特表 2023-503982 造血幹および前駆細胞を培養するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-01

(54)【発明の名称】造血幹および前駆細胞を培養するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0789 20100101AFI20230125BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230125BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20230125BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20230125BHJP

   C12N 5/0787 20100101ALI20230125BHJP

   C12M 3/00 20060101ALN20230125BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20230125BHJP

   C12N 5/074 20100101ALN20230125BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0789

C12N5/0783

C12N5/0786

C12N5/0781

C12N5/0787

C12M3/00 Z

C07K14/54

C12N5/074

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022530742

(86)(22)【出願日】2020-11-27

(85)【翻訳文提出日】2022-07-22

(86)【国際出願番号】 US2020062507

(87)【国際公開番号】W WO2021108769

(87)【国際公開日】2021-06-03

(31)【優先権主張番号】62/941,563

(32)【優先日】2019-11-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521502171

【氏名又は名称】デヴェラ セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】バイ， タオ

(72)【発明者】

【氏名】チャンドラセカラン， デビカ

(72)【発明者】

【氏名】プリーブ， メアリー

(72)【発明者】

【氏名】ディレーニー， コリーン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA21

4B029BB11

4B065AA90X

4B065BB19

4B065BB32

4B065BC46

4B065BD39

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA50

4H045CA40

4H045DA02

4H045EA20

(57)【要約】

本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の亜集団を維持しつつまたは増加させつつ造血幹および前駆細胞を培養するための組成物および方法を提供する。これらの方法および組成物によって、封入された造血幹および前駆細胞を培養するための生体適合性培養微小環境を提供するための３Ｄ双性イオンヒドロゲルが説明される。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、ＨＳＣのまたはＨＳＣおよびＭＰＰの亜集団を維持しつつ封入ＨＳＰＣを培養するための生体適合性培養微小環境を提供するために、アルギネート－ポリリシン３Ｄ双性イオンヒドロゲルを使用する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

排他的所有権または秘匿特権を請求する本発明の実施形態を以下の通り定義する。
造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を培養する方法であって、
造血幹細胞（ＨＳＣ；Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^＋）を含む少なくとも１つのＨＳＰＣ集団を用意するステップ；
前記ＨＳＰＣ集団をＣＤ３４^＋またはＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣについて富化して、Ｔ細胞および赤血球が枯渇した富化ＨＳＰＣ集団を調製するステップ；
前記富化ＨＳＰＣを、アルギネートとポリリシンとを含む双性イオンヒドロゲルに封入して、封入ＨＳＰＣを形成するステップ；および
前記ヒドロゲル封入ＨＳＰＣを、インターロイキン－３（ＩＬ－３）と、インターロイキン－６（ＩＬ－６）と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、Ｆｌｔ３－リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）と、幹細胞因子（ＳＣＦ）とを含む培養培地で、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団を産生するのに十分な時間、培養するステップ
を含み、
前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージおよび／または数が、前記富化ＨＳＰＣ中のＨＳＣのパーセンテージおよび／または数と同じであるかまたはそれより高い／多い、方法。

【請求項2】

造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を培養する方法であって、
造血幹細胞（ＨＳＣ；Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^＋）と、２％未満のＴ細胞と、２％未満の赤血球とを含む、少なくとも１つのＣＤ３４^＋またはＣＤ１３３^＋富化ＨＳＰＣ集団を用意するステップ；
前記富化ＨＳＰＣを、アルギネートとポリリシンとを含む双性イオンヒドロゲルに封入して、ヒドロゲル封入ＨＳＰＣを形成するステップ；および
前記ヒドロゲル封入ＨＳＰＣを、インターロイキン－３（ＩＬ－３）と、インターロイキン－６（ＩＬ－６）と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、Ｆｌｔ３－リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）と、幹細胞因子（ＳＣＦ）とを含む培養培地で、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団を産生するのに十分な時間、培養するステップ
を含み、
前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージおよび／または数が、前記富化ＨＳＰＣ中のＨＳＣのパーセンテージおよび／または数と同じであるかまたはそれより高い／多い、方法。

【請求項3】

前記拡大ＨＳＰＣ集団内の複能性前駆細胞（ＭＰＰ；Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^－）のパーセンテージが、前記富化ＨＳＰＣ中のＭＰＰのパーセンテージおよび／または数と同じであるかまたはそれより高い／多い、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

前記富化ＨＳＰＣ集団が、臍帯血、胎盤血、および／または体性幹細胞に由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記富化ＨＳＰＣ集団が、ＰＢＭＣの体性幹細胞（somatic stems cell）に由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記富化ＨＳＰＣ集団が、臍帯血および／または胎盤血に由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記富化ＨＳＰＣ集団が、互いにまたはレシピエントと免疫的に適合していない臍帯血および／または胎盤血の少なくとも２つの異なる供給源に由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記培養培地が、血清サプリメントも血清サプリメント代替品も含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記培養培地が、ウシ胎仔血清も、ヒト血清アルブミンも、ヒト血小板溶解物も含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記培養培地が、外来性のＩＬ－１５も、ＩＬ－７も、ＩＬ－２も、Ｇ－ＣＳＦも、ＧＭ－ＣＳＦも、ＬＩＦも、ＭＩＰ－１ａも含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記培養培地が、アリール炭化水素受容体アンタゴニストを含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記培養培地およびヒドロゲルが、フィブロネクチンおよび／またはその断片を含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記培養培地およびヒドロゲルが、外来性フィーダー細胞を含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記培養培地およびヒドロゲルが、Ｎｏｔｃｈリガンドを含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

Ｎｏｔｃｈリガンドがヒドロゲルに結合している、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記富化ＨＳＰＣが、体細胞にも、胚性幹細胞にも、人工多能性幹細胞にも由来しない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージが、前記富化ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージより少なくとも２倍高く、およびまたは前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの数が、前記富化ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの数の少なくとも１０倍である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記培養するステップの終了時の前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージが、前記培養するステップの開始時の前記封入ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージより少なくとも２倍高く、および／または前記培養するステップの終了時の前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの数が、前記培養するステップの開始時の前記封入ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの数の少なくとも１０倍である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記培養するステップの終了時の前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣおよび／もしくはＭＰＰのパーセンテージが、前記培養するステップの開始時の前記封入ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣおよび／もしくはＭＰＰＳのパーセンテージより少なくとも２倍高く、ならびに／または前記培養するステップの終了時の前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣおよび／もしくはＭＰＰの数が、前記培養するステップの開始時の前記封入ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣおよび／もしくはＭＰＰの数の少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍であるか、もしくはそれより多い、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記富化ＨＳＰＣ集団が、遺伝子改変されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記封入ＨＳＰＣ集団が、培養中に遺伝子改変される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団が、遺伝子の野生型バージョンを前記ＨＳＰＣの少なくとも一部のゲノムに導入するように遺伝子改変されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記封入ＨＳＰＣ集団が、約２～約２１日間培養される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記封入ＨＳＰＣ集団が、約７～約１５日間培養される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記富化ＨＳＰＣが、約２５％～約９５％、５０％～約９５％ＨＳＰＣまたは約７５％～約９５％ＨＳＰＣを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記拡大ＨＳＰＣ中の前記ＨＳＣの少なくとも一部が、静止状態である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ポリリシンが、ポリ－Ｌ－リシンである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団が、少なくとも約５％、少なくとも約１０％もしくは少なくとも約１５％ＨＳＣを含むか、または少なくとも約５％、少なくとも約１０％もしくは少なくとも約１５％ＨＳＣおよびＭＰＰを含み、あるいは前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内の前記ＨＳＣまたは前記ＨＳＣおよびＭＰＰが、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも４０倍拡大される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣを前記ヒドロゲルから放出するステップを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記拡大ＨＳＰＣを、ＨＰＣ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、ＣＤ２０^＋Ｂ細胞、ＣＤ１４^＋単球、および／またはＣＤ１５^＋好中球に分化させるステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

富化された造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）集団を含む組成物であって、
造血幹細胞（ＨＳＣ；Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^＋）と２％未満のＴ細胞と２％未満の赤血球とを含む少なくとも約２５％または少なくとも約５０％ＨＳＰＣであって、
アルギネートとポリリシンとを含む双性イオンヒドロゲルに封入されているＨＳＰＣ
を含む、組成物。

【請求項32】

インターロイキン－３（ＩＬ－３）と、インターロイキン－６（ＩＬ－６）と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、Ｆｌｔ３－リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）と、幹細胞因子（ＳＣＦ）とを含む培養培地をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記ＨＳＰＣが、臍帯血、胎盤血、および／または体性幹細胞に由来する、請求項３１および３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項34】

前記ＨＳＰＣが、ＰＢＭＣに由来する、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項35】

前記ＨＳＰＣが、臍帯血および／または胎盤血に由来する、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項36】

前記ＨＳＰＣが、互いにまたはレシピエントと免疫的に適合していない臍帯血および／または胎盤血の少なくとも２つの異なる供給源に由来する、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項37】

前記培養培地が、血清サプリメントも血清サプリメント代替品も含まない、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

前記培養培地が、ウシ胎仔血清も、ヒト血清アルブミンも、ヒト血小板溶解物も含まない、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

前記培養培地が、外来性のＩＬ－１５も、ＩＬ－７も、ＩＬ－２も、Ｇ－ＣＳＦも、ＧＭ－ＣＳＦも、ＬＩＦも、ＭＩＰ－１ａも含まない、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項40】

前記培養培地が、アリール炭化水素受容体アンタゴニストを含まない、請求項３２から３９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項41】

前記培養培地およびヒドロゲルが、フィブロネクチンおよび／またはその断片を含まない、請求項３２から４０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項42】

前記培養培地およびヒドロゲルが、外来性フィーダー細胞を含まない、請求項３２から４１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項43】

前記培養培地およびヒドロゲルが、Ｎｏｔｃｈリガンドを含まない、請求項３２から４２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項44】

Ｎｏｔｃｈリガンドがヒドロゲルに結合している、請求項３２から４２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項45】

前記ＨＳＰＣが、体細胞、胚性幹細胞、および／または人工多能性幹細胞に由来しない、請求項３１から４４のいずれかに記載の組成物。

【請求項46】

前記ＨＳＰＣが、遺伝子改変されている、請求項３１から４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項47】

前記ＨＳＰＣが、遺伝子の野生型バージョンを前記ＨＳＰＣの少なくとも一部のゲノムに導入するように遺伝子改変されている、請求項３１から４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項48】

前記ＨＳＰＣが、約５０％～約９５％ＨＳＰＣまたは約７５％～約９５％ＨＳＰＣを含む、請求項３１から４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項49】

前記ＨＳＰＣ中の前記ＨＳＣの少なくとも一部が、静止状態である、請求項３１から４８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項50】

前記ポリリシンが、ポリ－Ｌ－リシンである、請求項３１から４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

前記ＨＳＰＣが、少なくとも約５％、少なくとも約１０％もしくは少なくとも約１５％ＨＳＣを含むか、または少なくとも約５％、少なくとも約１０％もしくは少なくとも約１５％ＨＳＣおよびＭＰＰを含む、請求項３２から５０のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年１１月２７日に出願した米国特許仮出願第６２／９４１５６３号の利益を主張するものであり、前記仮出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

背景
造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、医学において、細胞療法のためにも、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージなどの他の治療用細胞型の生成のための先駆体としても、多くの使途がある。造血幹および前駆細胞、特に、ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの臍帯血移植は、そのような細胞の用途である。最近、造血幹および前駆細胞の拡大集団の投与は、臍帯血移植の橋渡しをする手段として、および患者の移植前の前処置に関連する感染を低減させるための手段として、研究されている。

【0003】

ＨＳＰＣは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージなどの、造血系統の中の他の細胞型の供給源でもある。これらの細胞型を調製するために、ＨＳＰＣは、それらを拡大させ、所望の細胞型へと分化させるために、典型的にはｅｘ ｖｉｖｏで培養される。ＨＳＰＣのｅｘ ｖｉｖｏ拡大は、典型的には培養プレート、フラスコ、バッグなど、またはバイオリアクターを使用して、静的または動的システムで行うことができる。そのようなシステムは、例えば、一般に懸濁物の単層を形成する組織培養プレートなどの、２次元システム（２Ｄ）で、またはＨＳＰＣがマトリックス上もしくは内で培養される３次元（３Ｄ）システムで、ＨＳＰＣを培養することを含み得る。

【0004】

２Ｄおよび３Ｄシステムは、ある特定の細胞型の生成に有効であり得るが、２Ｄおよび３Ｄシステムに伴う課題の１つは、ＨＳＰＣの中の亜集団である、造血幹細胞（ＨＳＣ）の維持である。ＨＳＣは、他の細胞型に分化する潜在性を保持するが、典型的には静止状態である。典型的には、２Ｄまたは３Ｄシステムでの培養中にＨＳＣのパーセンテージは経時的に低下する。ＨＳＣは、複能性前駆細胞（ＭＰＰ）へ、そしてさらに、造血前駆細胞（例えば、骨髄系もしくはリンパ系前駆体）またはより拘束細胞型（系統^＋）に、経時的に形質転換する傾向がある。しかるが故に、これらのシステムは、細胞培養下でＨＳＣのパーセンテージが維持または増加される、ＨＳＰＣの高度に富化された集団の培養および維持には適していない。それ故、ＨＳＣのパーセンテージが維持または増加される、ＨＳＰＣを培養するための組成物および方法が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

概要
本概要は、下記の詳細な説明にさらに記載される概念の選択を単純化された形で紹介するために提供される。本概要は、請求項記載の主題の重要な特徴を特定することを意図したものではなく、請求項記載の主題の範囲を決定する補助として使用されることを意図したものでもない。

【0006】

本開示は、ＨＳＣの亜集団を維持しつつまたは増加させつつ造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を培養するための組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、ＨＳＣのまたはＨＳＣおよびＭＰＰの亜集団を維持しつつ封入ＨＳＰＣを培養するための生体適合性培養微小環境を提供するために、アルギネート－ポリリシン３Ｄ双性イオンヒドロゲルを使用する。有利なことに、封入も、解重合／修復プロセスも、細胞生存率を有意に低下させなかった。さらに、高いＨＳＰＣ生存率をＨＳＰＣの封入および培養中に維持することができ、したがって、７５％より高い生存率が培養ステップ全体にわたって維持される。この結果は、本明細書に記載のアルギネート－ポリリシン３Ｄヒドロゲル内に封入されたＨＳＰＣを培養する方法を、ＨＳＰＣの培養および維持にならびにＨＳＰＣの細胞集団内のＨＳＣおよびＭＰＰの維持および／または拡大に使用することができることを示す。

【0007】

一部の実施形態では、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を培養するための方法であって、造血幹細胞（hematopoietic stems cell）（ＨＳＣ；Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^＋）を含む少なくとも１つのＨＳＰＣ集団を用意するステップ；ＨＳＰＣ集団をＣＤ３４^＋またはＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣについて富化して、Ｔ細胞および赤血球が枯渇した富化ＨＳＰＣ集団を調製するステップ；富化ＨＳＰＣを、アルギネートとポリリシンとを含むヒドロゲルに封入して、封入ＨＳＰＣを形成するステップ；および封入ＨＳＰＣを、インターロイキン－３（ＩＬ－３）と、インターロイキン－６（ＩＬ－６）と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、Ｆｌｔ３－リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）と、幹細胞因子（ＳＣＦ）とを含む培養培地で、拡大されたＨＳＰＣ集団を産生するのに十分な時間、培養するステップを含み、拡大されたＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージが、富化ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージと同じであるかまたはそれより高い、方法が提供される。

【0008】

一部の実施形態では、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を培養するための方法であって、造血幹細胞（ＨＳＣ；Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^＋）と、２％未満のＴ細胞と、２％未満の赤血球とを含む、少なくとも１つのＣＤ３４^＋またはＣＤ１３３^＋富化ＨＳＰＣ集団を用意するステップ；富化ＨＳＰＣを、アルギネートとポリリシンとを含む双性イオンヒドロゲルに封入して、封入ＨＳＰＣを形成するステップ；封入ＨＳＰＣを、インターロイキン－３（ＩＬ－３）と、インターロイキン－６（ＩＬ－６）と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、Ｆｌｔ３－リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）と、幹細胞因子（ＳＣＦ）とを含む培養培地で、拡大されたＨＳＰＣ集団を産生するのに十分な時間、培養するステップを含み、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージが、富化ＨＳＰＣ中のＨＳＣのパーセンテージと同じであるかまたはそれより高い、方法が提供される。

【0009】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内の複能性前駆細胞（ＭＰＰ；Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^－）のパーセンテージは、富化ＨＳＰＣ中のＭＰＰのパーセンテージと同じであるか、またはそれより高い。

【0010】

一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣ集団は、臍帯血、胎盤血、または体性幹細胞に由来する。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣ集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の体性幹細胞に由来する。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣ集団は、臍帯血または胎盤血に由来する。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣ集団は、互いにまたはレシピエントと免疫的に適合していない臍帯血および／または胎盤血の少なくとも２つの異なる供給源に由来する。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、体細胞にも、胚性幹細胞にも、人工多能性幹細胞にも由来しない。

