特表 2023-504208 アルカリホスファターゼポリペプチド及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-01

(54)【発明の名称】アルカリホスファターゼポリペプチド及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20230125BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20230125BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230125BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20230125BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230125BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230125BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230125BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20230125BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20230125BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20230125BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20230125BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230125BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230125BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20230125BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20230125BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230125BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230125BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230125BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55 ZNA

C12N9/16 B

C07K19/00

C07K14/47

C07K16/00

C12N15/62 Z

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

A61P19/08

A61P19/10

A61P19/04

A61P21/04

A61P11/00

A61P25/00

A61K38/46

A61K47/02

A61K9/08

A61K47/68

A61P21/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022534699

(86)(22)【出願日】2020-12-09

(85)【翻訳文提出日】2022-07-20

(86)【国際出願番号】 US2020064140

(87)【国際公開番号】W WO2021119218

(87)【国際公開日】2021-06-17

(31)【優先権主張番号】62/945,431

(32)【優先日】2019-12-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503102674

【氏名又は名称】アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ヴォエトリ， ウォルター シー．

(72)【発明者】

【氏名】バラネッロ， マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ブシャール， キース

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050CC05

4B050DD11

4B050EE10

4B050FF11E

4B050FF14E

4B050LL01

4B064AG01

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE06

4B064CE11

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA12

4C076BB02

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076CC01

4C076CC09

4C076CC15

4C076DD23

4C076DD26

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084CA18

4C084DC22

4C084MA17

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA59

4C084ZA94

4C084ZA96

4C084ZA97

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA23

4H045GA26

(57)【要約】

低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）などの骨石灰化障害及びその症状を処置するための、可溶性アルカリホスファターゼ、その変異体、フラグメント、融合タンパク質を含むポリペプチド及びその使用方法が記載される。ポリペプチドは、天然に存在するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に由来する可溶性アルカリホスファターゼ（ｓＡＬＰ）又はそのフラグメントを含む。一態様において、天然に存在するアルカリホスファターゼに対して少なくとも１つの変異を有する組換えアルカリホスファターゼを含むポリペプチドが記載される。変異は、その少なくとも１つの変異のない天然に存在するアルカリホスファターゼに対して少なくとも１つの活性又は薬物動態（ＰＫ）特性を改善し得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

天然に存在するアルカリホスファターゼに対して少なくとも１つの変異を有する組換えアルカリホスファターゼを含むポリペプチドであって、前記変異は、前記少なくとも１つの変異のない前記天然に存在するアルカリホスファターゼに対して少なくとも１つの活性又は薬物動態特性を改善する、ポリペプチド。

【請求項2】

前記天然に存在するアルカリホスファターゼは、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）、生殖系列アルカリホスファターゼ（ＧＡＬＰ）又は腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＬＰ）である、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記ＴＮＳＡＬＰは、哺乳動物ＴＮＳＡＬＰである、請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記哺乳動物ＴＮＳＡＬＰは、ヒト、ゴリラ、マウス、ウサギ、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、オランウータン、ヒヒ、ラット、ウシ、ヤギ又はラマＴＮＳＡＬＰである、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記哺乳動物ＴＮＳＡＬＰは、ヒトＴＮＳＡＬＰである、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

配列番号１のアミノ酸１～４９１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記少なくとも１つの変異は、配列番号１に対するＥ１０８Ｘ、Ｍ３８４Ｘ、Ｌ３８５Ｘ、Ｎ２１３Ｘ及びＮ２８６Ｘからなる群から選択され、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記少なくとも１つの変異は、配列番号１に対するＥ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｑ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｍ３８４Ｒ、Ｌ３８５Ｔ、Ｎ２１３Ｑ及びＮ２８６Ｑからなる群から選択される、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対するＥ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｍ及びＥ１０８Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項８に記載のポリペプチド。

【請求項10】

前記変異は、配列番号１に対するＥ１０８Ｍである、請求項９に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対するＥ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｑ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｍ３８４Ｒ、Ｌ３８５Ｔ、Ｎ２１３Ｑ及びＮ２８６Ｑからなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ又は５つの変異を有する、請求項７～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対するＥ１０８Ｍ、Ｎ２１３Ｑ及びＮ２８６Ｑ変異を有する、請求項１１に記載のポリペプチド。

【請求項13】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対するＥ１０８Ａ変異を有しない、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

前記天然に存在するアルカリホスファターゼは、ＩＡＬＰである、請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項15】

前記ＩＡＬＰは、哺乳動物ＩＡＬＰである、請求項１４に記載のポリペプチド。

【請求項16】

前記哺乳動物ＩＡＬＰは、ゴリラ、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、ラット、ウシ、ヤギ、ラマ又はヒトＩＡＬＰである、請求項１５に記載のポリペプチド。

【請求項17】

前記哺乳動物ＩＡＬＰは、ヒトＩＡＬＰである、請求項１６に記載のポリペプチド。

【請求項18】

配列番号４のアミノ酸１～４８６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１７に記載のポリペプチド。

【請求項19】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＷ２４５Ｘ変異を有し、ここで、Ｘは、異なる種に由来する任意の天然に存在する保存されたアミノ酸である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項20】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＷ２４５Ｒ変異を有する、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項21】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＣ４８１Ｘ変異を有し、ここで、Ｘは、任意の非チオール含有アミノ酸である、請求項１４～２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項22】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＣ４８１Ｇ変異を有する、請求項２１に記載のポリペプチド。

【請求項23】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列アスパラギン－Ｘ－Ｚを含むコンセンサスＮ結合型グリコシル化部位に変異を有し、ここで、Ｘは、Ｐを除く任意のアミノ酸であり、及びＺは、Ｓ又はＴを除く任意のアミノ酸である、請求項１４～２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項24】

前記アスパラギン部位は、グルタミン残基に変異されている、請求項２３に記載のポリペプチド。

【請求項25】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＳ４２９Ｑ、Ｓ４２９Ｈ、Ｓ４２９Ｅ及びＳ４２９Ｄからなる群から選択される変異を有する、請求項１４～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項26】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＳ４２９Ｈ変異を有する、請求項２５に記載のポリペプチド。

【請求項27】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＳ４２８Ｒ、Ｓ４２８Ｑ及びＳ４２８Ｄからなる群から選択される変異を有する、請求項１４～２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項28】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＳ４２８Ｑ又はＳ４２８Ｄ変異を有する、請求項２７に記載のポリペプチド。

【請求項29】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列の少なくとも５０アミノ酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項30】

前記少なくとも１つの活性は、増加した触媒活性、増加した温度安定性、増加した亜鉛結合、亜鉛枯渇バッファーにおける活性の維持、ｐＨ５．０～７．５における活性の維持、減少した二量体化、減少した凝集及び増加した製造可能性からなる群から選択される、請求項１～２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項31】

前記増加した触媒活性は、ピリドキサール５－リン酸及び／又はピロリン酸の増加した加水分解を含む、請求項３０に記載のポリペプチド。

【請求項32】

前記増加した触媒活性は、前記天然に存在するアルカリホスファターゼの活性よりも約４倍～約３０倍良好である、請求項３０又は３１に記載のポリペプチド。

【請求項33】

前記少なくとも１つの薬物動態特性は、増加した基質特異性、天然基質に対する増加した活性、人工基質に対する増加した活性、天然基質のための減少したＫｍ及び用量あたりの増加した曲線下面積（ＡＵＣ）からなる群から選択される、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項34】

前記人工基質は、リン酸ウンベリフェリル、リン酸パラニトロフェニル（ｐＮＰＰ）及びＭＵＰからなる群から選択され；及び／又は前記天然基質は、ピリドキサール－５’－リン酸、ＰＬＰ及びＰＥＡからなる群から選択される、請求項３３に記載のポリペプチド。

【請求項35】

領域Ｙをさらに含み、ここで、Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列である、請求項１～３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項36】

構造
Ｚ－ＡＬＰ－Ｙ－Ｘｎ
（式中、
Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｚは、不存在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；
Ｘｎは、ポリアスパラギン酸（Ｄｎ）、ポリグルタミン酸（Ｅｎ）、ポリ（アスパラギン酸－アラニン－アスパラギン酸）（ＤＡＤ）ｎ、ポリ（アスパラギン酸－アスパラギン酸－セリン）（ＤＤＳ）ｎ、ポリ（アスパラギン酸－セリン－セリン（ＤＳＳ）ｎ、ポリ（グルタミン酸－グルタミン酸－セリン）（ＥＥＳ）ｎ及びＶＨＨからなる群から選択される骨標的化部分であり、且つｎ＝１～５０であり；及び
ＡＬＰは、前記組換えアルカリホスファターゼである）
を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項37】

Ｙは、フラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ）である、請求項３５又は３６に記載のポリペプチド。

【請求項38】

前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はそれらのキメラを含む、請求項３７に記載のポリペプチド。

【請求項39】

前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２／４キメラを含む、請求項３８に記載のポリペプチド。

【請求項40】

前記Ｆｃ領域は、配列番号２５３の配列を含むか、又はそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項３９に記載のポリペプチド。

【請求項41】

配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４０に記載のポリペプチド。

【請求項42】

配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４１に記載のポリペプチド。

【請求項43】

配列番号７２、１２３、１５５又は１７７のいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４１に記載のポリペプチド。

【請求項44】

配列番号７２、１２３、１５５又は１７７のいずれか１つの配列を含むか又はそれからなる、請求項４３に記載のポリペプチド。

【請求項45】

配列番号１２３に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４３に記載のポリペプチド。

【請求項46】

配列番号１２３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４５に記載のポリペプチド。

【請求項47】

配列番号１２３のアミノ酸配列からなる、請求項４６に記載のポリペプチド。

【請求項48】

二量体である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項49】

アルカリホスファターゼ及びフラグメント結晶化（Ｆｃ）領域を含むポリペプチドであって、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２／４キメラである、ポリペプチド。

【請求項50】

前記Ｆｃ領域は、配列番号２５３の配列を含むか、又はそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項４９に記載のポリペプチド。

【請求項51】

前記組換えアルカリホスファターゼは、ＴＮＳＡＬＰ、ＩＡＬＰ、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）及び生殖系列アルカリホスファターゼ（ＧＡＬＰ）からなる群から選択される、請求項４９又は５０に記載のポリペプチド。

【請求項52】

前記組換えアルカリホスファターゼは、哺乳動物アルカリホスファターゼである、請求項５１に記載のポリペプチド。

【請求項53】

前記哺乳動物アルカリホスファターゼは、ヒト、ゴリラ、マウス、ウサギ、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、オランウータン、ヒヒ、ラット、ウシ、ヤギ又はラマアルカリホスファターゼである、請求項５２に記載のポリペプチド。

【請求項54】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１～６のいずれか１つの配列又はそのフラグメントを含む、請求項５３に記載のポリペプチド。

【請求項55】

前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１のアミノ酸１～４９１又は配列番号４のアミノ酸１～４８６を含む、請求項５４に記載のポリペプチド。

【請求項56】

Ｄｎ、Ｅｎ、（ＤＡＤ）ｎ、（ＤＤＳ）ｎ、（ＤＳＳ）ｎ、（ＥＥＳ）ｎ及びＶＨＨからなる群から選択される骨標的化部分Ｘｎをさらに含み、ここで、ｎ＝１～５０である、請求項１～３８又は４９～５５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項57】

ｎ＝１～３０である、請求項５６に記載のポリペプチド。

【請求項58】

前記骨標的化部分は、
（ａ）Ｄｎであり、且つｎ＝７～１０であるか；
（ｂ）Ｅｎであり、且つｎ＝１０～１５であるか；
（ｃ）（ＤＡＤ）ｎであり、且つｎ＝２～４であるか；
（ｄ）（ＤＤＳ）ｎであり、且つｎ＝２～４であるか；
（ｅ）（ＤＳＳ）ｎであり、且つｎ＝３であるか；又は
（ｆ）（ＥＥＳ）ｎであり、且つｎ＝３～４である、請求項５７に記載のポリペプチド。

【請求項59】

前記骨標的化部分は、（ＤＡＤ）_３又は（ＤＤＳ）_３を含む、請求項５８に記載のポリペプチド。

【請求項60】

前記ＶＨＨの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、少なくとも１つのグルタミン酸又はアスパラギン酸残基で置換されている、請求項５６～５９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項61】

前記少なくとも１つのＣＤＲは、２～３０個のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基で置換されている、請求項６０に記載のポリペプチド。

【請求項62】

２つ又は３つのＣＤＲは、２～３０個のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基で置換されている、請求項６０又は６１に記載のポリペプチド。

【請求項63】

前記少なくとも１つのＣＤＲは、５つ又は７つのグルタミン酸又はアスパラギン酸残基で置換されている、請求項６１又は６２に記載のポリペプチド。

【請求項64】

請求項１～６３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項65】

請求項６４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項66】

請求項６４に記載のポリヌクレオチド又は請求項６５に記載のベクターを含む細胞。

【請求項67】

請求項１～６３のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）請求項６４に記載のポリヌクレオチド又は請求項６５に記載のベクターで形質転換された細胞を提供することであって、前記ポリヌクレオチドは、前記細胞内での発現のために配置される、提供すること；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で前記形質転換細胞を培養することであって、前記ポリペプチドの発現をもたらす、培養すること；及び
（ｃ）ポリペプチドを単離すること
を含む方法。

【請求項68】

請求項１～６３のいずれか一項に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項69】

前記薬学的に許容される担体は、塩化ナトリウム及び／又はリン酸ナトリウムを含む、請求項６８に記載の医薬組成物。

【請求項70】

約７．４のｐＨで約１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は約２５ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項６９に記載の医薬組成物。

【請求項71】

約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの投与量で製剤化される、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項72】

約０．１ｍＬ～約５０ｍＬの容量で製剤化される、請求項６８～７１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項73】

低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）、骨折、骨粗鬆症、硬化性骨症、軟骨石灰化症、筋緊張低下症、デュシェンヌ筋ジストロフィー、気管気管支軟化症、発作、神経線維腫症及び頭蓋骨癒合症から選択される疾患の処置を、それを必要としている対象において行う方法であって、前記対象に、請求項１～６３のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項６８～７３のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項74】

前記ポリペプチドは、前記疾患を処置するのに十分な量において且つ期間にわたって投与される、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記処置は、前記対象の骨形成を増強する、請求項７３又は７４に記載の方法。

【請求項76】

前記ポリペプチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記ポリペプチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記ポリペプチドは、１日、１週間、１ヶ月又は１年あたり１回投与される、請求項７３～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記ポリペプチドは、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、１年又はそれを超えて投与される、請求項７３～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記組成物は、皮下、静脈内、筋肉内、舌下、髄腔内又は皮内に投与される、請求項７３～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記組成物は、皮下又は静脈内に投与される、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記対象は、ヒトである、請求項７３～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記ヒトは、新生児、小児、青年又は成人である、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記組換えポリペプチドの投与前に、前記対象は、約３５０メートル以下の６分間の平均歩行距離を有するとして特徴付けられる、請求項７３～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記組換えポリペプチドの投与は、前記対象による６分間の平均歩行距離の少なくとも１００メートル以上の増加を促進する、請求項７３～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記対象は、前記組換えポリペプチドの投与後、６分間で約５００メートル以上の平均歩行距離を示す、請求項７３～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記対象は、前記組換えポリペプチドの投与後、補助移動装置への減少した依存度を示す、請求項７３～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記補助移動装置は、歩行器、車椅子、装具、松葉杖及び矯正器具からなる群から選択される少なくとも１つの装置である、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記組換えポリペプチドの投与前に、前記対象は、約４．５μＭ以上の血漿ＰＰｉ濃度を有するとして特徴付けられる、請求項７３～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記組換えポリペプチドの投与は、前記対象からの血漿サンプル中のＰＰｉ濃度の少なくとも約１μＭの中央値減少を促進する、請求項７３～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記対象は、前記組換えポリペプチドの投与後、約２μＭ～約５μＭの血漿ＰＰｉ濃度を示す、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

ｉ）前記対象は、０～１４日齢であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約９０Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｉｉ）前記対象は、１５日齢～１歳未満であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約１３４Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｉｉｉ）前記対象は、約１歳～１０歳未満であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約１５６Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｉｖ）前記対象は、約１０歳～約１３歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約１４１Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｖ）前記対象は、雌性であり、且つ約１３歳～約１５歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約６２Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｖｉ）前記対象は、雄性であり、且つ約１３歳～約１５歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約１２７Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｖｉｉ）前記対象は、雌性であり、且つ約１５歳～約１７歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約５４Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｖｉｉｉ）前記対象は、雄性であり、且つ約１５歳～約１７歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約８９Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｉｘ）前記対象は、約１７歳以上であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約４８Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；又は
ｘ）前記対象は、約１７歳以上であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与前に、約５９Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられる、請求項７３～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記組換えポリペプチドの投与は、前記対象からの血漿サンプル中のＡＬＰ濃度の少なくとも約１００Ｕ／Ｌ以上の中央値増加を促進する、請求項７３～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

ｉ）前記対象は、０～１４日齢であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約２７３Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｉｉ）前記対象は、１５日齢～１歳未満であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約５１８Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｉｉｉ）前記対象は、約１歳～約１０歳未満であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約３６９Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｉｖ）前記対象は、約１０歳～約１３歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約４６０Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｖ）前記対象は、雌性であり、且つ約１３歳～約１５歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約２８０Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｖｉ）前記対象は、雄性であり、且つ約１３歳～約１５歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約５１７Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｖｉｉ）前記対象は、雌性であり、且つ約１５歳～約１７歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約１２８Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｖｉｉｉ）前記対象は、雄性であり、且つ約１５歳～約１７歳であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約３６５Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；
ｉｘ）前記対象は、雌性であり、且つ約１７歳以上であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約９５Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；又は
ｘ）前記対象は、雄性であり、且つ約１７歳以上であり、且つ前記組換えポリペプチドの投与後、約１６４Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられる、請求項７３～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記組換えポリペプチドの投与前に、前記対象は、約１０以下の平均Ｂｒｕｉｎｉｎｋｓ－Ｏｓｅｒｅｔｓｋｙ運動技能試験第２版（ＢＯＴ－２）強度スコアを有するとして特徴付けられる、請求項７３～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記組換えポリペプチドの投与前に、前記対象は、約５以下の平均ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアを有するとして特徴付けられる、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記組換えポリペプチドの投与は、前記対象の約１０以上の平均ＢＯＴ－２強度スコアをもたらす、請求項７３～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記組換えポリペプチドの投与は、前記対象の約５以上の平均ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアをもたらす、請求項７３～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記組換えポリペプチドの投与前に、前記対象は、約０．８以上の平均小児健康評価質問票（ＣＨＡＱ）指数スコアを有するとして特徴付けられる、請求項７３～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記組換えポリペプチドの投与は、前記対象の約０．５以下の平均ＣＨＡＱ指数スコアをもたらす、請求項７３～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記組換えポリペプチドの投与前に、前記対象は、約４０以下の平均小児転帰データ収集ツール（ＰＯＤＣＩ）スコアを有するとして特徴付けられる、請求項７３～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記組換えポリペプチドの投与は、前記対象の約４０以上の平均ＰＯＤＣＩスコアをもたらす、請求項３～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記組換えポリペプチドの投与前に、前記対象は、約５未満の平均筋力グレードを有するとして特徴付けられる、請求項７３～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記組換えポリペプチドの投与は、前記対象の筋力グレードの約１以上の平均増加をもたらす、請求項７３～１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

前記組換えポリペプチドの投与前に、前記対象は、予測されるＨＨＤ値の約８０％未満の平均ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）値を有するとして特徴付けられる、請求項７３～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記組換えポリペプチドの投与は、前記対象の、予測されるＨＨＤ値の約８０％以上の平均ＨＨＤ値をもたらす、請求項７３～１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記ＨＨＤ値は、前記対象の握力、膝屈曲、膝伸展、股関節屈曲、股関節伸展又は股関節外転を表す、請求項１０５又は１０６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）は、稀な遺伝性の骨格疾患であり、疾患の最も重症な形態では出生１０万人に１人の割合で発症する。この障害は、典型的には、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）をコードする遺伝子の機能喪失型変異に起因する。ＨＰＰは、早期の歯の喪失から子宮内での骨の石灰化のほぼ完全な欠如まで、顕著な範囲の症状及び重症度を示す。ＨＰＰの症状は、患者によって著しく異なり、患者の年齢によっても著しく異なる。ＨＰＰの患者の多くは、骨格の変化、低身長、慢性痛、痛みを伴う下肢、筋力低下、歩行障害及び早期の非外傷性の歯の喪失を示す。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0002】

ＴＮＳＡＬＰの可溶性フラグメントを含む組換え産生酵素補充療法（ＥＲＴ）であるアスフォターゼアルファ（ＳＴＲＥＮＳＩＱ（登録商標）、Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）は、ＨＰＰ患者が利用できる最初のＥＲＴである。アスフォターゼアルファは、骨の石灰化及び密度並びに呼吸及び運動機能、認知発達及び筋力強化によって証明されるように、最も重症のＨＰＰに対して変革効果を示している（Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６：９０４－９１３，２０１２）。アスフォターゼアルファの安全性及び治療上の利点は、実証されているが、特に小児患者の間では、複数の注射レジメンへのコンプライアンスが課題となり得る。週に３～６回の皮下投与による最も一般的な副作用は、注射部位反応（すなわち掻痒、痛み及び紅斑）である。したがって、例えば、投与量及び頻度を減らし、コンプライアンスを高めることにより、生活の質を改善するための改善が望ましいであろう。したがって、ＨＰＰ及び関連する骨石灰化障害を処置するための新しい組成物及び方法は、有益であろう。

【課題を解決するための手段】

【0003】

一態様において、天然に存在するアルカリホスファターゼに対して少なくとも１つの変異を有する組換えアルカリホスファターゼを含むポリペプチドが記載される。変異は、その少なくとも１つの変異のない天然に存在するアルカリホスファターゼに対して少なくとも１つの活性又は薬物動態（ＰＫ）特性を改善し得る。

【0004】

天然に存在するアルカリホスファターゼは、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）、生殖系列アルカリホスファターゼ（ＧＡＬＰ）又は腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＬＰ）であり得る。ＴＮＳＡＬＰは、哺乳動物ＴＮＳＡＬＰ（例えば、ヒト、ゴリラ、マウス、ウサギ、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、オランウータン、ヒヒ、ラット、ウシ、ヤギ又はラマＴＮＳＡＬＰ）であり得る。ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～４９１に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有し得る。

【0005】

少なくとも１つの変異は、配列番号１に対するＥ１０８Ｘ、Ｍ３８４Ｘ、Ｌ３８５Ｘ、Ｎ２１３Ｘ及びＮ２８６Ｘからなる群から選択され得、及びＸは、任意のアミノ酸である。少なくとも１つの変異は、配列番号１に対するＥ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｑ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｍ３８４Ｒ、Ｌ３８５Ｔ、Ｎ２１３Ｑ及びＮ２８６Ｑからなる群から選択され得る。組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対するＥ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｑ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｍ３８４Ｒ、Ｌ３８５Ｔ、Ｎ２１３Ｑ及びＮ２８６Ｑからなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ又は５つの変異を有し得る。例えば、組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対するＥ１０８Ｍ、Ｎ２１３Ｑ及びＮ２８６Ｑ変異を有し得る。組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対するＥ１０８Ａ変異を有しなくてもよい。

【0006】

少なくとも１つの活性又は薬物動態（ＰＫ）特性を改善する、本明細書に記載のＡＬＰにおける少なくとも１つの変異は、酵素の特定の領域内に存在し得る。変異は、アルカリホスファターゼのエクトドメインに存在し得る。例えば、変異は、クラウンドメイン、触媒ドメイン又は二量体化ドメインに存在し得る。変異は、含まれる場合、ＧＰＩアンカードメインに存在し得る。ポリペプチドは、ヒトＴＮＳＡＬＰのアミノ酸１～４９１若しくは１～４８６又はアラインメント及び／又は配列相同性に基づく類似のＡＬＰ位置内に存在する変異を含み得る。例えば、ポリペプチドは、配列番号１に対して、位置１～４９１、１～４８６、２５～４７５、２５～２４０、５０～４００、５０～３５０及び／又は１００～３００内に変異を有し得る。ポリペプチドは、配列番号１に対して、位置１００～１２５、１００～１１０、２００～２２５、２１０～２２０、２７５～３００、２８０～２９０、４２５～４５０及び／又は４２５～４３５内に変異を有し得る。例えば、ポリペプチドは、配列番号１に対して、位置１０８、２１３、２８６及び／又は４２９間に変異を有し得る。特定の実施形態において、変異は、ＡＬＰの配列内にあり、変異は、ＡＬＰのＮ末端ドメイン又はＣ末端ドメインに存在する非天然アミノ酸のストレッチではない。

【0007】

天然に存在するアルカリホスファターゼは、ＩＡＬＰ（例えば、ゴリラ、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、ラット、ウシ、ヤギ、ラマ又はヒトＩＡＬＰなどの哺乳動物ＩＡＬＰ）であり得る。ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１～４８６に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有し得る。組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＷ２４５Ｘ変異を有し得、ここで、Ｘは、異なる種に由来する任意の天然に存在する保存されたアミノ酸である。組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＷ２４５Ｒ変異を有し得る。組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＣ４８１Ｘ変異を有し得、ここで、Ｘは、任意の非チオール含有アミノ酸である。組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＣ４８１Ｇ変異を有し得る。

【0008】

組換えアルカリホスファターゼは、コンセンサスＮ結合型グリコシル化部位に変異を有し得る。コンセンサスＮ結合型グリコシル化部位は、配列アスパラギン－Ｘ－Ｚを有するモチーフを含み、ここで、Ｘは、Ｐを除く任意のアミノ酸であり、及びＺは、Ｓ又はＴを除く任意のアミノ酸である。アスパラギン部位は、グルタミン残基に変異され得る。

【0009】

組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＳ４２９Ｑ、Ｓ４２９Ｈ、Ｓ４２９Ｅ及びＳ４２９Ｄからなる群から選択される変異を有し得る。組換えアルカリホスファターゼは、配列番号４に対するＳ４２８Ｒ、Ｓ４２８Ｑ及びＳ４２８Ｄからなる群から選択される変異を有し得る。

【0010】

組換えアルカリホスファターゼは、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列の少なくとも５０（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又はそれを超える）アミノ酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有し得る。

【0011】

変異によって改善された少なくとも１つの活性は、増加した触媒活性、増加した温度安定性、増加した亜鉛結合、亜鉛枯渇バッファーにおける活性の維持、ｐＨ５．０～７．５における活性の維持、減少した二量体化、減少した凝集及び増加した製造可能性からなる群から選択され得る。増加した触媒活性は、ピリドキサール５－リン酸及び／又はピロリン酸の増加した加水分解を含み得る。増加した触媒活性は、天然に存在するアルカリホスファターゼの活性よりも約２倍～約３０倍良好であり得る。変異によって改善された少なくとも１つのＰＫ特性は、増加した基質特異性、天然基質に対する増加した活性、人工基質に対する増加した活性、天然基質のための減少したＫｍ及び用量あたりの増加した曲線下面積（ＡＵＣ）からなる群から選択され得る。例示的な人工基質は、リン酸４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＰ）、リン酸ウンベリフェロン及びリン酸パラニトロフェニル（ｐＮＰＰ）であり、及び例示的な天然基質は、ピリドキサール－５’－リン酸、ＰＬＰ及びＰＥＡである。

【0012】

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、領域Ｙをさらに含み得、ここで、Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列である。Ｙは、フラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ）であり得る。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はそれらのキメラを含み得る。例えば、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２／４キメラを含み得る。Ｆｃ領域は、配列番号２５３の配列を含み得るか、又はそれに対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有し得る。

【0013】

ポリペプチドは、骨標的化部分をさらに含み得る。ＡＬＰ、骨標的化部分及びＹ領域を含むポリペプチドは、構造Ｚ－ＡＬＰ－Ｙ－Ｘｎを有し得、ここで、Ｙは、少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；Ｚは、不存在であるか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり；Ｘｎは、ポリアスパラギン酸（Ｄｎ）、ポリグルタミン酸（Ｅｎ）、ポリ（アスパラギン酸－アラニン－アスパラギン酸）（ＤＡＤ）ｎ、ポリ（アスパラギン酸－アスパラギン酸－セリン）（ＤＤＳ）ｎ、ポリ（アスパラギン酸－セリン－セリン（ＤＳＳ）ｎ、ポリ（グルタミン酸－グルタミン酸－セリン）（ＥＥＳ）ｎ及びＶＨＨからなる群から選択される骨標的化部分であり、且つｎ＝１～５０であり；ＡＬＰは、組換えアルカリホスファターゼである。

【0014】

ポリペプチドは、構造Ｙ－ＡＬＰ－Ｚ－Ｘｎ又はその任意のトポロジー的配列（例えば、Ｘｎ－Ｙ－ＡＬＰ－Ｚ及びＹ－Ｘｎ－ＡＬＰ－Ｚ）を有し得る。

【0015】

ポリペプチドは、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つ（例えば、配列番号７２、１２３、１５５又は１７７のいずれか１つ）に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。例えば、ポリペプチドは、配列番号７２、１２３、１５５又は１７７のいずれか１つの配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、任意のｓＡＬＰ触媒ドメイン、Ｆｃ ＩｇＧアイソタイプ又は表１に列挙された骨標的化部分及びそれらのトポロジー的配列を含み得る。ポリペプチドは、配列番号１２３に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号１２３を含み得るか又はそれからなり得る。

【0016】

ポリペプチドは、配列番号１７７に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号１７７を含み得るか又はそれからなり得る。

【0017】

ポリペプチドは、配列番号２６０又は２６１に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２６０の配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２６１の配列を含み得るか又はそれからなり得る。

【0018】

ポリペプチドは、分泌シグナルペプチドを含み得る。ポリペプチドは、配列番号２６３又は２６４に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２６３の配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２６４の配列を含み得るか又はそれからなり得る。

【0019】

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、二量体である。代わりに、ポリペプチドは、単量体であり得る。

【0020】

アルカリホスファターゼ及びフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域を含むポリペプチドであって、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２／４キメラである、ポリペプチドも記載される。Ｆｃ領域は、配列番号２５３の配列を含み得るか、又はそれに対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有し得る。組換えアルカリホスファターゼは、ＴＮＳＡＬＰ、ＩＡＬＰ、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）及び生殖系列アルカリホスファターゼ（ＧＡＬＰ）からなる群から選択され得る。組換えアルカリホスファターゼは、哺乳動物アルカリホスファターゼ（例えば、ヒト、ゴリラ、マウス、ウサギ、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、オランウータン、ヒヒ、ラット、ウシ、ヤギ又はラマアルカリホスファターゼ）であり得る。組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１～６のいずれか１つの配列又はそのフラグメントを含み得る。例えば、組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１のアミノ酸１～４９１又は配列番号４のアミノ酸１～４８６を含み得る。

