特表 2023-500358 ジカ・デングワクチン及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-05

(54)【発明の名称】ジカ・デングワクチン及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/40 20060101AFI20221223BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20221223BHJP

   C07K 14/08 20060101ALI20221223BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20221223BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20221223BHJP

   A61K 39/235 20060101ALI20221223BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221223BHJP

【ＦＩ】

C12N15/40 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/11 Z

C07K14/08

A61K39/12

A61K39/00 H

A61K39/235

A61P31/14

C12N1/19

C12N1/21

C12N1/15

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022526316

(86)(22)【出願日】2020-11-09

(85)【翻訳文提出日】2022-05-06

(86)【国際出願番号】 CN2020127614

(87)【国際公開番号】W WO2021089055

(87)【国際公開日】2021-05-14

(31)【優先権主張番号】201911082867.5

(32)【優先日】2019-11-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517121939

【氏名又は名称】中国科学院微生物研究所

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】高福

(72)【発明者】

【氏名】戴連攀

(72)【発明者】

【氏名】厳景華

(72)【発明者】

【氏名】徐坤

(72)【発明者】

【氏名】韓雨旋

(72)【発明者】

【氏名】王奇慧

(72)【発明者】

【氏名】黄慶瑞

(72)【発明者】

【氏名】李金和

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA45

4C085AA03

4C085BA51

4C085BA77

4C085BA99

4C085CC08

4C085DD01

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明はジカ・デングワクチン及びその使用を提供する。本発明は、ジカウイルス又はデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域に突然変異を導入し、この突然変異を有する抗原は、ＡＤＥを引き起こす抗体に結合できない。本発明により提供される前記抗原から得られたワクチンは、免疫を獲得した後、ＦＬエピトープによって誘導される抗体の生成を回避することができ、ＡＤＥ現象の低減又は除去を実現することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ジカウイルス又はデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する抗原であって、
前記Ｅタンパク質のＦＬ融合領域は、
（１）Ｄ９８位の突然変異、Ｎ１０３位の突然変異のうちの１種又は２種と、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の３つの部位の突然変異との組み合わせ、
（２）Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異のうちの１種又はそれらの組み合わせ、
（３）Ｗ１０１の単一部位の突然変異、
のうちの一種の突然変異を有する、抗原。

【請求項2】

Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｄ９８、Ｎ１０３、Ｇ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８の５つの部位の突然変異から選択され、又は、
Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｇ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８の３つの部位の突然変異から選択され、又は、
Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｇ１０６及びＬ１０７の２つの部位の突然変異から選択され、又は、
Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｇ１０６及びＦ１０８の２つの部位の突然変異から選択され、又は、
Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｌ１０７及びＦ１０８の２つの部位の突然変異から選択され、又は、
Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｇ１０６の単一部位の突然変異から選択され、又は、
Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｌ１０７の単一部位の突然変異から選択され、又は、
Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｆ１０８の単一部位の突然変異から選択され、又は、
Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｗ１０１の単一部位の突然変異から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の抗原。

【請求項3】

Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、以下の突然変異或いは突然変異の組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗原。

【表1】

【表2】

【請求項4】

前記抗原がジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はジカウイルスのＭタンパク質の配列の全長又は一部をさらに含み、任意で、前記抗原はジカウイルスのＭタンパク質の配列の全長をさらに含み、又は
前記抗原がデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はデングウイルスのＭタンパク質の配列の全長又は一部をさらに含み、任意で、前記抗原はデングウイルスのＭタンパク質の配列の全長をさらに含む、ことを特徴とする、請求項１に記
載の抗原。

【請求項5】

前記抗原がジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はジカウイルスのｐｒＭタンパク質の配列の全長又は一部をさらに含み、任意で、前記抗原はジカウイルスのｐｒＭタンパク質の配列の全長をさらに含み、又は
前記抗原がデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はデングウイルスのｐｒＭタンパク質の配列の全長又は一部をさらに含み、任意で、前記抗原はデングウイルスのｐｒＭタンパク質の配列の全長をさらに含む、ことを特徴とする、請求項１に記載の抗原。

【請求項6】

前記抗原がジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はジカウイルスのＥタンパク質の配列の全長又は一部を有し、任意で、前記抗原はジカウイルスのＥタンパク質の配列の全長を含み、又は
前記抗原がデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はデングウイルスのＥタンパク質の配列の全長又は一部を有し、任意で、前記抗原はデングウイルスのＥタンパク質の配列の全長を含む、ことを特徴とする、請求項１に記載の抗原。

【請求項7】

ジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域の抗原結合エピトープであって、
前記ジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域は、アミノ酸配列Ｄ９８－Ｒ９９－Ｇ１００－Ｗ１０１－Ｇ１０２－Ｎ１０３－Ｇ１０４－Ｃ１０５－Ｇ１０６－Ｌ１０７－Ｆ１０８－Ｇ１０９を含み、
（１）Ｄ９８位の突然変異、Ｎ１０３位の突然変異のうちの１種又は２種と、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の３つの部位の突然変異との組み合わせ、
（２）Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異のうちの１種又はそれらの組み合わせ、
（３）Ｗ１０１の単一部位の突然変異、
のうちの一種の突然変異を有する、ことを特徴とするジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域の抗原結合エピトープ。

【請求項8】

請求項７に記載の抗原結合エピトープを含有するジカウイルス抗原。

【請求項9】

デングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域の抗原結合エピトープであって、
前記デングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域は、アミノ酸配列Ｄ９８－Ｒ９９－Ｇ１００－Ｗ１０１－Ｇ１０２－Ｎ１０３－Ｇ１０４－Ｃ１０５－Ｇ１０６－Ｌ１０７－Ｆ１０８－Ｇ１０９を含み、
（１）Ｄ９８位の突然変異、Ｎ１０３位の突然変異のうちの１種又は２種と、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の３つの部位の突然変異との組み合わせ、
（２）Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異のうちの１種又はそれらの組み合わせ、
（３）Ｗ１０１の単一部位の突然変異、
のうちの一種の突然変異を有する、ことを特徴とするデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域の抗原結合エピトープ。

【請求項10】

請求項９に記載の抗原結合エピトープを含むデングウイルス抗原。

【請求項11】

請求項１～６のいずれかに記載の抗原、請求項８に記載のジカウイルス抗原或いは請求項１０に記載のデングウイルス抗原に結合する抗体。

【請求項12】

請求項１～６のいずれかに記載の抗原、請求項７に記載の抗原結合エピトープ、請求項８に記載のジカウイルス抗原、請求項９に記載の抗原結合エピトープ、又は請求項１０に
記載のデングウイルス抗原をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項13】

請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット、組換えベクター、トランスジェニック細胞株、組換え菌、アデノウイルス、レンチウイルス或いはウイルス粒子。

【請求項14】

請求項１～６のいずれかに記載の抗原、請求項７に記載の抗原結合エピトープ、請求項８に記載のジカウイルス抗原、請求項９に記載の抗原結合エピトープ、又は請求項１０に記載のデングウイルス抗原をコードする、ｍＲＮＡ。

【請求項15】

活性成分として、請求項１～６のいずれかに記載の抗原、請求項８に記載のジカウイルス抗原、請求項１０に記載のデングウイルス抗原、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載の発現カセット、組換えベクター、トランスジェニック細胞株、組換え菌、アデノウイルス、レンチウイルス或いはウイルス粒子、又は請求項１４に記載のｍＲＮＡを含む、ワクチン。

【請求項16】

前記ワクチンは、不活化ワクチン、弱毒化ワクチン、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチン、アデノウイルスワクチン、他のウイルスベクターワクチン、サブユニットワクチン及びウイルス粒子のうちの一種以上を含み、任意で、前記ワクチンはアデノウイルスワクチンであり、及び／又は、
前記ワクチンは薬学的又は獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤、補助剤又は賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載のワクチン。

【請求項17】

組換えベクターがパッケージングされたチンパンジーアデノウイルス７型を含み、
前記組換えベクターは、バックボーン及びバックボーンに挿入される標的遺伝子を含む核酸配列を含み、
前記バックボーンは、複製欠損型チンパンジーアデノウイルス７型ベクターであり、
前記標的遺伝子は、請求項１２に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載のｍＲＮＡであることを特徴とする、組換えアデノウイルスワクチン。

【請求項18】

ジカウイルス又はデングウイルス感染を予防及び／又は治療するためのワクチンの調製、又は、ジカウイルス又はデングウイルス感染を検出するための検出試薬又はキットの調製における、請求項１～６のいずれかに記載の抗原、請求項７に記載の抗原結合エピトープ、請求項８に記載のジカウイルス抗原、請求項９に記載の抗原結合エピトープ、請求項１０に記載のデングウイルス抗原、請求項１１に記載の抗体、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載の発現カセット、組換えベクター、トランスジェニック細胞株、組換え菌、アデノウイルス、レンチウイルス或いはウイルス粒子、又は請求項１４に記載のｍＲＮＡの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、具体的にジカ・デングワクチン及びその使用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

ジカウイルス（Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ、ＺＩＫＶ）は蚊媒介性ウイルスであり、フラビウイルス科フラビウイルス属に属する。２０１５～２０１６年にアメリカで発生したＺＩＫＶの流行は、中国を含む世界８４カ国に広がった。しかし、これまでのところ、利用可能なワクチンおよび薬物は存在しない。ＺＩＫＶ感染の世界的な発生率は現在減少しているが、ＺＩＫＶは、依然として流行地域に住む人々にとって脅威であるので、ＺＩＫＶのためのワクチンの開発は一刻の猶予も許さない課題となっている。

【0003】

ＤＥＮＶウイルス（ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ，ＤＥＮＶ）は、フラビウイルス科フラビウイルス属の蚊媒介性ウイルスであり、４種の血清型が存在する。

【0004】

ＺＩＫＶウイルス及びＤＥＮＶウイルスの構造は類似しており、いずれも二十面体の球状構造を呈し、エンベロープを有し、エンベロープ表面にエンベロープ（Ｅｎｖｅｌｏｐｅ，Ｅ）タンパク質を含む。内部のウイルスゲノムは長さ約１１ｋｂの一本鎖陽方向鎖ＲＮＡであり、１つのオープンリーディングフレームのみを含む。当該ゲノムはポリタンパク質として翻訳され、その後、このポリタンパク質は３つの構造タンパク質（Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ）及び７つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５）に切断されることができる。

【0005】

ＺＩＫＶ及びＤＥＮＶの表面の主要なタンパク質である約５３ｋＤのＥタンパク質は、ウイルスの細胞への侵入および膜融合を媒介するため、中和抗体を活性化するための重要なターゲットである。一方、Ｅタンパク質もワクチンを設計する際に重要な標的タンパク質である。Ｅタンパク質は５０４個のアミノ酸を有し、二量体として存在しており、各単量体は、それぞれ、ＤＩ、ＤＩＩ及びＤＩＩＩという３つのドメインを有する。ＤＩＩ頭部（９８～１０９位のアミノ酸）は、高度に保存された融合領域（ｆｕｓｉｏｎ ｌｏｏｐ，ＦＬ）を含む。ここで、ＺＩＫＶウイルス及びＤＥＮＶウイルスのＦＬ領域の配列は、完全に同一であり、いずれもＤ９８－Ｒ９９－Ｇ１００－Ｗ１０１－Ｇ１０２－Ｎ１０３－Ｇ１０４－Ｃ１０５－Ｇ１０６－Ｌ１０７－Ｆ１０８－Ｇ１０９である。ＦＬ領域はウイルス侵入の膜融合過程において重要な作用を果たし、ウイルス感染過程において、免疫細胞がＦＬに対する抗体を大量に産生する。

【0006】

約２６ｋＤのｐｒＭタンパク質は、Ｅタンパク質の正確な折り畳みを補助し、ｐｒＭ／Ｅの３’末端の膜貫通領域は、小胞体保持シグナルとして、ｐｒＭとＥとの異種二量体の形成を補助する。ｐｒＭタンパク質の主な機能の１つは、Ｅタンパク質の安定性を維持することであり、未成熟なウイルス粒子では、ｐｒポリペプチドがＥタンパク質の先端に位置してｐｒ－Ｅスパイクを形成し、Ｅタンパク質の融合ペプチドを覆い隠し、この場合、ｐｒＭが立体障害の原因でフーリンと接触して切断されることが困難である。次いで、ゴルジ体内腔の酸性環境で転位反応が誘導され、フーリン切断部位を露出させ、ｐｒＭタンパク質がフーリンによってＭタンパク質に切断される。この時、切断されたｐｒポリペプチドは、直ちにウイルス粒子から解離するのではなく、中性ｐＨの細胞環境中に曝露された後に、ｐｒポリペプチドが放出され、成熟なウイルス粒子が形成する。

【0007】

ＺＩＫＶの遺伝子構成及び抗原特性は、４種の血清型のデングウイルス（ｄｅｎｇｕｅ
ｖｉｒｕｓ、ＤＥＮＶ）に非常に類似しており、約５６％のアミノ酸類似性を有する。そのため、ＺＩＫＶ感染によって誘導される抗体は、ＤＥＮＶに対してより強い交差反応を発生し、これもワクチン安全の問題において考慮されるべきものである。多くの研究には、ＺＩＫＶ感染後の既存の抗体が、ＤＥＮＶと交差反応して、その後のＤＥＮＶ感染を増強し得ることを示している（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。この現象は、抗体依存性感染増強現象（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ、ＡＤＥ）と呼ばれ、ＡＤＥとは、抗体がウイルスを中和するのに不十分であるか、亜中和濃度である場合、逆にウイルスの感染を増強することを指す（非特許文献７；非特許文献８）。疫学的調査の不足にもかかわらず、ヒト、サル及びマウス由来の既存のＺＩＫＶ抗体はすべて、細胞実験においてＤＥＮＶの感染を増強することが示されている（非特許文献２；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。また、サル及びマウスモデルにおいて、ＺＩＫＶ感染、ワクチン免疫或いは胎児が母親由来の抗体も、ＤＥＮＶ感染症状を悪化させることが示されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献４；非特許文献５）。従って、ＺＩＫＶワクチンで免疫を獲得した後、将来のＤＥＮＶの感染に対するＡＤＥ現象が存在する可能性がある。このことは、ＺＩＫＶワクチン設計において考慮すべきものである。

【0008】

ＡＤＥ反応を引き起こす抗体は、主にウイルスのＦＬ融合領域によって誘発されるものである（非特許文献７；非特許文献８）。フラビウイルス感染では、このような抗体が全誘導抗体の大部分を占める。このような抗体は、エピトープが十分に保存されているので、一般に異なる血清型の間に交差反応を示す。それらの多くは中和活性が低く、ＡＤＥ反応を引き起こしやすいが、高い中和活性を有する抗体の大部分はいずれもＥタンパク質の他のエピトープに結合する。Ｅタンパク質の第Ｉのドメイン（Ｄｏｍａｉｎ Ｉ、ＤＩ）、第ＩＩのドメイン（Ｄｏｍａｉｎ ＩＩ、ＤＩＩ）及び第ＩＩＩのドメイン（Ｄｏｍａｉｎ ＩＩＩ、ＤＩＩＩ）、或いは四次構造エピトープを標的とする一連のＺＩＫＶ中和モノクローナル抗体が同定されている（非特許文献９；非特許文献５；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。従って、理想的なＺＩＫＶワクチン設計戦略は、免疫反応のホットスポットエピトープをＦＬ領域から他の中和エピトープに移動させることである。

