特表 2022-541181 ＴＣＲ遺伝子の単離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-22

(54)【発明の名称】ＴＣＲ遺伝子の単離方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220914BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20220914BHJP

   C40B 40/08 20060101ALI20220914BHJP

   C40B 40/10 20060101ALI20220914BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220914BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220914BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20220914BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220914BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20220914BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220914BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20220914BHJP

   C40B 50/06 20060101ALI20220914BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220914BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220914BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220914BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20220914BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220914BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20220914BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220914BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220914BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220914BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220914BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220914BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220914BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20220914BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20220914BHJP

   C07K 14/57 20060101ALN20220914BHJP

   C07K 14/55 20060101ALN20220914BHJP

   C07K 14/525 20060101ALN20220914BHJP

   C07K 14/53 20060101ALN20220914BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20220914BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALN20220914BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20220914BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/725 ZNA

C40B40/08

C40B40/10

C12Q1/6869 Z

C12N5/0783

C12N5/0781

C12N15/62 Z

C12N5/0784

C12N5/10

C12N15/10 100Z

C40B50/06

A61P35/00

A61K35/17 Z

A61P43/00 121

A61P37/00

A61P37/06

A61P31/00

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K47/68

A61K48/00

G01N33/53 Y

C12P21/02 C

C12Q1/02

C12Q1/686 Z

C07K16/28

C07K14/57

C07K14/55

C07K14/525

C07K14/53

C07K19/00

C12Q1/6876 Z

C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022502277

(86)(22)【出願日】2020-07-13

(85)【翻訳文提出日】2022-03-08

(86)【国際出願番号】 US2020041824

(87)【国際公開番号】W WO2021011482

(87)【国際公開日】2021-01-21

(31)【優先権主張番号】62/874,125

(32)【優先日】2019-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/975,924

(32)【優先日】2020-02-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/024,341

(32)【優先日】2020-05-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/034,157

(32)【優先日】2020-06-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/039,346

(32)【優先日】2020-06-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522014792

【氏名又は名称】ネオジン セラピューティクス ビー．ブイ．

(74)【代理人】

【識別番号】100072604

【弁理士】

【氏名又は名称】有我 軍一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100140501

【弁理士】

【氏名又は名称】有我 栄一郎

(72)【発明者】

【氏名】アントニウス ニコラス マリア シューマッハ

(72)【発明者】

【氏名】カーステン リンネマン

(72)【発明者】

【氏名】トマス クイルマン

(72)【発明者】

【氏名】ギャビン エム． ベンドル

(72)【発明者】

【氏名】ジュール エフ．シー． ガディオット

(72)【発明者】

【氏名】イェルン ダブリュ．ジェイ． ファン ヘイスト

(72)【発明者】

【氏名】ラクエル ゴメス‐エーラント

(72)【発明者】

【氏名】デボラ ソフィー シュリッケマ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA12

4B063QA13

4B063QA19

4B063QA20

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QR73

4B063QR77

4B063QS25

4B063QS34

4B064AE63

4B064AG20

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD50

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC03

4C076CC27

4C076CC31

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB011

4C084ZB081

4C084ZB261

4C084ZB311

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB12

4C085BB50

4C085CC03

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087CA05

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB01

4C087ZB08

4C087ZB26

4C087ZB31

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA61

4H045CA40

4H045DA04

4H045DA12

4H045DA18

4H045DA22

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収する方法を提供する。いくつかの態様において、ＴＣＲレパトアは、非生存性試料から回収される。いくつかの態様では、ＴＣＲａβ対のライブラリーが作製される。いくつかの態様において、開示される方法は、癌の免疫療法または診断の目的で使用される。本明細書に記載されるいくつかの態様は、核酸のコンビナトリアルライブラリーに由来するＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多様なＴ細胞集団からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収するための方法であって、前記方法が、
対象の試料に含まれるＴＣＲαおよびＴＣＲβのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定すること、
前記レパトア全体から、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のサブセットを１つ以上選択すること、
ＴＣＲαβ対のライブラリーを形成する選択したＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによって、ＴＣＲレパトアを作製すること、ならびに、
作製した前記ＴＣＲレパトアから、所望の特徴を有するＴＣＲαとβの対を少なくとも１つ同定すること
を含む、方法。

【請求項2】

前記レパトア全体に由来するＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の前記１つ以上のサブセットが、
前記Ｔ細胞集団中での頻度に基づいて、
第二のＴ細胞集団との比較における相対的な濃縮度に基づいて、
所与のＴＣＲ鎖と比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡのコピー数が異なることに基づいて、
前記ＴＣＲ鎖の生物学的特性であって、ここで前記特性が、（予測される）抗原特異性、（予測される）ＨＬＡ拘束性、抗原親和性、共受容体依存性、または親Ｔ細胞系列（例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８Ｔ細胞）またはＴＣＲ配列モチーフのうちの少なくとも１つから選択される、前記ＴＣＲ鎖の生物学的特性に基づいて、
遺伝子発現の空間的パターンであって、ここで前記空間的な遺伝子の発現パターンが、組織内の起源領域または他の遺伝子の共発現パターンのうちの少なくとも１つに由来する、前記遺伝子発現の空間的パターンに基づいて、
例えば複数の腫瘍病変において出現しているなど、複数の試料において同様の頻度で共出現または出現していることに基づいて、
前記ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するための複数の群への選択に基づいて、
異なる態様で定義したような複数の基準の組み合わせに基づいて、
のうちの少なくとも１つの基準に基づいて選択される、請求項１の方法。

【請求項3】

前記Ｔ細胞集団中での頻度に基づく選択が、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖についての個別の順位またはＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を組み合わせた場合の順位を作成するために使用される、ＴＣＲ配列の前記頻度のデータに基づくものである、請求項２の方法。

【請求項4】

ＴＣＲレパトアの回収に関して望まれる深度で定義され、頻度に基づいてＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のコレクションを選択するために用いられる頻度閾値を決定することをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ＴＣＲαおよびＴＣＲβの配列を決定することが、
多重ＰＣＲ、
標的濃縮によるＴＣＲ配列の回収、
５'ＲＡＣＥとＰＣＲによるＴＣＲ配列の回収、
空間的配列決定によるＴＣＲ配列の回収、
ＲＮＡ配列よるＴＣＲ配列の回収、および
固有の分子識別子（ＵＭＩ）の利用、
のうちの少なくとも１つによって達成される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

回収されたＴＣＲ鎖の配列が、完全なＴＣＲ鎖配列を組み立てるためのヌクレオチド配列アライメントに基づいて少なくとも１つのＴＣＲ－Ｖセグメントファミリーおよび少なくとも１つのＴＣＲ－Ｊセグメントファミリーを選択するのに十分な５'および３'のヌクレオチド配列情報とともに、ＣＤＲ３ヌクレオチド配列と定義される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製する選択されたＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによってＴＣＲレパトアを作製する方法であって、
ＴＣＲ鎖配列を使用して、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ断片の別々のライブラリーを合成し、その後、正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結した１つのＤＮＡまたはＲＮＡ断片に連結すること；
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを、正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結したＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を直接合成することによって生成すること；
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを、細胞が少なくとも１つのＴＣＲα鎖と１つのＴＣＲβ鎖を発現するように、ＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子の別々のコレクションで細胞プールを修飾することによって、細胞内で作製すること；および／または、
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを一本鎖ＴＣＲ構築物に連結すること、ここで、この一本鎖ＴＣＲ構築物にはＴＣＲαおよびＴＣＲβ両方の可変鎖断片が融合されていて、かつ、（ｉ）膜貫通ドメインのみ、または（ｉｉ）ＣＤ３εもしくはＣＤ３ζシグナルドメインを単独でまたはＣＤ２８シグナルドメインとの組み合わせを含むがこれに限らない付加的な細胞内シグナル伝達ドメインと融合されている、
のうちの少なくとも１つによって、達成される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記作製されたＴＣＲレパトアから所望の特徴を有するＴＣＲαβ対を少なくとも１つ同定する方法であって、
生成されたＴＣＲαβ対の前記ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲ単離用の少なくとも１つの活性化マーカーに基づいて抗原反応性のレポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の前記ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを細胞増殖を追跡するのに適した蛍光色素で標識し、少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲ単離用の増殖性に基づいて抗原反応性のレポーター細胞を単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の前記ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも２つの試料に分け、試料を少なくとも１つの目的の抗原を発現しているかまたは発現していない抗原提示細胞によって刺激し、刺激後、両方のレポーター細胞集団を一定期間インキュベートし、次いで、両方のレポーター細胞集団をＴＣＲ分離によって分析し、両方の試料から得られたＴＣＲαβ対を比較することで、少なくとも１つの抗原に暴露された前記試料においてより豊富に含まれているＴＣＲ遺伝子を特定すること；
生成されたＴＣＲαβ対の前記ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲの誘発を示す少なくとも１つのレポーター遺伝子、例えばＮＦＡＴ－ＧＦＰまたはＮＦＡＴ－ＹＦＰに基づいて、抗原反応性レポーター細胞を単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の前記ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、抗原反応性レポーター細胞を、ＴＣＲのシグナル伝達に際して獲得される抗生物質耐性を含むがこれには限定されない選択的生存に基づく抗原特異的レポーター細胞の選択に基づいて、例えばＮＦＡＴ－ピューロマイシン導入遺伝子の使用によって、ＴＣＲ単離用に単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の前記ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを目的の抗原を担持する１つ以上のＭＨＣ複合体に曝露し、ＴＣＲ単離用に、ＭＨＣ複合体に結合したレポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の前記ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激し、その後、単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体的手法を使用して目的のＴＣＲαβ対を同定し、ＴＣＲ単離と少なくとも１つの活性化マーカーの転写レベルでの検出とを組み合わせ、それにより、ＴＣＲαβの転写物が活性化マーカーのレベルの上昇と共発現する前記Ｔ細胞のプールに含まれる単一のレポーター細胞を検出すること；
のうちの少なくとも１つによって達成される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記対象の試料が非生存性出発材料を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記同定したＴＣＲレパトアの特定の部分が回収される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

抗原特異的ＴＣＲ配列が回収される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

クラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ配列が回収される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、
新生抗原特異的ＴＣＲ配列、
ウイルス特異的ＴＣＲ配列、
共有腫瘍抗原特異的ＴＣＲ配列、
自己抗原特異的ＴＣＲ配列、
の少なくとも１つが回収される、方法。

【請求項14】

前記新生抗原特異的ＴＣＲ配列を発現するＴ細胞を癌治療として投与するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記方法が診断のための方法である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記診断が、感染症または自己免疫疾患の病的部位からＴＣＲレパトアを回収することである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記方法が、ＢＣＲ／抗体レパトアの回収のための方法である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記ＴＣＲαおよびβのヌクレオチド配列を含む核酸を対象から単離することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記活性化マーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＯＸ４０からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。

【請求項20】

ＤＮＡおよびＲＮＡの単離が、異なる細胞型の混合物であるＴ細胞集団または組織試料（血液または腫瘍組織など）の一部に由来する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記対象の試料が体液から単離された細胞を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記細胞が腫瘍特異的Ｔ細胞または腫瘍浸潤リンパ球である、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記体液が、血液、尿、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、喀痰、粘膜分泌物、膣液、腹水、胸水、心嚢液、腹膜液、および腹腔液からなる群より選択される、請求項２０～２１に記載の方法。

【請求項24】

前記ＴＣＲαβ鎖配列を使用して、癌、免疫学的障害、自己免疫疾患、または感染症に罹患している対象を治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記作製したＴＣＲレパトアから、所望の特徴を有するＴＣＲαとβの対を少なくとも１つ同定する方法であって、
少なくとも１つの活性化マーカーに基づく同定または選択；
抗原に応答した増殖に基づく同定または選択；
非刺激細胞と比較して抗原刺激細胞においてより豊富に含まれているＴＣＲ遺伝子を同定することに基づく同定または選択；
ＴＣＲの誘発によるレポーター遺伝子の活性化に基づく同定または選択；
ＴＣＲのシグナル伝達に際して獲得される抗生物質耐性を含むがこれに限定されない、選択的生存に基づく同定または選択；
１つ以上のＭＨＣ複合体への結合に基づく同定または選択；
単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体技術を用いた同定または選択；あるいは
これらの任意の組み合わせ；
のうちの少なくとも１つによって達成される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

ＴＣＲ単離が、抗原反応性Ｔ細胞のＴＣＲαβ遺伝子配列を決定するためにＤＮＡ配列決定もしくはＲＮＡ配列決定によって分析されるＴＣＲαβ特異的ＰＣＲ産物を生成するために、バルクの抗原反応性Ｔ細胞からＤＮＡもしくはＲＮＡを単離すること；または、分析した単一のＴ細胞において発現する前記ＴＣＲαβ遺伝子の配列を分析するための単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲもしくは微少流体技術、によって達成される、請求項８に記載の方法。

【請求項27】

前記レポーター細胞がＴ細胞である、請求項８に記載の方法。

【請求項28】

単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体技術を用いた同定または選択が、活性化関連遺伝子の共発現を決定することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

複数のＴ細胞ライブラリーを作製する方法であって、前記方法が、請求項１の方法に従ってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収すること；前記ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するために、前記レパトア全体からＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を複数の群に選択すること；を含み、ここで複数のＴ細胞ライブラリーが、より複雑度が小さい、または前記ＴＣＲレパトアの特定の部分を回収するものとして作製される、方法。

【請求項30】

ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の選択が頻度範囲に基づく、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

核酸のコンビナトリアルライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供すること、前記複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで前記連続部分は、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組合せを含み、ここで前記２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの第一のバリアントヌクレオチド部分配列は前記連続部分の第一の末端を規定し、前記２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの第二のバリアントヌクレオチド部分配列は前記第一の末端とは反対側にある前記連続部分の第二の末端を規定し；
前記複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成された細胞の集団に、前記ライブラリーを導入すること；
前記２つ以上のバリアント核酸部分配列の前記組み合わせに依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて、前記細胞集団の亜集団を選択すること、ここで前記亜集団は複数の細胞を含み；
前記亜集団から前記複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
前記サブセットの個別のメンバーの前記連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；ならびに、
前記ヌクレオチド配列に基づいて、前記２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること；
を含む、方法。

【請求項32】

前記１つ以上のポリペプチドが、
Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖；
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；
スイッチレセプター；または
抗体もしくはその抗原結合断片の１本以上の鎖、
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項33】

前記第一のバリアントヌクレオチド部分配列がＴＣＲαバリアントアミノ酸配列をコードし、前記第二のバリアントヌクレオチド部分配列がＴＣＲβバリアントアミノ酸配列をコードする、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

前記２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列が、ＴＣＲＶ領域；ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；ＴＣＲ－Ｊセグメント；およびＴＣＲ定常領域；のうちの１つ以上をコードしている、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列がそれぞれ、ＣＡＲの抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、または１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをコードしている、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項36】

前記連続部分が６００ｂｐ～１５，０００ｂｐの長さである、請求項３１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

提供することが、前記ライブラリーを生成することを含む、請求項３１～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記ライブラリーを生成する方法であって、
前記１つ以上のポリペプチドの２以上のバリアントアミノ酸配列のセットをコードする、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のセットを同定すること、ここで、前記少なくとも１つの機能的特性は、前記２つ以上のバリアントアミノ酸配列のセットのそれぞれに由来するバリアントアミノ酸配列の組み合わせに依存し；および
前記２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のセットのそれぞれに由来するバリアントヌクレオチド部分配列を組み合わせることで前記連続部分を組み立て、それによって前記複数のバリアント核酸の前記メンバーを生成すること、
を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記ライブラリーに含まれる前記複数のバリアント核酸の連続部分間の編集距離が最大化される、請求項３１～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記ライブラリーが、前記２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の少なくとも１００の異なる組み合わせを含む、請求項３１～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

導入することが、ウイルス導入、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはヌクレアーゼ媒介性部位特異的統合を介して前記ライブラリーを導入することを含む、請求項３１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

導入することが、５以下の感染多重度（ＭＯＩ）で前記細胞の集団をウイルス導入することを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記ライブラリーに含まれる前記２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の異なる組み合わせの数に基づいて、前記細胞の集団の大きさを調整することを含む、請求項３１～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記細胞の集団が不死化Ｔ細胞または初代Ｔ細胞を含む、請求項３１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記不死化Ｔ細胞または初代Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記複数のバリアント核酸の少なくとも１つを発現する前記細胞の集団に含まれる細胞を選択またはスクリーニングするためにマーカーを使用することをさらに含む、請求項３１～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記マーカーが、細胞毒耐性マーカーおよび／または細胞表面マーカーである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記細胞集団の細胞が、遺伝的に修飾されている、請求項３１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記集団の細胞が、前記少なくとも１つの機能的特性を前記細胞に付与する内因性ポリペプチドを含まない、請求項３１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記細胞が、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２８のうちの１つ以上の発現を排除または低減させるように遺伝的に修飾される、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記細胞が、ＣＤ４および／またはＣＤ８と共に再構成され、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ配列のスクリーニングに利用される、請求項４８または４９に記載の方法。

【請求項52】

前記細胞がＴ細胞である、請求項５０または５１に記載の方法。

【請求項53】

選択することが、検出可能なマーカーの発現に基づいて前記亜集団を選択することを含み、ここで前記発現が、前記１つ以上のポリペプチドの前記少なくとも１つの機能的特性に依存する、請求項３１～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記検出可能なマーカーが、細胞表面マーカー、サイトカインマーカー、細胞増殖マーカー、転写レポーター、シグナル伝達レポーター、および／または細胞毒性レポーターを含む、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

請求項５４に記載の方法であって、ここで、
前記細胞表面マーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０のうちの１つ以上を含み；
前記サイトカインマーカーが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ以上を含み；
前記転写レポーターが、ＮＦ－κＢ、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１のうちの１つ以上を含み；
前記シグナル伝達レポーターが、ＺＡＰ７０、ＥＲＫ１／２のうちの１つ以上を含み；および
前記細胞毒性レポーターが、ＣＤ１０７Ａ、ＣＤ１０７Ｂのうちの１つ以上を含む、
方法。

【請求項56】

選択することが、前記細胞の集団を、
第二の集団；
前記１つ以上のポリペプチドのリガンド；
前記１つ以上のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト；および
小分子；
のうちの１つ以上と接触させることを含み、
ここで前記接触によって誘発される前記亜集団の変化が、前記１つ以上のポリペプチドの前記少なくとも１つの機能的特性に依存する、
請求項３１～５５のいずれか１つに記載の方法。

【請求項57】

選択することがさらに、
前記変化の有無および／または前記変化の大きさを検出すること；ならびに
前記検出に基づいて、前記亜集団を選択すること、
を含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記細胞の第二の集団が抗原提示細胞を含む、請求項５６または５７に記載の方法。

【請求項59】

前記抗原提示細胞が、Ｂ細胞および／または樹状細胞を含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記細胞の第二の集団が、初代細胞または不死化細胞を含む、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記ライブラリーのバリアントヌクレオチド配列が、前記バリアントヌクレオチド部分配列によってコードされるアミノ酸を含むバリアントポリペプチドを発現する細胞に由来し、前記細胞が対象から得られ、および前記細胞の第二の集団が前記対象から得られる、請求項５６～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

選択することが、閾値を超えるまたは下回る前記少なくとも１つの機能的特性の測定に基づいて、前記細胞の集団の第一の亜集団を選択することを含む、請求項３１～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記閾値が、前記細胞の集団の未選択の亜集団における前記機能的特性の測定に基づいて決定される、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

選択することが、第二の閾値を超えるまたは下回る前記少なくとも１つの機能的特性の第二の測定値に基づいて前記細胞の集団の第二の亜集団を選択することをさらに含み、ここで、前記第一および第二の亜集団が重複していない、請求項６２に記載の方法。

【請求項65】

前記少なくとも１つの組み合せを特定することが、前記第一および第二の亜集団の間で前記少なくとも１つの組み合せの存在量を比較することを含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記少なくとも１つの組み合せを同定することが、細胞の対照集団と比較して、前記亜集団における前記少なくとも１つの組み合せの濃縮度を測定することを含む、請求項３１～６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記細胞の集団が、前記細胞の対照集団を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記細胞の亜集団と対照集団が重複しておらず、ここで重複していないとは、両集団中の前記細胞が異なる活性化状態にあるが、同じバリアント核酸を担持することができることを表す、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記細胞の対照集団が、前記少なくとも１つの機能的特性とは異なる第二の機能的特性に基づいて選択される、請求項６６に記載の方法。

【請求項70】

前記亜集団が複数の細胞を含む、請求項３１～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記単離することが、前記少なくとも１つの機能的特性に基づいて、前記亜集団の単一クローンを単離することを含まない、請求項３１～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記亜集団が少なくとも１，０００の細胞を含む、請求項３１～７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

決定することが、前記連続部分の少なくとも６００ｂｐの配列決定リードを生成することによって、前記個別のメンバーについて配列決定することを含む、請求項３１～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

前記配列決定リードが６００ｂｐ～１５，０００ｂｐの長さである、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

決定することが、前記個別のメンバーの少なくとも前記連続部分を増幅することを含む、請求項３１～７４のいずれか１つに記載の方法。

【請求項76】

増幅することが、不変ヌクレオチド部分配列にハイブリダイズする増幅プライマーを使用することを含み、ここで前記複数のバリアント核酸はそれぞれ、前記不変ヌクレオチド部分配列を含み、およびここで、前記不変ヌクレオチド部分配列は、前記１つ以上のポリペプチドの不変アミノ酸配列をコードしている、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記１つ以上のポリペプチドが、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、ここで前記不変アミノ酸配列がＴＣＲα定常領域を含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記１つ以上のポリペプチドが、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、ここで前記不変アミノ酸配列がＴＣＲβ定常領域を含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項79】

前記単離することが、前記亜集団由来のゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性標的断片化を使用することを含む、請求項３１～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

前記決定することが、前記個別のメンバーを増幅する前または前記個別のメンバーを増幅することなく、前記連続部分の前記ヌクレオチド配列のそれぞれについて、少なくとも１０の平均カバー数を得ることを含む、請求項３１～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

前記決定することが、前記連続部分の前記ヌクレオチド配列のそれぞれについて、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００または少なくとも１，０００の平均カバー数を得ることを含む、請求項３１～８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項82】

核酸のコンビナトリアルライブラリーからＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供すること、前記複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、
ここで前記連続部分は、ＴＣＲαのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、前記連続部分の第一の末端を規定する第一のバリアントヌクレオチド部分配列と
ＴＣＲβのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、前記第一の末端とは反対側にある前記連続部分の第二の末端を規定する第二のバリアントヌクレオチド部分配列
の組み合わせを含み；
前記複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現するように構成された不死化Ｔ細胞の集団に、前記ライブラリーを導入すること；
前記不死化Ｔ細胞と抗原を発現している不死化Ｂ細胞との接触に応答して閾値を超えるＴ細胞活性化マーカーの発現に基づいて、前記不死化Ｔ細胞の集団の亜集団を選択すること、ここで前記亜集団は複数のＴ細胞を含み；
前記亜集団から前記複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
前記サブセットの個々のメンバーの前記連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、
前記サブセットの前記ヌクレオチド配列に含まれる前記少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、前記第一と第二のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること、
を含む、方法。

【請求項83】

請求項８２に記載の方法であって、
前記不死化Ｔ細胞と前記不死化Ｂ細胞との接触に応答して第二の閾値を下回る前記Ｔ細胞活性化マーカーの前記発現に基づいて、前記不死化Ｔ細胞の集団の第二の亜集団を選択すること、ここで前記第二の亜集団は第二の複数のＴ細胞を含み、前記亜集団と第二の亜集団は重複しておらず；
前記第二の亜集団から前記複数のバリアント核酸の第二のサブセットを単離すること；および、
前記第二のサブセットの個別のメンバーの前記連続部分の第二のヌクレオチド配列を決定すること、
ここで、前記少なくとも１つの組み合わせは、前記第二のサブセットの前記第二のヌクレオチド配列における前記少なくとも１つの組み合わせと比較して、前記サブセット中の前記少なくとも１つの組み合わせの濃縮度に基づいて同定される、
をさらに含む、方法。

【請求項84】

核酸のコンビナトリアルライブラリーからキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞内シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供すること、前記複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで前記連続部分は、
ＣＡＲヒンジドメインをコードしている第一のバリアントヌクレオチド部分配列、
ＣＡＲ膜貫通ドメインをコードしている第二のバリアントヌクレオチド部分配列、および
ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインをコードしている第三のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの２つ以上の組み合わせを含み、
ここで前記第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの１つは、前記連続部分の第一の末端を規定し、ここで前記第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列の別の１つは、前記第一の末端の反対側にある前記連続部分の第二の末端を規定し；
前記複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＣＡＲを発現するように構成された細胞の集団に、前記ライブラリーを導入すること、ここで前記細胞の集団は、不死化Ｔ細胞または初代ヒトＴ細胞の集団を含み；
前記細胞と前記ＣＡＲの抗原結合ドメインに特異的な抗原を発現している抗原提示細胞とを接触させることに応答して閾値を超える細胞増殖に基づいて、前記細胞の集団の亜集団を選択すること、ここで前記亜集団は複数の細胞を含み；
前記亜集団から前記複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
前記サブセットの個々のメンバーの前記連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、
前記サブセットの前記ヌクレオチド配列に含まれる前記少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、前記第一、第二、および第三のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること、
を含む、方法。

【請求項85】

１つより多いＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインが存在する、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

少なくとも２つのＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインが存在する、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記少なくとも２つのＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζＩＴＡＭ１、ＣＤ３ζＩＴＡＭ１２、ＣＤ３ζＩＴＡＭ１２３；ＣＤ３δ、ＣＤ３εおよびＣＤ３γの任意のＩＴＡＭを有するＣＤ３ζ；ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ならびにＣＤ２のうちの少なくとも２つである、請求項８４に記載の方法。

【請求項88】

請求項８４に記載の方法であって、
前記細胞と前記抗原提示細胞との接触に応答して第二の閾値レベルを下回る細胞増殖に基づいて、前記細胞の集団の第二の亜集団を選択すること、ここで前記第二の亜集団は第二の複数の細胞を含み、ここで前記亜集団と第二の亜集団は重複しておらず；
前記第二の亜集団から前記複数のバリアント核酸の第二のサブセットを単離すること；
前記第二のサブセットの個別のメンバーの前記連続部分の第二のヌクレオチド配列を決定すること、および
ここで前記少なくとも１つの組み合わせは、前記第二のサブセットの前記第二のヌクレオチド配列における前記少なくとも１つの組み合わせと比較した、前記サブセット中の前記少なくとも１つの組み合わせの濃縮度に基づいて同定される、
を含む、方法。

【請求項89】

核酸のコンビナトリアルライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸を含むコンビナトリアルライブラリを提供すること、前記複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み；
前記複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされる１つ以上の複数のポリペプチドを発現するように構成された細胞の集団に、前記ライブラリーを導入すること；
前記少なくとも６００ｂｐの連続部分に依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて前記細胞の集団の亜集団を選択すること、ここで前記亜集団は複数の細胞を含み；
前記亜集団から前記複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
前記サブセットの個別のメンバーの前記連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および
前記ヌクレオチド配列に基づいて、前記少なくとも６００ｂｐの連続部分を同定するこ と、
を含む、方法。

【請求項90】

前記少なくとも６００ｂｐの連続部分が６００塩基対全体に分布している、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

核酸のライブラリーから抗原特異的Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に、核酸ライブラリーを導入すること；
抗体への応答に対する閾値レベルを上回るマーカーの発現に基づいて、前記細胞集団の亜集団を選択すること、ここで前記亜集団は複数の細胞を含み；
前記亜集団から前記複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
前記バリアント核酸のヌクレオチド配列を決定すること；および、
前記サブセットに含まれる前記ヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて、少なくとも１つのバリアントヌクレオチド配列を同定すること、
を含む、方法。

【請求項92】

ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードしている前記複数のバリアント核酸を含んでいる前記ライブラリーを提供することをさらに含む、請求項９１または９０に記載の方法。

【請求項93】

試料からＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
試料に含まれるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の配列を決定すること；
ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製するために、ＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を選択し、コンビナトリアルペアリングを行うこと；
前記ＴＣＲαβ対のライブラリーをレポーター細胞のプールに導入すること；
前記ＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾された前記レポーター細胞を、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞で刺激すること；
前記少なくとも１つの目的の抗原に特異的なＴＣＲαβ対を決定すること；および、
前記ＴＣＲαβ対を細胞に導入し、前記ＴＣＲαβ対を含む細胞を選択すること、
を含む、方法。

【請求項94】

自己免疫疾患の診断または治療のために、抗原特異的ＴＣＲ配列を発現しているＴ細胞を投与するステップをさらに含む、請求項１４記載の方法。

【請求項95】

前記Ｔ細胞が、自己由来であってもまたは同種異系であってもよい、請求項１４に記載の方法。

【請求項96】

前記活性化マーカーがＣＤ６９であり、２つの細胞集団が単離され、一方の細胞集団はＣＤ６９を高発現し、他方の細胞集団はＣＤ６９を低発現している、請求項８に記載の方法。

【請求項97】

請求項１～３０および９５、９６のいずれか１項に記載の方法に従って回収された前記Ｔ細胞受容体のレパトアを含む、ヌクレオチドライブラリー。

【請求項98】

請求項１～９６のいずれか１項に記載の方法に従って同定されたヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド構築物。

【請求項99】

請求項９８に記載のヌクレオチド構築物を含む、細胞。

【請求項100】

核酸のライブラリーから抗原特異的Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、前記方法が、
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に前記核酸ライブラリーを導入して、細胞のライブラリーを作製すること；
抗原に応答して第一の閾値を超えるマーカーの発現に基づいて、前記細胞のライブラリーの第一の集団を選択すること；および、
前記ライブラリーの前記第一の集団からバリアント核酸の第一の集団を単離すること、
を含む、方法。

【請求項101】

前記方法がさらに、
前記バリアント核酸の第一の集団の少なくとも１つのヌクレオチド配列または核酸の同一性を同定すること；および、
前記サブセットに含まれる前記ヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて、少なくとも１つのバリアントヌクレオチド配列を同定すること、
を含む、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記閾値レベルが、
ｄ）マーカーの発現に基づく前記細胞の全プールの割合の回収；または
ｅ）前記細胞の全プールからの最小限の数の細胞の回収；または
ｆ）抗原に反応して発現する少なくとも１つのマーカーへの磁気プローブの結合に基づく、磁石によって保持される細胞の回収、
のうちの少なくとも１つに基づく、請求項１００または１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記対照が、第二の閾値未満の第二の細胞集団である、請求項６６～６９、８２、８４、９１、または１０１に記載の方法。

【請求項104】

前記対照が、
細胞の参照集団、
前記細胞の集団に導入された核酸のコンビナトリアルライブラリー、
前記第一の集団と同じ細胞の集団から第二の閾値未満の発現マーカーに基づいて選別された細胞の集団、
前記関連するＴＣＲライブラリーを発現するレポーターＴ細胞といかなる外因性抗原も提示しないＢ細胞等の抗原提示細胞との共培養から得られた少なくとも１つの細胞の集団、
のうちの１つ以上である、請求項６６～６９、８２、８４、９１、または１０１に記載の方法。

【請求項105】

前記対照（もしくは下位）試料が、前記上位試料と同じ細胞集団から選別されるが、活性化マーカーの発現が低く；または前記下位試料が、前記関連するＴＣＲライブラリーを発現するレポーターＴ細胞、および外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞の共培養から得られたものである、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記細胞の集団に抗原を添加することをさらに含む、請求項１００～１０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項107】

第一の集団および／または前記対照の前記単離することが、ａ）磁気ビーズ濃縮、ｂ）フローサイトメトリーソーティング、またはｃ）両方のうちの少なくとも１つによって達成される、請求項１００～１０６のいずれか１つに記載の方法。

【請求項108】

核酸のライブラリーから抗原特異的Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖とＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、前記方法が、
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に前記核酸ライブラリーを導入して細胞のライブラリーを作製すること；および、
前記サブセットに含まれる前記ヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて、バリアント核酸の前記第一の集団の少なくとも１つのヌクレオチド配列または核酸の同一性を同定すること、
を含む、方法。

【請求項109】

前記少なくとも１つの核酸が、細胞の第一の集団から単離される、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記細胞の第一の集団が、抗原に応答して第一の閾値レベルを超えるマーカーの発現に基づいて選択される、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

核酸のライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法であって、
前記核酸のライブラリーを細胞の集団に導入して細胞ライブラリーを作製すること；
前記細胞ライブラリーを細胞の第一の集団と接触させること；
磁気ビーズ濃縮により、少なくとも１つのマーカーの発現に基づいて、前記細胞ライブラリーの亜集団を選択すること；および、
前記亜集団に含まれる前記ヌクレオチド配列が対照との比較において有意に濃縮されていることまたは枯渇していることに基づいて、少なくとも１つのヌクレオチド配列を決定すること、
を含む、方法。

【請求項112】

前記細胞の亜集団の少なくとも一部が、前記核酸のライブラリのメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成される、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

マーカーの発現が、前記ライブラリーから導入された核酸に連動し、連動が、前記導入された核酸がマーカーの発現を変化させることを表す、請求項１１１に記載の方法。

【請求項114】

選択することが、閾値レベルを上回るのマーカー発現に基づく、請求項１１１に記載の方法。

【請求項115】

選択することが、閾値を上回る少なくとも２つのマーカーの発現に基づく、請求項１１１に記載の方法。

【請求項116】

抗原を同定または刺激または提供することが、
ａ）多数の抗原を選択すること；
ｂ）それぞれの抗原が正確に２つの抗原プールに存在する抗原プールを作製すること；
ｃ）前記それぞれの抗原プールに対する少なくとも１つのＴ細胞受容体を発現するレポーター細胞の反応性を評価すること；および、
ｄ）正確に２つの抗原プールに対する反応性を評価することによって、前記少なくとも１つのＴ細胞受容体が前記選択された抗原のいずれかに対して反応性を有するか否かを決定すること、
のうちの１つ以上を含む、請求項８、８２、９１、９３または１００のいずれか１つに記載の方法。

【請求項117】

正確に２つの抗原プールに対する反応性が、ペアワイズ濃縮度分析によって検出される、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記ライブラリーがＴＣＲライブラリーである、請求項１１１に記載の方法。

【請求項119】

活性化マーカーを用いる、請求項１１１に記載の方法。

【請求項120】

反応性を評価するために上位下位比較を採用する、請求項１１１に記載の方法。

【請求項121】

反応性の評価に上位下位比較を採用する、請求項１～１２０のいずれか１項に記載の反応性の評価を伴うまたは反応性の評価をさらに含む、方法。

【請求項122】

ライブラリーを伴う請求項１～１２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記ライブラリー中の前記複数のバリアント核酸の前記ヌクレオチド配列が、
前記宿主細胞にとって好ましいコドン使用を導入すること、
ｍＲＮＡ構造の安定性を最適化すること、
反復配列を回避すること、
長い同種重合体を回避すること、および
所与のバリアント核酸配列内の局所的なＧＣ含有量に大きな相違が生じることを回避すること、
のうちの少なくとも１つに基づいて最適化される、方法。

【請求項123】

前記抗原が抗原提示細胞を介して提示される、請求項９１に記載の方法。

【請求項124】

前記ライブラリーがコンビナトリアルライブラリーである、請求項９１に記載の方法。

【請求項125】

前記抗原が細胞によって提供される、請求項１～１２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項126】

前記過程が、高度な抗原多様性および／または複雑性を伴う、請求項１～１２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項127】

ライブラリーを伴う請求項１～１２６のいずれか１項に記載の方法であって、前記ライブラリーがコンビナトリアルライブラリーである、方法。

【請求項128】

前記コンビナトリアルライブラリーがＴＣＲライブラリーである、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

細胞のコレクションであって、前記コレクションが、
少なくとも２つのＴ細胞のセットであって、ここで少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ少なくとも１つのＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここで前記ＴＣＲαおよび前記ＴＣＲβのそれぞれは対象に由来し、ここで前記Ｔ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、およびここで前記セットは１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されている、少なくとも２つのＴ細胞のセット；ならびに、
少なくとも２つのＢ細胞のセットであって、ここで前記少なくとも２つのＢ細胞はそれぞれ少なくとも１つの外因性新生抗原（または抗原）を発現するように構成されており、その結果、少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が産生可能になり、およびここで前記少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）は、前記対象内におけるものと同じである、少なくとも２つのＢ細胞のセット、
を含む、コレクション。

【請求項130】

前記少なくとも２つのＢ細胞のセットが、前記外因性新生抗原（または抗原）を産生する少なくとも第一のＢ細胞；および前記第二の外因性新生抗原（または抗原）を産生する少なくとも第二のＢ細胞、を含む、請求項１２９に記載の組成物。

【請求項131】

ＴＣＲ発現細胞のライブラリーであって、前記ＴＣＲ発現細胞のライブラリーが少なくとも３つのＴ細胞のセットを含み、
ここで前記Ｔ細胞のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つのＴＣＲαおよびＴＣＲβの対（少なくとも２つのＴＣＲ対）を発現するように構成されており、
ここで前記少なくとも２つのＴＣＲ対は対象に由来し、
ここで前記少なくとも３つのＴ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、
ここで前記少なくとも３つのＴ細胞は、Ｂ細胞によって提示された抗原（または新生抗原）への結合に際して、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されており、
ここでＴＣＲ細胞の数に反映される各ＴＣＲ対のゲノムコピー量が、前記試料に含まれる全てのＴＣＲのリードを示すものであり、および
ここで前記ＴＣＲのうちの少なくとも１つが、前記ライブラリーを含む組成物全体に均等に分布していない、
ライブラリー。

【請求項132】

少なくとも１つのＴ細胞の分布が、Ｂ細胞によって提示される抗原に結合することによって変化する、請求項１３１に記載のＴＣＲ発現細胞のライブラリー。

【請求項133】

前記少なくとも２つのＴＣＲ対が、前記ＴＣＲ発現細胞のライブラリー中にほぼ均等に存在する、請求項１３１に記載のＴＣＲ発現細胞のライブラリー。

【請求項134】

対象を治療する方法であって、前記方法が、
腫瘍を有する対象を特定すること；
少なくとも２つのＴ細胞のセットを提供すること、ここで、前記少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ、少なくとも１つの異なるＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されており、前記ＴＣＲαおよび前記ＴＣＲβはそれぞれ前記対象に由来し；
少なくとも２つのＢ細胞のセットを提供すること、ここで、前記Ｂ細胞のセットは少なくとも２つの外因性新生抗原を発現するように構成されており、前記少なくとも２つの外因性新生抗原は、前記対象内で見出されるものと同じであり；
前記少なくとも２つのＴ細胞のセットと前記少なくとも２つのＢ細胞のセットを組み合わせ、前記少なくとも２つの外因性新生抗原を介した前記少なくとも２つのＴ細胞の活性化に基づいて、少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを選択すること；および
前記少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを前記対象に投与し、それによって前記腫瘍を治療すること、
を含む、方法。

【請求項135】

治療することにより前記腫瘍の大きさが縮小する、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

対象を治療する方法であって、前記方法が、
腫瘍を有する対象を特定すること；
少なくとも２つのＴ細胞のセットを提供すること、ここで、前記少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ、少なくとも１つの異なるＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されており、前記ＴＣＲαおよび前記ＴＣＲβはそれぞれ前記対象に由来し；
少なくとも２つの抗原提示細胞のセットを提供すること、ここで、前記抗原提示細胞のセットは前記対象に由来するものであり、少なくとも２つの外因性新生抗原を発現するように構成されており、前記少なくとも２つの外因性新生抗原は、前記対象内で見出される新生抗原と同じであり；
前記少なくとも２つのＴ細胞のセットと前記少なくとも２つの抗原提示細胞のセットを組み合わせ、前記少なくとも２つの外因性新生抗原を介した前記少なくとも２つのＴ細胞の活性化に基づいて、少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを選択すること；および、
前記少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを前記対象に投与し、それによって前記腫瘍を治療すること、
を含む、方法。

【請求項137】

対象の腫瘍中に存在する第一の抗原（または新生抗原）に結合する第一のＴＣＲ対；および前記対象の腫瘍中に存在する第二の抗原（または新生抗原）に結合する第二のＴＣＲ対を含む、医薬組成物。

【請求項138】

前記第一のＴＣＲ対がＭＨＣクラスＩ拘束性であり、前記第二のＴＣＲ対がＭＨＣクラスＩＩ拘束性である、請求項１３７に記載の医薬組成物。

【請求項139】

第一の抗原に結合し、かつ、ＭＨＣクラスＩ拘束性である第一のＴＣＲ対と、第二の抗原に結合し、かつ、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性である第二のＴＣＲ対を含む、医薬組成物。

【請求項140】

第三のＴＣＲ対をさらに含む、請求項１３７～１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項141】

前記第一のＴＣＲ対が腫瘍由来の新生抗原に結合し、前記第二のＴＣＲ対が前記腫瘍由来の新生抗原に結合し、前記第一および第二のＴＣＲ対が両方とも前記腫瘍の宿主に存在する、請求項１３７～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項142】

細胞のコレクションであって、前記コレクションが、
少なくとも２つのＴ細胞のセットであって、ここで、それぞれが少なくとも１つのＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここで前記対は対象に由来し、ここで前記Ｔ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、およびここで前記セットは１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されている、少なくとも２つのＴ細胞のセット；ならびに、
少なくとも２つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）細胞のセットであって、ここで、前記少なくとも２つのＡＰＣはそれぞれ少なくとも１つの外因性新生抗原（または抗原）を発現するように構成されており、その結果、少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が産生可能になり、およびここで前記少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が前記対象内におけるものと同じである、少なくとも２つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）細胞のセット、
を含む、コレクション。

【請求項143】

前記ＴＣＲ対および／または前記ＴＣＲ対を発現しているＴ細胞が、抗原（新生抗原など）への結合によって選択または同定され、ここで前記抗原が、Ｂ細胞または抗原提示細胞によって発現される、請求項１～１４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項144】

前記抗原または新生抗原が、対象における腫瘍に由来し、前記ＴＣＲ対のＴＣＲαおよびＴＣＲβもそれぞれ前記対象由来である、請求項１～１４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項145】

少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１，０００、１０，０００、１００，０００、または１００万のＴＣＲ対（またはこれらの対を含む細胞）が存在し、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１，０００、１０，０００、１００，０００、または１００万の抗原が存在する、請求項１～１４４のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照

【0002】

本出願は、２０１９年７月１５日に出願の米国仮特許出願第６２／８７４１２５号、２０２０年２月１３日に出願の米国仮特許出願第６２／９７５９２４号、２０２０年５月１３日に出願の米国仮特許出願第６３／０２４３４１号、２０２０年６月３日に出願の米国仮特許出願第６３／０３４１５７号、および２０２０年６月１５日に出願の米国仮特許出願第６３／０３９３４６号の優先権を主張し、これらの全体は参照することにより本明細書に組み込まれる。
配列表の参照

【0003】

本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０２０年７月１３日に作成され、サイズが２１，７６５バイトの「ＮＴＢＶ００１ＷＯＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ」と題するファイルとして提供される。電子形式の配列表に含まれる情報は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0004】

本技術は基本的に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の配列を単離し、ＴＣＲのレパトアを回収することに関する。また、組成物および治療法も提供する。

【背景技術】

【0005】

ＴＣＲαとβの対を検出するためには、これまで、ＰＣＲに基づく技術とＴＣＲバルク鎖配列決定が用いられてきた（コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ Ｍｅｄ）２０１３；リンネマン（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ）ら、ネイチャー・メディシン、２０１３；トラン（Ｔｒａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１５；トランら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．）、２０１６；ツジ（Ｔｓｕｊｉ）ら、癌免疫学研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ）、２０１８）。

【発明の概要】

【0006】

本明細書ではいくつかの態様において、核酸のコンビナトリアルライブラリーから、Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖とＴＣＲβ鎖をコードしているヌクレオチド配列を同定する方法を説明する。この方法は、（Ｉ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードしている複数のバリアント核酸を含んでいるライブラリーを提供すること、（ＩＩ）複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされているＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に、ライブラリーを導入すること、（ＩＩＩ）抗体への応答に対する閾値レベルを上回るマーカーの発現に基づいて、細胞集団の亜集団を選択すること、ここで亜集団は複数の細胞を含み、（ＩＶ）亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること、（Ｖ）バリアント核酸のヌクレオチド配列を決定すること、ならびに（ＶＩ）サブセットに含まれるヌクレオチド配列の、対照との比較における濃縮度に基づいて、少なくとも１つのバリアントヌクレオチド配列を同定すること、を含む。

【0007】

他のいくつかの態様は、多様なＴ細胞集団からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収する方法に関し、この方法は、Ｉ）対象の試料に含まれるＴＣＲαおよびＴＣＲβのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定すること、ＩＩ）レパトア全体から、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のサブセットを１つ以上選択すること、ＩＩＩ）ＴＣＲαβ対のライブラリーを形成する選択したＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによって、ＴＣＲレパトアを作製すること、ならびに、ＩＶ）作製したＴＣＲレパトアから、所望の特徴を有するＴＣＲαとβの対を少なくとも１つ同定すること、を含む。

【0008】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、レパトア全体から、ａ）Ｔ細胞集団中での頻度に基づいて、ｂ）第二のＴ細胞集団との比較における相対的な濃縮度に基づいて、ｃ）所与のＴＣＲ鎖と比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡのコピー数が異なることに基づいて、ｄ）ＴＣＲ鎖の生物学的特性であって、ここでこの特性が、（予測される）抗原特異性、配列モチーフ、（予測される）ＨＬＡ拘束性、親和性、共受容体依存性、または親Ｔ細胞系列（例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８Ｔ細胞）のうちの少なくとも１つから選択される、ＴＣＲ鎖の生物学的特性に基づいて、ｅ）遺伝子発現の空間的パターンであって、ここで空間的な遺伝子の発現パターンが、組織での起源領域または他の遺伝子の共発現パターンの少なくとも１つに由来する、遺伝子発現の空間的パターンに基づいて、ｆ）例えば複数の腫瘍病変において出現しているなど、複数の試料において同様の頻度で共出現または出現していることに基づいて、ｇ）ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するための、複数の群への選択に基づいて、ｈ）異なる態様で定義したような複数の基準の組み合わせに基づいて、のうちの少なくとも１つの基準に基づいて選択される。いくつかの態様において、Ｔ細胞集団中での頻度に基づく選択は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖についての個別の順位またはＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を組み合わせた場合の順位を作成するために使用されるＴＣＲ配列の頻度のデータに基づくものである。いくつかの態様において、この方法はさらに、ＴＣＲレパトアの回収に関して望まれる深度で定義され、頻度に基づいてＴＣＲαおよびβ鎖のコレクションを選択するために用いられる頻度閾値を決定することを含む。いくつかの態様において、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの配列を決定することは、ａ）多重ＰＣＲ、ｂ）標的濃縮によるＴＣＲ配列の回収、ｃ）５'ＲＡＣＥとＰＣＲによるＴＣＲ配列の回収、ｄ）空間的配列決定によるＴＣＲ配列の回収、またはｅ）ＲＮＡ配列のデータによるＴＣＲ配列の回収、のうちの少なくとも１つによって、達成される。いくつかの態様において、回収されたＴＣＲ鎖の配列は、完全なＴＣＲ鎖配列を組み立てるためのヌクレオチド配列アライメントに基づいて少なくとも１つのＴＣＲ－Ｖセグメントファミリーおよび少なくとも１つのＴＣＲ－Ｊセグメントファミリーを選択するのに十分な５'および３'のヌクレオチド配列情報とともに、ＣＤＲ３ヌクレオチド配列と定義される。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列アライメントは、６５％配列同一性、７０％配列同一性、７５％配列同一性、８０％配列同一性、８５％配列同一性、９０％配列同一性、９５％配列同一性、９６％配列同一性、９７％配列同一性、９８％配列同一性、９９％配列同一性、１００％配列同一性、およびその間の任意の数または範囲に基づくものである。いくつかの態様において、最適な配列アライメントは、当業者に公知のリードマッピングアルゴリズムに従って、測定距離を最小化することに基づくものである。いくつかの態様においては、最良のアライメントが求められる。

【0009】

いくつかの態様において、ステップＩＩＩは、ｉ）ＴＣＲ鎖の配列を使用して、ＴＣＲα鎖ＤＮＡ断片およびＴＣＲβ鎖ＤＮＡ断片のライブラリーをそれぞれ別々に合成し、その後、１つのＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に連結すること（必要に応じて、ここで正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結される）、ｉｉ）正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結したＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を直接合成することによって、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の組み合わせを生成すること、または、ｉｉｉ）細胞が１つのＴＣＲα鎖と１つのＴＣＲβ鎖を発現するように、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターの形でコードされたＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子の別々のコレクションで細胞プールを修飾することによって、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の組み合わせを細胞内で作製すること、（ｉｖ）ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の組み合わせを、両ＴＣＲ鎖断片とＣＤ３ζもしくはＣＤ３εシグナルドメインを単独でまたはＣＤ２８シグナルドメインとの組み合わせで含む一本鎖ＴＣＲ構築物に連結すること、のうちの少なくとも１つによって達成される。いくつかの態様では、正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結したＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を直接合成することにより、インシリコでランダムペアリングを実施し、得られたすべての組み合わせを１つのＤＮＡ断片として合成する必要性が排除される。いくつかの態様において、ステップＩＶは、ｉ）生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞またはＴ細胞のプールを、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲ単離用の少なくとも１つの活性化マーカーに基づいて、抗原反応性のレポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；ｉｉ）生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞またはＴ細胞のプールを細胞増殖を追跡するのに適した蛍光色素で標識し、少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲ単離用の増殖性に基づいて抗原反応性のレポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；ｉｉｉ）生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞またはＴ細胞のプールを少なくとも２つの試料に分け；試料をそれぞれ、少なくとも１つの目的の抗原を発現しているかまたは発現していない抗原提示細胞によって刺激し；刺激後、レポーター細胞またはＴ細胞集団の両方を一定期間インキュベートし、次いで、レポーター細胞またはＴ細胞集団の両方をＴＣＲ単離によって分析し；両方の試料から得られたＴＣＲαβ対を比較することで、少なくとも１つの抗原に暴露された試料においてより豊富に含まれているＴＣＲ遺伝子を特定すること；ｉｖ）生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞またはＴ細胞のプールを、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲの誘発を示す少なくとも１つのレポーター遺伝子、例えばＮＦＡＴ－ＧＦＰまたはＮＦＡＴ－ＹＦＰに基づいて、抗原反応レポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；ｖ）生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞またはＴ細胞のプールを、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞を、ＴＣＲのシグナル伝達に際して獲得される抗生物質耐性に基づく抗原特異的レポーター細胞またはＴ細胞の選択に基づいて、例えばＮＦＡＴ－ピューロマイシン導入遺伝子を使用することによって、ＴＣＲ単離用に単離すること；ｖｉ）生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞またはＴ細胞のプールを、目的の抗原を担持する１つ以上のＭＨＣ複合体に曝露し；ＴＣＲ単離用に、ＭＨＣ複合体に結合したレポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；ｖｉｉ）生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞またはＴ細胞のプールを、少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激し；その後、単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体的手法を使用して目的のＴＣＲαβ対を同定し、ＴＣＲ単離と少なくとも１つの活性化マーカーの転写レベルでの検出とを組み合わせ；それにより、ＴＣＲαβの転写物が活性化マーカーのレベルの上昇と共発現するレポーター細胞またはＴ細胞のプールに含まれる単一のレポーター細胞またはＴ細胞を検出すること、のうちの少なくとも１つによって達成される。いくつかの態様において、ステップｉ～ｖｉにおけるＴＣＲ単離は、（ｉ）バルクの抗原反応性レポーター細胞もしくはＴ細胞からＤＮＡもしくはＲＮＡを単離してＴＣＲαβ特異的ＰＣＲ産物を生成し、これをＤＮＡ配列決定によって分析して、抗原反応性レポーター細胞もしくはＴ細胞のＴＣＲαβ遺伝子配列を決定すること、または（ｉｉ）単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲもしくは微少流体的手法によって、分析した単一のＴ細胞において発現するＴＣＲαβ遺伝子配列を分析すること、によって達成することが可能である。いくつかの態様において、レポーター細胞はＴ細胞である。いくつかの態様において、レポーター細胞は、ＴＣＲの会合を監視する。いくつかの態様において、レポーター細胞のプールは、ＴＣＲα／βヌルの可能性がある。

【0010】

いくつかの態様において、対象の試料は、非生存性出発材料を含む。いくつかの態様では、回収されたＴＣＲレパトアの定義された部分が回収される。いくつかの態様において、定義されたまたは選択的な回収は、ａ）Ｔ細胞集団中での頻度に基づいて、ｂ）第二のＴ細胞集団との比較における相対的な濃縮度に基づいて、ｃ）所与のＴＣＲ鎖と比較してＤＮＡおよびＲＮＡのコピー数が異なることに基づいて、ｄ）ＴＣＲ鎖の生物学的特性であって、ここで特性が、（予測される）抗原特異性、（予測される）ＨＬＡ拘束性、親和性、共受容体依存性、親Ｔ細胞系列（例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８Ｔ細胞）、またはＴＣＲ配列モチーフのうちの少なくとも１つから選択される、ＴＣＲ鎖の生物学的特性に基づいて、ｅ）遺伝子発現の空間的パターンであって、ここで遺伝子発現の空間的パターンが組織内の起源領域または他の遺伝子の共発現パターンのうちの少なくとも１つに由来する、遺伝子発現の空間的パターンに基づいて、ｆ）例えば複数の腫瘍病変において出現しているなど、複数の試料において同様の頻度で共出現または出現していることに基づいて、ｇ）ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するための複数の群への選択に基づいて、異なる態様で定義したような複数の基準の組み合わせに基づいて、などを含むがこれらには限定されない基準に基づいて、検出されたＴＣＲ鎖の一部分のみまたは全体を選択することによって実施される。いくつかの態様において、ＴＣＲ配列の選択的な回収とは、特定のＶ遺伝子セグメントを含むＴＣＲ配列の回収を指す。

【0011】

いくつかの態様では、抗原特異的ＴＣＲ配列が回収される。いくつかの態様では、治療用ＴＣＲ配列が回収される。いくつかの態様では、腫瘍反応性ＴＣＲ配列が回収される。いくつかの態様では、新生抗原特異的ＴＣＲ配列が回収される。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法はさらに、新生抗原特異的ＴＣＲ配列を発現しているＴ細胞を癌治療として投与する工程を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、診断のためのものである。いくつかの態様において、診断は、感染症または自己免疫疾患の病的部位からＴＣＲレパトアを回収することである。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、ＢＣＲ／抗体レパトアを回収するためのものである。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法はさらに、ＴＣＲαおよびβのヌクレオチド配列を含む核酸を対象から単離することを含む。いくつかの態様において、活性化マーカーは、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞活性化マーカーである。任意のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞活性化マーカーを使用することができる。本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、活性化マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦからなる群より選択される。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法において、ＤＮＡおよびＲＮＡは、異なる細胞型の混合物または組織試料の一部（血液または腫瘍組織等）であるＴ細胞集団から単離される。いくつかの態様において、対象の試料は、体液から単離された細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は、腫瘍特異的Ｔ細胞である。いくつかの態様において、体液は、血液、尿、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、喀痰、粘膜分泌物、膣液、腹水、胸水、心嚢液、腹膜液、および腹腔液からなる群より選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法はさらに、ＴＣＲαβ鎖配列を使用して、癌、免疫学的障害、自己免疫疾患、または感染症に罹患している対象を治療することを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法のステップＩＶは、（ｉ）少なくとも１つの活性化マーカーに基づく同定または選択；（ｉｉ）抗原に応答した増殖に基づく同定または選択；（ｉｉｉ）非刺激細胞と比較して抗原刺激細胞においてより豊富に含まれているＴＣＲ遺伝子を同定することに基づく同定または選択；（ｉｖ）ＴＣＲの誘発によるレポーター遺伝子の活性化に基づく同定または選択；（ｖ）ＴＣＲのシグナル伝達に際して獲得される抗生物質耐性を含むがこれに限定されない、選択的生存に基づく同定または選択；（ｖｉ）１つ以上のＭＨＣ複合体への結合に基づく同定または選択；（ｖｉｉ）単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体技術を用いた同定または選択；あるいはこれらの任意の組み合わせ；のうちの少なくとも１つによって達成される。いくつかの態様において、ステップ（ｖｉｉ）は、活性化関連遺伝子の共発現を決定することをさらに含む。

【0012】

本明細書では、いくつかの態様において、複数のＴ細胞ライブラリーを作製する方法を開示し、この方法は、（ａ）本明細書に記載の方法に従ってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収すること；（ｂ）ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するために、全レパトアからＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を複数の群に選択すること；を含み、ここで複数のＴ細胞ライブラリーは、より複雑度が小さい、またはＴＣＲレパトアの特定の部分を回収するものとして作製される。いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列は、頻度範囲に基づいて選択される。

【0013】

本明細書では、いくつかの態様において、複数のＴ細胞ライブラリーを作製する方法を説明し、この方法は、（ａ）本明細書に記載の方法に従ってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収すること；（ｂ）ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するために、全レパトアからＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を複数の群に選択すること；を含み、ここで複数のＴ細胞ライブラリーは、より複雑度が小さい、またはＴＣＲレパトアの特定の部分を回収するものとして作製される。

【0014】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列は、頻度範囲に基づいて選択される。

【0015】

本明細書では、記載のいくつかの態様において、多様なＴ細胞集団からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収するための方法を説明し、この方法は、Ｉ）対象の試料に含まれるＴＣＲαおよびＴＣＲβのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定すること、ＩＩ）レパトア全体から、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のサブセットを１つ以上選択すること、ＩＩＩ）ＴＣＲαβ対のライブラリーを形成する選択したＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによって、ＴＣＲレパトアを作製すること、ならびに、ＩＶ）作製したＴＣＲレパトアから、所望の特徴を有するＴＣＲαとβの対を少なくとも１つ同定すること、を含む。

【0016】

いくつかの態様では、核酸のコンビナトリアルライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、複数のバリアント核酸を含むコンビナトリアルライブラリーを提供することを含み、複数のバリアント核酸はそれぞれ、少なくとも６００ｂｐの連続部分を含む。方法はさらに、複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成された細胞の集団に、ライブラリーを導入することを含む。方法はさらに、少なくとも６００ｂｐの連続部分に依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて細胞集団の亜集団を選択することを含み、ここで亜集団は、複数の細胞を含む。方法はさらに、亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離することを含む。方法はさらに、サブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定することを含む。方法はさらに、ヌクレオチド配列に基づいて、少なくとも６００ｂｐの連続部分を同定することを含む。いくつかの態様において、この方法は、少なくとも６００ｂｐの連続部分が６００塩基対全体に分布しているものでもあり得る。

【0017】

いくつかの態様において、方法は、以下に説明するステップ（１）～（７）の１つ以上を含む場合がある。ステップ（１）試料を取得する。試料は、感染症、自己免疫疾患、または癌を患っている患者に由来する組織、血液、または体液であってよい。試料は生存細胞であっても非生存細胞であってもよい。ステップ（２）試料に含まれるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の配列を決定する。ステップ（３）ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製するために、ＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を選択し、コンビナトリアルペアリングを行う。ステップ（４）ＴＣＲαβ対のライブラリーをレポーター細胞のプール、例えばジャーカットレポーターＴ細胞のプールに導入する。ステップ（５）ＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞を、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞で刺激する。少なくとも１つの目的の抗原は、自己由来であっても同種異系であってもよい。ステップ（６）少なくとも１つの目的の抗原に特異的なＴＣＲαβ対を決定する。ステップ（７）ＴＣＲαβ対を細胞に導入し、ＴＣＲαβ対を含む細胞を選択する。いくつかの態様において、方法は、前述したステップ（１）～（７）のうちの１つ以上を含み得る。いずれのステップも、適宜、本明細書で提供される他の態様によって省略、反復、または置換することができる。また、その他の介在するステップを追加することも可能である。

【0018】

いくつかの態様は、前述した態様のいずれか１つに従って回収されるＴ細胞受容体のレパトアを含むヌクレオチドライブラリーに関する。いくつかの態様において、ヌクレオチド構築物は、前述した態様のいずれか１つに従って同定されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、細胞は、本明細書に記載のヌクレオチド構築物を含む。

【0019】

いくつかの態様では、多様なＴ細胞集団からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収する方法が提供される。この方法は、対象の試料に含まれるＴＣＲαおよびＴＣＲβのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定すること；ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットを全レパトアから選択すること；ＴＣＲαβ鎖のライブラリーを形成する選択したＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによって、ＴＣＲレパトアを作製すること；所望の特徴を有する少なくとも１つのＴＣＲαβ対を、作製したＴＣＲレパトアから同定すること、を含む。いくつかの態様では、複数のＴ細胞ライブラリーを作製する方法が提供される。この方法は、前述の方法に従ってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収すること；ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するために、全レパトアからＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を複数の群に選択すること、を含み、ここで複数のＴ細胞ライブラリーは、より複雑度が小さい、またはＴＣＲレパトアの特定の部分を回収するものとして作製される。

【0020】

いくつかの態様では、核酸のコンビナトリアルライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、複数のバリアント核酸を含むコンビナトリアルライブラリーを提供することを含み、複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで、連続部分は２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列を含み、ここで、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの第一のバリアントヌクレオチド部分配列は、連続部分の第一の末端を規定し、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの第二のバリアントヌクレオチド部分配列は、第一の末端とは反対側にある、連続部分の第二の末端を規定し；複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成された細胞の集団に、ライブラリーを導入すること；２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせに依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて細胞集団の亜集団を選択すること、ここで亜集団は複数の細胞を含み；亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；サブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、ヌクレオチド配列に基づいて、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること；を含む。

【0021】

いくつかの態様では、核酸のコンビナトリアルライブラリーからＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供することを含み、複数のバリアント核酸はそれぞれ、少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み；ここで連続部分は、ＴＣＲαのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、連続部分の第一の末端を規定する第一のバリアントヌクレオチド部分配列とＴＣＲβのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、第一の末端とは反対側にある連続部分の第二の末端を規定する第二のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを含む。方法はさらに、複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現するように構成された不死化Ｔ細胞の集団に、ライブラリーを導入することを含む場合がある。方法はさらに、不死化Ｔ細胞と抗原を発現している不死化Ｂ細胞との接触に応答して閾値を超えるＴ細胞活性化マーカーの発現に基づいて、不死化Ｔ細胞の集団の亜集団を選択することを含む場合があり、ここで亜集団は複数のＴ細胞を含む。方法はさらに、亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離することを含む場合がある。方法はさらに、サブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、サブセットのヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、第一と第二のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定することを含む場合がある。

【0022】

いくつかの態様では、核酸のコンビナトリアルライブラリーからキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞内シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供することを含む場合があり、複数のバリアント核酸はそれぞれ、少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで、連続部分は、ＣＡＲヒンジドメインをコードしている第一のバリアントヌクレオチド部分配列、ＣＡＲ膜貫通ドメインをコードしている第二のバリアントヌクレオチド部分配列、およびＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインをコードしている第三のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの２つ以上の組み合わせを含む。第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの１つは連続部分の第一の末端を規定し、およびここで、第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列の別の１つは、第一の末端の反対側にある連続部分の第二の末端を規定する。方法はさらに、複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＣＡＲを発現するように構成された細胞の集団に、ライブラリーを導入することを含む場合がある。細胞の集団は、不死化Ｔ細胞または初代ヒトＴ細胞の集団を含む。本方法はさらに、細胞とＣＡＲの抗原結合ドメインに特異的な抗原を発現している抗原提示細胞とを接触させることに応答して閾値を超える細胞増殖に基づいて、細胞の集団の亜集団を選択することを含む場合があり、ここで亜集団は複数の細胞を含む。方法はさらに、亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離することを含む場合がある。方法はさらに、サブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、サブセットのヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、第一、第二、および第三のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定することを含む場合がある。

【0023】

いくつかの態様では、核酸のコンビナトリアルライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、複数のバリアント核酸を含むコンビナトリアルライブラリーを提供すること、複数のバリアント核酸はそれぞれ、少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み；複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成された細胞の集団に、ライブラリーを導入すること；少なくとも６００ｂｐの連続部分に依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて細胞集団の亜集団を選択すること、ここで亜集団は複数の細胞を含み；亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；サブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、ヌクレオチド配列に基づいて、少なくとも６００ｂｐの連続部分を同定すること、を含む場合がある。

【0024】

いくつかの態様では、核酸のライブラリーから抗原特異的Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖とＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団にライブラリーを導入すること、抗原に応答して閾値を超えるマーカーの発現に基づいて、細胞集団の亜集団を選択することを含み、ここで亜集団は複数の細胞を含む。方法はさらに、亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離することを含む場合がある。方法はさらに、バリアント核酸のヌクレオチド配列を決定すること、および、サブセットに含まれるヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて少なくとも１つのバリアント核酸配列を同定すること、を含む場合がある。

【0025】

いくつかの態様では、試料からＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、試料に含まれるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の配列を決定すること；ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製するために、ＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を選択し、コンビナトリアルペアリングを行うこと；ライブラリーをレポーター細胞のプールに導入すること；ＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞を、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞で刺激すること（ここで抗原は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が由来するのと同じ宿主由来であり得る）；少なくとも１つの目的の抗原に特異的なＴＣＲαβ対を決定すること；および、ＴＣＲαβ対を細胞に導入し、ＴＣＲαβ対を含む細胞を選択すること；を含む場合がある。

【0026】

いくつかの態様では、前述した方法のいずれか１つに従って回収されたＴ細胞受容体のレパトアを含むヌクレオチドライブラリーが提供される。

【0027】

いくつかの態様では、本明細書の方法のいずれか１つに従って同定されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物が提供される。

【0028】

いくつかの態様では、本明細書で提供される任意のヌクレオチド配列に従うヌクレオチド構築物を含む細胞が提供される。

【0029】

いくつかの態様では、核酸のライブラリーから抗原特異的Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖とＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に核酸ライブラリーを導入して細胞のライブラリーを作製すること；抗原に応答して第一の閾値を超えるマーカーの発現に基づいて、細胞のライブラリーの第一の集団を選択すること；および、ライブラリーの第一の集団からバリアント核酸の第一の集団を単離すること、を含む場合がある。いくつかの態様では、抗原は１つ以上であってもよく、また、抗原、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖の配列の全てが単一の対象で見出されるものであってもよい。

【0030】

いくつかの態様では、核酸のライブラリーからＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖とＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に核酸ライブラリーを導入して細胞のライブラリーを作製すること；および、サブセットに含まれるヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて、バリアント核酸の第一の集団の少なくとも１つのヌクレオチド配列または核酸の同一性を同定すること、を含む場合がある。

【0031】

いくつかの態様では、核酸のライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、核酸のライブラリーを細胞の集団に導入して細胞ライブラリーを作製すること；細胞ライブラリーを細胞の第一の集団と接触させること；磁気ビーズ濃縮により、少なくとも１つのマーカーの発現に基づいて、細胞ライブラリーの亜集団を選択すること；および、亜集団に含まれるヌクレオチド配列が対照との比較において有意に濃縮されていることまたは枯渇していることに基づいて、少なくとも１つのヌクレオチド配列を決定すること、を含む場合がある。

【0032】

いくつかの態様では、細胞のコレクションが提供される。このコレクションは、少なくとも２つのＴ細胞のセットであって、ここで少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ少なくとも１つのＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここでＴＣＲαおよびＴＣＲβのそれぞれは対象に由来し、ここでＴ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、およびここでセットは１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されている、少なくとも２つのＴ細胞のセットと；少なくとも２つのＢ細胞のセットであって、ここで少なくとも２つのＢ細胞はそれぞれ少なくとも１つの外因性新生抗原（または抗原）を発現するように構成されており、その結果、少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が産生可能になり、およびここで少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）は、対象内におけるものと同じである、少なくとも２つのＢ細胞のセット、を含む。

【0033】

いくつかの態様では、ＴＣＲ発現細胞のライブラリーが提供される。ＴＣＲ発現細胞のライブラリーは、少なくとも３つのＴ細胞のセットであって、ここでＴ細胞のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つのＴＣＲαとＴＣＲβの対（少なくとも２つのＴＣＲ対）を発現するように構成されており、ここで少なくとも２つのＴＣＲ対は一人の対象に由来し、ここで少なくとも３つのＴ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、ここで少なくとも３つのＴ細胞は、Ｂ細胞によって提示された抗原（または新生抗原）への結合に際して、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されており、ここでＴＣＲ細胞の数に反映される各ＴＣＲ対のゲノムコピー量から、試料に含まれる全てのＴＣＲのリードを得られ、およびここでＴＣＲのうちの少なくとも１つが、ライブラリーを含む組成物全体に均等に分布していない、少なくとも３つのＴ細胞のセットを含む。

【0034】

いくつかの態様では、対象を治療する方法が提供される。この方法は、腫瘍を有する対象を特定すること；少なくとも２つのＴ細胞のセットを提供すること、少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ、少なくとも１つの異なるＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここでそれぞれのＴＣＲαおよびＴＣＲβは対象に由来し、少なくとも２つのＢ細胞のセットを提供すること、ここでＢ細胞のセットは少なくとも２つの外因性新生抗原を発現するように構成されており、ここで少なくとも２つの外因性新生抗原は、対象内で見出されるものと同じであり；少なくとも２つのＴ細胞のセットと少なくとも２つのＢ細胞のセットを組み合わせ、少なくとも２つの外因性新生抗原を介した少なくとも２つのＴ細胞の活性化に基づいて、少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを選択すること；および少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを対象に投与し、それによって腫瘍を治療すること、を含む。

【0035】

いくつかの態様では、対象を治療する方法が提供される。この方法は、腫瘍を有する対象を特定すること；少なくとも２つのＴ細胞のセットを提供すること、少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ、少なくとも１つの異なるＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここでそれぞれのＴＣＲαおよびＴＣＲβは対象に由来し；少なくとも２つの抗原提示細胞のセットを提供すること、ここで抗原提示細胞のセットは対象に由来するものであって、少なくとも２つの外因性新生抗原を発現するように構成されており、ここで少なくとも２つの外因性新生抗原は、対象内で見出される新生抗原と同じであり；少なくとも２つのＴ細胞のセットと少なくとも２つの抗原提示細胞のセットを組み合わせ、少なくとも２つの外因性新生抗原を介した少なくとも２つのＴ細胞の活性化に基づいて、少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを選択すること；および少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを対象に投与し、それによって腫瘍を治療すること、を含む。

【0036】

いくつかの態様では、医薬組成物が提供される。組成物は、対象の腫瘍中に存在する第一の抗原（または新生抗原）に結合する第一のＴＣＲ対と、対象の腫瘍中に存在する第二の抗原（または新生抗原）に結合する第二のＴＣＲ対とを含む可能性がある。

【0037】

いくつかの態様では、医薬組成物が提供される。組成物は、第一の抗原に結合し、かつ、ＭＨＣクラスＩ拘束性である第一のＴＣＲ対と、第二の抗原に結合し、かつ、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性である第二のＴＣＲ対とを含む可能性がある。

【0038】

いくつかの態様では、細胞のコレクションが提供される。このコレクションは、少なくとも２つのＴ細胞のセットであって、ここで、少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ少なくとも１つのＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここで対は対象に由来し、ここでＴ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、およびここでセットは１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されている、少なくとも２つのＴ細胞のセットと；少なくとも２つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）細胞のセットであって、ここで、少なくとも２つのＡＰＣはそれぞれ少なくとも１つの外因性新生抗原（または抗原）を発現するように構成されており、その結果、少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が産生可能になり、およびここで少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）は、対象内におけるものと同じである、少なくとも２つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）細胞のセット、を含む場合がある。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】ライブラリー生成用にＴＣＲレパトアを回収する方法の概略を示す。

【図2】癌治療での活用に向けて、ＴＣＲレパトアを回収し、抗原特異的ＴＣＲα配列およびＴＣＲβ配列を同定する方法の概略を示す。

【図3】ＴＣＲ発現カセットの例示的な設計を示す。

【図4】コンビナトリアルＴＣＲライブラリーのスクリーニングに関するいくつかの態様を示す。

【図5】本明細書で開示する、癌患者の治療に関する適用過程の例を示す。

【図6】ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性カセットの模式図を示す。

【図7】ＴＣＲ発現カセットを組み立てるための計画例を示す。

【図8】本開示の態様に従うスクリーニング方法の模式図を示す。

【図9】本開示の態様に従うスクリーニング方法のフローチャートを示す。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｊでは、新生抗原特異的ＴＣＲ配列を同定するための、非生存腫瘍標本からのＴＣＲレパトアの回収を図示する。図１０Ａは、スクリーニングプロセスのいくつかの態様の模式図である。

【図10B】ＴＣＲクローン型の数を示すグラフである。

【図10C】１０，０００個のＴＣＲαとβの組み合わせそれぞれの確率密度を示すグラフである。

【図10D】ブラストサイジン選択前後の細胞集団を示すプロットである。

【図10E】図中に示す種々のマーカーを使用した一連のＦＡＣＳの結果である。

【図10F】様々なＰＣＲ産物を示すゲルである。

【図10G】Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）および非存在下（ｙ軸）におけるスクリーニングの平均Ｒｌｏｇ変換リードカウントを示す一連のプロットであり、１０Ｂ～１０Ｆに記載のｐｔ１腫瘍試料、ならびに同一の方法で処理した３つの追加のＭＭＲｐ－ＣＲＣ試料（ｐｔ２、ｐｔ３およびｐｔ４）について示している。新生抗原反応性のＴＣＲリード化合物は、円で囲んだより大きな黒点として示した。

【図10H】ステップ１０Ｈを示すプロットである。

【図10I】陽性対照（ＰＭＡ／イオノマイシンによる処理）と比較した場合に、ＣＤ６９陽性として測定される活性化を示すグラフである。対照（ＰＡＲＶＡ－Ｐ７０Ｒ）、ならびにＡＫＡＰ８Ｌ－Ｒ１９１Ｗペプチドによる活性化を示している。

【図10J】陽性対照（ＰＭＡ／イオノマイシンによる処理）と比較した場合に、ＣＤ６９陽性として測定される活性化を示すグラフである。対照（ＥＴＳ１－Ｒ７０Ｗ）、ならびにＴＰ５３－Ｒ２８２Ｗペプチドによる活性化を示している。

【図10K】陽性対照（ＰＭＡ／イオノマイシンによる処理）と比較した場合に、ＣＤ６９陽性として測定される活性化を示すグラフである。対照のＢ細胞（ＴＭＧを発現していない）、ならびにＭＧ９１（ＨＳＰＡ９－ｐ．Ｋ６５４ＲｆｓＸ４２）またはＴＭＧ３を発現しているＢ細胞による活性化を示している。

【図10L】陽性対照（ＰＭＡ／イオノマイシンによる処理）と比較した場合に、ＣＤ６９陽性として測定される活性化を示すグラフである。対照のＢ細胞（ＴＭＧを発現していない）、ならびにＭＧ１３２（ＩＴＰＲ３－ｐ．Ｌ２３７９Ｍ）またはＴＭＧ４を発現するＢ細胞による活性化を示している。

【図11A】ＴＣＲのクローン型の数を示す棒グラフである。

【図11B】ＴＣＲ発現プラスミドの模式図である。

【図11C】各患者ライブラリーにおける１０，０００個のＴＣＲαとβの組み合わせそれぞれの確率密度を示すグラフである。

【図11D】各ＴＣＲあたりのリード量の範囲、平均カバー数、および中央値±ａ^２ｌｏｇ単位の範囲内にあるＴＣＲの割合を示す。

【図12A】ＴＣＲのクローン型の数を示す棒グラフである。

【図12B】２つの患者ライブラリーにおける１０，０００個のＴＣＲαとβの組み合わせそれぞれの確率密度を示すグラフである。

【図12C】１０，０００個のＴＣＲαとβの組み合わせそれぞれのカバー数を示す表である。

【図13A】未知の抗原特異性を有する２４のＴＣＲのうち、既知の抗原特異性を有する６つのＴＣＲの希釈倍率を示す表である。

【図13B】選択後のＴＣＲ陽性ジャーカットレポーター細胞の頻度を示すＦＡＣＳの結果である。

【図13C】ＣＤ６９活性化マーカーに基づく上位および下位Ｔ細胞集団の選別戦略を示すＦＡＣＳプロットである。

【図13D】様々なＰＣＲ産物を示すゲルである。

【図13E】既知の抗原特異性を有するＴＣＲと未知の抗原特異性を有するＴＣＲの、濃縮度と頻度を比較したグラフである。

【図14A】特徴が分かっているＴＣＲ鎖を添加した５０×５０および１００×１００の設計のフローチャートである。

【図14B】ＣＤ６９活性化マーカーに基づく上位および下位Ｔ細胞集団の選別戦略を示す複数のＦＡＣＳプロットである。

【図14C】様々なＰＣＲ産物を示すゲルである。

【図14D】上位試料対下位試料におけるＴＣＲ表現の倍率変化を、これらの試料における平均的な発現と比較して示すプロットである。

【図14E】最も濃縮されたＴＣＲ配列の順位と、そのようなＴＣＲの基準平均、Ｌｏｇ（２）倍率変化および補正後のｐ値を示す表である。

【図14F】抗原非存在下でのＴＣＲ反応性と抗原存在下でのＴＣＲ反応性とを比較するプロットである。

【図14G】スクリーニングにおいて濃縮される抗原特異的ＴＣＲおよび特異性不明のＴＣＲの確率を示すグラフである。

【図15A】ＴＣＲカセットのコンビナトリアルアセンブリーを示す模式図である。

【図15B】ＴＣＲライブラリーにおけるＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖およびＴＣＲαβの組み合わせの確率密度を示す一連のグラフである。