【0011】

一部の実施形態では、培養培地は、血清サプリメントも血清サプリメント代替品も含まない。一部の実施形態では、培養培地は、ウシ胎仔血清、ヒト血清アルブミン、および／またはヒト血小板溶解物を含まない。一部の実施形態では、培養培地は、外来性のインターロイキン１５（ＩＬ－１５）も、インターロイキン７（ＩＬ－７）も、インターロイキン２（ＩＬ－２）も、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）も、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）も、白血病抑制因子（ＬＩＦ）も、マクロファージ炎症性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－１ａ）も含まない。一部の実施形態では、培養培地は、アリール炭化水素受容体アンタゴニストを含まない。一部の実施形態では、培養培地およびヒドロゲルは、フィブロネクチンおよび／またはその断片を含まない。一部の実施形態では、培養培地およびヒドロゲルは、外来性フィーダー細胞を含まない。一部の実施形態では、培養培地およびヒドロゲルは、Ｎｏｔｃｈリガンドを含まない。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドがヒドロゲルに結合している。一部の実施形態では、ポリリシンは、ポリ－Ｌ－リシンである。

【0012】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージは、富化ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージより少なくとも２倍高い。一部の実施形態では、培養ステップの終了時のヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージは、培養ステップの開始時の封入ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージより少なくとも２倍高い。一部の実施形態では、培養ステップの終了時のヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣおよびＭＰＰのパーセンテージは、培養ステップの開始時の封入ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣおよびＭＰＰＳのパーセンテージより少なくとも２倍高い。

【0013】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの数は、封入された富化ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの数より少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍多いか、またはそれよりも多い。一部の実施形態では、培養ステップの終了時のヒドロゲル拡大集団内のＨＳＣの数は、培養ステップの開始時の封入ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの数より少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍多いか、またはそれよりも多い。一部の実施形態では、培養ステップの終了時のヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣおよびＭＰＰの数は、培養ステップの開始時の封入ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣおよびＭＰＰのパーセンテージより少なくとも１０倍多い。

【0014】

一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣ集団は、遺伝子改変されている。一部の実施形態では、封入ＨＳＰＣ集団は、培養中に遺伝子改変される。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、遺伝子の野生型バージョンをＨＳＰＣの少なくとも一部のゲノムに導入するように遺伝子改変されている。一部の実施形態では、封入ＨＳＰＣ集団は、約２～約２１日間培養される。一部の実施形態では、封入ＨＳＰＣ集団は、約７～約１５日間培養される。

【0015】

一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、約２５％～約９５％、５０％～約９５％ＨＳＰＣまたは約７５％～約９５％ＨＳＰＣを含む。一部の実施形態では、拡大ＨＳＣ（expanded HSC）中のＨＳＣの少なくとも一部は静止状態である。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％もしくは少なくとも約１５％ＨＳＣを含むか、または少なくとも約５％、少なくとも約１０％もしくは少なくとも約１５％ＨＳＣおよびＭＰＰを含む。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、ヒドロゲルから放出される。

【0016】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、造血前駆細胞（骨髄系もしくはリンパ系；ＨＰＣ）、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ２０^＋Ｂ細胞、ＣＤ１４^＋単球、ＣＤ１５^＋好中球、および／またはマクロファージに分化する。

【0017】

一部の実施形態では、富化された造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）集団の組成物であって、アルギネートとポリリシンとを含む双性イオンヒドロゲルに封入されている、造血幹細胞（ＨＳＣ；Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^＋）と２％未満のＴ細胞と２％未満の赤血球とを含む少なくとも約２５％または少なくとも約５０％ＨＳＰＣを含む、組成物が提供される。組成物は、インターロイキン－３（ＩＬ－３）と、インターロイキン－６（ＩＬ－６）と、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と、Ｆｌｔ３－リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）と、幹細胞因子（ＳＣＦ）とを含む培養培地をさらに含む。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、臍帯血、胎盤血または体性幹細胞に由来する。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、ＰＢＭＣの中の体性幹細胞からのものである。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、臍帯血または胎盤血に由来する。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、互いにまたはレシピエントと免疫的に適合していない臍帯血および／または胎盤血の少なくとも２つの異なる供給源に由来する。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、体細胞にも、胚性幹細胞にも、人工多能性幹細胞にも由来しない。

【0018】

一部の実施形態では、培養培地は、血清サプリメントも血清サプリメント代替品も含まない。一部の実施形態では、培養培地は、ウシ胎仔血清も、ヒト血清アルブミンも、ヒト血小板溶解物も含まない。一部の実施形態では、培養培地は、外来性のＩＬ－１５も、ＩＬ－７も、ＩＬ－２も、Ｇ－ＣＳＦも、ＧＭ－ＣＳＦも、ＬＩＦも、ＭＩＰ－１ａも含まない。一部の実施形態では、培養培地は、アリール炭化水素受容体アンタゴニストを含まない。一部の実施形態では、培養培地およびヒドロゲルは、フィブロネクチンおよび／またはその断片を含まない。一部の実施形態では、培養培地およびヒドロゲルは、外来性フィーダー細胞を含まない。一部の実施形態では、培養培地およびヒドロゲルは、Ｎｏｔｃｈリガンドを含まない。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドがヒドロゲルに結合している。

【0019】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、遺伝子改変されている。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、遺伝子の野生型バージョンをＨＳＰＣの少なくとも一部のゲノムに導入するように遺伝子改変されている。

【0020】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、約２５％～約９５％ＨＳＰＣ、約５０％～約９５％ＨＳＰＣまたは約７５％～約９５％ＨＳＰＣを含む。一部の実施形態では、ＨＳＰＣ中のＨＳＣの少なくとも一部は静止状態である。

【0021】

一部の実施形態では、ポリリシンは、ポリ－Ｌ－リシンである。

【0022】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％もしくは少なくとも約１５％ＨＳＣを含むか、または少なくとも約５％、少なくとも約１０％もしくは少なくとも約１５％ＨＳＣおよびＭＰＰを含む。

【0023】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、富化ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの数の少なくとも１０倍の数のＨＳＣを含む。

【0024】

本発明の上述の態様および付随する利点の多くは、下記の詳細な説明を参照し、その際、添付の図面と併せて考慮することによって、より良く理解されるようになるので、より容易に正しく評価されるようになる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、３Ｄ ＡＬＧ培養、静置フラスコおよびローラーボトルでの３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養、ならびに２Ｄ＋Ｎｏｔｃｈリガンド培養という、４つの異なる培養システムにおける１４日間のＴＮＣ（全有核細胞；黒色の棒）、ＣＤ３４^＋細胞（白色の棒）ならびにＨＳＣおよびＭＰＰ（Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋／－細胞；灰色の棒）の拡大を描示する。

【0026】

【図2】図２は、培養前（０日目（Ｄ０）および未培養）に収集した細胞試料、ならびに１４日間、２Ｄ＋Ｎｏｔｃｈ培養、３Ｄ ＡＬＧおよび３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ 静置フラスコおよび３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ ローラーボトルの形式で培養した、細胞試料中の細胞のコロニー形成効率を描示する。ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位－赤芽球コロニー；ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ：コロニー形成単位（顆粒球、単球）；ＣＦＵ－ＧＥＭＭ：コロニー形成単位（顆粒球、赤血球、単球、巨核球）。

【0027】

【図3】図３は、成人動員末梢血由来ＣＤ３４^＋細胞から、２つの異なる培養システム（静置フラスコ内での３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養、および２Ｄ＋Ｎｏｔｃｈリガンド）および２つの異なる培地処方（ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ （ＳＦＥＭＩＩ）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；およびＳｔｅｍＰｒｏ ＨＳＣ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１４日間拡大した、ＴＮＣ（全有核細胞；黒色の棒）、ＣＤ３４^＋細胞 （白色の棒）、およびＨＳＣ／ＭＰＰ（Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋／－細胞；灰色の棒）の拡大を描示する。

【0028】

【図4】図４は、成人動員末梢血由来ＣＤ３４^＋細胞から、ＳＦＥＭ ＩＩ培地またはＳｔｅｍＰｒｏ培地中での２Ｄ Ｎｏｔｃｈ培養で、およびＳＦＥＭ ＩＩ培地またはＳｔｅｍＰｒｏ培地中での３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養で１４日間拡大した、ＣＤ３４^＋細胞のコロニー形性効率を描示する。ＢＦＵ－Ｅ：バースト形成単位－赤芽球コロニー；ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ：コロニー形成単位（顆粒球、単球）；ＣＦＵ－ＧＥＭＭ：コロニー形成単位（顆粒球、赤血球、単球、巨核球）。

【発明を実施するための形態】

【0029】

詳細な説明
本開示は、拡大ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージを維持するまたは上昇させるようにＨＳＰＣ集団を培養するための組成物および方法を提供する。拡大ＨＳＰＣ集団は、一般に、赤血球、Ｔ細胞および他の非ＨＳＰＣ細胞を枯渇させたＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４^＋および／またはＣＤ１３３^＋細胞）を単離して富化ＨＳＰＣ（富化ＨＳＰＣ集団とも呼ばれる）を形成し、次いで、アルギネートとポリリシンとを含む双性イオンヒドロゲル中でＨＳＰＣを拡大させて、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ（拡大ＨＳＰＣ集団とも呼ばれる）を形成することによって、調製される。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、有意なパーセンテージのＨＳＣを含む。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、有意なパーセンテージのＨＳＣおよびＭＰＰを含む。（本明細書で使用される場合、複能性前駆体（ＭＰＰＳ）は、Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^－であり、ＨＳＣは、Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^＋である）。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、全ＨＳＰＣのパーセンテージとして、富化ＨＳＰＣ中のＨＳＣのパーセンテージと同じであるかまたはそれより高い、ＨＳＣの亜集団を含む。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、全ＨＳＰＣのパーセンテージとして、富化ＨＳＰＣ中のＨＳＣおよびＭＰＰのパーセンテージと同じであるかまたはそれより高い、ＨＳＣおよびＭＰＰの亜集団を含む。

【0030】

ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、臍帯血移植において、免疫療法において、遺伝子療法において、および／またはＨＳＰＣに由来する他の細胞型の調製において使用することができる。

【0031】

ＨＳＰＣは、単一の供給源（例えば、単一のヒトドナー）からのものであることもあり、または複数の供給源、例えば、少なくとも２名もしくは少なくとも４名の異なるドナーからのものであることもある。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、臍帯血および／または胎盤血からのものである。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、出生後のヒトからの体性幹細胞である。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、成人体性幹細胞からのものである。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣである。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、ＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣである。

【0032】

一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、約５０％から約９５％までのＨＳＰＣ、約５０％から約９０％までのＨＳＰＣ、約６０％から約９０％までのＨＳＰＣ、約７０％から約９５％までのＨＳＰＣ、約７０％から約９０％までのＨＳＰＣ、約８０％から約９０％までのＨＳＰＣ、または約８０％から約９５％までのＨＳＰＣを含む。

【0033】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、約７０％から約９５％までのＨＳＰＣ、約７５％から約９５％までのＨＳＰＣ、約８０％から約９５％までのＨＳＰＣ、約７０％から約９０％までのＨＳＰＣ、約７５％から約９０％までのＨＳＰＣ、または約８０％から約９０％までのＨＳＰＣを含む。

【0034】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣのパーセンテージは、培養ステップ中に上昇し、その結果、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、富化ＨＳＰＣと比較して高いパーセンテージのＨＳＣを含む。典型的には、ＨＳＣは、富化ＨＳＰＣ集団の５％未満を構成する。本明細書の一部の実施形態では、ＨＳＣのパーセンテージは、富化ＨＳＰＣ中のＨＳＣの元々のパーセンテージ（１００％；この場合、富化ＨＳＰＣ集団内の１００％ＨＳＣは、富化ＨＳＰＣ集団の５％にほぼ等しいまたはそれ未満の％を構成する）と比べて１．５倍（１５０％）、２倍（２００％）、２．５倍（２５０％）、またはそれより大きく上昇する。

【0035】

一部の実施形態では、封入された富化ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの数は、培養ステップ中に増加し、その結果、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、封入された富化ＨＳＰＣと比較して多い数のＨＳＣを含む。本明細書の一部の実施形態では、ＨＳＣの数は、封入された富化ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの元々の数と比べて少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、またはそれより大きく増加する。

【0036】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、富化ＨＳＰＣと比較して高い比率の静止細胞を含む。特定の実施形態では、静止細胞は、可逆的に細胞周期のＧ０期にある細胞である。すなわち、静止細胞は、Ｇ０期にあるが細胞周期に再び入ることができる細胞である。対照的に、細胞は、細胞周期のＧ０期に不可逆的に、例えば、老化または分化によって、入ることができる。本開示のヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、有意な割合の、老化したまたは分化したＨＳＰＣを含まない。

【0037】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、富化ＨＳＰＣと比較して高い比率の、休止、非周期状態（Ｇ０期）の細胞を含む。休止、非周期細胞は、例えば、細胞増殖に関連するタンパク質に特異的な抗体、例えば抗Ｋｉ－６７抗体などを用いて同定することができ、細胞が休止（非周期）細胞であるのか細胞分裂中であるのかを区別することができる染色剤、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２などを用いて同定することもできる。Ｋｉ－６７は、細胞増殖に関連する核タンパク質である。休止、非周期細胞（Ｇ０期）には、Ｋｉ－６７発現が殆どまたは全くない。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色剤は、非休止細胞（例えば、Ｇ２－Ｓ／Ｍ）の細胞の存在量がＧ０またはＧ１の細胞と比較して多い状態にある核酸に結合する。

【0038】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、富化ＨＳＰＣと比較して高い比率の、ＨＳＣ（Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^＋）である、休止、非周期状態（Ｇ０期）の細胞を含む。一部の実施形態では、ヒドロゲルで拡大された封入ＨＳＰＣ集団は、培養開始時の、富化され、封入されたＨＳＰＣと比較して高い比率の、ＨＳＣ（Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ９０^＋）である、休止、非周期状態（Ｇ０期）の細胞を含む。

【0039】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、２％未満のＣＤ３^＋細胞を含有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、１％未満のＣＤ３^＋細胞を含有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、２％未満のＣＤ１９^＋細胞を含有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、１％未満のＣＤ１９^＋細胞を含有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、２０％未満のＣＤ３４^－細胞を含有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、１５％未満のＣＤ３４_－細胞を含有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、１０％未満のＣＤ３４^－細胞を含有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、２０％未満のＣＤ１３３^－細胞を含有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、１５％未満のＣＤ１３３^－細胞を含有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団は、１０％未満のＣＤ１３３^－細胞を含有する。
ＨＳＰＣの調製および培養

【0040】

ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、富化ＨＳＰＣ（ＨＳＰＣの富化集団または富化ＨＳＰＣ集団とも呼ばれる）から培養された造血幹および前駆細胞を含む。ＨＳＰＣは、典型的に、１つまたは複数のヒト供給源に由来する。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣについて富化される。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、単一のヒト臍帯血源または胎盤血源からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、複数のヒト臍帯血源および／または胎盤血源からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣが、プールされる前に互いにまたはレシピエントとＨＬＡが適合していないため、単一のＨＬＡ型を含むこともあり、または複数のＨＬＡ型を含むこともある。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、単一のヒトＰＢＭＣ源からの体性幹細胞からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、複数のヒトＰＢＭＣ源からの体性幹細胞からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、Ｔ細胞が枯渇したものである。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞が枯渇したとは、２％未満のＣＤ３^＋細胞、または１％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．５％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．１％未満のＣＤ３^＋細胞を指す。

【0041】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、ＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣについて富化される。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、単一のヒト臍帯血源または胎盤血源からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、複数のヒト臍帯血源および／または胎盤血源からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣが、プールされる前に互いにまたはレシピエントとＨＬＡが適合していないため、単一のＨＬＡ型を含むこともあり、または複数のＨＬＡ型を含むこともある。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、単一のヒトＰＢＭＣ源からの体性幹細胞からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、複数のヒトＰＢＭＣ源からの体性幹細胞からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、Ｔ細胞が枯渇したものである。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞が枯渇したとは、２％未満のＣＤ３^＋細胞、または１％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．５％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．１％未満のＣＤ３^＋細胞を指す。

【0042】

一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣに由来するヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、典型的に、１つまたは複数のヒト供給源に由来する。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、拡大ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣである。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、単一のヒト臍帯血源または胎盤血源からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、結果として得られるヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、複数のヒト臍帯血源および／または胎盤血源からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣが、プールされる前に互いにまたはレシピエントとＨＬＡが適合していないため、単一のＨＬＡ型を含むこともあり、または複数のＨＬＡ型を含むこともある。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、単一の体性幹細胞源（例えば、ＰＢＭＣ）からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、複数のヒト体性幹細胞源（例えば、ＰＢＭＣ）からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、Ｔ細胞が枯渇したものである。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞が枯渇したとは、２％未満のＣＤ３^＋細胞、または１％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．５％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．１％未満のＣＤ３^＋細胞を指す。

【0043】

一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、拡大ＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣである。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、単一のヒト臍帯血源および／または胎盤血源からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、結果として得られるヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、複数のヒト臍帯血源および／または胎盤血源からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣが、プールされる前に互いにまたはレシピエントとＨＬＡが適合していないため、単一のＨＬＡ型を含むこともあり、または複数のＨＬＡ型を含むこともある。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、単一の体性幹細胞源（例えば、ＰＢＭＣ）からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、複数のヒト体性幹細胞源（例えば、ＰＢＭＣ）からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣは、Ｔ細胞が枯渇したものである。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞が枯渇したとは、２％未満のＣＤ３^＋細胞、または１％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．５％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．１％未満のＣＤ３^＋細胞を指す。
臍帯血および／または胎盤血に由来するＨＳＰＣ