【0021】

上記の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｄｎ、Ｅｎ、（ＤＡＤ）ｎ、（ＤＤＳ）ｎ、（ＤＳＳ）ｎ、（ＥＥＳ）ｎ及びＶＨＨからなる群から選択される骨標的化部分Ｘｎをさらに含み、ここで、ｎ＝１～５０（例えば、１～３０）である。いくつかの特定の実施形態において、骨標的化部分は、ｎ＝７～１０の場合にＤｎ；ｎ＝１０～１５の場合にＥｎ；ｎ＝２～４の場合に（ＤＡＤ）ｎ；ｎ＝２～４の場合に（ＤＤＳ）ｎ；ｎ＝３の場合に（ＤＳＳ）ｎ；又はｎ＝３～４の場合に（ＥＥＳ）ｎであり得る。例えば、骨標的化部分は、（ＤＡＤ）_３又は（ＤＤＳ）_３を含み得る。

【0022】

ＶＨＨ骨標的化部分は、１つ以上の置換を含み得る。例えば、ＶＨＨの少なくとも１つ（例えば、２つ又は３つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、少なくとも１つ（例えば、２～３０個、例えば５又は７つ）のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基で置換され得る。

【0023】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、翻訳後修飾されている（例えば、グリコシル化又はシアル化されている）。

【0024】

上記の態様のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター及びポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞）も記載される。ポリヌクレオチドは、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つ（例えば、配列番号７２、１２３、１５５又は１７７のいずれか１つ）に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６５～２６８のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有し得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６５～２６８のいずれか１つを含み得るか又はそれからなり得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６５を含み得るか又はそれからなり得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６６を含み得るか又はそれからなり得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６７を含み得るか又はそれからなり得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６８を含み得るか又はそれからなり得る。

【0025】

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２６９の配列でないか又はそれを含まない。

【0026】

いくつかの実施形態において、アルカリホスファターゼは、配列番号２６９のアスフォターゼアルファのアルカリホスファターゼ（例えば、アミノ酸１～４８５）を含まない。

【0027】

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２６９のアミノ酸配列を有するポリペプチドではなく、配列番号２６９のアスフォターゼアルファのアルカリホスファターゼ（例えば、アミノ酸１～４８５）を含まない。

【0028】

上記の態様のいずれかのポリペプチドを産生する方法であって、ポリヌクレオチドが細胞内での発現のために配置されるように、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターで形質転換された細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞）を提供すること；ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で形質転換細胞を培養することであって、ポリペプチドの発現をもたらす、培養すること；及びポリペプチドを単離することによる方法も記載される。

【0029】

上記の態様のいずれかのポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物も記載される。薬学的に許容される担体は、塩化ナトリウム及び／又はリン酸ナトリウムを含み得る。組成物は、約７．４のｐＨで約１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は約２５ｍＭのリン酸ナトリウムを含み得る。

【0030】

組成物は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬの投与量で製剤化され得る。組成物は、約０．１ｍＬ～約５０ｍＬ（例えば、約０．１～約１０ｍＬ）の容量で製剤化され得る。

【0031】

別の態様において、低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）、骨折、骨粗鬆症、硬化性骨症、軟骨石灰化症、筋緊張低下症、デュシェンヌ筋ジストロフィー、気管気管支軟化症、発作、神経線維腫症（例えば、ＮＦ－１）、頭蓋骨癒合症又はそれらの１つ以上の症状からなる群から選択される疾患の処置を、それを必要としている対象（例えば、ヒト対象）において行う方法であって、対象に、上記の態様のいずれかのポリペプチド又は医薬組成物を対象に投与することによる方法が記載される。ポリペプチドは、疾患を処置するか又はその１つ以上の症状を緩和するのに十分な量において且つ期間にわたって投与され得る。処置は、対象の骨形成を増強し得る。ポリペプチドは、筋力低下を処置するために使用され得る。

【0032】

ポリペプチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ）の投与量で投与され得る。ポリペプチドは、１日、１週間、１ヶ月又は１年あたり１回（例えば、１週間あたり１回）投与され得る。ポリペプチドは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／週～約２０ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ／週～約１０ｍｇ／ｋｇ／週）の投与量で投与され得る。ポリペプチドは、少なくとも１日、１週間、１ヶ月、１年又はそれを超えて投与され得る。

【0033】

ポリペプチドは、皮下、静脈内、筋肉内、舌下、髄腔内又は皮内に投与され得る。特に、ポリペプチド又はポリペプチド含有組成物は、皮下投与によって投与され得る。

【0034】

対象は、新生児、子供、青年又は成人などのヒト対象であり得る。

【0035】

組換えポリペプチドの投与前に、対象は、約３５０メートル以下の６分間の平均歩行距離を有するとして特徴付けられ得る。組換えポリペプチドの投与は、対象による６分間の平均歩行距離の少なくとも１００メートル以上の増加を促進し得る。対象は、組換えポリペプチドの投与後（例えば、１ヶ月～１年の処置期間後）、６分間で約５００メートル以上の平均歩行距離を示し得る。

【0036】

対象は、組換えポリペプチドの投与後、補助移動装置（例えば、歩行器、車椅子、装具、松葉杖及び矯正器具）への減少した依存度を示し得る。

【0037】

組換えポリペプチドの投与前に、対象は、約４．５μＭ以上の血漿ＰＰｉ濃度を有するとして特徴付けられ得る。組換えポリペプチドの投与は、対象からの血漿サンプル中のＰＰｉ濃度の少なくとも約１μＭの中央値減少を促進し得る。対象は、組換えポリペプチドの投与後、約２μＭ～約５μＭの血漿ＰＰｉ濃度を示し得る。

【0038】

いくつかの実施形態において、対象は、０～１４日齢であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約９０Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、１５日齢～１歳未満であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約１３４Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、約１歳～１０歳未満であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約１５６Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、約１０歳～約１３歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約１４１Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、雌性であり、且つ約１３歳～約１５歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約６２Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、雄性であり、且つ約１３歳～約１５歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約１２７Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、雌性であり、且つ約１５歳～約１７歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約５４Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、雄性であり、且つ約１５歳～約１７歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約８９Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、約１７歳以上であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約４８Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；又は対象は、約１７歳以上であり、且つ組換えポリペプチドの投与前に、約５９Ｕ／Ｌ以下の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられる。

【0039】

組換えポリペプチドの投与は、対象からの血漿サンプル中のＡＬＰ濃度の少なくとも約１００Ｕ／Ｌ以上の中央値増加を促進し得る。

【0040】

いくつかの実施形態において、対象は、０～１４日齢であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約２７３Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、１５日齢～１歳未満であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約５１８Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、約１歳～約１０歳未満であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約３６９Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、約１０歳～約１３歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約４６０Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、雌性であり、且つ約１３歳～約１５歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約２８０Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、雄性であり、且つ約１３歳～約１５歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約５１７Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、雌性であり、且つ約１５歳～約１７歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約１２８Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、雄性であり、且つ約１５歳～約１７歳であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約３６５Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；対象は、雌性であり、且つ約１７歳以上であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約９５Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられるか；又は対象は、雄性であり、且つ約１７歳以上であり、且つ組換えポリペプチドの投与後、約１６４Ｕ／Ｌ以上の血漿ＡＬＰ濃度を有するとして特徴付けられる。

【0041】

組換えポリペプチドの投与前に、対象は、約１０以下の平均Ｂｒｕｉｎｉｎｋｓ－Ｏｓｅｒｅｔｓｋｙ運動技能試験（Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ）第２版（ＢＯＴ－２）強度スコアを有するとして特徴付けられ得る。組換えポリペプチドの投与前に、対象は、約５以下の平均ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアを有するとして特徴付けられ得る。組換えポリペプチドの投与は、対象の約１０以上の平均ＢＯＴ－２強度スコアをもたらし得る。組換えポリペプチドの投与は、対象の約５以上の平均ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアをもたらし得る。

【0042】

組換えポリペプチドの投与前に、対象は、約０．８以上の平均小児健康評価質問票（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（ＣＨＡＱ）指数スコアを有するとして特徴付けられ得る。組換えポリペプチドの投与は、対象の約０．５以下の平均ＣＨＡＱ指数スコアをもたらし得る。

【0043】

組換えポリペプチドの投与前に、対象は、約４０以下の平均小児転帰データ収集ツール（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＰＯＤＣＩ）スコアを有するとして特徴付けられ得る。組換えポリペプチドの投与は、対象の約４０以上の平均ＰＯＤＣＩスコアをもたらし得る。

【0044】

組換えポリペプチドの投与前に、対象は、約５未満の平均筋力グレードを有するとして特徴付けられ得る。組換えポリペプチドの投与は、対象の筋力グレードの約１以上の平均増加をもたらす。

【0045】

組換えポリペプチドの投与前に、対象は、予測されるＨＨＤ値の約８０％未満の平均ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）値を有するとして特徴付けられ得る。組換えポリペプチドの投与は、対象の、予測されるＨＨＤ値の約８０％以上の平均ＨＨＤ値をもたらし得る。ＨＨＤ値は、対象の握力、膝屈曲、膝伸展、股関節屈曲、股関節伸展又は股関節外転を表し得る。

【0046】

別の態様において、本発明は、ｓＡＬＰ又はｓＡＬＰ融合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を含む、本明細書に記載のポリペプチドの活性（例えば、結合活性）を決定するための方法を特徴とする。この方法は、例えば、骨（例えば、哺乳動物（例えば、マウス又はヒト）からの骨などの大腿骨）に由来する骨ホモジネートを提供することを含み得る。骨ホモジネートは、骨組織を採取し、その組織を例えばコラゲナーゼで処理して、結合組織を除去することによって得ることができる。骨は、例えば、骨髄及び／又は他の汚染物質を除去することによって精製され得る。骨が乾燥すると、例えば骨組織がホモジナイズされるまで、例えば骨を粉砕、破砕及び／又はスライスすることにより、骨をホモジナイズすることができる。次に、骨ホモジネートは、その後のアッセイで使用するために、液体、例えばＰＢＳに再懸濁され得る。本明細書に記載のポリペプチドは、ホモジネートと共に、例えば少なくとも１分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間又はそれを超えてインキュベートされ得る。次に、サンプルをボルテックス及び／又は遠心分離して、上清中又は骨ホモジネートに結合したタンパク質の画分が取得され得る。続いて、結合タンパク質と非結合タンパク質との比率を測定及び定量化して、ホモジネートに対するポリペプチドによる結合親和性を決定することができる。

【0047】

定義
名詞の前の「１つの」又は「複数」という用語は、１つ以上の特定の名詞を表す。例えば、「哺乳動物細胞」という句は、「１つ以上の哺乳動物細胞」を表す。

【0048】

「約」という用語は、実験誤差による変動を説明することを意味し、いくつかの実施形態において、「約」は、記載された値の±１０％を表す。本明細書で報告される全ての測定値は、明示的に使用されているかどうかにかかわらず、特に明記されていない限り、「約」という用語によって修飾されるものと理解される。

【0049】

「骨標的化部分」という用語は、骨標的化部分が単独で骨基質に対して少なくとも約１×１０^－５Ｍ又はそれより良好な（例えば、約１０^－６Ｍ、約１０^－７Ｍ、約１０^－８Ｍ、約１０^－９Ｍ又はそれより良好な）インビボ結合親和性を有するように、骨基質に対して十分な親和性を有する少なくとも３アミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を意味する。

【0050】

本明細書で互換的に使用される「簡潔な痛みの目録 － 短い形式」及び「ＢＰＩ－ＳＦ」という用語は、患者、特にＨＰＰを有する患者（例えば、約１３歳以上の患者）の痛みを測定する方法を指す。ＢＰＩ－ＳＦは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｌｅｅｌａｎｄ＆Ｒｙａｎ（Ａｎｎ Ａｃａｄ Ｍｅｄ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，２３（２），１２９－１３８；１９９４）で説明されている自己報告の痛みの測定値である。ＢＰＩ－ＳＦは、痛みの重症度及び日常機能に対する痛みの影響を評価するために設計された質問票である。ＢＰＩ－ＳＦは、質問票実施の２４時間前の痛みの重症度（４項目）及び痛みによる支障（７項目）を評価するために数値評価スケールを利用する１１項目で構成されている。ＢＰＩ－ＳＦ質問票は、痛みの強さ及び痛みが患者（例えば、約１３歳以上のＨＰＰ患者）の日常の機能を妨げる程度に関する情報を０（痛みなし）～１０（重度の痛み又は痛みによって引き起こされる重大な障害）の数値評価スケールで提供する。スコアが低いほど、生活の質がより良好であり、痛みが軽減されていることを示す。例えば、ＨＰＰの青年及び成人のＢＰＩ－ＳＦスコアは、１１の痛みの評価を複合したものである。

【0051】

本明細書で使用される「Ｂｒｕｉｎｉｎｋｓ－Ｏｓｅｒｅｔｓｋｙ運動技能試験第２版」及び「ＢＯＴ－２」という用語は、ＨＰＰを有する患者（例えば、約５歳～約１２歳のＨＰＰを有する子供、約１３歳～約１７歳のＨＰＰを有する青年又は約１８歳以上のＨＰＰを有する成人）の粗大運動能力及び微細運動能力の標準化された試験の第２版を指す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｒｕｉｎｉｎｋｓ，Ｒ．Ｈ．（２００５）．Ｂｒｕｉｎｉｎｋｓ－Ｏｓｅｒｅｔｓｋｙ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ，（ＢＯＴ－２）．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ：Ｐｅａｒｓｏｎ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔを参照されたい。ＢＯＴ－２は、様々な患者の粗大運動能力及び微細運動能力を評価するために個別に投与される。例えば、ＢＯＴ－２は、ＨＰＰを有する患者（例えば、約５歳～約１２歳のＨＰＰを有する子供、約１３歳～約１７歳のＨＰＰを有する青年又は約１８歳以上のＨＰＰを有する成人）の身体障害及び移動制限を評価するために使用できる。ＢＯＴ－２は、次の例示的な領域で複合ＢＯＴ－２スコアを提供する：強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調。例えば、ＢＯＴ－２強度の合計スコアは、患者に腹筋運動、Ｖ字腹筋、立幅跳び、壁掛け、空気椅子及び腕立て伏せを行わせることで決定できる。走行速度及び敏捷性の合計スコアは、患者に平均台をまたぐか、又はシャトルラン、両足横跳び若しくは片足横跳びを実行させることで決定できる。ＢＯＴ－２合計強度及びＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性の合計スコアは、０～２５の範囲であり、約１０～２５のスコアは、健常な対象を表すと見なされる。

【0052】

本明細書で使用される「触媒能力のある」という用語は、骨石灰化阻害剤無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を加水分解して無機リン酸（Ｐｉ）を提供し、それによりＰＰｉの細胞外濃度を低下させるｓＡＬＰを指す。したがって、触媒能力のあるｓＡＬＰは、ＰＰｉの濃度を調節することにより、骨の骨格石灰化を改善する。

【0053】

本明細書で使用される「小児健康評価質問票」及び「ＣＨＡＱ」という用語は、ＨＰＰを有する子供、青年及び一部の成人など、１～１９歳の患者の健康状態（例えば、日常生活動作（ＡＤＬ）を実行する能力及び痛みの発生率）を評価するために使用される質問票を指す。ＣＨＡＱ指数の説明については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｒｕｃｅ＆Ｆｒｉｅｓ（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０（１）：１６７－１７８，２００３）を参照されたい。ＣＨＡＱは、８歳を超える子供に対して面接又は自己申告によって管理され得る。ＣＨＡＱには、更衣／整容、起床、食事、歩行、衛生、リーチ、グリップ及び動作の８つのサブスケールが含まれる。各カテゴリ内のスコアの範囲は、０～３であり、ここで、スコア０は、困難を伴わないことを示し；スコア１は、一部困難を伴うことを示し；スコア２は、大いに困難を伴うことを示し；スコア３は、患者が活動を実行できないことを示す。ＣＨＡＱ指数は、痛みの存在及び重症度を判断するためにも使用され得る。

【0054】

本明細書で使用される「ＥｕｒｏＱｏｌ ５元質問票」及び「ＥＱ－５Ｄ」という用語は、本明細書で使用される場合、約５歳～約１２歳のＨＰＰを有する子供、約１３歳～約１７歳のＨＰＰを有する青年又は約１８歳以上のＨＰＰを有する成人などの患者の健康状態（例えば、移動性、セルフケア、学校、仕事若しくは家事の通常の活動を実行する能力、ＡＤＬ（例えば、更衣、排泄、料理）を実行する能力、痛み又は不快感の経験及び不安又はうつ状態）を評価するために使用される質問票を指す。ＥＱ－５Ｄ指数の説明については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｅｅｎａｎ＆Ｏｐｐｅ（ＥＱ－５Ｄ－３Ｌ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１，２０１５）を参照されたい。ＥＱ－５Ｄは、自己管理、臨床医による管理又は面接で行われ得る。ＥＱ－５Ｄ質問票には、ＨＰＰ患者の健康状態を特徴付ける次の５つの観点が含まれる：移動性、セルフケア、ＡＤＬを実行する能力、痛み又は不快感の発生率及び不安又はうつ状態。本明細書に記載されるように、ＥＱ－５Ｄは、ＨＰＰ患者を、生理的状態に問題がないことを示すレベルＩ、生理的状態に一部問題があることを示すレベルＩＩ、生理的状態に極端な問題があることを示すレベルＩＩＩ又は生理学的状態に最も極端な問題を示すレベルＩＶの健康状態を有するとして分類するために、６ＭＷＴなどの少なくとも１つの身体的評価と組み合わせて使用され得る。ＥＱ－５Ｄは、ＩＶからＩＩＩ、ＩＶからＩＩ、ＩＶからＩ、ＩＩＩからＩＩ、ＩＩＩからＩ又はＩＩからＩの健康状態など、ある健康状態から別の健康状態へのＨＰＰ患者の移行を評価するための分析の一部としても使用できる。小児健康実用指標（Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｕｔｉｌｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）－９Ｄ（ＣＨＵ－９Ｄ）は、ＨＰＰ患者の健康状態を評価するためにも使用できる。ＣＨＵ－９Ｄ及びＥＱ－５Ｄ指数の説明については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｔｅｖｅｎｓ（Ａｐｐｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｃｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｏｌｉｃｙ．９（３）：１５７－６９，２０１１）及び国際公開第２０１８／１９１２５４号パンフレットを参照されたい。

【0055】

「有効性」という用語は、用量反応アッセイにおける化合物のＥ_ｍａｘ値を意味する。

【0056】

「Ｆｃ」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリンのフラグメント結晶化可能領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４を意味する。Ｆｃは、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域を結合するヒンジ領域の任意の部分も含み得る。Ｆｃは、ヒトを含む任意の哺乳動物に由来することができ、（例えば、グリコシル化又はシアル化によって）翻訳後修飾され得る。非限定的な例において、Ｆｃは、配列番号２５９のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１のフラグメント結晶化可能領域であり得るか、又はＦｃは、配列番号２５３のヒトＩｇＧ２／４のフラグメント結晶化可能領域であり得る。

【0057】

「フラグメント」とは、好ましくは、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える部分を含む、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの部分を意味する。フラグメントは、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００の又はそれを超えるヌクレオチド、最大でポリヌクレオチドの全長又は１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００の又はそれを超えるアミノ酸残基、最大でポリペプチドの全長を含み得る。

【0058】

本明細書で互換的に使用される「ハンドヘルドダイナモメトリー」及び「ＨＨＤ」という用語は、対象、特に約１３歳以上のＨＰＰを有する対象のグリップ及び筋力を測定する方法を指す。ダイナモメーターを使用して、ＨＰＰを有する対象の握力、膝屈曲、膝伸展、股関節屈曲、股関節伸展及び股関節外転を評価することができる。例えば、約１３歳以上のＨＰＰを有する対象の膝の屈曲及び伸展及び股関節の屈曲、伸展、外転は、例えば、ＭＩＣＲＯＦＥＴ２ＴＭダイナモメーターを使用して測定でき、対象の握力は、例えば、ＪＡＭＡＲ（登録商標）グリップダイナモメーターを使用して測定できる。特に、管理者は、ダイナモメーターを静止させて持ち、対象は、ダイナモメーターに対して最大の力を加える。ピーク力データは、ポンド単位で収集され、ニュートン（Ｎ）に変換される。次に、トルク値は、Ｎメートル単位の肢長を使用して計算される。次に、トルク値を、例えばほぼ同じ年齢、同じ性別及び／又は同じ身長の正常な対象の値と比較し、対象のＨＨＤスコアを生成するためのパーセンテージ値として表すことができる。

【0059】

本明細書で使用される「健康状態」という用語は、約５歳～約１２歳のＨＰＰを有する子供、約１３歳～約１７歳のＨＰＰを有する青年又は約１８歳以上のＨＰＰを有する成人など、ＨＰＰを有する患者の特徴付けられた生理学的状態を指す。ＨＰＰ患者の健康状態は、６ＭＷＴ、ＢＯＴ－２、ＢＳＩＤ－ＩＩＩ及び歩行分析の１つ以上の測定基準から選択される少なくとも１つの身体的評価及びＥＱ－５Ｄ、ＣＨＡＱ、ＰＯＤＣＩ、ＣＨＵ－９Ｄ、ＳＦ－３６、ＳＦ－１２及びＰｅｄｓＱＬの１つ以上の指標から選択される少なくとも１つの生活の質の評価によって特徴付けることができる。特に、ＨＰＰ患者の健康状態は、例えば、ＥＱ－５Ｄと組み合わせた６ＭＷＴによって特徴付けられる。上記の測定基準から選択される少なくとも１つの身体的評価及び少なくとも１つの生活の質の評価の結果を得た後、ＨＰＰ患者は、生理的状態に問題がないことを示すレベルＩ、生理的状態に一部問題があることを示すレベルＩＩ、生理的状態に極端な問題があることを示すレベルＩＩＩ又は生理学的状態に最も極端な問題を示すレベルＩＶの健康状態を有すると識別され得る。測定基準は、例えば、本明細書に記載のｓＡＬＰによる処置後、ＨＰＰ患者のある健康状態から別の健康状態への移行（ｓＡＬＰの投与後のＩＶからＩＩＩ、ＩＶからＩＩ、ＩＶからＩ、ＩＩＩからＩＩ、ＩＩＩからＩ又はＩＩからＩの健康状態の移行など）を評価するために使用できる。

【0060】

本明細書で使用される「低ホスファターゼ症」及び「ＨＰＰ」という用語は、例えば、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）をコードするＡＬＰＬ（アルカリホスファターゼ、肝臓／骨／腎臓）遺伝子の１つ以上の機能喪失型変異によって引き起こされる稀な遺伝性の骨格障害を指す。ＨＰＰは、さらに、乳児ＨＰＰ、小児ＨＰＰ、周産期ＨＰＰ（例えば、良性周産期ＨＰＰ又は致死周産期ＨＰＰ）、歯状ＨＰＰ、青年期ＨＰＰ又は成人ＨＰＰとして特徴付けられ得る。例えば、「小児ＨＰＰは、約５歳～約１２歳のＨＰＰを有する患者を表し、「青年ＨＰＰ」は、約１３歳～約１７歳のＨＰＰを有する患者を表し、「成人ＨＰＰ」は、約１８歳以上のＨＰＰを有する患者を表す。本明細書で使用される「成人ＨＰＰ」という用語は、以下の症状の１つ以上の存在を特徴とする状態又は表現型を指す：無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の血中及び／又は尿中レベルの上昇、低石灰化、高カルシウム尿症、１以上の骨格変形、筋緊張低下症、筋力低下、リウマチ性合併症、動揺性歩行、歩行困難、骨痛、痛み、骨折、ピロリン酸カルシウム二水和物結晶沈着、偽性痛風、関節炎、ピロリン酸関節症、軟骨石灰化、石灰沈着性関節周囲炎及び偽性骨折。本明細書で使用される「青年ＨＰＰ」という用語は、以下の症状の１つ以上の存在を特徴とする状態又は表現型を指す：ＰＰｉ、ＰＥＡ又はＰＬＰの血中又は尿中レベルの上昇；骨軟化症、１つ以上の骨格変形、筋緊張低下症、筋力低下、リウマチ性合併症、関節炎、偽性痛風、動揺性歩行、歩行困難、骨痛、痛み、歯の早期喪失、低石灰化、肺形成不全、呼吸機能不全、発作、高カルシウム尿症、低身長及び成長遅延。本明細書で使用される「小児ＨＰＰ」という用語は、以下の症状の１つ以上の存在を特徴とする状態又は表現型を指す：ＰＰｉ、ＰＥＡ又はＰＬＰの血中又は尿中レベルの上昇；くる病、くる病性肋骨、１つ以上の骨格変形、筋緊張低下症、筋力低下、リウマチ性合併症、関節炎、偽性痛風、動揺性歩行、歩行困難、骨痛、痛み、歯の早期喪失、低石灰化、運動発達の遅延、発作、高カルシウム尿症、低身長、骨折、偽性骨折及び成長遅延。

【0061】

本明細書で互換的に使用される「下肢機能スケール」及び「ＬＥＦＳ」という用語は、患者、特にＨＰＰを有する患者（例えば、約１３歳以上の患者）の下肢の機能障害を測定する方法を指す。ＬＥＦＳは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｉｎｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈｙｓ Ｔｈｅｒ．７９：３７１－８３，１９９９）で説明されている自己報告の測定値である。合計ＬＥＦＳスコアは、０～８０の範囲であり、スコアが高いほど、下肢の機能が優れていることを示す。約９ポイントのＬＥＦＳスコアの変化は、臨床的に意味のある変化と見なされる。資格のある理学療法士は、面接形式でＨＰＰ患者（例えば、約１３歳以上のＨＰＰ患者）にＬＥＦＳを投与できる。ＬＥＦＳスコアが高いほど、移行動作（例えば、風呂から出る、ベッドで転がる）、移動（例えば、不均一な地面を歩く、走る）、階段を上ること、しゃがむことを含む下肢の機能が改善されていることを示す。ＬＥＦＳを使用して、ＨＰＰ患者の下肢の一方又は両方の機能障害を評価でき、これには、患者を経時的に監視し、アスフォターゼアルファ処置の有効性を評価する機能が含まれる。

【0062】

「核酸」、「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合した、天然に存在するか又は修飾されたヌクレオチドの配列を有する高分子、例えばＲＮＡ又はＤＮＡを意味する。核酸分子は、例えば、一本鎖又は二本鎖であり得、修飾若しくは非修飾ヌクレオチド又はそれらの混合物若しくは組み合わせを含み得る。様々な塩、混合塩及び核酸分子の遊離酸形態も含まれる。

【0063】

本明細書で使用される「小児転帰データ収集ツール」及び「ＰＯＤＣＩ」という用語は、１９歳未満の患者、特にＨＰＰを有する患者などの慢性的な健康障害を有する患者の全体的な健康状態、痛みの発生率及びＡＤＬを実行する能力を評価するために使用される質問票を指す。ＰＯＤＣＩ指数の説明については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｏｒｔｈｏｐ．２３（６）：７８８－７９０，２００３）を参照されたい。質問票は、患者又は患者の状態を知っている患者の親／保護者によって記入され得る。ＰＯＤＣＩから生成された８つのスケールには、次のものが含まれる。１）日常のパーソナルケア及び学生活動を行う際に遭遇する困難を測定するための上肢及び身体機能スケール；２）日常活動で日常的な運動及び運動活動を行う際に経験した困難を測定するための移動及び基本的可動性スケール；３）より活発な活動又はスポーツに参加する際に遭遇する困難又は制限を測定するためのスポーツ／身体機能スケール；４）過去１週間に経験した痛みのレベルを測定するための痛み／快適スケール；５）処置の長期的な期待を測定するための処置期待スケール；６）個人的な外見並びに友人及び同年代の他人との類似性に対する全体的な満足度を測定するための幸福度スケール；７）これが生涯にわたる状態である場合、現在の制限に対する患者の受容を測定するための症状による満足度スケール；８）上記の最初の４つのスケールから計算される一般的な複合スケールである全体機能スケール。標準化されたスコアは、ＰＯＤＣＩの一連の質問から生成され、０～１００のスケールに変換される。ここで、０は、重大な障害を表し、１００は、障害が少ないことを表す。

【0064】

「組換えタンパク質」という用語は、当技術分野で公知である。組換えタンパク質は、糖タンパク質であり得る。例えば、ＣＨＯ細胞で作製された組換えタンパク質又は組換えタンパク質変異体は、糖部分がタンパク質に共有結合している状態でグリコシル化されており、糖タンパク質である。簡潔には、「組換えタンパク質」という用語は、細胞培養システムを使用して製造することができるタンパク質を指し得る。細胞培養系の細胞は、例えば、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞、酵母細胞又は細菌細胞を含む哺乳動物細胞に由来し得る。一般に、細胞培養物中の細胞は、目的の組換えタンパク質をコードする導入されたポリヌクレオチドを含む（このポリヌクレオチドは、プラスミドベクターなどのベクター上に保有され得る）。組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターも含むことができる。

【0065】

本明細書で使用される場合、「６分間歩行試験」及び「６ＭＷＴ」は、ＨＰＰを有する患者（例えば、約５歳～約１２歳のＨＰＰを有する子供、約１３歳～約１７歳のＨＰＰを有する青年又は約１８歳以上のＨＰＰを有する成人）の歩行能力を評価するための標準化された試験である身体的評価を指す。特に、歩行能力は、患者が各足を順番に上げ下ろしする能力を指す。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｘ－ｍｉｎｕｔｅ ｗａｌｋ ｔｅｓｔ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６６（１）：１１１－７，２００２）を参照されたい。６ＭＷＴは、患者が６分間で平坦な硬い面を歩行する距離（例えば、メートル単位など）から決定される。次に、６ＭＷＴ距離は、ベースライン時の患者の６ＭＷＴ距離、未処置の対象（例えば、ほぼ同じ年齢、身長及び／又は性別の未処置の対象）の６ＭＷＴ距離又は健常な対象（例えば、ほぼ同じ年齢、身長及び／又は性別の健常な対象）の６ＭＷＴ距離と比較でき、６ＭＷＴ値を決定するためのパーセンテージとして表される。

【0066】

「処置すること」、「処置する」及び「処置」とは、ＨＰＰ（例えば、小児、青年又は成人ＨＰＰ）などの病状若しくはその１つ以上の症状を治癒、改善、安定化、可能性を低減若しくは予防することを目的とした患者の医療管理及び／又は例えば医薬組成物（例えば、本明細書に記載のｓＡＬＰ）を投与することによる、ＨＰＰなどの病状を示すか若しくはそれを有する可能性のある患者の管理を意味する。この用語には、能動的処置、すなわち特に疾患、病的状態、障害又は事象の改善に向けられた又は治癒に関連した処置が含まれ、また原因的処置、すなわち関連する疾患、病的状態、障害又は事象の原因の除去に向けられた処置も含まれる。さらに、この用語には、緩和的処置、すなわち疾患、病的状態、障害又は事象の治癒よりも、少なくとも１つの症状の緩和又は改善のために設計された処置；対症的処置、すなわち関連する疾患、病状、障害又は事象の全身症状に向けられた処置；予防的処置、すなわち例えば依然として病気ではないが、特定の疾患、病的状態、障害又は事象の影響を受けやすいか又はそうでなければそのリスクがある患者において、関連する疾患、病的状態、障害又は事象の発症を最小限に抑えるか、部分的又は完全に阻害することを目的とした処置；及び支持的処置、すなわち関連する疾患、病的状態、障害又は事象の改善に向けられた別の特定の療法を補うために採用される処置も含まれる。