【0009】

抗体は、ウイルス粒子に結合して髓細胞の表面のＦｃγ受容体タンパク質に結合することによって細胞に取り込まれ、続いてウイルスの感染を促進する。ＤＥＮＶには４種の血清型が存在するので、初感染と異なる血清型のＤＥＮＶに再感染した場合、ＡＤＥが生じる可能性が高い。そのため、ヒトがＤＥＮＶ感染後、より重篤な病態を示す（非特許文献１３）。現在唯一市販されているＤＥＮＶワクチンＤｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）は、ＡＣＥ現象のために使用に制限がある。Ｄｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）は、ＤＥＮＶ血清陽性の人にのみ使用でき、血清陰性の人では、ワクチンの接種が逆にデング熱感染を悪化させる（非特許文献１４；非特許文献１５）。従って、ＡＤＥを回避する方法も、ＤＥＮＶワクチン開発における課題である。

【0010】

この背景技術部分に開示された情報は、本発明の一般的な背景の理解を高めることのみを意図しており、当業者に既に知られている従来技術を構成するという承認又は任意の形態の示唆として解釈されるべきではない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８

【非特許文献2】Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７

【非特許文献3】Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７

【非特許文献4】Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７

【非特許文献5】Ｓｔｅｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６

【非特許文献6】Ｖａｌｉａｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８

【非特許文献7】Ｂｅｌｔｒａｍｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【非特許文献8】Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【非特許文献9】Ｂａｒｂａ－Ｓｐａｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６

【非特許文献10】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７

【非特許文献11】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６

【非特許文献12】Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６

【非特許文献13】Ｋａｔｚｅｌｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７

【非特許文献14】Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８

【非特許文献15】Ｓｌｏｎ－Ｃａｍｐｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９

【非特許文献16】Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ．９２，６ｅ０１７２２－１７．２６Ｆｅｂ．

【非特許文献17】Ｈａｓｓａｎ，Ａｈｍｅｄ Ｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌ．２８，１０：２６３４－２６４６．ｅ４．

【非特許文献18】Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８５０５．

【非特許文献19】Ｗａｎｇ，Ｑｉｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ８．３６９（２０１６）：３６９ｒａ１７９．

【非特許文献20】Ｄａｉ，Ｌｉａｎｐａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ（２０１６）：Ｓ１９３１３１２８１６３０１４９４．

【非特許文献21】Ｃｈｅｒｒｉｅｒ，Ｍｉｃｋａｅｌ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８．２０（２００９）：３２６９－３２７６．

【非特許文献22】Ａｂｂｉｎｋ，Ｐｅｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９．４２０（２０１７）．

【非特許文献23】Ｄｏｗｄ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，Ｖｏｌ ３５４，Ｉｓｓｕｅ ６３０９

【非特許文献24】Ｃｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８．２４：１３９７５－１３９８６．

【非特許文献25】Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１５），ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５．１：７１－７１．

【非特許文献26】Ｄｅｎｇ，Ｙｏｎｇｑｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），ＰＬＯＳ ＯＮＥ ６．１

【非特許文献27】Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８０．２４：１２１４９－１２１５９．

【非特許文献28】Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６，１７０－１７７．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明の目的は、ＡＤＥ反応を回避するジカ・デングワクチン及びその使用を提供することである。本発明は、結晶構造解析並びに他の構造及び機能の分析に基づいて、ＡＤＥ現象を引き起こす主要な抗体のエピトープ情報を得る。本発明の実施例で提供される抗原は、ジカウイルス又はデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域に突然変異を導入した抗原であり、この突然変異を有する抗原は、いずれもＡＤＥを引き起こす抗体（ＦＬＥ抗体）に結合できない。本発明で提供される前記抗原から得られたワクチンにより、免疫を獲得した後、ＦＬエピトープによって誘導される抗体の生成を回避することができ、ＡＤＥ現象の低減又は除去を実現することができる。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の目的を実現するために、本発明の実施例は、ジカウイルス又はデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域（ｆｕｓｉｏｎ ｌｏｏｐ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を有する抗原であって、
前記Ｅタンパク質のＦＬ融合領域は、
（１）Ｄ９８位の突然変異、Ｎ１０３位の突然変異のうちの１種又は２種と、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の３つの部位の突然変異との組み合わせ、
（２）Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異のうちの１種又はそれらの組み合わせ、
（３）Ｗ１０１の単一部位の突然変異、
のうちの一種の突然変異を有する、抗原を提供する。

【0014】

（１）Ｄ９８位の突然変異、Ｎ１０３位の突然変異のうちの１種又は２種と、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の３つの部位の突然変異との組み合わせは、
Ｄ９８、Ｎ１０３、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の５つの部位の突然変異、
Ｄ９８、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の４つの部位の突然変異、
Ｎ１０３、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の４つの部位の突然変異、のうちのいずれか一種である。

【0015】

（２）Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異のうちの１種又はそれらの組み合わせは、
Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異から選択される単一部位の突然変異、
Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異から選択される２つの部位の突然変異、
Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の３つの部位の突然変異、のうちのいずれか一種である。

【0016】

前記Ｄ９８位の突然変異はＥタンパク質の９８位のアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸で置換されることを指す。前記Ｎ１０３位の突然変異はＥタンパク質の１０３位のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン以外の任意のアミノ酸で置換されることを指す。前記Ｇ１０６位の突然変異はＥタンパク質の１０６位のグリシン（Ｇ）がグリシン以外の任意のアミノ酸で置換されることを指す。前記Ｌ１０７位の突然変異はＥタンパク質の１０７位のロイシン（Ｌ）がロイシン以外の任意のアミノ酸で置換されることを指す。前記Ｆ１０８位突然変異はＥタンパク質の１０８位のフェニルアラニン（Ｆ）がフェニルアラニン以外の任意のアミノ酸で置換されることを指す。前記Ｗ１０１位の突然変異はＥタンパク質の１０１位のトリプトファン（Ｗ）がトリプトファン以外の任意のアミノ酸で置換されることを指す。

【0017】

Ｄ９８部位、Ｗ１０１部位、Ｎ１０３部位、Ｇ１０６部位、Ｌ１０７部位或いはＦ１０８部位は、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域に位置する。ＦＬ（融合領域）配列はフラビウイルス属ウイルス間で高度に保存されており、ここで、ＺＩＫＶウイルス及びＤＥＮＶウイルスのＦＬ配列は完全に同一であり、両方ともＤ９８－Ｒ９９－Ｇ１００－Ｗ１０１－Ｇ１０２－Ｎ１０３－Ｇ１０４－Ｃ１０５－Ｇ１０６－Ｌ１０７－Ｆ１０８－Ｇ１０９である。本発明において、Ｄ９８、Ｗ１０１、Ｎ１０３、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８部位の番号付けに関しては、ジカウイルス及びデングウイルスのＥタンパク質配列中の位置を参照して行い、具体的にはジカウイルス（ＺＩＫＶ ＦＳＳ１３０２５株を例として、ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＮ８６０８８５．１）Ｅタンパク質のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す９８、１０１、１０３、１０６、１０７及び１０８部位を参照し得る。

【0018】

一つの可能な実施形態において、前記抗原の、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｄ９８、Ｎ１０３、Ｇ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８の５つの部位の突然変異から
選択され、
又は、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｇ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８の３つの部位の突然変異から選択され、
又は、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｇ１０６及びＬ１０７の２つの部位の突然変異から選択され、
又は、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｇ１０６及びＦ１０８の２つの部位の突然変異から選択され、
又は、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｌ１０７及びＦ１０８の２つの部位の突然変異から選択され、
又は、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｇ１０６の単一部位の突然変異から選択され、
又は、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｌ１０７の単一部位の突然変異から選択され、
又は、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｆ１０８の単一部位の突然変異から選択され、
又は、Ｅタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、Ｗ１０１の単一部位の突然変異から選択される。

【0019】

一つの可能な実施形態において、前記抗原のＥタンパク質のＦＬ融合領域の突然変異は、以下の突然変異或いは突然変異の組み合わせから選択される。

【0020】

【表1】

【0021】

【表2】

【0022】

前記表中、Ｄ９８Ｎ突然変異は、Ｅタンパク質の９８位のアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されることを指す。

【0023】

Ｎ１０３Ｔ突然変異は、Ｅタンパク質の１０３位のアスパラギン（Ｎ）がスレオニン（Ｔ）で置換されることを指す。

【0024】

Ｇ１０６Ｆ突然変異は、Ｅタンパク質の１０６位のグリシン（Ｇ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されることを指し、Ｇ１０６Ｌ突然変異は、Ｅタンパク質の１０６位のグリシン（Ｇ）がロイシン（Ｌ）で置換されることを指す。

【0025】

Ｌ１０７Ｅ突然変異は、Ｅタンパク質の１０７位のロイシン（Ｌ）がグルタミン酸（Ｅ）で置換されることを指し、Ｌ１０７Ｋ突然変異は、Ｅタンパク質の１０７位のロイシン（Ｌ）がリジン（Ｋ）で置換されることを指す。

【0026】

Ｆ１０８Ｗ突然変異は、Ｅタンパク質の１０８位のフェニルアラニン（Ｆ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されることを指す。

【0027】

アミノ酸の突然変異はこのように類推されることができ、一つの英文字で表されるアミノ酸の種類が当業者に一般的に理解されているものである。

【0028】

一つの可能な実施形態において、前記抗原がジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はさらにジカウイルスのＭタンパク質の配列の全長又は一部を含み、任意で、前記抗原はさらにジカウイルスのＭタンパク質の配列の全長を含む。

【0029】

前記抗原がデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はさらにデングウイルスのＭタンパク質の配列の全長又は一部を含み、任意で、前記抗原はさらにデングウイルスのＭタンパク質の配列の全長を含む。

【0030】

Ｍタンパク質は、ｐｒＭ構造タンパク質がフーリンによって切断された後に形成されるものである。Ｍタンパク質の配列の全長又は一部とは、Ｍタンパク質配列における０．５％～１００％、５０～１００％、６０～１００％、７０～１００％、８０～１００％、９０～１００％を指し、前記配列はＭタンパク質から連続的に選択された配列であってもよく、Ｍタンパク質配列から個別に選択されたフラグメントの組み合わせであってもよい。

【0031】

一つの可能な実施形態において、前記抗原がジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はさらにジカウイルスのｐｒＭタンパク質の配列の全長又は一部を含み、任意で、前記抗原は更にジカウイルスのｐｒＭタンパク質の配列の全長を含む。

【0032】

前記抗原がデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原は更にデングウイルスのｐｒＭタンパク質の配列の全長又は一部を含み、任意で、前記抗原は更にデングウイルスのｐｒＭタンパク質の配列の全長を含む。

【0033】

前記ｐｒＭタンパク質は、約２６ｋＤのジカウイルス又はデングウイルスの構造タンパク質であり、Ｅタンパク質の正確な折り畳みを補助するために使用される。ｐｒＭタンパク質の配列の全長又は一部とは、ｐｒＭタンパク質の配列における０．５％～１００％、５０～１００％、６０～１００％、７０～１００％、８０～１００％、９０～１００％の配列を指し、前記配列は、ｐｒＭタンパク質から連続的に選択された配列であってもよく、ｐｒＭタンパク質配列から個別に選択されたフラグメントの組み合わせであってもよい。

【0034】

一つの可能な実施形態において、前記抗原がジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はジカウイルスのＥタンパク質の配列の全長又は一部を有し、任意で、前記抗原はジカウイルスのＥタンパク質の配列の全長を含む。

【0035】

前記抗原がデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域を有する場合、前記抗原はデ
ングウイルスのＥタンパク質の配列の全長又は一部を有し、任意で、前記抗原はデングウイルスのＥタンパク質の配列の全長を含む。

【0036】

Ｅタンパク質の配列の全長又は一部とは、Ｅタンパク質の０．５％～１００％、５０～１００％、６０～１００％、７０～１００％、８０～１００％、９０～１００％の配列を指し、前記配列はＥタンパク質から連続的に選択された配列であってもよく、Ｅタンパク質配列から個別に選択されたフラグメントの組み合わせであってもよい。

【0037】

前記ジカウイルスのＥタンパク質、ｐｒＭタンパク質、Ｍタンパク質の配列はＮＣＢＩに開示されたジカウイルスの各ウイルス株の全配列及び従来技術の報告から取得することができ、前記デングウイルスのＥタンパク質、ｐｒＭタンパク質、Ｍタンパク質配列はＮＣＢＩに開示された４種の血清型のデングウイルスの各ウイルス株の全配列及び従来技術から取得することができる。

【0038】

一つの可能な実施形態において、前記ジカウイルスは、全てのジカウイルス株、例えば、ＺＩＫＶ ＦＳＳ１３０２５株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＮ８６０８８５．１）、ＺＩＫＫ
ＳＭＧＣ－１株を含む。

【0039】

一つの可能な実施形態において、前記デングウイルスは、４種の血清型のデングウイルスの各デングウイルス株、例えば、ＤＥＮＶ１（Ｈａｗａｉｉ株，ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＭ２０４１１９）、ＤＥＮＶ２（Ｎｅｗ Ｇｕｉｎｅａ Ｃ株，ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＭ２０４１１８．１）、ＤＥＮＶ３（ＹＮ０２株，ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ８２４９０３）及びＤＥＮＶ４（中国広州Ｂ５株，ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２８９０２９）を含む。

【0040】

本発明の実施例はまた、ジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域の抗原結合エピトープ（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ）を提供し、前記ジカウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域は、アミノ酸配列Ｄ９８－Ｒ９９－Ｇ１００－Ｗ１０１－Ｇ１０２－Ｎ１０３－Ｇ１０４－Ｃ１０５－Ｇ１０６－Ｌ１０７－Ｆ１０８－Ｇ１０９を含み、
（１）Ｄ９８位の突然変異、Ｎ１０３位の突然変異のうちの１種又は２種と、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の３つの部位の突然変異との組み合わせ、
（２）Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異のうちの１種又はそれらの組み合わせ、
（３）Ｗ１０１の単一部位の突然変異、
のうちの一種の突然変異を有する。

【0041】

本発明の実施例は、また、前記抗原結合エピトープを含有するジカウイルス抗原を提供する。

【0042】

一つの可能な実施形態において、前記ジカウイルス抗原は、更に、
ジカウイルスのＥタンパク質の配列の全長又は一部、
ジカウイルスのＭタンパク質配列の全長又は一部、
ジカウイルスのｐｒＭタンパク質の全長又は一部、
のうちの一種以上の配列を含む。

【0043】

本発明の実施例はまた、デングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域の抗原結合エピトープを提供し、前記デングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域は、アミノ酸配列Ｄ９８－Ｒ９９－Ｇ１００－Ｗ１０１－Ｇ１０２－Ｎ１０３－Ｇ１０４－Ｃ１０５－Ｇ１０６－Ｌ１０７－Ｆ１０８－Ｇ１０９を含み、
（１）Ｄ９８位の突然変異、Ｎ１０３位の突然変異のうちの１種又は２種と、Ｇ１０６、
Ｌ１０７、Ｆ１０８の３つの部位の突然変異との組み合わせ、
（２）Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異のうちの１種又はそれらの組み合わせ、
（３）Ｗ１０１の単一部位の突然変異、
のうちの一種の突然変異を有する。

【0044】

本発明の実施例はまた、前記抗原結合エピトープを含むデングウイルス抗原を提供する。

【0045】

一つの可能な実施形態において、前記デングウイルス抗原は、更に、
デングウイルスのＥタンパク質の配列の全長又は一部、
デングウイルスのＭタンパク質の配列の全長又は一部、
デングウイルスのｐｒＭタンパク質の配列の全長又は一部、
のうちの一種以上の配列を含む。

【0046】

本発明の実施例はまた、前記抗原、ジカウイルス抗原、デングウイルス抗原に結合する抗体を提供する。

【0047】

本発明の実施例はまた、前記抗原、抗原結合エピトープ、ジカウイルス抗原、デングウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0048】

