特表 2023-510238 送達組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-13

(54)【発明の名称】送達組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20230306BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230306BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 9/50 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230306BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20230306BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230306BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20230306BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230306BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20230306BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20230306BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20230306BHJP

   C12N 15/57 20060101ALN20230306BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20230306BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17 A

C12N15/09 110

C07K19/00

C12N9/50

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N5/10

A61K38/02

A61P43/00 111

A61K38/43

A61K48/00

A61K47/65

C12N9/12 ZNA

C12N15/54

C12N15/57

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022541282

(86)(22)【出願日】2021-01-03

(85)【翻訳文提出日】2022-08-29

(86)【国際出願番号】 IL2021050007

(87)【国際公開番号】W WO2021137241

(87)【国際公開日】2021-07-08

(31)【優先権主張番号】62/956,342

(32)【優先日】2020-01-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522266483

【氏名又は名称】エディティ セラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ゴラン マシアチ，ミカル

(72)【発明者】

【氏名】マナスター，ヨアヴ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4C076

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC07

4B050KK07

4B050LL01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC29

4C076CC41

4C076CC47

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF34

4C076FF67

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA03

4C084BA44

4C084DC01

4C084DC02

4C084DC22

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA06

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZC41

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BB65

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA06

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZC41

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

外因性非細胞傷害性治療用タンパク質性剤を含む改変細胞が提供される。リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質、またはその機能的断片、および目的のタンパク質を含む非細胞傷害性キメラポリペプチドも提供される。本発明の改変リンパ球およびキメラポリペプチドに関連する治療用組成物、核酸分子、および使用方法も提供される。
【選択図】図９Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

目的の非溶解性治療用タンパク質を標的細胞に送達する方法であって、
前記標的細胞を改変白血球と接触させることであって、
前記改変白血球が、非改変白血球と比較して低下した細胞傷害性を含み、
かつ前記目的の非溶解性治療用タンパク質を含む、接触させることと、
それによって目的の非溶解性治療用タンパク質を標的細胞に送達することと、
を含む、方法。

【請求項2】

ゲノム編集タンパク質を標的細胞に送達する方法であって、
前記標的細胞を改変白血球と接触させることであって、
前記改変白血球が、前記ゲノム編集タンパク質を含む、接触させることと、
それによって目的の非溶解性治療用タンパク質を標的細胞に送達することと、
を含む、方法。

【請求項3】

前記目的の非溶解性治療用タンパク質または前記ゲノム編集タンパク質が、前記標的細胞の細胞質または核に送達される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記改変白血球が、前記標的細胞と免疫シナプスを形成することができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記改変白血球が、分泌リソソーム内に前記目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記改変白血球が、前記改変細胞の細胞膜内にまたは前記改変細胞の細胞膜に結合された前記目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質を含まない、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記改変白血球が、改変Ｔ細胞、改変ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および改変骨髄細胞から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記改変白血球が、改変非細胞傷害性白血球であるか、または前記改変白血球が、細胞要害性を低下させるようにさらに改変されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記改変白血球が、ノックアウトもしくはノックダウン、または少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質を含み、任意により前記内因性細胞傷害性タンパク質がグランザイムＢである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記改変白血球が、少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質中に突然変異を含み、前記突然変異が、前記内因性細胞傷害性タンパク質の細胞傷害性を低下させる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記改変白血球が、少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質のアンチセンス媒介性の低下を含み、前記アンチセンス媒介性が、前記内因性細胞傷害性タンパク質の細胞傷害性を低下させる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記目的の非溶解性治療用タンパク質が、
ａ．自然に分泌されるタンパク質；
ｂ．前記改変白血球の前記膜中に発現する膜タンパク質；
ｃ．表面受容体結合タンパク質；
ｄ．ウイルス透過タンパク質またはエンベロープタンパク質、および
ｅ．ナノ粒子結合タンパク質または内包化タンパク質
をいずれも含まない、請求項１、３～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質が、細胞質タンパク質または核タンパク質である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質が、シグナルペプチドを含まない、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質が、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記目的の非溶解性治療用タンパク質が、ゲノム編集タンパク質を含む、請求項１、３～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ゲノム編集タンパク質が、前記標的細胞の核内の遺伝子を改変する、請求項２～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記ゲノム編集タンパク質が、メガヌクレアーゼである、請求項２～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質が、少なくとも５０ｋＤａの分子量を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ゲノム編集タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である、請求項２～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記目的の非溶解性治療用タンパク質が、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアント、および治療用ポリペプチドを含むキメラタンパク質であるか、または前記ゲノム編集タンパク質が、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアント、および前記ゲノム編集タンパク質を含むキメラタンパク質である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントが、シグナルペプチドを含み、任意により、前記シグナルペプチドが、Ｎ末端シグナルペプチドである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質が、ペプチド結合によって前記治療用ポリペプチドまたはゲノム編集タンパク質に直接結合されるか、またはタンパク質リンカーによって間接的に結合される、請求項２０または２２に記載の方法。

【請求項24】

前記リンカーが、切断可能リンカーであり、任意により前記リンカーが、分泌性顆粒内または酸性ｐＨで切断される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記治療用ポリペプチドまたはゲノム編集タンパク質が、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記溶解性顆粒分泌タンパク質が、少なくとも１つの不活性化突然変異を含む溶解タンパク質であり、前記不活性化突然変異が、前記溶解タンパク質の溶解機能を阻害する、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質が、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、グランザイムＭ、グラニュライシン、セルグリシン、およびパーフォリンからなる群から選択される、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質が、グランザイムＢである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記移入が、エキソソームによって媒介されない、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

細胞質へ送達することが、エンドソームに進入することを含まない、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記白血球を提供することと、前記白血球を活性化することと、前記活性化後に前記白血球において前記目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質を発現させて、前記改変白血球を産生することと、をさらに含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記発現が、前記接触前の５日以内に行われる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記標的細胞が、前記目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質による治療を必要とする対象に存在し、前記方法が、前記改変白血球を含む医薬組成物を投与することを含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記対象が、遺伝子療法を必要としており、前記改変白血球が、ゲノム編集タンパク質を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記改変白血球が、前記対象に対して自己由来または同種異系である、請求項３３または３４に記載の方法。

【請求項36】

前記対象から白血球を抽出することと、前記白血球を活性化することと、前記活性化後に前記白血球において前記目的の非細胞傷害性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質を発現させて、前記改変白血球を産生することと、前記改変白血球を前記対象に戻すことと、を含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記発現することが、前記戻す前の５日以内に行われる、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記治療が、前記標的細胞を死滅させることを含まない、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記対象が、がんに罹患していない、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質、またはその機能的断片もしくはバリアント、および目的のタンパク質を含む、非溶解性キメラポリペプチド。

【請求項41】

前記目的のタンパク質が、細胞表面受容体に結合しない、請求項４０に記載のキメラポリペプチド。

【請求項42】

前記リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質が、ペプチド結合によって前記目的のタンパク質に直接結合されるか、またはタンパク質リンカーによって間接的に結合される、請求項４０または４１に記載のキメラポリペプチド。

【請求項43】

前記リンカーが、切断可能リンカーであり、任意により前記切断可能リンカーが、分泌性顆粒内または酸性ｐＨで切断される、請求項４２に記載のキメラポリペプチド。

【請求項44】

前記目的のタンパク質が、少なくとも１つのＮＬＳを含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項45】

前記リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質が、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、グランザイムＭ、およびパーフォリンからなる群から選択される、請求項４０～４４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項46】

前記リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質が、グランザイムＢである、請求項４５に記載のキメラポリペプチド。

【請求項47】

前記目的のタンパク質が、ゲノム編集タンパク質である、請求項４０～４６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項48】

前記ゲノム編集タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である、請求項４７に記載のキメラポリペプチド。

【請求項49】

前記ゲノム編集タンパク質が、メガヌクレアーゼである、請求項４７に記載のキメラポリペプチド。

【請求項50】

前記目的のタンパク質が、少なくとも５０ｋＤａの分子量を含む、請求項４０～４９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項51】

請求項４０～５０のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項52】

前記ポリヌクレオチドが、リンパ球または骨髄細胞中で前記キメラポリペプチドを発現することができる発現ベクターである、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項53】

以下の少なくとも１つを含む、非改変白血球と比較して低下した細胞傷害性を有する改変白血球：
ａ．請求項４０～５０のいずれか一項に記載の非細胞傷害性キメラポリペプチド；
ｂ．請求項５１または５２に記載のポリヌクレオチド；および
ｃ．目的の非細胞傷害性治療用タンパク質を含む分泌性顆粒。

【請求項54】

前記白血球が、標的細胞と免疫シナプスを形成することができる、請求項５３に記載の改変白血球。

【請求項55】

前記白血球が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および骨髄細胞から選択される、請求項５３または５４に記載の改変白血球。

【請求項56】

前記改変白血球が、前記改変白血球の細胞膜内にまたは前記改変白血球の細胞膜に結合された前記非細胞傷害性治療用タンパク質を含まない、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の改変白血球。

【請求項57】

前記改変白血球が改変非細胞傷害性白血球であるか、または前記改変白血球が少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質の突然変異を含み、前記突然変異が、前記内因性細胞傷害性タンパク質の前記細胞傷害性を低下させる、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の改変白血球。

【請求項58】

前記改変細胞が、ノックアウトもしくはノックダウン、または少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質を含み、任意により前記内因性細胞傷害性タンパク質が、グランザイムＢである、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の改変白血球。

【請求項59】

請求項５３～５８のいずれか一項に記載の改変白血球を含む治療用組成物。

【請求項60】

対象へ投与するために製剤化され、薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくはアジュバント、またはその両方を含む、請求項５９に記載の治療用組成物。

【請求項61】

ａ．請求項４０～５０のいずれか一項に記載の非細胞傷害性キメラポリペプチド；
ｂ．請求項５１または５２に記載のポリヌクレオチド；
ｃ．請求項５３～５８のいずれか一項に記載の改変白血球；および
ｄ．請求項５９または６０に記載の治療用組成物
のうちの少なくとも１つを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照
本出願は、２０２０年１月２日に出願された米国仮特許出願第６２／９５６，３４２号の優先権の利益を主張し、その内容はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、細胞ベースの送達系の分野にある。

【背景技術】

【0003】

治療剤を標的細胞の細胞質に、または核にも導入できる生物学的送達系が緊急に必要とされている。治療剤を標的細胞の細胞表面に運ぶことができる送達系は存在するが、標的が、細胞表面受容体である場合、または治療剤が細胞透過性部分を含む場合にのみ有効である。このように、他の点では創薬可能な多くの細胞質標的は、それらに到達できる送達系がないため、現在治療に適していない。

【0004】

近年、ゲノム編集技術が開発され、高い効率、特異性、および汎用性が示されている。それにもかかわらず、細胞に治療を効果的に送達する上記の能力が制限され、これらの新しい技術にも等しく適用される。

【0005】

遺伝子療法技術の効果的な適用を妨げる障害としては、免疫原性、標的臓器、組織または細胞に対して特異性を必要とすること、ならびに適切な組成、パッケージング、機能特性、および送達ビヒクルの安定性が欠如していることが挙げられる。現在の遺伝子療法および全身遺伝子療法のための遺伝子編集送達系は、ウイルス性または非ウイルス性にかかわらず、全身投与後に急速に循環から除去される。さらに、ウイルス系の免疫原性は、急性炎症応答を誘発する可能性があり、これにより、最善でも、その後の投与効果が制限され、最悪の場合、患者に危険を及ぼし得る。したがって、依然として効率的かつ正確な遺伝子編集送達系が必要とされている。

【0006】

白血球、特にリンパ球は、広く研究され、細胞傷害性治療剤として利用されている。これらの細胞は、何億年にもわたる進化によって完成され、身体内のあらゆる細胞を監視し、標的にし、必要に応じて死滅させる可能性がある。リンパ球誘発性死滅は、非常に効率的で特異性の高いプロセスであり、最小限の副次的損傷が生じ、隣接するバイスタンダー細胞を損傷しないようにする。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞などのリンパ球のいくつかの系統は、標的細胞に直接付着し、それらの溶解性顆粒の内容物をそれらの細胞に分泌し、その後死滅させることができる。

【0007】

このプロセスには、２つの重要なタンパク質が関与している。パーフォリンは標的細胞膜上に集合して孔を形成し、そこから溶解タンパク質であるグランザイムが標的細胞に進入し、アポトーシスカスケードを開始する。グランザイムの送達は、がん細胞を死滅させる方法として想定されてきたが、送達／非細胞傷害性の選択肢として使用されたことはない。国際特許出願ＷＯ２０１５／１５７８６４、ならびに記事Ｄａｌｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」Ｏｂｅｒｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３「ＥＧＦＲ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」、およびＺｈｏａ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ＨＥＲ２－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」では、すべて、細胞傷害性細胞および細胞傷害性グランザイム融合タンパク質を利用して、標的細胞の免疫細胞の死滅を強化している。これらのすべての場合において、目標は、標的細胞の死であり、すべての場合において、細胞の自然な細胞傷害性が強化される。治療剤、特に遺伝子療法を送達するためにリンパ球の自然な溶解経路を乗っ取るタンパク質移入の非細胞傷害性方法は、治療送達の問題に対する強力な解決策をもたらすであろう。この細胞死滅経路を送達経路に変換することにより、これまで想定されていなかった新規解決策をもたらす。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、外因性非溶解性治療用タンパク質性剤を含む改変細胞を提供する。リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質、またはその機能的断片、および目的のタンパク質を含む非溶解性キメラポリペプチドも提供される。改変細胞を含む治療用組成物、キメラポリペプチドをコードする核酸分子、および使用方法も提供される。

【0009】

第１の態様によれば、改変リンパ球または骨髄細胞が提供され、このリンパ球または骨髄細胞は、外因性の非細胞傷害性治療用タンパク質性剤を含む。

【0010】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球または骨髄細胞は、リンパ球または骨髄細胞の細胞膜内に非細胞傷害性治療用タンパク質性剤を含まない。

【0011】

いくつかの実施形態によれば、剤は、以下のいずれでもない治療部分を含む：
ａ．自然に分泌されるタンパク質、
ｂ．改変細胞の膜で発現する膜タンパク質、
ｃ．表面受容体結合剤、
ｄ．ウイルス透過タンパク質またはエンベロープタンパク質、および
ｅ．ナノ粒子結合剤または内包化剤。

【0012】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択されるか、または骨髄細胞は、マクロファージである。

【0013】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球は、非細胞傷害性リンパ球である。

【0014】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球または骨髄細胞は、細胞株の細胞または初代細胞である。

【0015】

いくつかの実施形態によれば、治療用タンパク質性剤は、リンパ球の分泌性顆粒中にある。

【0016】

いくつかの実施形態によれば、治療部分は、細胞質タンパク質または核タンパク質である。

【0017】

いくつかの実施形態によれば、治療用タンパク質性剤は、シグナルペプチドを含まない。

【0018】

いくつかの実施形態によれば、治療用タンパク質性剤は、ＲＮＡ－タンパク質複合体である。

【0019】

いくつかの実施形態によれば、治療用タンパク質性剤は、少なくとも５０ｋＤａの分子量を含む。

【0020】

いくつかの実施形態によれば、治療用タンパク質性剤は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその機能的断片もしくはそのバリアントを含むキメラタンパク質と、治療用ポリペプチドとを含む。

【0021】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、ペプチド結合によって治療用ポリペプチドに直接結合されるか、またはタンパク質リンカーによって間接的に結合される。

【0022】

いくつかの実施形態によれば、リンカーは、切断可能リンカーである。

【0023】

いくつかの実施形態によれば、切断可能リンカーは、酸性ｐＨで切断される。

【0024】

いくつかの実施形態によれば、治療用ポリペプチドは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。

【0025】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、グランザイムＭ、グラニュライシン、セルグリシン、およびパーフォリンからなる群から選択される。

【0026】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＢである。

【0027】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、非細胞傷害性であるかまたは不活化されている。

【0028】

いくつかの実施形態によれば、治療用タンパク質性剤は、ゲノム編集剤である。

【0029】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）を含む。

【0030】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集剤は、メガヌクレアーゼを含む。

【0031】

別の態様によれば、本発明の改変リンパ球を含む治療用組成物が提供される。

【0032】

いくつかの実施形態によれば、本発明の治療用組成物は、対象への投与のために製剤化され、薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくはアジュバント、またはその両方を含む。

【0033】

別の態様によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその機能的断片および目的のタンパク質を含む非細胞傷害性キメラポリペプチドが提供される。

【0034】

いくつかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、標的細胞中の細胞表面受容体に結合しない。

【0035】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、ペプチド結合によって目的のタンパク質に直接結合されるか、またはタンパク質リンカーによって間接的に結合される。

【0036】

いくつかの実施形態によれば、リンカーは、切断可能リンカーであり、任意により、切断可能リンカーは、分泌性顆粒内で切断される。

【0037】

いくつかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、少なくとも１つのＮＬＳを含む。

【0038】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、グランザイムＭ、グラニュライシン、セルグリシン、およびパーフォリンからなる群から選択される。

【0039】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＢである。

【0040】

いくつかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、ゲノム編集剤である。

【0041】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。

【0042】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集剤は、メガヌクレアーゼである。

【0043】

別の態様によれば、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。

【0044】

いくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、リンパ球または骨髄細胞中でキメラポリペプチドを発現することができる発現ベクターである。

【0045】

別の態様によれば、非溶解性治療用タンパク質性剤を標的細胞に送達する方法が提供され、この方法は、標的細胞を、
ａ．本発明の改変リンパ球または骨髄細胞；
ｂ．本発明の治療用組成物；
ｃ．本発明のキメラポリペプチドを発現する改変リンパ球または骨髄細胞；
ｄ．本発明のポリヌクレオチドを発現する改変リンパ球または骨髄細胞；
のうちのいずれかと接触させること、
それにより、非細胞傷害性治療用タンパク質性剤を標的細胞に送達すること、を含む。

【0046】

いくつかの実施形態によれば、標的細胞は、非細胞傷害性治療用タンパク質性剤による治療を必要とする対象にある。

【0047】

いくつかの実施形態によれば、改変リンパ球または骨髄細胞は、対象に対して自己由来または同種異系である。

【0048】

いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、対象からリンパ球または骨髄細胞を抽出することと、リンパ球または骨髄細胞において非細胞傷害性治療用タンパク質性剤を発現させて、改変リンパ球または骨髄細胞を産生することと、改変リンパ球または骨髄細胞を対象に戻すことと、を含む。

【0049】

別の態様により、それを必要とする対象の治療に使用するための、本発明の改変リンパ球または骨髄細胞、または本発明の医薬組成物が提供される。

【0050】

別の態様によれば、目的の非溶解性治療用タンパク質を標的細胞に送達する方法が提供され、この方法は、標的細胞を改変白血球と接触させることであって、改変白血球が、非改変白血球と比較して減少した細胞傷害性を含み、かつ、目的の非溶解性治療用タンパク質を含む、接触させることと、それによって目的の非溶解性治療用タンパク質を標的細胞に送達することと、を含む。

【0051】

別の態様によれば、ゲノム編集タンパク質を標的細胞に送達する方法が提供され、この方法は、標的細胞を改変白血球と接触させることを含み、改変白血球は、ゲノム編集タンパク質を含み、それによって目的の非溶解性治療用タンパク質を標的細胞に送達する。

【0052】

いくつかの実施形態によれば、目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質は、標的細胞の細胞質または核に送達される。

【0053】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、標的細胞と免疫シナプスを形成することができる。

【0054】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、分泌リソソーム内に目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質を含む。

【0055】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、改変細胞の細胞膜内にまたは細胞膜に結合された、目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質を含まない。

【0056】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、改変Ｔ細胞、改変ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および改変骨髄細胞から選択される。

【0057】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、改変非細胞傷害性白血球であるか、または改変白血球は、さらに改変されて、細胞傷害性を低下させる。

【0058】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、ノックアウトもしくはノックダウン、または少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質を含み、任意により、内因性細胞傷害性タンパク質は、グランザイムＢである。

【0059】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質中に突然変異を含み、この突然変異が、内因性細胞傷害性タンパク質の細胞傷害性を低下させる。

【0060】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質のアンチセンス媒介性の低下を含み、このアンチセンス媒介性が、内因性細胞傷害性タンパク質の細胞傷害性を低下させる。

【0061】

いくつかの実施形態によれば、目的の非溶解性治療用タンパク質は、以下のいずれも含まない：
ａ．自然に分泌されるタンパク質；
ｂ．改変白血球の膜中に発現する膜タンパク質；
ｃ．表面受容体結合タンパク質；
ｄ．ウイルス透過タンパク質またはエンベロープタンパク質、および
ｅ．ナノ粒子結合タンパク質または内包化タンパク質。

【0062】

いくつかの実施形態によれば、目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質は、細胞質タンパク質または核タンパク質である。

【0063】

いくつかの実施形態によれば、目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質は、シグナルペプチドを含まない。

【0064】

いくつかの実施形態によれば、目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

【0065】

いくつかの実施形態によれば、目的の非溶解性治療用タンパク質は、ゲノム編集タンパク質を含む。

【0066】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集タンパク質は、標的細胞の核内の遺伝子を改変する。

【0067】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集タンパク質は、メガヌクレアーゼである。

【0068】

いくつかの実施形態によれば、目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質は、少なくとも５０ｋＤａの分子量を含む。

【0069】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。

【0070】

いくつかの実施形態によれば、目的の非溶解性治療用タンパク質は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアント、および治療用ポリペプチドを含むキメラタンパク質であるか、またはゲノム編集タンパク質は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアント、およびゲノム編集タンパク質を含むキメラタンパク質である。

【0071】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントは、シグナルペプチドを含み、任意により、シグナルペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドである。

【0072】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、ペプチド結合によって治療用ポリペプチドまたはゲノム編集タンパク質に直接結合されるか、またはタンパク質リンカーによって間接的に結合される。

【0073】

いくつかの実施形態によれば、リンカーは、切断可能リンカーであり、任意により、リンカーは、分泌性顆粒内または酸性ｐＨで切断される。

【0074】

いくつかの実施形態によれば、治療用ポリペプチドまたはゲノム編集タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。

【0075】

いくつかの実施形態によれば、溶解性顆粒分泌タンパク質は、少なくとも１つの不活性化突然変異を含む溶解タンパク質であり、不活性化突然変異は、溶解タンパク質の溶解機能を阻害する。

【0076】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、グランザイムＭ、グラニュライシン、セルグリシン、およびパーフォリンからなる群から選択される。

【0077】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＢである。

【0078】

いくつかの実施形態によれば、移入は、エキソソームによって媒介されない。

【0079】

いくつかの実施形態によれば、細胞質への送達は、エンドソームに進入することを含まない。

【0080】

いくつかの実施形態によれば、この方法は、白血球を提供することと、白血球を活性化することと、活性化後に白血球において目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質を発現させて、改変白血球を産生することと、をさらに含む。

【0081】

いくつかの実施形態によれば、発現は、接触の５日前までに行われる。

【0082】

いくつかの実施形態によれば、標的細胞は、目的の非溶解性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質による治療を必要とする対象にあり、この方法は、改変白血球を含む医薬組成物を投与することを含む。

【0083】

いくつかの実施形態によれば、対象は、遺伝子療法を必要としており、改変白血球は、ゲノム編集タンパク質を含む。

【0084】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、対象にとって自己由来または同種異系である。

【0085】

いくつかの実施形態によれば、この方法は、対象から白血球を抽出することと、白血球を活性化することと、活性化後に目的の非細胞傷害性治療用タンパク質またはゲノム編集タンパク質を白血球中に発現させて、改変白血球を産生することと、改変白血球を対象に戻すことと、を含む。