【図15C】より複雑なＴＣＲライブラリーを作製するための別の計画を示すグラフである。

【図15D】より複雑なＴＣＲライブラリーを作製するための別の計画を示すグラフである。

【図15E】１００×１００のライブラリーを４つ合成し、これらを１：１：１：１の等モル比で混合することによって作製した２つの２００×２００ＴＣＲライブラリー中に存在するＴＣＲの組み合わせの確率密度を描写するグラフである。

【図15F】２００×２００ライブラリーのスクリーニング手法を用いて行った、ｐｔ２に含まれるＴＣＲの同定について示す図である。

【図15G】１００×１００スクリーニングで同定されたｐｔ２由来ＴＣＲの、１００×１００および２００×２００ライブラリースクリーニングの両方における統計的挙動を示す表である。

【図16A】ＣＤ６９陽性細胞の割合と、ＡＰＣを刺激するために使用したＣＭＶペプチドの量との関係を示すグラフである。

【図16B】ＣＤ６９陽性細胞割合と、細胞播種密度との関係を示す棒グラフである。

【図16C】ＣＤ６９陽性細胞割合と、エフェクター対標的比および培養容器との関係を示す棒グラフである。

【図16D】ＣＤ６９陽性細胞割合と、播種したエフェクター細胞の数および使用された抗原性ペプチドの量との関係を示す一連の棒グラフである。

【図16E】様々なＴＣＲに対する濃縮度の度合いを示す棒グラフである。

【図17A】ＣＤＫ４およびＣＭＶを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞によるペプチド滴定アッセイ。ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞に、ＣＤＫ４－８もしくはＣＤＫ４－１７ ＴＣＲ、またはＣＭＶ－１もしくはＣＭＶ－２ ＴＣＲレトロウイルスのいずれかを形質導入した。導入したＴＣＲは、マウス定常領域とヒト可変領域から構成される。次に、ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性の集団を選別した。上段は選別細胞、下段は選別後の細胞を示す。

【図17B】種々の濃度の同族ペプチド（ＣＤＫ４）を負荷したＪＹ細胞と２０時間、共培養した後に（Ｅ：Ｔ比は１：１）、ＣＤ６９の上方制御によって評価したＴＣＲ導入または非導入ジャーカット細胞の活性化。ＥＣ５０値はグラフ中に記載している。ＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激を陽性対照として用いた。また、ＪＹ細胞を添加しなかったものと、最高濃度（１ｍｇ／ｍｌ）の無関係なペプチドを加えたＪＹ細胞との共培養を陰性対照として用いた（各グラフの右側に示す）。アッセイは３つ組で行った（ＣＤＫ４変異ペプチドを導入しなかったジャーカット細胞については２つ組で行った）。データは平均±標準偏差を示す（エラーバーはペプチド滴定曲線にのみ示した）。ｎは１であり、ＮＴは非導入を示す。

【図17C】種々の濃度の同族ペプチド（ＣＭＶ）を負荷したＪＹ細胞と２０時間、共培養した後に（Ｅ：Ｔ比は１：１）、ＣＤ６９の上方制御によって評価したＴＣＲ導入または非導入ジャーカット細胞の活性化。ＥＣ５０値はグラフ中に記載している。ＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激を陽性対照として用いた。また、ＪＹ細胞を添加しなかったものと、最高濃度（１ｍｇ／ｍｌ）の無関係なペプチドを加えたＪＹ細胞との共培養を陰性対照として用いた（各グラフの右側に示す）。アッセイは３つ組で行った（ＣＤＫ４変異ペプチドを導入しなかったジャーカット細胞については２つ組で行った）。データは平均±標準偏差を示す（エラーバーはペプチド滴定曲線にのみ示した）。ｎは１であり、ＮＴは非導入を示す。

【図18A】異なる導入効率でＣＭＶ－１を導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞のブラストサイジン選択。ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞に、様々な量のＣＭＶ－１－ブラストサイジンレトロウイルス上清を形質導入し、様々な導入効率の導入細胞を得た。

【図18B】非導入およびＴＣＲ導入ジャーカット細胞を、ＣＤ８およびｍＴＣＲβで染色した。ＣＭＶ－１導入効率の異なるジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で播種し、種々の濃度のブラストサイジンで選抜した。４日後、ブラストサイジンを除去するか（「４日目にブラストサイジンを除去」と示す）、あるいは新しいブラストサイジンをそれぞれの濃度で添加する（「４日目に新しいブラストサイジンを添加」と示す）ことにより、細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で再び播種した。ブラストサイジン選択開始後６日目または７日目それぞれにおける全生細胞およびｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の増殖倍率。ｎは１であり、ＮＴは非導入を示す。

【図18C】非導入およびＴＣＲ導入ジャーカット細胞を、ＣＤ８およびｍＴＣＲβで染色した。ＣＭＶ－１導入効率の異なるジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で播種し、種々の濃度のブラストサイジンで選抜した。４日後、ブラストサイジンを除去するか（「４日目にブラストサイジンを除去」と示す）、あるいは新しいブラストサイジンをそれぞれの濃度で添加する（「４日目に新しいブラストサイジンを添加」と示す）ことにより、細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で再び播種した。それぞれ、ブラストサイジン選抜開始後６日または７日目のｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の割合。ｎは１であり、ＮＴは非導入を示す。

【図18D】非導入およびＴＣＲ導入ジャーカット細胞を、ＣＤ８およびｍＴＣＲβで染色した。ＣＭＶ－１導入効率の異なるジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で播種し、種々の濃度のブラストサイジンで選抜した。４日後、ブラストサイジンを除去するか（「４日目にブラストサイジンを除去」と示す）、あるいは新しいブラストサイジンをそれぞれの濃度で添加する（「４日目に新しいブラストサイジンを添加」と示す）ことにより、細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で再び播種した。ブラストサイジン選択開始後６日目または７日目それぞれにおける全生細胞およびｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の増殖倍率。ｎは１であり、ＮＴは非導入を示す。

【図18E】非導入およびＴＣＲ導入ジャーカット細胞を、ＣＤ８およびｍＴＣＲβで染色した。ＣＭＶ－１導入効率の異なるジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で播種し、種々の濃度のブラストサイジンで選抜した。４日後、ブラストサイジンを除去するか（「４日目にブラストサイジンを除去」と示す）、あるいは新しいブラストサイジンをそれぞれの濃度で添加する（「４日目に新しいブラストサイジンを添加」と示す）ことにより、細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で再び播種した。それぞれ、ブラストサイジン選抜開始後６日または７日目のｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の割合。ｎは１であり、ＮＴは非導入を示す。

【図19A】ジャーカット細胞とＡＰＣの共培養の拡張。（左図）各実験におけるエフェクタージャーカット細胞のＣＤ８とｍＴＣＲβの発現。ジャーカット細胞に１６のＴＣＲから構成されるＴＣＲライブラリーを形質導入した。１６のうちの４つは、ＴＭＧ２．１に含まれる抗原に特異的なものとした。（右図）ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬと２０時間、共培養を行った（Ｅ：Ｔ比は１：１、細胞密度は２．５×１０^６細胞／ｍｌとした）。陰性対照として非導入ＥＢＶ ＬＣＬを使用した。全生細胞とＣＤ６９陽性エフェクター細胞の割合とプロットした。どの条件を１１００ｒｐｍで１分間遠心沈殿したかを（短時間の遠心）緑色の文字で示している。使用した細胞の総数は以下の通りとした：０．５×１０^６細胞（９６ウェル）、≦２×１０^６細胞（１５／５０ｍｌのファルコンチューブそれぞれに、１．３／２×１０^６細胞）、１７０×１０^６細胞（ＧＭＰバッグ）。データは平均±標準偏差を示している。ｎ＝１。９６ウェルには丸底９６ウェルプレートを、ＧＭＰバッグはＭＡＣＳ ＧＭＰ細胞分化バッグ（Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｂａｇ）５００を使用した。^＊は、少ない生細胞に由来するデータである。

【図19B】ジャーカット細胞とＡＰＣの共培養の拡張。（左図）各実験におけるエフェクタージャーカット細胞のＣＤ８とｍＴＣＲβの発現。ジャーカット細胞にＣＤＫ４－１７ ＴＣＲを形質導入した。二重陰性の集団は、それらのＣＤ２０発現が低いことによってゲートアウトが不可能な、標的細胞である。（右図）ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬと２０時間、共培養を行った（Ｅ：Ｔ比は１：１、細胞密度は２．５×１０^６細胞／ｍｌとした）。陰性対照として非導入ＥＢＶ ＬＣＬを使用した。全生細胞とＣＤ６９陽性エフェクター細胞の割合とプロットした。どの条件を１１００ｒｐｍで１分間遠心沈殿したかを（短時間の遠心）緑色の文字で示している。使用した細胞の総数は以下の通りとした：０．５×１０^６細胞（９６ウェル）、≦２×１０^６細胞（１５／５０ｍｌのファルコンチューブそれぞれに、１．３／２×１０^６細胞）、１７０×１０^６細胞（ＧＭＰバッグ）。データは平均±標準偏差を示している。ｎ＝１。９６ウェルには丸底９６ウェルプレートを、ＧＭＰバッグはＭＡＣＳ ＧＭＰ細胞分化バッグ５００を使用した。^＊は、少ない生細胞に由来するデータである。

【図19C】ジャーカット細胞とＡＰＣの共培養の拡張。（左図）各実験におけるエフェクタージャーカット細胞のＣＤ８とｍＴＣＲβの発現。ジャーカット細胞にＣＤＫ４－１７ ＴＣＲを形質導入した。二重陰性の集団は、それらのＣＤ２０発現が低いことによってゲートアウトが不可能な、標的細胞である。（右図）ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬと２０時間、共培養を行った（Ｅ：Ｔ比は１：１、細胞密度は２．５×１０^６細胞／ｍｌとした）。陰性対照として非導入ＥＢＶ ＬＣＬを使用した。全生細胞とＣＤ６９陽性エフェクター細胞の割合とプロットした。どの条件を１１００ｒｐｍで１分間遠心沈殿したかを（短時間の遠心）緑色の文字で示している。使用した細胞の総数は以下の通りとした：０．５×１０^６細胞（９６ウェル）、≦２×１０^６細胞（１５／５０ｍｌのファルコンチューブそれぞれに、１．３／２×１０^６細胞）、１７０×１０^６細胞（ＧＭＰバッグ）。９６ウェルの共培養は三つ組で行った。データは平均±標準偏差を示している。ｎ＝１。９６ウェルには丸底９６ウェルプレートを、ＧＭＰバッグはＭＡＣＳ ＧＭＰ細胞分化バッグ５００を使用した。^＊は、少ない生細胞に由来するデータである。

【図19D】ジャーカット細胞とＡＰＣの共培養の拡張。（左図）各実験におけるエフェクタージャーカット細胞のＣＤ８とｍＴＣＲβの発現。ジャーカット細胞にＣＤＫ４－１７ ＴＣＲを形質導入した。（右図）ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬと２０時間、共培養を行った（Ｅ：Ｔ比は１：１、細胞密度は２．５×１０^６細胞／ｍｌとした）。陰性対照として非導入ＥＢＶ ＬＣＬを使用した。全生細胞とＣＤ６９陽性エフェクター細胞の割合とプロットした。どの条件を１１００ｒｐｍで１分間遠心沈殿したかを（短時間の遠心）緑色の文字で示している。使用した細胞の総数は以下の通りとした：０．５×１０^６細胞（９６ウェル）、≦２×１０^６細胞（１５／５０ｍｌのファルコンチューブそれぞれに、１．３／２×１０^６細胞）、１７０×１０^６細胞（ＧＭＰバッグ）。（１９ｄ）９６ウェルの共培養は二つ組で行った。データは平均±標準偏差を示している。ｎ＝１。９６ウェルには丸底９６ウェルプレートを、ＧＭＰバッグはＭＡＣＳ ＧＭＰ細胞分化バッグ５００を使用した。^＊は、少ない生細胞に由来するデータである。

【図20A】Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの経時的分析。ＣＤＫ４－８またはＣＭＶ－１ ＴＣＲを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が８０％超）を、ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬの存在下（ＣＤＫ４－８：丸、ＣＭＶ－１：三角）、または非存在下（ＣＤＫ４－８：四角、ＣＭＶ－１：逆三角）で、１６、２０、２４、２８、３２時間、Ｅ：Ｔ比１：１で培養した。その後、エフェクター細胞におけるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの発現をマルチカラーフローサイトメトリーで分析した。ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬと共培養した非導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を陰性対照として用いた（菱形）。代表として示したそれぞれのドットプロットは、ＣＤＫ４－８導入ジャーカット細胞とＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬとを２０時間の共培養した結果である。エフェクター細胞におけるＣＤ６９の上方制御を示す。共培養は三つ組で行った（平均±標準偏差を示す）。ｎ＝１、ＮＴは非導入を表す。

【図20B】Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの経時的分析。ＣＤＫ４－８またはＣＭＶ－１ ＴＣＲを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が８０％超）を、ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬの存在下（ＣＤＫ４－８：丸、ＣＭＶ－１：三角）、または非存在下（ＣＤＫ４－８：四角、ＣＭＶ－１：逆三角）で、１６、２０、２４、２８、３２時間、Ｅ：Ｔ比１：１で培養した。その後、エフェクター細胞におけるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの発現をマルチカラーフローサイトメトリーで分析した。ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬと共培養した非導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を陰性対照として用いた（菱形）。代表として示したそれぞれのドットプロットは、ＣＤＫ４－８導入ジャーカット細胞とＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬとを２０時間の共培養した結果である。エフェクター細胞におけるＣＤ２５の上方制御を示す。共培養は三つ組で行った（平均±標準偏差を示す）。ｎ＝１、ＮＴは非導入を表す。

【図20C】Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの経時的分析。ＣＤＫ４－８またはＣＭＶ－１ ＴＣＲを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が８０％超）を、ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬの存在下（ＣＤＫ４－８：丸、ＣＭＶ－１：三角）、または非存在下（ＣＤＫ４－８：四角、ＣＭＶ－１：逆三角）で、１６、２０、２４、２８、３２時間、Ｅ：Ｔ比１：１で培養した。その後、エフェクター細胞におけるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの発現をマルチカラーフローサイトメトリーで分析した。ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬと共培養した非導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を陰性対照として用いた（菱形）。代表として示したそれぞれのドットプロットは、ＣＤＫ４－８導入ジャーカット細胞とＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬとを２０時間の共培養した結果である。ＣＤ６９とＣＤ２５との共発現分析。共培養は三つ組で行った（平均±標準偏差を示す）。ｎ＝１、ＮＴは非導入を表す。

【図20D】Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの経時的分析。ＣＤＫ４－８またはＣＭＶ－１ ＴＣＲを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が８０％超）を、ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬの存在下（ＣＤＫ４－８：丸、ＣＭＶ－１：三角）、または非存在下（ＣＤＫ４－８：四角、ＣＭＶ－１：逆三角）で、１６、２０、２４、２８、３２時間、Ｅ：Ｔ比１：１で培養した。その後、エフェクター細胞におけるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの発現をマルチカラーフローサイトメトリーで分析した。ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬと共培養した非導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を陰性対照として用いた（菱形）。代表として示したそれぞれのドットプロットは、ＣＤＫ４－８導入ジャーカット細胞とＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬとを２０時間の共培養した結果である。エフェクター細胞におけるＣＤ６２Ｌの下方制御を示す。共培養は三つ組で行った（平均±標準偏差を示す）。ｎ＝１、ＮＴは非導入を表す。

【図20E】Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの経時的分析。ＣＤＫ４－８またはＣＭＶ－１ ＴＣＲを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が８０％超）を、ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬの存在下（ＣＤＫ４－８：丸、ＣＭＶ－１：三角）、または非存在下（ＣＤＫ４－８：四角、ＣＭＶ－１：逆三角）で、１６、２０、２４、２８、３２時間、Ｅ：Ｔ比１：１で培養した。その後、エフェクター細胞におけるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの発現をマルチカラーフローサイトメトリーで分析した。ＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬと共培養した非導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を陰性対照として用いた（菱形）。代表として示したそれぞれのドットプロットは、ＣＤＫ４－８導入ジャーカット細胞とＴＭＧ２．１を発現しているＥＢＶ ＬＣＬとを２０時間の共培養した結果である。ＣＤ６９とＣＤ６２Ｌとの共発現分析。共培養は三つ組で行った（平均±標準偏差を示す）。ｎ＝１、ＮＴは非導入を表す。

【図21A】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ピューロマイシン耐性遺伝子を持つ、ＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスベクターの有効性の評価。ピューロマイシン耐性カセットを有する４つのＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスプラスミドの模式図である。

【図21B】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ピューロマイシン耐性遺伝子を持つ、ＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスベクターの有効性の評価。形質移入試薬としてＰＥＩを使用することにより、４つのベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。形質移入効率の指標として、追加のプラスミド（ｐｍａｘＧＦＰ）を共に導入した。ドットプロットは、形質移入後３日目の形質移入しなかったＨＥＫ２９３Ｔ細胞と形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ＧＦＰの発現を示す。ｎ＝１、ＮＴは非導入を表す。

【図21C】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ピューロマイシン耐性遺伝子を持つ、ＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスベクターの有効性の評価。レンチウイルス上清をポリブレンと組み合わせて使用し、ジャーカット ＴＣＲ ＫＯ細胞に導入した。ジャーカット細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで２４時間刺激し、その後、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで３日間選択した。ドットプロットは、非導入および導入されたジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞での、生細胞（ＤＡＰＩ陰性）およびＣＤ６９陽性の割合を示す。ｎ＝１、ＮＴは非導入を表す。

【図21D】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ピューロマイシン耐性遺伝子を持つ、ＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスベクターの有効性の評価。導入後、ピューロマイシンで選択した細胞を、２回目の２４時間ＰＭＡ／イオマイシン刺激に供するために２０日間増殖させ、その後、様々な濃度のピューロマイシンを用いて、４日間のピューロマイシン選択を行った。生細胞（ＤＡＰＩ陰性）とＣＤ６９陽性細胞の割合をプロットする。ＮＴ細胞は、図２１ＣのＮＴ細胞とは異なることに注意されたい。ｎ＝１、ＮＴは非導入を表す。

【図22A】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ＥＧＦＰーＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスベクターの有効性の評価。ＥＧＦＰ遺伝子を有する４つのＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスプラスミドの模式図である。

【図22B】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ＥＧＦＰーＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスベクターの有効性の評価。形質移入試薬としてＰＥＩまたはフュージーン（ＦｕＧＥＮＥ）を用いて、４つのＮＦＡＴベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。形質移入後３日目のＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ＧＦＰ陽性の割合を示す。ｎ＝１、ＭＦＩは平均蛍光強度、ＥＧＦＰは高感度緑色蛍光タンパク質、ＮＴは非導入を示す。

【図22C】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ＥＧＦＰーＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスベクターの有効性の評価。導入試薬としてポリブレンを用いて、ＰＥＩ形質移入からのレンチウイルス上清をジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞に導入した。ＮＦＡＴを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで２４時間刺激し、２４時間ごとにＧＦＰの発現（ＧＦＰ陽性細胞の割合およびＭＦＩとして示す）を３日間測定した。ジャーカット細胞の活性化は、ＣＤ６９の上方制御によって評価した。ｎ＝１、ＭＦＩは平均蛍光強度、ＥＧＦＰは高感度緑色蛍光タンパク質、ＮＴは非導入を示す。

【図23】初代Ｔ細胞における、ＥＧＦＰ－ＮＦＡＴに基づくレポーターレンチウイルスベクターの有効性の評価。初代Ｔ細胞に、図２３で使用したＮＦＡＴ４×レンチウイルスベクター、または異なる最小プロモーター（ｍｉｎＰ）を含むＮＦＡＴ４ｘレンチウイルスベクター（ＮＦＡＴ４ｘ新）のいずれかを導入した。ＮＦＡＴを導入した初代Ｔ細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで２４時間刺激し、２４時間ごとにＧＦＰの発現（ＧＦＰ陽性細胞の割合およびＭＦＩとして示す）を３日間測定した。ジャーカット細胞の活性化は、ＣＤ６９の発現により評価した。ｎ＝２、生物学的に独立した反復実験（平均±標準偏差として示す）。^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１、ｎｓ：有意差なし（二元配置分散分析に続くシダックスの多重比較検定）。ＭＦＩは平均蛍光強度を、ＮＴは非導入を示す。

【図24A】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ＮＦＡＴに基づくレポータープラスミドの非ウイルス性送達。２つのＮＦＡＴプラスミドの模式図である。ＮＦＡＴ０×はＮＦＡＴ結合部位を含まないもので、ｍｉｎＰ単体のバックグラウンドシグナルを評価するために使用した。

【図24B】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ＮＦＡＴに基づくレポータープラスミドの非ウイルス性送達。ＮＦＡＴ０×およびＮＦＡＴ４ｘを、ＣＤＫ４－１７導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の割合がおよそ９０％）にエレクトロポレーションによって導入した。プラスミドＤＮＡの存在下または非存在下で、エレクトロポレーションしなかった、またはエレクトロポレーションしたジャーカット細胞の生存率を、エレクトロポレーション後２０時間目、２日目および６日目に評価した。ｎ＝１。ｍｉｎＰは最小プロモーターを、ＥＧＦＰは高感度緑色蛍光タンパク質を示す。

【図24C】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ＮＦＡＴに基づくレポータープラスミドの非ウイルス性送達。ＮＦＡＴ０ｘおよびＮＦＡＴ４ｘを、ＣＤＫ４－１７導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の割合がおよそ９０％）にエレクトロポレーションによって導入した。ＮＦＡＴを形質移入したジャーカット細胞における、Ｅ２クリムゾンおよびＧＦＰの一重陽性および二重陽性集団の割合の経時的分析。抗生物質による選択としては、６日目から開始する、７日間の０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン選択を行った。選択開始後４日目に、新しいピューロマイシンと交換した。ｎ＝１。ｍｉｎＰは最小プロモーターを、ＥＧＦＰは高感度緑色蛍光タンパク質を示す。

【図24D】ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞における、ＮＦＡＴに基づくレポータープラスミドの非ウイルス性送達。ＮＦＡＴ０ｘおよびＮＦＡＴ４ｘを、ＣＤＫ４－１７導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の割合がおよそ９０％）にエレクトロポレーションによって導入した。ピューロマイシン選択７日後の、細胞生存率（ＤＡＰＩ陰性細胞）および、ＧＦＰとＥ２クリムゾン発現のドットプロット。ｎ＝１。ｍｉｎＰは最小プロモーターを、ＥＧＦＰは高感度緑色蛍光タンパク質を示す。

【図25A】非導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞のブラストサイジン選択。非形質転換ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で播種し、異なる濃度のブラストサイジンで６日間選択した。４日後、ブラストサイジンを除去するか（「４日目にブラストサイジンを除去」と示す）、あるいは新しいブラストサイジンをそれぞれの濃度で添加する（「４日目に新しいブラストサイジンを添加」と示す）ことにより、細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で再び播種した。ブラストサイジン選択後の全生細胞の増殖倍率。ｎ＝１。ＮＴは非導入を示す。

【図25B】非導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞のブラストサイジン選択。非形質転換ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で播種し、異なる濃度のブラストサイジンで６日間選択した。４日後、ブラストサイジンを除去するか（「４日目にブラストサイジンを除去」と示す）、あるいは新しいブラストサイジンをそれぞれの濃度で添加する（「４日目に新しいブラストサイジンを添加」と示す）ことにより、細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で再び播種した。４μｇ／ｍｌのブラストサイジンの存在下または非存在下で培養した非導入細胞のＦＳＣ－Ａ／ＳＳＣ－ＡおよびＣＤ８／ｍＴＣＲβ発現を示すフローサイトメトリーのプロットである。ｎ＝１。ＮＴは非導入を示す。

【図26A】異なる導入効率でＣＭＶ－１を導入し、４μｇ／ｍｌのブラストサイジンで選択した、ＣＭＶ－１導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞のｍＴＣＲβのＭＦＩ。導入効率の異なるＣＭＶ－１ＴＣＲレトロウイルス導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で播種し、４μｇ／ｍｌブラストサイジンで選択した。４日後、ブラストサイジンを除去するか（以下、４日目にブラスチジンを除去）、あるいは新たに４μｇ／ｍｌのブラストサイジンを添加する（以下、４日目に新たにブラスチジンを添加）ことにより、０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で細胞を再度播種した。６日間または７日間、ブラストサイジンで選択したｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞のｍＴＣＲβのＭＦＩを示す。ｎ＝１。ＭＦＩは平均蛍光強度を示す。

【図26B】異なる導入効率でＣＭＶ－１を導入し、４μｇ／ｍｌのブラストサイジンで選択した、ＣＭＶ－１導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞のｍＴＣＲβのＭＦＩ。導入効率の異なるＣＭＶ－１ＴＣＲレトロウイルス導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で播種し、４μｇ／ｍｌブラストサイジンで選択した。４日後、ブラストサイジンを除去するか（以下、４日目にブラスチジンを除去）、あるいは新たに４μｇ／ｍｌのブラストサイジンを添加する（以下、４日目に新たにブラスチジンを添加）ことにより、０．２５×１０^６細胞／ｍｌの密度で細胞を再度播種した。ブラストサイジン選択開始後７日目のＣＤ８およびｍＴＣＲβ染色を示す代表的なドットプロット。ｎ＝１。ＭＦＩは平均蛍光強度を示す。

【図27】２種類の抗ヒトＣＤ６９モノクローナル抗体、クローンＦＮ５０とクローンＣＨ／４を用いたＴ細胞の活性化の測定。実験の設定については、図１９Ｂの説明に記載した。細胞を、ＣＤ６９クローンＦＮ５０（ＡＰＣ）およびＣＤ６９クローンＣＨ／４（ＰＥ）に関して同時に染色した。ｎ＝１。９６ウェルには丸底９６ウェルプレートを使用した。^＊は、少ない生細胞に由来するデータである。

【図28】新生抗原特異的ＴＣＲ単離プラットフォームのいくつかの態様を示す。

【図29】ＴＣＲのカバー数を維持しながら、多数の細胞のより効率的な処理を可能にすることによる、ＴＣＲ単離プラットフォームの向上。

【図30】ブラストサイジンの効率と毒性を試験する方法。

【図31】ＴＣＲプラットフォーム分離プラットフォームの様々な態様を示す。このプラットフォームは、すべてのステップ、または枠で囲ったステップのそれぞれ（例えば、１、および／または２、および／または３、および／または４）、または直線状に配置し、番号を付けたステップ（例えば、１～７）のうちのいずれか１つ以上を含む可能性がある。

【図32】配列番号１では、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性発現カセットとして発現されるＴＣＲ遺伝子のアミノ酸配列を、配列番号４では、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ブラストサイジン耐性発現カセットとして発現されるＴＣＲ遺伝子のアミノ酸配列を示す。

【図33】配列番号２は、ＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子のアミノ酸配列である。

【図34】配列番号３は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＩＲＥＳ－フュージョンレッド（ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ）のヌクレオチド配列の例を示している。

【図35A】スクリーニング設計の概略を示す。５つの特徴の分かっているＴＣＲと、卵巣癌（ＯＶＣ）または大腸癌（ＣＲＣ）試料に由来する９５の特徴の分かっていないＴＣＲを使用して、１００×１００設計のコンビナトリアルＴＣＲライブラリーを作製した。

【図35B】は、ＣＤ６９マーカーを使用し、ＦＡＣＳによって、Ｔ細胞活性化に関して細胞を選別した結果を示している。

【図35C】得られたＰＣＲ産物のサイズが約１．５ｋｂであることを示す。ＰＣＲは、選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からＴＣＲｂ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットの一部を増幅するために、サイクル数を制限して行った。

【図35D】図３５ＣのスクリーニングデータのＴＣＲ濃縮度分析について示している。

【図35E】５つの特徴の分かっている抗原反応性ＴＣＲの特徴を示す。

【図36A】スクリーニング設計の概略を示す。５つの特徴の分かっているＴＣＲと、卵巣癌（ＯＶＣ）または大腸癌（ＣＲＣ）試料に由来する９５の特徴の分かっていないＴＣＲを使用して、１００×１００設計のコンビナトリアルＴＣＲライブラリーを作製した。

【図36B】スクリーニングにおける選別戦略を示している。

【図36C】ＴＣＲ発現カセットの回収について示す。

【図36D】図３６ＣのスクリーニングデータのＴＣＲ濃縮度分析について示している。

【図36E】図３６Ｄにおいて最も有意に濃縮された上位７つのＴＣＲの特徴を示している。

【図37A】は、６×６のコンビナトリアルＴＭＧエンコーディングの設計の模式図を示す。

【図37B】ｐｔ２－ＴＣＲライブラリーのスクリーニングの反復実験の数の関数として、ＴＣＲα×βすべての組み合わせの順位について分析した結果を示す図である。

【図37C】ＣＲＣ－ＴＣＲライブラリースクリーニングを２回または３回反復して行った結果に基づく統計分析を表にまとめた。

【図37D】ペアワイズＴＣＲ濃縮度分析に使用したｐｔ４試料に関する表である。

【図37E】ペアワイズＴＣＲ濃縮度分析の結果を示す。

【図38】スクリーニングデータと検証データの間における、ＴＣＲの活性化とＴＣＲのバックグラウンドの活性化の相関を示す図である。

【図39】ＴＣＲ表現の指標を示す。このグラフは、５つの特徴の分かっているＴＣＲをそれらの同族抗原で刺激すると、上位試料（最も明るい灰色）で濃縮されることを示している。ＴＭＧを発現するＢ細胞との共培養に由来する下位試料は、より低いｒｌｏｇ値を示す。

【図40】配列番号１、すなわち、ＴＣＲｂ－Ｐ２ＡＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性発現カセットとして発現されるＴＣＲ遺伝子の模式図である。

【図41】配列番号２、すなわち、ＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子の模式図である。

【図42】配列番号３、すなわち、Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＩＲＥＳフュージョンレッドの模式図である。

【図43】配列番号４、すなわち、ＴＣＲｂ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａブラストサイジン耐性発現カセットとして発現されるＴＣＲ遺伝子の模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0040】

様々の態様の詳細な説明

【0041】

本開示は、多様なＴ細胞集団からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収するための方法および組成物を提供する。方法のいくつかの態様では、ヒト組織標本を含む非生存材料から、抗原特異的ＴＣＲを同定および単離することを提供する。いくつかの態様は、図３１の一部または全部に従うものである。いくつかの態様において、方法は、図３１および本明細書で概略を示すステップ（１）～（７）の１つ以上を含む場合がある。例えば方法は、（１）試料を取得すること、を含む場合がある。試料は、感染症、自己免疫疾患、または癌を患っている患者に由来する組織、血液、または体液であってよい。試料は生存細胞であっても非生存細胞であってもよい。ステップ（２）試料に含まれるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の配列を決定する。ステップ（３）ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製するために、ＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を選択し、コンビナトリアルペアリングを行う。ステップ（４）ＴＣＲαβ対のライブラリーをレポーター細胞のプール、例えばジャーカットレポーターＴ細胞のプールに導入する。ステップ（５）ＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞を、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞で刺激する。少なくとも１つの目的の抗原は、自己由来であっても同種異系であってもよい。ステップ（６）少なくとも１つの目的の抗原に特異的なＴＣＲαβ対を決定する。ステップ（７）ＴＣＲαβ対を細胞に導入し、ＴＣＲαβ対を含む細胞を選択する。いくつかの態様において、方法は、前述したステップ（１）～（７）のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの態様では、いずれのステップも、適宜、本明細書で提供される他の態様によって省略、反復、または置換することができる。また、その他の介在するステップを追加することも可能である。

【0042】

いくつかの態様では、本明細書に記載のいずれの方法に関しても、ＴＣＲ対および／またはＴＣＲ対を発現しているＴ細胞は、抗原（新生抗原など）への結合によって選択または同定され、ここで抗原は、Ｂ細胞または抗原提示細胞によって発現される。いくつかの態様では、本明細書に記載のいずれの方法に関しても、抗原または新生抗原は対象の腫瘍に由来し、ＴＣＲ対のＴＣＲαおよびＴＣＲβもそれぞれ、この対象に由来する。いくつかの態様では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万のＴＣＲ対（またはこれらの対を含む細胞）が存在し、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万の抗原が存在する。

【0043】

いくつかの態様において、前述した方法で用いられる、および／または前述した方法から得られる組成物はいずれも、ライブラリーおよび／またはキットおよび／または組成物としての、および／または医療用途および／またはスクリーニング系においてのそれらの適用が想定される。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に提供される方法のいずれかによって選択または生成されたＴＣＲα鎖およびβ鎖の対合であり得る。いくつかの態様において、組成物は、本明細書で提供される任意の方法に伴われる成分または、本明細書で提供される任意の方法に由来するの製品のいずれであってもよい。

【0044】

様々な細胞組成物、ライブラリー、細胞およびタンパク質関連治療薬も提供される。いくつかの態様において、共培養は、細胞の集団に、少なくとも第一および第二の型の細胞を含む。いくつかの態様において、共培養に含まれる第一および第二の型の細胞は、接触して表現型の変化を誘導する可能性がある。いくつかの態様において、共培養は、培養容器内で維持される。いくつかの態様において、共培養は、培養バッグ内で維持される。いくつかの態様において、第一および第二の型の細胞は、２つ以上の異なる細胞型の集団である。いくつかの態様において、細胞の集団は、正確に２つの異なる細胞型の集団である。いくつかの態様において、本明細書で提供される任意の方法に由来する細胞のコレクションまたは中間産物または結果として生じる細胞集団のいずれかは、特定の組成物、ライブラリー、治療薬等として想定される。いくつかの態様において、共培養は、Ｔ細胞とＢ細胞を含む。

【0045】

いくつかの態様において、共培養に含まれる第一の型の細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの態様において、第一の型は、ヒトＴ細胞を含む。いくつかの態様において、第一の型は、ジャーカットＴ細胞を含む。いくつかの態様において、第一の型は、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように操作され、内因性ＴＣＲ発現を欠くジャーカットＴ細胞を含む。いくつかの態様において、第一の型は、１つ以上のバリアント核酸分子を発現するジャーカットＴ細胞を含む。いくつかの態様において、第一の型は、１つ以上のバリアントＴＣＲを発現するジャーカットＴ細胞を含む。いくつかの態様において、ジャーカットＴ細胞は、低密度での前培養に起因して、ＣＤ６９を含むがこれに限定されない活性化マーカーを低いバックグラウンドレベルで発現する。

【0046】

いくつかの態様において、共培養に含まれる第二の型の細胞は、抗原を提示可能な細胞を含む。いくつかの態様において、他の型の細胞は、抗原を提示することができるヒト細胞を含む。いくつかの態様において、他の型の細胞は、ヒト腫瘍細胞を含む。いくつかの態様において、他の型の細胞は、ヒトＢ細胞を含む。いくつかの態様において、他の型の細胞は、ヒト自己Ｂ細胞を含む。いくつかの態様において、他の型の細胞は、ヒト自己不死化Ｂ細胞を含む。いくつかの態様において、Ｂ細胞集団は、外来抗原を発現するように操作される。いくつかの態様において、Ｂ細胞集団は、複数の外因性抗原を発現するように操作される。いくつかの態様において、Ｂ細胞集団は、複数の外因性新生抗原を発現するように操作される。いくつかの態様において、Ｂ細胞集団は、複数の外来性新生抗原を複数のミニ遺伝子の形式で発現するように操作される。いくつかの態様において、Ｂ細胞集団は、複数の外因性新生抗原を単一のＴＭＧの形式で発現するように操作される。いくつかの態様において、Ｂ細胞集団は、複数の外因性新生抗原を複数のＴＭＧの形式で発現するように操作される。いくつかの態様において、Ｂ細胞集団中の個々の細胞は、単一の外来性ミニ遺伝子またはＴＭＧのみを発現する。いくつかの態様において、Ｂ細胞集団中の個々の細胞は、複数の外来性ミニ遺伝子またはＴＭＧを発現することができる。

【0047】

いくつかの態様では、組成物が提供される。組成物は、ｉ）活性化され、その活性化が１つ以上のＴ細胞活性化マーカーによって測定される、Ｔ細胞の第一の集団；およびｉｉ）参照集団として、同じＴＣＲライブラリーを発現しているかまたは同じＴＣＲライブラリーのプラスミドプールに含まれる、Ｔ細胞の別の選択物の第二の集団を含み、ここで、１つ以上のＴＣＲが、Ｔ細胞の第二の集団と比較して、Ｔ細胞の第一の集団で濃縮されている。

【0048】

いくつかの態様では、細胞のコレクションが提供され、このコレクションは、少なくとも１つのＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されたＴ細胞のセットであって、ここで対は対象に由来し、ここでＴ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、ここでＴ細胞のセットが１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されている、Ｔ細胞のセットと；Ｂ細胞のセットであって、ここでＢ細胞のセットは少なくとも１つの外因性新生抗原を発現するように構成されており、ここで少なくとも１つの外因性新生抗原は対象の腫瘍に由来する、Ｂ細胞のセットを含む。

【0049】

いくつかの態様では、コレクション中に少なくとも２つのＴＣＲ対と少なくとも２つの外来性新生抗原が存在する。いくつかの態様では、組成物中に少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万のＴＣＲ対（またはその対を含む細胞）が存在する。いくつかの態様では、コレクション中に少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万個の抗原（またはこれらの抗原を発現するＢ細胞）が存在する。いくつかの態様では、組成物中に少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万のＴＣＲ対（またはこれらの対を含む細胞）が存在し、コレクション中には少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万の抗原が存在している。いくつかの態様では、それぞれの対の配列またはその一部は異なる。いくつかの態様では、それぞれのＴＣＲ対は異なる。

【0050】

いくつかの態様において、共培養中で２つ以上の細胞集団が存在する比率は、１０００：１～１：１０００の範囲内である。

【0051】

いくつかの態様において、共培養中で２つ以上の細胞集団が存在する比率は、接触誘導性表現型を誘導できるように設定される。

【0052】

いくつかの態様では、共培養中でＢ細胞集団とＴ細胞集団が存在する比率によって、Ｔ細胞の活性化が可能になる。

【0053】

いくつかの態様では、共培養中でＢ細胞集団とＴ細胞集団が存在する比率によって、特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞サブセットのＴ細胞の活性化が可能になる。いくつかの態様では、共培養中で２つ以上の細胞集団が存在する比率は、１０００：１～１：１０００の範囲内である。いくつかの態様において、比率は、ＴＣＲ細胞の活性化を導くのに十分である

【0054】

いくつかの態様において、共培養または組成物は、ａ）ヒトＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂおよびＴＣＲバリアントライブラリーを発現するように操作され、内因性ＴＣＲの発現を欠くジャーカットＴ細胞；ならびに、ｂ）不死化された自己ヒトＢ細胞であって、自己ヒトＢ細胞が単一のミニ遺伝子またはＴＭＧの形式で複数の抗原を発現する自己ヒトＢ細胞、を含む。いくつかの態様において、共培養は、培養容器または培養バッグ内で維持され、Ｂ細胞集団およびＴ細胞集団は、Ｔ細胞の活性化を可能にする比率で存在する。抗原特異的Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲライブラリー中の特定のＴＣＲを介してのみ媒介される。

【0055】

いくつかの態様において、Ｔ細胞（ＴＣＲ対を発現する）対Ｂ細胞（新生抗原を提供する）の数および／または比率は、少なくとも２対２、例えば、少なくとも１０対１０、少なくとも１０００（ＴＣＲ対）対１０（新生抗原）、少なくとも１０，０００（ＴＣＲ対）対１０（新生抗原）、少なくとも１０，０００（ＴＣＲ対）対１００（新生抗原）、少なくとも１０，０００（ＴＣＲ対）対１０００（新生抗原）、少なくとも１００，０００（ＴＣＲ対）対１０、１００、１０００、もしくは１０，０００（抗原）、少なくとも５０対５０、少なくとも１００対１００、少なくとも１，０００，０００（ＴＣＲ）対１０，０００（抗原）、前記比率の任意の二つの数の間に定義される任意の範囲など、である。いくつかの態様では、単一のＴＣＲ対および／または抗原が各細胞（ＴまたはＢ細胞）中に存在し、前述した各数値が細胞数をも表す可能性がある。

【0056】

いくつかの態様において、組成物は、Ｂ細胞およびＴ細胞の共培養を含み、ここで、Ｔ細胞によって発現される少なくとも２つの異なるＴＣＲ対と、Ｂ細胞によって発現される少なくとも２つの異なる抗原が存在する。

【0057】

いくつかの態様では、Ｔ細胞には非常の多くのＴＣＲが存在し、Ｂ細胞には非常の多くの抗原が存在する。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも１つのＴＣＲおよび１つの抗原（または少なくとも２つ以上のＴＣＲおよび／または２つ以上の抗原）を介したＴ細胞の活性化を誘導できるように構成される。いくつかの態様では、組成物中に低バックグラウンドレベルのＣＤ６９が存在する。いくつかの態様において、組成物は、自己のＡＰＣ（または自己の不死化Ｂ細胞）を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、ＴＣＲライブラリーを発現するように操作されている（および／または内因性ＴＣＲの発現を欠いている）。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、天然のＴＣＲの発現を欠いているが、外因性ＴＣＲ対を介してＴＣＲの活性化が可能になるように構成される。

【0058】

いくつかの態様では、細胞のコレクションが提供される。このコレクションは、少なくとも２つのＴ細胞のセットを含む。いくつかの態様において、それぞれは、少なくとも１つのＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成される。いくつかの態様において、ＴＣＲαおよびＴＣＲβはそれぞれ対象に由来し、Ｔ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、セットは１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するように構成されている。コレクションはさらに、少なくとも２つのＢ細胞のセットを含む。少なくとも２つのＢ細胞はそれぞれ、少なくとも１つの外因性新生抗原（または抗原）を発現するように構成されており、その結果、少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が産生可能になり、および少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）は、対象内におけるものと同じである。

【0059】

いくつかの態様において、細胞組成物中に、少なくとも２つのＢ細胞のセットは、外因性新生抗原（または抗原）を産生する少なくとも第一のＢ細胞と、第二の外因性新生抗原（または抗原）を産生する少なくとも第二のＢ細胞を含む。

【0060】

いくつかの態様では、ＴＣＲ発現細胞のライブラリーが提供される。ＴＣＲ発現細胞のライブラリーは、少なくとも３つのＴ細胞のセットであって、ここでＴ細胞のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つのＴＣＲαとＴＣＲβの対（少なくとも２つのＴＣＲ対）を発現するように構成されており、ここで少なくとも２つのＴＣＲ対は一人の対象に由来し、ここで少なくとも３つのＴ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、ここで少なくとも３つのＴ細胞は、Ｂ細胞によって提示された抗原（または新生抗原）への結合に際して、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されており、ここでＴＣＲ細胞の数に反映される各ＴＣＲ対のゲノムコピー量から、試料に含まれる全てのＴＣＲのリードを得られ、およびここでＴＣＲのうちの少なくとも１つが、ライブラリーを含む組成物全体に均等に分布していない、少なくとも３つのＴ細胞のセットを含む。

【0061】

いくつかの態様において、少なくとも１つのＴ細胞の分布は、Ｂ細胞によって提示される抗原に結合することによって変化する。いくつかの態様において、少なくとも２つのＴＣＲ対は、ライブラリー中にほぼ均等に存在する。

【0062】

いくつかの態様では、細胞のコレクションが提供される。このコレクションは、少なくとも２つのＴ細胞のセットを含み、ここでそれぞれは、少なくとも１つのＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここで対は対象に由来し、ここでＴ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、およびここでセットは１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されている。コレクションはさらに、少なくとも２つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）細胞のセットを含む場合があり、ここで少なくとも２つのＡＰＣはそれぞれ少なくとも１つの外因性新生抗原（または抗原）を発現するように構成されており、その結果、少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が産生可能になり、およびここで少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）は、対象内におけるものと同じである。

【0063】

いくつかの態様において、セットまたはキットは、Ｔ細胞の第一の集団とＴ細胞の第二の集団を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞の第一の集団は、測定可能な特定の表現型を共有するＴ細胞から構成される。いくつかの態様において、Ｔ細胞の第一の集団は、Ｔ細胞活性化の表現型を共有するＴ細胞を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞の第一の集団は、選択されたＴ細胞の集団であってよい。

【0064】

いくつかの態様において、Ｔ細胞の第一の集団は、１つ以上のマーカーの特定の発現レベルを共有するＴ細胞を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞の第一の集団は、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの発現を共有するＴ細胞を含む。

【0065】

いくつかの態様において、Ｔ細胞は、バリアント核酸分子のライブラリーを発現する。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、ＴＣＲライブラリーを発現する。

【0066】

いくつかの態様において、Ｔ細胞の第二の集団は、参照集団とすることができる。参照集団は、選択されたＴ細胞の第一の集団によって発現されるのと同じＴＣＲライブラリーを発現する、選択されたまたは選択されないＴ細胞の集団であってよい。いくつかの態様において、参照は、Ｔ細胞の第一の集団によって発現されるのと同じＴＣＲライブラリーのプラスミドプールである。

【0067】

いくつかの態様において、各ＴＣＲの量は、試料に含まれる全てのＴＣＲのリードを得ることが可能であるような量であり、ここで、組成物全体に均等に分布していないＴＣＲ対が少なくとも１つ存在する。いくつかの態様において、ＴＣＲ細胞の数に反映される各ＴＣＲ対のゲノムコピー量は、試料に含まれる全てのＴＣＲのリードを得られるような量である。いくつかの態様において、ＴＣＲのうちの少なくとも１つは、ライブラリーを含む組成物全体にわたって均等に発現していない。いくつかの態様において、ＴＣＲの大部分は、選択されたＴ細胞の集団と参照との間でほぼ均等に表現されている。いくつかの態様では、ＴＣＲライブラリー中に存在する全ＴＣＲの９０％を超えるものが、Ｔ細胞の第一の集団とＴ細胞の第二の集団（例えば、参照集団）の両方において表現される。いくつかの態様では、ＴＣＲライブラリーに存在する全ＴＣＲの９９％を超えるものが、Ｔ細胞の第一の集団とＴ細胞の第二の集団の両方において表現される。

【0068】

いくつかの態様において、１つ以上のＴＣＲは、第二の集団と比較して、第一の集団で濃縮される。いくつかの態様において、１つ以上のＴＣＲは、第二の集団と比較して、第一の集団において統計的に有意に濃縮される。

【0069】

いくつかの態様において、組成物は、スクリーニング方法から、例えば上位下位比較から得られた、上位１、２、３、４、５、６、７、８、９、または少なくとも１０％のＴＣＲ（もしくはこれらのＴＣＲを発現している細胞）を含む。

【0070】

いくつかの態様において、全ＴＣＲの９９％を超えるものが、Ｔ細胞の（選択された）第一の集団の中に存在する。いくつかの態様において、ＴＣＲの大部分は、Ｔ細胞の組成物中で、Ｔ細胞の第一の集団と第二の集団（例えば、この状況では参照）の間でほぼ均等に分布している。

【0071】

いくつかの態様では、所望の特徴を有する少なくとも１つのＴＣＲαβ対が同定され、単離され、および／または提供される。いくつかの態様において、所望の特徴を有する少なくとも１つのＴＣＲαβ対は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来する。いくつかの態様において、所望の特徴を有する少なくとも１つのＴＣＲαβ対は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来し、同一の対象における癌治療のために使用される。いくつかの態様において、所望の特徴を有する少なくとも１つのＴＣＲαβ対は、末梢血に由来する。いくつかの態様において、所望の特徴は、抗原に対する特異性である。いくつかの態様において、所望の特徴は、新生抗原を認識することである。いくつかの態様において、所望の特徴は、ウイルス抗原を認識することである。いくつかの態様において、所望の特徴は、腫瘍細胞によって発現される共有抗原を認識することである。いくつかの態様において、所望の特徴は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩへの拘束性である。いくつかの態様において、所望の特徴は、抗原に対する結合活性である。いくつかの態様において、所望の特徴は、抗原に対する反応性の欠如である。いくつかの態様では、複数の特徴を有することが望まれる。いくつかの態様において、そのＴＣＲ対は、これらの特徴のうちのいずれか１つ以上に関して構成される。

【0072】

いくつかの態様において、所望の特徴を有する少なくとも１つのＴＣＲαβ対は、治療のために使用されるか、および／または準備されるか、および／または条件付けられる。いくつかの態様において、少なくとも１つのＴＣＲαβ対は、治療のために使用されるか、および／または準備されるか、および／または条件付けられる。いくつかの態様において、少なくとも１つのＴＣＲαβ対は、癌治療のために使用されるか、または使用のために構成される。いくつかの態様において、少なくとも１つのＴＣＲαβ対は、感染症の治療のために使用されるか、および／または準備されるか、および／または条件付けられる。いくつかの態様において、少なくとも１つのＴＣＲαβ対は、自己免疫疾患の治療のために使用されるか、および／または準備されるか、および／または条件付けられる。いくつかの態様において、少なくとも１つのＴＣＲαβ対は、治療用の組換えタンパク質を設計するために使用されるか、および／または準備されるか、および／または条件付けられる。いくつかの態様において、組換えタンパク質は、治療のために投与される。

【0073】

いくつかの態様では、少なくとも１つのＴＣＲαβ対が、治療用にＴ細胞を操作するために使用される。いくつかの態様では、少なくとも２つのＴＣＲαβ対が、治療用にＴ細胞を操作するために使用される。いくつかの態様では、２つを超えるＴＣＲαβ対が、治療用にＴ細胞を操作するために使用される。いくつかの態様では、５つのＴＣＲαβ対が、治療用にＴ細胞を操作するために使用される。いくつかの態様では、１０のＴＣＲαβ対が、治療用にＴ細胞を操作するために使用される。いくつかの態様では、２０のＴＣＲαβ対が、治療用にＴ細胞を操作するために使用される。いくつかの態様では、操作されたＴ細胞が治療のために投与される。いくつかの態様において、ＴＣＲαβ対は、ウイルスを用いてＴ細胞に導入される。いくつかの態様において、ウイルスはレンチウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスはレトロウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスはアデノウイルスである。いくつかの態様において、ウイルスは、ＴＣＲのＴ細胞ゲノムへの組み込みを媒介する。

【0074】

いくつかの態様において、ウイルスは、ＴＣＲの一過性の発現をもたらす。いくつかの態様において、ウイルスは、相同指向性修復（ＨＤＲ）によるＴ細胞内のゲノム二重鎖切断の修復鋳型としてＴＣＲのＤＮＡを担持する。

【0075】

いくつかの態様において、ＴＣＲαβ対は、非ウイルス性遺伝子送達法を用いてＴ細胞に導入される。いくつかの態様において、非ウイルス性遺伝子送達法は、エレクトロポレーションに基づくものである。いくつかの態様において、非ウイルス性遺伝子送達法は、Ｔ細胞に成分を送達するためにＴ細胞の細胞膜に一時的な穿孔を形成することができる他の方法に基づいている。いくつかの態様において、非ウイルス性遺伝子送達法は、トランスポザーゼを含む。いくつかの態様において、非ウイルス性遺伝子送達法は、ヌクレアーゼを含む。

【0076】

いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体である。

【0077】

いくつかの態様において、操作されたＴ細胞は、ＴＣＲで修飾され、そして、その表現型および反応性を制御するために、さらに遺伝学的に修飾される。

【0078】

いくつかの態様では、異なる抗原に対する特異性を有する異なるＴＣＲαβ対を発現する操作されたＴ細胞が、投与用の細胞組成物として組み合わされる。いくつかの態様では、組み合わせることによって複数の抗原を標的とすることが可能となり、そのため、単剤療法よりも効果的であり得る。いくつかの態様では、組み合わせることによってＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞を両方一緒に標的とすることが可能であり、そのため、固形癌の治療に相乗効果を発揮する可能性がある。いくつかの態様では、組み合わせることによって切断型および分岐型腫瘍変異を一緒に標的とすることが可能である。いくつかの態様において、組み合わせることは、操作されたＴ細胞集団それぞれを等しい比率で利用することに基づいている。いくつかの態様において、組み合わせることは、操作されたＴ細胞集団それぞれを異なる細胞数で利用することに基づいている。

【0079】

いくつかの態様において、組成物は、１つ以上のＴＣＲ遺伝子の使用に基づく操作されたＴ細胞の産物を含んでいる。いくつかの態様において、操作されたＴ細胞は、それを受け入れる患者の自己由来である；ＴＩＬ由来である；少なくとも１つのクラスＩＴＣＲと１つのクラスＩＩＴＣＲの使用を採用する；ならびに等比を採用する、のうちの少なくとも１つを含む。

【0080】

本明細書で提供される態様のいくつかは、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の天然の組み合わせを回収する必要性を回避し、また、非生存細胞材料および非生存組織試料に適用することが可能である。コンビナトリアルＴＣＲαβライブラリーを生成することによって、本開示のいくつかの態様は、保存されたまたは保管された試料から抗原特異的ＴＣＲαβ対を同定することを可能にする。例えば、本開示の態様は、非生存Ｔ細胞の細胞膜の完全性の喪失に起因する、異なるＴ細胞由来のＴＣＲαとＴＣＲβのｍＲＮＡ転写物の混合に関連する問題を解決することが可能である。そのような混合物では、本来のＴＣＲαβ対に関する情報が失われている。本明細書で提供される方法のいくつかの態様は、回収されたＴＣＲライブラリーが高頻度のＴＣＲ配列に対して偏ることによって引き起こされる、これまでに報告されているＴＣＲライブラリースクリーニング技術の感度の低さを解決する。本明細書で提供される方法のいくつかの態様は、その後の応用に、回収されたＴＣＲ鎖の完全なレパトアを含める必要性を排除し、それによって、例えば、所望の特性を有するＴＣＲ鎖にＴＣＲの発見を集中させることを可能になる。ドロップレットＰＣＲや微少流体装置などの単一細胞に基づく手法とは異なり、本明細書に開示するＴ細胞から特定のＴＣＲαβ対を回収する方法は、拡張性の制限となる特定の器具や生きた細胞材料を必要としない。事前に天然のＴＣＲαβ対を回収することができない、Ｔ細胞集団からＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列のコレクションを回収するバルクＰＣＲ法とは異なり、本明細書に開示の方法は、目的のＴＣＲαβ対を回収するために、同定したＴＣＲレパトアの定義した部分を回収するための設計を用いる。

【0081】

本明細書に開示の方法は、治療および診断の目的で、および／または組成物、および／または医薬品に使用することができる。組換えＴＣＲ遺伝子は、例えば、癌免疫療法などの免疫療法用に、所望の特異性を有するＴ細胞を産生するために使用することができる。癌免疫療法に適用する場合、遺伝子導入によって抗原特異的Ｔ細胞を生成するためのＴＣＲ遺伝子を選択することによって、所望の特異性を有するＴ細胞を産生することができる。いくつかの態様において、この手法は、ＴＣＲαβ対をコードする遺伝子の導入により、Ｔ細胞間で抗原特異性を転移させることができるという観察に基づいている。目的のＴＣＲ遺伝子は、γ－レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター、トランスポゾンに基づく遺伝子導入プラットフォーム、ｍＲＮＡ導入（例えば、エレクトロポレーションまたはナノ粒子による導入）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含むゲノム工学ツールを利用して、ヒトＴ細胞のゲノムに導入することができる。後者は、新規ＴＣＲ鎖を内在性ＴＣＲ遺伝子座に部位特異的に組み込むことにより、内在性ＴＣＲ鎖の同時ノックアウトを可能にする。

【0082】

いくつかの態様において、結果的に選択された分子の対は、本明細書に記載の任意の障害に関して、対象の治療および／または対象のための医薬に使用される。

【0083】

いくつかの態様では、対象を治療する方法が提供される。この方法は、腫瘍を有する対象を特定すること；少なくとも２つのＴ細胞のセットを提供すること、少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ、少なくとも１つの異なるＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここでＴＣＲαおよびＴＣＲβはそれぞれ対象に由来し；少なくとも２つのＢ細胞のセットを提供すること、ここで、Ｂ細胞のセットは少なくとも２つの外因性新生抗原を発現するように構成されており、ここで少なくとも２つの外因性新生抗原は、対象内で見出されるものと同じであり；少なくとも２つのＴ細胞のセットと少なくとも２つのＢ細胞のセットを組み合わせて、少なくとも２つの外因性新生抗原を介した少なくとも２つのＴ細胞の活性化に基づいて、少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを選択すること；および少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを対象に投与し、それによって腫瘍を治療すること、を含む。いくつかの態様では、本明細書で提供される任意の比率のＴ細胞とＢ細胞を、この過程で使用することができる。いくつかの態様では、治療することにより、腫瘍の大きさが縮小する。いくつかの態様では、治療は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％（前述した値のうちの任意の２つの間で定義される任意の範囲を含む）、腫瘍の大きさを縮小する。

【0084】

いくつかの態様では、対象を治療する方法が提供される。この方法は、腫瘍を有する対象を特定すること；少なくとも２つのＴ細胞のセットを提供すること、少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ、少なくとも１つの異なるＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここでそれぞれのＴＣＲαおよびＴＣＲβは対象に由来し；少なくとも２つの抗原提示細胞のセットを提供すること、ここで、抗原提示細胞のセットは対象に由来するものであり、少なくとも２つの外因性新生抗原を発現するように構成されており、ここで少なくとも２つの外因性新生抗原は、対象内で見出される新生抗原と同じであり；少なくとも２つのＴ細胞のセットと少なくとも２つの抗原提示細胞のセットを組み合わせて、少なくとも２つの外因性新生抗原を介した少なくとも２つのＴ細胞の活性化に基づいて、少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを選択すること；および少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを対象に投与し、それによって腫瘍を治療すること、を含む。いくつかの態様では、２つ以上のＴＣＲ対が存在し、例えば、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のＴＣＲ対を使用することができる。いくつかの態様において、ＴＣＲ対は、細胞療法を介して投与される。いくつかの態様において、対は、他の対と異なる配列を有する。

【0085】

いくつかの態様では、任意の方法によって本明細書で提供される選択したＴＣＲ対または対の組み合わせを、本明細書で提供する治療方法において使用することができる。

【0086】

いくつかの態様では、医薬組成物が提供される。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象の腫瘍中に存在する第一の抗原（または新生抗原）に結合する第一のＴＣＲ対；および対象の腫瘍中に存在する第二の抗原（または新生抗原）に結合する第二のＴＣＲ対とを含む。いくつかの態様では、２つ以上のＴＣＲ対が存在し、例えば、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のＴＣＲの対を使用することができる。いくつかの態様において、ＴＣＲ対は、細胞療法を介して投与される。いくつかの態様において、対は、他の対と異なる配列を有する。いくつかの態様において、第一のＴＣＲ対はＭＨＣクラスＩ拘束性であり、第二のＴＣＲ対はＭＨＣクラスＩＩ拘束性である。

【0087】

いくつかの態様では、医薬組成物が提供される。組成物は、第一の抗原に結合し、かつ、ＭＨＣクラスＩ拘束性である第一のＴＣＲ対と、第二の抗原に結合し、かつ、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性である第二のＴＣＲ対とを含む可能性がある。

【0088】

いくつかの態様において、組成物はさらに、第三の対を含む場合がある。

【0089】

いくつかの態様では、第一のＴＣＲ対は腫瘍由来の新生抗原に結合し、第二のＴＣＲ対は腫瘍由来の新生抗原に結合し、第一および第二のＴＣＲ対は両方とも腫瘍の宿主に存在する。

【0090】

癌治療用の組換えＴＣＲ遺伝子は、さまざまな供給源から得ることができる。第一に、血液や腫瘍組織などの患者の生存標本から腫瘍抗原に対する特異性を有するＴ細胞を検出し、単離することが可能である。当該技術分野において記載のある技術には、ＭＨＣ多量体結合Ｔ細胞の単離、ならびに抗原刺激後に特定の表現型マーカーを発現するかまたは特定のサイトカインを分泌するＴ細胞のフローサイトメトリーまたは磁気ビーズ選択による単離が含まれる。その後、単離した抗原特異的Ｔ細胞を用いて、単一の細胞を使用するＰＣＲに基づく技術、ＴＣＲバルク鎖配列決定、または微少流体学に基づくＰＣＲ技術により、発現したＴＣＲ遺伝子の配列を決定することができる。第二に、アロＣＴＬシステムまたは動物モデル（例えば、ＨＬＡトランスジェニックおよび／またはヒトＴＣＲトランスジェニックマウスモデル）が、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞／ＴＣＲの別の供給源となる。第三に、治療用ＴＣＲ遺伝子を、ファージ、酵母、またはＴ細胞提示系によって組換えＴＣＲライブラリーとして発現されたインビトロ変異型ＴＣＲ鎖から選択することができる。

【0091】

癌治療用のＴ細胞（またはＴＣＲ）は、所望される治療基準に基づいて選択することができる。第一に、癌治療に用いられるＴＣＲ遺伝子は、理想的には、生体組織では発現が低いか、または発現していない腫瘍特異的抗原を認識することが望まれる。第二に、ＴＣＲはその抗原を高感度で認識することが望まれ、例えば、少量の抗原によって、ＴＣＲ修飾型Ｔ細胞の腫瘍細胞に対するエフェクター機能、例えば細胞溶解活性が引き起こされることが望ましい。第三に、ＴＣＲは生体組織で発現している他の抗原に対して交差反応性を持たないことが望まれる。

【0092】

ＴＣＲ遺伝子導入により、細胞系列特異的抗原（例えばＭＡＲＴ－１）、過剰発現抗原（例えばＷＴ－１）、癌／精巣（Ｃ／Ｔ）抗原（例えばＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ１０）、ウイルス抗原（例えばＨＰＶＥ６、Ｅ７）、変異タンパク質（新抗原）などの様々な腫瘍抗体を標的とすることができる。注目すべきは、新生抗原特異的ＴＣＲ配列は、癌の治療に特に適している可能性があることである。例えば、新生抗原特異的Ｔ細胞は、免疫チェックポイント阻害療法と養子Ｔ細胞療法の両治療後において、進行した転移性癌の退縮と相関がある。腫瘍で見られるゲノム変異の大部分はパッセンジャー変異であり、腫瘍のごく一部にしか認められないため、またＭＨＣ拘束性のため、Ｔ細胞が認識できる腫瘍新生抗原のレパトアは患者個人によって大きく異なる。したがって、ＴＣＲ遺伝子導入を利用して治療のための新生抗原特異的Ｔ細胞を生成するには、多くの場合、患者や腫瘍ごとに一つ以上の新しい新生抗原特異的ＴＣＲ配列が必要となる。ＴＣＲ遺伝子導入に使用されるＴＣＲの安全要件を考えると、商業的に拡張可能な手法は、理想的には、患者から直接得られた新抗原特異的ＴＣＲであれば安全であると想定できるため、自己組織に依存する。さらに、ＴＣＲを分離するために患者の生存細胞を取り扱う必要性を回避するため、例えば、保管しておいた腫瘍試料などの非生存組織を使用することが、商業的に拡張可能な過程を達成するために好ましい。本明細書に開示された方法は、関連する新生抗原特異的ＴＣＲを患者ごとに高感度で同定するという重大な必要性に対処するものである。さらに、本明細書に記載の方法で開示される新生抗原特異的ＴＣＲ遺伝子の導入は、例えば、免疫チェックポイント阻害などの他の治療の恩恵を受けられらない患者に利益をもたらす可能性がある。

【0093】

いくつかの態様では、核酸のコンビナトリアルライブラリーからＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、ａ）複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供することを含み、複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで連続部分は、１）ＴＣＲαのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、連続部分の第一の末端を規定する第一のバリアントヌクレオチド部分配列、および２）ＴＣＲβのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、第一の末端とは反対側にある連続部分の第二の末端を規定する第二のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせ、を含む。この方法はさらに、複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現するように構成された不死化Ｔ細胞の集団にライブラリーを導入すること、および不死化Ｔ細胞と抗原を発現している不死化Ｂ細胞との接触に応答して閾値を超えるＴ細胞活性化マーカーの発現に基づいて、不死化Ｔ細胞の集団の亜集団を選択すること、ここで亜集団は複数のＴ細胞を含み、および／または亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること、および／またはサブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定すること、および／または、サブセットのヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、第一と第二のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること、を含む。

【0094】

いくつかの態様では、核酸のコンビナトリアルライブラリーからキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞内シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供することを含み、複数のバリアント核酸はそれぞれ、少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで連続部分は、（１）ＣＡＲヒンジドメインをコードしている第一のバリアントヌクレオチド部分配列；（２）ＣＡＲ膜貫通ドメインをコードしている第二のバリアントヌクレオチド部分配列；および（３）ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインをコードしている第三のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせ、を２つ以上含む。第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの１つは、連続部分の第一の末端を規定し、第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列の別の１つは、第一の末端の反対側にある連続部分の第二の末端を規定する。この方法はさらに、複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＣＡＲを発現するように構成された細胞の集団にライブラリーを導入することを含み、ここで細胞の集団は、不死化Ｔ細胞または初代ヒトＴ細胞の集団を含む。この方法はさらに、細胞とＣＡＲの抗原結合ドメインに特異的な抗原を発現している抗原提示細胞とを接触させることに応答して閾値を超える細胞増殖に基づいて、細胞の集団の亜集団を選択することを含む場合があり、ここで亜集団は複数の細胞を含む。方法はさらに、亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離し、および／またはサブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；サブセットのヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、第一、第二、および第三のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること、を含む場合がある。
定義

【0095】

本明細書全体を通じて「含む」という用語、または「含まれる」もしくは「含んでいる」などの変形は、言及している要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を含むことを意味し、他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を除外しないものと理解される。

【0096】

以下の用語および方法の説明は、本開示をより良く説明するため、および当業者が本開示を実施する際の指針とするために提供される。単数形の「１つ」、「１種」、および「この」は、文脈から明らかにそうでないと判断されない限り、１つまたは２つ以上を指す。例えば、「核酸分子を含んでいる」という用語は、単一のまたは複数の核酸分子を含むもので、「少なくとも１つの核酸分子を含んでいる」という句と同等であるとみなされる。「または」という用語は、文脈からそうではないことが明らかでない限り、記載された代替要素の単一の要素または２つ以上の要素の組合せを指す。本明細書で使用する場合、「含む」は「包含する」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含んでいる」とは、追加の要素を排除することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを包含する」ことを意味する。特段の指定のない限り、本定義が他に存在し得る定義と異なる可能性がある場合には、本明細書で提供される定義が優先される。

【0097】

特段の記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全てのヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＨＧＮＣ）の識別子（ＩＤ）は、その全体が参照により組み込まれる。本開示の実施または試験には、本明細書に記載の方法および材料と類似または同等のものを使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図していない。

【0098】

「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」とは、Ｔ細胞すなわちＴリンパ球の表面に存在し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子にペプチドとして結合した抗原を認識する分子を意味する。ＭＨＣ分子には、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩがあり、クラスＩとクラスＩＩのＭＨＣ分子はいずれも、免疫反応に重要な役割を担っている。ＭＨＣクラスＩの分子は、すべての有核細胞や血小板に、要するに赤血球以外のすべての細胞で発現している。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）とも呼ばれるキラーＴ細胞にエピトープを提示する。ＭＨＣクラスＩＩは、あらゆる種類の細胞で条件付きで発現させることができるが、通常は「専門」の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、すなわちマクロファージ、Ｂ細胞、そして特に樹状細胞（ＤＣ）にのみ発現する。ＡＰＣは抗原タンパク質を取り込み、抗原プロセッシングを行い、その分子画分（エピトープと呼ばれる画分）を取り出し、そしてこれをＭＨＣクラスＩＩ分子と結合させてＡＰＣの表面に表示する（抗原提示）。細胞表面では、エピトープはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような免疫学的構造によって認識され得る。いくつかの態様において、ＴＣＲは、２つのポリペプチド鎖、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）を含む。いくつかの態様において、ＴＣＲは、ＴＣＲγおよびＴＣＲδ鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）を含む。いくつかの態様において、ＴＣＲは、細胞外可変領域および細胞外定常領域を含む。いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる３つの超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの態様では、ＣＤＲ３が主な抗原認識領域である。いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖遺伝子はＶおよびＪを含み、ＴＣＲβ鎖遺伝子はＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含み、ＴＣＲの多様性に寄与している。

【0099】

本明細書で使用する場合、「ＴＣＲレパトア」という用語は、試料またはライブラリーに含まれるＴＣＲ鎖のコレクションを指す。コレクションは、少なくとも２つ以上の異なるＴＣＲ鎖バリアントを含み得る。いくつかの態様において、「ＴＣＲレパトア」は、試料またはライブラリーに含まれる全てのＴＣＲ鎖のコレクションを指す。いくつかの態様において、「ＴＣＲレパトア」は、試料またはライブラリーに含まれるＴＣＲ鎖のサブセットまたは選択物のコレクションを指す。いくつかの態様において、「ＴＣＲレパトア」は、試料またはライブラリーに含まれるＴＣＲαβ対のコレクションを指す。いくつかの態様において、「ＴＣＲレパトア」は、試料またはライブラリーに含まれるＴＣＲαβ対のサブセットまたは選択物のコレクションを指す。

【0100】

ＴＣＲ鎖のサブセットまたは選択物は、例えば、ＴＣＲ鎖の頻度に基づくものであってもよい。いくつかの態様において、「ＴＣＲ鎖の頻度」は、全ＴＣＲ鎖のアミノ酸配列（の一部）をコードする全核酸のうち、特定のＴＣＲ鎖のアミノ酸配列（の一部）をコードする核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の絶対数を指す。いくつかの態様において、特定のＴＣＲ鎖のアミノ酸配列（の一部）をコードする核酸分子の絶対数は、「固有の分子識別子（Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）」（ＵＭＩ）を用いた固有の分子の数に基づいて決定してもよい（例えば、キビオジャ（Ｋｉｖｉｏｊａ）ら、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔ Ｍｅｔｈ）、２０１１およびイスラム（Ｉｓｌａｍ）ら、ネイチャー・メソッズ、２０１３に記載された原理として）。いくつかの態様では、ＴＣＲ鎖の頻度をパーセンテージで表してもよい。全ＴＣＲ鎖の総数は、ＴＣＲα鎖をコードする核酸分子のみ、ＴＣＲβ鎖のみ、またはＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方を含んでいてもよい。いくつかの態様において、頻度は、試料に含まれる鎖間において、あるＴＣＲ鎖が、０．００１％、０．０１％、０．１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはその間の任意の数もしくは範囲と同等以上、同等、これより多い、または未満の頻度であるとして表現される。ＴＣＲ鎖アミノ酸配列（の一部）をコードする核酸分子の絶対数または対応するパーセンテージを用いて、ＴＣＲ鎖の順位を得ることができる。いくつかの態様において、頻度は、あるＴＣＲ鎖が、試料に含まれている鎖の中で、上位１０００、上位９００、上位８００、上位７００、上位６００、上位５００、上位４５０、上位４００、上位３５０、上位３００、上位２５０、上位２００、上位１５０、上位１４０、上位１３０、上位１２０、上位１１０、上位１００、上位９０、上位８０、上位７０、上位６０、上位５０、上位４０、上位３０、上位２０、上位１０、上位５、またはその間の任意の数もしくは範囲にあるとして表現される。いくつかの態様において、「ＴＣＲ鎖の頻度」は、その試料に含まれる全ＴＣＲ鎖に対する、あるＴＣＲ鎖の頻度を指す。いくつかの態様において、「ＴＣＲ鎖の頻度」は、試料に含まれる全ＴＣＲ鎖またはＴＣＲ鎖のサブセットによりも、あるＴＣＲ鎖の頻度が少ないことを指す。

【0101】

本明細書で使用する場合、「頻度閾値」という用語は、ＴＣＲ鎖のサブセットまたは選択物に含まれる所与のＴＣＲ鎖が、試料中で出現する最小の頻度を指す。いくつかの態様において、頻度閾値は、試料に含まれるＴＣＲ鎖の順位が、上位１０００、上位９００、上位８００、上位７００、上位６００、上位５００、上位４５０、上位４００、上位３５０、上位３００、上位２５０、上位２００、上位１５０、上位１４０、上位１３０、上位１２０、上位１１０、上位１００、上位９０、上位８０、上位７０、上位６０、上位５０、上位４０、上位３０、上位２０、上位１０、上位５、またはその間の任意の数もしくは範囲であることを含む。いくつかの態様において、頻度閾値は、試料に含まれる鎖が、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはその間の任意の数もしくは範囲のすべてのＴＣＲ鎖を含むものとして表現される。いくつかの態様において、「頻度閾値」は、試料に含まれる全ＴＣＲ鎖に対する閾値を指す。いくつかの態様において、「頻度閾値」は、試料に含まれる全ＴＣＲ鎖またはＴＣＲ鎖のサブセットによりも、あるＴＣＲ鎖の閾値が小さいことを指す。

【0102】

本明細書において、「相対的な濃縮度」という用語は、ある試料におけるＴＣＲ鎖の量または頻度が、他の試料と比較して多いことを意味する。比較できる試料には、例えば、腫瘍試料と血液、異なる腫瘍試料、腫瘍試料と非腫瘍試料、異なる領域に由来する同じ腫瘍の試料、腫瘍の中心部に由来する試料と辺縁部または境界領域に由来する試料、異なる活性または分化状態を有するＴ細胞由来の試料、その他がある。

【0103】

本明細書で使用する場合、「スイッチレセプター」は、当業者が通常使用するのと同じ意味で用いられ、スイッチレセプターは、通常、Ｔ細胞の抑制またはアポトーシスを伴って、細胞外シグナルをＴ細胞活性化シグナルに変換するために使用される分子を含むが、これらには限定されない。これは、抑制性またはアポトーシス誘導性リガンド（例えば、これらには限定されないが、ＴＧＦＢＲ２、ＦＡＳまたはＴＩＧＩＴ）と結合する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、Ｔ細胞活性化受容体（ＣＤ３ε、ＣＤ２８、ＩＬ２ＲＢ等）に由来する細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）と融合させることによって達成することができる。当業者は、Ｔ細胞活性化リガンドと結合するＥＣＤをＴ細胞阻害性受容体（例えば、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４）に由来するＩＳＤと組み合わせることによって、Ｔ細胞機能を阻害するように融合受容体分子を設計することもできることを理解するであろう。いくつかの態様において、スイッチレセプターは、１つ、２つ、またはさらに多くのシグナル伝達ドメインと融合させたＥＣＤを含んでいてもよいが、これらに限定されるものではない。いくつかの態様において、スイッチレセプター分子は、ＥＣＤおよびＩＳＤに加えて複数の異なる膜貫通ドメイン（ＴＭ）、または、ＥＣＤとＴＭおよび／もしくはＴＭとＩＳＤを含むがこれに限定されない異なるドメイン間を繋ぐリンカーまたはスペーサー配列を含むがこれに限定されない、任意の他の新規成分を含むレセプターを含むが、これらに限定されるものではない。

【0104】

本明細書で使用する場合、「一本鎖ＴＣＲ」は、当業者が通常使用するのと同じ意味で用いられる。この用語はさらに、ＴＣＲαとＴＣＲβの可変鎖断片をリンカーで共有結合することを含むが、これには限定されない。一本鎖ＴＣＲは、ＴＣＲαとＴＣＲβの可変鎖断片をＴＣＲβ定常ドメインに融合させたリンカーで共有結合し、ＴＣＲα定常ドメインとトランスで共発現させることを含むが、これには限定されない。いくつかの態様において、一本鎖ＴＣＲは、ＴＣＲαとＴＣＲβの可変鎖断片をＴＣＲα定常ドメインに融合させたリンカーで共有結合し、ＴＣＲβ定常ドメインとトランスで共発現させることを含むが、これには限定されない。一本鎖ＴＣＲのいくつかの態様は、ＴＣＲαとＴＣＲβの可変鎖断片をリンカーで共有結合し、ＣＤ３εまたはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに単独でまたはＣＤ２８シグナル伝達ドメインと組み合わせて融合させたものを含むが、これに限定されない。

【0105】

本明細書で使用する場合、「遺伝子発現の空間的パターン」という用語は、特定の領域または空間における遺伝子の発現を指す。いくつかの態様において、「遺伝子発現の空間的パターン」は、腫瘍などの組織内での、すなわち、腫瘍内における遺伝子の発現を指す。いくつかの態様において、「遺伝子発現の空間的パターン」は、１つ以上の表現型マーカーの発現または発現の欠如によって特徴付けられる領域または空間において、遺伝子発現が濃縮されていることを指す。いくつかの態様において、表現型マーカーは、１つ以上の表面マーカーまたはその断片、１つ以上のタンパク質またはその断片、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または他の任意のＲＮＡなどの１つ以上のＲＮＡを含むがこれらには限定されない、表現型と関連する任意のマーカーであってよい。他の態様において、「遺伝子発現の空間的パターン」は、少なくとも１つの他の遺伝子の発現または発現の欠如と組み合わせた、１つの遺伝子の発現または発現の欠如を指す。

【0106】

本明細書で使用する場合、「共発現パターン」という用語は、同一細胞内または同一組織試料内における１つ以上の遺伝子の発現を含む。いくつかの態様において、「共発現パターン」という用語は、同一細胞内または同一組織試料内における１つ以上の遺伝子の発現の欠如を指す。

【0107】

「癌」という用語は、分化能の消失を伴う特徴的な退形成、速い増殖速度、周辺組織への浸潤、および転移能を示す悪性新生物を意味する。「癌」という用語は、対象における細胞の制御不能な増殖を特徴とする疾患を含むものとする。いくつかの態様において、「癌」および「腫瘍」という用語は、同じ意味で用いられる。いくつかの態様において、「腫瘍」という用語は、良性すなわち非悪性の増殖を指す。

【0108】

「ライブラリー」という用語は、ＴＣＲ鎖のコレクションを意味する。いくつかの態様において、ライブラリーは、組み合わさってＴＣＲαβの対を形成するＴＣＲ鎖のコレクションを含む。いくつかの態様において、ライブラリーは、組み合わさってＴＣＲαβの対を形成するＴＣＲ鎖のサブセットまたは選択物のコレクションを含む。