【0044】

富化ＨＳＰＣは、典型的に、ＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞またはＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞であり、１つまたは複数のヒト供給源に由来する。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、単一のヒト臍帯血源または胎盤血源からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、複数のヒト臍帯血源および／または胎盤血源からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。富化ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣが、プールされる前に互いにまたはレシピエントとＨＬＡが適合していないため、単一のＨＬＡ型を含むこともあり、または複数のＨＬＡ型を含むこともある。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、単一のヒト臍帯血源または胎盤血源からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、複数のヒト臍帯血源および／または胎盤血源からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。富化ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣが、プールされる前に互いにまたはレシピエントとＨＬＡが適合していないため、単一のＨＬＡ型を含むこともあり、または複数のＨＬＡ型を含むこともある。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、Ｔ細胞が枯渇したものである。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞が枯渇したとは、２％未満のＣＤ３^＋細胞、または１％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．５％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．１％未満のＣＤ３^＋細胞を指す。

【0045】

一部の実施形態では、造血幹および前駆細胞は、臍帯血および／または胎盤血（ヒト臍帯血および／またはヒト胎盤血）に由来する。そのような血液は、当技術分野において公知の方法によって得ることができる。例えば、ヒトの分娩時の臍帯血および胎盤血の収集の論考については米国特許第５，００４，６８１号および同第７，１４７，６２６号ならびに米国特許出願公開第２０１３／００９５０７９号（両方ともそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。臍帯血および／またはヒト胎盤血の収集は、典型的に、無菌条件下で行われる。収集し次第、臍帯血または胎盤血は、抗凝固剤、例えば、ＣＰＤ（クエン酸－リン酸－デキストロース）、ＡＣＤ（酸性クエン酸－デキストロース）、アルセバー溶液（Alsever et al., N. Y. St. J. Med. 41:126, 1941）、Ｄｅ Ｇｏｗｉｎ溶液（De Gowin, et al., J. Am. Med. Ass. 114:850, 1940）、Ｅｄｇｌｕｇａｔｅ－Ｍｇ（Smith, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 38:573, 1959）、Ｒｏｕｓ－Ｔｕｒｎｅｒ溶液（Rous and Turner, J. Exp. Med. 23:219, 1916）、他のグルコース混合物、ヘパリン、ビスクマ酢酸エチルなどと、混合され得る。一般には、Hurn, 1968, Storage of Blood, Academic Press, New York, pp. 26-160を参照されたい。一実施形態では、ＡＣＤが使用され得る。

【0046】

臍帯血は、好ましくは、臍帯からの直接ドレナージにより、ならびに／または娩出された胎盤からのその根元でのおよび拡張した静脈での針穿刺吸引により、得ることができる。好ましくは、収集されるヒト臍帯血および／または胎盤血には、汚染（例えば、細菌またはウイルス）、特に、ウイルス汚染がない。

【0047】

臍帯血の収集の前に、母体の既往歴を判定して、臍帯血がもたらし得るリスク、例えば、遺伝的疾患または感染性疾患の伝染、例えば、がん、がん（例えば、白血病）、免疫障害、神経障害、肝炎またはＡＩＤＳを同定することができる。収集された臍帯血は、細胞生存率、ＨＬＡ型判定、ＡＢＯ／Ｒｈ型判定、ＣＤ３４^＋細胞計数、ＣＤ１３３^＋細胞計数、および／または全有核細胞計数のうちの１つまたは複数のための検査を受けたものであり得る。

【0048】

臍帯血および／または胎盤血は、分娩時にヒトドナーから収集された後、その血液が処理されて富化ＨＳＰＣが生成される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、好ましくはＣＤ３４^＋細胞または主にＣＤ３４^＋ＨＳＰＣである。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、好ましくはＣＤ１３３^＋細胞または主にＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣである。ＨＳＰＣは、典型的に、Ｔ細胞および赤血球が枯渇したものであり、その結果、富化ＨＳＰＣとなる。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞が枯渇したとは、約２％未満のＣＤ３^＋細胞、約１％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．５％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．１％未満のＣＤ３^＋細胞を指す。したがって、富化は、細胞集団内のＨＳＰＣのパーセンテージを（富化手順前の集団のパーセンテージと比べて）上昇させるプロセスを指す。精製、例えば、ＣＤ３４^＋選択またはＣＤ１３３^＋選択は、Ｔ細胞および赤血球の富化および枯渇の一例である。

【0049】

富化のための処理の前の、収集された臍帯血および／または胎盤血は、新鮮なものであることもあり、または事前に凍結保存されたものであることもある。細胞分離／選択のための当技術分野において公知の任意の適する技法を使用して、ＨＳＰＣの富化を実行することができる。細胞表面マーカーの差次的発現に依存する方法を使用することができる。例えば、ＣＤ３４を発現する細胞を、ＣＤ３４を発現しない細胞と分離するために、細胞表面マーカーＣＤ３４を発現する細胞を、ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体を使用して正に選択することができる。同様に、ＣＤ１３３を発現する細胞を、ＣＤ１３３を発現しない細胞と分離するために、細胞表面マーカーＣＤ１３３を発現する細胞を、ＣＤ１３３に対するモノクローナル抗体を使用して正に選択することができる。さらに、用いられる分離技法によって、好ましくは、選択される細胞の生存率が最大化される。用いられる特定の技法は、分離の効率、その方法の細胞傷害性、遂行の容易さおよび速度、ならびに精巧な装置および／または高度な技術的スキルの必要性に依存する。

【0050】

分離のための手順は、例えば、限定ではなく、抗体がコーティングされた磁気ビーズを使用する、磁気分離、親和性クロマトグラフィー、および固体マトリックス、例えばプレート、ビーズなど、に結合された抗体を用いる「パニング」、または他の便利な技法を含み得る。正確な分離／選択をもたらす技法は、様々な洗練度、例えば、複数のカラーチャネル、小角および鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどを有することができる、蛍光活性化細胞選別装置を含む。

【0051】

選択プロセスにおいて使用される細胞表面分子に対する抗体を、選ばれた選択プロセスに適応する多数の異なる材料とコンジュゲートすることができる。例えば、特定の細胞型の容易な分離を可能にするために、直接分離を可能にする磁気ビーズ；例えば固体支持体に結合された、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンに特異的な抗体を用いて除去することができる、ビオチン；例えば蛍光活性化細胞選別装置と共に使用することができる、蛍光色素；などに、抗体をコンジュゲートすることができる。残存細胞の生存率に対して過度に有害でない任意の細胞分離技法を用いることができる。

【0052】

好ましい実施形態では、新鮮な臍帯血ユニットまたは凍結され解凍された臍帯血ユニットは、酸化鉄および特異的モノクローナル抗体に結合されたデキストランで構成されているナノサイズの超常磁性粒子を用いる磁気細胞分離装置、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、磁気粒子に直接または間接的にコンジュゲートされた抗ＣＤ３４抗体を使用して、ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣについて富化するように処理される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒは、単回使用の使い捨てチューブセットが取り付けられた、閉鎖型無菌システムである。単一ユニットの収集された臍帯血および／または胎盤血をＣＤ３４^＋ＨＳＰＣについて富化するように処理するために使い捨てチューブセットを使用し、その後、廃棄することができる。

【0053】

好ましい実施形態では、新鮮な臍帯血ユニットまたは凍結され解凍された臍帯血ユニットは、酸化鉄および特異的モノクローナル抗体に結合されたデキストランで構成されているナノサイズの超常磁性粒子を用いる磁気細胞分離装置、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、磁気粒子に直接または間接的にコンジュゲートされた抗ＣＤ１３３抗体を使用して、ＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣについて富化するように処理される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒは、単回使用の使い捨てチューブセットが取り付けられた、閉鎖型無菌システムである。単一ユニットの収集された臍帯血および／または胎盤血をＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣについて富化するように処理するために使い捨てチューブセットを使用し、その後、廃棄することができる。

【0054】

ある実施形態では、単一の臍帯血および／または胎盤血ユニットが、富化ＨＳＰＣを調製するために使用される。他の実施形態では、２もしくはそれより多くのまたは４もしくはそれより多くの臍帯血および／または胎盤血ユニットを、ＨＳＰＣについて富化する前にプールすることができる。別の実施形態では、ＨＳＰＣの個々の集団をＨＳＰＣについて富化した後にプールすることができる。特定の実施形態では、プールされる臍帯血および／もしくは胎盤血ユニットまたはＨＳＰＣの集団の数は、２、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０であるか、または前述の数の少なくともいずれかである。一部の実施形態では、プールは、２～８、４～８、２～１０、４～１０、４～２０、または４～２５の、および２０または２５以下の、臍帯血および／もしくは胎盤血ユニット、またはＨＳＰＣ集団を含有する。プーリングは、典型的には、レシピエントへの投与の前に凍結および保管することができる細胞産物中のＨＳＰＣの数を増加させるために行われる。

【0055】

臍帯血または造血幹もしくは幹および前駆細胞集団を、ＨＳＰＣのＨＬＡ型に関してまたはそれと関係なくプールすることができる。一部の実施形態では、プール内の細胞は、人種にも民族性にも関係なく組み合わせられる。一部の実施形態では、プール内の細胞は、同じ人種、例えば、アフリカ系アメリカ人、白人、アジア人、ヒスパニック系、ネイティブアメリカン、オーストラリア先住民系、イヌイット族、太平洋諸島の住民、の個体の臍帯血および／もしくは胎盤血に由来し、または同じ民族性、例えば、アイルランド人、イタリア人、インド人、日本人、中国人、ロシア人など、の個体の臍帯血および／もしくは胎盤血に由来する。

【0056】

典型的には、ＨＳＰＣについて富化する前に、臍帯血または胎盤血の赤血球および白血球が分離される。一部の実施形態では、赤血球の枯渇は、赤血球の白血球からの分離を指す。赤血球と白血球の分離を行ってしまえば、赤血球画分を廃棄し、白血球画分を、例えば、上で説明したような磁気細胞分離装置で処理してＣＤ３４^＋ＨＳＰＣまたはＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣについて富化することができる。白血球画分と赤血球画分の分離は、例えば、限定ではなく、アフェレーシス、遠心分離技法などを含む、当技術分野において公知の任意方法によって、行うことができる。使用することができる他の分離方法としては、市販の製品ＦＩＣＯＬＬ（商標）またはＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥ（商標）またはＰＥＲＣＯＬＬ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）の使用が挙げられる。ＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥ（商標）は、通常はコニカルチューブの底に配置され、上に全血が積層される。遠心分離された後、コニカルチューブの中に、上から下へ次の層が見えることになる：血漿および他の構成要素、単核細胞（白血球）を含有するバフィーコートと呼ばれる単核細胞の層、ＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥ（商標）、そしてペレット形態で存在するはずである赤血球および顆粒球。この分離技法は、単核細胞の容易な採取を可能にする。別の方法としては、赤血球の除去のためのヘタスターチ（ヒドロキシ－エチルデンプン）媒介沈降が挙げられ、これは、臍帯血に使用することができ、骨髄（ＢＭ）源に使用することもできる。

【0057】

必要に応じて、ＣＤ３４^＋またはＣＤ１３３^＋細胞選択の前に、臍帯血または胎盤ユニットのアリコートを、全有核細胞計数値および／またはＣＤ３４^＋もしくはＣＤ１３３^＋細胞含有量についてチェックすることができる。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞選択の後、ＣＤ３４^＋細胞画分とＣＤ３４^－細胞画分の両方が回収される。必要に応じて、最初のＨＬＡ型判別および将来のキメリズム研究のために、未処理血液製剤またはＣＤ３４^－細胞画分の試料からＤＮＡを抽出することができる。同様に、特定の実施形態では、ＣＤ１３３^＋細胞選択の後、ＣＤ１３３^＋細胞画分とＣＤ１３３^－細胞画分の両方が回収される。必要に応じて、最初のＨＬＡ型判別および将来のキメリズム研究のために、未処理血液製剤またはＣＤ１３３^－細胞画分の試料からＤＮＡを抽出することができる。
体性幹細胞からのＨＳＰＣ

【0058】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、出生後のヒト（単数または複数）に由来する。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、ＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞またはＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞であり、１つまたは複数のヒト供給源に由来する。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、単一のヒト体性幹細胞源からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、複数のヒト体性幹細胞源からのＣＤ３４^＋造血幹および前駆細胞である。富化ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣが、プールされる前に互いにＨＬＡが適合していないため、単一のＨＬＡ型を含むこともあり、または複数のＨＬＡ型を含むこともある。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、単一のヒト体性幹細胞源からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、複数のヒト体性幹細胞源からのＣＤ１３３^＋造血幹および前駆細胞である。富化ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣが、プールされる前に互いにまたはレシピエントとＨＬＡが適合していないため、単一のＨＬＡ型を含むこともあり、または複数のＨＬＡ型を含むこともある。一部の実施形態では、富化ＨＳＰＣは、Ｔ細胞が枯渇したものである。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞が枯渇したとは、２％未満のＣＤ３^＋細胞、または１％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．５％未満のＣＤ３^＋細胞、または０．１％未満のＣＤ３^＋細胞を指す。

【0059】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、出生後（例えば、成人または子供）のＰＢＭＣから収集された体性幹細胞からのものである。ＰＢＭＣは、対象から、任意の好適な方法を使用して、例えば、モービライザーを使用する対象の幹細胞の末梢血への動員、骨髄の吸引、および／またはアフェレーシス、例えば白血球アフェレーシスによって、得ることができる。

【0060】

一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、対象から、モービライザーを使用する幹細胞の末梢血への動員、続いての白血球アフェレーシスの後に得られる。本明細書で使用される場合、「モービライザー」は、成長因子もしくはコロニー刺激因子またはその活性断片もしくは模倣物、核酸、炭水化物、抗体、あるいはＢＭから末梢血への幹細胞の遊走を増進するように作用する任意の他の作用物質などの、任意の物質を、それが小有機分子であるか、合成もしくは天然由来であるか、ポリペプチドであるかを問わず、指す。そのような「モービライザー」は、末梢血中の幹細胞（例えば、造血幹細胞または造血幹および前駆細胞）の数を増加させることができ、したがって、幹細胞源のより容易な入手を可能にする。対象における採取されることになる入手可能な幹細胞の数を増加させることに適した任意のモービライザーを用いることができる。ある実施形態では、モービライザーは、サイトカイン、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）である。適するモービライザーの市販の例は、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標）（フィルグラスチム）である。本開示における使用に適するモービライザーの別の例は、ＳＴＥＭＧＥＮ（商標）として市販されている組換えメチオニルヒト幹細胞因子である。本開示における使用に適するモービライザーのさらに別の例は、プレリキサフォルであり、これは、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の阻害剤であり、その同族リガンドである間質細胞由来因子－１ａ（ＳＣＦ－１アルファ）の結合を遮断するものであり、ＧｅｎｚｙｍｅからＭＯＺＯＢＩＬ（商標）として市販されている。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、対象から１５ｃｃ／ｋｇ体重を標的収集目標としたＢＭ回収後に単離されるか、または毎日Ｇ－ＣＳＦ（フィルグラスチム；１６ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ；１～６日目）およびプレリキサフォル（２４０ｍｇ／ｋｇ／日；４～６日目）を皮下投与してＣＤ３４^＋細胞を動員し、続いて白血球アフェレーシスを行った対象から単離される。

【0061】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、富化ＨＳＰＣを調製するために、ＣＤ３４^＋細胞の富化、例えば、本明細書に記載のまたは当業者に公知の方法による富化によって、ＰＢＭＣから単離される。一部の実施形態では、ＣＤ３４細胞は、Ａｄａｉｒら（Haematologica 103(11):1806-1814, 2018；この開示は参照により本明細書に組み込まれる）により記載されたような系統枯渇によって富化される。
富化ＨＳＰＣ

【0062】

上で説明したような富化ＨＳＰＣを、その後、拡大の前に、例えば、適切な細胞培養培地での懸濁、または凍結保存により、保管および／または輸送のために処理することができる。好ましい実施形態では、細胞培養培地または凍結保存用培地は、ＨＳＰＣの生存率の維持に適している。例えば、細胞培養培地は、例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ Ｉ、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）、Ｘ－ＶＩＶＯ １０、ＳＴＥＭｉｕｍ（登録商標）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ、ＳｔｅｍＰｒｏ ＨＳＣ培地（Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハム栄養混合物（ハムＦ－１０、およびハムＦ－１２）、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）、イスコフ改変ダルベッコ培地および（ＩＭＤＭ）、またはこれらの組合せなどの、無血清、無血清成分（例えば、ヒト血清アルブミン、またはヒト血小板溶解物）、無サイトカインの造血幹細胞または幹および前駆細胞培養培地であり得る。成長因子が細胞培養培地に添加される。例えば、一部の実施形態では、成長因子は、次の濃度で添加される：約５０～３００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、約５０～３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３－リガンド（Ｆｌｔ３－Ｌ）、約５０～１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）、約５０～１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６（ＩＬ－６）、および約１０～５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３（ＩＬ－３）。さらに特定の実施形態では、細胞培養培地は、３００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子、３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３－リガンド、１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン、１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６および１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３；または５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３－リガンド、５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン、５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６および１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３を含有する。別の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－３（ｒｈＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－６（ｒｈＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦｌｔ３－リガンド（ｒｈＦｌｔ３－Ｌ）、および５０ｎｇ／ｍｌの（50 ng/ml and）組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）が補充された無血清、造血幹細胞または幹および前駆細胞培養培地（例えば、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍまたはＳＴＥＭＳＰＡＮ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ））を含むか、または代替的にそれらからなる。別の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、組換えヒトｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｌｔ３－Ｌ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＩＬ－６（各々５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で）およびｒｈＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で）が補充された、無血清造血幹細胞または幹および前駆細胞培養培地（例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ ＩＩ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ））からなる。凍結保存用培地は、下記のもののいずれかを含む任意の適する培地であり得る。