【0067】

「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、シアル化又はリン酸化）にかかわらず、本明細書に記載されるように、天然に存在する又は天然に存在しないポリペプチド又はペプチドの全部又は一部を構成する、２つ以上の天然又は非天然アミノ酸残基の任意の鎖を指す。

【0068】

「ＡＬＰ」、「ｓＡＬＰ」、「可溶性アルカリホスファターゼ」、「アルカリホスファターゼ」及び「アルカリホスファターゼの細胞外ドメイン」という用語は、互換的に使用され（文脈で別段の指示がない限り）、可溶性の、膜に結合していないアルカリホスファターゼ又はドメイン、生物学的に活性なフラグメント又はそれらの生物学的に活性な変異体を意味する。ＡＬＰは、例えば、Ｃ末端ＧＰＩシグナル配列を欠くアルカリホスファターゼ及びアルカリホスファターゼ活性、例えばＰＰｉ又は他の天然又は人工基質を加水分解する能力を保持する、そのさらなる変異体及び類似体を含む。これには、特に明記されていない限り、ＴＮＳＡＬＰ、ＰＡＬＰ、ＧＡＬＰ及びＩＡＬＰドメイン並びにそれらの生物学的に活性なフラグメント又は生物学的に活性な変異体が含まれる。成熟したｓＡＬＰは、ＧＰＩ膜アンカー及びシグナルペプチドを欠いており、これは、プロセシング中に切断される。

【0069】

「ＡＬＰポリペプチド」という用語は、本明細書で定義されるように、ＡＬＰ配列を含む任意の配列を意味する。例示的なＡＬＰポリペプチドには、Ａ及びＢのそれぞれが存在しないか、又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列である、構造Ａ－ＡＬＰ－Ｂを有するもの（例えば、本明細書に記載の任意のＡＬＰ融合ポリペプチド）が含まれる。

【0070】

「単離された」又は「精製された」という用語は、他の自然に付随する成分から分離されていることを意味する。典型的には、化合物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子）、因子、細胞又は他の成分は、少なくとも、例えばタンパク質、抗体、天然に存在する有機分子及びそれが天然に関連する他の成分を重量で５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらには９９％含まない場合、単離されたと見なされる。いくつかの例において、成分は、重量で少なくとも７５％、９０％、さらには９９％純粋である。単離された成分は、化学合成、天然源からの因子の分離又は成分を天然に産生しない組換え宿主細胞における成分の産生によって得ることができる。タンパク質及び小分子は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）によって記載されるものなどの標準的な技術を使用して当業者によって精製され得る。成分は、好ましくは、少なくとも例えば出発物質の２、５又は１０倍純粋であり、これは、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学密度、ＨＰＬＣ分析又はウエスタン分析を使用して測定される（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０００）。精製の例示的な方法は、カラムクロマトグラフィー、ろ過、免疫沈降及び磁気ビーズ免疫親和性精製である。

【0071】

「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、共に投与される化合物の治療特性を保持しながら、処置される患者に生理学的に許容される、担体又は賦形剤を意味する。１つの例示的な薬学的に許容される担体物質は、生理食塩水である。他の生理学的に許容される担体及びそれらの製剤は、当業者に知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｌｌｅｎ，Ｅｄ．２０１２）に記載されている。

【0072】

「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される賦形剤で製剤化された本明細書に記載のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む組成物を意味し、患者における疾患又は事象の処置又は予防のための処置レジメンの一部として政府規制当局の承認を得て製造又は販売されるものを含む。医薬組成物は、例えば、皮下投与、静脈内投与（例えば、粒子状塞栓を含まない、静脈内使用に適した溶媒系における滅菌溶液として）、経口投与（例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ゲルキャップ又はシロップ）又は本明細書に記載される他の任意の製剤、例えば単位剤形のために製剤化することができる。

【0073】

「対象」又は「患者」という用語は、ヒト又は非ヒト哺乳動物（ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコなど）を含むが、これらに限定されない哺乳動物を意味する。

【0074】

「哺乳動物細胞」という用語は、当技術分野で知られており、例えばヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、ハムスター又はウサギを含む任意の哺乳動物からの又はそれに由来する任意の細胞を指すことができる。哺乳動物細胞は、不死化細胞、分化細胞又は未分化細胞であり得る。

【0075】

「治療有効量」という用語は、本明細書に記載の疾患又は状態の任意の症状、特にＨＰＰを実質的に処置、予防、遅延、抑制又は阻止するのに十分である、本明細書に記載のポリペプチド又はポリヌクレオチドの量を意味する。本明細書に記載の組成物の治療有効量は、処置される障害の重症度及び対象の状態、体重及び一般的な状態に依存し得、そのような要因を考慮して当業者によって決定され得る。本明細書に記載の治療有効量の組成物は、単回投与又は一定期間にわたって投与される複数回投与で対象に投与することができる。

【0076】

本明細書で使用される場合、ポリペプチド又は核酸配列が参照配列に対して「少なくともＸ％の配列同一性」を有すると言及される場合、それは、ポリペプチド又は核酸中のアミノ酸残基又はヌクレオチドの少なくともＸパーセントが、配列が最適にアラインされている場合、参照配列のものと同一であることを意味する。配列の最適なアラインメントは、当技術分野の範囲内である様々な方法、例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－７，１９８１）及びＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０）で決定することができる。これら及び他のアラインメントアルゴリズムは、ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）（Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ．，ｐｐ ３５３－３５８，１９７９）に組み込まれた「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２－４８９，１９８１）、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用してアクセスできる。さらに、当業者は、比較される配列の長さにわたって最適なアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

【0077】

「好ましい」及び「好ましくは」という言葉は、特定の状況下で特定の利益をもたらし得る、開示される化合物、組成物及び方法の実施形態を指す。しかし、同じ又は他の状況下では、他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用でないことを意味するものではなく、他の実施形態を本開示の範囲から除外することを意図するものではない。

【0078】

個別のステップを含む本明細書に開示される任意の方法について、ステップは、任意の実行可能な順序で実施することができ、また必要に応じて２つ以上のステップの任意の組み合わせを同時に実施することができる。

【0079】

上記の要約は、開示される各実施形態又は開示される化合物、組成物及び方法の全ての実施を説明することを意図するものではない。以下の説明は、より具体的に例示的な実施形態を例示する。本出願を通して、いくつかの箇所で例のリストを通してガイダンスが提供され得、その例は、様々な組み合わせで使用できる。いずれの場合にも、列挙されたリストは、代表群としてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。

【0080】

全ての見出しは、読者の便宜のためのものであり、特に明記されていない限り、見出しに続く文書の意味を限定するために使用されるものではない。

【0081】

出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。この特許又は特許出願のコピーは、カラー図面と共に、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁から提供される。

【図面の簡単な説明】

【0082】

【図1A】［図１Ａ－１Ｄ］ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）又は骨ホモジネートに結合する蛍光Ｆｃ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ－Ｋａｔｕｓｈｋａ ２ｓ蛍光タンパク質に融合されたＮ末端ＨＡ結合配列からなる二量体融合タンパク質）を示すグラフである。図１Ａは、非標的Ｆｃ－Ｋａｔｕｓｈｋａ ２ｓサンプル（ＦＬＵ００２）に対して正規化された、ＣＡＰＴＡＬ（登録商標）ＨＡに結合した蛍光Ｆｃ融合タンパク質の蛍光強度を示し；図１Ｂは、インキュベーション後の非結合タンパク質の総量を表す、ＨＡとの２時間のインキュベーション後のタンパク質懸濁液の蛍光強度を示し；図１Ｃ（結合）及び図１Ｄ（非結合）は、マウスＣ５６ＢＬ／６大腿骨ホモジネートに結合する蛍光Ｆｃ融合の類似の定量を示す。Ｎ＝２±ｍａｘ／分（＊ｐ＜０．０５対ＦＬＵ００２、一元配置分散分析、ダネットの事後分析）。

【図1B】同上。

【図1C】同上。

【図1D】同上。

【図2A-2B】蛍光プローブを介して測定された、マウス骨ホモジネートへの骨標的化（ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０）（ＡＬＰ０３１；配列番号３１）及び非標的化（ＡＬＰ－Ｆｃ）（ＡＬＰ０８６；配列番号２２２）融合結合を示すグラフである。骨ホモジネート結合（図２Ａ）及び非結合（図２Ｂ）タンパク質画分の蛍光強度を非標的化陰性対照（ＡＬＰ－Ｆｃ）に対して正規化した。Ｎ＝３±ＳＤ。

【図3A-3B】マウス骨ホモジネートに結合する蛍光標識されたＶＨＨタンパク質を示すグラフである。骨ホモジネート結合（図３Ａ）及び非結合（図３Ｂ）タンパク質画分の蛍光強度を非標的化陰性対照ＶＨＨに対して正規化した。Ｎ＝３±ＳＤ。

【図4】ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０（ＡＬＰ０３１；配列番号３１）及びＡＬＰ－Ｆｃ（ＡＬＰ０８６；配列番号２２２）で処置したＪ：ＮＵマウスの経時的な（２４～４３２時間）縦断的全身インビボイメージングスペクトル（ＩＶＩＳ）生動物イメージングの代表的な生蛍光画像のセットである。

【図5A】［図５Ａ－５Ｂ］ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０（ＡＬＰ０３１；配列番号３１）又はＡＬＰ－Ｆｃ（ＡＬＰ０８６；配列番号２２２）で処置されたマウスの縦断的全身ＩＶＩＳ生動物イメージングの定量的データを示すグラフである。図５Ａは、全身の関心領域及び定量化された総放射効率を示す。図５Ｂは、脊椎関心領域内の総放射効率及び定量化された放射効率を示し、１８日間の研究を通して縦断的にプロットされた。Ｎ＝６±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ マンホイットニーの独立ｔ検定、両側。

【図5B】同上。

【図6A】［図６Ａ－６Ｂ］１８日後の選択された組織（脊椎、頭蓋骨、大腿骨、肝臓、腎臓及び脾臓）におけるタンパク質蓄積のエクスビボ蛍光定量化を示すグラフである。図６Ａは、ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０（ＡＬＰ０３１；配列番号３１）及びＡＬＰ－Ｆｃ（ＡＬＰ０８６；配列番号２２２）で処置されたマウスからの単回投与の１８日後の組織標本の生の総放射効率を示す。図６Ｂは、ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０（ＡＬＰ０３１；配列番号３１）で処置されたマウスからのエクスビボ骨組織の体積正規化された総放射効率を示す。Ｎ＝６±ＳＤ、＊＊ｐ＜０．０１ マンホイットニーの独立ｔ検定、両側。

【図6B】同上。

【図7】非標的ＶＨＨ（配列番号２４８）、ＶＨＨ００１（配列番号２４９）又はＶＨＨ００２（配列番号２５０）を使用した、蛍光標識された化合物の単回静脈内用量を投与されたマウスにおける縦断的研究からの代表的な２Ｄ蛍光ＩＶＩＳ画像を示すグラフである。

【図8】２Ｄ ＩＶＩＳ画像からの、非標的ＶＨＨ（配列番号２４８）、ＶＨＨ００１（配列番号２４９）又はＶＨＨ００２（配列番号２５０）を使用した、蛍光標識された化合物の単回静脈内用量を投与されたマウスの総放射効率の縦断的研究からの定量的データを示す生蛍光画像のセットである。放射効率は、マウスの関心領域全体（ＲＯＩ）から得られた。Ｎ＝５±ＳＤ、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの事後分析。

【図9A】［図９Ａ－９Ｃ］非標的ＶＨＨ（配列番号２４８）、ＶＨＨ００１（配列番号２４９）及びＶＨＨ００２（配列番号２５０）を使用した、蛍光標識された化合物を投与されたマウスからのエクスビボ骨組織の定量化を示すグラフである。図９Ａは、脊椎を示し、図９Ｂは、後肢を示し、図９Ｃは、頭蓋骨を示し、これらは、単回投与注射の７日（１６８時間）後、全ての処置群からの全てのマウスから回収された。同等の関心領域（ＲＯＩ）が同様の組織の周囲に描かれ、総放射効率が組織の体積に対して正規化された。Ｎ＝５±ＳＤ、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、テューキーの事後分析。

【図9B】同上。

【図9C】同上。

【図10A】［図１０Ａ－１０Ｂ］インビトロでの骨標的化タンパク質の複数回投与の結合及び解離を示すグラフである。図１０Ａは、ＶＨＨ００１（配列番号２４９）、ＶＨＨ００２（配列番号２５０）及びＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０（ＡＬＰ０３１；配列番号３１）の骨ホモジネート結合タンパク質を示し、図１０Ｂは、ＶＨＨ００１（配列番号２４９）、ＶＨＨ００２（配列番号２５０）及びＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０（ＡＬＰ０３１；配列番号３１）の非結合タンパク質を示す。

【図10B】同上。

【図11】時間の関数として、骨ホモジネートに結合した１６個の骨タグ付き融合タンパク質によって生成されたＭＵＰ蛍光強度を示すグラフである（ＡＬＰ０３１（ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０）、ＡＬＰ０８６（ＡＬＰ－Ｆｃ）及びＡＬＰ２０２～ＡＬＰ２１６、それぞれ配列番号３１、２２２及び１２４～１３８に対応する。

【図12】ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０、ＡＬＰ０３１（配列番号３１）（実施例８、Ｎ＝６）で処置されたマウスの一連の２次元ＩＶＩＳ画像であり、経時的なインビボ骨結合を示している。

【図13】ＡＬＰ－Ｆｃ融合タンパク質、タグなし、ＡＬＰ０８６、実施例８、Ｎ＝６で処置されたマウスの一連の２次元ＩＶＩＳ画像であり、経時的なインビボ骨結合を示している。

【図14】様々なタグ付きコンストラクト（ＡＬＰ２３０－ＡＬＰ２３９、ＡＬＰ２４２、ＡＬＰ２４３、ＡＬＰ２４７、ＡＬＰ２４８、ＡＬＰ２５０、ＡＬＰ２５２１、ＡＬＰ２５３及びＡＬＰ２５４について、結合画分と非結合画分とを比較した、上清中の結合活性を示すグラフである。破線は、対照としてのベースライン骨結合を示す。Ｄ_５又はＤ_６の骨標的化部分を有するコンストラクトは、ほぼ等しい結合（Ｂ）及び非結合（Ｕ）成分を示した。

【図15A】［図１５Ａ－１５Ｂ］ｉＶ経路（図１５Ａ）又は皮下経路（図１５Ｂ）を介した健康な雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの用量投与後の時間に対するｍｇ／Ｌ／用量［（ｍｇ／Ｌ）／（ｍｇ／ｋｇ）］での血漿タンパク質レベルを示すｐＫデータを示すグラフである。

【図15B】同上。

【図16】毎日のＰＢＳ又は毎日、隔日及び毎週の投与スケジュールのＡＬＰ２０１で皮下処置されたＨＰＰマウスのカプランマイヤー生存曲線を示すグラフである。ＨＯＭ ＰＢＳ ＱＤ動物の生存期間中央値は、２１．５日であった。

【図17】ＡＬＰ２０１又はＰＢＳのいずれかで処置されたＨＰＰマウスの時間（３６日間の研究）の関数としての平均体重を示すグラフである。

【図18】ＡＬＰ２０１又はＰＢＳのいずれかで処置されたＨＰＰマウスの１１日目における後足の石灰化指数を示すグラフである。

【図19】様々な濃度でＡＬＰ０２３を使用して、蛍光が時間に対してプロットされた、リン酸４－メチルウンベリフェリル（ＭＵＰ）加水分解アッセイの例示的な進行曲線を示すグラフである。

【図20】例示的なＶＨＨドメインを示す概略図である。Ｆは、ＶＨＨフレームワーク領域を表し、灰色の領域は、ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及び骨標的化配列の配置又は間隔設定に使用され得るエンドセグメントを表す。

【図21】個々のドメインが標識された、例示的なＡＬＰ－Ｆｃ骨タグ分子を示す概略図である。

【図22】ＡＬＰ２０１、ＡＬＰ２５９及びアスフォターゼアルファ（配列番号２６９）のピロリン酸濃度に対してプロットされた反応速度を有する選択されたコンストラクトによるピロリン酸加水分解の速度とピロリン酸（ＰＰｉ）レベルの増加との関係を示す飽和曲線を示す一連のグラフである。

【図23】ＡＬＰ／ＴＰＬＤＨ結合ＰＬＰ加水分解アッセイの例示的な進行曲線を示すグラフであり、１０ｎｇ／ｍｌでのＡＬＰ２０１について、蛍光が時間に対してプロットされている。

【図24】反応速度をｕＭ単位のＰＬＰ濃度に対してプロットした、選択されたコンストラクト（ＡＬＰ２０１、ＡＬＰ２５９及びアスフォターゼアルファ；それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び１２．５ｎｇ／ｍＬ）によるＡＬＰ／ＴＰＬＤＨ結合アッセイによる、増加するピリドキシル－５’ホスフェート（ＰＬＰ）レベルとＰＬＰ加水分解の速度との関係を示す飽和曲線を示す一連のグラフである。

【図25】ＡＬＰ２０１、ＡＬＰ２５９、アスフォターゼアルファ又はＰＢＳのいずれかで処置されたＨＰＰマウスの３６／３７日目における後足の石灰化指数を示すグラフである。

【図26】ＡＬＰ２０１、アスフォターゼアルファ又はＰＢＳのいずれかで処置されたＨＰＰマウスの３６／３７日目の脛骨の長さを示すグラフである。

【図27】ＡＬＰ２０１、アスフォターゼアルファ又はＰＢＳのいずれかで処置されたＨＰＰマウスの３６／３７日目の大腿骨の長さを示すグラフである。

【図28】ＡＬＰ２０１、アスフォターゼアルファ又はＰＢＳのいずれかで処置されたＨＰＰマウスの３６／３７日目のマウス骨アルカリホスファターゼ活性レベルを示すグラフである。

【図29】ＡＬＰ２０１又はＡＬＰ２５９のいずれかで処置されたＡｋｐ２ＧＷ ＨＰＰマウスの３６／３７日目のマウス骨アルカリホスファターゼ活性レベルを示すグラフである。

【図30】ＨＰＰマウス大腿骨組織で実施された４－ＭＵＰ加水分解アッセイの例示的な進行曲線を示すグラフであり、蛍光（ＲＦＵ）が時間（秒）に対してプロットされている。

【図31】ＡＬＰ２０１、アスフォターゼアルファ又はＰＢＳのいずれかで処置されたＨＰＰマウスの３６／３７日目の体重を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0083】

低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）などの骨石灰化障害及びその症状を処置するための、可溶性アルカリホスファターゼ、そのフラグメント、融合タンパク質を含むポリペプチド及びその使用方法が記載される。ポリペプチドは、天然に存在するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に由来する可溶性アルカリホスファターゼ（ｓＡＬＰ）又はそのフラグメントを含む。アルカリホスファターゼには、異なる組織で差次的に発現する様々なアイソザイムが含まれる。４つの主要なＡＬＰアイソザイムには、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）、生殖系列アルカリホスファターゼ（ＧＡＬＰ）及び腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＬＰ）が含まれる。したがって、これらのＡＬＰアイソザイムに由来するタンパク質が記載される。

【0084】

ＨＰＰは、稀な遺伝性の骨格疾患であり、疾患の最も重症な形態では出生１０万人に１人の割合で発症する。この障害は、典型的には、ＴＮＳＡＬＰをコードする遺伝子の機能喪失型変異に起因する。ＨＰＰは、早期の歯の喪失から子宮内での骨の石灰化のほぼ完全な欠如まで、顕著な範囲の症状及び重症度を示す。ＨＰＰの症状は対象によって著しく異なり、対象の年齢によっても著しく異なる。ＨＰＰを有する対象の多くは、骨格の変化、低身長、慢性痛、痛みを伴う下肢、歩行障害及び早期の非外傷性の歯の喪失を示す。内因性ＴＮＳＡＬＰの機能喪失型変異により、ＨＰＰを有する対象は、天然のＡＬＰ活性を回復し、正常な骨基質石灰化を提供するために、本明細書に記載されるポリペプチドの機能的ＡＬＰ活性を必要とする。

【0085】

部位特異的変異誘発を実施することにより、アルカリホスファターゼポリペプチド及びその融合タンパク質のタンパク質活性、タンパク質安定性及び薬物動態特性を体系的に調べた。本明細書に記載のアルカリホスファターゼポリペプチド及びその融合タンパク質の変異には、アルカリホスファターゼ酵素の活性部位内及びその周辺、Ｎ結合型グリコシル化の１つ以上のコンセンサス部位、含まれる場合には骨標的化部分及び／又は含まれる場合にはフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域におけるアミノ酸残基の変化が含まれる。これらの変化の１つ以上を含むアルカリホスファターゼポリペプチド及びその融合タンパク質並びに変化がタンパク質活性、タンパク質安定性及び薬物動態特性の１つ以上を改善することを示すデータが本明細書に開示される。アルカリホスファターゼポリペプチド及びその融合タンパク質は、本明細書でより詳細に記載されている。

【0086】

可溶性アルカリホスファターゼ
天然に存在するＡＬＰ及びそのフラグメント並びにその少なくとも１つの変異のない天然に存在するＡＬＰと比較して、少なくとも１つの活性又は薬物動態（ＰＫ）特性を改善する１つ以上の変異を有するＡＬＰを含む、ＡＬＰを含むポリペプチドが記載される。

【0087】

ＡＬＰは、ＴＮＳＡＬＰ、ＰＡＬＰ、ＧＡＬＰ若しくはＩＡＬＰの可溶性フラグメント又はそれらのキメラであり得る。ＡＬＰは、任意の適切な生物に由来し得、例えば、哺乳動物ＡＬＰであり得る。哺乳動物ＡＬＰには、例えば、ヒト、ゴリラ、マウス、ウサギ、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、オランウータン、ヒヒ、ラット、ウシ、ヤギ及びラマＡＬＰが含まれる。いくつかの特定の実施形態において、ＡＬＰは、ヒトＴＮＳＡＬＰ又はヒトＩＡＬＰなどのヒトＡＬＰである。ＡＬＰは、配列番号１～６のいずれか１つに対して少なくとも７０％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性（例えば、配列番号１の残基１～４９１又は配列番号４の残基１～４８６に対して少なくとも８５％の配列同一性）を有し得る。ＡＬＰは、配列番号１～６のいずれか１つの少なくとも５０（例えば、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又はそれを超える）アミノ酸の領域に対して少なくとも７０％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有し得る。

【0088】

ＴＮＳＡＬＰは、Ｃ末端の糖脂質部分によってアンカーされた膜結合タンパク質である（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ，Ｐ０５１８６）。糖脂質アンカー（ＧＰＩ）は、疎水性のＣ末端を除去した後、翻訳後に追加される。これは、一時的な膜アンカーとしても、ＧＰＩの追加のシグナルとしても機能する。ＧＰＩアンカーは細胞膜に位置し、ＴＮＳＡＬＰの残りの部分は細胞外に位置する。特に、ＴＮＳＡＬＰ（例えば、ヒトＴＮＳＡＬＰ（ｈＴＮＳＡＬＰ））は、疎水性Ｃ末端配列の最初のアミノ酸（アラニン）を終止コドンで置き換えるように操作し、それにより、ＴＮＳＡＬＰの天然のアンカー型の全てのアミノ酸残基を含むが、ＧＰＩ膜アンカーを欠く、操作された可溶性ＴＮＳＡＬＰを産生することができる。当業者は、ＧＰＩ膜アンカーの位置がＡＬＰによって異なり、例えば、ポリペプチドのＣ末端に最後の１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、５０又はそれを超えるアミノ酸残基を含み得ることを理解するであろう。したがって、天然ＡＬＰのＣ末端は、ＡＬＰ活性に影響を与えることなく、特定のアミノ酸によって切断することができる。

【0089】

Ｃ末端のＧＰＩアンカーに加え、ＴＮＳＡＬＰはＮ末端のシグナルペプチド配列も有する。Ｎ末端シグナルペプチドは、合成時にタンパク質上に存在するが、小胞体への移行後にＴＮＳＡＬＰから切断される。例示的なＮ末端シグナルペプチドは、ＭＩＳＰＦＬＶＬＡＩＧＴＣＬＴＮＳ（配列番号２５１）である。

【0090】

本明細書に記載のｓＡＬＰは、その分泌型（すなわちＮ末端シグナルを欠く）及び非分泌型（すなわちＮ末端シグナルを有する）の両方を含む。当業者は、Ｎ末端シグナルペプチドの位置がアルカリホスファターゼによって異なり、例えば、ポリペプチドのＮ末端に最初の５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、３０又はそれを超えるアミノ酸残基を含み得ることを理解するであろう。当業者は、例えば、Ｂｅｎｄｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（４）：７８３－７９５，２００４）に記載され、ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／で入手可能なものなどの適切なコンピュータアルゴリズムにより、シグナル配列切断部位の位置を予測することができる。

【0091】

ＡＬＰは、１つ以上の変異、例えば、天然に存在しない変異である変異を含み得る。１つ以上の変異は、好ましくは、アルカリホスファターゼ及び／又は骨標的化コンジュゲートの治療的特徴を増強する。例えば、１つ以上の変異は、骨標的化コンジュゲートのクリアランス速度、活性、有効性及び／又は溶解性を改善することができる。変異は、アミノ酸置換又は１つ以上のアミノ酸の挿入又は欠失であり得る。１つ以上の変異は、その少なくとも１つの変異のない天然に存在するＡＬＰと比較して、少なくとも１つの薬物動態（ＰＫ）特性の活性を改善し得る。ＡＬＰ（例えば、ヒトＴＮＳＡＬＰ）は、配列番号１に対するＥ１０８Ｘ、Ｍ３８４Ｘ、Ｌ３８５Ｘ、Ｎ２１３Ｘ及びＮ２８６Ｘからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有し得、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。１つ以上の変異は、配列番号１に対する例えばＥ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｑ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｍ３８４Ｒ、Ｌ３８５Ｔ、Ｎ２１３Ｑ及びＮ２８６Ｑを含み得る。ＡＬＰは、異なるアミノ酸位置に２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える）の変異を含み得る。例えば、ＡＬＰは、配列番号１に対するＥ１０８Ｍ、Ｎ２１３Ｑ及びＮ２８６Ｑ変異を含み得る。ＡＬＰ（例えば、ヒトＩＡＬＰ）は、配列番号４に対してＷ２４５Ｘ変異を有し得、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。ＡＬＰは、配列番号４に対するＷ２４５Ｒ変異を有し得る。ＡＬＰは、配列番号４に対するＣ４８１Ｘ変異を有し得、ここで、Ｘは、任意の非チオール含有アミノ酸である（例えば、Ｃ４８１Ｇ）。

【0092】

本明細書に記載のポリペプチドは、ＡＬＰの特定の領域内に存在する天然に存在するＡＬＰと比較した変異を含むＡＬＰを含み得る。変異はＡＬＰのエクトドメインに存在し得る。例えば、変異は、ＡＬＰのクラウンドメイン、触媒ドメイン又は二量体化ドメインに存在し得る。変異が含まれる場合、ＧＰＩアンカードメインに存在し得る。ポリペプチドは、ヒトＴＮＳＡＬＰのアミノ酸１～４９１若しくは１～４８６又はアラインメント及び／又は配列相同性に基づく類似のＡＬＰ位置内に存在する変異を含み得る。例えば、ポリペプチドは、配列番号１に対して、位置１～４９１、１～４８６、２５～４７５、２５～２４０、５０～４００、５０～３５０及び／又は１００～３００内に変異を有し得る。ポリペプチドは、配列番号１に対して、位置１００～１２５、１００～１１０、２００～２２５、２１０～２２０、２７５～３００、２８０～２９０、４２５～４５０及び／又は４２５～４３５内に変異を有し得る。例えば、ポリペプチドは、配列番号１に対して、位置１０８、２１３、２８６及び／又は４２９間に変異を有し得る。特定の実施形態において、変異は、ＡＬＰの配列内にあり、変異は、ＡＬＰのＮ末端ドメイン又はＣ末端ドメインに存在する非天然アミノ酸のストレッチではない。

【0093】

ＡＬＰは、コンセンサスＮ結合型グリコシル化部位に変異を有し得る。コンセンサスＮ－結合型グリコシル化部位は、アスパラギン－Ｘ－Ｚモチーフを含み、ここで、Ｘは、Ｐを除く任意のアミノ酸であり、Ｚは、Ｓ又はＴを除く任意のアミノ酸である。アスパラギンは、グルタミンに変異し得る。

【0094】

ＡＬＰは、配列番号４に対するＳ４２９Ｘ変異を有し得、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。例えば、ＡＬＰは、配列番号４に対するＳ４２９Ｑ、Ｓ４２９Ｈ、Ｓ４２９Ｅ又はＳ４２９Ｄ変異を有し得る。

【0095】

ＡＬＰは、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの少なくとも５０（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３５０、４００又はそれを超える）アミノ酸の領域に対して少なくとも７０％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有し得、且つ／又は１つ以上の上記変異を含み得る。

【0096】

変異型ＡＬＰは、天然に存在するＡＬＰに対してＰＫ特性の少なくとも１つの活性を改善し得る。例えば、変異は、増加した触媒活性、増加した温度安定性、増加した亜鉛結合、亜鉛枯渇バッファーにおける活性の維持、ｐＨ５．０～７．５における活性の維持、減少した二量体化、減少した凝集及び／又はＡＬＰの増加した製造可能性の１つ以上を提供し得る。増加した触媒活性には、ピリドキサール５－リン酸及び／又はピロリン酸の増加した加水分解が含まれ得る。増加した触媒活性は、天然に存在するＡＬＰの活性よりも少なくとも２倍（例えば、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、例えば、約２倍～約３０倍）良好であり得る。改善されたＰＫ特性には、増加した基質特異性、天然基質に対する増加した活性、人工基質に対する増加した活性、天然基質のための減少したＫｍ及び用量あたりの増加した曲線下面積（ＡＵＣ）の１つ以上が含まれ得る。人工ＡＬＰ基質には、例えば、リン酸ウンベリフェリル（例えば、リン酸４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＰ））、リン酸ウンベリフェロン及びリン酸パラニトロフェニル（ｐＮＰＰ）が含まれる。天然基質には、例えば、ピリドキサール－５’－リン酸、ＰＬＰ及びＰＥＡが含まれる。

【0097】

本明細書に記載のＡＬＰは、二量体の形態であり得る。代わりに、ＡＬＰは、単量体の形態であり得る。

【0098】

骨標的化部分
本明細書に記載のポリペプチドは、骨標的化部分をさらに含み得る。骨標的化部分は、骨に対して十分な親和性を有するアミノ酸の任意の配列である（例えば、骨のヒドロキシアパタイトミネラル相）。骨のミネラル相には正に帯電した領域が含まれる。したがって、グルタミン酸又はアスパラギン酸などの負に帯電したアミノ酸は、ポリペプチドを骨に標的指向化し得る。骨標的化部分は、ｓＡＬＰが骨組織に局在化し、ｓＡＬＰの活性が低下するまで結合したままとなることを可能にする。これにより、ｓＡＬＰは天然ＴＮＳＡＬＰの位置でヒドロキシアパタイト骨形成を触媒することができる。