【0109】

本明細書で使用する場合、「新生抗原」という用語は、腫瘍特異的なゲノム変異に由来する抗原を指す。例えば、新生抗原は、非同義一塩基変異に起因して腫瘍試料中で変異タンパク質が発現した結果、または変異によってフレームシフトが誘発されたことで別の読み取り枠が発現した結果、生じる場合がある。したがって、新生抗原は病的状態に関連し得る。いくつかの態様において、「変異タンパク質」は、標準的なアミノ酸配列の同じ位置にあるアミノ酸とは異なるアミノ酸を少なくとも１つ含むタンパク質を指す。いくつかの態様において、変異タンパク質は、標準的なアミノ酸配列への挿入、欠失、置換、読み取り枠シフトに起因するアミノ酸の包含、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0110】

「治療」という用語は、当該技術分野における通常の意味を包含し、障害の少なくとも１つの形態または他の症状の緩和、または疾患重症度の軽減などを含む。治療は、完全な治癒をもたらす、または疾患のすべての症状または発現を根絶する必要はなく、実行可能な治療を構成する。関連分野で認識されているように、治療薬として使用される組成物は、所与の病状の重症度を軽減させることができるが、有用とみなされるために疾患のすべての発現を消失させる必要はない。疾患の影響を軽減すること（例えば、その症状の数または重症度を軽減することによって、または別の治療の有効性を高めることによって、または別の有益な効果をもたらすことによって）、または対象に疾患が発生するまたは疾患が悪化する可能性を低減することで十分である。

【0111】

「抗体」は、少なくとも免疫グロブリン可変領域の軽鎖または重鎖のいずれかを含むポリペプチドであり、抗原のエピトープを特異的に認識して結合するものを指す。いくつかの態様において、抗体は、重鎖および軽鎖からなり、それぞれの鎖は、可変重（Ｖ_Ｈ）領域および可変軽（Ｖ_Ｌ）領域と呼ばれる可変領域を有する。Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、共に、抗体によって認識される抗原に結合する役割を果たす。抗体という用語は、インタクトな免疫グロブリン、ならびにそのバリアントおよび部分、例えばＦａｂ'断片、Ｆ（ａｂ）'２断片、およびインタクトな免疫グロブリンに由来する他の任意の分子を含む。

【0112】

本明細書で使用する場合、「Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）／抗体レパトア」という句は、試料中のＢＣＲまたは抗体鎖のコレクションを指す。いくつかの態様において、「ＢＣＲ／抗体レパトア」は、試料中のすべてのＢＣＲまたは抗体鎖のコレクションを指す。いくつかの態様において、「ＢＣＲ／抗体レパトア」は、試料中のＢＣＲまたは抗体鎖のサブセットまたは選択物のコレクションを指す。

【0113】

本明細書で使用する場合、「新鮮凍結」または「瞬間凍結」という用語は、組織または細胞試料を採取後、時間をおかずに凍結することを意味する。いくつかの態様において、組織または細胞試料は、凍結前に保存されない。「新鮮凍結」または「瞬間凍結」という用語は、同じ意味で用いられる。

【0114】

本明細書で使用する場合、「ＴＣＲ単離」という用語は、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のどの特定の組み合わせが所望の機能を媒介するかという評価を包含する。「ＴＣＲ単離」という用語は、一本鎖ＴＣＲ分子の単離を意味する場合もある。ＴＣＲ単離の方法は、所望の機能とＴＣＲカセットの設計によって異なる場合がある。

【0115】

「活性化マーカー」という用語は、当業者に理解される用語の全範囲を包含し、さらに、外部刺激に応答して細胞内で差次的に制御される１つまたは複数の遺伝子を意味する。活性化マーカーとして機能する遺伝子は、細胞ゲノムの天然部分であっても、または当業者に知られている遺伝子工学ツール（例えば、ウイルス遺伝子送達）により導入されてもよい。注目すべきは、差次的制御は、ＲＮＡレベルとして検出される遺伝子発現の増加または減少を説明し得る。特定の例において、転写産物レベルのそのような変化は、タンパク質レベルで検出可能な変化をもたらす場合がある。非限定的な例として、Ｔ細胞受容体の誘発と相関するＴ細胞の活性化マーカーには、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＯＸ４０、ならびにＮＦＡＴ－ＧＦＰまたはＮＦＡＴ－ピューロマイシン耐性遺伝子などの人工レポーター遺伝子が含まれる得る。

【0116】

本明細書で使用する場合、「ＴＣＲライブラリー」という用語は、ＴＣＲをコードしているプラスミドまたはそれらのプラスミドを含んでいる細胞のポリクローナルなコレクションを指す。コレクションは、少なくとも２つ以上の異なるＴＣＲ鎖バリアントを含む場合がある。「ＴＣＲライブラリー」は、ＴＣＲをコードしているプラスミドのサブセットまたは選択物のコレクションを含む場合がある。「ＴＣＲライブラリー」は、ＴＣＲをコードしているプラスミドのコレクションから発現させることができる、全ＴＣＲのコレクションを指す場合がある。いくつかの態様において、「ＴＣＲライブラリー」は、ＴＣＲをコードしているプラスミドのコレクションから発現させることができるＴＣＲのサブセットまたは選択物のコレクションを指す。いくつかの態様において、「ＴＣＲライブラリー」は、ＴＣＲをコードしているプラスミドのポリクローナルなコレクションに含まれるＴＣＲαβ対のコレクションを指す。いくつかの態様において、「ＴＣＲライブラリー」は、ＴＣＲをコードしているプラスミドのポリクローナルなコレクションに含まれるＴＣＲαβ対のサブセットまたは選択物のコレクションを指す。
様々な態様の一般的な説明

【0117】

本明細書に記載のいくつかの態様は、核酸のコンビナトリアルライブラリーから、Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖とＴＣＲβ鎖をコードしているヌクレオチド配列を同定する方法に関する。いくつかの態様において、この方法は、（Ｉ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードしている複数のバリアント核酸を含んでいるライブラリーを提供すること、（ＩＩ）複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされているＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に、ライブラリーを導入すること、（ＩＩＩ）抗体への応答に対する閾値レベルを上回るマーカーの発現に基づいて、細胞集団の亜集団を選択すること、ここで亜集団は複数の細胞を含み、（ＩＶ）亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること、（Ｖ）バリアント核酸のヌクレオチド配列を決定すること、ならびに（ＶＩ）サブセットに含まれるヌクレオチド配列の、対照との比較における濃縮度に基づいて、少なくとも１つのバリアントヌクレオチド配列を同定すること、を含む。いくつかの態様において、濃縮度は、適切な分析用ソフトウェアを用いた統計的な濃縮度に基づく場合がある。いくつかの態様において、濃縮度の有意性を同定するために、Ｒ ＤＥＳｅｑ２パッケージを使用を使用することができる。いくつかの態様では、有意性に関するｐ値の閾値は、０．２、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、０、またはこれらいずれかの値の間の任意の値として定義することができる。

【0118】

いくつかの態様では、多様なＴ細胞集団からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収するための方法を説明する。この方法は、（Ｉ）対象の試料に含まれるＴＣＲαおよびＴＣＲβのヌクレオチド配列を決定すること、（ＩＩ）このレパトア全体から、少なくとも１つの基準に基づいて、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のサブセットを１つ以上選択すること、（ＩＩＩ）ＴＣＲαβ対のライブラリーを形成する選択したＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによって、ＴＣＲレパトアを作製すること、ならびに、ＩＶ）この作製したＴＣＲレパトアから、所望の特徴を有するＴＣＲαとβの対を少なくとも１つ同定すること、を含む場合がある。図１～３に、この方法の様々な態様を示す。

【0119】

いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖の選択は、本明細書でさらに説明するように、最初は頻度閾値に基づいて行われるであろう。いくつかの態様において、選択は、１つ以上の基準に基づいて行われるであろう。選択に関する１つ以上の基準を、例えば、分析された腫瘍の型に基づいて選んでもよい。いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖の選択は、スクリーニング効率の閾値に基づく。いくつかの態様において、選択基準は、どの程度の数のコンビナトリアルＴＣＲαβ鎖を効率的にスクリーニングすることができるかに基づいて選択される。例えば、１×１０^６のＴＣＲαβ対を効率的にスクリーニングできる場合、最大１０００のＴＣＲα鎖および１０００個のＴＣＲβ鎖が選択され得る。いくつかの態様では、例えば、Ｔ細胞のかなりの割合が２つのインフレームＴＣＲα再構成を担持するという事実を補償するために、異なる数のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を選択してもよい。いくつかの態様では、ＴＣＲαとＴＣＲβの比を、例えば１００万：１～１：１００万とすることができる。いくつかの態様では、比を、例えば、１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、１０：１、１：１、１：１０、１：１００、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００を含む、これらの範囲の間にある任意の比とすることができる。

【0120】

いくつかの態様では、本明細書に記載の方法によって生成されたライブラリーにおいて同定されたＴＣＲ鎖配列は、単離したＴＣＲ鎖配列を提供した患者の治療または診断に有用である。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法によって生成されたライブラリーにおいて同定されたＴＣＲ鎖配列は、単離したＴＣＲ鎖配列を提供した患者以外の患者の治療または診断に有用である。例えば、ある患者から単離されたＴＣＲ鎖配列は、別の患者が共有する腫瘍抗原を認識する可能性がある。

【0121】

いくつかの態様では、本明細書に記載の方法によって大量のライブラリーが生成される。いくつかの態様では、大量のライブラリーをスクリーニングすることにより、ＴＣＲの特徴の予測が可能になり、それによって、例えば、ＴＣＲ鎖の特異的な選択が可能になる。

【0122】

いくつかの態様において、ＴＣＲライブラリーは、ｉ）コンビナトリアルＴＣＲライブラリー；ｉｉ）このようなライブラリーを発現している細胞；および／またはｉｉｉ）ＴＣＲアンプリコンの配列決定用ライブラリーを含む場合がある。

【0123】

いくつかの態様において、ＴＣＲライブラリーは、コンビナトリアル様式で正確に１つのＴＣＲα鎖と１つのＴＣＲβ鎖を発現するプラスミドの、ポリクローナルなコレクションである。ライブラリーの性質は、所与のα鎖が所与のβ鎖と対になっている頻度が、そのβ鎖の全体的な発現量に比例するようなものである。逆に、所与のβ鎖が所与のα鎖と対になっている頻度は、そのα鎖の全体的な発現量に比例する（このことから、ライブラリー内の個々の鎖の頻度を制御できることがわかる）。個々の組み合わせの頻度が中央値の頻度±１ｌｏｇ２単位の範囲内にある割合は、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、８６％、９７％、９８％、９９％、１００％、または任意の前記２つの値の間である。

【0124】

いくつかの態様において、ライブラリーは、関連する核酸配列を発現している細胞を伴う場合がある。発現は、安定的または一時的な手法を含んでいてもよく、ＤＮＡ／ＲＮＡ（またはその誘導体）によって付与されてもよい。そのようなライブラリーを発現しているポリクローナルプールに含まれる細胞の数は、プール中に存在するＴＣＲバリアントの数に、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、７５０、１，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００を乗じた数であってよい。

【0125】

いくつかの態様において、ＴＣＲアンプリコンの配列決定用ライブラリーは、所与の試料に含まれるＴＣＲの頻度を表すＤＮＡ分子のコレクションである。アンプリコンは所与の細胞で発現するα鎖およびβ鎖の両方に関する情報を含み、また、Ｖ領域とＪ領域の両方の同一性、ならびにα鎖とβ鎖の両方のＣＤＲ３配列を同定するためには、６００以上の連続した一連のヌクレオチド配列が必要である。

【0126】

いくつかの態様において、ライブラリーは、約１．５ｋｂのバリアントライブラリーである。

【0127】

本明細書に記載の方法で使用される多様なＴ細胞集団は、任意の系統のＴ細胞またはそれらの混合物を含み得る。いくつかの態様において、多様なＴ細胞集団は、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において、多様なＴ細胞集団は、ナイーブＴ細胞を含む。いくつかの態様において、多様なＴ細胞集団は、エフェクターＴ細胞を含む。任意のタイプのエフェクターＴ細胞は、Ｔｈ_１、Ｔｈ_２、Ｔｈ_１７および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む、多様なＴ細胞集団中に見出され得る。いくつかの態様において、多様なＴ細胞集団は、制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）を含む。いくつかの態様において、多様なＴ細胞集団は、記憶Ｔ細胞を含む。任意の記憶サブタイプは、中心記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＣＭ細胞）、エフェクター記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＥＭ細胞およびＴ_ＥＭＲＡ細胞）、組織常在記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＲＭ）、記憶幹細胞Ｔ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）ならびに仮想記憶Ｔ細胞を含む、多様なＴ細胞集団中に見出され得る。いくつかの態様において、仮想記憶Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において、仮想記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において、多様なＴ細胞集団は、制御性Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において、多様なＴ細胞集団は、機能不全Ｔ細胞を含む。機能不全Ｔ細胞は、（１）抑制性受容体が高レベルであること、（２）ケモカインＣＸＣＬ１３を分泌しながらも、古典的なエフェクター機能（例えばＩＦＮ－γ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α）を喪失していること、および（３）高レベルのグランザイムＢなどの細胞障害と関連する転写プロファイルが高レベルで発現していること、によって特徴づけられる。いくつかの態様において、多様なＴ細胞集団は、αβＴ細胞を含む。いくつかの態様において、多様なＴ細胞集団は、γδＴ細胞を含む。多様なＴ細胞集団は、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）および粘膜関連不変性Ｔ細胞（ＭＡＩＴ）を含む場合がある。Ｔ細胞集団は、異なる細胞型の混合物の一部または組織試料の一部、例えば、血液もしくは腫瘍組織等であり得る。多様なＴ細胞集団は、異なる系列のＴ細胞の混合物またはＴ細胞と非Ｔ細胞の混合物を含み得る。

【0128】

いくつかの態様において、ＴＣＲαおよびβのヌクレオチド配列は、対象の試料内で決定される。ＴＣＲαおよびβのヌクレオチド配列は、試料から得られたＤＮＡまたはＲＮＡを利用して決定することができる。いくつかの態様において、ＴＣＲαおよびβのヌクレオチド配列を決定することは、多重ＰＣＲを含む。いくつかの態様において、ＴＣＲαおよびβのヌクレオチド配列を決定することは、標的濃縮によるＴＣＲ配列の回収を含む。例えば、標的濃縮に関して、ＴＣＲ遺伝子の捕捉を利用することができる（リンネマンら、ネイチャー・メソッズ、２０１３）。いくつかの態様において、ＴＣＲ配列の回収は、５'ＲＡＣＥおよびＰＣＲによる回収を利用することを含む。いくつかの態様において、ＴＣＲ配列の回収は、空間的配列決定を利用することを含む。

【0129】

いくつかの態様において、ＤＮＡまたはＲＮＡは、生存細胞から単離される。いくつかの態様において、ＤＮＡまたはＲＮＡは、保存された細胞または保存された組織試料から単離される。保存された細胞および保存された組織試料は、生存細胞であっても、または非生存細胞であってもよい。保存された組織試料は、生存細胞もしくは非生存細胞を含んでいても、または生存細胞と非生存細胞両方の組み合わせを含んでいてもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡは、瞬間凍結した細胞または組織、および固定またはホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料など、任意の保存方法によって保存された試料または標本から単離することができる。細胞および組織試料の保存方法ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離方法は、当業者に公知である。いくつかの態様において、試料は、腫瘍試料である。いくつかの態様において、腫瘍試料は、ＦＦＰＥ試料である。いくつかの態様において、腫瘍試料は、瞬間凍結試料である。いくつかの態様において、Ｔ細胞集団は、異なる細胞型の混合物の一部または組織試料の一部、例えば血液、尿、流入領域リンパ節もしくは腫瘍組織等である。いくつかの態様において、試料は、非生存性腫瘍標本である。いくつかの態様において、非生存性腫瘍標本は、瞬間凍結試料またはＦＦＰＥ試料である。

【0130】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、レパトア全体から、ａ）Ｔ細胞集団中での頻度に基づいて、ｂ）第二のＴ細胞集団との比較における相対的な濃縮度に基づいて、ｃ）ＴＣＲ鎖の生物学的特性であって、ここでこの特性が、（予測される）抗原特異性、（予測される）ＨＬＡ拘束性、親和性、共受容体依存性、または親Ｔ細胞系列（例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８Ｔ細胞）のうちの少なくとも１つから選択される、ＴＣＲ鎖の生物学的特性に基づいて、ｄ）遺伝子発現の空間的パターンであって、ここで空間的な遺伝子の発現パターンが、組織での起源領域または他の遺伝子の発現パターン、例えば共発現など、の少なくとも１つに由来する、遺伝子発現の空間的パターンに基づいて、ｅ）例えば複数の腫瘍病変において出現しているなど、複数の試料において同様の頻度で共出現または出現していることに基づいて、ｆ）このＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するための、複数の群への選択に基づいて、ｇ）異なる態様で定義したような複数の基準の組み合わせに基づいて、のうちの少なくとも１つの基準に基づいて選択される。

【0131】

いくつかの態様において、選択基準を、包含する代わりに除外するために（例えば、前段落の選択肢ｂまたはｃにおいて）用いることができる。このことは、本明細書で提供されるいずれの態様にも適用することができる。したがって、対象に投与もしくは供給しないために、またはＴＣＲコレクションへのその包含を除外するために、基準を適用することができる。

【0132】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の配列は、所与のＴＣＲ鎖と比較してＤＮＡおよびＲＮＡのコピー数が異なることに基づいて、全レパトアから選択される。例えば、ＲＮＡ由来のコピー数とゲノムコピー数の比は、所与のＴＣＲ鎖のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡを定量化することに基づいて求めることができる。いくつかの態様では、ＲＮＡのコピー数がゲノムＤＮＡのコピー数よりはるかに多く、１より大きい比となるＴＣＲ鎖が選択される。いくつかの態様では、試料に含まれる他の全てのＴＣＲに対して任意の所与のＴＣＲに関して得られた比を順位付け、選択することができる。例えば、比がより小さいために順位がより低くなっているＴＣＲと比較して、比がより大きいために順位がより高くなっているＴＣＲを選択することで、ＲＮＡのコピー数がより多いＴＣＲ鎖を選択することができる。いくつかの態様では、比がより大きいために順位がより高くなっているＴＣＲと比較して、比がより小さいために順位がより低くなっているＴＣＲを選択することで、ＲＮＡのコピー数がより少ないＴＣＲ鎖を選択することができる。順位を、ＲＮＡ由来のコピー数とゲノムコピー数との間の比に関する任意の数値に調整することができる。

【0133】

いくつかの態様では、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの鎖はそれぞれ最大１０００までの範囲で、任意の数のＴＣＲα鎖と任意の数のＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、それぞれ１０００を超えるＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の数は、約１×１０^６のＴＣＲαβ対を生じるように選択される。いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の数は、１×１０^６を超えるＴＣＲαβ対を生じるように選択される。

【0134】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、全レパトアから、Ｔ細胞集団中での頻度に基づいて選択される。いくつかの態様では、ＴＣＲ配列の頻度に関するデータを用いて、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖に関する別の順位が作成される。例えば、異なるＴＣＲ鎖のアミノ酸配列（の一部）をコードする核酸分子の絶対数を、多重ＰＣＲ、標的濃縮または５'ＲＡＣＥとＰＣＲを用いて、Ｔ細胞を含有する試料について決定してもよい。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法においてＤＮＡが使用される。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法においてＲＮＡが使用される。得られたＴＣＲ鎖配列のコレクションは、ＴＣＲα鎖配列のコレクションとＴＣＲβ鎖配列のコレクションとに分けられる。ＴＣＲセグメントがアミノ酸配列レベルで読み取り枠から外れて結合している、および／または停止コドンが導入されている、および／またはフレームシフト変異が存在する、および／または欠陥のあるスプライシング部位が存在する、任意の非生産的ＴＣＲ鎖配列はコレクションから除去される。いくつかの態様では、特定のＴＣＲ鎖のアミノ酸配列（の一部）をコードする核酸分子の絶対数を、「固有の分子識別子」（ＵＭＩ）を用いた固有の分子の数に基づいて決定し、降順に並び替えてＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を順位づける。いくつかの態様では、各コレクションを、特定のＴＣＲ鎖をコードしている核酸分子の絶対数（あるいは、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲｂ鎖それぞれの総数に対する割合）のいずれかを用いて降順に並び替え、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の順位を決定する。

【0135】

本明細書で提供されるいずれの態様においても、ＲＮＡを回収または作製し、ＤＮＡ配列決定を行う代わりにＲＮＡの配列を分析することができる。

【0136】

いくつかの態様では、ＴＣＲ配列の頻度に関するデータを用いて、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖に関する複合順位が作成される。例えば、異なるＴＣＲ鎖アミノ酸配列（の一部）をコードする核酸分子の絶対数を、多重ＰＣＲ、標的濃縮または５'ＲＡＣＥとＰＣＲを用いて、Ｔ細胞を含有する試料について決定してもよい。いくつかの態様にでは、本明細書に記載の方法においてＤＮＡが使用される。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法においてＲＮＡが使用される。ＴＣＲセグメントがアミノ酸配列レベルで読み取り枠から外れて結合している、および／または停止コドンが導入されている、および／またはフレームシフト変異が存在する、および／または欠陥のあるスプライシング部位が存在する、任意の非生産的ＴＣＲ鎖配列は、コレクションから除去される。残りのＴＣＲ鎖の配列を、特定のＴＣＲ鎖をコードする核酸分子の絶対数（必要に応じて固有の分子識別子（ＵＭＩ）を用いて決定される）、またはＴＣＲ鎖の全セット中での割合のいずれかを用いて降順に並び替え、ＴＣＲ鎖の順位を決定する。

【0137】

いくつかの態様において、頻度閾値は、ＴＣＲレパトアの回収に関して望まれる深度で定義される。例えば、異なるＴＣＲ鎖アミノ酸配列（の一部）をコードする核酸分子の絶対数を、多重ＰＣＲ、標的濃縮または５'ＲＡＣＥとＰＣＲを用いて、および必要に応じて、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を用いて、Ｔ細胞を含有する試料について決定してもよい。本明細書に記載の方法においてＤＮＡが使用される。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法においてＲＮＡが使用される。得られたＴＣＲ鎖配列のコレクションは、ＴＣＲα鎖配列のコレクションとＴＣＲβ鎖配列のコレクションとに分けられる。ＴＣＲセグメントがアミノ酸配列レベルで読み取り枠から外れて結合している、および／または停止コドンが導入されている、および／またはフレームシフト変異が存在する、および／または欠陥のあるスプライシング部位が存在する、任意の非生産的ＴＣＲ鎖配列は、コレクションから除去される。各コレクションを、特定のＴＣＲ鎖をコードしている核酸分子の絶対数（あるいは、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲｂ鎖それぞれの総数に対する割合）のいずれかを用いて降順に並び替え、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の順位を決定する。試料中で最も頻度のが高い１０のＴＣＲを回収することを意図している場合、最も頻度の高い上位１０のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のみを選択してもよい。対照的に、試料に含まれるＴＣＲレパトアの大部分を回収することが望まれる場合、最も頻度の高い上位１０を超えるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を選択してもよい。頻度閾値を低くすると、選択したＴＣＲ鎖のプールや得られたＴＣＲライブラリーに、より大きな深度だけでなく、高い多様性をもたらす可能性がある。重要なことに、本開示の態様の１つに記載したように、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖を、複合順位からもまた選択してもよい。

【0138】

いくつかの態様では、より低い頻度閾値を用いて、頻度に基づいてＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を選択する。いくつかの態様では、等しい数のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を選択する必要はない。例えば、異なるＴＣＲ鎖アミノ酸配列（の一部）をコードする核酸分子の絶対数を、多重ＰＣＲ、標的濃縮または５'ＲＡＣＥとＰＣＲを用いて、および必要に応じて、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を用いて、Ｔ細胞を含有する試料について決定してもよい。本明細書に記載の方法においてＤＮＡが使用される。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法においてＲＮＡが使用される。得られたＴＣＲ鎖配列のコレクションは、ＴＣＲα鎖配列のコレクションとＴＣＲβ鎖配列のコレクションとに分けられる。ＴＣＲセグメントがアミノ酸配列レベルで読み取り枠から外れて結合している、および／または停止コドンが導入されている、および／またはフレームシフト変異が存在する、および／または欠陥のあるスプライシング部位が存在する、任意の非生産的ＴＣＲ鎖配列は、コレクションから除去される。各コレクションを、特定のＴＣＲ鎖をコードしている核酸分子の絶対数（あるいは、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲｂ鎖それぞれの総数に対する割合）のいずれかを用いて降順に並び替え、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の順位を決定する。その結果得られる順位は、等しい数のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を選択することを妨げる、異なる数のＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖を含み得る。あるいは、例えば細胞内の両方のＴＣＲα遺伝子座が生産的に再構成される傾向があるため、一方のカテゴリーから、他方よりも、多くのＴＣＲ鎖を選択することが望まれる場合もある。さらに、特定の頻度（絶対数もしくは割合で表される）を超えるかまたはそれ未満の全てのＴＣＲ鎖を選択した場合、これによって、それぞれ異なる数のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖が選択される可能性がある。重要なことに、先の態様の１つに記載したように、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖を、複合順位からもまた選択してもよい。

【0139】

いくつかの態様では、定量的頻度データに基づいて、最も豊富な上位１００のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、定量的頻度データに基づいて、最も豊富な上位１００を超えるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、頻度データに基づいて、最も豊富な上位１００、上位２００、上位３００、上位４００、上位５００、上位６００、上位７００、上位８００、上位９００、上位１０００、またはその間の任意の数もしくは範囲のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、頻度データに基づいて、最も豊富な上位１０００を超えるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、頻度データに基づいて、上位５％、上位１０％、上位２０％、上位３０％、上位４０％、上位５０％、上位６０％、上位７０％、上位８０％、上位９０％、上位１００％、またはその間の任意の数もしくは範囲のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、選択された鎖は、ＴＣＲαβ対のコレクションを構成するための基本単位として機能する。

【0140】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、全レパトアから、第二のＴ細胞集団との比較における相対的な濃縮度に基づいて選択される。いくつかの態様では、別の試料と比較した場合に、所与の試料において最も高倍率の濃縮度の上位１００のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、相対的な濃縮度に基づいて、最も豊富な上位１００のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、最も高倍率の濃縮度とは別の試料との比較である。いくつかの態様では、相対的な濃縮度に基づいて、最も豊富な上位１００を超えるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、相対的な濃縮度に基づいて、最も豊富な上位１００、上位２００、上位３００、上位４００、上位５００、上位６００、上位７００、上位８００、上位９００、上位１０００、またはその間の任意の数もしくは範囲のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、相対的な濃縮度に基づいて、最も豊富な上位１０００を超えるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、相対的な濃縮度に基づいて、上位５％、上位１０％、上位２０％、上位３０％、上位４０％、上位５０％、上位６０％、上位７０％、上位８０％、上位９０％、上位１００％、またはその間の任意の数もしくは範囲のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が選択される。いくつかの態様では、腫瘍病変からのＴＣＲ鎖は、血液における対応する頻度との比較における相対的な濃縮度に基づいて、選択される。いくつかの態様では、腫瘍病変からのＴＣＲ鎖は、第二の腫瘍病変との比較における相対的な濃縮度に基づいて、選択される。いくつかの態様では、複数の試料におけるＴＣＲの定量を並行して実施する。例えば、複数の腫瘍病変、同一個体由来の対応させた腫瘍病変と血液試料、またはより大きな腫瘍病変の異なる箇所から採取した複数の切片を並行して分析することができる。同一個体に由来する複数の試料または対応させた試料を分析することで、ＴＣＲ鎖の生物学的関連性を決定することができる。例えば、血液と比較して腫瘍において濃縮された頻度を有してるかまたは複数の腫瘍病巣において出現するＴＣＲ鎖は、末梢血にも高い頻度で出現しているかまたは単一の腫瘍病巣に出現するＴＣＲ鎖と比較して、腫瘍抗原の認識と関連する可能性が高いと考えられる。いくつかの態様では、ＴＣＲ鎖は、腫瘍周囲の正常組織を含み得る腫瘍辺縁部または腫の境界領域と比較した場合の、腫瘍中心部におけるＴＣＲ鎖の頻度に基づいて選択される。開示したいずれかの態様では、相対頻度の差は、相対頻度の倍率差に基づく順位を作成するために使用することができる。相対頻度の倍率差は、１０^－６～１０^６の間の任意の数であってよい。いくつかの態様では、比較した少なくとも２つの試料のうちの１つにのみ見出されるＴＣＲ鎖は、ＴＣＲライブラリー生成のために優先的に選択または除外することができる。いくつかの態様では、順位が上位１００のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が、ＴＣＲライブラリーの生成に使用される。いくつかの態様では、順位が上位１００を超えるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が、ＴＣＲライブラリーの生成に使用される。いくつかの態様では、新生抗原特異的である可能性が高いＴＣＲ鎖を標的選択するために、異なる試料に含まれるＴＣＲ鎖レパトアを比較する。いくつかの態様では、ＴＣＲ鎖配列を相対的な濃縮度に基づいて順序付け、次いで、例えば前述のように、頻度に基づく順位に従って選択する。ＴＣＲ鎖を選択するためには、基準をどのような順序で使用しても、基準をどのように組み合わせて使用してもよい。

【0141】

本明細書で提供されるいずれかの態様では、複数の測定基準を使用することもできる。すなわち、２つ以上の側面の組み合わせによる順位付け、例えば頻度による順位付けと腫瘍濃縮度による順位付けなど、を行うことができる。いくつかの態様において、ＴＣＲは、腫瘍における高い頻度と腫瘍における濃縮度の両方を有する。

【0142】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、全レパトアから、ＴＣＲ鎖の生物学的特性または配列の特徴に基づいて選択される。いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖の生物学的特性または配列の特徴は、（予測される）抗原特異性、（予測される）ＨＬＡ拘束性、親和性、共受容体依存性、または親Ｔ細胞系列（例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８Ｔ細胞）のうちの少なくとも１つから選択される。いくつかの態様において、生物学的特性に関する情報は、インシリコでのアルゴリズムに基づく予測によって得られる。

【0143】

いくつかの態様では、試料中のＴＣＲクラスターを同定するためにアルゴリズムが使用される。ＴＣＲクラスターに関する情報は、例えば、その後のＴＣＲライブラリー生成のためのＴＣＲ鎖の標的選択に使用することができる。いくつかの態様では、ＴＣＲクラスターに関する情報は、定義された特性を有するクラスターを選択するために使用される。いくつかの態様では、ＴＣＲクラスターに関する情報は、クラスターと公開されているＴＣＲデータベースを比較するために使用される。いくつかの態様では、ＴＣＲクラスターに関する情報は、無関係なＴＣＲ特異性を有する可能性の高いクラスターまたはＴＣＲ鎖を除去するために使用される。いくつかの態様では、クラスターは、クラスターと公開されているＴＣＲデータベースとの比較に基づいて除去される。無関係である可能性が高いＴＣＲ特異性の例としては、例えば、インフルエンザ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、および他のウイルスならびに細菌の感染性物質に由来するウイルスエピトープの認識などがある。生成されたＴＣＲ鎖のセットであって、無関係なＴＣＲ鎖が除去されているＴＣＲ鎖のセットは、その後、ＴＣＲライブラリー生成のために使用することができる。いくつかの態様では、ＴＣＲクラスターに関する情報は、関連するアミノ酸配列を有するＴＣＲ鎖のクラスターを優先的に含めるために使用される。

【0144】

いくつかの態様では、ＴＣＲの特性は、ＴＣＲ鎖のアミノ酸配列に基づいて同定される。いくつかの態様では、ＴＣＲの特性は、ＴＣＲαβ複合体の構造的特徴に基づいて同定される。特性の例としては、例えば、ＨＬＡ拘束性、抗原特異性、共受容体依存性、親Ｔ細胞系列、ＴＣＲのクラスター間で共有される特性、その他が挙げられる。

【0145】

いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、全レパトアから、空間的な情報に基づいて選択される。いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、全レパトアから、遺伝子またはタンパク質発現の空間的パターンに基づいて選択され、ここで、遺伝子またはタンパク質発現の空間的パターンは、組織内の起源領域または他の遺伝子もしくはタンパク質の共発現パターン（疑いを避けるために共発現がない可能性も含む）の少なくとも１つに由来する。いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖は、腫瘍内局在性に基づいて選択される。いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖は、特定の表現型マーカーの過剰発現（または発現の欠如）を示している空間における濃縮度に基づいて選択される。表現型マーカーは、１つ以上の表面マーカーもしくはその断片、１つ以上のタンパク質もしくはその断片、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または他の任意のＲＮＡなどの１つ以上のＲＮＡを含むがこれらには限定されない、表現型と関連する任意のマーカーであってよい。

【0146】

いくつかの態様では、空間的配列決定法は、ＴＣＲ鎖をふるい分けるために使用される。空間的配列決定により、ＴＣＲの配列情報を含むトランスクリプトーム情報または遺伝情報を、組織内での細胞の位置とともに細胞から回収することができる。例えば、隣接する細胞のセットを回収し、それらの組織内での起源領域を示すラベルを付けることで、トランスクリプトーム情報や遺伝情報を空間的な次元と関連づける。組織内の同じまたは近傍の空間的位置から回収された細胞は、空間的クラスターを形成する。特定の空間的クラスターに由来するＴＣＲ鎖を、特定の情報に基づいて優先的に選択してもよい。使用できる情報には、例えば、解剖学的情報が含まれる。例えば、腫瘍中心部または三次リンパ節構造に局在する細胞のクラスターは、腫瘍辺縁部に局在するクラスターよりも強い関心をもたれる場合がある。使用できる情報には、例えば、トランスクリプトーム情報および／またはタンパク質の発現情報が含まれる。例えば、ＰＤ－１およびＣＤ３９の発現が高い空間的クラスターは、そのようなマーカーの発現が低いクラスターよりも、新生抗原特異的なＴＣＲ鎖が濃縮されている可能性が高い。したがって、ＰＤ－１およびＣＤ３９の発現が高いクラスターを、ＴＣＲ鎖をふるい分けるために選択することができる。いくつかの態様において、クラスターは、例えば、腫瘍辺縁部と比較した場合の、腫瘍中心部における過剰発現に基づいて選択される。選択のための例示的なパラメーターを表１に示す。

【0147】

【表1】

【0148】

選択されたＴＣＲ鎖のセットは、ＴＣＲライブラリーの生成に使用することができる。いくつかの態様では、ＲＮＡまたはＤＮＡの空間分解配列決定が用いられる。いくつかの態様では、バルクＴＣＲ鎖集団は、例えば、Ｔ細胞の表現型に関連する付加的な転写物とともに回収される。Ｔ細胞の表現型に関連する転写物の例としては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＣＤ１０３、ＣＤ３９、ＦｏｘＰ３、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＣＸＣＬ１３等が挙げられる。いくつかの態様では、解剖学的局在性や、複数の空間的クラスターから回収されたＴ細胞特異的トランスクリプトームが、目的のクラスターを同定するために使用される。

【0149】

いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、全レパトアから、複数の試料において同様の頻度で共出現または出現していることに基づいて選択される。いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、全レパトアから、複数の腫瘍病変において出現していることに基づいて選択される。いくつかの態様において、複数の腫瘍病変に由来するＴＣＲ鎖の頻度情報は、目的のＴＣＲ鎖をふるい分けるために使用される。いくつかの態様では、目的のＴＣＲ鎖をふるい分けるために使用される特定の情報は、１つの腫瘍病変のみに発現しているＴＣＲ鎖を除外することを含む。いくつかの態様では、目的のＴＣＲ鎖をふるい分けるために使用される特定の情報は、試験された全腫瘍病変において発現しているＴＣＲ鎖を選択的に含めることを含む。

【0150】

いくつかの態様では、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、全レパトアから、ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するための、複数の群への選択に基づいて選択される。いくつかの態様では、定義された閾値を超える頻度を有する全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列は、まとめて１つの群に選択される。例えば、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列全体に対してある割合を構成する、例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．０５％もしくは０．０１％以上、またはこの範囲間の任意の他の数を構成する全てのＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を、１つの群に選択してもよい。同様の原理で、例えば、順位が１０以上（上位１０）、１００以上（上位１００）、１０００以上（上位１０００）または１００００以上（上位１００００）の全てのＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を、１つの群に選択してもよい。いくつかの態様では、定義された閾値を下回るまたは定義された２つの閾値の間にある全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列が、１つの群に選択される。例えば、１％未満または１％と０．１％の間にある全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を、１つの群に選択することができる。同様の原理で、例えば、順位が１０以下または順位が１０から１００の間にある全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を、１つの群に選択してもよい。いくつかの態様では、定義された閾値を超える頻度を有する全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列がまとめて１つの群に選択され、定義された閾値を下回る全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列が別の群に選択される。例えば、１％以上の全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を１つの群に選択し、１％未満の全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を第二の群に選択する。同様の原理で、例えば、順位１０以上の全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を１つの群に選択し、順位１０未満の全てのＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を第二の群に選択する。

【0151】

いくつかの態様では、実質的に複雑なＴＣＲライブラリーを作製することなく、大量のＴＣＲがスクリーニングされる。一例として、複数のサブライブラリーを生成することができる。いくつかの態様において、ＴＣＲライブラリーの複雑度は、含まれる全てのＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のランダムな対合から生じる複雑度よりも小さい。いくつかの態様では、生成されたＴＣＲライブラリーは、生じる可能性のあるＴＣＲαとＴＣＲβの組み合わせを全ては含まない。いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖のセットは、ＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列をランダムに対合させることによって得られるであろうよりも複雑度が低いライブラリーを１つ以上作製するために、個々のプールに分離される。いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖は、順位閾値に基づいてプールされる。いくつかの態様において、一定の順位内にある全てのＴＣＲは、ＴＣＲライブラリー生成用のプールを形成する。例えば、上位５０の順位のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をプール１に含めることができ、上位２５から７５までの順位のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をプール２に含めることができる、などである。さらなる例として、上位５０から１００までの順位のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を、プール２に含めることができる、などである。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖に関して別の閾値を使うことを含む、任意の順位基準を使用することができる。いくつかの態様において、順位は頻度に基づくものである。いくつかの態様において、順位付けは、参照試料と比較した場合の、相対的な濃縮度に基づくものである。いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖は、空間情報に基づいてプールされる。例えば、所与の空間的クラスターに由来する全てのＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖は、特定のプールを形成する場合がある。いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖は、ＴＣＲの特徴に基づいてプールされる。任意のＴＣＲの特徴を使用して、ＴＣＲをプールすることができる。例えば、定義された配列の特徴または予測される特性を有する全てのＴＣＲは、特定のプールを形成する場合がある。予測される特性の例としては、例えば、共受容体依存性、起源となるＴ細胞系列、ＨＬＡ拘束性、特異性等が挙げられる。

【0152】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、全レパトアから、異なる態様で定義されるような複数の基準の組み合わせに基づいて選択される。

【0153】

いくつかの態様において、ＴＣＲレパトアは、選択したＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによって作製される。いくつかの態様において、コンビナトリアルペアリングは、選択した全てのＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のランダムペアリングを含む。ＴＣＲαβ鎖のライブラリーは、選択したＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによって作製することができる。いくつかの態様では、選択したＴＣＲ鎖配列は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ断片のライブラリーを合成するために使用される。当業者に知られているクローニング戦略（例えば、ギブソン分子集合体およびゴールデンゲート集合体を含むが、これらに限定されない）を用いて、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ断片を正確に１つずつ連結させることによって、人工ＴＣＲ遺伝子を作製することができる。いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせは、正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結したＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を直接合成することによって生成される。いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせは、細胞がおよそ１つのＴＣＲα鎖と１つのＴＣＲβ鎖を発現するように、ＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子の別々のコレクションで細胞プールを修飾することによって、細胞内で作製される。

【0154】

いくつかの態様において、ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製する選択されたＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによってＴＣＲレパトアを作製することは、ａ）ＴＣＲ鎖配列を使用して、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ断片の別々のライブラリーを合成し、その後、正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結した１つのＤＮＡまたはＲＮＡ断片に連結すること、ｂ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを、正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結したＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を直接合成することによって生成すること、ｃ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを、細胞が少なくとも１つのＴＣＲα鎖と１つのＴＣＲβ鎖を発現するように、ＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子の別々のコレクションで細胞プールを修飾することによって、細胞内で作製すること、および／またはｄ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを一本鎖ＴＣＲ構築物に連結すること、ここで、この一本鎖ＴＣＲ構築物にはＴＣＲαおよびＴＣＲβ両方の可変鎖断片が融合されていて、かつ、（ｉ）膜貫通ドメインのみ、または（ｉｉ）ＣＤ３ζもしくはＣＤ３εシグナルドメインを単独でまたはＣＤ２８シグナルドメインとの組み合わせを含むがこれに限らない付加的な細胞内シグナル伝達ドメインと融合されている、のうちの少なくとも１つによって、達成される。

【0155】

本明細書のいずれの態様についても、いくつかの態様では、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ配列が回収される。

【0156】

本明細書で提供されるいずれの態様についても、いくつかの態様では、新生抗原特異的ＴＣＲ配列、ウイルス特異的ＴＣＲ配列、共有腫瘍抗原特異的ＴＣＲ配列、および／または自己抗原特異的ＴＣＲ配列のうちの少なくとも１つが回収される。

【0157】

いくつかの態様において、活性化マーカーは、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＯＸ４０からなる群より選択することができる。

【0158】

いくつかの態様において、ＴＣＲレパトアは、試料に含まれる全てのＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を表す。いくつかの態様において、ＴＣＲレパトアは、試料から回収された全てのＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を表す。いくつかの態様において、ＴＣＲレパトアは、試料中に存在するＴＣＲ配列の全レパトアから、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のサブセットとして選択される。いくつかの態様において、ＴＣＲレパトアは、試料から回収されたＴＣＲ配列全レパトアから、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のサブセットとして選択される。

【0159】

いくつかの態様において、方法は、作製されたＴＣＲレパトアから少なくとも１つのＴＣＲαβ対を同定することを含む。いくつかの態様において、ＴＣＲαβ対は、新たに生成される組合せを表す。いくつかの態様において、ＴＣＲαβ対は、新たに生成されない組合せを表す。いくつかの態様において、レポーター細胞またはＴ細胞のプールは、生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾される。いくつかの態様において、修飾されたレポーター細胞またはＴ細胞のプールは、少なくとも１つの目的の抗原を負荷された抗原提示細胞によって刺激され得る。レポーター細胞またはＴ細胞に対する任意の刺激アッセイを使用することができる。レポーター細胞またはＴ細胞に対する刺激アッセイは、当業者に知られている。いくつかの態様において、抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞は、少なくとも１つの活性化マーカーに基づいて単離される。例えば、任意のＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞活性化マーカーを使用することができる。いくつかの態様では、任意のＣＤマーカーを使用することができる。いくつかの態様では、活性化マーカーとして、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦなどのマーカーを挙げることができる。いくつかの態様において、抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞は、増殖性に基づいて単離される。いくつかの態様において、抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞は、レポーター細胞またはＴ細胞の活性化に依存した耐性遺伝子の発現によって獲得される抗生物質選抜への耐性に基づいて単離される。例えば、当業者に知られている、磁気ビーズ濃縮またはフローサイトメトリーを含むがこれらに限定されない、任意のレポーター細胞またはＴ細胞の単離方法を使用することができる。いくつかの態様では、レポーター細胞またはＴ細胞の単離が必要とされない場合がある。例えば、レポーター細胞もしくはＴ細胞の増殖性、または抗生物質による選択を利用した場合、選択の必要性が排除され得る。いくつかの態様において、ＲＮＡは、バルク抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞から得られる。バルク抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞から得られたＲＮＡは、ＴＣＲαβ特異的ｃＤＮＡを生成するために使用することができる。いくつかの態様において、ＴＣＲαβ特異的ｃＤＮＡは、抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞のＴＣＲαβ遺伝子の配列を決定するために、ＤＮＡ配列決定によって分析される。いくつかの態様において、ＤＮＡは、抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞のＴＣＲαβ遺伝子の配列を決定するためにＤＮＡ配列決定によって分析されるＴＣＲα／β特異的ＰＣＲ産物を生成するために、バルク抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞から得られる。いくつかの態様では、定義されたＴＣＲαβ対を、ＲＮＡまたはＤＮＡから生成された特異的ＰＣＲ産物の配列決定によって検出することができる分子核酸に基づく識別子（「バーコード」）と関連付けてもよい。

【0160】

いくつかの態様において、ＴＣＲαβ対は、単一細胞の使用に基づく手法を用いて決定される。単一細胞の使用に基づく手法には、例えば、ドロップレットＰＣＲが含まれる。単一細胞の使用に基づく手法を用いて、抗原反応性Ｔ細胞のＴＣＲαβ遺伝子の配列を分析することができる。いくつかの態様において、抗原反応性Ｔ細胞は、１つ以上の活性化マーカーによって同定される。例えば、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞活性化マーカーを含む、任意のＣＤマーカーを使用することができる。いくつかの態様において、活性化マーカーは、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦを含む。いくつかの態様において、抗原反応性Ｔ細胞は、その転写プロファイルによって同定される。

【0161】

いくつかの態様において、ＴＣＲαβ対は、バルクＴ細胞に挿入されたＴＣＲαβ遺伝子のゲノムＰＣＲによって決定される。いくつかの態様において、生成されたＰＣＲ産物は、ＤＮＡ配列決定分析に供される。

【0162】

いくつかの態様において、ＴＣＲが導入されたレポーター細胞またはＴ細胞の活性化は、レポーター遺伝子を用いて同定される。レポーター遺伝子は、ＴＣＲの誘発を示すことができる。レポーター遺伝子の例としては、例えば、ＮＦＡＴ－ＧＦＰまたはＮＦＡＴ－ＹＦＰが挙げられる。いくつかの態様において、抗原反応性レポーター細胞またはＴ細胞は、Ｔ細胞の活性化に依存した耐性遺伝子の発現によって獲得される抗生物質選抜への耐性に基づいて単離される。レポーター遺伝子の例としては、例えば、ＮＦＡＴ－ピューロマイシン耐性またはＮＦＡＴ－ハイグロマイシンが挙げられる。いくつかの態様では、レポーター遺伝子の組み合わせが使用される。

【0163】

いくつかの態様において、抗原反応性細胞は、目的の抗原を担持するＭＨＣ複合体への結合によって同定される。

【0164】

前記いずれの態様においても、少なくとも１つのＴＣＲαβ対が、作製されたＴＣＲレパトアから同定される。所望されるＴＣＲαβ対の特徴としては、抗原特異性、ＴＣＲ親和性、ＴＣＲ共受容体依存性、ＨＬＡ拘束性、ＴＣＲ交差反応性、ＴＣＲ抗腫瘍反応性、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。

【0165】

前記いずれの態様においても、回収されたＴＣＲ鎖配列は、完全なＴＣＲ鎖配列を組み立てるためのヌクレオチド配列アライメントに基づいて少なくとも１つのＴＣＲ－Ｖセグメントファミリーおよび少なくとも１つのＴＣＲ－Ｊセグメントファミリーを選択するのに十分な５'および３'のヌクレオチド配列情報とともに、ＣＤＲ３ヌクレオチド配列と定義される。いくつかの態様において、Ｊ遺伝子は、２桁または４桁の解像度で同定される。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列アライメントは、６５％配列同一性、７０％配列同一性、７５％配列同一性、８０％配列同一性、８５％配列同一性、９０％配列同一性、９５％配列同一性、９６％配列同一性、９７％配列同一性、９８％配列同一性、９９％配列同一性、１００％配列同一性、およびその間の任意の数または範囲に基づくものである。いくつかの態様では、作製されたＴＣＲライブラリーから所望の特徴を有するＴＣＲα鎖およびβ鎖を同定するのに十分な配列情報が得られる。

【0166】

いくつかの態様において、回収されたＴＣＲ鎖は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列によって定義される。いくつかの態様において、回収されたＴＣＲ鎖は、ＣＤＲ３のアミノ酸配列によって定義される。

【0167】

いくつかの態様において、回収されたＴＣＲ鎖は、少なくとも１つのＴＣＲ－Ｖおよび１つのＴＣＲ－Ｊセグメントファミリーを選択するのに十分な５'および３'のヌクレオチド配列情報によって定義される。いくつかの態様において、回収されたＴＣＲ鎖は、少なくとも１つのＴＣＲ－Ｖおよび１つのＴＣＲ－Ｊセグメントファミリーを選択するのに十分なアミノ酸配列情報によって定義される。いくつかの態様において、回収されたＴＣＲ鎖は、作製したＴＣＲライブラリーに含まれるＴＣＲαβ対を明確に同定するのに十分なヌクレオチドまたはアミノ酸配列情報として定義される。いくつかの態様において、回収されたＴＣＲ鎖は、作製したＴＣＲライブラリーに含まれるＴＣＲαβ対を明確に同定する、ヌクレオチドに基づくバーコードなどの、固有の分子識別子として定義される。

【0168】

いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖配列は、ヌクレオチド配列のアライメントに基づいて定義される。いくつかの態様において、ＴＣＲ鎖配列は、アミノ酸配列のアライメントに基づいて定義される。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のアライメントを用いて、完全なＴＣＲ鎖配列を組み立てることができる。

【0169】

いくつかの態様では、前述したような、非生存性の出発材料を含む対象由来の試料を使用することができる。非生存性の出発材料としては、例えば、非生存細胞または非生存組織試料が挙げられる。非生存性の出発材料は、当該技術分野において知られている任意の方法によって保存することができる。

【0170】

前述のいずれかの態様では、同定したＴＣＲレパトアの定義された部分を回収することができる。いくつかの態様において、同定したＴＣＲレパトアの定義された部分は、完全なＴＣＲレパトアではなく、ＴＣＲレパトアの選択された部分を回収することを含む。選択されたＴＣＲレパトアは、Ｔ細胞集団中での定義された頻度、第二のＴ細胞集団との比較における相対的な濃縮度、ＴＣＲ鎖の生物学的特性、遺伝子発現の空間的パターン、複数の試料において同様の頻度で出現または共出現していること、ＴＣＲ鎖の複数の群またはプールへの選択、またはそれらの任意の組み合わせなど、前述した基準のいずれかにより定義することができる。いくつかの態様において、選択されたＴＣＲレパトアは、所与の抗原特異性によって定義される。いくつかの態様において、抗原特異性は、新生抗原に対する特異性を含む。いくつかの態様において、抗原特異性は、予想される抗原特異性を含む。

【0171】

いくつかの態様では、抗原特異的ＴＣＲ配列が回収される。いくつかの態様では、新生抗原特異的ＴＣＲ配列が回収される。例えば、新生抗原は、腫瘍において見られ、抗原特異的Ｔ細胞によって認識される変異したタンパク質であり得る。したがって、腫瘍指向性の抗原特異的Ｔ細胞は、腫瘍またはその腫瘍抗原に特異的なＴＣＲ配列と共に存在し得る。

【0172】

前述のいずれかの態様では、抗原特異的ＴＣＲ配列を発現しているＴ細胞を、感染症または自己免疫疾患の診断または治療に使用することができる。

【0173】

前述のいずれかの態様では、新生抗原特異的ＴＣＲ配列を発現しているＴ細胞を、癌治療として投与することができる。例えば、新生抗原特異的Ｔ細胞を、新生抗原を発現する腫瘍を標的とするために使用することができる。いくつかの態様において、新生抗原特異的Ｔ細胞は、新生抗原特異的ＴＣＲ鎖をＴ細胞に導入することによって生成される。いくつかの態様において、新生抗原特異的ＴＣＲ配列を発現しているＴ細胞は、自己由来であってもまたは同種異系であってもよい。

【0174】

前述のいずれかの態様では、方法を、診断に用いることができる。例えば、ある組織抗原に対する抗原特異的ＴＣＲの存在は、自己免疫疾患の指標となり得る。別の例として、特定の病原体に対する抗原特異的ＴＣＲの存在は、感染症の指標となり得る。

【0175】

いくつかの態様において、診断は、感染症の病的部位からＴＣＲレパトアを回収することである。いくつかの態様において、診断は、自己免疫の部位からＴＣＲレパトアを回収することである。例えば、感染部位または自己免疫部位の細胞または組織は、特定のＴ細胞によって認識される特定の抗原を発現している場合がある。感染部位または自己免疫部位で特定の抗原を検出できるＴ細胞のＴＣＲ配列を決定することにより、感染部位や自己免疫部位に関連するかまたは特異的なＴＣＲレパトアを回収することができる。自己免疫を媒介する自己抗原または病原体に対するＴＣＲ配列を同定するために、選択したＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖から生成したＴＣＲαβのコンビナトリアルライブラリーを、選択した自己抗原または病原体由来の抗原のセットに対する反応性に関して試験することができる。

【0176】

前述した態様のいずれかにおいて、方法は、ＢＣＲ／抗体レパトアの回収に使用することができる。例えば、ＢＣＲ受容体を発現するＢ細胞または特定の抗原に特異的な抗体を産生するＢ細胞を回収することができる。このように、回収したＢ細胞のＢＣＲ／抗体レパトアは、前述した任意の方法を適用して、免疫グロブリン重鎖および軽鎖を回収し、選択し、そしてコンビナトリアルペアリングして抗体レパトアを作製することにより、決定することが可能である。作製された抗体レパトアから目的の特性を持つ抗体を選択することができる。

【0177】

前述した態様のいずれかにおいて、方法は、ＴＣＲαおよびβの核酸配列を含む患者の試料から核酸を単離することを含む場合がある。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。核酸は、血液、皮膚、肝臓、骨髄、生検材料などを含むがこれらに限定されない、対象の任意の組織または細胞から単離することができる。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は哺乳類である。いくつかの態様において、対象は、動物である。

【0178】

本明細書に記載の任意の態様において、対象由来の試料は、体液から単離された細胞を含んでいてもよい。いくつかの態様において、細胞は、腫瘍特異的Ｔ細胞または腫瘍浸潤リンパ球である。いくつかの態様において、体液は、血液、尿、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、喀痰、粘膜分泌物、膣液、腹水、胸水、心嚢液、腹膜液、および腹腔液からなる群より選択される。

【0179】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の１つ以上のサブセットは、レパトア全体から、Ｔ細胞集団中での頻度に基づいて；第二のＴ細胞集団との比較における相対的な濃縮度に基づいて；所与のＴＣＲ鎖と比較してＤＮＡおよびＲＮＡのコピー数が異なることに基づいて；ＴＣＲ鎖の生物学的特性であって、ここでこの特性が、（予測される）抗原特異性、（予測される）ＨＬＡ拘束性、親和性、共受容体依存性、または親Ｔ細胞系列（例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８Ｔ細胞）またはＴＣＲ配列モチーフのうちの少なくとも１つから選択される、ＴＣＲ鎖の生物学的特性に基づいて；遺伝子発現の空間的パターンであって、ここで空間的な遺伝子の発現パターンが、組織での起源領域または他の遺伝子の共発現パターンの少なくとも１つに由来する、遺伝子発現の空間的パターンに基づいて；例えば複数の腫瘍病変において出現しているなど、複数の試料において同様の頻度で共出現または出現していることに基づいて；このＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するための、複数の群への選択に基づいて；異なる態様で定義したような複数の基準の組み合わせに基づいて、のうちの少なくとも１つの基準に基づいて選択される。

【0180】

いくつかの態様において、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの配列の決定は、多重ＰＣＲ；標的濃縮によるＴＣＲ配列の回収；５'ＲＡＣＥとＰＣＲによるＴＣＲ配列の回収；空間的配列決定によるＴＣＲ配列の回収；ＲＮＡ配列によるＴＣＲ配列の回収；および固有の分子識別子（ＵＭＩ）の使用、のうちの少なくとも１つによって達成される。

【0181】

いくつかの態様において、ステップＩＩＩは、ＴＣＲ鎖の配列を使用してＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片のライブラリーを合成し、これを１つのＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片に連結すること（必要に応じて、ここで正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結される）；正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結したＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を直接合成することによって、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを生成すること；または、細胞が１つのＴＣＲα鎖と１つのＴＣＲβ鎖を発現するように、ＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子の別々のコレクションで細胞プールを修飾することによって、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを細胞内で作製すること；ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを、両ＴＣＲ鎖断片とＣＤ３ζもしくはＣＤ３εシグナルドメインを単独でまたはＣＤ２８シグナルドメインとの組み合わせで含む一本鎖ＴＣＲ構築物として連結すること、のうちの少なくとも１つによって達成される。

【0182】

いくつかの態様において、ステップＩＶは、生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲ単離用の少なくとも１つの活性化マーカーに基づいて抗原反応性のレポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを細胞増殖を追跡するのに適した蛍光色素で標識し、少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲ単離用の増殖性に基づいて抗原反応性のレポーター細胞を単離すること；生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも２つの試料に分け、試料を少なくとも１つの目的の抗原を発現しているかまたは発現していない抗原提示細胞によって刺激し、刺激後、両方のレポーター細胞集団を一定期間インキュベートし、次いで、両方のレポーター細胞集団をＴＣＲ分離によって分析し、両方の試料から得られたＴＣＲαβ対を比較することで、少なくとも１つの抗原に暴露された試料においてより豊富に含まれているＴＣＲ遺伝子を特定すること；生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲの誘発を示す少なくとも１つのレポーター遺伝子、例えばＮＦＡＴ－ＧＦＰまたはＮＦＡＴ－ＹＦＰに基づいて抗原反応レポーター細胞を単離すること；生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、抗原反応性レポーター細胞を、ＴＣＲのシグナル伝達に際して獲得される抗生物質耐性を含むがこれには限定されない選択的生存に基づく抗原特異的レポーター細胞の選択に基づいて、例えばＮＦＡＴ－ピューロマイシン導入遺伝子の使用によって、ＴＣＲ単離用に単離すること；生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを目的の抗原を担持する１つ以上のＭＨＣ複合体に曝露し、ＴＣＲ単離用に、ＭＨＣ複合体に結合したレポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；生成されたＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激し、その後、単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体的手法を使用して目的のＴＣＲαβ対を同定し、ＴＣＲ単離と少なくとも１つの活性化マーカーの転写レベルでの検出とを組み合わせ、それにより、ＴＣＲαβの転写物が活性化マーカーのレベルの上昇と共発現するＴ細胞のプールに含まれる単一のレポーター細胞を検出すること、のうちの少なくとも１つによって達成される。

【0183】

いくつかの態様において、活性化マーカーは、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞活性化マーカー、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＯＸ４０からなる群より選択される。

【0184】

いくつかの態様において、活性化マーカーはＣＤ６９であり、ＣＤ６９を高発現している細胞集団とＣＤ６９を低発現している他の細胞集団の２つの細胞集団が、さらなる分析のために単離される。

【0185】

いくつかの態様において、ステップＩＶは、少なくとも１つの活性化マーカーに基づく同定または選択；抗原に応答した増殖に基づく同定または選択；非刺激細胞と比較して、抗原刺激細胞においてより豊富に含まれるＴＣＲ遺伝子の同定に基づく同定または選択；ＴＣＲの誘発によるレポーター遺伝子の活性化に基づく同定または選択；ＴＣＲシグナル伝達に際した抗生物質耐性の獲得を含むがこれに限定されない、選択的な生存に基づく同定または選択；１つ以上のＭＨＣ複合体への結合に基づく同定または選択；単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体技術を用いた同定または選択；またはそれらの任意の組み合わせ、のうちの少なくとも１つによって達成される。

【0186】

いくつかの態様において、レポーター細胞はＴ細胞である。

【0187】

いくつかの態様において、単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲもしくは微少流体技術、またはそれらの任意の組み合わせを用いた同定または選択は、活性化関連遺伝子の共発現を決定することをさらに含む。

【0188】

本明細書で記載されるいくつかの態様において、複数のＴ細胞ライブラリーを作製する方法は、（ａ）本明細書に記載の方法に従ってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収すること；（ｂ）ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するために、全レパトアからＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を複数の群に選択すること；を含み、ここで複数のＴ細胞ライブラリーは、より複雑度が小さい、またはＴＣＲレパトアの特定の部分を回収するものとして作製される。

【0189】

いくつかの態様において、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の選択は、頻度範囲に基づく。

【0190】

いくつかの態様において、細胞は、ゲーティングに基づいて選択されるかまたは選別される。いくつかの態様において、細胞は、試料に含まれる生きている単細胞のうち、最上位０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９．９％、またはその間の任意の数または範囲に基づいて選別される。いくつかの態様において、細胞は、試料に含まれる生きている単細胞のうち、最下位０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９．９％、またはその間の任意の数または範囲に基づいて選別される。

【0191】

いくつかの態様において、核酸のライブラリーは、細胞の集団に導入される。いくつかの態様において、細胞の集団は、２倍体である。いくつかの態様において、細胞の集団は、任意の倍数性を有する。いくつかの態様において、細胞の第一の集団は、ライブラリー細胞の集団から選択される。いくつかの態様では、細胞の第一の集団における核酸配列の濃縮度および／または枯渇度が、目的の核酸配列を同定するために測定される。いくつかの態様において、第一の集団における核酸配列の濃縮度および／または枯渇度は、集団と参照とを比較することによって測定される。いくつかの態様において、参照は、細胞の第二の集団または核酸配列のライブラリーであってもよい。いくつかの態様において、細胞の第一の集団における核酸配列の濃縮度および／または枯渇度は、２つ以上の参照と比較することによって測定される。

【0192】

いくつかの態様において、第一および／または第二の集団は、フローサイトメトリーソーティングに基づいて単離される。いくつかの態様において、フローサイトメトリーソーティングは、表現型の変化を検出することに基づいて実施される。いくつかの態様において、表現型の変化は、ライブラリー細胞の集団を別の細胞の集団と接触させることによって誘導される。

【0193】

いくつかの態様において、表現型の変化は、蛍光標識されたプローブが細胞に結合することによって検出される。いくつかの態様において、フローサイトメトリーソーティングは、閾値に基づいて実施される。いくつかの態様において、閾値は、フローサイトメトリーソーティングによって全細胞の画分から最も高い蛍光シグナルを有する細胞の割合を回収する意図に基づくものである。いくつかの態様では、蛍光シグナルに基づいて、上位０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９．９％の細胞が分離される。いくつかの態様において、閾値は、フローサイトメトリーソーティングによって全細胞の画分から低い蛍光シグナルを有する細胞の割合を回収する意図に基づくものである。いくつかの態様では、蛍光シグナルに基づいて、下位０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９．９％の細胞が単離される。いくつかの態様では、複数の閾値を使用して、試料を第一の集団と第二の集団に分離する。

【0194】

いくつかの態様において、閾値は、蛍光に基づくフローサイトメトリーによって細胞の全プールから最小限の数の細胞を回収する意図に基づくものである。例えば、１０×１０ｅ６の細胞から少なくとも１×１０ｅ６の細胞を回収したい場合、蛍光シグナルに基づいて細胞の上位１０％または下位１０％が単離される。

【0195】

いくつかの態様において、閾値は、第二の細胞集団の蛍光シグナル強度に基づくものである。いくつかの態様において、閾値は、参照集団よりも高い蛍光シグナル強度に基づくものである。いくつかの態様において、閾値は、参照集団よりも低い蛍光シグナル強度に基づくものである。いくつかの態様において、参照集団における蛍光シグナル強度は、二次マーカー発現している集団のサブセットに基づくものである。

【0196】

いくつかの態様において、第一および／または第二の集団は、磁気ビーズ濃縮に基づいて単離される。いくつかの態様において、磁気ビーズ濃縮は、表現型の変化に基づいて実施される。いくつかの態様において、表現型の変化は、ライブラリー細胞の集団と別の細胞の集団とを接触させることによって誘導される。

【0197】

いくつかの態様において、ライブラリー細胞の集団を別の細胞の集団（「他の細胞集団」と呼ぶこともできる）と接触させることは、表現型を変えるように遺伝的に操作された別の細胞の集団と接触させることである。いくつかの態様において、他の細胞集団は、遺伝子操作された細胞のポリクローナルプールである。いくつかの態様において、他の細胞集団は、バリアント分子を発現するように遺伝子操作されたものである。いくつかの態様において、他の細胞集団は、１つ以上の抗原を発現するように遺伝子操作されたものである。いくつかの態様において、他の細胞集団は、ミニ遺伝子の形式で１つ以上の抗原を発現するように遺伝子操作されたものである。いくつかの態様において、他の細胞集団は、縦列ミニ遺伝子の形式で１つまたは複数の抗原を発現するように遺伝子操作されたものである。

【0198】

いくつかの態様において、他の細胞集団は、抗原を提示することができる細胞（抗原提示細胞、ＡＰＣ）である。いくつかの態様において、他の細胞集団は、樹状細胞である。いくつかの態様において、他の細胞集団は、単球である。いくつかの態様において、他の細胞集団は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ対立遺伝子で操作された細胞である。いくつかの態様において、他の細胞集団は、Ｂ細胞であってよい。いくつかの態様において、他の細胞集団は、自己細胞であってよい。いくつかの態様において、他の細胞集団は、自己のＢ細胞であってよい。いくつかの態様において、他の細胞集団は、不死化自己Ｂ細胞であってよい。いくつかの態様において、他の細胞集団は、ＥＢＶ感染によって不死化された自己Ｂ細胞であってよい。

【0199】

いくつかの態様において、ライブラリー細胞の集団と他の細胞集団とを接触させることは、いずれかの細胞集団に属し、細胞で発現する因子間の特定の相互作用を引き起こすことである。いくつかの態様において、因子間の相互作用は、受容体－リガンド相互作用である。いくつかの態様において、受容体－リガンド相互作用における受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの態様において、受容体－リガンド相互作用におけるリガンドは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）上に提示される抗原である。いくつかの態様において、ライブラリー細胞の集団と他の細胞集団との間の受容体－リガンド相互作用は、検出可能な表現型の変化を誘発する。

【0200】

いくつかの態様において、ライブラリー細胞の集団において発現されるバリアントのコレクションは、それぞれが単一のＴＣＲα鎖と単一のＴＣＲβ鎖の組み合わせを発現しているプラスミドのライブラリーである。いくつかの態様において、ＴＣＲライブラリーは、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のコレクションをコンビナトリアルに接合することによって構築される。いくつかの態様では、ＴＣＲαとＴＣＲβの全ての組み合わせがＴＣＲライブラリー中に存在し得る。いくつかの態様において、より複雑度の低い複数のライブラリーが、より複雑度の高いライブラリーを作製するために使用される。いくつかの態様において、組み合わせたより複雑度の高いライブラリーの複雑度は、組み合わせたより複雑度の高いライブラリー中に存在するＴＣＲαとＴＣＲβの全ての組み合わせを有するライブラリーよりも小さい。いくつかの態様において、対合情報または対合尤度に関する情報が、より複雑度の低い複数のライブラリーの設計において使用され、ＴＣＲライブラリーにおいてこれらのＴＣＲα－ＴＣＲβ対が提示される機会を最大化する。いくつかの態様において、より複雑度の低いライブラリーは、１つ以上のＴＣＲα鎖と１つ以上のＴＣＲβ鎖の全ての組み合わせを含むことができる。いくつかの態様において、ＴＣＲライブラリーは、最初にＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方をコードする単一ヌクレオチド分子について複数のバリアントを生成し、その後、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方をコードする分子の、２つ以上の異なるバリアントを混合することによって構築される。

【0201】

いくつかの態様において、表現型の変化は、プローブが細胞に結合することによって検出される。いくつかの態様では、細胞を、プローブを結合させる前にいかなる固定剤で処理する必要もない。いくつかの態様では、プローブによって、磁気ビーズを細胞に結合させることが可能になる。いくつかの態様では、磁気ビーズ濃縮によって、ライブラリーの細胞の集団から細胞の第一の集団および／または第二の集団を分離することが可能になる。いくつかの態様において、細胞の第一の集団または第二の集団は、磁石によって保持された細胞である。いくつかの態様において、細胞の第一の集団または第二の集団は、磁石によって保持されない細胞である。いくつかの態様では、複数のプローブの結合が、連続した磁気ビーズ濃縮によって第一の集団および／または第二の集団を単離するために使用される。いくつかの態様において、プローブは、ＣＤ６２Ｌに結合する。いくつかの態様において、プローブは、ＣＤ６９に結合する。いくつかの態様において、少なくとも１つのヌクレオチド配列は、細胞の第一の集団において統計的に有意に濃縮されているか、または枯渇している。いくつかの態様において、統計的に有意な濃縮度または枯渇度は、参照に対して決定される。いくつかの態様において、少なくとも１つのヌクレオチド配列が、第二の細胞の集団との比較において、第一の細胞の集団では統計的に濃縮される。いくつかの態様において、フローサイトメトリーソーティングおよび磁気ビーズ濃縮が組み合わされる。

【0202】

いくつかの態様では、核酸のライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、細胞の集団にライブラリーを導入すること；細胞のライブラリーを第二の細胞集団と接触させること；磁気ビーズ濃縮により、少なくとも１つのマーカーの発現に基づいて細胞のライブラリーの第一の集団を選択すること；選択した第一の集団に含まれるヌクレオチド配列の、対照との比較における統計的に有意な濃縮度または枯渇度に基づいて、少なくとも１つのヌクレオチド配列を同定すること、を含む。いくつかの態様において、濃縮されているかまたは枯渇している実体は、核酸のライブラリーに含まれるヌクレオチド配列である。いくつかの態様において、細胞の第一の集団の少なくとも一部は、核酸のライブラリーのメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成される。いくつかの態様において、マーカーの発現は、ライブラリーから導入された核酸に連動する。いくつかの態様において、「連動」は、導入された核酸がマーカーの発現を変化させることを表す。

【0203】

いくつかの態様では、核酸のライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、核酸のライブラリーを細胞の集団に導入して細胞のライブラリーを作製すること；細胞のライブラリーを細胞の第一の集団と接触させること；磁気ビーズ濃縮により、少なくとも１つのマーカーの発現に基づいて細胞のライブラリーの亜集団を選択すること；および、亜集団に含まれるヌクレオチド配列の、対照との比較における統計的に有意な濃縮度または枯渇度に基づいて、少なくとも１つのヌクレオチド配列を同定すること、を含む。いくつかの態様において、細胞の亜集団の少なくとも一部は、核酸のライブラリーのメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成される。

【0204】

いくつかの態様において、選択は、第一の閾値レベルを超えるマーカーの発現に基づくものである。いくつかの態様において、マーカーは磁気ビーズ濃縮に適しており、これは、マーカーが細胞外発現することにより、磁気ビーズによって標識可能であること（例えば、細胞外から到達可能であること）を意味し得るが、これに限定されない。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、発現されるポリペプチドをコードする。

【0205】

いくつかの態様において、細胞の集団に導入された核酸のライブラリーは、バリアント分子の発現をもたらす。いくつかの態様において、そのようなバリアント分子は、Ｔ細胞受容体の配列である。いくつかの態様において、そのようなバリアント分子は、スイッチレセプターである。いくつかの態様において、そのようなバリアント分子は、ＣＡＲ分子である。

【0206】

いくつかの態様では、核酸の（必要に応じて）コンビナトリアルライブラリーからＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、核酸ライブラリーをＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現できる細胞の集団に導入して細胞のライブラリーを作製すること；ならびに、サブセットに含まれるヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて、バリアント核酸の第一の集団の少なくとも１つのヌクレオチド配列または核酸の同一性を決定すること、を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの核酸は、細胞の第一の集団から単離される。いくつかの態様において、細胞の第一の集団は、抗原に応答して第一の閾値レベルを超えるマーカーの発現に基づいて選択される。

【0207】

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法のいずれかはさらに、感染症または自己免疫疾患の診断または治療のために、抗原特異的ＴＣＲ配列を発現しているＴ細胞を投与するステップを含む。

【0208】

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法または組成物のいずれについても、Ｔ細胞は、自己由来であってもまたは同種異系であってもよい。

【0209】

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法または組成物のいずれについても、活性化マーカーはＣＤ６９である。

【0210】

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法または組成物のいずれについても、ＣＤ６９を高発現している１つの細胞集団とＣＤ６９を低発現している他の細胞集団の２つの細胞集団が単離される。

【0211】

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法または組成物のいずれについても、本明細書で提供される方法のいずれか１つに従って回収されたＴ細胞受容体のレパトアを含むヌクレオチドライブラリーが提供される。

【0212】

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法または組成物のいずれについても、本明細書に提供される方法のいずれかに従って同定されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物が提供される。

【0213】

いくつかの態様では、本明細書で提供される方法または組成物のいずれについても、前述のヌクレオチド構築物を含む細胞が提供される。

【0214】

いくつかの態様では、試料からＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、ａ）試料に含まれるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の配列を決定すること、ｂ）ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製するために、ＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を選択し、コンビナトリアルペアリングを行うこと、ｃ）ＴＣＲαβ対のライブラリーをレポーター細胞のプールに導入すること、ｄ）ＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞を、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞で刺激すること（いくつかの態様において、このことは、本明細書に記載の正確に２つのプールを使う過程によって行うことができる）、ｅ）少なくとも１つの目的の抗原に特異的なＴＣＲαβ対を決定すること、およびｆ）ＴＣＲαβ対を細胞に導入し、ＴＣＲαβ対を含む細胞を選択すること、を含む。

【0215】

いくつかの態様では、核酸のコンビナトリアルライブラリーから、Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖とＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、ａ）複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされているＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に、ライブラリーを導入すること、ｂ）抗原（必要に応じて抗原提示細胞であってもよい）への反応に対する閾値レベルを上回るマーカーの発現に基づいて、細胞集団の亜集団を選択すること、ここでこの亜集団は複数の細胞を含み、ｃ）亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること、ｄ）バリアント核酸のヌクレオチド配列を決定すること、ならびにｅ）サブセットに含まれるヌクレオチド配列の、対照との比較における濃縮度に基づいて、少なくとも１つのバリアントヌクレオチド配列を同定すること、を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供することを含む。

【0216】

いくつかの態様において、選別される細胞の割合は、対照培養物と新生抗原発現細胞を含む培養物においてマーカーを発現しているＴ細胞の割合の比較に基づく。細胞の選別には、任意のマーカーを使用することができる。いくつかの態様において、細胞を選別するためのマーカーは、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ６９を含む。

【0217】

さらなる態様を図３５Ａ～３５Ｅに示す。これらの図は、遺伝子合成によって生成されたＴＣＲライブラリーからの抗原特異的ＴＣＲの回収を示すものである。これらの態様は、Ｅ：Ｔ比を上昇させることによって、ＴＣＲライブラリースクリーニングプラットフォームの感度を上げるという考えを示している。これらの項目については、後述する実施例の一部においても具体的に示す。

【0218】

本明細書で「ステップ」に使用される番号は、単に、その特定のセクションで議論されている態様を示し、文字は過程そのもののステップを示す。したがって、例えば、「ステップ３５」は３５と題された態様を示し、「ａ」はその態様のステップ「ａ」を示す。「ステップ」という用語は過程の一部を示し、あるステップを別のステップを開始する前に完了することは必ずしも必要とされない。

【0219】

ステップ３５Ａ）スクリーニング設計の概略。卵巣癌（ＯＶＣ）または大腸癌（ＣＲＣ）試料に由来する５つの特性が明らかになっているＴＣＲと９５の特徴が分かっていないＴＣＲを用いて、１００×１００設計のコンビナトリアルＴＣＲライブラリーを作製した。ライブラリーはツイストバイオサイエンス（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社により、ヒトのＶ、ＣＤＲ３、Ｊセグメントを使用して組み立てられたが、定常（Ｃ）領域はマウス由来であった。このライブラリーを、ジャーカットレポーターＴ細胞のレトロウイルス導入に使用した。ポリクローナルレポーターＴ細胞を、ＴＭＧ形式で同族抗原を提示するように操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養した。この例では、ＴＭＧを発現するＥＢＶ ＬＣＬ細胞、および特異的抗原を提示するように操作されていないＥＢＶ ＬＣＬを共培養に用いた。

【0220】

ステップ３５Ｂ）スクリーニングのための選別戦略。３５Ａで概説したように作製した１００×１００設計のＴＣＲライブラリーを発現するジャーカットレポーターＴ細胞を、３５Ａで述べたＡＰＣと１：１、１：２および１：３の割合で２１時間共培養した。共培養の後、Ｂ細胞でのＣＤ２０の発現に基づく磁気ビーズ選択を用いて、ＡＰＣを枯渇させた。Ｂ細胞枯渇後、ＣＤ６９マーカーを使用したＦＡＣＳにより、Ｔ細胞活性化について細胞を選別した。いくつかの態様では、ライブラリーは任意の方法によって選別することができる。選別戦略は、（左から右へ向かって）リンパ球を選択する連続したゲーティング、一重の細胞を選択するゲーティング、ＣＤ２０陽性細胞を除外するゲーティング、ならびにＣＤ６９高発現細胞およびＣＤ６９低発現のそれぞれを補足する２つの選別ゲート（「上位」および「下位」）を含む。結果を図３５Ｂのグラフに示す。

【0221】

ステップ３５Ｃ）ＴＣＲ発現カセットの回収。いくつかの態様では、様々な技術のいずれかによって、関連するＴＣＲ発現カセットを回収することができる。いくつかの態様では、図３５Ｂからの上位および下位試料のＴＣＲ発現カセットは、１０Ｃに記載のＰＣＲ戦略を用いて回収することができ、その後、バーコーディングＰＣＲを行う。プラスミドＴＣＲライブラリーに関する対照ＰＣＲも含めた。２回目のＰＣＲを行った後のＰＣＲ産物を、アジレント・テープステーション（Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ）を使用して分析した。結果を図３５Ｃに示す。