【0086】

いくつかの実施形態によれば、発現は、戻す５日前までに行われる。

【0087】

いくつかの実施形態によれば、治療は、標的細胞を死滅させることを含まない。

【0088】

いくつかの実施形態によれば、対象は、がんに罹患していない。

【0089】

別の態様によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアント、および目的のタンパク質を含む、非溶解性キメラポリペプチドが提供される。

【0090】

いくつかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、細胞表面受容体に結合しない。

【0091】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、ペプチド結合によって目的のタンパク質に直接結合されるか、またはタンパク質リンカーによって間接的に結合される。

【0092】

いくつかの実施形態によれば、リンカーは、切断可能リンカーであり、任意により、切断可能リンカーは、分泌性顆粒内または酸性ｐＨで切断される。

【0093】

いくつかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、少なくとも１つのＮＬＳを含む。

【0094】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、グランザイムＭ、およびパーフォリンからなる群から選択される。

【0095】

いくつかの実施形態によれば、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＢである。

【0096】

いくつかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、ゲノム編集タンパク質である。

【0097】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。

【0098】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム編集タンパク質は、メガヌクレアーゼである。

【0099】

いくつかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、少なくとも５０ｋＤａの分子量を含む。

【0100】

別の態様によれば、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。

【0101】

いくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、リンパ球または骨髄細胞中でキメラポリペプチドを発現することができる発現ベクターである。

【0102】

別の態様によれば、以下の少なくとも１つを含む、非改変白血球と比較して低下した細胞傷害性を有する改変白血球が提供される：
ａ．本発明の非細胞傷害性キメラポリペプチド；
ｂ．本発明のポリヌクレオチド；および
ｃ．目的の非細胞傷害性治療用タンパク質を含む分泌性顆粒。

【0103】

いくつかの実施形態によれば、白血球は、標的細胞と免疫シナプスを形成することができる。

【0104】

いくつかの実施形態によれば、白血球は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および骨髄細胞から選択される。

【0105】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、改変白血球の細胞膜内にまたは細胞膜に結合された、目的の非細胞傷害性治療用タンパク質を含まない。

【0106】

いくつかの実施形態によれば、改変白血球は、改変非細胞傷害性白血球であるか、または改変白血球は、少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質の突然変異を含み、この突然変異により、内因性細胞傷害性タンパク質の細胞傷害性が低下する。

【0107】

いくつかの実施形態によれば、改変細胞は、ノックアウトもしくはノックダウン、または少なくとも１つの内因性細胞傷害性タンパク質を含み、任意により、内因性細胞傷害性タンパク質は、グランザイムＢである。

【0108】

別の態様によれば、本発明の改変白血球を含む治療用組成物が提供される。

【0109】

いくつかの実施形態によれば、組成物は、対象への投与のために製剤化され、薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくはアジュバント、またはその両方を含む。

【0110】

別の態様によれば、以下の少なくとも１つを含むキットが提供される：
ａ．本発明の非細胞傷害性キメラポリペプチド；
ｂ．本発明のポリヌクレオチド；
ｃ．本発明の改変白血球；および
ｄ．本発明の治療用組成物。

【0111】

本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになるであろうため、これらは、例示としてのみ与えられていることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0112】

【図1】本発明の融合タンパク質発現プラスミドの模式図を示す図である。

【図2A-2E】Ｋ５６２標的細胞へのグランザイム－Ｃｈｅｒｒｙタンパク質の移入を示す図である。（図２Ａ）総生存イベントのＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングを使用した、エフェクターＴ細胞からの標的Ｋ５６２細胞のサイズ分離のドットプロットを示す図である。（図２Ｂ）グランザイム－Ｃｈｅｒｒｙ形質導入Ｔ細胞との共培養後のＧＦＰ陽性標的Ｋ５６２細胞のゲーティングのヒストグラムを示す図である。（図２Ｃ）モックエレクトロポレーションＴ細胞（灰色で塗りつぶされたヒストグラム）またはグランザイム－Ｃｈｅｒｒｙをコードする図１に記載されているプラスミド１＿３（黒枠のヒストグラム）のコード領域のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物をエレクトロポレートされたＴ細胞のいずれかと共培養した後の、ＧＦＰ陽性標的Ｋ５６２細胞（２Ｂに示すＧＦＰ＋ゲート）におけるＣｈｅｒｒｙ蛍光のヒストグラムを示す図である。（図２Ｄ）モックエレクトロポレーションＹＴＳ（灰色で塗りつぶされたヒストグラム）またはグランザイム－Ｃｈｅｒｒｙをコードする図１に示すプラスミド１＿３（黒枠のヒストグラム）のコード領域のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物をエレクトロポレートされたＹＴＳ細胞のいずれかと共培養した後の、ＧＦＰ陽性標的Ｋ５６２細胞におけるＣｈｅｒｒｙ蛍光のヒストグラムを示す図である。（図２Ｅ）Ｃｈｅｒｒｙ発現ＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳ細胞（陰性対照として使用）と共培養後のＴａｇ－ｉｔ標識Ｋ５６２細胞におけるＣｈｅｒｒｙ蛍光のヒストグラムを示す図である。

【図3A-3D】機能性を有するグランザイムノックアウト細胞を示す図である。（図３Ａ）親（灰色）およびＧＺＭＢ－ＫＯ（黒線）ＹＴＳ細胞におけるＧＺＭＢ発現のヒストグラムを示す図である。（図３Ｂ）内因性ＧＺＭＢ発現ＹＴＳ細胞と共培養されたＫ５６２細胞（薄灰色）およびＹＴＳ ＧＺＭＢ－ＫＯ細胞と共培養されたＫ５６２細胞（濃灰色）の前方散乱によって測定されたサイズのヒストグラムを示す図である。（図３Ｃ）以下と共培養したＫ５６２細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現のヒストグラム；（左のヒストグラム）モックエレクトロポレートした内因性ＧＺＭＢ発現ＹＴＳ細胞（濃淡）、ＧＺＭＢ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙプラスミドをエレクトロポレートしたＹＴＳ細胞（灰色線）、（右のヒストグラム）モックエレクトロポレートしたＹＴＳ ＧＺＭＢ－ＫＯ細胞（濃淡）またはＧＺＭＢ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙプラスミドをエレクトロポレートしたＹＴＳ細胞（黒線）。（図３Ｄ）Ｋ５６２細胞のみ、または親ＹＴＳ細胞またはＧＺＭＢ ＫＯ ＹＴＳとの共培養後の生／死染色のヒストグラム表示を示す図である。

【図4A-4D】（図４Ａ）ｐＭＡＸ＿ｈＧＺＭＢ＿ＨＡ－Ｃａｓ９＿Ｐ２Ａ＿ｃｒｍＣｈｅｒｒｙプラスミドをエレクトロポレートした初代Ｔ細胞の代表的な顕微鏡写真を示す図である。明視野（ＢＦ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｃａｓ－９、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）、およびすべてのチャネルをマージしたものが示されている。（図４Ｂ）Ｔａｇ－ｉｔ標識標的Ｋ５６２細胞および非標識Ｔａｇ－ｉｔ陰性エフェクターＹＴＳ細胞を定義するために使用されるゲートのヒストグラムを示す図である。（図４Ｃ）ｈＧＺＭＢ＿Ｃａｓ９のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物を過剰発現するＹＴＳ細胞（第１レーン）およびＧＺＭＢ－ＣＡＳ９発現ＹＴＳ細胞と共培養したＫ５６２標的細胞（第２レーン）におけるＣａｓ９のウエスタンブロット検出の写真を示す図である。ＹＴＳ細胞およびＫ５６２細胞は、図４Ｂに示されるゲートを使用してＴａｇ－ｉｔ発現によって選別した。灰色の矢印は、Ｋ５６２細胞中のＣａｓ９バンドを示す。ラダーは、サイズ比較用に提供されており、ＹＴＳ細胞で観察された２つのバンドのうち低い方のバンドが、Ｃａｓ９の分子量に対応することを示している。（図４Ｄ）ＧＺＭＢ－ＣＡＳ９を発現するＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳ細胞またはモック処理されたＧＺＭＢ ＫＯ ＹＴＳ細胞との共培養後のＫ５６２標的細胞中でのグランザイムＢの細胞内染色によって検出されたＧＺＭＢ－Ｃａｓ９のヒストグラムを示す図である。

【図5A-5D】グランザイムを介したＣＡＳ９およびメガヌクレアーゼ移入後の標的細胞での編集を示す図である。（図５Ａ～図５Ｂ）（５Ａ）ＹＴＳ細胞および（５Ｂ）ＧＺＭＢ＿Ｃａｓ９ｍＲＮＡをエレクトロポレートしたＴ細胞との共培養後の黒色腫細胞の顕微鏡写真を示す図である。ＲＦＰ細胞が示され（黒い矢印）、ＧＦＰ陽性細胞はゲノム編集の成功を示している（白い矢印）。（図５Ｃ）ＧＺＭＢ－ＣＡＳ９ ｍＲＮＡをエレクトロポレートしたＹＴＳ細胞からのＧＺＭＢ－ＣＡＳ９の移入後のＫ５６２標的細胞のＲＦＰ陽性集団におけるＧＦＰ発現細胞のヒストグラムを示す図である。（図５Ｄ）ＧＺＭＢ－メガヌクレアーゼ ｍＲＮＡをエレクトロポレートしたＹＴＳ細胞からのＧＺＭＢ－メガヌクレアーゼの移入後のＫ５６２標的細胞のＲＦＰ陽性集団におけるＧＦＰ発現細胞のヒストグラムを示す図である。

【図6A-6C】Ｋ５６２骨髄細胞株は、カーゴの送達が可能なエフェクター細胞として機能することを示す図である。（図６Ａ）図１に示すプラスミド１＿３のコード領域のＧＺＭＢ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ ＩＶＴ産物をエレクトロポレートしたＫ５６２細胞との共培養後のＴａｇ－ｉｔ陽性黒色腫標的細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙシグナルのヒストグラムを示す図である。（図６Ｂ）図１に示すプラスミド２＿６のコード領域のＧＺＭＢ－メガヌクレアーゼ－ＧＦＰｍＲＮＡ ＩＶＴ産物をエレクトロポレートしたＫ５６２細胞との共培養後のＴａｇ－ｉｔ陽性黒色腫標的細胞におけるＧＦＰシグナルのヒストグラム表示を示す図である。（図６Ｃ）ＧＺＭＢ－ＣＡＳ９ ｍＲＮＡをエレクトロポレートしたＫ５６２細胞からのＧＺＭＢ－ＣＡＳ９の移入後の黒色腫標的細胞のＲＦＰ陽性集団におけるＧＦＰ発現細胞のヒストグラムを示す図である。

【図7A-7D】Ｔ細胞からＰ８１５標的細胞へのＣａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰの移入を示す図である。図７Ａ～図７Ｃには、以下のヒストグラムを示す。（図７Ａ）モックおよびＣａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ－タンパク質複合体をエレクトロポレートしたＴ細胞におけるＧＦＰ発現のヒストグラム。（図７Ｂ）モックまたはＣａｓ９－ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞との共培養実験における、標的Ｐ８１５細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞との間のＣＤ８陽性および陰性分化に使用されるゲート。および（図７Ｃ）モックエレクトロポレートＴ細胞またはＣａｓ９－ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞のいずれかと共培養したＣＤ８陰性標的Ｐ８１５細胞（図７Ｂに示すＣＤ８－ゲート）におけるＧＦＰ蛍光。モックは、灰色で塗りつぶされたヒストグラムとして示され、Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ－タンパク質複合体形質導入Ｔ細胞は、黒枠のヒストグラムとして示す。図７Ｄは、共培養されたＣａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ－タンパク質複合体で形質導入されたＴ細胞およびＰ８１５細胞の代表的な顕微鏡写真である。Ｃａｓ９－ＧＦＰは、緑色に見えることができる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、水色で表示される。緑のみで青ではない細胞は、ＲＮＡ－タンパク質複合体を受け入れた標的細胞であり、一部を矢印でマークしている。

【図8A-8I】ＹＴＳ細胞からＫ５６２およびＭＣＦ７標的細胞へのＣａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＰの移入を示す図である。（図８Ａ）モックエレクトロポレートしたＹＴＳ細胞およびＣａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ－タンパク質複合体を形質導入したＹＴＳ細胞におけるＣａｓ９－ＧＦＰ蛍光のヒストグラム、（図８Ｂ）Ｔａｇ－ｉｔ標識標的Ｋ５６２細胞および非標識Ｔａｇ－ｉｔ陰性エフェクターＹＴＳ細胞を定義するために使用されるゲートのヒストグラム、（図８Ｃ）モックエレクトロポレートされたＹＴＳ細胞またはＣａｓ９－ＧＦＰ形質導入ＹＴＳ細胞のいずれかと共培養させたＴａｇ－ｉｔ陽性標的Ｋ５６２細胞（図８Ｂに示すようにＴａｇｉｔ＋ゲート）におけるＣａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ－タンパク質複合体由来蛍光のヒストグラム、（図８Ｄ）Ｔａｇ－ｉｔ標識標的ＭＣＦ７細胞および非標識Ｔａｇ－ｉｔ陰性エフェクターＹＴＳ細胞を定義するために使用されるゲートのヒストグラム、および（図８Ｅ）モックエレクトロポレートＹＴＳ細胞またはＣａｓ９－ＧＦＰ形質導入ＹＴＳ 細胞のいずれかとの共培養させたＴａｇ－ｉｔ陽性標的ＭＣＦ７細胞（図８Ｄに示すようにＴａｇｉｔ＋ゲート）におけるＣａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ－タンパク質複合体由来の蛍光のヒストグラムである。モックエレクトロポレーション実験は、灰色で塗りつぶされたのヒストグラムとして表示され、Ｃａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ－タンパク質複合体エレクトロポレーション実験は、黒枠のヒストグラムとして示す。（図８Ｆ）Ｃａｓ９－ＧＦＰ形質導入ＹＴＳ細胞とＫ５６２細胞との共培養の上清と共にインキュベートしたＫ５６２細胞におけるＧＦＰシグナルのヒストグラム。（図８Ｇ）Ｃａｓ９－ＧＦＰ形質導入ＹＴＳ細胞と黒色腫細胞との共培養の上清とインキュベートした黒色腫細胞のＧＦＰシグナル。（図８Ｈ）モックエレクトロポレートＹＴＳ細胞またはＣａｓ９－ＧＦＰ形質導入ＹＴＳ細胞のいずれかと共培養した（この共培養の上清は、図８Ｆで使用した）Ｔａｇ－ｉｔ陽性標的Ｋ５６２細胞中のＣａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ－タンパク質複合体由来の蛍光。（図８Ｉ）モックエレクトロポレートＹＴＳ細胞またはＣａｓ９－ＧＦＰ形質導入ＹＴＳ細胞のいずれかと共培養した（この共培養の上清は、図８Ｇで使用した）Ｔａｇ－ｉｔ陽性標的黒色腫細胞細胞中のＣａｓ９－ＧＦＰ ＲＮＡ－タンパク質複合体由来の蛍光。

【図9A-9C】ＣＡＳ９ ＲＮＰ移入後の標的細胞の編集を示す図である。（図９Ａ～図９Ｃ）以下との共培養後の黒色腫細胞細胞の顕微鏡写真である。（９Ａ）ＣＡＳ９ ＲＮＰ形質導入ＹＴＳ細胞、（９Ｂ）ＣＡＳ９ ＲＮＰ形質導入ＹＴＳグランザイムＢノックアウト細胞、および（９Ｃ）ＣＡＳ９ ＲＮＰ形質導入Ｋ５６２骨髄細胞。ＲＦＰ細胞が示され（黒い矢印）、ＧＦＰ陽性細胞はゲノム編集の成功を示している（白い矢印）。

【発明の詳細な説明】

【0113】

本発明は、いくつかの実施形態において、外因性治療剤を含む改変細胞を提供する。目的のタンパク質およびリンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質、そのバリアントまたはその断片を含む、キメラポリペプチドも提供される。改変細胞を含む治療用組成物、キメラポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに本発明の改変細胞、医薬組成物およびキメラポリペプチドの使用方法も提供される。

【0114】

本発明は、白血球、特にＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球が、治療剤の送達系として使用できるという驚くべき発見に基づく。特に、これらの細胞は、本来細胞傷害性であるが、それらの細胞傷害機能は、それらの送達能力に必要とされず、実際に、非細胞傷害性送達は、所望の結果が標的細胞の死ではない場合、細胞傷害性送達よりも優れていることが見出された。グランザイムなどの溶解性顆粒分泌タンパク質を目的のタンパク質に融合させることにより、そのタンパク質が、溶解性顆粒を標的とし、それが分泌され、さらには標的細胞によって取り込まれ、細胞の細胞質に到達することが最初に見出された。この移入は、サイズが１００ｋＤａをはるかに超えるＣａｓ－９などの非常に大きいタンパク質でも実証された。この移入には、グランザイムの細胞傷害特性を必要としない。これは、変異型グランザイムおよび阻害ジペプチドを含むプログランザイムの両方が同等にタンパク質移入を促進できるためである。さらに驚くべきことに、同様に非常に大きいサイズのＲＮＡ－タンパク質複合体は、リンパ球または骨髄細胞にエレクトロポレートされたときに、溶解性顆粒分泌タンパク質融合への融合がなくても標的細胞に移入されることを発見した。ＲＮＡ－タンパク質複合体は、標的細胞のゲノムを編集することができたので、この複合体は、標的細胞の内部に到達することができ、そこで実際に機能した。これまで知られていなかったこの機序により、リンパ球を幅広い治療送達系として使用することが可能になる。特に、標的細胞におけるゲノム編集のための送達系を提供する。

【0115】

本発明の白血球（リンパ球および骨髄細胞）が、対象におけるその標的に治療剤をもたらすための送達様式であることは、当業者によって理解されるであろう。免疫細胞は、身体内の疾患部位にホーミングすることが当技術分野でよく知られている。そのため、これらは治療剤を疾患部位に運ぶための理想的な送達方法である。現在の治療法が遭遇する主要な障害は、多くの既知の標的が細胞内にあるという事実であるが、細胞内送達の信頼できる方法は、現在存在しない。そのため、ほとんどの治療法は、細胞表面分子を標的とすることに限定されている。これにより、利用可能である創薬可能な標的のプールが大幅に制限される。特に、様々な疾患／状態を治療できる可能性がある遺伝子療法は、遺伝子編集剤を、核内に送達できる場合にのみ実現可能である。さらに、短い循環半減期および体内分布の問題が、多くの有望な治療法を妨げている。本発明の細胞および組成物は、これらすべての問題に対する包括的な解決策を提供する。治療剤は、身体内を移動する間、白血球内で保護されるため、分解および半減期の懸念が制限される。白血球は、その本来のホーミング能力によって、またはその細胞表面の標的化部分により、最初に疾患部位にホーミングすることによって、オフターゲット効果を減少させる。細胞が活性化されるまでリンパ球は溶解小胞を分泌しないため、オフターゲット効果はさらに制限される。このメカニズムは、疾患／標的細胞を直接制御し、標的化することができる。最後に、溶解小胞が標的細胞に取り込まれ、そのカーゴが標的細胞の内部に送達され、これにより、すべての細胞標的へのアクセスが可能になり、ゲノム編集さえも可能になる。本技術のこれらすべての態様の組み合わせにより、本技術は、治療送達系として唯一適したものとなる。

【0116】

キメラ分子
第一の態様によって、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片、および目的の分子を含むキメラ分子が提供される。

【0117】

リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片が、キメラ分子の標的化部分であり、目的のタンパク質がカーゴであることは、当業者には理解されるであろう。標的化部分は、任意の直接的な治療機能を保有することを意図したものではなく、むしろ標的細胞への移入を促進することを意図したものである。移入を促進することには、リンパ球によって分泌され、標的細胞によって取り込まれる溶解性顆粒にカーゴを送達することを含む。目的のタンパク質は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質による送達後に、その標的に作用することができる治療用カーゴである。

【0118】

いくつかの実施形態では、キメラ分子は、キメラポリペプチドである。いくつかの実施形態では、目的の分子は、目的のタンパク質である。本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義的に使用される。別の実施形態では、本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、天然ペプチド、ペプチドミメティック（典型的には、非ペプチド結合または他の合成修飾を含む）、ならびにペプチド類似体ペプトイドおよびセミペプトイド、またはそれらの任意の組み合わせを包含する。別の実施形態では、記載のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、身体内にある間により安定にするか、または細胞への透過をより可能にする改変を有する。一実施形態では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、天然アミノ酸ポリマーに適用される。別の実施形態では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。

【0119】

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、人工ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、天然には見出されないポリペプチドである。本明細書で使用される「キメラポリペプチド」という用語は、同じタンパク質中には自然には見られない、少なくとも２つの異なるタンパク質ドメインまたは領域を含む単一のポリペプチド鎖を指す。融合タンパク質は、１つのペプチドのアミノ末端と別のペプチドのカルボキシル末端との間に形成されるペプチド結合を介して２つ以上のペプチドを連結することによって形成され得る。融合タンパク質は、単一の連続結合体をコードする核酸配列から単一のポリペプチド融合タンパク質として発現され得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、元は別々のタンパク質をコードしていた２つ以上の遺伝子を連結することによって創出される。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療に使用するための組換えＤＮＡ技術によって人工的に創出できる。「キメラの」または「キメラ」は、通常、異なる機能または物理化学的パターンを有するポリペプチドからできているハイブリッドタンパク質を指す。例えば、融合タンパク質は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質である第１の部分、および目的のタンパク質である第２の部分（例えば、第１の部分に遺伝的に融合されたもの）（例えば、異なる酵素活性、すなわち、ＤＮＡヌクレアーゼを有するタンパク質）を含み得る。融合タンパク質生成、組換えタンパク質生成、組換えＤＮＡ生成、およびＤＮＡ融合技術の方法は、当技術分野で周知であり、本発明のキメラ分子を作製するための任意のこのような方法を使用することができる。キメラポリペプチドは、切断時に２つ以上のポリペプチドに分離されるように、切断可能であり得る。非限定的な一例では、切断時に、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質および目的のタンパク質を含む融合ポリペプチドは、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質および目的のタンパク質に分割され、その結果、目的のタンパク質の機能性は、無傷である。

【0120】

本明細書で使用する場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換え核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）によってコードされ、したがって天然には存在しないタンパク質を指す。「組換えＤＮＡまたはＲＮＡ」という用語は、遺伝子組換えの実験的方法によって形成されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。一般に、この組換え分子は、細胞内で組換えタンパク質を発現させるために使用される、ｍＲＮＡ、ベクター、プラスミドまたはウイルスの形態である。

【0121】

いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、目的のタンパク質に直接結合している。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、目的のタンパク質に、リンカーによって連結している。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質と目的のタンパク質との間に介在アミノ酸は存在しない。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質と目的のタンパク質とを分離するアミノ酸リンカーが存在する。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、目的の分子のＮ末端にある。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、目的の分子のＣ末端にある。

【0122】

本明細書で使用される「リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質」および「分泌リソソームタンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用され、分泌リソソームとして知られる溶解性顆粒を介して、リンパ球によって分泌される任意のタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイム／パーフォリン経路に関与するタンパク質であり、標的細胞の抗原依存性リンパ球認識中に、リンパ球の溶解性顆粒から標的細胞に自然に分泌される。いくつかの実施形態では、抗原依存性リンパ球認識は、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって媒介される。いくつかの実施形態では、抗原依存性リンパ球認識は、標的細胞上のＭＨＣ／ペプチド複合体への操作されたＴ細胞受容体ライゲーションによって媒介される。いくつかの実施形態では、抗原依存性リンパ球認識は、標的細胞上の抗原へのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ライゲーションによって媒介される。いくつかの実施形態では、分泌リソソームタンパク質は、溶解性顆粒分泌タンパク質である。いくつかの実施形態では、溶解性顆粒分泌タンパク質は、分泌リソソームタンパク質である。