【0063】

特定の実施形態では、ＨＳＰＣは、赤血球が枯渇したものであり、赤血球枯渇画分中のＣＤ３４^＋および／またはＣＤ１３３^＋細胞の数が決定される。一部の実施形態では、赤血球の枯渇は、赤血球の白血球からの分離、または赤血球のＣＤ３４^＋および／もしくはＣＤ１３３^＋細胞からの分離を指す。好ましくは、３５０万より多くのＣＤ３４^＋細胞を含有する臍帯血および／または胎盤血ユニットが上記の富化方法に付される。

【0064】

ＨＳＰＣが上記の富化方法または当技術分野において公知の他の方法に従って（例えば、分娩時にヒトからまたは分娩後にヒトから収集されたヒト臍帯血および／またはヒト胎盤血から）単離された後、富化ＨＳＰＣは、ヒドロゲルに封入される。

【0065】

富化ＨＳＰＣは、典型的には、ＨＳＰＣの単個細胞の懸濁液であり、その後、アルギネート－ポリリシンヒドロゲル内に封入される。ポリリシンは、典型的にはポリ－Ｌ－リシンである。封入ＨＳＰＣは、ヒドロゲルの微小環境内で実質的に分化することなく拡大することができる。一部の実施形態では、封入ＨＳＰＣは、ヒドロゲルの微小環境内で実質的に分化することなく拡大することができ、したがって、ＨＳＣのパーセンテージは、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣにおいて出発富化ＨＳＰＣと比べて維持または増加される。アルギネートによる封入は、ＨＳＣが前駆体（例えば、系統拘束前駆体および／または最終分化細胞型、例えば、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞、マクロファージ、ＣＤ２０^＋Ｂ細胞、ＣＤ１４^＋単球、ＣＤ１５^＋好中球など）に有意に分化することなくＨＳＰＣを維持および拡大するのに有用な、スケーラブルで可逆的な培養環境を提供する。

【0066】

一部の実施形態では、アルギネート－ポリリシンヒドロゲルは、二価カチオンをさらに含む。適する二価カチオンとしては、Ｃａ_２ ^＋またはＢａ_２ ^＋が挙げられる。

【0067】

一部の実施形態では、アルギネート濃度は、封入中は約１％（ｗ／ｖ）～約３％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、アルギネート濃度は、封入中は約１％（ｗ／ｖ）～約５％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、アルギネート濃度は、封入中は約２％（ｗ／ｖ）である。

【0068】

一部の実施形態では、ポリリシン濃度は、封入中は約０．０１％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、ポリリシン濃度は、封入中は約０．１％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、ポリリシンは、ポリ－Ｌ－リシンであり、濃度は、封入中は約０．０１％（ｗ／ｖ）～約１０％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、ポリリシンは、ポリ－Ｌ－リシンであり、濃度は、封入中は約０．１％（ｗ／ｖ）である。

【0069】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、約１×１０^４細胞／ｍｌ～約１×１０^７細胞／ｍｌの細胞播種密度で封入される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、約１×１０^５細胞／ｍｌ～約１×１０^７細胞／ｍｌの細胞播種密度で封入される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、約１×１０^６細胞／ｍｌ～約１×１０^７細胞／ｍｌの細胞播種密度で封入される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、約５×１０^６細胞／ｍｌの細胞播種密度で封入される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、約１×１０^６細胞／ｍｌ～約１×１０^７細胞／ｍｌの細胞播種密度で封入される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、約５×１０^６細胞／ｍｌの細胞播種密度で封入される。

【0070】

富化ＨＳＰＣの封入は、任意の適する技法を使用して行うことができる。例えば、同軸エレクトロスプレー法、遠心コーティング、フローバイブレーションノズル、油－水エマルジョン、エアドリッピングノズル、パンコーティング、イオノトロピックゲル化、コアセルベーション相分離、界面架橋または重合、噴霧乾燥、およびこれらの組み合わせなどの技法も、使用することができる。

【0071】

アルギネートは、典型的には、医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）条件内および／またはＧＭＰ条件下で生成されるアルギネートであり、分子量は、１ｋＤａ～２０００ｋＤａから選択され得る。Ｃ－５エピマー－Ｌ－グルロン酸塩（Ｇ）／ｂ－Ｄ－マンヌロン酸塩（Ｍ）比は、０．１～１０から選択され得る。アルギネート溶液の作業粘度は、１ｍＰａ^＊ｓ～５００ｍＰａ^＊ｓから選択され得る。アルギネートは、好ましくは、低エンドトキシン、例えば、（ＥＵ／ｇ）＜１００を有する。

【0072】

アルギネートは、主として、ゲル化剤、例えば、正荷電ポリマー、または二価イオン、例えばＭｇ_２ ^＋、Ｃａ_２ ^＋、Ｓｒ_２ ^＋、Ｂａ_２ ^＋、またはこれらの組合せなどによって、物理的に架橋される。

【0073】

正荷電ポリマーは、ポリリシン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、カチオン性キトサン、カチオン性ゼラチン、カチオン性デキストラン、カチオン性セルロース、カチオン性シクロデキストリン、ポリブレン、ポリエチレンイミン、ポリビニルピリジン、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（アミドアミン）、およびポリ（アミノ－ｃｏ－エステル）、ポリ（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）から選択することができるが、これらに限定されない。正荷電ポリマーは、典型的には、ポリリシン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、またはこれらの混合物である。

【0074】

アルギネートおよびゲル化剤（複数可）に適する溶液としては、食塩水（例えば、ＰＢＳ、ＤＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＢＳＳ、ＥＢＳＳ、クエン酸食塩水など）、細胞培養培地（例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ、ＳＴＥＭＬＩＮＥ（商標）Ｉ、ＳＴＥＭＬＩＮＥ（商標）ＩＩ、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１０、ＳＴＥＭｉｕｍ（登録商標）、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）－３４ ＳＦＭ、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）ＨＳＣ培地（Ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハム栄養混合物（ハムＦ－１０、およびハムＦ－１２）、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）、イスコフ改変ダルベッコ培地および（ＩＭＤＭ））、またはこれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。

【0075】

ヒドロゲル封入細胞の形成は、幾つかの方法により行うことができる。これらの方法は、アルギネート／細胞水滴とＣａＣｌ_２含有浴の両方の形成を含む。マイクロカプセル技術は、例えば、米国特許第８，４３５，７８７号に記載されている。別の方法は、油相中のアルギネート／細胞水滴とＣａＣｌ_２含有水滴の両方の形成を含む。２タイプの液滴が互いに融合すると、細胞を含有する架橋したヒドロゲルビーズが形成される（例えば、H. Shintaku, et al., Microsystems Technology 13:951, 2007を参照されたい）。この方法は、下記でさらに十分に説明される。

【0076】

典型的なプロセスには、液滴形成、およびヒドロゲルを形成するための液滴の合体という２つのステージがある。液滴形成のために、水性相をマイクロチャネル内の油に導入することによって、細胞を含有するアルギン酸ナトリウム溶液の液滴が、マイクロチャネルの上流に位置するノズルから形成される。アルギネートの液滴は、連続液相の流れに続いて、主チャネル内を下流に流れる。次に、アルギネートの液滴は、下流に位置する第２のノズルから形成される塩化カルシウム溶液の液滴と融合する。

【0077】

直径が３００μｍより小さいビーズ（例えば、約１０μｍ～約３００μｍの範囲内のビーズ）を有するヒドロゲルを生成するために、チャネルの深さは、好ましくは約５０μｍであり、好ましい直径は、それぞれ、ノズルについては５０μｍ、および主チャネルについては２００μｍである。

【0078】

アルギン酸ナトリウム溶液は、好ましくは、約１％～約３％（ｗ／ｖ）または約１．５％ ｗ／ｖの濃度で用いられ、細胞がこのアルギネートに１０^５細胞／ｍｌの濃度で分散される。塩化カルシウムは、好ましくは０．１Ｍの濃度で供給される。ヒマワリ油などの植物油を油相として使用することができる。

【0079】

第２のプロトコールは、Workman, et al., Macromolecular Rapid Communications 29:165, 2008によって記載されている。この方法では、遮蔽された接合部が、アルギネートマイクロスフェアを生成するために用いられる。ＣａＣＯ_３および細胞と混合された水性アルギン酸ナトリウムが中央チャネルに導入される。酢酸と混合されたヒマワリ油が最も外側のチャネルに供給される。ヒマワリ油は、アルギネート溶液が酸性化した油流と接触するのを防止するシールドとして作用するように中間チャネルに供給される。これらのチャネル間を２つの油が層流方式で流れ、保護ヒマワリ油へのＨ^＋の拡散を最小限に抑える。接合部での液滴形成後、Ｈ^＋は、アルギネート液滴内に拡散し、かくてＣａ_２ ^＋をＣａＣＯ_３から遊離させ、これに起因してアルギネートのゲル化が生じる。接合部前のチャネルは、好ましくは約５００μｍ^２の断面積を有し、接合部後のチャネルは、好ましくは約１０００μｍ^２の断面積を有する。

【0080】

封入を、噴射封入技法を使用して行うこともできる。多くのそのような技法が当技術分野において公知であり、バイオエレクトロスプレー噴射、空気力学的支援によるバイオ噴射、および圧力支援による細胞噴射が好ましい。エレクトロスプレー法は、バイオエレクトロスプレー法または電気流体力学的噴射としても公知であり、スプレーノズルまたは針と接地電極の間の電位差に依拠して規定サイズの液滴を生じさせる。

【0081】

培地は、外部電界を生じさせる電極よりも高い電位に保持されている導電針に通され、その針から出た培地は、その外部電界に通される。針は中空であり、０．２ｍｍ～２ｍｍの間の内径、および平坦なエッジ幾何形状または面取りをしたエッジ幾何形状のどちらかを有する。針はまた同軸であり、したがって、異なる流体を同じ針から同時に噴霧することができる。液滴の形成は、針と電極の間の電位差（電圧の差）、培地の流速、ならびにその相対的な特徴、例えば、粘度、表面張力、導電率および比誘電率によって決まる。電圧および間隔は、電場が両方の変数に依存するので、関連している。通常は、封入は、およそ５～１０ｋＶの電圧を用いて１または２ｃｍ間隔で行われる。ジェットが安定している場合、ほぼ単一分布の液滴サイズを得ることができる。この技術を使用して、生細胞を封入することができる（例えば、Jayasinghe et al., Small 2:216-219, 2006；およびJayasinghe et al., Biotechnol. J. 1:86-94, 2006を参照されたい）。初期の研究は、液滴サイズの分散が広い不安定なジェットをもたらしたが、これは、同軸噴射針を使用して安定した噴射を生じさせ（Jayasinghe et al., Lab Chip 6:1086-1090, 2006）、マイクロ封入材料を外側のジェットで噴霧し、生体材料を内側のジェットで噴霧することよって改善された。

【0082】

空気力学的支援による噴射は、圧力勾配に依拠する。圧力がチャンバ内で周囲雰囲気に対して加えられ、それによって、引き込み効果が生じてジェットが生成される。生細胞をこのようにして封入することができる（Arumuganathar et al., Biomed. Mat. 2:158-168, 2007）。

【0083】

圧力支援による噴射は、同軸針を用い、この同軸針では、１つのオリフィスが培地を噴射するために使用され、もう１つのオリフィスが、印加される圧力の導管としての役割を果たす。空気力学的支援による噴射とは異なり、加圧チャンバはない。

【0084】

噴射技術の一般的な概説については、Jayasinghe, Regen. Med. 3:49-61, 2008、ならびに米国特許第６，６４９，３８４号、米国特許出願公開第２００６／００５１３２９号および米国特許第４，３５３，８８８号を参照されたい。（全て、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。複数のノズルを使用することにより、噴射技術の規模を拡大することができる。

【0085】

一部の実施形態では、封入に向けてＨＳＰＣを準備するために、典型的に個々の細胞であるＨＳＰＣは、ＰＢＳなどの適する水性緩衝液で洗浄され、沈殿され、封入用ポリマーを含む緩衝液に再懸濁される。封入材料は、任意の適する形態のアルギネート、好ましくはＧＭＰアルギネート、およびポリリシン、好ましくはポリ－Ｌ－リシンであり得る。アルギネートは、容易に固化して所望の特性を有するマトリックスであって、生理的ｐＨで水または食塩水に不溶性であるマトリックスを形成することができる。所望の特性としては、栄養透過性が挙げられる。典型的に、結果として得られるヒドロゲルは、電荷平衡状態にある。本明細書で使用される場合、「電荷平衡」ヒドロゲルは、ヒドロゲルカプセルが形成されるとアルギネートおよびポリリシンが平衡に達する、アルギネートおよびポリリシンから形成されているヒドロゲルを指す。

【0086】

一部の実施形態では、アルギネートは、好ましくは、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを欠いているＰＢＳ緩衝液中にあり、このことによって、封入用ヒドロゲルの時期尚早の固化が防止される。典型的には、緩衝液は、ＭＯＰＳ、ＰＢＳまたは本明細書に記載の細胞培養培地などの適する緩衝液中に１～５重量％のアルギネートを含む。

【0087】

ヒドロゲルのためのゲル化剤は、次の３つの方法のうちの１つで導入することができる：（１）二次液滴集団を生成し、導入して細胞カプセルと融合させる方法；（２）細胞液滴を、確立された重合剤を含有する水相ストリームへ油相に沿って抽出する方法；（３）ゲル化剤を油相に直接溶解する方法；または（４）細胞およびアルギネートをゲル化剤の溶液に導入する方法。

【0088】

ゲル化溶液、例えば、好ましくはＣａ_２ ^＋、Ｓｒ_２ ^＋またはＢａ_２ ^＋イオンは、アルギネートを固化させるために使用される。ＣａＣｌ_２、またはそれぞれのＳｒもしくはＢａ化合物は、１０ｍＭ～１Ｍの間の濃度で水に溶解される。Ｃａ、ＳｒおよびＢａの組合せをわずか１ｍＭ程度の１つの塩と共に使用して、最適なヒドロゲル特性を得ることができる。ゲル化溶液は、典型的には、ポリ－Ｌ－リシンなどのポリリシンを、例えば０．０１５～０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で含む。この溶液は、好ましくは、エレクトロスプレーユニットの電極に配置される収集容器内に保持される。アルギネート溶液に懸濁しているＨＳＰＣは、噴霧機を通過し、その結果、液滴が固化またはゲル化溶液を保持する容器に収集される。封入細胞を噴霧後に容器の底から取り出すことができる。
封入ＨＳＰＣの培養

【0089】

封入ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣ、例えば、ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣまたはＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣを維持および／または拡大するために培養培地で培養される（一部の実施形態では、まとめて拡大と呼ばれる）。ＨＳＰＣは、培養培地において、ＨＳＰＣ生存率および／またはＨＳＰＣ増殖を維持する（例えば、ＨＳＰＣが成長して分裂する（増殖する）ように有糸分裂を促進する）条件下で培養される。一部の実施形態では、封入ＨＳＰＣの培養中に、最終分化細胞型へのＨＳＣの最小限の分化が起こる（すなわち、結果として得られる細胞の５％未満、４％未満、３％未満、または２％未満）。一部の実施形態では、封入ＨＳＰＣの培養中に、拘束前駆体（例えば、骨髄系およびリンパ系）のパーセンテージは、富化ＨＳＰＣの場合とほぼ同じままである（例えば、５％未満の変化、１０％未満の変化）。一部の実施形態では、封入ＨＳＰＣの培養中に、最終分化細胞型へのＨＳＣおよびＭＰＰの最小限の分化が起こる（すなわち、結果として得られる細胞の５％未満、４％未満、３％未満、または２％未満）。一部の実施形態では、封入ＨＳＰＣの培養中に、拘束前駆体（例えば、骨髄系およびリンパ系）のパーセンテージは、富化ＨＳＰＣとほぼ同じままである（例えば、５％未満の変化、１０％未満の変化）。

【0090】

一般的な培養および拡大技法としては、米国特許第７，３９９，６３３号、米国特許出願公開第２０１３／００９５０７９号、Delaney et al., Nature Med. 16(2):232-236, 2010に記載されているもの（全て、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに下記で説明されるものが挙げられるが、それらに限定されない。これらの技法を本明細書に記載の方法および組成物による使用に適応させることができる。

【0091】

本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞層」、「フィーダー層」、または「フィーダー細胞」は、第２の種類の細胞を維持することおよび分化させることまたは増殖させることができる環境を提供するために第２の種類の細胞（例えば、ＨＳＰＣ）と共培養される、ある種類の外来性細胞を指す。理論により拘束されるものではないが、フィーダー細胞は、例えば、第２の種類の細胞にペプチド、ポリペプチド、電気シグナル、有機分子、核酸分子、成長因子、他の因子（例えば、サイトカイン）、および代謝栄養素を提供することができる。