本発明の実施例はまた、前記ポリヌクレオチドを含む発現カセット、組換えベクター、トランスジェニック細胞株、組換え菌、アデノウイルス、レンチウイルス又はウイルス粒子を提供する。

【0049】

本発明の実施例はまた、前記抗原、抗原結合エピトープ、ジカウイルス抗原、デングウイルス抗原をコードするｍＲＮＡを提供する。

【0050】

本発明の実施例はまた、活性成分として、前記ワクチンは、活性成分として、前記抗原、前記ジカウイルス抗原、前記デングウイルス抗原、前記ポリヌクレオチド、前記発現カセット、組換えベクター、トランスジェニック細胞株、組換え菌、アデノウイルス、レンチウイルス又はウイルス粒子、或いは前記ｍＲＮＡを含むワクチンを提供する。

【0051】

一つの可能な実施形態において、前記ワクチンは、不活化ワクチン、弱毒化ワクチン、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチン、アデノウイルスワクチン（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）、他のウイルスベクターワクチン、サブユニットワクチン、及びウイルス粒子のうちの一種以上を含む。

【0052】

一つの可能な実施形態において、前記ワクチンは、アデノウイルスワクチンである。

【0053】

一つの可能な実施形態において、前記ワクチンは、さらに、薬学的又は獣医学的に許容されるビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）、希釈剤、補助剤又は賦形剤を含む。

【0054】

本発明の実施例は、また、フラビウイルス属に属するウイルスによる感染を予防及び／又は治療するためのワクチンの調製における、前記抗原、前記抗原結合エピトープ、前記抗体、前記ポリヌクレオチド、前記発現カセット、組換えベクター、トランスジェニック細胞株、組換え菌、アデノウイルス、レンチウイルス又はウイルス粒子、或いは前記ｍＲＮＡの使用を提供する。

【0055】

本発明の実施例は、また、フラビウイルス属に属するウイルスによる感染を検出するた
めの検出試薬又はキットの調製における、前記抗原、前記抗原結合エピトープ、前記抗体、前記ポリヌクレオチド、前記発現カセット、組換えベクター、トランスジェニック細胞株、組換え菌、アデノウイルス、レンチウイルス又はウイルス粒子、或いは前記ｍＲＮＡの使用を提供する。

【発明の効果】

【0056】

本発明は、結晶構造解析並びに他の構造及び機能の分析に基づいて、ＡＤＥ現象を引き起こす主要な抗体のエピトープ情報を得る。本発明の実施例で提供される抗原は、ジカウイルス又はデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域に、ｉ．Ｄ９８位の突然変異、Ｎ１０３位の突然変異のうちの１種又は２種と、Ｇ１０６、Ｌ１０７、Ｆ１０８の３つの部位の突然変異との組み合わせ、ｉｉ．Ｇ１０６位の突然変異、Ｌ１０７位の突然変異、Ｆ１０８位の突然変異のうちの１種又はそれらの組み合わせ、ｉｉｉ．Ｗ１０１の単一部位の突然変異、のうちの一種の突然変異を導入する。この突然変異を有する抗原は、いずれもＡＤＥを引き起こす抗体（ＦＬＥ抗体）に結合できない。本発明により提供される前記抗原から得られたワクチンにより、免疫を獲得した後、ＦＬエピトープによって誘導される抗体の生成を回避することができ、ＡＤＥ現象の低減又は除去を実現することができる。

【0057】

（２）本発明の実施例で提供される抗原は、ＡＤＥを引き起こす抗体（ＦＬＥ抗体）には結合しないが、他のエピトープの抗体に対する結合力には影響を与えない。本発明は、前記抗原から獲得した数種のジカウイルスのアデノウイルスワクチンを例とし、得られた組換えアデノウイルスワクチンが抗原の免疫原性を低下させず、依然として中和抗体の生成をよく活性化できることと、前記ワクチンがマウスチャレンジ試験（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｔｅｓｔ）に完全な保護効果を果たすことと、前記ワクチンがマウスをウイルス血症と組織臓器の感染からよく保護することができることと、免疫を獲得した後、４種の血清型のＤＥＮＶウイルスに対するＡＤＥ現象を低下させ、さらに除去することができることを証明する。

【0058】

本発明は、さらに、突然変異後のＥタンパク質は二量体の形態を維持しており、ＦＬ突然変異したアミノ酸側鎖のみに変化が生じ、胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞の単一細胞配列決定により組換えアデノウイルスワクチンで誘導したマウスの抗体反応を分析し、ＦＬ領域突然変異した組換えアデノウイルスワクチンはＦＬ領域が野生型のワクチンに比べて、ＦＬエピトープによって誘導される抗体を顕著に低下させ、抗原の優性エピトープが転移することが証明される。これから、本発明により提供される前記抗原から得られたワクチンはＡＤＥ現象を除去し得る作用機序が分かる。

【0059】

（３）本発明は、さらに、前記抗原から獲得した数種のデングウイルスのアデノウイルスの発現プラスミドを例とし、得られた抗原がいずれもＡＤＥを引き起こす抗体（ＦＬＥ抗体）に結合できないことを証明する。そのため、本発明の前記抗原により、デングウイルスワクチンの免疫を獲得した後、ＦＬエピトープによって誘導される抗体の生成を回避することができ、免疫後のＤＥＮＶウイルス感染によるＡＤＥ現象を低減又は除去することができる。

【0060】

（４）本発明により提供される前記抗原から得られたワクチンは、例えば核酸ワクチン、ｍＲＮＡワクチン、アデノウイルスベクターワクチン、他のウイルスベクターワクチン、ウイルス様粒子、前記抗原配列に基づく弱毒化ワクチン又は不活化ワクチン、他の骨格のキメラワクチン等の様々な形態を含むことができ、ＡＤＥ現象を除去するジカワクチン及び四価デングワクチンを製造することに用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0061】

一つ又は複数の実施例は、添付の図面の対応する図によって例示的に説明されており、これらの例示的な説明が実施例を限定するものとして解釈されるべきではない。ここで、「例示的」という用語は「例、実施例又は説明的なものとして用いられる」ことを意味する。ここで、「例示的」として説明したいかなる実施例は、他の実施例よりも好ましい又は良好であるものと解釈されるべきではない。

【図1】図１は、野生型組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴで免疫されたマウスの中和試験（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の結果を示す図である。

【図2A】図２Ａは、野生型組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴで免疫されたマウスの血清がＤＥＮＶ１に感染した細胞を増強する実験結果を示す図である。

【図2B】図２Ｂは、野生型組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴで免疫されたマウスの血清がＤＥＮＶ２に感染した細胞を増強する実験結果を示す図である。

【図2C】図２Ｃは、野生型組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴで免疫されたマウスの血清がＤＥＮＶ３に感染した細胞を増強する実験結果を示す図である。

【図2D】図２Ｄは、野生型組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴで免疫されたマウスの血清がＤＥＮＶ４に感染した細胞を増強する実験結果を示す図である。

【図3】図３は、Ｚ６抗体が４種の血清型のＤＥＮＶに感染した細胞に対していずれもある程度のＡＤＥを有することを示す図である。

【図4】図４は、Ｚ６抗体のＦａｂフラグメントとＺＩＫＶ Ｅタンパク質との複合体の構造を示す図である。

【図5A】図５Ａは、Ｚ６抗体とＺＩＫＶ Ｅタンパク質との複合体の構造を示す図である。

【図5B】図５Ｂは、２Ａ１０Ｇ６抗体とＺＩＫＶ Ｅタンパク質との複合体の構造を示す図である。

【図5C】図５Ｃは、Ｅ５３抗体とＷＮＶ Ｅタンパク質との複合体の構造を示す図である。

【図5D】図５Ｄは、図５Ａ～５Ｃの３つの抗体とＺＩＫＶ Ｅタンパク質構造の重畳図である。

【図6】図６は、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質とＺ６抗体との結合、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質と２Ａ１０Ｇ６抗体との結合、及びＷＮＶ Ｅタンパク質とＥ５３抗体との結合のアミノ酸部位分析を示す図である。

【図7】図７は、フラビウイルス属ウイルスの系統樹を示す図である。

【図8】図８は、ＺＩＫＶ Ｍ／Ｅ ＭｕｔＡ／Ｂ／Ｃ突然変異体の突然変異部位及び配列を示す図である。

【図9】図９は、フローサイトメータによるＭ／Ｅ－ＭｕｔＡ／Ｂ／Ｃ抗原活性の検出結果を示す図である。

【図10】図１０は、ｐＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ／ＭｕｔＣ組換えプラスミドの構築フローを示す図である。

【図11】図１１は、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清の中和抗体価を示す図である。

【図12】図１２は、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＩｆｎａｒ１^－／－マウスの血清の中和抗体価を示す図である。

【図13A】図１３Ａは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＩｆｎａｒ１^－／－マウスのチャレンジ試験後の死亡率の結果を示す図である。

【図13B】図１３Ｂは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＩｆｎａｒ１^－／－マウスのチャレンジ試験後の体重変化の結果を示す図である。

【図14】図１４は、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンのＺＩＫＶ感染によるウイルス血症からＩｆｎａｒ１^－／－マウスの保護の実験結果を示す図である。

【図15】図１５は、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンのＺＩＫＶチャレンジ後の組織臓器の感染からＩｆｎａｒ１^－／－マウスの保護の実験結果を示す図である。

【図16】図１６は、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＩｆｎａｒ１^－／－マウスのＺＩＫＶチャレンジ前後の血清中の中和抗体価変化の結果を示す図である。

【図17A】図１７Ａは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＺＩＫＶに対する交差反応実験の結果を示す図である。

【図17B】図１７Ｂは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＤＥＮＶ１に対する交差反応実験の結果を示す図である。

【図17C】図１７Ｃは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＤＥＮＶ２に対する交差反応実験の結果を示す図である。

【図17D】図１７Ｄは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＤＥＮＶ３に対する交差反応実験の結果を示す図である。

【図17E】図１７Ｅは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＤＥＮＶ４に対する交差反応実験の結果を示す図である。

【図18A】図１８Ａは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＺＩＫＶ感染細胞に対するＡＤＥ実験の結果を示す図である。

【図18B】図１８Ｂは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＤＥＮＶ１感染細胞に対するＡＤＥ実験の結果を示す図である。

【図18C】図１８Ｃは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＤＥＮＶ２感染細胞に対するＡＤＥ実験の結果を示す図である。

【図18D】図１８Ｄは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＤＥＮＶ３感染細胞に対するＡＤＥ実験の結果を示す図である。

【図18E】図１８Ｅは、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清がＤＥＮＶ４感染細胞に対するＡＤＥ実験の結果を示す図である。

【図19A】図１９Ａは、インビボ実験によるＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンがＩｆｎα／βｒ^－／－Ｉｆｎγｒ^－／－マウスのＤＥＮＶ２型の感染の増強に与える影響の検出結果を示す図である。

【図19B】図１９Ｂは、インビボ実験によるＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンがＩｆｎα／βｒ^－／－Ｉｆｎγｒ^－／－マウスのＤＥＮＶ２型の感染の増強に与える影響の検出結果を示す図である。

【図20】図２０は、フローサイトメトリーによるＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスリンパ節細胞からＺＩＫＶ Ｅタンパク質に結合するＧＣ Ｂ細胞を選別する条件を示す図である。

【図21】図２１は、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスのＺＩＫＶ Ｅタンパク質に結合するＧＣ Ｂ細胞の抗体レパートリーの解析結果を示す図である。

【図22】図２２は、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスによって誘発される抗体レパートリーにおける対になるＨＶ及びＬＶの結果を示す図である。

【図23】図２３は、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスによって誘発される抗体レパートリーにおける対になるＨＶ及びＬＶの結果を示す図である。

【図24-1】図２４－１は、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスによって誘発される抗体レパートリーにおける対になるＨＶ及びＬＶの結果を示す図である。

【図24-2】図２４－２は、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスによって誘発される抗体レパートリーにおける対になるＨＶ及びＬＶの結果を示す図である。

【図25】図２５は、ＺＩＫＶ組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスによって誘導される抗体が異なるＺＩＫＶ Ｅタンパク質及びＤＥＮＶ Ｅタンパク質への結合能力の同定を示す図である。

【図26A】図２６Ａは、代表的なＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導される抗体がＤＥＮＶ１感染細胞のＡＤＥ促進効果を検出する実験結果を示す図である。

【図26B】図２６Ｂは、代表的なＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導される抗体がＤＥＮＶ２感染細胞のＡＤＥ促進効果を検出する実験結果を示す図である。

【図26C】図２６Ｃは、代表的なＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導される抗体がＤＥＮＶ３感染細胞のＡＤＥ促進効果を検出する実験結果を示す図である。

【図26D】図２６Ｄは、代表的なＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導される抗体がＤＥＮＶ４感染細胞のＡＤＥ促進効果を検出する実験結果を示す図である。

【図27】図２７は、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導されるモノクローナル抗体で使用されるＶ遺伝子座と、報告されたＦＬＥモノクローナル抗体とのアラインメントを示す図である。

【図28A】図２８Ａは、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導されるモノクローナル抗体と、報告されたＦＬＥモノクローナル抗体との配列アラインメントを示す図である。

【図28B】図２８Ｂは、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導されるモノクローナル抗体と、報告されたＦＬＥモノクローナル抗体との配列アラインメントを示す図である。

【図28C】図２８Ｃは、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導されるモノクローナル抗体と、報告されたＦＬＥモノクローナル抗体との配列アラインメントを示す図である。

【図28D】図２８Ｄは、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導されるモノクローナル抗体と、報告されたＦＬＥモノクローナル抗体との配列アラインメントを示す図である。

【図28E】図２８Ｅは、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスによって誘導されるモノクローナル抗体と、報告されたＦＬＥモノクローナル抗体との配列アラインメントを示す図である。

【図29A】図２９Ａは、ＢＩＡｃｏｒｅによるＦＬＥ抗体に対するＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質の親和性の検出結果を示す図である。

【図29B】図２９Ｂは、ＢＩＡｃｏｒｅによるＦＬＥ抗体に対するＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質の親和性の検出結果を示す図である。

【図29C】図２９Ｃは、ＢＩＡｃｏｒｅによるＦＬＥ抗体に対するＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質の親和性の検出結果を示す図である。

【図29D】図２９Ｄは、ＢＩＡｃｏｒｅによるＦＬＥ抗体に対するＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質の親和性の検出結果を示す図である。

【図30A】図３０Ａは、ＢＩＡｃｏｒｅによる非ＦＬＥ中和抗体に対するＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質の親和性の検出結果を示す図である。

【図30B】図３０Ｂは、ＢＩＡｃｏｒｅによる非ＦＬＥ中和抗体に対するＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質の親和性の検出結果を示す図である。

【図30C】図３０Ｃは、ＢＩＡｃｏｒｅによる非ＦＬＥ中和抗体に対するＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質の親和性の検出結果を示す図である。

【図30D】図３０Ｄは、ＢＩＡｃｏｒｅによる非ＦＬＥ中和抗体に対するＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質の親和性の検出結果を示す図である。

【図31】図３１は、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣとＺ３Ｌ１単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）との複合体のタンパク質構造を示す図である。

【図32】図３２は、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質の二量体構造を示す図である。

【図33】図３３は、Ｚ３Ｌ１／ＺＩＫＶ ｓＥ ＭｕｔＣ複合体構造とＺ３Ｌ１／ＺＩＫＶ ｓＥ ＷＴ（ＰＤＢ：５ＧＺＮ）複合体構造とを重畳した後の比較分析を示す図である。