【0099】

骨標的化部分は、ＡＬＰのＮ末端又はＣ末端に配置され得る。骨標的化部分は、ポリアスパラギン酸（Ｄｎ）、ポリグルタミン酸（Ｅｎ）、ポリ（アスパラギン酸－アラニン－アスパラギン酸）（ＤＡＤ）ｎ、ポリ（アスパラギン酸－アスパラギン酸－セリン）（ＤＤＳ）ｎ、ポリ（アスパラギン酸－セリン－セリン（ＤＳＳ）ｎ、ポリ（グルタミン酸－グルタミン酸－セリン）（ＥＥＳ）ｎを含み得る。ｎは、１～５０の任意の整数（例えば、１～３０、３～３０、３～２０、５～１６、１０～１６、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０）であり得る。いくつかの実施形態において、骨標的化部分は、ｎ＝７～１０の場合Ｄｎ；ｎ＝１０～１５の場合Ｅｎ；ｎ＝２～４の場合（ＤＡＤ）ｎ；ｎ＝２～４の場合（ＤＤＳ）ｎ；ｎ＝３の場合（ＤＳＳ）ｎ；又はｎ＝３～４の場合（ＥＥＳ）ｎの構造を含み得る。

【0100】

標的化配列には、Ｄｎが含まれ得、ここで、ｎは、例えば３～９、１７～３０、１０～１６又は３～３０である。標的化配列には、Ｅｎが含まれ得、ここで、ｎは、例えば３～９、１７～３０、１０～１６又は３～３０である。骨標的化部分は、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基の両方を含む配列を含み得る。

【0101】

任意選択により、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ及び／又はＡｌａの１つ以上などの他のアミノ酸を、Ｄｎ又はＥｎ骨標的配列内に含めることができる。非限定的な例として、標的化部分は、（ＤＤＳ）ｎを含むことができ、ここで、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。

【0102】

骨標的化部分は、骨ミネラルに結合することが知られている唾液タンパク質であるスタテリンからの骨標的化配列の全部又は一部を含み得る。スタテリン骨標的化配列の例は、ＤＤＳＥＥＫＦＬＲＲＩＧＲＦＧ（配列番号２５２）である。骨標的化配列は、スタテリンからの骨標的化配列にコンジュゲートされたＤｎ又はＥｎ配列を含み得る。

【0103】

任意選択により、本明細書に記載の骨標的化コンジュゲートの実施形態のいずれかについて、標的化配列は、システイン残基がＮ末端、Ｃ末端又はその両方に隣接し得る。システイン残基は、ポリペプチドを別の化学部分にコンジュゲートさせるために使用することができる。

【0104】

骨標的化部分は、骨標的化配列を含むＶＨＨ抗体又はそのフラグメントを含み得る。骨標的化配列は、ＶＨＨ抗体フラグメント内及び／又はその末端に配置されて、骨標的化ＶＨＨコンストラクトを生成し得る。ＶＨＨ抗体フラグメントには、ラクダ科動物（例えば、ラマ）に見られるように、重鎖ホモ二量体ＩｇＧの可変ドメイン（ＶＨＨ）の全て又は一部が含まれる。ホモ二量体抗体は、軽鎖（ＶＬ及びＣＬ）及び従来の抗体に特徴的な第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を欠いている。従来の抗体の可変ドメインと同様に、これらの重鎖ホモ二量体（ＶＨＨ）の可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３と呼ばれることもある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。ラマ抗体からのＣＤＲ Ｈ３は、同等のマウスＣＤＲ３よりも最大３倍長くてもよい。ＶＨＨ配列には、３つのＣＤＲ領域に隣接する複数のフレームワーク（Ｆ）領域が含まれ得る。ＶＨＨ配列には、天然に存在する配列並びにＭＡ１０、ＭＧ６及びＭＧ７などのファージディスプレイを使用して同定された配列が含まれる（Ｅｍｅｌｉｅ Ｄ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｗｅｎｔｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２０１４）。骨標的化ＶＨＨコンストラクトは、Ｄｎ又はＥｎ（ｎ＝１～５０）などの少なくとも１つの骨標的化配列を含むように調製され得る。骨標的化配列は、ＶＨＨのＣＤＲ配列内及び／又はＶＨＨ配列の一端又は両端に配置することができる（図２０、概略図）。ＶＨＨの１つ、２つ若しくは３つ全てのＣＤＲ又はその一部は、骨標的化配列で置換され得る。ＣＤＲを含まないＶＨＨフラグメントの部分、例えば、フレームワーク（Ｆ）領域は、骨標的化部分においてスペーサー領域として機能し得る。任意選択により、骨標的化配列は、ＣＤＲ配列の２つ又は３つ全ての中に配置され得る。図２０に概略的に示されるように、ＦはＶＨＨフレームワーク領域を表し、灰色の領域はＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及び骨標的化配列の配置又は間隔設定に使用され得るエンドセグメントを含む。

【0105】

Ｆｃ領域
本明細書に記載のポリペプチドは、Ｆｃ領域をさらに含み得る。例えば、ｓＡＬＰは、例えばポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドであり得る。免疫グロブリン分子は、当技術分野で周知の構造を有する。これには、鎖間ジスルフィド結合によって結合された２つの軽鎖（それぞれ約２３ｋＤ）及び２つの重鎖（それぞれ約５０～７０ｋＤ）が含まれる。免疫グロブリンは、タンパク質分解により（例えば、パパイン切断により）容易に切断されて、Ｆａｂ（軽鎖並びに重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む）及びＦｃ（隣接する配列と共に重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）になる。本明細書に記載の有用なＦｃフラグメントには、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）からの、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥを含む任意の免疫グロブリン分子のＦｃフラグメント及びそれらの様々なサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）が含まれる。例えば、ＦｃフラグメントはヒトＩｇＧ１であり得る。

【0106】

Ｆｃ領域は、ＩｇＧのＦｃフラグメントの全部又は一部を含み得る。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はＩｇＧ２／４などの２つ以上のＩｇＧのキメラであり得る。ＩｇＧ２／４キメラは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１０６５８５号パンフレットに記載されている。Ｆｃフラグメントは、対象への投与後のポリペプチドの半減期及び循環時間を増加させ得る。例えば、ポリペプチドの半減期は、約１０～約１００時間（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０時間）であり得る。半減期は、投与形態によって異なり得る。Ｆｃフラグメントは、例えば、重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン並びにヒンジ領域の任意の部分を含み得る。Ｆｃ領域は、当業者に知られている任意の適切な１つ以上のアミノ酸残基で任意選択によりグリコシル化することができる。特に、融合ポリペプチドのＦｃフラグメントは、配列番号２５３若しくは配列番号２５９のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号２５３又は配列番号２５９に対して少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する。操作された、例えば、天然に存在しないＦｃ領域も使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／００７８０９号パンフレットを参照されたい）。本明細書に記載されるＦｃフラグメントは、本明細書に記載のＦｃフラグメントのいずれかに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０個又はそれを超える数の付加、欠失又は置換を有し得る。

【0107】

リンカー及びスペーサー
本明細書に記載のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の１つ以上のリンカー又はスペーサーを含み得る。ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置する１つ以上の末端残基も含み得る。リンカー又はスペーサーは、１つ以上の配列（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれを超える）アミノ酸を含み得る。本明細書に記載のポリペプチドからリンカー又はスペーサーを省略し得る。

【0108】

リンカーは、隣接するドメイン間の柔軟性を促進するため又はドメイン間の立体障害を排除するために任意の適切なアミノ酸を含むことができる。さらに、リンカー又はスペーサーを使用して、タンパク質の折り畳み、熱安定性及び／又はポリペプチドの組換え発現を増強することができる。

【0109】

１つ以上のさらなるアミノ酸は、Ｎ末端において、Ｃ末端において且つ／又は本明細書に記載のポリペプチドの成分のいずれか若しくは全ての間に介在する配列として配置することができる。例えば、Ｆｃ領域と骨標的化部分との間にさらなるアミノ酸が含まれ得る。例示的な介在配列は、Ｆｃ領域と骨標的化部分配列との間に配置することができるＧＧＧＧＳ（配列番号２５４）などの１つ以上のグリシン又はセリンを含む。いくつかの実施形態において、さらなる可動性を提供するために、より長い介在配列が使用され得る。

【0110】

いくつかの実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＡ）_２ＧＧＧＧＳ（配列番号２５５）、（ＧＧＧＧＱ）_２ＧＧＧＧＳ（配列番号２５６）、（ＧＧＧＰＳ）_２ＧＧＧＧＳ（配列番号２５７）又はＧＧＧＧＳ（ＰＧＧＧＳ）_２（配列番号２５８）の配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＡ）_２ＧＧＧＧＳ（配列番号２５５）、（ＧＧＧＧＱ）_２ＧＧＧＧＳ（配列番号２５６）、（ＧＧＧＰＳ）_２ＧＧＧＧＳ（配列番号２５７）又はＧＧＧＧＳ（ＰＧＧＧＳ）_２（配列番号２５８）の配列を含まない。

【0111】

ポリペプチドのトポロジー
本明細書に記載のポリペプチドは、ｓＡＬＰ、骨標的化部分、Ｆｃ領域、スペーサー及びリンカーの１つ以上を含み得る。本明細書に記載のポリペプチドの成分は、適切な機能を提供する、Ｎ末端からＣ末端に配置された任意の適切なトポロジーを含み得る。骨標的化部分を含むポリペプチドは、骨標的化コンジュゲート又は骨標的化Ｆｃコンジュゲートと呼ばれ得る。

【0112】

例えば、ｓＡＬＰ及びＦｃ領域を含むポリペプチドは、構造Ｎ－ｓＡＬＰ－Ｆｃ－Ｃ又はＮ－Ｆｃ－ｓＡＬＰ－Ｃを有し得る。任意選択により、ポリペプチドは、これらのドメインの１つ以上の間に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える）のアミノ酸のリンカー又はスペーサーをさらに含み得る。

【0113】

ポリペプチドは、ｓＡＬＰ及び骨標的化部分（ＢＴＭ）を含み得、構造Ｎ－ｓＡＬＰ－ＢＴＭ－Ｃ又はＮ－ＢＴＭ－ｓＡＬＰ－Ｃを有し得る。任意選択により、ポリペプチドは、これらのドメインの１つ以上の間に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える）のアミノ酸のリンカー又はスペーサーをさらに含み得る。

【0114】

ポリペプチドは、ｓＡＬＰ、Ｆｃ領域及びＢＴＭを含み得る。３つの成分全てを含むポリペプチドは、構造Ｎ－ｓＡＬＰ－Ｆｃ－ＢＴＭ－Ｃ、Ｎ－Ｆｃ－ＢＴＭ－ｓＡＬＰ－Ｃ、Ｎ－ＢＴＭ－ｓＡＬＰ－Ｆｃ－Ｃ、Ｎ－ｓＡＬＰ－ＢＴＭ－Ｆｃ－Ｃ、Ｎ－Ｆｃ－ｓＡＬＰ－ＢＴＭ－Ｃ又はＮ－ＢＴＭ－Ｆｃ－ｓＡＬＰ－Ｃを有し得る。任意選択により、ポリペプチドは、これらのドメインの１つ以上の間に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える）のアミノ酸のリンカー又はスペーサーをさらに含み得る。

【0115】

ポリペプチドは、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。例えば、ポリペプチドは、配列番号７２、１２３、１５５又は１７７のいずれか１つの配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号１２３に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得、ここで、任意選択により、ポリペプチドは、以下の修飾：Ｅ１０８Ｍ、Ｎ２１３Ｑ及びＮ２８６Ｑの１つ以上を含む。ポリペプチドは、配列番号１２３を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号１７７に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号１７７を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２６０又は２６１に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２６０の配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２６１の配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、分泌シグナルペプチドを含み得る。ポリペプチドは、配列番号２６３又は２６４に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２６３の配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、配列番号２６４の配列を含み得るか又はそれからなり得る。ポリペプチドは、任意のｓＡＬＰ触媒ドメイン、Ｆｃ ＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２／４のＦｃ）又は表１に列挙された骨標的化部分及びそれらのトポロジー的配列を含み得る。ポリペプチドは、表１に列挙された任意の単一ドメインを含み得る。

【0116】

【表1-1】

【0117】

【表1-2】

【0118】

【表1-3】

【0119】

【表1-4】

【0120】

【表1-5】

【0121】

【表1-6】

【0122】

【表1-7】

【0123】

【表1-8】

【0124】

【表1-9】

【0125】

【表1-10】

【0126】

【表1-11】

【0127】

【表1-12】

【0128】

【表1-13】

【0129】

【表1-14】

【0130】

骨組織への調節可能な結合
本明細書に記載の骨標的化コンジュゲートは、骨組織への様々な結合を示すことができる。例えば、骨を標的としたコンジュゲートは、骨（結合）及び／又は解離挙動に関連して差異を示し得る。ｐｏｌｙＤ及びｐｏｌｙＥ標的化配列を含む骨標的化Ｆｃコンジュゲートは、例えば、骨組織に対して高い結合親和性を示す一方、スタテリン由来又はＶＨＨ配列を標的化配列として使用する特定の骨標的化Ｆｃコンジュゲートは、骨組織に対して中程度の結合親和性を示し得る（例えば、図１及び１４を参照されたい）。

【0131】

骨標的コンジュゲートは、それらの結合親和性が類似している場合でも、解離挙動の違いを示し得る。例えば、骨組織に結合したＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０（配列番号３１）などの骨標的Ｆｃコンジュゲートは、溶液中で非結合コンジュゲートと容易に交換できない可能性がある一方、ｐｏｌｙＤ又はｐｏｌｙＥ配列を１つ以上のそのＣＤＲ（例えば、配列番号２４９及び２５０）内に含む単一ドメインの骨標的ＶＨＨコンストラクトは、非結合コンジュゲートの存在下で骨組織に結合及び解離するためのより多くの移動性を示し得る（例えば、図１０Ａ～１０Ｂを参照されたい）。

【0132】

本明細書に記載の骨標的化コンジュゲートは、結合親和性、解離速度、滞留時間及び移動性を変化させるように標的化配列及び他の成分を選択することにより、特定の治療ニーズを満たすように調整することができる。例えば、標的への能動的平衡結合は、最も強い結合分子がそうであろうように、ポリペプチドが骨上の活性部位を遮断しないことを確実にし得る。特に、骨に強く結合しすぎるコンストラクトは、よりゆっくりと解離する。ＡＬＰの触媒活性は亜鉛イオン及びマグネシウムイオンに依存しているため、これらのイオンが失われると、ＡＬＰは経時的に不活性化され得る。不活性なＡＬＰコンストラクトが骨に結合したままである場合、それらは活性なＡＬＰの動員を妨げる。逆に、骨からの活性ＡＬＰの急速な解離は、ＡＬＰがその酵素活性を最大化するのを妨げることによって有効性を低下させる。したがって、結合のバランスが望まれる。選択は、標的化配列について説明した選択肢（例えば、ポリＤ、ポリＥ、ファージディスプレイ由来の配列、完全若しくは部分的なスタテリン配列、完全若しくは部分的なＶＨＨ配列又はそれらの組み合わせ）及び異なるトポロジー的選択肢（例えば、コンジュゲートのＮ末端又はＣ末端の骨標的化部分）から行うことができる。これにより、有効性を高め、不活性酵素の長期結合を減少させる骨結合滞留時間を確立するための好ましい結合速度が保証される。骨結合滞留時間は、約１秒～約１ヶ月（例えば、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、２分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月）の範囲を示し得る。

【0133】

ｓＡＬＰコンストラクトを試験するための方法
本明細書に記載のポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、触媒活性、骨標的化能力及びＰＫプロファイルを試験するために、以下により詳細に記載される１つ以上のアッセイを使用して試験され得る。

【0134】

ヒドロキシアパタイト結合アッセイ
合成ＨＡは、本明細書に記載のポリペプチドによるＨＡ結合を精査するために使用され得る。別の遠心分離管では、骨標的化ポリペプチドを例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（１管あたり１ｍＬの懸濁液）中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で希釈し得る。各ポリペプチド含有チューブに、１ｍｇの合成ＨＡを添加し得、ＨＡが沈降するのを防ぐために、チューブを軌道混合しながら室温で２時間インキュベートし得る。インキュベーション後、サンプルを１６，０００ｒｃｆで５分間遠心分離して、固体ＨＡ結合画分が非結合タンパク質懸濁液から分離され得る。続いて、ＨＡ結合画分をＰＢＳで、例えば３回洗浄し、最終的なＨＡ画分を１００μＬのＰＢＳに懸濁できる。懸濁したＨＡ結合画分及び１００μＬの非結合タンパク質懸濁液を９６ウェル黒色プレートに移し（１ウェルあたり１画分）、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘ）を使用して４８８ｎｍ／５８５ｎｍでの蛍光励起／発光により相対タンパク質濃度を測定できる。

【0135】

骨ホモジネートアッセイ
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨は、使用前に－８０℃で保管され得る。大腿骨は、１ｘＥＤＴＡフリーのセリン及びシステインプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標），Ｒｏｃｈｅ）を含むＢＳ中の１ｍＬ ０．２％（ｗ／ｗ）コラゲナーゼタイプ２（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含む、２ｍＬ遠心分離管（１管あたり２つの大腿骨）に移すことができる。大腿骨を短時間ボルテックスし、振とう（８００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートできる。残存している結合組織を取り除くことができ、大腿骨を氷上のペトリ皿に置くことができる。骨髄は、針及びシリンジを使用してＰＢＳで洗い流すことができる。乾燥した骨を計量し（典型的には１つの大腿骨あたり３０～５０ｍｇ）、１ｘプロテアーゼ阻害剤を含む０．７５ｍＬ ＰＢＳと共に、予め冷却した硬組織を粉砕する個別の使い捨てビートビーター（ＰＲＥＣＥＬＬＹＳ（登録商標）、Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に入れる。大腿骨は、ハイスループットビーズミルホモジナイザー（Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ、４℃、最高速度、３０秒間を４サイクル）を使用してホモジナイズできる。ホモジネートを１．５ｍＬの遠心分離管に移し、１２，０００ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離して、遊離したタンパク質／細胞破片から骨ホモジネートを分離できる。スライス及び他の粉砕メカニズムを含む、骨ホモジネートを単離する他の方法が使用され得る。次に、骨ホモジネートは、結合アッセイで使用するために、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡに再懸濁され得る。

【0136】

骨標的化ポリペプチドは、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５０ｎＭに希釈し、個々の１．５ｍＬ遠心分離管（１管あたり１ｍＬ）で３ｍｇの骨ホモジネートとインキュベートできる。サンプルを室温で２時間混合した後、骨ホモジネートに結合した画分と結合していない画分を遠心分離によって分離できる。骨ホモジネート画分をＰＢＳで３回洗浄することができ、最終ホモジネートペレットは１００μＬのＰＢＳに懸濁され得る。懸濁骨ホモジネート及び１００μＬの非結合タンパク質懸濁液は、蛍光プレートリーダーを使用して相対蛍光Ｆｃ融合濃度について定量化できる。

【0137】

インビトロでの骨ホモジネートに対する相対的タンパク質親和性の決定
骨結合タンパク質の相対的親和性をランク付けするために、複数回投与アッセイを開発することができる。骨ホモジネートに効率的に結合するタンパク質について、相対的解離速度は、この動的タンパク質対骨交換アッセイによって決定された。１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内で飽和濃度（１μＭ）の非標識骨結合タンパク質を５ｍｇの骨ホモジネートとインキュベートすることにより、タンパク質を個別に評価できる（例えば、チューブごとに１つのタンパク質タイプ）。非標識タンパク質との２４時間のインキュベーション後、骨ホモジネートを遠心分離（１６，０００ｒｃｆ、５分間）して、過剰な非結合タンパク質を除去することができる。所与の骨結合タンパク質で飽和した骨ホモジネートは、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）蛍光プローブで標識された同じ骨結合タンパク質の０．５μＭ溶液に再懸濁し、１、２、４、８及び２４時間インキュベートした後、骨ホモジネートを遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄し、９６ウェル黒色プレートに移すことができる。最初の遠心分離からの上清も収集して、懸濁液中に残った（非結合）蛍光タンパク質の量を定量化することができる。蛍光プレートリーダーを使用して、各時点での結合及び非結合の蛍光標識タンパク質の量を定量化し得、これにより非標識タンパク質の解離速度の速度論的表現が可能になる。

【0138】

ＡＬＰ活性の代謝アッセイ（ＭＵＰ）
タンパク質サンプル（上清、部分精製又はカラム精製サンプル）は、人工基質としてリン酸４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＰ）を使用して溶液中のＡＬＰ活性についてアッセイされ得る。４－ＭＵＰのホスホエステル結合の加水分解により、蛍光化合物４－メチルウンベリフェロンが放出され、これは、蛍光光度計で簡単に検出できる。産物の定量は、０、１．２５ｕＭ、２．５ｕＭ、５ｕＭ、１０ｕＭ及び２０ｕＭの標準濃度で、同じプレートで測定された４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）標準曲線を使用して実行され得る。４－ＭＵの１０ｍＭストック溶液をエタノールで調製し、アッセイバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン］で希釈できる。精製した融合タンパク質サンプルは、アッセイバッファー中０．１ｍｇ／ｍＬ溶液として調製し、アッセイバッファーでのアッセイに適した最終濃度（例えば、１ｎＭ）に段階希釈することができる。４－ＭＵＰストック溶液はアッセイバッファーで調製した。アッセイを開始する前に、タンパク質サンプルに最終濃度１０ｕＭで４－ＭＵＰを添加することにより、全ての溶液を３７℃にし得る。４－ＭＵの産生は、３６０ｎｍの励起波長及び４６５ｎｍの発光波長で測定され得る。データは、３７℃に保持されたプレートリーダーで４０秒ごとに合計２０分間収集され得る。反応速度は、活性の単位で線形回帰によって計算され、ここで、１Ｕ＝１マイクロモルの加水分解された４－ＭＵＰ／分である。比活性は、アッセイされたタンパク質の単位／ｍｇで計算することができる。

【0139】

プレート骨アッセイ
骨ホモジネート画分は、ＡＬＰ活性についてアッセイすることができる。骨ホモジネート画分を１００μＬのＰＢＳに懸濁し、９６ウェル黒色プレートに移すことができる。１００μＬの非結合タンパク質懸濁液も９６ウェルプレートの別々のウェルに移すことができる。各ウェルに、１００μＬのＡＬＰ検出溶液（１０μＭ ４－ＭＵＰ、１％ＢＳＡ）を加え、動的蛍光読み取り（３６０／４６５）を直ちに開始し、２０分間実行し、３０秒ごとに蛍光強度発光を収集することができる。時間に対する蛍光強度の傾きは、各サンプル画分のＡＬＰ濃度を表し得る。

【0140】

直線性を維持するために、試験したコンストラクトの結合画分及び非結合画分のＭＵＰ活性を最初の５分間の初期活性勾配によって測定し得る。ＭＵＰ活性の比率は、各融合タンパク質について、比率＝（結合活性）／（非結合活性）として決定され得る。

【0141】

血清アッセイにおけるタンパク質活性
血清サンプルをアッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４及び１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１００倍～６，０００倍に希釈して、ｐＫを測定することができる。希釈されたサンプルは定量化でき、標準曲線は既知の活性及び濃度のアスフォターゼアルファに基づいて作成できる。時間に対する蛍光強度の傾きは、単位／ｍＬ血清の関数としての各サンプル画分におけるＡＬＰ活性に対応する４－ＭＵ産生の速度を表し得る。

【0142】

マウスにおけるインビボ蛍光イメージング
半定量的生体内分布研究は、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０標識骨標的化タンパク質及びタンパク質フラグメント（例えば、ＶＨＨ）を使用してヌードマウスで実施できる。骨標的ＡＬＰ－Ｆｃ融合タンパク質及び骨標的ＶＨＨは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳＡＩＶＩキット（活性化スクシンイミジルエステルを介した共有結合）を使用してＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０で蛍光標識し、ゲル排除樹脂で精製して非コンジュゲートフルオロフォアを除去できる。精製されたタンパク質（ＰＢＳに懸濁）は、約３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈を介してヌードマウスに注射することができる。

【0143】

雌性Ｊ：ＮＵ非近交系マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）は、容量を正規化した１００μＬの尾静脈注射により３ｍｇ／ｋｇの被験物質を投与され得る。インビボ画像取得のために、対象は、イメージングプラットフォーム（ＩＶＩＳスペクトルイメージングシステムＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で２～３％のイソフルラン麻酔下に維持することができる。視野（ＦＯＶ）Ｃ、Ｆ／Ｓｔｏｐ２、ミディアムビニング及び８００ｎｍ発行／７５０ｎｍ励起フィルターを備えた自動露出設定が、２Ｄ落射照明及び３Ｄ透過照明の両方の取得に使用された。エクスビボ組織標本の２Ｄ落射照明蛍光イメージングは、各組織タイプの全ての標本を単一の画像で同時に取得できることを除き、同一条件下で取得できる。全ての動物実験は、動物福祉法（Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ）の規定及び実験動物の管理及び使用に関するガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）の原則に従って実施される。

【0144】

蛍光画像解析は、製造元提供の２Ｄ／３Ｄソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．５．１，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して実行できる。対象の各セットに適用される均一な領域の関心領域（ＲＯＩ）は、対象の位置の違いを考慮して手動で配置された。縦断的なインビボ画像カラースケール範囲は、全ての対象及び時点で正規化できる。エクスビボ標本のカラースケールは、各組織セットの蛍光シグナルを最もよく表すように個別に決定され得る。

【0145】

ピロリン酸加水分解アッセイ
本明細書に記載のポリペプチドは、天然基質であるピロリン酸に対する活性についてアッセイされ得る。ピロリン酸加水分解は、リン酸の結合時に明緑色に変化するＰｉＢｌｕｅアッセイ試薬（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、産物であるリン酸アニオンを検出することによって測定することができる。各ウェルのリン酸塩レベルの定量化は、アッセイプレートで読み取られ得るアッセイバッファーで作製されたリン酸塩溶液の標準曲線を使用して実施できる。ピロリン酸ナトリウム十水和物（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のストック溶液は、純水中で１０ｍＭの濃度で調製できる。精製した融合タンパク質サンプルは、アッセイバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン］中０．１ｍｇ／ｍＬ溶液として調製され、アッセイバッファーでのアッセイに適した最終濃度に段階希釈した。アッセイ用のピロリン酸サンプルは、アッセイバッファーでストック溶液を希釈して調製され得る。反応を開始する前に、全ての溶液を３７℃にした。透明な９６ウェルプレートにタンパク質溶液を加え、プレートを３７℃に保持されたＪｉｔｔｅｒｂｕｇプレートシェーカーに入れた。反応の開始は、タンパク質溶液にピロリン酸溶液を添加することによって実施され得る。典型的には、ピロリン酸加水分解反応は、同じプレート内で、０ｕＭ、１．５６ｕＭ、３．１２ｕＭ、６．２５ｕＭ、１２．５ｕＭ、２５ｕＭ、５０ｕＭ、１００ｕＭ、２００ｕＭ及び４００ｕＭのピロリン酸濃度で、同時に実施され得る。各ピロリン酸濃度で８つの反応ウェルを設定し、ピロリン酸をプレートに加えてから０、１、２、３、４、５、６及び７分が経過した後、ＰｉＢｌｕｅ試薬（最終反応容量と同じ容量で添加）を加えることにより、反応を停止できる。ＰｉＢｌｕｅ試薬を加えると、検出試薬のｐＨが低下し、酵素が不活性化されるため、それ以上の反応が停止する。６２０ｎｍでの吸光度を読み取る前に、プレート内で３０分間発色させることができる。各ピロリン酸濃度での反応速度は、個々の時点から進行曲線を構成することによって計算され得る。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ酵素反応速度論的適合を使用し、各濃度での反応速度を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍのＫｍ及びＶｍａｘ値が計算され得る。ｋｃａｔ値は次のように計算された。Ｖｍａｘ／（分析されたモルタンパク質）＝ｋｃａｔ。

【0146】

ピリドキシル－５’－リン酸加水分解アッセイ。
アルカリホスファターゼの第２の天然基質はピリドキシル－５’リン酸（ＰＬＰ）である。ポリペプチドは、ＰＬＰ加水分解の産物であるピリドキシルがＭ．ｌｏｔｉテトラメトリックピリドキシルデヒドロゲナーゼ（ｔＰＬＤＨ、配列番号２４６）によって蛍光ピリドキソラクトンに変換される結合アッセイ形式で、ＰＬＰに対する活性についてアッセイすることができる。６ｘＨｉｓタグ付きｔＰＬＤＨの遺伝子は、標準的な方法で合成され、Ｔ７プロモーターの制御下で細菌発現プラスミドにクローニングすることができる。６ｘＨｉｓタグ付きｔＰＬＤＨは、標準プロトコルを使用してＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現され、標準アフィニティークロマトグラフィー法で精製された。遠心分離濃縮、すなわちＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５スピン濃縮器を使用してタンパク質を１９００ｕＭの濃度に濃縮し、アッセイで使用するまで－８０℃で凍結することができる。精製した融合タンパク質サンプルは、アッセイバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン］中の０．１ｍｇ／ｍＬ溶液として調製できる。段階希釈された最終サンプルは、ピリドキソラクトン標準（アッセイバッファーで作製）と共に、黒色９６ウェルプレートに配置することができる。タンパク質サンプルに、ＮＡＤ^＋、ｔＰＬＤＨ及びＰＬＰ溶液（アッセイバッファーで作製）を加えて、最終濃度を３ｍＭ ＮＡＤ＋、４ｕＭ ｔＰＬＤＨ及び３ｕＭ ＰＬＰとし、混合することができる。反応を開始する前に、全ての溶液を３７℃にし、反応プレートを３７℃でインキュベートでき、蛍光は３５５ｎｍでの励起によって検出され、発光は４４５ｎｍで測定される。生成されたピリドキソラクトン産物の量は、プレートのピリドキソラクトンウェルから測定された蛍光から生成された標準曲線を使用して計算できる。反応速度は、産生したピリドキシルμモル／分単位の進行曲線の線形回帰によって計算できる。比活性は、反応速度をアッセイ反応で使用されるタンパク質濃度で割ることによって計算できる。

【0147】

マウスモデルにおける薬物動態分析
１１～１２週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に、４～７ｍｇ／ｋｇの単回注射で、尾静脈又は皮下に、滅菌ＰＢＳ（カルシウム又はマグネシウムなし）中の１ｍｇ／ｍＬのサンプルタンパク質を投与し、１４～２１日間フォローすることができる。２回の中間採血及び１回の終末採血（心臓穿刺、ＣＯ_２麻酔）を、各マウスで、コホート内でずらして実行することができる（４つの群のそれぞれに４匹のマウス、分子ごと、投与タイプごと）。血液サンプル（１００μＬ、遠心分離後に５０μＬの血漿を生成）は、０．２５、１、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１９２、２６４、３３６及び４８０時間でＬｉ／ヘパリン処理チューブに収集できる。血液サンプルは、血漿へと処理されるまで４℃で保存できる。血漿サンプルは液体窒素で急速凍結し、－８０℃で保存し、さらに定量することができる。

