特表2023-501058ベータ－ラパコンを有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-18
(54)【発明の名称】ベータ－ラパコンを有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/352 20060101AFI20230111BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230111BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230111BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230111BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20230111BHJP
【ＦＩ】
A61K31/352 ZNA
A61P1/16
A61P29/00
A61P43/00 105
A23L33/105
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022520836
(86)(22)【出願日】2021-10-06
(85)【翻訳文提出日】2022-04-04
(86)【国際出願番号】 KR2021013732
(87)【国際公開番号】W WO2022075756
(87)【国際公開日】2022-04-14
(31)【優先権主張番号】10-2020-0130028
(32)【優先日】2020-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520470084
【氏名又は名称】株式会社 キュロム・バイオサイエンス
【氏名又は名称原語表記】ＣＵＲＯＭＥ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100130111
【弁理士】
【氏名又は名称】新保 斉
(72)【発明者】
【氏名】ユン、ジュ ソク
(72)【発明者】
【氏名】ソ、ガン シク
(72)【発明者】
【氏名】ハン、ジョン ス
(72)【発明者】
【氏名】ムン、ソン ジェ
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジョン フン
(72)【発明者】
【氏名】ユン、ス ビン
【テーマコード（参考）】
4B018
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B018MD61
4B018ME07
4B018ME14
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA75
4C086ZB11
4C086ZB21
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ベータ－ラパコン（β－ｌａｐａｃｈｏｎｅ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とする胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項2】
前記胆汁うっ滞性肝疾患は、原発性胆汁性肝硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ Ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ，ＰＳＣ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｆａｍｉｌｉａｌ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ，ＰＦＩＣ）、良性再発性肝内胆汁うっ滞（Ｂｅｎｉｇｎ Ｒｅｃｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）、妊娠性肝内胆汁うっ滞（Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ，ＩＣＰ）、ウイルス性肝炎による胆汁うっ滞、アルコール性肝炎による胆汁うっ滞、薬物誘発性胆汁うっ滞、経静脈栄養療法（Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）時の胆汁うっ滞、悪性腫瘍性胆汁うっ滞、肝移植後胆汁うっ滞、感染性胆汁うっ滞及びアラージル症候群（Ａｌａｇｉｌｌｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＳ）からなる群から選ばれる１つ以上である請求項１に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項3】
前記組成物は、胆管細胞の線維化抑制及び炎症抑制をする請求項１に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項4】
前記組成物は、血中のＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ及びビリルビンからなる群から選ばれる１つ以上の血液指標の数値を改善する請求項１に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項5】
前記線維化抑制は、Ｃｏｌ１α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ １）、Ｃｏｌ４α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＶ Ａｌｐｈａ １）、α－ＳＭＡ（Ａｌｐｈａ－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）、フィブロネクチン、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １）、Ｃｏｌ１α２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２）及びＴＧＦ－β２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２）から選ばれる少なくとも１つの線維化因子を抑制する請求項３に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項6】
前記炎症抑制は、ＩＬ－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ｂｅｔａ）、ＩＬ－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６）、ＩＬ－１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１８）、ＩＮＦ－γ（（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、ＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、ＴＮＦ－β（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－β）、ＭＣＰ－１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ－１）から選ばれる少なくとも１つの炎症性サイトカイン因子を抑制する請求項３に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項7】
前記胆汁うっ滞性肝疾患は、炎症性腸疾患を伴う請求項１に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項8】
前記炎症性腸疾患は、クローン病又は潰瘍性大腸炎である請求項７に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項9】
前記組成物は、腸組織の線維化抑制及び炎症性サイトカイン抑制をする請求項７に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項10】
ベータ－ラパコン（β－ｌａｐａｃｈｏｎｅ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とする胆汁うっ滞性肝疾患予防又は改善用健康機能食品。
【請求項11】
前記胆汁うっ滞性肝疾患は、炎症性腸疾患を伴う請求項１０に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は改善用健康機能食品。