【図34】図３４は、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣのＦＬ領域とＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴのＦＬ領域（ＰＤＢ：５ＪＨＭ）を重畳した後の比較分析を示す図である。

【図35A】図３５Ａは、ＺＩＫＶ ｓＥ ＭｕｔＣのＦＬをフラビウイルス属ウイルスＦＬＥ抗体とＥタンパク質との複合体に重ね合わせる構造の比較分析を示す図である。Ｚ６抗体とＺＩＫＶ ｓＥタンパク質を使用した。

【図35B】図３５Ｂは、ＺＩＫＶ ｓＥ ＭｕｔＣのＦＬをフラビウイルス属ウイルスＦＬＥ抗体とＥタンパク質との複合体に重ね合わせる構造の比較分析を示す図である。２Ａ１０Ｇ６抗体とＺＩＫＶ ｓＥタンパク質（ＰＤＢ：５ＪＨＬ）を使用した。

【図35C】図３５Ｃは、ＺＩＫＶ ｓＥ ＭｕｔＣのＦＬをフラビウイルス属ウイルスＦＬＥ抗体とＥタンパク質との複合体に重ね合わせる構造の比較分析を示す図である。Ｅ５３抗体とＷＮＶ ｓＥタンパク質（ＰＤＢ：３Ｉ５０）を使用した。

【図36】図３６は、フローサイトメトリーによるＤＥＮＶ２野生型及び突然変異体Ｅタンパク質の抗原活性を測定した結果を示す図である。

【図37】図３７は、フローサイトメトリーによるＺＩＫＶ Ｅタンパク質１０１位のトリプトファンから他の１９種のアミノ酸へ突然変異させる時の抗原活性の検出結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0062】

本発明の実施例的目的、技術案及び利点をより明確にするために、以下では本発明の実施例における技術案を明確に、完全に説明する。説明された実施例は本発明の一部の実施例であり、全ての実施例ではないことは明らかである。本発明における実施例に基づき、当業者が創造的な労働なしに得られた全ての他の実施例も、本発明の保護請求の範囲内にある。本明細書および請求の範囲中に、特に明記しない限り、「含む」という用語、又は「含有」もしくは「備える」などの変形は、記載された要素又は構成要素を含むが、他の要素又は構成要素を除外しないと理解されるべきである。

【0063】

なお、以下の発明を実施するための形態では、本発明をよりよく説明するために、多数の具体的な詳細が記載される。当業者は、本発明が何らかの詳細が無くとも同様に実施できることを理解すべきである。いくつかの実施例では、当業者に周知の原料、要素、方法、手段などは、本発明の主旨を強調するために、詳細に説明されない。

【0064】

実施例１ ＺＩＫＶ野生型Ｍ／Ｅ及びｐｒＭ／Ｅ抗原で構成された組換えチンパンジーアデノウイルスワクチンにより誘導されたマウスの体液性免疫反応の検出

【0065】

ＺＩＫＶ ＦＳＳ１３０２５ウイルス株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＮ８６０８８５．１）のＭ／Ｅ抗原は、ベクターであるチンパンジーアデノウイルス７型に構築され、アデノウイルスをパッケージングし、培養し、精製した後、組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ（組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴの構築については、非特許文献１６を参照）が得られた。実験により、このワクチンがマウスに対して良好な保護効果を有することが証明された。ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ抗原で構築されたアデノウイルスワクチンも保護効果を有することが報告されている。従って、ＺＩＫＶ－ＳＭＧＣ－１ウイルス株のｐｒＭ／Ｅ抗原がベクターであるチンパンジーアデノウイルス７型に構築され、パッケージングして、組換えアデノウイルスＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴ（組
換えアデノウイルスＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴの構築については、非特許文献１７を参照）が得られ、その後の実験の対照とした。

【0066】

組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴにより誘導されたマウスの体液性免疫反応を評価した。

【0067】

１５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをランダムに３群に分け、それぞれ１．６ｘ１０^１１ｖｐ（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）のＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴアデノウイルスワクチン、ＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴアデノウイルスワクチン、及びＰＢＳで免疫し、４週間後に採血して、遠心分離して血清を分取し、血清を５６℃で３０分間加熱して不活性化し、マイクロ中和試験を使用して血清中の中和抗体価を測定した。

【0068】

マイクロ中和試験の過程は、以下の通りである。一日前に、ＶＥＲＯ細胞を９６ウェルプレートに播種した。翌日に、９６ウェルプレートを用いて、１％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１０２７０－１０６）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃ１１９９５５００ＢＴ）で血清を段階希釈し、ウイルスも１％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地で希釈し、血清とウイルス液とを均一に混合して、各ウェルに１００ＦＦＵ ＺＩＫＶ－ＳＭＧＣ－１を加え、３７℃で２時間インキュベートした。ＶＥＲＯ細胞プレートから培養上清液を除去し、血清とウイルスとの混合物を加え、２時間培養した後に１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを追加した。細胞を３７℃のインキュベーター中で４日間培養した。４日後に細胞培養プレートを取り出し、上清液を全て捨て、ＰＢＳで１回洗浄して、メタノール１５０μｌを加えて固定し、－２０℃の冷蔵庫に１５～２０分間放置した後に、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳで調製された２％脱脂乳（ブロッキング溶液）を用いてブロッキングして、室温で３０分間放置した後、一次抗体を添加した。一次抗体は、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質に結合できるＺ６抗体であり、この一次抗体をブロッキング溶液で５μｇ／ｍＬ作業濃度まで希釈して、室温で２時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、さらに二次抗体を加えた。二次抗体はＨＲＰコンジュゲート型ヤギ―抗ヒト抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，ＳＡ００００１－１７）であり、この二次抗体をブロッキング溶液で１５００倍に希釈し、室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ発色液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｐ０２０９）５０μｌを加え、室温でインキュベートし、約２０分間反応して、色の変化を観察し、２Ｍ塩酸５０μｌを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０吸光値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データに対して非線形フィッティングの計算を行い、５０％の細胞感染を中和する時の血清希釈倍数を計算して中和力価の値（ＭＮ_５０）を得た。最低希釈倍数の血清が５０％の細胞感染を中和することができない場合に、当該サンプルのＭＮ_５０を最低希釈倍数の半分として定義した。

【0069】

中和試験結果は図１に示す。ＰＢＳで免疫した群が陰性対照群Ｓｈａｍ群（図においてＳｈａｍで示す）であり、当該群の血清中に中和抗体が検出できない。ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ群（図においてＭ／Ｅで示す）及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴ群（図においてｐｒＭ／Ｅで示す）のマウスはいずれも中和抗体のＬｏｇ ＭＮ_５０の平均値が２～２．５の間であることを検出でき、統計学的に分析して、この２群の間に有意差がない。これから、組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴは、いずれもマウスでより高レベルの中和抗体を生成するように誘導することが分かる。

【0070】

実施例２ インビトロ実験による野生型組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴで免疫されたマウスの血清のＤＥＮＶに対するＡＤＥの検出

【0071】

フラビウイルス属ウイルスｅｎｖｅｌｏｐ（Ｅ）タンパク質のｆｕｓｉｏｎ ｌｏｏｐ（ＦＬ）配列が高度に保存されているため、ＺＩＫＶの感染、或いはＺＩＫＶ Ｅタンパク質免疫表現型ワクチンは、ＤＥＮＶと交差反応し得る抗体を誘発し、結果として、ＤＥＮＶに対する抗体依存性増強反応（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＡＤＥ）（非特許文献１８）になる。従って、上記のように構築された組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴで免疫されたマウスの血清がＤＥＮＶに対してＡＤＥを産生できるかどうかを検出した。

【0072】

１％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃ１１８７５５００ＢＴ）で血清（実施例１の組換えアデノウイルスワクチンで免疫されたマウスから採取したもの）を段階希釈し、希釈したサンプルを９６ウェルプレートに１０μｌ／ウェルで加え、続いて対応するＤＥＮＶ（ＤＥＮＶ２，ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＭ２０４１１８．１；ＤＥＮＶ３，ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ８２４９０３；ＤＥＮＶ４，ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２８９０２９；ＤＥＮＶ１は深セン市第三人民病院の感染患者サンプルから分離したウイルス株である）を加え、３７℃のセルインキュベーターに１時間置いた。

【0073】

培養された細胞表面にＦｃγＲＩＩＡ受容体が発現されたＫ５６２細胞８００ｇを５分間遠心分離し、１％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地で再懸濁して細胞を計数し、さらに細胞密度を３ｘ１０^６個／ｍｌに調整した。得られたものをウイルスと血清との混合物に１０μｌ／ウェルで添加し、３７℃のセルインキュベーター中で２時間インキュベートした。２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地を１００μｌ／ウェルで補充し、３７℃のセルインキュベーター中で４日間培養を継続した。４日後、細胞を９６ウェルプレートに移し、８００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した後、ＰＢＳで１回洗浄し、遠心分離して細胞を回収し。９６ウェルプレートにＦｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ，５５４７２２）１００μｌ／ウェルを加え、４℃の冷蔵庫に２０分間置いた。次いで、８００ｇで５分間遠心分離によって細胞を回収し、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ，５５４７２３）で２回洗浄した。ＦＩＴＣ標識されたＺ６抗体（Ｚ６－ＦＩＴＣ）を５０μｌ／ウェルで添加し、４℃の冷蔵庫に１時間置いた。細胞を遠心分離により回収し、そして１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。ＰＢＳで細胞を再懸濁（２００μｌ／ウェル）し、フローサイトメータを用いてウイルス感染された陽性細胞の割合を検出した。

【0074】

結果は図２Ａ～Ｄに示す。実験には細胞表面にＦｃγＲＩＩＡ受容体が発現されたＫ５６２細胞を細胞感染モデルとして用いた。組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ群（図においてＭ／Ｅで示す）及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴ群（図においてｐｒＭ／Ｅで示す）で免疫されたマウスの血清が４種の血清型のＤＥＮＶで感染したＫ５６２細胞に対していずれも増強作用を有し、対照群Ｓｈａｍ群（図においてＳｈａｍで示す）の血清ではＡＤＥは発生しない。組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴで免疫されたマウスの血清は、ＺＩＫＶ及びＤＥＮＶに対して交差反応性があり、血清中の抗体の一部はＤＥＮＶに結合し、ＡＤＥ反応を誘導すると推測された。

【0075】

実施例３ インビトロ実験によるモノクローナル抗体のＤＥＮＶ１－４に対するＡＤＥの検出

【0076】

Ｚ６抗体は、ＺＩＫＶに感染した一患者の血液から単離されたＢ細胞を配列決定して抗体配列を得た後に、組換え、発現、精製を経て得られたＺＩＫＶ Ｅタンパク質に結合できるモノクローナル抗体である。前の試験から、当該抗体は主にＺＩＫＶ Ｅタンパク質のＦＬエピトープに結合することを証明する（非特許文献１９）。ＺＩＫＶ及びＤＥＮＶのＦＬ配列が高度に保存されており、かつＺ６抗体はより低い中和活性を有する（非特許
文献１９）ため、Ｚ６抗体はＤＥＮＶに対してＡＤＥを引き起こす可能性が高いが、ＺＩＫＶ野生型Ｍ／Ｅ及びｐｒＭ／Ｅ抗原で構築された組換えチンパンジーアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴは、ＦＬエピトープを標的とする抗体の産生を活性化し、ＡＤＥをもたらす可能性が高いと推測された。

【0077】

Ｚ６抗体がＡＤＥ現象を生じるか否かを検出して、結果を図３に示す。図３の結果は、Ｚ６抗体が４種の血清型のＤＥＮＶに対していずれもある程度のＡＤＥを有することを示す。より低い中和活性を有するＺ６抗体は、ＤＥＮＶと交差反応した。Ｚ６抗体は、ＤＥＮＶ Ｅタンパク質のＦＬエピトープに結合することによりＡＤＥを引き起こす可能性が高いと推測し、これについてさらに検討した。

【0078】

実施例４ ＺＩＫＶ Ｅタンパク質とＺ６抗体との複合体の構造解析

【0079】

フラビウイルス属におけるＦＬエピトープの抗体と抗原との複合体の構造として、２Ａ１０Ｇ６抗体とＺＩＫＶ可溶性Ｅタンパク質（ｓｏｌｕｂｌｅ Ｅ，ｓＥ）との複合体の構造（非特許文献２０）、Ｅ５３抗体とＷＮＶ Ｅタンパク質との複合体の構造（非特許文献２１）が報告されている。２Ａ１０Ｇ６は、フラビウイルスに対する広範囲の中和抗体であり、ＤＥＮＶ１－４、ＷＮＶ、ＹＦＶ及びＺＩＫＶを中和することができ、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質のＦＬ及びｂｃ ｌｏｏｐに結合する（非特許文献２０）。

【0080】

ＺＩＫＶ ＦＬエピトープの抗体結合機構をさらに解析するために、タンパク質結晶化、Ｘ線回折法、及びデータ解析を組み合わせて、分解能３ÅのＺ６抗体のＦａｂフラグメントとＺＩＫＶ Ｅタンパク質との複合体の構造を得た。結果は図４に示し、複合体の構造のデータ収集及び最適化パラメータを表１に示す。

【0081】

図４から分かるように、Ｚ６抗体は、２Ａ１０Ｇ６抗体と同様に、Ｅタンパク質のＤＩＩの先端にほぼ垂直な角度で結合し、Ｅタンパク質のＦＬ及びｂｃ ｌｏｏｐと相互作用した。しかし、図５Ａ～Ｄに示すように、Ｚ６抗体と２Ａ１０Ｇ６抗体との違いは、Ｚ６の重鎖と軽鎖の両方がＺＩＫＶ Ｅタンパク質と相互作用するのに対して、２Ａ１０Ｇ６は主にその重鎖をＺＩＫＶ Ｅタンパク質に結合することである。図６に示すように、結合したアミノ酸部位を分析することにより、Ｚ６抗体はＺＩＫＶ Ｅタンパク質のＷ１０１、Ｇ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８とより多くの相互作用を持っていることが分かる。前記の４つのアミノ酸部位は、２Ａ１０Ｇ６抗体がＺＩＫＶＥタンパク質に結合するときにも重要な役割を果たす。Ｅ５３とＥタンパク質との相互作用はＷ１０１に依存しないが、Ｇ１０６及びＬ１０７とより多くの接触があった。

【0082】

従って、これらの４つのアミノ酸部位での免疫原の修飾は、ＦＬエピトープによって誘導される抗体の生成を回避し、それによって、ＤＥＮＶに対するＡＤＥの低減又は除去をもたらすことができると予測される。

【0083】

Ｍ／Ｅ抗原に基づくＺＩＫＶワクチンが優れた保護効果を有することが文献に報告されている（非特許文献２２）。従って、Ｍ／Ｅ抗原を選択して後続の突然変異設計を行う。

【0084】

また、ｐｒＭ／Ｅ抗原に基づくＺＩＫＶワクチンも優れた保護効果を有することが文献に報告されており（非特許文献２３）、且つ前のデータもＭ／Ｅ抗原に基づく突然変異設計がｐｒＭ／Ｅ抗原に類似な効果を有することを証明するため、本発明の実施例には、ｐｒＭ／Ｅ抗原に基づく突然変異設計の実験結果については説明を省略した。本発明の実施例におけるＭ／Ｅ抗原に対する突然変異設計は、ｐｒＭ／Ｅ抗原に対しても同様に適用できる。