【0123】

いくつかの実施形態では、溶解性顆粒は、溶解小胞である。いくつかの実施形態では、溶解性顆粒は、分泌リソソームである。溶解性顆粒は、リンパ球中に見られるよく知られた細胞小器官である。これは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの細胞傷害性リンパ球が活性化されると、微小管を介して細胞の先端側に移動する特殊な分泌細胞小器官であり、リンパ球標的細胞シナプスに向かう。この顆粒のタンパク質含有量は、当技術分野において開示されており、当技術分野で知られている方法によってこれらの顆粒を単離することによって調べることができる。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、溶解性顆粒から分泌される任意のタンパク質である。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、溶解性顆粒中の任意のタンパク質である。溶解性顆粒に見られるタンパク質は、当技術分野でよく知られており、例えば、「Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｔｔａｃｋ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｒｅ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｋｉｌｌｉｎｇ ｅｎｔｉｔｉｅｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ」、Ｂａｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０２０ Ｍａｙ２２；３６８（６４９３）：８９７－９０１に見出すことができ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質を表１に提供する。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、表１に提供されるタンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、グランザイムＭ、グラニュライシン、セルグリシン、およびパーフォリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、グランザイムＭ、およびパーフォリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、グランザイムである。いくつかの実施形態では、グランザイムは、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、およびグランザイムＭから選択される。いくつかの実施形態では、グランザイムは、グランザイムＢである。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、パーフォリンである。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、ヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。

【表1】

【0124】

いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢタンパク質は、アクセッション番号ＮＰ＿００４１２２またはＮＰ＿００１３３２９４０で提供されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、グランザイムＢは、ヒトグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）である。いくつかの実施形態では、グランザイムＢは、アミノ酸配列MQPILLLLAFLLLPRADAGEIIGGHEAKPHSRPYMAYLMIWDQKSLKRCGGFLIRDDFVLTAAHCWGSSINVTLGAHNIKEQEPTQQFIPVKRPIPHPAYNPKNFSNDIMLLQLERKAKRTRAVQPLRLPSNKAQVKPGQTCSVAGWGQTAPLGKHSHTLQEVKMTVQEDRKCESDLRHYYDSTIELCVGDPEIKKTSFKGDSGGPLVCNKVAQGIVSYGRNNGMPPRACTKVSSFVHWIKKTMKRY（配列番号８）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢは、配列番号８からなる。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢタンパク質は、アクセッション番号ＮＰ＿０３８５７０で提供されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢは、アミノ酸配列MKILLLLLTLSLASRTKAGEIIGGHEVKPHSRPYMALLSIKDQQPEAICGGFLIREDFVLTAAHCEGSIINVTLGAHNIKEQEKTQQVIPMVKCIPHPDYNPKTFSNDIMLLKLKSKAKRTRAVRPLNLPRRNVNVKPGDVCYVAGWGRMAPMGKYSNTLQEVELTVQKDRECESYFKNRYNKTNQICAGDPKTKRASFRGDSGGPLVCKKVAAGIVSYGYKDGSPPRAFTKVSSFLSWIKKTMKSS（配列番号１６）を含む。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢは、配列番号１６からなる。

【0125】

いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、小胞体シグナル配列（ＥＲＳＳ）である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号８のアミノ酸１～１８である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６のアミノ酸１～１８である。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６のアミノ酸１～１８を含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６のアミノ酸１～１８からなる。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、シグナルペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、グランザイムは、シグナルペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢは、シグナルペプチドを含まず、配列番号８のアミノ酸１９～２４７を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドを含まないタンパク質は、依然としてＮ末端メチオニンを保持している。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢは、シグナルペプチドを含まず、アミノ酸１および１９～２４７を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢは、シグナルペプチドを含まず、配列番号１６のアミノ酸１９～２４７を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢは、シグナルペプチドを含まず、配列番号１６のアミノ酸１および１９～２４７を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態では、グランザイムは、プログランザイムである。いくつかの実施形態では、プログランザイムは、阻害性ジペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ジペプチドは、Ｎ末端ジペプチドである。いくつかの実施形態では、ジペプチドは、ＧＥである。いくつかの実施形態では、ジペプチドは、配列番号８のアミノ酸１９～２０である。いくつかの実施形態では、ジペプチドは、配列番号１６のアミノ酸１９～２０である。いくつかの実施形態では、グランザイムＢは、阻害性ジペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢは、ジペプチドを含まず、配列番号８のアミノ酸２１～２４７を含むか、それらからなる。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢは、ジペプチドを含まず、配列番号１６のアミノ酸２１～２４７を含むか、それらからなる。

【0126】

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質の断片を含む。いくつかの実施形態では、断片は、機能的断片である。いくつかの実施形態では、機能は、ＥＲへの進入である。いくつかの実施形態では、機能は、溶解小胞への進入である。いくつかの実施形態では、機能は、分泌である。いくつかの実施形態では、分泌は、免疫シナプスへの分泌である。いくつかの実施形態では、機能は、溶解性顆粒への進入である。いくつかの実施形態では、機能は、キメラ分子またはその断片を溶解性顆粒に含めることである。いくつかの実施形態では、機能は、目的の分子を溶解性顆粒に含めることである。いくつかの実施形態では、機能は、目的のタンパク質を溶解性顆粒に含めることである。いくつかの実施形態では、機能は、本発明のキメラ分子を溶解性顆粒に導くことである。いくつかの実施形態では、機能は、目的の分子を溶解性顆粒に導くことである。いくつかの実施形態では、機能は、溶解小胞における分泌である。いくつかの実施形態では、機能は、溶解小胞からの分泌である。いくつかの実施形態では、機能は、細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、機能は、標的細胞への送達である。いくつかの実施形態では、断片は、キメラポリペプチドを標的細胞に送達できる断片である。いくつかの実施形態では、断片は、キメラポリペプチドを溶解性顆粒に送達できる断片である。いくつかの実施形態では、断片は、キメラポリペプチドおよび／または目的のタンパク質の溶解性顆粒への包含を促進することができる断片である。いくつかの実施形態では、断片は、キメラポリペプチドをＥＲに送達できる断片である。いくつかの実施形態では、断片は、非細胞傷害性断片である。いくつかの実施形態では、断片は、溶解活性を含まない断片である。いくつかの実施形態では、断片は、酵素ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、酵素活性は、プロテアーゼ活性である。

【0127】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、グランザイムシグナル伝達エレメントによって改変リンパ球の溶解性顆粒に自然に輸送され、標的認識時にグランザイム経路を通じて標的細胞に放出される。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒標的化部分／リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質／断片（例えば、グランザイムＢ）および目的のタンパク質（例えば、ＣＡＳヌクレアーゼ）を含む融合タンパク質は、グランザイムシグナル伝達エレメントによって、改変細胞の溶解性顆粒に自然に輸送され、標的認識時にグランザイム経路を介して標的細胞に放出される。例えば、グランザイムＢおよびＣＡＳヌクレアーゼを含む融合タンパク質の翻訳が開始されると、ＥＲシグナルペプチドは、融合タンパク質をＥＲに向かわせ、そこで同時翻訳的に挿入される。融合タンパク質がＥＲ中で合成されると、Ｎ－グリカンが追加され、翻訳された融合タンパク質をゴルジネットワークに対して標的化させる。ゴルジ体では、Ｎ－グリカンがリン酸化され、融合タンパク質上で結果として生じるリン酸化糖部分が、マンノース－６－リン酸受容体に結合し、それによってタンパク質が溶解性顆粒を標的とし、そこで標的細胞が認識されるまで隔離され、その後、確実に免疫シナプスに放出される。融合タンパク質／ポリペプチドは、溶解性顆粒内で切断されてもよく、したがって、標的細胞認識時に目的の独立タンパク質（ｓｔａｎｄ－ａｌｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）が免疫シナプスに放出されるように、目的のタンパク質を標的化部分から分離する。あるいは、切断は、標的細胞の細胞質または標的細胞の別の分画で起こり得る。ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ）はまた、融合タンパク質または目的のタンパク質（例えば、ＲＮＰ）との複合体としてエフェクター細胞に送達することができるか、または核酸分子は、標的細胞に直接送達することができる。

【0128】

いくつかの実施形態では、断片は、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、小胞体シグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、断片は、Ｎ末端断片である。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、複数のグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、グリコシル化は、Ｎ連結型グリコシル化である。いくつかの実施形態では、グリコシル化は、Ｏ連結型グリコシル化である。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢ中のグリコシル化部位は、配列番号８のアミノ酸７１にある。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢ中のグリコシル化部位は、配列番号１６のアミノ酸７１にある。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢ中のグリコシル化部位は、配列番号８のアミノ酸１０４にある。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢ中のグリコシル化部位は、配列番号１６のアミノ酸１８２にある。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、断片は、複数のグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、断片は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質中のすべてのグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、断片は、ヒトグランザイムＢの少なくともＮ末端の７１アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は、マウスグランザイムＢの少なくともＮ末端の７１アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は、ヒトグランザイムＢの少なくともＮ末端の１０４アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は、マウスグランザイムＢの少なくともＮ末端の１８２アミノ酸を含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、または１５０のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも５０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも１００のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のリンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、断片は、最大で２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５または２５０のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、断片は、最大で２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のリンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

【0130】

いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質のバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、天然タンパク質のバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、グランザイムＢのバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、突然変異体である。いくつかの実施形態では、バリアントは、天然タンパク質の突然変異形態である。いくつかの実施形態では、突然変異体は、少なくとも１つの突然変異体を含む天然タンパク質である。いくつかの実施形態では、バリアントは、切断可能バリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、切断できないバリアントである。いくつかの実施形態では、天然タンパク質の阻害性ジペプチドは、切断不能である。いくつかの実施形態では、突然変異は、阻害性ジペプチドを切断不能にするための阻害性ジペプチドの突然変異である。いくつかの実施形態では、バリアントは、非細胞傷害性バリアントである。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞傷害性を低下させる。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞傷害性を無効にする。いくつかの実施形態では、突然変異体は、非細胞傷害性突然変異体である。いくつかの実施形態では、突然変異体は、非溶解性突然変異体である。いくつかの実施形態では、非細胞傷害性は、非溶解性である。いくつかの実施形態では、非溶解性は、非細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、突然変異は、タンパク質の酵素機能を低下させる。いくつかの実施形態では、突然変異は、タンパク質の酵素機能を無効にする。いくつかの実施形態では、酵素機能は、切断である。いくつかの実施形態では、切断は、タンパク質切断である。いくつかの実施形態では、酵素機能は、プロテアーゼ機能である。いくつかの実施形態では、酵素機能は、溶解を誘導する。いくつかの実施形態では、酵素機能は、細胞死を誘導する。いくつかの実施形態では、バリアントは、不活化バリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、不活性なバリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、非細胞傷害性バリアントである。いくつかの実施形態では、非細胞傷害性バリアントは、標的細胞においてアポトーシスを誘導することができない。いくつかの実施形態では、バリアントは、非溶解性バリアントである。いくつかの実施形態では、バリアントは、標的細胞においてアポトーシスを誘導することができない。いくつかの実施形態では、バリアントは、相同体である。いくつかの実施形態では、相同体は、ヒトにおいて細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、相同体は、ヒトにおいて細胞傷害性が低下している。

【0131】

いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、非細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、溶解性でない。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、酵素的に活性ではない。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、不活性である。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、不活化されている。いくつかの実施形態では、不活化は、酵素活性の喪失である。いくつかの実施形態では、酵素活性は、プロテアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、阻害性ジペプチドを含めることにより、グランザイムが不活性になる。いくつかの実施形態では、阻害性ジペプチドは、突然変異している。いくつかの実施形態では、突然変異は、阻害性ジペプチドを切断不能にし、結果として、活性化可能な形態のグランザイムがもたらされる。いくつかの実施形態では、阻害性ジペプチドは、切断不能な突然変異阻害性ジペプチドである。いくつかの実施形態では、突然変異は、配列番号８のアミノ酸１９の突然変異である。いくつかの実施形態では、突然変異は、配列番号１６のアミノ酸１９の突然変異である。いくつかの実施形態では、突然変異は、ジペプチドの最初のアミノ酸の突然変異である。いくつかの実施形態では、突然変異は、配列番号８のアミノ酸２０の突然変異である。いくつかの実施形態では、突然変異は、配列番号１６のアミノ酸２０の突然変異である。いくつかの実施形態では、突然変異は、ジペプチドの第２のアミノ酸の突然変異である。いくつかの実施形態では、突然変異は、アラニンへの突然変異である。いくつかの実施形態では、ジペプチドの両方のアミノ酸が、突然変異している。いくつかの実施形態では、配列番号８のアミノ酸１９および２０が突然変異している。いくつかの実施形態では、配列番号１６のアミノ酸１９および２０が突然変異している。いくつかの実施形態では、ジペプチドは、ＡＡに突然変異している。

【0132】

いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質と目的のタンパク質とは、リンカーによって分離されている。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質と目的のタンパク質とは、リンカーによって連結されている。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質と目的のタンパク質とは、リンカーによって連結されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチド結合である。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、化学リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブルリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、複数のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大２５のアミノ酸を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＳ）ｎを含むか、または（ＧＳ）ｎからなり、ここで、ｎは、１～１０の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号：９）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）を含むか、ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）からなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含むか、または（ＧＧＧＧＳ）ｎからなり、ここで、ｎは、１～５の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＳ（配列番号４３）を含むか、ＧＧＳ（配列番号４３）からなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＳ）ｎを含むか、または（ＧＧＳ）ｎからなり、ここで、ｎは、１～１０の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４４）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＳＧＦＡＮＥＬＧＰＲＬＭＧＫ（配列番号７２）である。いくつかの実施形態では、ＯＬＬＡＳリンカーは、配列番号７２からなる。

【0134】

いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。当業者は、目的のタンパク質をリンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質から分離して、タンパク質がより良好に機能できるようにすることが有利であり得ることを理解するであろう。しかし、このような分離は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質が、目的のタンパク質の溶解性顆粒および／または標的細胞への送達を促進する機能を行った後にのみ起こるべきである。当業者は、切断が溶解性顆粒で生じる場合、目的のタンパク質が依然として標的細胞に移入することを理解するであろう。リンパ球が標的細胞に係合したときに、顆粒内に存在するすべてのタンパク質（リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質から分離されていても、目的のタンパク質を含む）が、溶解性顆粒分泌のプロセスによって受動的に標的細胞に拡散する。免疫シナプスにおけるこのタイプのタンパク質の移入は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ｐＨ依存性切断可能リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、酸性ｐＨで、切断可能である。当業者は、溶解性顆粒が、酸性ｐＨを含むことを理解するであろう。酸性ｐＨで切断するリンカーは、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質またはその断片が、少なくとも溶解小胞に到達するまで確実に、目的のタンパク質に接続されているようにする。溶解性顆粒が標的細胞に到達すると、目的のタンパク質がリンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質から放出され、標的細胞内で自由に機能し得る。いくつかの実施形態では、酸性ｐＨ切断可能リンカーは、アスパラギン酸－プロリン（ＤＰ）ジペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＲＡＲＤＰＰＶＡＴ（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１２からなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＤＸＤＰＨＦ（配列番号１３）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１３からなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＴＧＤＰ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１４からなる。

【0135】

いくつかの実施形態では、リンカーは、カテプシン切断可能リンカーである。カテプシンの非限定的な例としては、カテプシンＬ、カテプシンＢおよびカテプシンＣが含まれるが、これらに限定されない。カテプシンは、溶解性顆粒中で活性であることが知られており、これらは、リンカーの標的切断にも有用である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジペプチドＶＡを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジペプチドＶＡからなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジペプチドＧＥを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ジペプチドＧＥからなる。

【0136】

いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞質中で切断可能である。いくつかの実施形態では、細胞質切断可能リンカーは、細胞質グルタチオンレベルで切断可能である。ＥＲシグナルペプチドを含めることにより、キメラポリペプチドのＥＲへの同時翻訳進入が引き起こされ、それによってリンパ球の細胞質の切断誘導環境からリンカーが隔離されることは、当業者には理解されるであろう。したがって、融合タンパク質が標的細胞の細胞質に到着するまで、細胞質の切断は妨げられ、目的のタンパク質は、自由にその機能を発揮するように設定される。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、ｍＣｈｅｒｒｙの最初の１１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、切断可能リンカーは、ｍＣｈｅｒｒｙの最初の２～１１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ｍＣｈｅｒｒｙは、ＭＶＳＫＧＥＥＤＮＭＡＩＩＫＥＦＭＲＦＫＶＨＭＥＧＳＶＮＧＨＥＦＥＩＥＧＥＧＥＧＲＰＹＥＧＴＱＴＡＫＬＫＶＴＫＧＧＰＬＰＦＡＷＤＩＬＳＰＱＦＭＹＧＳＫＡＹＶＫＨＰＡＤＩＰＤＹＬＫＬＳＦＰＥＧＦＫＷＥＲＶＭＮＦＥＤＧＧＶＶＴＶＴＱＤＳＳＬＱＤＧＥＦＩＹＫＶＫＬＲＧＴＮＦＰＳＤＧＰＶＭＱＫＫＴＭＧＷＥＡＳＳＥＲＭＹＰＥＤＧＡＬＫＧＥＩＫＱＲＬＫＬＫＤＧＧＨＹＤＡＥＶＫＴＴＹＫＡＫＫＰＶＱＬＰＧＡＹＮＶＮＩＫＬＤＩＴＳＨＮＥＤＹＴＩＶＥＱＹＥＲＡＥＧＲＨＳＴＧＧＭＤＥＬＹＫ（配列番号１）を含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態では、ｍＣｈｅｒｒｙは、配列番号１を含むか、配列番号１からなる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＶＳＫＧＥＥＤＮＭＡ（配列番号２）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号２からなる。いくつかの実施形態では、配列番号２は、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態では、ｍＣｈｅｒｒｙは、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙである。いくつかの実施形態では、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙは、ｍＣｈｅｒｒｙの最初の１１のアミノ酸を欠いている。いくつかの実施形態では、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙは、配列番号３からなる。いくつかの実施形態では、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙは、配列番号７によってコードされる。

【0137】

いくつかの実施形態では、目的の分子は、治療分子である。いくつかの実施形態では、分子は、薬物である。いくつかの実施形態では、分子は、生物製剤である。いくつかの実施形態では、分子は、生物学的分子である。いくつかの実施形態では、分子は、核酸分子である。いくつかの実施形態では、分子は、核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、分子は、タンパク質－ＲＮＡ複合体である。いくつかの実施形態では、分子は、ＲＮＰである。いくつかの実施形態では、分子は、タンパク質である。いくつかの実施形態では、分子は、タンパク質断片である。いくつかの実施形態では、分子は、非天然分子である。いくつかの実施形態では、分子は、天然分子である。いくつかの実施形態では、分子は、天然分子の改変形態である。いくつかの実施形態では、分子は酵素であるか、または酵素的に活性である。いくつかの実施形態では、分子は、結合分子である。いくつかの実施形態では、目的の分子は、カーゴである。いくつかの実施形態では、目的の分子は、治療剤である。いくつかの実施形態では、治療剤は、治療用タンパク質性剤である。

【0138】

いくつかの実施形態では、目的の分子は、目的のタンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、治療剤である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、細胞質タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、細胞質中で活性である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、核タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、核中で活性である。

【0139】

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、膜タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、リンパ球膜タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、天然の膜タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、リンパ球において、天然の膜性ではない。いくつかの実施形態では、細胞は、その細胞膜内に目的の分子を含まない。いくつかの実施形態では、細胞は、その細胞膜に結合されている目的の分子を含まない。いくつかの実施形態では、細胞は、その細胞膜内に治療剤を含まない。いくつかの実施形態では、細胞膜は、原形質膜である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、膜貫通ドメインを含まない。

【0140】

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、天然に分泌されるタンパク質ではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、シグナルペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、シグナルペプチドを天然に含まない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、受容体リガンドではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、受容体に結合しない。いくつかの実施形態では、受容体は、表面受容体である。いくつかの実施形態では、受容体は、原形質膜受容体である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、標的タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、標的細胞において効果を誘導する。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、標的細胞において治療効果を誘導する。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、表面タンパク質に結合し、その表面タンパク質を活性化または阻害する。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、アゴニストである。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、表面タンパク質に結合し、結合した受容体を介してシグナル伝達を誘導する。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、表面受容体リガンドである。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、その標的に自然に結合するタンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、合成結合剤である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ＶＨＨである。

【0141】

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ウイルスタンパク質ではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ウイルスエンベロープタンパク質ではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ウイルス透過タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ウイルススパイクタンパク質ではない。いくつかの実施形態では、治療剤は、完全ウイルスではない。いくつかの実施形態では、治療剤は、ワクチンではない。いくつかの実施形態では、治療剤は、腫瘍溶解性ウイルスではない。いくつかの実施形態では、治療剤は、ウイルス粒子ではない。いくつかの実施形態では、治療剤は、ウイルスゲノムではない。いくつかの実施形態では、治療剤は、ウイルスゲノム編集タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、抗原結合タンパク質またはその断片である。いくつかの実施形態では、抗原は、表面抗原ではない。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞質抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、核抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、内部抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、標的細胞の内部にある。いくつかの実施形態では、目的の分子は、ナノ粒子に結合されていない。いくつかの実施形態では、目的の分子は、内包化されていない。いくつかの実施形態では、内包化は、内包化されたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、ナノ粒子に結合されていない。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、内包化されていない。

【0142】

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、タンパク質断片である。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも１つの機能ドメインを含む。いくつかの実施形態では、断片は、治療用断片である。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、または１００のアミノ酸を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、断片は、少なくとも２５のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、断片は、完全なタンパク質ではない。いくつかの実施形態では、断片は、切断部位を含まない。いくつかの実施形態では、断片は、切断部位を含まず、これにより、目的のタンパク質が、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質から早期に切断され得る。いくつかの実施形態では、早期とは、ＥＲへの進入前である。いくつかの実施形態では、早期とは、溶解性顆粒への進入前である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質ではない。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、標的化部分ではない。

【0143】

いくつかの実施形態では、目的の分子は、２５、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１８０、１９０または２００キロダルトン（ｋＤａ）を超える分子量を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、目的の分子は、２５ｋＤａを超える分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、２８ｋＤａを超える分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、５０ｋＤａを超える分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、７５ｋＤａを超える分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、１００ｋＤａを超える分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、１２５ｋＤａを超える分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、１５０ｋＤａを超える分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、１６０ｋＤａを超える分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、１９０ｋＤａを超える分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、２５～３００、２５～２５０、２５～２００、２５～１９０、２５～１７５、２５～１６５、２８～３００、２８～２５０、２８～２００、２８～１９０、２８～１７５、２８～１６５、３０～３００、３０～３００、３０～２００、３０～１９０、３０～１７５、３０～１６５、５０～３００、５０～５００、５０～２００、５０～１９０、５０～１７５、５０～１６５、７５～３００、７５～７５０、７５～２００、７５～１９０、７５～１７５、７５～１６５、１００～３００、１００～１０００、１００～２００、１００～１９０、１００～１７５、または１００～１６５ｋＤａの分子量を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、目的の分子は、２５～３００ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、２５～２００ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、２５～１９０ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、２５～１６５ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、３０～３００ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、３０～２００ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、３０～１９０ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、３０～１６５ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、５０～３００ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、５０～２００ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、５０～１９０ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、５０～１６５ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、１００～３００ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、１００～２００ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、１００～１９０ｋＤａの分子量を含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、１００～１６５ｋＤａの分子量を含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、目的の分子は、細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、細胞傷害性ではなく、目的の分子は、細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、細胞傷害性であり、目的の分子は、細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、細胞傷害性であり、目的の分子は、細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質は、細胞傷害性でなく、目的の分子は、細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、細胞傷害性タンパク質は、細胞においてアポトーシスを誘導することができるタンパク質である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、標的細胞の内部に送達されたときに、細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、標的細胞の表面に送達されたときに、細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、内部は、細胞質である。いくつかの実施形態では、内部は、核である。いくつかの実施形態では、内部は、ミトコンドリアである。いくつかの実施形態では、細胞傷害性は、溶解性である。