【0092】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、無血清である培養培地であって、成長因子の存在下で造血幹および前駆細胞の生存率を維持するのに適している培養培地において培養され、細胞成長条件（例えば、有糸分裂を促進する）に曝露され、その結果、ＨＳＰＣは、増殖してＨＳＰＣの拡大集団（拡大ＨＳＰＣ集団、拡大ＨＳＰＣ、または代替的に、ヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ集団またはヒドロゲル拡大ＨＳＰＣ）を生成し、ＨＳＰＣ集団内のＨＳＣの生存率を維持する。

【0093】

例示的な実施形態では、造血幹および前駆細胞の維持および／または拡大に適している培養培地は、本明細書に記載されるような、成長因子を伴う、非動物由来ＢＳＡ、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２－メルカプトエタノールおよび他のサプリメントを含有するイスコフＭＤＭなどの、無血清の培養培地である。他の実施形態では、造血幹細胞培養培地は、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、またはＳＴＥＭＳＰＡＮ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）である。

【0094】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、Ｎｏｔｃｈリガンド（すなわち、Ｎｏｔｃｈアゴニストとも呼ばれる、分化の阻害に有効なＮｏｔｃｈ機能のアゴニスト）の非存在下で培養される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、Ｎｏｔｃｈリガンドならびにフィブロネクチンおよび／またはその断片の非存在下で培養される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、Ｎｏｔｃｈリガンド、フィブロネクチンおよび／またはその断片、ならびにアリール炭化水素アンタゴニスト（例えば、ＳＲ１）、ならびにピリミド－インドール誘導体、例えばＵＭ７２９およびＵＭ１７１の非存在下で培養される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、Ｎｏｔｃｈリガンド、典型的には官能化形態のアルギネートおよび／またはポリリシンに結合されたＮｏｔｃｈリガンド、の存在下で培養される。いずれの実施形態においても、さらなる拘束細胞型へのＨＳＰＣの分化は、培養中には最小限に抑えられる。一部の実施形態では、複能性前駆体、骨髄系およびリンパ系前駆体、ならびにより拘束細胞型へのＨＳＣの分化は、培養中には最小限に抑えられる。一部の実施形態では、ＨＳＣのパーセンテージは、培養中に同じままであるかまたは上昇する。一部の実施形態では、骨髄系およびリンパ系前駆体、ならびにより拘束細胞型へのＨＳＣの分化は、培養中には最小限に抑えられる。一部の実施形態では、骨髄系およびリンパ系前駆体、ならびにより拘束細胞型へのＨＳＣおよびＭＰＰの分化は、培養中には最小限に抑えられる。一部の実施形態では、ＨＳＣおよびＭＰＰのパーセンテージは、培養中に同じままであるかまたは上昇する。

【0095】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５日間、またはそれより長く培養され、あるいは好ましくは、ＨＳＰＣは、少なくとも１０日、約２～約１０日、約２～約２１日、約７～約１５日、約７～約１４日、または約１３～約１５日間、培養される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、約１４日、約１３日または約１５日間、培養される。典型的には、封入ＨＳＰＣは、ヒドロゲルカプセル内の細胞密度を最大化するのに十分な期間にわたって培養されるが、ヒドロゲルカプセルが破裂するほど長い期間にわたって培養されない。ＨＳＰＣの最も一般的なｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養条件下で、これは、典型的に約１４日であるが、さほど典型的でない培地または細胞培養条件が使用された場合、この期間は、短縮または延長され得る。

【0096】

封入ＨＳＰＣを培養するための例示的な培養条件としては、次のヒト成長因子が補充された無血清の培養培地での７～１４日または７～１５日間の細胞培養が挙げられる：幹細胞因子、Ｆｌｔ３－リガンド、トロンボポエチン、インターロイキン－６およびインターロイキン－３。好ましくは、前述の成長因子は、次の濃度で存在する：５０～３００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子、５０～３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３－リガンド、５０～１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン、５０～１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６、および１０～５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３。さらに特定の実施形態では、３００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子、３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３－リガンド、１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン、１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６および１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３、または５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３－リガンド、５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン、５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６および１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３が、使用される。別の好ましい実施形態では、培養培地（例えば、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ））は、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－３（ｒｈＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－６（ｒｈＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦｌｔ３－リガンド（ｒｈＦｌｔ３－Ｌ）、および５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）を含有するか、またはそれらからなる。別の好ましい実施形態では、培養培地（例えば、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ ＩＩ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ））は、組換えヒトｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｌｔ３－Ｌ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＩＬ－６（各々５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で）およびｒｈＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で）を含有するか、またはそれらからなる。

【0097】

一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、培養システムに含まれている。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ヒドロゲル（例えば、アルギネート－ポリリシンヒドロゲル）に結合している。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＸＩ（Ｄｅｌｔａ１^{ｅｘｔ－ＩｇＧ}）であり、培養は、本明細書に記載の通りに行われ、Ｄｅｌｔａ１^{ｅｘｔ－ＩｇＧ}（ＤＸＩ）がヒドロゲルに結合している。一部の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドが使用され、アルギネート－ポリリシンヒドロゲルに結合しており、この場合、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｎｏｔｃｈ １および／またはＮｏｔｃｈ ２受容体特異的抗体であり（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願公開第２０１７／０１０７４９３号を参照されたい）、培養は、本明細書に記載の通りに行われる：Ｎｏｔｃｈ １および／またはＮｏｔｃｈ ２受容体特異的抗体は、ヒドロゲルに結合している。好ましくは、培養培地（例えば、ＳＴＥＭＳＰＡＮ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍまたはＳＴＥＭＳＰＡＮ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ））には、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－３（ｒｈＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－６（ｒｈＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌの組合せヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦｌｔ３－リガンド（ｒｈＦｌｔ３－Ｌ）、および５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）が補充される。

【0098】

一部の実施形態では、培養培地は、ｒｈＩＬ－３、ｒｈＩＬ－６、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＦｌｔ３－ＬおよびｒｈＳＣＦ以外の成長因子を含まない。

【0099】

一部の実施形態では、培養培地は、次の添加される成長因子またはサイトカインを含有しない：ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＭＩＰ－１ａ、ＩＬ－２またはＩＬ－１５。一部の実施形態では、培養培地は、米国特許第９，１７５，２６６号または米国特許出願公開第２０１８／０２３７７４９号（それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどの、アリール炭化水素受容体アンタゴニストを含有しない。

【0100】

造血幹および前駆細胞の培養後、細胞および生存ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣまたはＣＤ１３３^＋ＨＳＰＣ）の総数を決定することができる。例えば、培養中の１４日目に、試料を全生存有核細胞計数値の決定のために採取することができる。加えて、ＣＤ３４^＋細胞および／またはＣＤ１３３^＋細胞の総数を、マルチパラメータフローサイトメトリーにより決定することができ、したがって、試料中のＣＤ３４^＋細胞および／またはＣＤ１３３^＋細胞のパーセンテージを決定することができる。

【0101】

生存率は、当技術分野において公知の任意の方法により、例えば、トリパンブルー排除または７－ＡＡＤ排除により、決定することができる。生存ＨＳＰＣのパーセンテージは、フローサイトメトリー、および生存細胞により排除される染色剤の使用によって、評価することができる。生存ＨＳＰＣのパーセンテージは、アリコートのＨＳＰＣ（ＴＮＣ；生存ＨＳＰＣと非生存ＨＳＰＣの両方）の総数で割った、試料中のアリコート中の７－ＡＡＤ（または他の適切な染色剤）を排除するＨＳＰＣ^＋細胞の数に等しい。

【0102】

造血幹および前駆細胞の培養後、拡大ＨＳＰＣ中のＨＳＣのパーセンテージを決定することができる。例えば、培養中の１４日目に、ＣＤ３４^＋細胞がＨＳＰＣであり、ＨＳＣがＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋である、試料を、例えばマルチパラメータフローサイトメトリーにより、全ＨＳＰＣのパーセンテージとしてＨＳＣを判定するために採取することができる。同様に、培養中の１４日目に、ＣＤ１３３^＋細胞がＨＳＰＣであり、ＨＳＣがＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋である、試料を、例えばマルチパラメータフローサイトメトリーにより、全ＨＳＰＣのパーセンテージとしてＨＳＣを判定するために採取することができる。一部の実施形態では、拡大ＨＳＰＣ中のＨＳＣおよびＭＰＰのパーセンテージを決定することができる。例えば、培養中の１４日目に、ＣＤ３４^＋細胞がＨＳＰＣであり、ＨＳＣがＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋であり、ＭＰＰがＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^－である、試料を、例えばマルチパラメータフローサイトメトリーにより、全ＨＳＰＣのパーセンテージとしてＨＳＣおよびＭＰＰを判定するために採取することができる。同様に、培養中の１４日目に、ＣＤ１３３^＋細胞がＨＳＰＣであり、ＨＳＣがＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋であり、ＭＰＰがＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^－である、試料を、例えばマルチパラメータフローサイトメトリーにより、全ＨＳＰＣのパーセンテージとしてＨＳＣおよびＭＰＰを判定するために採取することができる。
Ｎｏｔｃｈリガンド

【0103】

ＮｏｔｃｈアゴニストまたはＮｏｔｃｈリガンドとも呼ばれる、Ｎｏｔｃｈ機能のアゴニストは、Ｎｏｔｃｈ経路機能の活性化を促進する、すなわち、引き起こすまたは増加させる、作用物質である。本明細書で使用される場合、「Ｎｏｔｃｈ機能」は、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインの核移行、ＲＢＰ－ＪκまたはそのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのホモログであるＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓの核移行；Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ複合体のｂＨＬＨ遺伝子、例えばＭａｓｔｅｒｍｉｎｄの活性化；ＨＥＳ－１遺伝子またはＫＢＦ２（ＣＢＦ１とも呼ばれる）遺伝子の活性化；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ神経芽細胞分離の阻害；およびＮｏｔｃｈのＤｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄ／Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｆｒｉｎｇｅ、ＤｅｌｔｅｘもしくはＲＢＰ－Ｊκ／Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓまたはこれらのホモログもしくはアナログへの結合を含むがそれらに限定されない、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達（signaling）（シグナル伝達（signal transduction））経路により媒介される機能を意味する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、および活性化によるその効果についてはKopan et al., Cell 137:216-233, 2009による総説を参照されたい。またJarriault et al., Mol. Cell. Biol. 18:7423-7431, 1998も参照されたい。

【0104】

例示的なＮｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化する、細胞外結合リガンドＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ、またはＮｏｔｃｈの細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化する、ＤｅｌｔａもしくはＳｅｒｒａｔｅの断片である。ヒトをはじめとする幾つかの種から単離されたＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅの核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、国際特許公開番号ＷＯ９３／１２１４１、ＷＯ９６／２７６１０、ＷＯ９７／０１５７１、およびGray et al., Am. J. Path. 154:785-794, 1999において開示されている。

【0105】

好ましい実施形態では、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、ｍｙｃエピトープタグに融合したタンパク質の細胞外ドメインからなるＤｅｌｔａもしくはＳｅｒｒａｔｅタンパク質の活性断片（それぞれ、Ｄｅｌｔａ^{ｅｘｔ－ｍｙｃ}もしくはＳｅｒｒａｔｅ^{ｅｘｔ－ｍｙｃ}）、またはＩｇＧのＦｃ部分に融合したタンパク質の細胞外ドメインからなるＤｅｌｔａもしくはＳｅｒｒａｔｅタンパク質の活性断片（それぞれ、Ｄｅｌｔａ^{ｅｘｔ－ＩｇＧ}もしくはＳｅｒｒａｔｅ^{ｅｘｔ－ＩｇＧ}）である。Ｎｏｔｃｈアゴニストとしては、Ｎｏｔｃｈタンパク質ならびにこれらのアナログおよび誘導体（断片を含む）；Ｎｏｔｃｈ経路の他のエレメントであるタンパク質ならびにこれらのアナログおよび誘導体（断片を含む）；それらに対する抗体ならびにそれらの結合領域を含有するそのような抗体の断片または他の誘導体；それらのタンパク質および誘導体またはアナログをコードする核酸；ならびにＮｏｔｃｈ経路活性を促進するようにＮｏｔｃｈタンパク質とまたはＮｏｔｃｈ経路内の他のタンパク質と結合するかまたは別様に相互作用する、タンパク質ならびにこれらの誘導体およびアナログが挙げられるが、それらに限定されない。そのようなアゴニストとしては、細胞内ドメインを含むＮｏｔｃｈタンパク質およびこれらの誘導体；前述のものをコードするＮｏｔｃｈ核酸；ならびにＮｏｔｃｈリガンドのＮｏｔｃｈ相互作用ドメイン（例えば、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅの細胞外ドメイン）を含むタンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。他のアゴニストとしては、ＲＢＰＪκ／Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ＨａｉｒｌｅｓｓまたはＤｅｌｔｅｘが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｒｉｎｇｅを、例えばＤｅｌｔａタンパク質と併用して、Ｎｏｔｃｈ活性化を増強することができる。これらのタンパク質、それらの断片および誘導体を、組換え発現させて単離することができ、または化学的に合成することができる。

【0106】

Ｎｏｔｃｈのアゴニストはまた、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバーに結合する、ペプチド模倣物またはペプチドアナログまたは有機分子であり得る。そのようなアゴニストは、当技術分野において公知のものから選択される結合アッセイ、例えば、Rebay et al., Cell 67:687-699, 1991および国際特許公開番号ＷＯ９２／１９７３４（両方とも、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている細胞凝集アッセイによって、同定することができる。

【0107】

Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈタンパク質へのまたはＮｏｔｃｈの断片への結合を媒介するＮｏｔｃｈ相互作用遺伝子によりコードされたタンパク質の断片であって、アゴニストタンパク質への結合に関与するＮｏｔｃｈの領域、例えば、Ｎｏｔｃｈの上皮成長因子様リピート１１および１２、を含有するＮｏｔｃｈの断片から少なくともなる、タンパク質である。Ｎｏｔｃｈ相互作用遺伝子は、本明細書で使用される場合、遺伝子Ｎｏｔｃｈ、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、ＲＢＰＪκ、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓ、およびＤｅｌｔｅｘ、ならびに配列相同性または遺伝子相互作用に基づいて同定され得る、Ｄｅｌｔａ／ＳｅｒｒａｔｅファミリーまたはＤｅｌｔｅｘファミリーの他のメンバー、より一般的には、分子相互作用（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合、または遺伝子相互作用（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、表現型として示されるような）により同定される遺伝子の「Ｎｏｔｃｈカスケード」または「Ｎｏｔｃｈ群」のメンバーを意味するものとする。Ｎｏｔｃｈへの結合に関与する領域を含有するＮｏｔｃｈ結合タンパク質の例示的な断片は、米国特許第５，６４８，４６４号、同第５，８４９，８６９号および同第５，８５６，４４１号（全て、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。Ａｒｔａｖａｎｉｓ－Ｔｓａｋｏｎａｓらの米国特許第５，７８０，３００号（参照により本明細書に組み込まれる）には、Ｎｏｔｃｈアゴニストが、Ｎｏｔｃｈの活性化またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバーの活性化に必要とされる成熟またはプロセシングステップを媒介する細胞プロセスを促進または活性化する試薬、例えば、Ｎｏｔｃｈプロセシングに必要とされるフューリン様転換酵素；Ｎｏｔｃｈの上流でもしくはＮｏｔｃｈに平行してＮｏｔｃｈ経路の活性化に必要とされると考えられているメタロプロテアーゼ－ディスインテグリン（ＡＤＡＭ）である、Ｋｕｚｂａｎｉａｎ（Schlondorff and Blobel, J. Cell Sci. 112:3603-3617, 1999）；または、より一般的には、細胞輸送およびプロセシングタンパク質、例えば、細胞コンパートメント間の移動に必要とされるＧＴＰａｓｅのｒａｂファミリー（Ｒａｂ ＧＴＰａｓｅに関する概説については、Olkkonen and Stenmark, Int. Rev. Cytol. 176:1-85, 1997を参照されたい）を含むことが記載されている。アゴニストは、上記プロセスのうちの１つの活性を増加させる任意の分子、例えば、フューリン、Ｋｕｚｂａｎｉａｎもしくはｒａｂタンパク質をコードする核酸、またはその断片もしくは誘導体もしくはドミナントアクティブ変異体、あるいは上記タンパク質に結合し、その機能を活性化する、ペプチド模倣物またはペプチドアナログまたは有機分子であり得る。

【0108】

米国特許第５，７８０，３００号には、Ｎｏｔｃｈ経路を活性化するために使用され得るクラスのＮｏｔｃｈアゴニスト分子（およびそれらの同定方法）、例えば、ＮｏｔｃｈアンキリンリピートとＲＢＰ－Ｊκの解離を誘発することによって細胞質から核へのＲＢＰ－Ｊκの移行を促進する分子が、さらに開示されている。