【0222】

ステップ３５Ｄ）スクリーニングデータのＴＣＲ濃縮度分析。いくつかの態様では、ステップ３５ＣからのＰＣＲ産物プールを、任意の数の方法で分析することができる。例えば、３５ＣからのＰＣＲ産物プールをライブラリー調製に使用し、ナノポア技術を使用して配列決定した。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の同一性を回復させ、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して差次的に表されるＴＣＲの組み合わせを同定した。Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）および非存在下（ｙ軸）でのスクリーニングに関する平均Ｒｌｏｇ変換リードカウントを、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比が１：１、１：２、１：３の場合について表す。５つの特徴が分かっている抗原反応性ＴＣＲは、図３５Ｄにおいて、より大きな灰色のドットとして示している。

【0223】

ステップ３５Ｅ）５つの特徴が分かっている抗原反応性ＴＣＲの特性。３５Ｄのデータから最も差次的に表現されたＴＣＲα×β鎖の組み合わせの順位、およびそれに付随するｐ値を、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して同定した。差次的表現分析は当業者に知られており、濃縮ＴＣＲが、抗原が提示されなかった「上位」および「下位」試料の両方との比較において、抗原が提示された「上位」試料では濃縮されていて、「下位」試料では枯渇していると定義される線形モデルに基づいて行われる。その特性を図３５Ｅに示す。

【0224】

さらなる態様を図３６に示す。この図は、遺伝子合成によって生成されたＴＣＲライブラリーからの抗原特異的ＴＣＲの回収を示すものである。これらの態様は、ＴＣＲライブラリースクリーニングのために細胞を分離する方法として、流体に基づく選別の代わりにビーズに基づく選別を使用するという考えを示している。ビーズに基づく細胞選別の利点は、ＦＡＣＳに基づく細胞選別よりも拡張性が高いことである。

【0225】

ステップ３６Ａ）スクリーニング設計の概略。卵巣癌（ＯＶＣ）または大腸癌（ＣＲＣ）試料に由来する５つの特徴が分かっているＴＣＲと９５の特徴が分かっていないＴＣＲを用いて、１００×１００設計のコンビナトリアルＴＣＲライブラリーを作製した。ライブラリーはツイストバイオサイエンス社により、ヒトのＶ、ＣＤＲ３、Ｊセグメントを使用して組み立てられたが、定常（Ｃ）領域はマウス由来であった。このライブラリーを、ジャーカットレポーターＴ細胞のレトロウイルス導入に使用した。ポリクローナルレポーターＴ細胞を、ＴＭＧ形式で特異的抗原を提示するように操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養した。

【0226】

ステップ３６Ｂ）スクリーニングのための選別戦略。３６Ａで概説したように作製した１００×１００設計のＴＣＲライブラリーを発現するジャーカットレポーターＴ細胞を、３６Ａで述べたＡＰＣと１：１、１：２および１：３の割合で２１時間共培養した。共培養の後、ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）のオート（Ａｕｔｏ）ＭＡＣＳを使って、連続的な細胞分離を行った。まず、死細胞を死細胞除去キットを用いて除去した。Ｂ細胞でのＣＤ２０の発現に基づく磁気ビーズ選択を用いて、ＡＰＣを、生細胞とともに枯渇させた。Ｂ細胞除去後、ＣＤ２０陰性細胞を、非活性化ジャーカット細胞に発現するマーカーであるＣＤ６２Ｌの発現を用いて分離した。次いで、ＣＤ６２Ｌ陰性とＣＤ６２Ｌ陽性を別々に抗ＣＤ６９ビオチン標識抗体で染色し、その後、抗ビオチンミクロビーズで細胞を分離した。ＴＣＲカセットを回収するために使用した最終画分は、「上位」画分に相当するＣＤ２０陰性、ＣＤ６２Ｌ陰性、ＣＤ６９陽性細胞と、「下位」画分に相当するＣＤ２０陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＤ６９陰性細胞であった。細胞分離過程の概略を図３６Ｂに示す。

【0227】

ステップ３６Ｃ）ＴＣＲ発現カセットの回収。いくつかの態様では、様々な技術のいずれかによって、関連するＴＣＲ発現カセットを回収することができる。いくつかの態様では、図３６Ｂからの上位および下位試料のＴＣＲ発現カセットを、１０Ｃに記載のＰＣＲ戦略を用いて回収し、次いでバーコーディングＰＣＲを実施した。プラスミドＴＣＲライブラリーに関する対照ＰＣＲも含めた。２回目のＰＣＲを行った後ＰＣＲ産物を、アジレント・テープステーションを使用して分析した。結果を図３６Ｃに示す。

【0228】

ステップ３６Ｄ）スクリーニングデータのＴＣＲ濃縮度分析。いくつかの態様では、ステップ３６ＣからのＰＣＲ産物プールを、任意の数の方法で分析することができる。例えば、３６ＣからのＰＣＲ産物プールをライブラリー調製に使用し、ナノポア技術を使用して配列決定した。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の同一性を、ライブラリー中に存在する鎖に対するアライメントによって回復させ、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して差次的に表されるＴＣＲの組み合わせを同定した。Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）と非存在下（ｙ軸）のスクリーニングに関する平均Ｒｌｏｇ変換リードカウントを、全てのＴＣＲについて灰色で表し、５つの特徴が分かっている抗原反応性ＴＣＲを黒点で表す。

【0229】

ステップ３６Ｅ）最も有意に濃縮された上位７つのＴＣＲの特徴。３６Ｄのデータから、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して、差次的に表現されたＴＣＲα×β鎖の組み合わせを同定した。差次的表現分析は当業者に知られており、濃縮ＴＣＲが、ＴＭＧが発現していない「上位」および「下位」試料の両方との比較において、ＴＭＧが発現した「上位」試料では濃縮されていて、「下位」試料では枯渇していると定義される線形モデルに基づいて行われる。上位７つの最も有意なα鎖およびβ鎖のヒット、ならびにそれらの名称、それらのｌｏｇ２変換後の倍率変化、および差分表現の有意性を図３６Ｅの表に示す。

【0230】

さらなる態様を図３７に示す。この図は、大腸癌（ＣＲＣ）患者２および４（ｐｔ２およびｐｔ４）から新生抗原反応性ＴＣＲを同定するために行った、さらなる遺伝子スクリーニングの分析を示すものである。これらの態様は、コンビナトリアル縦列ミニ遺伝子（ＴＭＧ）エンコーディングを使用して、多数のミニ遺伝子に対してＴＣＲライブラリーを効率的にスクリーニングするという考えを示している。

【0231】

ステップ３７Ａ）６×６コンビナトリアルＴＭＧエンコーディング設計の概略。ＴＣＲライブラリーを、３６のＴＭＧを発現しているＡＰＣに対してスクリーニングする必要がある場合、それぞれが６つのＴＭＧの特有な組み合わせを発現するＡＰＣのプールを作製することができる。例えば、プールＣ１は、ＴＭＧ１、ＴＭＧ２、ＴＭＧ３、ＴＭＧ４、ＴＭＧ５およびＴＭＧ６を発現するＡＰＣで構成される。プールＲ１は、ＴＭＧ１、ＴＭＧ７、ＴＭＧ１３、ＴＭＧ１９、ＴＭＧ２５およびＴＭＧ３１を発現するＡＰＣから構成される。ＡＰＣの各プールに対して別々のＴＣＲライブラリースクリーニングを行うことができる。スクリーニング手法においてＴＣＲによって認識された２つのプールの組み合わせから、認識されたＴＭＧを、両方のプールで表現されるＴＭＧとして決定することができる。

【0232】

ｐｔ２－ＴＣＲライブラリースクリーニングの反復実験の数の関数としての、ＴＣＲα×βの全組み合わせの順位分析。図１０Ｇのｐｔ２ＴＣＲライブラリースクリーニングのデータを、３回の反復実験のすべて、または３回の反復実験のうちの２回を使用して分析した。両条件について差次的に発現したＴＣＲ組合せを、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して同定した。濃縮度の有意性の順位は、ＤＥＳｅｑ２を使用して計算されたワルド統計量に基づくものであり、最高値のワルド統計量に最高順位（１位）を割り当てた。２回の反復実験または３回の反復実験を使用した分析に基づく順位を、それぞれ、ｙ軸とｘ軸に表す。図１０Ｇで同定された新生抗原反応性ＴＣＲリード化合物を、より大きな黒い点として示す。

【0233】

ステップ３７Ｃ）ＣＲＣ－ＴＣＲライブラリースクリーニングの２回または３回の反復実験に基づく統計分析の要約表。図３７Ｂの分析を、図１０Ｇで実施されたすべての患者ＴＣＲライブラリーのスクリーニングに適用した。図３７Ｂで同定された全ての新生抗原反応性ＴＣＲリード化合物について、下位試料に対する上位試料におけるＴＣＲの濃縮度の統計的有意性をそのボンフェローニ補正ｐ値とともに表に示している。このｐ値は、スクリーニングの３回の反復実験に基づく分析、または３回のうちのいずれか２回のスクリーニングの反復実験の組み合わせについて表すものである。最後の列のレ点は、スクリーニング解析に２回または３回分のスクリーニングの反復実験が含まれているかどうかに関係なく、また３回のうち２回のスクリーニングの反復実験のいかなる組み合わせが選択されたとしても、上位に順位づけられる同じＴＣＲリード化合物が選ばれたであろうことを表している。一例を図３７Ｂに示す。この図は、さらなる検証のために選択されたｐｔ４に由来する、上位に順位づけられた７つの新生抗原反応性ＴＣＲ（図１０Ｇを参照のこと）が、２回の反復実験のみを用いた分析に基づいて上位に順位づけられた７つのＴＣＲと同じであることを示している。

【0234】

ステップ３７Ｄ）ペアワイズＴＣＲ濃縮度分析に使用したｐｔ４試料の表。６つの試料（それぞれが上位と下位両方の試料によって表される）を、ペアワイズＴＣＲ濃縮度分析に使用した。試料は、ＴＣＲライブラリー発現レポーターＴ細胞と、ＴＭＧ１、ＴＭＧ２、ＴＭＧ３またはＴＭＧ４を個別に発現するＢ細胞株との共培養（試料１～４）、ならびにこれらのＢ細胞株のプールを１：１：１：１の比率で混合した共培養（試料５）を含むものとした。試料６については、外来性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞との共培養を行った。

【0235】

ステップ３７Ｅ）ペアワイズＴＣＲ濃縮度分析の結果。図１９Ｄの試料に含まれる全ての分析可能な対を、ＤＥＳｅｑ２を使用して、上位試料の下位試料との比較におけるＴＣＲの濃縮度について分析した。差次的表現分析は当業者に知られており、濃縮ＴＣＲが、ＴＭＧが発現していない「上位」および「下位」試料の両方との比較において、ＴＭＧが発現した「上位」試料では濃縮されていて、「下位」試料では枯渇していると定義される線形モデルに基づいて行われる。ボンフェローニで補正したｐ値を昇順に並べ、プロットした。薄灰色の点はα４３．β１６ＴＣＲの分析によるｐ値を、濃灰色の点はα９．β１４ＴＣＲを含む分析によるｐ値を表している。上位の外れ値は、図１０Ｇで同定されたのと同じＴＣＲであった。ＴＣＲα９．β１４の反応性は、ＴＭＧ４から発現された抗原に起因している可能性がある。なぜなら、ＴＭＧ４は試料４と５の間で共有されているためである。ＴＣＲα４３．β１６の反応性は、ＴＭＧ３に起因する可能性がある。なぜなら、ＴＭＧ３は試料３と５の間で共有されているためである。

【0236】

さらなる態様を図３８に示す。この図は、大腸癌（ＣＲＣ）患者２からの新生抗原反応性ＴＣＲを同定するために行った、さらなる遺伝子スクリーニングの分析を示すものである。これらの態様はプラットフォームの感度を示し、また、ＴＣＲ感度などのＴＣＲの特徴は遺伝子スクリーニングデータから決定され得るという概念を支持するものである。

【0237】

ステップ３８Ａ）スクリーニングデータと検証データとの間における、ＴＣＲの活性化およびＴＣＲのバックグラウンド活性の相関。遺伝子スクリーニング手法においてＴＣＲ反応性が異なる１６のＣＲＣ－ｐｔ２－ＴＣＲを、図１０Ｇのデータに基づいて同定した。まず、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用してＲｌｏｇ変換後のリードカウントを計算し、上位試料のＲｌｏｇ値から下位試料のＲｌｏｇ値を減算し、Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）および非存在下（ｙ軸）で行った共培養について表した（図３８）。これらのＴＣＲをレポーターＴ細胞内で発現させ、独立した検証実験において、関連するＴＭＧ（ＴＭＧ２）を発現するＥＢＶ－Ｂ細胞と共培養した。Ｔ細胞の活性化は、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ６９マーカーを使用して測定した。検証データとＴＣＲライブラリースクリーニングのデータを比較するために、スクリーニングにおけるＴＣＲの活性化倍率を、ＴＭＧ２を発現するＥＢＶ－Ｂ細胞との共培養から得られた上位試料と下位試料のＲｌｏｇ値の差として定義した（ｙ軸；中央の図）。検証実験における活性化の倍率は、ＴＭＧ２発現ＥＢＶ－Ｂ細胞との共培養後の非組換えＥＢＶ－Ｂ細胞との共培養後に対する、ＣＤ６９陽性細胞の比率と定義する（ｘ軸；中央の図）。スクリーニングのバックグラウンドは、非組換えＥＢＶ－Ｂ細胞との共培養から得られた上位および下位試料に含まれる所与のＴＣＲの濃縮度と定義する（ｙ軸、右図）。検証実験のバックグラウンドは、非組換えＥＢＶ－Ｂ細胞との共培養後のＣＤ６９陽性細胞の割合として定義する（ｘ軸；右図）。

【0238】

いくつかの態様では、ＴＣＲαβライブラリーからの抗原反応性ＴＣＲの回収は、抗原に対する反応性に基づく１つ以上の亜集団の単離を通して行うことができる。いくつかの態様において、この手法は、ｉ）ＴＣＲαβライブラリーのＴＣＲの発現を可能にするために、レポーターＴ細胞の遺伝子を操作するステップ；ｉｉ）これらの細胞と、少なくとも１つの抗原を発現する抗原提示細胞との共培養を実施するステップ；ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化マーカーに基づいて、細胞を、ａ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する「上位」集団、およびｂ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの発現を欠く（もしくは発現が低い）「下位」集団、に分離するステップ；ｉｖ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲと続くディープシークエンシングを用いて、上位試料および下位試料からＴＣＲを同定するステップ；ならびに、ｖ）下位試料との比較において、上位試料で濃縮されている少なくとも１つの抗原反応性ＴＣＲを同定するステップ、のうちの１つ以上を伴う。Ｔ細胞活性化のマーカーの発現は、活性化Ｔ細胞を区別するマーカー（例えば、ＣＤ６９）の相対的に高い発現であっても、または非活性化Ｔ細胞を区別するマーカー（例えば、ＣＤ６２Ｌ）の相対的に低いレベルの発現であってもよい。

【0239】

いくつかの態様において、上位は、上位１、５、１０、２０、３０、４０、または５０％、下位は、下位１、５、１０、２０、３０、４０、または５０％であり、上位および下位について示した値のうちの任意の２つの間にある範囲の任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、任意の態様において、上位／下位手法（上位集団と下位集団の両方を採用する）が本明細書で提供される。

【0240】

いくつかの態様では、核酸のライブラリーから抗原特異的Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、ａ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に核酸ライブラリーを導入して細胞のライブラリーを作製すること；ｂ）抗原に応答して第一の閾値を超えるマーカーの発現に基づいて、細胞のライブラリーの第一の集団を選択すること；および、ｃ）ライブラリーの第一の集団からバリアント核酸の第一の集団を単離すること、を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、ａ）バリアント核酸の第一の集団の少なくとも１つのヌクレオチド配列または核酸の同一性を同定すること；およびｂ）サブセットに含まれるヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて、少なくとも１つのバリアントヌクレオチド配列を同定すること、を含む。いくつかの態様において、閾値レベルは、ａ）マーカーの発現に基づく細胞の全プールの割合の回収；またはｂ）細胞の全プールからの最小限の数の細胞の回収；またはｃ）抗原に応答して発現する少なくとも１つのマーカーへの磁気プローブの結合に基づく、磁石によって保持される細胞の回収、のうちの少なくとも１つに基づく。

【0241】

いくつかの態様において、対照は、第二の閾値未満の第二の細胞集団である。いくつかの態様において、対照は、細胞の参照集団、細胞の集団に導入された核酸のコンビナトリアルライブラリー、第一の集団と同じ細胞の集団から第二の閾値未満の発現マーカーに基づいて選別された細胞の集団、および／または関連するＴＣＲライブラリーを発現するレポーターＴ細胞と外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞との共培養から得られた少なくとも１つの細胞の集団、のうちの１つ以上である。いくつかの態様において、下位（もしくは対照）試料は、上位試料と同じ細胞集団から選別されるが、活性化マーカーの発現が低く、または下位試料は、関連するＴＣＲライブラリーを発現するレポーターＴ細胞、および外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞の共培養から得られたものである。いくつかの態様において、上位画分と下位画分との間に重複はない。いくつかの態様において、方法はさらに、細胞の集団に抗原を添加することを含む。いくつかの態様において、第一の集団および／または対照の単離は、ａ）磁気ビーズ濃縮、ｂ）フローサイトメトリーソーティング、またはｃ）その両方、のうちの少なくとも１つによって達成される。いくつかの態様において、対照は、細胞の参照集団、細胞の集団に導入された核酸のコンビナトリアルライブラリー、第一の集団と同じ細胞の集団から第二の閾値未満の発現マーカーに基づいて選別された細胞の集団、または関連するＴＣＲライブラリーを発現するレポーターＴ細胞といかなる外因性抗原も提示しないＢ細胞等の抗原提示細胞との共培養から得られた少なくとも１つの細胞の集団、のうちの１つ以上である。

【0242】

いくつかの態様では、抗原刺激に際して抗原反応性ＴＣＲが活性化マーカー陽性となり、それによって、そのようなＴＣＲが下位集団と比較して上位集団に濃縮されるように上位／下位手法が設定される。上位／下位手法は、実施例２４に記載したように、様々な添付図によって説明される。

【0243】

いくつかの態様において、下位試料（または対照）は、任意の参照細胞集団であっても、またはＴＣＲプラスミドの参照ライブラリーであってもよい。下位試料は、上位試料と同じ細胞集団から選別されるが、活性化マーカー発現が低いものであってもよい。下位試料は、関連するＴＣＲライブラリーを発現するレポーターＴ細胞と外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞との共培養から得ることができる。下位試料は、レポーターＴ細胞（ここから上位試料を選別した）を作製するために使用されたＴＣＲプラスミドライブラリーであってもよい。いくつかの態様において、上位試料および下位試料におけるＴＣＲの発現は表現を、差次的ＴＣＲ表現分析を行なっている最中に、他の任意の追加試料におけるＴＣＲの表現と比較することもできる。いくつかの態様では、そのような追加試料は、プラスミドＴＣＲライブラリーであってもよい。いくつかの態様では、そのような追加試料は、関連するＴＲＣライブラリを発現するレポーターＴ細胞と外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞との共培養に由来するものであってもよい。

【0244】

いくつかの態様において、方法は、多様なＴ細胞集団からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収するものである。この方法は、対象の試料に含まれる対合したＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定すること；全レパトアからＴＣＲαβ対配列を選択すること；選択したＴＣＲαβ対のライブラリーを作製することによって、ＴＣＲレパトアを作製すること；および、作製したＴＣＲライブラリーから所望の特徴を有する少なくとも１つのＴＣＲαβ対を特定すること、を含む場合がある。

【0245】

いくつかの態様において、ＴＣＲαβ対は、ＴＣＲ配列モチーフを含む場合がある。

【0246】

いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ＴＣＲαβ対のライブラリーである。いくつかの態様において、これらのライブラリーは、本明細書で提供される任意の方法によって作製することができる。いくつかの態様において、ライブラリーは、非生存性であった試料に由来する。

【0247】

いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、ＴＣＲαβ対のライブラリーがレポーター細胞のプールに導入されている細胞集団および／またはライブラリーである。したがって、いくつかの態様では、選択され、コンビナトリアルに対合したＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の配列（ＴＣＲαβ対のライブラリー）を含むレポーター細胞のプールが提供される。

【0248】

いくつかの態様において、ライブラリーは、刺激されたライブラリーの場合がある。いくつかの態様において、ライブラリーは、ＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞を含んでいてもよく、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、少なくとも１つの目的の抗原は、自己由来であっても同種異系であってもよい。

【0249】

いくつかの態様において、本明細書で提供されるのは、試料に由来する１つ以上のＴＣＲαβ対または非生存性試料の特徴を伴うライブラリーである。
スクリーニングに関するさらなる態様

【0250】

本開示のさらなる態様が開示される。本態様はいずれも、本明細書で提供される他の態様のいずれかと組み合わせることができる。本明細書で提供するのは、高処理の核酸配列決定を介して、遺伝子の機能獲得型／機能喪失型スクリーニング（「遺伝子バリアントライブラリーのスクリーニング」とも呼ばれる）によりバリアント配列のライブラリーから目的の配列を特定する方法（本明細書では「スクリーニング方法」とも呼ばれる）である。このスクリーニング方法は、バリアント塩基配列のライブラリーをスクリーニングするために使用することができ、この方法では、少なくとも６００ｂｐのバリアント塩基配列を同定することによってのみ、個々の核酸配列を明確に区別することができる。

【0251】

いくつかの態様では、任意の適切な方法において、関連するプールされた抗原を同定する方法を採用することができる。例えば、いくつかの態様において、同定または刺激することは、ａ）多数の抗原を選択すること；ｂ）それぞれの抗原が正確に２つの抗原プールに存在する抗原プールを作製すること；ｃ）それぞれの抗原プールに対する少なくとも１つのＴ細胞受容体を発現するレポーター細胞の反応性を評価すること；および、ｄ）正確に２つの抗原プールに対する反応性を評価することによって、少なくとも１つのＴ細胞受容体が選択された抗原のいずれかに対して反応性を有するか否かを決定すること、を含む。いくつかの態様において、正確に２つの抗原プールに対する反応性は、ペアワイズ濃縮度分析によって検出される。いくつかの態様において、ライブラリーは、ＴＣＲライブラリーである。いくつかの態様においては、活性化マーカーを用いる。いくつかの態様においては、反応性を評価するために（本明細書に記載されるような）上位下位比較を採用する。いくつかの態様において、他の手法では、単一プールに対する反応性を使用して、特有の反応パターンを作成することができるが、この過程では、ペアワイズ分析を用いて、反復実験を特異的に分析することによってシグナル強度を増強させることができる。

【0252】

本開示のスクリーニング方法は、高処理の方法であってもよい。ポリクローナル遺伝子ライブラリーのスクリーニングは、個別のクローンの生成および解析を必要とするのではなく、１回の実験で多数（例えば、数万）のタンパク質バリアントのスクリーニングを可能にすることができる。さらに、バリアント遺伝子ライブラリーの生成は、個別のバリアント遺伝子を合成することと比較して、より安価で時間を短縮できる可能性がある。スクリーニング方法のいくつかの態様は、バリアントの機能的選択を可能にし、また、タンパク質バリアントは、１つ以上の機能的特性に基づいて選択され得る。本開示のスクリーニング方法は、高感度なスクリーニング方法とすることができる。目的のバリアントは機能的表現型に基づいて選択されるが、目的のバリアントの配列同一性は、稀なバリアントでさえ高感度で検出できるＤＮＡ配列決定法に基づいて同定される。いくつかの態様において、本明細書で提供される態様の感度は、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：１，０００，０００またはさらに低いレベルを含む所望のレベルで区別することを可能にし得る。いくつかの態様では、（ｉ）十分な数の細胞が分析されること、および（ｉｉ）十分な配列リードを生成できること、を条件として、より高い感度が可能となる。いくつかの態様おいて、考慮すべき要因は、逆多重化である。しかし、このことは、例えば、ｉ）多重化しないこと、またはｉｉ）より多くのリードを捨てるという犠牲を払って（例えば、より多く配列決定して）、バーコード閾値を高くすることによって、対処することができる。

【0253】

スクリーニング方法のいくつかの態様は、タンパク質バリアントに関する高処理系での遺伝子バリアントライブラリースクリーニングを実行するための方法であり、ここでバリアント間の識別は、２００を超える長さのアミノ酸およびポリクローナル集団分析に基づく。いくつかの態様における本スクリーニング方法は、一部のＮＧＳシーケンスリード、例えばオックスフォードナノポア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）プラットフォームによって生成されたものなど、における高いエラー率を克服するスクリーニングのプロトコールおよびバイオインフォマティクスの過程を含む。

【0254】

本開示のスクリーニング方法は、サイズに依存せず、また、配列内での位置の多様性の制限なしに、任意の適したバリアントタンパク質を同定することを含む場合がある。いくつかの態様において、方法は、別個のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の対合が未知であるか曖昧である大規模なＴＣＲコレクションから目的のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）配列を選択することを含み、また、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの可変領域をコードするバリアント遺伝子カセットの全配列を決定することを含む。いくつかの態様において、本発明のスクリーニング方法は、ＴＣＲによって媒介されるレポーター細胞の機能的応答（例えば、ＣＤ６９の上方制御）に基づいて、高処理での（例えば、クローンの生成を回避することによる）ＴＣＲライブラリーのスクリーニングを可能にする。

【0255】

いくつかの態様において、方法は、例えば、いくつかの異なるシグナル伝達ドメインのプールから選択された最大３つの異なるシグナルドメインのコンビナトリアルアセンブリーによって分子設計が大きく異なったＣＡＲバリアントの大規模コレクションから、特性が強化されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）配列を同定することを含む。いくつかの態様では、このスクリーニング方法によって、ＣＡＲ分子全体にわたって変異多様性を有するスクリーニングバリアントを用いた、網羅的なＣＡＲ強化が可能となる。

【0256】

本明細書で提供される態様のいずれについても、必要に応じて、１つより多いＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインが存在し得る。いくつかの態様では、少なくとも２つのＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインが存在する。いくつかの態様では、少なくとも２つのＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＩＴＡＭ１、ＣＤ３ζＩＴＡＭ１２、ＣＤ３ζＩＴＡＭ１２３；ＣＤ３δ、ＣＤ３εおよびＣＤ３γの任意のＩＴＡＭを有するＣＤ３ζ；ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ならびにＣＤ２のうちの少なくとも２つである。

【0257】

いくつかの態様において、本開示のスクリーニング方法は、単細胞クローンを誘導することなく、ポリクローナルなレポーター細胞集団を分析することを含む。いくつかの態様において、スクリーニング方法は、単細胞クローンを生成することなく、（例えば、１００倍のカバー数で）目的の組み合わせを同定するために、１０，０００を超えるバリアントを含むライブラリーをスクリーニングすることに使用することができる。

【0258】

いくつかの態様において、カバー数の量は、スクリーニングの主な焦点（濃縮したスクリーニング（カバー数がより少ない）または枯渇したスクリーニング（カバー数がより多い））、ライブラリー内の個々のバリアントの表現の広がり、選択過程における細胞の損失等を含む多くの要因に依存する。一般的には、１００～２０００の、または例えば、１００～４００倍に濃縮したスクリーニングなど、５０～１０，０００の範囲を使用することができる。

【0259】

いくつかの態様において、本開示のスクリーニング方法は、分子リード化合物の同定に関する遺伝子スクリーニングの方法論および完全なタンパク質全体に多様な変異を有するより大きなタンパク質の強化を提供する。他の利用可能な方法と比較して、この方法は、いくつかの態様において、分子リード化合物の同定において高い処理量（費用および期間の削減）と高い感度を提供することができる。

【0260】

一般論として、スクリーニング方法は、（１）その全ヌクレオチド配列の少なくとも６００ｂｐを決定することによって明確に識別できる（または識別のみできる）少なくとも２つのバリアントヌクレオチド配列を含むバリアントヌクレオチド配列のライブラリーを生成すること；（２）バリアントヌクレオチド配列のライブラリーをレポーター細胞に導入すること；（３）少なくとも１つの機能的特性に基づいてレポーター細胞を選択すること；（４）選択したレポーター細胞からバリアントヌクレオチド配列を単離すること；（５）単離したバリアントヌクレオチド配列の全ヌクレオチド配列の少なくとも６００ｂｐを決定すること；および（６）少なくとも１つの目的のバリアントヌクレオチド配列を選択すること、を含む可能性がある。

【0261】

本明細書で提供される（６００ｂｐの範囲または同等の長さのアミノ酸への参照を提供する）態様のいずれかについては、ライブラリー配列の変異は、合計６００ｂｐを超える範囲に存在する場合がある。いくつかの態様において、ライブラリーは、１５００ｂｐより長いアンプリコンを含むか、それらからなるか、本質的にそれらからなるか、またはそれらを包含するであろう。いくつかの態様において、ライブラリーは、１５００ｂｐより長くなるであろうアンプリコンの少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、または１００％を含む、もしくはそれらからなる、または本質的にそれらからなるであろう。

【0262】

図８では、本開示のスクリーニング方法のいくつかの態様が提供される。方法は、複数のバリアント核酸（ここでは８１２ａ、８１２ｂ、８１２ｃとして示す）を含むコンビナトリアルライブラリー８１１を提供すること８１０を含み得る。ライブラリーに含まれるバリアント核酸はそれぞれ、長さが少なくとも６００ｂｐの連続部分８１４を含み得る。

【0263】

生体高分子（例えば、核酸またはポリペプチド）に関連して本明細書で使用される「連続」は、介在配列を含まない生体高分子の個々の構成要素（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の配列（例えば、介在ヌクレオチドもしく介在ヌクレオチド配列を含まないヌクレオチドの配列、介在アミノ酸もしくは介在アミノ酸配列を含まないアミノ酸の配列）を指す。連続部分８１４は、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列を含む場合がある。

【0264】

本明細書で使用する場合、「バリアントヌクレオチド部分配列」は、核酸および／またはその核酸によってコードされるポリペプチドの機能活性の単位を規定する、ヌクレオチド配列のファミリーのいずれか１つを含む場合がある。いくつかの態様において、バリアントヌクレオチド部分配列は、核酸および／または核酸によってコードされるポリペプチドの個別の機能活性（例えば、結合親和性、特異性）を付与する、および／またはそれに寄与する場合がある。いくつかの例において、ヌクレオチド配列のファミリーは、核酸中でのバリアントヌクレオチド部分配列の位置；共通配列との配列類似性を有すること；および／または可変領域と不変領域（ここで不変領域は、ヌクレオチド配列の同じファミリーの他のメンバーによって共有される）を有すること、を理由に、個別の機能活性を付与する、および／またはそれに寄与する。いくつかの態様において、ＴＣＲライブラリーは、ＴＣＲα鎖、またはその１つ以上の機能的ドメイン（例えば、ＴＣＲαＶ領域、ＴＣＲα相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、ＴＣＲαＪセグメント、ＴＣＲα定常領域）に相当するバリアントヌクレオチド部分配列を有するバリアント核酸、およびＴＣＲβ鎖、またはその機能的ドメイン（例えば、ＴＣＲβＶ領域、ＴＣＲβ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、ＴＣＲβＪセグメント、ＴＣＲβ定常領域）に相当するバリアントヌクレオチド部分配列を有するバリアント核酸を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲライブラリーは、１つ以上のＣＡＲ機能的ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および２～３のシグナル伝達モジュールを含み得る細胞内シグナル伝達ドメイン）に相当するバリアントヌクレオチド部分配列を有するバリアント核酸を含む。

【0265】

さらに図８を参照すると、ライブラリーの核酸８１２ａは、ライブラリー中に存在する可能性のある複数の変種（８１６ａ、８１６ｂ）のうちの１つであるバリアントヌクレオチド部分配列８１６ａを含んでいてもよい。核酸８１２ａはまた、異なる位置に、存在する可能性のある複数の変種（８１８ａ、８１８ｂ）のうちの１つである別のバリアントヌクレオチド部分配列８１８ａを含んでいてもよい。ライブラリーに含まれる別の核酸８１２ｂは、第一の組み合わせである８１６ａ／８１８ａとは異なる組み合わせの８１６ａ／８１８ｂバリアントヌクレオチド部分配列を含んでいてもよい。さらに第三の核酸８１２ｃは、第一の組み合わせである８１６ａ／８１８ａ、または第二の組み合わせである８１６ａ／８１８ｂとは異なる組み合わせの８１６ｂ／８１８ｂバリアントヌクレオチド部分配列を含んでもよい。さらに、連続する部分の一方の末端（例えば、５'または３'末端）は、バリアントヌクレオチド部分配列の１つによって規定されていてもよく、連続する部分の他方の末端（例えば、それぞれ、３'または５'末端）は、バリアントヌクレオチド部分配列の別の１つによって規定されていてもよい。

【0266】

また、連続部分は、式５'－Ａ^＊－Ｘ－Ｂ^＊－３'で表すことができ、ここで、Ａ^＊およびＢ^＊はバリアントヌクレオチド部分配列の異なるファミリーを表し、Ｘは存在しなくてもよく（この場合、連続部分は５'－Ａ^＊－Ｂ^＊－３'）、存在する場合には、任意の長さのヌクレオチド配列であってよい。いくつかの態様において、Ａ^＊は、バリアントヌクレオチド部分配列のファミリーの任意のメンバーであってよい（例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３など）。いくつかの態様において、Ｂ^＊は、バリアントヌクレオチド部分配列のファミリーの任意のメンバーであってよい（例えば、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３など）。いくつかの態様において、Ｘは、バリアントヌクレオチド部分配列の１つ以上のファミリー（例えば、Ｃ、Ｄ、など）のメンバーを含み得る。

【0267】

スクリーニング方法はさらに、複数のバリアント核酸のメンバー８２６ａ、８２６ｂによってコードされる１つ以上の遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）８２４ａ、８２４ｂを発現可能な細胞８２２の集団に、ライブラリー８２０を導入することを含む場合がある。

【0268】

スクリーニング方法は、少なくとも１つの機能的特性８３２、例えば、発現されたポリペプチドのリガンドへの結合に基づいて、細胞の集団の亜集団８３０を選択することを含む場合があり、ここで機能的特性は、細胞に導入された核酸メンバー８２６ａ、８２６ｂにおけるバリアントヌクレオチド部分配列の組合せに依存する。細胞の亜集団は複数の細胞を含み得る。いくつかの態様において、細胞の亜集団は、複数のバリアント核酸の複数の異なるメンバーを含む場合があり、ここで異なるメンバー同士は、バリアントヌクレオチド部分配列の異なる組み合わせを有することによって互いに異なっている。

【0269】

いくつかの態様において、スクリーニング方法は、例えば、細胞からゲノムＤＮＡを抽出することによって、細胞の亜集団から複数のバリアント核酸のサブセット８４２を単離すること８４０を含む場合がある。

【0270】

いくつかの態様において、スクリーニング方法はさらに、複数のバリアント核酸のサブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列８５０を、例えば、サブセット８４２に含まれるバリアント核酸の少なくとも連続部分を高処理配列決定することによって、決定することを含む場合がある。

【0271】

いくつかの態様において、方法はさらに、亜集団の細胞中に存在したバリアントヌクレオチド部分配列８１６ａ／８１８ａの組み合わせ８６０を同定することを含む場合がある。いくつかの態様において、同定することは、細胞の亜集団において見出された２つ以上の組み合わせのうちのバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせが、予め定められた閾値と比較して、または細胞の対照亜集団におけるその特定の組み合わせの存在量と比較して、濃縮されているか否かを分析することを含む。いくつかの態様において、濃縮された組み合わせは、細胞の亜集団が選択された根拠となる機能的特性を細胞に付与するものとして同定される。

【0272】

図９では、本発明のスクリーニング方法のいくつかの態様を提供する。方法９００は、複数のバリアント核酸を含むコンビナトリアルライブラリーを提供すること９１０を含む場合があり、複数のバリアント核酸はそれぞれ、少なくとも６００ｂｐの連続部分を有し、ここで、連続部分は２つ以上のバリアント核酸部分配列の組み合わせを含み、ここで、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの第一のバリアントヌクレオチド部分配列は連続部分の第一の末端を規定し、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの第二のバリアントヌクレオチド部分配列は、第一の末端とは反対側にある連続部分の第二の末端を規定する。コンビナトリアルライブラリーは、複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成された細胞の集団に導入すること９２０ができる。次いで、方法は、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせに依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて細胞集団の亜集団を選択すること９３０を含む場合があり、ここで、亜集団は複数の細胞を含む。方法は、亜集団から複数のバリアント核酸のサブセット（例えば、１つまたは複数の）を単離すること９４０、サブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定すること９５０を含む場合がある。次いで、決定されたヌクレオチド配列に基づいて、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを１つ以上同定すること９６０ができる。

【0273】

いくつかの態様において、各スクリーニングには、「参照」試料と「上位」試料が存在する。「上位」試料は、ＣＤ６９の発現が最も高い、選別された細胞を含み、「参照」試料は、ＣＤ６９の発現が低い、選別された細胞を含む。いくつかの態様において、試料は、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、合成プロモーターレポーターマーカーまたは増殖マーカーを含むがこれらには限定されない任意の他の活性化マーカーに基づいて分離され得る。このことに関しては、複雑度Ｙを有するライブラリーに含まれるそれぞれのバリアントについて、最低１００～２００倍のカバー数でバリアントを単離することができる。この場合、１試料あたりの合計が、１００～２００×Ｙバリアント／細胞を上回る場合がある。

【0274】

ある核酸のバリアントヌクレオチド配列が、他の核酸中の相当するバリアントヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードするとき、ある核酸は、コンビナトリアルライブラリーに含まれる他の核酸と「異なる」または「別個である」と考えることができる。いくつかの態様において、ある核酸は、それらが同じアミノ酸配列をコードしていても、それらのヌクレオチド配列の違いに基づいて、コンビナトリアルライブラリーに含まれる別の核酸と「異なる」または「別個である」と考えてよい。

【0275】

コンビナトリアルライブラリーは、任意の適した数の異なる（または「バリアント」な）核酸を含む場合がある。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーは、約１００またはそれ以上の、例えば、約２００以上、約３００以上、約４００以上、約５００以上、約６００以上、約７００以上、約８００以上、約９００以上、約１０００以上、約２０００以上、約３０００以上、約４０００以上、約５０００以上、約７，５００以上、約１０，０００以上、約２０，０００以上、約５０，０００以上、約１×１０^５以上、約２×１０^５以上、約５×１０^５以上、約１×１０^６以上、約１×１０^７以上、約１×１０^８以上、約１×１０^９以上、約１×１０^１０以上の、約１×１０^１１以上を含む、異なる核酸、または前述した値のうちの任意の２つの値で定義される範囲内の数の異なる核酸を含む。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーは、約１００～約２００、約２００～約５００、約５００～約１，０００、約１，０００～約５，０００、約５，０００～約１×１０^４、約１×１０^４～約２×１０^４、約２ｘ１０^４～約５×１０^４、約５×１０^４～約１×１０^５、約１×１０^５～約１×１０^６、約１×１０^６～約１×１０^７、約１×１０^７～約１×１０^８、約１×１０^８～約１×１０^９、約１×１０^９～約１×１０^１０、約１×１０^１０～約１×１０^１１、またはそれ以上の異なる核酸を含む。いくつかの態様において、ライブラリーは、少なくとも１００の、例えば、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも７，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１×１０^５、少なくとも２×１０^５、少なくとも５×１０^５、少なくとも１×１０^６、少なくとも１×１０^７、少なくとも１×１０^８、少なくとも１×１０^９、少なくとも１×１０^１０の、少なくとも１×１０^１１を含む、２つのバリアントヌクレオチド部分配列の異なる組み合わせを含む。

【0276】

いくつかの態様において、１つ以上のポリペプチド（いくつかの態様では、コンビナトリアルライブラリーのバリアント核酸によってコードされる）は、Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；スイッチレセプター；または抗体もしくはその抗原結合断片の１本以上の鎖、を含む。いくつかの態様では、第一のバリアントヌクレオチド部分配列は、ＴＣＲαバリアントアミノ酸配列をコードし、第二のバリアントヌクレオチド部分配列は、ＴＣＲβバリアントアミノ酸配列をコードしている。いくつかの態様では、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列は、ＴＣＲ－Ｖ領域；ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；ＴＣＲ－Ｊセグメント；およびＴＣＲ定常領域、のうちの１つ以上をコードしている。いくつかの態様において、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列はそれぞれ、ＣＡＲの抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、または１つ以上の細胞内シグナリングドメインをコードしている。

【0277】

いくつかの態様では、ライブラリーに含まれる複数のバリアント核酸の連続部分間の編集距離が最大化される。いくつかの態様では、コンビナトリアルライブラリーの任意の２つのバリアント核酸間の編集距離は、例えば、コドン使用を制御することによって、最大化される。いくつかの態様において、このことは、コドン最適化を含み得る。いくつかの態様において、ライブラリーを伴う本明細書で提供される方法のいずれかは、宿主細胞にとって好ましいコドン使用を導入すること、ｍＲＮＡ構造の安定性を最適化すること、反復配列を回避すること、長い同種重合体を回避すること、および所与のバリアント核酸配列内の局所的なＧＣ含有量に大きな相違が生じることを回避すること、のうちの少なくとも１つに基づいて、ライブラリー（例えば、複数のバリアント核酸のライブラリー）中のヌクレオチド配列が最適化されることを含み得る。

【0278】

いくつかの態様において、ライブラリーに含まれる複数のバリアント核酸のヌクレオチド配列は、１）細胞集団の細胞が遺伝子改変される、本明細書に提供される任意の方法、または２）細胞がＣＤ４および／またはＣＤ８と共に再構成され、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ配列をスクリーニングするために利用される、本明細書に提供される任意の方法、の少なくとも１つに基づいて最適化される。

【0279】

いくつかの態様において、使用される細胞はＴ細胞である。

【0280】

いくつかの態様において、細胞の亜集団と対照集団は重複していない。いくつかの態様において、重複していないことは、両集団中の細胞が異なる活性化状態にあるが、同じバリアント核酸を担持することができることを表す。

【0281】

いくつかの態様において、１つ以上のポリペプチドは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、ここで、不変アミノ酸配列はＴＣＲβの定常領域を含む。

【0282】

いくつかの態様において、決定することは、連続部分のヌクレオチド配列のそれぞれについて、少なくとも２５、少なくとも５０、１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００または少なくとも１，０００の平均カバー数を得ることを含む。

【0283】

いくつかの態様において、反応性の評価を伴う、または反応性の評価をさらに含むことができる任意の方法は、反応性を評価するために上位下位比較を使用する場合がある。

【0284】

いくつかの態様において、ライブラリーを伴う本明細書で提供される方法のいずれかは、宿主細胞にとって好ましいコドン使用を導入すること、ｍＲＮＡ構造の安定性を最適化すること、反復配列を回避すること、長い同種重合体を回避すること、および所与のバリアント核酸配列内の局所的なＧＣ含有量に大きな相違が生じることを回避すること、のうちの少なくとも１つに基づいて、ライブラリー（例えば、複数のバリアント核酸のライブラリー）中のヌクレオチド配列が最適化されることを含み得る。

【0285】

いくつかの態様において、抗原は、抗原提示細胞を介して提示される。

【0286】

いくつかの態様において、ライブラリーは、コンビナトリアルライブラリーである。

【0287】

いくつかの態様において、抗原は、細胞によって提供される。

【0288】

いくつかの態様において、過程は、高度な抗原多様性および／または複雑性を伴う。

【0289】

ライブラリーを伴ういくつかの態様では、ライブラリーはコンビナトリアルライブラリーである。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーは、ＴＣＲライブラリーである。

【0290】

連続部分は、少なくとも６００ｂｐの任意の適した長さを有するものであってよい。いくつかの態様において、連続部分の長さは、機能的特性に基づいて細胞の亜集団を選択した後に連続部分の配列決定に使用される配列決定プラットフォームのリード長（例えば、正確なリード長）に依存する。いくつかの態様において、連続部分は、少なくとも６００ｂｐの長さ、例えば、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐ、少なくとも１，１００ｂｐ、少なくとも１，２００ｂｐ、少なくとも１，３００ｂｐ、少なくとも１，４００ｂｐ、少なくとも１，５００ｂｐ、少なくとも１，７５０ｂｐ、少なくとも２，０００ｂｐ、少なくとも２，５００ｂｐ、少なくとも３，０００ｂｐ、少なくとも４，０００ｂｐ、少なくとも５，０００ｂｐ、少なくとも６，０００ｂｐ、少なくとも７，０００ｂｐ、少なくとも８，０００ｂｐ、少なくとも９，０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１１，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１３，０００ｂｐ、少なくとも１４，０００ｂｐ、もしくは少なくとも１５，０００ｂｐ、または前記値のうちの任意の２つで定義される範囲内の長さを有する。いくつかの態様において、連続部分は、約６００ｂｐ～約１５０００ｂｐ、例えば、約８００ｂｐ～約１２０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１００００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約８０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約６０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約５０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約４０００ｂｐを含む長さを有する。

【0291】

コンビナトリアルライブラリーに含まれるバリアント核酸は、任意の適した数のバリアントヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの態様では、コンビナトリアルライブラリーに含まれるすべての核酸が、同じ数のバリアントヌクレオチド配列を有する。いくつかの態様では、コンビナトリアルライブラリーに含まれるバリアント核酸は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０またはそれ以上のバリアントヌクレオチド配列を有し、そのそれぞれは、バリアント核酸の連続部分を組み立てるためにコンビナトリアル様式で組み立てることができるバリアントを有し得る。

【0292】

コンビナトリアルライブラリーは、それぞれのバリアントヌクレオチド配列について任意の適した数のバリアントを含み得る。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーに含まれるバリアントヌクレオチド配列に関するバリアントの数は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１４以上、１６以上、１８以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、７５以上、１００以上、１２５以上、１５０以上、１７５以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１，０００以上、１，５００以上、２，５００以上、３，０００以上、４，０００以上、５，０００以上、７，５００以上、１０，０００以上、またはこれら２つの値で定義される範囲のバリアントの数である。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーに含まれるバリアントヌクレオチド配列に関するのバリアントの数は、２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～５００、５００～１，０００、１，０００～２，０００、２，０００～５，０００、または５，０００～１０，０００の間である。いくつかの態様において、ライブラリー中の個別のバリアントの分布頻度は、それらのバリアントの８０％を超えるものが、頻度中央値÷８から始まり頻度中央値×８で終わる範囲内の頻度を有するようなものである。

【0293】

いくつかの態様では、本明細書で提供されるスクリーニングおよび／またはライブラリーに関連する方法のいずれかに関して、ＴＣＲ対および／またはＴＣＲ対を発現するＴ細胞は、抗原（新生抗原など）への結合によって選択または識別され、ここで、抗原はＢ細胞または抗原提示細胞によって発現される。

【0294】

いくつかの態様では、本明細書で提供されるスクリーニングおよび／またはライブラリーに関連する方法のいずれかに関して、抗原または新生抗原は対象の腫瘍に由来し、ＴＣＲ対のＴＣＲαおよびＴＣＲβもそれぞれ対象に由来する（つまり、一人の対象が、抗原配列と両ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列の全てを有する）。

【0295】

いくつかの態様では、本明細書で提供されるスクリーニングおよび／またはライブラリーに関連する方法のいずれかに関して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万のＴＣＲ対（もしくはこれらの対を含む細胞）が存在し、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万の抗原が存在する。

【0296】

いくつかの態様では、本明細書で提供されるスクリーニングおよび／またはライブラリーに関連する方法のいずれかに関して、ａ）ＴＣＲ対および／またはＴＣＲ対を発現するＴ細胞は、抗原（新生抗原など）への結合によって選択または識別され、ここで、抗原はＢ細胞または抗原提示細胞によって発現され、ｂ）抗原または新生抗原は対象の腫瘍に由来し、ＴＣＲ対のＴＣＲαおよびＴＣＲβもそれぞれ対象に由来し（つまり、一人の対象が、抗原配列と両ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列の全てを有し）、ｃ）少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万のＴＣＲ対（もしくはこれらの対を含む細胞）、および少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、または１００万の抗原が存在する。

【0297】

コンビナトリアルライブラリーは、任意の好適な生体分子（例えば、タンパク質、核酸、核タンパク質など）のライブラリーであってもよい。いくつかの態様において、好適な生体分子は、配列（例えば、タンパク質および／または核酸配列）が、少なくとも６００ヌクレオチドに相当する配列単位（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）の連続する部分にわたって変化させることが可能なものである。好適なコンビナトリアルライブラリーは、ＴＣＲ、ＣＡＲ、抗体、ＲＮＡガイドヌクレアーゼなどに関するコンビナトリアルライブラリーを含むが、これらに限定されるものではない。

【0298】

いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーは、多様なＴ細胞集団に由来するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを含む。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーの複数の核酸は、１つ以上のＴＣＲα機能的ドメイン（例えば、ＴＣＲαＶ領域、ＴＣＲα相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、ＴＣＲαＪセグメント、ＴＣＲα定常領域）、および１つ以上のＴＣＲβ機能的ドメイン（例えば、ＴＣＲβＶ領域、ＴＣＲβ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、ＴＣＲβＪセグメント、ＴＣＲβ定常領域）をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーＴＣＲの核酸の連続部分は、６００ｂｐ～２，０００ｂｐの間の長さ、例えば、８００ｂｐ～１，９００ｂｐ、１，０００ｂｐ～１，９００ｂｐ、１，２００ｂｐ～１，９００ｂｐ、１，４００ｂｐ～１，９００ｂｐ、１，５００ｂｐ～約１，９００ｂｐ、１，６００ｂｐ～１，９００ｂｐ、１，７００ｂｐ～１，９００ｂｐの間の長さ、または約１，８００ｂｐの長さである。

【0299】

いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーの複数の核酸は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）機能的ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および２～３のシグナル伝達モジュールを含み得る細胞内シグナル伝達ドメイン）をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーＣＡＲの核酸の連続部分は、６００ｂｐ～２，０００ｂｐの間の長さ、例えば、８００ｂｐ～１，９００ｂｐ、１，０００ｂｐ～１，８００ｂｐ、１，２００ｂｐ～１，８００ｂｐ、１，４００ｂｐ～１，７００ｂｐの間の長さ、または約１，５００ｂｐの長さである。

【0300】

いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーは、抗体の重鎖および軽鎖配列のレパトアを含む。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーの複数の核酸は、１つ以上の抗体重鎖の機能的ドメイン（例えば、重鎖可変領域（１つ以上のＣＤＲ、フレームワーク領域を含む）、および／または重鎖定常領域（１つ以上のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を含む）をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーの複数の核酸は、１つ以上の抗体軽鎖の機能的ドメイン（例えば、軽鎖可変領域（１つ以上のＣＤＲ、フレームワーク領域を含む））、および／または軽鎖定常領域をコードするバリアントヌクレオチド配列を含む。

【0301】

いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーの核酸は、バリアント核酸を含む好適なベクターを含む。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーの核酸は、好適な制御配列および／または非翻訳配列を含む。好適な非翻訳配列には、プロモーター、シグナルペプチド、スプライシング部位、停止コドン、およびポリ（Ａ）シグナル配列が含まれるが、これらには限定されない。いくつかの態様において、核酸は、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光分子、または細胞表面マーカー）を含む。

【0302】

いくつかの態様において、スクリーニング方法は、コンビナトリアルライブラリーを生成することを含む。コンビナトリアルライブラリーは、任意の好適な選択肢を用いて作製することができる。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーを生成することは、１つ以上のポリペプチドの２つ以上のバリアントアミノ酸配列のセットをコードする、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のセットを同定すること、ここで、少なくとも１つの機能的特性は、２つ以上のバリアントアミノ酸配列のセットのそれぞれに由来するバリアントアミノ酸配列の組み合わせに依存し；および２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のセットのそれぞれに由来するバリアントヌクレオチド部分配列を組み合わせることで連続部分を組み立て、それによって複数のバリアント核酸のメンバーを生成すること、を含む。

【0303】

いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーを生成することは、レポーター細胞によって発現されることになるポリペプチドのバリアントアミノ酸配列をコードするバリアントヌクレオチド部分配列の複数のバリアントを同定することを含む。ポリペプチドが２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列を含む場合、連続部分は、バリアントヌクレオチド部分配列のそれぞれに由来するバリアントを組み合わせることによって組み立てることができる。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーを生成することは、ライブラリーの核酸をインシリコで、例えば、コドン使用の制御を通じて編集距離を最大化するように、設計することを含む。任意の好適なアルゴリズムを、編集距離を最大化するために使用してもよい。コンビナトリアルライブラリーを、任意の好適な選択肢を使用して、例えば、インシリコで生成された設計に基づいて、合成してもよい。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーは、多様なＴ細胞集団に由来するＴＣＲのレパトアを含む。

【0304】

コンビナトリアルライブラリーを細胞に導入するための任意の好適な選択肢を使用してもよい。好適な選択肢としては、ウイルス導入、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、形質転換、エレクトロポレーション、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的統合（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ）などが挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーを細胞に導入することは、ウイルス導入、トランスポゾン媒介性遺伝子導入、またはヌクレアーゼ媒介性部位特異的統合を含む。

【0305】

コンビナトリアルライブラリーを、ライブラリーの核酸によってコードされるポリペプチドを発現するように構成された任意の好適な細胞、例えば、レポーター細胞に導入してもよい。好適な細胞としては、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母、および細菌が挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの態様において、好適な担体としては、ウイルス、酵母、細菌、およびファージが挙げられる。本開示では、簡略化のために全体を通して「細胞」という用語を使用するが、本明細書における「細胞」のこのような開示はすべて、様々な形態のＴ細胞（不死化Ｔ細胞など）、酵母および細菌だけでなく、ウイルスやファージを含む任意の担体と共に、より一般的に使用できることが、本明細書においては想定される。したがって、本明細書で使用される「細胞」（コンビナトリアルライブラリーが導入され得る細胞への言及を含む）周辺の開示は、真核細胞、原核細胞、およびウイルスとファージも担体として使用できる選択肢を示すために、含めることができる。細胞は、細胞株であっても、不死化細胞であっても、または初代細胞であってもよい。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞から誘導されたものである。いくつかの態様において、細胞の集団は、不死化Ｔ細胞または初代Ｔ細胞を含む。いくつかの態様において、不死化Ｔ細胞または初代Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーは、不死化Ｔ細胞または初代Ｔ細胞に（例えば、ウイルス導入により）導入される。いくつかの態様において、細胞は、目的のバリアントヌクレオチド部分配列の組合せを同定するために細胞が選択されることになる機能的特性を全くまたはほとんど示さない。いくつかの態様において、細胞は、ライブラリーの核酸によってコードされるポリペプチドによって媒介され、かつバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせに依存する機能的特性を全くまたはほとんど示さない。いくつかの態様において、細胞集団の細胞は、操作、例えば遺伝的に改変される。いくつかの態様において、細胞は、細胞による機能的特性の内因性のまたはバックグラウンドの発現を低減または排除するように操作、例えば遺伝的に改変される。いくつかの態様において、細胞は、コンビナトリアルライブラリーを導入したときに機能的特性を示す細胞の能力を増強するように操作、例えば遺伝的に改変される。いくつかの態様において、細胞は、培養中の集団の成長および／または維持を促進するように操作、例えば遺伝的に改変されている。いくつかの態様において、集団の細胞は、少なくとも１つの機能的特性を細胞に付与する内因性ポリペプチドを含まない。いくつかの態様において、細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２８のうちの１つ以上の発現を導入または増強または排除または低減するように、遺伝的に改変される。いくつかの態様において、遺伝的に改変された細胞は、Ｔ細胞である。

【0306】

いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーが導入された細胞の集団のそれぞれの細胞は、複数の核酸のうち平均して１つの核酸を含む。いくつかの態様において、細胞の集団には、１０以下の感染多重度（ＭＯＩ）で、例えば、７以下、５以下、３以下、２以下、１以下を含む感染多重度（ＭＯＩ）でコンビナトリアルライブラリーが導入される。いくつかの態様において、導入することは、５以下の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞の集団をウイルス導入することを含んでいる。いくつかの態様では、細胞の集団のそれぞれの細胞に正確に１つまたは２つの核酸を導入するために、ヌクレアーゼ媒介性部位特異的統合（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ）が使用される。

【0307】

コンビナトリアルライブラリーが導入される細胞の集団の大きさには、任意の適した数の細胞が含まれ得る。いくつかの態様では、細胞の数は、ライブラリーの大きさ、ライブラリーにおけるバリアント核酸の相対的な表現、集団におけるそれぞれのバリアント核酸の所望されるレベルの表現（「カバー数」とも称される）、実施するスクリーンニングの種類（例えば、「濃縮」スクリーンニング（濃縮されたバリアントを同定することが主な目的）または「枯渇」スクリーニング（枯渇したバリアントを同定することが主な目的）のいずれが実行されるか）、ライブラリーに含まれる個々のバリアントの表現およびエラー率、ならびに細胞損失に関連する少なくとも１つの機能的特性に基づいて全細胞集団の亜集団を選択するために必要な過程のステップ、の１つ以上に依存する。そのような過程のステップの例としては、正常に形質導入された細胞に関する選択、および／または発現されるポリペプチドによって媒介される機能的特性に関するフローサイトメトリーによる選択が含まれるが、これらには限定されない。いくつかの態様において、スクリーニング方法は、ライブラリーに含まれる２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の異なる組み合わせの数に基づいて、細胞の集団の大きさを調整することを含む。

【0308】

いくつかの態様において、スクリーニング方法は、核酸に含まれる選択マーカーに基づいて、ライブラリーの核酸を受け取ったことによって正常に改変された細胞を同定することを含む。いくつかの態様において、スクリーニング方法は、複数のバリアント核酸の少なくとも１つを発現する細胞の集団に含まれる細胞を選択またはスクリーニングするためにマーカーを使用することを含む。いくつかの態様において、マーカーは、細胞毒耐性マーカーおよび／または細胞表面マーカーである。正常に改変された細胞を、使用される選択可能なマーカーに応じて、任意の好適な方法を用いて選択することができる。いくつかの態様において、細胞は、抗生物質耐性、例えば、これらに限定されるものではないが、ピューロマイシンまたはブラストサイジンに対する耐性に基づいて選択される。いくつかの態様において、細胞は、検出可能なマーカーの発現、例えば、これらに限定されるものではないが、フローサイトメトリーによる選別に使用できる細胞表面マーカーまたは蛍光分子による発現に基づいて選択される。いくつかの態様において、細胞は、例えば、磁気ビーズの使用に基づく濃縮に適した細胞表面マーカーに基づいて選択される。

【0309】

細胞の集団の亜集団を選択することは、バリアント核酸によってコードされるポリペプチドの任意の適した機能的特性に基づくものであってもよい。適した機能的特性としては、リガンド結合（例えば、抗原結合）、刺激に応答したシグナル伝達（例えば、抗原結合に対する応答）が挙げられるが、これらには限定されない。シグナル伝達としては、リン酸化、転位、シグナル伝達ドメインの相互作用、または転写の変化を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。バリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせに依存する機能的特性に基づいて細胞の集団の亜集団を選択することは、任意の好適な選択肢を用いて実施することができる。いくつかの態様において、好適な機能的出力は、これらは限定されないが、マーカーの発現、または刺激に応答した細胞増殖を使用して測定される。

【0310】

いくつかの態様において、選択することは、検出可能なマーカーの発現に基づいて亜集団を選択することを含み、ここで発現は、１つ以上のポリペプチドの少なくとも１つの機能的特性に依存する。いくつかの態様において、検出可能なマーカーは、細胞表面マーカー、サイトカインマーカー、細胞増殖マーカー、転写レポーター、シグナル伝達レポーター、および／または細胞毒性レポーターを含む。いくつかの態様において、細胞表面マーカーは、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７のうちの１つ以上を含み；サイトカインマーカーは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ以上を含み；転写レポーターは、ＮＦ－κＢ、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１のうちの１つ以上を含み；シグナル伝達レポーターは、ＺＡＰ７０、ＥＲＫ１／２のうちの１つ以上を含み；および細胞毒性レポーターは、ＣＤ１０７Ａ、ＣＤ１０７Ｂ、グランザイムＢのうちの１つ以上を含む。

【0311】

いくつかの態様において、細胞の集団の亜集団を選択することは、機能的特性を示す（例えば、機能的アッセイにおいて陽性に応答する）細胞を選択することを含む。いくつかの態様において、細胞の集団の亜集団を選択することは、機能的特性を示さない（例えば、機能的アッセイにおいて陰性に応答する）細胞を選択することを含む。いくつかの態様において、スクリーニング方法は、機能的特性を示す細胞の集団の亜集団を選択すること、および機能的特性を示さない細胞の集団の別の亜集団を選択することを含む。いくつかの態様において、細胞の集団の亜集団を選択することは、亜集団それぞれの細胞によって示される機能的特性のレベルまたは程度の階層化に基づいて、複数の細胞の亜集団を選択することを含む。

【0312】

いくつかの態様において、亜集団を選択することは、細胞の集団を、第二の集団；１つ以上のポリペプチドのリガンド；１つ以上のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト；および小分子、のうちの１つ以上と接触させることを含み、ここで接触によって誘発される亜集団の変化は、１つ以上のポリペプチドの少なくとも１つの機能的特性に依存する。いくつかの態様において、亜集団を選択することは、変化の有無および／または変化の大きさを検出すること；ならびに検出に基づいて亜集団を選択することを含む。いくつかの態様において、細胞の第二の集団は、抗原提示細胞を含む。いくつかの態様において、抗原提示細胞は、Ｂ細胞および／または樹状細胞を含む。いくつかの態様において、細胞の第二の集団は、初代細胞または不死化細胞を含む。いくつかの態様において、ライブラリーのバリアントヌクレオチド部分配列は、バリアントヌクレオチド部分配列によってコードされるアミノ酸を含むバリアントポリペプチドを発現する細胞に由来し、ここで細胞は対象に由来し、ここで細胞の第二の集団もこの対象に由来する。

【0313】

いくつかの態様において、選択することは、閾値を超えるまたは下回る少なくとも１つの機能的特性の測定に基づいて、細胞の集団の第一の亜集団を選択することを含む。いくつかの態様において、閾値は、細胞の集団の未選択の亜集団における機能的特性の測定に基づいて決定される。いくつかの態様において、選択することはさらに、第二の閾値を超えるまたは下回る少なくとも１つの機能的特性の第二の測定値に基づいて細胞の集団の第二の亜集団を選択することを含み、ここで、第一および第二の亜集団は重複していない。いくつかの態様において、少なくとも１つの組み合せを特定することは、第一および第二の亜集団の間で少なくとも１つの組み合せの存在量を比較することを含む。

【0314】

いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーがＴＣＲαとＴＣＲβのバリアントを含むＴＣＲライブラリーである場合、細胞の亜集団は、１つ以上のマーカーの発現の変化によって、抗原提示に応答する細胞の能力に基づいて選択される。好適なマーカーとしては、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＧＭ－ＣＳＦが挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの態様において、マーカーは、これらに限定されるものではないが、ＮＦ－κＢ、ＮＦＡＴ、およびＡＰ－１を含む、プロモーター活性レポーターである。

【0315】

いくつかの態様において、抗原は、Ｂ細胞（例えば、不死化Ｂ細胞）および樹状細胞を含むがこれらには限定されない抗原提示細胞によって提示される。いくつかの態様において、抗原の同一性は分かっていない。いくつかの態様において、抗原は新生抗原である。

【0316】

いくつかの態様において、コンビナトリアルライブラリーがＣＡＲ機能的ドメインのバリアントを含むＣＡＲライブラリーである場合、細胞の亜集団は、細胞増殖の変化および／またはマーカー発現の変化によって、抗原提示に応答する細胞の能力に基づいて選択される。好適なマーカーとしては、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＧＭ－ＣＳＦが挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの態様において、マーカーは、ＺＡＰ７０およびＥＲＫ１／２リン酸化を含むがこれらに限定されない、シグナル伝達レポーターである。いくつかの態様において、マーカーは、これらに限定されるものではないが、ＣＤ１０７ＡおよびＣＤ１０７Ｂなどの細胞傷害性レポーターである。いくつかの態様において、マーカーは、これらに限定されるものではないが、ＮＦ－κＢ、ＮＦＡＴ、およびＡＰ－１などのプロモーター活性レポーターである。

【0317】

いくつかの態様において、亜集団は、複数の細胞を含む。いくつかの態様において、単離することは、少なくとも１つの機能的性質に基づいて、亜集団の単一クローンを単離することを含まない。いくつかの態様において、亜集団は、少なくとも１，０００の細胞を含む（例えば、１００のバリアントについて１０倍のカバー数）。

【0318】

いくつかの態様では、バリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせに依存する機能的特性に基づいて選択される亜集団は、約１，０００以上の細胞を含み、例えば約２，０００以上の細胞、約３，０００以上の細胞、約４，０００以上の細胞、約５，０００以上の細胞、約７，５００以上の細胞、約１０，０００以上の細胞、約２０，０００以上の細胞、約５０，０００以上の細胞、約１×１０^５以上の細胞、約２×１０^５以上の細胞、約５×１０^５以上の細胞、約１×１０^６以上の細胞、約１×１０^７以上の細胞、約１×１０^８以上の細胞、約１×１０^９以上の細胞、約１×１０^１０以上の細胞、約１×１０^１１以上の細胞、約１×１０^１２以上の細胞を含む、または前述した値のうちの任意の２つにより定義される範囲内の細胞数、を含む。いくつかの態様において、バリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせに依存する機能的特性に基づいて選択される亜集団は、約１，０００～約１×１０^１２の細胞を含み、例えば、約２，０００～約１×１０^１２の細胞、約３，０００～約１×１０^１０の細胞、約５，０００～約１×１０^９の細胞、約１×１０^４～約１×１０^９の細胞を含む、細胞を含む。

【0319】

いくつかの態様において、ＴＣＲ対の機能は、抗原への結合である。

【0320】

いくつかの態様において、亜集団は、初期集団の画分であり、本来の集団の、例えば１０^－１４、１０^－１３、１０^－１２、１０^－１１、１０^－１０、１０^－９、１０^－８、０．００００００１、０．０００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４，０５０、６０、７０、８０または９０（前述した値の任意の二つの間に定義される範囲を含む）％未満である。

【0321】

いくつかの態様において、バリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせに依存する機能的特性に基づいて選択される亜集団の大きさは、ライブラリーに含まれるバリアント核酸が亜集団中で適切に表現されるような、十分な大きさである。いくつかの態様において、亜集団は、約１０倍以上のカバー数を提供するサイズを有し、例えば、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約６０倍以上、約７０倍以上、約８０倍以上、約９０倍以上、約１００倍以上、約１２０倍以上、約１４０倍以上、約１６０倍以上、約１８０倍以上、約２００倍以上、約２５０倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上を含む、またはライブラリーに含まれるバリアント核酸の総数の、前述した値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の倍率のカバー数を有する。いくつかの態様において、亜集団は、ライブラリーに含まれるバリアント核酸の総数の約１０～約１，０００倍のカバー数を提供するサイズを有し、例えば、約３０～約７５０倍、約４０～約５００倍、約５０～約５００倍、約５０～約４００倍、約６０～約３００倍、約７０～約２５０倍、約８０～約２００倍含む、カバー数を提供するサイズを有する。

【0322】

亜集団からバリアント核酸を単離することは、任意の適した手法を用いて行うことができる。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、任意の好適な方法を用いて亜集団からゲノムＤＮＡを抽出することを含む。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、亜集団からバルクゲノムＤＮＡを抽出することを含む。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、亜集団から個別のクローンを単離することも、個別のクローンからゲノムＤＮＡを単離することも含まない。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、亜集団から個別のクローンを単離することも、個別のクローンを拡大することも、それによって拡大されたクローン集団からゲノムＤＮＡを単離することも含まない。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、亜集団から個別のクローンを単離することもまたは拡大することもなく、亜集団からバルクゲノムＤＮＡを抽出することを含む。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、任意の好適な方法を用いて亜集団からＲＮＡを抽出することを含む。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、亜集団からバルクＲＮＡを抽出することを含む。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、亜集団からｍＲＮＡを抽出することを含む。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、亜集団から個別のクローンを単離することも、個別のクローンからＲＮＡを単離することも含まない。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、単細胞ＰＣＲ法による単細胞の分析を含まない。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、亜集団から個別のクローンを単離することも、個別のクローンを拡大することも、それによって拡大されたクローン集団からＲＮＡを単離することも含まない。いくつかの態様において、バリアント核酸を単離することは、亜集団から個別のクローンを単離することもまたは拡大することもなく、亜集団からＲＮＡを抽出することを含む。用語「ＲＮＡ」は、属に関する用語であり、例えば、天然版のおよび人工版のＲＮＡを含む。本明細書では、しばしば「ＤＮＡ」に関する選択肢を概説するが、そのような選択肢および態様のすべては、代わりにＲＮＡに対して使用できることが理解されよう。

【0323】

いくつかの態様において、亜集団から抽出されたゲノムＤＮＡの量は、ライブラリーのバリアント核酸に含まれるバリアントそれぞれについて適切なカバー数を提供するのに十分な量である。いくつかの態様において、亜集団から抽出されたゲノムＤＮＡの量は、約１０倍以上のカバー数を提供するのに十分であり、例えば、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約６０倍以上、約７０倍以上、約８０倍以上、約９０倍以上、約１００倍以上、約１２０倍以上、約１４０倍以上、約１６０倍以上、約１８０倍以上、約２００倍以上、約２００倍以上約２５０倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１，０００倍以上を含む、またはライブラリーに含まれるバリアント核酸の総数の、前述した値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の倍率のカバー数を有する。いくつかの態様において、亜集団から抽出されたゲノムＤＮＡの量は、ライブラリー中のバリアント核酸の総数の約１０～約１，０００倍のカバー数を提供するのに十分な量を有し、例えば、約２０～約１，０００倍、約３０～約７５０倍、約４０～約５００倍、約５０～約５００倍、約５０～４００倍、約６０～３００倍、約７０～約２５０倍、約８０～約２００倍を含む、カバー数を提供するのに十分な量である。いくつかの態様において、決定することは、個別のメンバーを増幅する前にまたは個別のメンバーを増幅することなく、連続部分のヌクレオチド配列のそれぞれについて、少なくとも１０の平均カバー数を得ることを含む。

【0324】

いくつかの態様において、亜集団からバリアント核酸を単離することは、抽出したバリアント核酸を増幅することを含む。バリアント核酸の任意の適した部分を増幅してもよい。いくつかの態様では、実質的に、バリアント核酸の連続部分のみが増幅される。いくつかの態様では、ポリペプチドの全体をコードしているバリアント核酸の部分が増幅される。いくつかの態様において、増幅産物（すなわちアンプリコン）の大きさは、少なくとも６００ｂｐであり、例えば、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐ、少なくとも１，１００ｂｐ、少なくとも１，２００ｂｐ、少なくとも１，３００ｂｐ、少なくとも１，４００ｂｐ、少なくとも１，５００ｂｐ、少なくとも１，７５０ｂｐ、少なくとも２，０００ｂｐ、少なくとも２，５００ｂｐ、少なくとも３，０００ｂｐ、少なくとも４，０００ｂｐ、少なくとも５，０００ｂｐ、少なくとも６，０００ｂｐ、少なくとも７，０００ｂｐ、少なくとも８，０００ｂｐ、少なくとも９，０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１１，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１３，０００ｂｐ、少なくとも１４，０００ｂｐ、または少なくとも１５，０００ｂｐ、あるいは前述した値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の長さである。いくつかの態様において、増幅産物（すなわちアンプリコン）の大きさは、約６００ｂｐ～約１５，０００ｂｐであり、例えば、８００ｂｐから約１２，０００ｂｐ、約１，０００ｂｐから約１０，０００ｂｐ、約１，０００ｂｐから約８，０００ｂｐ、約１，０００ｂｐから約６，０００ｂｐ、約１，０００ｂｐから約５，０００ｂｐ、約１，０００ｂｐから約４，０００ｂｐ、約１，０００ｂｐから約３，０００ｂｐ、約１，０００ｂｐから約２，０００ｂｐを含む、大きさである。

【0325】

いくつかの態様において、決定することは、複数の核酸の個別のメンバーの少なくとも連続部分を増幅することを含む。いくつかの態様において、増幅することは、不変ヌクレオチド部分配列にハイブリダイズする増幅プライマーを使用することを含み、ここで複数のバリアント核酸はそれぞれ、不変ヌクレオチド部分配列を含み、ここで不変ヌクレオチド部分配列は、１つ以上のポリペプチドの不変アミノ酸配列をコードしている。いくつかの態様において、増幅することは、不変ヌクレオチド配列の外側のヌクレオチド部分配列にハイブリダイズする増幅プライマーを使用することを含み、ここで不変ヌクレオチド配列の外側のヌクレオチド部分配列には、遺伝子ベクターの非翻訳領域のヌクレオチド配列が含まれるが、これに限定されるものではない。いくつかの態様において、１つ以上のポリペプチドは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、不変アミノ酸配列は、ＴＣＲα定常領域を含む。

【0326】

いくつかの態様において、増幅することは、増幅されたアンプリコンのライブラリーに含まれるコンビナトリアルライブラリーのバリアント核酸のバリアントそれぞれについて十分なカバー数を提供するように実施される。いくつかの態様において、単離されたバリアント核酸は、約１，０００倍以上のカバー数を提供するように増幅され、例えば、約２，０００倍以上、約３，０００倍以上、約４，０００倍以上、約５，０００倍以上、約６，０００倍以上、約７，０００倍以上、約８，０００倍以上、約９，０００倍以上、約１０，０００倍以上、約１２，０００倍以上、約１４，０００倍以上、約１６，０００倍以上、約１８，０００倍以上、約２０，０００倍以上、約２５，０００倍以上、約３０，０００倍以上、約４０，０００倍以上、約５０，０００倍以上、約１００，０００以上を含む、または結果として得られるアンプリコンライブラリーに含まれるコンビナトリアルライブラリーのバリアント核酸の総数の、前述した値のうちの任意の２つによって定義される範囲内のカバー数を提供するように増幅される。いくつかの態様において、単離されたバリアント核酸は、結果として得られるアンプリコンライブラリー中のコンビナトリアルライブラリーのバリアントの総数の約１，０００～約１００，０００倍のカバー数を提供するように増幅され、例えば、約２，０００～約１００，０００倍、約３，０００～約７５，０００倍、約４，０００～約５０，０００倍、約５，０００～約５０，０００倍、約５，０００～約４０，０００倍、約６，０００～約３０，０００倍、約７，０００～約２５，０００倍、約８，０００～約２０，０００を含む、カバー数を提供するように増幅される。いくつかの態様において、決定することは、連続部分のヌクレオチド配列のそれぞれについて、少なくとも１，０００の平均カバー数を得ることを含む。

【0327】

いくつかの態様において、増幅することは、結果として得られるアンプリコンライブラリーにおける増幅バイアスを低減する様式で行われる。いくつかの態様において、増幅バイアスは、増幅のサイクル数を減少させることによって低減される。いくつかの態様において、増幅バイアスは、増幅のサイクル数を減少させるのに十分に大きな細胞の亜集団を有することによって低減される。いくつかの態様では、増幅バイアスに起因する配列決定データの偏りを低減するために、固有の分子識別子（ＵＭＩ）が使用される。

【0328】

いくつかの態様において、亜集団からバリアント核酸を単離することは、単離したバリアント核酸を増幅することを含まない。

【0329】

いくつかの態様において、亜集団からバリアント核酸を単離することは、ＣＲＩＳＰＲの使用に基づく選択的ライブラリー製剤を使用することを含む。ＣＲＩＳＰＲの使用に基づく選択的ライブラリー製剤に関する任意の好適な選択肢を使用することができる。いくつかの態様において、単離することは、亜集団由来のゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性標的断片化を使用することを含む。いくつかの態様において、亜集団からバリアント核酸を単離することは、亜集団から抽出されたゲノムＤＮＡを脱リン酸化すること、目的の配列（例えば、バリアント核酸の連続部分）に隣接した位置にＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９媒介性二本鎖切断を導入すること、および二本鎖切断部位にアダプター（例えば、配列決定アダプター）を連結すること、を含む。次いで、アダプターを連結した配列を、任意の好適な手法を用いて配列決定することができる。いくつかの態様において、サブセットの個別のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定することは、サブセットの個別のメンバーそれぞれをバーコーディングすることを含む。

【0330】

サブセットの個別のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定することは、任意の好適な選択肢を使用して行うことができる。いくつかの態様において、連続部分のヌクレオチド配列を決定することは、連続部分を配列決定することを含む。任意の好適な配列決定プラットフォームを使用することができる。好適な配列決定プラットフォームとしては、サンガー配列決定、パイロシークエンシング、単一分子配列決定、イオン半導体配列決定、合成による配列決定、コンビナトリアルプローブアンカー合成配列決定、連結による配列決定、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定および／またはナノポアシーケンシングなどが挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの態様において、連続部分のヌクレオチド配列を決定することは、配列決定リードを長くすることが可能な配列決定プラットフォームを使用することを含む。いくつかの態様において、決定することは、連続部分の少なくとも６００ｂｐの配列決定リードを生成することによって、個別のメンバーについて配列決定することを含む。いくつかの態様において、配列決定リードは、６００ｂｐ～１５，０００ｂｐの長さである。いくつかの態様において、連続部分のヌクレオチド配列を決定することは、連続部分のうちの、少なくとも６００ｂｐの配列決定リードを生成または取得することを伴い、例えば、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐ、少なくとも１，１００ｂｐ、少なくとも１，２００ｂｐ、少なくとも１，３００ｂｐ、少なくとも１，４００ｂｐ、少なくとも１，５００ｂｐ、少なくとも１，７５０ｂｐ、少なくとも２，０００ｂｐ、少なくとも２，５００ｂｐ、少なくとも３，０００ｂｐ、少なくとも４，０００ｂｐ、少なくとも５，０００ｂｐ、少なくとも６，０００ｂｐ、少なくとも７，０００ｂｐ、少なくとも８，０００ｂｐ、少なくとも９，０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１１，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１３，０００ｂｐ、少なくとも１４，０００ｂｐ、もしくは少なくとも１５，０００ｂｐ、または前述した値のうちの任意の２つによって定義される範囲内の配列決定リード長の、配列決定リードを生成または取得することを伴う。いくつかの態様において、配列決定リードは、連続部分のうちの、約６００ｂｐから約１，０００ｂｐ、約１，０００ｂｐから約２，０００ｂｐ、約２，０００ｂｐから約３，０００ｂｐ、約３，０００ｂｐから約４，０００ｂｐ、約４，０００ｂｐから約５，０００ｂｐ、約５，０００ｂｐから約７，０００ｂｐ、約７，０００ｂｐから約１０，０００ｂｐ、および／または約１０，０００ｂｐから約１５，０００ｂｐである。