【0145】

いくつかの実施形態では、目的の分子は、ＲＮＡ－タンパク質複合体である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－タンパク質複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）である。「リボヌクレオチド」または「リボ核酸」（ＲＮＡ）という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド単位を含む改変または非改変ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分の１’位でＮ－グリコシド連結で付着した窒素含有塩基を有する、リボシル部分の２’位に付着したヒドロキシル基、および別のヌクレオチドへの連結を可能にするか、または連結を妨げることができる部分を含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、タンパク質は、ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、目的の分子は、ゲノム編集複合体である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ゲノム編集タンパク質である。いくつかの実施形態では、編集は、改変することである。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、クラスター化規則的間隔短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、メガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、天然のメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、改変／操作されたメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、哺乳動物ゲノムのＤＮＡ標的配列に特異的である。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、哺乳動物遺伝子のＤＮＡ標的配列に特異的である。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、ＰＣＳＫ９特異的メガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的メガヌクレアーゼは、アミノ酸配列MHMNTKYNKEFLLYLAGFVDGDGSIFARIKPSQRSKFKHKLHLVFAVYQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVLDSGSVSFYSLSEIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGAGSGTGYNKEFLLYLAGFVDGDGSIYARIKPVQRAKFKHELVLGFDVTQKTQRRWFLDKLVDEIGVGYVYDKGSVSAYRLSQIKPLHNFLTQLQPFLKLKQKQANLVLKIIEQLPSAKESPDKFLEVCTWVDQIAALNDSKTRKTTSETVRAVLDSLSEKKKSSP（配列番号５３）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的メガヌクレアーゼは、配列番号５４に提供されるヌクレオチド配列によってコードされる。

【0147】

いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９オルソログである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９バリアントである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９ホモログである。

【0148】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ＣＰＦ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ＣａｓＩヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ＣａｓＩＢヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ３ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ４ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ５ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ６ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ７ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ８ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１００ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｙ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｙ２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｙ３ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｅ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｅ２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｃ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｃ２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓａ５ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｎ２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｍ２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｍ３ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｍ４ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｍ５ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｍ６ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｍｒ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｍｒ３ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｍｒ４ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｍｒ５ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｍｒ６ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｂ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｂ２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｂ３ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｘ１７ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｘ１４ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｘ１０ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｘ１６ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ＣｓａＸヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｘ３ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｘ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｘ１５ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｆ２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｆ３ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃｓｆ４ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、プライムエディター１（ＰＥ１）ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、ＰＥ１は、配列番号２７によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、プライムエディター２（ＰＥ２）ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、ＰＥ２は、配列番号２８によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、プライムエディター３（ＰＥ３）ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ＭＡＤ７ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲｉヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ干渉）である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲａヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ活性化）である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、クラス１ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、ホーミングエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、メガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、標的ゲノム摂動を生じさせるために利用可能である。いくつかの実施形態では、上記のエンドヌクレアーゼの１つ以上またはその相同体、その天然分子の組換え、そのコドン最適化型、またはその改変型、およびそれらの組み合わせが使用される。

【0149】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９は、配列番号１９を含む。いくつかの実施形態では、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９は、配列番号１９からなる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、連鎖球菌血清型（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ｍ１ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、Ｓｐ血清型Ｍ１ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、連鎖球菌血清型Ｍ１ Ｃａｓ９は、配列番号２０を含む。いくつかの実施形態では、連鎖球菌血清型Ｍ１ Ｃａｓ９は、配列番号２０からなるいくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９は、配列番号２１を含む。いくつかの実施形態では、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９は、配列番号２１からなる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、髄膜炎菌血清群（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ）Ｃ（８０１３株）Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、髄膜炎菌血清群Ｃ（８０１３株）Ｃａｓ９は、配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、髄膜炎菌血清群Ｃ（８０１３株）Ｃａｓ９は、配列番号２２からなる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＣａｓ９は、配列番号２３を含む。いくつかの実施形態では、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＣａｓ９は、配列番号２３からなる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ１２ａフランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜種ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）（Ｕ１１２株）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、配列番号２４を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、配列番号２４からなる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ１２ａ ＯＳ＝アシダミノコッカスｓｐ．（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（ＢＶ３Ｌ６株）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、配列番号２５を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、配列番号２５からなる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６のＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、配列番号２６を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａは、配列番号２６からなる。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、プライムエディター１（ＰＥ１）である。いくつかの実施形態では、ＰＥ１は、配列番号７３からなる。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、プライムエディター２（ＰＥ２）である。いくつかの実施形態では、ＰＥ２は、配列番号７４からなる。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、配列番号１９～２６および７３、７４から選択される。

【0150】

いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、本明細書で上に提供されたもののうちの１つである。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、本明細書で上に提供された配列のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、本明細書で上に提供された配列のうちの１つからなる。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、本明細書で上に提供された配列のうちの１つに対応する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質は、本明細書で上に提供されたタンパク質／配列のバリアントまたはそのうちの１つである。当業者であれば、哺乳動物または特にヒトにおける発現のために最適化された、天然タンパク質を改変することができるか、またはバリアントを生成できることを理解するであろう。このような最適化には、コドンの最適化、構造の最適化、発現の最適化、ゲノム編集の最適化、特異性の最適化、およびその他の最適化が含まれる。当技術分野で知られている任意のこのような最適化を使用することができ、上記のものに対応するまたは由来する任意のバリアント配列を使用することができる。

【0151】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－タンパク質複合体中のＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、化学修飾されている。いくつかの実施形態では、この修飾は、ＲＮＡの安定性を高める。いくつかの実施形態では、この修飾は、ＲＮＡの半減期を延長させる。いくつかの実施形態では、この修飾は、ＲＮＡの分解を減少させる。いくつかの実施形態では、この修飾は、ＲＮＡの切断を減少させる。いくつかの実施形態では、この修飾は、ＲＮＡの免疫原性を減少させる。いくつかの実施形態では、この修飾は、オフターゲット効果を減少させる。ＲＮＡの化学修飾は、当技術分野において周知であり、例えば、２－Ｏ－メチル類似体、２－フルオロ類似体、２－ＭＯＥおよびホスホロチオエートが挙げられ、そのようないずれかの修飾を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、目的の標的タンパク質を標的とする。いくつかの実施形態では、目的の標的タンパク質は、疾患関連タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的の標的タンパク質は、疾患を生じさせるタンパク質である。いくつかの実施形態では、目的の標的タンパク質の改変は、治療上の利点を有する。いくつかの実施形態では、疾患は、目的の標的タンパク質中での突然変異を特徴とする。いくつかの実施形態では、疾患は、目的の標的タンパク質中での突然変異によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、疾患は、目的の標的タンパク質の遺伝子編集によって治療可能である。いくつかの実施形態では、疾患は、目的の標的タンパク質の調節を変更することによって治療可能である。いくつかの実施形態では、調節は、ダウンレギュレーションである。いくつかの実施形態では、調節は、アップレギュレーションである。

【0152】

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、局在化配列をさらに含む。当業者であれば、特定の細胞内場所で作用することが意図されているタンパク質が、その場所を標的とする場合、機能が増強され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、局在化配列は、核局在化配列（ＮＬＳ）である。いくつかの実施形態では、局在化配列は、ミトコンドリア局在化配列（ＭＬＳ）である。いくつかの実施形態では、局在化配列は、連結しているタンパク質を細胞質から標的の細胞内場所に輸送することができる。いくつかの実施形態では、その場所は、細胞小器官である。いくつかの実施形態では、細胞小器官は、膜を含み、配列は、膜を横切ってまたは膜を通過して輸送され得る。いくつかの実施形態では、局在化配列は、目的のタンパク質のＮ末端に付着する。いくつかの実施形態では、局在化配列は、目的のタンパク質のＣ末端に付着する。いくつかの実施形態では、局在化配列は、目的のタンパク質の内部にある。いくつかの実施形態では、局在化配列は、目的のタンパク質に直接結合している。いくつかの実施形態では、局在化配列は、リンカーによって目的のタンパク質に結合されている。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、局在化配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、局在化配列は、目的のタンパク質に作動可能に連結されている。

【0153】

核酸分子
別の態様により、本発明のキメラ分子をコードするポリヌクレオチドが提供される。

【0154】

例示的な核酸分子の模式図を図１に提供する。

【0155】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、哺乳動物細胞における発現のために構成される。いくつかの実施形態では、発現のために構成されたものは、発現可能である。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ヒト細胞における発現のために構成される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、リンパ球における発現のために構成される。

【0156】

本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成、例えば、遺伝子産物の転写および／または翻訳を指す。したがって、核酸分子の発現は、核酸断片の転写（例えば、ｍＲＮＡまたは他の機能的ＲＮＡをもたらす転写）および／または前駆体もしくは成熟タンパク質（ポリペプチド）へのＲＮＡの翻訳を指し得る。

【0157】

細胞内での遺伝子の発現は、当業者に周知である。多くの方法の中でも、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、または細胞のゲノムの直接改変によって行うことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、オープンリーディングフレームである。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、本発明のキメラポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、プラスミドまたはウイルスベクターなどの発現ベクター内にある。発現ベクターは、当技術分野でよく知られており、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、その他多くの企業から市販されている。

【0158】

ベクター核酸配列は、一般に、少なくとも、細胞内で増殖するための複製起点、および異種ポリヌクレオチド配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、選択マーカー（抗生物質耐性など）、ポリアデニン配列などの任意の追加エレメントを含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ベクターは、非ウイルス法またはウイルス法を介して送達されるＤＮＡプラスミドであり得る。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはポックスウイルスベクターであり得る。プロモーターは、哺乳動物細胞において活性であり得る。プロモーターは、ヒト細胞において活性であり得る。プロモーターは、リンパ球において活性であり得る。

【0160】

いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーターである。「作動可能に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ベクターが宿主細胞に導入された場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系または宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節エレメント（複数可）に連結されていることを意味することを意図している。

【0161】

いくつかの実施形態では、ベクターは、エレクトロポレーション（例えば、Ｆｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，５８２４（１９８５））、熱ショック、ウイルスベクターによる感染、小さいビーズもしくは粒子のマトリックス内、または表面上のいずれかにおいて核酸を含む小粒子による高速弾道浸透（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２７．７０－７３（１９８７））などの標準的な方法によって細胞に導入される。

【0162】

本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ、すなわちＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周りに集積している転写制御モジュールの群を指す。プロモーターは、個別の機能モジュールで構成され、それぞれが約７～２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写活性化因子タンパク質または転写抑制因子タンパク質の認識部位を１つ以上含む。

【0163】

いくつかの実施形態では、核酸配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩおよびＰｏｌ ＩＩ）によって転写される。ＲＮＡＰ ＩＩは、真核細胞中で見られる酵素である。ＤＮＡの転写を触媒して、ｍＲＮＡの前駆体およびほとんどのｓｎＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡを合成する。

【0164】

いくつかの実施形態では、哺乳動物発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（±）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（±）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶおよびｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能）、ｐＴＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）、ならびにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0165】

いくつかの実施形態では、レトロウイルスなどの真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが、本発明によって使用される。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、ウシパピローマウイルス由来のベクターとしては、ｐＢＶ－１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタインバーウイルス由来のベクターとしては、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現が可能になる他のベクターが挙げられる。

【0166】

いくつかの実施形態では、水平感染および標的特異性などの利点を提供する組換えウイルスベクターが、ｉｎ ｖｉｖｏ発現に使用される。一実施形態では、水平感染は、例えばレトロウイルスのライフサイクルに固有のものであり、単一の感染細胞が、出芽して隣接細胞に感染する多くの子孫ウイルス粒子を産生するプロセスである。一実施形態では、その結果、広い領域が急速に感染するようになり、そのほとんどは、最初は、元のウイルス粒子に感染していなかった。一実施形態では、水平に広がることができないウイルスベクターが産生される。一実施形態では、この特徴は、所望の目的が特定の遺伝子を局所的な数の標的細胞のみに導入することである場合に有用であり得る。

【0167】

本発明の発現ベクターを細胞に導入するには、様々な方法を用いることができる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９），Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）およびＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｌ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４－５１２，１９８６］に一般的に記載されており、例えば、安定または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターによる感染が挙げられる。さらに、ポジティブ－ネガティブセレクション方法については、米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。

【0168】

（ポリペプチドをコードしている）挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むこと以外に、本発明の発現構築物は、発現されたポリペプチドの安定性、産生、精製、収量または活性を最適化するように操作された配列も含むことができることが理解されるであろう。

【0169】

いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢをコードする核酸配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００４１３１、ＮＭ＿００１３４６０１１、またはＮＲ＿１４４３４３によって提供される。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢをコードする核酸配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００４１３１、ＮＭ＿００１３４６０１１、またはＮＲ＿１４４３４３によって提供される。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢをコードする核酸配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００４１３１によって提供される。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢは、ヌクレオチド配列agctccaaccagggcagccttcctgagaagatgcaaccaatcctgcttctgctggccttcctcctgctgcccagggcagatgcaggggagatcatcgggggacatgaggccaagccccactcccgcccctacatggcttatcttatgatctgggatcagaagtctctgaagaggtgcggtggcttcctgatacgagacgacttcgtgctgacagctgctcactgttggggaagctccataaatgtcaccttgggggcccacaatatcaaagaacaggagccgacccagcagtttatccctgtgaaaagacccatcccccatccagcctataatcctaagaacttctccaacgacatcatgctactgcagctggagagaaaggccaagcggaccagagctgtgcagcccctcaggctacctagcaacaaggcccaggtgaagccagggcagacatgcagtgtggccggctgggggcagacggcccccctgggaaaacactcacacacactacaagaggtgaagatgacagtgcaggaagatcgaaagtgcgaatctgacttacgccattattacgacagtaccattgagttgtgcgtgggggacccagagattaaaaagacttcctttaagggggactctggaggccctcttgtgtgtaacaaggtggcccagggcattgtctcctatggacgaaacaatggcatgcctccacgagcctgcaccaaagtctcaagctttgtacactggataaagaaaaccatgaaacgctactaactacaggaagcaaactaagcccccgctgtaatgaaacaccttctctggagccaagtccagatttacactgggagaggtgccagcaactgaataaatacctcttagctgagtgga（配列番号１５）によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列番号１５は、配列番号８をコードする。配列番号８を改変するために、配列番号１５の改変を行うことができることは理解されるであろう。例えば、配列番号８の最初の１８のアミノ酸を除去するために、配列番号１５の最初の５４のヌクレオチドを除去することができる。ＡＴＧが除去された場合、オープンリーディングフレームの始めに追加することができる。

【0170】

いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢをコードする核酸配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０１３５４２によって提供される。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢは、ヌクレオチド配列ATGAAGATCCTCCTGCTACTGCTGACCTTGTCTCTGGCCTCCAGGACAAAGGCAGGGGAGATCATCGGGGGACATGAAGTCAAGCCCCACTCTCGACCCTACATGGCCTTACTTTCGATCAAGGATCAGCAGCCTGAGGCGATATGTGGGGGCTTCCTTATTCGAGAGGACTTTGTGCTGACTGCTGCTCACTGTGAAGGAAGTATAATAAATGTCACTTTGGGGGCCCACAACATCAAAGAACAGGAGAAGACCCAGCAAGTCATCCCTATGGTAAAATGCATTCCCCACCCAGACTATAATCCTAAGACATTCTCCAATGACATCATGCTGCTAAAGCTGAAGAGTAAGGCCAAGAGGACTAGAGCTGTGAGGCCCCTCAACCTGCCCAGGCGCAATGTCAATGTGAAGCCAGGAGATGTGTGCTATGTGGCTGGTTGGGGAAGGATGGCCCCAATGGGCAAATACTCAAACACGCTACAAGAGGTTGAGCTGACAGTACAGAAGGATCGGGAGTGTGAGTCCTACTTTAAAAATCGTTACAACAAAACCAATCAGATATGTGCGGGGGACCCAAAGACCAAACGTGCTTCCTTTCGGGGGGATTCTGGAGGCCCGCTTGTGTGTAAAAAAGTGGCTGCAGGCATAGTTTCCTATGGATATAAGGATGGTTCACCTCCACGTGCTTTCACCAAAGTCTCGAGTTTCTTATCCTGGATAAAGAAAACAATGAAAAGCAGC(配列番号１７）によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列番号１７は、配列番号１６をコードする。配列番号１６を改変するために、配列番号１７の改変を行うことができることは理解されるであろう。例えば、配列番号１７の最初の１８のアミノ酸を除去するために、配列番号１６の最初の５４のヌクレオチドを除去することができる。ＡＴＧが除去された場合、オープンリーディングフレームの始めに追加することができる。

【0171】

いくつかの実施形態では、突然変異体、非活性化ヒトグランザイムＢをコードするヌクレオチド配列は、配列atgcaaccaatcctgcttctgctggccttcctcctgctgcccagggcagatgcagcagcaatcatcgggggacatgaggccaagccccactcccgcccctacatggcttatcttatgatctgggatcagaagtctctgaagaggtgcggtggcttcctgatacgagacgacttcgtgctgacagctgctcactgttggggaagctccataaatgtcaccttgggggcccacaatatcaaagaacaggagccgacccagcagtttatccctgtgaaaagacccatcccccatccagcctataatcctaagaacttctccaacgacatcatgctactgcagctggagagaaaggccaagcggaccagagctgtgcagcccctcaggctacctagcaacaaggcccaggtgaagccagggcagacatgcagtgtggccggctgggggcagacggcccccctgggaaaacactcacacacactacaagaggtgaagatgacagtgcaggaagatcgaaagtgcgaatctgacttacgccattattacgacagtaccattgagttgtgcgtgggggacccagagattaaaaagacttcctttaagggggactctggaggccctcttgtgtgtaacaaggtggcccagggcattgtctcctatggacgaaacaatggcatgcctccacgagcctgcaccaaagtctcaagctttgtacactggataaagaaaaccatgaaacgcta（配列番号１８）によってコードされる。いくつかの実施形態では、突然変異体、非活性化マウスグランザイムＢをコードするヌクレオチド配列は、配列atgaagatcctcctgctactgctgaccttgtctctggcctccaggacaaaggcagcagcaatcatcgggggacatgaagtcaagccccactctcgaccctacatggccttactttcgatcaaggatcagcagcctgaggcgatatgtgggggcttccttattcgagaggactttgtgctgactgctgctcactgtgaaggaagtataataaatgtcactttgggggcccacaacatcaaagaacaggagaagacccagcaagtcatccctatggtaaaatgcattccccacccagactataatcctaagacattctccaatgacatcatgctgctaaagctgaagagtaaggccaagaggactagagctgtgaggcccctcaacctgcccaggcgcaatgtcaatgtgaagccaggagatgtgtgctatgtggctggttggggaaggatggccccaatgggcaaatactcaaacacgctacaagaggttgagctgacagtacagaaggatcgggagtgtgagtcctactttaaaaatcgttacaacaaaaccaatcagatatgtgcgggggacccaaagaccaaacgtgcttcctttcggggggattctggaggcccgcttgtgtgtaaaaaagtggctgcaggcatagtttcctatggatataaggatggttcacctccacgtgctttcaccaaagtctcgagtttcttatcctggataaagaaaacaatgaaaagcag（配列番号４１）によってコードされる。

【0172】

いくつかの実施形態では、連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）をコードするヌクレオチド配列は、atggacaagaagtatagcatcggcctggatatcggcacaaactccgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccaagcaagaagtttaaggtgctgggcaacaccgatagacactccatcaagaagaatctgatcggcgccctgctgttcgactctggcgagacagccgaggccacacggctgaagagaaccgcccggagaaggtatacacgccggaagaataggatctgctacctgcaggagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgattctttctttcaccgcctggaggagagcttcctggtggaggaggataagaagcacgagcggcaccctatctttggcaacatcgtggacgaggtggcctatcacgagaagtacccaacaatctatcacctgaggaagaagctggtggactccaccgataaggccgacctgcgcctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccactttctgatcgagggcgatctgaacccagacaatagcgatgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaatcagctgtttgaggagaaccccatcaatgcctctggagtggacgcaaaggcaatcctgagcgccagactgtccaagtctagaaggctggagaacctgatcgcccagctgccaggcgagaagaagaacggcctgtttggcaatctgatcgccctgtccctgggcctgacacccaacttcaagtctaattttgatctggccgaggacgccaagctgcagctgtccaaggacacctatgacgatgacctggataacctgctggcccagatcggcgatcagtacgccgacctgttcctggccgccaagaatctgtctgacgccatcctgctg agcgatatcctgcgcgtgaacaccgagatcacaaaggcccccctgagcgcctccatgatcaagagatatgacgagcaccaccaggatctgaccctgctgaaggccctggtgaggcagcagctgcctgagaagtacaaggagatcttctttgatcagagcaagaatggatacgcaggatatatcgacggaggagcatcccaggaggagttctacaagtttatcaagcctatcctggagaagatggacggcacagaggagctgctggtgaagctgaatcgggaggacctgctgaggaagcagcgcacctttgataacggcagcatccctcaccagatccacctgggagagctgcacgcaatcctgcgccggcaggaggacttctacccatttctgaaggataaccgggagaagatcgagaagatcctgacattcagaatcccctactatgtgggacctctggcccggggcaatagcagatttgcctggatgacccgcaagtccgaggagacaatcacaccctggaacttcgaggaggtggtggataagggcgcctctgcccagagcttcatcgagcggatgaccaattttgacaagaacctgcctaatgagaaggtgctgccaaagcactctctgctgtacgagtatttcaccgtgtataacgagctgacaaaggtgaagtacgtgaccgagggcatgagaaagcctgccttcctgagcggcgagcagaagaaggccatcgtggacctgctgtttaagaccaataggaaggtgacagtgaagcagctgaaggaggactatttcaagaagatcgagtgttttgattctgtggagatcagcggcgtggaggacaggtttaacgcctccctgggcacctaccacgatctgctgaagatcatcaaggataaggacttcctggacaacgaggagaatgaggatatcctggaggacatcgtgctgaccctgacactgtttgaggatagggagatgatcgaggagcgcc tgaagacatatgcccacctgttcgatgacaaagtgatgaagcagctgaagagaaggcgctacaccggatggggccggctgagcagaaagctgatcaatggcatccgcgacaagcagtctggcaagacaatcctggactttctgaagagcgatggcttcgccaaccggaacttcatgcagctgatccacgatgactccctgaccttcaaggaggatatccagaaggcacaggtgtctggacagggcgacagcctgcacgagcacatcgccaacctggccggctctcctgccatcaagaagggcatcctgcagaccgtgaaggtggtggacgagctggtgaaagtgatgggcaggcacaagccagagaacatcgtgatcgagatggcccgcgagaatcagaccacacagaagggccagaagaactcccgggagagaatgaagagaatcgaggagggcatcaaggagctgggctctcagatcctgaaggagcaccccgtggagaacacacagctgcagaatgagaagctgtatctgtactatctgcagaatggccgggatatgtacgtggaccaggagctggatatcaacagactgtctgattatgacgtggatcacatcgtgccacagtccttcctgaaggatgactctatcgacaataaggtgctgaccaggagcgacaagaaccgcggcaagtccgataatgtgccctctgaggaggtggtgaagaagatgaagaactactggaggcagctgctgaatgccaagctgatcacacagaggaagtttgataacctgaccaaggcagagaggggaggactgtccgagctggacaaggccggcttcatcaagcggcagctggtggagacaagacagatcacaaagcacgtggcccagatcctggattctagaatgaacacaaagtacgatgagaatgacaagctgatcagggaggtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtctgactttaggaagga tttccagttttataaggtgcgcgagatcaacaattatcaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtggtgggcacagccctgatcaagaagtaccctaagctggagtccgagttcgtgtacggcgactataaggtgtacgatgtgcgcaagatgatcgccaagtctgagcaggagatcggcaaggccaccgccaagtatttcttttacagcaacatcatgaatttctttaagaccgagatcacactggccaatggcgagatcaggaagcgcccactgatcgagacaaacggcgagacaggcgagatcgtgtgggacaagggcagggattttgccaccgtgcgcaaggtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaagaagaccgaggtgcagacaggcggcttctccaaggagtctatcctgcctaagcggaactccgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccccaagaagtatggcggcttcgacagccctacagtggcctactccgtgctggtggtggccaaggtggagaagggcaagagcaagaagctgaagtccgtgaaggagctgctgggcatcaccatcatggagcgcagctccttcgagaagaatcctatcgactttctggaggccaagggctataaggaggtgaagaaggacctgatcatcaagctgccaaagtactctctgtttgagctggagaacggaaggaagagaatgctggcaagcgccggagagctgcagaagggcaatgagctggccctgccctccaagtacgtgaacttcctgtatctggcctcccactacgagaagctgaagggctctcctgaggataacgagcagaagcagctgtttgtggagcagcacaagcactatctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgccaatctggataaggtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagccaatc agagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgacaaacctgggagcaccagcagccttcaagtattttgacaccacaatcgacaggaagcggtacaccagcacaaaggaggtgctggacgccacactgatccaccagtccatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgat（配列番号４２）である。