【請求項12】
前記炎症性腸疾患は、クローン病又は潰瘍性大腸炎である請求項１１に記載の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は改善用健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ベータ－ラパコン（β－ｌａｐａｃｈｏｎｅ）を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
胆汁うっ滞性肝疾患（Ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ）は、胆汁の形成又は流れの障害に起因する肝疾患である。胆汁うっ滞とは、肝で作られて胆道と腸を通じて循環する胆汁の循環障害による生化学的、生理的、臨床的変化を総称するものである。
【0003】
胆汁うっ滞性肝疾患の代表症状である原発性胆汁性肝硬変症又は原発性胆汁うっ滞性肝硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，ＰＢＣ）は、疾患初期に発病した小葉内管（ｉｎｔｒａｌｏｂｕｌａｒ ｄｕｃｔ）と共に肝の小胆管の遅い進行性破壊を特徴とする、肝の自己免疫疾患である。このような管が損傷すると、胆汁は肝に蓄積され（胆汁うっ滞症）、時間が経つにつれて組織を損傷させ、これは、傷痕、線維症及び肝硬変を変を引き起こすことがある。
【0004】
胆汁は、体内の老廃物を排泄する機能の他にも、胆汁酸（塩）を腸に伝達して脂肪とビタミンの吸収を助ける重要な役割を担い、肝細胞で作られて微細胆管（ｂｉｌｅ ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ）を通じて胆道に分泌され、続いて、十二指腸を経て腸肝（ｅｎｔｅｒｏｈｅｐａｔｉｃ）循環をする。このような胆汁分泌過程に障害が起きると胆汁うっ滞が発生し、胆汁酸、ビリルビンなどのような胆汁成分が肝細胞及び血液内に溜まるか、腸に伝達されるべき胆汁が減少しながら、黄疸、掻痒症、灰色便、脂肪性下痢（ｓｔｅａｔｏｒｒｈｅａ）、ビタミン吸収障害が現れ、悪化すると、肝不全につながることがあり、肝移植が必要な場合もある。
【0005】
原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ Ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ；以下、ＰＳＣ）は、一般に、胆汁が胆嚢から排出されるようにする胆管の炎症と線維化が特徴であり、肝及び胆嚢の長期進行性疾患（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）である。ＰＳＣの症状は初期に現れないこともあり、皮膚と目の黄変、かゆみ症及び腹痛のような肝疾患の徴候及び症状を経験することもある。
【0006】
ＰＳＣで発生する胆管損傷は、胆道系（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒｅｅ）の管を狭め、腸への胆汁の流れを妨害することによって、結局、肝硬変及び肝不全につながることがある。ＰＳＣは、肝癌、胆嚢癌、結腸直膓癌、胆管癌などの様々な癌発生の危険を増加させる。ＰＳＣの根本原因は知られていないが、遺伝的感受性、免疫系機能障害及び腸内細菌叢の異常構成が重要な働きをすることがある。これは、ＰＳＣ患者が高い割合で炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ；以下、ＩＢＤ）、最も高い割合で潰瘍性大腸炎を患っているという点でＩＢＤ患者と最も連関性が高い。ＩＢＤ患者の約３～７．５％がＰＳＣを患っており、ＰＳＣ患者の８０％はいずれかの形態のＩＢＤを患っている。
【0007】
一般に、３０代又は４０代の若い人々に主に発生するものと知られているＰＳＣは、現在まで効果的な治療法はなく、最も確実な治療法は肝移植であるが、移植後にも再発する恐れがある。米国食品医薬局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ）によってＰＳＣを標的とする承認された治療剤はまだない。一部の専門家たちは、ＰＳＣ患者において増加した肝酵素数値を下げ、他の胆汁うっ滞性肝疾患において効果の立証されたＵＤＣＡ（Ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）を推奨している。しかしながら、ＵＤＣＡによるＰＳＣ症状好転及び患者生存率を向上させる効果はまだ明確にされていない。米国肝疾患研究協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）及び米国胃腸病学大学（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）の指針は、ＰＳＣの治療のためにＵＤＣＡ使用を勧告しないが、ヨーロッパ肝研究協会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ）は、中間容量（１３～１５ｍｇ／ｋｇ）のＵＤＣＡ使用を推奨している。したがって、現在までは肝移植（Ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）がＰＳＣの立証された唯一の治療法であるが、全ての患者が肝移植を受けることができるわけではないので、ＰＳＣに効果的な治療剤の開発が至急な実情である。
【0008】
ＰＳＣ患者の８０％が持っているＩＢＤは、潰瘍性大腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ；以下、ＵＣ）とクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ；以下、ＣＤ）に代表される、原因の分からない胃腸管の慢性再発性炎症疾患である。疾病が進行しがら悪化と好転の状態が反復され、結局には狭窄や穿孔のような深刻な合併症が発生する。過去は、西欧に比べてアジア国家の発病率が相対的に低いと報告されたが、ＩＢＤの有病率は世界的に増加の趨勢であり、西欧に比べてアジア国家での増加率がより高い。ＩＢＤは他の慢性疾患と違い若い年齢層における発病危険が高い点から、社会的及び経済的な観点で非常に慎重に管理される必要がある。
【0009】
一方、ベータ－ラパコン（β－Ｌａｐａｃｈｏｎｅ；以下、ＢＬ）は、キノン系化合物であり、ラパチョ（Ｌａｐａｃｈｏ）の木から得、医療の目的に長く用いられてきた。ＢＬは、細胞内のＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）酵素によってＮＡＤＨから２個の電子を受けてＮＡＤ＋への転換を促進することが、試験管内（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ）及び生体内（Ｉｎ－ｖｉｖｏ）の両方から確認され、特に、ＮＱＯ１－欠損（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）細胞研究から検証された。しかしながら、現在までＢＬをＮＡＤ＋
－促進剤として胆汁うっ滞性肝疾患に適用する研究はなされていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は、ベータ－ラパコン（β－Ｌａｐａｃｈｏｎｅ）を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物を提供することにある。
【0011】
本発明の他の目的は、ベータ－ラパコン（β－Ｌａｐａｃｈｏｎｅ）を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患及び炎症性腸疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、ベータ－ラパコン（β－Ｌａｐａｃｈｏｎｅ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0013】
また、本発明は、下記化学式１で表示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0014】
【化1】
【0015】