【0109】

一部の実施形態では、ＤＸＩが使用される。ＮｏｔｃｈアゴニストＤＸＩは、米国特許第７，３９９，６３３号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、ＩｇＧのＦｃ部分に融合したタンパク質の細胞外ドメインからなるＤｅｌｔａ１の固定化断片（Ｄｅｌｔａ１^{ｅｘｔ－ＩｇＧ}もしくはＤＸＩ）、または米国特許第１０，２０８，２８６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、固定化Ｎｏｔｃｈ－１もしくはＮｏｔｃｈ－２特異的抗体である。好ましくは、Ｄｅｌｔａ１^{ｅｘｔ－ＩｇＧ}は、細胞培養皿の表面に固定化される。
ヒドロゲルからの拡大ＨＳＰＣの放出

【0110】

培養ＨＳＰＣを、キレート剤の存在下で解重合され得るヒドロゲル（例えば、アルギネート／ポリリシンヒドロゲルまたはアルギネートヒドロゲル）から、放出することができる。例えば、クエン酸ナトリウムまたはＥＤＴＡなどのキレート剤を使用して、ヒドロゲルの解重合を誘導することができる。
遺伝子操作されたＨＳＰＣ

【0111】

ＨＳＰＣを、培養ステップ前、中または後にタンパク質、核酸または炭水化物などの目的の分子（単数または複数）を発現するように、遺伝子操作することができる。ＨＳＰＣを、タンパク質、核酸または炭水化物などの目的の分子（単数または複数）の発現を低減または消失させるように、遺伝子操作することができる。ＨＳＰＣを、培養ステップ前、中または後に遺伝子操作することができる。

【0112】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（まとめてタンパク質と呼ばれる）などの、目的のタンパク質を発現するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、遺伝子の通常（例えば、野生型）バージョンを発現するように遺伝子操作される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、内在性遺伝子の変更バージョン（例えば、変異タンパク質をコードする遺伝子）を発現するように遺伝子操作される。

【0113】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、異種タンパク質を発現するように遺伝子操作される。本明細書で使用される場合、異種タンパク質は、ＨＳＰＣによって通常は発現されないタンパク質である。本明細書で使用される場合、異種タンパク質は、ＨＳＰＣに由来する細胞によって通常は発現されないタンパク質である。一部の実施形態では、異種タンパク質は、抗体認識受容体である。

【0114】

ＨＳＰＣ集団を培養前または中または後に遺伝子改変することができる。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、培養中に遺伝子操作される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、培養後に遺伝子操作される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、培養前に遺伝子操作される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、富化中または後に遺伝子操作される。一部の実施形態では、ＨＳＰＣは、富化後に遺伝子改変される。

【0115】

一例として、遺伝される状態に対する治療利益を提供するために遺伝子改変を選択することができる。一部の実施形態では、状態は、グレーブス病、関節リウマチ（ＲＡ）、悪性貧血、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）もしくは重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ファンコニ貧血（ＦＡ）、バッテン病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）もしくは異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、筋ジストロフィー（ＭＤ）、肺胞タンパク症（pulmonary aveolar proteinosis）（ＰＡＰ）、ピルビン酸キナーゼ欠損症、シュワッハマン（Shwachmann）－ダイアモンド－ブラックファン貧血、先天性角化異常症、嚢胞性線維症（ＣＦ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、または筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）であり得る。一部の実施形態では、状態に依存して、遺伝子改変は、タンパク質をコードする治療遺伝子および／または機能が妨げられている遺伝子の導入であり得る。例示的な治療遺伝子および遺伝子産物としては、可溶性ＣＤ４０；ＣＴＬＡ；Ｆａｓ Ｌ；ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２などに対する抗体；ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６に対する抗体；ＩＬ－４；ＩＬ－１０；ＩＬ－１２；ＩＬ－１３；ＩＬ－１Ｒアルファ、ｓＩＬ－１ＲＩ、ｓＩＬ－１ＲＩＩ；ｓＴＮＦＲ－Ｉ；ｓＴＮＦＲ－ＩＩ；ＴＮＦに対する抗体；ｐ５３、ＰＴＰＮ２２、およびＤＲＢ１^＊１５０１／ＤＱＢ１^＊０６０２；グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ＦＡＮＣファミリー遺伝子；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン２；ならびに／またはＣ９ＯＲＦ７２が、挙げられる。

【0116】

別の例として、遺伝子改変は、赤血球および凝固（clotting）に関連する疾患に対する治療的に有効な応答を提供するために選択された治療遺伝子の導入であり得る。一部の実施形態では、疾患は、サラセミア、または鎌状赤血球症／形質のような、ヘモグロビン異常症である。治療遺伝子は、例えば、ヘモグロビンの産生を誘導するもしくは増加させる遺伝子；ベータ－グロビンもしくはアルファ－グロビンの産生を誘導するもしくは増加させる遺伝子；または体内の細胞への酸素の利用可能性を増加させる遺伝子であり得る。治療遺伝子は、例えば、ＨＢＢまたはＣＹＢ５Ｒ３であり得る。例示的な有効な処置は、例えば、血液細胞計数値を増加させることができ、血液細胞の機能を改善することができ、または患者の細胞の酸素化を増加させることができる。別の特定の実施形態では、疾患は、血友病である。治療遺伝子は、例えば、凝固／凝固因子ＶＩＩＩもしくは凝固／凝固因子ＩＸの産生を増加させ、凝固因子ＶＩＩＩもしくは凝固因子ＩＸの通常バージョンの産生を生じさせる遺伝子、凝固／凝固因子ＶＩＩＩもしくは凝固／凝固因子ＩＸに対する抗体の産生を低減させる遺伝子、または血餅の適切な形成を生じさせる遺伝子であり得る。例示的な治療遺伝子としては、Ｆ８およびＦ９が挙げられる。例示的な有効な処置は、例えば、凝固／凝固因子ＶＩＩＩおよびＩＸの産生を増加もしくは誘導することができ、凝固／凝固因子ＶＩＩＩおよびＩＸの機能を改善することができ、または対象における凝固時間を短縮することができる。

【0117】

別の例として、遺伝子改変は、リソソーム蓄積障害に対する治療的に有効な応答を提供するための治療遺伝子の導入であり得る。特定の実施形態では、リソソーム蓄積障害は、ムコ多糖症（ＭＰＳ）Ｉ型；ＭＰＳ ＩＩ型またはハンター症候群；ＭＰＳ ＩＩＩまたはサンフィリポ症候群；ＭＰＳ ＩＶまたはモルキオ症候群；ＭＰＳ Ｖ；ＭＰＳ ＶＩまたはマロトー・ラミー症候群；ＭＰＳ ＶＩＩまたはスライ症候群；アルファ－マンノシドーシス；ベータ－マンノシドーシス；ＧＳＤＩ、フォン・ギールケ病またはテイ・サックスとしても公知の、糖原病Ｉ型；ポンペ病；ゴーシェ病；ファブリー病である。治療遺伝子は、例えば、酵素をコードする、またはその産生を誘導する、またはリソソームにおいてムコ多糖の分解を別様に引き起こす、遺伝子であり得る。例示的な治療用遺伝子としては、ＩＤＵＡまたはイズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ、およびＨＹＡＬ１が挙げられる。リソソーム蓄積障害のための例示的な有効な遺伝子治療は、例えば、リソソーム内の様々な物質の分解に関与する酵素をコードすること、またはそのような酵素の産生を誘導することができ；頭部（巨頭症（Macrosephaly）を除く）、肝臓、脾臓、舌または声帯をはじめとする様々な器官の腫脹を軽減すること、消失させること、予防することまたは遅延させることができ；脳内の流体を低減させることができ；心臓弁の異常を軽減することができ；気道の狭窄を予防することまたは拡張させること、ならびに感染症および睡眠時無呼吸のような関連する上気道の状態を予防することができ；ニューロンの破壊および／または随伴症状を軽減すること、消失させること、予防することまたは遅延させることができる。

【0118】

別の例として、遺伝子改変は、過剰増殖性疾患に対する治療的に有効な応答を提供するための治療遺伝子の導入であり得る。特定の実施形態では、過剰増殖性疾患はがんである。治療遺伝子は、例えば、腫瘍抑制遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子であり得る。例示的な治療遺伝子および遺伝子産物としては、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬＩ、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ－１、ＢＤＮＦ、Ｂｅｔａ^＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ－ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ－１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ－１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ－１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ－４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ １、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ ２１（ＮＰＲＬ２）、Ｇｅｎｅ ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ－１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１ ＩＬ－１２、ＩＮＧ１、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、ＩＲＦ－１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ－１（ＨＹＡＬ１）、ＬＵＣＡ－２（ＨＹＡＬ２）、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ－Ｉ、ＭＥＮ－ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ－１、ＮＦ－２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ－３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ ｒａｓ、ＳＥＭ Ａ３、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ－ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ－１、ＹＥＳ、およびｚａｃ１が挙げられる。例示的な有効な遺伝子治療は、腫瘍を抑制することもしくは消失させることができ、がん細胞の数の減少をもたらすことができ、腫瘍サイズを低減させることができ、腫瘍成長を緩徐化することもしくは消失させることができ、または腫瘍によって引き起こされる症状を軽減することなどができる。

【0119】

別の例として、遺伝子改変は、感染性疾患に対する治療的に有効な応答を提供するために選択される治療遺伝子の導入であり得る。特定の実施形態では、感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。治療遺伝子は、例えば、免疫細胞をＨＩＶ感染に対して耐性にする遺伝子、または免疫再構築によって免疫細胞がウイルスを有効に中和できるようにする遺伝子、免疫細胞により発現されるタンパク質をコードする遺伝子の多形、患者において発現されない感染と闘うのに有利な遺伝子、感染性因子、受容体もしくは共受容体をコードする遺伝子；受容体または共受容体のリガンドをコードする遺伝子；ある特定の転写因子の作用を遮断するためのリボザイム、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはデコイＲＮＡをコードする遺伝子を含む、ウイルス複製に不可欠なウイルスおよび細胞遺伝子；ドミナントネガティブウイルスタンパク質、細胞内抗体、イントラカインおよび自殺遺伝子をコードする遺伝子であり得る。例示的な治療遺伝子および遺伝子産物としては、アルファ２ベータ１；アルファｖベータ３；アルファｖベータ５；アルファｖベータ６；ＢＯＢ／ＧＰＲ１５；Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ－３３／ＴＹＭＳＴＲ；ＣＣＲ２；ＣＣＲ３；ＣＣＲ５；ＣＣＲ８；ＣＤ４；ＣＤ４６；ＣＤ５５；ＣＸＣＲ４；アミノペプチダーゼ－Ｎ；ＨＨＶ－７；ＩＣＡＭ；ＩＣＡＭ－１；ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ；ＨｖｅＡ；アルファ－ジストログリカン；ＬＤＬＲ／アルファ２ＭＲ／ＬＲＰ；ＰＶＲ；ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ；およびラミニン受容体が挙げられる。ＨＩＶの処置のための治療有効量は、例えば、ＨＩＶに対する対象の免疫を高めることができ、ＡＩＤＳもしくはＨＩＶに随伴する症状を改善することができ、またはＨＩＶに対する対象の自然もしくは適応免疫応答を誘導することができる。ＨＩＶに対する免疫応答は、抗体産生を含むことができ、ＡＩＤＳの予防をもたらすことができ、ならびに／または対象のＡＩＤＳもしくはＨＩＶ感染の症状を改善することができ、またはＨＩＶの感染力および／もしくは毒性を減少もしくは消失させるこができる。

【0120】

一部の実施形態では、ＨＳＰＣを、目的の抗原に結合する異種抗原認識受容体を発現するように遺伝子操作することができる。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。抗原認識受容体は、腫瘍抗原または病原体抗原に結合することができる。

【0121】

一部の実施形態では、抗原認識受容体は、腫瘍抗原、例えば、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ１Ｘ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ１０４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１４２、ＣＤ４４Ｖ６、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、皮膚リンパ球関連抗原（ＣＬＡ；Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１（ＰＳＧＬ－１）の特殊なグリコフォーム）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシン－プロテインキナーゼｅｒｂ－Ｂ ２、３、４（ｅｒｂ－Ｂ２、３、４）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児型アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－アルファ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒ－アルファ２）、カッパ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、黒色腫抗原ファミリーＡ、１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ムチン１（ＭＵＣ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳ０－１、癌胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、テトラスパニン８（ＴＳＰＡＮ８）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、サイトカイン受容体様因子２（ＣＲＬＦ２）、ＢＣＭＡ、ＧＰＣ３、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、またはＥＲＢＢに結合する。

【0122】

ＨＳＰＣを任意の適する技法によって遺伝子改変することができる。遺伝子改変ＨＳＰＣを調製する方法は、一般に、ＨＳＰＣにポリヌクレオチド（複数可）を導入するステップを含む。所望の分子をコードするポリヌクレオチド（複数可）を、培養前、中または後にＨＳＰＣに導入することができる。所望のポリヌクレオチド含有遺伝子を、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、遺伝子配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクター（例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルス）による感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、微小核細胞融合法、スフェロプラスト融合、ＣＲＩＳＰＲまたは他の稀切断エンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼもしくはＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）の使用、ジンクフィンガー技術などを含む、当技術分野において公知の任意の方法によって、ＨＳＰＣに導入することができる。細胞への外来遺伝子の導入のための非常に多くの技法が公知であり（例えば、Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618, 1993; Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644, 1993; Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92, 1985（全て、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、レシピエント細胞の必須生理的機能が破壊されないことを条件に、そのような技法を使用することができる。技法は、遺伝子が、必要に応じて細胞により発現され、好ましくは、遺伝性であり、その細胞の子孫により発現可能であるような、細胞への遺伝子の安定した移入をもたらすはずである。一部の実施形態では、移入の方法は、選択可能なマーカーまたはタグ配列の細胞への移入を含む。その場合、細胞は選択下に置かれて、移入された遺伝子を取り込んで発現している細胞が単離される。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド（複数可）または遺伝子は、細胞において安定的に発現されることを考慮してレンチウイルスベクターに含められる。
ＨＳＰＣの凍結保存

【0123】

ＨＳＰＣ集団を凍結保存することができる。典型的には、ＨＳＰＣは、封入からの除去後に放出される。用語「凍結された／凍結する（こと）」および「凍結保存された／凍結保存する（こと）」は、本願では同義で使用される。凍結保存は、細胞を生存可能な形態で保存する、当技術分野において公知の任意の方法であり得る。細胞の凍結は、通常は破壊的である。冷却すると、細胞内の水が凍結する。その結果、細胞膜に対する浸透圧効果、細胞脱水、溶質濃縮、および氷晶形成によって傷害が生じる。氷は細胞の外側に形成するので、利用可能な水が溶液から除去され、細胞から抜き取られ、それに起因して浸透圧脱水および溶質濃度の上昇が生じ、最終的に細胞を破壊する。論考については、Mazur, Cryobiology 14:251-272, 1977を参照されたい。

【0124】

これらの有害作用は、（ａ）凍結防止剤の使用、（ｂ）凍結速度の制御、および（ｃ）分解反応を最小限に抑えることができる十分低い温度での保管によって、回避することができる。

【0125】

使用することができる凍結防止剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Lovelock and Bishop, Nature 183:1394-1395, 1959; Ashwood-Smith, Nature 190:1204-1205. 1961）、グリセロール、ポリビニル／ピロリジン（Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci. 85:576, 1960）、ポリエチレングリコール（Sloviter and Ravdin, Nature 196:548, 1962）、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ－エリトリトール、Ｄ－リビトール、Ｄ－マンニトール（Rowe et al., Fed. Proc. 21:157, 1962）、Ｄ－ソルビトール、ｉ－イノシトール、Ｄ－ラクトース、塩化コリン（Bender et al., J. Appl. Physiol. 15:520, 1960）、アミノ酸（Phan The Tran and Bender, Exp. Cell Res. 20:651, 1960）、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート（Lovelock, Biochem. J. 56:265, 1954）、無機塩（Phan The Tran and Bender, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388, 1960；Phan The Tran and Bender, in Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, Ilbery ed., Butterworth, London, p. 59, 1961）、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ５またはＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＤＭＳＯが使用され、この液体は、低濃度で細胞に対して非毒性である。一部の実施形態では、血漿（例えば、２０～２５％の濃度まで）の添加は、ＤＭＳＯの保護効果を増大させることができる。一部の実施形態では、ヒト血清アルブミン（例えば、２～１０％の濃度まで）の添加は、ＤＭＳＯの保護効果を増大させることができる。ＤＭＳＯの添加後は、細胞を凍結するまで０℃で保持するべきである。約１％のＤＭＳＯ濃度は、４℃より上の温度では毒性であるからである。

【0126】

別の例は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、または他の適する細胞凍結培地を含有するＰＢＳの使用を含む。その際、これは、ＤＭＳＯおよびＨＳＡの最終濃度がそれぞれ１０％および４％になるように、培地で１：１希釈される。次いで、細胞は、毎分１°の速度で－８０℃へと凍結され、液体窒素保管タンクの蒸気相内で保管される。

【0127】

制御された緩徐な冷却速度が重要であり得る。異なる凍結防止剤（Rapatz et al., Cryobiology 5(1):18-25, 1968）および異なる細胞型は、異なる最適冷却速度を有する（例えば、骨髄幹細胞の生存に対するおよびそれらの移植可能性に対する冷却速度の影響については、Rowe and Rinfret, Blood 20:636, 1962; Rowe, Cryobiology 3(1):12-18, 1966；Lewis, et al., Transfusion 7(1):17-32, 1967；およびMazur, Science 168:939-949, 1970を参照されたい）。水が氷に変わる融解相の熱を最小限に抑えるべきである。冷却手順は、例えば、プログラム可能な凍結デバイスまたはメタノール浴手順の使用により、行うことができる。

