▶ ウニベルシテテット イ トロムソ−ノルゲス アークティスク ウニベルシテットの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-05
(54)【発明の名称】海洋性ＤＮＡポリメラーゼＩ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20221128BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20221128BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20221128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221128BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20221128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221128BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20221128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N9/12 ZNA
C12Q1/48 Z
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12Q1/6844 Z
C12N1/19
C12N1/15
C12N5/10
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520140
(86)(22)【出願日】2020-10-01
(85)【翻訳文提出日】2022-04-28
(86)【国際出願番号】 EP2020077534
(87)【国際公開番号】W WO2021064108
(87)【国際公開日】2021-04-08
(31)【優先権主張番号】19200782.1
(32)【優先日】2019-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518338943
【氏名又は名称】ウニベルシテテット イ トロムソ－ノルゲス アークティスク ウニベルシテット
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ラーセン、アトレ ノラルフ
(72)【発明者】
【氏名】ピョートロフスキー、イヴォンネ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC01
4B050DD01
4B050LL03
4B050LL05
4B063QA01
4B063QQ28
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS32
4B063QX02
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
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4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA29
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼに関する。特に、本発明は、高いポリメラーゼ活性、鎖置換活性及び３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、海洋起源の熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。さらに、本発明は、実質的に鎖置換活性のない熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントであって、前記ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性及び３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を示し、前記ＤＮＡポリメラーゼは、２５℃を超える温度で、より好ましくは約３０℃を超える温度で不可逆的に不活性化されるものである、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント。
【請求項2】
単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントであって、前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント。
【請求項3】
単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントであって、前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント。
【請求項4】
前記単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、配列番号１又は配列番号２と配列の全長にわたって少なくとも７０％の配列同一性、例えば、配列番号１又は配列番号２と配列の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号１又は配列番号２と配列の全長にわたって少なくとも９０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項２又は３に記載の単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント。
【請求項5】
前記アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸番号に従う番号付けでアミノ酸４３１～４４７位及び５１９～５２３位に対応するアミノ酸領域の少なくとも１つに少なくとも１つの突然変異を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性を持たない、請求項２～４のいずれか一項に記載の単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント。
【請求項6】
４４９位、４５０位、４５１位、及び５２１位のアミノ酸が、【表1】
【請求項7】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、以下のアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼＩの群から選択され：・４５０位のアミノ酸がＡｓｐである、
・４４９位及び４５１位のアミノ酸がＡｌａである、
・４４９位及び４５０位のアミノ酸がそれぞれＡｌａ及びＡｓｐである、
・４５０位及び４５１位のアミノ酸がそれぞれＡｓｐ及びＡｌａである、
・４４９位、４５０位、及び４５１位のアミノ酸がそれぞれＡｌａ、Ａｓｐ、及びＡｌａである、
・配列番号８の５２１位のアミノ酸がＡｌａである、ここで、番号付けは配列番号１のアミノ酸の番号に従うものである、かつ
・前記ＤＮＡポリメラーゼＩのいずれも鎖鎖置換活性を持たない、
請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント。
【請求項8】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３、４、５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３、４、５、６、７、及び８のそれぞれと配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、ただし・配列番号３の４５０位のアミノ酸はＡｓｐであり、
・配列番号４の４４９位及び４５１位のアミノ酸はＡｌａであり、
・配列番号５の４４９位及び４５０位のアミノ酸はそれぞれＡｌａ及びＡｓｐであり、
・配列番号６の４５０位及び４５１位のアミノ酸はそれぞれＡｓｐ及びＡｌａであり、
・配列番号７の４４９位、４５０位及び４５１位のアミノ酸は、それぞれＡｌａ、Ａｓｐ及びＡｌａであり、
・配列番号８の５２１位のアミノ酸はＡｌａである、
請求項５又は６に記載の単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント。
【請求項9】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩである、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離されたＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント及びバッファーを含む組成物。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか一項に記載の単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸分子。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか一項に記載の単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸分子、ならびに前記核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写及び翻訳に必要な調節配列を含む発現ベクター。
【請求項13】
１２に記載の１つ以上の発現ベクター、又は請求項１１に記載の１つ以上の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項14】
請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを調製する方法であって：ａ）請求項１２に記載の１つ以上の組換え発現ベクター、又は請求項１１に記載の１つ以上の核酸分子を含む宿主細胞を、コードされたＤＮＡポリメラーゼの発現に適した条件下で培養するステップ；及び
ｂ）宿主細胞から、あるいは培地又は上清から、ＤＮＡポリメラーゼを単離又は取得するステップ
を含む方法。
【請求項15】
核酸増幅プロセス、配列決定反応、組換えクローニングプロセス又はマルチプルＤＮＡアセンブリプロセスにおける請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントの使用。
【請求項16】
２つ以上の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子をアセンブリする方法であって：（ａ）アセンブリされる２つ以上のｄｓＤＮＡ分子を提供するステップであって、前記ｄｓＤＮＡ分子は一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡオーバーハングを含み、前記２つ以上のｄｓＤＮＡ分子の前記オーバーハングを含む末端は配列同一性の領域を共有するステップ；
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子を、前記ＤＮＡ分子がオーバーハング部分を介してアニーリングする条件下でインキュベートするステップ；
（ｃ）アニーリングされた分子を、請求項１～９のいずれか一項に記載の熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントと接触させるステップであって、この接触により、ＤＮＡポリメラーゼは、ステップ（ｂ）で形成されたＤＮＡ分子のアニーリング後に残っているギャップを埋め、ここで、前記ＤＮＡポリメラーゼは、低下、減弱、又は不活性化した鎖置換活性を有するステップ
を含む方法。
【請求項17】
ステップ（ａ）の２つ以上のＤＮＡ分子のオーバーハングが、３’－５’エキソヌクレアーゼ、好ましくは熱不安定性エキソヌクレアーゼを使用して提供される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを使用するヌクレオチド重合の方法であって：（ａ）請求項１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント、テンプレート核酸分子、テンプレート核酸分子の一部にアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドプライマー、及び１つ以上のヌクレオチド種を含む反応混合物を提供するステップ；及び
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレート核酸分子にアニーリングし、前記ＤＮＡポリメラーゼが、１つ以上のヌクレオチドを重合することによってオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させる条件下で、前記反応混合物をインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項19】