【0085】

【表3】

【0086】

実施例５ 進化距離が遠いフラビウイルス属ウイルスのＦＬを利用したキメラウイルス抗原タンパク質の構築

【0087】

フラビウイルス属ウイルスのＥタンパク質のＦＬエピトープのアミノ酸配列を比較することにより、ほとんどのウイルスのＦＬ配列が保存されているが、進化距離が遠い一部のウイルスのＦＬ配列はＺＩＫＶのＦＬ配列とは異なることを見出した。ＺＩＫＶ ＦＬエピトープを破壊すると同時に正常なタンパク質の折り畳みや他の中和エピトープの表示に影響を与えないために、ＺＩＫＶとの進化距離が遠いフラビウイルス属ウイルスのＦＬのアミノ酸配列（フラビウイルス属の系統樹は図７に示す）を用いて、キメラウイルス抗原タンパク質を構築した。これにより、抗原の全体的なコンフォメーションを良好に維持し、突然変異部位以外のエピトープへの影響を減少させることができると推測した。

【0088】

これらのウイルスのＥタンパク質のＦＬ配列を参照として使用して、ＺＩＫＶ Ｍ／Ｅ抗原の突然変異体を設計し、ここで、Ｍ及びＥは全長であり、ＦＬ融合領域の突然変異部位と配列を図８に示す。ここで、ＭｕｔＡは、ＡＥＦＶ（Ａｅｄｅｓ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ，ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＣ１８１９２３．１）に由来し、突然変異部位はＤ９８Ｎ、Ｎ１０３Ｔ、Ｇ１０６Ｆ、Ｌ１０７Ｅ及びＦ１０８Ｗであり、
ＭｕｔＢは、ＣＦＡＶ（Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｖｉｒｕｓ，ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１５６４．２）に由来し、突然変異部位は、Ｄ９８Ｎ、Ｎ１０３Ｔ、Ｇ１０６Ｆ、Ｌ１０７Ｋ及びＦ１０８Ｗであり、
ＭｕｔＣは、ＮＡＫＶ（Ｎａｋｉｗｏｇｏ ｖｉｒｕｓ，ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿０３０４００．１）に由来し、突然変異部位は、Ｄ９８Ｎ、Ｎ１０３Ｔ、Ｇ１０６Ｌ、Ｌ１０７Ｅ及びＦ１０８Ｗである。

【0089】

ｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＡ／Ｂ／Ｃプラスミドを構築する際に使用したプライマーを表２に示す。ＭｕｔＡの構築を例とすると、プラスミドｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＷＴをテンプレートとして使用し、ＷＴ－Ｆ及びｍｕｔＡ－Ｒをプライマーとして使用して、ＰＣＲによって生成物ｍｕｔＡ－１を得た。プラスミドｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＷＴをテンプレートとして使用し、ＷＴ－Ｒ及びｍｕｔＡ－Ｆをプライマーとして使用して、ＰＣＲによって生成物ｍｕｔＡ－２を得た。さらに、モル比１：１のｍｕｔＡ－１とｍｕｔＡ－２との混合物をテンプレートとして使用し、ＷＴ－Ｆ及びＷＴ－Ｒをプライマーとして使用し、ＰＣＲによって、ＰＣＲ生成物ｍｕｔＡを得た。ｐＣＡＧＧＳプラスミドをＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素切断し、両付着末端を有する線状化プラスミドを得た。酵素切断された線状化プラスミドとＰＣＲ生成物ｍｕｔＡとをモル比１：５で混合し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎキットを用いて組換えを行い、組換え生成物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、アンピシリン耐性のプレートに塗布して３７℃で培養した後、細胞を選択し、クローン化し、ＰＣＲ同定及び配列決定を行い、次いで、プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＡ）を抽出して後続の実験に使用した。

【0090】

【表4】

【0091】

実施例６ Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＡ／Ｂ／Ｃ抗原の活性の検出

【0092】

野生型プラスミドｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及び突然変異体プラスミドｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＡ、ｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－Ｍｕ
ｔＣをそれぞれ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８時間後に、細胞を収集し、消化し単一細胞化し、固定化・透過処理して、ＺＩＫＶＥ結合抗体とインキュベートし、ヤギ抗ヒト（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ）ＦＩＴＣ二次抗体とインキュベートし、最後にフローサイトメータを用いてサンプルの陽性率を検出した。結果は図９に示す。

【0093】

Ｚ３Ｌ１、Ｚ２０及びＺ２３はすべて、中和活性の高いＺＩＫＶ特異的抗体であり、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質のＤＩ、ＤＩＩ及びＤＩＩＩにそれぞれ結合した（非特許文献１９）。

【0094】

図９から分かるように、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質のＦＬエピトープに結合する抗体（Ｚ６及び２Ａ１０Ｇ６）は、野生型Ｍ／Ｅ－ＷＴ抗原を発現する細胞に結合することができたが、３つの突然変異抗原を発現する細胞には結合しなかった。これに対し、非ＦＬエピトープに結合する高い中和活性を有するＺ３Ｌ１、Ｚ２３及びＺ２０抗体は、野生型Ｍ／Ｅ－ＷＴ抗原的を発現する細胞、及び３つの突然変異抗原を発現する細胞の両方に結合した。これから分かるように、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＡ、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣ抗原のＦＬエピトープが破壊され、対応する抗体が結合できなくなったが、他のＺＩＫＶの強力な中和抗体が結合するエピトープは変化しなく、対応する抗体が依然として結合できる。

【0095】

即ち、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＡ、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣ抗原は、ＤＥＮＶ ＦＬに結合する抗体の産生をほとんど又は全く誘導せず、それによってＤＥＮＶに対するＡＤＥを減少させることができ、同時に、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＡ、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣ抗原が他の抗体エピトープに影響を及ぼさなかった。

【0096】

実施例７ ＺＩＫＶのＭ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣ抗原を用いた組換えチンパンジーアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣの構築

【0097】

図９から分かるように、ＭｕｔＢ及びＭｕｔＣの細胞陽性の強度はＭｕｔＡよりわずかに高いため、後続の実験は主にＭｕｔＢ及びＭｕｔＣを用いて行った。

【0098】

まず、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣ抗原をｐｓｈｕｔｔｌｅベクターにクローニングした。プラスミドｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ又はｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣをテンプレートとして使用し、ｔｏ＿ｐｓｈｕｔｔｌｅ－Ｆ及びｔｏ＿ｐｓｈｕｔｔｌｅ－Ｒをプライマーとして使用し、ＰＣＲ反応によって、ＰＣＲ生成物ｔｏ＿ｐｓｈｕｔｔｌｅ－ｍｕｔＢ及びＰＣＲ生成物ｔｏ＿ｐｓｈｕｔｔｌｅ－ｍｕｔＣを得た。ｐｓｈｕｔｔｌｅプラスミドを、ＸｂａＩ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＦＤ０６８４）及びＫｐｎＩ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＦＤ０５２４）で制限酵素切断し、両付着末端を有する線状化プラスミドを得た。酵素切断された線状化プラスミドをそれぞれＰＣＲ生成物ｔｏ＿ｐｓｈｕｔｔｌｅ－ｍｕｔＢ或いはｔｏ＿ｐｓｈｕｔｔｌｅ－ｍｕｔＣとモル比１：５で混合し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎキットを用いて組換えを行い、組換え生成物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、カンナ耐性のプレートに塗布して３７℃で培養した。その後、細胞を選択してクローン化し、ＰＣＲ同定及び配列決定を行い、次いで、プラスミドを抽出した。次いで、ｐｓｈｕｔｔｌｅプラスミド上でＭ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣを発現するカセットを、ＡｄＣ７ベクターに構築した。前記構築手順については、非特許文献１６を参照した。

【0099】

プラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅ－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ或いはＭｕｔＣをテンプレートとして使用し、ｔｏ＿ＡｄＣ７－Ｆ及びｔｏ＿ＡｄＣ７－Ｒをプライマーとして使用し、ＰＣＲ反応によってＰＣＲ生成物ｔｏ＿ＡｄＣ７－ＭｕｔＢ及びｔｏ＿ＡｄＣ７－ＭｕｔＣを得
た。ＡｄＣ７プラスミドを、ＰＩ－ＳｃｅＩ（ＮＥＢ，Ｒ０６９６Ｓ）及びＩ－ＣｅｕＩ（ＮＥＢ，Ｒ０６９９Ｓ）で制限酵素切断し、両付着末端を有する線状化プラスミドを得た。酵素切断された線状化プラスミドとＰＣＲ生成物ｔｏ＿ＡｄＣ７－ＭｕｔＢ或いはｔｏ＿ＡｄＣ７－ＭｕｔＣとをモル比１：５で混合し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎキットを用いて組換えを行い、組換え生成物をｓｔｂｌ２コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリン耐性のプレートに塗布して３０℃で培養した後、細胞を選択してクローン化し、ＰＣＲ同定及び配列決定を行い、次いで、プラスミドを抽出した。組換えプラスミドの構築フローを図１０に示す。使用したプライマー配列を表３に示す。

【0100】

【表5】

【0101】

ｐＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びｐＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣプラスミドを制限酵素ＰａｃＩ（ＮＥＢ，Ｒ０５４７Ｓ）で線状に消化した後、次いで、６５℃、恒温浴で２０分間加熱して、酵素を不活性化した。Ｆｕｇｅｎｅ－６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ２６９１）を用いてプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、３７℃のインキュベーター中で少なくとも７日間培養した後、顕微鏡下でプラークの出現について毎日調べた。プラーク細胞が脱落する時にすべての細胞及び上清を収集して第一世代の組換えアデノウイルスになった。１：１０の割合で、４０プレートの細胞に達するまで順次拡大培養することができた。その後、すべての細胞を収集し、細胞を３回凍結融解して溶解して、ウイルスを放出した後、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって精製し、ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ－６ ＤＧ Ｍｅｄｉａ，ＢＩＯ－ＲＡＤ，１５００７３８）で脱塩し、精製し、ＮＡＮＯＤＲＯＰによってサンプルのＯＤ２６０を検出した。サンプルの濃度がＯＤ２６０値に１．１ｘ１０^１２を掛けたものであり、単位はｖｐ（ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ）／ｍｌであり、分注して－８０℃で保存した。

【0102】

実施例８ 組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣにより誘導されたＢＡＬＢ／ｃマウスの体液性免疫反応の評価

【0103】

２４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをランダムに４群に分け、筋肉内注射により３種の組換えアデノウイルスワクチン、それぞれＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣで免疫し、アデノウイルスワクチン免疫の用量は１．６ｘ１０^１１ｖｐであり、１群のマウスがＰＢＳで免疫して陰性対照とした。４週間後に、採血して血清を分離し、マイクロ中和試験を用いて血清中の中和抗体価を検出した。

【0104】

結果は図１１に示す。野生型ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及び突然変異体アデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣはいずれもマウスを誘導して中和抗体を生成することができ、Ｌｏｇ（ＭＮ_５０）値の平均値が２．０～２．５の間にあり、且つＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣの二群とＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ群との中和抗体価は有意差がなく、これは突然変異が抗原の免疫原性を有意に低下させず、依然として中和抗体の生成を良好に活性化することができるこ
とを示す。ここで、図中のＳｈａｍはＰＢＳで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＷＴはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫した群を指す。

【0105】

実施例９ ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンにより誘導されたＩｆｎａｒ１^－／－マウスの体液性免疫反応の評価

【0106】

ＺＩＫＶをＢＡＬＢ／ｃマウスに感染させた後マウスの死亡及び明らかな病徴が発生しないため、ワクチンの効果をより良好に検証するために、免疫不全症マウスＩｆｎａｒ１^－／－マウスをＺＩＫＶの感染モデル（Ｌａｚｅａｒ，Ｈｅｌｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０１６），ｖｏｌ．１９，５：７２０－３０．）として選択し、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンにより誘導されたＩｆｎａｒ１^－／－マウスの体液性免疫レベルを評価した。

【0107】

Ｉｆｎａｒ１^－／－マウスをランダムに４群に分け、筋肉内注射によりそれぞれＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチンを注射し、アデノウイルスワクチン免疫の用量は１．６ｘ １０^１１ｖｐであり、１群のマウスがＰＢＳで免疫して陰性対照とした。２８日後に採血して血清を分離し、マイクロ中和試験を用いてＩｆｎａｒ１^－／－マウス血清中の中和ＺＩＫＶ抗体の力価レベルを検出し、結果を図１２に示す。

【0108】

図１２から分かるように、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンはいずれもマウスに高いレベルの中和抗体を誘導することができる。ここで、図中のＳｈａｍはＰＢＳで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＷＴはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫した群を指す。

【0109】

実施例１０ Ｉｆｎａｒ１^－／－マウス免疫後のチャレンジ保護試験

【0110】

実施例９で免疫化されたＩｆｎａｒ１^－／－マウスに免疫後３０日目にＺＩＫＶをチャレンジし、腹腔内に５ｘ１０^６ＰＦＵ ＺＩＫＶ（ＳＭＧＣ－１株）を注射した後、毎日マウスの状態を観察し、体重変化をモニタリングし、実験結果は図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。

【0111】

図１３Ａ及び図１３Ｂから分かるように、ｓｈａｍ群がチャレンジ後の４日目から徐々に体重が減少し（図１３Ｂ）、ｓｈａｍ群のマウスが６日目又は７日目に全部死亡（図１３Ａ）した。これに対しＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣで免疫した三群のマウスが、チャレンジ後に体重が減少せず（図１３Ｂ）、この三群のマウスはいずれも死亡しなかった（図１３Ａ）。これはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンが野生型のＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンと同様に、マウスへのチャレンジにおいて完全な保護作用を果たすことを示す。ここで、図中のＳｈａｍはＰＢＳで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＷＴはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫した群を指す。

【0112】

ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンがマウスをウイルス感染後に引き起こされるウイルス血症から保護することができるか否かを検出するた
めに、当該実験にはチャレンジ後の３日目及び６日目のマウス血液を収集し、血清を分離し、次いで、ＭａｇａＢｉｏ ＰｌｕｓウイルスＲＮＡキット（Ｂｉｏｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢＳＣ５８Ｓ１Ｂ）を用いてＲＮＡを抽出し、次いで、ＦａｓｔＫｉｎｇ一段法逆転写－蛍光定量キット（ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ、ＦＰ３１４）を用いてウイルスＲＮＡを定量的に測定し、定量時に使用したプローブ及びプライマー配列は表４に示し、定量結果は図１４に示す。

【0113】

【表6】

【0114】

図１４から分かるように、Ｓｈａｍ群のマウスは感染後の３日目及び６日目にいずれも高いウイルス量を検出することができ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチンで免疫されたマウスが感染後の３日目及び６日目の血清にウイルスが検出されず、これはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンが野生型のＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンと同様に、マウスをウイルス血症から良好に保護することができることを示す。ここで、図中のＳｈａｍはＰＢＳで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＷＴはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫した群を指す。

【0115】

実施例１１ ＺＩＫＶワクチンの殺菌免疫（ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）効果の検出

【0116】

前記実験は、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫されたマウスが、ＺＩＫＶ感染によるウイルス血症および死亡から保護できることを実証した。さらに実験を設計してＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンが殺菌免疫を提供できるか否かを検出し、具体的なステップは以下のとおりであった。

【0117】

Ｉｆｎａｒ１^－／－マウスをランダムに４群に分け、筋肉内注射により３種の組換えアデノウイルスワクチンＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣで免疫し、アデノウイルスワクチン免疫の用量が１．６ｘ１０^１１ｖｐであり、１群のマウスがＰＢＳで免疫して陰性対照とした。免疫後の２８日目に採血して血清を分離し、免疫後の３０日目に腹腔内経路によりＺＩＫＶ（ＳＭＧＣ－１株）５ｘ１０^４ＦＦＵを注射し、ＺＩＫＶでチャレンジした６日目に再び採血した後、その日に肝臓、脾臓、睾丸、脳及び脊髓の一部を解剖して取り出した。解剖して取り出した組織臓器をＰＢＳ溶液に加え、次いで、粉砕器（ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ、ＯＳＥ－Ｙ３０）で粉砕し、遠心分離して上清を取り出してＭａｇａＢｉｏ ＰｌｕｓウイルスＲＮＡキットを用いてＲＮＡを抽出し、次にＺＩＫＶ ＲＮＡに対してＲＴ－ＰＣＲ検出を行い、結果は図１５に示す。