【0331】

ヌクレオチド配列に基づいて２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の少なくとも１つの組み合わせを同定することは、任意の好適な選択肢を使用して行うことができる。いくつかの態様では、機能的特性に基づいて選択された亜集団において、その組み合わせが濃縮されている、または枯渇していることを決定することによって、目的の組み合わせを同定する。組合せの相対的存在量は、亜集団から決定されたヌクレオチド配列の組合せの存在量と、存在量の参照レベルとの任意の適した比較に基づくものであってよい。存在量の適した参照レベルとしては、機能的特性の欠如、異なるレベルの応答、もしくは異なるタイプの応答に基づいて選択された細胞の別の亜集団における組み合わせの存在量；または選択されていない亜集団における組み合わせの存在量が挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの態様において、目的の組み合わせは、負に選択された亜集団と比較して、正に選択された亜集団においてその組み合わせが濃縮されている、または枯渇していることを決定することによって同定される。いくつかの態様において、目的の組み合わせは、コンビナトリアルライブラリー中での組み合わせの存在量と比較して、機能的特性に基づいて選択された亜集団においてその組み合わせが濃縮されている、または枯渇していることを決定することによって同定される。

【0332】

いくつかの態様において、少なくとも１つの組み合せを同定することは、細胞の対照集団と比較して、亜集団における少なくとも１つの組み合せの濃縮度を測定することを含む。いくつかの態様において、細胞の集団は、細胞の対照集団を含み、ここで細胞の亜集団および対照集団は、重複していない。いくつかの態様において、細胞の対照集団は、少なくとも１つの機能的特性とは異なる第二の機能的特性に基づいて選択される。

【0333】

いくつかの態様において、スクリーニング方法は、複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供すること、複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで連続部分は、ＴＣＲαのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、連続部分の第一の末端を規定する第一のバリアントヌクレオチド部分配列とＴＣＲβのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、第一の末端とは反対側にある連続部分の第二の末端を規定する第二のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを含み；複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現するように構成された不死化Ｔ細胞の集団に、ライブラリーを導入すること；不死化Ｔ細胞と抗原を発現している不死化Ｂ細胞との接触に応答して閾値を超えるＴ細胞活性化マーカーの発現に基づいて、不死化Ｔ細胞の集団の亜集団を選択すること、ここで亜集団は複数のＴ細胞を含み；亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；サブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、サブセットのヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、第一と第二のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること、を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、不死化Ｔ細胞と不死化Ｂ細胞との接触に応答して第二の閾値を下回るＴ細胞活性化マーカーの発現に基づいて、不死化Ｔ細胞の集団の第二の亜集団を選択すること、ここで第二の亜集団は第二の複数のＴ細胞を含み、ここで亜集団と第二の亜集団は重複しておらず；第二の亜集団から複数のバリアント核酸の第二のサブセットを単離すること；および、第二のサブセットの個別のメンバーの連続部分の第二のヌクレオチド配列を決定すること、ここで、少なくとも１つの組み合わせは、第二のサブセットの第二のヌクレオチド配列における少なくとも１つの組み合わせと比較した、サブセット中の少なくとも１つの組み合わせの濃縮度に基づいて同定される；を含む。

【0334】

いくつかの態様において、スクリーニング方法は、複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供すること、複数のバリアント核酸はそれぞれ、少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで連続部分は、ＣＡＲヒンジドメインをコードしている第一のバリアントヌクレオチド部分配列、ＣＡＲ膜貫通ドメインをコードしている第二のバリアントヌクレオチド部分配列、およびＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインをコードしている第三のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの２つ以上の組み合わせを含み、ここで、第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの１つは、連続部分の第一の末端を規定し、ここで、第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列の別の１つは、第一の末端の反対側にある連続部分の第二の末端を規定し；複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＣＡＲを発現するように構成された細胞の集団に、ライブラリーを導入すること、ここで細胞の集団は、不死化Ｔ細胞または初代ヒトＴ細胞の集団を含み；細胞とＣＡＲの抗原結合ドメインに特異的な抗原を発現している抗原提示細胞とを接触させることに応答して閾値を超える細胞増殖に基づいて、細胞の集団の亜集団を選択すること、ここで亜集団は複数の細胞を含み；亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；サブセットの個々のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、サブセットのヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、第一、第二、および第三のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること、を含む。いくつかの態様において、方法はさらに、細胞と抗原提示細胞とを接触させることに応答して第二の閾値レベルを下回る細胞増殖に基づいて、細胞の集団の第二の亜集団を選択すること、ここで第二の亜集団は第二の複数の細胞を含み、ここで亜集団と第二の亜集団は重複しておらず；第二の亜集団から前記複数のバリアント核酸の第二のサブセットを単離すること；第二のサブセットの個別のメンバーの連続部分の第二のヌクレオチド配列を決定すること、ここで少なくとも１つの組み合わせは、第二のサブセットの第二のヌクレオチド配列における少なくとも１つの組み合わせと比較して、サブセット中の少なくとも１つの組み合わせの濃縮度に基づいて同定される、を含む。

【0335】

本開示内では、様々な態様が、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを含む連続部分を伴うものとして説明されることが多い。さらに、これらの態様はしばしば、第一のバリアントヌクレオチド部分配列および第二のバリアントヌクレオチド、ならびに２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせに依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて細胞集団の亜集団を選択することを伴う。しかしながら、２つ以上のバリアントヌクレオチドを伴うそのような全ての態様について明示的に考慮される代替態様は、単一の機能的配列（すなわち、単一のバリアントヌクレオチド）を伴うものである。そのような態様において、６００ｂｐの配列は、例えば、単一の機能を有する単一のタンパク質をコードし得る、単一の核酸配列にわたる配列に関するものとなるであろう。したがって、「２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列」を伴う本明細書に開示される全ての態様に関しては、改めて、配列自体が６００ｂｐ以上の「バリアントヌクレオチド部分配列」のみが存在する状況に方法を適用することも想定される。例えば、いくつかの態様では、核酸のコンビナトリアルライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法が提供される。この方法は、複数のバリアント核酸を含むコンビナトリアルライブラリーを提供することを含み、複数のバリアント核酸はそれぞれ、少なくとも６００ｂｐの連続部分を含む。方法はさらに、複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成された細胞の集団に、ライブラリーを導入することをさらに含む。方法はさらに、少なくとも６００ｂｐの連続部分に依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて細胞の集団の亜集団を選択することを含み、ここで亜集団は複数の細胞を含む。方法はさらに、亜集団から複数のバリアント核酸のサブセットを単離することを含む。方法はさらに、サブセットの個別のメンバーの連続部分のヌクレオチド配列を決定することを含む。方法はさらに、ヌクレオチド配列に基づいて、少なくとも６００ｂｐの連続部分を同定することを含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも６００ｂｐの連続部分が６００塩基対全体に分布しているものでもあり得る。

【0336】

本発明のスクリーニング方法のさらなる態様が提供される。いくつかの態様において、本開示のスクリーニング方法は、任意のタンパク質バリアントであって、そこで（ａ）タンパク質配列が、２００アミノ酸以上の連続した領域で変化させることが意図されている；（ｂ）タンパク質バリアントを、選択圧に暴露することができるレポーター細胞（酵母および細菌を含む）または別の機能的担体（例えば、ウイルス、ファージ）において発現させることができる；および（ｃ）目的のタンパク質バリアントを発現するレポーター細胞を、選択圧後の少なくとも１つの機能的特性（例えば、抗原結合、抗原に応答した遺伝子発現など）に基づいて選択することが可能な、任意のタンパク質バリアントのスクリーニングに使用することができる。
その全塩基配列のうちの少なくとも６００ｂｐを決定することによってのみ明確に識別することができる少なくとも２つのバリアント塩基配列を含むバリアント塩基配列のライブラリーの生成

【0337】

いくつかの態様において、バリアントヌクレオチド配列のライブラリーは、任意の好適なインシリコにおける設計およびタンパク質工学的手法によって生成される。それぞれのバリアントを、細胞内でバリアントヌクレオチド配列の発現をもたらす遺伝子ベクターにコード化することができる。実施されるそのスクリーニングに応じて、バリアントヌクレオチド配列は、適切なプロモーター、シグナルペプチド、スプライス供与部位／受容部位、停止コドンおよびポリ（Ａ）シグナル配列と組み合わせることができる。発現構築物には、選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光分子、または細胞表面マーカーを含めてもよい。

【0338】

いくつかの態様では、バリアントを高い確度で同定する能力を高めるために、インシリコアルゴリズムを利用してコドン使用頻度を制御し、それによって任意の２つのバリアント間の編集距離（所与のヌクレオチド配列をライブラリーに含まれる任意の他のバリアントヌクレオチド配列に変換させるのに関わる、ヌクレオチドの変化の数であってよい）を最大化し、バリアントヌクレオチド配列を区別する能力を高めることができる。バリアント配列ライブラリーは、ＤＮＡ合成などが挙げられるがこれには限定されない任意の好適な選択肢によって生成することができる。

【0339】

いくつかの態様における本開示のスクリーニング方法は、２００を超えるアミノ酸を決定することによってのみバリアントを確度をもって同定することができる、任意の好適なタンパク質のスクリーニングに使用することができる。例としては、ＴＣＲ、ＣＡＲ、抗体、ＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ、合成スイッチレセプター、および指向性タンパク質進化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0340】

いくつかの態様において、ライブラリーは、ＴＣＲαおよびＴＣＲβのバリアントを含むＴＣＲライブラリーである。ＴＣＲライブラリーは、任意の所与のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が、複数の相補的二量体化パートナーと共に発現するか、または二量体化パートナーが分かっていないかのいずれかである、任意の好適なライブラリーであってよい。どちらの場合においても、ＴＣＲバリアントは、ＴＣＲαとＴＣＲβの両方の可変配列を配列決定することによってのみ、明確に同定することができる。

【0341】

いくつかの態様において、ライブラリーは、ＣＡＲバリアントを含むＣＡＲライブラリーである。ＣＡＲライブラリーは、任意の所与のＣＡＲバリアントを確度をもって同定するために２００を超えるアミノ酸を配列決定する必要がある、任意の好適なライブラリーであってよい。例としては、高度に多様な抗原結合ドメインを有する任意のＣＡＲライブラリー、またはＣＡＲタンパク質ドメインの一部もしくは全部を使用する任意の他のコンビナトリアル構築物、例えば、ヒンジドメイン、膜貫通ドメインおよび２つのシグナル伝達ドメインのバリアントが組み合わさって、５００以上のバリアントを含むライブラリーを作製するライブラリーが挙げられる。

【0342】

いくつかの態様において、ライブラリーは、抗体バリアントを含む抗体ライブラリーである。バリアントヌクレオチド配列は、重鎖および軽鎖の両方の配列を配列決定することによってのみ明確に同定することができる１つの発現構築物において追合している抗体重鎖および軽鎖をコードする核酸を含む場合がある。いくつかの態様では、抗体バリアントのライブラリーを、レポーター細胞（または別の機能的媒介物）に導入し、少なくとも１つの機能的特性（抗原結合など）に基づいて選択することができる。
バリアントヌクレオチド配列ライブラリーのレポーター細胞への導入

【0343】

バリアントヌクレオチド配列のライブラリーを、任意の好適な手法によって、レポーター細胞に導入することができる。いくつかの態様では、レトロウイルスまたはレンチウイルス遺伝子送達が、ライブラリーをレポーター細胞に（または、本明細書で述べるような任意の担体に）導入するために使用される。任意の好適な手法を使用して、ライブラリーをレポーター細胞に導入してもよい。レポーター細胞は、任意の好適な細胞（または担体）であってもよい。いくつかの態様において、レポーター細胞は、（１）導入されたバリアントヌクレオチド配列に依存し、外部の選択圧に応答して、測定可能な機能獲得または機能喪失を示すその能力；（２）選択圧への応答を測定するために使用するマーカー分子のバックグラウンド発現が最小限であること；および（３）培養物中でのレポーター細胞の増殖および細胞生存率、などのいくつかの基準に基づいて選択することができる。好適なレポーター細胞としては、これらに限定されるものではないが、スクリーニングのための、例えば、免疫受容体（ＴＣＲ／ＣＡＲ）ライブラリーのスクリーニングのための、不死化ジャーカットＴ細胞または初代ヒトＴ細胞が挙げられる。他の担体選択肢も本明細書に記載される。

【0344】

いくつかの態様において、それぞれのレポーター細胞は、平均して１つのバリアントヌクレオチド配列のみが形質導入され、したがって、ウイルス導入は、低いＭＯＩで行われる。いくつかの態様では、ポリクローナルレポーター細胞プールにおける各バリアントヌクレオチド配列の表現レベル（以下：カバー数）を維持するために、形質導入されるレポーター細胞の数は、ライブラリーバリアントの数に直接関係する。

【0345】

いくつかの態様では、ライブラリーで修飾した後、例えば抗生物質耐性（例えばピューロマイシンまたはブラストサイジン）に基づいて、正常に修飾されたレポーター細胞を選択することができる。このような選択では、低ＭＯＩで導入した後の集団から非導入細胞を排除することにより、全体の細胞数を減少させることができる。いくつかの態様において、選択の強度は、バリアント配列ライブラリーの多様性に依存する。いくつかの態様において、ライブラリーは、集団でのライブラリーカバー数を維持するためにライブラリーがより高度な多様性を有しているより大きなレポーター細胞の集団に、導入される。いくつかの態様では、選択後に特定のレベルのカバー数を維持するために、十分な数のポリクローナルレポーター細胞が使用される。

【0346】

いくつかの態様において、ライブラリーは、トランスポゾン媒介性遺伝子送達によってレポーター細胞に導入することができる。いくつかの態様において、ライブラリーは、ＤＮＡヌクレアーゼ媒介性部位特異的統合（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＴＡＬＥＮを使用する）によってレポーター細胞に導入することができる。

【0347】

いくつかの態様では、修飾されたレポーター細胞による細胞表面マーカーに関するビーズの使用に基づく濃縮に基づいて、修飾されたレポーター細胞を選択することができる。いくつかの態様において、修飾されたレポーター細胞は、細胞表面マーカーまたは蛍光分子に対するフローサイトメトリーソーティングによって選択することができる。

【0348】

いくつかの態様において、レポーター細胞は、（１）外部の選択圧に応答して機能獲得または機能喪失を示す能力を強化するため、（２）選択圧への応答を測定するために用いられるマーカー分子のバックグラウンド発現を低減するため、および／または（３）細胞培養においてレポーター細胞集団を維持する能力を高めるために、遺伝的に修飾される。
少なくとも１つの機能的特性に基づくレポーター細胞の選択

【0349】

いくつかの態様では、発現されたタンパク質バリアントに依存するレポーター細胞による機能獲得または機能喪失を測定するために、レポーター細胞のポリクローナル集団に対して選択的圧が加えられる。例えば、レポーター細胞を、抗原を発現する細胞で刺激することができる。その後、刺激に応答して、レポーター細胞を好適なマーカーに基づいて単離することができる。例えば、レポーター細胞のフローサイトメトリーソーティングを実施するために、ＴＣＲ導入ジャーカット細胞における抗原発現細胞に応答したＣＤ６９の上方制御を利用することができる。応答する集団と応答しない集団の両方を十分なカバー数で単離し、別々に分析することができる。それにより、正の集団における濃縮度と負の集団における枯渇度を決定することによって、所与のバリアントヌクレオチド配列の相対的な濃縮倍率を測定することができる。

【0350】

いくつかの態様において、レポーター細胞に対する選択的圧は、受容体アゴニストまたはアンタゴニストによる刺激；小分子への曝露；２つ以上の同時刺激への曝露、のうちの１つ以上の様式で適用される。いくつかの態様において、レポーター細胞は、タンパク質マーカーの上方制御または下方制御に基づいて単離され、例えば、マーカー陽性および陰性レポーター細胞のフローサイトメトリーソーティングまたはビーズの使用に基づく選別に使用される。いくつかの態様において、レポーター細胞は、レポーター細胞の選択的な生存または細胞死をもたらす薬物耐性／感受性に基づいて単離される。いくつかの態様において、レポーター細胞は、複数のマーカー分子に基づいて単離される。

【0351】

いくつかの態様では、正および負に応答するレポーター細胞の両方を単離する代わりに、１つの集団のみが単離される。所与のバリアントヌクレオチド配列の濃縮倍率は、選択圧に暴露されなかったポリクローナルレポーター細胞との比較によって確立することができる。

【0352】

リポーター細胞を選択する前述した手法のいずれか１つまたはそれらの組み合わせを使用することができる。
選択したレポーター細胞からのバリアントヌクレオチド配列の単離

【0353】

いくつかの態様では、単離したポリクローナルレポーター細胞集団をバルクレベルで分析するために、任意の好適な手法を用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離する。その後、バリアントヌクレオチド配列を、ＰＣＲによって増幅する。このような増幅は、完全なバリアントヌクレオチド配列について実施することも、またはバリアントが変異多様性を示す領域のみについて実施することもできる。ＰＣＲアンプリコンは、十分なリード長および総数の配列決定リードを提供できるプラットフォーム、例えば、これらには限定されないが、オックスフォードナノポアテクノロジーなどでＮＧＳ分析用に調製することができる。いくつかの態様において、ＰＣＲのプロトコールは、任意の好適な選択肢（例えば、固有の分子識別子（ＵＭＩ）の使用および最小限のＰＣＲサイクル数）を使用して、定義されたバリアントヌクレオチド配列に対する任意の偏った増幅を避けるように改良することができる。

【0354】

いくつかの態様では、バリアントヌクレオチド配列の偏った増幅を防ぐ手段として、選択されたレポーター細胞からｇＤＮＡを単離し、ＣＲＩＳＰＲの使用に基づく選択的ライブラリーの調製に供する。ゲノムＤＮＡを脱リン酸化し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性二本鎖切断を目的の配列に隣接する配列に導入することができる。二本鎖切断に直接隣接するヌクレオチドは、この処理後もリン酸化されたままの場合があり、それによって、続くライブラリー調製ステップでリン酸化依存的なアダプターの連結が可能になる。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の方向と使用するプロトスペーサー配列に応じて、好適な配列決定に関する選択肢（例えば、オックスフォードナノポアテクノロジー）を使用して、挿入物を特異的に配列決定することができる。
単離したバリアントヌクレオチド配列の全ヌクレオチド配列のうちの少なくとも６００ｂｐを決定する

【0355】

いくつかの態様において、ＰＣＲアンプリコンは、好適なＮＧＳプラットフォームを利用して配列決定される。アンプリコンの配列決定には、遺伝子バリアントライブラリーの特性に応じて、任意の好適な配列決定プラットフォームを使用することができる。好適な配列決定プラットフォームとしては、オックスフォードナノポアテクノロジーが挙げられるが、これに限定されるものではない。
少なくとも１つの目的のバリアントヌクレオチド配列の選択

【0356】

いくつかの態様において、目的のバリアントヌクレオチド配列、例えば、ＴＣＲおよびＣＡＲは、両方の細胞集団におけるバリアントのリードカウントによって決定されるように、正に選択された（マーカー分子陽性）レポーター細胞集団におけるバリアントの濃縮度および負に選択された（マーカー分子陰性）レポーター細胞集団におけるバリアントの枯渇度を決定することによって、相対的な濃縮度に基づいて選択される。いくつかの態様において、目的のバリアントヌクレオチド配列は、相対的な濃縮度；異なる選択圧下、例えば異なる抗原投与量下、で生じる相対的な濃縮度；異なるマーカー分子に基づいて単離した複数の細胞集団における相対的な濃縮度；マーカー分子の組み合わせに基づいて単離した細胞集団における相対的な濃縮度；異なる型のレポーター細胞から構成される複数の細胞集団において生じる相対的な濃縮度；バリアントヌクレオチド配列、例えばＴＣＲやＣＡＲの、本来の遺伝子バリアントライブラリーとの比較における、単離したレポーター細胞の集団中での濃縮度、の１つ以上に基づいて選択される。

【0357】

いくつかの態様では、以下に記載するアレンジメントまたはその下位区分はいずれも、本明細書で提供される態様の一部を構成してもよく、またはそれらと組み合わせてもよい。アレンジメントには、以下のように１～１４５の番号が付けられる。
１．多様なＴ細胞集団からＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収するための方法であって、該方法が、
対象の試料に含まれるＴＣＲαおよびＴＣＲβのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定すること、
該レパトア全体から、ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のサブセットを１つ以上選択すること、
ＴＣＲαβ対のライブラリーを形成する選択したＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによって、ＴＣＲレパトアを作製すること、ならびに、
作製した該ＴＣＲレパトアから、所望の特徴を有するＴＣＲαとβの対を少なくとも１つ同定すること
を含む、方法。
２．該レパトア全体に由来するＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の該１つ以上のサブセットが、
該Ｔ細胞集団中での頻度に基づいて、
第二のＴ細胞集団との比較における相対的な濃縮度に基づいて、
所与のＴＣＲ鎖と比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡのコピー数が異なることに基づいて、
該ＴＣＲ鎖の生物学的特性であって、ここで該特性が、（予測される）抗原特異性、（予測される）ＨＬＡ拘束性、抗原親和性、共受容体依存性、または親Ｔ細胞系列（例えば、ＣＤ４もしくはＣＤ８Ｔ細胞）またはＴＣＲ配列モチーフのうちの少なくとも１つから選択される、該ＴＣＲ鎖の生物学的特性に基づいて、
遺伝子発現の空間的パターンであって、ここで該空間的な遺伝子の発現パターンが、組織内の起源領域または他の遺伝子の共発現パターンのうちの少なくとも１つに由来する、該遺伝子発現の空間的パターンに基づいて、
例えば複数の腫瘍病変において出現しているなど、複数の試料において同様の頻度で共出現または出現していることに基づいて、
該ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するための複数の群への選択に基づいて、
異なる態様で定義したような複数の基準の組み合わせに基づいて、
のうちの少なくとも１つの基準に基づいて選択される、アレンジメント１の方法。
３．該Ｔ細胞集団中での頻度に基づく選択が、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖についての個別の順位またはＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を組み合わせた場合の順位を作成するために使用される、ＴＣＲ配列の該頻度のデータに基づくものである、アレンジメント２の方法。
４．ＴＣＲレパトアの回収に関して望まれる深度で定義され、頻度に基づいてＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のコレクションを選択するために用いられる頻度閾値を決定することをさらに含む、アレンジメント１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．ＴＣＲαおよびＴＣＲβの配列を決定することが、
多重ＰＣＲ、
標的濃縮によるＴＣＲ配列の回収、
５'ＲＡＣＥとＰＣＲによるＴＣＲ配列の回収、
空間的配列決定によるＴＣＲ配列の回収、
ＲＮＡ配列よるＴＣＲ配列の回収、および
固有の分子識別子（ＵＭＩ）の利用、
のうちの少なくとも１つによって達成される、アレンジメント１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．回収されたＴＣＲ鎖の配列が、完全なＴＣＲ鎖配列を組み立てるためのヌクレオチド配列アライメントに基づいて少なくとも１つのＴＣＲ－Ｖセグメントファミリーおよび少なくとも１つのＴＣＲ－Ｊセグメントファミリーを選択するのに十分な５'および３'のヌクレオチド配列情報とともに、ＣＤＲ３ヌクレオチド配列と定義される、アレンジメント１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製する選択されたＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列のコンビナトリアルペアリングによってＴＣＲレパトアを作製する方法であって、
ＴＣＲ鎖配列を使用して、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ断片の別々のライブラリーを合成し、その後、正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結した１つのＤＮＡまたはＲＮＡ断片に連結すること；
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを、正確に１つずつのＴＣＲα鎖とβ鎖が連結したＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を直接合成することによって生成すること；
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを、細胞が少なくとも１つのＴＣＲα鎖と１つのＴＣＲβ鎖を発現するように、ＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子の別々のコレクションで細胞プールを修飾することによって、細胞内で作製すること；および／または、
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の組み合わせを一本鎖ＴＣＲ構築物に連結すること、ここで、この一本鎖ＴＣＲ構築物にはＴＣＲαおよびＴＣＲβ両方の可変鎖断片が融合されていて、かつ、（ｉ）膜貫通ドメインのみ、または（ｉｉ）ＣＤ３εもしくはＣＤ３ζシグナルドメインを単独でまたはＣＤ２８シグナルドメインとの組み合わせを含むがこれに限らない付加的な細胞内シグナル伝達ドメインと融合されている、
のうちの少なくとも１つによって、達成される、アレンジメント１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．該作製されたＴＣＲレパトアから所望の特徴を有するＴＣＲαβ対を少なくとも１つ同定する方法であって、
生成されたＴＣＲαβ対の該ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲ単離用の少なくとも１つの活性化マーカーに基づいて抗原反応性のレポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の該ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを細胞増殖を追跡するのに適した蛍光色素で標識し、少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲ単離用の増殖性に基づいて抗原反応性のレポーター細胞を単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の該ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも２つの試料に分け、試料を少なくとも１つの目的の抗原を発現しているかまたは発現していない抗原提示細胞によって刺激し、刺激後、両方のレポーター細胞集団を一定期間インキュベートし、次いで、両方のレポーター細胞集団をＴＣＲ分離によって分析し、両方の試料から得られたＴＣＲαβ対を比較することで、少なくとも１つの抗原に暴露された該試料においてより豊富に含まれているＴＣＲ遺伝子を特定すること；
生成されたＴＣＲαβ対の該ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲの誘発を示す少なくとも１つのレポーター遺伝子、例えばＮＦＡＴ－ＧＦＰまたはＮＦＡＴ－ＹＦＰに基づいて、抗原反応性レポーター細胞を単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の該ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、抗原反応性レポーター細胞を、ＴＣＲのシグナル伝達に際して獲得される抗生物質耐性を含むがこれには限定されない選択的生存に基づく抗原特異的レポーター細胞の選択に基づいて、例えばＮＦＡＴ－ピューロマイシン導入遺伝子の使用によって、ＴＣＲ単離用に単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の該ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを目的の抗原を担持する１つ以上のＭＨＣ複合体に曝露し、ＴＣＲ単離用に、ＭＨＣ複合体に結合したレポーター細胞またはＴ細胞を単離すること；
生成されたＴＣＲαβ対の該ライブラリーで修飾されたレポーター細胞のプールを少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激し、その後、単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体的手法を使用して目的のＴＣＲαβ対を同定し、ＴＣＲ単離と少なくとも１つの活性化マーカーの転写レベルでの検出とを組み合わせ、それにより、ＴＣＲαβの転写物が活性化マーカーのレベルの上昇と共発現する該Ｔ細胞のプールに含まれる単一のレポーター細胞を検出すること；
のうちの少なくとも１つによって達成される、アレンジメント１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．該対象の試料が非生存性出発材料を含む、アレンジメント１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．該同定したＴＣＲレパトアの特定の部分が回収される、アレンジメント１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．抗原特異的ＴＣＲ配列が回収される、アレンジメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．クラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ配列が回収される、アレンジメント１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．アレンジメント１～１２のいずれか１つに記載の方法であって、ここで、
新生抗原特異的ＴＣＲ配列、
ウイルス特異的ＴＣＲ配列、
共有腫瘍抗原特異的ＴＣＲ配列、
自己抗原特異的ＴＣＲ配列、
の少なくとも１つが回収される、方法。
１４．該新生抗原特異的ＴＣＲ配列を発現するＴ細胞を癌治療として投与するステップをさらに含む、アレンジメント１２に記載の方法。
１５．該方法が診断のための方法である、アレンジメント１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１６．該診断が、感染症または自己免疫疾患の病的部位からＴＣＲレパトアを回収することである、アレンジメント１５に記載の方法。
１７．該方法が、ＢＣＲ／抗体レパトアの回収のための方法である、アレンジメント１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１８．該ＴＣＲαおよびβのヌクレオチド配列を含む核酸を対象から単離することをさらに含む、アレンジメント１～１６のいずれか１つに記載の方法。
１９．該活性化マーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＯＸ４０からなる群より選択される、アレンジメント８に記載の方法。
２０．ＤＮＡおよびＲＮＡの単離が、異なる細胞型の混合物であるＴ細胞集団または組織試料（血液または腫瘍組織など）の一部に由来する、アレンジメント１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２１．該対象の試料が体液から単離された細胞を含む、アレンジメント１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２２．該細胞が腫瘍特異的Ｔ細胞または腫瘍浸潤リンパ球である、アレンジメント２０に記載の方法。
２３．該体液が、血液、尿、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、喀痰、粘膜分泌物、膣液、腹水、胸水、心嚢液、腹膜液、および腹腔液からなる群より選択される、アレンジメント２０～２１に記載の方法。
２４．該ＴＣＲαβ鎖配列を使用して、癌、免疫学的障害、自己免疫疾患、または感染症に罹患している対象を治療することをさらに含む、アレンジメント１に記載の方法。
２５．該作製したＴＣＲレパトアから、所望の特徴を有するＴＣＲαとβの対を少なくとも１つ同定する方法であって、
少なくとも１つの活性化マーカーに基づく同定または選択；
抗原に応答した増殖に基づく同定または選択；
非刺激細胞と比較して抗原刺激細胞においてより豊富に含まれているＴＣＲ遺伝子を同定することに基づく同定または選択；
ＴＣＲの誘発によるレポーター遺伝子の活性化に基づく同定または選択；
ＴＣＲのシグナル伝達に際して獲得される抗生物質耐性を含むがこれに限定されない、選択的生存に基づく同定または選択；
１つ以上のＭＨＣ複合体への結合に基づく同定または選択；
単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体技術を用いた同定または選択；あるいは
これらの任意の組み合わせ；
のうちの少なくとも１つによって達成される、アレンジメント１～７のいずれか１つに記載の方法。
２６．ＴＣＲ単離が、抗原反応性Ｔ細胞のＴＣＲαβ遺伝子配列を決定するためにＤＮＡ配列決定もしくはＲＮＡ配列決定によって分析されるＴＣＲαβ特異的ＰＣＲ産物を生成するために、バルクの抗原反応性Ｔ細胞からＤＮＡもしくはＲＮＡを単離すること；または、分析した単一のＴ細胞において発現する該ＴＣＲαβ遺伝子の配列を分析するための単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲもしくは微少流体技術、によって達成される、アレンジメント８に記載の方法。
２７．該レポーター細胞がＴ細胞である、アレンジメント８に記載の方法。
２８．単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体技術を用いた同定または選択が、活性化関連遺伝子の共発現を決定することをさらに含む、アレンジメント２４に記載の方法。
２９．複数のＴ細胞ライブラリーを作製する方法であって、該方法が、アレンジメント１の方法に従ってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパトアを回収すること；該ＴＣＲレパトアの特定の部分を別々に回収するために、該レパトア全体からＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列を複数の群に選択すること；を含み、ここで複数のＴ細胞ライブラリーが、より複雑度が小さい、または該ＴＣＲレパトアの特定の部分を回収するものとして作製される、方法。
３０．ＴＣＲα鎖配列およびＴＣＲβ鎖配列の選択が頻度範囲に基づく、アレンジメント２９に記載の方法。
３１．核酸のコンビナトリアルライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供すること、該複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで該連続部分は、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組合せを含み、ここで該２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの第一のバリアントヌクレオチド部分配列は該連続部分の第一の末端を規定し、該２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの第二のバリアントヌクレオチド部分配列は該第一の末端とは反対側にある該連続部分の第二の末端を規定し；
該複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成された細胞の集団に、該ライブラリーを導入すること；
該２つ以上のバリアント核酸部分配列の該組み合わせに依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて、該細胞集団の亜集団を選択すること、ここで該亜集団は複数の細胞を含み；
該亜集団から該複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
該サブセットの個別のメンバーの該連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；ならびに、
該ヌクレオチド配列に基づいて、該２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること；
を含む、方法。
３２．該１つ以上のポリペプチドが、
Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖；
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；
スイッチレセプター；または
抗体もしくはその抗原結合断片の１本以上の鎖、
を含む、アレンジメント１に記載の方法。
３３．該第一のバリアントヌクレオチド部分配列がＴＣＲαバリアントアミノ酸配列をコードし、該第二のバリアントヌクレオチド部分配列がＴＣＲβバリアントアミノ酸配列をコードする、アレンジメント３１または３２に記載の方法。
３４．該２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列が、ＴＣＲＶ領域；ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；ＴＣＲ－Ｊセグメント；およびＴＣＲ定常領域；のうちの１つ以上をコードしている、アレンジメント３１～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．該２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列がそれぞれ、ＣＡＲの抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、または１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインをコードしている、アレンジメント３１または３２に記載の方法。
３６．該連続部分が６００ｂｐ～１５，０００ｂｐの長さである、アレンジメント３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．提供することが、該ライブラリーを生成することを含む、アレンジメント３１～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．該ライブラリーを生成する方法であって、
該１つ以上のポリペプチドの２以上のバリアントアミノ酸配列のセットをコードする、２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のセットを同定すること、ここで、該少なくとも１つの機能的特性は、該２つ以上のバリアントアミノ酸配列のセットのそれぞれに由来するバリアントアミノ酸配列の組み合わせに依存し；および
該２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列のセットのそれぞれに由来するバリアントヌクレオチド部分配列を組み合わせることで該連続部分を組み立て、それによって該複数のバリアント核酸の該メンバーを生成すること、
を含む、アレンジメント３７に記載の方法。
３９．該ライブラリーに含まれる該複数のバリアント核酸の連続部分間の編集距離が最大化される、アレンジメント３１～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．該ライブラリーが、該２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の少なくとも１００の異なる組み合わせを含む、アレンジメント３１～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．導入することが、ウイルス導入、トランスポゾン媒介性遺伝子送達、またはヌクレアーゼ媒介性部位特異的統合を介して該ライブラリーを導入することを含む、アレンジメント３１～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．導入することが、５以下の感染多重度（ＭＯＩ）で該細胞の集団をウイルス導入することを含む、アレンジメント４１に記載の方法。
４３．該ライブラリーに含まれる該２つ以上のバリアントヌクレオチド部分配列の異なる組み合わせの数に基づいて、該細胞の集団の大きさを調整することを含む、アレンジメント３１～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．該細胞の集団が不死化Ｔ細胞または初代Ｔ細胞を含む、アレンジメント３１～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．該不死化Ｔ細胞または初代Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、アレンジメント４４に記載の方法。
４６．該複数のバリアント核酸の少なくとも１つを発現する該細胞の集団に含まれる細胞を選択またはスクリーニングするためにマーカーを使用することをさらに含む、アレンジメント３１～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．該マーカーが、細胞毒耐性マーカーおよび／または細胞表面マーカーである、アレンジメント４６に記載の方法。
４８．該細胞集団の細胞が、遺伝的に修飾されている、アレンジメント３１～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．該集団の細胞が、該少なくとも１つの機能的特性を該細胞に付与する内因性ポリペプチドを含まない、アレンジメント３１～４７のいずれか１つに記載の方法。
５０．該細胞が、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２８のうちの１つ以上の発現を排除または低減させるように遺伝的に修飾される、アレンジメント１～４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．該細胞が、ＣＤ４および／またはＣＤ８と共に再構成され、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性ＴＣＲ配列のスクリーニングに利用される、アレンジメント４８または４９に記載の方法。
５２．該細胞がＴ細胞である、アレンジメント５０または５１に記載の方法。
５３．選択することが、検出可能なマーカーの発現に基づいて該亜集団を選択することを含み、ここで該発現が、該１つ以上のポリペプチドの該少なくとも１つの機能的特性に依存する、アレンジメント３１～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．該検出可能なマーカーが、細胞表面マーカー、サイトカインマーカー、細胞増殖マーカー、転写レポーター、シグナル伝達レポーター、および／または細胞毒性レポーターを含む、アレンジメント５３に記載の方法。
５５．アレンジメント５４に記載の方法であって、ここで、
該細胞表面マーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０のうちの１つ以上を含み；
該サイトカインマーカーが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦのうちの１つ以上を含み；
該転写レポーターが、ＮＦ－κＢ、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１のうちの１つ以上を含み；
該シグナル伝達レポーターが、ＺＡＰ７０、ＥＲＫ１／２のうちの１つ以上を含み；および
該細胞毒性レポーターが、ＣＤ１０７Ａ、ＣＤ１０７Ｂのうちの１つ以上を含む、
方法。
５６．選択することが、該細胞の集団を、
第二の集団；
該１つ以上のポリペプチドのリガンド；
該１つ以上のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト；および
小分子；
のうちの１つ以上と接触させることを含み、
ここで該接触によって誘発される該亜集団の変化が、該１つ以上のポリペプチドの該少なくとも１つの機能的特性に依存する、
アレンジメント３１～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．選択することがさらに、
該変化の有無および／または該変化の大きさを検出すること；ならびに
該検出に基づいて、該亜集団を選択すること、
を含む、アレンジメント５６に記載の方法。
５８．該細胞の第二の集団が抗原提示細胞を含む、アレンジメント５６または５７に記載の方法。
５９．該抗原提示細胞が、Ｂ細胞および／または樹状細胞を含む、アレンジメント５８に記載の方法。
６０．該細胞の第二の集団が、初代細胞または不死化細胞を含む、アレンジメント５６～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．該ライブラリーのバリアントヌクレオチド配列が、該バリアントヌクレオチド部分配列によってコードされるアミノ酸を含むバリアントポリペプチドを発現する細胞に由来し、該細胞が対象から得られ、および該細胞の第二の集団が該対象から得られる、アレンジメント５６～６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．選択することが、閾値を超えるまたは下回る該少なくとも１つの機能的特性の測定に基づいて、該細胞の集団の第一の亜集団を選択することを含む、アレンジメント３１～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．該閾値が、該細胞の集団の未選択の亜集団における該機能的特性の測定に基づいて決定される、アレンジメント６２に記載の方法。
６４．選択することが、第二の閾値を超えるまたは下回る該少なくとも１つの機能的特性の第二の測定値に基づいて該細胞の集団の第二の亜集団を選択することをさらに含み、ここで、該第一および第二の亜集団が重複していない、アレンジメント６２に記載の方法。
６５．該少なくとも１つの組み合せを特定することが、該第一および第二の亜集団の間で該少なくとも１つの組み合せの存在量を比較することを含む、アレンジメント６４に記載の方法。
６６．該少なくとも１つの組み合せを同定することが、細胞の対照集団と比較して、該亜集団における該少なくとも１つの組み合せの濃縮度を測定することを含む、アレンジメント３１～６４のいずれか１つに記載の方法。
６７．該細胞の集団が、該細胞の対照集団を含む、アレンジメント６６に記載の方法。
６８．該細胞の亜集団と対照集団が重複しておらず、ここで重複していないとは、両集団中の該細胞が異なる活性化状態にあるが、同じバリアント核酸を担持することができることを表す、アレンジメント６７に記載の方法。
６９．該細胞の対照集団が、該少なくとも１つの機能的特性とは異なる第二の機能的特性に基づいて選択される、アレンジメント６６に記載の方法。
７０．該亜集団が複数の細胞を含む、アレンジメント３１～６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．該単離することが、該少なくとも１つの機能的特性に基づいて、該亜集団の単一クローンを単離することを含まない、アレンジメント３１～７０のいずれか１つに記載の方法。
７２．該亜集団が少なくとも１，０００の細胞を含む、アレンジメント３１～７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．決定することが、該連続部分の少なくとも６００ｂｐの配列決定リードを生成することによって、該個別のメンバーについて配列決定することを含む、アレンジメント３１～７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．該配列決定リードが６００ｂｐ～１５，０００ｂｐの長さである、アレンジメント７３に記載の方法。
７５．決定することが、該個別のメンバーの少なくとも該連続部分を増幅することを含む、アレンジメント３１～７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．増幅することが、不変ヌクレオチド部分配列にハイブリダイズする増幅プライマーを使用することを含み、ここで該複数のバリアント核酸はそれぞれ、該不変ヌクレオチド部分配列を含み、およびここで、該不変ヌクレオチド部分配列は、該１つ以上のポリペプチドの不変アミノ酸配列をコードしている、アレンジメント７５に記載の方法。
７７．該１つ以上のポリペプチドが、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、ここで該不変アミノ酸配列がＴＣＲα定常領域を含む、アレンジメント７６に記載の方法。
７８．該１つ以上のポリペプチドが、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、ここで該不変アミノ酸配列がＴＣＲβ定常領域を含む、アレンジメント７６に記載の方法。
７９．該単離することが、該亜集団由来のゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性標的断片化を使用することを含む、アレンジメント３１～７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．該決定することが、該個別のメンバーを増幅する前または該個別のメンバーを増幅することなく、該連続部分の該ヌクレオチド配列のそれぞれについて、少なくとも１０の平均カバー数を得ることを含む、アレンジメント３１～７８のいずれか１つに記載の方法。
８１．該決定することが、該連続部分の該ヌクレオチド配列のそれぞれについて、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００または少なくとも１，０００の平均カバー数を得ることを含む、アレンジメント３１～８０のいずれか１つに記載の方法。
８２．核酸のコンビナトリアルライブラリーからＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供すること、該複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、
ここで該連続部分は、ＴＣＲαのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、該連続部分の第一の末端を規定する第一のバリアントヌクレオチド部分配列と
ＴＣＲβのバリアントアミノ酸配列をコードしていて、かつ、該第一の末端とは反対側にある該連続部分の第二の末端を規定する第二のバリアントヌクレオチド部分配列
の組み合わせを含み；
該複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現するように構成された不死化Ｔ細胞の集団に、該ライブラリーを導入すること；
該不死化Ｔ細胞と抗原を発現している不死化Ｂ細胞との接触に応答して閾値を超えるＴ細胞活性化マーカーの発現に基づいて、該不死化Ｔ細胞の集団の亜集団を選択すること、ここで該亜集団は複数のＴ細胞を含み；
該亜集団から該複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
該サブセットの個々のメンバーの該連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、
該サブセットの該ヌクレオチド配列に含まれる該少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、該第一と第二のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること、
を含む、方法。
８３．アレンジメント８２に記載の方法であって、
該不死化Ｔ細胞と該不死化Ｂ細胞との接触に応答して第二の閾値を下回る該Ｔ細胞活性化マーカーの該発現に基づいて、該不死化Ｔ細胞の集団の第二の亜集団を選択すること、ここで該第二の亜集団は第二の複数のＴ細胞を含み、該亜集団と第二の亜集団は重複しておらず；
該第二の亜集団から該複数のバリアント核酸の第二のサブセットを単離すること；および、
該第二のサブセットの個別のメンバーの該連続部分の第二のヌクレオチド配列を決定すること、
ここで、該少なくとも１つの組み合わせは、該第二のサブセットの該第二のヌクレオチド配列における該少なくとも１つの組み合わせと比較して、該サブセット中の該少なくとも１つの組み合わせの濃縮度に基づいて同定される、
をさらに含む、方法。
８４．核酸のコンビナトリアルライブラリーからキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞内シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸を含むライブラリーを提供すること、該複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み、ここで該連続部分は、
ＣＡＲヒンジドメインをコードしている第一のバリアントヌクレオチド部分配列、
ＣＡＲ膜貫通ドメインをコードしている第二のバリアントヌクレオチド部分配列、および
ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインをコードしている第三のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの２つ以上の組み合わせを含み、
ここで該第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列のうちの１つは、該連続部分の第一の末端を規定し、ここで該第一、第二または第三のバリアントヌクレオチド部分配列の別の１つは、該第一の末端の反対側にある該連続部分の第二の末端を規定し；
該複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＣＡＲを発現するように構成された細胞の集団に、該ライブラリーを導入すること、ここで該細胞の集団は、不死化Ｔ細胞または初代ヒトＴ細胞の集団を含み；
該細胞と該ＣＡＲの抗原結合ドメインに特異的な抗原を発現している抗原提示細胞とを接触させることに応答して閾値を超える細胞増殖に基づいて、該細胞の集団の亜集団を選択すること、ここで該亜集団は複数の細胞を含み；
該亜集団から該複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
該サブセットの個々のメンバーの該連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および、
該サブセットの該ヌクレオチド配列に含まれる該少なくとも１つの組み合わせの対照との比較における濃縮度に基づいて、該第一、第二、および第三のバリアントヌクレオチド部分配列の組み合わせを少なくとも１つ同定すること、
を含む、方法。
８５．１つより多いＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインが存在する、アレンジメント８４に記載の方法。
８６．少なくとも２つのＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインが存在する、アレンジメント８５に記載の方法。
８７．該少なくとも２つのＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζＩＴＡＭ１、ＣＤ３ζＩＴＡＭ１２、ＣＤ３ζＩＴＡＭ１２３；ＣＤ３δ、ＣＤ３εおよびＣＤ３γの任意のＩＴＡＭを有するＣＤ３ζ；ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ならびにＣＤ２のうちの少なくとも２つである、アレンジメント８４に記載の方法。
８８．アレンジメント８４に記載の方法であって、
該細胞と該抗原提示細胞との接触に応答して第二の閾値レベルを下回る細胞増殖に基づいて、該細胞の集団の第二の亜集団を選択すること、ここで該第二の亜集団は第二の複数の細胞を含み、ここで該亜集団と第二の亜集団は重複しておらず；
該第二の亜集団から該複数のバリアント核酸の第二のサブセットを単離すること；
該第二のサブセットの個別のメンバーの該連続部分の第二のヌクレオチド配列を決定すること、および
ここで該少なくとも１つの組み合わせは、該第二のサブセットの該第二のヌクレオチド配列における該少なくとも１つの組み合わせと比較した、該サブセット中の該少なくとも１つの組み合わせの濃縮度に基づいて同定される、
を含む、方法。
８９．核酸のコンビナトリアルライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸を含むコンビナトリアルライブラリを提供すること、該複数のバリアント核酸はそれぞれ少なくとも６００ｂｐの連続部分を含み；
該複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされる１つ以上の複数のポリペプチドを発現するように構成された細胞の集団に、該ライブラリーを導入すること；
該少なくとも６００ｂｐの連続部分に依存する少なくとも１つの機能的特性に基づいて該細胞の集団の亜集団を選択すること、ここで該亜集団は複数の細胞を含み；
該亜集団から該複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
該サブセットの個別のメンバーの該連続部分のヌクレオチド配列を決定すること；および
該ヌクレオチド配列に基づいて、該少なくとも６００ｂｐの連続部分を同定すること、
を含む、方法。
９０．該少なくとも６００ｂｐの連続部分が６００塩基対全体に分布している、アレンジメント８９に記載の方法。
９１．核酸のライブラリーから抗原特異的Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
複数のバリアント核酸のメンバーによってコードされるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に、核酸ライブラリーを導入すること；
抗体への応答に対する閾値レベルを上回るマーカーの発現に基づいて、該細胞集団の亜集団を選択すること、ここで該亜集団は複数の細胞を含み；
該亜集団から該複数のバリアント核酸のサブセットを単離すること；
該バリアント核酸のヌクレオチド配列を決定すること；および、
該サブセットに含まれる該ヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて、少なくとも１つのバリアントヌクレオチド配列を同定すること、
を含む、方法。
９２．ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードしている該複数のバリアント核酸を含んでいる該ライブラリーを提供することをさらに含む、アレンジメント９０に記載の方法。
９３．試料からＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、
試料に含まれるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の配列を決定すること；
ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製するために、ＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を選択し、コンビナトリアルペアリングを行うこと；
該ＴＣＲαβ対のライブラリーをレポーター細胞のプールに導入すること；
該ＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾された該レポーター細胞を、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞で刺激すること；
該少なくとも１つの目的の抗原に特異的なＴＣＲαβ対を決定すること；および、
該ＴＣＲαβ対を細胞に導入し、該ＴＣＲαβ対を含む細胞を選択すること、
を含む、方法。
９４．自己免疫疾患の診断または治療のために、抗原特異的ＴＣＲ配列を発現しているＴ細胞を投与するステップをさらに含む、アレンジメント１４記載の方法。
９５．該Ｔ細胞が、自己由来であってもまたは同種異系であってもよい、アレンジメント１４に記載の方法。
９６．該活性化マーカーがＣＤ６９であり、２つの細胞集団が単離され、一方の細胞集団はＣＤ６９を高発現し、他方の細胞集団はＣＤ６９を低発現している、アレンジメント８に記載の方法。
９７．アレンジメント１～３０および９５、９６のいずれか１つに記載の方法に従って回収された該Ｔ細胞受容体のレパトアを含む、ヌクレオチドライブラリー。
９８．アレンジメント１～９６のいずれか１つに記載の方法に従って同定されたヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド構築物。
９９．アレンジメント９８に記載のヌクレオチド構築物を含む、細胞。
１００．核酸のライブラリーから抗原特異的Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖およびＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、該方法が、
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に該核酸ライブラリーを導入して、細胞のライブラリーを作製すること；
抗原に応答して第一の閾値を超えるマーカーの発現に基づいて、該細胞のライブラリーの第一の集団を選択すること；および、
該ライブラリーの該第一の集団からバリアント核酸の第一の集団を単離すること、
を含む、方法。
１０１．該方法がさらに、
該バリアント核酸の第一の集団の少なくとも１つのヌクレオチド配列または核酸の同一性を同定すること；および、
該サブセットに含まれる該ヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて、少なくとも１つのバリアントヌクレオチド配列を同定すること、
を含む、アレンジメント１００に記載の方法。
１０２．該閾値レベルが、
ａ）マーカーの発現に基づく該細胞の全プールの割合の回収；または
ｂ）該細胞の全プールからの最小限の数の細胞の回収；または
ｃ）抗原に反応して発現する少なくとも１つのマーカーへの磁気プローブの結合に基づく、磁石によって保持される細胞の回収、
のうちの少なくとも１つに基づく、アレンジメント１００または１０１に記載の方法。
１０３．該対照が、第二の閾値未満の第二の細胞集団である、アレンジメント６６～６９、８２、８４、９１、または１０１に記載の方法。
１０４．該対照が、
細胞の参照集団、
該細胞の集団に導入された核酸のコンビナトリアルライブラリー、
該第一の集団と同じ細胞の集団から第二の閾値未満の発現マーカーに基づいて選別された細胞の集団、
該関連するＴＣＲライブラリーを発現するレポーターＴ細胞といかなる外因性抗原も提示しないＢ細胞等の抗原提示細胞との共培養から得られた少なくとも１つの細胞の集団、
のうちの１つ以上である、アレンジメント６６～６９、８２、８４、９１、または１０１に記載の方法。
１０５．該対照（もしくは下位）試料が、該上位試料と同じ細胞集団から選別されるが、活性化マーカーの発現が低く；または該下位試料が、該関連するＴＣＲライブラリーを発現するレポーターＴ細胞、および外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞の共培養から得られたものである、アレンジメント１０４に記載の方法。
１０６．該細胞の集団に抗原を添加することをさらに含む、アレンジメント１００～１０５のいずれか１つに記載の方法。
１０７．第一の集団および／または該対照の該単離することが、ａ）磁気ビーズ濃縮、ｂ）フローサイトメトリーソーティング、またはｃ）両方のうちの少なくとも１つによって達成される、アレンジメント１００～１０６のいずれか１つに記載の方法。
１０８．核酸のライブラリーから抗原特異的Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）鎖とＴＣＲβ鎖の対をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、該方法が、
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現可能な細胞集団に該核酸ライブラリーを導入して細胞のライブラリーを作製すること；および、
該サブセットに含まれる該ヌクレオチド配列の対照との比較における濃縮度に基づいて、バリアント核酸の該第一の集団の少なくとも１つのヌクレオチド配列または核酸の同一性を同定すること、
を含む、方法。
１０９．該少なくとも１つの核酸が、細胞の第一の集団から単離される、アレンジメント１０８に記載の方法。
１１０．該細胞の第一の集団が、抗原に応答して第一の閾値レベルを超えるマーカーの発現に基づいて選択される、アレンジメント１０９に記載の方法。
１１１．核酸のライブラリーからヌクレオチド配列を同定する方法であって、
該核酸のライブラリーを細胞の集団に導入して細胞ライブラリーを作製すること；
該細胞ライブラリーを細胞の第一の集団と接触させること；
磁気ビーズ濃縮により、少なくとも１つのマーカーの発現に基づいて、該細胞ライブラリーの亜集団を選択すること；および、
該亜集団に含まれる該ヌクレオチド配列が対照との比較において有意に濃縮されていることまたは枯渇していることに基づいて、少なくとも１つのヌクレオチド配列を決定すること、
を含む、方法。
１１２．該細胞の亜集団の少なくとも一部が、該核酸のライブラリのメンバーによってコードされる１つ以上のポリペプチドを発現するように構成される、アレンジメント１１１に記載の方法。
１１３．マーカーの発現が、該ライブラリーから導入された核酸に連動し、連動が、該導入された核酸がマーカーの発現を変化させることを表す、アレンジメント１１１に記載の方法。
１１４．選択することが、閾値レベルを上回るのマーカー発現に基づく、アレンジメント１１１に記載の方法。
１１５．選択することが、閾値を上回る少なくとも２つのマーカーの発現に基づく、アレンジメント１１１に記載の方法。
１１６．抗原を同定または刺激または提供することが、
ａ）多数の抗原を選択すること；
ｂ）それぞれの抗原が正確に２つの抗原プールに存在する抗原プールを作製すること；
ｃ）該それぞれの抗原プールに対する少なくとも１つのＴ細胞受容体を発現するレポーター細胞の反応性を評価すること；および、
ｄ）正確に２つの抗原プールに対する反応性を評価することによって、該少なくとも１つのＴ細胞受容体が該選択された抗原のいずれかに対して反応性を有するか否かを決定すること、
のうちの１つ以上を含む、アレンジメント８、８２、９１、９３または１００のいずれか１つに記載の方法。
１１７．正確に２つの抗原プールに対する反応性が、ペアワイズ濃縮度分析によって検出される、アレンジメント１１６に記載の方法。
１１８．該ライブラリーがＴＣＲライブラリーである、アレンジメント１１１に記載の方法。
１１９．活性化マーカーを用いる、アレンジメント１１１に記載の方法。
１２０．反応性を評価するために上位下位比較を採用する、アレンジメント１１１に記載の方法。
１２１．反応性の評価に上位下位比較を採用する、アレンジメント１～１２０のいずれか１つに記載の反応性の評価を伴うまたは反応性の評価をさらに含む、方法。
１２２．ライブラリーを伴うアレンジメント１～１２１のいずれか１つに記載の方法であって、該ライブラリー中の該複数のバリアント核酸の該ヌクレオチド配列が、
該宿主細胞にとって好ましいコドン使用を導入すること、
ｍＲＮＡ構造の安定性を最適化すること、
反復配列を回避すること、
長い同種重合体を回避すること、および
所与のバリアント核酸配列内の局所的なＧＣ含有量に大きな相違が生じることを回避すること、
のうちの少なくとも１つに基づいて最適化される、方法。
１２３．該抗原が抗原提示細胞を介して提示される、アレンジメント９１に記載の方法。
１２４．該ライブラリーがコンビナトリアルライブラリーである、アレンジメント９１に記載の方法。
１２５．該抗原が細胞によって提供される、アレンジメント１～１２４のいずれか１つに記載の方法。
１２６．該過程が、高度な抗原多様性および／または複雑性を伴う、アレンジメント１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
１２７．ライブラリーを伴うアレンジメント１～１２６のいずれか１つに記載の方法であって、該ライブラリーがコンビナトリアルライブラリーである、方法。
１２８．該コンビナトリアルライブラリーがＴＣＲライブラリーである、アレンジメント１２７に記載の方法。
１２９．細胞のコレクションであって、該コレクションが、
少なくとも２つのＴ細胞のセットであって、ここで少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ少なくとも１つのＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここで該ＴＣＲαおよび該ＴＣＲβのそれぞれは対象に由来し、ここで該Ｔ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、およびここで該セットは１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されている、少なくとも２つのＴ細胞のセット；ならびに、
少なくとも２つのＢ細胞のセットであって、ここで該少なくとも２つのＢ細胞はそれぞれ少なくとも１つの外因性新生抗原（または抗原）を発現するように構成されており、その結果、少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が産生可能になり、およびここで該少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）は、該対象内におけるものと同じである、少なくとも２つのＢ細胞のセット、
を含む、コレクション。
１３０．該少なくとも２つのＢ細胞のセットが、該外因性新生抗原（または抗原）を産生する少なくとも第一のＢ細胞；および該第二の外因性新生抗原（または抗原）を産生する少なくとも第二のＢ細胞、を含む、アレンジメント１２９に記載の組成物。
１３１．ＴＣＲ発現細胞のライブラリーであって、該ＴＣＲ発現細胞のライブラリーが少なくとも３つのＴ細胞のセットを含み、
ここで該Ｔ細胞のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つのＴＣＲαおよびＴＣＲβの対（少なくとも２つのＴＣＲ対）を発現するように構成されており、
ここで該少なくとも２つのＴＣＲ対は対象に由来し、
ここで該少なくとも３つのＴ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、
ここで該少なくとも３つのＴ細胞は、Ｂ細胞によって提示された抗原（または新生抗原）への結合に際して、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されており、
ここでＴＣＲ細胞の数に反映される各ＴＣＲ対のゲノムコピー量が、該試料に含まれる全てのＴＣＲのリードを示すものであり、および
ここで該ＴＣＲのうちの少なくとも１つが、該ライブラリーを含む組成物全体に均等に分布していない、
ライブラリー。
１３２．少なくとも１つのＴ細胞の分布が、Ｂ細胞によって提示される抗原に結合することによって変化する、アレンジメント１３１に記載のＴＣＲ発現細胞のライブラリー。
１３３．該少なくとも２つのＴＣＲ対が、該ＴＣＲ発現細胞のライブラリー中にほぼ均等に存在する、アレンジメント１３１に記載のＴＣＲ発現細胞のライブラリー。
１３４．対象を治療する方法であって、該方法が、
腫瘍を有する対象を特定すること；
少なくとも２つのＴ細胞のセットを提供すること、ここで、該少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ、少なくとも１つの異なるＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されており、該ＴＣＲαおよび該ＴＣＲβはそれぞれ該対象に由来し；
少なくとも２つのＢ細胞のセットを提供すること、ここで、該Ｂ細胞のセットは少なくとも２つの外因性新生抗原を発現するように構成されており、該少なくとも２つの外因性新生抗原は、該対象内で見出されるものと同じであり；
該少なくとも２つのＴ細胞のセットと該少なくとも２つのＢ細胞のセットを組み合わせ、該少なくとも２つの外因性新生抗原を介した該少なくとも２つのＴ細胞の活性化に基づいて、少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを選択すること；および
該少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを該対象に投与し、それによって該腫瘍を治療すること、
を含む、方法。
１３５．治療することにより該腫瘍の大きさが縮小する、アレンジメント１３４に記載の方法。
１３６．対象を治療する方法であって、該方法が、
腫瘍を有する対象を特定すること；
少なくとも２つのＴ細胞のセットを提供すること、ここで、該少なくとも２つのＴ細胞はそれぞれ、少なくとも１つの異なるＴＣＲαとＴＣＲβの対を発現するように構成されており、該ＴＣＲαおよび該ＴＣＲβはそれぞれ該対象に由来し；
少なくとも２つの抗原提示細胞のセットを提供すること、ここで、該抗原提示細胞のセットは該対象に由来するものであり、少なくとも２つの外因性新生抗原を発現するように構成されており、該少なくとも２つの外因性新生抗原は、該対象内で見出される新生抗原と同じであり；
該少なくとも２つのＴ細胞のセットと該少なくとも２つの抗原提示細胞のセットを組み合わせ、該少なくとも２つの外因性新生抗原を介した該少なくとも２つのＴ細胞の活性化に基づいて、少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを選択すること；および、
該少なくとも２つのＴＣＲ対の組み合わせを該対象に投与し、それによって該腫瘍を治療すること、
を含む、方法。
１３７．対象の腫瘍中に存在する第一の抗原（または新生抗原）に結合する第一のＴＣＲ対；および該対象の腫瘍中に存在する第二の抗原（または新生抗原）に結合する第二のＴＣＲ対を含む、医薬組成物。
１３８．該第一のＴＣＲ対がＭＨＣクラスＩ拘束性であり、該第二のＴＣＲ対がＭＨＣクラスＩＩ拘束性である、アレンジメント１３７に記載の医薬組成物。
１３９．第一の抗原に結合し、かつ、ＭＨＣクラスＩ拘束性である第一のＴＣＲ対と、第二の抗原に結合し、かつ、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性である第二のＴＣＲ対を含む、医薬組成物。
１４０．第三のＴＣＲ対をさらに含む、アレンジメント１３７～１３９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１４１．該第一のＴＣＲ対が腫瘍由来の新生抗原に結合し、該第二のＴＣＲ対が該腫瘍由来の新生抗原に結合し、該第一および第二のＴＣＲ対が両方とも該腫瘍の宿主に存在する、アレンジメント１３７～１４０のいずれか１つに記載の医薬組成物。
１４２．細胞のコレクションであって、該コレクションが、
少なくとも２つのＴ細胞のセットであって、ここで、それぞれが少なくとも１つのＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を発現するように構成されており、ここで該対は対象に由来し、ここで該Ｔ細胞は内因性ＴＣＲを発現せず、およびここで該セットは１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを活性化するために構成されている、少なくとも２つのＴ細胞のセット；ならびに、
少なくとも２つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）細胞のセットであって、ここで、該少なくとも２つのＡＰＣはそれぞれ少なくとも１つの外因性新生抗原（または抗原）を発現するように構成されており、その結果、少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が産生可能になり、およびここで該少なくとも２つの外因性新生抗原（または抗原）が該対象内におけるものと同じである、少なくとも２つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）細胞のセット、
を含む、コレクション。
１４３．該ＴＣＲ対および／または該ＴＣＲ対を発現しているＴ細胞が、抗原（新生抗原など）への結合によって選択または同定され、ここで該抗原が、Ｂ細胞または抗原提示細胞によって発現される、アレンジメント１～１４２のいずれか１つに記載の方法。
１４４．該抗原または新生抗原が、対象における腫瘍に由来し、該ＴＣＲ対のＴＣＲαおよびＴＣＲβもそれぞれ該対象由来である、アレンジメント１～１４３のいずれか１つに記載の方法。
１４５．少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１，０００、１０，０００、１００，０００、または１００万のＴＣＲ対（またはこれらの対を含む細胞）が存在し、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１，０００、１０，０００、１００，０００、または１００万の抗原が存在する、アレンジメント１～１４４のいずれか１つに記載の方法。
さらなる態様

【0358】

様々な方法の種々の態様を、図１０Ａ～１０Ｊに示す。いくつかの態様において、図１０Ａ～１０Ｊのパネルでは、他の腫瘍の例として、ミスマッチ修復遺伝子欠損のない大腸癌（ＭＭＲｐ－ＣＲＣ）から新生抗原反応性ＴＣＲを単離する方法、およびそれが可能であることを示す。これらの腫瘍は一般に遺伝子変異数が低い。遺伝子変異数が、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害療法などの免疫腫瘍学的治療に対する反応性との相関が高いことを示唆する十分な証拠が存在する。実際、免疫チェックポイント阻害薬で治療されたＭＭＲｐ－ＣＲＣコホートでは、奏効率が低いことが観察されている。

【0359】

免疫チェックポイント阻害療法と同様に、Ｔ細胞療法は、免疫系によって腫瘍細胞が認識されることによって引き起こされる。ＭＭＲｐ－ＣＲＣでは遺伝子変異数が少ないことから、腫瘍新生抗原に対するＴ細胞の反応性が低いことが予想される。予期せぬことに、スクリーニングされた４つのＭＭＲｐ－ＣＲＣ患者試料すべてについて腫瘍新抗原を認識するＴＣＲが発見され、それによって、この患者群（そうでなければ治療選択肢が限られる）に対してＴＣＲＴ細胞療法が使用できるようになった（以下に概要を示し、また、下記実施例１３でも実証する）。

【0360】

いくつかの態様において、方法は、以下の過程１０Ａ～１０Ｊ（および当該態様のいくつかの添付図）に概要を示すステップのうちの１つ以上を含む場合がある。ステップはいずれも、必要に応じて、本明細書で提供される他の態様によって繰り返すことも、または置換することもできる。また、別の介在するステップを追加することも可能である。

【0361】

ステップ１０Ａ）スクリーニング過程の模式図。いくつかの態様では、ミスマッチ修復遺伝子欠損のない大腸癌（例えば、ＭＭＲｐ－ＣＲＣ）患者試料は、一般的な方法で非生存性腫瘍生検から遺伝子情報を得ることから始めて、ＴＣＲ同定プラットフォームに供される。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からバルクＴＣＲシーケンス情報を取得し、これを使用して、α鎖およびβ鎖発現カセットをコンビナトリアルに対合させたライブラリーを構築した。これらをジャーカットレポーターＴ細胞で発現させ、縦列ミニ遺伝子（ＴＭＧ）の形式でミニ遺伝子として腫瘍新生抗原を発現する自己Ｂ細胞に対するスクリーニングを行った。活性化したレポーターＴ細胞を回収し、そのＴＣＲを単離することにより、新生抗原反応性ＴＣＲを同定することができる。

【0362】

ステップ１０Ｂ）ヒトＭＭＲｐ－ＣＲＣ試料に含まれる浸潤リンパ球のバルクＴＣＲ配列決定。いくつかの態様では、１０Ａからの生成物を、ＴＣＲのバルク配列決定に供することができる。いくつかの態様において、ヒトＭＭＲｐ－ＣＲＣ腫瘍試料のｐｔ１は、ミラボラトリー（Ｍｉｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によるバルクＴＣＲ配列決定に供された。アライメントしてＴＣＲを同定した後、クローン型を、それらのＣＤＲ３アミノ酸配列ならびにそれらのＶおよびＪの同一性に基づいてまとめた。特有のクローン型の数を、α鎖とβ鎖の両方について表す。結果を、図１０Ｂのグラフに示す。

【0363】

ステップ１０Ｃ）ＴＣＲライブラリーの品質管理。いくつかの態様では、必要に応じた品質管理の確認を採用することができる。いくつかの態様では、１０Ａの腫瘍試料から、最も多く存在する１００のα鎖およびβ鎖を選択し、コンビナトリアルライブラリーの作製に使用した。ライブラリーは、ヒトＶ、ＣＤＲ３およびＪセグメントを使用してツイストバイオサイエンスによって組み立てられ、一方、定常（Ｃ）領域はマウス由来であった。可変ＴＣＲα鎖およびβ鎖ドメインに隣接したプライマー対を使用して両鎖を増幅し、ナノポアシーケンスを用いて両鎖の同一性を明らかにした。１０，０００のα×βの組み合わせそれぞれの表現を示す。結果を図１０Ｃのグラフに示し、確率密度をＹ軸に表している。

【0364】

ステップ１０Ｄ）ジャーカットレポーターＴ細胞におけるライブラリーの発現。いくつかの態様では、前述したライブラリーを、ジャーカットなどのレポーターＴ細胞で発現させることができる。１０Ｃからのライブラリーを、ウイルス産生のためにフェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）細胞に形質移入し、得られたウイルス上清を、ＣＤ８陽性ＴＣＲ陰性ＫＯジャーカットレポーターＴ細胞のレトロウイルス形質導入に使用した。ブラストサイジンを用いて細胞を選択し、マウスＴＣＲβ定常領域に対する抗体を用いてＴＣＲ発現の陽性度を試験した。結果を図１０Ｄのグラフに示す。

【0365】

ステップ１０Ｅ）スクリーニングのための選別戦略。いくつかの態様にでは、ライブラリーを、任意の方法によって選別することができる。１０ＤのジャーカットレポーターＴ細胞を、複数の縦列ミニ遺伝子（ＴＭＧ）の形式でｐｔ１のムタノームを発現するＢ細胞と１：１の割合で２１時間共培養した。次いで、細胞を、ＣＤ６９マーカーを用いたＦＡＣＳにより、Ｔ細胞活性化に関して選別した。選別戦略には、（左から）リンパ球を選択するための連続したゲーティング、一重の細胞を選択するためのゲーティング、ＣＤ２０陽性／陰性細胞を除外するためのゲーティング、およびＣＤ６９を高発現する細胞と低発現する細胞のそれぞれを補足する二つの選別ゲート（「上位」「下位」）を含めた。結果を図１０Ｅのグラフに示す。

【0366】

ステップ１０Ｆ）ＴＣＲ発現カセットの回収。いくつかの態様では、様々な技術のいずれかによって、関連するＴＣＲ発現カセットを回収することができる。いくつかの態様では、１０Ｅからの上位および下位試料（３回の反復実験、およびＴＭＧを発現しないＢ細胞とのジャーカットレポーターＴ細胞との共培養に関する３回の対照スクリーニングを含む）のＴＣＲ発現カセットを、１０Ｃに記載のＰＣＲ戦略を使用して回収し、続いてバーコーディングＰＣＲを実施した。プラスミドＴＣＲライブラリーに対する対照ＰＣＲも含めた。ＰＣＲ産物は、アジレント・テープステーション（左）を用いて分析した。ＰＣＲ産物を１：１の割合でプールし、テープステーションで分析した（右）。結果を図１０Ｆに示す。

【0367】

ステップ１０Ｇ）スクリーニング分析。いくつかの態様では、ステップＦからのＰＣＲ産物プールを、任意の数の方法で分析することができる。例えば、１０ＦからのＰＣＲ産物プールを使用してライブラリーを調製し、配列決定した。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の同一性を回復し、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して、差次的に発現したＴＣＲの組み合わせを同定した。Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）および非存在下（ｙ軸）でのスクリーニングの平均Ｒｌｏｇ変換リードカウントを、１０Ｂ～１０Ｆに記載のｐｔ１腫瘍試料、ならびに同一の方法で処理した３つの追加のＭＭＲｐ－ＣＲＣ試料（ｐｔ２、ｐｔ３およびｐｔ４）について表す。新生抗原反応性のＴＣＲリード化合物は、図１０Ｇにおいて円で囲んだより大きな黒点として示した。

【0368】

ステップ１０Ｈ）関連するＴＭＧのデコンボリューション。いくつかの態様では、関連するＴＭＧを、任意の数の方法でデコンボリューションすることができる。例えば、１０Ｇにおいて同定された新生抗原反応性ＴＣＲを、単一のＴＭＧ構築物を発現するＢ細胞を用いて再度スクリーニングした（１回のみの実験）。一例として、ｐｔ１試料の逆多重化スクリーニングを表す。ｐｔ１のＴＣＲリード化合物は、ｐｔ１－ＴＭＧ１を認識し、ｐｔ１－ＴＭＧ２を認識しない。結果を図１０Ｈのプロットに示す。

【0369】

ステップ１０Ｉ）ｐｔ１－ＴＣＲリード化合物抗原の同定。ＴＣＲリード化合物の抗原（例えば、ｐｔ１）は、任意の数の方法で同定することができる。例えば、ｐｔ１－ＴＣＲリード化合物によって認識される新生抗原を、ｐｔ１－ＴＭＧ１として表される単一ミニ遺伝子のペプチドをＢ細胞を負荷することによって同定した。陽性対照としてはｐｔ１－ＴＭＧ１を発現するＢ細胞を使用した。ＡＰＣを、１０Ｇで同定したｐｔ１新生抗原反応性ＴＣＲリード化合物を発現するジャーカットレポーターＴ細胞と共培養した。陽性対照（ＰＭＡ／イオノマイシンによる処理）と比較したＣＤ６９の陽性度として活性化を測定した。対照（ＰＡＲＶＡ－Ｐ７０Ｒ）、ならびにＡＫＡＰ８Ｌ－Ｒ１９１Ｗペプチドによる活性化を図１０Ｉに示す。

【0370】

ステップ１０Ｊ）ｐｔ３－ＴＣＲリード化合物抗原の同定。ＴＣＲリード化合物の抗原（例えば、ｐｔ３）は、任意の数の方法で同定することができる。例えば、ｐｔ３－ＴＣＲリード化合物によって認識される新生抗原を、ｐｔ３－ＴＭＧ１として表される単一ミニ遺伝子のペプチドをＢ細胞を負荷することによって同定した。陽性対照としてはｐｔ３－ＴＭＧ１を発現するＢ細胞を使用した。ＡＰＣを、１０Ｇで同定したｐｔ３新生抗原反応性ＴＣＲリード化合物を発現するジャーカットレポーターＴ細胞と共培養した。陽性対照（ＰＭＡ／イオノマイシンによる処理）と比較したＣＤ６９の陽性度として活性化を測定した。対照（ＥＴＳ１－Ｒ７０Ｗ）、ならびにＴＰ５３－Ｒ２８２Ｗペプチドによる活性化を図１０Ｊに示す。

【0371】

ステップ１０Ｋ）第一のｐｔ４－ＴＣＲリード化合物抗原の同定。第一のＴＣＲリード化合物の抗原（例えば、ｐｔ４）は、任意の数の方法で同定することができる。例えば、第一のｐｔ４－ＴＣＲリードによって認識される新生抗原を、Ｂ細胞中でのミニ遺伝子（ＨＳＰＡ９－ｐ．Ｋ６５４ＲｆｓＸ４２をコードするＭＧ９１）の発現によって同定した。陽性対照としては、ｐｔ４－ＴＭＧ３を発現するＢ細胞を使用した。ＡＰＣを、１０Ｇで同定した第一のｐｔ４新生抗原反応性ＴＣＲリード化合物を発現するジャーカットレポーターＴ細胞と共培養した。陽性対照（ＰＭＡ／イオノマイシンによる処理）と比較したＣＤ６９の陽性度として活性化を測定した。対照（ＭＧまたはＴＭＧを発現しないＢ細胞）、およびＭＧ９１／ＴＭＧ３試料による活性化を図１０Ｋに示す。

【0372】

ステップ１０Ｌ）第二のｐｔ４－ＴＣＲリード化合物抗原の同定。第二のＴＣＲリード化合物の抗原（例えば、ｐｔ４）は、任意の数の方法で同定することができる。例えば、第二のｐｔ４－ＴＣＲリードによって認識される新生抗原を、Ｂ細胞中でのミニ遺伝子（ＩＴＰＲ３－ｐ．Ｌ２３７９ＭをコードするＭＧ１３２）の発現によって同定した。陽性対照としては、ｐｔ４－ＴＭＧ４を発現するＢ細胞を使用した。ＡＰＣを、１０Ｇで同定した第二のｐｔ４新生抗原反応性ＴＣＲリード化合物を発現するジャーカットレポーターＴ細胞と共培養した。陽性対照（ＰＭＡ／イオノマイシンによる処理）と比較したＣＤ６９の陽性度として活性化を測定した。対照（ＭＧまたはＴＭＧを発現しないＢ細胞）、およびＭＧ１３２／ＴＭＧ４試料による活性化を図１０Ｌに示す。

【0373】

さらなる態様のいくつかを図１２Ａ～１２Ｃに示す。ＴＣＲαβライブラリー生成用の、メラノーマからのＴＣＲレパトアの回収。図１２Ａは、ヒトメラノーマ試料に含まれる浸潤リンパ球のバルクＴＣＲ配列決定を示す図である。２つのヒト腫瘍試料（ｐｔ５およびｐｔ６）を、ミラボラトリー（モスクワ、ロシア）によるバルクＴＣＲ配列決定に供した。アライメントしてＴＣＲを同定した後、クローン型を、それらのＣＤＲ３アミノ酸配列ならびにそれらのＶおよびＪの同一性に基づいてまとめた。各腫瘍試料の特有のクローン型の数を、α鎖とβ鎖の両方について表す。図１２Ｂでは、１００×１００ライブラリーの品質管理について示す。Ａ由来の各試料から、最も多く存在する１００のα鎖およびβ鎖を選択し、コンビナトリアルライブラリーの作製に使用した。ＢのＴＣＲβおよびＴＣＲα領域を、ツイストバイオサイエンスによって実施されたコンビナトリアルクローニング手法で合成し、図１１Ｂに表すレトロウイルス構築物に挿入した。可変ＴＣＲα鎖およびβ鎖ドメインに隣接したプライマー対を使用して両鎖を増幅し、ナノポアシーケンスを用いて両鎖の同一性を明らかにした。全ての患者ライブラリーについて、１０，０００のα×βの組み合わせそれぞれの表現を示す。図１２Ｃでは、患者ライブラリーにおけるＴＣＲ表現の特徴を提供する。１２Ｂの患者ライブラリーそれぞれについて、ＴＣＲあたりのリード量の範囲、平均カバー数、および中央値±ａ^２ｌｏｇ単位の範囲内にあるＴＣＲの割合を表す。