前記胆汁うっ滞性肝疾患は、原発性胆汁性肝硬変症（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｆａｍｉｌｉａｌ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ，ＰＦＩＣ）、良性再発性肝内胆汁うっ滞（Ｂｅｎｉｇｎ Ｒｅｃｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）、妊娠性肝内胆汁うっ滞（Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ，ＩＣＰ）、ウイルス性肝炎による胆汁うっ滞、アルコール性肝炎による胆汁うっ滞、薬物誘発性胆汁うっ滞、経静脈栄養療法（Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）時の胆汁うっ滞、悪性腫瘍性胆汁うっ滞、肝移植後胆汁うっ滞、感染性胆汁うっ滞及びアラージル症候群（Ａｌａｇｉｌｌｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＳ）からなる群から選ばれる１つ以上でよく、より好ましくは、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、原発性胆汁性肝硬変症（ＰＢＣ）又は進行性家族性肝内胆汁うっ滞（Ｂｅｎｉｇｎ Ｒｅｃｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）、アラージル症候群の予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0016】
前記ベータ－ラパコン（ＢＬ）は、薬学的に許容可能な塩の形態で使用されてよく、塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩、塩基を使用した薬学的に許容可能な金属塩を使用してもよいが、これに制限されるものではない。例えば、遊離酸としては、無機酸と有機酸を使用することができる。無機酸としては、塩酸、ブローム酸、硫酸、リン酸などを使用することができ、有機酸としてはクエン酸、酢酸、乳酸、マレイン酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、コハク酸、４－トルエンスルホン酸、グルタミン酸、又はアスパラギン酸などを使用することができる。
【0017】
本発明の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物は、特に、胆管細胞の線維化及び炎症性サイトカインを抑制することを特徴とする。
【0018】
また、前記組成物は、血中のＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ及びビリルビンからなる群から選ばれる１つ以上の数値を改善することを特徴とする。
【0019】
本発明の胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物は、線維化抑制及び炎症抑制を特徴とし、前記線維化抑制は、Ｃｏｌ１α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ １）、Ｃｏｌ４α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＶ Ａｌｐｈａ １）、α－ＳＭＡ（Ａｌｐｈａ－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）、フィブロネクチン、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １）、Ｃｏｌ１α２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２）及びＴＧＦ－β２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２）から選ばれる少なくとも１つの線維化因子を抑制することを特徴とする。
【0020】
前記炎症抑制は、ＩＬ－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ｂｅｔａ）、ＩＬ－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６）、ＩＬ－１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１８）、ＩＮＦ－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、ＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）、ＴＮＦ－β（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－β）、ＭＣＰ－１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ－１）から選ばれる少なくとも１つの炎症性サイトカイン因子を抑制することを特徴とする。
【0021】
また、前記胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を伴う胆汁うっ滞性肝疾患においてより優れた効果を有することを特徴とし、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であってよい。
【0022】
本発明の組成物は、ウルソデオキシコール酸（Ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＵＤＣＡ）又はオベチコール酸（Ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ；以下、ＯＣＡ）をさらに含む組成物が、それぞれの単独投与に比べて、胆汁うっ滞性肝疾患においてより優れた効果を有することを特徴とする。
【0023】
前記ベータ－ラパコンは、薬学組成物全重量に対して、好ましくは０．００１～５０重量％、より好ましくは０．００１～４０重量％、最も好ましくは０．００１～３０重量％で添加されてよい。
【0024】
前記薬学的組成物は、それぞれ、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、液剤、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用されてよい。前記薬学的組成物に含まれてよい担体、賦形剤及び希釈剤には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、甘味剤、酸味剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調合する。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明のベータ－ラパコンに少なくとも１つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調合する。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤には、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤、酸味剤などが含まれてよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてよい。坐剤の基剤には、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）－６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてよい。
【0025】
本発明の薬学的組成物の投与量は、治療する対象の年齢、性別、体重と、治療する特定疾患又は病理状態、疾患又は病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって異なるであろう。このような因子に基づく投与量の決定は、当業者のレベル内にあり、一般に、投与量は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。好ましい投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日～２００ｍｇ／ｋｇ／日であり、より好ましい投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／日～２００ｍｇ／ｋｇ／日である。投与は、１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【0026】