【0118】

図１５から分かるように、Ｓｈａｍ群のマウスでは５つの臓器全てにおいて一定量のウイルスが検出されたが、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄ
Ｃ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチンで免疫したこの３群のマウスでは全ての組織臓器においてウイルスが検出されなかった。ここで、図中のＳｈａｍはＰＢＳで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＷＴはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫した群を指す。

【0119】

マイクロ中和試験を用いて免疫後の２８日目及びチャレンジ後の７日目の血清中の中和抗体価を検出し、結果は図１６に示す。

【0120】

図１６から分かるように、チャレンジ前にＳｈａｍ群では中和抗体が検出されず、チャレンジ後の７日目にＳｈａｍ群の各マウスはいずれも高力価の中和抗体を検出することができた。ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫したこの２群はチャレンジ前後の血清中和抗体価に顕著な差異がなく、ほぼ同じレベルに維持された。これは、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチン及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンはいずれもチャレンジ完全免疫を提供することができ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンに比べて効果がやや高く、完全な殺菌免疫を提供することができることを示す。ここで、図中のＳｈａｍはＰＢＳで免疫した群であり、Ｍ／Ｅ－ＷＴは免疫ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチン群であり、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢは免疫ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチン群であり、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣは免疫ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチン群であり、図１６において左から右へ順にＳｈａｍ群、Ｍ／Ｅ－ＷＴ群、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ群、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣ群の結果であった。

【0121】

実施例１２ ＺＩＫＶワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清のＤＥＮＶに対する交差反応の検出

【0122】

ＺＩＫＶ感染がＤＥＮＶに対するＡＤＥをもたらす主な理由の１つは、ＺＩＫＶ及びＤＥＮＶのＥタンパク質のＦＬエピトープがより保存されており、ＺＩＫＶによって誘発されるいくつかの抗体がＤＥＮＶと交差反応した（非特許文献１８）。従って、さらにＥＬＩＳＡ実験によって、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清の４種の血清型のＤＥＮＶに対する交差反応が検出された。結果は図１７Ａ～Ｅに示す。

【0123】

図１７Ａ～Ｅから分かるように、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫しされたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清はいずれもＺＩＫＶ Ｅタンパク質への結合能力が強い。しかし、それらの４種の血清型のＤＥＮＶ Ｅタンパク質への結合能力は異なる。Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ群及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣ群のマウス血清が４種の血清型のＤＥＮＶ Ｅタンパク質への結合力が低いが、Ｍ／Ｅ－ＷＴ群のマウス血清が４種の血清型のＤＥＮＶ Ｅタンパク質への結合力が高いレベルで維持した。これから分かるように、突然変異体がＥタンパク質のＦＬエピトープを破壊し、当該エピトープによって誘導される抗体の量を減少させ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチンで免疫されたマウス血清がＤＥＮＶ Ｅタンパク質に結合する能力が低下した。

【0124】

ここで、図１７Ａ～ＥにおいてＳｈａｍはＰＢＳで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＷＴはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫した群を指す。図１７Ａはマウス血清がジカウイルス（ＺＩＫＶ）Ｅタンパク質への結合力の結果を示す図であり、図１７Ｂはマウス血清がデングウイルス１型（ＤＥＮＶ１）のＥタンパク質への結合力の結果を示す図であり、図１７Ｃはマウス
血清がデングウイルス２型（ＤＥＮＶ２）のＥタンパク質への結合力の結果を示す図であり、図１７Ｄはマウス血清がデングウイルス３型（ＤＥＮＶ３）のＥタンパク質への結合力の結果を示す図であり、図１７Ｅはマウス血清がデングウイルス４型（ＤＥＮＶ４）のＥタンパク質への結合力の結果を示す図であった。

【0125】

実施例１３ インビトロ実験によるＺＩＫＶワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清のＤＥＮＶに対するＡＤＥの検出

【0126】

実施例１２の実験結果は、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンがＤＥＮＶに対する交差抗体の誘導を減少させることを実証した。さらに実験を設計して、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンがＤＥＮＶに対するＡＤＥを減少させることができるか否かを検出し、具体的なステップは以下のとおりであった。

【0127】

実施例８で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を段階希釈し、それぞれＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３、及びＤＥＮＶ４と混合してインキュベートし、さらにＫ５６２細胞を加え、４日間培養した後にＦＩＴＣ標識されたＺ６抗体で染色し、続いてフローサイトメータを用いて陽性細胞の割合を検出した。結果は図１８Ａ～Ｅに示す。

【0128】

抗体の媒介なしでは、ＤＥＮＶウイルスがＫ５６２細胞に感染することができなかった。図１８Ａ～Ｅから分かるように、Ｓｈａｍ群の血清はＤＥＮＶに結合できる抗体を含まないため、検出されたサンプルの感染率はバックグラウンドレベルである。Ｍ／Ｅ－ＷＴ群のマウスの血清は一定の濃度で４種の血清型のＤＥＮＶウイルスがＫ５６２細胞に感染することを媒介することができた。それに対し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣとの２群のサンプルの感染率はいずれもＭ／Ｅ－ＷＴ群より著しく低く、ＤＥＮＶに対するＡＤＥの減少又は除去を示す。これは、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンがＡＤＥを低下させる良好な効果に達することを示す。

【0129】

ここで、図中のＳｈａｍはＰＢＳで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＷＴはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫した群を指す。

【0130】

図１８Ａ～Ｅでは、図１８Ａは、マウス血清がＺＩＫＶによるＫ５６２細胞の感染の増強に対する検出であり、図１８Ｂは、マウス血清がＤＥＮＶ１によるＫ５６２細胞の感染の増強に対する検出であり、図１８Ｃは、マウス血清がＤＥＮＶ２によるＫ５６２細胞の感染の増強に対する検出であり、図１８Ｄは、マウス血清がＤＥＮＶ３によるＫ５６２細胞の感染の増強に対する検出であり、図１８Ｅは、マウス血清がＤＥＮＶ４によるＫ５６２細胞の感染の増強に対する検出であった。

【0131】

前記一連のインビトロ実験はいずれもＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチンがＤＥＮＶに対するＡＤＥを低下させ又は除去することができることを証明した。

【0132】

実施例１４ インビボ実験によるＺＩＫＶワクチンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清のＤＥＮＶに対するＡＤＥの検出

【0133】

生理学的条件下で、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンがＤＥＮＶに対するＡＤＥを減少させることができるか否かをさらに実証するために、Ｉｆｎα／βｒ^－／－Ｉｆｎγｒ^－／－マウスに基づくモデルを使用して、ＤＥＮＶに
対するＡＤＥ現象を検証した。

【0134】

まず、８０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをランダムに４群に分け、各群２０匹であり、それぞれＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチン及びＰＢＳで免疫し、アデノウイルスワクチン免疫の用量はマウス１匹あたり１．６ｘ１０^１１ｖｐであり、４週間後に採血して血清を分離し、５６℃で３０分間加熱し、各群の２０匹のマウスの血清を混合して、後続の受動免疫Ｉｆｎα／βｒ^－／－Ｉｆｎγｒ^－／－マウスに用いた。Ｉｆｎα／βｒ^－／－Ｉｆｎγｒ^－／－マウスをランダムに４群に分け、腹腔内経路によりそれぞれＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチン或いはＰＢＳで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清（血清をＰＢＳで１：１０の割合で希釈し、各マウスに希釈後の血清２００μｌを注射する）を注射した。２４時間後に、皮下経路によりＤＥＮＶ２型ウイルスを、１匹ずつに、５０００ＦＦＵを注射し、注射する前に各マウスの体重を記録した。その後、毎日マウスの状態及び生存状況を観察し、体重を測定した。結果は図１９Ａ及び図１９Ｂに示す。

【0135】

図１９Ａ及び図１９Ｂから分かるように、Ｓｈａｍ群のマウスと比較して、Ｍ／Ｅ－ＷＴ群のマウス全体的な死亡時間はより早い。これは、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスの血清がＤＥＮＶの発病を増強することを示す。それに対し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣ群のマウス死亡時間及び傾向はＳｈａｍ群と一致する（図１９Ａ）。これは、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質の突然変異は、ＤＥＮＶに対してＡＤＥ現象を発生させる抗体の生成を減少し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣ群のマウスの表現をＳｈａｍ群と類似させることを示す。また、体重変化の傾向について、Ｍ／Ｅ－ＷＴ群のマウスの方がより早く体重が減少したのに対して、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＭ／Ｅ－ＭｕｔＣ群のマウスの体重変化の傾向はＳｈａｍ群と一致する（図１９Ｂ）。これらのインビボ実験の結果は、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンが野生型ワクチンで免疫した後のＤＥＮＶに対するＡＤＥを有意に減少させることができることを十分に実証している。

【0136】

ここで、図１９Ａ及び図１９Ｂ中のＳｈａｍはＰＢＳで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＷＴはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫した群を指し、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫した群を指す。

【0137】

実施例１５ ＺＩＫＶワクチンにより誘導されたＢＡＬＢ／ｃマウスによって産生された抗体レパートリーの解析

【0138】

ＦＬ変異ＺＩＫＶワクチンは、ＤＥＮＶに対するＡＤＥ反応を減少させながら防御免疫を誘導したので、マウスの体内のＺＩＫＶ ＥのＢ細胞系列をさらに解析して、突然変異ワクチンが抗体反応にどのように影響するかを説明した。

【0139】

ＢＡＬＢ／ｃマウスをランダムに３群に分け、筋肉内注射によりＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴアデノウイルスワクチン（ＷＴ群）、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢアデノウイルスワクチン（ＭｕｔＢ群）及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチン（ＭｕｔＣ群）で免疫し、各マウスを１．６ｘ１０^１１ｖｐで免疫した。免疫後の２０日目に、解剖してリンパ節を取り出して１％ＦＢＳを含有する１６４０培地に入れ、各ワクチン群の全てのマウスのリンパ節を混合し、スライドの粗面で粉砕した後、０．４５μｍフィルターでろ過した。リンパ球を４００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨て、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍｌで再懸濁した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒは０．５％ＦＢＳを添加したＰＢＳ溶液であった。再懸濁した後に１．５ｍｌのＥＰチューブに移し、４００ｇ、４℃
で１０分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞をＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ２００μｌで再懸濁し、生物素標識されたＺＩＫＶ Ｅ単量体タンパク質及び二量体タンパク質の混合物４μｇを添加し、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。その後ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍｌを加え、均一に混合し、遠心分離して細胞をペレット化した。さらにＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ１ｍｌで１回洗浄し、次いで、抗体を加えて染色し、抗体をＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで希釈し、各２００μｌの抗体液はＦＩＴＣ－ＧＬ７，２μｌ（ＢＤ，５５３６６６）、ＰＥ－ＣＤ１３８，４μｌ（ＢＤ，５５３７１４）、ＰＥ／ＣＹ７－ＣＤ３８，４μｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，１０２７１８）、ＡＰＣ－ＣＤ９３，４μｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，１３６５１０）、ＢＶ４２１－Ｂ２２０，１６μｌ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，１０３２４０）、ＢＶ５１０―ＩｇＤ，２μｌ（ＢＤ，５６３１１０）、ＢＶ７１１，４μｌ（ＢＤ，５６３２６２）を含む。各サンプルに抗体液２００μｌを加え、４℃、暗所で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。ＦＣＡＳ ｂｕｆｆｅｒ２ｍｌを添加し、細胞を懸濁し、０．４５μｍフィルターでろ過し、フローチューブに移し、ＧＬ－７^＋Ｂ２２０^ｈｉＣＤ３８^ｌｏＩｇＤ^－ＣＤ９３^－ＣＤ１３８^－＋（図２０に示す）の選別条件で選別し、ＺＩＫＶ Ｅと反応するＧＣ Ｂ細胞を選択し、次いで配列決定する前に、データベースを構築した。

【0140】

単一細胞のＢ細胞受容体（Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＢＣＲ）の対配列を得るために、単一細胞配列決定技術を使用した。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ
Ｖ（Ｄ）Ｊ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ，Ｍｏｕｓｅ Ｂ Ｃｅｌｌ，９６ ｒｘｎｓ（１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＰＮ－１００００７２）キットを用いて配列決定前のデータベース構築をした後、高スループット配列決定して、各細胞の重鎖及び軽鎖のＶ（Ｄ）Ｊフラグメントの全長配列を解析した。結果は図２１及び表５に示す。

【0141】

図２１及び表５から分かるように、ＷＴ群サンプルでは４５１個の重鎖可変領域配列及び６６１個の軽鎖可変領域配列が得られ、ペアリング可能なのは３３４対であり、ＭｕｔＢ群サンプルでは３１０個の重鎖可変領域配列及び３７９個の軽鎖可変領域配列が得られ、ペアリング可能なのは２３４対であり、ＭｕｔＣ群サンプルでは６６４個の重鎖可変領域配列及び７７６個の軽鎖可変領域配列が得られ、ペアリング可能なのは５１５対であった。ここで、図２１及び表５において、ＷＴはＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫した群を指し、ＭｕｔＢ指免疫ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチンで免疫した群を指し、ＭｕｔＣは免疫ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで免疫した群を指す。

【0142】

【表7】

【0143】

ＷＴ、ＭｕｔＢ及びＭｕｔＣにより誘導されたマウスから生成されるレパートリーを解析した結果から、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで活性化されたマウスの可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ，Ｖ）遺伝子は選好性があり、約６０％の重鎖はＩＧＨＶ９－２－１、ＩＧＨＶ１－２２及びＩＧＨＶ７－３を使用し、約６０％の軽鎖はＩＧＫＶ１０－９６、ＩＧＫＶ１４－１１１及びＩＧＫＶ６－２３（図２１）を使用することが分かる。それに対し、ＦＬ変異ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンでは
、ＢＣＲのプロファイルは、重鎖可変領域（ＨＶ）及び軽鎖可変領域（ＬＶ）の両方でより多様かつ分散した（図２１）。ＷＴ群において最も有意に活性化されたいくつかの可変領域遺伝子は、ＦＬ変異ワクチン群ＭｕｔＢ及びＭｕｔＣ群の抗体レパートリーに減少したか、又は全く出現しなかった（図２１）。

【0144】

次いで、抗体レパートリーにおける対になるＨＶ及びＬＶ結果を分析し、その結果をそれぞれ図２２、図２３及び図２４－１及び図２４－２に示す。

【0145】

図２２から分かるように、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで活性化されたマウスのＧＣ Ｂ細胞クローンのＨＶ：ＬＶは顕著な選好性があり、ここで、ＩＧＨＶ９－２－１：ＩＧＫＶ１０－９６（２９．９％）、ＩＧＨＶ１－２２：ＩＧＫＶ１４－１１１（１４．４％）及びＩＧＫＶ１－２２：ＩＧＫＶ６－２３（７．５％）の頻度が高く、これらの合計は約５０％であった。

【0146】

図２３及び図２４－１、２４－２から分かるように、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンで活性化されたマウスのＧＣ Ｂ細胞クローンのＨＶ：ＬＶの使用種がより多く、頻度分布もより分散した。ＷＴ群で最も高いＩＧＨＶ９－２－１：ＩＧＫＶ１０－９６が検出されたが、ＭｕｔＢもＭｕｔＣ群も検出されなかった。

【0147】

抗体レパートリー解析の結果は、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンのＦＬ領域を置換した後、Ｂ細胞反応の免疫優性エピトープが転移したことを示す。