【0173】

いくつかの実施形態では、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含み、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙに連結されたヒトグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号２９に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の最初の行（１＿２と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙに連結されたヒトグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号３０に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の２行目（１＿３と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含み、Ｎ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、その後にＰ２Ａペプチド－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙが続くヒトグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号３１に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の３行目（１＿４と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含むが、ＥＲシグナルペプチドを含まず、Ｎ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、その後にＰ２Ａペプチド－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙが続くヒトグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号６６に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の７行目（１＿１６と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ヒトグランザイムＢをコードし、Ｎ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、その後にＰ２Ａ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙが続くプラスミドが、配列番号３２に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の４行目（１＿５と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ＥＲシグナルペプチドを含まず、Ｎ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、その後にＰ２Ａ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙが続くヒトグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号６５に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の８行目（１＿１５と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含み、配列番号２で示される切断可能リンカーによって、Ｎ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、その後にＰ２Ａ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙが続く、ヒトグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号３３に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の５行目（１＿６と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含むが、ＥＲシグナルペプチドを含まず、配列番号２によって示される切断可能リンカーによってＮ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、その後にＰ２Ａ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙが続く、ヒトグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号６７に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の９行目（１＿１７と表示）として示す。いくつかの実施形態では、配列番号２によって示される切断可能リンカーによってＮ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、その後にＰ２Ａ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙが続く、ヒト野生型グランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号３４に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の６行目（１＿７と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ＥＲシグナルペプチドを含まず、配列番号２によって示される切断可能リンカーによってＮ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、その後にＰ２Ａ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙが続く、ヒト野生型グランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号６８に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の１０行目（１＿１８と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙに連結されたマウス野生型グランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号３５に提供される。いくつかの実施形態では、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含み、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙに連結されたマウスグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号３６に提供される。いくつかの実施形態では、マウス野生型グランザイムＢをコードし、Ｎ末端ＮＬＳ、続いてＰ２Ａペプチド、次いでｃｒｍＣｈｅｒｒｙを有する全長Ｃａｓ９に連結されたプラスミドが、配列番号３７に提供される。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢをコードし、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含み、Ｎ末端ＮＬＳ、その後にＰ２Ａペプチド、次にｃｒｍＣｈｅｒｒｙを有する全長Ｃａｓ９に連結されたプラスミドが、配列番号３８に提供される。いくつかの実施形態では、マウス野生型グランザイムＢをコードし、切断可能リンカーによってＮ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、続いてＰ２Ａペプチド、次いでｃｒｍＣｈｅｒｒが続くプラスミドが、配列番号３９に提供される。いくつかの実施形態では、マウスグランザイムＢをコードし、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含み、切断可能リンカーによってＮ末端ＮＬＳを有する全長Ｃａｓ９に連結され、その後にＰ２Ａペプチド、次にｃｒｍＣｈｅｒｒｙが続くプラスミドが、配列番号４０に提供される。

【0174】

いくつかの実施形態では、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含み、Ｎ末端ＮＬＳを有するメガヌクレアーゼに連結されたヒトグランザイムＢをコードするプラスミドは、配列番号６９に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の１１行目（２＿４と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含むがＥＲシグナルペプチドを含まず、Ｎ末端ＮＬＳを有するメガヌクレアーゼに連結されたヒトグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号７０に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の１２行目（２＿５と表示）として示す。いくつかの実施形態では、ＧＥジペプチドのＡＡへの突然変異を含み、Ｎ末端ＮＬＳを有するメガヌクレアーゼに連結され、その後にＧＦＰが続く、ヒトグランザイムＢをコードするプラスミドが、配列番号７１に提供される。このプラスミドのコード領域の模式図を、図１の１３行目（２＿６と表示）として示す。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＮＬＳを有するメガヌクレアーゼをコードするプラスミドが、配列番号５に提供される。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ＮＬＳおよびＣ末端ＮＬＳを有するメガヌクレアーゼをコードするプラスミドが、配列番号６に提供される。

【0175】

改変細胞
別の態様により、治療剤を含む改変細胞が提供される。

【0176】

いくつかの実施形態では、細胞は、グランザイムを発現する細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、天然にグランザイムを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、改変前にグランザイムを発現する。いくつかの実施形態では、グランザイムは、グランザイムＢである。いくつかの実施形態では、細胞は、パーフォリンを発現する細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、改変前に、パーフォリンを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、グランザイムおよびパーフォリンを発現する細胞である。いくつかの実施形態では、発現は、分泌である。グランザイムとパーフォリンとの組み合わせを発現／分泌する細胞は、当技術分野で周知であり、このような細胞のいずれを使用してもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、白血球細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、白血球である。いくつかの実施形態では、白血球は、リンパ球または骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＣＤ４５＋細胞である。いくつかの実施形態では、白血球細胞（ＣＤ４５＋細胞）は、グランザイムおよび／またはパーフォリンを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫シナプスを形成することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫シナプスを産生する細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、標的細胞と免疫シナプスを形成する能力を特徴とする。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球および骨髄細胞から選択される。いくつかの実施形態では、骨髄細胞は、マクロファージである。いくつかの実施形態では、骨髄細胞は、マクロファージを含む。いくつかの実施形態では、骨髄細胞は、樹状細胞である。いくつかの実施形態では、骨髄細胞は、樹状細胞を含む。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および骨髄細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージから選択される。いくつかの実施形態では、免疫シナプスを形成できる細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、およびマクロファージから選択される。いくつかの実施形態では、免疫シナプスを形成できる細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、および骨髄細胞から選択される。いくつかの実施形態では、免疫シナプスを形成できる細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、およびマクロファージから選択される。免疫シナプスを形成できる細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージから選択される。いくつかの実施形態では、免疫シナプスを形成できる細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、およびマクロファージから選択される。免疫シナプスを形成できる細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞から選択される。いくつかの実施形態では、免疫シナプスを形成できる細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージから選択される。いくつかの実施形態では、免疫シナプスを形成できる細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および骨髄細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球、および貪食シナプスを産生することができる細胞から選択される。いくつかの実施形態では、免疫シナプスは、貪食シナプスである。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球およびマクロファージから選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球および骨髄細胞から選択される。

【0177】

本明細書で使用される「免疫シナプス」および「免疫学的シナプス」という用語は、交換可能に使用され、免疫細胞と、多くの場合、抗原提示細胞である、標的細胞との間の物理的界面を指す。いくつかの実施形態では、免疫シナプスは、超分子活性化クラスターである。いくつかの実施形態では、シナプスは、免疫細胞とその標的との間のタンパク質の移入を媒介するタンパク質クラスターの３つの同心リングを含む。いくつかの実施形態では、シナプスは、周辺に接着分子を含む。当業者は、免疫学的シナプスの接着分子により、エフェクターと標的細胞との間の結合力の増加および接触の持続の増長がもたらされることを理解するであろう。この増加した結合力／増長した接触により、分子のより強力な輸送が可能になる。このようにして、シナプス形成は、治療分子の順調で効率的な移入の課題に対する解決策となる。いくつかの実施形態では、シナプスは、高密度のＴ細胞受容体および共刺激分子を含む。いくつかの実施形態では、高密度は、免疫学的シナプスの中心にある。いくつかの実施形態では、免疫シナプス形成が、免疫細胞の活性化を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫シナプス形成が、リンパ球の活性化を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫シナプス形成が、Ｔ細胞の活性化を誘発する。いくつかの実施形態では、活性化は、エフェクター機能の実行に必要な最小閾値を超える活性化である。いくつかの実施形態では、活性化は、抗ＣＤ３抗体による人工的活性化以上の活性化である。いくつかの実施形態では、活性化は、ＩＬ－２による人工的活性化以上の活性化である。いくつかの実施形態では、活性化は、抗ＣＤ３抗体による人工的活性化を超える活性化である。いくつかの実施形態では、活性化は、ＩＬ－２による人工的活性化を超える活性化である。

【0178】

いくつかの実施形態では、細胞は、養子細胞移入の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、治療用細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、養子Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、養子ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＡＲ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲ ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、培養中の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、増殖されている。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏである。

【0179】

いくつかの実施形態では、細胞は、治療剤および／または分子および／またはタンパク質を発現するように改変される。いくつかの実施形態では、改変は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏまたはｅｘ－ｖｉｖｏで行われる。いくつかの実施形態では、改変は、目的のタンパク質または目的のリボ核タンパク質または目的のヌクレオチド配列または目的の他の分子の導入によって行われる。目的の分子の細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ導入は、当技術分野で周知であり、非限定的な例として、エレクトロポレーション、トランスフェクション、感染、プラスミド、ウイルス、およびリポソームによって実施され得る。いくつかの実施形態では、改変は、リンパ球中で発現するヌクレオチド配列および／または分子（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を導入することによって行われる。

【0180】

いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、末梢血リンパ球である。いくつかの実施形態では、末梢血細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、骨髄リンパ球である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、組織常在リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、培養中の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象中にある。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株由来である。いくつかの実施形態では、細胞株は、グランザイムノックダウン細胞株である。

【0181】

いくつかの実施形態では、細胞は、天然細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、培養中の別の細胞から分化したものである。いくつかの実施形態では、分化は、トランス分化である。いくつかの実施形態では、分化は、自然に発生する分化である。分化によって培養で細胞を産生する方法は、当技術分野で周知であり、任意のこのような方法を使用して、本発明の改変細胞を産生するために使用される細胞を産生することができる。いくつかの実施形態では、幹細胞を分化させて、細胞を産生する。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、ＥＳＣではない。いくつかの実施形態では、細胞は、胚性細胞に由来しない。いくつかの実施形態では、幹細胞は、多分化性幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、間葉系間質細胞または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＳＣに由来しないか、またはトランス分化されていない。

【0182】

いくつかの実施形態では、細胞は、分泌リソソームを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、溶解性顆粒を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、溶解細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、溶解性顆粒を含む。いくつかの実施形態では、リンパ球は、活性化に応答して溶解性顆粒を発現する。いくつかの実施形態では、溶解性顆粒は、活性化に応答して分極化する。いくつかの実施形態では、リンパ球は、分極溶解性顆粒を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つのリンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、リンパ球は、少なくとも１つのリンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、発現は、活性化に応答する。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、ナイーブリンパ球である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、活性化リンパ球である。リンパ球の活性化は、当技術分野で周知であり、以下に開示する方法を含む、任意の既知の方法によって行うことができる。このような方法には、抗ＣＤ３刺激および／またはＩＬ－２刺激が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、その細胞傷害性を阻害するように改変されている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、その細胞傷害性を無効にするように改変されている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。

【0183】

いくつかの実施形態では、細胞は、非細胞傷害性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、非溶解性細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、標的細胞中で溶解を誘導しない。いくつかの実施形態では、細胞は、標的細胞中でアポトーシスを誘導しない。いくつかの実施形態では、リンパ球は、非細胞傷害性リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、改変前は、非細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、改変前は、非細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、細胞は、本来細胞傷害性であり、細胞傷害性を低下させるために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞は、本来細胞傷害性であり、細胞傷害性を阻害するために改変されている。いくつかの実施形態では、細胞は、本来細胞傷害性であり、細胞傷害性を無効にするために改変されている。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＣＲの突然変異である。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＣＲの除去である。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＣＲのダウンレギュレーションである。いくつかの実施形態では、改変は、ＴＣＲの発現の阻害である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、内因性ＴＣＲである。いくつかの実施形態では、改変は、グランザイムの突然変異である。いくつかの実施形態では、細胞は、グランザイムノックダウン細胞株の細胞である。いくつかの実施形態では、ノックダウンは、ＣＲＩＳＰＲ除去である。いくつかの実施形態では、改変は、炎症誘発性サイトカインの突然変異である。いくつかの実施形態では、細胞は、炎症誘発性サイトカインノックダウン細胞株の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性は、内因性細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞傷害性ではなく、キメラ分子は、細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞傷害性ではなく、目的の分子は、細胞傷害性である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞傷害性タンパク質の突然変異またはノックアウトを含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性タンパク質は、溶解性顆粒分泌タンパク質以外の細胞傷害性タンパク質である。いくつかの実施形態では、ノックアウトは、細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子座の遺伝子切除によるものである。いくつかの実施形態では、遺伝子切除は、ゲノム編集タンパク質によるものである。いくつかの実施形態では、遺伝子切除は、ＣＲＩＳＰＲによる。

【0184】

いくつかの実施形態では、改変細胞は、活性化時／活性化後の標的細胞に対する溶解効果を防止するようにさらに改変／操作される。いくつかの実施形態では、活性化は、グランザイム－パーフォリン経路の活性化である。いくつかの実施形態では、改変リンパ球は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質の内因性発現をノックダウンするように操作される。いくつかの実施形態では、ノックダウンは、ノックアウトである。いくつかの実施形態では、改変細胞は、細胞媒介死滅エレメントをコードする遺伝子をノックダウンするように操作される。このような死滅エレメントの例としては、内因性グランザイム、ＦａｓＬおよびＴｒａｉｌが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＦａｓＬの内因性発現が、ノックダウンされる。いくつかの実施形態では、Ｔｒａｉｌ受容体の内因性発現が、ノックダウンされる。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインの内因性発現が、ノックダウンされる。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインの内因性発現が、阻害される。炎症誘発性サイトカインは、当技術分野において周知であり、非限定的な例として、ＴＮＦαおよびＩＮＦγが含まれる。いくつかの実施形態では、ノックダウンは、ノックアウトされている。遺伝子ノックダウン／ノックアウトは、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集、または特定のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは類似の阻害性核酸分子をコードする配列の導入など、当技術分野において知られている任意の簡便な方法によって達成することができる。いくつかの実施形態では、さらなる改変／操作は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。いくつかの実施形態では、さらなる改変／操作は、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。

【0185】

いくつかの実施形態では、細胞は、治療剤および標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、治療剤とは別の分子である。いくつかの実施形態では、治療剤は、標的化分子ではない。いくつかの実施形態では、標的化部分は、操作された分子である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、天然に存在しない。いくつかの実施形態では、標的化部分は、操作されたＴＣＲである。いくつかの実施形態では、標的化部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、その標的に結合したときに、リンパ球を活性化する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、その標的に結合したときに、活性化カスケードを開始する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、標的結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、膜貫通タンパク質である。いくつかの実施形態では、標的化部分は、共活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リンパ球は、ＣＡＲ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、ＴＩＬである。

【0186】

本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」および「ＣＡＲ－ＮＫ細胞」という用語は、目的の少なくとも１つの標的タンパク質に対して特異性を有し、免疫細胞（リンパ球）に移植される、操作された受容体を指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞に移植されたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞に移植されたモノクローナル抗体の特異性を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球および制御性Ｔ細胞から選択される。本発明の細胞が非細胞傷害性にされているか、または天然に非細胞傷害性である場合、活性化により治療剤または目的の分子を含む小胞が分泌されるが、それでも標的細胞の死滅をもたらさないことは、当業者には理解されるであろう。いくつかの実施形態では、標的細胞は、係合細胞（ｅｎｇａｇｅｄ ｃｅｌｌ）である。いくつかの実施形態では、係合は、ＣＡＲによって係合される。

【0187】

ＣＡＲ－ＴおよびＣＡＲ－ＮＫ細胞およびそれらのベクターは、当技術分野で周知である。このような細胞は、受容体が結合するタンパク質を標的にして係合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、少なくとも１つのウイルスタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、少なくとも１つのがんタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、少なくとも１つの表面タンパク質を標的とする。いくつかの実施形態では、表面タンパク質は、標的タンパク質である。いくつかの実施形態では、表面タンパク質は、標的細胞の表面上にある。

【0188】

ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築は、当技術分野で周知である。非限定的な一例では、ウイルスタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製することができ、次いで、その抗体をコードするベクターが構築される。ベクターは、共刺激シグナル領域も含む。いくつかの実施形態では、共刺激シグナル領域は、既知のＴ細胞またはＮＫ細胞刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、以下のうちの少なくとも１つから選択される：ＣＤ３Ｚ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３のほか、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＤ３Ｚシグナル伝達ドメインも含む。次いで、このベクターを、例えばレンチウイルス感染によってトランスフェクトするか、またはリンパ球にエレクトロポレートする。

【0189】

いくつかの実施形態では、細胞は、対象由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象にとって自己由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象にとって同種異系由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、ユニバーサル同種異系リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、非免疫原性リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、市販のリンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象にとって同系由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象と一致するＨＬＡ型を共有する。自己細胞とは、改変（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏ改変）後に再導入される同じ対象に由来する細胞を指す。細胞は、白血球除去法によって患者の血液から抽出されてもよい。細胞／リンパ球抽出の方法は、当技術分野で周知であり、このような方法をいずれも使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、養子細胞移入用である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、養子細胞移植用である。

【0190】

いくつかの実施形態では、治療剤は、目的の分子である。いくつかの実施形態では、治療剤は、目的のタンパク質である。いくつかの実施形態では、治療剤は、キメラ分子である。いくつかの実施形態では、治療剤は、キメラポリペプチドである。いくつかの実施形態では、治療剤は、タンパク質である。いくつかの実施形態では、治療剤は、タンパク質性剤である。いくつかの実施形態では、治療剤は、白血球にとって外因性である。いくつかの実施形態では、治療剤は、天然に存在しない。いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞傷害性ではない。いくつかの実施形態では、治療剤は、溶解性ではない。いくつかの実施形態では、治療剤は、本発明のキメラ分子である。いくつかの実施形態では、治療剤は、本発明のキメラポリペプチドである。

【0191】

いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞質中で作用する。いくつかの実施形態では、治療剤は、核中で作用する。いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞中で作用する。いくつかの実施形態では、治療剤の標的は、内部標的である。いくつかの実施形態では、治療剤の標的は、核標的である。いくつかの実施形態では、治療剤の標的は、細胞質標的である。いくつかの実施形態では、治療剤の標的は、細胞表面標的ではない。いくつかの実施形態では、治療剤の標的は、受容体ではない。

【0192】

いくつかの実施形態では、治療剤は、疾患、障害、または状態を治療する。いくつかの実施形態では、治療剤は、ある疾患を治療する。このような疾患の例としては、遺伝性疾患、自己免疫疾患、細菌性疾患、ウイルス性疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、心血管疾患、変性疾患、脳疾患、消化器疾患、肝疾患、神経疾患、およびエネルギー恒常性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、増殖性疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、疾患は、がんではない。いくつかの実施形態では、治療剤は、抗がん治療剤ではない。いくつかの実施形態では、白血球は、疾患の細胞を標的とする標的化部分を含む。当業者であれば、本発明のリンパ球によって疾患の経路にある細胞を識別し、次いで治療することができることを理解するであろう。例えば、ニューロン疾患は、ニューロン標的化部分を有するリンパ球で治療することができ、エネルギー恒常性疾患は、膵臓標的化部分を有するリンパ球などで治療することができる。いくつかの実施形態では、治療剤は、ある状態を治療する。状態の例としては、炎症状態、老化関連状態、変性状態、および他の多くの状態が挙げられるが、これらに限定されない。

【0193】

本明細書で使用される、疾患、障害、もしくは状態の「治療」または「治療すること」という用語は、その少なくとも１つの症状の緩和、その重症度の軽減、またはその進行の阻害を包含する。治療は、疾患、障害、または状態が完全に治癒することを意味する必要はない。有効な治療であるためには、本明細書の有用な組成物または方法は、疾患、障害、もしくは状態の重症度を軽減するか、それに関連する症状の重症度を軽減するか、または患者または対象の生活の質に対して改善をもたらすことのみを必要とする。

【0194】

いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝性疾患である。いくつかの実施形態では、状態は、遺伝的状態である。いくつかの実施形態では、障害は、遺伝性障害である。いくつかの実施形態では、遺伝性疾患、状態、または障害は、遺伝子突然変異によって引き起こされるものである。いくつかの実施形態では、疾患は、疾患状態または障害である。いくつかの実施形態では、疾患は、がんではない。いくつかの実施形態では、遺伝子突然変異は、体細胞突然変異である。いくつかの実施形態では、遺伝子突然変異は、生殖細胞系突然変異である。いくつかの実施形態では、遺伝性疾患、障害または状態は、遺伝子療法によって治療可能である。いくつかの実施形態では、治療剤は、遺伝子編集剤である。いくつかの実施形態では、治療剤は、遺伝子編集タンパク質である。いくつかの実施形態では、治療剤は、遺伝子編集複合体である。いくつかの実施形態では、複合体は、ＲＮＡ－タンパク質複合体である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、ゲノム編集である。いくつかの実施形態では、治療剤は、Ｃａｓ９またはそのホモログ、オルソログもしくはバリアントを含む。

【0195】

遺伝性疾患および障害は当技術分野で周知であり、そのような任意の疾患／障害の治療が想定されている。遺伝性疾患および障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アンジェルマン症候群、強直性脊椎炎、アペール症候群、先天性副腎過形成、嚢胞性線維症、ダウン症候群、脆弱Ｘ症候群、ヘモクロマトーシス、血友病、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、マルファン症候群、筋ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、プラダー・ウィリー症候群、レット症候群、テイ・サックス病、サラセミア、トゥレット症候群、ターナー症候群、フォン・ヴィレブランド病、およびウィリアムズ症候群。

【0196】

いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞の溶解性顆粒中にある。いくつかの実施形態では、治療剤は、リンパ球の溶解性顆粒中にある。いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞の分泌性顆粒中にある。いくつかの実施形態では、治療剤は、リンパ球の分泌性顆粒中にある。いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞の分泌リソソーム中にある。いくつかの実施形態では、治療剤は、リンパ球の分泌リソソーム中にある。いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞のエキソソーム中にはない。いくつかの実施形態では、リンパ球の溶解性顆粒は、治療剤を含む。いくつかの実施形態では、細胞の分泌性顆粒は、治療剤を含む。いくつかの実施形態では、リンパ球の分泌性顆粒は、治療剤を含む。いくつかの実施形態では、目的の治療剤／タンパク質の少なくとも５０％は、顆粒／リソソーム中にある。いくつかの実施形態では、目的の治療剤／タンパク質の少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％は、顆粒／リソソーム中にある。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、目的の治療剤／タンパク質の少なくとも７５％は、顆粒／リソソーム中にある。エキソソーム中ではなく（またはエキソソーム中のみではなく）溶解性顆粒／分泌性顆粒中に治療剤を有することが有利であることは、当業者には理解されるであろう。エキソソームは、無差別に産生され、治療剤は、エキソソーム中にあれば、継続的に放出される。さらに、標準条件下では、エキソソームは、多く産生されない。対照的に、溶解／分泌小胞は、細胞活性化時にのみ分泌される。したがって、リンパ球がその標的に係合する前に対象内を通過するとき、溶解小胞内の治療剤は放出されないが、エキソソーム内容物は放出され得る。標的細胞が係合すると、リンパ球が活性化され、多数の溶解小胞が放出される。したがって、エキソソーム経路ではなく、溶解経路を採用することにより、標的の送達およびロバストな送達が同時に確実に行われる。好都合なことに、標的細胞の認識によって活性化される白血球（リンパ球および骨髄）を介した治療剤の送達は、他の既知のｉｎ ｖｉｖｏ送達方法と比較して、標的細胞または標的組織内の細胞に対する特異性の増加をもたらす。