【0148】

インビボマウスＨＰＰモデル
有効性は、インビボマウスＨＰＰモデルで測定できる。この予防的研究では、処置は出生時に開始し、３５日間継続することができる。ポリペプチド又はビヒクル（ＰＢＳ）をＡｋｐ２ＧＷ^－／－マウスの肩甲骨領域に皮下投与することができる。処置終了時に評価できる有効性エンドポイントは、生存率、骨石灰化障害及び成長（体重）であった。動物の一般的な幸福の指標として、体重も毎日評価することができる。年齢及び同腹子を一致させたＰＢＳ処理ＷＴマウスを参照対照として使用することができる。動物は、２４日目までポリペプチドの毎日の皮下注射を受け得る。２５日目に、ポリペプチドの１日皮下用量を最初の投与量の半ログ（ｈａｌｆ－ｌｏｇ）だけ減少させ、３５日目の最後の処置用量まで維持し得る。

【0149】

医薬組成物、製剤及び投与
ｓＡＬＰ又はｓＡＬＰ融合ポリペプチドを含む本明細書に記載のポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、当技術分野で知られている様々な方法によって医薬組成物として製剤化することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／又は様式を使用して、製剤を規定することができる。投与経路は、環境及び治療目標など、様々な要因によって異なり得る。特に、本明細書に記載のポリペプチド及び融合ポリペプチドは、当技術分野で知られている任意の経路、例えば、皮下（例えば、皮下注射による）、静脈内、経口、鼻腔内、筋肉内、舌下、髄腔内又は皮内による投与のための製剤であり得る。例として、医薬組成物は、液体、溶液、懸濁液、ピル、カプセル、錠剤、ゲルキャップ、粉末、ゲル、軟膏、クリーム、噴霧剤、ミスト、噴霧蒸気、エアロゾル又はフィトソームの形態であり得る。

【0150】

製剤
ｓＡＬＰ及びｓＡＬＰ融合ポリペプチドを含む組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、標準的な方法に従って製剤化することができる。医薬製剤は十分に確立された技術であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｌｌｅｎ，Ｅｄ．２０１２；Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”７^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；及びＫｉｂｂｅ（２０００）“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，”３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）でさらに説明される。例えば、ｓＡＬＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、例えば、適切な濃度で、２～８℃（例えば、４℃）での保存に適した緩衝液として製剤化することができる。組成物は、０℃未満の温度（例えば、－２０℃又は－８０℃）での貯蔵のために製剤化することもできる。組成物は、２～８度で最大２年間（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１年半又は２年）の保存のためにさらに製剤化することができる。したがって、本明細書に記載の組成物は、２～８℃（例えば、４℃）で少なくとも１年間の貯蔵において安定であり得る。組成物は、適切な容量、例えば、約０．１ｍＬ～約１０ｍＬの容量で製剤化することができる。

【0151】

ｓＡＬＰ及びｓＡＬＰ融合ポリペプチドを含む組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、様々な形態であり得る。これらの形態には、例えば、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソーム及び坐剤などの液体、半固体及び固体の剤形が含まれる。好ましい形態は、部分的に、意図された投与様式及び治療用途に依存する。

【0152】

例えば、全身的又は局所的送達を目的とした組成物は、注射可能又は注入可能な溶液の形態であり得る。したがって、組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、非経口様式（例えば、皮下、静脈内、腹腔内又は筋肉内注射）による投与用に製剤化することができる。「非経口投与」、「非経口的に投与される」及び本明細書で使用される他の文法的に同等の句は、通常は注射による経腸及び局所投与以外の投与様式を指し、皮下、皮内、静脈内、鼻腔内、眼内、肺、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮膚内、肺内、腹腔内、経気管、皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内及び胸骨内注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。特定の投与経路には、静脈内及び皮下投与が含まれる。

【0153】

ｓＡＬＰ及びｓＡＬＰ融合ポリペプチドを含む組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、溶液、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム又は高濃度での安定した保存に適した他の秩序構造として製剤化することができる。滅菌注射液は、本明細書に記載の組成物を、必要な量で、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒に組み込んだ後、フィルター滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、本明細書に記載の組成物を、基本的な分散媒及び上記に列挙したものから必要な他の成分を含む、滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法には、本明細書に記載の組成物に加えて、以前に滅菌ろ過された溶液から任意のさらなる所望の成分（以下を参照されたい）の粉末が得られる、真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持により、且つ界面活性剤の使用により維持することができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる試薬、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。

【0154】

本明細書に記載の組成物は、免疫リポソーム組成物に製剤化することもできる。そのような製剤は、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：３６８８；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４０３０；及び米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び米国特許第４，５４４，５４５号明細書に記載されている方法などの当技術分野で知られている方法によって調製することができる。循環時間が増強されたリポソームは、例えば、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。

【0155】

ｓＡＬＰ及びｓＡＬＰ融合ポリペプチドを含む組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの急速放出から組成物（例えば、ｓＡＬＰポリペプチド又はｓＡＬＰ融合ポリペプチド）を保護する担体を用いて製剤化することもできる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が当技術分野で公知である。例えば、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９７８）“Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，” Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。

【0156】

ｓＡＬＰ又はｓＡＬＰ融合ポリペプチドを含む組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、透明で無色～わずかに黄色の水溶液、ｐＨ７．４の注射用溶液として製剤化することができる。ｓＡＬＰ又はｓＡＬＰポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、１２ｍｇ／０．３ｍＬ、１８ｍｇ／０．４５ｍＬ、２８ｍｇ／０．７ｍＬ、４０ｍｇ／１ｍｌ又は８０ｍｇ／０．８ｍＬの濃度で製剤化され得る。ｓＡＬＰ又はｓＡＬＰポリペプチド（例えば、１２ｍｇ／０．３ｍＬ、１８ｍｇ／０．４５ｍＬ、２８ｍｇ／０．７ｍＬ、４０ｍｇ／１ｍｌ又は８０ｍｇ／０．８ｍＬの濃度で製剤化されたもの）は、塩化ナトリウム及び／又はリン酸ナトリウムなどの担体（例えば、約１５０ｍＭのＮａＣｌ及び／又は約２５ｍＭのリン酸ナトリウム、特に約７．４のｐＨ）を用いて製剤化され得る。特に、組成物は、注射用の４０ｍｇ／ｍｌ溶液として製剤化することができ、ここで、溶液の各ｍｌは、４０ｍｇのｓＡＬＰ又はｓＡＬＰポリペプチドを含む（例えば、各バイアルは０．３ｍｌの溶液及び１２ｍｇのｓＡＬＰ（４０ｍｇ／ｍｌ）を含むか、各バイアルは０．４５ｍｌの溶液及び１８ｍｇのｓＡＬＰ（４０ｍｇ／ｍｌ）を含むか、各バイアルは０．７ｍｌの溶液及び２８ｍｇのｓＡＬＰ（４０ｍｇ／ｍｌ）を含むか、又は各バイアルは１．０ｍｌの溶液及び４０ｍｇのｓＡＬＰ又はｓＡＬＰポリペプチド（４０ｍｇ／ｍｌ）を含む）。ｓＡＬＰ又はｓＡＬＰポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で注射用溶液として製剤化することができ、ここで、各１ｍｌの溶液は、１００ｍｇのｓＡＬＰ又はｓＡＬＰポリペプチドを含む（例えば、各バイアルは０．８ｍｌの溶液及び８０ｍｇのアスフォターゼアルファ（１００ｍｇ／ｍｌ）を含む）。ｓＡＬＰは、約０．１ｍｇ～約５００ｍｇが約０．０１ｍＬ～約１０ｍＬの容量で存在するように製剤化され得る。

【0157】

組成物を第２の活性剤と組み合わせて使用する場合、組成物を第２の薬剤と共に製剤化するか、又は組成物を第２の薬剤配合物とは別に製剤化することができる。例えば、それぞれの医薬組成物は、例えば、投与の直前に混合することができ、一緒に投与することができるか、又は別々に、例えば同時に若しくは異なる時間に投与することができる。

【0158】

ｓＡＬＰ及びｓＡＬＰ融合ポリペプチドを含む組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、静脈内ガンマグロブリン療法（ＩＶＩＧ）、プラスマフェレーシス、血漿置換又は血漿交換と共に、対象への投与又は胎児に投与される場合、そのような胎児を妊娠している女性への投与のために製剤化できる。

【0159】

担体／ビヒクル
ｓＡＬＰ又はｓＡＬＰ融合ポリペプチドを含む調製物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、薬学的に許容される無菌の水性又は非水性溶媒、懸濁液又は乳濁液と組み合わせて、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象に提供することができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油及び注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、水－アルコール溶液、生理食塩水を含むエマルジョン又は懸濁液及び塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース溶液、デキストロース＋塩化ナトリウム溶液、ラクトースを含むリンゲル溶液又は固定油を含む、緩衝医療非経口ビヒクルが含まれる。例えば、薬学的に許容される担体は、塩化ナトリウム及び／又はリン酸ナトリウムを含むことができ、その組成物は、例えば、約１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び／又は約２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４を含む。

【0160】

静脈内ビヒクルは、流体及び栄養補給剤、リンガーのデキストロースに基づくものなどの電解質補充剤などを含み得る。薬学的に許容される塩をその中に含めることができ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩である。さらに、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、そのようなビヒクル中に存在することができる。薬学的に許容される担体の徹底した議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｌｌｅｎ，Ｅｄ．２０１２で見ることができる。

【0161】

投与量
本明細書に記載のｓＡＬＰポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象に、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０５ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～６０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ又は２．０ｍｇ／ｋｇ～３．０ｍｇ／ｋｇ）又は１μｇ／ｋｇ～１，０００μｇ／ｋｇ（例えば、５μｇ／ｋｇ～１，０００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～７５０μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ～７５０μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～７５０μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～５０μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ～５０μｇ／ｋｇ又は１０μｇ／ｋｇ～５０μｇ／ｋｇ）の範囲の個別用量で投与することができる。

【0162】

ｓＡＬＰの例示的な用量には、例えば、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、２．５、５、１０、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０又は５００ｍｇ／ｋｇ；又は１、２、２．５、５、１０、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、９００又は１，０００μｇ／ｋｇが含まれる。本明細書に記載されている全ての投与量又は範囲について、「約」という用語を使用して、記載されている値又は範囲の終点の±１０％だけこれらの投与量を変更することができる。特に、本開示による組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約５００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日又は約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量で対象に投与することができる。例えば、ｓＡＬＰ組成物（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ／週～約１４０ｍｇ／ｋｇ／週、例えば、約０．８ｍｇ／ｋｇ／週～約５０ｍｇ／ｋｇ／週又は約１ｍｇ／ｋｇ／週～約１０ｍｇ／ｋｇ／週（例えば、約６又は約９ｍｇ／ｋｇ／週）の範囲の毎週の投与量で対象に投与することができる。特に、ｓＡＬＰは、週に１回以上（例えば、週に１、２、３、４、５、６、７回又はそれを超える）、隔週に１回以上、１ヶ月に１回以上（例：１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日又は３０日ごとに１回）投与することができる。

【0163】

特に、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、２ｍｇ／ｋｇを週３回（総用量６ｍｇ／ｋｇ／週）、１ｍｇ／ｋｇを週６回（総用量６ｍｇ／ｋｇ／週）、３ｍｇ／ｋｇを週３回（総用量９ｍｇ／ｋｇ／週）、０．５ｍｇ／ｋｇを週３回（総用量１．５ｍｇ／ｋｇ／週）又は９．３ｍｇ／ｋｇを週３回（総用量２８ｍｇ／ｋｇ／週）の投与量で投与することができる。投与量は、疾患の程度及びＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象とは異なるパラメータなどの従来の要因に従って、臨床医によって適合され得る。代わりに、０．１ｍｇ／ｋｇ～９ｍｇ／ｋｇを週に１回投与することができる。

【0164】

ｓＡＬＰ及びｓＡＬＰ融合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を含む組成物の投与量は、単一又は複数の投与レジメンのいずれかで提供することができる。用量は、例えば、毎時、隔時間、毎日、隔日、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回、毎週、隔週、毎月、隔月又は毎年投与することができる。代わりに、用量は、例えば、１日、１週間又は１ヶ月に２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回又は１２回投与することができる。特に、投与レジメンは週に一回である。投薬レジメンの期間は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９若しくは３０日、週若しくは月又はＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか若しくはそれを発症しやすい対象の残存寿命であり得る。投与量、頻度及び投与期間は、疾患の程度及びＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象とは異なるパラメータなどの従来の要因に従って、臨床医によって適合されるであろう。

【0165】

例えば、ｓＡＬＰ又はｓＡＬＰ融合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与量は、週に１回以上（例えば、２、３、４、５、６又は７回）、皮下又は静脈内投与される、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。

【0166】

核酸及びポリペプチドの産生
ｓＡＬＰ及びｓＡＬＰ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、当技術分野で知られている任意の方法で産生することができる。ポリヌクレオチドは、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つ（例えば、配列番号７２、１２３、１５５又は１７７のいずれか１つ）に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６５～２６８のいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％）の配列同一性を有し得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６５～２６８のいずれか１つを含み得るか又はそれからなり得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６５を含み得るか又はそれからなり得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６６を含み得るか又はそれからなり得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６７を含み得るか又はそれからなり得る。ポリヌクレオチドは、配列番号２６８を含み得るか又はそれからなり得る。

【0167】

典型的には、所望の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、分子クローニング法を使用して生成され、一般に、プラスミド又はウイルスなどのベクター内に配置される。ベクターは、ポリヌクレオチドを融合ポリペプチドの発現に適した宿主細胞に形質転換するために使用される。代表的な方法は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に開示されている。多くの細胞型を適切な宿主細胞として使用することができるが、適切な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はシアル化）を付与することができるため、哺乳動物細胞が好ましい。本開示の宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ－７細胞又は当技術分野で知られている他の任意の適切な宿主細胞を含み得る。例えば、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞）又はＨＥＫ２９３細胞である。

【0168】

ｓＡＬＰ及びｓＡＬＰ融合ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、宿主細胞におけるｓＡＬＰポリペプチドの発現をもたらすのに適した任意の条件下で産生することができる。そのような条件には、緩衝剤、重炭酸塩及び／又はＨＥＰＥＳ、塩化物、リン酸、塩化物、リン酸塩、カルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄などのイオン、単糖、アミノ酸、潜在的に脂質、ヌクレオチド、ビタミン及びインスリン様成長因子などの炭素源；２～４ｍＭのＬ－グルタミン及び５％のウシ胎児血清を添加したアルファＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ－Ｆ１２、ＩＭＤＭなどの通常の市販培地；２～４ｍＭのＬ－グルタミンを添加した、ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）ＳＦＭ４ＣＨＯ、Ｓｉｇｍａ ＣＨＯ ＤＨＦＲ^－、Ｃａｍｂｒｅｘ ＰＯＷＥＲ（商標）ＣＨＯ ＣＤなどの動物性タンパク質を含まない通常の市販培地の適切な選択が含まれる。これらの培地は、選択圧を維持し、安定したタンパク質産物の発現を可能にするために、チミジン、ヒポキサンチン及びＬ－グリシンなしで調製されることが望ましい。

【0169】

バルクタンパク質を製造するための大スケールの方法は、例えば、国際公開第２０１７／０３１１１４号パンフレット及び国際公開第２０１７／２１４１３０号パンフレットに記載されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0170】

処置方法
ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象の少なくとも１つの症状を処置又は改善するための方法が本明細書で提供される。骨折、骨粗鬆症、硬化性骨症、軟骨石灰化症、筋緊張低下症、デュシェンヌ筋ジストロフィー、気管気管支軟化症、発作、神経線維腫症１（ＮＦ－１）及び頭蓋骨癒合症などの他の疾患又は障害も、本明細書に記載の組成物及び方法によって処理することができる。対象は、筋力低下を有し得る。対象は、ピロリン酸カルシウム沈着（ＣＰＰＤ）又は家族性低リン血症などの筋力低下疾患を有し得る。そのような処置は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドを投与して、そのような対象における上昇したＰＰｉ濃度を低下させることを含み得る。例えば、可溶性アルカリホスファターゼ（ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、新生児、子供、青年又は成人に投与され得る。

【0171】

対象は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与前に、骨石灰化障害（例えば、ＨＰＰ）と診断され得る。さらに、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、以前にｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）で処置されたことがないナイーブな対象であり得る。

【0172】

方法は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を、ある期間にわたって単回又は複数回の投与で、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象に投与することを含む。特に、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列を有するポリペプチドなどのｓＡＬＰを、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）濃度が上昇しているか、又はＨＰＰ症状（例えば、筋力低下）に対して少なくとも１つの所定のバイオマーカー／スコア（１０未満の平均ＢＯＴ－２強度スコア、５未満の平均ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコア、約０．８を超える平均ＣＨＡＱ指数スコア及び／又は約４０未満の平均ＰＯＤＣＩスコア並びに予測された６ＭＷＴ値の約８０％未満の平均６ＭＷＴ、５未満の筋力グレード及び／又は例えば予測されたＨＨＤ値の約８０％未満の平均ＨＨＤ値（例えば、平均ＨＨＤ筋力又は握力値）など）を有すると以前に判断された対象に投与することができる。例えば、ｓＡＬＰは、乳児又は小児（例えば、約１２歳未満の対象）の場合、約５．７１μＭ超；青年（例えば、約１３歳～約１８歳の対象）の場合、約４．７８μＭ超；又は成人（例えば、約１８歳を超える対象）の場合、約５．８２μＭ超のサンプル（例えば、血漿サンプル）中のＰＰｉの濃度を有すると以前に決定された対象に投与することができる。他の実施形態において、本明細書に記載のＨＰＰなどの骨石灰化障害は、少なくとも１つのアルカリホスファターゼ基質（例えば、ＰＰｉ、ＰＬＰ、ＰＥＡなど）の濃度の上昇によって引き起こされる。代わりに、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、筋力低下スコア（例えば、ＢＯＴ－２強度スコア、ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコア、ＣＨＡＱ指数スコア、ＢＳＩＤ－ＩＩＩスケールスコア、ＰＤＭＳ－２標準スコア、筋力スコア、６ＭＷＴ値及び／又はＨＨＤ値を使用）を決定する前に、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象に投与することができる。本明細書に記載の方法によるＡＬＰによる処置は、例えば、ＡＤＬの活性の増加、痛みの減少及び／又は運動発達の改善を促進する。

【0173】

さらに、本明細書に記載のＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の、それぞれの記載されているスコア（例えば、ＢＯＴ－２強度スコア、ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコア、ＣＨＡＱ指数スコア、ＢＳＩＤ－ＩＩＩスケールスコア、ＰＤＭＳ－２標準スコア、６ＭＷＴ、１２－ＰＯＭＡ－Ｇ、修正されたパフォーマンス指向の移動性評価（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｂｏｎｅ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ４：Ｐ１３６に示されているようなｍＰＯＭＡ－Ｇ）又はＨＨＤ値）は、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を使用した処置効果を評価するために、単独又は任意の組み合わせで使用でき、ここで、特定のテストスコアと比較した改善は、ｓＡＬＰがＨＰＰなどの骨石灰化障害の処置に有効であることを示す。

【0174】

例えば、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）のＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象への投与がＢＯＴ－２強度スコアの約１０又は約１０超への平均増加を生じる（対象の以前の平均ＢＯＴ－２強度スコアが約１０未満であった）場合、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの処置は、例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する身体的障害を処置するのに有効である。代わりに、ｓＡＬＰの投与がＢＯＴ－２強度スコアの約１０又は約１０超への平均増加を生じない場合、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与量及び／又は頻度を変更して、対象に対するアルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの有効量を決定することができる。例えば、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与量は、例えば、約０．５～３ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約３～６ｍｇ／ｋｇ／週から約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【0175】

代わりに、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）のＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象への投与が、１つ以上の対象の筋力グレードの分類の改善（例えば、以前のより低い筋力グレードからの１、２、３、４又は５の筋力グレードへの改善）を生じる（対象の以前の平均筋力グレードが約５未満であった）場合、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの処置は、例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する身体的障害を処置するのに有効である。代わりに、ｓＡＬＰの投与が、以前のより低い筋力グレードからの、１つ以上の対象の筋力グレードの分類の改善を生じない場合、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与量及び／又は頻度を変更（例えば、増加）して、対象に対するアルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの有効量を決定することができる。例えば、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与量は、例えば、約０．５～３ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約３～６ｍｇ／ｋｇ／週から約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【0176】

診断及び／又は処置のためのバイオマーカー／エンドポイント
骨石灰化（例えば、本明細書に記載されるような周産期ＨＰＰ、乳児ＨＰＰ、小児ＨＰＰ及び歯限局型低ホスファターゼ血症、ＨＰＰ様疾患、ＣＰＰＤ及び家族性低リン血症を含むＨＰＰなど）は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）で処置することができる。本明細書に記載の方法は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の診断、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の識別又はＨＰＰなどの骨石灰化障害の処置の有効性の試験にも有用である。例えば、対象が特定の特徴的なバイオマーカー又は測定基準スコアを有するとして特徴付けられる場合、対象は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすいと診断され得る。対象は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）で処置され得、処置の有効性又は効果は、特徴的なバイオマーカー又は測定基準スコアを使用して分析され得る。そのようなバイオマーカーには、例えば、血清、骨又は筋肉組織又は対象の尿中の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）濃度の上昇及び／又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の低下が含まれ得る。筋力低下処置の有効性を決定するための本明細書に記載の方法において有用な例示的な測定基準は、（１）Ｂｒｕｉｎｉｎｋｓ－Ｏｓｅｒｅｔｓｋｙ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ第２版（ＢＯＴ－２）、（２）小児健康評価質問票（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（ＣＨＡＱ）、（３）小児転帰データ収集ツール（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＰＯＤＣＩ）、（４）乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケール（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、第３版（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）、（５）Ｐｅａｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｓｃａｌｅｓ、第２版（ＰＤＭＳ－２）、（６）６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）、（７）筋力グレード、及び（８）ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）を含み得、これらは、以下でさらに詳細に説明される。

【0177】

骨の治癒及び石灰化
ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、骨石灰化のレベルに基づき、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）による処置のために特定することができる。例えば、骨石灰化は、患者をＨＰＰなどの骨石灰化障害を有すると診断するため又は本明細書に記載のポリペプチドの有効性を試験するための測定基準として使用され得る。骨石灰化障害（例えば、ＨＰＰ）を有する対象において、ｓＡＬＰの投与は、処置の成功後の対象における骨治癒の増加をもたらす。

【0178】

骨の治癒が減少すると、骨が失われ、石灰化が減少して、２つ以上の骨が分離する。骨の治癒及び石灰化の低下は、参照骨と比較され得る。骨の治癒及び石灰化の減少を特定する方法は常用であり、Ｘ線撮影及びコンピューター断層撮影（ＣＴ）などの非侵襲的技術が含まれる。典型的には、対象の関連領域の画像は、ｓＡＬＰ処置の前及び１つ以上の後の時点で撮影することができ、画像を比較して処置効果を評価することができる。骨の治癒及び／又は石灰化の低下は、不透明度の低下として識別できる。画像は、ｓＡＬＰ処置中いつでも撮影でき、ｓＡＬＰ ＥＲＴ処置の開始後、例えば、１、２、３、４、５、６日、週、月、年のタイミング又は有効性の低下が疑われる場合に撮影できる。対象の骨治癒及び／又は石灰化の減少は、ｓＡＬＰ処置期間の開始後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２週間又は月で検出可能になり得る。対象の骨治癒及び／又は石灰化の減少は、場合によりｓＡＬＰ ＥＲＴ処置期間の開始後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２週間、月又は年にわたって持続し得る。骨の治癒及び石灰化の増加は、ｓＡＬＰの有効性が回復し、治療後に骨石灰化障害（ＨＰＰなど）が効果的に処置されていることを確認するために使用され得る。

【0179】

骨密度（ＢＭＤ）
ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、ＢＭＤレベルに基づき、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）による処置のために特定することができる。ＢＭＤの低下（例えば、正常な対象と比較して）は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有すると患者を診断するための測定基準として使用され得る。

【0180】

ＢＭＤの減少を使用して、ＥＲＴ中のｓＡＬＰ（例えば、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つのポリペプチド）の有効性をモニターすることができる。ＢＭＤを測定する方法は当技術分野で知られており、例えば、骨生検、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ又はＤＥＸＡ）、末梢定量的ＣＴ（ｐＱＣＴ）、高解像度ｐＱＣＴ（ＨＲ－ｐＱＣＴ）及び定量的超音波（ＱＵＳ）を含む。測定は、ＣＴハウンスフィールド測定を含む任意の常用の方法で行うことができ、結果を標準データベース又は対照対象と比較することができる。ＢＭＤは、Ｚスコア又はＴスコアとして報告される場合がある。処置前のＢＭＤ値は、ｓＡＬＰ ＥＲＴ処置中いつでも測定でき、ｓＡＬＰ ＥＲＴ処置の開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日、週、月又は年のタイミングで撮影できる。処置後の基準点のＢＭＤ値は、例えば、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％又は１％減少し得る。ｓＡＬＰ処置の開始後の基準点のＢＭＤ値の減少も変化しないか又は変化が検出されない可能性がある。ＢＭＤの増加は、ｓＡＬＰの有効性が回復し、治療後に骨石灰化障害（ＨＰＰなど）が効果的に処置されていることを確認するために使用され得る。

【0181】

血漿無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）濃度
ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、対象からの血漿又は尿サンプルなどのサンプル中の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及び／又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）濃度を測定することにより、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）による処置のために特定することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５（４）：１４４０－１４４５）に詳細に説明されるように、当業者に知られている任意の方法を使用して、血漿サンプル又は代替的に尿サンプル中のＰＰｉ及び／又はＡＬＰ濃度を定量化することができる。血漿又は尿サンプル中のＰＰｉ濃度を定量化する方法も、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７７（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３：６１－６３），Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９７８（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１：５５７－５６５），及びＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９６８（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１３７－１４５）に記載される。

【0182】

特に、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）は、血漿ＰＰｉ濃度が最大約６μＭ（例えば、約４．５μＭ、約５μＭ若しくは約５．５μＭ又は約４．５μＭ～約６μＭの範囲内の血漿ＰＰｉ濃度）であると以前に決定された、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象に投与することができる。例えば、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、約５．７１μＭ以上の血漿ＰＰｉ濃度を有する乳児又は小児（例えば、約１２歳未満の対象）；約４．７８μＭ以上の血漿ＰＰｉ濃度を有する青年（例えば、約１３歳～約１８歳の対象）；又は約５．８２μＭ以上の血漿ＰＰｉ濃度を有する成人（例えば、約１８歳を超える対象）に投与される。さらに、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドは、血漿ＡＬＰ濃度が、例えば、０～１４日齢の対象で約９０Ｕ／Ｌ以下；１５日齢～１歳未満の対象で約１３４Ｕ／Ｌ以下；約１歳～１０歳未満の対象で約１５６Ｕ／Ｌ以下；約１０歳～約１３歳未満の対象で約１４１Ｕ／Ｌ以下；約１３歳～約１５歳未満の雌性対象で約６２Ｕ／Ｌ以下；約１３歳～約１５歳未満の雄性対象で約１２７Ｕ／Ｌ以下；約１５歳～約１７歳未満の雌性対象で約５４Ｕ／Ｌ以下；約１５歳～約１７歳未満の雄性対象で約８９Ｕ／Ｌ以下；約１７歳以上の雌性対象で約４８Ｕ／Ｌ以下；又は約１７歳以上の雄性対象で約５９Ｕ／Ｌ以下であると以前に決定された、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象（例えば、ヒト）に投与することができる。

【0183】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象（例えば、ヒト）の血漿ＰＰｉ濃度及び／又は血漿ＡＬＰ濃度を正常な対象の血漿ＰＰｉ濃度及び／又は血漿ＡＬＰと比較して、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を投与された対象の処置効果を決定することができる。特に、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドは、少なくとも１年（例えば、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年、少なくとも１０年又は対象の生涯にわたってなどの１０年超）の処置期間にわたって投与することができる。代わりに、この方法は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドを投与する前に血漿ＰＰｉ濃度及び／又は血漿ＡＬＰ濃度を決定して、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる処置の対象における効果を評価することを含み得る。

【0184】

方法は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象（例えば、ヒト対象）からのサンプル（例えば、血漿サンプル）中のＰＰｉの減少及び／又はＡＬＰ濃度の増加をもたらす。例えば、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）による処置は、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ又は約３μＭ又は２５％以上（例えば、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６０％超）の、対象からのサンプル（例えば、血漿サンプル）中のＰＰｉ濃度の減少をもたらす。したがって、対象は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与後、例えば、約２μＭ～約５μＭ、約３μＭ～約５μＭ、約２μＭ～約４μＭ又は約２μＭ～約３μＭの血漿ＰＰｉ濃度を示す。

【0185】

同様に、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる処置は、方法は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象（例えば、ヒト）からのサンプル（例えば、血漿サンプル）中のＡＬＰ濃度の、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与前の対象と比較して、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６０％超の増加をもたらす。例えば、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与は、対象からのサンプル（例えば、血漿サンプル）中のＡＬＰ濃度を、例えば０～１４日齢の対象で約２７３Ｕ／Ｌ以上；１５日齢～１歳未満の対象で約５１８Ｕ／Ｌ以上；約１歳～１０歳未満で約３６９Ｕ／Ｌ以上；約１０歳～約１３歳未満の対象で約４６０Ｕ／Ｌ以上；約１３歳～約１５歳未満の雌性対象で約２８０Ｕ／Ｌ以上；約１３歳～約１５歳未満の雄性対象で約５１７Ｕ／Ｌ以上；約１５歳～約１７歳未満の雌性対象で約１２８Ｕ／Ｌ以上；約１５歳～約１７歳未満の雄性対象で約３６５Ｕ／Ｌ以上；約１７歳以上の雌性対象で約９５Ｕ／Ｌ以上；又は約１７歳以上の雄性対象で約１６４Ｕ／Ｌ以上に増加させる。

【0186】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象（例えば、ヒト）の血漿ＰＰｉの減少及び／又はＡＬＰ濃度の増加は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して持続し得る。例えば、血漿ＰＰｉ濃度は約２５％減少し、ｓＡＬＰによる処置中に減少した血漿ＰＰｉ濃度の±１０％にとどまり、且つ／又は血漿ＡＬＰ濃度は約５０％増加し、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる処置中に増加した血漿ＡＬＰ濃度の±１０％にとどまる。

【0187】

代わりに、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与がＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象（例えば、ヒト）からの血漿サンプル中のＰＰｉ濃度の、約２５％以上の平均減少をもたらさない場合、対象に対するｓＡＬＰの有効量を決定するために、ｓＡＬＰ投与の投与量及び／又は頻度を変更することができる。同様に、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与が、対象からの血漿サンプル中のＡＬＰ濃度の約５０％以上増加もたらさない場合、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与量及び／又は頻度を変更して、対象に対するアルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの有効量を決定することができる。例えば、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与量は、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ／週又は約３．５ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【0188】