【0148】

実施例１６ ＤＥＮＶ感染に対するＡＤＥ反応を有する主要なＦＬＥ抗体タイプの同定

【0149】

ＤＥＮＶに対するＡＤＥ反応を引き起こす抗体の大部分は、Ｅタンパク質のＦＬＥを標的としたが、ＺＩＫＶ感染によって誘導される抗体もＤＥＮＶに対するＡＤＥ反応をもたらしたので、前記単離されたモノクローナル抗体の結合特性を同定し、どれがＦＬＥに結合するか、およびＤＥＮＶに対するＡＤＥ反応を誘導するか否かを検出した。

【0150】

ＧＣ Ｂ細胞クローンの類似性分類に基づいて、それぞれＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣの３つの群の総数の６３．３８％、４６．５７％及び４３．８８％をカバーするいくつかの代表的なモノクローナル抗体遺伝子を合成した（金唯智、蘇州）（表６）。次いで、ＨＶ及びＬＶ遺伝子を、それぞれマウスＩｇＧ２Ａ及びＩｇκ発現ベクターにクローニングした。ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチン群（表６中、Ｍ／Ｅ－ＷＴで示す）由来のモノクローナル抗体をそれぞれＺＷＴ．１－１０と命名し、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢワクチン群（表６中、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢで示す）及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチン群（表６中、Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣで示す）由来のモノクローナル抗体をそれぞれＺＭｕｔＢ．１－８及びＺＭｕｔＣ．１－１３と命名した（表６）。

【0151】

【表8】

【0152】

【表9】

【0153】

モノクローナル抗体を発現する重鎖及び軽鎖プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、３日後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡ実験により上清中の抗体がＺＩＫＶ－Ｅ
タンパク質への結合能力を検出した。

【0154】

ＥＬＩＳＡの実験方法は以下の通りである。タンパク質をＥＬＩＳＡコーティング液（炭酸ナトリウム－炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ ９．６）で３μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μｌを加え、４℃で一晩放置した。翌
日、コーティング液を捨て、ＰＢＳで調製された５％脱脂乳でＥＬＩＳＡプレートをブロックし、室温で１時間放置した。ブロッキング溶液を捨て、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにモノクローナル抗体を発現する培養上清１００μｌを加え、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、ブロッキング溶液で１：２０００で希釈したＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＨＲＰ（ａｂ６７８９）二次抗体を加え、室温で１．５時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ発色液を加えて発色させ、３０分間後に２Ｍ塩酸５０μｌを加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０値を検出した。

【0155】

ＥＬＩＳＡ検出結果は図２５に示す。大部分のモノクローナル抗体はＺＩＫＶ ｓＥタンパク質の単量体或いは二量体形態に結合することができる。表６から分かるように、結合した陽性率はそれぞれＭＥ－ＷＴ群９０％（９／１０）、ＭＥ－ＭｕｔＢ群８７．５％（７／８）、ＭＥ－ＭｕｔＣ群７６．９％（１０／１３）に達成した。

【0156】

ＺＩＫＶ ｓＥタンパク質に結合する２６個の陽性モノクローナル抗体をさらに評価した。図２５から、ＭＥ－ＷＴ群由来のモノクローナル抗体の全てがＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質と反応しなかったが、血清型１～４型のＤＥＮＶのｓＥタンパク質と交差反応したことを見出した。これは、ＭＥ－ＷＴ群由来のモノクローナル抗体がＦＬＥに結合するモノクローナル抗体であり、ＭＥ－ＭｕｔＢ及びＭＥ－ＭｕｔＣ群由来のモノクローナル抗体が主にＺＩＫＶ特異的抗体で、ほとんどがＤＥＮＶ ｓＥに結合しないことを示す。

【0157】

ＭＥ－ＷＴ群由来の代表的なＦＬＥモノクローナル抗体を精製し、これらの抗体がＫ５６２細胞上のＤＥＮＶに対するＡＤＥ現象をさらに評価し、結果は図２６Ａ～Ｄに示す。図２６Ａ～Ｄから分かるように、検出した全てのＭＥ－ＷＴ群由来の抗体は、４種の血清型のＤＥＮＶに対していずれもある程度の感染効果を増強した。ここで、図２６Ａ～ＤにおいてＺＷＴ．１、４、６、８、９、１０はそれぞれＭ／Ｅ－ＷＴ群由来のモノクローナル抗体であり、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ ２、ＤＥＮＶ ３、ＤＥＮＶ ４はそれぞれ血清型１－４型のＤＥＮＶウイルスであり、図２６Ａ～Ｄは順に、ＺＷＴ．１、４、６、８、９、１０抗体が４種の血清型のＤＥＮＶがＫ５６２細胞を感染増強を促進した結果であった。

【0158】

ＭＥ－ＷＴ群由来のＦＬＥモノクローナル抗体は主に４種類のＨＶ：ＬＶ遺伝子パネルであり、文献及びデータベースにおいて従来報告されたフラビウイルスＦＬＥマウス由来モノクローナル抗体を検索しようと試み、さらに分離した抗体遺伝子座及び配列と比較し、以下の４つのモノクローナル抗体を発見した。

【0159】

６Ｂ６Ｃ－１は、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＴＢＥＶ）感染後に単離されたものであり（非特許文献２４）、４Ｇ２及び２Ａ１０Ｇ６は、いずれもＤＥＮＶ感染後に単離されたものであり（非特許文献２５；非特許文献２６）、
Ｅ５３は、ＷＮＶ感染後に単離されたものである（非特許文献２７）。

【0160】

図２７、及び図２８Ａ～Ｅに示すように、解析により、ＭＥ－ＷＴ群から分離したＦＬＥモノクローナル抗体はこの４つの報告されたモノクローナル抗体の遺伝子座及び配列と多くの類似を有することが分かった。図２７から分かるように、６Ｂ６Ｃ－１及び４Ｇ２は、それぞれＺＷＴ．１－３及びＺＷＴ．４－５と同じＨＶ：ＬＶ遺伝子対を使用しており、配列類似度が高く、２Ａ１０Ｇ６及びＥ５３は、それぞれＺＷＴ．６及びＺＷＴ．８と同じＨＶ遺伝子を使用した。

【0161】

２Ａ１０Ｇ６及びＺＷＴ．６は異なるＬＶ遺伝子を使用したが、２つの抗体のＬＶ配列はいくらか類似しており、図２８Ｅから分かるように、２Ａ１０Ｇ６及びＺＷＴ．６のＣＤＲＬ３及びＦＲ４は完全に同一であった。

【0162】

以上の分析から分かるように、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＷＴワクチンで免疫されたマウスのリンパ節ＧＣ Ｂ細胞からクローニングされたＦＬＥモノクローナル抗体は報告されたマウスのＦＬＥモノクローナル抗体とほぼ同じ遺伝子座を使用し、配列が類似している。これから分かるように、誘導マウスが生成するＦＬエピトープに結合する抗体に使用される遺伝子座は選好性があり、生成されたＦＬＥ抗体の特性も類似していた。

【0163】

図２８Ａは、ＺＷＴ．１、ＺＷＴ．２、ＺＷＴ．３、６Ｂ６Ｃ－１の抗体重鎖とマウス遺伝子座の配列とのアラインメント解析であり、図２８Ｂは、ＺＷＴ．１、ＺＷＴ．２、ＺＷＴ．３、６Ｂ６Ｃ－１の抗体軽鎖とマウス遺伝子座との配列アラインメントであり、図２８Ｃは、ＺＷＴ．４、ＺＷＴ．５、ＺＷＴ．６、４Ｇ２、２Ａ１０Ｇ６の抗体重鎖とマウス遺伝子座との配列アラインメントであり、図２８Ｄは、ＺＷＴ．４、ＺＷＴ．５、４Ｇ２抗体軽鎖とマウス遺伝子座との配列アラインメントであり、図２８Ｅは、ＺＷＴ．６、２Ａ１０Ｇ６の抗体軽鎖とマウス遺伝子座との配列アラインメントである。

【0164】

実施例１７ ＳＰＲ実験によるＺＩＫＶ抗体に対する野生型及び突然変異体ＺＩＫＶのＥタンパク質の親和性の検出

【0165】

ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣワクチンは、ＤＥＮＶに対するＡＤＥを回避しながらマウスに完全な防御を提供することができたので、潜在的な分子メカニズムを説明するために、代表的な可溶性ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質を発現して精製して、ｓＥ－ＷＴと比較した。

【0166】

ＢＩＯＣＯＲＥ８０００は表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）の原理に基づき、分子間の相互作用を検出することができ、分子結合過程における動的な変化をリアルタイムに反映し、相互作用の動力学パラメータを得た。

【0167】

ＢＩＯＣＯＲＥ８０００を使用して、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質及びＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質と、ＦＬＥ抗体及び非ＦＬＥ中和抗体との親和性を検出した。ＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質及びＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質は、それぞれ、アミノカップリング法で、ＣＭ５チップに固定された。次いで、４種の抗体を段階希釈して移動相とした。試験抗体は固定されたＺＩＫＶ ｓＥタンパク質を順に流れ、異なる結合対応信号を得て、収集されたデータはフィッティングの計算を経て、得られた結果は図２９Ａ～Ｄ及び図３０Ａ～Ｄに示す。

【0168】

図２９Ａ～Ｄにおいて、図２９Ａ～Ｄは順に、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質と２Ａ１０Ｇ６抗体との結合結果（ｓＥ－ＷＴ－２Ａ１０Ｇ６）、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質と２Ａ１０Ｇ６抗体との結合結果（ｓＥ－ＭｕｔＣ－２Ａ１０Ｇ６）、ＺＩＫＶ
ｓＥ－ＷＴタンパク質とＺ６抗体との結合結果（ｓＥ－ＷＴ－Ｚ６）、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質とＺ６抗体との結合結果（ｓＥ－ＭｕｔＣ－Ｚ６）である。ここで、図２９Ａから分かるように、２Ａ１０Ｇ６抗体がＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質に結合する親和性が９．１３ｎＭであり、図２９Ｃから分かるように、Ｚ６抗体がＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質に結合する親和性が７．１４ｎＭであり、図２９Ｂから分かるように、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質が２Ａ１０Ｇ６抗体に全く結合しなく、図２９Ｄから分かるように、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質がＺ６抗体に全く結合しなく、この結果も理論分析と一致した。

【0169】

図３０Ａ～Ｄにおいて、図３０Ａ～Ｄは順に、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質とＺ３Ｌ１抗体との結合結果（ｓＥ－ＷＴ－Ｚ３Ｌ１）、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質とＺ３Ｌ１抗体との結合結果（ｓＥ－ＭｕｔＣ－Ｚ３Ｌ１）、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質とＺ２３抗体との結合結果（ｓＥ－ＷＴ－Ｚ２３）、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質とＺ２３抗体との結合結果（ｓＥ－ＭｕｔＣ－Ｚ２３）である。ここで、図３０Ａ及び図３０Ｃから分かるように、Ｚ３Ｌ１及びＺ２３抗体がＺＩＫＶ Ｅ－ＷＴタンパク質に結合する親和性はそれぞれ９．４８μＭ及び０．６２５μＭであり、図３０Ｂ及び図３０Ｄから分かるように、Ｚ３Ｌ１及びＺ２３抗体がＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質に結合する親和性はそれぞれ８．０１μＭ及び０．７０１μＭである。突然変異タンパク質ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣがＺ２３及びＺ３Ｌ１に結合する親和性は、野生型ＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質と比較してほとんど変化せず、これは、設計された突然変異体が、タンパク質の全体的なコンフォメーションを維持することができ、突然変異部位以外の他のエピトープの変化が存在しないことを示す。

【0170】

実施例１８ 突然変異体ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣタンパク質とＺ３Ｌ１抗体との複合体の構造解析

【0171】

突然変異体ワクチンの作用機序をさらに説明するために、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣとＺ３Ｌ１単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）との複合体タンパク質を精製し、次いで、結晶スクリーニングした後、Ｘ線回折及び構造解析を経て、分解能が３Åの複合体の原子構造を得た。前記構造は図３１に示し、複合体のデータ収集及び最適化パラメータは表７に示す。

【0172】

【表10】

【0173】

図３１から分かるように、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質のＦＬ配列に５つの点突然変異が導入したにもかかわらず、ｓＥ－ＭｕｔＣは、融合前状態である二量体形態でＺ３Ｌ１のｓｃＦＶに結合した。表８に示すように、二量体の接触界面を詳細に分析した結果、突然変異したＦＬアミノ酸残基は隣接する２つのＥタンパク質のプロトマーの相互作用を再構築し、Ｎ９８及びＷ１０８の２つの位置にそれぞれ４個及び１個の水素結合を生成し、Ｅタンパク質二量体の安定化に有利である。

【0174】

図３２から分かるように、ｓＥ－ＭｕｔＣの折畳形態は、野生型タンパク質と非常に類似しており、正常な二次、三次および四次エピトープ構造を呈した。

【0175】

中和エピトープのコンフォメーションを解析するために、ＺＩＫＶ ｓＥ－ＭｕｔＣとＺ３Ｌ１のｓｃＦｖとの複合体構造（Ｚ３Ｌ１／ＺＩＫＶ ｓＥ ＭｕｔＣ）を、Ｚ３Ｌ１とＺＩＫＶ ｓＥ－ＷＴタンパク質との複合体構造（Ｚ３Ｌ１／ＺＩＫＶ ｓＥ ＷＴ
，ＰＤＢ：５ＧＺＮ）に重ね合わせ、結果を図３３に示す。図３３から分かるように、ＺＩＫＶ野生型タンパク質ｓＥ－ＷＴ及び突然変異体タンパク質ｓＥ－ＭｕｔＣはＺ３Ｌ１抗体との結合プロフィールが同じであり、結合箇所は主にＤＩ中のＤ０、Ｅ０及びＦ０鎖、ならびに１５０ｌｏｏｐであり、また、ＤＩＩ中のｋｌヘアピンである（非特許文献１９）。

【0176】

ｓＥ－ＭｕｔＣのＦＬ領域をｓＥ－ＷＴと重ね合わせて比較分析して、結果は図３４に示される。図３４から分かるように、両者のＦＬエピトープのコンフォメーションは非常に類似し、突然変異部位の側鎖のみにおいて差異を示す。

【0177】

突然変異体抗原ｓＥ－ＭｕｔＣがＦＬＥ抗体を誘導する可能性を分析するために、既知の構造のＦＬＥ抗体（Ｚ６抗体、２Ａ１０Ｇ６抗体及びＥ５３抗体）がフラビウイルスＥタンパク質に結合する構造を、ｓＥ－ＭｕｔＣのＤＩＩ構造と重ね合わせて分析し、結果は図３５Ａ～Ｃに示す。

【0178】

図３５Ａ～Ｃにおいて、図３５Ａ～Ｃは、それぞれ、Ｚ６抗体とＺＩＫＶ ｓＥタンパク質との複合体構造、２Ａ１０Ｇ６抗体とＺＩＫＶ ｓＥタンパク質（ＰＤＢ：５ＪＨＬ）との複合体構造、及びＥ５３抗体とＷＮＶ ｓＥタンパク質（ＰＤＢ：３Ｉ５０）との複合体構造を用いた。図３５Ａ～Ｃから分かるように、モノクローナル抗体がｓＥ－ＭｕｔＣに結合した場合、Ｇ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８の突然変異は抗原と抗体との結合を明らかに阻害する。Ｇ１０６Ｌの突出している長側鎖は、これらのＦＬＥ抗体の結合を阻害することができる。Ｌ１０７Ｅの突然変異後、荷電側鎖が形成され、相互作用における局所的な疎水性相互作用を破壊する可能性がある。さらに、Ｆ１０８Ｗ突然変異が立体障害を形成し、ｓＥ－ＭｕｔＣのＦＬエピトープと２Ａ１０Ｇ６抗体との相互作用に影響した。したがって、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質のＦＬエピトープにおけるＧ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８の３つの重要なアミノ酸の突然変異は相乗的に作用し、ＦＬＥ抗体の誘発を解消した。