請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを使用して核酸を増幅する方法であって：（ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント、テンプレート核酸分子、テンプレート核酸分子の一部にアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドプライマー、及びヌクレオチドを含む反応混合物を提供するステップ；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレート核酸分子にアニーリングし、前記ＤＮＡポリメラーゼが、１つ以上のヌクレオチドを重合して前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることによりポリヌクレオチドを生成する条件下で、前記反応混合物をインキュベートするステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼに関する。特に、本発明は、海洋起源の熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。さらに、本発明は、実質的に鎖置換活性のない熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。本発明はさらに、様々な分子生物学的プロセスにおける前記ＤＮＡポリメラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
合成生物学は急速に進化している分野であり、将来のバイオエコノミー及びバイオエネルギーの課題に対する可能な解決策として期待されている。合成生物学の究極のビジョンは、細胞が有用な役割を予測どおりに果たすことができるようにする、新しい生物学的操作システムを創出することである。合成生物学のパイプラインの重要なステップの１つは、ＤＮＡフラグメントをより大きな機能的構築物にアセンブリすることであり、多くの場合、多数のアセンブリが含まれる。
【0003】
しかし、現在障壁になっているのは、時間のかかる手動処理ステップなしで多数のＤＮＡアセンブリを行うためのしっかりした室温法がないことである。したがって、現在のハードルを回避できる新しいＤＮＡアセンブリ法が強く望まれている。
【0004】
ゲノムＤＮＡの複製は、モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）からのポリデオキシリボヌクレオチドの合成を触媒する、ＤＮＡポリメラーゼの主要な機能である。
【0005】
インビトロでは、ＤＮＡポリメラーゼの特性は、様々なＤＮＡ増幅プロセス、ＤＮＡアセンブリプロセス、及び、目的のＤＮＡ鎖テンプレートを読み取り、テンプレートにマッチする２つの新しいＤＮＡ鎖を作成するＤＮＡ分子の合成などのＤＮＡ合成で使用される。
【0006】
様々な種類のポリメラーゼが発見されている。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）やその他の原核細胞では、既知のＤＮＡポリメラーゼは一般にＤＮＡポリメラーゼＩ～Ｖと呼ばれている。これら様々なグループは、複製の忠実度、熱安定性、伸長速度、校正活性及び効率が異なる。いくつかのＤＮＡポリメラーゼはかなり単純で、他のＤＮＡポリメラーゼはより複雑である。例えば、大腸菌ポリメラーゼＩＩＩは２０個の異なるペプチドサブユニットからなる。ＤＮＡポリメラーゼはモノヌクレオチドから新規に合成を開始できないため、インビトロでのＤＮＡ複製プロセスで使用する場合、ｄＮＴＰに加えて、鎖成長の開始点として使用できる３’末端ヒドロキシル基を持つプライマー（初期オリゴヌクレオチド）が必要である。プライマーは、フリー３’－ＯＨ基を有する短い又は長いＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメントとすることができ、テンプレートの相補的領域へのアニーリングによってＤＮＡポリメラーゼに二本鎖構造を提供する。選択されたＤＮＡポリメラーゼはテンプレートに沿って作用し、プライマーを５’→３’方向に延長する。
【0007】
ＤＮＡ鎖の極性のため、ＤＮＡ分子の２つの鎖の複製は双方向であり、テンプレートの複製の方向に応じて、「リーディング」鎖と「ラギング」鎖の２つの異なる産物がもたらされる。リーディング鎖は単一の連続鎖として合成されるが、ラギング鎖は最初に岡崎フラグメントと呼ばれる小さなオリゴヌクレオチドとして合成され、次にライゲーションされて連続鎖を形成する。インビボでは、低分子ＲＮＡ分子は、リーディング鎖と、特にラギング鎖の両方の合成において天然のプライマーとして機能する。
【0008】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩは、リーディング鎖と、ラギング鎖上の岡崎フラグメントとを連続的に合成し、合成されたフラグメント間にギャップを残し、ギャップはその後ＤＮＡポリメラーゼＩで埋められることはよく知られている。
【0009】
ＤＮＡ合成活性に加えて、ＤＮＡポリメラーゼは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性や鎖置換活性などの他の酵素活性も発揮し得る。ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性の役割は、ライゲーションの前にイニシエーターＲＮＡ又はプライマーを除去することである。インビボでは、いくつかのＤＮＡポリメラーゼの３’－５’エキソヌクレアーゼ活性は、遺伝的安定性にとって重要であり、ＤＮＡポリメラーゼのエラーを修正する。例えば、生成されるＤＮＡ分子において生じた塩基対のミスマッチは、その後、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能によって修正される。
【0010】
非特許文献１及び非特許文献２は、鎖置換活性が変化した変異型ＤＮＡポリメラーゼを開示している。
ミスマッチ塩基対を置換及び修正するには、ＤＮＡポリメラーゼの校正活性が、誤って導入されたｄＮＴＰを除去できなければならず、したがってヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ分子のリン酸骨格のホスホジエステル結合の切断に関与する。ミスマッチｄＮＴＰを除去し、ひいてはＤＮＡを分解する機能は、インビトロ分子生物学において様々な方法で利用される。配列特異的ＤＮＡ増幅は、親子鑑定、法医学的調査、診断など、分子生物学で多くの用途がある。広く使用されているＤＮＡポリメラーゼの多くは、少なくとも７０℃などの高温で安定しているため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やサーモサイクルＤＮＡシーケンシングなどのＤＮＡ検出及び分析方法での使用が可能である。このようなプロセスに適用可能なＤＮＡポリメラーゼは、一般に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれている。
ミスマッチ塩基対を置換及び修正するには、ＤＮＡポリメラーゼの校正活性が、誤って導入されたｄＮＴＰを除去できなければならず、したがってヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ分子のリン酸骨格のホスホジエステル結合の切断に関与する。ミスマッチｄＮＴＰを除去し、ひいてはＤＮＡを分解する機能は、インビトロ分子生物学において様々な方法で利用される。配列特異的ＤＮＡ増幅は、親子鑑定、法医学的調査、診断など、分子生物学で多くの用途がある。広く使用されているＤＮＡポリメラーゼの多くは、少なくとも７０℃などの高温で安定しているため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やサーモサイクルＤＮＡシーケンシングなどのＤＮＡ検出及び分析方法での使用が可能である。このようなプロセスに適用可能なＤＮＡポリメラーゼは、一般に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれている。
【0011】
ＰＣＲは、テンプレートＤＮＡを変性させ、プライマーをアニーリングし、様々な温度条件に耐える耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用してプライマーを伸長するという熱サイクルに基づいており、増幅によって目的のＤＮＡの量を指数関数的に増加させる。他の増幅方法は等温、すなわち、一定の温度で実施される。今日、様々な等温ＤＮＡ増幅法が存在する。例えば、ストランド変位増幅（例えば、非特許文献３参照）及びループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）（例えば、非特許文献４参照）。ストランド変位増幅に有用なＤＮＡポリメラーゼとしては、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが提供するＥｑｕｉＰｈｉ２９ＴＭ ＤＮＡポリメラーゼなどが市販されている。
【0012】
ＤＮＡポリメラーゼは、Ｇｉｂｓｏｎらによって非特許文献５に記載されたギブソン・アセンブリ（商標）法などのＤＮＡアセンブリプロセスでも使用される。これは、核酸分子のシングルステップ等温式アセンブリを可能にする。ただし、この方法では、プロセスを５０℃で実施する必要がある。
【0013】
しかし、現在の障壁は、時間のかかる手動処理ステップなしでマルチプルＤＮＡアセンブリを行うためのしっかりした室温法がないことである。例えば、ＤＮＡアセンブリ法でＰＣＲ生成物を使用する場合、マルチプルＤＮＡアセンブリプロセスで使用する前に、生成物を精製する（クリーンアップ手順を行う）必要がある。数回のアセンブリが必要な場合にも、精製ステップが必要である。したがって、現在のハードルを回避できる新しいＤＮＡアセンブリ法が強く望まれている。
【0014】
海洋起源の様々な酵素が知られている。例えば、特許文献１は、室温を超える温度を含む幅広い温度で活性である、サイクロバシラス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種から単離された海洋起源の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを開示している。
【0015】
特許文献２は、一本鎖ＤＮＡを分解することができる、冷水環境に由来する熱不安定性エキソヌクレアーゼを開示しており、これは６５℃未満の温度にさらされると１５～２０分以内に不活性化される可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0016】
【特許文献1】国際公開第２０１７／１６２７６５号
【特許文献2】国際公開第２０１６／０２６５７４号
【非特許文献】
【0017】
【非特許文献1】Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１９，第１～１１頁
【非特許文献2】Ｓｉｎｇｈ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，ｖｏｌ．２８２，ｎｏ．１４，第１０５９４－１０６０４頁
【非特許文献3】Ｗａｌｋｅｒ ＧＴ．Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１９９３；３：１－６
【非特許文献4】Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈ，Ｙｏｎｅｋａｗａ Ｔ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ，Ａｍｉｎｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００；２８：Ｅ６３
【非特許文献5】Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９，ｖｏｌ．６，ｐｐ．３４３－３４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明者らは、スバールバル諸島周辺の海洋北極圏で収集された海洋環境サンプルのメタゲノム解析によって、ＤＮＡポリメラーゼＩを同定した。他の既知のＤＮＡポリメラーゼとは異なり、本発明の単離されたＤＮＡポリメラーゼは本質的に熱に不安定である。このことは、酵素を様々なＤＮＡ増幅プロセス及びＤＮＡアセンブリプロセスなどの分子生物学プロセスにおいて特に有用にする。例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、２５℃を超える温度、例えば約３０℃を超える温度で迅速かつ不可逆的に不活性化され、その結果、本発明のＤＮＡポリメラーゼの対象となる生成物をさらに取り扱う前に不活性化ステップを必要としない。
【0019】
さらに、本発明者らは、本ＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌由来の中温性クレノウ酵素やバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の好熱性Ｂｓｔポリメラーゼなどの市販のＤＮＡポリメラーゼと比較して、非常に強力なポリメラーゼ活性を発揮することを示した。
【0020】
本ＤＮＡポリメラーゼの強力なポリメラーゼ活性と温度不安定性の特性により、室温で実行でき、不活性化ステップの必要性を回避する、幅広いＤＮＡ増幅プロセスに非常に有用なＤＮＡポリメラーゼになる。
【0021】
本ＤＮＡポリメラーゼは、さらに３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を発揮し、複製されたＤＮＡ分子の校正を行う。
本ＤＮＡポリメラーゼは、さらに鎖置換活性を有し、ストランド変位増幅プロセスにとって魅力的なポリメラーゼとなっている。
本ＤＮＡポリメラーゼは、さらに鎖置換活性を有し、ストランド変位増幅プロセスにとって魅力的なポリメラーゼとなっている。
【0022】