Ｂｒｕｉｎｉｎｋｓ－Ｏｓｅｒｅｔｓｋｙ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ第２版（ＢＯＴ－２）
例示的なＢｒｕｉｎｉｎｋｓ－Ｏｓｅｒｅｔｓｋｙ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ第２版（ＢＯＴ－２）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｒｕｉｎｉｎｋｓ，Ｒ．Ｈ．（２００５）．Ｂｒｕｉｎｉｎｋｓ－Ｏｓｅｒｅｔｓｋｙ Ｔｅｓｔ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ，（ＢＯＴ－２），Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ：Ｐｅａｒｓｏｎ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔに記載されている。特に、ＢＯＴ－２は、対象のＢＯＴ－２スコアを生成するために、骨石灰化障害（例えば、ＨＰＰ）を有するか又はそれを発症しやすい対象における身体障害及び運動制限を評価するために使用することができる。

【0189】

ＢＯＴ－２には、対象の身体的障害を評価するための一連のテストが含まれ、これは、例えば、テストを含むキットを使用して実施できる。ＢＯＴ－２は、次の領域で複合ＢＯＴ－２スコアを提供する：強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調。例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、腹筋運動、Ｖ字腹筋、立幅跳び、空気椅子及び／又は腕立て伏せを実行して、ＢＯＴ－２強度スコアを決定できる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、平均台またぎ、シャトルラン、両足横跳び及び／又は片足横跳びをしてＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアを決定することができる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、円を切り取り及び／又は点をつないで、ＢＯＴ－２の微細運動精度スコアを決定できる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、星を複写及び／又は四角を複写して、ＢＯＴ－２の微細運動統合スコアを決定できる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、コイン移動、カード分類及び／又はブロック糸通しをして、手先の器用さスコアを決定できる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、足及び指のタッピング及び／又は挙手跳躍運動を実行して、ＢＯＴ－２両側協調スコアを決定できる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、平均台で前に進んで且つ／又は片足で立って、ＢＯＴ－２バランススコアを決定できる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、標的にボールを投げ、且つ／又は投げられたボールをキャッチして、ＢＯＴ－２上肢協調スコアを決定できる。

【0190】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、１つ以上の記載されている領域（強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調）でテストを実行して、対象の身体障害を示すＢＯＴ－２スコアを生成し得る。各ＢＯＴ－２領域（強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調）内で、そのような対象は、対象のＢＯＴ－２スコアを決定するために、１つ以上のテストを実行し得、例えば、対象は、腹筋運動、Ｖ字腹筋、立幅跳び、壁掛け、空気椅子及び腕立て伏せの１つ以上を実行して、ＢＯＴ－２強度スコアを決定し得る。したがって、１つのテスト（例えば、腹筋運動、Ｖ字腹筋、立幅跳び、壁掛け、空気椅子及び腕立て伏せの群から選択される１つのテスト）のみを実行して、ＨＰＰ（例えば、ＨＰＰ様疾患）などの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のＢＯＴ－２スコア（例えば、ＢＯＴ－２強度スコア）を決定できる。

【0191】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の各ＢＯＴ－２スコア（強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調）は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有しない対象のＢＯＴ－２スコアと比較して、例えば、ＢＯＴ－２スコアのベースライン比較を決定することができる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の各ＢＯＴ－２スコア（例えば、強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調）は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい他の対象のＢＯＴ－２スコアと比較して、例えば、対象の相対的なＢＯＴ－２スコアを提供することができる。

【0192】

ＢＯＴ－２スコア（例えば、強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調スコア）は約０～約２５以下の範囲であり、ここで、約１０～２０のスコアが健常な対象（例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有しない対象）を表すと見なされる。約１０未満の平均ＢＯＴ－２スコア（例えば、強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調スコア）を有する対象は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド、例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド、で処置することができる。

【0193】

例えば、ＢＯＴ－２強度スコアが１０未満（例えば、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０）である、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、対象の寿命までのある期間にわたって、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）によって処置することができる。同様に、ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアが１０未満（例えば、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０）である、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、対象の寿命までのある期間にわたって、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）によって処置することができる。

【0194】

方法は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のＢＯＴ－２スコア（例えば、強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び／又は上肢協調スコア）の改善をもたらすことができる。例えば、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）などのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる、一定期間のｓＡＬＰによる処置などの処置は、ＢＯＴ－２強度スコアの約１０～約２０（例えば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９又は約２０）への平均増加をもたらすことができる。さらに、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）による処置は、ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアの約５～約２０（例えば、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９又は約２０）への平均増加をもたらすことができる。

【0195】

ＢＯＴ－２スコア（例えば、強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び／又は上肢協調スコア）の増加は、ｓＡＬＰなど、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の、例えば一定期間の投与を通して持続し得る。同様に、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与後の、筋肉の身体的障害の減少は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与を通して持続し得る。

【0196】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のＢＯＴ－２スコア（強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調スコア）は、ｓＡＬＰなど、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を使用して処置効果を評価するために、単独で又は他の測定基準と組み合わせて使用することができ、ここで、特定のテストスコアと比較した改善は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する筋肉障害の処置に効果的であることを示す。例えば、本明細書に記載のｓＡＬＰのＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象への投与がＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアの約５又は約５超への平均増加を生じる（対象の以前の平均ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアが約５未満であった）場合、ｓＡＬＰは、例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する身体障害の処置に効果的であると考えられる。

【0197】

さらに、各ＢＯＴ－２領域（強度、走行速度及び敏捷性、微細運動精度、微細運動統合、手先の器用さ、両側協調、バランス及び上肢協調）内で、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、対象のＢＯＴ－２スコアを決定するために、１つ以上のテストを実行し得る。

【0198】

代わりに、ｓＡＬＰなど、アルカリホスファターゼ又は本明細書に記載のアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与が、ＢＯＴ－２走行速度及び敏捷性スコアの約５超への平均増加を生じない場合、投与量及び／又は投与頻度を変更して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象に対するアルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの有効量を決定することができる。例えば、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与量は、例えば、約０．５～３ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約３～６ｍｇ／ｋｇ／週から約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【0199】

小児健康評価質問票（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（ＣＨＡＱ）
小児健康評価質問票（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（ＣＨＡＱ）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｒｕｃｅ＆Ｆｒｉｅｓ（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０（１）：１６７－１７８，２００３）及びＫｌｅｐｐｅｒ（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４９：Ｓ５－Ｓ１４，２００３）に記載されているように、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する子供の健康状態を評価するために実施して、子供のＣＨＡＱ指数スコアを生成することができる。ＣＨＡＱには、更衣／整容、起床、食事、歩行、衛生、リーチ、グリップ及び動作の８つのカテゴリの質問が含まれ、親又は保護者は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する子供がそれぞれの活動を行うのにどの程度困難であるかを記録する。各カテゴリ内のスコアの範囲は０～３であり、ここで、スコア０は困難を伴わないことを示し；スコア１は、一部困難を伴うことを示し；スコア２は、大いに困難を伴うことを示し；スコア３は、子供が活動を実行できないことを示す。

【0200】

約０．８を超える（例えば、約０．８、約１、約１．２、約１．４、約１．６、約１．８、約２．０、約２．２、約２．４、約２．６、約２．８又は約３．０）平均ＣＨＡＱ指数スコア（例えば、日常生活動作（ＡＤＬ）及び／又は痛みの障害を示す）を有する、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供は、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰなどのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を投与することによって処置できる。例えば、平均ＣＨＡＱ指数スコアが約０．８を超える子供は、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰなどのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を投与することにより、対象の寿命までのある期間にわたって処置できる。さらに、本明細書に開示されるＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供は、平均ＣＨＡＱ指数スコアに到達するため、８つのカテゴリ（更衣／整容、起床、食事、歩行、衛生、リーチ、グリップ及び動作）の１つ以上で、１つ以上の質問をされ得、平均ＣＨＡＱ指数スコアが約０．８を超える場合、ｓＡＬＰなど、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドを投与することで、子供を処置することができる。

【0201】

本明細書に開示されるＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供のＣＨＡＱ指数スコアは、ＨＰＰなどのそのような骨石灰化障害を有しない子供のＣＨＡＱ指数スコアと比較して、例えば、ＣＨＡＱ指数スコアの標準偏差を決定することができる。さらに、本明細書に開示されるＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供のＣＨＡＱ指数スコアは、本明細書に開示されるＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい他の子供のＣＨＡＱ指数スコアと比較して、例えば、ＣＨＡＱ指数スコアの標準偏差を決定することができる。

【0202】

方法は、本明細書に開示されるＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供のＣＨＡＱ指数スコア（例えば、ＡＤＬの障害及び／又は痛みを示す）の改善をもたらすことができる。例えば、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）による、子供の寿命までの一定期間のｓＡＬＰによる処置などの処置は、ＨＰＰ様疾患を有する子供において、ＣＨＡＱ指数スコアの約０～約０．５以下（例えば、約０、約０．１、約０．２、約０．４又は約０．５）への平均減少をもたらすことができる。

【0203】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供のＣＨＡＱ指数スコアの減少は、ｓＡＬＰなど、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して、例えば、子供の寿命までのある期間にわたって、持続し得る。同様に、子供のＡＤＬの増加及び／又は痛みの減少は、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して、子供の寿命までのある期間にわたって、持続し得る。

【0204】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供のＣＨＡＱ指数スコアは、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰなどのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を使用した処置効率を評価するために使用され、ここで、特定のテストスコアと比較した改善は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する日常生活動作（ＡＤＬ）の障害及び痛みの処置に効果的であることを示す。特に、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供は、平均ＣＨＡＱ指数スコアに到達し、ｓＡＬＰ投与の処置効果を評価するため、８つのカテゴリ（更衣／整容、起床、食事、歩行、衛生、リーチ、グリップ及び動作）の１つ以上で、１つ以上の質問をされ得る。例えば、本明細書に記載のｓＡＬＰのＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供への投与がＣＨＡＱインデックススコアの約０．５以下への平均減少を生じる（子供の以前の平均ＣＨＡＱ指数スコアは約０．８超であった）場合、ｓＡＬＰは、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する、日常生活動作（ＡＤＬ）における障害及び痛みの処置に効果的である。代わりに、ｓＡＬＰの投与がＣＨＡＱ指数スコアの約０．５以下への平均減少を生じない場合、ｓＡＬＰ投与の投与量及び／又は投与頻度を変更して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供に対するｓＡＬＰの有効量を決定することができる。例えば、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与量は、例えば、約０．５～３ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約３～６ｍｇ／ｋｇ／週から約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【0205】

小児転帰データ収集ツール（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＰＯＤＣＩ）
ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい特定の対象は、小児転帰データ収集ツール（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＰＯＤＣＩ）を使用して、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）などのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる処置のために特定することができる。Ｐｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｏｒｔｈｏｐ．２３（６）：７８８－７９０，２００３）に記載されているように、対象のＰＯＤＣＩスコアを生成するために、ＰＯＤＣＩを実施して、子供の健康状態を評価することができる。ＰＯＤＣＩには、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象又は対象の親／保護者が記入できる８つのカテゴリの質問が含まれる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のＰＯＤＣＩを決定するために使用できるカテゴリは、以下を含む：１）日常のパーソナルケア及び学生活動を行う際に遭遇する困難を測定するための上肢及び身体機能スケール；２）日常活動で日常的な運動及び運動活動を行う際に経験した困難を測定するための移動及び基本的可動性スケール；３）より活発な活動又はスポーツに参加する際に遭遇する困難又は制限を測定するためのスポーツ／身体機能スケール；４）過去１週間に経験した痛みのレベルを測定するための痛み／快適スケール；５）処置の長期的な期待を測定するための処置期待スケール；６）個人的な外見並びに友人及び同年代の他人との類似性に対する全体的な満足度を測定するための幸福度スケール；７）これが生涯にわたる状態である場合、現在の制限に対する対象の受容を測定するための症状による満足度スケール；８）上記の最初の４つのスケールから計算される一般的な複合スケールである全体機能スケール。各カテゴリにおいて、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象について標準化されたスコアが決定され、０から１００のスケールに変換され、ここで、０は重大な障害を表し、１００は障害が少ないことを表す。

【0206】

約４０未満（例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５又は約３９）の平均ＰＯＤＣＩスコア（例えば、ＡＤＬの障害及び／又は痛みを示す）を有する、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰなどのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を投与することによって処置できる。例えば、平均ＰＯＤＣＩスコアが４０未満の対象は、対象の寿命までのある期間にわたって、ｓＡＬＰを投与することによって処置することができる。さらに、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、平均ＰＯＤＣＩスコアに到達するため、上記の８つのスケール（例えば、移動及び基本的可動性、スポーツ／身体機能並びに痛み／快適スケール）の１つ以上で、１つ以上の質問をされ得、平均ＰＯＤＣＩスコアが４０未満の場合、ｓＡＬＰを投与することによって対象を処置することができる。

【0207】

本明細書に記載の方法は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のＰＯＤＣＩスコア（例えば、ＡＤＬの障害及び／又は痛みを示す）の増加をもたらすことができる。例えば、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）などのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる、対象の寿命までの一定期間のｓＡＬＰによる処置などの処置は、ＰＯＤＣＩスコアの約４０～約５０（例えば、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９又は約５０）への平均増加をもたらすことができる。

【0208】

ＰＯＤＣＩスコアの増加は、ｓＡＬＰなど、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して、例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の寿命までのある期間にわたって、持続し得る。同様に、ＡＤＬの増加及び／又は痛みの減少は、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して、対象の寿命までのある期間にわたって、持続し得る。

【0209】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のＰＯＤＣＩスコアは、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰなどのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を使用した処置効率を評価するために使用され、ここで、特定のテストスコアと比較した改善は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する日常生活動作（ＡＤＬ）の障害及び痛みの処置に効果的であることを示す。特に、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、平均ＰＯＤＣＩスコアに到達し、ｓＡＬＰ投与の処置効果を評価するため、８つのスケール（上肢及び身体機能スケール、移動及び基本的可動性スケール、スポーツ／身体機能スケール、痛み／快適スケール、処置期待スケール、幸福度スケール、症状による満足度スケール及び全体機能スケール）の１つ以上で、１つ以上の質問をされ得る。

【0210】

例えば、本明細書に記載のｓＡＬＰのＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象への投与がＰＯＤＣＩスコアの約４０又は約４０超への平均増加を生じる（対象の以前の平均ＰＯＤＣＩスコアは約４０未満であった）場合、ｓＡＬＰは、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する、日常生活動作（ＡＤＬ）における障害及び痛みの処置に効果的である。代わりに、本明細書に記載のｓＡＬＰの投与がＰＯＤＣＩスコアの約４０又は約４０超以上への平均増加を生じない場合、ｓＡＬＰ投与の投与量及び投与頻度を変更して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象に対するｓＡＬＰの有効量を決定することができる。例えば、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与量は、例えば、約０．５～３ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約３～６ｍｇ／ｋｇ／週から約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【0211】

乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケール（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、第３版（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）
別のエンドポイントである、乳幼児発達のＢａｙｌｅｙスケール（Ｂａｙｌｅｙ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｔｏｄｄｌｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、第３版（ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）は、Ｂａｙｌｅｙ．（２００６）．Ｂａｙｌｅｙ ｓｃａｌｅｓ ｏｆ ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ ｔｏｄｄｌｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｍａｎｕａｌ．Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ：Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔに記載されているように、出生からＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の健康状態を評価するために実施して、対象のＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアを生成することができる。ＢＳＩＤ－ＩＩＩには、生のＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアを決定するために対象に投与できる一連の発達的遊戯課題が含まれる。例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象（例えば、ＨＰＰを有する約３歳以下の乳児）のＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアを決定するためのカテゴリは、把握、知覚－運動統合、運動計画及び速度、視覚追跡、リーチ、物体把握、物体操作、機能的手技、触覚情報への応答、手足及び胴体の動き、静的ポジショニング、動的運動、バランス及び運動計画を含み得る。次に、ＢＳＩＤ－ＩＩＩの測定値は、スケーリングされたＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアに変換され、これを使用して、健常で年齢が調整された対象と比較した対象のパフォーマンスを判断できる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象（例えば、ＨＰＰを有する対象）のＢＳＩＤ－ＩＩＩスケールスコアは、０～１４の範囲であり得、ここで、約７～約１３のスコアは、健常な対象の正常範囲と見なされる。

【0212】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、乳児（例えば、約３歳又は３歳未満）として、記載されているカテゴリ（把握、知覚－運動統合、運動計画及び速度、視覚追跡、リーチ、物体把握、物体操作、機能的手技、触覚情報への応答、手足及び胴体の動き、静的ポジショニング、動的運動、バランス及び運動計画）の１つ以上でテストを実行して、運動発達の遅延を示すＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアを生成し得る。記載されているカテゴリ（把握、知覚－運動統合、運動計画及び速度、視覚追跡、リーチ、物体把握、物体操作、機能的手技、触覚情報への応答、手足及び胴体の動き、静的ポジショニング、動的運動、バランス及び運動計画）の１つ以上で、幼児として約２未満の平均ＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアを有する、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与によって処置することができる。特に、乳児として約２未満の平均ＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアを有する、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、対象の寿命までのある期間にわたって、ｓＡＬＰを投与することによって処置することができる。

【0213】

この方法は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の平均ＢＳＩＤ－ＩＩＩスコア（例えば、運動発達の遅延を示す）の改善をもたらすことができる。例えば、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）による、対象の寿命までの一定期間のｓＡＬＰによる処置などの処置は、ＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアの約５超（例えば、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２又は約１３）への平均増加をもたらすことができる。

【0214】

ＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアの増加は、ｓＡＬＰなど、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の寿命までのある期間にわたって、持続し得る。同様に、運動発達の増加は、ｓＡＬＰなど、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して、例えば、対象の寿命までのある期間にわたって、持続し得る。

【0215】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアは、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰなどのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を使用した処置効率を評価するために使用され、ここで、特定のテストスコアと比較した改善は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する運動発達の遅延の処置に効果的であることを示す。特に、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、平均ＢＳＩＤ－ＩＩＩスコアに到達し、ｓＡＬＰ投与の処置効果を評価するため、乳児（例えば、ＨＰＰを有する約３歳以下）として、記載されているカテゴリ（把握、知覚－運動統合、運動計画及び速度、視覚追跡、リーチ、物体把握、物体操作、機能的手技、触覚情報への応答、手足及び胴体の動き、静的ポジショニング、動的運動、バランス及び運動計画）の１つ以上でテストを実行し得る。

【0216】

例えば、ｓＡＬＰのＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供への投与がＢＳＩＤ－ＩＩＩスケールスコアの約５超への平均増加（子供の以前の平均ＢＳＩＤ－ＩＩＩスケールスコアは乳児（例えば、約３歳又は３歳未満）として約２未満であった）を生じる場合、ｓＡＬＰは、ＨＰＰ様疾患に関連する、例えば運動発達の遅延の処置に効果的である。代わりに、ｓＡＬＰの投与がＢＳＩＤ－ＩＩＩスケールスコアの約５超への平均増加を生じない場合、ｓＡＬＰ投与の投与量及び／又は投与頻度を変更して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供に対するｓＡＬＰの有効量を決定することができる。例えば、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与量は、例えば、約０．５～３ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約３～６ｍｇ／ｋｇ／週から約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【0217】

Ｐｅａｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｓｃａｌｅｓ、第２版（ＰＤＭＳ－２）
別のエンドポイントである、Ｐｅａｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｓｃａｌｅｓ、第２版（ＰＤＭＳ－２）は、ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ．（Ｏｃｃｕｐ．Ｔｈｅｒ．Ｉｎｔ．１２（１）：１－１３，２００５）に記載されているように、出生からＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の健康状態を評価するために実施して、対象のＰＤＭＳ－２スコアを生成することができる。ＰＤＭＳ－２には、ＨＰＰを有する対象など、対象の運動能力を測定するための６つのカテゴリのサブテストが含まれる。

【0218】

特に、ＰＤＭＳ－２の測定値は、次のサブテストから決定できる。１）ある場所から別の場所に移動する対象の能力を測定するための自発運動サブテスト（測定には、這う、歩く、走る、跳ねる、前に跳ぶなどが含まれる）；２）環境事象に自動的に反応する対象の能力を測定するための反射神経サブテスト；３）重心内で身体の制御を維持し、平衡を維持する対象の能力を測定するための静止サブテスト；４）ボールをキャッチする、投げる、蹴るなど、物体を操作する対象の能力を測定するための物体操作サブテスト；５）片手で物体を保持する能力及び両手の指を制御して使用することを含む動作など、対象の手を使用する能力を測定するための把持サブテスト；６）対象が視知覚の能力を使用して、物体に手を伸ばして握ること、ブロックで構築すること及びデザインをコピーすることなどの複雑な目と手の協調タスクを実行する能力を測定するための視覚－運動統合サブテスト。ＰＤＭＳ－２測定値は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のこれらのカテゴリの１つ以上について決定でき、次に、０～１３の範囲のＰＤＭＳ－２運動標準スコアなどのＰＤＭＳ－２スコアに変換され、ここで、健常な対象（例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有しない対象）の範囲は、約７～約１３である。

【0219】

平均ＰＤＭＳスコア（例えば、運動発達の遅延を示す）を有する、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象は、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与によって処置することができる。

【0220】

本明細書に記載の方法は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のＰＤＭＳ－２Ｉスコア（例えば、運動発達の遅延を示す）の改善をもたらすことができる。例えば、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）などのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる処置は、ＰＤＭＳ－２スコアの約７～約１３（例えば、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２又は約１３）への平均増加をもたらすことができる。

【0221】

ＰＤＭＳ－２スコアの増加は、ｓＡＬＰなど、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して、長期間、例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の寿命までのある期間にわたって、持続し得る。同様に、運動発達の増加は、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の寿命までのある期間にわたって、持続し得る。

【0222】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のＰＤＭＳ－２スコアは、アルカリホスファターゼ又はｓＡＬＰなどのアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）を使用した処置効率を評価するために使用され、ここで、特定のテストスコアと比較した改善は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドが、例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害に関連する運動発達の遅延の処置に効果的であることを示す。例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供は、平均ＰＤＭＳ－２スコアに到達し、ｓＡＬＰ投与の処置効果を評価するため、約５歳又は５歳未満で、記載されているカテゴリ（運動、反射神経、静止、物体操作、把持、視覚運動）の１つ以上でテストを実行し得る。

【0223】

例えば、ｓＡＬＰのＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい子供への投与がＰＤＭＳ－２標準スコアの約７への平均増加を生じる（子供の以前の平均ＰＤＭＳ－２標準スコアは約５であった）場合、ｓＡＬＰは、ＨＰＰ様疾患に関連する、例えば運動発達の遅延の処置に効果的である。代わりに、ｓＡＬＰの投与がＰＤＭＳ－２標準スコアの約７への平均増加を生じない場合、子供に対するｓＡＬＰの有効量を決定するために、ｓＡＬＰ投与の投与量及び／又は頻度を変更することができる。例えば、ｓＡＬＰ（例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与量は、例えば、約０．５～３ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約３～６ｍｇ／ｋｇ／週から約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【0224】

６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）
ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象は、６ＭＷＴを使用して、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）による処置のために特定することができる。特に、６ＭＷＴを使用して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する成人の歩行能力を評価し、成人の６ＭＷＴ値を生成できる。６ＭＷＴは、硬い面の平らで真っ直ぐな囲われた廊下（長さ約３０メートルなど）を使用して、屋内又は屋外で実行することができる。ストップウォッチ又は他のタイマーを使用して時間を追跡することができ、機械的カウンター又は他の装置を使用して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象が歩く距離（例えば、メートル単位）を決定することができる。例えば、廊下の長さを３メートルごとにマークして、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象が歩いたメートル数を決定できる。転回点は３０メートルで、スタートラインもマークされている。次に、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象が６分間に歩いた距離を、例えば、ほぼ同じ年齢、同じ性別及び／又は同じ身長の正常対象によって予測された歩行メートル数と比較し、対象の６ＭＷＴ値を生成するためのパーセンテージ値として表すことができる。ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象の６ＭＷＴ値は、対象のベースラインでの６ＭＷＴ値と比較することができる。さらに、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象の６ＭＷＴ値は、正常な対象の６ＭＷＴ値と比較することができる。

【0225】

予測された６ＭＷＴ値の約８０％未満の平均６ＭＷＴ（例えば、ほぼ同じ年齢、同じ性別及び／又は同じ身長の正常対象に対して）を有する、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象は、例えば、少なくとも２週間（例えば、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年若しくは少なくとも１０年又は対象の生涯、特に少なくとも６週間）の処置期間にわたり、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドを投与することなどにより、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）で処置することができる。例えば、予測された６ＭＷＴ値の約８０％未満（例えば、予測された６ＭＷＴ値の約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％又は約７５％）の平均６ＭＷＴを有する、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象は、少なくとも２週間の処置期間（例えば、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年若しくは少なくとも１０年又は対象の生涯、特に少なくとも６週間）にわたって、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによって処置することができる。

【0226】

この方法は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象の６ＭＷＴ値の改善をもたらすことができる。例えば、少なくとも２週間（例えば、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年若しくは少なくとも１０年又は対象の生涯、特に少なくとも６週間）の処置期間にわたり、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる処置などによる、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）での処置は、対象の予測された６ＭＷＴ値の約８０％以上（例えば、予測６ＭＷＴ値の約８２％、約８４％、約８６％、約８８％、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％又はそれを超える）への６ＭＷＴ値の平均増加をもたらすことができる。

【0227】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象の６ＭＷＴ値の増加は、例えば、少なくとも２週間（例えば、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年若しくは少なくとも１０年又は対象の生涯、特に少なくとも６週間）の処置期間にわたり、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して持続し得る。例えば、６ＭＷＴ値は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象の予測された６ＭＷＴ値の約８０％超に増加し、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる処置中に増加した６ＭＷＴ値の±１０％にとどまる。

【0228】

同様に、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象の歩行能力の改善は、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与を通して、例えば、少なくとも２週間（例えば、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年若しくは少なくとも１０年又は対象の生涯、特に少なくとも６週間）の処置期間、持続し得る。例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象は、ｓＡＬＰによる処置中に、歩行器、車椅子、装具、松葉杖又は矯正器具などの補助移動装置への減少した依存度を示す。

【0229】

代わりに、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与が（例えば、ほぼ同じ年齢、同じ性別及び／又は身長の正常な対象の）予測された６ＭＷＴ値の８０％超の６ＭＷＴ値の平均増加を生じない場合、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与量及び／又は頻度を変更して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象に対するアルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの有効量を決定することができる。例えば、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与量は、例えば、約０．１～３ｍｇ／ｋｇ／週又は約３～６ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【0230】

ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）
ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象のグリップ及び筋力は、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）を使用して評価できる。例えば、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有するか又はそれを発症しやすい対象の膝の屈曲及び伸展及び股関節の屈曲、伸展、外転は、例えば、ＭＩＣＲＯＦＥＴ２ＴＭダイナモメーターを使用して測定でき、対象の握力は、例えば、Ｊａｍａｒ（登録商標）グリップダイナモメーターを使用して測定できる。特に、管理者はダイナモメーターを静止させて持ち、対象はダイナモメーターに対して最大の力を加える。ピーク力データはポンド単位で収集され、ニュートン（Ｎ）に変換される。次に、トルク値は、Ｎメートル単位の肢長を使用して計算される。次に、トルク値を、例えば、ほぼ同じ年齢、同じ性別及び／又は同じ身長の正常な対象のトルク値と比較し、対象のＨＨＤ値を生成するためのパーセンテージ値として表すことができる。

【0231】

予測されたＨＨＤ値の約８０％未満の平均ＨＨＤ値（例えば、ほぼ同じ年齢、同じ性別及び／又は同じ身長の正常対象に対して）を有する、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象は、例えば、少なくとも２週間（例えば、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年若しくは少なくとも１０年又は対象の生涯、特に少なくとも６週間）の処置期間にわたり、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドを投与することなどにより、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）で処置することができる。例えば、予測されたＨＨＤ値の約８０％未満（例えば、予測されたＨＨＤ値の約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％又は約７５％）の平均ＨＨＤを有する、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象は、少なくとも２週間の処置期間（例えば、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年若しくは少なくとも１０年又は対象の生涯、特に少なくとも６週間）にわたって、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによって処置することができる。

【0232】

この方法は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象のＨＨＤ値の改善をもたらすことができる。例えば、少なくとも２週間（例えば、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年若しくは少なくとも１０年又は対象の生涯、特に少なくとも６週間）の処置期間にわたり、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる処置などによる、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）での処置は、対象の予測されたＨＨＤ値の約８０％以上（例えば、予測ＨＨＤ値の約８３％、約８５％、約８７％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％若しくは約１００％又は１００％）へのＨＨＤ値の平均増加をもたらすことができる。

【0233】

ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象のＨＨＤ値の増加は、例えば、少なくとも２週間（例えば、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年若しくは少なくとも１０年又は対象の生涯、特に少なくとも６週間）の処置期間にわたり、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与を通して持続し得る。例えば、ＨＨＤ値は、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象の予測されたＨＨＤ値の約８０％超に増加し、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドによる処置中に増加したＨＨＤ値の±１０％にとどまる。

【0234】

代わりに、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ｓＡＬＰ、例えば、本明細書に記載されるように、配列番号７～２２３、２４７及び２６２～２６４のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８５％の配列同一性を有するその変異体及び／又は天然に存在するＡＬＰに対して少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド）の投与が（例えば、ほぼ同じ年齢、同じ性別及び／又は身長の、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象の）予測されたＨＨＤ値の８０％超のＨＨＤ値の平均増加を生じない場合、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与量及び／又は頻度を変更して、ＨＰＰなどの骨石灰化障害を有する対象に対するアルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの有効量を決定することができる。例えば、アルカリホスファターゼ又はアルカリホスファターゼ活性を有するポリペプチドの投与量は、例えば、約０．１～３ｍｇ／ｋｇ／週又は約３～６ｍｇ／ｋｇ／週から約３～６ｍｇ／ｋｇ／週又は約６～９ｍｇ／ｋｇ／週に増加させることができる。

【実施例】

【0235】

本開示は、以下の実施例によって説明される。特定の例、材料、量及び手順は、本明細書に記載される開示の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきであることを理解されたい。

【0236】

実施例１
タンパク質の設計及び発現
アルカリホスファターゼ融合タンパク質。
アルカリホスファターゼ融合タンパク質のタンパク質活性、タンパク質安定性及び薬物動態特性を体系的に調べるために、いくつかのコンストラクトを設計及び試験した（表１を参照されたい）。いくつかのコンストラクトは、標準的なＤＮＡ合成技術によって生成され、それらの配列は、最終的に構築されたプラスミドのＤＮＡ配列決定によって検証された。さらなるコンストラクトは、既存のプラスミドに対して標準的な部位特異的変異誘発技術を実施することによって生成された。試験したアルカリホスファターゼ融合タンパク質の変異は、酵素の活性部位内及びその周辺に位置する残基、Ｎ－結合型グリコシル化のコンセンサス部位、骨標的化部分及びタンパク質に結合したフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域のアイソタイプで変化する。これらのコンストラクトは、以下に詳述するように、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ及びＥｘｐｉＣＨＯ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって発現された。