【0128】

プログラム可能な凍結装置は、最適な冷却速度の決定を可能にし、標準的な再現性のある冷却を容易にする。プログラム可能な速度制御されたフリーザー、例えば、ＣｒｙｏｍｅｄまたはＰｌａｎａｒは、凍結レジメンを所望の冷却速度曲線に合わせることを可能にする。例えば、１０％ＤＭＳＯおよび２０％血漿中の骨髄細胞について、最適な速度は、０℃から－８０℃まで１°～３℃／分である。好ましい実施形態では、この冷却速度を使用することができる。細胞を保持する容器は、極低温度で安定していなければならず、凍結および解凍の両方の有効な制御のための迅速な熱伝達が可能ならしめなければならない。密封プラスチックバイアル（例えば、Ｎｕｎｃ、Ｗｈｅａｔｏｎ（商標）Ｃｒｙｕｌｅ（商標）アンプル）またはガラスアンプルを複数の少量（１～２ｍｌ）またはより大量（例えば、５～３０ｍｌ）のために使用することができ、その一方で、より大きい体積（２０～２００ｍｌ）を、冷却中のより良好な熱伝達のために金属プレートの間に保持されたポリオレフィンバッグまたはエチレン酢酸ビニルフリーザーバッグ（例えば、ＯｒｉＧｅｎ）の中で凍結させることができる。例として、骨髄細胞のバッグは、－８０℃のフリーザー内にそれらを置くことによって偶然にもおおよそ３℃／分の冷却速度がもたらされることにより、首尾よく凍結された。

【0129】

代替実施形態では、メタノール浴で冷却する方法を使用することができる。メタノール浴法は、大規模な複数の小さいアイテムの通例の凍結保存によく適している。この方法は、凍結速度の手動制御を必要とせず、速度をモニターするためのレコーダーも必要としない。好ましい実施形態では、ＤＭＳＯ処理細胞は、氷上で予冷され、冷却されたメタノールが入っているトレーに移され、次にそのトレーが－８０℃の機械式冷蔵庫（例えば、ＨａｒｒｉｓまたはＲｅｖｃｏ）内に置かれる。メタノール浴および試料の熱電対測定は、１°～３℃／分の望ましい冷却速度を示す。少なくとも２時間後、検体は、－８０℃の温度に達しており、それらを永久保管のために液体窒素（－１９６℃）に直接入れることができる。

【0130】

完全な凍結の後、ＨＳＰＣ集団を長期冷凍保管容器に迅速に移すことができる。好ましい実施形態では、試料を液体窒素（－１９６℃）またはその蒸気（－１６５℃）内で極低温保管することができる。別の好ましい実施形態では、試料を液体窒素蒸気相（例えば、－１３０℃）内で冷凍保管することができる。そのような保管は、熱漏れおよび窒素喪失が絶対最小限に抑えられるように、極低真空かつ内部超断熱性である大型の魔法瓶容器に似ている高効率液体窒素冷蔵庫を使用できることによって、大いに助長される。

【0131】

適するラッキングシステムが市販されており、それらを個々の検体のカタログ作成、保管および取出しに使用することができる。

【0132】

生存細胞の他の凍結保存方法またはそれらの改良版を利用することができ、使用が想定される（例えば、コールドメタルミラー技法；Livesey and Linner, Nature 327:255, 1987；Linner et al., J. Histochem. Cytochem. 34(9):1123-1135, 1986；またＳｅｎｋａｎらによる米国特許第４，１９９，０２２号、Ｓｃｈｗａｒｔｚによる米国特許第３，７５３，３５７号、Ｆａｈｙによる米国特許第４，５５９，２９８号も参照されたい）。

【0133】

凍結保存細胞または凍結細胞は、好ましくは迅速に（例えば、３７°～４１℃で維持された水浴内で）解凍され、解凍し次第、冷却される。特定の実施形態では、凍結細胞が入っているバイアルをその首まで温水浴に浸漬することができ、穏やかな回転によって、細胞懸濁液は、それが解凍して温水から内部の氷の塊への熱伝達が増加するので、確実に混合されることになる。氷が完全に融解し次第、直ちにバイアルを氷中に置くことができる。

【0134】

ある実施形態では、凍結保存ＨＳＰＣ集団は解凍され、またはその一部分を、それを必要とするヒト患者に注入することができ、もしくは他の細胞型を生成するために使用することができる。解凍された細胞の処理に関する幾つかの手順が利用可能であり、望ましいとみなされる場合にはそのような手順を用いることができる。

【0135】

解凍の際の細胞の凝集を防止するために細胞を処理することが望ましいこともある。凝集を防止するために、凍結前および／または後のＤＮａｓｅの添加（Spitzer et al., Cancer 45:3075-3085, 1980）、低分子量デキストランおよびクエン酸塩、ヒドロキシエチルデンプン（Stiff et al., Cryobiology 20:17-24, 1983）などを含むがこれらに限定されない、様々な手順を使用することができる。

【0136】

凍結防止剤は、ヒトにおいて毒性である場合、凍結ＨＳＰＣ集団の治療上の使用の前に除去すべきである。凍結保存剤としてＤＭＳＯを用いる実施形態では、細胞の損失を回避するためにこのステップを割愛することが好ましい。しかし、凍結防止剤の除去が所望される場合、除去は、好ましくは、解凍の際に遂行される。

【0137】

凍結防止剤を除去する１つの方法は、わずかな濃度への希釈による方法である。この希釈は、培地の添加、続いて、必要に応じて、細胞をペレット化するための１または複数の遠心分離サイクル、上清の除去、および細胞の再懸濁によって遂行することができる。例えば、解凍された細胞中の細胞内ＤＭＳＯを、回収された細胞に悪影響を及ぼさないレベル（１％未満）に低下させることができる。この低下は、ＤＭＳＯ除去中に生じる、潜在的に損傷を与える浸透圧勾配を最小限に抑えるために好ましくは緩徐に行われる。

【0138】

凍結防止剤の除去後、細胞計数（例えば、血球計の使用による）および生存率試験（例えば、トリパンブルー排除による；Kuchler, in Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa., pp. 18-19, 1977；Methods in Medical Research, Eisen et al., eds., Vol. 10, Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, pp. 39-47, 1964）を行って、細胞生存を確認することができる。抗原（例えば、ＣＤ５６）陽性の生存細胞のパーセンテージは、細胞のアリコート内の７－ＡＡＤ（または生存細胞により排除される他の適する色素）を排除する抗原陽性細胞の数を計算し、細胞のアリコート内の有核細胞（ＴＮＣ）（生存細胞と非生存細胞の両方）の総数で割ることによって決定することができる。次いで、抗原陽性の生存細胞の数を、抗原陽性の生存細胞のパーセンテージにＴＮＣを掛けることによって決定することができる。

【0139】

凍結保存前および／または解凍後に、有核細胞の総数、または特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋および／もしくはＣＤ１３３^＋細胞の総数を、決定することができる。例えば、全有核細胞計数は、血球計の使用およびトリパンブルー色素の排除によって行うことができる。細胞充実度が高い検体は、手作業での計数に適切な濃度範囲に希釈することができる。産物の最終細胞計数値は、任意の希釈倍率について補正される。総有核細胞計数値＝（ｍＬ当たりの生存有核細胞）×（ｍｌでの産物の体積）。試料中のＣＤ３４^＋陽性細胞の数は、例えば、蛍光色素とコンジュゲートした抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーの使用により、決定することができる。同様に、試料中のＣＤ１３３^＋陽性細胞の数は、例えば、蛍光色素とコンジュゲートした抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーの使用により、決定することができる。

【実施例】

【0140】

（実施例１）
封入ＨＳＰＣ集団の生成
以下の実施例は、封入ＨＳＰＣ集団の調製を説明する。

【0141】

必要とした機器：ＢｕｃｈｉエンカプスレータＢ－３９５ Ｐｒｏ。
必要とした材料：

【0142】

ａ．アルギン酸Ｎａ溶液。１～おおよそ３％（ｗ／ｖ）アルギン酸Ｎａ（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ）滅菌濾過溶液、室温でｐＨ７．０～７．４。アルギン酸Ｎａを細胞と混合し、細胞を封入しているアルギン酸Ｃａビーズを形成した。

【0143】

ｂ１．アルギネート／ポリリシン（ＡＬＧ／ＰＬＬ）ヒドロゲルのための硬化（ゲル化）溶液：１０ｍＭ ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸（Morpholinopropanesulfomic acid）、Ｆｉｓｈｅｒ）；１００ｍＭ ＣａＣｌ_２（二水和物、Ｓｉｇｍａ）、０．０１％～おおよそ０．１％ポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ、Ｓｉｇｍａ）、室温でｐＨ７．４。

【0144】

ｂ２．アルギネート（ＡＬＧ）ヒドロゲルのための硬化（ゲル化）溶液：１０ｍＭ ＭＯＰＳ；１００ｍＭ ＣａＣｌ_２（二水和物、Ｓｉｇｍａ）；室温でｐＨ７．４。

【0145】

ｃ．１％～おおよそ３％アルギン酸Ｎａ溶液。１１８ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液中の２ｍＬの１．８％アルギン酸Ｎａ溶液。ゲル化溶液がアルギン酸Ｎａと反応して、Ｃａ／ＰＬＬ－アルギネートダブルネットワークビーズを形成する。

【0146】

ｄ．Ｃａ－可溶化溶液。５０ｍＭクエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）；０．４５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌまたは５０ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＭＯＰＳ 室温でｐＨ７．４。この溶液は、ビーズ内のアルギン酸Ｃａ網目構造を可溶化して非平衡アルギネートを放出する。

【0147】

ｅ．ＭＯＰＳ（洗浄）緩衝液：１０ｍＭ ＭＯＰＳ ０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ）。ｐＨを室温で７．４に調整。（ＭＯＰＳ洗浄ステップは、必要に応じたものであり、各生成ステップ後にカプセルを洗浄して未反応成分を除去するために使用する。この緩衝液は、生理条件を維持するのにも役立つ）。

【0148】

ｆ．必要体積：以下の体積を、ヒト細胞を１０^４～１０^７細胞／ｍＬの濃度で含有する１２ｍＬのアルギネート－ＰＬＬマイクロカプセルを生成する際に必要とした。注記：全ての非滅菌溶液は、カプセル生成中に密閉反応容器に送達されることになる場合、滅菌状態を維持するために０．２μｍ液体フィルター膜に通した（濾過した）。

【0149】

１． １２ｍＬの１．８％滅菌アルギネート溶液。
２． ２５０ｍＬの硬化溶液（非滅菌）
３． １０００ｍＬのＭＯＰＳ洗浄緩衝液（非滅菌）
４． ２００ｍＬの可溶化溶液（非滅菌）

【0150】

ｇ．富化ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣは、プールされた臍帯血ユニットから、米国特許出願公開第２０１３／００９５０７９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように調製した。一般に、少なくとも２または４臍帯血ユニットからＣＤ３４^＋細胞を、ＣＤ３４^＋細胞について富化前または後のどちらかでプールした。
例示的なステップ：

【0151】

アルギネート－ポリ－Ｌ－リシン（ＡＬＧ／ＰＬＬ）ヒドロゲルの調製を下に記載する。ポリリシンを有さないアルギネートヒドロゲルは、上記のｂ１の代わりに硬化溶液ｂ２を使用して、下記のように調製することができる。

【0152】

１． 下に記載するような、７５０μｍノズルが適所に付いており、７０％アルコールを有するスプレーが付いている容器（container）（例えば、２Ｌガラス容器（vessel））を用意した。

【0153】

２． 全ての溶液および実験器具を準備した。

【0154】

３． ２００ｍＬの硬化溶液（ｂ１）を、耐圧瓶を使用してオートクレーブ処理済みの反応容器にポンプで送り込んだ。硬化溶液を、反応容器に入れる前に、オートクレーブ処理済みの液体フィルターにポンプで送って通すことによって滅菌した。

【0155】

４． 反応容器を層状空気流キャビネット下に置いた。

【0156】

５． １×１０^４～１×１０^７細胞／ｍＬの濃度の細胞の培養物を層流キャビネット下で調製した。細胞を遠心分離し、上清をデカントし、ペレットを２ｍＬの滅菌ＭＯＰＳ洗浄緩衝液に再懸濁させた。滅菌２５ｍＬピペットを使用して、１０ｍＬの１．８％アルギン酸ナトリウム溶液を再懸濁細胞に添加した。溶液を、２５ｍｌピペットに２回、再吸引することによって混合した。再懸濁および混合中に気泡が全くまたは殆ど導入されなかったことを確認した。滅菌２０ｍｌシリンジを、オートクレーブ処理済み長さ１５ｃｍシリコーン管（内径３ｍｍ）に取り付けた。この管を使用して細胞をシリンジに輸送し、その後、管を取り外した。シリンジに細胞－アルギネート懸濁液を充填し、シリンジを反応容器の上のビーズ生成ユニットに取り付けた。反応容器をエンカプスレータ制御ユニットに固定し、それをベンチの上に（層流キャビネット内ではなく）置いた。

【0157】

６． バイパスカップをノズルの真下に配置して、アルギネートがゲル化溶液に望ましくなく入ることを一切防止した。

【0158】

７． マグネチックスターラーのスイッチを入れた。

【0159】

８． ビーズ形成を、次のパラメーターを用いて開始した：ノズルサイズ：７５０μｍ；攪拌速度：３０％；振動数：３００Ｈｚ、電圧１０００Ｖ；およびシリンジポンプ速度３５ｍＬ／分。アルギネート液滴の安定した液滴鎖が確立されたら、バイパスカップをノズルの下から除去し、液滴を攪拌された硬化溶液に入らせた。（注記：全てのアルギネート溶液がシリンジを通してポンプで送られる直前に、バイパスカップをもう１度ノズルの下に配置した）。

【0160】

９． 液滴を硬化溶液浴中で１０分間放置して硬化させてＣａ／ＰＬＬ－アルギネートおよびＣａ／ＡＬＧビーズを形成し、次いで、ゲル化溶液を排液した。注記：ビーズ、およびその後、カプセルには、凝集を防止するために少量の液体で常に覆っておくべきであり、そうしなければ、ビーズおよびカプセルの再懸濁は困難であり得、膜が損傷する可能性がある。

【0161】

１０． ２００ｍＬのＭＯＰＳ緩衝液をポンプで送り込み、１分間攪拌し、次いで緩衝液を流出させた。洗浄ステップをもう１度繰り返した。

【0162】

１１． １５０ｍＬのＣａ－可溶化溶液をポンプで送り込み、おおよそ１０分攪拌してアルギネート／Ｃａ_２ ^＋網目構造を溶解した。適切な溶解時間は、アルギネートの分子量および純度、ならびに解重合溶液に対する封入細胞の感受性に依存した。（可溶化プロセスは、単独でのＡＬＧ群には必要とされない）。

【0163】

１２． 解重合溶液を流出させた。

【0164】

１３． １５０ｍＬのＭＯＰＳ洗浄緩衝液をポンプで送り込み、カプセルを再懸濁させ、ビーズ収集フラスコに移した。

【0165】

１４． 洗浄緩衝液を培養培地で置き換えた。

【0166】

１５． カプセルをフラスコまたはバイオリアクターに無菌で移して細胞を拡大させた。
（実施例２）
封入ＨＳＰＣ集団の生成

【0167】

以下の実施例は、封入ＨＳＰＣ集団の調製を記載する。

【0168】

必要とした機器：ＢｕｃｈｉエンカプスレータＢ－３９５ Ｐｒｏ。
必要とした材料：

【0169】

ａ．アルギネート（ＡＬＧ）ゲル化溶液：１．５％アルギネート－ＵＰ ＬＶＧを、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－６および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を補充したＳＦＥＭ ＩＩ培地中で調製し、０．２μｍボトルトップフィルターを使用して濾過した。３０ｍＬの体積をこの実験のために調製し、使用時まで４～８℃で保管した。

【0170】

ｂ．塩化カルシウム硬化溶液：２．５％ＣａＣｌ_２溶液を、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水を使用して調製し、０．２μｍボトルトップフィルターを使用して濾過した。５００ｍＬの体積を調製し、使用時まで室温で保管した。

【0171】

ｃ．塩化カルシウム＋ポリ－Ｌ－リシン硬化溶液：２．５％ＣａＣｌ_２および０．０１％ポリ－Ｌ－リシン溶液を、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水を使用して調製し、０．２μｍボトルトップフィルターを使用して濾過した。５００ｍｌの体積を調製し、使用時まで４～８℃で保管した。

【0172】

ｄ．１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液：０．８５ｇのＮａＣｌをＭｉｌｌｉ Ｑ水に溶解し、０．２μｍボトルトップフィルターを使用して濾過した。１Ｌの体積を調製し、使用時まで室温で保管した。

【0173】

ｅ．５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液：１００ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液および０．４３ｇのＮａＣｌを、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水を使用して希釈して１Ｌの最終体積にした。この溶液を、０．２μｍボトルトップフィルターを使用して濾過し、使用時まで４～８℃で保管した。