本発明者らはまた、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性が十分に弱められているか又は存在しない、本発明のＤＮＡポリメラーゼの改変された変異体を合成した。
鎖置換活性が弱められているか又は欠如している本発明の改変されたＤＮＡポリメラーゼは、例えば、一本鎖５’オーバーハングを有する２つ以上の二本鎖核酸分子がアセンブリされる組換えクローニングプロセスにおいて特に有用である。特に、鎖置換活性が弱められているか又は欠如している改変ＤＮＡポリメラーゼは、マルチプルＤＮＡアセンブリ法で有用であり、その熱不安定性により、室温での作業が可能になる。本ＤＮＡポリメラーゼのさらなる利点は、以下にさらに示されるように、ＤＮＡ増幅又はＤＮＡアセンブリプロセスで使用される場合、不活性化ステップとみなされるものが必要ないことである。
鎖置換活性が弱められているか又は欠如している本発明の改変されたＤＮＡポリメラーゼは、例えば、一本鎖５’オーバーハングを有する２つ以上の二本鎖核酸分子がアセンブリされる組換えクローニングプロセスにおいて特に有用である。特に、鎖置換活性が弱められているか又は欠如している改変ＤＮＡポリメラーゼは、マルチプルＤＮＡアセンブリ法で有用であり、その熱不安定性により、室温での作業が可能になる。本ＤＮＡポリメラーゼのさらなる利点は、以下にさらに示されるように、ＤＮＡ増幅又はＤＮＡアセンブリプロセスで使用される場合、不活性化ステップとみなされるものが必要ないことである。
【課題を解決するための手段】
【0023】
第１の態様によれば、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントが提供され、前記ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を示し、前記ＤＮＡポリメラーゼは、２５℃を超える温度で、より好ましくは約３０℃を超える温度で不可逆的に不活性化される。
【0024】
この態様の一実施形態によれば、鎖置換活性を低下、減弱、又は不活性化させたＤＮＡポリメラーゼが提供される。
本発明の第２の態様によれば、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントが提供され、前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む。
本発明の第２の態様によれば、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントが提供され、前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む。
【0025】
本発明の第３の態様によれば、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントが提供され、前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む。
【0026】
上記の態様による、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、配列番号１又は配列番号２と配列の全長にわたって少なくとも７０％同一の、例えば、配列番号１又は配列番号２と配列の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号１又は配列番号２と配列の全長にわたって少なくとも９０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含み得る。
【0027】
第４の態様によれば、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントが提供され、前記アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸番号に従う番号付けでアミノ酸４３１～４４７位及び５１９～５２３位に対応するアミノ酸領域の少なくとも１つに少なくとも１つの突然変異を含み、前記ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を持たない。例えば、前記ＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、配列番号１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列のＳ４４９、Ａ４５０、Ｆ４５１、及び／又はＲ５２１に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの突然変異を含む。
【0028】
第５の態様によれば、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントが提供され、前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列のＳ４４９、Ａ４５０、Ｆ４５１、及び／又はＲ５２１に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの突然変異を含み、前記少なくとも１つの突然変異は、以下に置換することである：
・Ｓ４４９に対応する位置の疎水性側鎖を有するアミノ酸、
・Ａ４５０に対応する位置の負に帯電した側鎖を有するアミノ酸、
・Ｆ４５１に対応する位置の疎水性側鎖を有するアミノ酸、及び／又は
・Ｒ５２１に対応する位置の疎水性側鎖を有するアミノ酸。
・Ｓ４４９に対応する位置の疎水性側鎖を有するアミノ酸、
・Ａ４５０に対応する位置の負に帯電した側鎖を有するアミノ酸、
・Ｆ４５１に対応する位置の疎水性側鎖を有するアミノ酸、及び／又は
・Ｒ５２１に対応する位置の疎水性側鎖を有するアミノ酸。
【0029】
例えば、前記単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、上記の態様の一実施形態によれば、アミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１又は配列番号２の番号付けに従う４４９位のアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅからなる群から選択される。
【0030】
さらに、前記単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、上記の態様の一実施形態によれば、アミノ酸配列を含み得、ここで、配列番号１又は配列番号２の番号付けに従う４５０位のアミノ酸は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎからなる群から選択される。
【0031】
さらに、前記単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、上記の態様の一実施形態によれば、アミノ酸配列を含み得、ここで、配列番号１又は配列番号２の番号付けに従う４５１位のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅからなる群から選択される。
【0032】
さらに、前記単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、上記の態様の一実施形態によれば、アミノ酸配列を含み得、ここで、配列番号１又は配列番号２の番号付けに従う５２１位のアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅからなる群から選択される。
【0033】
さらに、前記単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、上記の態様の一実施形態によれば、アミノ酸配列を含み得、ここで、４４９位、４５０位、４５１位及び５２１位のアミノ酸は、
【0034】
【表1】
【0035】
からなる群から選択され、ただし、４４９位（Ｓ４４９）、４５０位（Ａ４５０）、４５１位（Ｆ４５１）、及び５２１位（Ｒ５２１）のアミノ酸は、同時にそれぞれＳｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、及びＡｒｇではない。
【0036】
さらに、前記単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、上記の態様の一実施形態によれば、アミノ酸配列を含み得、４４９位、４５０位、４５１位及び５２１位のアミノ酸は、
【0037】
【表2】
【0038】
からなる群から選択され、ただし、４４９位（Ｓ４４９）、４５０位（Ａ４５０）、４５１位（Ｆ４５１）、及び５２１位（Ｒ５２１）のアミノ酸は、同時にそれぞれＳｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、及びＡｒｇではない。前述の態様のいずれかによる一実施形態では、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼの群から選択される：
・４５０位のアミノ酸がＡｓｐである、
・４４９位及び４５１位のアミノ酸がＡｌａである、
・４４９位及び４５０位のアミノ酸がそれぞれＡｌａ及びＡｓｐである、
・４５０位及び４５１位のアミノ酸がそれぞれＡｓｐ及びＡｌａである、
・４４９位、４５０位、及び４５１位のアミノ酸がそれぞれＡｌａ、Ａｓｐ、及びＡｌａである、
・配列番号８の５２１位のアミノ酸がＡｌａである。ここで、番号付けは配列番号１のアミノ酸の番号に従うものであり、前記ＤＮＡポリメラーゼのいずれも鎖鎖置換活性を持たない。
・４５０位のアミノ酸がＡｓｐである、
・４４９位及び４５１位のアミノ酸がＡｌａである、
・４４９位及び４５０位のアミノ酸がそれぞれＡｌａ及びＡｓｐである、
・４５０位及び４５１位のアミノ酸がそれぞれＡｓｐ及びＡｌａである、
・４４９位、４５０位、及び４５１位のアミノ酸がそれぞれＡｌａ、Ａｓｐ、及びＡｌａである、
・配列番号８の５２１位のアミノ酸がＡｌａである。ここで、番号付けは配列番号１のアミノ酸の番号に従うものであり、前記ＤＮＡポリメラーゼのいずれも鎖鎖置換活性を持たない。
【0039】
第６の態様によれば、単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントが提供され、前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３、４、５、６、７及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３、４、５、６、７、及び８のそれぞれと配列の全長にわたって少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は９９％の配列同一性であるアミノ酸配列を含み、ただし
・配列番号３の４５０位のアミノ酸はＡｓｐであり、
・配列番号４の４４９位及び４５１位のアミノ酸はＡｌａであり、
・配列番号５の４４９位及び４５０位のアミノ酸はそれぞれＡｌａ及びＡｓｐであり、
・配列番号６の４５０位及び４５１位のアミノ酸はそれぞれＡｓｐ及びＡｌａであり、
・配列番号７の４４９位、４５０位及び４５１位のアミノ酸は、それぞれＡｌａ、Ａｓｐ及びＡｌａであり、
・配列番号８の５２１位のアミノ酸はＡｌａである。
・配列番号３の４５０位のアミノ酸はＡｓｐであり、
・配列番号４の４４９位及び４５１位のアミノ酸はＡｌａであり、
・配列番号５の４４９位及び４５０位のアミノ酸はそれぞれＡｌａ及びＡｓｐであり、
・配列番号６の４５０位及び４５１位のアミノ酸はそれぞれＡｓｐ及びＡｌａであり、
・配列番号７の４４９位、４５０位及び４５１位のアミノ酸は、それぞれＡｌａ、Ａｓｐ及びＡｌａであり、
・配列番号８の５２１位のアミノ酸はＡｌａである。
【0040】
本発明はまた、上記の態様のいずれかに従って、ＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを提供し、ここで、酵素は、２５℃を超える温度で、例えば３０℃を超える温度で不可逆的に不活性化される。
【0041】
第７の態様によれば、前述の態様のいずれかによる単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントとバッファーとを含む組成物が提供される。
上記の態様のいずれかの実施形態によれば、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端の５’－３’－エキソヌクレアーゼドメインを欠くラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩである。
上記の態様のいずれかの実施形態によれば、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎ末端の５’－３’－エキソヌクレアーゼドメインを欠くラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩである。
【0042】
配列番号１及び配列番号２は、Ｎ末端の５’－３’－エキソヌクレアーゼドメインを欠くラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ配列の例である。
第９の態様によれば、上記の態様のいずれかによる単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸分子が提供される。上記の態様による一実施形態では、核酸分子は、配列番号９の核酸配列を含むか、又は配列番号９と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性を有する核酸分子を含む。