【0197】

医薬組成物
別の態様により、本発明の改変細胞を含む組成物が提供される。

【0198】

いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、治療用組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、治療に使用するための組成物である。いくつかの実施形態では、治療は、それを必要とする対象の治療である。いくつかの実施形態では、治療は、治療剤によって治療可能な疾患、状態または障害の治療である。

【0199】

いくつかの実施形態では、組成物は、改変細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、複数の改変細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、６００万、７００万、９００万、１０００万、２０００万、３０００万、４０００万、５０００万、６０００万、７０００万、８０００万、９０００万、１億、２億、３億、４億、５億、６億、７億、８億、９億または１０億個の改変細胞を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

【0200】

いくつかの実施形態では、組成物は、全身投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象への投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、局所投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象への投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、対象への投与のために製剤化されたものは、不明な化学物質含有物なく製剤化される。いくつかの実施形態では、対象への投与のために製剤化された組成物は、化学的に定義されている。いくつかの実施形態では、投与用に製剤化された組成物は、動物血清を含まない。いくつかの実施形態では、動物血清は、非ヒト動物血清である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患に罹患している。

【0201】

本明細書で使用される場合、用語「投与する」、「投与」および同様の用語は、健全な医療行為において、治療効果をもたらすような方法で、対象に、活性剤を含有する組成物を送達する任意の方法を指す。本主題の一態様は、本主題の組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に静脈内投与することを提供する。他の好適な投与経路には、非経口、経口、皮下、髄腔内、筋肉内、または腹腔内が含まれ得る。

【0202】

投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、存在する場合には、同時治療の種類、治療頻度、および所望の効果の性質に依存するであろう。

【0203】

いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体またはアジュバントを含む。本明細書で使用される「担体」、「賦形剤」、または「アジュバント」という用語は、活性剤ではない医薬組成物の任意の成分を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、非毒性、不活性固体、半固体液体充填剤、希釈剤、内包化材料、任意の種類の製剤補助剤、または単に生理食塩水などの滅菌水性媒体を指す。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末トラガント；麦芽、ゼラチン、タルク；ココアバターおよび座薬ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、とうもろこし油、大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張生理食塩水、リンゲル液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬品製剤中に使用される他の非毒性適合物質が挙げられる。本明細書において担体として機能し得る物質のいくつかの非限定的な例としては、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、ポリオール、アルギン酸、発熱物質非含有水、等張食塩水、リン酸塩緩衝液、ココアバター（座薬基剤）、乳化剤、および他の医薬品製剤中に使用される他の非毒性適合物質が挙げられる。ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤および潤滑剤、ならびに着色剤、香味剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、および防腐剤も存在し得る。本明細書で企図される組成物を製剤化するために、任意の非毒性、不活性、および有効な担体を使用することができる。この点に関して、好適な薬学的に許容される担体、賦形剤、および希釈剤は、当業者に周知であり、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｄａｖａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（２００１）；ｔｈｅ ＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）；および「Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ」Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔに記載されており、これらすべての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本組成物に有用な薬学的に許容される賦形剤、担体および希釈剤の例としては、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、およびＤＭＳＯが挙げられる。これらの追加の不活性成分、ならびに有効な製剤および投与手順は、当技術分野で周知であり、標準的なテキスト、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．編Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，（２００５）に記載されており、これらのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。現在記載されている組成物は、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、徐放性粒子、および血清中のペプチドまたはポリペプチドの半減期を延長させる他のビヒクルなど、人工的に創出された構造にも含まれ得る。リポソームとしては、エマルジョン、泡、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層などが挙げられる。現在記載されているペプチドと共に使用するためのリポソームは、中性および負に荷電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを一般的に含む標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般に、リポソームのサイズおよび血中安定性などを考慮して決定される。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋで検討されているように、リポソームの調製には様々な方法が利用可能であり、また米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号を参照されたい。

【0204】

担体は、合計で、本明細書に提示される医薬組成物の約０．１重量％～約９９．９９９９９重量％を構成し得る。

【0205】

いくつかの実施形態では、組成物は、ヒトへの投与に好適である担体である。いくつかの実施形態では、組成物は、非ヒトタンパク質を含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、非ヒトタンパク質を欠いている。いくつかの実施形態では、担体は、細胞用の培地を含む。いくつかの実施形態では、培地は、リンパ球培地である。いくつかの実施形態では、培地は、骨髄培地である。いくつかの実施形態では、培地は、マクロファージ培地である。いくつかの実施形態では、培地は、化学的に定義された培地である。いくつかの実施形態では、培地は、動物性タンパク質を欠いている。いくつかの実施形態では、培地は、動物性血清を欠いている。いくつかの実施形態では、組成物は、動物性血清を欠いている。いくつかの実施形態では、組成物は、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、対象に対して非免疫原性である非免疫原性である。

【0206】

使用方法
一態様により、治療剤を標的細胞に送達する方法が提供され、この方法は、標的細胞を本発明の改変細胞と接触させ、それによって治療剤を標的細胞に送達することを含む。

【0207】

別態様により、治療剤を標的細胞に送達する方法が提供され、この方法は、標的細胞を本発明の組成物と接触させ、それによって治療剤を標的細胞に送達することを含む。

【0208】

別の態様により、治療剤を標的細胞に送達する方法が提供され、この方法は、標的細胞を本発明のキメラ分子を発現する改変細胞と接触させ、それによって治療剤を標的細胞に送達することを含む。

【0209】

別の態様により、治療剤を標的細胞に送達する方法が提供され、この方法は、標的細胞を本発明のポリヌクレオチドを発現する改変細胞と接触させ、それによって治療剤を標的細胞に送達することを含む。

【0210】

いくつかの実施形態では、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ法である。いくつかの実施形態では、この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。いくつかの実施形態では、この方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ法である。いくつかの実施形態では、この方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで実施される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、対象中にある。いくつかの実施形態では、対象は、治療を必要としている。いくつかの実施形態では、治療は、治療剤による。いくつかの実施形態では、治療は、治療剤を用いる。いくつかの実施形態では、対象は、治療剤による治療に適応可能である。いくつかの実施形態では、この方法は、ゲノム編集の方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、遺伝子療法の方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、ゲノム遺伝子座を編集する方法である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患または状態に罹患している。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、治療剤によって治療可能である。

【0211】

いくつかの実施形態では、標的細胞内でのゲノム編集の方法が提供され、この方法は、標的細胞を本発明の改変細胞と接触させること、それによって遺伝子編集剤を標的細胞に送達することを含み、遺伝子編集剤は、標的細胞の核内の遺伝子を改変／編集する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集は、標的細胞の核内の遺伝子を改変することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集剤は、遺伝子編集タンパク質である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集剤は、標的細胞の核内の遺伝子を改変する。

【0212】

いくつかの実施形態では、ゲノム編集の方法は、遺伝性疾患を治療する方法である。いくつかの実施形態では、ゲノム編集の方法は、ゲノム編集標的化核酸分子を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的化核酸分子は、ゲノム編集タンパク質と適合性がある。ゲノム編集タンパク質（ＣＡＳ９など）と共に使用するための標的化核酸分子は、当技術分野で周知である。これらの配列を設計する方法もよく知られており、ゲノム編集を行うための標的配列を選択するための方法も同様である。任意のそのような方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、化学修飾されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、化学修飾されている骨格を含む。

【0213】

いくつかの実施形態では、標的化核酸分子は、ゲノム編集タンパク質と共に提供される。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質および標的化核酸分子は、一緒に提供される。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質および標的化核酸分子は、ＲＮＰ中に提供される。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質および標的化核酸分子は、別々に提供される。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質および標的化核酸分子は、標的細胞に別々に提供される。いくつかの実施形態では、ゲノム編集タンパク質および標的化核酸分子は、対象に別々に提供される。

【0214】

核酸分子送達の方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。このような送達方法はいずれも、使用することができる。ヌクレオフェクション、リポフェクション、トランスフェクション、およびウイルス送達などのｉｎ ｖｉｔｒｏでの送達方法を使用することができる。レンチウイルス、ナノ粒子送達、微粒子送達、脂質送達、リガンド結合送達および他の多くのｉｎ ｖｉｖｏ送達の方法が想定される。核酸送達のための当技術分野で知られている任意の方法を使用して、標的化核酸を標的細胞に送達することができる。

【0215】

別の態様により、それを必要とする対象を治療する方法が提供され、この方法は、対象に本発明の改変細胞を投与し、それによって対象を治療することを含む。

【0216】

別の態様により、それを必要とする対象を治療する方法が提供され、この方法は、対象に本発明の組成物を投与し、それによって対象を治療することを含む。

【0217】

別の態様により、それを必要とする対象を治療する方法が提供され、この方法は、対象に本発明のキメラ分子を発現する改変細胞を投与し、それによって対象を治療することを含む。

【0218】

別の態様により、それを必要とする対象を治療する方法が提供され、この方法は、対象に本発明のポリヌクレオチドを発現する改変細胞を投与し、それによって対象を治療することを含む。

【0219】

別の態様により、本発明の改変細胞を産生する方法が提供され、この方法は、細胞を提供することと、治療剤を細胞に導入することと、を含む。

【0220】

別の態様により、本発明の改変細胞を産生する方法が提供され、この方法は、細胞を提供することと、本発明のキメラポリペプチドを細胞に導入することと、を含む。

【0221】

いくつかの実施形態では、標的細胞は、疾患の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、細胞が自然にホーミングする細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、リンパ球が自然にホーミングする細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、細胞上の標的化部分の標的である表面タンパク質を発現する細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象にとって自己由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象にとって同種異系由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象にとって同系由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、培養中にある。いくつかの実施形態では、細胞は、対象中にある。いくつかの実施形態では、細胞は、培養で増殖された細胞の集団である。

【0222】

いくつかの実施形態では、この方法は、細胞を得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、得ることは、対象から細胞を抽出することである。いくつかの実施形態では、この方法は、対象から細胞を抽出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、リンパ球を得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、得ることは、対象からリンパ球を抽出することである。いくつかの実施形態では、この方法は、対象からリンパ球を抽出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、抽出された細胞を増殖することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、抽出された細胞を活性化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、抽出されたリンパ球を活性化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、抽出された細胞を改変することをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変することは、標的化部分により改変することである。いくつかの実施形態では、改変することは、治療剤によるものである。いくつかの実施形態では、改変することは、細胞中で発現することである。いくつかの実施形態では、細胞内で発現することは、改変することである。いくつかの実施形態では、改変することは、本発明のキメラ分子によるものである。いくつかの実施形態では、改変することは、細胞内で発現することである。いくつかの実施形態では、改変することにより、改変細胞を産生する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、本発明の改変細胞である。いくつかの実施形態では、この方法は、対象に細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与することは、細胞を対象に戻すことである。

【0223】

いくつかの実施形態では、改変することまたは発現することは、細胞が活性化された後に行われる。いくつかの実施形態では、改変することまたは発現することは、活性化された直後に行われる。いくつかの実施形態では、細胞は、活性化されている間に投与される。いくつかの実施形態では、改変することまたは発現することは、細胞が活性化されている間に行われる。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または発現する前に安定様式に戻ることができない。いくつかの実施形態では、改変することまたは発現することは、投与することに近接して行われる。一過性にロードされるカーゴの場合、エフェクター細胞中のカーゴの濃度を希釈するので、投与前に長時間改変細胞を増殖させないことが有利であることは、当業者には理解されるであろう。いくつかの実施形態では、細胞は、投与前の３、６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、または１２０時間以内に改変される。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、細胞は、投与前の２４時間以内に改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、投与前の４８時間以内に改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、投与前の７２時間以内に改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、投与前の９６時間以内に改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、投与前の１２０時間以内に改変される。いくつかの実施形態では、治療剤を改変することまたは発現することは、細胞が活性化された後に行われる。いくつかの実施形態では、標的化部分を改変することまたは発現することは、活性化の前に行われる。エフェクター細胞中で細胞傷害性タンパク質／ＣＡＲ／サイトカインおよび同様の分子を発現させるための当技術分野で公知の現在の方法では、エフェクター細胞が最初に活性化されないことは、当業者には理解されるであろう。むしろ、最初に発現が生じ、次に細胞が活性化される。本方法では、エフェクター細胞が最初に活性化される。この活性化により、細胞質が溶解性顆粒で満たされるように誘導され、発現した治療剤／キメラポリペプチドが主に顆粒に入り、その結果移入を促進することを確実にする。

【0224】

いくつかの実施形態では、改変細胞は、その顆粒（溶解性顆粒などの分泌リソソーム）内に目的のカーゴを含むように改変されている。いくつかの実施形態では、活性化後の改変により、カーゴが顆粒にロードされる。いくつかの実施形態では、目的のカーゴは、本明細書で上に開示された融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、得られた細胞または改変細胞は、さらに操作されて、グランザイム－パーフォリン経路の活性化時／活性化後の標的細胞に対する溶解効果を防止するようになる。いくつかの実施形態では、改変細胞は、リンパ球溶解性顆粒分泌タンパク質の内因性発現をノックアウトするように操作される。いくつかの実施形態では、改変細胞は、内因性グランザイムおよび／またはＦａｓＬおよび／またはＴｒａｉｌなどの細胞媒介死滅エレメントをコードする遺伝子をノックアウトするように操作される。いくつかの実施形態では、典型的には、Ｔ細胞膜上で発現し、標的細胞上のそれらのリガンドに結合したときに、アポトーシスを開始するＦａｓＬ受容体およびＴｒａｉｌ受容体の内因性発現がノックアウトされ得る。遺伝子ノックアウトは、当技術分野で知られている任意の簡便な方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による編集、特定のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡをコードする配列の導入などによって達成できる。いくつかの実施形態では、細胞は、標的化核酸分子を発現するように改変されている。

【0225】

いくつかの実施形態では、送達は、標的細胞の細胞質への送達である。いくつかの実施形態では、送達は、標的細胞の核への送達である。いくつかの実施形態では、送達は、標的細胞の細胞質または核への送達である。いくつかの実施形態では、送達は、パーフォリン孔を通す。いくつかの実施形態では、送達は、標的細胞によるエンドサイトーシスを含まない。いくつかの実施形態では、送達は、エキソソームによるものではない。いくつかの実施形態では、送達は、細胞外小胞によるものではない。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、溶解性細胞外小胞ではない。いくつかの実施形態では、送達は、標的細胞内のエンドソームを経由しない。いくつかの実施形態では、送達は、食作用によるものではない。いくつかの実施形態では、送達は、免疫シナプスへの送達である。いくつかの実施形態では、送達は、標的細胞のゲノムを編集することを含む。いくつかの実施形態では、送達は、標的細胞のゲノム遺伝子座を編集することを含む。いくつかの実施形態では、送達は、遺伝子療法を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、標的化核酸分子を標的細胞に送達することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、標的化核酸分子を対象に送達することをさらに含む。

【0226】

別の態様により、本発明のキメラポリペプチドを含むキットが提供される。

【0227】

別の態様により、本発明のポリヌクレオチドを含むキットが提供される。

【0228】

別の態様により、本発明の改変細胞を含むキットが提供される。

【0229】

別の態様により、本発明の組成物を含むキットが提供される。

【0230】

いくつかの実施形態では、キットは、細胞をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、細胞内でポリペプチドを発現させるための手段をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、細胞内で目的のタンパク質を発現させるための手段をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、細胞内でポリヌクレオチドを発現させるための手段をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の方法を実施するための説明書をさらに含む。

【0231】

別の態様により、標的細胞に治療剤を送達する方法で使用するための、本発明の改変細胞、本発明の組成物、本発明のキメラ分子を発現する改変細胞、または本発明のポリヌクレオチドを発現する改変細胞が提供される。

【0232】

別の態様により、その必要のある対象を治療する方法において使用するために、本発明の改変細胞、本発明の組成物、本発明のキメラ分子を発現する改変細胞、または本発明のポリヌクレオチドを発現する改変細胞が提供される。

【0233】

いくつかの実施形態では、使用は、改変細胞または組成物を標的細胞または対象に投与することを含む、送達／治療の方法を含む。いくつかの実施形態では、使用は、本発明の方法を含む。いくつかの実施形態では、使用は、上記に記載の方法を含む。いくつかの実施形態では、使用は、改変細胞を提供することを含む。いくつかの実施形態では、使用は、対象から細胞を抽出することを含む。いくつかの実施形態では、使用は、細胞を改変することを含む。いくつかの実施形態では、使用は、細胞を対象に戻すことを含む。いくつかの実施形態では、使用は、遺伝子療法における使用である。

【0234】

本明細書で使用する「約」という用語は、値と組み合わせる場合、参照値の±１０％を指す。例えば、長さ約１０００ナノメートル（ｎｍ）は、長さ１０００ｎｍ±１００ｎｍを指す。

【0235】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「ポリペプチド」への言及は、当業者に知られている１つ以上のポリペプチドおよびその同等物への言及を含むなどである。任意の要素をいずれも除外するように請求項を作成することができることにさらに留意されたい。このように、この記述は、特許請求要素の説明、または「否定的な」限定の使用に関連して、「単独で（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語を使用するための前提条件として役立つことを意図している。

【0236】

「Ａ、Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つ」に類似した慣行が適用される場合、一般に、そのような構成は、当業者が慣行を理解するという意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に、などのシステムを含むが、これらに限定されない）。明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する事実上任意の選言的な単語および／または句は、用語のうちの１つ、用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を考慮するように理解されるべきであることは、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解されよう。

【0237】

明確にするために、別個の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に言えば、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴は、別々に、または任意の好適な下位組み合わせで提供されてもよい。本発明に関する実施形態のすべての組み合わせは、本発明に具体的に包含され、あらゆる組み合わせが個々に明示的に開示されているかのように、本明細書に開示されている。さらに、様々な実施形態およびその要素のすべての下位組み合わせもまた、本発明によって具体的に包含され、このような下位組み合わせのすべてが、個別かつ明示的に本明細書に開示されているかのように、本明細書に開示される。

【0238】

本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴は、限定することを意図しない以下の実施例を検討することにより、当業者に明らかになるであろう。加えて、上記で説明され、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、以下の実施例において、実験的裏付けが見出される。

【0239】

上記で説明され、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、以下の実施例において、実験的裏付けが見出される。

【0240】

実施例
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような技術は、文献で詳細に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，ＲＭ，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（編）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１－４巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；以下に記載の方法米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ － Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ－ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（編），「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（編），「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらはすべて参照により組み込まれる。他の一般的な参考資料は、本明細書に提供する。

【0241】

材料及び方法
ＣＤ８ Ｔ細胞の生産および維持：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを使用した密度勾配遠心分離によって、バフィーコートから単離させた。ＰＢＭＣ細胞を収集し、予熱したＲＰＭＩ １６４０培地（ＢＩ、カタログ番号０１－１００－１Ａ）に入れ、次いでカウントし、凍結させた。凍結保存用バイアルあたり、２０００万個の細胞を凍結した。

【0242】

５ＰＢＭＣバイアル（１億個の細胞）を解凍し、５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体と３００Ｕ／ｍｌのＩＬ２を添加した完全培地１ｍｌあたり２００万個の細胞の密度で播種した。細胞を５日間培養中で維持した。培養中、各培地添加物に１００Ｕ／ｍｌのＩＬ２を添加した。

【0243】

ＣＤ８陽性細胞は、ＣＤ８単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙ ＃１３０－０９６－４９５）を使用したネガティブセレクションによって単離した。ＣＤ８細胞を、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ２を含むｃＲＰＭＩ培地に１００万細胞／ｍｌの密度で播種した。培養６～１０日目の細胞を実験に使用した。

【0244】

細胞株培養：ＹＴＳ、Ｐ８１５、およびＫ５６２細胞株を、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、および０．１ｍＭ ＭＥＭイーグル非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ培地で維持した。

【0245】

ＭＣＦ－７細胞を、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、０．１ｍＭＭＥＭイーグル非必須アミノ酸、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、および０．０１ｍｇ／ｍｌインスリンを添加したＭＥＭ－アルファ培地で維持した。ＭｅｌＡ２－およびＭｅｌＡ２＋は、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ－グルタミン、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、０．１ｍＭＭＥＭイーグル非必須アミノ酸、１．５ｇ／Ｌを添加したＤＭＥＭ培地で生育させた。

【0246】

エレクトロポレーション（ＥＰ）：各エレクトロポレーションにおいて、１～８×１０^６の細胞を回収し、Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で３回洗浄して培地を交換した。細胞をエッペンドルフチューブに１０×１０^６細胞／ｍｌの濃度で入れた。１０^６細胞あたり３～１０μｇのインサート（ＤＮＡプラスミド、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＣＡＳ９＋ｓｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ））を添加した。模擬対照のために、細胞をインサートなしでエレクトロポレートした。エレクトロポレーションは、ＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）またはＮｅｐａ２１遺伝子エレクトロポレーター（ＮｅｐａＧｅｎｅ）のいずれかを使用して行った。エレクトロポレーションの前に、細胞をＡｍａｘａ（Ｌｏｎｚａ）用の特定のエレクトロポレーションバッファまたはＮｅｐａ２１用のＯｐｔｉｍｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）のいずれかに再懸濁させた。細胞およびインサートを、Ｎｅｐａ２１用の２ｍｍエレクトロポレーションキュベットおよびＡｍａｘａ用のセルプロジェクトキュベット（Ｌｏｎｚａ）に入れた。Ｎｅｐａ２１（ＮｅｐａＧｅｎｅ Ｕｎｉｔ）によるエレクトロポレーションは、２．５ｍｓの２２５～２５０Ｖパルス長を使用して実施した。Ａｍａｘａを使用したエレクトロポレーションは、デバイスによって定義された細胞プロジェクト固有の条件を使用して実行した。

【0247】

実施完了後、４００μｌの予熱したＲＰＭＩ培地をキュベットに加え、２０～３０分回復させるために、細胞をキュベットに残存させた。細胞をキュベットから２４または６ウェルプレートに、１０^６細胞／ｍｌで移した。

【0248】

実験用に使用する前に、細胞を２時間から３日間、培養中で維持した。

【0249】

細胞のトランスフェクションは、製造業者の指示に従って行った。簡潔に言えば、トランスフェクションの前日に、３００Ｋ細胞を６ウェルプレートに播種した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ カタログ＃Ｌ３００００１５）と一緒に、２μｇのＤＮＡを用いて脂質ナノ粒子混合物を調製し、穏やかに滴下して細胞に適用した。