【0374】

さらなる態様のいくつかを、図１３Ａ～１３Ｅに（いくつかの態様にかかるステップとして）提供する。図１３（Ａ～Ｅ）は、プラスミドの人工的な混合によって生成されたＴＣＲライブラリーからの抗原特異的ＴＣＲの回収を示す図である。ステップ１３Ａ）ＴＣＲプラスミドの人工的な混合によるライブラリー生成。プラスミドの人工的な混合によりＴＣＲライブラリーを生成した。それぞれが特徴の分かっている単一のＴＣＲを発現する６個のプラスミドを、それぞれが特徴の分かっていない単一の卵巣癌（ＯＶＣ）ＴＣＲを発現する１１個のプラスミドと、それぞれが特徴の分かっていない単一の大腸癌（ＣＲＣ）ＴＣＲを発現する１３個のプラスミドとのプールに混合した。特徴が分かっているＴＣＲのうち、ＣＭＶ１およびＣＤＫ４－８ＴＣＲプラスミドは１：１００，００モル比でこのプールに混合し、ＣＭＶ２、ＣＤＫ４－１７、ＧＣＮ１Ｌ１およびＮＹ－ＥＳＯ １Ｇ４ ＴＣＲプラスミドは１：１００，０００モル比でこのプールに混合した。その頻度を図１３Ａに示す。ステップ１３Ｂ）ジャーカットレポーターＴ細胞におけるライブラリーの発現。いくつかの態様では、ステップ１３ＡからのＴＣＲの混合物を、ジャーカットなどのレポーターＴ細胞で発現させることができる。ステップ１３ＡからのＴＣＲプラスミドのプールを、ウイルス産生のためにフェニックス細胞に形質移入し、得られたウイルス上清を、ＴＣＲ陰性ＫＯジャーカットレポーターＴ細胞のレトロウイルス形質導入に使用した。細胞をピューロマイシンを用いて選択し、マウスＴＣＲβ定常領域に対する抗体を用いてＴＣＲ発現の陽性度を試験した。結果を図１３Ｂのグラフに示す。ステップ１３Ｃ）では、スクリーニングのための選別戦略を提供する。いくつかの態様では、ライブラリーを、任意の方法によって選別することができる。ステップ１３ＢからのジャーカットレポーターＴ細胞を複数の縦列ミニ遺伝子（ＴＭＧ）の形式で特徴の分かっているＴＣＲに対する同族抗原のそれぞれを発現するＢ細胞と１：１の割合で２１時間共培養した。次いで、細胞を、ＣＤ６９マーカーを用いたＦＡＣＳにより、Ｔ細胞活性化に関して選別した。選別戦略には、（左から）リンパ球を選択するための連続したゲーティング、一重の細胞を選択するためのゲーティング、ＣＤ２０陽性／陰性細胞を除外するためのゲーティング、およびＣＤ６９を高発現する細胞と低発現する細胞のそれぞれを補足する二つの選別ゲート（「上位」「下位」）を含めた。結果を図１３Ｃのグラフに示す。

【0375】

ステップ１３Ｄ）では、ＴＣＲ発現カセットに関する情報を提供する。いくつかの態様では、様々な技術のいずれかによって、関連するＴＣＲ発現カセットを回収することができる。いくつかの態様では、ステップ１３Ｃからの上位および下位試料（ＴＭＧを発現するＢ細胞を用いたスクリーニングの反復実験のうちの１回と外来抗原を発現しないＢ細胞を用いたスクリーニングの反復実験のうちの１回）のＴＣＲ発現カセットを、１０Ｃに記載のＰＣＲ戦略を使用して回収し、続いてバーコーディングＰＣＲを実施した。プラスミドＴＣＲライブラリーに対する対照ＰＣＲも含めた。２回目のＰＣＲ後のＰＣＲ産物を、アジレント・テープステーションを使用して分析した。結果を図１３Ｄに示す。

【0376】

ステップ１３Ｅ）では、スクリーニングデータの分析を提供する。いくつかの態様では、ステップ１３ＤからのＰＣＲ産物プールを、任意の数の方法で分析することができる。例えば、１３ＤからのＰＣＲ産物プールを使用してライブラリーを調製し、ナノポア技術を使用して配列決定した。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の同一性を回復し、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して、差次的に発現したＴＣＲα鎖およびβ鎖の組み合わせを同定した。ｘ軸に測定されたＴＣＲの頻度を、ｙ軸には上位試料と下位試料との間における正規化リードカウントのｌｏｇ２変換後の倍率変化を表す。図１３Ｅでは、特徴の分かっている（抗原特異的）ＴＣＲを灰色で、特徴の分かっていない（関連のない）ＴＣＲを黒色で示した。

【0377】

さらなる態様を図１４で示し、これは、遺伝子合成によって生成されたＴＣＲライブラリーからの抗原特異的ＴＣＲの回収を示す図である。ステップ１４Ａ（図１４Ａ）では、スクリーン設計の概略を提供する。卵巣癌（ＯＶＣ）または大腸癌（ＣＲＣ）試料に由来する５つの特性が分かっているＴＣＲと、４５または９５の特徴の分かっていないＴＣＲを用いて、５０×５０および１００×１００設計のコンビナトリアルＴＣＲライブラリーをそれぞれ作製した。ライブラリーはツイストバイオサイエンス社により、ヒトのＶ、ＣＤＲ３、Ｊセグメントを使用して組み立てられたが、定常Ｉ領域はマウス由来であった。このライブラリーを、ジャーカットレポーターＴ細胞のレトロウイルス導入に使用した。ポリクローナルレポーターＴ細胞を、様々な様式で抗原を提示するように操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養した。ＡＰＣには、ペプチドを負荷したＪＹ細胞、それぞれが異なるミニ遺伝子を発現するＥＢＶ ＬＣＬ細胞株の混合物、ＴＭＧを発現するＥＢＶ ＬＣＬ細胞、および特定の抗原を提示するように操作されていないＥＢＶ ＬＣＬを含めた。

【0378】

ステップ１４Ｂでは、スクリーニングのための選別戦略を提供する。１４Ａ）で概説したように作製した５０×５０設計のＴＣＲライブラリーを発現するジャーカットレポーターＴ細胞を、１４Ａ）で述べたＡＰＣと、１：１の割合で２１時間共培養した。次いで細胞を、ＣＤ６９マーカーを用いたＦＡＣＳにより、Ｔ細胞活性化に関して選別した。いくつかの態様では、ライブラリーを、任意の方法によって選別することができる。選別戦略には、（左から右に向かって）リンパ球を選択するための連続したゲーティング、一重の細胞を選択するためのゲーティング、ＣＤ２０陽性／陰性細胞を除外するためのゲーティング、およびＣＤ６９を高発現する細胞と低発現する細胞のそれぞれを補足する二つの選別ゲート（「上位」「下位」）を含めた。結果を図１４Ｂのグラフに示す。

【0379】

ステップ１４Ｃ（図１４Ｃ）では、ＴＣＲ発現カセットの回収を示す。いくつかの態様では、様々な技術のいずれかによって、関連するＴＣＲ発現カセットを回収することができる。いくつかの態様では、図１４Ｂからの上位および下位試料のＴＣＲ発現カセットを、１０Ｃに記載のＰＣＲ戦略を使用して回収し、続いてバーコーディングＰＣＲを実施した。プラスミドＴＣＲライブラリーに対する対照ＰＣＲも含めた。２回目のＰＣＲ後のＰＣＲ産物を、アジレント・テープステーションを使用して分析した。結果を図１４Ｃに示す。

【0380】

ステップ１４Ｄ）では、５０×５０のスクリーンデータの分析を提供する。いくつかの態様では、ステップ１４ＣからのＰＣＲ産物プールを、任意の数の方法で分析することができる。例えば、１４ＣからのＰＣＲ産物プールを使用してライブラリーを調製し、ナノポア技術を使用して配列決定した。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の同一性を回復し、すべてのＴＣＲについて、上位試料と下位試料との間におけるＴＣＲ表現の倍率変化（ｙ軸）を、ＴＣＲの平均発現（ｘ軸）に対する関数として表す。

【0381】

ステップ１４Ｅ）は、最も有意に濃縮された上位１０のＴＣＲの特徴を示す。１４Ｄのデータから、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して、差次的に表現されたＴＣＲα×β鎖の組み合わせを同定した。差次的表現分析は当業者に知られており、濃縮ＴＣＲが、抗原が提示されていない「上位」および「下位」試料の両方との比較において、抗原が提示されている「上位」試料では濃縮されていて、抗原が再提示されている「下位」試料では枯渇していると定義する線形モデルに基づいている。上位１０の最も有意なα鎖およびβ鎖のヒット、ならびにそれらの名称、それらのｌｏｇ２変換後の倍率変化、および差分表現の有意性を図１４Ｅに表わした。

【0382】

ステップ１４Ｆ）は、１００×１００のスクリーンデータの分析を示す。１００×１００ライブラリーを、１４Ａ～１４Ｅで説明した５０×５０ライブラリーのスクリーニングと同様にスクリーニングした。ＴＣＲα鎖およびβ鎖を同定した後、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して、差次的に発現したＴＣＲの組み合わせを同定した。差次的表現分析は当業者に知られている。Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）および非存在下（ｙ軸）における１００×１００ライブラリースクリーニングの平均Ｒｌｏｇ変換リードカウントを、図１４Ｆに表す。５つの添加した特徴の分かっているＴＣＲを、円で囲んだより大きな黒点として示す。

【0383】

ステップ１４Ｇでは、特徴の分かっているＴＣＲの順位付けを示す。１００×１００ライブラリーで表現されるＴＣＲのすべての組み合わせに関する濃縮度の有意性の順位を示しており、統計分析は、１４Ｅで説明したように行った。ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用してワルド統計量を計算し、ｙ軸にワルド統計量を降順にプロットした（確率尺度）。添加した特徴の分かっているＴＣＲを灰色の陰影で示す。挿入図は、統計的に有意に濃縮された上位２０のＴＣＲの拡大図を示す。

【0384】

図１５Ａ～１５Ｄは、遺伝子合成を用いたＴＣＲレパトアの作製に関するいくつかの態様を示す図である。ステップ１５Ａ）（図１５Ａ）では、ＴＣＲライブラリーの模式図を提供する。ライブラリーを作製するための足場として、ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖の両方、ならびにピューロマイシン選択マーカーを含むレトロウイルス構築物を使用した。ＴＣＲαまたはβ鎖いずれかの可変領域（Ｖ－ＣＤＲ３－Ｊ）を、それぞれ、１００のオリゴヌクレオチドのプールとして合成した。その後、α鎖とβ鎖のプールをコンビナトリアルクローニング反応に使用し、総複雑度１０，０００のライブラリーを得た。ＴＣＲ鎖の合成とコンビナトリアルクローニングは、いずれもツイストバイオサイエンス（サンフランシスコ、米国）により行われた。この構築物を用いたレトロウイルス導入は、最終的に１つの転写物の発現をもたらし、その結果、２Ａ部位でのペプチド切断により、ＴＣＲβ鎖およびα鎖ならびにピューロマイシン耐性マーカーが翻訳されることになる。

【0385】

ステップ１５Ｂ）では、１００のα鎖と１００のβ鎖のコンビナトリアルＴＣＲライブラリーの品質管理を提供する。可変ＴＣＲα鎖およびβ鎖ドメインに隣接したプライマー対を使用して両鎖を増幅し、ナノポアシーケンスを使用して両鎖の同一性を明らかにした。１００のα鎖（左図）、１００本のβ鎖（中央図）、または１０，０００のα×βの組み合わせそれぞれの表現を表す。

【0386】

ステップ１５Ｃ）では、より複雑度の低い複数のライブラリーからの、より複雑度の高いライブラリーの作製を示す。この模式図では、より複雑度の低い複数のライブラリーから、より複雑なライブラリーを作製する考えを示している。いくつかの態様において、より複雑度の低いライブラリーは、重複して存在する可能性があるα鎖およびβ鎖のいかなる組み合わせも含まない。いくつかの他の態様では、より複雑度の低いライブラリーは、重複して存在する可能性があるα鎖およびβ鎖の組み合わせを含む。この例では、等モル比で４つの１００×１００ライブラリーを混合することによって、２００のα鎖と２００のβ鎖のコンビナトリアルライブラリー（２００×２００ライブラリー）が作製される。この例では、４つのサブライブラリーは、ｉ）ＴＣＲα１～１００番およびＴＣＲβ１～１００番、ｉｉ）ＴＣＲα１０１～２００番およびＴＣＲβ１～１００番、ｉｉｉ）ＴＣＲα１～１００番およびＴＣＲβ１０１～２００番、ならびにｉｖ）ＴＣＲα１０１～２００番およびＴＣＲβ１０１～２００番のコンビナトリアルライブラリーとして生成される。いくつかの態様において、ライブラリーの複雑度は、５０×５０～２０００×２０００の間で変化し得る。

【0387】

ステップ１５Ｄ）（図１５Ｄで示すように）対合情報または対合尤度に基づく設計によるＴＣＲライブラリーの削減。この模式図では、ライブラリー中に存在する抗原特異的ＴＣＲ鎖対の数に影響を与えることなく、または数への効果を制限して、ＴＣＲライブラリーの複雑度を低減する考えを図示する。一例として、１００×１００ライブラリーの１０，０００の複雑度は、１０×１０設計のコンビナトリアルサブライブラリーを１０個、等モル比で混合することにより低減することができる。このことによって、ＴＣＲライブラリーの複雑度は十分の一に低減する。実験的に同定されたＴＣＲαβ対、または他の方法で既知のＴＣＲαβ対に関する全てのα鎖およびβ鎖、または対合する可能性が高い全てのα鎖およびβ鎖が、単一のコンビナトリアルサブライブラリー中で表されるように、ＴＣＲα鎖とβ鎖の対合に関する情報、またはα鎖とβ鎖の対合尤度情報をこのライブラリーの設計に含めることが可能である。いくつかの態様では、この原理を、複雑度がより高いまたはより低い複合ライブラリーに適用することができる。いくつかの態様では、コンビナトリアルサブライブラリーの複雑度は、より高くてもまたはより低くてもよい。いくつかの態様では、コンビナトリアルサブライブラリーは、重複するＴＣＲ鎖の組合せを含む可能性がある。いくつかの態様において、複合ライブラリーは、１００（１０×１０）～９０，０００（３００×３００）の範囲を有することができる。いくつかの態様では、サブライブラリーの大きさは、１（１×１）～１００（５０×５０）の範囲とすることができる。

【0388】

さらなる態様を図１６Ａ～１６Ｅに示し、この図では、ＴＣＲレパトアからのＴＣＲαβ対の同定に使用される共培養条件を提供する。

【0389】

図１６Ａでは、活性化ジャーカット細胞の選択マーカーとしてＣＤ６９を使用した場合の結果を図示する。ｈＣＤ８を発現するジャーカット細胞に、２１％の導入効率でＣＭＶ＃１－ＴＣＲを形質導入した。ＪＹ細胞を、様々な量のＣＭＶｐｐ６５ペプチド（示したように０～１０ｕｇ／ｍｌの範囲）または１μｇ／ｍｌのＭＡＲＴ－１無関係ペプチド（ＩＲＲ）を用い、３７℃で１時間パルスした。１時間後、細胞を洗浄し、１×１０^５の細胞を、丸底９６ウェルプレート中で、１ウェル当たり１×１０^５の形質転換ジャーカット細胞と３７℃で２０時間共培養した。細胞を回収し、抗ヒトＣＤ６９（クローン：ＦＮ５０）で染色し、ＦＡＣＳで分析した。

【0390】

図１６Ｂでは、播種密度に応じたＣＤ６９のバックグラウンド発現を示す。ｈＣＤ８とＣＭＶ＃１－ＴＣＲを発現するジャーカット細胞を異なる密度（０．２５×１０^６／ｍｌ，０．５×１０^６／ｍｌ，１×１０^６／ｍｌ）で２日間培養した。細胞を採取し、抗ヒトＣＤ６９（クローン：ＦＮ５０）で染色し、ＦＡＣＳで分析した。

【0391】

図１６Ｃでは、異なる培養容器および様々なエフェクター対標的比で共培養した活性化ジャーカット細胞におけるＣＤ６９の発現を示す。ｈＣＤ８とＴＣＲライブラリー（４つの特徴の分かっている抗原特異的ＴＣＲのαおよびβ鎖からなる４×４コンビナトリアルライブラリー）を発現するジャーカット細胞を、培養面積０．３２ＣＭ^２当たりエフェクター細胞が２．５×１０^５になるように維持しながら、同族ミニ遺伝子を発現する標的Ｂ細胞（ＴＭＧ２．１）と共培養した。細胞を丸底９６ウェルプレート中で、エフェクターと標的細胞の比率を１：１または１：２にして培養した。あるいは、Ｔ２５培養フラスコ中で、この表面積に使用する総細胞量の１／３または１／２の細胞を、エフェクターと標的細胞の比率を１：１に保ちながら培養した。さらに、Ｔ７５培養フラスコ中で、エフェクターと標的細胞の比率を１：２および３：１にして細胞を培養した。２０時間培養した後、細胞を回収し、抗ヒトＣＤ６９（クローン：ＦＮ５０）で染色し、ＦＡＣＳで分析した。

【0392】

図１６Ｄでは、様々な共培養密度におけるＣＤ６９の発現を示す。ｈＣＤ８およびＣＤＫ４－１７またはＣＤＫ４－８ＴＣＲを発現するジャーカット細胞を、丸底９６ウェルプレート中で、示した量のＣＤＫ４_{２３－３２（２４Ｌ）}ペプチドでパルスしたＪＹ細胞と、または無関係なＭＡＲＴ－１_{２６－３５（２７Ｌ）}ペプチドでパルスしたＪＹ細胞と、１：１の比率で共培養した。エフェクター細胞の播種密度は、１ウェルあたり１２５×１０^３、２５０×１０^３または５００×１０^３のいずれかとした。２０時間後、細胞を回収し、抗ヒトＣＤ６９（クローン：ＦＮ５０）で染色し、ＦＡＣＳで分析した。

【0393】

図１６Ｅは、反応性ＴＣＲを同定するための遺伝子スクリーニングにおけるＴ細胞活性化のマーカーとしてのＣＤ６９の使用を示す図である。特異性不明のＴＣＲを等しい比率で発現するジャーカットｈＣＤ８陽性細胞のプールを、ＣＤＫ４－１７、ＣＤＫ４－８、ＣＭＶ＃１、ＣＭＶ＃２またはＧＣＮ１Ｌ１のいずれかのＴＣＲを示した頻度で発現するジャーカットｈＣＤ８陽性細胞と混合した。この混合細胞を、すべての同族ミニ遺伝子を発現する標的Ｂ細胞と共培養した。２０時間後に細胞を回収し、抗ヒトＣＤ６９（クローン：ＦＮ５０）で染色して、それぞれがＣＤ６９を高レベルでまたは低レベルで発現する「上位」集団と「下位」集団に選別した。これらの試料はそれぞれ、選別した細胞全体の約１０％を含んでいた。これらの細胞からゲノムＤＮＡを回収し、ＴＣＲβ可変ドメインをＰＣＲで増幅した。試料をイルミナシーケンスに供し、得られたリードを参照ＴＣＲβ配列上にマッピングした。濃縮倍率は、上位試料と下位試料におけるリードの正規化された数として計算される。

【0394】

さらなる態様を図１７～図２７に示す。

【0395】

図１７および図２７では、抗原活性化Ｔ細胞を検出するためのＣＤ６９の使用について説明する。ＣＤ６９の発現パターンに関する知識によって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ライブラリーのスクリーニングにおける活性化Ｔ細胞の検出および選択が可能になる。

【0396】

図１８、図２５ａおよび２５ｂならびに図２６では、ＴＣＲ遺伝子を形質導入したジャーカットレポーターＴ細胞を選択するためのブラストサイジンの使用と、それによるＴＣＲライブラリー導入後のレポーターＴ細胞の効率的な選択の提供を説明する。

【0397】

図１９では、ＴＣＲライブラリーのスクリーニング過程において、ＴＣＲライブラリーを形質導入した多数のレポーターＴ細胞の刺激を可能にする、細胞培養バッグ中でのジャーカットレポーターＴ細胞の刺激について説明する。多数の細胞を使用し、十分なカバー数を維持することによって、ＴＣＲライブラリースクリーニングの感度を高めることができる。

【0398】

図２０では、異なるＴＣＲを導入したジャーカットレポーターＴ細胞におけるＣＤ６９、ＣＤ２５およびＣＤ６２Ｌの発現の経時的分析を説明する。発現マーカーの経時的な発現を理解することで、抗原活性化Ｔ細胞を特異的に検出するための単一（または複数）の活性化マーカーの選択、および例えば磁気ビーズ濃縮による２段階の選択手法の実行が可能になる。

【0399】

図２１から図２４では、ＮＦＡＴレポーター遺伝子カセットの設計、送達の型およびそのゲノム挿入部位が、レポーター遺伝子の機能および抗原非依存性バックグラウンド発現のレベルを制御するという理解を提供する、抗原活性化Ｔ細胞の検出に関する異なるＮＦＡＴレポータ系の使用について説明する。このデータは、異なるウイルス送達ベクター、クローナルなレポーターＴ細胞集団、異なるレポーターＴ細胞または異なるレポーター系が、より適したレポーター機能をもたらす可能性があることを示す。

【0400】

いくつかの態様において、方法は、以下に説明するステップ（１）～（７）（および図３１を参照）を含む場合がある。ステップ（１）試料を取得する。試料は、感染症、自己免疫疾患、または癌を患っている患者に由来する組織、血液、または体液であってよい。試料は生存細胞であっても非生存細胞であってもよい。ステップ（２）試料に含まれるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の配列を決定する。ステップ（３）ＴＣＲαβ対のライブラリーを作製するために、ＴＣＲα鎖配列とＴＣＲβ鎖配列を選択し、コンビナトリアルペアリングを行う。ステップ（４）ＴＣＲαβ対のライブラリーをレポーター細胞のプール、例えばジャーカットレポーターＴ細胞のプールに導入する。ステップ（５）ＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたレポーター細胞を、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞で刺激する。少なくとも１つの目的の抗原は、自己由来であっても同種異系であってもよい。ステップ（６）少なくとも１つの目的の抗原に特異的なＴＣＲαβ対を決定する。ステップ（７）ＴＣＲαβ対を細胞に導入し、ＴＣＲαβ対を含む細胞を選択する。

【0401】

いくつかの態様において、方法は、前述したステップ（１）～（７）のうちの１つ以上を含み得る。いずれのステップも、適宜、本明細書で提供される他の態様によって省略、反復、または置換することができる。また、その他の介在するステップを追加することも可能である。例えば、いくつかの態様は、ステップ（２）および（３）を含む。他の態様は、ステップ（５）および（６）を含む。さらに他の態様は、ステップ（７）を含む。いくつかの態様はステップ（１）～（７）を含み、さらに、ＴＣＲαβ対を含有する細胞を治療のために患者に投与することを含む。いくつかの態様において、抗原提示細胞は、新生抗原ライブラリーをＢ細胞に導入することによって得ることができる。新生抗原ライブラリーは、自己であってもまたは同種異系であってもよい。いくつかの態様は、ＴＣＲ鎖サブセットを選択することによってＴＣＲレパトアを作製することに関する。いくつかの態様は、新生抗原ライブラリーに由来する任意の新生抗原を含むＢ細胞に関する。いくつかの態様は、濃縮度／枯渇度に基づく遺伝子スクリーニングへの適用に関する。いくつかの態様は、大きなサイズのアンプリコンを用いて遺伝子スクリーニングを行うことに関する。いくつかの態様は、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を検出するための方法に関する。いくつかの態様は、前述した態様のいずれか１つ以上を組み合わせたものである。

【0402】

いくつかの態様は、前述した態様のいずれか１つに従って回収されたＴ細胞受容体のレパトアを構成するヌクレオチドライブラリーに関する。

【0403】

いくつかの態様では、前述した態様のいずれか１つに従って同定されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構築物を提供する。いくつかの態様において、細胞は、本明細書に記載のヌクレオチド構築物を含む。

【0404】

いくつかの態様は、図２８に従うものである。いくつかの態様では、新生抗原特異的ＴＣＲの同定は、拡張可能かつ低侵襲である遺伝子スクリーニング手法を適用することによって達成される。少量の非生存性の保管腫瘍組織が、ＴＩＬの代わりに腫瘍内ＴＣＲ配列の供給源として使用される。次に、レトロウイルス遺伝子導入により、同定された腫瘍内ＴＣＲのライブラリーをジャーカットレポーターＴ細胞株と呼ばれる不死化Ｔリンパ球細胞株に導入する。ＴＣＲライブラリーを発現するジャーカット細胞（エフェクター細胞、略してＥ）を濃縮し、その後、ムタノームを発現する患者由来ＡＰＣ（標的細胞、略してＴ）に対する反応性についてスクリーニングする。フローサイトメトリーソーティングの後、ジャーカット細胞を、細胞増殖および下流のシグナル伝達に関与する^３２初期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９（一例として）の発現に基づいて選択する。いくつかの態様において、試料は、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、合成プロモーターレポーターマーカーまたは増殖マーカーを含むがこれらに限定されない、任意の他の活性化マーカーに基づいて分離することができる。最終段階として、新生抗原特異的ＴＣＲを次世代シークエンシングによって同定する。現在のＴＣＲ単離プラットフォームでは、１０，０００のＴＣＲのライブラリーをスクリーニングすることができる。このようなライブラリーから新生抗原特異的ＴＣＲを高感度で同定し、その他の処理工程でＴＣＲが失われないようにするためには、ＴＣＲのカバー数を維持するために、スクリーニング工程で固有のＴＣＲをそれぞれ複数回表現させなければならない。したがって、多数のＴＣＲ導入ジャーカット細胞およびＡＰＣをスクリーニングする必要がある^３３。

【0405】

レトロウイルスＴＣＲライブラリーをジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞に導入した後、毒性を引き起こすこともＴＣＲのカバー数を喪失することもなく正常にＴＣＲ導入されたジャーカット細胞を濃縮するためには（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が８０％超）、効率的でハイスループットの選択手順が有用である。いくつかの態様では、丸底９６ウェルプレートを、ＡＰＣ－ジャーカット共培養のために使用することができる。いくつかの態様では、ＧＭＰバッグをＡＰＣ－ジャーカット共培養のために使用することができる。いくつかの態様において、共培養は、閉鎖系で実施することができる。いくつかの態様では、１６８×１０^６のジャーカット細胞とＡＰＣを含む共培養を、ＧＭＰバッグ内に設置することができる。いくつかの態様では、１６、２０、２４、４８または３２時間、共培養することができる。いくつかの態様では、読み出しは、ＣＤ６９、ＣＤ２５、またはＣＤ６２Ｌに関するものであってよい。いくつかの態様では、読み出しは、ＣＤ６９とＣＤ２５の組み合わせとすることができる。いくつかの態様では、読み出しは、ＣＤ６９とＣＤ６２Ｌの組み合わせとすることができる。いくつかの態様は、ＣＤ６９との組み合わせでＣＤ２５陽性ＣＤ６２Ｌジャーカット細胞を選択することに関する。いくつかの態様では、ＧＭＰバッグを用いることができる。

【0406】

抗生物質による選択は、ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞を濃縮するための魅力的な戦略である。いくつかの態様では、ブラストサイジン選択を使用することができる。いくつかの態様は、図３０に従うものである。いくつかの態様では、選択の４日目に、細胞は、それぞれの濃度のブラステイシジンを含む培地または含まない培地のいずれかに、その開始時の密度で再度播種される。いくつかの態様では、ブラストサイジンの濃度は４μｇ／ｍｌである。いくつかの態様は、開始時の細胞密度を０．２５×１０^６細胞／ｍｌ、ブラストサイジンの濃度を４μｇ／ｍｌとし、４日後に抗生物質を除去する７日間の選択である。いくつかの態様では、０．５ｅ６／ｍｌの細胞で播種し、６μｇ／ｍＬのブラストサイジンを加え、４日後に、ブラストサイジンを加えずに０．５ｅ６／ｍｌで細胞を再度播種することが可能である。

【0407】

いくつかの態様において、レポーター系は、ＡＰ－１であっても、またはＮＦｋＢシグナル伝達経路であってもよい。

【0408】

いくつかの態様は、図２９に従うものである。いくつかの態様において、目標の１つは、ライブラリー内のＴＣＲの数を増やして、１０，０００を超えるＴＣＲの高感度スクリーニングを可能にすることである。これは、ＴＣＲカバー数を維持しながら多数の細胞のより効率的な処理を可能にするために、様々な処理ステップを最適化することによって、ＴＣＲ発見プラットフォームの拡張性を高める必要性を強調するものである。いくつかの態様では、４つの既知の、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１拘束性ＴＣＲであるＣＤＫ４－ＴＣＲのクローン８および１７（略してＣＤＫ４－８および１７）ならびにＣＭＶ－ＴＣＲクローン１および２（略してＣＭＶ－１および２）を使用した。２つのＣＤＫ４－ＴＣＲは、変異したサイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４_Ｒ２４Ｃ）ペプチドに特異的である。この変異由来の新生抗原エピトープは、複数のメラノーマ患者で同定されている^３４。さらに、２つのＣＭＶ－ＴＣＲは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の構成要素であるｐｐ６５^３５によってコードされるペプチドを標的としている。ＣＤＫ４とＣＭＶエピトープの両方について、潜在的に異なる親和性を持つ２つの異なるＴＣＲクローンを研究において使用した。これにより、同族ペプチドに対するＴＣＲの親和性がスクリーニング過程に果たす役割を評価することができる。
さらなる態様－実施例１９の結果

【0409】

ＴＣＲ遺伝子治療は、癌抗原に対して所望の特異性を持つＴＣＲを発現するように、自己Ｔ細胞を操作することを伴う。癌抗原の１つに非同義体細胞変異由来の新生抗原があり、これは悪性細胞のみに発現しているため、ＴＣＲ遺伝子治療の魅力的な標的である。しかし、ほとんどの新生抗原は所与の患者の腫瘍に特有であり、それらを標的とするためには個別化された手法が必要である。この課題を克服するために、腫瘍生検から単離した患者のＴＣＲ遺伝子のライブラリーから、そのようなＴＣＲを同定する遺伝子スクリーニング的手法を組み込むことによって、完全に個別化された新生抗原特異的ＴＣＲ遺伝子治療が提供される。現在のＴＣＲ単離プラットフォームでは１０，０００のＴＣＲをスクリーニングすることが可能であり、この方法は、スクリーニング感度を最大化するために、ＴＣＲライブラリーを導入したレポータージャーカットＴ細胞と新生抗原発現抗原提示細胞（ＡＰＣ）を大量に処理することを伴う。しかし、多数の細胞を扱うことは、プラットフォームの拡張性に影響を与える可能性がある。そこで、本研究では、多数の細胞を処理するための複数の方法を検討することで、感度を維持したままスクリーニングプラットフォームの拡張性を高めることを目的とした。最初に、ブラストサイジン選択により、ＴＣＲを発現するジャーカット細胞が効率的かつ最小限の毒性で濃縮できることを示した。次に、ジャーカット細胞－ＡＰＣ共培養を、確立されている９６ウェルプレートの形式から、より高処理のＭＡＣＳ ＧＭＰ細胞分化バッグ装置に拡張すると、ジャーカット細胞の活性化が同等になった。さらに、現在スクリーニング過程において用いられているフローサイトメトリーソーティングを、より拡張性の高いビーズを用いた選別に置き換えるために、様々な方法を検討した。そこで、ＣＤ６９に加えて、さらに２つのＴ細胞活性化マーカーであるＣＤ２５とＣＤ６２Ｌの発現プロファイルを検討したところ、これらがＣＤ６９と組み合わせた２段階のビーズを用いた濃縮に適した候補となる可能性があることが判明した。さらに、抗生物質耐性カセットやビーズに基づく選別に好適な細胞表面マーカーなどのレポーター遺伝子を利用することにより、フローサイトメトリーソーティングの使用を回避することができる、ＮＦＡＴ（ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）に基づくレポーター系を評価した。しかしながら、ＮＦＡＴレポーター系は高レベルのバックグラウンドシグナルを示した。

【0410】

腫瘍の微小環境では、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８陽性Ｔ細胞）は、主に腫瘍の退縮に関与している^１。Ｔ細胞は、α鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体の、特有なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。α鎖とβ鎖はそれぞれ、定常領域と可変領域から構成される^２。可変領域は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって、その主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）上に提示された同族ペプチドに対する、所与のＴ細胞の特異性と親和性に寄与するものである。ＭＨＣ分子は、ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる^２，３。ＣＤ８／ＣＤ４およびＣＤ２８はＴ細胞共受容体の一例であり、これらは、ＴＣＲ－ＨＬＡ複合体を安定化させ、ＣＤ３ζとともに、タンパク質であるチロシンのリン酸化および細胞質カルシウムの放出を伴う下流のシグナル伝達を引き起こす。この下流のシグナル伝達は、転写因子であるＮＦＡＴ（ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、ＡＰ－１、ＮＦ－κＢの核内移動を誘導し、Ｔ細胞の活性化に特異的な遺伝子の転写を誘導する^４，５。活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞は、インターロイキン２（ＩＬ－２）、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αなどの様々な炎症性サイトカインを産生することにより、ウイルス性抗原、細菌性抗原、癌抗原などを発現する標的細胞を殺すことができる。分泌されたＩＬ－２は、Ｔ細胞上のＩＬ－２受容体に結合し、より多くのＩＬ－２の産生を促し、Ｔ細胞の増殖を促進するという正のフィードバックループをもたらす^５，６。

【0411】

現在までに、癌免疫療法が進行した腫瘍を治療する最も有効な方法の一つであることが示されている。多くの免疫療法的手法は、細胞傷害性Ｔ細胞の殺傷能力を利用している^７，８。その一例が、腫瘍の微小環境下でＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞傷害性活性を抑制する、免疫チェックポイント分子ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１の阻害である^９，１０。チェックポイント阻害は、非同義変異が多く見られる癌^１１、例えばメラノーマ^{１２，１３}や非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）^{１４，１５}などで最も有効な、拡張性のある一般的な投与型の治療法である。さらに、インビトロで増殖させ、ＩＬ－２を添加した自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子細胞移植は、メラノーマ^{１６，１７}や子宮頸癌^{１８，１９}で治癒の可能性を示している。しかし、腫瘍抗原特異的ＴＩＬは末端分化型Ｔ細胞であることが多く、インビトロでの増殖過程において、短期間で消失する可能性がある^７，２０。

【0412】

前述した免疫療法はいずれも、腫瘍の退縮に関与する腫瘍抗原反応性ＴＣＲを同定するものではない。それらのＴＣＲを検出することは、腫瘍抗原に対するＴＣＲを持つＴ細胞を遺伝子工学的に作製するのに有用である。このような治療法はＴＣＲ遺伝子治療と呼ばれ、所望の抗原特異性を持つ「適合」Ｔ細胞を大量に生成できるため、他の免疫療法的な戦略よりも有利である^２１。腫瘍抗原には、非自己抗原と自己抗原がある^７，２１。自己抗原はこれまで、癌ワクチン試験の主な対象であったが、おそらく自己抗原に対する中枢性免疫寛容が原因で、これらの試験では効果が認められなかった^２２。しかしながら、異常に発現した自己抗原を標的としたＴＣＲ遺伝子治療試験の中には、臨床的な有効性を示すものがあった。例えば、滑膜細胞肉腫やメラノーマの患者では、癌の生殖系列であるＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープを標的とすることで、治癒の可能性が示されている^２３。しかしながら、腫瘍に関連した自己抗原を標的とすることは、しばしば重篤なオン・ターゲット毒性を引き起こすため^{２４，２５}、非自己抗原を標的とする免疫療法の必要性が指摘されている。そのような型の一つとして、突然変異由来の新生抗原がある^{７，８，２１}。

【0413】

新生抗原は非同義の体細胞突然変異から生じ、その結果、健康な組織には存在しない新規ポリペプチドが生成される。このことによって、新生抗原が免疫療法の標的として有用であり、健康な組織には全く存在しないため、オン・ターゲット毒性を防ぐことができると考えられる。さらに、新生抗原特異的Ｔ細胞の発見は、親和性の高い自己抗原反応性Ｔ細胞に対する中枢性免疫寛容に影響されることもない。新生抗原の多くは、悪性細胞の生存にいかなる利点をも与えないパッセンジャー遺伝子の変異から発生する。これらの変異は通常、各患者に固有のものであるため、新生抗原を標的とした治療には、ゲノム解読の手法を伴う個別化治療が必要である^８，２６。

【0414】

近年開発された全エクソーム解析（ＷＥＳ）とＲＮＡ配列決定により、新生抗原反応性Ｔ細胞がＴＩＬに存在し、腫瘍の退縮を媒介している可能性が明らかになってきた^{２７，２８}。例えば、高い特異性と感度を持つペプチド－ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）多量体と組み合わせたＷＥＳ^２９により、メラノーマ患者のＴＩＬ材料からの新生抗原特異的Ｔ細胞の同定に至った^{１３，３０}。この方法は拡張性が高いにもかかわらず、ＨＬＡ対立遺伝子のカバー数の限界に依存し、ｐＭＨＣの結合を予測するアルゴリズムが必要とする。これらの制限によって、一部の新抗原反応性ＴＣＲが見落とされる可能性がある。ｐＭＨＣ多量体の限界を回避するために、質量分析を用いてＭＨＣ結合新生抗原を同定する研究がなされている。この手法とＷＥＳおよび、参照としてトランスクリプトーム配列決定を組み合わせることで、マウス腫瘍細胞株における新生抗原の発見につながった^３１。しかし、この方法は処理量が少なく、偽陰性になることも多い^８。前述の方法を使うことで、複数の新生抗原特異的ＴＣＲを同時に同定できる可能性があるにもかかわらず、そのようなＴＣＲを発見するための、より拡張性が高く、感度の高いプラットフォームが今なお必要とされている。

【0415】

新生抗原特異的ＴＣＲの同定は、拡張性が高く、低侵襲な遺伝子スクリーニング手法を適用することにより達成される。少量の非生存性の保管腫瘍組織が、ＴＩＬの代わりに腫瘍内ＴＣＲ配列の供給源として使用される。次に、レトロウイルス遺伝子導入により、同定された腫瘍内ＴＣＲのライブラリーをジャーカットレポーターＴ細胞株と呼ばれる不死化Ｔリンパ球細胞株に導入する。ＴＣＲライブラリーを発現するジャーカット細胞（エフェクター細胞、略してＥ）を濃縮し、その後、ムタノームを発現する患者由来ＡＰＣ（標的細胞、略してＴ）に対する反応性についてスクリーニングする。フローサイトメトリーソーティングの後、ジャーカット細胞を、細胞増殖および下流のシグナル伝達に関与する^３２初期Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９の発現に基づいて選択する。最終段階として、新生抗原特異的ＴＣＲを次世代シークエンシングによって同定する。いくつかの態様では、現在のＴＣＲ単離プラットフォームでは、１０，０００のＴＣＲのライブラリーをスクリーニングすることができる。前述した手法に沿って、実施例１９では、この手法を支持するさらなる結果および証拠を提供する。

【0416】

ＴＣＲの選択は、多数の方法によって達成することができる。バリアントの濃縮は、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを含むがこれらには限定されない好適な分析ツールを用いて決定することができる。バリアントの濃縮は、レポーターＴ細胞とＴＭＧを発現するＢ細胞とを接触させた上位と下位の対と、レポーターＴ細胞とＴＭＧを発現するように操作されていないＢ細胞とを接触させた上位と下位の対とを対比させることを含んでもよい。バリアントの濃縮は、ＤＥＳｅｑ２ワルド検定統計量に基づいて、ＴＣＲの組み合わせを降順に順位付けすることを含んでもよい。バリアントの濃縮は、より高い順位のＴＣＲの組み合わせについて、ボンフェローニ補正ｐ値に基づいて統計的有意性を決定することを含んでもよい。少なくとも１つのＴＣＲの組み合わせの選択は、補正されたｐ値および他の統計的指標に基づくものであってよい。本実施例の手順は、ＴＣＲ反応性の感度を高めるために、単一の反復実験において実行してもよいし、二回の反復実験で、三回の反復実験でまたは三回以上の反復実験において実行してもよい。反復実験の回数は、ＴＭＧを発現するＡＰＣとの共培養に由来する試料の場合と、ＴＭＧを発現するように操作されていないＡＰＣとの共培養に由来する試料の場合で変化させてもよい。これらの選択肢はいずれも、本明細書で提供される任意の方法と組み合わせることができる。

【0417】

本開示の態様は、以下の実施例においてさらに説明されるが、これらは説明のためにのみ提供されるものであり、請求する発明の主題をいかなる形でも制限することを意図していない。

【実施例】

【0418】

実施例１

【0419】

本実施例では、新生抗原特異的ＴＣＲ配列を同定するために、非生存性腫瘍標本からＴＣＲレパトアを回収することを説明する。

【0420】

新鮮凍結腫瘍標本または固定標本、ホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍標本からＤＮＡまたはＲＮＡを単離し、これらを使用して、ＴＣＲα鎖およびβ鎖のバルク配列決定を実施する。特定のＴＣＲ鎖（の一部）のアミノ酸配列をコードする核酸分子の絶対数を、「固有の分子識別子」（ＵＭＩ）を用いて固有の分子の数に基づいて決定する。あるいは、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列決定にＵＭＩを含めず、ＴＣＲ鎖の頻度をＵＭＩ数ではなく、次世代シーケンサーのリード数に基づいて測定する。例えば腫瘍内ＴＣＲ鎖の存在量などの基準を適用することで、同定したＴＣＲ配列の全セットからＴＣＲα鎖およびβ鎖の定義されたセットを選択する。その後、選択したＴＣＲα鎖およびβ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ断片を、それぞれ、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成によって生成する。ＲＮＡ断片は標準的な技術でｃＤＮＡに変換することができる。選択したすべてのＴＣＲα鎖およびβ鎖を、コンビナトリアルペアリングによって、ＴＣＲαβ遺伝子をコードする単一の発現構築物とすることで、腫瘍内ＴＣＲαβ対の元のレパトアの定義された部分を再現する。単一の発現構築物は、単一のＴＣＲα鎖およびβ鎖の所与の組み合わせを発現させるために使用することができる。あるいは、ＴＣＲα鎖およびβ鎖は、別々の発現構築物から発現させることができる。ウイルスベクターを含む、任意の好適な発現ベクターを使用することができる。安定した発現のためには、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターまたは粒子類を使用する。結果として生じたＴＣＲαβ遺伝子のライブラリーを、レポーターＴ細胞のプールで発現させる。ライブラリー発現Ｔ細胞を新生抗原刺激によって活性化し、Ｔ細胞活性化マーカーに基づいて新生抗原特異的Ｔ細胞を濃縮する。その後、抗原刺激を行わなかった試料と比較した、抗原刺激を行った試料での濃縮度によって、発現した新生抗原特異的ＴＣＲαβ遺伝子を同定する。同定したＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子のセットを、癌治療のための新生抗原特異的Ｔ細胞の操作に利用する。
実施例２

【0421】

本実施例では、ＴＣＲαβライブラリーを生成するために、ＴＣＲレパトアを回収することを説明する。

【0422】

新鮮凍結標本、固定標本、ホルマリン固定／パラフィン包埋標本（ＦＦＰＥ）からＤＮＡまたはＲＮＡを単離し、これらを使用して、ＴＣＲα鎖およびβ鎖のバルク配列決定を実施する。特定のＴＣＲ鎖（の一部）のアミノ酸配列をコードする核酸分子の絶対数を、「固有の分子識別子」（ＵＭＩ）を用いて固有の分子の数に基づいて決定する。例えば、ＴＣＲ鎖の存在量などの基準を適用することで、同定したＴＣＲ配列の全セットからＴＣＲα鎖およびβ鎖の定義されたセットを選択する。その後、選択したＴＣＲα鎖およびβ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ断片を、それぞれ、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成によって生成する。ＲＮＡ断片は標準的な技術でｃＤＮＡに変換することができる。選択したすべてのＴＣＲα鎖およびβ鎖を、コンビナトリアルペアリングによってＴＣＲαβ遺伝子とすることで、ＴＣＲαβ対の元のレパトアの定義された部分を再現する。対合したＴＣＲα鎖とβ鎖は、選択したＴＣＲレパトアを含むＴＣＲαβライブラリーを表す。
実施例３

【0423】

本実施例では、回収したＴＣＲレパトアのライブラリーを利用した免疫療法による癌患者の治療について説明する。

【0424】

ＴＣＲレパトアを回収し、実施例１および２に概説した方法でＴＣＲαβライブラリーを作製する。ＴＣＲαβ遺伝子のライブラリーを、レポーターＴ細胞のプールで発現させる。新生抗原特異的Ｔ細胞を抗原刺激により活性化し、Ｔ細胞活性化に基づいて単離する。その後、発現した新生抗原特異的ＴＣＲαβ遺伝子を同定する。同定したＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子のセットを利用して、ＴＣＲ遺伝子をＴ細胞内で発現させることにより、癌治療のための新生抗原特異的Ｔ細胞を操作する。操作した新生抗原特異的Ｔ細胞を、癌を治療するための免疫療法として、癌患者に注入する。癌患者は、その患者のＴＣＲαβレパトアが配列決定された患者であっても、同じ新生抗原を保有または発現する癌を有する患者であってもよい。治療に使用される細胞は、自己由来であっても同種異系であってもよい。
実施例４

【0425】

本実施例では、感染症または自己免疫疾患の部位からＴＣＲレパトアを回収することを説明する。

【0426】

感染部位または自己免疫部位から得られた新鮮凍結標本、固定標本、ホルマリン固定／パラフィン包埋標本（ＦＦＰＥ）からＤＮＡまたはＲＮＡを単離し、これらを使用して、ＴＣＲα鎖およびβ鎖のバルク配列決定を実施する。例えば、ＴＣＲ鎖の存在量などの基準を適用することで、同定したＴＣＲ配列の全セットからＴＣＲα鎖およびβ鎖の定義されたセットを選択する。その後、選択したＴＣＲα鎖およびβ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ断片を、それぞれ、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成によって生成する。ＲＮＡ断片は標準的な技術でｃＤＮＡに変換することができる。選択したすべてのＴＣＲα鎖およびβ鎖を、ＴＣＲαβ遺伝子にコンビナトリアルペアリングすることで、ＴＣＲαβ対の元のレパトアの定義された部分を再現する。感染や自己免疫の部位で特定の抗原を検出できるＴ細胞のＴＣＲ配列を決定することにより、感染部位や自己免疫部位に関連した、あるいはそれらの部位に特異的なＴＣＲレパトアを回収することができる。

【0427】

結果として生じたＴＣＲαβ遺伝子のライブラリーを、レポーターＴ細胞のプールで発現させる。抗原特異的Ｔ細胞を抗原刺激により活性化し、Ｔ細胞活性化に基づいて単離する。その後、発現した抗原特異的なＴＣＲαβ遺伝子を同定する。同定したＴＣＲ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子のセットを、感染症または自己免疫疾患の診断または治療に利用する。
実施例５

【0428】

本実施例では、ＴＣＲプラスミドを人工的に混合して生成したＴＣＲライブラリーから、抗原特異的ＴＣＲを回収することを説明する。

【0429】

ＴＣＲ発現カセットを、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性の形式で生成する（図６にＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性カセットの模式図を示す；このような形式で発現したＴＣＲの例として、配列番号１、図３２、図４０を提供する）。複数のＴＣＲライブラリーを、１つの新生抗原特異的ＴＣＲと種々の非関連ＴＣＲを様々な比率で混合することによって生成する。結果として生じたＴＣＲライブラリーは、１つのＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１拘束性の新生抗原特異的ＴＣＲを１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００の頻度で含む。新生抗原特異的ＴＣＲを１：１０の頻度で含むＴＣＲライブラリーを作製するために、レトロウイルス発現ベクター中で新生抗原特異的ＴＣＲをコードする１つのプラスミドコピーを、それぞれ特異性が異なるＴＣＲをコードする９つの他のレトロウイルスベクターそれぞれに対する１つのプラスミドコピーと混合する。したがって、レトロウイルス発現ベクター中で新生抗原特異的ＴＣＲをコードする１つのプラスミドコピーを、それぞれが特異性の異なる別のＴＣＲをコードしている９つの他のレトロウイルスベクターのそれぞれについて、１、１１、１１１および１，１１１プラスミドコピーと混合して、それぞれ１：１０、１：１００、１：１，０００および１：１０，０００の頻度で新生抗原特異的ＴＣＲを含むＴＣＲライブラリーを得る。

【0430】

いくつかの態様では、配列番号１をコードする任意の１つ以上の核酸を用いることができる。いくつかの態様では、５つの特徴が分かっているＴＣＲを、１：１６、１：１００、１：２５００、および１：１０，０００の頻度で混合することによって、前述したものを変化させることが可能である。最後に、混合には、９つの他のＴＣＲプラスミドではなく、２４の他のＴＣＲプラスミドを使用することができる。

【0431】

それぞれのＴＣＲライブラリーを、当業者に知られている方法により、フェニックス－広宿主性（Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ａｍｐｈｏ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１３）などの広宿主性ウイルス産生細胞に別々に形質移入する。結果として生じたレトロウイルスビリオンを使用して、ジャーカットレポーターＴ細胞株を形質転換する。ジャーカットレポーターＴ細胞株は、内因性ＴＣＲ発現を欠くもので（例えば、メザドラ（Ｍｅｚｚａｄｒａ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１７に記載）、当業者に知られている方法でＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように修飾する。ジャーカットレポーターＴ細胞を、ＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞の頻度を全Ｔ細胞の２５～３０％に制限するために、個別のＴＣＲライブラリーを低いＭＯＩで形質転換する。ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性導入遺伝子を発現するように修飾したジャーカットＴ細胞を、形質導入後に細胞培養にピューロマイシンを添加して正に選択する。遺伝子組換え細胞の抗生物質選択は、当業者に既知である。

【0432】

いくつかの態様では、配列番号２（図３３）をコードする任意の１つ以上の核酸を用いることができる。図４１では、配列番号２、すなわち、ＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子を示す。

【0433】

当業者であればさらに、本明細書に記載の方法は、例えばＦＡＣＳによるＴＣＲ導入細胞の選別や磁気ビーズの使用に基づく選別など、ピューロマイシンを使用しない選別を含み得ることを理解する。したがって、ＴＣＲカセットは、ピューロマイシン選択遺伝子を欠いていてもよい。

【0434】

ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞を、組換えＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１－ＩＲＥＳ－フュージョンレッド導入遺伝子を発現する抗原負荷Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１－ＩＲＥＳ－フュージョンレッド；配列番号３；図３４、図４２）で刺激する。導入遺伝子を発現するＫ５６２細胞の生成については記載があり（例えば、ヒラノ（Ｈｉｒａｎｏ）ら、臨床癌研究（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ）、２００６；バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、インターナショナル・イムノロジー（Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ）、２０１０；バトラーら、臨床癌研究、２００７；ローレンス（Ｌｏｒｅｎｚ）ら、ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、２０１７）、当業者に知られている。ペプチド負荷Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ａ２細胞は、３７℃で９０分間、目的のペプチドでパルスし、その後洗浄することによって得られる。当業者であれば、本明細書に記載のペプチド提示ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性Ｋ５６２細胞株を、他のＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性抗原提示細胞で置換してもよいことを理解する。あるいは、変異形態（ＨＬＡ－Ａ０２^＊０１導入Ｋ５６２細胞におけるＴＭＧの発現）を使用することができる。

【0435】

各ＴＣＲライブラリーには、以下の刺激条件をそれぞれ使用する。
１．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの新生抗原ペプチドを負荷した４ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
２．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの新生抗原ペプチドを負荷した８ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。

【0436】

その後、共培養物を採取し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色する。ＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＡＲＩＡフュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）フローサイトメトリーソーターを用いて、以下の集団をそれぞれの刺激条件に関して選別する。
１．生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、高ＣＤ６９（高ＣＤ６９は、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づく、生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性細胞のうちの上位５～５０％を含む）。
２．生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、低ＣＤ６９（低ＣＤ６９は、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づく、生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性細胞のうちの下位５～５０％を含む）。

【0437】

あるいは、各ＴＣＲライブラリーに、以下の刺激条件をそれぞれ用いることができる。
１．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの新生抗原ペプチドを負荷した４ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
２．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの新生抗原ペプチドを負荷した８ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
３．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの無関係な対照ペプチドを負荷した４ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
４．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの無関係な対照ペプチドを負荷した８ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。

【0438】

その後、共培養物を採取し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色する。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、それぞれの試料について、生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、ＣＤ６９陽性細胞を選別する。

【0439】

選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これをＰＣＲの鋳型として使用し、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットの一部を増幅する。得られたＰＣＲ産物の大きさは約１．５ｋｂで、オックスフォードナノポアミニオン（ＭｉｎＩｏｎ）シーケンサーで配列決定し、選別したＴ細胞集団（低ＣＤ６９および高ＣＤ６９またはＣＤ６９陽性）に含まれる新生抗原特異的ＴＣＲ配列の相対的な存在量を比較することができる。

【0440】

いくつかの態様では、オックスフォードナノポアミニオンシーケンサーは、他の配列決定機器に置き換えてもよく、または他の配列決定戦略を用いることもできる。
実施例６

【0441】

本実施例では、遺伝子合成により生成したＴＣＲライブラリーから、抗原特異的ＴＣＲを回収することを説明する。

【0442】

遺伝子合成により、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１拘束性の新生抗原特異的ＴＣＲを２つ含む複数のＴＣＲライブラリーを生成する。そのために、新生抗原特異的ＴＣＲに由来する２つのＴＣＲα鎖断片と２つのＴＣＲβ鎖断片、および特異性が異なるＴＣＲに由来する９８のＴＣＲα鎖断片と９８のＴＣＲβ鎖断片を合成する。あるいは、５＋９５のＴＣＲを用いることも可能である。その後、得られた断片を使用して、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα形式のＴＣＲ発現カセットを含むＴＣＲライブラリーを生成する。ライブラリー生成のために、選択した全てのＴＣＲαおよびＴＣＲβ断片を混合し、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットをコードする連続した核酸分子に接合する。重要なことに、１つのＴＣＲカセットにつき、ＴＣＲβ断片とＴＣＲα断片を１つだけ結合させることができる。異なる数のＴＣＲαとＴＣＲβ断片を選択して混合することにより、異なる複雑度を持つＴＣＲライブラリーを作製することができる。
１．新生抗原特異的ＴＣＲに由来する２つのＴＣＲα鎖断片と２つのＴＣＲβ鎖断片によって、複雑度４（４種類のＴＣＲαβ対）のＴＣＲライブラリーが作製される。
２．新生抗原特異的ＴＣＲに由来する２つのＴＣＲα鎖断片と２つのＴＣＲβ鎖断片、および特異性が異なるＴＣＲ由来に由来する８つのＴＣＲα鎖断片と８つのＴＣＲβ鎖断片によって、複雑度１００（１００種類のＴＣＲαβ対）のＴＣＲライブラリーが作製される。
３．新生抗原特異的ＴＣＲに由来する２つのＴＣＲα鎖断片と２つのＴＣＲβ鎖断片、および特異性が異なるＴＣＲに由来する４８のＴＣＲα鎖断片と４８のＴＣＲβ鎖断片によって、複雑度２５００（２５００種類のＴＣＲαβ対）のＴＣＲライブラリーが作製される。
４．新生抗原特異的ＴＣＲに由来する２つのＴＣＲα鎖断片と２つのＴＣＲβ鎖断片、および特異性が異なるＴＣＲ由来する９８のＴＣＲα鎖断片と９８のＴＣＲβ鎖断片によって、複雑度１０，０００（１０，０００種類のＴＣＲαβ対）のＴＣＲライブラリーがが作製される。

【0443】

あるいは、選択肢として、ＴＣＲα鎖断片とＴＣＲｂ鎖断片に関する設計を、４＋０、５＋５、５＋４５および５＋９５とすることができる。

【0444】

結果として生じたＴＣＲライブラリーは、ＴＣＲ発現カセットを、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性の形式で（配列番号１、図４０）含むことになる。

【0445】

それぞれのＴＣＲライブラリーを、当業者に知られている方法により、フェニックス－広宿主性（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１３）などの広宿主性ウイルス産生細胞に別々に形質移入する。結果として生じたレトロウイルスビリオンを使用して、ジャーカットレポーターＴ細胞株を形質転換する。ジャーカットレポーターＴ細胞株は、内因性ＴＣＲ発現を欠くもので（例えばメザドラら、ネイチャー、２０１７に記載）、当業者に知られている方法でＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように修飾する。ジャーカットレポーターＴ細胞を、ＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞の頻度を全Ｔ細胞の２５～３０％に制限するために、個別のＴＣＲライブラリーを低いＭＯＩで形質転換する。ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性導入遺伝子を発現するように修飾したジャーカットＴ細胞を、形質導入後に細胞培養にピューロマイシンを添加して正に選択する。遺伝子組換え細胞の抗生物質選択は、当業者に既知である。

【0446】

当業者であればさらに、本明細書に記載の方法は、例えばＦＡＣＳによるＴＣＲ導入細胞の選別や磁気ビーズの使用に基づく選別など、ピューロマイシンを使用しない選別を含み得ることを理解する。したがって、ＴＣＲカセットは、ピューロマイシン選択遺伝子を欠いていてもよい。

【0447】

ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞を、組換えＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１－ＩＲＥＳ－フュージョンレッド導入遺伝子を発現する抗原負荷Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１－ＩＲＥＳ－フュージョンレッド；配列番号３）で６時間刺激する。導入遺伝子を発現するＫ５６２細胞の生成については記載があり（例えば、ヒラノら、臨床癌研究、２００６；バトラーら、インターナショナル・イムノロジー、２０１０；バトラーら、臨床癌研究、２００７；ローレンスら、ヒト遺伝子治療、２０１７）、当業者に知られている。ペプチド負荷Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ａ２細胞は、３７℃で９０分間、目的のペプチドでパルスし、その後洗浄することによって得られる。当業者であれば、本明細書に記載のペプチド提示ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性Ｋ５６２細胞株を、他のＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性抗原提示細胞で置換してもよいことを理解するであろう。

【0448】

以下の刺激条件を使用する。
１．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの新生抗原ペプチドを負荷した４ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
２．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの新生抗原ペプチドを負荷した８ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。

【0449】

その後、共培養物を採取し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色する。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、以下の集団をそれぞれの刺激条件に関して選別する。
１．生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、高ＣＤ６９（高ＣＤ６９は、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づく、生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性細胞のうちの上位５～６０％を含む）。
２．生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、低ＣＤ６９（低ＣＤ６９は、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づく、生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性細胞のうちの下位５～５０％を含む）。

【0450】

あるいは、各ＴＣＲライブラリーに、以下の刺激条件をそれぞれ用いることができる。
１．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１ｕｇの新生抗原ペプチドを負荷した４ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
２．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの新生抗原ペプチドを負荷した８ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
３．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの無関係な対照ペプチドを負荷した４ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
４．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの無関係な対照ペプチドを負荷した８ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。

【0451】

その後、共培養物を採取し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色する。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、それぞれの試料について、生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、ＣＤ６９陽性細胞を選別する。

【0452】

選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これをＰＣＲの鋳型として使用し、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットの一部を増幅する。得られたＰＣＲ産物の大きさは約１．５ｋｂで、オックスフォードナノポアミニオンシーケンサーで配列決定し、選別したＴ細胞集団（低ＣＤ６９および高ＣＤ６９またはＣＤ６９陽性）に含まれる新生抗原特異的ＴＣＲ配列の相対的な存在量を比較することができる。

【0453】

いくつかの態様では、オックスフォードナノポアミニオンシーケンサーは、他の配列決定機器に置き換えてもよく、または他の配列決定戦略を用いてもよい。
実施例７

【0454】

本実施例では、新鮮凍結メラノーマ病巣から生成したＴＣＲライブラリーから、新生抗原特異的ＴＣＲを回収することを説明する。

【0455】

新鮮な凍結メラノーマ標本からＤＮＡとＲＮＡを単離し、２つの目的のために使用する。

【0456】

第一に、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを単離し、これらを使用して、ＴＣＲα鎖およびβ鎖のバルク配列決定を実施する。特定のＴＣＲ鎖（の一部）のアミノ酸配列をコードする核酸分子の絶対数を、「固有の分子識別子」（ＵＭＩ）を用いて固有の分子の数に基づいて決定する。別の方法として、リード数を使用することもできる。得られたＴＣＲ鎖配列のコレクションを、ＴＣＲα鎖配列のコレクションとＴＣＲβ鎖配列のコレクションとに分ける。ＴＣＲセグメントがアミノ酸配列レベルで読み取り枠から外れて結合している、および／または停止コドンが導入されている、および／またはフレームシフト変異が存在する、および／または欠陥のあるスプライシング部位が存在する、任意の非生産的ＴＣＲ鎖配列を、コレクションから除去する。各コレクションを、特定のＴＣＲ鎖をコードしている核酸分子の絶対数（あるいは、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲｂ鎖それぞれの総数に対する割合）のいずれかを用いて降順に並び替え、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の順位を決定する。最も多く存在する上位１００のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を選択し、ＤＮＡ合成によって断片として生成する。ライブラリー生成のために、選択した全てのＴＣＲαおよびＴＣＲβ断片を混合し、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットをコードする連続した核酸分子に接合する。重要なことに、１つのＴＣＲカセットにつき、ＴＣＲβ断片とＴＣＲα断片を１つだけ結合させることができる。結果とした生じるＴＣＲライブラリーは、約１０，０００のＴＣＲ発現カセットを、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－ピューロマイシン耐性の形式で（配列番号１）含むことになる。

【0457】

第二に、腫瘍由来の組織および健常組織のＤＮＡとＲＮＡを使用して、全エクソーム解析（ＷＥＳ）によって腫瘍特異的変異のセットを決定し、ＲＮＡ配列決定を利用して発現している変異遺伝子のセットを確立する。複数の腫瘍由来変異ペプチドを縦列の配置でコードする縦列ミニ遺伝子（ＴＭＧ）構築物を生成することができる。ＴＭＧ構築物を使用して、転写ｍＲＮＡをインビトロで生成する（例えば、ステバノフ（Ｓｔｅｖａｎｏｖｉ）ら、サイエンス、２０１７）。あるいは、ＴＭＧ発現構築物を、Ｂ細胞（ＡＰＣ）のウイルス産生／形質導入に使用することができる。

【0458】

これと並行して、メラノーマ患者由来の適合する自己血液を用いて、不死化Ｂ細胞を作製する。ＥＢＶを用いたヒトＢ細胞の不死化は、当業者に知られている（例えば、トラギアイ（Ｔｒａｇｇｉａｉ）ら、分子生物学の手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ）、２０１２）。不死化された自己Ｂ細胞を、ＴＭＧ－ｍＲＮＡを用いたＢ細胞のエレクトロポレーションによって抗原を発現するＢ細胞を生成するために用いる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）のエレクトロポレーションについてはこれまでにも記載があり、当業者に知られている。当業者であれば、他の方法もまた、自己のＢ細胞を不死化し、そのような自己の不死化Ｂ細胞によって抗原発現を誘導することを可能にすることを理解する。例えば、ペプチドによるパルス化、ＴＭＧをコードするＤＮＡプラスミドによる形質移入またはＴＭＧをコードするウイルス粒子による形質導入が挙げられる。

【0459】

ＴＣＲライブラリーを、当業者に知られている方法により、フェニックス－広宿主性（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１３）などの広宿主性ウイルス産生細胞に形質移入する。結果として生じたレトロウイルスビリオンを使用して、ジャーカットレポーターＴ細胞株を形質転換する。ジャーカットレポーターＴ細胞株は、内因性ＴＣＲ発現を欠くもので（例えば、メザドラら、ネイチャー、２０１７に記載）、当業者に知られている方法でＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように修飾する。ジャーカットレポーターＴ細胞を、ＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞の頻度を全Ｔ細胞の２５～３０％に制限するために、ＴＣＲライブラリーを低いＭＯＩで形質転換する。ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性導入遺伝子を発現するように修飾したジャーカットＴ細胞を、形質導入後に細胞培養にピューロマイシンを添加して正に選択する。遺伝子組換え細胞の抗生物質選択は、当業者に既知である。当業者であればさらに、本明細書に記載の方法は、例えばＦＡＣＳによるＴＣＲ導入細胞の選別や磁気ビーズの使用に基づく選別など、ピューロマイシンを使用しない選別を含み得ることを理解する。したがって、ＴＣＲカセットは、ピューロマイシン選択遺伝子を欠いていてもよい。

【0460】

ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞を、以下の条件で、抗原を負荷したＢ細胞によって６時間刺激する。
１．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、４ｅ^７抗原負荷自己Ｂ細胞で刺激する。
２．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、４ｅ^７の自己Ｂ細胞で刺激する。

【0461】

その後、共培養物を採取し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色する。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、以下の集団をそれぞれの刺激条件に関して選別する。
１．生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、高ＣＤ６９（高ＣＤ６９は、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づく、生存細胞、単一細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性細胞のうちの上位５～５０％を含む）。
２．生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、低ＣＤ６９（低ＣＤ６９は、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づく、生存細胞、単一細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性細胞のうちの下位５～５０％を含む）。

【0462】

あるいは、各ＴＣＲライブラリーに、以下の刺激条件をそれぞれ用いることができる。
１．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの新生抗原ペプチドを負荷した４ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
２．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの新生抗原ペプチドを負荷した８ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
３．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの無関係な対照ペプチドを負荷した４ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。
４．４ｅ^７のＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を、１μｇの無関係な対照ペプチドを負荷した８ｅ^７のＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ２で刺激する。

【0463】

その後、共培養物を採取し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色する。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、それぞれの試料について、各サンプルについて、生細胞、単細胞、ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、ＣＤ６９陽性細胞を選別する。

【0464】

選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これをＰＣＲの鋳型として使用し、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットの一部を増幅する。得られたＰＣＲ産物の大きさは約１．５ｋｂで、オックスフォードナノポアミニオンシーケンサーで配列決定し、選別したＴ細胞集団（低ＣＤ６９および高ＣＤ６９またはＣＤ６９陽性）に含まれる新生抗原特異的ＴＣＲ配列の相対的な存在量を比較することができる。

【0465】

いくつかの態様では、オックスフォードナノポアミニオンシーケンサーは、いくつかの他の配列決定機器に置き換えてもよく、または他の配列決定戦略を用いてもよい。
実施例８

【0466】

本実施例では、遺伝子合成を用いたＴＣＲレパトアの作製について説明する。

【0467】

ＴＣＲは、図３に示すような設計のカセットとして発現させることができる。このようなＴＣＲカセットを大量に合成するために、各ＴＣＲ鎖の超可変部を断片として、例えばＣＤＲ３－Ｊセグメントなどとして、合成する。その他の構成要素は「市販の」構成単位とすることができる。目的のＴＣＲ鎖をすべて再現するために、可変／固有の断片を合成し、「市販の」構成単位と混合する。その原理を図７に図示する。その後、すべての構成要素を混合し、組み立てることによって、図３に図示するようなＴＣＲカセットが作製される。この組み立ては、特定の配列の突出によって制御される。つまり、特定のＣＤＲ３－Ｊセグメントは、異なる断片間の配列の重なりによって、特定のＶセグメントにのみ融合し、すべてのＴＣＲカセットは最終的にＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαの形式になる。すべてのＴＣＲαはすべてのＴＣＲβ断片と対合する可能性がある。最後に、全てのＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットを発現ベクターにクローニングする。状況によっては、Ｖ－ＣＤＲ３－Ｊ（α鎖とβ鎖の両方）を可変部分として、Ｃβ－Ｐ２Ａを市販の構成単位として使用してもよい。

【0468】

あるいは、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαの任意のおよび全ての可能な組み合わせを、遺伝子合成によって完全に生成する。このようにして、すべてのＴＣＲα断片とＴＣＲβ断片をコンビナトリアルに対合させることが可能である。

【0469】

さらに別の方法としては、前述したように、コンビナトリアル合成または遺伝子合成によってＴＣＲα断片およびＴＣＲβ断片を生成する方法がある。しかしながら、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットを生成する代わりに、得られたＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のコレクションを別々の発現ベクターにクローニングする。すべてのＴ細胞が平均して１つのＴＣＲαと１つのＴＣＲβを発現するように細胞をベクターコレクションで修飾することで、前述したコンビナトリアルペアリングに類似したものとなる。

【0470】

別の方法として、ＴＣＲαおよびＴＣＲβのみを使用する代わりに、ＣＤ３εもしくはＣＤ３ζシグナルドメインを単独でまたはＣＤ２８シグナルドメインとの組み合わせで融合させた一本鎖ＴＣＲ構築物などの、修飾したＴＣＲを用いることができる。
実施例９

【0471】

本実施例では、ＴＣＲレパトアからＴＣＲαβ対を同定することを説明する。

【0472】

生成したＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾したＴ細胞のプールを、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞で刺激し、ＴＣＲ単離用の少なくとも１つの活性化マーカーに基づいて、抗原反応性Ｔ細胞を単離する。あるいは、Ｔ細胞のプールを、細胞増殖を追跡するのに適した蛍光色素で標識し、少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲ単離用の増殖に基づいて、抗原反応性Ｔ細胞を単離する。活性化Ｔ細胞の精製は、抗体標識し、それに続いて、フローサイトメトリーソーティング、磁気ビーズに基づく選択、または他の任意の抗体結合に基づく選択方法に基づいて単離することによって、達成することができる。

【0473】

さらに別の方法では、生成したＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾したＴ細胞のプールを、少なくとも２つの試料に分割する。試料を、少なくとも１つの目的の抗原を発現しているかまたは発現していない抗原提示細胞によって刺激する。刺激後、両方のＴ細胞集団を一定期間インキュベートし、次いで、両方のＴ細胞集団をＴＣＲ分離によって分析する。両方の試料から得られたＴＣＲαβ対を比較することで、少なくとも１つの抗原に曝露された試料においてより豊富に含まれているＴＣＲ遺伝子を同定する。増殖は、ＣＦＳＥやセルトレースバイオレット（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅｒ Ｖｉｏｌｅｔ）などの蛍光色素の希釈の検出に基づいて、検出することができる。増殖している細胞を、フローサイトメトリーによって、希釈された蛍光シグナルに基づいて選別する。

【0474】

さらなる方法では、生成したＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾されたＴ細胞のプールを、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、ＴＣＲの誘発を示す少なくとも１つのレポーター遺伝子、例えばＮＦＡＴ－ＧＦＰまたはＮＦＡＴ－ＹＦＰに基づいて、抗原反応性Ｔ細胞を単離する。

【0475】

さらに別の方法では、生成したＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾したＴ細胞のプールを、少なくとも１つの目的の抗原を提示する抗原提示細胞によって刺激し、そして抗原反応性Ｔ細胞を、ＴＣＲのシグナル伝達に際して獲得される抗生物質耐性に基づく抗原特異的Ｔ細胞の選択を使用して、例えばＮＦＡＴ－ピューロマイシン導入遺伝子の使用によって、ＴＣＲ単離用に単離する。あるいは、修飾したＴ細胞のプールを、目的の抗原を担持する１つ以上のＭＨＣ複合体に曝露する。ＴＣＲ単離用に、ＭＨＣ複合体に結合したＴ細胞を単離する。ＭＨＣ複合体との結合に基づく単離は、フローサイトメトリーソーティングまたは磁気ビーズ濃縮によって実施することができる。

【0476】

前述したいずれの方法においても、ＴＣＲ単離は、（ｉ）バルクの抗原反応性Ｔ細胞からＤＮＡまたはＲＮＡを分離してＴＣＲαβ特異的ＰＣＲ産物を生成し、これをＤＮＡ配列決定またはＲＮＡ配列決定によって分析して、抗原反応性Ｔ細胞のＴＣＲαβ遺伝子配列を決定すること、または（ｉｉ）単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲもしくは微少流体的手法によって、分析した単一のＴ細胞において発現するＴＣＲαβ遺伝子配列を分析すること、によって達成することができる。このようにして、ＴＣＲαβの転写物が活性化マーカーのレベルの上昇と共発現するＴ細胞のプールに含まれる単一のＴ細胞を検出する。

【0477】

さらなる方法では、生成したＴＣＲαβ対のライブラリーで修飾したＴ細胞のプールを、少なくとも１つの目的の抗原を発現する抗原提示細胞によって刺激する。その後、単一細胞の使用に基づくドロップレットＰＣＲまたは微少流体的手法を使用して目的のＴＣＲαβ対を同定し、ＴＣＲ単離と少なくとも１つの活性化マーカーの転写レベルでの検出とを組み合わせる。それにより、ＴＣＲαβの転写物が１つ以上の活性化マーカーのレベルの上昇と共発現するＴ細胞のプールに含まれる単一のＴ細胞を検出する。
実施例１０

【0478】

本実施例では、バリアントＴＣＲαおよびＴＣＲβポリペプチドをコードする核酸配列のコンビナトリアルライブラリーから、機能的なＴＣＲα／ＴＣＲβの組み合わせを同定するスクリーニング方法について説明する。

【0479】

非生存性腫瘍から新生抗原特異的ＴＣＲを同定するために、腫瘍由来のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のコンビナトリアルアセンブリーによってＴＣＲライブラリーを生成する過程を開発した。これらのＴＣＲ鎖を、腫瘍組織から単離したＤＮＡまたはＲＮＡのＴＣＲバルク鎖配列決定により同定する。ＴＣＲαβ対を約１．５ｋｂの導入遺伝子としてコードし、レポーター細胞に導入する。抗原を発現する細胞で刺激することによって、抗原反応性ＴＣＲαβの組み合わせを発現するレポーター細胞を、遺伝子変異ライブラリーのスクリーニングで選択することができる。コンビナトリアルアセンブリーを考慮すると、各ＴＣＲバリアントは、ＴＣＲαとＴＣＲβの両方の可変配列を決定することによってのみ、明確に同定することができる。したがって、遺伝子スクリーニング中に単離されたレポーター細胞にコードされた導入遺伝子を、約１．５ｋｂのＰＣＲアンプリコンとして回収し、オックスフォードナノポアシーケンスにより全長を決定し、バイオインフォマティクス分析パイプラインによって分析する。

【0480】

この過程により、癌治療への適用可能性に関してさらに評価できるＴＣＲリード化合物を同定することができる。
１．バリアントヌクレオチド配列ライブラリーの生成

【0481】

本明細書に記載の１つ以上の例で説明したように、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を選択して、コンビナトリアルペアリングを行い、それによってＴＣＲバリアントの全セットを生成する。コンビナトリアルペアリングのため、所与のＴＣＲバリアントは、ＴＣＲαとＴＣＲβの可変配列を決定することによってのみ、明確に同定することができる。これには約１．５ｋｂのＰＣＲアンプリコンの配列決定を含めてもよい。
２．バリアントヌクレオチド配列ライブラリーのレポーター細胞への導入

【0482】

ステップ１で説明したコンビナトリアルＴＣＲライブラリーを、ウイルス産生細胞であるフェニックス－広宿主性細胞に形質移入し、ライブラリー中に存在する全てのＴＣＲバリアントをコードするレトロウイルスを産生する。続いて、このウイルスを用いて、内在性ＴＣＲの発現を欠くジャーカットＴ細胞を形質転換する。ＴＣＲライブラリーにはブラストサイジン選択マーカーがコードされており、ＴＣＲのプールを発現する形質転換されたレポーターＴ細胞を抗生物質で選択できるようになっている。
３．少なくとも１つの機能的特性に基づくレポーター細胞の選択

【0483】

様々なＴＣＲを発現するレポーターＴ細胞のポリクローナル混合物を低密度で播種し、その後、新生抗原の候補を発現する不死化Ｂ細胞と共培養する。レポーターＴ細胞の量は、すべてのＴＣＲバリアントが少なくとも１００の平均カバー数で表現されるような量である。その後、共培養物を採取し、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９の高発現または低発現のいずれかに基づくＦＡＣＳ選別に供する。これらそれぞれの「上位」および「下位」集団を採取し、さらに分析する。その他の活性化マーカーをＦＡＣＳ選別に使用してもよく、その場合は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＧＭ－ＣＳＦを、ＣＤ６９と置き換えるか、またはＣＤ６９と組み合わるかのいずれかによって、活性化レポーターＴ細胞を選択することができる。それに加えて、活性化した細胞を選択するために、様々なプロモーター活性レポーターを使用してもよい。
４．選択したレポーター細胞からのバリアントヌクレオチド配列の単離

【0484】

ゲノムＤＮＡを単離し、ＴＣＲをコードするレトロウイルス挿入物のＰＣＲ増幅に供した。ＰＣＲプライマーはレトロウイルスベクターとＴＣＲα鎖の定常領域にあり、その結果、約１５００塩基のアンプリコンが得られる。すべてのＴＣＲバリアントを少なくとも１００の平均カバー数で表現するのに十分な量のゲノムＤＮＡを使用する。特定のＴＣＲバリアントが偏って増幅されることを防ぐために、増幅は最小限に抑えられるが、ライブラリー中で表現される各ＴＣＲについて少なくとも１００００の平均カバー数を得る必要がある。ゲノムＤＮＡからのＴＣＲ増幅を、上位および下位試料の両方について実施する。
５．単離したバリアントヌクレオチド配列の全ヌクレオチド配列のうちの、少なくとも６００ｂｐの決定

【0485】

増幅されたＴＣＲ配列をさらに、オックスフォードナノポアシーケンス用に処理する。最初のＰＣＲ反応では、テール付きプライマーを使用する。これらのプライマーには、迅速な接着化学で修飾されるバーコード付きのより外側のプライマーを用いた２回目のＰＣＲ用の新しい結合部位が含まれる。上位試料と下位試料のＰＣＲには、それぞれ異なるバーコードを使用する。すべてのＰＣＲステップにおいて、特定のＴＣＲバリアントが偏って増幅されることを防ぐために、増幅は最小限に抑えられる。しかしながら、すべてのＴＣＲバリアントを少なくとも１００００の平均カバー数で表現するのに十分なＰＣＲ産物を使用する。