【0237】

骨標的化蛍光－Ｆｃ融合。
ポリペプチド及びＶＨＨ配列のＨＡ及び骨結合能力を体系的に比較するために、（Ｎ末端骨標的化－ヒトＩｇＧ１結晶領域（Ｆｃ）－Ｋａｔｕｓｈｋａ２ｓ蛍光タンパク質－Ｃ末端Ｈｉｓタグ）を含むタンパク質融合体を設計した（配列番号２２４～２４５）。標的化に使用される蛍光融合タンパク質のリストを表２に示す。蛍光融合タンパク質は、以下に詳述するようにＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用して一過性にトランスフェクトされた。

【0238】

【表2】

【0239】

生物学的に不活性なＥＲＴ代理分子（ＡＬＰ－Ｆｃ）。
臨床的に利用可能なＥＲＴの骨標的化機能をモデル化するために、ＡＬＰ－Ｆｃ－（Ａｓｐ）_１０融合をＡＬＰ－Ｆｃ融合と比較した。これらの研究に使用されたＡＬＰは、合成基質であるリン酸４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＰ）に対する酵素活性のために特別に設計された。図２１は、ＡＬＰ－Ｆｃ－（ＡＳＰ）_１０の構造モデルを示す。ＡＬＰ－Ｆｃ（配列番号２２２）及びＡＬＰ－Ｆｃ－（Ａｓｐ）_１０（配列番号３１）タンパク質は、以下に詳述するようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞を使用して一過性にトランスフェクトされた。

【0240】

重鎖のみの単一ドメイン可変重鎖（ＶＨＨ）抗体フラグメント。
骨を標的としたＶＨＨタンパク質は、非標的ＶＨＨ分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）をポリアスパラギン酸配列に置き換えることによって設計された。表３は、骨結合について評価されたＶＨＨタンパク質のリストを示す。ＶＨＨタンパク質は、以下に詳述するようにＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用して一過性にトランスフェクトされた。

【0241】

【表3】

【0242】

細胞培養物の一過性トランスフェクション
全てのＥｘｐｉ２９３トランスフェクションには１．０μｇプラスミドＤＮＡ／ｍＬトランスフェクション培養物の比率を使用し、全てのＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションには０．８μｇプラスミドＤＮＡ／ｍｌトランスフェクション培養物の比率を使用した。培養物は、２５．４ｍｍのスローで、シェーカー上で１２０ＲＰＭに維持された。

【0243】

Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中、加湿した８％ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で培養した。トランスフェクションの前日、細胞を２．５×１０^６細胞／ｍＬに分割した。２４時間後、ストックはおよそ４×１０^６細胞／ｍＬであり、２．５×１０^６細胞／ｍＬに希釈された。Ｅｘｐｉ２９３トランスフェクションは、製造元のプロトコルに従って実行された。Ｅｘｐｉ２９３発現システムキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）は、トランスフェクションエンハンサー及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３トランスフェクション試薬を含み、全てのＥｘｐｉ２９３トランスフェクションに使用された。要約すると、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３トランスフェクション試薬及びプラスミドＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で別々に希釈した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３とＤＮＡの混合物を合わせ、さらに１０～２０分間インキュベートした。次に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３－ＤＮＡ－ＯｐｔｉＭＥＭ混合物を細胞に加えた。エンハンサー１及びエンハンサー２は、トランスフェクションの１６～１８時間後にトランスフェクトされた培養物に加えた。

【0244】

ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞は、ＥｘｐｉＣＨＯ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中、加湿した８％ＣＯ_２インキュベーター内で、３７℃で培養した。トランスフェクションの前日、細胞を３～４×１０^６細胞／ｍＬに分割した。２４時間後、ストックは７～１０×１０^６細胞／ｍＬであり、新鮮な培地を加えて６×１０^６細胞／ｍＬに希釈された。ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションは、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、製造元の標準プロトコルに従って実施された。要約すると、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯトランスフェクション試薬及びプラスミドＤＮＡをＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で別々に希釈した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯとＤＮＡの混合物を直ちに合わせ、１～５分間インキュベートした。次に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＣＨＯ－ＤＮＡ－ＯｐｔｉＰＲＯ混合物を細胞に加えた。エンハンサー及び３０％ｖ／ｖフィードは、トランスフェクションの１８～２２時間後に加えた。

【0245】

細胞培養物の回収
Ｅｘｐｉ２９３遺伝子導入物は４日目に回収され、ＥｘｐｉＣＨＯ遺伝子導入物は５日目に回収された。細胞培養物を１９００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を０．２μｍの使い捨て膜フィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で滅菌ろ過した。

【0246】

大規模タンパク質発現
ＡＬＰ２０１及びＡＬＰ２１３は、安定細胞培養（ＣＨＯ ＫＳ）で発現し、５．０×１０^５細胞／ｍＬでの初期播種から５Ｌバイオリアクター（ＡＰＰＬＩＫＯＮ）で増殖させ、温度（３６．５℃、５日目に３３℃に移行）、撹拌（８０Ｗ／ｍ^２）及びＯ_２（必要に応じて、０～０．６ＶＶＭ）は、標準的な手順に従って１１日間制御する。

【0247】

タンパク質精製。
Ｎｉ－ＮＴＡレジンによるＶＨＨ及び蛍光Ｆｃ融合タンパク質の精製。Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを有する蛍光Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗレジン（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してバッチで精製された。細胞上清を、透析フラスコ（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標），ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、４℃で４８時間、Ｎｉ－ＮＴＡ結合／洗浄バッファー（２．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍイミダゾール、水酸化ナトリウムでｐＨ７．４に緩衝）に対して透析した。Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗレジンを洗浄し、Ｎｉ－ＮＴＡ結合／洗浄バッファーに再懸濁した後、透析した上清（レジン１ｍＬあたり約８ｍｇのタンパク質）と４℃で振とうしながら９０分間インキュベートした。重力精製カラムを０．１Ｎ水酸化ナトリウムで１時間消毒した後、タンパク質のローディング／溶出の前にＮｉ－ＮＴＡ結合／洗浄バッファーでリンスした。Ｎｉレジンを含有する透析上清をカラムに注ぎ、未結合のタンパク質懸濁液をレジンに流した。レジン結合タンパク質を４０カラム容量（約２００ｍＬ）のＮｉ－ＮＴＡ結合／洗浄バッファーで洗浄した。蛍光Ｆｃ－融合タンパク質は、５ｍＬの溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．５、５００ｍＭ塩化ナトリウム）を添加し、円錐管に溶出する前に樹脂と５分間バッファーインキュベートすることにより、３つの画分に溶出した。溶出したタンパク質を、３０ｋＤ ＭＷＣＯ遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標））を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４にバッファー交換し、最終濃縮タンパク質をろ過した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍ及び５５８ｎｍでのＵＶ／ＶＩＳ吸光度（最大Ｋａｔｕｓｈｋａ ２ｓ吸光度）を使用して定量化し、その後、光から保護して４℃で保存した。

【0248】

プロテインＡレジンとのＡＬＰ－Ｆｃ融合物の精製。
ＡＬＰ－Ｆｃ融合物は、プロテインＡレジン（ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）ＳＵＲＥ（商標），ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してバッチで精製した。樹脂を完全に洗浄し、タンパク質ローディングバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム）に懸濁した後、発現した標的タンパク質（樹脂１ｍＬあたり約１０ｍｇのタンパク質）を含む細胞上清と一晩インキュベート（４℃）した。重力カラムを水酸化ナトリウムで消毒し、ローディングバッファーですすぎ、プロテインＡレジン／上清をロードした。レジン結合タンパク質は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ１１で溶出する前に、４０カラム容量（約２００ｍＬ）のローディングバッファーで洗浄した。タンパク質は３ｍＬの画分に溶出され、ローディングバッファーで１：１に希釈することで直ちに中和された。特定のサンプルは、強力陰イオン交換クロマトグラフィー（ＣＡＰＴＯ（商標）Ｑ ＩＭＰＲＥＳ、５ｍＬカラム；カラム洗浄バッファー２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４、バッファーＡ；１２カラム容量もわたり、バッファーＡとバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）間の勾配溶出、２５％バッファーＢで開始、１００％バッファーＢへ）によってさらに精製した。ＡＬＰ－Ｆｃ融合物を含む画分をプールし、ＰＢＳ ｐＨ７．４で透析するか、３０ｋＤ ＭＷＣＯ遠心フィルターを使用してバッファーをＰＢＳ ｐＨ７．４に交換した。タンパク質濃度は２８０ｎｍでの吸光度を介して決定され、純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって評価された。タンパク質をろ過し、４℃で保存した。

【0249】

大規模タンパク質精製
安定細胞株バイオリアクター発現からのタンパク質は、強力陰イオン交換クロマトグラフィーがＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱカラムを使用し、１３～１５カラム容量にわたり、０％から７０～７５％勾配のバッファーＢで同じバッファーを使用して実施されたことを除いて、以前のサンプルと同様に精製された。サンプルをＵＦ／ＤＦで濃縮するか、又はＰＢＳで透析し、滅菌ろ過し、４℃で保存した（サンプル濃度は典型的にはおよそ４～８ｍｇ／ｍＬであった）。

【0250】

実施例２
リン酸４－メチルウンベリフェリル加水分解タンパク質活性アッセイ
アルカリホスファターゼ活性は、人工基質であるリン酸４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＰ）を使用して定期的に測定された。４－ＭＵＰでのホスホエステル結合の切断により、蛍光産物である４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）が生成され、これは、３６０ｎｍ／４６５ｎｍの励起／発光で検出できる。

【0251】

タンパク質サンプル（上清、部分精製又はカラム精製サンプル）を、人工基質としてリン酸４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵＰ）を使用して溶液中のＡＬＰ活性についてアッセイした。４－ＭＵＰのホスホエステル結合の加水分解により、蛍光化合物４－メチルウンベリフェロンが放出され、これは、蛍光光度計で簡単に検出できる。産物の定量は、０、１．２５ｕＭ、２．５ｕＭ、５ｕＭ、１０ｕＭ及び２０ｕＭの標準濃度で、同じプレートで測定された４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）標準曲線を使用して実行された。４－ＭＵの１０ｍＭストック溶液をエタノールで調製し、アッセイバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン］で希釈した。精製した融合タンパク質サンプルは、アッセイバッファー中０．１ｍｇ／ｍＬ溶液として調製し、アッセイバッファーでのアッセイに適した最終濃度（通常、およそ１ｎＭ）に段階希釈した。４－ＭＵＰストック溶液はアッセイバッファーで調製した。アッセイを開始する前に、タンパク質サンプルに最終濃度１０ｕＭで４－ＭＵＰを添加することにより、全ての溶液を３７℃にした。４－ＭＵの産生は、３６０ｎｍの励起波長及び４６５ｎｍの発光波長で測定された。データは、３７℃に保持されたプレートリーダーで４０秒ごとに合計２０分間収集された。反応速度は、活性の単位で線形回帰によって計算され、ここで、１Ｕ＝１マイクロモルの加水分解された４－ＭＵＰ／分である。比活性は、アッセイされたタンパク質の単位／ｍｇで計算された。４－ＭＵＰ加水分解アッセイの進行曲線を図１９に示す。表４の比活性は次のとおりである。＜２Ｕ／ｍｇ（－）、２～９．９Ｕ／ｍｇ（＋）、１０～３０Ｕ／ｍｇ（＋＋）及び＞３０Ｕ／ｍｇ（＋＋＋）。

【0252】

【表4】

【0253】

プレート骨アッセイ
骨ホモジネート画分をＡＬＰ活性についてアッセイした。骨ホモジネート画分を１００μＬのＰＢＳに懸濁し、９６ウェル黒色プレートに移した。１００μＬの非結合タンパク質懸濁液も９６ウェルプレートの別々のウェルに移した。各ウェルに、１００μＬのＡＬＰ検出溶液（１０μＭ ４－ＭＵＰ、１％ＢＳＡ）を加え、動的蛍光読み取り（３６０／４６５）を直ちに開始し、２０分間実行し、３０秒ごとに蛍光強度発光を収集した。時間に対する蛍光強度の傾きは、各サンプル画分のＡＬＰ濃度を表していた。

【0254】

直線性を維持するために、１７のコンストラクトの結合画分及び非結合画分のＭＵＰ活性を、最初の５分間の初期活性勾配によって測定した。ＭＵＰ活性の比率は、各融合タンパク質について、比率＝（結合活性）／（非結合活性）として決定された。結果は表５及び図１４に示される。様々なコンストラクトを用いて骨ホモジネートに対して実施されたＭＵＰ加水分解アッセイからの例示的な進行曲線が図１１に示され、結合活性は表５に作表されている。表５のＭＵＰ活性は、次のように定量化された。＜０．２（－）；０．２～０．４９（＋）；０．５～５．０（＋＋）；＞５．０（＋＋＋）。

【0255】

【表5】

【0256】

実施例３
天然基質に対するアルカリホスファターゼコンストラクトの活性
本明細書に記載のタンパク質融合分子の改善された特性は、天然及び人工基質の加水分解を測定する異なる酵素アッセイで検証された。活性アッセイで使用される人工基質には、４－ＭＵＰ及びリン酸パラニトロフェニル（ｐＮＰＰ）が含まれていた。活性アッセイで使用される天然基質には、ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキシル－５’－リン酸（ＰＬＰ）が含まれていた。野生型ＡＬＰに対する活性の変化は、陰性（酵素活性の低下）から最大９．５倍の酵素活性の増加（８５０％の活性増加）までの範囲であった。

【0257】

ピロリン酸加水分解アッセイ。
特定の精製アルカリホスファターゼ融合タンパク質を、天然基質であるピロリン酸に対する活性についてアッセイした。ピロリン酸加水分解は、リン酸の結合時に明緑色に変化するＰｉＢｌｕｅアッセイ試薬（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、産物であるリン酸アニオンを検出することによって測定された。各ウェルのリン酸塩レベルの定量化は、アッセイプレートで読み取られたアッセイバッファーで作製されたリン酸塩溶液の標準曲線を使用して実施された。ピロリン酸ナトリウム十水和物（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のストック溶液は、純水中で１０ｍＭの濃度で調製した。精製した融合タンパク質サンプルは、アッセイバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン］中０．１ｍｇ／ｍＬ溶液として調製され、アッセイバッファーでのアッセイに適した最終濃度に段階希釈した。アッセイ用のピロリン酸サンプルは、アッセイバッファーでストック溶液を希釈して調製した。反応を開始する前に、全ての溶液を３７℃にした。透明な９６ウェルプレートにタンパク質溶液を加え、プレートを３７℃に保持されたＪｉｔｔｅｒｂｕｇプレートシェーカーに入れた。反応の開始は、タンパク質溶液にピロリン酸溶液を添加することによって実施された。

【0258】

典型的には、ピロリン酸加水分解反応は、同じプレート内で、０ｕＭ、１．５６ｕＭ、３．１２ｕＭ、６．２５ｕＭ、１２．５ｕＭ、２５ｕＭ、５０ｕＭ、１００ｕＭ、２００ｕＭ及び４００ｕＭのピロリン酸濃度で、同時に実施された。各ピロリン酸濃度で８つの反応ウェルを設定し、ピロリン酸をプレートに加えてから０、１、２、３、４、５、６及び７分が経過した後、ＰｉＢｌｕｅ試薬（最終反応容量と同じ容量で添加）を加えることにより、反応を停止した。検出試薬のｐＨが低いと酵素が不活性化されるため、ＰｉＢｌｕｅ試薬を加えるとそれ以上の反応が停止する。６２０ｎｍでの吸光度を読み取る前に、プレート内で３０分間発色させる。各ピロリン酸濃度での反応速度は、個々の時点から進行曲線を構成することによって計算される。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ酵素反応速度論的適合を使用し、各濃度での反応速度を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍのＫｍ及びＶｍａｘ値を計算した。ｋｃａｔ値は、Ｖｍａｘ値から次のように計算された。Ｖｍａｘ／（分析されたモルタンパク質）＝ｋｃａｔ。
触媒効率は次のように定義される。触媒効率＝ｋｃａｔ／Ｋｍ。

【0259】

選択した化合物のピロリン酸加水分解活性の詳細を示すミカエリス・メンテンプロットを図２２に示す。１０ｎｇ／ｍＬのＡＬＰ２０１、１０ｎｇ／ｍＬのＡＬＰ２５０及び２５ｎｇ／ｍＬのアスフォターゼアルファ（配列番号２６９）が全て示されている。標準偏差が示される（バー）、Ｎ＝３。

【0260】

【表6】

【0261】

ピリドキシル－５’－リン酸加水分解アッセイ。
アルカリホスファターゼの第２の天然基質はピリドキシル－５’リン酸（ＰＬＰ）である。特定の精製アルカリホスファターゼ融合タンパク質を、ＰＬＰ加水分解の産物であるピリドキシルがＭ．ｌｏｔｉテトラメトリックピリドキシルデヒドロゲナーゼ（ｔＰＬＤＨ、配列番号２４６）によって蛍光ピリドキソラクトンに変換される結合アッセイ形式で、ＰＬＰに対する活性についてアッセイした。６ｘＨｉｓタグ付きｔＰＬＤＨの遺伝子は、標準的な方法で合成され、Ｔ７プロモーターの制御下で細菌発現プラスミドにクローニングされた。６ｘＨｉｓタグ付きｔＰＬＤＨは、標準プロトコルを使用してＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現され、標準アフィニティークロマトグラフィー法で精製された。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５スピン濃縮器を使用してタンパク質を１９００ｕＭの濃度に濃縮し、アッセイで使用するまで－８０℃で凍結した。精製した融合タンパク質サンプルは、アッセイバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン］中の０．１ｍｇ／ｍＬ溶液として調製した。段階希釈された最終サンプルは、ピリドキソラクトン標準（アッセイバッファーで作製）と共に、黒色９６ウェルプレートに配置される。タンパク質サンプルに、ＮＡＤ^＋、ｔＰＬＤＨ及びＰＬＰ溶液（アッセイバッファーで作製）を加えて、最終濃度を３ｍＭ ＮＡＤ＋、４ｕＭ ｔＰＬＤＨ及び３ｕＭ ＰＬＰとし、混合する。反応を開始する前に、全ての溶液を３７℃にし、反応プレートを３７℃でインキュベートし、蛍光は３５５ｎｍでの励起によって検出され、発光は４４５ｎｍで測定される。生成されたピリドキソラクトン産物の量は、プレートのピリドキソラクトンウェルから測定された蛍光から生成された標準曲線を使用して計算される。反応速度は、産生したピリドキシルｕモル／分単位の進行曲線の線形回帰によって計算される。比活性は、反応速度をアッセイ反応で使用されるタンパク質濃度で割ることによって計算される。ＡＬＰ２０１、１０ｎｇ／ｍＬについて、このアッセイによって生成されたデータの例示的な進行曲線が図２３に示されている。１０ｎｇ／ｍＬのＡＬＰ２０１、１０ｎｇ／ｍＬのＡＬＰ２５０及び１２．５ｎｇ／ｍＬのアスフォターゼアルファのピリドキサール－５’－リン酸加水分解活性の詳細を示すミカエリス・メンテンプロットを図２４に示す。

【0262】

【表7】

【0263】

実施例４
ヒドロキシアパタイト結合アッセイ
ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）への蛍光Ｆｃ融合物結合の特性評価。
Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＨＡ（ＣＡＰＴＡＬ（登録商標））は、Ｐｌａｓｍａ－Ｂｉｏｔａｌ Ｌｔｄ．（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。別の１．５ｍＬ遠心分離管では、骨標的化蛍光Ｆｃ融合物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（１管あたり１ｍＬの懸濁液）中の０．１％（ｗ／ｗ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で５０ｎＭに希釈される。各蛍光Ｆｃ融合物含有チューブに、１ｍｇの合成ＨＡを添加し、ＨＡが沈降するのを防ぐために、チューブを軌道混合しながら室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを１６，０００ｒｃｆで５分間遠心分離して、固体ＨＡ結合画分を非結合タンパク質懸濁液から分離した。続いて、ＨＡ結合画分をＰＢＳで３回洗浄し、最終的なＨＡ画分を１００μＬのＰＢＳに懸濁した。懸濁したＨＡ結合画分及び１００μＬの非結合タンパク質懸濁液を９６ウェル黒色プレートに移し（１ウェルあたり１画分）、蛍光プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘ）を使用して４８８ｎｍ／５８５ｎｍでの蛍光励起／発光により相対タンパク質濃度を測定した。

【0264】

２０個の蛍光Ｆｃ融合タンパク質がＨＥＫ細胞で一過性に発現され、Ｎｉ－ＮＴＡレジンを使用して精製された（配列の詳細については、表１を参照されたい）。蛍光Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロで骨標的化部分を体系的に評価するための、Ｎ末端ＨＡ結合配列のみが異なっていた。別のチューブにおいて、蛍光Ｆｃ融合タンパク質をＢＳＡの存在下でＨＡと懸濁状態でインキュベートし、非特異的結合を防いだ。図１Ａは、非標的蛍光Ｆｃ融合（ＦＬＵ００２）と比較した、各蛍光Ｆｃ融合サンプルのＨＡ結合画分の蛍光強度を示す。さらに、非結合タンパク質画分は、ＨＡとのインキュベーション直後（ＨＡペレットの最初の洗浄の前）に収集された。これらの蛍光強度は、ＦＬＵ００２に関してもプロットされ、図１Ｂに示される。ＦＬＵ００１、００３、００４、０１６、０２７及び０３１について、これらのタンパク質はいずれも非結合タンパク質画分でバックグラウンドを超えて検出されなかったため、１００％のタンパク質がＨＡに結合した。逆に、ＦＬＵ００２は、ＦＬＵ００１と比較して４分の１のＨＡへの結合を示し、有意な非結合蛍光シグナル（ＦＬＵ００１又はバックグラウンドの１００倍）を示した。ＦＬＵ００５－００９、０１１－０１４及び０２０は、ＦＬＵ００２と同様のＨＡ結合特性を示した。興味深いことに、２つのタンパク質（ＦＬＵ０１０及びＦＬＵ０１５）は、ＨＡ結合画分及び非結合画分で有意な蛍光（陰性対照を超える）を示した。

【0265】

ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）は、インビトロ骨標的化アッセイの結合基質として骨に対して互換的に使用されているが、特にインビボでの制御された結晶核形成におけるコラーゲン及び他の細胞外マトリックスタンパク質の役割に関して、セラミックＨＡと天然骨との間に有意差が認められている（Ｚｈａｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，２０２－２０６，２００６）。ＣＡＰＴＡＬ（登録商標）ブランドのＨＡは、Ｃａ：ＰＯ_４比（１．６７）、鉄含有量（１００ｐｐｍ）、マグネシウム含有量（８００～１１００ｐｐｍ）及び結晶格子に基づいて骨ミネラル類似体として製造されたため、この研究で特に使用された。依然として、ＣＡＰＴＡＬ（登録商標）ＨＡと骨ホモジネートとの間で総タンパク質結合に有意差が観察された。最も重要なことに、ＢＳＡブロッキング剤の存在下でも、ＨＡとインキュベートした全ての蛍光Ｆｃ融合タンパク質で非特異的結合が観察された。骨ホモジネートとインキュベートした場合、非標的蛍光Ｆｃ融合対照タンパク質（ＦＬＵ００２）は、バックグラウンド（骨ホモジネートのみ）を超える蛍光シグナルを示さなかった。したがって、骨ホモジネートは、より典型的なイオン交換樹脂のように挙動するＨＡと比較して、よりストリンジェントな結合基質であった。ただし、適切な対照タンパク質に正規化すると（図１Ａ～１Ｄのように）、ＨＡ結合データは効率的な骨結合タンパク質の識別に有用であったが、蛍光Ｆｃ融合タンパク質検出のダイナミックレンジはＨＡ結合アッセイで大幅に減少した（およそ５倍）。ＡＬＰ－Ｆｃタンパク質は、ＨＡへのさらに大きい非特異的結合を示した。これは、ＡＬＰ触媒ドメインの負電荷によるものである可能性が高い。場合により、これにより、一部のＡＬＰ－Ｆｃ－Ｘタンパク質がＨＡ結合特性を有すると誤って識別されることもあったが、これは骨ホモジネートとインキュベートした場合には観察されなかった。このため、骨ホモジネートは骨結合タンパク質をスクリーニングするための優れた基質と見なされ、その後の全てのインビトロアッセイに使用された。

【0266】

実施例５
骨ホモジネートアッセイ
以前の文献のアッセイは、骨スライス又は他の三次元的に物理的に制限された基質に依存していた。タンパク質の有効性を識別及び定量化し、結合パーセンテージを定量化するには、より正確で、より速く、より効率的なアッセイが必要であった。

【0267】

骨ホモジネートの調製。
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨は、使用前に－８０℃で保管した。大腿骨は、１ｘＥＤＴＡフリーのセリン及びシステインプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標），Ｒｏｃｈｅ）を含むＢＳ中の１ｍＬ ０．２％（ｗ／ｗ）コラゲナーゼタイプ２（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含む、２ｍＬ遠心分離管（１管あたり２つの大腿骨）に移した。大腿骨を短時間ボルテックスし、振とう（８００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートした。残存している結合組織を取り除き、大腿骨を氷上のペトリ皿に置いた。針及びシリンジを使用して骨髄をＰＢＳで洗い流した。乾燥した骨を計量し（典型的には１つの大腿骨あたり３０～５０ｍｇ）、１ｘプロテアーゼ阻害剤を含む０．７５ｍＬ ＰＢＳと共に、予め冷却した硬組織を粉砕する個別の使い捨てビートビーター（ＰＲＥＣＥＬＬＹＳ（登録商標）、Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に入れた。次に、ハイスループットビーズミルホモジナイザー（Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ、４℃、最高速度、３０秒間を４サイクル）を使用して大腿骨をホモジナイズした。ホモジネートを１．５ｍＬの遠心分離管に移し、１２，０００ｘｇで１５分間、４℃で遠心分離して、遊離したタンパク質／細胞破片から骨ホモジネートを分離した。骨ホモジネートを、結合アッセイで使用するために、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡに再懸濁した。

【0268】

インビトロでの骨ホモジネートへの蛍光Ｆｃ融合物の結合。
蛍光Ｆｃ融合タンパク質は、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５０ｎＭに希釈し、個々の１．５ｍＬ遠心分離管（１管あたり１ｍＬ）で３ｍｇの骨ホモジネートとインキュベートした。サンプルを室温で２時間混合した後、骨ホモジネートに結合した画分と結合していない画分を遠心分離によって分離した。骨ホモジネート画分をＰＢＳで３回洗浄し、最終ホモジネートペレットを１００μＬのＰＢＳに懸濁した。懸濁骨ホモジネート及び１００μＬの非結合タンパク質懸濁液を、蛍光プレートリーダーを使用して相対蛍光Ｆｃ融合濃度について定量化した。

【0269】

全ての蛍光Ｆｃ融合タンパク質について、骨ホモジネートへの結合はＨＡへの結合と同様の傾向を示したが、図１Ｃに示すように、効率的な骨結合タンパク質（例えば、ＦＬＵ００１）と非結合剤（例えば、ＦＬＵ００２）との間に大きい数値差があった。骨結合画分では、ＨＡへの結合で観察された４倍の増加と比較して、陰性対照（ＦＬＵ００２）よりもＦＬＵ００１で８倍の蛍光の増加が観察された。骨ホモジネートへのＦＬＵ０１０の結合は、陰性対照（ＦＬＵ００２）を有意に上回っていなかったが、ＦＬＵ０１５は依然として骨ホモジネートへの効率的な結合を示し、非結合画分に有意な存在を示した。これらの結果が統計的な異常ではないことを確認するために、ｎ＝４で実験を繰り返し、ＦＬＵ０１０及び０１５で同じ結果が観察された。

【0270】

重要なことに、ＨＡ（実施例２）及び骨ホモジネートに結合したタンパク質の総量を定量化する生の蛍光データは、骨ホモジネートと比較して、同等の質量のＨＡへの非標的タンパク質の有意に大きい結合を示し（場合によりＨＡへの結合が７５倍も増加）、これは、効率的な骨標的化部分の不存在下であっても、ＨＡへのタンパク質の非特異的結合が一部存在することを示している。ＨＡへの非特異的結合は、タンパク質インキュベーションからブロッキング剤を除去するとさらに悪化した。これは、特異的ＨＡ結合部分を有しないものを含む様々なタンパク質に結合するＨＡの能力を示す。ＨＡは非標的融合から中程度のＨＡ結合融合を区別するのにあまり有用ではなかったが、ＨＡは非常に効率的な骨結合タンパク質を決定するための適切な基質であった。骨ホモジネートはよりストリンジェントな結合基質であり、非標的タンパク質の非特異的結合を示さなかったため（図１を参照されたい）、その後の全ての骨結合スクリーニングアッセイは、結合基質としてマウス骨ホモジネートを使用して実施した（図２Ａ～２Ｂ）。

【0271】

結合画分及び非結合画分の蛍光強度を非標的蛍光Ｆｃ融合タンパク質に正規化して、異なる標的化部分を比較した（図３Ａ～３Ｂ）。インビトロ結合実験は、重複±標準偏差で実施された。

【0272】

骨ホモジネートに結合するコンストラクトの特性評価
インビトロモデルを使用して、インビボ投与の前にＥＲＴ様分子の骨結合を特徴付けた。ヒドロキシアパタイト蛍光ベースの結合アッセイを利用するために、ＡＬＰ０３１（ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ１０）及びＡＬＰ０８６（ＡＬＰ－Ｆｃ）タンパク質を、市販の抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で蛍光標識した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素は、タンパク質の第一級アミンと反応するスクシンイミジルエステル又はテトラフルオロフェニルエステルで前に活性化されていた。したがって、蛍光標識は部位特異的でなく、標識の程度は抗体１モルあたりフルオロフォア３～５モルであった。標識及び精製して遊離色素を除去した後、０．１％ＢＳＡで３０ｎＭタンパク質溶液を作成し、ＦＦＣコンストラクトについて上記のように記載されているように骨ホモジネート結合アッセイを実施した。骨ホモジネートに対して異なる親和性を有するコンストラクトの例示的なデータが図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｄ、図２及び図３に示される。

【0273】

プレート骨ＡＬＰ活性アッセイ
骨ホモジネート画分は、４－ＭＵＰを使用してＡＬＰ活性についてアッセイした。骨ホモジネート画分を１００μＬのＰＢＳに懸濁し、９６ウェル黒色プレートに移した。１００μＬの非結合タンパク質懸濁液も９６ウェルプレートの別々のウェルに移した。各ウェルに、１００μＬのＡＬＰ検出溶液（１０μＭ ４－ＭＵＰ、１％ＢＳＡ）を加え、動的蛍光読み取り（３６０／４６５）を直ちに開始し、２０分間実行し、３０秒ごとに蛍光強度発光を収集した。時間に対する蛍光強度の傾きは、各サンプル画分のＡＬＰ濃度を表していた。