【0250】

移入アッセイ：０．５～１×１０^５Ｋ５６２、Ｐ８１５、またはＭｅｌＡ２＋／－標的細胞を、製造業者の指示（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ＃４２５１０１）に従って、最終濃度１．６μＭのＴａｇ－ｉｔで標識するか、ＧＦＰまたは遺伝子標的化ｓｇＲＮＡもしくはＰＮＡレポーター系でトランスフェクトし、９６ウェルＵ字型プレートに播種した。１～６×１０^５のＴ、ＹＴＳ、またはＫ５６２エフェクター細胞にＣａｓ９－ｓｇＲＮＡＲＮＰ複合体をロードするか、またはグランザイム－Ｃｈｅｒｒｙ、グランザイム－Ｃａｓ９、グランザイム－メガヌクレアーゼ、またはグランザイム－メガヌクレアーゼ－ＧＦＰ融合構築物を発現させ、標的細胞と一緒に培養する。細胞を３７℃で２～１６時間共培養した。遺伝子編集タンパク質を標的細胞に導入した結果として発生した特定の遺伝子編集イベントについて、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、またはその後の対象遺伝子のゲノム配列分析によって、融合タンパク質またはＲＮＰの移入をモニターした。リダイレクト移入アッセイのために、Ｐ８１５標的細胞を室温で、２μｇ／ｍｌのＯＫＴ－３抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃ ＢＬＧ－３１７３２６）を含むＰＢＳで１時間プレコートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、標的細胞と共培養した。エフェクター細胞との共培養の前に、標的細胞を汎カスパーゼ阻害剤Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＦＭＫ００１）で、５０μＭで２時間処理し、その濃度をエフェクター細胞の添加後も維持し、細胞選別処置を行った。

【0251】

ＦＡＣＳ分析のための細胞染色：共培養後、細胞の生存率について、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）ブルー４５０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号６５－０８６３－１８）または近赤外６３３／６３５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ｌ１０１１９）を使用して染色した。青色および近赤外生存率色素、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅｅ Ｆｌｕｏｒ（商標）４５０および６３３／６３５染色は、室温で１００マイクロリットルのＵ字型９６ウェルプレートで実施した。サンプルの取得は、以下のデバイスで行った：５レーザーＦｏｒｔｅｓａセルアナライザー（ＢｉｏＲａｄ）、ＭａｃｓＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙ）、またはＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩセルソーター。生存率色素の測定に加えて、細胞は、ＧＦＰ、ＰＮＡ ＲＦＰ、およびｍＣｈｅｒｒｙシグナルについてもモニターした。蛍光分析の前に、前方側方散乱ゲートは、各細胞型についてそれ自体で決定された各細胞型固有の散乱パターンに従って最初に配置した。ｍＣｈｅｒｒｙシグナル解析では、ＧＦＰ発現またはＴａｇ－ｉｔ標識に基づいて、標的細胞を選択した。ＰＮＡレポーター系を発現する細胞を分析するために、ＧＦＰ発現は、ＲＦＰ発現についてゲーティングした細胞において判定した。抗Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ａｂｃａｍ ｃａｔ＃ａｂ１９１４６８）および抗グランザイムＢ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ＃５１５４０６）を使用した細胞内染色は、製造業者の指示に従って、細胞内Ｃｙｔｏｆｉｘ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ＃４２０８０１）バッファおよびＰｅｒｍ Ｗａｓｈ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ＃４２１００２）を用いて行った。分析は、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）またはＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤｅＮｏｖｏ）ソフトウェアを使用して実施した。セルソーティングでは、Ｔａｇ－ｉｔまたはＲＦＰシグナルの２つの対数差に基づいて、標的細胞集団を単離した。その後、Ｔ細胞またはＹＴＳ細胞との共培養後に選別された標的細胞に、最終濃度５０μＭの汎カスパーゼ阻害剤Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ＃ＦＭＫ００１）および濃度を増加させた２％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加した。蛍光顕微鏡：ＧＦＰ、ＲＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の画像は、ＯｂｓｅｒｖｅｒＺ１（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡およびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、露光範囲２～２００ミリ秒で得た。

【0252】

グランザイムノックダウン：ＰＢＭＣは、前述のとおり単離した。活性化されたＴ細胞は、ＨＬＡ－２バックグラウンドで黒色腫細胞に対して操作された抗原特異的ＴＣＲを運ぶレトロウイルスにより形質導入した。２日後、形質導入されたＴ細胞を収集し、６ウェルプレートに３回播種した。

【0253】

次に、ＧＺＭＢ－ＣＡＳ９融合タンパク質および内因性グランザイムＢに対するｓｉＲＮＡを用いて、細胞をエレクトロポレートした。グランザイムＢｓｉＲＮＡは、内因的に発現したグランザイムＢの３’ＵＴＲを標的とするように設計した。ｓｉＲＮＡは、グランザイムＢのオープンリーディングフレームのみを含むグランザイムＢ－Ｃａｓ９融合ｍＲＮＡを認識しない。ｓｉＧｚｍＢ－１およびｓｉＧｚｍＢ－２（ＡｘｏＬａｂ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の２つのｓｉＲＮＡを設計し、合成した。ｓｉＲＮＡ活性を評価するために、Ｔ細胞に、３００ｐｍｏｌのｓｉＧｚｍＢ－１またはｓｉＧｚｍＢ－２のいずれかをエレクトロポレートし、グランザイムＢ抗体およびＦＡＣＳ分析を使用して、グランザイムＢタンパク質レベルについて試験を行った。
ｓｉＧｚｍＢ‐１センス鎖:5’g*g*AgCcAaGuCcAgAuUuA-3’（配列番号４５）アンチセンス鎖5’-U*A*aAuCuGgAcUuGgCuCc*u*u-3’（配列番号４６）ｓｉＧｚｍＢ‐２センス鎖5’-c*g*CuGuAaUgAaAcAcCuU-3’（配列番号：４７）アンチセンス鎖５’-A*A*gGuGuUuCaUuAcAgCg*u*u-3’（配列番号：４８）小文字のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル残基を表す。大文字のヌクレオチドは、２’－フルオロ残基を示す。「*」は、ホスホロチオエート主鎖の改変を示す。細胞は、空のベクターで模擬調製するか、ｈＧＺＭＢ＿ｃｒｍＣｈｅｒｒｙのみをエレクトロポレートするか、または発現プラスミドおよびｓｉＲＮＡを二重にエレクトロポレートした。

【0254】

翌日、標的細胞を調製した。ＨＬＡ－Ａ２を発現するかまたは発現しないＭＡＲＴ１発現黒色腫細胞株を使用した。両方の細胞株をＣＦＳＥで染色して、エフェクターＴ細胞と区別した。リンパ球細胞の各ウェルを２つに分割して複製プレートを作成し、２．５×１０^４の標的細胞を各ウェルに加えた。細胞を３時間共培養し、フローサイトメトリーにより分析してｃｒｍＣｈｅｒｒｙの移入を測定した。

【0255】

ＲＮＡ－タンパク質複合体の生成およびヌクレオフェクション：Ｃａｓ９タンパク質（Ａｌｔ－Ｒ Ｓｐ Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ３、ＩＤＴ）またはＣａｓ９－ＧＦＰ（ＣＡＳ９ＧＦＰＰＲＯ、Ｓｉｇｍａ）を合成修飾ｓｇＲＮＡと混合した。最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に、２’－Ｏ－メチルおよび３’ホスホロチオエートヌクレオチド連結を有する、ＥＭＸ１＿１、Ｒｏｓａ２６＿１、ＧｚｍＢ＿１、およびＧｚｍＢ＿２を、Ｓｙｎｔｈｅｇｏから注文した。ｓｇＲＮＡ配列および標的遺伝子については、表２を参照されたい。ＨＢＢ１ ｓｇＲＮＡは、ＡｘｏＬａｂに注文し、オリゴ全体c*u*u*GCC*C*Cf*Af*Cf*AfGGfGfCAGfUfAAgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAc*u*u*g*a*a*a*a*a*gugG*ca*c*c*g*a*g*u*cg*g*u*g*c*u*u*u*u*uに沿って複数の改変を加えた。大文字は、非改変ＲＮＡを示す。小文字は、２’－Ｏ－メチル残基を示す。「ｆ」は、２’－フルオロ残基を示す。「＊」は、ホスホロチオエート骨格の改変を示す。ＲＮＡタンパク質の調製では、４００～５７３ｐｍｏｌのＣａｓ９またはＣａｓ９－ＧＦＰを４８０～６８７ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ対Ｃａｓ９タンパク質の比率を１．２～１．３に維持）と混合し、室温で１０～２０分間インキュベートした。ＲＮＡ－タンパク質複合体および４００～５７１ｐｍｏｌのエレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）を、エレクトロポレーションの直前に細胞に添加した。

【表2】

【0256】

ＲＮＡ－タンパク質複合体移入アッセイ：１０^５Ｔａｇ－ｉｔ標識標的細胞またはＡｂコーティング標的細胞（活性化用）を、９６ウェルＵ型プレートに播種した。２時間のインキュベーション後、標的細胞を洗浄し、ヌクレオフェクション後の６×１０^５エフェクター細胞（Ｔ、Ｋ５６２またはＹＴＳ細胞）を標的細胞に添加した。１０μｌのカスパーゼ－８阻害剤を最終濃度５０μＭで再度添加した。細胞を３７℃で４時間共培養した。

【0257】

ＳＤＳ Ｐａｇｅエレクトロポレーション用サンプルの調製：細胞をＲＩＰＡバッファで溶解した（細胞ペレット体積の２０倍）。ＲＩＰＡバッファは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０（ＮＰ－４０）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、および０．１％ＳＤＳを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０であった。細胞を４℃で３０分間溶解し、続いて１４０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、タンパク質濃度をブラッドフォード試薬で測定した。タンパク質濃度を内挿するために、ＯＤ値をＢＳＡ量とＯＤの参照グラフにプロットした。

【0258】

サンプルを４Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１６１０７４７）に１：４で混合し、７０℃で１０分間加熱した。サンプルは、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｍｉｄｉ Ｇｅｌｓで泳動した。泳動条件は、Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ実施バッファ（Ｂｉｏｒａｄカタログ＃１６１－０７７２）において、５０分間、２００Ｖであった。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ ＴＵＲＢＯ （ＢｉｏＲａｄ Ｃａｔ＃１７０４１５９）を使用して、２．５Ａおよび２５Ｖで１０分間、ゲルを転写した。

【0259】

イムノブロッティング：ブロッキングは、３％ ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃａｔ＃９９９７Ｓ）（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、室温（ＲＴ）で１時間行った。使用した一次抗体は、ウサギ抗Ｃａｓ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｔ＃ ６３２６０７）であった。これをブロッキング溶液で１：２５００に希釈し、室温で１．５時間インキュベートした。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｃａｔ＃１１５－０３５－０６２）であった。これをブロッキング溶液で１：１００００に希釈して、室温で１時間インキュベートした。ローディングの均一性を確認するために、ブロットをポンソーレッドで染色した。

【0260】

実施例１：初代Ｔ細胞およびＮＫ細胞株ＹＴＳは、グランザイム－Ｃｈｅｒｒｙタンパク質を標的細胞に効率的に移入させる
目的のタンパク質を標的細胞に移入させるグランザイムＢ融合タンパク質の能力の試験を行うために、グランザイムＢ－ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を作製した。ｍＣｈｅｒｒｙを使用した（配列番号１）。最初の１１のアミノ酸、ＭＶＳＫＧＥＥＤＮＭＡ（配列番号４）は、可能性のある切断部位のために除去された。これにより、ここでも蛍光性短縮タンパク質ｃｒｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号３）が産生された。不活性なヒトグランザイムＢ（Ｇ１９Ａ／Ｅ２０Ａ）を、間にグリシン－セリンリンカー（配列番号１１）を用いて、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙのＮ末端に配置した。この融合タンパク質をコードする核酸配列をｐＭＡＸ発現ベクターに挿入して、ｐＭＡＸ－ｈＧＺＭＢ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙベクター（配列番号２９）を産生した（図１）。

【0261】

グランザイムＢ＿ｃｒｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質の細胞内局在プロファイルを評価するために、健康なドナーから単離させた初代ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞中で、ｐＭＡＸ－ｈＧＺＭＢ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙベクターを発現させた。エレクトロポレートした細胞には、Ｃｈｅｒｒｙ蛍光が確認された。

【0262】

ヒトＫ５６２慢性骨髄性白血病細胞（ヒト赤白血病細胞株）を標的細胞として使用した。細胞には、ｐＭａｘＧＦＰベクターをエレクトロポレートし、ＧＦＰ蛍光が標的細胞中で確認された。初代Ｔ細胞もＧＦＰ陰性であることが確認され、Ｋ５６２細胞は、Ｃｈｅｒｒｙ陰性であることが確認された。

【0263】

エレクトロポレートした初代Ｔ細胞を、エレクトロポレートしたＫ５６２細胞とエフェクター対標的比６：１で、４時間共培養した。共培養後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。Ｋ５６２細胞は、前方散乱および側方散乱のみを使用して、標的細胞集団をゲーティングすることにより分離できた（図２Ａ）。さらに確実にＫ５６２細胞のみが分析されるようにするために、この集団内でＧＦＰ陽性細胞を選択した（図２Ｂ）。Ｃｈｅｒｒｙの発現についてこのＧＦＰ陽性集団を分析した場合に、高度にＣｈｅｒｒｙ陽性であることを見出した（図２Ｃ）。実際、ＧＦＰ陽性Ｋ５６２細胞の９０％以上（９４．８％）がＣｈｅｒｒｙ陽性でもあることも見出した。空のベクターでエレクトロポレートした対照細胞を共培養に使用した場合、Ｋ５６２細胞は、予測どおり１００％Ｃｈｅｒｒｙ陰性であった（図２Ｃ）。

【0264】

これらの実験は、初代Ｔ細胞の代わりに、ＹＴＳ ＮＫ細胞株の細胞を用いて繰り返した。共培養後、Ｋ５６２細胞は、最初に前方散乱および側方散乱に基づいて、次にＧＦＰ発現に基づいて再びゲーティングした。標的癌細胞は、高度にＣｈｅｒｒｙ陽性であることがここでも判明し、細胞の８８．１％がＣｈｅｒｒｙを発現することが判明した（図２Ｄ）。これらの結果をまとめると、Ｔ細胞およびＮＫ細胞が、グランザイム融合タンパク質を標的細胞に移入できる効率が高いことが示されている。重要なことに、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙ発現プラスミドのみのコード領域のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物（グランザイムへの融合なし）を、ＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳ細胞中で発現させた場合、Ｔａｇ－ｉｔ陽性Ｋ５６２標的細胞へのＣｈｅｒｒｙの移入は、観察されなかった（図２Ｅ）。

【0265】

実施例２：グランザイムＢノックダウンおよび／またはノックアウトは、グランザイムＢ－ｃｒｍＣｈｅｒｒｙの標的細胞への移入を増強する
外因性グランザイムＢ融合タンパク質の移入に対する内因性グランザイムノックダウンの効果を試験するために、内因性グランザイムＢのみに対するｓｉＲＮＡ分子を利用した（材料および方法を参照されたい）。初代ヒトＴ細胞を単離し、ＭＡＲＴ１に応答し、ＨＬＡ－Ａ２に制限される抗原特異的に操作されたＴＣＲを保有しているレトロウイルスベクターで形質導入した。これらの細胞は、内因性グランザイムＢのｓｉＲＮＡノックダウンの有無にかかわらず、ｈＧＺＭＢ＿ｃｒｍＣｈｅｒｒｙ（図１のプラスミド１＿３）をコードするｍＲＮＡ ＩＶＴ産物でもエレクトロポレートした。

【0266】

このアッセイで使用される標的黒色腫細胞は、ＨＬＡ－Ａ２および表面黒色腫抗原ＭＡＲＴ１、またはＭＡＲＴ１のみを発現し、ＨＬＡ－Ａ２は発現しない。これらの標的細胞は、ＣＦＳＥで染色されており、Ｔ細胞と容易に区別できる。Ｔ細胞を標的黒色腫細胞と４時間共培養し、ＣＦＳＥ陽性細胞中でのＣｈｅｒｒｙの発現を評価した。ＨＬＡ－Ａ２発現黒色腫細胞では、内因性グランザイムＢをノックダウンさせたＴ細胞は、非ノックダウン細胞と共培養させた場合と比較して、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光細胞の産生を２５％増加させた。

【0267】

さらに、内因性グランザイムＢがノックアウトされた細胞株を生成した。ＹＴＳ細胞は、ＣＲＩＳＰＲノックアウトのためのＲＮＡ－タンパク質複合体を用いて、Ｎｅｐａ遺伝子エレクトロポレーター（２００ボルト、５ｍｓ）によってエレクトロポレートした。Ａｌｔ－Ｒ（商標）Ｓ．ｐ．Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｖ３（ＩＤＴ）をＧｚｍＢ＿１（配列番号５１）またはＧｚｍＢ＿２（配列番号５２）合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）と一緒に、グランザイムＢに対してインキュベートし、安定したＲＮＡ－タンパク質複合体を産生した。ＹＴＳ細胞には、ｓｇＲＮＡＧｚｍＢ＿１のみ、ＧｚｍＢ＿２のみを含むＲＮＡ－タンパク質複合体、または両方の複合体を比率１：１で混合したもののいずれかを、エレクトロポレートした。これらの複合体をＹＴＳ細胞にエレクトロポレートし、細胞を３日間培養して回復させた。ＹＴＳ細胞におけるグランザイムＢの発現は、培養１０日後に測定した。図３Ａに示すように、ＲＮＡタンパク質ＧｚｍＢ＿１がエレクトロポレートされたＹＴＳ細胞は、親ＹＴＳ細胞と比較して、グランザイムＢ発現のほぼ９５％の減少を示した。ＲＮＡ－タンパク質ＧｚｍＢ＿２またはＧｚｍＢ＿１とＧｚｍＢ＿２との混合物をエレクトロポレートしたＹＴＳ細胞は、グランザイムＢ減少率が有意に低いことを示した（データは示していない）。

【0268】

ノックアウト細胞が実際に細胞傷害効果を低下させたことを確認するために、ＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳ細胞をＫ５６２標的細胞と２４時間または４８時間共培養した。２４時間の共培養では、未処理細胞に典型的な前方散乱内でゲーティングされたＫ５６２細胞の割合は、ＧＺＭＢ ＫＯ細胞と共培養されたＫ５６２細胞において、非ＫＯ ＹＴＳ細胞と共培養されたものと比較して有意に高かった。これは、非ノックアウト細胞と共培養された細胞中において、平均ＦＣＳが高いことを確認できる（図３Ｂ）。グランザイムＢを発現する親ＹＴＳと共培養されたＫ５６２のサイズの有意な増加は、パーフォリン－グランザイム細胞死経路の結果として誘導される典型的な浸透圧不安定性であり、ナイーブ未処理Ｋ５６２細胞と同様のサイズおよび粒度を示す、ＧＺＭＢ ＫＯ ＹＴＳ細胞と共培養されたＫ５６２には見られない。

【0269】

ＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳ細胞の細胞傷害効果の低下をさらに検証するために、Ｋ５６２細胞の生存率について、親またはＫＯ ＹＴＳ ＮＫ細胞との４８時間の共培養後に試験した。細胞は、本明細書で上述したように、生存染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。図３Ｄに見られるように、ＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳ細胞と培養されたＫ５６２細胞は、親ＹＴＳ細胞と共に培養されたＫ５６２（６０％）と比較して、死細胞染色の減少（３６％）を示す。したがって、ＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳ細胞株は、親ＹＴＳ細胞株と比較して、細胞傷害性／溶解活性の低下を示した。

【0270】

この同じ共培養系を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙの移入を確認した。ＧＺＭＢ－ＫＯ細胞および親ＹＴＳ細胞を、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙに融合したグランザイムを発現するプラスミド（図１のプラスミド１＿３）でトランスフェクトした。次に、前述のとおり（実施例１）、それらをＫ５６２細胞と４時間共培養し、標的細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を測定した。図３Ｃで見られるように、ＫＯ細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙを効率よく移入するのみでなく、実際に移入効率も増加し（ＫＯでは陰性細胞よりもＭＦＩ比が４．６倍増加するのに対しＷＴグランザイムでは２．８倍）、ここでも、非細胞傷害性細胞、特にＧＺＭＢ－ＫＯ細胞を移入に使用することの優位性を証明している。

【0271】

これらの結果をまとめると、強力な送達ビヒクルとして、細胞傷害性が低下したエフェクター細胞が示される。

【0272】

実施例３：Ｃａｓ９に融合したグランザイムＢの標的細胞への移入
不活性なグランザイムＢにより、ｍＣｈｅｒｒｙを標的細胞に首尾よく移入できることが確立されたので、次に、この方法で顕著に大きいタンパク質が移入され、標的細胞内に酵素活性を保持できるかについて、試験を行った。ｍＣｈｅｒｒｙは、わずか約２７ｋＤａの分子量を有し、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙは、さらに小さく、わずかに約２５．５ｋＤａの分子量を有する。対照的に、ゲノム編集タンパク質であるＣａｓ９は、１６３ｋＤａを超える分子量を有する。第２のゲノム編集タンパク質である、ＰＣＳＫ９に特異的なメガヌクレアーゼも調査した。メガヌクレアーゼは、約３７ｋＤａの分子量を有する。

【0273】

完全なＣａｓ９コード配列は、ｐＭａｘ発現プラスミドにおいて、グランザイムＢの後に、それらの間のリンカー（ＧＳリンカー）と共に配置した（図１を参照）。Ｃａｓ９には、Ｎ末端ＨＡタグも含めた。プラスミドを受け入れた細胞を容易に追跡するために、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙをＣａｓ９の下流に挿入した。Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは、Ｃａｓ９とｃｒｍＣｈｅｒｒｙとの間に配置した。これにより、結果として、効率よくエレクトロポレートされた細胞中で、Ｃｈｅｒｒｙが発現するが、Ｃｈｅｒｒｙは、グランザイムから離されるため、顆粒球小胞に到達すること、または移入されることは期待されない。実際に、ｐＭＡＸ－ｈＧＺＭＢ＿ＨＡ－Ｃａｓ９＿Ｐ２Ａ＿ｃｒｍＣｈｅｒｒｙベクターをＨＥＫ２９３細胞で発現させた場合、Ｃｈｅｒｒｙは、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙを単独で発現させた場合に観察されたものと同様の散在性細胞質染色を有していた。対照的に、Ｃａｓ９は、グランザイム＿ｃｒｍＣｈｅｒｒｙについて観察されたものと同様の小胞への侵入を示す点状染色を示した（データは示していない）。メガヌクレアーゼもグランザイムＢに連結し、ＯＬＬＡＳフレキシブルリンカーを用いた。メガヌクレアーゼは、Ｃａｓ９よりもはるかに小さいため、ＧＦＰは、Ｐ２Ａペプチドを必要とせずに、メガヌクレアーゼ自体に直接結合され得る（図１を参照）。

【0274】

新しい融合タンパク質がＤＮＡ編集活性を保持していることを確認するために、レポーター系（ＰＮＡ Ｂｉｏ）を使用した。グランザイムＢは、十分に大きいタンパク質であるため、特にリンカーが切断可能でない場合、編集タンパク質の機能を損ない得るという懸念がある。ＰＮＡレポーター系は、特定の編集標的化配列によって連結されている２つの蛍光タンパク質（ＲＦＰおよびＧＦＰ）をコードする遺伝子を運ぶ。ＲＦＰおよびＧＦＰコード配列は、赤を発現するように設計されており、緑の蛍光タンパク質はフレーム外に配置されているため発現しない。系には、２つのＧＦＰコード配列が含まれるが、１つは、ＲＦＰから－１フレームシフトに配置され、もう１つは、ＲＦＰから－２フレームシフトに配置される。編集ヌクレアーゼが発現したときに、ＲＦＰとＧＦＰ発現配列との間の編集標的部位に、二本鎖の破断が誘導され、これにより、フレームシフト突然変異およびＧＦＰの発現が生じる。細胞内のＲＦＰによって正規化されたＧＦＰ発現の後に、編集ヌクレアーゼが機能的に切断しているか、およびどの程度切断しているかが示される。融合されたＣａｓ９の編集効率を評価するために、Ｋ５６２細胞を、Ｎｅｐａ遺伝子エレクトロポレーター（２５０ボルト２．５秒）によって、ＥＭＸ１＿１－ＰＮＡレポーター系プラスミド（ＰＮＡＢｉｏ）５～８μｇ、およびＥＭＸ１＿１ガイド発現プラスミド（配列番号４９）２μｇを、エレクトロポレートした。ＥＲシグナルペプチド（ＥＲＳＰ）を含まないＧＺＭＢ－ＣＡＳ９融合タンパク質を発現させ（２μｇ）、陽性対照として、Ｃａｓ９発現プラスミド（青色蛍光タンパク質に融合したＣａｓ９ ２μｇ）も発現させた。ＥＲＳＰの除去は、Ｋ５６２細胞内での融合タンパク質の細胞質発現および核局在化を確実にするために必要であった。同じ実験を、ＥＲＳＰを含まないメガヌクレアーゼ融合タンパク質の発現（２μｇ）およびＰＣＳＫ９－ＰＮＡレポーター系プラスミド（５μｇ）を用いて実施した。メガヌクレアーゼ発現プラスミドを陽性対照として使用した（２μｇ）。３日間の培養後、編集効率は、ＦＡＣＳ分析によってＲＦＰシグナルに対して正規化されたＧＦＰシグナルを追跡することによって評価した。結果を表３に示す。ＣＡＳ９またはメガヌクレアーゼを含む融合タンパク質は、両方ともその機能を保持していた。