本発明の薬学的組成物は、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与されてよい。投与のあらゆる方式は予想され得るが、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜又は脳血管内注射及び皮膚塗布によって投与されてよい。本発明のベータ－ラパコンを含む薬学的組成物は、毒性及び副作用がほとんどないので、予防目的で長期間服用時にも安心して使用できる薬剤である。
【0027】
また、本発明は、ベータ－ラパコン（β－ｌａｐａｃｈｏｎｅ）を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は改善用健康機能食品を提供する。
【0028】
本発明は、ベータ－ラパコン（β－ｌａｐａｃｈｏｎｅ）を有効成分として含む、炎症性腸疾患を伴う胆汁うっ滞性肝疾患の予防又は症状改善用健康機能食品を提供する。前記炎症性腸疾患は、クローン病又は潰瘍性大腸炎であってよい。
【0029】
前記ベータ－ラパコン（β－ｌａｐａｃｈｏｎｅ）を有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は症状改善用健康機能食品は、ウルソデオキシコール酸（Ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＵＤＣＡ）又はオベチコール酸（Ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＯＣＡ）をさらに含むことができる。
【0030】
前記健康機能食品は、ベータ－ラパコン（ＢＬ）を含む組成物が食品全重量に対して、好ましくは０．００１～５０重量％、より好ましくは０．００１～３０重量％、最も好ましくは０．００１～１０重量％で添加されてよい。
【0031】
前記健康機能食品は、人体に有用な機能性を有する原料又は成分を使用して錠剤、カプセル剤、粉末、丸剤又は液剤などの形態で製造及び加工した食品をいう。ここで、機能性とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節するか、或いは生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の健康機能食品は、当業界に通常用いられる方法によって製造可能であり、前記製造時には、当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造することができる。
【発明の効果】
【0032】
本発明は、ベータ－ラパコンを有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物に関し、胆汁うっ滞性肝疾患の効果的な予防及び治療剤として用いることができる。
【0033】
また、ベータ－ラパコンを有効成分として含む胆汁うっ滞性肝疾患予防又は治療用薬学組成物は、線維化抑制及び炎症抑制の効果があることを確認したので、胆汁うっ滞性肝疾患の効果的な予防及び治療剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】ＤＤＣ－誘導胆汁うっ滞性肝疾患動物モデルにおいてベータ－ラパコン（ＢＬ）を適用又は非適用した後の肝門脈（ＰＶ）周辺組織を示す写真である。
【図2】ＤＤＣ－誘導胆汁うっ滞性肝疾患動物モデルの肝門脈周辺コラーゲン組織に及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）効果を示すものである。Ａ．シリウスレッド（Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ）及びマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色した肝門脈周辺組織の写真、Ｂ．シリウスレッド及びマッソントリクロームで染色した組織のイメージを定量化したグラフである。
【図3】ＤＤＣ－誘導胆汁うっ滞性肝疾患マウス（ｎ＝６）の線維化関連遺伝子発現に及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すものである。
【図4】ＤＤＣ－誘導胆汁うっ滞性肝疾患マウス（ｎ＝６）の血液指標（ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ビリルビン）に及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すものである。
【図5】ＤＤＣ－誘導胆汁うっ滞性肝疾患マウス（ｎ＝６）の線維化関連遺伝子発現に及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すものである。
【図6】ＤＤＣ－誘導胆汁うっ滞性肝疾患マウス（ｎ＝６）の炎症関連遺伝子発現に及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すものである。
【図7】ＤＤＣ－誘導胆汁うっ滞性肝疾患動物モデルにおいて血液指標（総ビリルビン，ＡＬＰ）に及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すものである。
【図8】Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ－誘導胆汁うっ滞性肝疾患動物モデルにおいて血液指標ＡＳＴ、ＡＬＴ及びＡＬＰに及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すものである。
【図9】ＤＳＳ－誘導炎症性腸疾患マウスで炎症性腸疾患マウスの生存率に及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すものである。
【図10】ＤＳＳ－誘導炎症性腸疾患マウス（ｎ＝１０）の体重変化（Ａ）及び大腸炎の臨床点数（ｃｏｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）（Ｂ）にベータ－ラパコンが及ぼす効果を示すグラフである。
【図11】ＤＳＳ－誘導炎症性腸疾患マウスの腸の長さの比較写真（Ａ）及びそれを示すグラフ（Ｂ）である。
【図12】ＤＳＳ－誘導炎症性腸疾患マウスの腸組織の炎症性サイトカインに及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すグラフである。
【図13】ＬＸ－２肝星状（Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ）細胞モデルにおいて線維化関連ｍＲＮＡ発現に及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すグラフである。
【図14】大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）株であるＲａｗ２６４．７細胞モデルにおいて炎症性サイトカインタンパク質ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α発現に及ぼすベータ－ラパコンの効果を示すグラフである。
【図15】末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）において炎症性サイトカインＩＬ－１β及びＩＬ－１８タンパク質の発現に及ぼすベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0035】
以下において、特に説明がない限り、ベータ－ラパコンは、ベータ－ラパコンその自体、その薬学的に許容可能な塩のいずれをも含む概念で使用するものとする。
【0036】
肝胆汁うっ滞の原因は、各種の薬物副作用、感染、腫瘍、胆管腫瘍、嚢胞、胆管結石、狭窄、胆管に対する物理的圧力など、非常に様々であり、原因による胆汁うっ滞性肝疾患として原発性胆汁性肝硬変症（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ Ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ，ＰＳＣ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｆａｍｉｌｉａｌ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ，ＰＦＩＣ）、良性再発性肝内胆汁うっ滞（Ｂｅｎｉｇｎ Ｒｅｃｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）、妊娠性肝内胆汁うっ滞（Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ，ＩＣＰ）、ウイルス性肝炎による胆汁うっ滞、アルコール性肝炎による胆汁うっ滞、薬物誘発性胆汁うっ滞、経静脈栄養療法（Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）時の胆汁うっ滞、悪性腫瘍性胆汁うっ滞、肝移植後胆汁うっ滞、感染性胆汁うっ滞及びアラージル症候群（Ａｌａｇｉｌｌｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＳ）が含まれる。