【0274】

直線性を維持するために、複数のコンストラクトの結合画分及び非結合画分のＭＵＰ活性を、最初の５分間の初期活性勾配によって測定した。ＭＵＰ活性の比率は、各融合タンパク質について、比率＝（結合活性）／（非結合活性）として決定された。結果は図１４に示される。この比率は、ポリ酸性骨標的化タグの長さが長くなるにつれて指数関数的な応答を示し、個々の残基がポリ酸性ペプチドに付加されると、骨ホモジネートの結合が大幅に強化される。

【0275】

インビトロでの骨ホモジネートに対する相対的タンパク質親和性の決定
骨結合タンパク質の相対的親和性をランク付けするために、複数回投与アッセイが開発された。骨ホモジネートに効率的に結合するタンパク質について、相対的解離速度は、この動的タンパク質対骨交換アッセイによって決定された。

【0276】

１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内で飽和濃度（１μＭ）の非標識骨結合タンパク質を５ｍｇの骨ホモジネートとインキュベートすることにより、タンパク質を個別に評価した（例えば、チューブごとに１つのタンパク質タイプ）。非標識タンパク質との２４時間のインキュベーション後、骨ホモジネートを遠心分離（１６，０００ｒｃｆ、５分間）して、過剰な非結合タンパク質を除去した。所与の骨結合タンパク質で飽和した骨ホモジネートは、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）蛍光プローブで標識された同じ骨結合タンパク質の０．５μＭ溶液に再懸濁し、１、２、４、８及び２４時間インキュベートした後、骨ホモジネートを遠心分離し、ＰＢＳで３回洗浄し、９６ウェル黒色プレートに移した。最初の遠心分離からの上清も収集して、懸濁液中に残った（非結合）蛍光タンパク質の量を定量化した。蛍光プレートリーダーを使用して、各時点での結合及び非結合の蛍光標識タンパク質の量を定量化し、これにより、非標識タンパク質の解離速度の速度論的表現が可能になった。

【0277】

骨ホモジネートを最初に所定のタンパク質で２４時間飽和させ、完全に洗浄して過剰な非標識タンパク質を除去し、最後に蛍光標識を含む同じタンパク質とインキュベートして、骨ホモジネートの表面を可溶性（蛍光標識）タンパク質で飽和させたタンパク質の交換を追跡した。蛍光シグナルは、飽和濃度の非標識タンパク質で２４時間前処理されていないサンプルに対して正規化され、これは、蛍光標識タンパク質の最大の潜在的結合を表している。ＶＨＨ００１（円）は、結合タンパク質濃度と非結合タンパク質濃度の即時平衡を示し、急速な交換速度又は低親和性の骨ホモジネート結合剤を示している。ＶＨＨ００２（四角）は、溶液中の蛍光標識タンパク質による結合タンパク質のより緩やかな置換を示した。ＡＬＰ０３１（三角）は、蛍光標識タンパク質による結合タンパク質の最小の置換を示し、これは、結合すると骨に対して高い親和性を示すことを示している。

【0278】

予め飽和された骨上の蛍光タンパク質蓄積の速度論的曲線により、骨上の非標識タンパク質が標識タンパク質に置換されていることが示された（図１０Ａ～１０Ｂ）。

【0279】

骨ホモジネートへのＡＬＰ－Ｆｃ－（Ａｓｐ）_１０及びＡＬＰ－Ｆｃ結合の特性評価。
インビトロモデルを使用して、インビボ投与の前にＥＲＴ様分子の骨結合を特徴付けた。ヒドロキシアパタイト蛍光ベースの結合アッセイを利用するために、ＡＬＰ－Ｆｃ－（Ａｓｐ）_１０及びＡＬＰ－Ｆｃ融合タンパク質を、市販の抗体標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で蛍光標識した。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素は、タンパク質の第一級アミンと反応するスクシンイミジルエステル又はテトラフルオロフェニルエステルで前に活性化されていた。したがって、蛍光標識は部位特異的でなく、標識の程度は抗体１モルあたりフルオロフォア３～５モルであった。標識及び精製して遊離色素を除去した後、０．１％ＢＳＡで３０ｎＭタンパク質溶液を作成し、記載されているように骨ホモジネート結合アッセイを実施した。

【0280】

結合／非結合の画分は、骨タグの長さの関数としての近似ガウス分布に従って変化した。

【0281】

結果
骨ホモジネート結合のインビトロ特性は、インビボでの骨標的化を示した（実施例５を参照されたい）が、会合（結合）のみの研究では、２つの非常に効率的な骨標的化部分間の区別はできなかった。例えば、ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０（配列番号３１）及びＶＨＨ００２（配列番号２５０）の両方が、インビトロで骨ホモジネートに定量的に結合し、インビボで骨に効率的に結合し保持されることを示した。これらのタンパク質は、これらの実験ではほとんど区別できないが、解離挙動に基づいて、骨に対してまったく異なる親和性を有する。図１０Ａ～１０Ｂに示されるように、骨に結合したＶＨＨ００２は、溶液中の過剰な可溶性蛍光標識ＶＨＨ００２と交換し得る。対照的に、ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０は、過剰な可溶性蛍光標識ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０の存在下であっても、一度結合すると骨ホモジネートからの解離をほとんど示さない。したがって、ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０は、ほぼ同等の会合（結合）率を有するにもかかわらず、ＶＨＨ００２と比較して骨に対してはるかに高い親和性を示した。ＶＨＨ００２及びＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０は効率的に骨に局在化し、７日を超えて骨コンパートメントに残存したが、おそらくそれらの局在化のメカニズムはかなり異なっていた。ＶＨＨ００２は骨から解離する能力を示したが、ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０は結合後の解離が有意に遅いことを示した。ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０分子は、最初の結合部位の近くに残存する可能性がある一方、ＶＨＨ００２は骨組織全体に結合及び解離するためのより多くの可動性を有する。

【0282】

骨局在化のメカニズム及び治療効果に対する新規標的化ドメインの影響を適切に理解することは、最適に効果的な酵素補充療法を開発するために非常に重要である。さらに、骨に対する治療剤の滞留時間と及び動性を調整することで、ＨＰＰなどの疾患の処置に使用するためにｓＡＬＰコンストラクトを最適化することができる。

【0283】

実施例６
マウスモデルにおける薬物動態分析
１１～１２週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に、４～７ｍｇ／ｋｇの単回注射で、尾静脈又は皮下に、滅菌ＰＢＳ（カルシウム又はマグネシウムなし）中の１ｍｇ／ｍＬのサンプルタンパク質を投与し、１４～２１日間フォローした。２回の中間採血及び１回の終末採血（心臓穿刺、ＣＯ_２麻酔）を、各マウスで、コホート内でずらして実行した（４つの群のそれぞれに４匹のマウス、分子ごと、投与タイプごと）。血液サンプル（１００μＬ、遠心分離後に５０μＬの血漿を生成）を、０．２５、１、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１９２、２６４、３３６及び４８０時間でＬｉ／ヘパリン処理チューブに収集した。血液サンプルは、血漿に加工されるまで４℃で保存された。その後、血漿サンプルは、液体窒素で瞬間凍結され、－８０℃で保存された。

【0284】

マウス血漿サンプル中の酵素活性の定量化：
実施例２で酵素比活性を決定するために使用された４－ＭＵＰアッセイは、未知のアルカリホスファターゼ濃度で収集されたサンプル中の活性を測定するためにわずかに修正された。血清サンプルをアッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４及び１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１００倍～６，０００倍に希釈して、活性アルカリホスファターゼ濃度を測定した。標準曲線が、既知の活性及び濃度の参照標準アルカリホスファターゼサンプルの観察された活性に基づいて作成されたことを除いて、希釈サンプルは、実施例２に記載されているように定量化した。時間に対する蛍光強度の傾きは、関数として（本明細書では単位／ｍＬ血清として）の各サンプル画分におけるＡＬＰ活性に対応する４－ＭＵ産生の速度を表された。静脈内投与及び皮下投与後の選択された化合物の例示的なマウスＰＫ曲線は、図１５Ａ（ＩＶ）及び図１５Ｂ（皮下）並びに表８に見出すことができる。

【0285】

【表8】

【0286】

実施例７
ＨＰＰのマウス有効性モデルにおけるアルカリホスファターゼコンストラクトの試験
アルカリホスファターゼコンストラクトの前臨床有効性研究は、ＨＰＰのＡｋｐ２ＧＷ（－／－）マウスモデルを使用して実施された。Ａｋｐ２ＧＷ（－／－）マウスは、依然にアスフォターゼアルファの前臨床評価で使用されたＡｋｐ２（－／－）マウス（Ｎａｒｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．１９９７）で使用されたものと同じＨＰＰ誘導ＴＮＳＡＬＰ変異を共有する。これらの研究では、被験物質（ＡＬＰ２０１又はビヒクル（ＰＢＳ））を肩甲骨領域に皮下投与し、出生後１日目から３５日目まで投与した。報告された結果には、全生存期間、体重増加率、３６日目（又は研究終了［ＥＯＳ］前の場合には死亡時）の後足骨の骨石灰化及びＥＯＳトラフ血漿酵素活性レベル（毎日［ＱＤ］及び毎週［Ｑ１Ｗ］の群では３６日目、２日ごと［Ｑ２Ｄ］用量群では３７日目に取得）が含まれていた。いくつかの研究において、ＥＯＳ大腿骨及び脛骨の長さ並びにマウス大腿骨アルカリホスファターゼ活性が測定された。

【0287】

動物の一般的な幸福の指標として、体重も毎日評価された。年齢及び同腹子を一致させたＰＢＳ処理ＷＴマウスを参照対照として使用した。群７の動物は、２４日目まで群３～５の同じＡＬＰ２０１の皮下注射を毎日受けた。２５日目に、ＡＬＰ２０１の１日皮下用量を最初の投与量の半ログ（ｈａｌｆ－ｌｏｇ）だけ減少させ、３５日目の最後の処置用量まで維持された。ＡＬＰ２０１は、陰性（ＰＢＳ）対照と比較して、生存率及び骨の石灰化において統計的に有意な改善を示した。

【0288】

生存曲線を図１６に示し、平均体重を図１７にグラフ化する。１１日目の後足の石灰化指数による骨石灰化表現型の補正を図１８に示す。これらの研究の用量群の表を表９に示す。

【0289】

【表9】

【0290】

骨石灰化結果
３６／３７日目の骨石灰化の結果は、処置されたＡｋｐ２ＧＷ（－／－）マウスの後足のＸ線分析によって決定された。後足の骨石灰化のＸ線による視覚化を、影響なし、軽度の欠損、中程度の欠損、重度の欠損の４つの分類カテゴリを例示する３６日目のベンチマークＸ線画像と比較した。これらの分類の詳細な説明は、表１０に見出される。盲検の個体は、各マウスの画像にスコアを割り当て、完了すると、スコアは個々の用量群内で蓄積された。

【0291】

【表10】

【0292】

有効性研究における骨石灰化指数の分布を表１１に示し、図２５にグラフで示す。

【0293】

【表11】

【0294】

生存結果
ＰＢＳで処理された全てのＡｋｐ２ＧＷ（－／－）マウスは、研究の２６日目以前に死亡し、生存期間の中央値は２０日であった。Ａｋｐ２ＧＷ（－／－）マウスのＡＬＰ２０１及びＡＬＰ２５９処置は、ＰＢＳビヒクル対照と比較して全ての用量群で３６日生存率を有意に改善した（図１６）。全てのＡＬＰ２０１投与群は、少なくとも６９％のＥＯＳ生存率に達し、０．１５ｍｇ／ｋｇ／日の用量を超える全てのＱＤ及びＱ２Ｄ間隔投与群は、８８％以上の全生存率を記録した。ＡＬＰ２０１ ４．８ｍｇ／ｋｇ Ｑ１Ｗ群とアスフォターゼアルファ９．８ｍｇ／ｋｇ ＱＤ群の生存曲線は、非常に類似した結果を有する（表１２及び図１６）。

【0295】

【表12】

【0296】

研究終了時の血漿アルカリホスファターゼ活性測定及び結果
マウス血漿サンプルは、研究終了時（毎日（ＱＤ）及び毎週（Ｑ１Ｗ）の投与群では３６日目、２日ごと（Ｑ２Ｄ）の投与群では３７日目）に収集及び調製された。血漿サンプル中のアルカリホスファターゼ活性は、実施例６に概説された方法を使用してアッセイされた。血漿サンプル中の測定された反応速度は、Ｕ／ｍＬの単位で血漿アルカリホスファターゼ活性値について値を取得する既知の酵素活性の標準曲線を使用して計算された。独立したサンプリングポイントごとにデータをコンパイルするために、サンプルが２回重複して実行された。Ｕ／ｍＬの値は、次の関係によってｍｇ／Ｌの単位に変換された。
ｍｇ／Ｌ単位の濃度＝（Ｕ／ｍＬ単位の測定活性値／Ｕ／ｍｇ単位の被験物質の比活性度）＊１０００。

【0297】

研究終了時の血漿活性レベルの分布を図２８に示し、平均値を表１３に示す。

【0298】

【表13】

【0299】

研究終了時の骨組織アルカリホスファターゼ活性測定
研究の３６／３７日目にマウス大腿骨サンプルを回収し、余分な組織を取り除き、急速凍結し、－８０℃で保存した。分析の前に、大腿骨サンプルをドライアイスに移し、滅菌した冷たいペトリ皿に置き、洗浄して、残留結合組織を全て除去した。骨鋏を使用して、大腿骨の端を切り取り、シャフトを湿った氷上で０．５ｍＬの収集チューブ（２０ゲージの注射針で底に１つの穴を開けて準備）に移した。収集チューブを１．５ｍＬの遠心分離管にロードし、ベンチトップマイクロ遠心分離機で、４０００ｒｐｍで３０秒間スピンし、マウスの大腿骨から骨髄を効果的に排出した。調製したマウス大腿骨シャフトを秤量し、９６ウェル黒色不透明アッセイプレート内の９０マイクロリットルの希釈バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）に移した。マウスの大腿骨シャフトが長すぎてアッセイウェルに収まらない場合、大腿骨シャフトを半分に切断し、両方の半分を同じウェルに配置した。

【0300】

各アッセイプレートにおいて、対照は、アッセイ前に９０℃で６０分間保持し、これらの骨サンプルのアルカリホスファターゼ活性を効果的に熱殺菌した、未処理の野生型及びＡＫＰ２ＧＷ（＋／－）ヘテロ接合マウスの大腿骨シャフトを含み、これは、アッセイの陰性対照として機能した。

【0301】

既知の比活性を有するアルカリホスファターゼ活性参照標準の希釈系列を使用して各プレートにおいて標準曲線を作成し、０、１．２５、２．５、５、１０、２０、３５及び５０ｎｇ／ｍＬの最終アッセイ濃度でアッセイプレートに移した。

【0302】

アッセイの前に、プレートを密封し、Ｊｉｔｔｅｒｂｕｇ加熱プレートシェーカー（振とうなし）で１５分間、３７℃に加熱した。３７℃に温まると、１６０ｍＬの基質溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１５．６２５～１５６．２５ｍＭ ４－ＭＵＰ）であった。ウェル内の４－ＭＵＰの最終濃度は、２５０ｕＬの容量で１０－１００ｕＭであった。４－メチルウンベリフェロン産生の進行曲線は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｉ３ｘプレートリーダー（励起λ＝３６５ｎｍ及び発光λ＝４４５ｎｍに設定）又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｐａｒａｄｉｇｍプレートリーダー（励起λ＝３６０ｎｍフィルター及び発光λ＝４４５ｎｍフィルターに設定）のいずれかを使用して３７℃で測定した。

【0303】

全てのサンプルの活性勾配は、市販のスプレッドシートプログラム（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）で線形回帰を使用して計算された。実験の過程で活性勾配が目に見えて非線形になった場合、サンプルの進行曲線の最初の線形部分を使用して、初期反応速度を取得するための線形回帰を実行した。個々の進行曲線の傾きは、相対蛍光単位（ＲＦＵ）／分で計算された。このアッセイの進行曲線の例を、図２８及び２９にプロットされた個々の対象からの値の分布と共に、図３０に示す。

【0304】

処置されたＡｋｐＧＷ（－／－）の大腿骨は、アルカリホスファターゼ活性の明らかな増加を示し（表１４）、ＡＬＰ２０１及びＡＬＰ２５９が骨組織に酵素活性を送達する能力を示している。

【0305】

【表14】

【0306】

脛骨及び大腿骨の長さ結果
研究終了時に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して脛骨及び大腿骨の長さを測定して、Ｆａｘｉｔｒｏｎ Ｘ－Ｒａｙによってキャプチャされた骨画像の両端に１つずつ、骨の最も長い部分の長さが分析点を接続する直線でキャプチャされるように分析点を取得した（ＩｍａｇｅＪ長さ）。

【0307】

ミリメートル（ｍｍ）単位の骨の長さは、次の式を使用して計算された。

【数1】

【0308】

９．８ｍｇ／ｋｇでのアスフォターゼアルファの毎日の投与と比較して、ＡＬＰ２０１を毎日及びＱ２Ｄで投与したＡＫＰ２ＧＷ（－／－）マウスは、大腿骨及び脛骨の長さの両方で統計的に有意な改善が見られた。すなわち、大腿骨の長さはそれぞれｐ＝０．０２１２及びｐ＝０．００３２、脛骨の長さはそれぞれｐ＝０．００３０及びｐ＝０．００８８、一元配置分散分析、処置の３６／３７日後：アスフォターゼアルファに対するダネットの多重比較検定（図２６、脛骨及び図２７、大腿骨）。

【0309】

体重結果
有効性試験では、全てのマウスの体重をモニターした。全ての処置群で、ＡＬＰ２０１及びＡＬＰ２５９で処置したＡｋｐ２ＧＷ（－／－）マウスの体重は、ＰＢＳで処置した野生型同腹仔の体重よりも一貫してわずかに低かったが、研究中の任意の時点、任意の群で、統計的に有意な差は全くなかった（図１７）。

【0310】

ＡＬＰ２５９は、ピロリン酸加水分解に対して２倍長い酵素活性を示し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＩＶ投与後のインビボ半減期はアスフォターゼアルファより４～５倍長いことを示した。ＡＬＰ２５９は、ＨＰＰのＡＫＰ２ＧＷ（－／－）マウスモデルにおけるアスフォターゼアルファよりも血漿中の研究終了時の蓄積が約５０倍多く、研究終了時のＡＫＰ２ＧＷ（－／－）骨活性蓄積は、ＡＬＰ２０１の１４０％を示した。ＡＬＰ２５９は、正常な骨表現型を有する未処置のマウスの２０％未満と比較して、ＡＫＰ２ＧＷ（－／－）マウスモデルで骨石灰化について明確な有効性を示し、マウスの１００％が正常な骨石灰化を有するｑ２ｄ用量間隔で、４．８ｍｇ／ｋｇで処置された。

【0311】

実施例８
骨標的化のインビボ特性評価：マウスにおけるインビボ蛍光イメージング
半定量的生体内分布研究は、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０標識骨標的化タンパク質及びタンパク質フラグメント（ＶＨＨ）を使用してヌードマウスで実施された。骨標的ＡＬＰ－Ｆｃ融合タンパク質及び骨標的ＶＨＨは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳＡＩＶＩキット（活性化スクシンイミジルエステルを介した共有結合）を使用してＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０で蛍光標識し、ゲル排除樹脂で精製して非コンジュゲートフルオロフォアを除去した。精製されたタンパク質（ＰＢＳに懸濁）は、約３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈を介してヌードマウスに注射された。

【0312】

雌性Ｊ：ＮＵ非近交系マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）は、容量を正規化した１００μＬの尾静脈注射により３ｍｇ／ｋｇの被験物質を投与された。インビボ画像取得のために、対象は、イメージングプラットフォーム（ＩＶＩＳ（登録商標）スペクトルイメージングシステムＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で２～３％のイソフルラン麻酔下に維持された。視野（ＦＯＶ）Ｃ、Ｆ／Ｓｔｏｐ２、ミディアムビニング及び８００ｎｍ発行／７５０ｎｍ励起フィルターを備えた自動露出設定が２Ｄ落射照明及び３Ｄ透過照明の両方の取得に使用された。エクスビボ組織標本の２Ｄ落射照明蛍光イメージングは、各組織タイプの全ての標本を単一の画像で同時に取得できることを除き、同一条件下で取得した。全ての動物実験は、動物福祉法（Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ）の規定及び実験動物の管理及び使用に関するガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）の原則に従って実施された。

【0313】

蛍光画像解析は、製造元提供の２Ｄ／３Ｄソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．５．１，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して実行された。対象の各セットに適用される均一な領域の関心領域（ＲＯＩ）は、対象の位置の違いを考慮して手動で配置された。縦断的なインビボ画像カラースケール範囲は、全ての対象及び時点で正規化した。エクスビボ標本のカラースケールは、各組織セットの蛍光シグナルを最もよく表すように個別に決定した。図４、８、１２及び１３の全ての画像は、次のパラメータを適用して表される。不透明度＝８０、カラーテーブル＝「ブルーホット」、平滑化＝なし、対数目盛。Ｒｅａｄ Ｂｉａｓ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ａｄａｐｔｉｖｅ ＦＬ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ及びＦｌａｔ Ｆｉｅｌｄ、Ｃｏｓｍｉｃ及びＬｅｎｓ Ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ Ｃｏｒｒｅｃｔも適用される。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０シグナルは、放射効率（ｐ／秒／ｃｍ^２／ｓｒ）／（μＷ／ｃｍ^２）として表される。

【0314】

エクスビボの骨標本は、マイクロコンピューター断層撮影Ｘ線システム（Ｑｕａｎｔｕｍ ＦＸ μＣＴ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で個別に画像化された。次のパラメータが全ての取得に使用された。電圧＝９０ｋＶ、電流＝１８０μＡ、ＦＯＶ＝４０ｍｍ、１７秒の取得時間。総骨量（Ｔｔ．ＢＶ、ｍｍ^３）の定量化は、骨成長ワークフローを使用して、製造元提供のソフトウェア（ＡｃｃｕＣＴ １．０ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して計算した。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０シグナルの骨体積への正規化は、（（ｐ／秒／ｃｍ^２／ｓｒ）／（μＷ／ｃｍ^２））／ｍｍ^３として表される。統計分析は、市販の統計ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実施した。

【0315】

ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０（配列番号３１）は骨標的化タンパク質の可能なシグナルを最大化し、ＡＬＰ－Ｆｃ（配列番号２２２）は骨ホモジネートへの結合を示さなかったため、これらのタンパク質をインビボでの骨標的化実験の陽性及び陰性対照タンパク質として利用した。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０標識ＡＬＦ－Ｆｃ又はＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０の静脈内注射を青年期のヌードマウスに投与し、１８日間の研究を通してタンパク質の生体内分布をインビボで追跡した。２次元ＩＶＩＳ生動物蛍光イメージングは、１、４、７、１１、１５及び１８日目に全てのマウスで実行された。１８日間の研究の終了時に、マウスを屠殺し、肝臓、腎臓、脾臓、大腿骨、頭蓋骨及び脊椎に対してエクスビボ特異的蛍光イメージングを実施した。図４及び５Ａ～５Ｂは、全身イメージングゲート内で検出された蛍光タンパク質の総放射効率を示す。定量的には、蛍光標識された骨標的化ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０で処置されたマウスの平均総放射効率は、投与後最初の４日間を通して非標的ＡＬＰ－Ｆｃで処置されたマウスと同様であった。しかし、７日目以降、ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０は、骨への標的タンパク質の蓄積及び非標的タンパク質のクリアランスにより、ＡＬＰ－Ｆｃよりも有意に高い放射効率を示した。図５Ｂは、脊髄関心領域内の同じ処置されたマウスの総放射効率の比較を示す。脊髄関心領域では、４日以内に標的及び非標的ＡＬＰ－Ｆｃ融合間で統計的差異が観察され、その差異は１８日間の研究期間を通して維持された。図４は、各画像化時点での各処置群からの代表的な画像を示し、カラースケールは放射効率を示す。

【0316】

新しく開発された骨ホモジネートスクリーニングアッセイは、インビボで検証された。開発されたスクリーニングアッセイにより、ＡＬＰ－Ｆｃ－Ｄ_１０及びＡＬＰ－Ｆｃは、それぞれ、骨結合特性の２つの極値、骨ホモジネートへのタンパク質の定量的結合を示し、骨ホモジネートへの特異的結合を示さなかった。インビボ生体内分布研究は、単回静脈内注入後２週間を超えて骨組織内でＡＬＰ０３１の保持が延長されることを示した（図１２、カラースケールで示された放射効率）。対照的に、ＡＬＰ０８６（非標的ＡＬＰ－Ｆｃ）は、注射後４～７日にわたってインビボで検出できなかった（図１３、カラースケールで示された放射効率）。さらに、ＡＬＰ０３１の静脈内投与により、マウスの脊椎、頭蓋骨及び大腿骨の石灰化組織全体に薬物を均等に分布させた（図６Ａ～６Ｂ）。これらの結果は、骨ホモジネートスクリーニングアッセイにより骨標的タンパク質が非標的タンパク質から区別されたことを確認した。

【0317】

ＶＨＨコンストラクトのさらなるインビボ研究により、非常に効率的な骨結合剤とより低い親和性を有する骨結合タンパク質中間体とが区別された（図７、８、９Ａ～９Ｃ及び１０Ａ～１０Ｂ）。この目的のために、非標的ＶＨＨタンパク質が腎排泄を介して体循環から急速に排除され、バックグラウンドシグナルを制限し、骨局在の早期分化を可能にしたため、インビボでＶＨＨタンパク質を研究することが有利であった。図８は、非標的対照と比較して注射後２４時間でＶＨＨ００１及びＶＨＨ００２で処置されたマウスの全身蛍光シグナルの増加及びＶＨＨ００１と比較してＶＨＨ００２の増強されたシグナルを示した。時間の経過と共に、ＶＨＨ００１で処置したマウスからのシグナルは非標的対照のベースラインレベルに近づき、ＶＨＨ００２で処置したマウスからのシグナルは７日間の研究を通して有意に増加したままであった。この骨標的化挙動は、開発されたインビトロスクリーニングアッセイで観察され、非標的ＶＨＨ対照タンパク質をＶＨＨ００１の中間結合及びＶＨＨ００２の非常に効率的な結合から区別し、スクリーニングとインビボ骨標的化との間の検証可能な相関を示した。

【0318】

実施例９
成人男性の対象は、約５．８２μＭの無機ピロリン酸（ＰＰｉ）濃度の上昇、１０未満の平均ＢＯＴ－２強度スコアを示す。対象は２４歳で、痛みを伴う下肢及び歩行障害を経験している。対象は、ＨＰＰと診断され、処置のために選択され得る。対象は、Ｘ線検査及び骨塩密度検査を受けることができ、これは、いずれも脚の骨石灰化の減少を示し得る。

【0319】

配列番号７２のポリペプチドを含む製剤は、０．１ｍｇ／ｍＬで製剤化することができる。製剤は、０．１ｍｇ／ｋｇ／週の投与量で８週間、週に１回対象に皮下注射することができる。対象は、８週間の処置レジメンの後に処置効果について評価することができる。対象は、骨の痛みの軽減及び歩行の正常化を認め得る。対象は、フォローアップＸ線検査及び骨塩密度検査を受けることができ、これは、処置前と比較して、骨石灰化の正常化を示し得る。対象のＰＰｉ濃度は５μＭ未満に減少させることができ、ＢＯＴ－２強度スコアは１２に改善することができ、ポリペプチドによる処置効果を示している。

【0320】

実施例１０
青年期の女性対象は、約４．７８μＭの無機ピロリン酸（ＰＰｉ）濃度の上昇及び予測された６ＭＷＴ値の約７０％未満の平均６ＭＷＴを示す。対象は１４歳であり、歯の喪失及び慢性痛を経験している。対象は、ＨＰＰと診断され、処置のために選択され得る。対象は、Ｘ線検査及び骨塩密度検査を受けることができ、これは、いずれも対象の歯及び大腿骨の骨石灰化を示し得る。

【0321】

配列番号１２３のポリペプチドを含む製剤は、０．５ｍｇ／ｍＬで製剤化することができる。製剤は、０．５ｍｇ／ｋｇ／週の投与量で４週間、週に１回対象に皮下注射することができる。対象は、４週間の処置レジメンの後に処置効果について評価することができる。対象は、慢性痛の軽減を認め得る。対象は、フォローアップＸ線検査及び骨塩密度検査を受けることができ、これは、処置前と比較して、対象の大腿骨における骨石灰化の正常化を示し得る。対象のＰＰｉ濃度は４μＭ未満に低下する可能性があり、対象の６ＭＷＴスコアは予測値の約８５％に向上し、ポリペプチドによる処置効果を示している。

【0322】

実施例１１
青年期の女性対象は、約４．８５μＭの無機ピロリン酸（ＰＰｉ）濃度の上昇及び予測された６ＭＷＴ値の約６５％未満の平均６ＭＷＴを示す。対象は１５歳であり、歯の喪失及び慢性痛を経験している。対象は、ＨＰＰと診断され、処置のために選択され得る。対象は、Ｘ線検査及び骨塩密度検査を受けることができ、これは、いずれも対象の歯及び大腿骨の骨石灰化を示し得る。

【0323】

配列番号１７７のポリペプチドを含む製剤は、０．７ｍｇ／ｍＬで製剤化することができる。製剤は、０．７ｍｇ／ｋｇ／週の投与量で６週間、週に１回対象に皮下注射することができる。対象は、６週間の処置レジメンの後に処置効果について評価することができる。対象は、慢性痛の軽減を認め得る。対象は、フォローアップＸ線検査及び骨塩密度検査を受けることができ、これは、処置前と比較して、対象の大腿骨における骨石灰化の正常化を示し得る。対象のＰＰｉ濃度は４μＭ未満に低下する可能性があり、対象の６ＭＷＴスコアは予測値の約８８％に向上し、ポリペプチドによる処置効果を示している。

【0324】

他の実施形態
前述の詳細な説明及び例は、理解の明確性のためにのみ提供されている。そこから不必要な限定が理解されるべきではない。当業者にとって明らかな変形形態は、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれるため、本発明は、示され、説明された正確な詳細に限定されない。

【0325】

特に明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などを表す全ての数字は、全ての場合に「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。したがって、反対の別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも且つ均等論を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数に照らして、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。

【0326】

本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは、近似値であるにもかかわらず、特定の例に示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、全ての数値には、それぞれの試験測定で見出された標準偏差から必然的に生じる範囲が本質的に含まれる。

【0327】

本明細書に引用されている全ての特許、仮特許出願を含む特許出願、特許刊行物及び非特許刊行物を含む刊行物並びに電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑでのヌクレオチド配列の提出物、並びに例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢでのアミノ酸配列の提出物、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑの注釈付きコーディング領域からの翻訳物を含む）は、参照により組み込まれる。前述の詳細な説明及び例は、理解の明確性のためにのみ提供されている。そこから不必要な限定が理解されるべきではない。当業者にとって明らかな変形形態は、特許請求の範囲によって定義される実施形態に含まれるため、本開示は、示され、説明された正確な詳細に限定されない。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A-2B】

【図3A-3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

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【国際調査報告】