第９の態様によれば、上記の態様のいずれかによる単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸分子が提供される。上記の態様による一実施形態では、核酸分子は、配列番号９の核酸配列を含むか、又は配列番号９と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性を有する核酸分子を含む。
【0043】
上記の態様による一実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むか、又は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のそれぞれと配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。
【0044】
第１０の態様によれば、上記の態様による単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸分子、ならびに前記核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写及び翻訳に必要な調節配列を含む発現ベクターが提供される。
【0045】
前記発現ベクターは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み得るか、又は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のそれぞれと配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。
【0046】
第１１の態様によれば、上記の１つ以上の発現ベクター、又は本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする上記の１つ以上の核酸分子を含む宿主細胞が提供される。
第１２の態様によれば、以下のステップを含む、本発明によるＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを調製するための方法：
ａ）第１０の態様による１つ以上の組換え発現ベクター、又は第９の態様による１つ以上の核酸分子を含む宿主細胞を、コードされたＤＮＡポリメラーゼの発現に適した条件下で培養するステップ；
ｂ）宿主細胞から、あるいは培地又は上清から、ラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを単離又は取得するステップ。
第１２の態様によれば、以下のステップを含む、本発明によるＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを調製するための方法：
ａ）第１０の態様による１つ以上の組換え発現ベクター、又は第９の態様による１つ以上の核酸分子を含む宿主細胞を、コードされたＤＮＡポリメラーゼの発現に適した条件下で培養するステップ；
ｂ）宿主細胞から、あるいは培地又は上清から、ラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを単離又は取得するステップ。
【0047】
第１３の態様によれば、本発明はさらに、核酸増幅プロセス、配列決定反応、組換えクローニングプロセス又はマルチプルＤＮＡアセンブリプロセスにおける本発明のラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ又は酵素的に活性なフラグメントなどのＤＮＡポリメラーゼの使用に関する。
【0048】
この態様の一実施形態によれば、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ストランド変位増幅において使用される。
さらに、第１４の態様によれば、２つ以上の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子をアセンブリするための方法が提供され、前記プロセスは以下のステップを含む：
（ａ）アセンブリされる２つ以上のｄｓＤＮＡ分子を提供するステップであって、ｄｓＤＮＡ分子は一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡオーバーハングを含み、２つ以上のｄｓＤＮＡ分子の前記オーバーハングを含む末端は配列同一性の領域を共有するステップ；
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子を、前記ＤＮＡ分子がオーバーハング部分を介してアニーリングする条件下でインキュベートするステップ；
（ｃ）アニーリングされた分子を、ラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントなどの、態様１～６のいずれかによる熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼと接触させるステップであって、この接触により、ＤＮＡポリメラーゼは、ステップ（ｂ）で形成されたＤＮＡ分子のアニーリング後に残っているギャップを埋め、ここで、前記ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性が低下、減弱、又は不活性化しているステップ。
さらに、第１４の態様によれば、２つ以上の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子をアセンブリするための方法が提供され、前記プロセスは以下のステップを含む：
（ａ）アセンブリされる２つ以上のｄｓＤＮＡ分子を提供するステップであって、ｄｓＤＮＡ分子は一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡオーバーハングを含み、２つ以上のｄｓＤＮＡ分子の前記オーバーハングを含む末端は配列同一性の領域を共有するステップ；
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子を、前記ＤＮＡ分子がオーバーハング部分を介してアニーリングする条件下でインキュベートするステップ；
（ｃ）アニーリングされた分子を、ラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントなどの、態様１～６のいずれかによる熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼと接触させるステップであって、この接触により、ＤＮＡポリメラーゼは、ステップ（ｂ）で形成されたＤＮＡ分子のアニーリング後に残っているギャップを埋め、ここで、前記ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性が低下、減弱、又は不活性化しているステップ。
【0049】
上記の方法のステップ（ａ）～（ｃ）は、一定の温度で実施することができる。一実施形態によれば、前記プロセスは、２０℃～２５℃の範囲内の温度で実施される。
別の実施形態によれば、ステップ（ｃ）のアセンブリされたＤＮＡ分子は、増殖のために適切な宿主細胞にさらに移される。
別の実施形態によれば、ステップ（ｃ）のアセンブリされたＤＮＡ分子は、増殖のために適切な宿主細胞にさらに移される。
【0050】
第１５の態様によれば、上記の方法のステップ（ａ）の２つ以上のＤＮＡ分子のオーバーハングが、３’－５’エキソヌクレアーゼ、好ましくは熱不安定性エキソヌクレアーゼを使用して提供される方法が提供される。
【0051】
第１６の態様によれば、本発明のラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントなどのＤＮＡポリメラーゼを使用するヌクレオチド重合の方法が提供され、前記方法は以下のステップを含む：
（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント、テンプレート核酸分子、テンプレート核酸分子の一部にアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドプライマー、及び１つ以上のヌクレオチド種を含む反応混合物を提供するステップ；及び
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレート核酸分子にアニーリングし、前記ＤＮＡポリメラーゼが、１つ以上のヌクレオチドを重合することによって前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させる条件下で、前記反応混合物をインキュベートするステップ。
（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント、テンプレート核酸分子、テンプレート核酸分子の一部にアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドプライマー、及び１つ以上のヌクレオチド種を含む反応混合物を提供するステップ；及び
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレート核酸分子にアニーリングし、前記ＤＮＡポリメラーゼが、１つ以上のヌクレオチドを重合することによって前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させる条件下で、前記反応混合物をインキュベートするステップ。
【0052】
第１７の態様によれば、ラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントなどのＤＮＡポリメラーゼを使用して核酸を増幅する方法が提供され、前記方法は、以下のステップを含む：
（ａ）態様１～６のいずれかによるＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント、テンプレート核酸分子、テンプレート核酸の一部にアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドプライマー、及びヌクレオチドを含む反応混合物を提供するステップ；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレート核酸分子にアニーリングし、前記ＤＮＡポリメラーゼが、１つ以上のヌクレオチドを重合して前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることによりポリヌクレオチドを生成する条件下で、前記反応混合物をインキュベートするステップ。
（ａ）態様１～６のいずれかによるＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメント、テンプレート核酸分子、テンプレート核酸の一部にアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドプライマー、及びヌクレオチドを含む反応混合物を提供するステップ；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレート核酸分子にアニーリングし、前記ＤＮＡポリメラーゼが、１つ以上のヌクレオチドを重合して前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることによりポリヌクレオチドを生成する条件下で、前記反応混合物をインキュベートするステップ。
【図面の簡単な説明】
【0053】
【図1】本発明のＤＮＡポリメラーゼと相同なポリメラーゼであるクレノウフラグメント（ＰＤＢコード：１Ｄ８Ｙ）を表し、３つの連続するアミノ酸残基Ｓ４４９、Ａ４５０、及びＦ４５１を含む矢印で識別されるαヘリックスを示している。また、残基Ｒ５２１、Ｃ末端及びＮ末端の位置も示す。
【図2】本発明のＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【図3】大腸菌由来のクレノウ酵素及び好熱性バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂｓｔ）ポリメラーゼのポリメラーゼ活性と比較した、本ラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を示す。
【図4】様々な温度で酵素をインキュベートした後、２５℃で本野生型ラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼの残存活性を測定した実験結果を示す。
【図5】野生型（ｗｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ａ４５０Ｄ変異体（ＳＤＦ）、Ｓ４４９Ａ＋Ｆ４５１Ａ変異体（ＡＡＡ）、Ｓ４４９Ａ＋Ａ４５０Ｄ変異体（ＡＤＦ）、Ａ４５０Ｄ＋Ｆ４５１Ａ変異体（ＳＤＡ）、Ｓ４４９Ａ＋Ａ４５０Ｄ＋Ｆ４５１Ａ変異体（ＡＤＡ）、及びＲ５２１Ａ変異体で表される、２５℃での本発明のラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性の比較を示す。
【図6】野生型（ｗｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ａ４５０Ｄ変異体（ＳＤＦ）、Ｓ４４９Ａ＋Ｆ４５１Ａ変異体（ＡＡＡ）、Ｓ４４９Ａ＋Ａ４５０Ｄ変異体（ＡＤＦ）、Ａ４５０Ｄ＋Ｆ４５１Ａ変異体（ＳＤＡ）、Ｓ４４９Ａ＋Ａ４５０Ｄ＋Ｆ４５１Ａ変異体（ＡＤＡ）、及びＲ５２１Ａ変異体で表される、２５℃での本発明のラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【0054】
本発明の詳細な説明