【0037】
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。ただし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、別の形態で具体化されてもよい。むしろ、ここで紹介される内容が徹底且つ完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。
【0038】
＜実施例１．胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルの構築＞
【0039】
ＤＤＣ（３，５－ｄｉｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－１，４－ｄｉｈｙｄｒｏｃｏｌｌｉｄｉｎｅ）は、ヘム（ｈｅｍｅ）を生成するためにプロトポルフィリン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）ＩＸにＦｅを挿入するフェロケラーゼ（ｆｅｒｒｏｃｈｅｌａｔａｓｅ）の活性を抑制することによって肝内プロトポルフィリンの蓄積を誘導し、胆汁を通じてのみ肝外に排出可能な疎水性プロトポルフィリンの特性による胆管内蓄積及び結晶化によって胆管内外に炎症及び線維化を誘発する。この機序によって肝組織内胆汁うっ滞及び炎症と線維化を誘導するので、ＤＤＣ食餌誘導動物モデルは最も多用される齧歯類胆汁うっ滞性肝疾患動物モデルの一つである。
【0040】
ＤＤＣで誘導された胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルは、８週齢（８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ）Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｓａｍｔａｋｏ，Ｋｏｒｅａ）を使用し、Ｅｌｉｓａ Ｐｏｓｅなどの方法によって準備した。簡略にいうと、０．１％（ｗ／ｗ）のＤＤＣが補充された標準齧歯類食餌を７又は１４日間与えて胆汁うっ滞性肝疾患を誘導した。１２時間の明暗周期を維持し、水は自由に摂取可能にした。標準齧歯類食餌は、中間小麦、小麦、とうもろこし及びとうもろこしグルテン粉、大豆油（タンパク質の１４％）を含めた。全ての動物関連手続は、韓国生命工学研究院（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ）、ＫＲＩＢＢ－ＡＥＣ－２０１６５）動物保護機関と使用委員会によって検討及び承認された。
【0041】
＜実施例２．胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルの病変に対するべータ－ラパコンの予防効果＞
【0042】
２．１ 胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルの組織学（ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）分析
【0043】
ＤＤＣの長期間供給は、管内ポルフィリンプラグ（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ｐｌｕｇ）を生成して胆道上皮を損傷させることによって管閉鎖を誘導する。胆管における胆汁の毒性蓄積は、胆管細胞の活性化と管反応増殖（ｄｕｃｔｕｌａｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）につながり、シリウスレッド染色とマッソントリクローム染色に陽性を示す。
【0044】
胆汁うっ滞性肝疾患動物モデルの組織染色は、Ｈ＆Ｅ染色（組織基本染色）、シリウスレッド染色（コラーゲン染色）及びマッソントリクローム染色（コラーゲン、細胞質、筋線維など）によって測定し、組織染色は、熟練した研究者によって測定された。
【0045】
１４日間マウスに０．１％ＤＤＣを含む飼料の食餌後に、肝門脈周辺の炎症、線維化、付着分子を組織染色し、その結果を図１に示した。
【0046】
ベータ－ラパコン（β－Ｌａｐａｃｈｏｎｅ，ＢＬ）の胆汁うっ滞性肝疾患に対する予防効果を確認するために、ＤＤＣ処理３日前に０ｍｇ／ｋｇ（ＤＤＣ－ｖｅｈｉｃｌｅ）、４０ｍｇ／ｋｇ（ＤＤＣ－ＢＬ４０）及び８０ｍｇ／ｋｇ（ＤＤＣ－ＢＬ８０）でマウスに飼料食餌（総１７日）し、３日からＤＤＣ（総１４日）と共に飼料食餌した。ＤＤＣ処理１４日後にマウスを犠牲させてマウスの肝門脈（ｐｏｒｔａｌ ｖｅｉｎ，ＰＶ）及び胆管（ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ）を含むように肝を摘出し、Ｈ＆Ｅで周辺の病変を確認して図１に示した。
【0047】
図１に見られるように、対照群としてＤＤＣ処理群（ＤＤＣ－ｖｅｈｉｃｌｅ）は、正常群（ＳＤ，ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｉｅｔ）に比べて、マウスの肝門脈（ｐｏｒｔａｌ ｖｅｉｎ，ＰＶ）及び胆管において病変（矢印で表示）を増加させている。また、ベータ－ラパコン（ＢＬ）を処理したＤＤＣ誘導胆汁うっ滞性肝疾患マウス（ＤＤＣ－ＢＬ４０、ＤＤＣ－ＢＬ８０）は、ビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を処理した対照群（ＤＤＣ－ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて、肝門脈（ｐｏｒｔａｌ ｖｅｉｎ，ＰＶ）及び胆管（ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ）周辺の病変（矢印で表示）が顕著に減少していることを確認した。また、４０ｍｇ／ｋｇ（ＢＬ４０）よりは８０ｍｇ／ｋｇ（ＢＬ８０）でベータ－ラパコン（ＢＬ）を処理した群において病変減少が顕著であることが見られ、ベータ－ラパコン（ＢＬ）が濃度依存的にＤＤＣ処理された肝門脈及び胆管の病変を減少させることを確認した。
【0048】
このような結果から、ベータ－ラパコン処理が胆汁うっ滞性肝疾患発生環境において肝門脈及び胆管病変の減少などの予防効果があることを確認した。
【0049】
２．２ 胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルにおけるコラーゲン量に対するベータ－ラパコンの効果
【0050】
前記実施例２．１で摘出した肝を、シリウスレッド、マッソントリクローム染色によって組織、細胞周辺の結合組織を確認し、図２Ａに示した。
【0051】
図２Ａに見られるように、シリウスレッド及びマッソントリクローム染色の結果、ＤＤＣによって結合組織の形成が増加し、このような線維化の進行をベータ－ラパコン処理によって抑制することを確認した。図２Ｂは、図２Ａの染色部分をデジタルイメージで定量化したものである。
【0052】
前記結果から、ベータ－ラパコンの処理が、胆汁うっ滞性肝疾患発生環境において結合組織の増加による線維化などを予防する効果があることが分かった。
【0053】
統計処理は、全実施例を通じて独立した実験（平均（ｍｅａｎｓ）±標準誤差（ＳＥＭ））から得た結果を、両側スチューデントのｔ検定（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）を用いて分析した。差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）は、ｐ＜０．０５において有意であると見なした。生存率（ｓｕｒｖｉｖａｌ）比較実験を行うとき、ログランク（ｌｏｇｒａｎｋ）（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）テストを用いてカプランマイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）生存分析、すなわち、累積限界推定法（ｐｒｏｄｕｃｔ－ｌｉｍｉｔ ｍｅｔｈｏｄ）によって結果をグラフ化して分析した（Ｐｒｉｓｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