【0486】

あるいは前述した方法の代わりに、増幅したＴＣＲ配列を、オックスフォードナノポアシーケンス用にさらに処理する。最初のＰＣＲ反応では、ＴＣＲカセットをテールの付いていないプライマーで増幅する。次の回のＰＣＲでは、テール付きプライマーを使用する。これらのプライマーには、迅速な接着化学で修飾されるバーコード付きのより外側のプライマーを用いた３回目のＰＣＲ用の新しい結合部位が含まれる。上位試料と下位試料のＰＣＲには、異なるバーコードを使用する。すべてのＰＣＲステップにおいて、特定のＴＣＲバリアントが偏って増幅されることを防ぐために、増幅は最小限に抑えられる。しかしながら、すべてのＴＣＲバリアントを少なくとも１００００の平均カバー数で表現するのに十分なＰＣＲ産物を使用する。当業者であれば、別のＰＣＲ増幅戦略を用いてもよいことを理解するであろう。

【0487】

上位試料および下位試料由来のバーコード付きＰＣＲ産物を等モル比でプールし、最終段階でこのプールに高速１Ｄシークエンスアダプターを連結して、配列決定に適したライブラリー調製物を得る。このライブラリーをオックスフォードナノポアＲ９．４．１フローセルに負荷し、ライブラリー中でコードされる全てのＴＣＲについて、少なくとも１００リードの平均カバー数に至るまで配列決定を行う。

【0488】

バイオインフォマティクス分析には、オックスフォードナノポアグッピーツールキット（ｇｕｐｐｙ ｔｏｏｌｋｉｔ）を使用する。グッピー・ベースコーラー（ｇｕｐｐｙ＿ｂａｓｅｃａｌｌｅｒ）を使用して、生データからシーケンスリードを取得する。グッピー・バーコーダー（ｇｕｐｐｙ＿ｂａｒｃｏｄｅｒ）を使用して、試料を逆多重化する。あるいは、グリッドイオン（ＧｒｉｄＩｏｎ）に基づく配列決定では、ミンノウ（ＭｉｎＫｎｏｗ）ソフトウェアパッケージを使用して、逆多重化したシーケンスリードを取得する。配列リードを、グッピー・アライナー（ｇｕｐｐｙ＿ａｌｉｇｎｅｒ）を用いて個々のα鎖およびβ鎖の配列から構成される参照とアライメントし、得られたビーエイエム（ｂａｍ）形式のアライメントファイルから各リードのα鎖およびβ鎖の同一性を抽出する。最終ステップで、各ＴＣＲの出現頻度を計算し、さらなる分析に使用する。
６．少なくとも１つの目的のバリアントヌクレオチド配列の選択

【0489】

目的のバリアントヌクレオチド配列を同定するために、両細胞集団におけるバリアントのリードカウントによって決定される、正に選択される（マーカー分子陽性）レポーター細胞集団におけるバリアントの濃縮度と、負に選択される（マーカー分子陰性）レポーター細胞集団におけるバリアントの枯渇度を決定することにより、相対的な濃縮度に基づいてＴＣＲを選択する。
実施例１１

【0490】

本実施例では、バリアントＣＡＲタンパク質ドメインをコードする核酸配列のコンビナトリアルライブラリーから、機能的ＣＡＲバリアントを同定するためのスクリーニング方法について説明する。

【0491】

最適な機能的特性を持つＣＡＲの設計を明らかにするために、ＣＡＲ分子のドメインをコンビナトリアルな様式で組み立てることができる。ＣＡＲ分子は、（ｉ）抗原結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン（通常２～３のシグナル伝達モジュールで構成される）を含み、約１．５ｋｂの合成分子を形成する。ＣＡＲバリアントのライブラリーをレポーター細胞に導入し、抗原発現細胞で刺激することで、所望の活性化表現型を示すＣＡＲバリアントを発現するレポーター細胞を、遺伝子スクリーニングで選択することができる。複数の分子ドメインのコンビナトリアルアセンブリーであることを考慮すると、それぞれのバリアントは、すべての可変分子部分の配列を決定することによってのみ、明確に同定することができる。したがって、遺伝子スクリーニング中に単離されたレポーター細胞にコードされた導入遺伝子を、約１．５ｋｂのＰＣＲアンプリコンとして回収し、オックスフォードナノポアシーケンスにより全長を決定し、そして、カスタマイズしたバイオインフォマティクス分析パイプラインによって分析する。

【0492】

この過程により、癌などの治療薬としての可能性に関してさらに評価することができるＣＡＲリード化合物を同定することができる。
１．バリアントヌクレオチド配列ライブラリーの生成

【0493】

ＣＡＲバリアントのライブラリーを、複数のＣＡＲタンパク質ドメインのコンビナトリアルアセンブリーによって生成する。２つのヒンジドメイン、１２の膜貫通ドメイン、および１３のシグナル伝達ドメイン（各バリアントに３つのシグナル伝達ドメインが組み込まれる）により、５０，０００を超えるタンパク質バリアントを含むライブラリーが生成される。ＣＡＲの変異体を明確に同定するためには、１．３ｋｂのＰＣＲアンプリコンの塩基配列を決定することができる。
２．バリアントヌクレオチド配列ライブラリーのレポーター細胞への導入

【0494】

ステップ１で説明したＣＡＲバリアントのライブラリーを、ウイルス産生細胞であるフェニックス－広宿主性細胞または２９３Ｔ細胞にそれぞれ形質移入し、ライブラリー中に存在する全てのＣＡＲバリアントをコードするレトロウイルスまたはレンチウイルスを産生する。続いて、このウイルスを用いて、不死化ジャーカットＴ細胞またはインビトロで活性化させた初代ヒトＴ細胞を形質転換する。ＣＡＲバリアントライブラリーには、細胞表面マーカーおよび／または抗生物質選択マーカーが共にコードされており、これによりＣＡＲバリアントのプールを発現する形質転換されたレポーターＴ細胞を選択することができる。
３．少なくとも１つの機能的特性に基づくレポーター細胞の選択

【0495】

ＣＡＲバリアントのライブラリーを発現するレポーターＴ細胞のポリクローナルな混合物を細胞増殖色素で標識し、低密度で播種し、そして、ＣＡＲ抗原結合ドメインの同族リガンドを発現する抗原提示細胞と共培養する。使用するレポーターＴ細胞の量は、すべてのＣＡＲバリアントが少なくとも１００の平均カバー数で表現されるような量である。その後、共培養体を採取し、少なくとも１回分裂したＴ細胞または分裂していないＴ細胞に基づくフローサイトメトリーソーティングに供する。これらそれぞれの「上位」および「下位」集団を採取し、さらに分析する。他の活性化マーカーを、例えば、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＧＭ－ＣＳＦなどを単独でまたは組み合わせて、応答性Ｔ細胞と非応答性Ｔ細胞のフローサイトメトリーによる選別に使用してもよい。さらに、応答性Ｔ細胞と非応答性Ｔ細胞を選別するために、種々の転写因子活性レポーター（ＮＦ－κＢ、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１）、シグナル伝達レポーター（ＺＡＰ７０、ＥＲＫ１／２リン酸化）または細胞毒性レポーター（ＣＤ１０７Ａ発現）などを使用してもよい。
４．選択したレポーター細胞からのバリアントヌクレオチド配列の単離

【0496】

選択したＣＡＲバリアントを発現するレポーターＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＣＡＲをコードするレトロウイルスまたはレンチウイルス挿入物のＰＣＲ増幅に供する。ＰＣＲプライマーはＣＡＲインサートの不変領域に結合し、その結果、大きさが平均して約１３００塩基のアンプリコンが得られる。

【0497】

あるいは、同様の固有の分子識別子（ＵＭＩ）に基づく手法を用いてもよい。すべてのＣＡＲバリアントを少なくとも１００の平均カバー数で表現するのに十分なゲノムＤＮＡを使用する。特定のＣＡＲバリアントが偏って増幅されることを防ぐために、ＰＣＲサイクルの回数は最小限に抑えられるが、ライブラリー中で表現される各ＣＡＲについて少なくとも１００００の平均カバー数を得る必要がある。ゲノムＤＮＡからのＣＡＲバリアントの増幅を、反応性レポーターＴ細胞と非反応性レポーターＴ細胞の両方について実施する（上位試料と下位試料）。
５．単離したバリアントヌクレオチド配列の全ヌクレオチド配列のうちの、少なくとも６００ｂｐの決定

【0498】

増幅されたＣＡＲ配列をさらに、オックスフォードナノポアシーケンス用に処理する。最初のＰＣＲ反応では、テール付きプライマーを使用する。これらのプライマーには、迅速な接着化学で修飾されるバーコード付きのより外側のプライマーを用いた２回目のＰＣＲ用の新しい結合部位が含まれる。上位試料と下位試料のＰＣＲには、それぞれ異なるバーコードを使用する。すべてのＰＣＲステップにおいて、特定のＣＡＲバリアントが偏って増幅されることを防ぐために、増幅は最小限に抑えられる。しかしながら、すべてのＣＡＲバリアントを少なくとも１００００の平均カバー数で表現するのに十分なＰＣＲ産物を使用する。

【0499】

上位試料および下位試料由来のバーコード付きＰＣＲ産物を等モル比でプールし、最終段階でこのプールに高速１Ｄシークエンスアダプターを連結して、配列決定に適したライブラリー調製物を得る。このライブラリーをオックスフォードナノポアＲ９．４．１フローセルに負荷し、ライブラリー中でコードされる全てのＣＡＲについて、少なくとも１００リードの平均カバー数に至るまで配列決定を行う。

【0500】

バイオインフォマティクス分析には、オックスフォードナノポアグッピーツールキットを使用する。グッピー・ベースコーラーを使用して、生データからシーケンスリードを取得する。グッピー・バーコーダーを使用して、試料を逆多重化する。配列リードを、グッピー・アライナーを用いて個々のＣＡＲバリアントの配列から構成される参照とアライメントし、得られたビーエイエム（ｂａｍ）形式のアライメントファイルから各リードに関するＣＡＲバリアントの同一性を抽出する。最終ステップで各ＴＣＲの出現頻度を計算し、さらなる分析に使用する。ＰＣＲによる増幅バイアスを回避するための選択肢として、ＵＭＩに基づくＣＡＲバリアントの計数を用いてもよい。
６．少なくとも１つの目的のバリアントヌクレオチド配列の選択

【0501】

目的のバリアントヌクレオチド配列を同定するために、両細胞集団におけるバリアントのリードカウントによって決定される、正に選択される（マーカー分子陽性）レポーター細胞集団におけるバリアントの濃縮度と、負に選択される（マーカー分子陰性）レポーター細胞集団におけるバリアントの枯渇度を決定することにより、相対的な濃縮度に基づいてＣＡＲを選択する。
実施例１２

【0502】

本実施例では、実施例１０および１１で説明した本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされる細胞の数の算出について説明する。

【0503】

１００の組み合わせを含むコンビナトリアルライブラリーの場合、陽性反応の選択に基づいて１０，０００の細胞を回収し、陰性反応細胞を１０，０００回収することで、１００倍のカバー数を達成することができる。したがって、選択前の細胞集団は２０，０００を超える集団とすることができる。

【0504】

１０００の組み合わせを含むコンビナトリアルライブラリーの場合、陽性反応の選択に基づいて１００，０００の細胞を回収し、陰性反応細胞を１００，０００回収することで、１００倍のカバー数を達成することができる。したがって、選択前の細胞集団は２００，０００超える集団とすることができる。

【0505】

１×１０^９の組み合わせを含むコンビナトリアルライブラリーの場合、陽性反応の選択に基づいて１×１０^１１の細胞を回収し、陰性反応細胞を１×１０^１１回収することで、１００倍のカバー数を達成することができる。したがって、選択前の細胞集団は２×１０^１１を超える集団とすることができる。
実施例１３

【0506】

本実施例では、ミスマッチ修復遺伝子欠損のない大腸癌（ＭＭＲｐ－ＣＲＣ）腫瘍からの新生抗原特異的Ｔ細胞受容体配列の回収を説明する（図１０Ａ）。

【0507】

新鮮凍結した４つのＭＭＲｐ－ＣＲＣ腫瘍標本からＤＮＡとＲＮＡを単離し、以下の２つの用途に使用した。

【0508】

第一に、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを使用して、ＴＣＲα鎖およびβ鎖のバルク配列決定を実施した（ミラボラトリー：モスクワ／ロシア）。得られたＴＣＲ鎖配列のコレクションをＴＣＲα鎖配列のコレクションとＴＣＲβ鎖配列のコレクションとに分け、１試料当たりおよそ１０，０００～３０，０００のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のコレクションを得た（図１０Ｂおよび１１Ａ）。

【0509】

図１０Ｂおよび図１１Ａでは、ヒト腫瘍試料における浸潤リンパ球のバルクＴＣＲ配列決定を図示する。４つのヒトＭＭＲｐ－ＣＲＣ腫瘍試料を、ミラボラトリーによるバルクＴＣＲ配列決定に供した。アライメントしてＴＣＲを同定した後、クローン型を、それらのＣＤＲ３アミノ酸配列ならびにそれらのＶおよびＪの同一性に基づいてまとめた。特有のクローン型の数を、各腫瘍試料のα鎖とβ鎖の両方について表す。

【0510】

ＴＣＲセグメント（ＴＣＲ遺伝子要素としても知られる）がアミノ酸配列レベルで読み取り枠から外れて結合している、および／または停止コドンが導入されている、および／またはフレームシフト変異が存在する、および／または欠陥のあるスプライシング部位が存在する、任意の非生産的ＴＣＲ鎖配列を、コレクションから除去した。各コレクションを、特定のＴＣＲ鎖をコードしている核酸分子のリード数または固有の分子識別子（ＵＭＩ）の数のいずれか（あるいは、全ＴＣＲα鎖またはＴＣＲｂ鎖それぞれに対する割合）を用いて降順に並び替え、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の順位を決定した。

【0511】

最も多く存在する上位１００のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を選択し、ＴＣＲライブラリーを生成した（ツイストバイオサイエンス；サンフランシスコ／米国により実施）。簡単に説明すると、選択したＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を、ＤＮＡ合成によって断片として生成した。ライブラリー生成のために、選択した全てのＴＣＲαおよびＴＣＲβ断片を、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットをコードする連続した核酸分子にコンビナトリアルに接合した（図１１ＢにＴＣＲ発現プラスミドの模式図を示す）。ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖の両方、ならびにブラストサイジン選択マーカーを含むレトロウイルス構築物を、ライブラリー作製のための足場として使用することができる。この構築物を用いたレトロウイルス導入により、最終的に１つの転写産物が発現し、２Ａ部位でのペプチド切断により、ＴＣＲβ鎖、α鎖、およびブラストサイジン耐性マーカーが翻訳されることになる。ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ブラストサイジン耐性（図１１Ｂ）（配列番号４）（図４３）の形式で、１つのカセットにつき１つのＴＣＲβ断片とＴＣＲα断片を結合させることができる。得られたＴＣＲライブラリーは、基本的に、非常に狭い頻度範囲において脱落なしに１０，０００のＴＣＲバリアントを含むものとなった（図１０Ｃ；図１１Ｃおよび１１Ｄ）。１００×１００ライブラリーの品質管理。１１Ａからの各試料について、最も多く存在する１００のα鎖およびβ鎖を選択し、コンビナトリアルライブラリーの作製に使用した。１１ＢのＴＣＲβおよびＴＣＲα領域を合成し、ツイストバイオサイエンスによって実行されたコンビナトリアルクローニング手法で１１Ｂのベクターに挿入した。可変ＴＣＲα鎖およびβ鎖ドメインに隣接したプライマー対を使用して両鎖を増幅し、ナノポアシーケンスを用いて両鎖の同一性を明らかにした。

【0512】

１０，０００のα×βの組み合わせそれぞれの表現が、すべての患者ライブラリーで表された（図１１Ｄ）。患者ライブラリーのＴＣＲ表現の特徴。１１Ｃの患者ライブラリーそれぞれについて、ＴＣＲあたりのリード量の範囲、平均カバー数、および中央値±ａ^２ｌｏｇ単位の範囲内にあるＴＣＲの割合を表す。第二に、腫瘍由来の組織および健常組織のＤＮＡとＲＮＡを使用して、全エクソーム解析（ＷＥＳ）によって腫瘍特異的変異のセットを決定し、ＲＮＡ配列決定を利用して発現している変異遺伝子のセットを確立した。腫瘍特異的な変異を同定し、選択するためのパイプラインは、選択肢を提供するものとなり得る。ＷＥＳおよびＲＮＡ配列決定に基づいてそのような変異を同定する方法は、これまでにも記載があり、当業者に知られている。その後、複数の腫瘍由来の変異ペプチドを縦列配置でコードする縦列ミニ遺伝子（ＴＭＧ）構築物を生成した。ＴＭＧ構築物は、連鎖状で、ＬＡＭＰ－１シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメイン（例えば、グロス（Ｇｒｏｓ）ら、ネイチャー・メディシン、２０１６に記載、ただしｐｔ４を除く）、および２Ａ要素を介してＬＡＭＰ－１細胞質ドメインに融合したピューロマイシン耐性マーカーを含む２５ｍｅｒのポリペプチドミニ遺伝子として、個々の１２の腫瘍変異をコードする。Ｐｔ４については、ＬＡＭＰ－１シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインを含まないが、ピューロマイシン耐性マーカーを含む、異なる連鎖状のミニ遺伝子である３３または３４をコードする縦列ミニ遺伝子設計を用いる。並行して、ＭＭＲｐ－ＣＲＣ患者由来の適合する自己血液を用いて、不死化Ｂ細胞を作製した。ＥＢＶを用いたヒトＢ細胞の不死化は、当業者に知られている（例えば、例えば、トラギアイら、分子生物学の手法、２０１２）。不死化した自己Ｂ細胞を使用し、ＴＭＧをコードするウイルス粒子によるレトロウイルス導入によって、抗原発現Ｂ細胞を作製した。ＴＭＧ以外の遺伝子を用いたヒト初代Ｂ細胞のレトロウイルス導入の手順については、文献に記載されており（例えば、クワッケンボス（Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ）ら、ネイチャー・メディシン、２０１０）、当業者に知られている。ＴＭＧ導入Ｂ細胞は、ピューロマイシン耐性に基づいて選択することができる。ピューロマイシン選択のための過程は当業者に知られている。ＴＣＲライブラリーを、フュージーン形質移入試薬および当業者に知られているプロトコールにより、フェニックス－広宿主性ウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１３）に形質移入した。結果として生じたレトロウイルスビリオンを使用して、ジャーカットレポーターＴ細胞株を形質転換した。ジャーカットレポーターＴ細胞株は内因性ＴＣＲ発現を欠くもので（そのような遺伝子ノックアウトの生成は、例えば、メザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法でＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように修飾する。ジャーカットレポーターＴ細胞にＴＣＲライブラリーを導入した結果、全ての生存しているＴ細胞のうち、１０～６０％がＴＣＲで修飾された（図１０Ｄ）。ＴＣＲライブラリーにマウスＴＣＲ定常ドメイン配列を使用したことで、マウスＴＣＲβの定常ドメインに特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＴＣＲ修飾ジャーカットＴ細胞を検出できるようになった。細胞培養にブラストサイジンを添加することで、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ブラストサイジン耐性導入遺伝子を発現するように改変したジャーカットＴ細胞が高い純度で正に選択された（図１０Ｄ）。遺伝子組換え細胞の抗生物質選択は、当業者に知られている。

【0513】

次に、ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞を、ＴＭＧを導入したＢ細胞と共培養することにより刺激した。共培養の３日前にジャーカットレポーターＴ細胞を低密度（１ｍｌあたり０．１×１０^６細胞）で播種した。種々のＴＭＧを発現するＢ細胞は、すべて等しい比率（１：１）で混合した。９０×１０^６のプールしておいたＢ細胞（またはＴＭＧを発現しない対照Ｂ細胞）を、全量７２ｍｌの培地中で９０×１０^６のジャーカットレポーターＴ細胞と混合した（１：１の比率）。この混合物を２００μｌ（１ウェル当たり０．５×１０^６）ずつ、ＴＣ処理した丸底９６ウェルプレートのおよそ３６０のウェルに分注した。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、３７℃で２０～２２時間インキュベートした。

【0514】

その後、共培養物を採取し、ＣＤ２０とＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色した。次に、４％ホルムアルデヒドを含む固定用緩衝液を使用して細胞を固定した。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、各刺激条件について以下の集団を選別した（図１０Ｅ）。

【0515】

リンパ球、単細胞、ＣＤ２０陰性、高ＣＤ６９（高ＣＤ６９は、単細胞、ＣＤ２０陰性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づいて選ばれる上位１０～１５％を含む）。

【0516】

リンパ球、単細胞、ＣＤ２０陰性、低ＣＤ６９（低ＣＤ６９は、単細胞、ＣＤ２０陰性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルが低い方から１０～１５％を含む）。

【0517】

選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これをサイクル数を制限した複数回のＰＣＲの鋳型として使用し、当業者に知られているＰＣＲ法を用いてＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットの一部を増幅した。得られたＰＣＲ産物の大きさは約１．５ｋｂ（図１０Ｆ）で、オックスフォードナノポアミニオンまたはグリッドイオン配列決定装置を用いて配列決定した。ここまでのスクリーニング手順全体を、最小カバー数を１００倍として、ＴＭＧ発現下について３回、ＴＭＧ非発現下について３回、同様の反復試験を実施する。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の同一性を回復し、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して差次的に表されるＴＣＲの組み合わせを同定する。Ｂ細胞におけるＴＭＧ発現の有無による平均Ｒｌｏｇ変換リードカウントを、新生抗原反応性ＴＣＲリード化合物を図示するために使用することができる。新生抗原反応性のＴＣＲリード化合物を、円で囲んだより大きな黒点として示す（図１０Ｇ）。

【0518】

ＴＣＲリード化合物によって認識されるＴＭＧをデコンボリューションするために、単一のＴＭＧ構築物を発現するＢ細胞（ＴＭＧ発現Ｂ細胞の混合物ではなく）を用いて、ＴＣＲライブラリーを１回のみの反復実験でスクリーニングした（図１０Ｈ）。その後、ＴＣＲリード化合物によって認識される新生抗原そのものを決定するために、ＴＭＧにコードされている単一の２５ｍｅｒペプチドを負荷したＢ細胞を使用した（図１０Ｉおよび１０Ｊ）。ＴＣＲリード化合物によって認識される新生抗原そのものを、ＴＭＧにコードされる単一ミニ遺伝子を発現するＢ細胞を用いて決定した（図１０Ｋおよび１０Ｌ）。

【0519】

まとめると、この実施例は、説明したプラットフォームによって、新鮮な凍結腫瘍材料から新生抗原特異的ＴＣＲを首尾よく同定できることを示している。
実施例１４

【0520】

本実施例では、患者特異的ＴＣＲαβライブラリーを生成するために、メラノーマ腫瘍試料からＴＣＲ配列を回収することを説明する（図１２Ａ～１２Ｃ）。

【0521】

新鮮凍結した２つのメラノーマ腫瘍標本からＤＮＡとＲＮＡを単離し、以下の２つの用途に使用した。

【0522】

第一に、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを使用して、腫瘍試料における浸潤リンパ球のＴＣＲα鎖およびβ鎖のバルク配列決定を実施した（ミラボラトリー、モスクワ、ロシア）。得られたＴＣＲ鎖配列のコレクションをＴＣＲα鎖配列のコレクションとＴＣＲβ鎖配列のコレクションとに分け、１試料当たりおよそ５，０００～１０，０００のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖のコレクションを得た（図１２Ａ）。２つのヒトメラノーマ腫瘍試料を、ミラボラトリーによるバルクＴＣＲ配列決定に供した。アライメントしてＴＣＲを同定した後、クローン型を、それらのＣＤＲ３アミノ酸配列ならびにそれらのＶおよびＪの同一性に基づいてまとめた。特有のクローン型の数を、各腫瘍試料のα鎖とβ鎖の両方について表す。

【0523】

ＴＣＲセグメント（ＴＣＲ遺伝子要素としても知られる）がアミノ酸配列レベルで読み取り枠から外れて結合している、および／または停止コドンが導入されている、および／またはフレームシフト変異が存在する、および／または欠陥のあるスプライシング部位が存在する、任意の非生産的ＴＣＲ鎖配列を、コレクションから除去した。各コレクションを、特定のＴＣＲ鎖をコードしている核酸分子のリード数または固有の分子識別子（ＵＭＩ）の数のいずれか（あるいは、全ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖それぞれに対する割合）を用いて降順に並び替え、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の順位を決定した。最も多く存在する上位１００のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を選択し、ＴＣＲライブラリーを生成する（ツイストバイオサイエンス、サンフランシスコ、米国により実施）。簡単に説明すると、選択したＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を、ＤＮＡ合成によって断片として生成する。ライブラリー生成のために、選択した全てのＴＣＲαおよびＴＣＲβ断片を、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットをコードする連続した核酸分子にコンビナトリアルに接合した（図１１ＢにＴＣＲ発現プラスミドの模式図を示す）。ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖の両方、ならびにブラストサイジン選択マーカーを含むレトロウイルス構築物を、ライブラリー作製のための足場として使用することができる。この構築物を用いたレトロウイルス導入により、最終的に１つの転写産物が発現し、２Ａ部位でのペプチド切断により、ＴＣＲβ鎖、α鎖、およびブラストサイジン耐性マーカーが翻訳されることになる。ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ブラストサイジン耐性（図１１Ｂ）（配列番号４）の形式で、１つのカセットにつき１つのＴＣＲβ断片とＴＣＲα断片を結合させることができる。得られるＴＣＲライブラリーは、基本的に、非常に狭い頻度範囲において脱落なしに１０，０００のＴＣＲバリアントを含むものとなるだろう（図１２Ｂ）。１００×１００ライブラリーの品質管理。１２Ａからの各試料について、最も多く存在する１００のα鎖およびβ鎖を選択し、コンビナトリアルライブラリーの作製に使用することができる。１２ＡのＴＣＲβおよびＴＣＲα領域を合成し、ツイストバイオサイエンスによって実行されるコンビナトリアルクローニング手法で１１Ｂのベクターに挿入することができる。可変ＴＣＲα鎖およびβ鎖ドメインに隣接したプライマー対を使用して両鎖を増幅することができ、ナノポアシーケンスを用いて両鎖の同一性を明らかにした。１０，０００のα×βの組み合わせそれぞれの表現を、すべての患者ライブラリーについて表す。１２Ｃ）患者ライブラリーのＴＣＲ表現の特徴。１２Ｂの患者ライブラリーそれぞれについて、ＴＣＲあたりのリード量の範囲、平均カバー数、および中央値±ａ^２ｌｏｇ単位の範囲内にあるＴＣＲの割合を表す。

【0524】

まとめると、この実施例は、バルクＴＣＲ配列決定に基づいてコンビナトリアルＴＣＲライブラリーを合成し、クローニングすることが可能であることを示している。
実施例１５

【0525】

本実施例では、ＴＣＲプラスミドを混合して生成したＴＣＲライブラリーから、抗原特異的ＴＣＲを回収することを説明する。

【0526】

それぞれが単一の特徴の分かっているＴＣＲをコードする６のプラスミドと、それぞれが単一の特徴の分かっていないＴＣＲをコードする２４のプラスミドを混合して、ＴＣＲライブラリーを生成した（図１３Ａ）。ＴＣＲ発現プラスミドの設計を図１５Ａに図示する。このＴＣＲライブラリーを、フュージーン形質移入試薬および当業者に知られているプロトコールにより、フェニックス－広宿主性ウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１３）に形質移入した。結果として生じたレトロウイルスビリオンを使用して、ジャーカットレポーターＴ細胞株を形質転換した。ジャーカットレポーターＴ細胞株は内因性ＴＣＲ発現を欠くもので（そのような遺伝子ノックアウトの生成は、例えば、メザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法でＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように修飾する。ジャーカットレポーターＴ細胞にＴＣＲライブラリーを導入した結果、全ての生存しているＴ細胞のうち、８０％がＴＣＲで修飾された。ＴＣＲライブラリーにマウスＴＣＲ定常ドメイン配列を使用することで（図１５Ａ）、マウスＴＣＲβの定常ドメインに特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＴＣＲ修飾ジャーカットＴ細胞を検出できるようになる。細胞培養にピューロマイシンを添加することで、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性導入遺伝子を発現するように改変したジャーカットＴ細胞が高い純度で正に選択された（図１３Ｂ）。遺伝子組換え細胞の抗生物質選択は、当業者に知られている。

【0527】

次に、ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞を、ＴＭＧを導入したＢ細胞と共培養することにより刺激した。共培養の３日前にジャーカットレポーターＴ細胞を低密度（１ｍｌあたり０．１×１０^６細胞）で播種した。９０×１０^６のＴＭＧを発現するプールしておいたＢ細胞（またはＴＭＧを発現しない対照Ｂ細胞）を、全量７２ｍｌの培地中で９０×１０^６のジャーカットレポーターＴ細胞と混合した（１：１の比率）。この混合物を２００μｌ（１ウェル当たり０．５×１０^６個）ずつ、ＴＣ処理した丸底９６ウェルプレートのおよそ３６０のウェルに分注した。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、３７℃で２０～２２時間インキュベートした。

【0528】

その後、共培養物を採取し、ＣＤ２０とＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色した。次に、４％ホルムアルデヒドを含む固定用緩衝液を使用して細胞を固定した。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、各刺激条件について以下の集団を選別した（図１３Ｃ）。
１．リンパ球、単細胞、ＣＤ２０陰性、高ＣＤ６９（高ＣＤ６９は、単細胞、ＣＤ２０陰性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づいて選ばれる上位１０～１５％を含む）。
２．リンパ球、単細胞、ＣＤ２０陰性、低ＣＤ６９（低ＣＤ６９は、単細胞、ＣＤ２０陰性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルが低い方から１０～１５％を含む）。

【0529】

選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これをサイクル数を制限した複数回のＰＣＲの鋳型として使用し、当業者に知られているＰＣＲ法を用いてＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットの一部を増幅した。得られたＰＣＲ産物の大きさは約１．５ｋｂ（図１３Ｄ）で、当業者に公知の技術を使用してオックスフォードナノポアミニオンまたはグリッドイオン配列決定装置を用いて配列決定することができる。ＴＣＲの同一性を、当業者に知られているアライメント技術を用いて回復し、それぞれＴＣＲについて、上位試料対下位試料における正規化リードカウントのｌｏｇ２変換した倍率濃縮を、ｌｏｇ１０変換したＴＣＲの頻度の関数として表す（図１３Ｅ；ＴＭＧ発現存在下での１回の反復実験；ＴＭＧ発現の非存在下における１回の反復実験）。

【0530】

まとめると、この実施例は、ＴＣＲプラスミドの混合物から、抗原反応性ＴＣＲを単離することができることを示している。
実施例１６

【0531】

本実施例では、遺伝子合成によって生成したＴＣＲライブラリーから、抗原特異的ＴＣＲを回収することを説明する。

【0532】

抗原反応性の特徴が明らかになっている５つＴＣＲと特徴の分かっていない４５または９５のＴＣＲ（それぞれ５０×５０および１００×１００ライブラリ用；図１４Ａ）を選択してＴＣＲライブラリーを生成した（ツイストバイオサイエンス、サンフランシスコ、米国で実施）。簡単に説明すると、これらのＴＣＲに由来するＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を、ＤＮＡ合成によって断片として生成した。ライブラリー生成のために、選択した全てのＴＣＲαおよびＴＣＲβ断片を、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセット（配列番号１）をコードする連続した核酸分子にコンビナトリアルに接合した。ライブラリー作製のための足場として、ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖の両方、ならびにピューロマイシン選択マーカーを含むレトロウイルス構築物を使用した。この構築物を用いたレトロウイルス導入により、最終的に１つの転写産物が発現し、２Ａ部位でのペプチド切断により、ＴＣＲβ鎖、α鎖、およびピューロマイシン耐性マーカーが翻訳されることになる。ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン（配列番号１）の形式で、１つのカセットにつき１つのＴＣＲβ断片とＴＣＲα断片を結合させた。５０または１００のＴＣＲそれぞれのＴＣＲβ領域とＴＣＲα領域を、ツイストバイオサイエンスによって実行されたコンビナトリアルクローニング手法で合成し、このベクターに挿入した。

【0533】

５０×５０のライブラリーを、フュージーン形質移入試薬および当業者に知られているプロトコールにより、フェニックス－広宿主性ウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１３）に形質移入した。結果として生じたレトロウイルスビリオンを使用して、ジャーカットレポーターＴ細胞株を形質転換した。ジャーカットレポーターＴ細胞株を、当業者に知られている方法でＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように修飾する。ジャーカットレポーターＴ細胞にＴＣＲライブラリーを導入した結果、全ての生存しているＴ細胞のうち、１５％がＴＣＲで修飾された（形質導入４日後、つまりピューロマイシン選択後、の染色に基づく。アッセイ当日の純度は６０％を上回った）。ＴＣＲライブラリー（配列番号１）にマウスＴＣＲ定常ドメイン配列を使用したことで、マウスＴＣＲβの定常ドメインに特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＴＣＲ修飾ジャーカットＴ細胞を検出できるようになる。細胞培養にブラストサイジンを添加することで、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性導入遺伝子を発現するように改変したジャーカットＴ細胞を高い純度で正に選択した。遺伝子組換え細胞の抗生物質選択は、当業者に知られている。

【0534】

次に、ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞を、様々な様式で抗原を提示するように操作されたＡＰＣで刺激した。ＡＰＣには、ペプチドを負荷したＪＹ細胞、それぞれが異なるミニ遺伝子を発現するＥＢＶ ＬＣＬ細胞株の混合物、ＴＭＧを発現するＥＢＶ ＬＣＬ細胞、および特定の抗原を発現するように操作されていないＥＢＶ ＬＣＬを含めた。共培養の３日前にジャーカットレポーターＴ細胞を低密度（１ｍｌあたり０．１×１０^６細胞）で播種した。ＡＰＣとジャーカットレポーターＴ細胞を１：１の比率で、１ｍｌ当たり２．５×１０^６の細胞密度で混合した。この混合物を２００μｌ（１ウェル当たり０．５×１０^６個）ずつ、ＴＣ処理した丸底９６ウェルプレートのおよそ４０のウェルに分注した。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、３７℃で２０～２２時間インキュベートした。

【0535】

その後、共培養物を採取し、ＣＤ８、ＣＤ２０とＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色した。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、各刺激条件について以下の集団を選別した（図１４Ｂ）。
１．リンパ球、単細胞、生細胞、ＣＤ２０陰性、ＣＤ８陽性、高ＣＤ６９（高ＣＤ６９は、単細胞、生細胞、ＣＤ２０陰性、ＣＤ８陽性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づいて選ばれる上位１０～１５％を含む）。
２．リンパ球、単細胞、生細胞、ＣＤ２０陰性、ＣＤ８陽性、低ＣＤ６９（低ＣＤ６９は、単細胞、生細胞、ＣＤ２０陰性、ＣＤ８陽性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルが低い方から１０～１５％を含む）。

【0536】

選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これをサイクル数を制限した複数回のＰＣＲの鋳型として使用し、当業者に知られているＰＣＲ法を用いてＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットの一部を増幅した。得られたＰＣＲ産物の大きさは約１．５ｋｂ（図１４Ｃ）で、当業者に公知の技術を使用してオックスフォードナノポアミニオン配列決定装置を用いて配列決定した。ＴＣＲの同一性を、当業者に知られているアライメント技術を用いて回復し、各ＴＣＲについて、上位試料対下位試料における正規化リードカウントの濃縮倍率（ｙ軸）を、平均ＴＣＲ表現量（ｘ軸）の関数として表した（図１４Ｄ）。１４Ｄ；外因性抗原存在下における各条件の１回の反復実験；外因性抗原非発現下での１回の反復実験。ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用し、抗原が提示されていない「上位」および「下位」試料の両方との比較において、濃縮ＴＣＲが、抗原が提示されている「上位」試料では濃縮されていて、抗原が再提示されている「下位」試料では枯渇していると定義する線形モデルによって説明されるように、「下位」試料との比較において「上位」試料で濃縮されているＴＣＲの組み合わせを同定した。ＴＣＲα鎖とβ鎖の同一性、および主要な統計的指標を表す（図１４Ｅ）。

【0537】

１００×１００ライブラリーのスクリーニングを、ジャーカットレポーターＴ細胞が内因性ＴＣＲ発現を欠くように、かつ、外因性のヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように操作したことを除いて、５０×５０のスクリーニングと同様の方法で実施した。５０×５０ライブラリーのスクリーニングとは対照的に、ＴＭＧを発現するＢ細胞との条件で３回、ＴＭＧを発現するように操作されていないＢ細胞との条件で１回、スクリーニングを反復して行った。ジャーカットレポーターＴ細胞にＴＣＲライブラリーを導入した結果、全ての生存しているＴ細胞のうち、１４％がＴＣＲ修飾Ｔ細胞となった。ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用してＲｌｏｇ変換リードカウントを計算し、下位試料の全ての反復実験に関する各ＴＣＲの平均Ｒｌｏｇ値を、上位試料の全複製にわたる各ＴＣＲの平均Ｒｌｏｇ値から引き、Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）および非存在下（ｙ軸）における共培養について表した（図１４Ｆ）。添加した５つの特徴の分かっているＴＣＲを、円で囲んだより大きな黒点として示す。並べ替えられた確率尺度のプロットの指標として、ワルド統計量を用いた（図１４Ｇ）。

【0538】

まとめると、この実施例は、５０×５０および１００×１００設計のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることで、抗原反応性ＴＣＲを同定できることを示している。
実施例１７

【0539】

本実施例では、遺伝子合成を用いたＴＣＲレパトアの作製について説明する。

【0540】

抗原反応性の特徴が明らかになっている５つＴＣＲと特徴の分かっていない９５のＴＣＲを選択してＴＣＲライブラリーを生成する（ツイストバイオサイエンス、サンフランシスコ、米国で実施）。簡単に説明すると、選択したＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を、ＤＮＡ合成によって断片として生成する。ライブラリーを生成するために、選択した全てのＴＣＲαおよびＴＣＲβ断片を、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットをコードする連続した核酸分子にコンビナトリアルに接合する（配列番号１；ライブラリー作製のための足場として、ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖の両方、ならびにピューロマイシン選択マーカーを含むレトロウイルス構築物を使用することができる。この構築物を用いたレトロウイルス導入によって最終的に１つの転写産物が発現し、２Ａ部位でのペプチド切断により、ＴＣＲβ鎖、α鎖、およびピューロマイシン耐性マーカーが翻訳されることになる）。１つのカセットにつき１つのＴＣＲβ断片とＴＣＲα断片を、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシンの形式で結合させることができる（配列番号１；図１５Ａ）。可変ＴＣＲα鎖およびβ鎖ドメインに隣接したプライマー対を使用して両鎖を増幅することが可能であり、ナノポアシーケンスを用いて両鎖の同一性を明らかにしたＴＣＲ鎖の同定は、当業者に知られている。１００×１００ライブラリーについて、１０，０００のα×βの組み合わせそれぞれの表現を示す。得られたＴＣＲライブラリーは、非常に狭い頻度範囲において脱落なしに１０，０００のＴＣＲバリアントを含んでいた（図１５Ｂ）。

【0541】

コンビナトリアルライブラリーを構成する別の方法が想定され、この方法では、複合ライブラリー中に存在することが求められる全てのＴＣＲの組み合わせを、個別にではなく集合的に表現する、重複したまたは重複していない複数のコンビナトリアルサブライブラリーから、より複雑なライブラリーを作製することができる（図１５Ｃ）。あるいは、生じる可能性がある全てのα鎖とβ鎖の組み合わせの全てを複合ライブラリー中に表現させないような形で、より小さいコンビナトリアルサブライブラリーからより大きなライブラリーを構成することによって、ライブラリーの複雑度を低減することができる。当業者は、対合情報または対合尤度を用いて、対合した鎖や対を形成する可能性が高い鎖の全てが、コンビナトリアルサブライブラリーのうちのいずれか１つに含まれるように、コンビナトリアルサブライブラリーを設計することができる（図１５Ｄ）。

【0542】

図１５Ｅでは、４つの１００×１００ライブラリーを合成し、これらを１：１：１：１の比率で混合して作製した２つの２００×２００ＴＣＲライブラリー中に存在するＴＣＲの組み合わせの同定についてを図示している。生じる可能性のあるＴＣＲの組み合わせそれぞれの出現（ｘ軸）を、その密度（ｙ軸）として表す。中央値±１ｌｏｇ２単位の範囲に入るＴＣＲの組み合わせの数は、それぞれ、９２％と８８％である。図１５Ｃ）に示した、４つの１００×１００ライブラリーを１：１：１：１の比率で混合することによって２００×２００ライブラリーを作製するという考えを、２つの患者ライブラリーについて試験する（図１５Ｅ）。このことは、より複雑度の低い複数のコンビナトリアルＴＣＲライブラリーを混合することによって、より複雑度の高いコンビナトリアルＴＣＲライブラリーを作製できることを示している。

【0543】

図１５Ｆは、２００×２００ライブラリーのスクリーニングにおける新生抗原の非存在下および存在下でのｐｔ－２ＴＣＲ反応性を表す。２００×２００ライブラリーを、図１０Ａ～１０ＨのバルクＴＣＲ配列決定データを用いて測定した、最も頻繁に発現する１９３本のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコンビナトリアルに接合することによって作製する。さらに、７つの既に特徴が明らかになっているＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含める。２００×２００ライブラリーは、ｇＤＮＡ単離後のカバー数が５７～１３３の範囲であること、ＴＭＧが発現している条件で２回の反復実験を、ＴＭＧを含まない条件で２回の反復実験を行ったことを除いて、１０Ａ～１０Ｈに記載の１００×１００ライブラリーのスクリーニングと同様にスクリーニングする。また、ＦＡＣＳ選別の前に、抗ＣＤ２０または抗Ｌｙ６Ｇマイクロビーズを用いてＢ細胞を枯渇させる点も異なる。ＴＣＲα鎖およびβ鎖を同定した後、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して、差次的に発現したＴＣＲの組み合わせを同定する。差次的表現分析は当業者に知られている。Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）および非存在下（ｙ軸）における２００×２００ライブラリースクリーニングの平均Ｒｌｏｇ変換リードカウントを、図１５Ｆに表す。６つの添加した特徴の分かっているＴＣＲを、より大きな濃い灰色の点として示す。１つの特徴の分かっているＴＣＲは、ｐｔ２－ＥＢＶ ＬＣＬでは発現しないＨＬＡアレルに限定されているため、表れていない。１００×１００ライブラリーのスクリーニングによって、１０Ａ～１０Ｈで同定したＴＣＲを、より大きな薄い灰色の点で示す。ｉ）２００×２００ライブラリーのスクリーニングで同定されたが、ｉｉ）１００×１００ライブラリーでは表現されなかったその他のＴＣＲリード化合物は、より大きな、中間程度の陰影をつけた灰色の点として表した。

【0544】

このことは、ライブラリーに添加された６つのＴＣＲが、２００×２００のスクリーニング手法で同定されることを示している。さらに、１００×１００ライブラリーでは表現されなかった新規ＴＣＲリード化合物が、２００×２００ライブラリーのスクリーニングで同定できることを示している。このように、飽和ライブラリースクリーニングでは、１００×１００のＴＣＲライブラリーを用いたスクリーニングよりも、２００×２００、あるいはより複雑なＴＣＲライブラリーから、より多くの新生抗原反応性ＴＣＲが同定できる可能性がある。

【0545】

図１５Ｇは、６つの特徴の分かっているＴＣＲと、１００×１００ライブラリスクリーンを用いて１０Ａ～１０Ｈで同定されたＴＣＲの、１００×１００と２００×２００ライブラリースクリーニング両方における統計的な指標を表している。ＤＥＳｅｑ２の基準平均指標で測定した、１０Ａ～１０Ｈにおいて１００×１００ライブラリーのスクリーニングで同定されたＴＣＲの表現量は、２００×２００のスクリーニングでは１００×１００のスクリーニングに比べ６分の１以下に少なくなっている。このことは、これらのＴＣＲを同定できなかったことの説明になると考えられ、また、ＴＣＲライブラリーにおいてＴＣＲバリアントを均等に表現させることの重要性を強調するものである。

【0546】

まとめると、この実施例は、複数のコンビナトリアルサブライブラリーを組み合わせるという考えに基づいて、遺伝子合成を用いてどのようにＴＣＲライブラリーを作製できるかについてと、ライブラリーの複雑度をどのようにして低減させることができるかについてを示している。
実施例１８

【0547】

本実施例では、ＴＣＲレパトアからＴＣＲαβ対を同定するための共培養条件の最適化について説明する。

【0548】

この実施例では、共培養条件を調整し、これを使用して、高度に希釈された抗原反応性ＴＣＲのＴＣＲレパトアから、ＴＣＲαβ対を同定した。ＣＤ６９の、スクリーニング目的におけるＴ細胞活性化マーカーとしての適合性を試験するために、ｈＣＤ８およびＣＭＶ＃１－ＴＣＲを発現するジャーカットＴ細胞を、様々な量のＣＭＶペプチドを負荷したＪＹ細胞と共培養した。ＡＰＣのペプチド負荷は、当業者に知られている。ＦＡＣＳで測定したＣＤ６９陽性率は、抗原ペプチドの濃度に依存して増加する（図１６Ａ）。

【0549】

播種密度がジャーカットＴ細胞のＣＤ６９染色のバックグラウンドに影響を与えるかどうかを調べるために、細胞を様々な密度で播種した。低密度で播種すると、ＦＡＣＳによって測定されるＣＤ６９のバックグラウンドでの発現が低減する（図１６Ｂ）。最適な共培養プレートが何であるかを試験するために、ＴＣＲを発現するジャーカットレポーターＴ細胞を、Ｔ７５もしくはＴ２５フラスコまたは丸底９６ウェルプレート中で、関連抗原を発現するＢ細胞と共培養した。ジャーカットＴ細胞の活性化は、丸底９６ウェルプレートで共培養した場合に最も顕著である（図１６Ｃ）。Ｔ細胞の活性化に対する共培養密度の影響を調べるために、ＴＣＲを発現するジャーカットＴ細胞を様々な密度で共培養した。ジャーカットＴ細胞の活性化は、共培養中に２５０，０００または１２５，０００のエフェクター細胞を播種したときに最も効率的である（図１６Ｄ）。図１６Ａ～１６Ｄで決定した共培養条件を遺伝子スクリーニングの設定で試験するために、５つの特徴の分かっているＴＣＲのうちの１つまたは２４の特徴が明らかになっていない（非関連）ＴＣＲのうちの１つをそれぞれ発現するジャーカットＴ細胞株を混合することによって、ジャーカットレポーターＴ細胞のポリクローナルプールを作製した。特徴の分かっているＴＣＲを発現する細胞が１：１０，０００～１：１，０００，０００の間の頻度で存在するように混合した。共培養の３日前に細胞を低密度（１００，０００細胞／ｍｌ）で播種し、共培養は、丸底９６ウェルプレートに２５万細胞の播種密度で行った。

【0550】

２０時間後、共培養物を採取し、ＣＤ２０とＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色した。次に、４％ホルムアルデヒドを含む固定用緩衝液を使用して細胞を固定した。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、各刺激条件について以下の集団を選別した。
１．リンパ球、単細胞、ＣＤ２０陰性、高ＣＤ６９（高ＣＤ６９は、単細胞、ＣＤ２０陰性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づいて選ばれる上位１０～１５％を含む）。
２．リンパ球、単細胞、ＣＤ２０陰性、低ＣＤ６９（低ＣＤ６９は、単細胞、ＣＤ２０陰性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルが低い方から１０～１５％を含む）。

【0551】

選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これをサイクル数を制限した複数回のＰＣＲの鋳型として使用し、当業者に知られているＰＣＲ法を用いてＴＣＲｂカセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物の大きさは約１．５ｋｂで、当業者に知られている技術を使用し、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）配列決定装置を用いて配列決定することができる。ＴＣＲの同一性を、当業者に知られているアライメント技術を用いて回復し、それぞれＴＣＲについて、上位試料対下位試料における正規化リードカウントの倍率濃縮を表す（図１６Ｅ）。

【0552】

まとめると、この実施例は、記載した共培養条件を用いた遺伝子スクリーニングにより、１：１，０００，０００以上の頻度を有する抗原反応性ＴＣＲを同定できることを示している。
実施例１９

【0553】

このようなライブラリーから新生抗原特異的ＴＣＲを高感度で同定し、その他の処理工程でＴＣＲが失われないようにするためには、ＴＣＲのカバー数を維持するために、スクリーニング工程で固有のＴＣＲをそれぞれ複数回表現させなければならない。したがって、多数のＴＣＲ導入ジャーカット細胞およびＡＰＣをスクリーニングする必要がある^３３。さらに、１０，０００を超えるＴＣＲを高感度にスクリーニングできるように、ライブラリーのＴＣＲ数を増やすことも目標の一つである。このことは、ＴＣＲカバー数を維持しながら多数の細胞のより効率的な処理を可能にするために、様々な処理ステップを最適化することによって、ＴＣＲ発見プラットフォームの拡張性を高める必要性を強調するものである。したがって、本研究の目的は、ＴＣＲ単離プラットフォームの感度を維持しながら拡張性を高めるために、これらの処理ステップの多くをさらに最適化することであった。

【0554】

これらの研究では、４つの既知の、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１拘束性ＴＣＲであるＣＤＫ４－ＴＣＲのクローン８および１７（略してＣＤＫ４－８および１７）ならびにＣＭＶ－ＴＣＲのクローン１および２（略してＣＭＶ－１および２）を使用した。この２つのＣＤＫ４ＴＣＲは、変異したサイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４_Ｒ２４Ｃ）ペプチドに特異的である。この変異由来の新生抗原エピトープは、複数のメラノーマ患者で同定されている^３４。さらに、２つのＣＭＶＴＣＲは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の構成要素であるｐｐ６５^３５によってコードされるペプチドを標的としている。ＣＤＫ４とＣＭＶエピトープの両方について、潜在的に異なる親和性を持つ２つの異なるＴＣＲクローンを研究において使用した。これにより、同族ペプチドに対するＴＣＲの親和性がスクリーニング過程に果たす役割を評価することができる。

【0555】

大量の細胞を処理する最初のステップとして、レトロウイルス導入後のＴＣＲ発現ジャーカット細胞を濃縮する方法としてのブラストサイジン選択を評価した。その結果、ブラストサイジン選択によって、形質導入されたジャーカット細胞を効率的に濃縮することができ、毒性も最小限に抑えられることが確認された。さらに、共培養の形式を９６ウェル（９６Ｗ）丸底プレートからＧＭＰバッグに拡張することにより、エフェクター細胞の活性化を同等に維持しながら、少なくとも１７０×１０^６のエフェクターと標的細胞のハイスループットな処理が可能であることがわかった。

【0556】

次に、ＴＣＲライブラリーのスクリーニング過程におけるフローサイトメトリーを使った選別のステップをビーズの使用に基づく選別ステップに置き換えるために、様々な方法を検討した。ＣＤ６９に加えて、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ２５とＣＤ６２Ｌを長期的な共培養アッセイで評価した。ＣＤ２５はＩＬ－２受容体α鎖として機能し、活性化後のＴ細胞に発現することが知られている^３２。一方、ＣＤ６２ＬはナイーブＴ細胞に発現し、Ｔ細胞の活性化により下方制御され、エフェクターＴ細胞が血流に再還流することを可能にする^３６。ＣＤ２５とＣＤ６２Ｌは有望な発現プロファイルを示したため、ＣＤ６９と組み合わせた２ステップのビーズに基づく選択の候補である。

【0557】

最後に、ＮＦＡＴを用いたレポーター系の有効性を評価した。Ｔ細胞の抗原特異的応答を研究するために、複数のヒトＮＦＡＴ結合部位に続いて最小プロモーターとレポーター遺伝子を含むベクターが確立されてきた^{３７－４０}。最小プロモーターはいかなるＮＦＡＴ結合部位をも含まず、その唯一の目的は、ＮＦＡＴ結合部位に転写因子が結合するとレポーター遺伝子の転写を開始させることである。これらの構築物を導入したジャーカット細胞は、Ｔ細胞が活性化している時にのみ、レポーター遺伝子を発現する。ビーズによる選別に好適な細胞表面マーカーや抗生物質耐性遺伝子をレポーター遺伝子として導入することで、フローサイトメトリーによる選別ステップを回避することも可能である。しかしながら、結果から、このレポーター系を使用すると、バックグラウンドが高くなるため、スクリーニングプラットフォームに組み込むことは困難であることが示された。
結果

【0558】

ペプチド滴定アッセイにより、ＣＤＫ４－ＴＣＲのクローン８と１７、ＣＭＶ－ＴＣＲのクローン１と２の間の親和性には差がない、もしくは差があってもごく僅かであることが示唆された。

【0559】

研究に使用する前に、４つのモデルＴＣＲ（ＣＤＫ４－ＴＣＲのクローン８と１７、ＣＭＶ－ＴＣＲのクローン１と２）のそれらの同族ペプチドに対する親和性を明らかにした。このことは、共培養アッセイでペプチド滴定を行うことで達成した。

【0560】

４つのＴＣＲを、レトロウイルス遺伝子導入によりジャーカットＴＣＲノックアウト（ＫＯ）ＣＤ８陽性細胞株に導入した。導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞のうち、３５～４５％がｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性であり、ＣＤ８陰性集団も示された（図１７ａ、上段）。共培養アッセイを行っている間に導入効率が補正されることを避けるために、ＴＣＲ導入ジャーカット細胞を選別して、およそ９０％のｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の集団を得た（図１７ａ、下段）。

【0561】

ＣＤ６９を読み出し情報として用い、ＣＤＫ４－８および１７を導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞と、段階的に濃度を変えたＣＤＫ４変異ペプチドを負荷したＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１発現ＪＹ細胞を２０時間共培養すると、ＣＤＫ４－１７ＴＣＲはＣＤＫ４－８ＴＣＲよりもその同族ペプチドに対してわずかに高い親和性を持つことが明らかになった（図１７ｂ、ＣＤＫ４－８のＥＣ５０：４３ｎｇ／ｍｌ，ＣＤＫ４－１７のＥＣ５０：２３ｎｇ／ｍｌ）。ＣＭＶ－ＴＣＲの場合、これらのＴＣＲを発現するジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を、段階的に濃度を変えたＣＭＶｐｐ６５ペプチドを負荷したＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１発現ＪＹ細胞と共培養すると、ＣＭＶ－１および２ＴＣＲはＣＭＶｐｐ６５ペプチドに対して同等の親和性を示した（図１７ｃ、ＣＭＶ－１のＥＣ５０：２．２ｎｇ／ｍ，ＣＭＶ－２のＥＣ５０：１．２ｎｇ／ｍｌ）。

【0562】

したがって、このデータは、ＣＤＫ４－８と１７はＣＤＫ４変異ペプチドに対して同等の親和性を持ち、ＣＭＶ－１と２はＣＭＶｐｐ６５ペプチドに対して同等の親和性を持つ（あるいは親和性には最小限の差しかない）ことを示唆している。しかし、これらの異なるＴＣＲクローンは、スクリーニング過程に対するＴＣＲの親和性の影響を研究するためのツールとしては、その価値は限定的である。そこで、ＣＤＫ４－ＴＣＲのうちの１つとＣＭＶ－ＴＣＲのうちの１つを、ＴＣＲのライブラリーを用いた試験を進める前に、研究に標準的に含めることにした。

【0563】

ＴＣＲの導入効率が異なるジャーカット細胞は、ブラストサイジンで効率的に選択される。

【0564】

レトロウイルスＴＣＲライブラリーをジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞に導入した後、毒性を引き起こすこともＴＣＲのカバー数を喪失することもなく正常にＴＣＲ導入されたジャーカット細胞を濃縮するためには（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が８０％超にするためには）、効率的でハイスループットの選択手順が有用である。抗生物質選択は、ＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞を濃縮するための魅力的な戦略であるため、これについて評価した。

【0565】

この目的で、まずＣＤＫ４－１７ＴＣＲを用いてブラストサイジン選択を評価した。ＴＣＲライブラリーの導入効率は様々であるため（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞は、通常１０～５６％の範囲）、ＣＤＫ４－１７導入効率の異なるジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が１０％と３０％）を使用して、ブラストサイジン選択を評価した。細胞を１ｍｌ当たり０．２５×１０^６細胞の密度で播種し、６μｇ／ｍｌのブラストサイジンで７日間選択すると、より低濃度の抗生物質（２および４μｇ／ｍｌ）や開始時の密度をより高く（０．５および１×１０^６細胞／ｍｌ）した場合と比較して、増殖倍率が最も高くなった。さらに、前述の選択条件により、ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞はおよそ９０％となった（データは示していない）。

【0566】

ＣＤＫ４－１７に最適なブラストサイジン選択条件が他のＴＣＲにも適用できるかどうかを検証するために、ＣＭＶ－ＴＣＲの一つであるＣＭＶ－１について調べた。さらに、より早い時点でブラステイシジンを除去することで、選択が継続され、増殖倍率が改善されるかどうかについても評価した。そのために、選択４日目に、細胞をそれぞれの濃度のブラストサイジンを含む培地または含まない培地に、開始時と同じ密度で再度、播種した（それぞれ「４日目にブラストサイジンを除去」「４日目に新しいブラストサイジンを添加」と示す）。

【0567】

異なる導入効率を達成するために、異なる容量のレトロウイルス上清によってジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を形質転換した（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が６、２０、６０％、図１８ａ）。

【0568】

ＴＣＲを導入した細胞を０．２５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で播種し、異なる濃度のブラストサイジン（０、４、５、６μｇ／ｍｌ）で選択した。４日目にブラストサイジンを除去した細胞と除去していない細胞の間に、選択から６日後の増殖倍率の点で顕著な差はなかった。ＣＤＫ４－１７ＴＣＲのデータとは逆に、より低濃度のブラストサイジン（４および５μｇ／ｍｌ）で導入効率の異なるジャーカット細胞を選択すると、６μｇ／ｍｌのブラストサイジンで選択した細胞よりも、増殖倍率がわずかに高いようであった（図１８ｂ、図２５ａに非導入細胞の増殖倍率を示す）。増殖倍率におけるこれらの差異にもかかわらず、ブラストサイジン濃度を変化させることで、一貫してｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の選択効率は８０～９０％となった（図１８ｃ、図２５ｂは、４μｇ／ｍｌ条件におけるＮＴ細胞の割合が、非常に少数の生存細胞が存在し、その一部がｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性ゲートに出現していることに起因していることを示している）。最後に、４日目にブラストサイジンを除去しても、増殖倍率および選択効率に影響を与えなかった（図１８ｂ，ｃ）。４μｇ／ｍｌの抗生物質を用いることで、増殖倍率が高くなり、８０～９０％のｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞が得られたため、このデータに基づいて、４μｇ／ｍｌのブラストサイジンで選択したジャーカット細胞のみを用いた７日目での測定を継続した。さらに、試験した３つの濃度の結果から、４μｇ／ｍｌブラストサイジンを使用することで毒性が最も低くなると判断した。

【0569】

選択から７日後時点の生存細胞総数およびｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の両方に関して、４日目にブラストサイジンを除去したＴＣＲ導入ジャーカット細胞は、４日目にブラストサイジンを添加した細胞よりもわずかに高い増殖倍率を示した（図１８ｄ）。しかしながら、４日目にブラストサイジンを除去しても、試験した全ての条件において９０％超のｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞をもたらす選択効率に影響はなかった（図１８ｅ）。

【0570】

注目すべきは、４日目にブラストサイジンを除去するか添加するかによって、ＣＤ８とｍＴＣＲβの二重陽性ジャーカット細胞のｍＴＣＲβのＭＦＩに違いが観察されたことである。ブラストサイジンを添加した細胞は、４日目にブラストサイジンを除去した細胞よりも高いＭＦＩを示した。この差は、選択後６日目よりも７日目の方がより顕著であった（図２６）。

【0571】

結論として、ＣＭＶ－１導入効率の異なるジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞は、３種類の異なる濃度のブラストサイジン（４、５、６μｇ／ｍｌ）で効率的に選択された。増殖倍率の点では、試験した３種類の抗生物質濃度間における差はわずかではあったが、低濃度のブラストサイジンの毒性が低いようであった。さらに、より早い時点でブラストサイジンを除去することで選択を継続することができ、７日間の選択期間中ずっと抗生物質に細胞を暴露するよりも増殖倍率がわずかに良くなることが示された。

【0572】

ＣＤ６９活性化マーカーの発現は、ＧＭＰバッグを用いたジャーカット細胞とＡＰＣの共培養と丸底９６ウェルプレートを用いた共培養とで同等になる。

【0573】

また、スクリーニングプラットフォームの拡張性を高めるためには、確立されている丸底９６ウェルプレートを用いた共培養の形式を最適化し、ＴＣＲのカバー数を維持しながら、多数のエフェクター細胞と標的細胞をより効率的に処理できるように設定する必要がある。これまでの研究から、９６ウェルプレートのウェルよりも大きな表面積を持つ平底の細胞培養容器で共培養を行うと、ジャーカット細胞におけるＣＤ６９の発現が低減することが示されている。さらに、このような共培養においてＥ：Ｔ比や開始時の細胞密度を変化させても、エフェクター細胞でＣＤ６９発現の増強は引き起こされなかった（データは示していない）。このデータは、丸底９６ウェルプレートのような丸底の培養容器を用いると、エフェクターと標的がより効率的に接触することを示唆している。そこで、エフェクターと標的の接触が強化され、１つの培養容器中で多量の細胞数を処理できる、より大規模な共培養系を特定することにした。

【0574】

異なる共培養系を比較する目的で、明確にＣＤ６９陽性の集団および陰性の集団を得るために、４０～５０％がＴＣＲ陽性であるＣＤ８陽性ジャーカット細胞をエフェクター細胞として使用した（図１９ａ、１９ｂ、１９ｃおよび１９ｄの左側）。標的細胞としてはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１を発現するＥＢＶ不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ ＬＣＬ）を利用して、ＴＣＲ発現ジャーカット細胞によって認識される抗原を発現するように操作した（ＥＢＶ ＬＣＬ－ＴＭＧ２．１）。

【0575】

まず、１５ｍｌおよび５０ｍｌのファルコンチューブをラックに設置して共培養を行い、エフェクターと標的の接触強化について検討した。ファルコンチューブは細胞培養処理されていないため、少量の細胞（２×１０^６以下の細胞、９６ウェルプレートのウェルと１５／５０ｍｌファルコンチューブの直径の違いから拡大した）を用いて、２０時間共培養後の細胞生存率とエフェクター細胞の活性化を評価した。生存細胞およびＣＤ６９陽性細胞の割合は、９６ウェルプレートでの共培養とファルコンチューブでの共培養の間で同等であった（図１９ａ）。しかし、細胞数を３８×１０^６まで増加させると、細胞生存率は急激に低下した（図１９ａ）。

【0576】

注目すべきは、ＣＤ６９の上方制御がジャーカット細胞活性化の唯一の指標であったため、抗ヒトＣＤ６９抗体（クローンＦＮ５０）がＣＤ６９発現を正確に表しているかどうかが検証されたことである。異なるエピトープを認識する２つの抗ヒトＣＤ６９抗体（クローンＣＨ／４）を用いた共染色により、２つの異なる抗体クローン間の染色のレベルが同等であることが明らかになった（図２７）。

【0577】

次に、ファルコンチューブを用いた共培養での細胞損失が、大気と接する培地の表面積が小さく、効率的なガス交換ができないことに起因するかどうかを検討した。これを評価する目的で、ファルコンチューブを遠心沈殿し、３８×１０^６の細胞が入ったチューブから１４ｍｌの培地を取り、全容量を１ｍｌとした。しかしながら、３８×１０^６の細胞を含むファルコンチューブでの共培養では、細胞生存率の急激な低下が観察された（図１９ｂ）。加えて、２５０ｍｌチューブを用いた共培養をさらにテストした。これらの容器は直径が広く、より効率的なガス交換が起こる可能性があるからである（適切な遠心分離ローターが利用できなかったため、遠心沈殿は行わなかった）。２５０ｍｌチューブを用いた共培養では、９６ウェルプレートでも共培養と同様にＣＤ６９が上方制御されたが、細胞死は増加した（図１９ｂ）。

【0578】

多数の細胞を（ファルコン）チューブに入れて共培養を行うことは、細胞死が増加するため、実行が不可能であると結論付けられた。この細胞生存率への影響は、ガス交換が非効率になったことと、多数の細胞を（ファルコン）チューブに入れたことに起因する可能性がある。そこで、多数の細胞を収容でき、バッグの表面積全体を使ったガス交換を起こすことが可能な培養容器である、ＭＡＣＳ ＧＭＰ細胞分化バッグ５００（略してＧＭＰバッグ）を用いて、細胞生存率およびエフェクターと標的の接触を評価した。

【0579】

現行のＴＣＲライブラリーのスクリーニングプラットフォームでは、１０，０００のＴＣＲをスクリーニングすることが可能であり、ＴＣＲのカバー数を維持するためには、１７０×１０^６のエフェクター細胞と標的細胞との共培養が必要とされる。そこで、ＧＭＰバッグを使用し、１７０×１０^６のジャーカット細胞とＡＰＣとの共培養を設定した。

【0580】

あるいは、スクリーニングプラットフォームには８０×１０＾６のエフェクター細胞と８０×１０＾６の標的細胞を含めることができるので、値を１６０×１０＾６とすることが可能である。また、少なくとも８０×１０＾６個の細胞を保持する必要があるが、多チャンネルの使用によって細胞の１０％程度を喪失する可能性があるため、それを補う意味で、共培養を９０×１０＾６の細胞を含めて設定することができる。

【0581】

エフェクターと標的の接触を強化し、効率的なガス交換を可能にするため、ＧＭＰバッグを丸いザルに水平に設置した（図１９ｃ）。２０時間共培養した後、ＧＭＰバッグでの共培養と９６ウェルプレートでの共培養の間では、同等の細胞生存率とＣＤ６９の上方制御が観察された。しかし、ＣＤ６９のＭＦＩは、ＧＭＰバッグの条件でわずかに低下した（図１９ｃ）。そこで、ＧＭＰバッグを遠心沈殿すれば、ＣＤ６９ＭＦＩが上昇するかどうかを評価した。ＧＭＰバッグの遠心沈殿を可能にするために、バッグを遠心分離機のローターに垂直に置き、細胞を乱すことなくザルに移した。遠心沈殿しないＧＭＰバッグも、直立させた状態で置いた。ＣＤ６９陽性ジャーカット細胞の割合およびＭＦＩは、ＧＭＰバッグでの共培養と９６ウェルプレートでの共培養の間で同等であった。また、２０時間共培養する前にエフェクター細胞と標的細胞を遠心沈殿させたかどうかによっては、ＣＤ６９の発現に大きな違いは認められなかった（図１９ｄ）。しかしながら、ＧＭＰバッグで２０時間共培養すると、細胞生存率が低下した。驚くべきことに、細胞の損失量は、ＧＭＰバッグごとに異なっていた（図１９ｄ）。

【0582】

以上のことから、ＧＭＰバッグでの共培養は、すでに確立されている９６ウェルプレートを用いた共培養フォーマットと同様に、エフェクター細胞の活性化をもたらすことが示唆された。しかしながら、図１９ｄに示した細胞死の増加の原因を調べるためには、さらなる研究、例えば、バッグの置き方の違いなどに関する研究が必要である。

【0583】

ＣＤ２５とＣＤ６２Ｌは、ＣＤ６９と組み合わせた２段階のビーズを用いた選択に適した発現プロファイルを示す。

【0584】

これまで、２０時間の共培養とフローサイトメトリーソーティングに続くＴＣＲライブラリースクリーニングのプラットフォームでは、活性化ジャーカット細胞を選択するための活性化マーカーとして、ＣＤ６９が使用されてきた。より拡張可能なビーズの使用に基づく選択手法を評価するために、ＣＤ６９に加えて、２つの補足的なＴ細胞活性化マーカーであるＣＤ２５とＣＤ６２Ｌの発現プロファイルを調査した。この目的で、同族抗原を発現する標的細胞と共培養した後、ＴＣＲを導入したジャーカット細胞におけるＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌの発現を経時的に分析した。

【0585】

ジャーカット細胞におけるＣＤ６９の上方制御は、共培養を開始してから１６～３２時間後も安定して維持されているようであった（図２０ａ）。これと比較して、ＣＤ２５陽性およびＣＤ６９陽性ＣＤ２５陽性エフェクター細胞の発現プロファイルは、共培養開始後２４時間目の時点でわずかな上方制御を示した（図２０ｂ、２０ｃ）。さらに、ＣＤ６２Ｌの下方制御は、共培養開始後１６～２０時間目の間でわずかに強まり、３２時間目まで安定したままであることが観察された。しかしながら、共培養開始後の分析した様々な時点において、未刺激のＴＣＲ導入ジャーカット細胞および非導入ジャーカット細胞のうちの２０～４０％がＣＤ６２Ｌ陰性であることから、ＣＤ６２Ｌを活性化マーカーとして使用するとバックグラウンドシグナルが高くなった（図２０ｄ）。ＣＤ６９とＣＤ６２Ｌの共発現分析により、ＣＤ６２Ｌの発現を非特異的に下方制御するエフェクター細胞は、ＣＤ６９を上方制御しないことが判明した。さらに、共培養の開始から１６～３２時間後には、ＣＤ６９の発現は上方制御されるがＣＤ６２Ｌの発現を欠く活性化ジャーカット細胞の集団が観察された（図２０ｅ）。

【0586】

ＣＤ２５とＣＤ６２Ｌは、その発現がＣＤ６９の上方制御と相関することから、この予備的な経時的分析において有望な発現プロファイルを示し、これらをＣＤ６９と組み合わせて２段階のビーズに基づく選択過程に使用できる可能性が示唆された。

【0587】

レンチウイルスＮＦＡＴレポーター系は、ジャーカットＴ細胞および初代Ｔ細胞において高いバックグラウンドシグナルを示す。

【0588】

ＴＣＲライブラリーのスクリーニング過程において、反応性ＴＣＲを選択するために内因性の細胞表面活性化マーカーを使用する代わりに、ジャーカット細胞においてＮＦＡＴに基づくレポーター系を構築する方法が考えられる。このレポーター系を構築することにより、活性化ジャーカット細胞を抗生物質で選択することができ、フローサイトメトリーソーティングを回避できる可能性がある。あるいは、抗生物質耐性カセットを、ビーズの使用に基づく濃縮に好適な任意の細胞表面マーカーに置き換えることができる。

【0589】

４種類のレンチウイルスＮＦＡＴに基づくレポーターベクターを設計した。自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスプラスミドは、切断されて活性のない５'ＬＴＲプロモーターを含むため、ゲノムに組み込むと、ピューロマイシン耐性レポーター遺伝子の転写は、ＮＦＡＴ転写因子がＮＦＡＴ結合部位に結合することにのみ依存することとなる^４１。３つの構築物は、２つ、４つ、または６つの同一のＮＦＡＴ結合部位を含み、その後に最小ＩＬ２プロモーターが続くものである。４つ目のベクターは、少なくとも３つの異なるＮＦＡＴ結合部位から構成される、完全なＩＬ２プロモーターを含むものである（図２１ａ）^６。最も感度の高いレポーターを決定するために、異なるＮＦＡＴを使用したレポータープラスミドを試験した。

【0590】

ＮＦＡＴに基づくレンチウイルスベクターを、ｐｍａｘＧＦＰプラスミドと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。導入効率の指標として、形質移入後３日目のウイルス産生細胞における一過性のＧＦＰ発現を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は１００％ＧＦＰ陽性であり、レンチウイルスの導入が成功したことが示唆された（図２１ｂ）。次に、レンチウイルス上清を使ってジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞の形質転換を行い、その後、細胞を非生理的なＰＭＡ／イオノマイシン刺激に２４時間暴露して、レポーター系の有効性を評価した。ＮＦＡＴの活性化は、刺激後７２時間で最大となることが分かっている^３８。そこで、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激の後、３日間のピューロマイシン選択を行った。しかしながら、生存率は、ＮＦＡＴ導入ジャーカット細胞で急激に低下し、ピューロマイシンに曝露した導入細胞と非導入細胞の間で同等となった（図２１ｃ、上段）。活性化された細胞の９９％超がＣＤ６９陽性であり、刺激が効率的であったことを示唆した（図２１ｃ、下段）。

【0591】

ＮＦＡＴを導入したピューロマイシン選択細胞を２０日間増殖させ、２回目の刺激と選択を行った。この実験における非導入ジャーカット細胞は、図２１ｃの非導入細胞とは異なることに留意されたい。ＰＭＡ／イオノマイシン刺激に続いて、様々な濃度のピューロマイシンで４日間選択した結果、細胞生存率の点で、刺激したＮＦＡＴ導入細胞と刺激していないＮＦＡＴ導入細胞との間に大きな差はなかった（図２１ｄ）。驚くべきことに、ＣＤ６９の発現は、非導入細胞よりも導入細胞で低かった（図２１ｄ）。この説明の１つとして、ＮＦＡＴ導入ジャーカット細胞が、１回目の非生理的ＰＭＡ／イオノマイシン刺激から完全には回復していなかったことが考えられる。

【0592】

まとめると、このデータは、Ｔ細胞刺激後にピューロマイシン耐性ＮＦＡＴ導入ジャーカット細胞が濃縮されないことを示している。ｐｍａｘＧＦＰプラスミドの形質移入が効率的であったとしても、レンチウイルス構築物の形質移入と導入がうまくいかなかったかもしれない（図２１ｂ）。他に可能な説明としては、抗生物質の選択が最適ではないことや、漏れのあるレポーター系であることが考えられる。前述した考えの一部に対処するために、以降の実験は、ＥＧＦＰレポーター遺伝子を含むＮＦＡＴレポーター構築物を用いて行った（図２２ａ）。あるいは、レポーター遺伝子を、ビーズに基づく選択／抗生物質耐性遺伝子に好適な任意の細胞表面マーカーとすることができる。

【0593】

レンチウイルスの形質移入効率は、ＥＧＦＰ ＮＦＡＴプラスミドを用いることで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＭＶ誘導性ＧＦＰ発現の読み出しによって直接評価することができる。このことから、ＰＥＩがフュージーンよりも効率的なレンチウイルス形質移入試薬であることが明らかになった（図２２ｂ）。レポーター系の有効性を調べるために、ＮＦＡＴを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞（ＰＥＩ形質移入試薬を使用）をＰＭＡ／イオノマイシンで２４時間刺激し、２４時間ごとに３日間、ＧＦＰ発現を読み出した。ＮＦＡＴに基づくベクターのいずれについても、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびＭＦＩに関して、刺激したジャーカット細胞と刺激していないジャーカット細胞の間に顕著な差は観察されなかった（図２２ｃ）。また、活性化に伴うＣＤ６９の上方制御から、ＰＭＡ／イオノマイシンの刺激が有効であることが明らかとなった（図２２ｃ）。全体として、このデータは、レンチウイルスＮＦＡＴレポーター系がジャーカット細胞において非常に高いバックグラウンドシグナルを有することを示唆している。

【0594】

次に、ＮＦＡＴを導入した初代Ｔ細胞においても、同様のバックグラウンドシグナルが観察されるかどうかを評価した。この目的のために、２つのＮＦＡＴに基づくレンチウイルスベクターである、ＮＦＡＴ４ｘとＮＦＡＴ４ｘ新を使用した。ＮＦＡＴ４ｘとは対照的に、ＮＦＡＴ４ｘ新は最小ＩＬ２プロモーターではなく、ｍｉｎＰと呼ばれる、より複雑でないプロモーターを含んでいる。ＭｉｎＰについてはこれまでに、ヤッツらによる記載がある^３８。２人の健常提供者由来の初代Ｔ細胞を、ＮＦＡＴレンチウイルス上清で形質転換し、その後ＰＭＡ／イオノマイシンで２４時間刺激した。ＧＦＰの発現を２４時間ごとに３日間測定した。ジャーカット細胞を用いたデータとは逆に、ＧＦＰ陽性細胞の割合とＭＦＩは、刺激条件において、非刺激条件よりもわずかに高いことが観察されたが、これらの違いはそれほど有意ではなかった（図２３）。さらに、異なる最小プロモーターを有するＮＦＡＴ４ｘ構築物を使用しても、形質導入されたＴ細胞におけるより特異的なＧＦＰの発現は生じなかった。ＣＤ６９はＰＭＡ／イオノマイシン刺激により上方制御されなかったが、刺激したＮＦＡＴ導入細胞と刺激しなかったＮＦＡＴ導入細胞との間におけるＧＦＰ発現の観点からの変動は、刺激が効果的であったことを示唆している（図２３）。

【0595】

総合すると、これらのデータは、ＮＦＡＴに基づくレポーターベクターをレンチウイルスで送達すると、ジャーカット細胞と初代細胞の両方で高いバックグラウンドシグナルが生じることを示している。

【0596】

ＮＦＡＴレポーター構築物を、非ウイルス性送達によってジャーカット細胞に導入しても、高いバックグラウンドシグナルが生じる。

【0597】

次に、２つの異なる構築物であるＮＦＡＴ０ｘとＮＦＡＴ４ｘを設計して、ジャーカット細胞における非ウイルス性ＮＦＡＴレポーター送達系の有効性を検討した（図２４ａ）。ＮＦＡＴ０ｘはＮＦＡＴ結合部位を全く含まないため、最小プロモーターのバックグラウンドシグナルを評価するための対照として機能する。プラスミドは両方とも、ＥＧＦＰレポーター遺伝子、および構成的に発現されるＥ２クリムゾンおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含む。２つのＮＦＡＴプラスミドを使ってジャーカット細胞をエレクトロポレーションすることにより、構築物は無作為に線形化され、ゲノムの任意の場所に統合されることになる。そのため、形質移入効率は低いと予想された。しかしながら、ゲノムにプラスミドが安定的に組み込まれたジャーカット細胞は、ピューロマイシン選択を行うことで濃縮されることとなる。選択されたジャーカット細胞を刺激することにより、ＮＦＡＴバックグラウンドシグナルをさらに評価する予定である。