本発明者らは、言及したように、海洋起源の新規なＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体を多くの分子生物学プロセスにおいて有用にする有利な特性を有するＤＮＡポリメラーゼを同定した。特に、酵素は、室温で行われるプロセスで使用され得る点、及びそれが２５℃を超える温度、例えば３０℃を超える温度で容易に不活性化される点で有利である。
本発明者らは、言及したように、海洋起源の新規なＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体を多くの分子生物学プロセスにおいて有用にする有利な特性を有するＤＮＡポリメラーゼを同定した。特に、酵素は、室温で行われるプロセスで使用され得る点、及びそれが２５℃を超える温度、例えば３０℃を超える温度で容易に不活性化される点で有利である。
【0055】
本明細書で特に定義されない限り、使用されるすべての技術的及び科学的用語は、遺伝学、生化学、及び分子生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0056】
適切な方法及び材料が本明細書に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似又は同等のすべての方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができる。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含め、本明細書が優先される。
【0057】
数値限定又は数値範囲が記載されている場合、その境界値も含まれる。また、数値限定又は数値範囲内のすべての値及び部分範囲は、明示的記載の如く特定的に含まれる。
以下に示すように、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、アセンブリ対象の核酸分子に５’－３’オーバーハングを提供するために、例えば、完全配列核酸分子を提供し、前記分子をベクターと結合するために使用することができる。したがって、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、１つ以上の対象核酸分子を担体又は発現ベクター中にアセンブリすることができ、ここで、所望の核酸分子及びベクターは、相補的な５’－３’オーバーハングを有する。
以下に示すように、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、アセンブリ対象の核酸分子に５’－３’オーバーハングを提供するために、例えば、完全配列核酸分子を提供し、前記分子をベクターと結合するために使用することができる。したがって、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、１つ以上の対象核酸分子を担体又は発現ベクター中にアセンブリすることができ、ここで、所望の核酸分子及びベクターは、相補的な５’－３’オーバーハングを有する。
【0058】
すなわち、共に５’－３’のオーバーハングを有する１つ以上の対象二本鎖核酸分子と選択されたベクターとが接触すると、例えばそれらが約１０～４０塩基対の長さの場合、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、対象の配列をアセンブリするために必要な数のヌクレオチドを埋める。ＤＮＡポリメラーゼは熱に不安定であるため、ＤＮＡポリメラーゼは短時間で不活性化されるが、例えば対象の核酸分子をアセンブリするには十分な時間活性である。
【0059】
例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、２５℃で経時的に不活性になり得るが、少なくとも６０分間はその活性を維持することが示されており、例えばマルチプルＤＮＡアセンブリ方法で使用する場合に、さらなるプロセスステップに影響を及ぼさない。一実施形態によれば、マルチプルＤＮＡアセンブリ方法で使用される場合、アニーリングされたＤＮＡ分子は、５～４５分の範囲、例えば１０～３０分の範囲、例えば１５～２０分の範囲の期間、鎖置換活性を低下、減弱、又は不活性化させたＤＮＡポリメラーゼと接触させられる。
【0060】
本発明の酵素は、室温で行われる様々なプロセスで使用することができる。「室温」という用語は、当技術分野で認識されている用語であり、１８℃～２５℃の範囲内の温度を含む。
【0061】
別の態様によれば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は、配列番号１と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントが提供される。
【0062】
ＤＮＡポリメラーゼの「酵素的に活性なフラグメント」という表現は、ポリメラーゼの活性が維持されている、すなわち、配列番号１～８に示されるアミノ酸配列を有するが、配列番号１～８に示される配列と比較して１つ以上のアミノ酸が除去されているＤＮＡポリメラーゼと比較して同じ又は少なくとも同様の活性を有するＤＮＡポリメラーゼを意味すると理解されるべきである。当業者は、例えばアミノ酸配列のＣ末端又はＮ末端にある１つ以上のアミノ酸が、そのタンパク質の活性に影響を与えることなく除去され得ることを認識するであろう。
【0063】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、既知のＤＮＡポリメラーゼと比較して優れたポリメラーゼ効率を発揮する。図３に示すように、本ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌由来のクレノウ酵素や好熱性バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂｓｔ）ポリメラーゼのポリメラーゼ活性と比較して改善されたポリメラーゼ活性を示す。当業者はさらに、Ｓｕｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００８，４２９，２２５－２３５に開示されているようなリアルタイムモレキュラービーコンアッセイ、又は、下記の実験部に示すようなその変法を使用して、ポリメラーゼ活性を測定できることを認識するであろう。
【0064】
第２の態様によれば、ＤＮＡポリメラーゼは、実質的に鎖転位活性なしで提供され、前記ＤＮＡポリメラーゼは、実質的に鎖転位活性がなく、さらに、２５℃を超える温度、例えば約３０℃を超える温度で不可逆的に不活性化される。この点に関して、図４を参照すると、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して低下した鎖置換活性を有することが示されている。当業者は、鎖置換活性が、Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０（３１）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ６６８８３８１／）に記載されている鎖置換活性アッセイなどの周知の方法を使用して測定できることを認識するであろう。
【0065】
「実質的に鎖置換活性がない」という表現は、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、ＤＮＡポリメラーゼの置換活性が減弱されているか、又は存在しないことを意味すると理解されるべきである。例えば、当業者は、配列番号３～８のアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼの程度まで低下した鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、減弱された鎖置換活性を有する、すなわち、実質的に鎖置換活性がないことを認識するであろう。
【0066】
さらに別の態様によれば、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、単離されたラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを提供する。
【0067】
さらに別の態様によれば、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２と配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、単離されたラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを提供する。
【0068】
上記のように、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸を含み、配列番号２のアミノ酸番号に従う番号付けでアミノ酸４３１～４４７位及び５１９～５２３位に対応する領域に少なくとも１つの突然変異を含むＤＮＡポリメラーゼが提供され、前記ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性を持たない。４３１～４４７位のアミノ酸は、本発明の同定された海洋ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性に関与すると考えられる３つのらせんを構成している。一実施形態によれば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸を含み、配列番号２のアミノ酸番号に従う番号付けでアミノ酸位置Ｇ４４７～Ｌ４５３及び位置Ｇ５１９～Ａ５２３に対応する領域に、少なくとも１つの突然変異を含むＤＮＡポリメラーゼが提供される。
【0069】
特に、突然変異が４４９位、４５０位、４５１位及び／又は５２１位に導入されたＤＮＡポリメラーゼが提供される。
本発明は、とりわけ、４４９位のセリンがアラニンに置換されているか、４５０位のアラニンがアスパラギンに置換されているか、４５１位のフェニルアラニンがアラニンに置換されているか、又は５２１位のアルギニンがアラニンに置換されている例を提供する。
本発明は、とりわけ、４４９位のセリンがアラニンに置換されているか、４５０位のアラニンがアスパラギンに置換されているか、４５１位のフェニルアラニンがアラニンに置換されているか、又は５２１位のアルギニンがアラニンに置換されている例を提供する。
【0070】
当業者は、アミノ酸が側鎖の化学的特性に依存してグループ化されることを認識するであろう。アミノ酸は一般に、疎水性又は親水性として、及び／又は極性又は非極性側鎖を有するものとして分類される。あるアミノ酸を、同じ生化学的特性を有する別のアミノ酸に置換することは、一般に保存的置換として知られている。当業者は、保存的置換がタンパク質のアミノ酸配列に、例えば本発明による酵素に、前記酵素の活性を変化させることなく導入され得ることを認識するであろう。したがって、そのような改変は生物学的に同等の生成物を構成すると予想される。
【0071】
アミノ酸の保存的置換には、以下のグループ内のアミノ酸の間で行われる置換が含まれる：
・Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ（疎水性側鎖を持つアミノ酸）
・Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ（疎水性側鎖を持つアミノ酸）
・Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ（正に帯電した側鎖を持つアミノ酸）
・Ａｌａ、Ｇｌｙ（小さい側鎖を持つアミノ酸）
・Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（非荷電側鎖を持つアミノ酸）
・Ａｓｎ、Ｇｌｎ（非荷電側鎖を持つアミノ酸）
・Ａｓｐ、Ｇｌｕ（負に帯電した側鎖を持つアミノ酸）
総じて、保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷又はサイズの特性を変更しないアミノ酸置換を指し、したがって、タンパク質の三次元構造を変更することはめったにない。そのため、生物学的活性もあまり変化しない。
・Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ（疎水性側鎖を持つアミノ酸）
・Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ（疎水性側鎖を持つアミノ酸）
・Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ（正に帯電した側鎖を持つアミノ酸）
・Ａｌａ、Ｇｌｙ（小さい側鎖を持つアミノ酸）
・Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（非荷電側鎖を持つアミノ酸）
・Ａｓｎ、Ｇｌｎ（非荷電側鎖を持つアミノ酸）
・Ａｓｐ、Ｇｌｕ（負に帯電した側鎖を持つアミノ酸）
総じて、保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷又はサイズの特性を変更しないアミノ酸置換を指し、したがって、タンパク質の三次元構造を変更することはめったにない。そのため、生物学的活性もあまり変化しない。
【0072】