【0054】
２．３ 胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルにおいてベータ－ラパコンの線維化関連遺伝子（ｍＲＮＡ）転写レベルに及ぼす影響の確認
【0055】
胆汁うっ滞性肝疾患マウスモデルは、ＤＤＣによって胆管が損傷しながら線維化が誘導され、これにより、線維化発達に重要な因子であるＣｏｌ１α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ １）、Ｃｏｌ４α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＶ Ａｌｐｈａ １）、α－ＳＭＡ（Ａｌｐｈａ－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）、フィブロネクチン、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １）、Ｃｏｌ１α２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２）及びＴＧＦ－β２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２）の転写レベル増加などを確認した。
【0056】
前記実施例２．１の胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルから得た肝組織において前記因子の発現を、実時間重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で次の手順によって行った。肝サンプルの総ＲＮＡをＴｒｉ－ＲＮＡ試薬（Ｆａｖｒｏｇｅｎ ＢＩＯＴＥＣＨＣＯＲＰ，Ｎｏｎｇ－Ｋｅ Ｒｄ，Ｔａｉｗａｎ）を用いてＦａｖｒｏｇｅｎから提示した手順にに従って抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ，Ｓｅｏｕｌ，０８５０６，Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡで逆転写した。定量的ＰＣＲは、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標） ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）、ＲＯＸ ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ，Ｓｅｏｕｌ，０８５０６，Ｋｏｒｅａ）及びＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。使用したプライマー配列は、下表１の通りである。
【0057】
【表1】
【0058】
ベータ－ラパコンを同時に処理したＤＤＣ誘導胆汁うっ滞性肝疾患マウスは、胆汁うっ滞性肝疾患の進行に関連した線維化関連遺伝子Ｃｏｌ１α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ １）、Ｃｏｌ４α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＶ Ａｌｐｈａ １）、α－ＳＭＡ（Ａｌｐｈａ－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）、フィブロネクチン、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １）及びＴＧＦ－β２（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ２）の転写レベルを確認し、ビークルを処理したマウスを対照群として発現量を比較し、図３に示した。図３Ａ～図３Ｆに見られるように、前記肝門脈病変及び線維化の減少結果と一致するように、ビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を処理したＤＤＣ誘導胆汁うっ滞性肝疾患対照群マウス（ＤＤＣ－ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて、ベータ－ラパコン（ＢＬ）を処理したＤＤＣ誘導胆汁うっ滞性肝疾患マウス（ＤＤＣ－ＢＬ４０、ＤＤＣ－ＢＬ８０）においてＣｏｌ１α１、Ｃｏｌ４α１、α－ＳＭＡ、フィブロネクチン及びＴＧＦ－β１の転写レベルが有意に減少することを確認した。ＤＤＣ誘導胆汁うっ滞性肝疾患マウスにおけるこのような結果は、前記肝門脈病変及び線維化の減少が、線維化関連遺伝子発現レベルでなされ、胆汁うっ滞性肝疾患が誘発されている間に起きる病理学的変化は、ベータ－ラパコン（ＢＬ）前処理によって抑制されていることが見られる。
【0059】
＜実施例３．胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルにおいてベータ－ラパコンの影響確認＞
【0060】
ベータ－ラパコン（ＢＬ）の胆汁うっ滞性肝疾患発病過程に及ぼす影響を確認するために、１％ＤＤＣとベータ－ラパコンをマウスに同時投与し、動物モデルの特性を確認した。
【0061】
３．１ 血液指標（ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ビリルビン）に及ぼす影響確認
【0062】
８週齢（８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ）Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｓａｍｔａｋｏ，Ｋｏｒｅａ）を各群に分け（＝６）、正常群（ｖｅｈｉｃｌｅ）、対照群（ＤＤＣ）、ＤＤＣ＋ベータ－ラパコン２０ｍｇ／ｋｇ、ＤＤＣ＋ベータ－ラパコン４０ｍｇ／ｋｇ、ＤＤＣ＋ベータ－ラパコン８０ｍｇ／ｋｇ、ＤＤＣ＋ベータ－ラパコン１００ｍｇ／ｋｇ、及び陽性対照群ＤＤＣ＋ウルソデオキシコール酸１００ｍｇ／ｋｇ、及びＤＤＣ＋オベチコール酸３０ｍｇ／ｋｇでマウスに飼料食餌（総７日）した。処理７日後にマウスを犠牲させて心臓から採血し、血液指標であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＳＴ）、アルカラインホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）、ビリルビン（ｂｉｌｌｉｒｕｂｉｎ）数値を分析し、それを図４に示した。
【0063】
図４に見られるように、ＤＤＣ処理は、血中のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ビリルビン数値を大きく増加させ、ベータ－ラパコン（ＢＬ）は、ＤＤＣ処理によって増加するＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ビリルビンのそれぞれを濃度依存的に抑制させており、比較物質であるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）及びオベチコール酸（ＯＣＡ）と比較して優れた効果を示している。
【0064】
３．２ 線維化関連遺伝子転写レベルに及ぼす影響確認
【0065】
前記実施例３．１の胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルを犠牲させて肝組織を摘出した後、前記実施例２．３の方法と類似の方法で線維化関連遺伝子ｍＲＮＡレベルを測定した。
【0066】
胆汁うっ滞性肝疾患マウスモデルは、ＤＤＣによって胆管が損傷しながら線維化が誘導され、これにより、線維化発達に重要な因子であるＣｏｌ１α１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ １）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １）及びＣｏｌ１α２（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２）の転写レベルを確認し、その結果を図５に示した。
【0067】
図５に見られるように、ＤＤＣは、線維化に関連した遺伝子Ｃｏｌ１α１、ＴＧＦ－β１及びＣｏｌ１α２の転写レベルを大きく増加させており、ベータ－ラパコン（ＢＬ）は、Ｃｏｌ１α１、ＴＧＦ－β１及びＣｏｌ１α２のそれぞれの転写レベルを濃度依存的に抑制している。
【0068】