【0174】

ｆ．溶解溶液：１００ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡおよび０．８５ｇのＮａＣｌを、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－６および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３を補充したＳＦＥＭ ＩＩ培地を使用して希釈して１Ｌの最終体積にした。この溶液を、０．２μｍボトルトップフィルターを使用して濾過し、使用時まで４～８℃で保管した。

【0175】

ｇ．富化ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣは、プールされた臍帯血ユニットから、米国特許出願公開第２０１３／００９５０７９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように調製した。一般に、少なくとも２または４臍帯血ユニットからＣＤ３４^＋細胞を、ＣＤ３４^＋細胞について富化前または後のどちらかでプールした。
例示的なステップ：

【0176】

プールされた臍帯血ユニットから富化したＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＦｌｔ３－Ｌ、ｒｈＩＬ－６および１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－３を補充したＳＦＥＭ ＩＩ培地に再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ_２および周囲Ｏ_２に設定したインキュベーターにおいて一晩培養した。

【0177】

封入に備えて、一晩培養した細胞を採取し、次いで１．５％アルギネートゲル化溶液に５×１０^５細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。ＢＵＣＨＩエンカプスレータに７５０μｍノズルを装着し、下記の設定を使用して始動した。

【表8-1】

【表8-2】

【0178】

２００ｍＬの塩化カルシウム硬化溶液または塩化カルシウム＋ポリ－Ｌ－リシン硬化溶液のどちらかを、エンカプスレータの下の捕捉容器に添加した。これらの溶液は、それぞれＡＬＧと架橋して、ＡＬＧまたはＡＬＧ＋ＰＬＬマイクロカプセルそれぞれの中に細胞を封入する。アルギネート溶液中の細胞懸濁液をシリンジ内に引き込み、ビーズ生成ユニットに入れた。シリンジポンプを起動し、硬化溶液が入っている容器に１０分にわたってビーズを収集した。次いで、硬化溶液を容器から、排液弁を解放することによって排液し、封入細胞のカプセルは中に残した。次いで、ＡＬＧマイクロカプセルを０．８５％ＮａＣｌ溶液で５分間洗浄し、その一方でＡＬＧ＋ＰＬＬマイクロカプセルを１５０ｍＬのＥＤＴＡ溶液で洗浄してＣａＣｌ_２／ＰＬＬ網目構造を溶解した。洗浄溶液を吸引した後、カプセルを数分間、滅菌ボトルの２００ｍＬのＰＢＳ溶液に移した。これの後、ＰＢＳ溶液を吸引し、カプセルを培養のために拡大培地に再懸濁させた。
（実施例３）
封入ＨＳＰＣの培養

【0179】

培養培地は、各々５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＳＣＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ｒｈＦｌｔ３－リガンド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ｒｈＴＰＯ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、およびｒｈＩＬ－６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ならびに１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ ＩＩ；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなった。

【0180】

ＡＬＧマイクロカプセルまたはＡＬＧ＋ＰＬＬマイクロカプセルのどちらかに封入された細胞を、Ｔフラスコなどの静的培養容器内、または回転を２ｒｐｍに設定したローラーボトル（動的培養）内のどちらかの培養培地において培養した。１４日間、培養を維持し、培養継続期間中に少なくとも１回は完全培地交換を行った。

【0181】

培養時間経過後、マイクロカプセルを適切な滅菌遠心分離管に移し、沈降させた。次いで、培養培地を吸引し、残留カプセルをＰＢＳ溶液で洗浄した。次いで、カプセルを溶解溶液に再懸濁させ、１０分間、ローテータにかけて細胞をマイクロカプセルから放出した。次いで、細胞混合物を７０μｍセルストレーナーで濾過してアルギネートカプセルの残屑を除去した。次いで、溶出物（elute）中の細胞を遠心分離し、所望の培地または緩衝液に再懸濁させた。
（実施例４）
２Ｄ培養システムと３Ｄ培養システムの比較

【0182】

臍帯血ＨＳＰＣの拡大について、５つの成長因子（ＳＣＦ、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ－３およびＩＬ－６）を補充したＳＦＥＭＩＩ培地での１４日の培養中に、２Ｄ培養システム（ＮｏｔｃｈリガンドＤＸＩを使用する）で有意な拡大が観察された。比較して、ＣＤ３４^＋細胞およびＨＳＣの拡大が、単独でのアルギネート（ＡＬＧ）、静置形式の（組織培養処理Ｔフラスコ（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ細胞培養フラスコＴ－２５およびＴ－７５細胞培養フラスコ）での）ＡＬＧ／ＰＬＬ、および５００ｍＬローラーボトル（ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ）でのＡＬＧ／ＰＬＬという、３Ｄ培養の３つのバージョンで観察された。図１に示すように、この観察は、全有核細胞（ＴＮＣ）、ＣＤ３４^＋集団ならびにＨＳＣおよびＭＰＰ集団（Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋／－細胞）に当てはまった。

【0183】

表１に示すように、ＣＤ３４^＋集団の有意な喪失が２Ｄ培養システム（Ｎｏｔｃｈリガンド、ＤＸＩを使用する）で観察された。（２Ｄ培養システムは、一般に、米国特許出願公開第２０１３／００９５０７９号に記載されているように行った。その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。対照的に、３Ｄ培養システム（実施例２で説明した通り）は、ＣＤ３４^＋集団を有意に保存した。加えて、３Ｄアルギネート－ポリ－Ｌ－リシンマトリックス（３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ）培養でのＨＳＰＣの培養は、ポリ－Ｌ－リシンを伴わないアルギネートマトリックス（３Ｄ ＡＬＧ）より有意に大きいＣＤ３４^＋集団を示した。より重要なこととして、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養システムからの細胞は、未培養のＨＳＰＣに匹敵するかまたはそれより高い、ＨＳＰＣ集団のはるかに高い頻度を示した。

【0184】

３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬシステムはまた、１４日後にＨＳＰＣの系統分化を最小限に抑えていた。下記の表１に示すように、２Ｄ Ｎｏｔｃｈプラットフォームで培養した場合、培養細胞による系統マーカーの有意な発現が、培養１４日後に観察された。対照的に、３Ｄ培養プラットフォーム（３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ）は、１４日目に最小限に抑えられた系統分化を示した。

【0185】

表1:培養前(0日目(D0)および未培養)に収集した細胞試料、ならびに14日間、次の形式:2D+Notch培養;3D ALGおよび3D ALG+PLL 静置フラスコ;ならびに3D ALG+PLL ローラーボトルで培養した細胞試料における、全CD34⁺細胞、CD34⁺前駆体、およびHSC/MPP、およびCD34^-系統⁺細胞の頻度。

【表1】

【0186】

ＣＦＣアッセイは、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養からの採取細胞のコロニー形成機能の保持を確実にした。図２に示すように、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養から採取した細胞は、良好かつ未培養細胞に匹敵する機能を示した。

【0187】

各群からの細胞のｉｎ ｖｉｖｏ生着能力も調査した。各群からの異なる数の細胞を放射線照射ＮＳＧマウスに注入した：１．モック：細胞０個；２．未培養：マウス１匹当たりＴＮＣ １００，０００個；３．２Ｄ Ｎｏｔｃｈ（ＤＸＩ）：マウス１匹当たりＴＮＣ １００，０００、５００，０００および７，３００，０００個；４．３Ｄ ＡＬＧ単独：マウス１匹当たりＴＮＣ １００，０００個；５．３Ｄ ＡＬＧ／ＰＬＬ 静置：マウス１匹当たりＴＮＣ １００，０００個；６．３Ｄ ＡＬＧ／ＰＬＬ ローラーボトル：マウス１匹当たりＴＮＣ １００，０００個。骨髄および末梢血試料を４、８、１２、１６、２２および２３週目に分析して、レシピエントマウスにおける生着および造血再構成についての潜在性を判定した。

【0188】

骨髄の分析について、表２に提示するように、最高の全ヒト生着が４週目に未培養群で観察された。同時に、および同数の注入細胞を用いて、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ群もまた高い全ヒト生着（％ヒトＣＤ４５^＋（ｈＣＤ４５^＋））を示した。対照的に、同数の注入細胞を用いて、３Ｄ ＡＬＧ単独群および２Ｄ Ｎｏｔｃｈ群は、４週目に、よりいっそう限られた全生着を示した。注入細胞数の増加に伴ってより高度な全生着が２Ｄ Ｎｏｔｃｈ群から観察された。全ての陽性生着群（ヒトキメリズム＞０．１％）において、より深い分析は、再増殖細胞の大多数が骨髄系表現型（ＣＤ３３^＋）を有すること、およびＨＳＣ集団を見出すことができることを示した。

【0189】

表2:最初の移植から4週間後のマウス骨髄におけるヒト生着(%hCD45)、ヒト骨髄系集団(CD45⁺CD33⁺)およびヒトHSPCの亜集団(HSC/MPP:Lin^-CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD133⁺CD90^+/-;前駆体:Lin^-CD34⁺CD38⁺/Lin^-CD34⁺CD38^-CD45RA⁺)のレベルを示す。各群についての個々のマウスからのデータを平均する:N=マウス5匹/群。

【表2-1】

【表2-2】

【0190】

末梢血分析について、４、８、１２、１６および２２週目に、４週目での骨髄分析と同様の観察結果が認められた。表３に示すように、ヒトキメリズムのより高い部分が未培養および３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ群で観察された。ヒト細胞間で、異なる系統が末梢血において検出された。１２および２２週目に、表４および５にそれぞれ示すように、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ群ならびに未培養細胞は、最高のヒト細胞キメリズムを示した。４週目とは異なり、１２週目に有意なＢ細胞集団（ＣＤ２０^＋細胞）が観察された。

【0191】

表3:最初の移植から4週間後のマウス血液におけるヒト生着(%hCD45)およびヒト系統亜集団のレベルを示す。各群についての個々のマウスからのデータを平均した:N=マウス5匹/群。

【表3】

【0192】

表4:最初の移植から12週間後のマウス血液におけるヒト生着(%hCD45)およびヒト系統亜集団のレベルを示す。各群についての個々のマウスからのデータを平均した:N=マウス5匹/群。

【表4】

【0193】

全ての群からの未培養および拡大細胞の長期生着を２２週目に評価した。表５に示すように、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ 静置およびローラーボトル培養細胞は、２２週目に未培養ＣＤ３４^＋細胞に匹敵するレベルの長期および多系統生着を実証した。最高用量で注入した２Ｄ Ｎｏｔｃｈ拡大細胞もまた、より低レベルでだが長期の多系統生着を実証した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞発生が２２週目までに有意に増加され、その結果、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に起因して、最高生着レベル（未培養細胞、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ 静置およびローラーボトルならびに最高用量の２Ｄ Ｎｏｔｃｈ拡大細胞）群内の一部のマウスを失った。長期生着は、残りの群（３Ｄ ＡＬＧおよびより低用量の２Ｄ Ｎｏｔｃｈ拡大細胞）では観察されなかった。

【0194】

表5:最初の移植から22週間後のマウス血液におけるヒト生着(%hCD45)およびヒト系統亜集団のレベルを示す。各群についての個々のマウスからのデータを平均した:未培養細胞(N=マウス4匹)、3D ALG+PLL ローラーボトル(N=マウス3匹)を除いて、全ての群についてN=マウス5匹。

【表5】

【0195】

マウスを２３週目に屠殺し、骨髄試料を用いて最終免疫表現型判定分析を行った。表６に提示するように、２２週目に末梢血における生着を示した群のみが、骨髄においても生着を示した。２３週目に最高全ヒト生着が、ヒトキメリズム５９％である３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ 静置群において観察された。未処置ＣＤ３４^＋細胞を注入したマウスも高レベルの生着（４６％ｈＣＤ４５^＋）を示し、これに、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ（ローラーボトル；３９％ｈＣＤ４５^＋）、２Ｄ Ｎｏｔｃｈ（３３％ｈＣＤ４５^＋）、および３Ｄ ＡＬＧ（３．７％ｈＣＤ４５^＋）で１４日間拡大した細胞を注入したマウスが続いた。上記の群の全てにおいて、ＨＳＰＣを示すＣＤ３４^＋細胞の明確に異なる集団が検出された。

【0196】

表6:最初の移植後23週のマウス骨髄におけるヒト生着(%hCD45)、ならびにヒトHSPC(CD34⁺)ならびに拘束T細胞、B細胞、NK細胞、単球および好中球(系統⁺)の亜集団のレベルを示す。各群についての個々のマウスからのデータを平均する:未培養細胞(N=マウス4匹)、3D ALG+PLL ローラーボトル(N=マウス3匹)を除いて、全ての群についてN=マウス5匹。

【表6】

【0197】

この評価では、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養は、１４日間のｅｘ ｖｉｖｏ培養後に臍帯血由来のＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの若干の拡大を支援し、系統拘束細胞への分化を阻害したが、未培養富化ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣに匹敵するレベルでのＮＳＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏコロニー形成およびｉｎ ｖｉｖｏ長期生着からも明らかなように、拡大ＨＳＰＣは、それらの機能的能力を保持した。
（実施例５）
成人末梢血ＨＳＰＣを拡大するための３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養システムの使用

【0198】

成人ＨＳＰＣを、健康なドナーから、Ｇ－ＣＳＦ（フィルグラスチム（filgastrim）；１６μｇ／ｋｇ ＢＩＤ；１～６日目）および／またはプレリキサフォル（２４０μｇ／ｋｇ／日；４～６日目）の毎日の投与により彼らの末梢血にＣＤ３４^＋ＨＳＰＣをまず動員することによって調製した。循環ＣＤ３４^＋血液細胞計数値を毎日分析し、ＣＤ３４^＋血液細胞計数値が＞５細胞／μｌであった場合には大容量白血球アフェレーシスを行った。最初の血小板洗浄後、白血球アフェレーシス産物を、標準的な技法（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ３４^＋陽性選択を含む）を使用するＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ細胞単離に付した。

【0199】

富化された成人ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣを、上記の実施例４に記載したような３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養システムと２Ｄ Ｎｏｔｃｈ培養システムの両方を使用して拡大した。加えて、両方のプラットフォームでの成人ＨＳＰＣの培養を、平行してＣＴＳ（商標）ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＨＳＣ拡大培地（ＳｔｅｍＰｒｏ）でも評価した。

【0200】

図３に示すように、富化された成人ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣの１４日間の培養後、全有核細胞（ＴＮＣ）、ＣＤ３４^＋細胞およびＨＳＣ／ＭＰＰ（Ｌｉｎ^－ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋／－細胞）の有意な拡大が、２Ｄ培養システム（ＮｏｔｃｈリガンドＤＸＩを使用する）において観察された。この培養プラットフォームは、表７に示すように培養ＨＳＰＣの系統^＋細胞への最終分化も支持した。

【0201】

比較して、ＴＮＣおよびＣＤ３４^＋細胞の拡大は、より低レベルでだが３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬシステムでも観察された（図３）。上記の実施例４と同様に、３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬシステムは、培養ＨＳＰＣの系統^＋細胞への最終分化の阻害も実証した（表７）。３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬシステムにおけるＨＳＣ／ＭＰＰ細胞集団の拡大は、ＳＦＥＭ ＩＩ培地でのみ達成され、ＳｔｅｍＰｒｏ培養培地では達成されなかった。注目すべきことに、ＳＦＥＭ ＩＩ培養培地は、２Ｄ Ｎｏｔｃｈ培養システムと３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養システムの両方においてＨＳＣ／ＭＰＰ細胞集団の拡大を支援する点でＳｔｅｍＰｒｏ培養培地より優れていた（図３）。表７に示すように、系統^＋細胞への最終分化の阻害は、この１４日ｅｘ ｖｉｖｏ培養中にＳＦＥＭ ＩＩ培地でのみ維持された。

【0202】

４つ全ての培養システムでの培養後の細胞の機能的能力を、実施例４に記載したようなｉｎ ｖｉｔｒｏコロニー形成アッセイによって評価した。３Ｄ ＡＬＧ＋ＰＬＬ培養システムにおいてＳＦＥＭ ＩＩ培養培地で培養した細胞のみが、複能性ＨＳＰＣ表現型を示す、３つ全てのコロニー形態（ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭおよびＣＦＵ－ＧＥＭＭ）を形成する潜在性を保持することができた。残りの培養システムは、拘束前駆体表現型を示す、ＣＦＵ－Ｇ／Ｍ／ＧＭ形態への偏りのあるコロニー形態を示した（図４）。

【0203】

表7.培養前(D0)に収集した細胞試料、ならびに14日間、次の形式:SFEM II培地での2D+Notch培養;StemPro培地での2D+Notch培養;SFEM II培地での3D ALG+PLL培養;およびStemPro培地での3D ALG+PLL培養で培養した細胞試料における、全CD34⁺細胞、複能性HSC/MPP、リンパ系および骨髄系前駆体ならびにCD34^-系統⁺細胞の頻度。

【表7】

【0204】

本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態により範囲が限定されることにならない。実際、本明細書に記載のものに加えて本発明の様々な修飾形態が、上述の説明および添付の図から当業者に明らかになる。そのような修飾形態は、添付の特許請求の範囲に記載の範囲に入るように意図されている。

【0205】

特許、特許出願公開および科学文献をはじめとする様々な刊行物を本明細書に引用しており、これらの刊行物の開示は、あらゆる目的でそれら全体が参照により組み込まれる。

【0206】

例示的な実施形態を例証し、説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなくそれらに様々な変更を加えることができることは理解される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【国際調査報告】