よって、当業者は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼであって、４４９位のアミノ酸が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅからなる群から選択され、かつ／又は、４５０位のアミノ酸が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎからなる群から選択され、かつ／又は、４５１位のアミノ酸が、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅからなる群から選択され、かつ／又は、５２１位のアミノ酸が、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅから選択され、ただし、４４９位（Ｓ４４９）、４５０位（Ａ４５０）、４５１位（Ｆ４５１）、及び５２１位（Ｒ５２１）は、それぞれＳｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、及びＡｒｇではないＤＮＡポリメラーゼが、配列番号３～８のＤＮＡポリメラーゼと同じ又はほぼ同じポリメラーゼ活性及び鎖置換活性を有し得ることを認識するであろう。
【0073】
また、当業者は、ＤＮＡポリメラーゼの活性を変えることなく、１つ以上のアミノ酸が欠失、挿入、又は付加され得ることを理解するであろう。
したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に開示されるＤＮＡポリメラーゼを包含し、上記のような改変（アミノ酸の置換、欠失、挿入及び付加）は、そのポリメラーゼの活性を、すなわち、ポリメラーゼ活性及び鎖置換活性に関して本質的に変えることなく導入され得ることが理解される。
したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に開示されるＤＮＡポリメラーゼを包含し、上記のような改変（アミノ酸の置換、欠失、挿入及び付加）は、そのポリメラーゼの活性を、すなわち、ポリメラーゼ活性及び鎖置換活性に関して本質的に変えることなく導入され得ることが理解される。
【0074】
また、当業者は、ラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩが、インタクトなＤＮＡポリメラーゼＩの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、５’→３’ＤＮＡポリメラーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼ酵素であることを理解するであろう。よく知られているラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩの例は、クレノウフラグメントである。
【0075】
さらに別の態様によれば、本発明は、配列番号３、４、５、６、７、及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号３、４、５、６、７、及び８のそれぞれと配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを提供する。
【0076】
別の態様によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と配列の全長にわたって少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼが提供される。
【0077】
さらに、本発明はまた、本発明による単離されたＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸分子を提供する。一態様によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むか、又は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８のそれぞれと配列の全長にわたって少なくとも６０％の配列同一性であるアミノ酸配列を含む核酸分子が提供される。
【0078】
さらに別の態様によれば、配列番号９に示される配列、又は配列番号９と配列の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号９と配列の全長にわたって少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性である核酸分子を含む核酸分子が提供される。
【0079】
また、当業者は、１つ以上のアミノ酸が、本発明の酵素の活性を変更することなく、欠失、挿入、又は付加され得ることを理解するであろう。
したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に開示されるＤＮＡポリメラーゼを包含し、上記のような改変（アミノ酸の置換、欠失、挿入及び付加）は、その酵素の活性を本質的に変えることなく導入され得ることが理解される。
したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に開示されるＤＮＡポリメラーゼを包含し、上記のような改変（アミノ酸の置換、欠失、挿入及び付加）は、その酵素の活性を本質的に変えることなく導入され得ることが理解される。
【0080】
本明細書で使用される場合、タンパク質及び核酸分子又はそのフラグメントの両方に関して、「配列同一性」に言及する場合、第２の配列に対して少なくともｘ％の同一性を有する配列は、ｘ％が、第１及び第２の両方の配列がグローバルアラインメントを介して最適にアラインメントされている場合に、マッチさせた第２の配列のアミノ酸と同一である第１の配列におけるアミノ酸の、第２のアミノ酸配列の全長に対する数を表すことを意味する。ｘが最大のとき、両方の配列は最適にアラインメントされている。アラインメント及び同一性のパーセンテージの決定は、手動又は自動で行うことができる。本明細書で配列同一性に言及するときはいつでも、比較は、配列番号１～配列番号９それぞれに示される配列全体で行われることが理解されるべきである。
【0081】
当業者は、アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントが、当分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｆ，Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ（２０１８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２７：１３５－１４５）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，ｐｐ４６７３－４６８０）、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、米国）又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの商業的に利用可能なソフトウェアといった、公に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成できることを認識するであろう。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴは、アミノ酸配列の同一性を決定するために使用されるソフトウェアの別の例である（ＭａｃＷｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年７月；４１（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ Ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５９７－Ｗ６００）。
【0082】
当業者は、核酸分子にアミノ酸配列を変更しない改変、例えば、置換の影響を受けるトリプレットが依然として同じアミノ酸をコードするようなヌクレオチドの置換を導入することができることを認識するであろう。例えば、アミノ酸のイソロイシンは、トリプレット（ＤＮＡコドン）ＡＴＴ、ＡＴＣ、及びＡＴＡによってコードされる。つまり、イソロイシントリプレットＡＴＴの３番目のヌクレオチドをＴからＣ又はＡに置換しても、結果として生じるアミノ酸配列は変更されない。そのようなヌクレオチド改変は、核酸配列を宿主細胞によって好ましく使用されるコドンに適合させることで、酵素の発現を増強するために、当業者に周知の技術（例えば、部位特異的変異導入）によって導入され得る。
【0083】
さらに、単離及び精製を容易にするポリペプチドをコードする核酸分子を、得られるＤＮＡポリメラーゼの活性に影響を与えることなく、本発明のヌクレオチド配列に加えることができる。
【0084】
また、宿主細胞からの所望の酵素の分泌を提供するシグナルペプチドをコードする核酸分子もまた、本発明の核酸配列に連結され得る。
本発明はさらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを含む組成物を提供する。本発明の酵素を含む組成物は、酵素の最適化された活性のためのバッファーを含み得る。当業者は、本発明の酵素を含む組成物に使用されるバッファーが、選択される酵素及び酵素が使用されるプロセスによって異なり、最適化され得ることを認識するであろう。本発明の酵素は、当業者に周知のクローニングプロセス、ＤＮＡアセンブリプロセス、及びＤＮＡ増幅プロセスなどの分子生物学プロセスで一般的に使用される条件内、すなわち、例えば塩の種類及び濃度、ｐＨ条件などに関して上記条件内に保持される。例えば、約８．０を超えるｐＨ、例えば、８．０～９．０の範囲内のｐＨを有するトリス緩衝液などの、トリス緩衝液などの周知のバッファーを使用することができる。一態様によれば、組成物のｐＨは８．５～９．０の範囲内である。
本発明はさらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを含む組成物を提供する。本発明の酵素を含む組成物は、酵素の最適化された活性のためのバッファーを含み得る。当業者は、本発明の酵素を含む組成物に使用されるバッファーが、選択される酵素及び酵素が使用されるプロセスによって異なり、最適化され得ることを認識するであろう。本発明の酵素は、当業者に周知のクローニングプロセス、ＤＮＡアセンブリプロセス、及びＤＮＡ増幅プロセスなどの分子生物学プロセスで一般的に使用される条件内、すなわち、例えば塩の種類及び濃度、ｐＨ条件などに関して上記条件内に保持される。例えば、約８．０を超えるｐＨ、例えば、８．０～９．０の範囲内のｐＨを有するトリス緩衝液などの、トリス緩衝液などの周知のバッファーを使用することができる。一態様によれば、組成物のｐＨは８．５～９．０の範囲内である。
【0085】
さらに、当業者は、塩の種類及びその濃度が可変であることを認識するであろう。一態様によれば、組成物は、ＮａＣｌ及びＫＣｌからなる群から選択される１つ以上の塩を含む。本組成物の別の態様によれば、ＮａＣｌ及びＫＣ１を含む。さらに別の態様によれば、組成物は、約５０ｍＭ以上のＮａＣｌ及び約５０ｍＭ以上のＫＣｌを含む。
【0086】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの調製
本発明のＤＮＡポリメラーゼ及びその酵素的に活性なフラグメント又はそれらをコードする核酸分子は、それらの自然環境から精製又は単離されるか、又は当業者に周知の組換えＤＮＡ手順によって生成される。
本発明のＤＮＡポリメラーゼ及びその酵素的に活性なフラグメント又はそれらをコードする核酸分子は、それらの自然環境から精製又は単離されるか、又は当業者に周知の組換えＤＮＡ手順によって生成される。
【0087】
本発明によるＤＮＡポリメラーゼをコードする、又はその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸分子は、当業者に周知の方法、又は当業者に周知の商業的供給者、例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどによって合成され得る。
【0088】
当業者は、一般に利用可能な遺伝子工学技術及び組換えＤＮＡ発現システムを使用する様々な宿主細胞システムにおける異種発現による組換えタンパク質の調製のための単離又は精製された核酸分子の発現のための様々な利用可能なバイオテクノロジー技術をよく知っており、精通している。例えば、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｅｄ．Ｒｏｃｋｙ Ｓ Ｔｕａｎ，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＳＮ １０６４－３７４５）又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），２００１，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，（ＩＳＢＮ ９７８－０８７９６９５７７－４）参照。例えば、本発明による酵素をコードする、又はその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸分子は、適切な宿主細胞において所望のタンパク質をコードする核酸配列を発現させるために特別に適合されたすべての必要な転写及び翻訳調節配列を含む適切な発現ベクターに挿入され得る。適切な発現ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、又は人工酵母染色体（ＹＡＣ）である。
【0089】
例えば、本発明によるＤＮＡポリメラーゼを調製するために発現及び使用されるＤＮＡ分子は、目的の配列の増殖又は本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする配列の発現に使用されるベクターに挿入され得る。ＦａｓｔＣｌｏｎｉｎｇは、この目的に適用できる方法の一例である。
【0090】