３．３ 炎症関連遺伝子転写レベルに及ぼす影響確認
【0069】
胆汁うっ滞性肝疾患は、門脈内の炎症と肝内胆管損傷が慢性に進行して胆汁うっ滞と肝線維化を発生させる。前記実施例３．１と同じ方法で得た胆汁うっ滞性肝疾患マウス動物モデルの肝組織の炎症性サイトカイン遺伝子ｍＲＮＡレベルを測定し、図６に示した。遺伝子発現分析のために使用したプライマー配列は、下表２の通りである。
【0070】
【表2】
【0071】
図６に見られるように、ＤＤＣは、炎症関連遺伝子であるＴＮＦα及びＩＬ－１βの転写レベルを大きく増加させており、ベータ－ラパコン（ＢＬ）は、ＴＮＦα及びＩＬ－１βのそれぞれの転写レベルを抑制している。
【0072】
＜実施例４．胆汁うっ滞性肝疾患誘導されたマウス動物モデルにおいてベータ－ラパコンの治療効果確認＞
【0073】
胆汁うっ滞性肝疾患誘導されたマウス動物モデルにおいてベータ－ラパコンの治療効果を確認した。８週齢（８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ）Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｓａｍｔａｋｏ，Ｋｏｒｅａ）を各群に分け（＝６）、対照群以外の各群に０．１％のＤＤＣを含む飼料食餌を３日間行った。その後、４日間に正常群、ＤＤＣ対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＤＤＣ＋ベータ－ラパコン２０ｍｇ／ｋｇ、ＤＤＣ＋ベータ－ラパコン４０ｍｇ／ｋｇ、ＤＤＣ＋ベータ－ラパコン８０ｍｇ／ｋｇ及び陽性対照群ＤＤＣ＋オベチコール酸３０ｍｇ／ｋｇでマウスに飼料食餌（総７日）した。７日食餌後にマウスを犠牲させて心臓から採血し、血液指標であるビリルビン及びＡＬＰ数値を分析し、それを図７に示した。
【0074】
図７に見られるように、ＤＤＣ処理は、血中ビリルビン及びＡＬＰ数値を大きく増加させており、ベータ－ラパコンは、ＤＤＣ処理によって増加したビリルビン及びＡＬＰのそれぞれを濃度依存的に抑制させている。また、比較物質であるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）及びオベチコール酸（ＯＣＡ）と比較して優れた効果を示している。
【0075】
＜実施例５．原発性胆汁性肝疾患（ＰＢＣ）誘導マウス動物モデルにおいてべータ－ラパコンの治療効果確認＞
【0076】
胆汁うっ滞性肝疾患のうち、原発性胆汁性肝硬変症（ＰＢＣ）は、ウイルスＲＮＡ模倣体及びＴｏｌｌ様受容体であるポリイノシン－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ－ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ，Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）を用いて類似状態に誘導することができる。
【0077】
８週齢（８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ）Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｓａｍｔａｋｏ，Ｋｏｒｅａ）を各群に分け（＝６）、正常群以外の各実験群にＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを５ｍｇ／ｋｇで１週間に２回ずつ８週間腹腔に投与した。その後、対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）、ベータ－ラパコン４０ｍｇ／ｋｇ、ベータ－ラパコン８０ｍｇ／ｋｇ及び陽性対照群ウルソデオキシコール酸１００ｍｇ／ｋｇ及びオベチコール酸３０ｍｇ／ｋｇでマウスに８週間飼料食餌した。処理実験１６週目に実験を終了し、マウスを犠牲させて心臓から採血し、血液指標であるＡＳＴ、ＡＬＴ及びＡＬＰ数値を分析し、それを図８に示した。
【0078】
図８に見られるように、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによって血中のＡＳＴ、ＡＬＴ及びＡＬＰ数値が増加しており、ベータ－ラパコン（ＢＬ）は、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによって増加したＡＳＴ、ＡＬＴ及びＡＬＰのそれぞれを抑制させている。対照群のうち、ＵＤＣＡは、ＤＤＣによって増加したＡＳＴ、ＡＬＴ及びＡＬＰを抑制させているが、ベータ－ラパコン（ＢＬ）は、比較物質であるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）及びオベチコール酸（ＯＣＡ）と比較して優れた効果を示している。
【0079】
＜実施例６．炎症性腸疾患誘導マウス動物モデルにおいてべータ－ラパコンの効果確認＞
【0080】
胆汁うっ滞性肝疾患患者の約８０％が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を患っているので、本発明者らは炎症性腸疾患マウス動物モデルにおいてベータ－ラパコン（ＢＬ）の効果を確認した。
【0081】
６．１ 生存率、体重、大腸炎の臨床点数（ｃｏｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）に及ぼす効果
【0082】
ＤＳＳ（ｄｅｘｔｒａｎ ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）で誘導された急性大腸炎マウスモデルは、８週齢（８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ）Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｓａｍｔａｋｏ，Ｋｏｒｅａ）を用いて構築した。
【0083】
８週齢（８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ）Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｓａｍｔａｋｏ，Ｋｏｒｅａ）を各群に分け（＝１０）、各実験群に、３％（ｗ／ｗ）のＤＳＳが飲水に補充された標準齧歯類食餌を初期５日間に給餌して急性大腸炎を誘導しながら、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ベータ－ラパコン４０ｍｇ／ｋｇ及びベータ－ラパコン８０ｍｇ／ｋｇを経口で１４日間投与した。
【0084】
全ての動物関連手続は、ハンヤング大学校動物保護機関と使用委員会で検討し、承認された。時間による生存率は図９に示し、各実験群マウスの体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）変化率を測定して図１０Ａに示し、直腸（ｒｅｃｔｕｍ）当たりの糞便潜在出血（ｏｃｃｕｌｔ ｂｌｏｏｄ）、総出血損失と大便の濃度を毎日測定した。各実験群の大腸炎臨床点数（ｃｏｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）は、処理群について知っていない２名の熟練した研究者により、動物体重減少の度合、血便及び便の緩さなどを測定し、表３のように点数に変換してその和を計算し、図１０Ｂに示した。
【0085】
【表3】
【0086】
図９に見られるように、ＤＳＳによって誘導されたＩＢＤマウスは、実験１４日目に７０％が斃死しており、ベータ－ラパコン４０ｍｇ／ｋｇ実験群は５０％、そしてベータ－ラパコン８０ｍｇ／ｋｇ実験群は２０％のみが斃死している。そして、図１０Ａに見られるように、ＤＳＳによって誘導されたＩＢＤマウスは、体重が減少して実験開始８日目に基準７５％まで減少した。ベータ－ラパコン（ＢＬ）を処理した群では、ＤＳＳによる体重減少が抑制されており、特に、ベータ－ラパコン８０ｍｇ／ｋｇ実験群は、初期体重の９０％まで回復した。また、図１０Ｂに見られるように、ＤＳＳによって誘導されたＩＢＤマウスの大腸炎の臨床点数（ｃｏｌｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）は、ベータ－ラパコン（ＢＬ）の処理濃度に依存的に減少していることを確認した。
【0087】
６．２ 腸の長さの回復及び炎症抑制に及ぼす効果
【0088】