【0179】

【表11】

【0180】

実施例１９ ＭｕｔＡ、ＭｕｔＢ及びＭｕｔＣ突然変異ＤＥＮＶワクチンの構築

【0181】

ＤＥＮＶワクチンの設計においてＡＤＥを回避する方法は、依然として未解決の問題（ＲＥＦ）であり、ＺＩＫＶのＦＬ及びＤＥＮＶのＦＬ配列が高度に保存されている。前記の体系的な試験から、ＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＢ及びＡｄＣ７－Ｍ／Ｅ－ＭｕｔＣアデノウイルスワクチンは、マウスに対して完全な防御を提供しながらＤＥＮＶに対するＡＤＥを回避することができることを実証した。従って、ＭｕｔＡ、ＭｕｔＢ及びＭｕｔＣ突
然変異したＤＥＮＶワクチンを構築することにより、当該ワクチンが同様の効果を有するかどうかを検証した。

【0182】

まず、ＪＥＶ（日本脳炎ウイルス（ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ））由来のシグナルペプチド遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）と、ＤＥＮＶ２ Ｎｅｗ Ｇｕｉｎｅａ Ｃウイルス株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＭ２０４１１８．１）を発現するＭ／Ｅ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８）とをｐｓｈｕｔｔｌｅベクターに構築し、野生型ＤＥＮＶ２ Ｍ／Ｅを発現するプラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＤＶ２－Ｍ／Ｅ－ＷＴを得た。ＪＥＶ由来のシグナルペプチド遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）と、ＤＥＮＶ２ Ｎｅｗ Ｇｕｉｎｅａ Ｃウイルス株のｐｒＭ／Ｅタンパク質を発現する遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９）とをｐｓｈｕｔｔｌｅベクターに構築し、野生型ＤＥＮＶ２ ｐｒＭ／Ｅを発現するプラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＤＶ２－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴを得た。

【0183】

全ての突然変異体は、Ｍ／Ｅ－ＷＴ抗原に基づいて構築された。ｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＤＶ２－Ｍ／Ｅ－ＷＴプラスミドをテンプレートとして使用して、突然変異体ＭｕｔＡ（Ｄ９８Ｎ、Ｎ１０３Ｔ、Ｇ１０６Ｆ、Ｌ１０７Ｅ及びＦ１０８Ｗ）、ＭｕｔＢ（Ｄ９８Ｎ、Ｎ１０３Ｔ、Ｇ１０６Ｆ、Ｌ１０７Ｋ及びＦ１０８Ｗ）及びＭｕｔＣ（Ｄ９８Ｎ、Ｎ１０３Ｔ、Ｇ１０６Ｌ、Ｌ１０７Ｅ及びＦ１０８Ｗ）プラスミドを構築した。構築中に使用されたプライマー配列を表９に示す。

【0184】

【表12】

【0185】

野生型タンパク質を発現するプラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＤＶ２－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及びｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＤＶ２－ｐｒＭ／Ｅ－ＷＴ、ならびに３種の突然変異体プラスミドを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８時間後に上清を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いてトリプシンで細胞を単一細胞に消化し、遠心分離後にＤＭＥＭ培地で再懸濁し、さらにＤＭＥＭ培地で１回洗浄した。次にＢＤ社のＦｉｘａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、氷上に２０分間置いた。次いで、８００ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を回収し、ＢＤ社の１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。各サンプルを５つに分け、ＦＬエピトープに結合できるＺ６、２Ａ１０Ｇ６及びｍＡｂ１１抗体、ならびに非ＦＬエピトープに結合できるｍＡｂ５１３及びＤ４４８抗体をそれぞれ添加し、４℃の冷蔵庫に１時間置いた。細胞を遠心分離により回収し、そして１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。次にＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＦＩＴＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，００００３－１２）抗体を加え、４℃の冷蔵庫に１時間置いた。細胞を遠心分離により回収し、そして１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。ＰＢＳで細胞を再懸濁（２００μｌ／ウェル）し、フローサイトメータを用いてサンプルの陽性率を検出し、実験結果を図３６に示す。

【0186】

図３６から分かるように、ＦＬエピトープに結合する抗体Ｚ６及び２Ａ１０Ｇ６は、ＤＥＮＶ２のＭ／Ｅ－ＷＴ及びｐｒＭ／Ｅ－ＷＴタンパク質を認識することができるが、ＤＥＮＶ２のＥタンパク質ＦＬエピトープに３種の突然変異の組み合わせを導入した場合、Ｚ６及び２Ａ１０Ｇ６抗体がＤＥＮＶ２のＭ／Ｅ－ＭｕｔＡ或いはＭ／Ｅ－ＭｕｔＢ或いはＭ／Ｅ－ＭｕｔＣタンパク質への結合能力が大幅に減少し又は結合しなくなった。より高い中和活性を有する非ＦＬエピトープに結合するｍＡｂ５１３及びＤ４４８抗体については、ＭｕｔＡ、ＭｕｔＢ及びＭｕｔＣ突然変異を導入したＤＥＮＶ２のＭ／Ｅ－ＭｕｔＡ或いはＭ／Ｅ－ＭｕｔＢ或いはＭ／Ｅ－ＭｕｔＣタンパク質に依然として結合することができる。これは、ＤＥＮＶ２ Ｅタンパク質のＦＬエピトープの突然変異は、他のエピトープに対して有意な影響を示さなかった。前記結果から分かるように、この３種の突然変異の組み合わせが、ＤＥＮＶワクチンに使用されることができる。Ｇ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８位の突然変異の組み合わせを有するＤＥＮＶ２ Ｅタンパク質抗原から得られたワクチンが、ワクチンで免疫した後、その後のＤＥＮＶウイルス感染によって引き起こされるＡＤＥ現象を減少させることができる。

【0187】

実施例２０ ＺＩＫＶ Ｅ Ｗ１０１位を他の１９種のアミノ酸に突然変異させた後の抗原活性に対する影響の検出

【0188】

Ｚ６／ＺＩＫＶ ｓＥ及び２Ａ１０Ｇ６／ＺＩＫＶ ｓＥの構造において、Ｅタンパク質と抗体との作用が最も多いアミノ酸はＷ１０１である。同時に、ほとんどのＦＬＥ抗体のＥタンパク質への結合はいずれもＷ１０１に依存することが文献に報告されている（非特許文献２８）。従って、Ｗ１０１を他の１９種のアミノ酸に突然変異させ、次にフローサイトメトリーによって細胞が抗原を発現するエピトープが変化するか否かを検出し、より最適な突然変異をスクリーニングした。

【0189】

ＪＥＶ由来のシグナルペプチド遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）及び野生型ＺＩＫＶのＭ／Ｅ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１）をｐＣＡＧＧＳベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）に構築して、野生型ＺＩＫＶのＭ／Ｅタンパク質を発現するプラスミドｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＷＴを得た。当該プラスミドをテンプレートとして使用して、Ｅタンパク質１０１位のトリプトファンを他の１９種のアミノ酸に突然変異させた。トリプトファンからアラニンへの突然変異を例とすると、プラスミドｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＷＴをテンプレートとして使用し、Ｗ１０１－ＷＴ－Ｆ及びＷ１０１－１Ａ－Ｒをプライマーとして使用し、ＰＣＲによって生成物Ｗ１０１－１Ａ－１を得て、プライマー配列は表１０に示す。プラスミドｐＣＡＧＧＳ－Ｍ／Ｅ－ＷＴをテンプレートとして使用し、Ｗ１０１－ＷＴ－Ｒ及びＷ１０１－１Ａ－Ｆをプライマーとして使用し、ＰＣＲによって生成物Ｗ１０１－１Ａ－２を得た。さらに、Ｗ１０１－１Ａ－１とＷ１０１－１Ａ－２とをモル比１：１で混合した混合物をテンプレートとして使用し、Ｗ１０１－ＷＴ－Ｆ及びＷ１０１－ＷＴ－Ｒをプライマーとして使用し、ＰＣＲによって、ＰＣＲ生成物Ｗ１０１－１Ａを得た。ｐ
ＣＡＧＧＳベクターを、ＸｈｏＩ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＦＤ０６９４）及びＥｃｏＲＩ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＦＤ０２７４）で制限酵素切断し、両付着末端を有する線状化プラスミドを得た。酵素切断した後の線状化プラスミドとＷ１０１－１Ａとをモル比１：５の割合で混合し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎキット（Ｔａｋａｒａ，６３９６４８）を用いて組換えを行い、組換え生成物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、アンピシリン耐性のプレートに塗布して３７℃で培養した後、細胞を選択して、クローン化して、ＰＣＲ同定及び配列決定を行った。

【0190】

【表13】

【0191】

【表14】

【0192】

Ｗ１０１の１９種の突然変異体プラスミドを抽出した後、野生型プラスミド及び１９種の突然変異体プラスミドをそれぞれ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８時間後に上清を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いてトリプシンで細胞を単一細胞に消化し、遠心分離後にＤＭＥＭ培地で再懸濁し、さらにＤＭＥＭ培地で１回洗浄した。次にＢＤ社のＦｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、氷上に２０分間置いた。次いで、８００ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を回収し、ＢＤ社の１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。各のサンプルを５つに分け、Ｚ６及び２Ａ１０Ｇ６抗体をそれぞれ添加し、４℃の冷蔵庫に１時間置いた。細胞を遠心分離により回収し、そして１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。次にＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＦＩＴＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，００００３－１２）抗体を加え、４℃の冷蔵庫に１時間置いた。細胞を遠心分離により回収し、そして１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。ＰＢＳで細胞を再懸濁（２００μｌ／ウェル）し、フローサイトメータを用いてサンプルの陽性率を検出し、実験結果を図３７に示す。

【0193】

図３７から分かるように、ＺＩＫＶ野生型Ｍ／Ｅ抗原はＺ６及び２Ａ１０Ｇ６抗体に結合することができるが、１９種の突然変異体はいずれもＺ６及び２Ａ１０Ｇ６抗体にほとんど結合することができない。これから分かるように、ＺＩＫＶ Ｅタンパク質の１０１位のトリプトファンがＦＬを標的とする抗体の活性化に重要であり、Ｗ１０１部位の突然変異によって調製されたワクチンはＦＬエピトープによって誘導される抗体の産生を低減
又は回避し、ワクチンで免疫した後にＤＥＮＶに対するＡＤＥ現象を引き起こすことを回避することができる。

【0194】

実施例２１ ＺＩＫＶ Ｅタンパク質Ｇ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８部位の突然変異がＦＬＥ抗体に対する結合能の検出

【0195】

前記のｐＣＡＧＧＳ－ＺＩＫＶ－Ｍ／Ｅ発現プラスミドに基づいて、以下の単一部位及び二重部位の点突然変異を行い、突然変異体プラスミドの構築方法は実施例２０を参照し、突然変異プラスミドを構築する過程で使用されるプライマーは表１１に示す。

【0196】

【表15】

【0197】

【表16】

【0198】

【表17】

【0199】

野生型プラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＺＩＫＶ－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及び構築された突然変異体プラスミドを、それぞれ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８時間後に細胞を収集し、単一細胞に消化し、固定化・透過処理して、ＦＬエピトープに結合するＡＤＥ抗体Ｚ６及び２Ａ１０Ｇ６とインキュベートした。Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ（ｍｏｕｓｅ）ＦＩＴＣ二次抗体とインキュベートし、最後にフローサイトメータを用いてサンプルの陽性率を検出した。陽性率が野生型陽性率の１０％未満であれば非結合とみなし、１０％～５０％であれば弱結合とみなし、結果を表１２に示す。

【0200】

表１２から明らかなように、前記突然変異は基本的にＦＬエピトープの代表的なＡＤＥ抗体（Ｚ６抗体及び２Ａ１０Ｇ６ 抗体）の結合を阻害することができる。これから分かるように、これらの突然変異により代表されるＧ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８部位の単一又は相乗的な突然変異で製造されたワクチンはＦＬエピトープによって誘導されるＡＤＥ抗体を低減又は回避することができ、そして、ワクチンで免疫した後、ＤＥＮＶに対するＡＤＥ現象を引き起こすことを回避した。

【0201】

【表18】

【0202】

実施例２２ ＤＥＮＶ Ｅタンパク質Ｇ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８部位の突然変異がＦＬＥ抗体に対する結合能の検出

【0203】

前記のｐＣＡＧＧＳ－ＤＥＮＶ２－Ｍ／Ｅ発現プラスミドに基づいて、以下の単一部位及び二重部位の点突然変異を行い、突然変異体プラスミドの構築方法は実施例１９を参照し、突然変異プラスミドを構築する過程で使用されるプライマーは表１３に示す。

【0204】

【表19】

【0205】

【表20】

【0206】

【表21】

【0207】

野生型プラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＺＩＫＶ－Ｍ／Ｅ－ＷＴ、ｐＣＡＧＧＳ－ＤＥＮＶ２－Ｍ／Ｅ－ＷＴ及び上記表の突然変異体構築物を、それぞれ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８時間後に細胞を収集し、単一細胞に消化し、固定化・透過処理して、ＦＬエピトープに結合するＡＤＥ抗体Ｚ６及び２Ａ１０Ｇ６とインキュベートした。Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ（ｍｏｕｓｅ）ＦＩＴＣ二次抗体とインキュベートし、最後にフローサイトメータを用いてサンプルの陽性率を検出した。陽性率が野生型陽性率の１０％未満であれば非結合とみなし、１０％～５０％であれば弱結合とみなし、結果を表１４に示す。

【0208】

表１４から明らかなように、前記突然変異は基本的にＦＬエピトープの代表的なＡＤＥ抗体の結合を阻害することができる。これから分かるように、これらの突然変異により代表されるＧ１０６、Ｌ１０７、及びＦ１０８の単一又は相乗的突然変異で製造されたワクチンはＦＬエピトープによって誘導されるＡＤＥ抗体を低減又は回避することができ、そして、ワクチンで免疫した後、ＤＥＮＶに対するＡＤＥ現象を引き起こすことを回避した。

【0209】

【表22】

【0210】

最後に説明するべきなのは、以上の実施例が本発明の技術案を説明するために用いられるものであり、制限したものではない。前記実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者であれば、依然として前記各実施例に記載の技術案を変更し、又はその一部の技術的特徴に等価置換を行うことができ、これらの変更や置換によって、対応する技術案の本質が本発明の各実施例の技術案の精神と範囲から逸脱することはないことが理解できる。

【産業上の利用可能性】

【0211】

本発明の実施例はジカ・デングワクチン及びその使用に関する。

【0212】

本発明は、結晶構造解析並びに他の構造及び機能の分析に基づいて、ＡＤＥ現象を引き起こす主要な抗体のエピトープ情報を得る。本発明の実施例で提供される抗原は、ジカウ
イルス又はデングウイルスのＥタンパク質のＦＬ融合領域に突然変異を導入し、この突然変異を有する抗原は、いずれもＡＤＥを引き起こす抗体（ＦＬＥ抗体）に結合できない。本発明により提供される前記抗原から得られたワクチンは、免疫を獲得した後、ＦＬエピトープによって誘導される抗体の生成を回避することができ、ＡＤＥ現象の低減又は除去を実現することができる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図28D】

【図28E】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図29D】

【図30A】

【図30B】

【図30C】

【図30D】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図36】

【図37】

【配列表】

2023500358000001.app

【国際調査報告】