本発明の一態様によれば、本発明によるＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸分子を含む発現ベクターなどのベクターが提供される。
さらなる態様によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８の配列の全長にわたって少なくとも約６０％、例えば少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターなどのベクターが提供される。
さらなる態様によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８の配列の全長にわたって少なくとも約６０％、例えば少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む発現ベクターなどのベクターが提供される。
【0091】
さらに別の態様によれば、配列番号９、又は配列番号９と配列の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性である核酸分子、又は配列番号９の配列の全長にわたって８０％の配列同一性、例えば、配列番号９の配列の全長にわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含むベクターが提供される。
【0092】
当業者は、本発明によるＤＮＡポリメラーゼが、本発明によるＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子を含む発現ベクターを使用して調製され得、前記分子が、対象とする宿主細胞に適合されたプロモーターに作動可能に連結されることを認識するであろう。
【0093】
当業者はさらに、本明細書で使用される「プロモーター」が、特定の遺伝子の転写を制御及び開始するＤＮＡコード配列の上流（５’プライム）のＤＮＡの領域を指すことを認識するであろう。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼや他のタンパク質の認識及び結合を制御して、転写を開始する。「作動可能に連結された」とは、プロモーターと第２の配列との間の機能的連結を指し、ここで、プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始及び媒介する。通常、作動可能に連結されているとは、連結されている核酸配列が隣接していることを意味する。例えば、細菌宿主細胞における組換えタンパク質の発現に適合されたベクターは、Ｔ７プロモーターなどの細菌発現系に適用可能なプロモーターを含み得る。
【0094】
本発明によるベクターは、当業者に周知の標準的なプラスミド単離技術を使用して、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（商標）又はＱＩＡＧＥＮ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ ＭａｘｉキットのＱＩＡｐｒｅｐ（商標）Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して単離することができる。
【0095】
様々な市販の宿主細胞又はウイルスを使用することができる。例えば、大腸菌、ＢＬ２１細胞又はＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの細菌宿主細胞を使用することができる。発現ベクターの形質転換は、当業者に周知の方法によって、例えば、化学的コンピテントセルを使用して実施することができる。
【0096】
適切な培地で宿主細胞を培養すると、宿主細胞内の発現ベクターによってコードされた本発明のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントが生成され、得られたＤＮＡポリメラーゼは、当業者に周知の方法によって収集及び精製され得る。
【0097】
発現ベクターはさらに、発現された酵素を培地に分泌するためのシグナル配列を含み得る。
上に概説したように、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、組換えＤＮＡ技術を使用して合成することができる。あるいは、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、無細胞発現系を使用して調製されるか、又は化学ペプチド合成法を使用して、例えば、アミノ酸の所望の配列に従って、あるアミノ酸のカルボキシル基を別のアミノ酸のアミノ基に段階的に縮合反応させることにより製造され得る。
上に概説したように、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、組換えＤＮＡ技術を使用して合成することができる。あるいは、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、無細胞発現系を使用して調製されるか、又は化学ペプチド合成法を使用して、例えば、アミノ酸の所望の配列に従って、あるアミノ酸のカルボキシル基を別のアミノ酸のアミノ基に段階的に縮合反応させることにより製造され得る。
【0098】
一態様によれば、本発明のＤＮＡポリメラーゼ又はその酵素的に活性なフラグメントを調製するためのプロセスが提供され、これは、（ｉ）コードされたＤＮＡポリメラーゼの発現に適した本発明の１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を培養するステップ；及び任意選択で（ｉｉ）宿主細胞又は培地（上清）からＤＮＡポリメラーゼを単離又は取得するステップを含む。
【0099】
当業者は、宿主細胞又は培地から組換え発現タンパク質を単離し、任意選択で精製するために様々な方法が利用可能であることを認識するであろう。得られた発現ＤＮＡポリメラーゼを発酵ブロスから単離及び精製するために、大きな粒子及びバイオマスを除去するために、１つ以上の前処理又は清澄化ステップが通常は最初に使用される。適用可能な前処理ステップの非限定的な例は、例えば、逆浸透、遠心分離、ろ過方法及びダイアフィルトレーション、又はそれらの組み合わせである。次に、得られた酵素は、通常、当業者に周知の様々なクロマトグラフィー法のうちの１つ以上によって、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は他のクロマトグラフィー技術、又はそれらの組み合わせによって精製される。
【0100】
例えば、適切な宿主細胞によって発現される酵素は、例えばＭａｂＳｅｃｌｅｓｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）培地及びＦＰＬＣクロマトグラフィーシステム（例えば、５ｍｍＵＶフローセルを取り付けたＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（商標）１０Ｐｒｏシステム）に搭載したＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｃｌｅｓｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）カラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて精製され得る。精製しようとする酵素を含むサンプルをロードした後、カラムは通常、１つ以上の適用可能な洗浄バッファーで１回以上洗浄され、その後、タンパク質は適切な溶出バッファーを使用して溶出される。得られた酵素は、上記のクロマトグラフィー法の１つ以上を使用してさらに精製されてもよい。
【0101】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの使用
本酵素は、ＤＮＡポリメラーゼが利用される任意の分子生物学プロセスで使用することができる。特に、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ増幅法及びＤＮＡアセンブリプロセス、特にマルチプルＤＮＡアセンブリプロセスで使用され得る。ＤＮＡポリメラーゼは、室温で行われる分子生物学のプロセスで使用するのに特に有利である。さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼはまた、不活性化ステップを回避することが好ましい分子生物学プロセスにおいても有用である。
本酵素は、ＤＮＡポリメラーゼが利用される任意の分子生物学プロセスで使用することができる。特に、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ増幅法及びＤＮＡアセンブリプロセス、特にマルチプルＤＮＡアセンブリプロセスで使用され得る。ＤＮＡポリメラーゼは、室温で行われる分子生物学のプロセスで使用するのに特に有利である。さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼはまた、不活性化ステップを回避することが好ましい分子生物学プロセスにおいても有用である。
【0102】
核酸分子をアセンブリするために、相同組換え技術に基づく様々な方法が知られている。本ＤＮＡポリメラーゼは、相同組換えに基づく核酸分子のアセンブリ方法、及び多数の核酸分子のアセンブリに適合した方法において特に有用である。例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、欧州特許第１９１５４４６号明細書に開示されているようなＤＮＡアセンブリプロセス、又は欧州特許第１９２９０１２号明細書に開示されているようなインビトロ組換え法において使用され得る。
【0103】
複数のＤＮＡ分子を所望の順序でアセンブリするために、アセンブリされる末端は配列同一性を共有する必要があり、これにより、エキソヌクレアーゼ消化ステップで生じるそれぞれのオーバーハングがアニーリング（ハイブリダイズ）することを確実にする。オーバーハングの長さは、好ましくは、一本鎖オーバーハングのハイブリダイゼーションを可能にするために、配列同一性の共有領域の相補的オーバーハングに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さである。複数のｄｓＤＮＡ分子のアニーリングの原理の説明としては、ＳＬＩＣ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂｙ Ｌｉ ａｎｄ Ｅｌｌｅｄｇｅ，２０１２，Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｐ５１－５９の第５４頁の図２を参照されたい。
【0104】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、重合プロセスを室温で実施できるため、特に適している。さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼは熱に不安定であり、約２５℃を超える温度で不活性化されるので、面倒な不活性化ステップを使用することなく、重合プロセスを容易に停止することができる。本ＤＮＡポリメラーゼが３’－５’エキソヌクレアーゼの形で校正活性を発揮するという事実は、それを高忠実度の増幅プロセスに適用可能にする。
【0105】
鎖置換活性が減弱されている、又は欠如している本発明のＤＮＡポリメラーゼは、マルチプルＤＮＡアセンブリプロセスにおいて特に有用である。
さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼドメインを欠くラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼであり、鎖置換活性が減弱されているか又は欠如していることも、マルチプルＤＮＡアセンブリプロセスにおいて特に有用である。
さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼドメインを欠くラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼであり、鎖置換活性が減弱されているか又は欠如していることも、マルチプルＤＮＡアセンブリプロセスにおいて特に有用である。
【0106】
実施例
実施例１：部位特異的変異導入によるＤＮＡポリメラーゼ（ＭＧ ｐｏｌ Ｉ）の同定及びその改変
スバールバル諸島周辺の北極圏で提供されたサンプルに由来するメタゲノムライブラリーを解析したところ、配列番号２によるポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列が同定された。
実施例１：部位特異的変異導入によるＤＮＡポリメラーゼ（ＭＧ ｐｏｌ Ｉ）の同定及びその改変
スバールバル諸島周辺の北極圏で提供されたサンプルに由来するメタゲノムライブラリーを解析したところ、配列番号２によるポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列が同定された。
【0107】
同定されたＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）のラージフラグメントをコードするコドン最適化遺伝子を含むベクターｐＥＴ１５１／Ｄ－ＴＯＰＯ（商標）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスから購入した。
【0108】