前記実施例６．１と同じ方法によって実験群をＤＳＳダイコン処理群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＤＳＳ処理群、ＤＳＳ＋ベータ－ラパコン８０ｍｇ／ｋｇ処理群に分けてそれぞれ処理した。実験終了後にマウスを犠牲させて腸を摘出し、ノギス（ｖｅｒｎｉｅｒ ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて正確な腸の長さを測定し、図１１Ａ及び図１１Ｂに示した。また、腸組織内の炎症性サイトカイン因子であるインターロイキン－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｂｅｔａ，ＩＬ－１β）、インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）、インターロイキン－１８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１８，ＩＬ－１８）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ＩＮＦ－γ）、腫瘍壊死因子－α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α，ＴＮＦ－α）、腫瘍壊死因子－β（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－β，ＴＮＦ－β）、及び単核球化学誘因物質タンパク質－１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ－１，ＭＣＰ－１）の遺伝子ｍＲＮＡレベルを、通常の実験手順によって実時間重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で分析し、図１２に示した。
【0089】
【0090】
炎症抑制は、炎症性サイトカイン抑制及び／又はサイトカイン遺伝子発現抑制を含むことができる。これと関連して、図１２に見られるように、ＤＳＳによってマウスの腸組織内炎症因子であるＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１８、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β及びＭＣＰ－１のｍＲＮＡレベルが大きく増加しており、ＤＳＳによって増加した前記各炎症性サイトカインはベータ－ラパコン（ＢＬ）処理によっていずれも有意に減少した。
【0091】
＜実施例７．細胞レベルにおいてべータ－ラパコンの抗線維化効果確認＞
【0092】
７．１ ＬＸ－２肝星状（Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ）細胞株モデルにおいてフィブロネクチン及びα－ＳＭＡ活性に対するベータ－ラパコンの効果
【0093】
胆汁うっ滞性肝疾患は、胆管の炎症及び線維化が肝硬変を誘発する点に着眼し、Ｔａｋａａｋｉ Ｈｉｇａｓｈｉら（２０１７）の方法を引用し、肝星状（Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ）ＬＸ－２細胞株モデルを用いて実験した。ＬＸ－２細胞株は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培地で継代培養した。ＬＸ－２細胞株を６ウェルプレートに１６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ密度で投入し、ＴＧＦ－β１１ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ－β１１ｎｇ／ｍｌ＋ベータ－ラパコン０．５μＭ又はＴＧＦ－β１１ｎｇ／ｍｌ＋ベータ－ラパコン１μＭを含有しているＤＭＥＭで２４時間培養した。その後、得られた細胞の線維化関連遺伝子フィブロネクチン及びα－ＳＭＡのタンパク質発現レベルをタンパク質免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏｔｂｌｏｔ）法で当業界に知られた通常の方法によって行った。
【0094】
図１３に見られるように、対照群であるＬＸ－２細胞株にＴＧＦ－β１を処理する場合に、対照群に比べて、線維化関連フィブロネクチン及びα平滑筋アクチン（α－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ，α－ＳＭＡ）のタンパク質発現レベルが増加したが、ベータ－ラパコンを投与した場合に、ＴＧＦ－β１によって増加したフィブロネクチン及びα－ＳＭＡは、ベータ－ラパコン濃度に依存的にそのレベルが減少した。
【0095】
７．２ 大食細胞（ｍａｒｃｒｏｐｈａｇｅ）株Ｒａｗ２６４．７細胞モデルにおいて炎症性サイトカインタンパク質発現に及ぼすベータ－ラパコンの効果
【0096】
大食細胞株であるＲａｗ２６４．７（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－７１、米国バージニア州マナサス）を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ培地で継代培養した。
【0097】
炎症誘導のために、ＲＡＷ２６４．７細胞を、２％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭに懸濁させた後、１２ウェルプレートに４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞数になるように接種した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。新しい培地に交換しながら、適正な濃度の該当の物質、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びベータ－ラパコンを０．２、０．５、１、２μＭとなるように処理して２４時間培養した後、ＡＴＰ（２．５ｍＭ）を処理して３０分さらに培養し、上清液を取った。Ｒａｗ２６４．７大食細胞のサイトカイン（ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α）放出は、それぞれのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の無細胞上清液－ＥＬＩＳＡセット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、メーカーの指針に従って定量し、図１４に示した。
【0098】
図１４に見られるように、Ｒａｗ２６４．７細胞株にＬＰＳ及びＡＴＰを処理する場合に、対照群に比べて、炎症性関連タンパク質であるＩＬ－１β及びＴＮＦ－αの発現が増加したが、ベータ－ラパコン（ＢＬ）を投与した場合に、ＬＰＳ及びＡＴＰによって増加したＩＬ－１β及びＴＮＦ－αタンパクが、ベータ－ラパコン濃度依存的にその発現量が減少することを確認した。
【0099】
７．３ 末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＭＢＣ）において炎症性サイトカイン１Ｌ－１β及びＩＬ－１８サイトカイン分泌に及ぼすベータ－ラパコンの効果
【0100】
胆汁うっ滞性肝疾患の発病機序に炎症性サイトカインが仲介する点に着眼し、Ｂｏｙｕｍら（１９６８）の方法を変形して末梢血液単核細胞モデルを利用した。健康な８週齢（８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ）Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（Ｓａｍｔａｋｏ，Ｋｏｒｅａ）から分離された末梢血液単核細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが含まれているＲＰＭＩ－１６４０培地で１次培養して保持させた。安定した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に、ＬＰＳを２００ｎｇ／ｍＬ、ＡＴＰ及びベータ－ラパコンを０、０．５、１、２μＭとなるように培地に処理し、４時間後にＩＬ－１β及びＩＬ－１８の発現レベルを確認し、その結果を図１５に示した。
【0101】
図１５に見られるように、末梢血液単核細胞にＬＰＳ及びＡＴＰを処理する場合に、対照群に比べて、炎症性関連タンパク質であるＩＬ－１β及びＩＬ－１８の発現レベルが増加したが、ベータ－ラパコン（ＢＬ）を投与した場合に、ＬＰＳ及びＡＴＰによって増加したＩＬ－１β及びＩＬ－１８のレベルがベータ－ラパコン（ＢＬ）濃度依存的にその発現量が減少することを確認した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】