【0598】

ＮＦＡＴ構築物を形質移入したＣＤＫ４－１７発現ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞は、時間の経過に伴う細胞生存率の大幅な低下を示さなかった（図２４ｂ）。驚くべきことに、エレクトロポレーション後２日目に、ＧＦＰ陽性、およびＧＦＰ陽性Ｅ２クリムゾン陽性細胞の増加が観察され、これはＮＦＡＴ０ｘを形質移入したジャーカット細胞でより顕著であった。形質移入から６日後にこれら２つの細胞集団が減少したことは、二重陽性およびＧＦＰ単陽性の発現が一過性であったことを示唆している（図２４ｃ）。形質移入６日後から、７日間のピューロマイシン選択を開始した。選択を行っている間に、Ｅ２クリムゾンおよびＧＦＰの一重陽性および二重陽性のジャーカット細胞の割合が増加した（図２４ｃ）。ピューロマイシン処理から７日後、生存している非エレクトロポレーションジャーカット細胞はなかったため、選択が完了したものと考えた（図２４ｄ）。しかしながら、ＧＦＰ陽性、およびＧＦＰ陽性Ｅ２クリムゾン陽性細胞の割合は、ＮＦＡＴ導入ジャーカット細胞のＥ２クリムゾン発現と同等であった。このことは、ＮＦＡＴレポータープラスミドの非ウイルス性送達もまた、高いバックグラウンドシグナルをもたらすことを示唆している。
実施例１９に関する考察

【0599】

新生抗原特異的ＴＣＲの同定に焦点を当てた、癌治療のための完全個別化ＴＣＲ遺伝子治療は、非常に有用である。この手法は遺伝子スクリーニングに依存するため、多数のＴＣＲ発現ジャーカット細胞とＡＰＣを処理する必要がある。多くの患者を治療できるようにするためには、スクリーニングの感度に影響を与えることなく、エフェクター細胞や標的細胞を効率的に処理できるスクリーニングプラットフォームが必要である。ここでは、新生抗原反応性ＴＣＲ単離プラットフォームの拡張性を高めるために行われた研究について説明する。
ＴＣＲを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞のブラストサイジン選択。

【0600】

レトロウイルスを使ってＴＣＲライブラリーをジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞に遺伝子導入した後、毒性を引き起こすこともＴＣＲのカバー数を喪失することもなく、ＴＣＲを発現するジャーカット細胞を濃縮するためには、効率的な選択方法が有用である。この目的のためには、抗生物質であるブラストサイジンによって、ＣＭＶ－１およびＣＤＫ４－１７ ＴＣＲを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞が効率的に選択されることが実証された（図１８、およびデータは示していない）。試験した種々のブラスチシジン濃度間やブラスチシジン選択方法間での差は大きくなかったが、ＣＭＶ－１導入細胞を、開始時の密度を０．２５×１０^６細胞／ｍｌ、ブラスチシジンの濃度を４μｇ／ｍｌとし、培養４日後にブラストサイジンを培地から除去して７日間選択すると、ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性ジャーカット細胞が９０％を超えるまでに濃縮され、さらに、増殖倍率も最も高かった（図１８）。

【0601】

しかしながらこの選択手法では、１０，０００ＴＣＲのライブラリーを導入した場合には、ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性ジャーカット細胞はおよそ７０％だった。加えて、ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性細胞の割合は、共培養アッセイの前にジャーカット細胞を増殖させるとさらに減少した（データは示していない）。したがって、患者由来ＴＣＲのライブラリーを導入したジャーカット細胞の濃縮には、標準的に、ブラストサイジンの濃度を６μｇ／ｍｌとし、４日目に新しいブラストサイジンを添加する選択を適用し、７０％を超えるｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性ジャーカット細胞集団を達成した（データは示していない）。さらに、必要な培養フラスコの数を減らすために、開始時の細胞密度を０．５×１０^６細胞／ｍｌとした。

【0602】

ブラストサイジン選択の研究は２つの既知のＴＣＲを用いて実施したが、患者スクリーニングでは１０，０００の特徴が明らかになっていないＴＣＲを導入した。したがって、ＴＣＲライブラリーを発現するジャーカット細胞の抗生物質選択には、単一のＴＣＲを発現する細胞の濃縮よりも粗い処理が必要になる可能性がある。同様の観察は、ＴＣＲライブラリーを発現するジャーカット細胞をピューロマイシンで１４日間選択したスピンドラー（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ）らの研究でも認められている。ＣＤ３陽性ＴＣＲαβ陽性細胞は、選択後、およそ１０％～およそ５０％まで濃縮された^４２。

【0603】

４日目にブラストサイジンを添加すると、ｍＴＣＲβのＭＦＩの低下を伴うＴＣＲ発現細胞の喪失が起こるのか、あるいは観察されたＭＦＩの差が、より長い抗生物質処理に起因するジャーカット細胞の表現型の変化の結果に過ぎないのかについては、まだ検討が必要である（図２６）。さらに、導入効率が低いことが（ｍＴＣＲβ陽性ＣＤ８陽性が１０％未満）、ＴＣＲのカバー数の低減を引き起こすかどうかを試験することは有用であろう。これらの疑問には、異なるＴＣＲのライブラリーをジャーカット細胞に導入し、ブラストサイジンで濃縮した細胞のＴＣＲを配列決定することによって、対処することができる。

【0604】

結論として、ＴＣＲ導入ジャーカット細胞を濃縮するために最も適していて、かつ、効率的な選択方法を見つける過程から、既知のＴＣＲを用いた研究が有用であることが示された。しかしながら、この実験から得られた知見はさらに検証されるべきであり、未知のＴＣＲのライブラリーをスクリーニングする際には、さらなる調整が必要となる可能性がある。
ＧＭＰバッグを使用した、ジャーカット細胞とＡＰＣの共培養。

【0605】

スクリーニングプラットフォームの拡張性をさらに高めるためには、ジャーカット細胞とＡＰＣの共培養形式を、確立されている９６ウェル丸底形式から拡張することを伴う。

【0606】

我々は、本研究が、９６ウェルプレートでの共培養と同様のＣＤ６９発現をもたらした、ＧＭＰバッグでの新しい共培養形式の有効性を調べた最初の研究であると理解している（図１９ｃ、図１９ｄ）。ＧＭＰバッグは、９６ウェルプレートの丸底ウェルを模倣する方法で折り畳むことができるため、エフェクター－標的間の接触を強化することができる。さらにＧＭＰバッグでは、細胞の喪失を防止するための、その表面積全体にわたる効率的なガス交換が可能になる。しかし図１９ｄに見られるように、ＧＭＰバッグでの共培養では、９６ウェルプレートでの共培養と比較して細胞死が増加した。この細胞生存率の低下は、短時間の遠心沈殿処理のために、ＧＭＰバッグの置き方を変える必要があったことに起因していると考えられる。細胞はＧＭＰバッグの底に集められたが、ここは培養容器の中で唯一、効率的なガス交換ができない部分である可能性がある。図１９ｃでは、ＧＭＰバッグの遠心沈殿を行わず、細胞はバッグの側面に集められた。このことが、細胞生存率が影響を受けなかった原因である可能性があることに留意されたい。図１９ｈで見られる細胞死の原因をさらに調べるためにはＧＭＰバッグを使用した共培養を繰り返すことが有用であるが、これらの観察は、インキュベーター内に柔軟なＧＭＰバッグを配置する一貫した方法を確立する必要性を強調するものである。例えば、ＣＯ_２透過性を維持しつつ適切な形状を有する骨組みのようなものを設計することができるだろう。

【0607】

ジャーカット細胞－ＡＰＣ共培養にＧＭＰバッグを使用することのその他の利点として、同様の細胞密度を維持したまま、より多くの細胞を加えることができることが挙げられる。このことによって、１０，０００を超えるＴＣＲをスクリーニングできる可能性がある。さらに、ＧＭＰバッグは閉鎖系であるため、相互汚染が起こる可能性が大幅に低減されるだろう。

【0608】

注目すべきは、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９の発現のみに基づく、異なる共培養系の有効性を評価したことである。この実験設定では、ＧＭＰバッグでの共培養がＴＣＲのカバー数に及ぼすであろう影響は考慮していない。それを研究するためには、ＴＣＲライブラリーを発現するジャーカット細胞とＡＰＣとの共培養を、ＧＭＰバッグと９６ウェルプレートで並行して実施することができる。その後、確立されたＣＤ６９に基づくフローサイトメトリーによって活性化ジャーカット細胞を選別し、次世代シーケンサーによって特定のＴＣＲの濃縮度を比較する。

【0609】

さらなる実験により、共培養をＧＭＰバッグを使用して実施することがＴＣＲ単離過程に及ぼす影響を評価する予定である。しかしながら、予備的なデータから、少なくとも１０，０００のＴＣＲを含むライブラリーのスクリーニングにおいて、エフェクター細胞と標的細胞を効率的に処理する有望な共培養系が示されている。
フローサイトメトリーを用いた選別のビーズの使用に基づく選択への置き換え

【0610】

現在、いくつかのＴＣＲスクリーニングプラットフォームは、新生抗原特異的ＴＣＲを同定するために、共培養した後、ＣＤ６９を発現するジャーカットＴ細胞をフローサイトメトリーによって選別することを伴う。しかしながら、活性化ジャーカット細胞をビーズを用いて選択することで、ＴＣＲスクリーニングプラットフォームの拡張性が向上する可能性がある。そこで、活性化ジャーカット集団と非活性化ジャーカット集団を明確に分離できるビーズを用いた選択のための、追加のまたは代替の活性化マーカーを評価することにした。

【0611】

さらに２つのＴ細胞活性化マーカー、ＣＤ２５およびＣＤ６２Ｌを用いて共培養の経時的分析を実施すると、ＣＤ２５発現の不均一性が、活性化ジャーカット細胞におけるＣＤ６９発現の不均一性よりも大きいことが明らかになった（図２０ａ、２０ｂ）。さらに、ＣＤ６２Ｌの下方制御は、一部の非導入細胞や非刺激ＴＣＲ導入エフェクター細胞もＣＤ６２Ｌに対しては陰性であったことから、活性化ジャーカット細胞に対してにのみ特異的なものではなかった（図２０ｄ）。したがって、これら２つの活性化マーカーは、ビーズに基づく選択手法において、それだけで使用する単一なマーカーとしては有力な候補にならない。しかしながら、ＣＤ２５とＣＤ６２Ｌは、ＣＤ６２Ｌ陽性またはＣＤ２５陽性エフェクター細胞それぞれを枯渇または濃縮させ、続いてＣＤ６９陽性選択によって活性化細胞を捕獲することを伴う、連続したビーズに基づく選択過程では使用することができる。注目すべきは、ＣＤ２５陽性集団およびＣＤ６９陽性ＣＤ２５陽性集団が２４時間後にわずかに増加していることである。しかしながら、ＣＤ２５が後期活性化マーカーであることが示されていることを考慮すれば^４３、これは驚くべきことではない。このことはまた、これら２つの活性化マーカーを有するエフェクター細胞の分析には、より遅い時間帯が最も理想的であることを示唆している。ＣＤ６２Ｌの排出は、Ｔ細胞活性化後４時間程度でピークに達すると報告されており、したがって早期活性化マーカーであるといえる^{４４，４５}。ある研究では、４時間でピークに達した後、ＣＤ６２Ｌは動的な発現プロファイルをとることが示されている^４４。しかしながらここでは、共培養の２０時間後にも、ＣＤ６９非常に安定して上方制御されているのと同様に、ＣＤ６２Ｌは非常に安定して下方制御されていることが観察された（図２０ａ、２０ｄ）。このことから、ジャーカット細胞を活性化させた１６～３２時間後にＣＤ６９とＣＤ６２Ｌとの共発現分析を行うことが有用であると考えられる（図２０ｅ）。それでもやはり、ＴＣＲ導入ジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞を、同族ペプチドを発現していないＥＢＶ ＬＣＬと共培養することによって、この経時的分析を繰り返して行う必要がある。それによって、３つの活性化マーカーのバックグラウンドシグナルをより正確に推測することができるだろう。

【0612】

最後に、活性化ジャーカット細胞の抗生物質選択またはビーズに基づく濃縮を可能にするレンチウイルスＮＦＡＴレポーター系の有効性を検討した。しかし、ＮＦＡＴベクターをレンチウイルスを用いて送達すると、ジャーカット細胞および初代細胞の両方で、高いバックグラウンドシグナルが見られた（図２２および図２４）。このレポーター系を採用した研究は、ほとんどがバックグランドシグナルが最小限のクローン集団に依存している^{３７，３８}。ピューロマイシン耐性レポーター遺伝子を持つＮＦＡＴ導入ジャーカット細胞を、抗生物質選択に２度暴露した（図２１）。しかしながら、最初の抗生物質処理後に部分的にクローナルな集団が得られたと仮定したにもかかわらず、２回目の選択後でも、刺激したジャーカット細胞と刺激していないジャーカット細胞の間に顕著な差はなかった。別の説明として、２回目のピューロマイシン選択に先立つ最適ではない非生理的なＰＭＡ／イオノマイシン刺激の影響が考えられ、それによってＣＤ６９陽性のＮＦＡＴ導入ジャーカット細胞が３０％未満となった可能性がある（図２１ｄ）。さらに、刺激したジャーカット細胞と刺激していないＥＧＦＰ ＮＦＡＴ導入ジャーカット細胞との間には顕著な差はなかった（図２２）。したがって、ＧＦＰ発現に違いが見られないため、クローンを選択することは不可能であろう。この結果は、別の最小プロモーターｍｉｎＰでも同程度のバックグラウンドが見られることが明らかになったことから、レポーター系の漏出性が最小ＩＬ２プロモーターに起因するものではないことを示唆している（図２３）。したがって、この漏出性がレンチウイルス送達系の特性である可能性があると結論付けた。

【0613】

ＳＩＮ ＮＦＡＴレトロウイルスベクターは、抗原特異的Ｔ細胞応答を研究するためにうまく活用され、その設定に用いられてきた^{３７，３８，４０}。ＮＦＡＴプラスミドを非ウイルス性送達しても、レポーターＥＧＦＰ遺伝子の発現は非刺激ジャーカット細胞で上昇し、高いバックグラウンドシグナルを示した（図２４）。しかしながら、ＮＦＡＴを導入したジャーカット細胞の漏出性をさらに評価するためには、Ｔ細胞の活性化が必要である。さらに、Ｅ２クリムゾン一重陽性集団を、フローサイトメトリーを用いた選別に供し、その後、Ｔ細胞刺激アッセイにおけるこの集団の有効性およびＧＦＰ漏出性を評価することができる。これらの転写因子は異なるシグナル伝達経路を利用しており、バックグラウンドシグナルに異なる影響を与える可能性があるため^３８、ＡＰ－１およびＮＦ－κＢレポーター系の感度について研究することが今後の課題である。例えば、ＮＦ－κＢレポーター系は、ジャーカット細胞におけるキメラ抗原受容体のライブラリーのスクリーニングにうまく応用されている^４０。

【0614】

本研究は、新生抗原特異的ＴＣＲ単離プラットフォームの拡張性を高めることを目的としたものである。レポータージャーカットＴ細胞とＡＰＣをより効率的に処理することで、最終的にはより多くの癌患者の治療が可能になるため、これらの実験は有用である。まず、レトロウイルスでＴＣＲを導入したジャーカットＴＣＲ ＫＯ細胞のブラストサイジン選択が、最も効率的で毒性の少ないエフェクター細胞の濃縮手順として同定された。さらに、ジャーカット細胞とＡＰＣの共培養を９６ウェル形式からより拡張性の高いＧＭＰバッグの設定に拡張したところ、ジャーカット細胞の活性化が同程度になった。最後に、ＴＣＲ探索プラットフォームにおいて、新生抗原特反応性ＴＣＲ発現ジャーカット細胞をフローサイトメトリーソーティングからより拡張性の高いなビーズに基づく選択に置き換えるための基盤を構築した。
材料および方法-実施例１９
細胞株

【0615】

ヒトジャーカット細胞株（クローンＥ６－１、ＴＩＢ－１５２）はＡＴＣＣから購入し、ヒトＥＢＶ不死化ＨＬＡ－Ａ２陽性Ｂ細胞株（ＪＹと称する）は、ＥＣＡＣＣから購入した。ジャーカットとＪＹの両細胞株を、１０％の熱不活性化牛胎児血清（ＦＢＳ、ギブコ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）を加えたＲＰＭＩ－１６４０培地、ＨＥＰＥＳ（ギブコ）にて培養した。ヒト胚性腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＲＬ－３２１６）およびフェニックス－広宿主性（Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ａｍｐｈｏ）細胞株はＡＴＣＣから購入し、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（ギブコ）で培養した。すべての細胞株を、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。
ヒト健常者提供者からのＴ細胞およびＢ細胞の単離

【0616】

健常なヒト提供者の軟膜を、十分な説明と同意に基づいて、サンクイン血液供給支援団体（Ｓａｎｑｕｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｐｐｌｙ、オランダ）から入手した。フィコールパクプラス（Ｆｉｃｏｌｌ ＰａｑｕｅＰｌｕｓ、シグマアルドリッチ）を用いて、軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。

【0617】

モジョソートヒトパンＢ細胞単離キット（ＭｏｊｏＳｏｒｔ Ｈｕｍａｎ Ｐａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、バイオレジェンド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））を用いてＨＬＡ－Ａ２陽性Ｂ細胞を負の選択によって単離し、その後、ヒトガンマヘルペスウイルス４（ＨＨＶ－４，ＡＴＣＣ ＶＲ－１４９２）でＥＢＶ不死化させた。ＥＢＶ不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ ＬＣＬ）を、２０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）を加えたＲＰＭＩ－１６４０培地、ＨＥＰＥＳ（ギブコ）で培養した。

【0618】

Ｔ細胞は単離した後、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ライフテクノロジーズヨーロッパ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ））を用いて活性化し、１０％のヒト血清（シグマアルドリッチ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）およびサイトカイン（５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１５および１００ＩＵ／ｍｌヒトＩＬ－２、ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））を加えたＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。すべての初代細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。
フローサイトメトリーおよび選別

【0619】

ＰＢＳ（ギブコ）に２％ＦＢＳを添加して、ＦＡＣＳ緩衝液を調製した。フローサイトメトリー分析を実施するために、細胞を、４℃、暗所で２０分間染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。ライブ／デッド固定可能近赤外線分光用（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ、（ライフテクノロジーズヨーロッパ、１：１０００希釈）またはＤＡＰＩ（シグマアルドリッチ、１：１０００希釈）を、染色による細胞の生死の判別に使用した。サイトフィックス（Ｃｙｔｏｆｉｘ、ＢＤバイオサイエンス）を用い、ウイルス産生細胞を４℃で３０分間固定し、測定前にＰＢＳで１回洗浄した。試料をＢＤ ＬＳＲフォルテッサ（Ｆｏｒｔｅｓｓａ）で測定し、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ｖ１０．６．１ソフトウェアで分析した。

【0620】

選別用の回収チューブとしては、ＦＢＳで被膜されたものを使用した。１５ｍｌのチューブ中で、２０×１０^６細胞当たり０．５ｍｌの抗体溶液を用いて染色した。染色は４℃、暗所で２０分間行い、その後、１０ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄した。次に、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞濃度を１５～２０×１０^６細胞／ｍｌに調整し、３５μｍの細胞濾過器に通した。選別を行う直前に、細胞の生死を判別する染色液としてＤＡＰＩ（シグマアルドリッチ、１：１０００希釈）を添加した。試料をＦＡＣＳアライアフュージョンで選別した。

【0621】

フローサイトメトリーおよび選別用の抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈した。以下の抗体および希釈倍率を使用した：抗ヒトＣＤ８ＡＰＣ（クローンＳＫ１、ＢＤバイオサイエンス、１：３００希釈）、抗ヒトＣＤ８ＡＰＣ－Ｒ７００（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤバイオサイエンス，１：６００希釈）、抗マウスＴＣＲβ ＰＥ（クローンＨ５７－５９７、ＢＤバイオサイエンス、１：１５０希釈）、抗ヒトＣＤ６９ ＰＥ／ＡＰＣ／ＢＶ５１０（クローンＦＮ５０、ＢＤバイオサイエンス、１：１００、１：２００および１：３００希釈のそれぞれ）、ＣＤ６９ ＰＥ（クローンＣＨ／４、サーモフィッシャーサイエンティフィック、１：１００希釈）、抗ヒトＣＤ２０ ＦＩＴＣ（クローン２Ｈ７、ＢＤバイオサイエンス、１：２５希釈）、抗ヒトＣＤ２０ ＰＥ／Ｃｙ７（クローンＬ２７、ＢＤバイオサイエンス、１：２００倍希釈）、抗ヒトＣＤ２５ ＢＶ７１１（クローン２Ａ３、ＢＤバイオサイエンス、１：２００希釈）、抗ヒトＣＤ６２Ｌ ＡＰＣ（クローンＤＲＥＧ－５６、ＢＤバイオサイエンス、１：２５希釈）、および抗ヒトＣＤ３ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（クローンＳＫ７、ＢＤバイオサイエンス、１：２５希釈）。注：ＣＤ６９の読み出しには、特に断りのない限り、抗ヒトＣＤ６９クローンＦＮ５０抗体を使用した。
レトロウイルスを使用した形質移入および形質導入

【0622】

レトロウイルスを用いた形質移入を実施するために、およそ１．８×１０^６のフェニックス－広宿主性細胞を１０ｃｍの培養皿に播種し、その２４時間後、形質移入試薬としてフュージーン６（プロメガ）を用いて１０μｇのｐＭＰ７１－ＴＣＲプラスミドで形質移入を行った。形質移入に使用したＴＣＲは、ジャーカット細胞株の内在性ＴＣＲとの二量体化を防ぐために、マウス定常領域とヒト可変領域から構成されている。従って、マウスＴＣＲβ（ｍＴＣＲβ）領域に対する単一の抗体で染色することにより、それぞれのＴＣＲの導入効率を測定することができる。形質移入の４８時間後にウイルス上清を回収し、０．４５μｍフィルターに通した。レトロウイルス導入を行うために、ＴＣ処理されていない２４ウェルプレートを０．５ｍｌ／ウェルのレトロネクチン（ＲＮ、タカラ）で被膜を施し、４℃で一晩または室温で２時間インキュベートした。プレートを、１ウェル当たり０．５ｍｌのブロッキング鑑賞液（５％ＦＢＳ添加ＰＢＳ）で３０分間、室温でブロッキングし、ＰＢＳで１回洗浄した。０．５ｍｌの培地に入れた２×１０^５のジャーカット細胞を、ＲＮ被膜２４ウェルプレートに播種し、０．５ｍｌのウイルス上清と混合した。プレートを８８０×ｇで９０分間遠心沈殿した（加速３、減速０）。３～４日後にフローサイトメトリーによって導入効率を測定した。
レンチウイルスを使用した形質移入および形質導入

【0623】

レンチウイルスを用いた形質移入を実施するために、およそ３×１０^６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍの培養皿に播種し、その２４時間後、第三世代パッケージング構築物（ｐＲＳＶ－ＲｅｖおよびｐＣｇｐＶパッケージングベクター、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇエンベロープベクター、セルバイオラボ）と形質移入試薬であるポリエチレンイミン（ＰＥＩ、１ｍｇ／ｍｌ、ポリサイエンス）またはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、１０μｇのｐＳＭＰＵＷ－ＮＦＡＴ－ＩＬ－２に基づくレポーター構築物で形質移入を行った。いくつかのレンチウイルス形質移入については、形質移入効率の尺度としてｐｍａｘＧＦＰ（ＳＥ細胞株４ＤヌクレオファクターＸキットＬ（ＳＥ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＸ Ｋｉｔ Ｌ）、ロンザ）を共に移入した。形質移入の４８時間後と７２時間後にウイルス上清を回収し、０．４５μｍフィルターに通した。初代Ｔ細胞を単離し、形質導入の４８時間前に、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを用いてＩＬ－２とＩＬ－１５を加えた培地中で活性化した（「ヒト健常者提供者からのＴ細胞およびＢ細胞の単離」の項を参照のこと）。初代Ｔ細胞へのレンチウイルスの導入は、「レンチウイルスを使用した形質移入および形質導入」の項で説明したように、ＲＮ被膜プレートを遠心することによる導入で実施した（２４ウェルプレートの１ウェルあたり２．５×１０^５の初代Ｔ細胞を使用）。ジャーカット細胞へのレンチウイルスの導入を実施するために、２×１０^５の細胞をポリブレン（シグマアルドリッチ）を含む１ｍｌのウイルス上清に再懸濁した。この細胞を２４ウェルプレートに播種し、３～４日後にフローサイトメトリーにより導入効率を測定した。形質導入された初代Ｔ細胞には、３～４日ごとにサイトカインを含む新鮮な培地を添加した。
ジャーカットＴＣＲノックアウト（ＫＯ）ＣＤ８陽性細胞株の生成

【0624】

ジャーカットＥ６－１細胞株にｐＭＰ７１－ＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８βをレトロウイルスで形質導入し、ＣＤ８を発現させた。さらに、シェパーらの研究^４６に記載されているように、ＴＣＲα鎖およびβ鎖をノックアウトすることによって、内因性ＴＣＲの発現を除去した。ＣＤ８を高発現している単一細胞のクローンを選別し、増殖させた。
ジャーカット細胞のエレクトロポレーション

【0625】

ｐＭＫＲＱ－ＮＦＡＴプラスミドの非ウイルス性送達によるジャーカット細胞への導入は（図２４）、ロンザのジャーカットクローンＥ６．１ ＡＴＣＣ用アマクサ４Ｄヌクレオファクタープロトコール（Ａｍａｘａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆａｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（カタログ番号Ｖ４ＸＣ－１０２４）に従って達成した。
共培養アッセイ

【0626】

ＣＤＫ４変異体（ＡＬＤＰＨＳＧＨＦＶ）ペプチドおよびＣＭＶｐｐ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドはペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）から購入した。３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした後、１ｍｌ当たり１×１０^６細胞の密度で、ＪＹ細胞にペプチドを負荷した。その後、ＪＹ細胞を培地で２回洗浄した。ＥＢＶ ＬＣＬに、２５ｍｅｒのポリペプチド鎖をコードするレトロウイルスベクターを形質導入した。これらのポリペプチドは、目的のエピトープ（例えば、ＣＤＫ４変異体およびＣＭＶｐｐ６５ペプチド）を含み、縦列ミニ遺伝子（ＴＭＧ）２．１と称される。同族ペプチドを含まない、または無関係なペプチドを負荷したＪＹ細胞、および非導入ＥＢＶ ＬＣＬを陰性対照として使用した。

【0627】

共培養の２４時間前に、エフェクター細胞と標的細胞を低密度（０．２５／０．５×１０^６細胞／ｍｌ）で播種した。特に断りのない限り、共培養は９６Ｗ丸底プレートに２００，０００のエフェクター細胞と標的細胞を入れて（総量２００μｌ、Ｅ：Ｔ比１：１）、２０時間行った。２０時間のインキュベーションの前にプレートを１１００ｒｐｍで１分間、遠心沈殿した。標的細胞をゲートアウトするために、抗ヒトＣＤ２０抗体をパネルに含めた。

【0628】

図１９ｃ、１９ｄで使用したＭＡＣＳ ＧＭＰ細胞分化バッグ５００は、ミルテニーバイオテックから購入した。
試薬

【0629】

追加の試薬として以下のものを使用した。ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（５０ｎｇ／ｍｌ、ＰＭＡ，シグマアルドリッチ）、イオノマイシンカルシウム（１ｍＭ、シグマアルドリッチ）、ピューロマイシン二塩酸塩（ギブコ）、ブラストサイジンＳ塩酸塩（ギブコ）。
増殖倍率

【0630】

図１８の増殖倍率の値を毒性の指標として用い、選択後の総細胞数を選択開始時の総細胞数で割ることにより算出した。得られた値を、４日目の再度播種について補正した。
統計的分析

【0631】

ＥＣ５０値の算出と統計分析はグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）８を用いて行った。図２３では、二元配置分散分析に続いてシダックの多重比較検定を行い、Ｐ値が０．０５以下の場合を統計的に有意とした（^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ≦０．０１）。

【0632】

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１５．ボルゲイＨ、パズ－アレスＬ、ホーンＬら。進行性非扁平上皮非小細胞肺癌におけるニボルマブ対ドセタキセル（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎｓｑｕａｍｏｕｓ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．）ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、２０１５；３７３（１７）：１６２７－１６３９。ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１５０７６４３
１６．イーＣ、トンプソンＪＡ、バードＤら。転移性黒色腫患者に対する抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンを用いた養子Ｔ細胞療法：移植Ｔ細胞のインビボでの持続性、移動性および抗腫瘍効果（Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ： Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ， ｍｉｇｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．）米国科学アカデミー紀要、２００２；９９（２５）：１６１６８－１６１７３。ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２４２６０００９９
１７．ローゼンバーグＳＡ、ヤンＪＣ、シェリーＲＭら。Ｔ細胞移植免疫療法を用いた前治療歴の長い転移性黒色腫患者における耐久性のある完全奏効（Ｄｕｒａｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｈｅａｖｉｌｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｕｓｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．）臨床癌研究（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、２０１１；１７（１３）：４５５０－４５５７。ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１１－０１１６
１８．ステバノビクＳ、ドレーパーＬＭ、ランハムＭＭら。ヒトパピローマウイルス標的腫瘍浸潤性Ｔ細胞による治療後の転移性子宮頸がんの完全退縮（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ．）臨床腫瘍学ジャーナル、２０１５；３３（１４）：１５４３－１５５０。ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１４．５８．９０９３
１９． ステバノビクＳ、ヘルマンＳＲ、ウンデルリッヒＪＲら。ヒトパピローマウイルス関連上皮性癌に対する腫瘍浸潤性リンパ球療法の第ＩＩ相試験（Ａ Ｐｈａｓｅ ＩＩ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｎｃｅｒｓ．）臨床癌研究、２０１９；２５（５）：１４８６－１４９３。ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１８－２７２２
２０．パパイオアナウＮＥ、ベニアタＯＶ、ビトソスＰ、ツシツシロニスＯ、サマラＰ。免疫系を利用した癌治療の改善（Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．）トランスレーショナル医療紀要（Ａｎｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．）２０１６；４（１４）。ｄｏｉ：１０．２１０３７／ａｔｍ．２０１６．０４．０１
２１．シャンＪ、ワンＬ。癌に対するＴＣＲ－Ｔ細胞臨床試験の新たなる世界：体系的な総説（Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ＴＣＲ－Ｔ ｃｅｌｌ ｔｒｉａｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ： Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．）癌の研究と治療における技術（Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．）、２０１９；１８。ｄｏｉ：１０．１１７７／１５３３０３３８１９８３１０６８
２２．ローゼンバーグＳＡ、ヤンＪＣ、レスティフォＮＰ。癌免疫療法：現行のワクチンを超えて（Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ： Ｍｏｖｉｎｇ ｂｅｙｏｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ．）ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ Ｍｅｄ．）、２００４；１０（９）：９０９－９１５。ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ１１００
２３．ロビンズＰＦ、カシミＳＨ、トランＴＬＮら。ＮＹ－ＥＳＯ－１反応性Ｔ細胞受容体を遺伝子工学的に導入したリンパ球を用いた予備的試験：長期追跡調査と奏効との相関関係（Ａ ｐｉｌｏｔ ｔｒｉａｌ ｕｓｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ＮＹ－ＥＳＯ－１－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．）癌臨床研究、２０１５；２１（５）：１０１９－１０２７。ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１４－２７０８
２４．パークハーストＭＲ、ヤンＪＣ、ランガンＲＣら。癌胎児性抗原を標的とするＴ細胞は、転移性大腸癌の退縮を媒介することができるが、重度の一過性大腸炎を誘発する（Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｃａｎ ｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｂｕｔ ｉｎｄｕｃｅ ｓｅｖｅｒｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｃｏｌｉｔｉｓ．）分子治療（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、２０１１；１９（３）：６２０－６２６。ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２７２
２５．モルガンＲＡ、チンナムサミーＮ、アバテ－ダガＤら。抗ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲ遺伝子治療後の癌の退縮と神経毒性（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｎｔｉ－ＭＡＧＥ－Ａ３ ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．）免疫治療学雑誌（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、２０１３；３６（２）：１３３－１５１。ｄｏｉ：１０．１０９７／ＣＪＩ．０ｂ０１３ｅ３１８２８２９９０３
２６．シューマッハーＴＮ、シュレイバーＲＤ。癌免疫治療における新生抗原（Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．）サイエンス（８０－）、２０１５；３４８（６２３０）：６９－７４。ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａａ４９７１
２７．トランＥ、ツルコッテＳ、グロスＡら。上皮性癌患者における変異特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞に基づく癌免疫療法（Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ．）サイエンス（８０－）、２０１４；３４４（６１８４）：６４１－６４５。ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５１１０２
２８．トランＥ、ロビンズＰＦ、リューＹ－Ｃら。癌の変異型ＫＲＡＳを標的としたＴ細胞移植療法（Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ．）ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、２０１６；３７５（２３）：２２５５－２２６２。ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０９２７９
２９．ロデンコＢ、トーベスＭ、ハドラップＳＲら。紫外線を介したリガンド交換によるペプチド－ＭＨＣクラスＩ複合体の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＵＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｇａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ．）ネイチャープロトコルズ（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．）、２００６；１（３）：１１２０－１１３２。ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００６．１２１
３０．コーエンＣＪ、ガートナーＪＪ、ホロビッツ－フリードＭら。腫瘍および末梢血リンパ球からの新生抗原特異的Ｔ細胞の単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｕｍｏｒ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．）ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．）、２０１５；１２５（１０）：３９８１－３９９１。ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ８２４１６
３１．ヤダフＭ、ジュンジュンワラＳ、ファンＱＴら。質量分析とエクソーム配列決定の組み合わせによる免疫原性腫瘍の変異の予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｕｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．）ネイチャー、２０１４；５１５（７５２８）：５７２－ ５７６。ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４００１
３２．ロペス－カブレラＭ、サンティスＡＧ、フェルナンデス－ルイズＥら。シグナル伝達受容体のＣ型動物レクチンスーパーファミリーの新しいメンバーであるヒト初期リンパ球活性化抗原ＡＩＭ／ＣＤ６９の分子クローニング、発現、および染色体局在（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅａｒｌｉｅｓｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ＡＩＭ／ＣＤ６９， ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ－Ｔｙｐｅ ａｎｉｍａｌ ｌｅｃｔｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ－ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）実験医学雑誌（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．）、１９９３；１７８（２）：５３７－５４８。ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．１７８．２．５３７
３３．クリシュナマニＶ、スタムネスＭＡ、ピペルＲＣ。ＭＡＬＴＡ： ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ、ｃＤＮＡライブラリーのカバー数を推定するための装置（ＭＡＬＴＡ： Ａ ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｗｉｔｈ ｓｈＲＮＡ，ＣＲＩＳＰＲ，ａｎｄ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．）ソフトウェアＸ（ＳｏｆｔｗａｒｅＸ．）、２０１９；９：１５４－１６０。ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｏｆｔｘ．２０１９．０１．００６
３４．ウォルフェルＴ、ホイヤーＭ、シュナイダーＪら。ヒト黒色腫における細胞溶解性Ｔリンパ球が標的とするｐ１６ＩＮＫ４ａ非感受性ＣＤＫ４変異体（Ａ ｐ１６ＩＮＫ４ａ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＣＤＫ４ ｍｕｔａｎｔ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．）サイエンス（８０－）、１９９５；２６９（５２２８）：１２８１－１２８４。ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．７６５２５７７
３５．ウィリスＭＲ、カーマイケルＡＪ、マイナードＫら。ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のサイトメガロウイルスに対する反応は、構造タンパク質ｐｐ６５によって支配される：ｐｐ６５特異的ＣＴＬの頻度、特異性、Ｔ細胞受容体使用率（Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ （ＣＴＬ） ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ｄｏｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｐ６５： ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ， ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｓａｇｅ ｏｆ ｐｐ６５－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ．）ウイルス学雑誌（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．）、１９９６；７０（１１）：７５６９－ ７５７９。ｄｏｉ：１０．１１２８／ｊｖｉ．７０．１１．７５６９－７５７９．１９９６
３６．ガルキナＥ、タノウシスＫ、プリースＧら。Ｌ－セレクチンの脱落は、定常的なＴ細胞輸送を制御するのではなく、抗原活性化Ｔリンパ球の移動経路を制御する（Ｌ－Ｓｅｌｅｃｔｉｎ Ｓｈｅｄｄｉｎｇ Ｄｏｅｓ Ｎｏｔ Ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｂｕｔ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ－ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．）実験薬学雑誌（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．）、２００３；１９８（９）：１３２３－１３３５。ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２００３０４８５
３７．フーイジバーグＥ、バッカーＡＱ、ルイゼンダールＪＪ、スピッツＨ。ＮＦＡＴ制御によるＧＦＰの発現により、抗原刺激を受けた初代ヒトＴ細胞の可視化と単離が可能になる（ＮＦＡＴ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＦＰ ｐｅｒｍｉｔｓ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ．）ブラッド（Ｂｌｏｏｄ．）、２０００；９６（２）：４５９－４６６。ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ．ｖ９６．２．４５９．０１４ｋ５０＿４５９＿４６６
３８．ヤッツＳ、ライトナーＪ、シュメッテラーＫら。３つの指標を有するＴ細胞レポーターラインにおける共刺激と共阻害の評価：ＮＦ－κＢ、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１の同時測定（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｔｒｉｐｌｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｌｉｎｅ： Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ＮＦ－κＢ， ＮＦＡＴ ａｎｄ ＡＰ－１．）ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．）、２０１６；４３０：１０－２０。ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１６．０１．００７
３９．モリモトＳ、フジキＦ、コンドウＫら。Ｔ細胞受容体の機能的結合性を効率的かつ正確に評価するための新規プラットフォーム細胞株の樹立（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｖｉｄｉｔｙ．）オンコターゲット（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．）、２０１８；９（７５）：３４１３２－３４１４１。ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２６１３９
４０．ライゼクＪ、ネレターＴ、ペンＨら。新規ＮＦ－κＢ／ＮＦＡＴレポーター細胞プラットフォームを用いたキメラ抗原受容体ライブラリーのスクリーニング（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ ＮＦ－κＢ／ＮＦＡＴ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ．）分子治療、２０１９；２７（２）：２８７－２９９。ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１８．１１．０１５
４１．ズフェリーＲ、デュルＴ、マンデルＲＪ、ブコフスキーＡ、クイロスＤ、ナルディニＬ、およびトロノＤ。自己不活性化レンチウイルスベクターによる安全かつ効率的なインビボ遺伝子送達（Ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｓａｆｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．）ウイルス学雑誌、７２（１２）， ９８７３－８０。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ．より検索。２０２０年５月２１日にアクセス。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／９８１１７２３％０Ａｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｎｉｈ．ｇｏ ｖ／ａｒｔｉｃｌｅｒｅｎｄｅｒ．ｆｃｇｉ？ａｒｔｉｄ＝ＰＭＣ１１０４９９
４２．スピンドラーＭＪ、ネルソンＡＬ、ワグナーＥＫら。天然型に対合したヒトＴＣＲαβレパトアの超並列検索とマイニング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｎｉｎｇ ｏｆ ｎａｔｉｖｅｌｙ ｐａｉｒｅｄ ｈｕｍａｎ ＴＣＲαβ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．）ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０２０年にオンラインで発行、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４３８－ｙ
４３．レディーＭ、エイリキスＥ、デービスＣ、デービスＨＭ、プラブハカーＵ。刺激したヒト末梢血単核球培養細胞におけるリンパ球活性化マーカーの発現とサイトカイン分泌プロファイルの網羅的解析：細胞性免疫機能をモニターするためのインビトロモデル（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ： Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．）ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド、２００４；２９３（１－２）：１２７－１４２。ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２００４．０７．００６
４４．チャオＣＣ、ジェンセンＲ、デイリーＭＯ。活性化Ｔ細胞によるＬ－セレクチンの制御機構（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．）免疫学雑誌、１９９７；１５９（４）：１６８６－１６９４。２０２０年５月１５日にアクセス。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／９２５７８２９
４５．ヤンＳ、リウＦ、ワンＱＪ、ローゼンバーグＳＡ、モーガンＲＡ。ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）の脱落は、ヒト腫瘍反応性Ｔリンパ球の溶血活性の獲得を制御する。（Ｔｈｅ Ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｏｆ ＣＤ６２Ｌ （Ｌ－ Ｓｅｌｅｃｔｉｎ） Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．）ティーグＲＭ編。プロスワン（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．）、２０１１；６（７）：ｅ２２５６０。ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２２５６０
４６．シェパーＷ、ケルダーマンＳ、ファンチＬＦら。ヒトの癌における腫瘍内ＴＣＲレパトアの低反応性と可変性（Ｌｏｗ ａｎｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ＴＣＲ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ．）ネイチャー・メディシン、２０１９；２５（１）：８９－９４。ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１８－０２６６－５
実施例２０

【0633】

本実施例では、異なるエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を用いて、ＴＣＲライブラリーから抗原特異的ＴＣＲを回収することを説明する。

【0634】

抗原反応性の特徴が明らかになっている５つＴＣＲと特徴の分かっていない９５のＴＣＲ（１００×１００ライブラリー用；図３５Ａ）を選択してＴＣＲライブラリーを生成した（ツイストバイオサイエンス、サンフランシスコ、米国で実施）。簡単に説明すると、これらのＴＣＲに由来するＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を、ＤＮＡ合成によって断片として生成した。ライブラリー生成のために、選択した全てのＴＣＲαおよびＴＣＲβ断片を、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセット（配列番号１）をコードする連続した核酸分子にコンビナトリアルに接合した。ライブラリー作製のための足場として、ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖の両方、ならびにピューロマイシン選択マーカーを含むレトロウイルス構築物を使用することができる。この構築物を用いたレトロウイルス導入により、最終的に１つの転写産物が発現し、２Ａ部位でのペプチド切断により、ＴＣＲβ鎖、α鎖、およびピューロマイシン耐性マーカーが翻訳されることになる。ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン（配列番号１）の形式で、１つのカセットにつき１つのＴＣＲβ断片とＴＣＲα断片を結合させることができる。１００のＴＣＲそれぞれのＴＣＲβ領域とＴＣＲα領域を、ツイストバイオサイエンスによって実行されたコンビナトリアルクローニング手法で合成し、このベクターに挿入した。

【0635】

１００×１００のライブラリーを、フュージーン形質移入試薬および当業者に知られているプロトコールにより、フェニックス－広宿主性ウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１３）に形質移入した。結果として生じたレトロウイルスビリオンを使用して、ジャーカットレポーターＴ細胞株を形質転換した。ジャーカットレポーターＴ細胞株は内因性ＴＣＲ発現を欠くもので（そのような遺伝子ノックアウトの生成は、例えば、メザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法でＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように修飾する。ジャーカットレポーターＴ細胞にＴＣＲライブラリーを導入した結果、全ての生存しているＴＣＲ修飾Ｔ細胞のうち、２５％がＴＣＲで修飾された（形質導入４日後、つまりピューロマイシン選択後、の染色に基づく結果。アッセイ当日の純度は８０％超であった）。ＴＣＲライブラリー（配列番号１）にマウスＴＣＲ定常ドメイン配列を使用することで、マウスＴＣＲβの定常ドメインに特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＴＣＲ修飾ジャーカットＴ細胞を検出できるようになる。細胞培養にピューロマイシンを添加することで、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性導入遺伝子を発現するように修飾したジャーカットＴ細胞が高い純度で正に選択された。遺伝子組換え細胞の抗生物質選択は、当業者に知られている。

【0636】

次に、ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞を、抗原を提示するように操作されたＡＰＣで刺激した。ＴＭＧを発現するＥＢＶ ＬＣＬ細胞に、特定の抗原を発現するように操作されていないＥＢＶ ＬＣＬを１０％ずつ添加した。共培養の３日前にジャーカットレポーターＴ細胞を低密度（１ｍｌあたり０．１×１０^６細胞）で播種した。ＡＰＣとジャーカットレポーターＴ細胞を１：１、１：２、１：３の比率で、１ｍｌ当たり２．５×１０^６の細胞密度で混合した。各Ｅ：Ｔ比について、ＴＭＧ発現条件で１回の反復実験を、ＴＭＧが発現していない条件で１回の陰性対照反復実験を実施した。この混合物を２００μｌ（１ウェル当たり０．５×１０^６細胞）ずつ、ＴＣ処理した丸底９６ウェルプレートのおよそ３６０、５４０または７２０のウェルに分注した。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心し、３７℃で２０～２２時間インキュベートした。

【0637】

その後、共培養物を採取し、ミルテニーの抗ＣＤ２０マイクロビーズで細胞を標識し、磁石上に置いたＬＳカラムに移した。磁気ビーズ選択では、ＣＤ２０陽性細胞はカラムに保持されるがＣＤ２０陰性細胞はカラムを通過するため、陰性画分を回収した。その後、これらのＣＤ２０陰性細胞を、ＣＤ２０とＣＤ６９の蛍光標識抗体で染色した。次に、４％ホルムアルデヒドを含む固定用緩衝液を用いて、細胞を固定した。ＢＤバイオサイエンスＡＲＩＡフュージョンフローサイトメトリーソーターを用いて、各刺激条件について以下の集団を選別した（図３５Ｂ）。
１．リンパ球、単細胞、生細胞、ＣＤ２０陰性、ＣＤ８陽性、高ＣＤ６９（高ＣＤ６９は、単細胞、ＣＤ２０陰性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルに基づいて選ばれる上位１０～１５％を含む）。
２．リンパ球、単細胞、生細胞、ＣＤ２０陰性、ＣＤ８陽性、低ＣＤ６９（低ＣＤ６９は、単細胞、ＣＤ２０陰性細胞のうち、ＣＤ６９蛍光シグナルが低い方から１０～１５％を含む）。

【0638】

選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これをサイクル数を制限した複数回のＰＣＲの鋳型として使用し、当業者に知られているＰＣＲ法を用いてＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットの一部を増幅した。得られたＰＣＲ産物の大きさは約１．５ｋｂ（図３５Ｃ）で、当業者に公知の技術を使用してオックスフォードナノポアミニオンまたはグリッドイオン配列決定装置を用いて配列決定することが可能である。ＴＣＲの同一性を、当業者に知られているアライメント技術を用いて回復し、差次的に発現するＴＣＲの組み合わせを、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して同定する。Ｒｌｏｇ変換リードカウントをＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して計算し、下位試料のＲｌｏｇ値を上位試料のＲｌｏｇ値から減算し、Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）および非存在下（ｙ軸）で実施した共培養について表した（図３５Ｄ）。５つの特徴の分かっているＴＣＲを、より大きな濃い灰色の点として示す。５つの特徴の分かっているＴＣＲのＴＣＲの同一性、および主要な統計的指標を表す（図３５Ｅ）。

【0639】

まとめると、この実施例は、エフェクター細胞に対する標的細胞の比率を上げることで、ＴＣＲライブラリーのスクリーニングプラットフォームの感度が向上することを示している。
実施例２１

【0640】

本実施例では、ビーズを用いた細胞選別戦略を用いて、遺伝子合成により作製したＴＣＲライブラリーから抗原特異的ＴＣＲを回収することを説明する。

【0641】

抗原反応性の特徴が明らかになっている５つＴＣＲと特徴の分かっていない９５のＴＣＲ（１００×１００ライブラリ用；図３６Ａ）を選択してＴＣＲライブラリーを生成した（ツイストバイオサイエンス、サンフランシスコ、米国で実施）。簡単に説明すると、これらのＴＣＲに由来するＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を、ＤＮＡ合成によって断片として生成した。ライブラリー生成のために、選択した全てのＴＣＲαおよびＴＣＲβ断片を、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセット（配列番号１）をコードする連続した核酸分子にコンビナトリアルに接合した。ライブラリー作製のための足場として、ＴＣＲβ鎖とＴＣＲα鎖の両方、ならびにピューロマイシン選択マーカーを含むレトロウイルス構築物を使用することができる。この構築物を用いたレトロウイルス導入により、最終的に１つの転写産物が発現し、２Ａ部位でのペプチド切断により、ＴＣＲβ鎖、α鎖、およびピューロマイシン耐性マーカーが翻訳されることになる。ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン（配列番号１）の形式で、１つのカセットにつき１つのＴＣＲβ断片とＴＣＲα断片を結合させることができる。１００のＴＣＲそれぞれのＴＣＲβ領域とＴＣＲα領域を、ツイストバイオサイエンスによって実行されたコンビナトリアルクローニング手法で合成し、このベクターに挿入した。

【0642】

１００×１００のライブラリーを、フュージーン形質移入試薬および当業者に知られているプロトコールにより、フェニックス－広宿主性ウイルス産生細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１３）に形質移入した。結果として生じたレトロウイルスビリオンを使用して、ジャーカットレポーターＴ細胞株を形質転換した。ジャーカットレポーターＴ細胞株は内因性ＴＣＲ発現を欠くもので（そのような遺伝子ノックアウトの生成は、例えば、メザドラら、ネイチャー、２０１７に記載されている）、当業者に知られている方法でＣＤ８α－Ｐ２Ａ－ＣＤ８β導入遺伝子（配列番号２）を形質導入すると、ヒトＣＤ８αおよびＣＤ８βを発現するように修飾する。ジャーカットレポーターＴ細胞にＴＣＲライブラリーを導入した結果、全ての生存しているＴＣＲ修飾Ｔ細胞のうち、２５％がＴＣＲで修飾された（形質導入４日後、つまりピューロマイシン選択後の染色に基づく結果。アッセイ当日の純度は８０％超であった）。ＴＣＲライブラリー（配列番号１）にマウスＴＣＲ定常ドメイン配列を使用することで、マウスＴＣＲβの定常ドメインに特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＴＣＲ修飾ジャーカットＴ細胞を検出できるようになる。細胞培養にピューロマイシンを添加することで、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲα－Ｔ２Ａ－ピューロマイシン耐性導入遺伝子を発現するように改変したジャーカットＴ細胞が高い純度で正に選択された。遺伝子組換え細胞の抗生物質選択は、当業者に知られている。

【0643】

次に、ＴＣＲを導入したジャーカットＴ細胞を、腫瘍由来抗原を提示するように操作された、または操作されていないＡＰＣで刺激した（それぞれにつき１回のみの反復実験とした）。共培養の３日前にジャーカットレポーターＴ細胞を低密度（１ｍｌあたり０．１×１０^６細胞）で播種した。ＡＰＣとジャーカットレポーターＴ細胞を１：１の比率で、１ｍｌ当たり２．５×１０^６の細胞密度で混合した。この混合物を２００μｌ（１ウェル当たり０．５×１０^６細胞）ずつ、ＴＣ処理した丸底９６ウェルプレートのおよそ３６０のウェルに分注した。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心し、３７℃で２０～２２時間インキュベートした。

【0644】

その後、共培養物を採取し、死細胞除去キットを用いて死細胞を除去した。生細胞を多段階単離戦略に基づいて単離し（図３６Ｂ）、抗ＣＤ２０マイクロビーズで標識し、オートＭＡＣＳ（ミルテニー、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）上に移した。磁気ビーズ選択では、ＣＤ２０陽性細胞はカラムに保持されるがＣＤ２０陰性細胞はカラムを通過するため、陰性画分を回収した。その後、これらのＣＤ２０陰性細胞をＣＤ６２Ｌマイクロビーズで標識し、オートＭＡＣＳを用いて非活性化ジャーカット細胞と活性化ジャーカット細胞とを分離した。この分離後、陰性画分（ＣＤ６２Ｌ陰性細胞）と陽性画分（ＣＤ６２Ｌ陰性細胞）の両方をＣＤ６９ビオチン抗体で標識し、抗ビオチンマイクロビーズを用いてＣＤ６９陰性およびＣＤ６９陽性画分を分離した。以下の集団をさらなる解析のために回収した（図３６Ｂ）。
１．ＣＤ２０陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＤ６９陰性（「下位」画分、つまり非活性化ジャーカットＴ細胞）。
２．ＣＤ２０陰性、ＣＤ６２Ｌ陰性、ＣＤ６９陽性（「上位」画分、つまり活性化されたジャーカットＴ細胞）。

【0645】

ビーズを用いて選別したＴＣＲ導入ジャーカットＴ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これをサイクル数を制限した複数回のＰＣＲの鋳型として使用し、当業者に知られているＰＣＲ法を用いてＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαカセットの一部を増幅した。得られたＰＣＲ産物の大きさは約１．５ｋｂ（図３６Ｃ）で、当業者に公知の技術を使用してオックスフォードナノポアミニオンまたはグリッドイオン配列決定装置を用いて配列決定することが可能である。ＴＣＲの同一性を、当業者に知られているアライメント技術を用いて回復し、差次的に発現するＴＣＲの組み合わせを、ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して同定する。各ＴＣＲのＲｌｏｇ変換リードカウントをＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して計算し、下位試料のＲｌｏｇ値を上位試料のＲｌｏｇ値から引き、Ｂ細胞によるＴＭＧ発現の存在下（ｘ軸）および非存在下（ｙ軸）で実施した共培養について表した（図３６Ｄ）。上位試料において最も差次的に表現された上位７つのＴＣＲのＴＣＲα鎖およびβ鎖の同一性、ならびに主要な統計的指標を表す（図３６Ｅ）。

【0646】

まとめると、この実施例は、ビーズを用いた選別によって活性化細胞と非活性化細胞がうまく分離され、この技術を、遺伝子スクリーニング手法を用いたＴＣＲライブラリーからの抗原特異的ＴＣＲを同定する方法として、ＦＡＣＳに基づく細胞分離の代替方法として使用できることを示している。
実施例２２

【0647】

本実施例では、コンビナトリアルＴＭＧエンコーディングを、ペアワイズＴＣＲ濃縮度分析を用いて解決できることを説明する。この実施例では、コンビナトリアルＴＭＧエンコーディングを使用してＴＭＧを発現するＡＰＣのプールを混合することの可能性についてと、ＴＣＲライブラリー由来のＴＣＲによって認識される抗原を発現しているＴＭＧの解明についてを示す。

【0648】

コンビナトリアルＴＭＧエンコーディングを用いることで、スクリーニングの回数を増やすことなく、したがって、ＴＣＲライブラリースクリーニングのデータに由来するＴＣＲリード化合物によって認識されるＴＭＧを同定できる可能性を維持したまま、多数のＴＭＧを効率的にスクリーニングすることができる。コンビナトリアルＴＭＧエンコーディングは、ＴＭＧを発現しているＡＰＣのプールを作製すること、および、それぞれのＴＭＧがプール中で正確に１つの組み合わせとして表現されるという原則に基づいている。プール中の組み合わせは各ＴＭＧについて固有であるため、ＴＣＲライブラリーのスクリーニングに含まれるＴＣＲによって認識されるＴＭＧを同定することが可能になる。ＴＣＲライブラリーのスクリーニングに由来する所与のＴＣＲリード化合物によって認識される抗原をコードしているＴＭＧを、ペアワイズＴＣＲ濃縮度分析によって同定することが可能である。ペアワイズＴＣＲ濃縮度分析は、単一のプールをそれぞれ別々に分析するのではなく、プールの対を特異的に分析することによってシグナル強度を高める役割を果たす。

【0649】

コンビナトリアルＴＭＧ設計の一例を図３７Ａに示す。３６のＴＭＧが１２のプール（Ｃ１～６およびＲ１～６）で発現し、プールはそれぞれ６つのＴＭＧを発現している。ＴＭＧを発現するＡＰＣのプールは、ポリクローナルなＡＰＣの操作（例えば、ポリクローナルなウイルスを生産してＡＰＣに導入すること、もしくはモノクローナルなウイルスを生産してウイルスを混合してプールとし、そしてポリクローナルにＡＰＣに導入すること）、またはそれぞれが単一のＴＭＧを発現する操作したＡＰＣ細胞株を混合することによって、作製することができる。一例として、ペアワイズＴＣＲ濃縮度分析により、ＡＰＣプールＣ１およびＲ１の両方が所与のＴＣＲを活性化できることが示された場合、そのＴＣＲはＴＭＧ１によって発現される抗原を認識していることになる。これは、ＴＭＧ１が両方のプールで表される唯一のＴＭＧであるためである。図３７Ａに示すコンビナトリアルＴＭＧエンコーディングは、１つのＴＭＧが正確に２つのプールに存在することに基づいているが、各ＴＭＧが正確に３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のプールに存在する、同様のコンビナトリアルＴＭＧエンコーディングを設計することができる。各ＴＭＧが正確に３つのプールに存在する場合、所与のＴＣＲによって認識される３つのプールを特定することで、認識されるＴＭＧを推定することができる。認識されるＴＭＧは、３つのプール全てに共有されるＴＭＧである。

【0650】

図１０Ｇでは、ＴＣＲライブラリー発現レポーターＴ細胞をＴＭＧを発現するように操作していないＡＰＣと共培養した３回の対照スクリーニング、およびそれぞれが単一のＴＭＧを発現するＡＰＣ細胞株のプールとの共培養に基づく３回のスクリーニングを含む、３回の反復実験を用いて行ったスクリーニングの結果を示している。各ＴＭＧが正確に２つのプール中で表現される、前述のコンビナトリアルＴＭＧエンコーディングは、２回の反復実験に基づくスクリーニング手法で十分なＴＣＲの同定感度を伴う。ＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用して、図１０Ｇのデータから差次的に表現されたＴＣＲαおよびβ鎖の組み合わせを統計分析した。図３７Ｂおよび３７Ｃに示すように、ＣＲＣ患者のスクリーニング（図１０Ｇ）で同定されたＴＣＲリード化合物の順位または有意性のいずれかが類似しているか否かを、３回の反復実験のうちの２回の結果に基づいて試験した。図３７Ｂに示すように、ｐｔ２について７つのＴＣＲリード化合物を選ぶ場合、３回の反復実験のうちの２回の任意の組み合わせの複合分析に基づいて、同じＴＣＲが選ばれていた可能性がある。類似の方法では、図１０Ｇで同定されたＴＣＲリード化合物のいずれについても、統計分析に３回の反復実験のうちの２回を用いることで同じ（セットの）ＴＣＲが選ばれたであろう（図３７Ｃ；「順位」の列）。さらに、４つのＣＲＣ患者ＴＣＲライブラリーのスクリーニングで同定されたＴＣＲリード化合物のいずれについても、３回の反復実験のうちの２回の結果に基づく統計分析において、補正後のｐ値は同様である（図３７Ｃ）。このことは、３回の反復実験を伴うスクリーニングと同様の感度でＴＣＲを同定するためには、２回の反復実験で十分であることを示している。これにより、それぞれのＴＭＧがＴＭＧプール中で正確に２回表現されるコンビナトリアルＴＭＧ設計を用いて、認識されるＴＭＧを同定することが可能になる。

【0651】

コンビナトリアルＴＭＧエンコーディング設計に由来するＴＭＧの認識を解決するためのペアワイズＴＣＲ濃縮度分析の感度を試験するために、６つのｐｔ４試料（それぞれが上位試料と下位試料からなる）を分析用に選択した（図３７Ｄ）。６試料中で生じる可能性のある１５全てのペアワイズの組み合わせについて、ＤＥＳｅｑ２を使用して、下位試料に対する上位試料でのＴＣＲの差次的発現を分析した。分析には相互作用モデルを使用し、プールの対の、下位試料との比較における、上位試料でのＴＣＲの濃縮度を、その他全てのプールの下位試料に対する上位試料でのＴＣＲの濃縮度と対比した。すべての補正後ｐ値を、最も低いｐ値から最も高いｐ値まで順位付け、図３７Ｅに表す。２つの補正後ｐ値が他から突出していた。これらは、試料４と５のペアワイズＴＣＲ濃縮度分析におけるＴＣＲα９．β１４、および試料３と５のペアワイズＴＣＲ濃縮度分析におけるＴＣＲα４３．β１６を表している。これらの結果は、試料４と５で表現されるＴＭＧ４、および試料３と５で表現されるＴＭＧ３が、それぞれのＴＣＲで認識される抗原をコードしていることを示している。

【0652】

まとめると、この実施例は、それぞれが複数のＴＭＧを発現しているＡＰＣのプールを用いて、多数のミニ遺伝子に対するＴＣＲライブラリースクリーニングを行うことができること、そしてこのコンビナトリアルＴＭＧエンコーディング手法により、抗原反応性ＴＣＲと認識抗原を発現しているＴＭＧの両方を同定できることを示している。
実施例２３

【0653】

本実施例では、ＴＣＲの特性を遺伝子スクリーニングのデータから導き出すことができることについて説明する。この実施例は、ＴＣＲライブラリースクリーニング手法が、ＴＣＲの特性を導き出すのに十分な感度を有することを実証するものである。このことを目的として、ＴＣＲの誘発された活性化とバックグラウンドの活性化に関して、ＴＣＲ同定プラットフォームに由来する機能的遺伝子スクリーニングのデータを、独立した検証実験と比較する。

【0654】

図１０Ｇで同定された１６個のＣＲＣ ｐｔ２ ＴＣＲを、認識されるＴＭＧ（ＴＭＧ２）に対する反応性について評価した。遺伝子スクリーニング手法において観察された活性化と検証実験で観察された活性化の間には良好な相関が観察される（図３８、中央の図）。また、遺伝子スクリーニング手法において観察されたバックグラウンドの活性化と、検証実験で観察されたバックグラウンドの活性化との間にも良い相関が観察された（図３８；右図）。

【0655】

これらのデータは、ＴＣＲライブラリーのスクリーニング手法を用いてＴＣＲを同定した後に独立した実験で決定することができるＴＣＲの特性は、機能的遺伝子スクリーニングのデータを使ってスクリーニング段階で決定することが可能であることを示している。例えば、図３８に例示したように、相対的なＴＣＲの感度や抗原非存在下でのＴＣＲの活性化は、ＴＣＲライブラリーのスクリーニングにおいて決定することができる。相対的なＴＣＲの感度は、癌患者の治療用にＴ細胞産物を操作するための最適なＴＣＲを決定するのに重要であると考えられる。抗原非存在下におけるＴＣＲの活性化については、そのようなＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞は非癌細胞上に提示された抗原を認識する恐れがあるため、負の選択基準を含めることが検討され得る。

【0656】

スクリーニング段階の後に実施する必要のあるＴＣＲ特性評価アッセイの回数を減らすために、ＴＣＲライブラリーのスクリーニング段階において追加のスクリーニングを含めることもできる。それらの例としては、これらに限定されるものではないが、ｉ）ＴＣＲライブラリーのスクリーニング段階において、野生型ＴＭＧを発現するＡＰＣをＴＣＲの変異特異性を決定するための対照として用いたスクリーニング；ｉｉ）クラスＩまたはクラスＩＩ提示に必須の要素（Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ／ＣＤ７４）を欠失し、かつ、ＴＭＧを発現するように操作されたＡＰＣを、ＴＣＲのクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束性を決定するための対照として用いたスクリーニング；ｉｉｉ）異なる強度のプロモーターからＴＭＧを発現するＡＰＣを、ＴＣＲの感受性を決定するために用いたスクリーニング；が挙げられる。

【0657】

まとめると、この実施例は、ＴＣＲライブラリースクリーニングによってＴＣＲの特性を決定できることを示している。それにより、ＴＣＲライブラリースクリーニング段階の後に実施する必要のある、ＴＣＲの特性を決定するための実験の回数を減らすことができるため、スクリーニングからＴＣＲの特性決定までにかかる総所要時間を短縮できるという利点がある。
実施例２４：
レポーターＴ細胞の亜集団の単離を介した、ＴＣＲαβライブラリーからの抗原反応性ＴＣＲの回収（上位下位手法）

【0658】

本実施例では、抗原への応答に基づいて１つ以上の亜集団を単離することを介して、ＴＣＲαβライブラリーから抗原反応性ＴＣＲを回収することを説明する。簡単に説明すると、この手法は、ｉ）レポーターＴ細胞を、ＴＣＲαβライブラリーに含まれるＴＣＲの発現が可能になるように、操作するステップ；ｉｉ）これらの細胞と少なくとも１つの抗原を発現する抗原提示細胞との共培養を実施するステップ；ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化マーカーに基づいて、細胞を、ａ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現している「上位」集団と、ｂ）１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの発現を欠く（または発現が低い）「下位」集団とに分離するステップ；ｉｖ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲとそれに続くディープシークエンシングを用いて、上位試料と下位試料からＴＣＲを同定するステップ；および、ｖ）下位試料と比較して、上位試料で濃縮されている少なくとも１つの抗原反応性ＴＣＲを同定するステップ、を伴う。Ｔ細胞活性化マーカーの発現は、活性化Ｔ細胞を識別するマーカー（ＣＤ６９）の相対的に高い発現であっても、または非活性化Ｔ細胞を識別するマーカー（ＣＤ６２Ｌ）の相対的に低いレベルの発現であってもよい。

【0659】

上位下位手法は、抗原刺激により抗原反応性ＴＣＲは活性化マーカー陽性となるため、そのようなＴＣＲは、下位集団と比較すると、上位集団において濃縮されるだろうという原理に基づいている。上位下位手法を、以下に述べるように、様々な添付図によって説明する。

【0660】

別の態様では、下位試料は、任意の参照細胞集団であっても、またはＴＣＲプラスミドの参照ライブラリーであってもよい。下位試料は、上位試料と同じ細胞集団から選別されるが、活性化マーカー発現が低いものであってもよい。下位試料は、関連するＴＣＲライブラリーを発現するレポーターＴ細胞と外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞との共培養から得ることができる。下位試料は、レポーターＴ細胞（ここから上位試料を選別した）を作製するために使用されたＴＣＲプラスミドライブラリーであってもよい。いくつかの態様において、上位試料および下位試料におけるＴＣＲの表現は、差次的ＴＣＲ表現分析を行なっている最中に、他の任意の追加試料におけるＴＣＲの表現と比較することもできる。いくつかの態様において、そのような追加試料は、プラスミドＴＣＲライブラリーであってもよい。他の態様において、そのような追加試料は、関連するＴＲＣライブラリーを発現するレポーターＴ細胞と外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞との共培養に由来するものであってもよい。

【0661】

図３９のｒｌｏｇ値は、ＴＣＲ表現の指標を表している。このグラフは、５つの特徴の分かっているＴＣＲをそれらの同族抗原で刺激すると、他のいずれの試料と比較しても、上位試料（最も明るい灰色の陰影）で濃縮されることを示すものである。ＴＭＧを発現するＢ細胞との共培養から得られた下位試料は、外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞との共培養から得られた上位または下位試料よりも低いｒｌｏｇ値を示している。これらの結果に基づいて、当業者は、上位下位手法を用いた抗原反応性ＴＣＲの同定は、ｉ）上位試料と同じ細胞集団に由来するが活性化マーカーの発現が低い下位試料（下位＋ＴＭＧ）を用いた場合の方が、ｉｉ）外因性抗原を発現するように操作されていないＢ細胞との共培養から得られた下位試料を用いた場合よりも、高感度となることを理解するだろう。これは、上位＋ＴＭＧと下位＋ＴＭＧの間の差が、上位＋ＴＭＧと上位／下位－ＴＭＧとの間の差より大きいため、前者の比較を用いればＴＣＲ反応性を高感度に検出することができるためである。下位試料（すなわち、参照ＴＣＲ表現）は、関連するプラスミドＴＣＲライブラリー（図３９の黒点）に由来するものであってよく、これは、外来抗原を発現するように操作されていないＢ細胞との共培養に由来する上位または下位試料におけるＴＣＲ表現と相関している。

【0662】

本実施例の別の観点を図３９に示し、ここでは、図１４Ｆ、Ｇの１００×１００コンビナトリアルライブラリーの遺伝子スクリーニングに関するさらなる分析について示している。この実施例では、上位下位手法を示し、ここで下位試料に含まれる細胞は、上位試料が含まれる細胞集団から理想的に選別されるが、活性化マーカーは陰性である。図３９では、図１４Ｆ、ＧのデータをＤＥＳｅｑ２Ｒパッケージを使用してＲｌｏｇ変換し、５つの特徴の分かっているＴＣＲのそれぞれについて表わしている。それぞれの点は、独立した実験の結果を示しており、また、試料の種類によって色分けされている。上位試料が、ＣＤ６９が最も高く発現していた上位１０％の細胞を表している一方、下位試料は、その同じ細胞集団から選別された細胞ではあるが、ＣＤ６９の発現が低かった細胞を表している。図１６Ｅでは、それぞれが、同一性は分かっているが特異性が分かっていない異なるＴＣＲを発現している２４のＴ細胞株から作製したジャーカットｈＣＤ８陽性細胞のプールに、上位下位手法を適用した。これらの細胞株を１：１の割合で混合し、また、ＣＤＫ４－１７、ＣＤＫ４－８、ＣＭＶ＃１、ＣＭＶ＃２、ＧＣＮ１Ｌ１のいずれかのＴＣＲを発現するジャーカットｈＣＤ８陽性細胞も１：１０，０００から１：１，０００，０００の範囲の種々の頻度で混合した。これら５つのＴＣＲの同族抗原を発現するＢ細胞と共培養した後、細胞をＣＤ６９（Ｔ細胞活性化マーカー）で染色した。ＦＡＣＳを用いて、ＣＤ６９を最も高く発現している上位１０％のＴ細胞を上位試料に選別し、ＣＤ６９を低レベルで発現しているほぼ同量のＴ細胞を下位試料としてＦＡＣＳで選別した。両試料のＴＣＲ含量を、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲと、それに続くイルミナプラットフォームを用いた次世代シークエンスで分析した。上位試料と下位試料でのＴＣＲの相対的な存在量を算出し、この方法により、５つの特徴の分かっているＴＣＲすべてが濃縮されていることが観察された。

【0663】

図１３Ａ～Ｅでは、６つの抗原特異的ＴＣＲを発現するプラスミドを、同一性は分かっているが特異性が分かっていないプラスミドのプールに１：１０，０００～１００，０００の頻度で混合して、ＴＣＲライブラリーを作製した。このプラスミドプールを用いてレトロウイルスを作製し、ジャーカットｈＣＤ８陽性ＴＣＲ ＫＯ細胞に感染させた。このレポーターＴ細胞のポリクローナルなプールと、抗原特異的ＴＣＲの同族抗原を発現するＢ細胞とで共培養を行った。ＦＡＣＳを用いて、ＣＤ６９最も高く発現する上位１０％のＴ細胞を上位試料に選別し、ＣＤ６９を低レベルで発現しているほぼ同量のＴ細胞を下位試料としてＦＡＣＳで選別した（図１３Ｃ）。両試料のＴＣＲ含量を、ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって分析し（図１３Ｄ）、次いでイルミナプラットフォームを用いた次世代シークエンスを行った。上位試料と下位試料でのＴＣＲの相対的な存在量を算出し、この方法により、５つの特徴の分かっているＴＣＲすべてが濃縮されていることが観察された（図１３Ｅ）。

【0664】

図１０Ａ～Ｊでは、大腸癌（ＣＲＣ）標本のバルクＴＣＲ配列決定を用いて得られた最も多く存在するＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖から、コンビナトリアルＴＣＲライブラリーを作製した。このライブラリーをジャーカットｈＣＤ８陽性ＴＣＲ ＫＯ細胞（図１０Ｄ）にレトロウイルス導入し、その細胞と腫瘍特異的新生抗原を発現するＥＢＶ－Ｂ細胞との共培養を行った。ＦＡＣＳを用いて、ＣＤ６９最も高く発現する上位１０％のＴ細胞を上位試料に選別し、ＣＤ６９を低レベルで発現しているほぼ同量のＴ細胞を下位試料としてＦＡＣＳで選別した（図１０Ｅ）。全試料のＴＣＲ含量を、ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって分析し（図１０Ｆ）、次いでオックスフォードナノポアテクノロジーで次世代シークエンスを行った。上位試料と下位試料におけるＴＣＲの相対的な存在量を算出した。さらに３つのＣＲＣ標本についてこの方法を用いたところ、合計１１の新生抗原反応性ＴＣＲの候補が同定された（図１０Ｇ）。これらのうちの４つについては、独立した共培養実験においてさらに検証を行なった（図１０Ｈ－Ｋ）。

【0665】

図３６Ａ～Ｅでは、上位および下位の試料を、オートＭＡＣＳ（ミルテニー、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を用いたビーズに基づく選別によって分離している。卵巣癌（ＯＶＣ）または大腸癌（ＣＲＣ）の試料に由来する、５つの特徴の分かっているＴＣＲと９５の特徴の分かっていないＴＣＲを使用して、１００×１００設計のコンビナトリアルＴＣＲライブラリーを作製し、これをレポーターＴ細胞で発現させた。５つの特徴の分かっているＴＣＲの同族抗原を発現するＢ細胞と共培養した後、ＣＤ２０マイクロビーズを用いてＢ細胞を枯渇させた。その後、ＣＤ６２ＬマーカーとＣＤ６９マーカーを用いた連続したビーズに基づく選別によって、上位および下位試料を回収した。ＣＤ６２Ｌは非活性化Ｔ細胞に発現するマーカーであり、ＣＤ６９は活性化Ｔ細胞に発現するマーカーである。ＣＤ６２Ｌマイクロビーズとは結合しないが、ＣＤ６９マイクロビーズとは結合する細胞を上位試料として、ＣＤ６２Ｌマイクロビーズと結合するが、ＣＤ６９マイクロビーズとは結合しない細胞を下位試料として分離した。両試料のＴＣＲ含量を、ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって分析し（図３６Ｃ）、次いでオックスフォードナノポアテクノロジーを用いた次世代シークエンスおよびスクリーニング分析を行った（図３６Ｄ、Ｅ）。５つの特徴の分かっているＴＣＲは、下位試料と比較して、上位試料で最も有意に濃縮された７つのＴＣＲに含まれていた。この結果は、ビーズに基づく選別が、ＴＣＲライブラリースクリーニング手法において上位試料と下位試料を分離するための代替戦略として使用できることを示している。

【0666】

この実施例は、抗原反応性ＴＣＲの機能的遺伝子スクリーニングを可能にするために、複数のＴＣＲを発現するレポーターＴ細胞に上位下位手法を広く適用できることを示している。上位下位手法は、複数のＴＣＲを発現するポリクローナルなレポーターＴ細胞を作製する様式とは独立して適用することが可能である。このことは、様々な方法、例えば、ｉ）それぞれが定義されたＴＣＲを１つだけ発現するレポーターＴ細胞株を混合すること、ｉｉ）定義されたＴＣＲをコードするプラスミドを混合し、ポリクローナルなウイルスを産生し、レポーターＴ細胞に形質導入すること、および、ｉｉｉ）ＴＣＲライブラリーを用いてポリクローナルなウイルスを産生し、レポーターＴ細胞に形質導入すること、によって得られたＴＣＲ発現レポーターＴ細胞からの抗原反応性ＴＣＲの同定によって裏付けられている。

【0667】

さらに、本実施例は、上位下位手法が、ｉ）様々なＴ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９単独で、またはＣＤ６２Ｌ／ＣＤ６９と併用して）による染色、ｉｉ）様々な細胞選別技術（ＦＡＣＳによる選別、ビーズに基づく選別）を用いた分離、ｉｉｉ）様々な次世代シークエンス技術を用いた分析（イルミナ、オックスフォードナノポアテクノロジー）などの、様々な細胞分離技術やＴＣＲ同定技術に応用可能なことを示している。

【0668】

いくつかの態様では、前述した実施例で説明した手法（上位下位手法）を、ＴＣＲライブラリーを作製するための任意の方法に適用することができる。そのような方法としては、これらには限定されないが、ｉ）図１５で説明したライブラリーを設計するための様々な方法；ｉｉ）単一細胞内で発現するＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方の配列を同定するＴＣＲ配列決定技術（対合したＴＣＲの配列決定）に基づくライブラリーの設計；ｉｉｉ）ＴＣＲαおよびＴＣＲβ配列の細胞内連結とその後のクローニングに基づくライブラリーの設計、が挙げられる。上位下位手法は、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ２５、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦを含むがこれらには限定されない、任意のＴ細胞活性化マーカー、またはＴ細胞活性化マーカーの組み合わせによる細胞分離に基づくものであってもよい。上位下位手法を、セルトレース（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ）染色を含むがこれらには限定されない、任意の増殖マーカーに適用してもよい。上位下位手法を、ＣＤ６９（プロモーター）－ＥＧＦＲｔレポーターおよびＣＤ６９（プロモーター）－ＬＮＧＦＲレポーターを含むがこれらには限定されない、任意のＴ細胞活性化レポーターに基づく細胞分離に適用してもよい。上位下位手法を、ＦＡＣＳを利用した選別、微少流体技術に基づく細胞選別、ビーズの使用に基づく細胞選別を含むがこれらには限定されない、任意の細胞分離技術に適用してもよい。上位下位手法は、イルミナ、オックスフォードナノポアまたはパシフィックバイオサイエンステクノロジーを用いた配列決定を含むがこれらに限定されない、任意の次世代シークエンシング技術を用いて分析することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図10-5】

【図10-6】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図14-4】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図15-4】

【図15-5】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図18-4】

【図19-1】

【図19-2】

【図19-3】

【図19-4】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図22-1】

【図22-2】

【図22-3】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図24-3】

【図25-1】

【図25-2】

【図26-1】

【図26-2】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34-1】

【図34-2】

【図35-1】

【図35-2】

【図35-3】

【図36-1】

【図36-2】

【図36-3】

【図36-4】

【図37-1】

【図37-2】

【図37-3】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【国際調査報告】