同定された酵素の鎖置換活性が野生型酵素と比較して低下、減弱、又は不活性化された改変酵素を提供するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ部位特異的変異導入キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して様々な変異を配列番号９に導入した。導入された改変を配列解析によって確認した。
【0109】
実施例２：本発明の組換えＤＮＡポリメラーゼＩ（ＭＧ Ｐｏｌ Ｉ）の調製
ＭＧ Ｐｏｌ Ｉラージフラグメントとその変異体の組換えタンパク質産生を、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）で行った。細胞をＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で増殖させ、０．１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によりＯＤ６００ｎｍ１．０で遺伝子発現を誘導した。タンパク質産生は１５℃で一晩行った。タンパク質精製のために、１／２リットル培養のペレットを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５（２５℃）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５、０．１５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１プロテアーゼインヒビタータブレット（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル、Ｒｏｃｈｅ）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞破壊を、ＳｏｎｉｃｓのＶＣＸ７５０を使用した超音波処理によって行った（パルス１．０／１．０、１５分、振幅２５％）。最初のステップでは、遠心分離（４８３８４ｇ、４５分、４℃）及びろ過（Φ０．４５μｍ）後に存在するＨｉｓ６タグ付きタンパク質の可溶性部分を、固定化Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５で洗浄した後、タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾール濃度で溶出し、さらに脱塩カラムを使用して、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、ｐＨ７．５に移した。第２のステップは、ＴＥＶプロテアーゼによるタグの切断であり、５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ ＤＴＴ中で４℃で一晩行った。Ｈｉｓ６タグ及びＨｉｓ６タグ付きＴＥＶプロテアーゼからタンパク質を分離するために、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５を適用することにより、第３のステップで第２のＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーを行った。最終的なタンパク質溶液を濃縮し、活性アッセイのために－２０℃で５０％グリセロールとともに保存した。
ＭＧ Ｐｏｌ Ｉラージフラグメントとその変異体の組換えタンパク質産生を、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）で行った。細胞をＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で増殖させ、０．１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によりＯＤ６００ｎｍ１．０で遺伝子発現を誘導した。タンパク質産生は１５℃で一晩行った。タンパク質精製のために、１／２リットル培養のペレットを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５（２５℃）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５、０．１５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１プロテアーゼインヒビタータブレット（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル、Ｒｏｃｈｅ）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞破壊を、ＳｏｎｉｃｓのＶＣＸ７５０を使用した超音波処理によって行った（パルス１．０／１．０、１５分、振幅２５％）。最初のステップでは、遠心分離（４８３８４ｇ、４５分、４℃）及びろ過（Φ０．４５μｍ）後に存在するＨｉｓ６タグ付きタンパク質の可溶性部分を、固定化Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５で洗浄した後、タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾール濃度で溶出し、さらに脱塩カラムを使用して、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、ｐＨ７．５に移した。第２のステップは、ＴＥＶプロテアーゼによるタグの切断であり、５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ ＤＴＴ中で４℃で一晩行った。Ｈｉｓ６タグ及びＨｉｓ６タグ付きＴＥＶプロテアーゼからタンパク質を分離するために、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５を適用することにより、第３のステップで第２のＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーを行った。最終的なタンパク質溶液を濃縮し、活性アッセイのために－２０℃で５０％グリセロールとともに保存した。
【0110】
実施例３：本酵素のポリメラーゼ活性の測定。
本酵素のポリメラーゼ活性を測定し、また前記新規酵素を既知のＤＮＡポリメラーゼと比較するために、モレキュラービーコンプローブ（Ｓｕｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００８，４２９，２２５－２３５から改変したもの）を使用した。モレキュラービーコンテンプレートは、ＧＣリッチな８マーのステム領域（配列は斜体で示されている）及び４３マーのエクステンションによって連結された２３マーのループで構成されている。ループが形成されるため、フルオロフォアのＤａｂｃｙｌとＦＡＭは近接し、クエンチされる。モレキュラービーコンテンプレートにアニーリングされたプライマーがＤＮＡポリメラーゼＩによって伸長されると、ステムが開かれ、２つのフルオロフォアの距離の増加がＦＡＭ蛍光の回復（励起４８５ｎｍ、発光５１８ｎｍ）によって測定される。
本酵素のポリメラーゼ活性を測定し、また前記新規酵素を既知のＤＮＡポリメラーゼと比較するために、モレキュラービーコンプローブ（Ｓｕｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００８，４２９，２２５－２３５から改変したもの）を使用した。モレキュラービーコンテンプレートは、ＧＣリッチな８マーのステム領域（配列は斜体で示されている）及び４３マーのエクステンションによって連結された２３マーのループで構成されている。ループが形成されるため、フルオロフォアのＤａｂｃｙｌとＦＡＭは近接し、クエンチされる。モレキュラービーコンテンプレートにアニーリングされたプライマーがＤＮＡポリメラーゼＩによって伸長されると、ステムが開かれ、２つのフルオロフォアの距離の増加がＦＡＭ蛍光の回復（励起４８５ｎｍ、発光５１８ｎｍ）によって測定される。
【0111】
【化1】
【0112】
モレキュラービーコン基質は、２０μｌの１０μＭモレキュラービーコンテンプレートと１５μＭプライマーを１０ｍＭトリス－ＨＣｌｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中９５℃で５分間インキュベートすることによって生成された。次に、反応物を室温で２時間冷却させた。基質溶液は、１０μＭの最終濃度で－２０℃で保存された。
【0113】
５０μｌの反応物は２００ｎＭの基質と２００μＭのｄＮＴＰ（等モル量のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ）で構成されていた。反応物はさらに、５０ｍＭトリス－ＨＣｌｐＨ８．５中の５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣ１、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、及び２％グリセロールを含んでいた。活性アッセイは、黒色の９６ウェル蛍光アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で２５℃で実施した。反応は、タンパク質溶液、すなわち、ＭＧ ｐｏｌ Ｉ及びそのバリアントの添加によって開始した。ＦＡＭ蛍光の増加は、４８５ｎｍで励起し、５１８ｎｍでの発光により、適切な時間間隔で相対蛍光単位として測定された。測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）Ｇｅｍｉｎｉマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で行った。
【0114】
結果を図３に示し、本発明の酵素が高いＤＮＡポリメラーゼ活性を有することを示している。
実施例４：鎖置換活性アッセイ
このアッセイは、クエンチされたレポーター鎖の置換時に測定される蛍光シグナルの増加に基づいている。これは、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性によってのみ達成可能である。
実施例４：鎖置換活性アッセイ
このアッセイは、クエンチされたレポーター鎖の置換時に測定される蛍光シグナルの増加に基づいている。これは、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性によってのみ達成可能である。
【0115】
鎖置換活性アッセイの基質は、１９オリゴヌクレオチドの「コールド」プライマーと、３’末端がＴＡＭＲＡフルオロフォア［ＴＡＭＲＡ］で標識された２０オリゴヌクレオチドからなるレポーター鎖で構成されている。テンプレート鎖は４０オリゴヌクレオチドで構成されており、５’末端がブラックホールクエンチャー２（ＢＨＱ２）で標識されている。プライマーはテンプレート鎖にアニーリングされ、テンプレート鎖の２０位に１ヌクレオチドのギャップを残す。さらに、ラベルが近接しているため、フルオロフォアＴＡＭＲＡはＢＨＱ２によってクエンチされる。ＤＮＡポリメラーゼＩの鎖置換活性により、ＴＡＭＲＡ標識オリゴヌクレオチドはテンプレート鎖から置換される。結果として、フルオロフォアとクエンチャーはもはや近接しておらず、ＴＡＭＲＡ蛍光の増加を測定することができる（励起５２５ｎｍ、発光５９８ｎｍ）。
【0116】
【化2】
【0117】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体のｍＲＦＵ／分／μｇとして表される鎖置換活性を、上記の鎖置換活性アッセイを使用して分析した。
鎖置換活性アッセイの基質は、２０μｌの１０μＭ「コールド」プライマー、１０μＭレポーター鎖、及び１０μＭテンプレート鎖を１０ｍＭトリス－ＨＣｌｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で９５℃で５分間インキュベートすることによって生成された。次に、反応物を室温で２時間冷却した。基質溶液は、１０μＭの最終濃度で－２０℃で保存された。
鎖置換活性アッセイの基質は、２０μｌの１０μＭ「コールド」プライマー、１０μＭレポーター鎖、及び１０μＭテンプレート鎖を１０ｍＭトリス－ＨＣｌｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で９５℃で５分間インキュベートすることによって生成された。次に、反応物を室温で２時間冷却した。基質溶液は、１０μＭの最終濃度で－２０℃で保存された。
【0118】
５０μｌの反応物は、２００ｎＭの基質と２００μＭのｄＮＴＰ（等モル量のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ）で構成されていた。反応物はさらに、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．５中５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２％グリセロールを含んでいた。活性アッセイは、黒色の９６ウェル蛍光アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で２５℃で実施した。反応は、タンパク質溶液、すなわち、ＭＧ ｐｏｌ Ｉ及びそのバリアントの添加によって開始された。ＴＡＭＲＡ蛍光の増加は、５２５ｎｍで励起し、５９８ｎｍで発光を記録することにより、適切な時間間隔で相対蛍光単位として測定された。測定はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）Ｍ２ｅＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で行った。
【0119】
分析結果を図５及び６に示す。
【0120】
【表3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】