【表3】

【0275】

次に、内因性ゲノムを編集する融合タンパク質の能力の試験を行った。ＰＮＡ系では、標的プラスミドの多くのコピーが特定の細胞中に存在する可能性があり、編集の可能性がより高くなる。しかし、内因性二倍体ゲノムには、標的配列のコピーが２つのみ存在する。融合タンパク質が、内因性標的を切断する能力の試験を行うために、同様の実験をＰＮＡプラスミドを含まない場合にのみ実施した。対照プラスミドおよび試験プラスミドは、Ｋ５６２細胞で発現させた。ｓｇＲＮＡは、ＣＡＳ９プラスミドと共に発現した。３日間の培養後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。編集標的に隣接する領域をＰＣＲ（Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ＮＥＢ）によって増幅させ、産物を次世代シーケンシングに送信した。使用したプライマーを表５に示す。編集イベントの数は、リードの総数に対して計算し、編集効率は、ＦＡＣＳ分析によって決定された蛍光細胞（インサート陽性イベントを示す）に対して正規化した。ゲノム編集の結果を表４にまとめる。ＣＡＳ９またはメガヌクレアーゼを含む融合タンパク質は、両方ともゲノム編集機能を保持していた。

【表4】

【表5】

【0276】

ここでは、融合タンパク質が依然として機能的に編集を誘導できることが確認されたので、次に、グランザイムＢおよびパーフォリン発現細胞における融合タンパク質の発現プロファイルを評価した。ｐＭＡＸ－ｈＧＺＭＢ＿ＨＡ－Ｃａｓ９＿Ｐ２Ａ＿ｃｒｍＣｈｅｒｒｙベクターを初代ＣＤ８Ｔ細胞にエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの４８時間後、細胞を抗グランザイムＢ抗体および抗Ｃａｓ９で染色し、ｃｒｍＣｈｅｒｒｙと共に撮像した。４つの代表的な細胞を示す図４Ａで見ることができるように、Ｃａｓ９およびグランザイムＢは小胞内に共局在する一方で、ｍＣｈｅｒｒｙは、拡散した細胞質ゾルパターンを示した。これは、大きいサイズであっても、Ｃａｓ９が、リンパ球内の溶解性顆粒に進入できることを示している。

【0277】

ここでは、グランザイムＢおよびパーフォリンを発現するエフェクター細胞中で、融合タンパク質が、溶解性顆粒の特徴的な発現プロファイルで発現することが確認されたので、次に、グランザイムＢに融合したＣＡＳ９およびメガヌクレアーゼのエフェクターから標的細胞への移入を評価した。１×１０^６のＹＴＳ細胞に、グランザイムＢ－ＣＡＳ９をコードする１０μｇのｍＲＮＡ ＩＶＴ産物を、２２５Ｖ、パルス長２．５ｍｓでＮｅｐａ遺伝子ユニットを用いて、エレクトロポレートした。融合タンパク質発現細胞を標的細胞（Ｋ５６２）とエフェクター対標的細胞比１：６で４時間共培養し、Ｃａｓ９の移入をモニターした。標的細胞は、Ｔａｇ－ｉｔ標識されているため、Ｔａｇ－ｉｔ蛍光によってＮＫ細胞から容易に分離することができた（図４Ｂ）。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ ＦＡＣＳソーターを使用して、Ｔａｇ－ｉｔ陽性細胞の分離後、選別された細胞を溶解し、ウエスタンブロットにかけた。これらの細胞におけるＣａｓ９タンパク質の発現は、抗Ｃａｓ９抗体を用いたブロットハイブリダイゼーションによって決定した。図４Ｃに見ることができるように、ＣＡＳ９タンパク質は、Ｋ５６２細胞中で検出可能であり、これは、このような大きなタンパク質でさえ、溶解性顆粒によって効果的に移入し得ることを示している。特に、リンパ球自体で、２つのバンドが検出される。これらは、切断前のグランザイム－ＣＡＳ９融合タンパク質（予測サイズ１９０ｋＤａ）および既に切断されたＣＡＳ９（予測サイズ１６０ｋＤａ）である。溶解小胞において切断が進行しているため、両方のタンパク質が検出される。標的細胞では、この時点までに、ＣＡＳ９がグランザイムから完全に分離されているため、下のバンドのみが検出される。

【0278】

次に、ＹＴＳノックアウトエフェクター細胞（上記のように生成）を使用して、グランザイム－ＣＡＳ９融合タンパク質のＫ５６２標的細胞への移入を評価した。ノックアウトエフェクター細胞では、内因性グランザイムＢが産生されないため、Ｔａｇ－ｉｔ陽性Ｋ５６２標的細胞中で、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗グランザイムＢ抗体による細胞内染色を使用して、グランザイムＢのＦＡＣＳ検出によって、標的細胞への融合タンパク質の移入を評価した。図４Ｄに見られるように、グランザイムＢは、ＧＺＭＢ－ＣＡＳ９発現ＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳと共に培養したＫ５６２細胞には明らかに存在したが、モックトランスフェクトＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳ細胞と共に培養したＫ５６２細胞には存在しなかった。これは、ＧＺＭＢ－ＫＯ ＹＴＳエフェクター細胞が、ＧＺＭＢ－ＣＡＳ９融合タンパク質を移入できることを明確に示している。

【0279】

実施例４：グランザイム媒介移入後の遺伝子編集
グランザイムの融合によって移入されたＣＡＳ９およびメガヌクレアーゼが、標的細胞においてゲノム編集を行う能力を評価した。ＣＤ８細胞は、前述のとおり、単離し、活性化させた。ＣＤ８細胞およびＹＴＳ細胞へのグランザイム－Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションは、前述のとおり実施した。Ｋ５６２および黒色腫標的細胞を前述のとおり共培養し、ＥＭＸ＿１ ｓｇＲＮＡをコードするプラスミドおよび切断標的領域にＥＭＸ配列を有するＰＮＡ－レポータープラスミドを用いて、エレクトロポレートした。標的細胞は、パルス長２．５ｍｓ、２５０Ｖで、ＮｅｐａＧｅｎｅユニットを用いて、エレクトロポレートした。細胞を回復させ、１０^５の細胞を、Ｕ字型プレートに播種した。これに、グランザイム－Ｃａｓ９またはグランザイム－メガヌクレアーゼを含む６×１０^５のＴ細胞またはＹＴＳ細胞を添加した。インサートなくエレクトロポレートしたＴ細胞またはＹＴＳ細胞を、対照として使用した。細胞を４時間共培養した。ＲＦＰ陽性標的細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ ＦＡＣＳソーターによってＲＦＰ陰性エフェクター細胞から分離し、ＲＦＰ陽性集団内のＧＦＰを遺伝子編集イベントのエビデンスとしてモニターした。図５Ａ～Ｂで見ることができるように、ＲＦＰ陽性細胞におけるＧＦＰの発現によって証明されるように、標的細胞において切断が生じた。したがって、グランザイムＢとの融合によって、ＣＡＳ９をエフェクターから標的細胞に移入させることができるのみでなく、ＣＡＳ９が標的細胞中で完全に機能し、編集を誘導できることは明白である。同様の結果が、Ｔ細胞（図５Ｂ）およびＹＴＳ細胞（図５Ａ）を用いて、標的Ｋ５６２および黒色腫細胞の両方で得られた。

【0280】

ＹＴＳ細胞によって移入させたグランザイム－Ｃａｓ９の編集効率も、グランザイムとＣＡＳ９との間に酸性ｐＨで切断されることが予測されるリンカー配列（配列番号２）を有するＧＺＭＢ－ＣＡＳ９融合タンパク質を使用して評価した（プラスミド１＿６、配列番号３３）。この構築物のコード領域のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物を、前述のとおりＹＴＳ細胞にエレクトロポレートした。切断標的領域にＥＭＸ配列を有するＰＮＡ－レポータープラスミドおよびＥＭＸ＿１ ｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを発現するＫ５６２標的細胞内のＣＡＳ９の編集活性の試験を行った。ＧＺＭＢ－ＣＡＳ９を発現するエフェクター細胞を、上記のＫ５６２標的細胞と共培養した。４時間の共培養後、本明細書で上述したようにＲＦＰシグナルに基づいて標的細胞を選別し、３日間生育させた。編集効率は、ＦＡＣＳ分析によってＲＦＰシグナルに対して正規化されたＧＦＰシグナルを追跡することによって評価した。図５Ｃに示すとおり、ＧＺＭＢ－ＣＡＳ９発現ＹＴＳエフェクター細胞と共に培養されたＫ５６２標的細胞において、モックトランスフェクトエフェクターＹＴＳ細胞と共に培養されたＫ５６２標的細胞と比較して、ＧＦＰ蛍光の実質的に３倍のシフトが観察される。これは、ＹＴＳ ＮＫ細胞によってＫ５６２標的細胞に移入させたＣＡＳ９が、溶解性顆粒の酸性ｐＨにおいてＧＺＭＢから分離された後でも編集機能を保持していることを示している。

【0281】

ＹＴＳ細胞によって移入させたグランザイム－メガヌクレアーゼの編集効率は、ＧＺＭＢ－メガヌクレアーゼ融合タンパク質（プラスミド２＿４；配列番号６９）を用いて評価した。この構築物のコード領域のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物を、前述のとおりＹＴＳ細胞にエレクトロポレートした。切断標的領域にＰＣＳＫ９配列を有するＰＮＡ－レポータープラスミドを発現する、Ｋ５６２標的細胞内のＰＣＳＫ９－メガヌクレアーゼの編集能力の試験を行った。エフェクター細胞と標的細胞との間の共培養およびＲＦＰ陽性標的細胞の選別は、本明細書で上述したように行った。編集効率は、ＦＡＣＳ分析によってＲＦＰシグナルに対して正規化されたＧＦＰシグナルを追跡することによって、３日後に評価した。図５Ｄに示すとおり、モックトランスフェクトエフェクターＹＴＳ細胞と共に培養されたＫ５６２標的細胞と比較して、ＧＺＭＢ－メガヌクレアーゼ発現ＹＴＳエフェクター細胞と共に培養されたＫ５６２標的細胞において、ＧＦＰ蛍光の実質的なシフトが観察される。これは、ＧＺＭＢ－メガヌクレアーゼ融合タンパク質が、ＹＴＳ ＮＫ細胞によってＫ５６２標的細胞に移入され、その編集機能を保持していることを示している。

【0282】

ＹＴＳ細胞によって移入させたグランザイム－Ｃａｓ９の編集効率も、グランザイムとＣＡＳ９との間に酸性ｐＨで切断されることが予測されるリンカー配列（配列番号２）を有するＧＺＭＢ－ＣＡＳ９融合タンパク質を使用して評価した（プラスミド１＿６、配列番号３３）。この構築物のコード領域のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物を、前述のとおりＹＴＳ細胞にエレクトロポレートした。切断標的領域におけるルシフェラーゼ配列およびルシフェラーゼ＿ｓｇＲＮＡを有するＰＮＡ－レポータープラスミドをコードするプラスミドを発現するＫ５６２標的細胞内のＣＡＳ９の編集活性の試験を行った（配列番号７５）。上記のグランザイムＢ－ＣＡＳ９を発現するエフェクター細胞を、上記のＫ５６２標的細胞と共培養した。細胞を共培養で４８時間生育させた後、ＤＮＡ抽出およびルシフェラーゼｓｇＲＮＡの認識部位の隣接領域におけるＰＣＲ増幅によって、編集効率を評価した。ＹＴＳの媒介によるグランザイムＢ－ＣＡＳ９の移入により、Ｋ５６２細胞中で１５．７％の編集が行われた。これは、ＹＴＳ ＮＫ細胞によってＫ５６２標的細胞に移入させたＣＡＳ９が、溶解性顆粒の酸性ｐＨで、ＧＺＭＢから分離された後でも編集機能を保持していることを示している。

【0283】

外因性ＰＮＡプラスミドの編集を示したので、内因性ゲノムの編集の試験を行った。共培養におけるグランザイムＢ－ＣＡＳ９融合タンパク質の移入によって媒介されるゲノム編集は、本明細書で上述したように行った。標的細胞には、ｍＣｈｅｒｒｙに融合したＥＭＸ－１ ｓｇＲＮＡをコードするプラスミドをエレクトロポレートした。４時間の共培養後、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルに基づいて標的細胞を選別し、３日間のインキュベーション後、ゲノムＤＮＡを抽出した。編集されたリードは、次世代シーケンシングによって定量化した。Ｔ細胞移入グランザイムＢ－ＣＡＳ９融合タンパク質では、黒色腫細胞で２％、Ｋ５６２細胞で１．２５％の編集が生じ、Ｋ５６２細胞へのＹＴＳ細胞移入では、生細胞および移入効率に対して正規化し、０．７１％の編集が生じた。これは、グランザイム媒介移入によってゲノム編集タンパク質を受け取った標的細胞中で、内因性編集が可能であることを示している。

【0284】

グランザイムＢ媒介送達後、標的細胞のゲノム内で遺伝子編集を行なうＰＣＳＫ９特異的メガヌクレアーゼの能力を評価した。プラスミド２＿４からのグランザイム－メガヌクレアーゼのコード領域のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物のＹＴＳ細胞へのトランスフェクションは、前述のとおり実施した。Ｋ５６２標的細胞は、本明細書で上述したようにＴａｇ－ｉｔで標識した。エフェクター細胞および標的細胞を４時間共培養した後、Ｔａｇ－ｉｔシグナルに基づいてＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ ＦＡＣＳソーターによって標的細胞を選別した。選別した標的細胞をさらに３日間培養し、ゲノムＤＮＡを抽出した。編集されたリードは、次世代シーケンシングによって定量化した。Ｋ５６２細胞へのＧＺＭＢ－メガヌクレアーゼのＹＴＳ細胞移入により、生細胞および移入効率について正規化した後、１．４％のゲノム編集がもたらされた。これは、グランザイムの媒介によってゲノム編集タンパク質を受け取った標的細胞中で、内因性編集が可能であることを示している。

【0285】

実施例５：骨髄細胞は、ゲノム編集タンパク質を移入することができる
骨髄細胞もリンパ球と同様にパーフォリンおよびグランザイムを発現することが知られているが、溶解性顆粒を産生することはない。Ｋ５６２、慢性骨髄性白血病細胞株を実験モデルとして使用して、骨髄細胞がカーゴを首尾よく移入する能力の試験を行った。Ｋ５６２が強力な送達ビヒクルとして使用できるかを調べるために、最初に、Ｋ５６２細胞から黒色腫細胞への、グランザイムＢに融合したｃｒｍＣｈｅｒｒｙの移入について、試験を行った。Ｋ５６２細胞には、上記のように、プラスミド１＿３のコード領域のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物をエレクトロポレートした。Ｋ５６２細胞およびＴａｇ－ｉｔ標識黒色腫細胞を４時間共培養し、Ｔａｇ－ｉｔ陽性細胞内のｍＣｈｅｒｒｙシグナルをモニターした。図６Ａに見ることができるように、Ｔａｇ－ｉｔ陽性の標的黒色腫細胞の約３０％が、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性として検出された。これは、骨髄細胞も、グランザイム媒介タンパク質移入が可能であることを明確に示している。

【0286】

次に、エフェクター細胞としてのＫ５６２によるメガヌクレアーゼの移入について、試験を行った。Ｋ５６２細胞には、メガヌクレアーゼおよびＧＦＰに連結されたヒト突然変異グランザイムＢをコードする５μｇのプラスミド２＿６（図１に示す）を、エレクトロポレートした。Ｋ５６２細胞を、Ｔａｇ－ｉｔで染色した標的黒色腫細胞とインキュベートし、４時間共培養した。ＧＦＰは、Ｔａｇ－ｉｔ陽性細胞中で検出され（Ｔａｇ－ｉｔ陽性細胞の約３０％）、これは、メガヌクレアーゼが首尾よく移入されたことを示している（図６Ｂ）。したがって、驚くべきことに、骨髄細胞もゲノム編集タンパク質を移入させる能力を有していた。

【0287】

グランザイムの融合によって移入されたＣＡＳ９およびメガヌクレアーゼが、標的細胞において編集を行う能力を評価した。Ｋ５６２細胞には、本明細書において上記のとおり、プラスミド２＿４の配列をコードするグランザイム－ＰＣＳＫ９特異的メガヌクレアーゼｍＲＮＡ ＩＶＴ産物を、エレクトロポレートした。操作されたＫ５６２細胞を、本明細書で上述したようにリポフェクタミン３０００を用いて、（メガヌクレアーゼ）切断標的領域内にＰＣＳＫ９配列を有するＰＮＡレポータープラスミドでトランスフェクトされた黒色腫標的細胞と共培養した。５×１０^４個のトランスフェクトされた黒色腫標的細胞をＵ字型９６ウェルプレートに播種した。これに、グランザイム－ＰＣＳＫ９メガヌクレアーゼを含む２×１０^５Ｋ５６２細胞を加えた。インサートのないエレクトロポレートされたＫ５６２細胞も対照として使用した。細胞を４時間共培養した。ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ ＦＡＣＳソーターによって、ＲＦＰ陰性標的細胞をＲＦＰ陰性エフェクター細胞から分離した。選別された細胞を３日間培養した後、遺伝子編集イベントのエビデンスとしてＲＦＰ陽性集団中のＧＦＰをモニターした。図６Ｃで見ることができるように、ＲＦＰ陽性黒色腫標的細胞におけるＧＦＰの発現によって証明されるように、標的細胞内で切断が生じた。したがって、グランザイムＢとの融合によって、編集ヌクレアーゼを骨髄エフェクター細胞から標的細胞に移入させることができるのみでなく、ヌクレアーゼも完全に機能し、標的細胞中で編集を誘導できることは明白である。

【0288】

エフェクター細胞としてのＫ５６２によるグランザイムＢ媒介送達後に、黒色腫標的細胞のゲノムにおいて遺伝子編集を行うＰＣＳＫ９特異的メガヌクレアーゼの能力を評価した。グランザイム－メガヌクレアーゼのコード領域のｍＲＮＡ ＩＶＴ産物（図１に記載のプラスミド２＿４）のＹＴＳ細胞へのエレクトロポレーションは、前述のとおり行った。Ｋ５６２標的細胞は、本明細書で上述したようにＴａｇ－ｉｔで標識した。エフェクター細胞および標的細胞を４時間共培養した後、Ｔａｇ－ｉｔシグナルに基づいてＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ ＦＡＣＳソーターによって標的細胞を選別した。選別した標的細胞をさらに３日間培養し、ゲノムＤＮＡを抽出した。編集したリードは、次世代シーケンシングによって定量化した。黒色腫細胞へのＧＺＭＢ－メガヌクレアーゼのＫ５６２細胞の移入により、生細胞および移入効率について正規化した後、２％のゲノム編集がもたらされた。これは、グランザイムの媒介によってゲノム編集タンパク質を受け取った標的細胞中で、内因性編集が可能であることを示している。

【0289】

実施例６：Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、標的細胞へのＣＡＳ９＋ｇＲＮＡ複合体の移入を媒介する
グランザイムＢ媒介移入に加えて、リンパ球によるタンパク質－ＲＮＡ複合体の直接移入の試験も行った。初代ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、前述のとおり、単離し、活性化させた。Ｃａｓ９－ＧＦＰをＥＭＸ１に対する合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とインキュベートして、安定したＲＮＡ－タンパク質複合体を産生した。この複合体は、Ｎｅｐａ２１（ＮｅｐａＧｅｎｅ Ｕｎｉｔ）を２２５Ｖ、パルス長２．５ｍｓで用いて初代Ｔ細胞にエレクトロポレートした。短時間の回復培養後、Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現を確認した（ＧＦＰ陽性＞９０％）（図７Ａ）。

【0290】

２つの異なる標的細胞：ヒトＫ５６２細胞およびマウスｐ８１５を以前と同様にＣＦＳＥで標識した。エレクトロポレートされたＴ細胞および標識された標的細胞は、以前と同じように４時間共培養した。共培養後、細胞を生存率色素（近赤外ＡＰＣ－Ｃｙ７ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、カタログ番号Ｌ１０１１９）およびＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に結合させた抗ＣＤ８で染色した。細胞は、フローサイトメトリー、およびＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（商標）Ｘ Ｍｋ ＩＩ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用した顕微鏡検査の両方によって分析した。

【0291】

ｐ８１５細胞およびＫ５６２細胞はＣＤ８について陰性であるため、エフェクター細胞および標的細胞は、ＣＤ８染色によって識別した（図７Ｂ）。ＣＤ８陰性細胞を調査したとき、それらの大部分がＧＦＰ陽性であることが判明し（図７Ｃ）、これは、Ｃａｓ９－ＧＦＰ融合タンパク質が標的細胞に首尾よく移入されたことを示している。細胞イメージングにより、ＣＤ８－／ＧＦＰ＋細胞の存在が確認された（図７Ｄ）。標的細胞内のＧＦＰシグナルは分散しており、これは、タンパク質が細胞質に到達していることを示している。ｐ８１５細胞およびＫ５６２細胞への移入についても同様の結果が見られた。結果を表６にまとめる。

【0292】

標的細胞としてＹＴＳ細胞エフェクター細胞およびＫ５６２またはヒトＭＣＦ７乳癌細胞を用いて、同じ実験を行った。ＹＴＳ細胞はまた、高レベルのＧＦＰを発現した（ＧＦＰ陽性＞５０％）（図８Ａ）。標的細胞は、Ｔａｇ－ｉｔ細胞生存率色素で染色され、Ｔａｇ－ｉｔ陽性であるために、ＹＴＳ細胞と区別することができた（図８Ｂおよび８Ｄ）。次に、Ｔａｇ－ｉｔ陽性細胞をＧＦＰ発現について評価した。Ｋ５６２（図８Ｃ）およびＭＣＦ７細胞（図８Ｅ）の両方が、高度にＧＦＰ陽性であることが判明し、これは、非常に大きいＲＮＡ－タンパク質複合体でさえ、グランザイムＢへの融合なく、移入できたことを示している。移入の結果を表６にまとめる。

【表6】

【0293】

ＲＮＰにはグランザイムタンパク質が含まれていなかったが、移入は、依然として、溶解性顆粒およびシナプス形成によって媒介されているという仮説を立てた。これは、エキソソームまたは他の細胞外小胞を細胞から単純に単離することができなかったことを意味する。これは、移入には、標的細胞の直接的な接触および認識が必要であるためである。この仮説を調べるために、ＹＴＳ細胞にＣＡＳ９－ＧＦＰを形質導入し、１４～１６時間培養した後、細胞から培地を回収した。馴化培地を標的Ｋ５６２細胞および黒色腫細胞に添加し、一晩インキュベートした。Ｋ５６２（図８Ｆ）も黒色腫細胞（図８Ｇ）もＧＦＰ陽性にならないことが判明した。エフェクター細胞を標的Ｋ５６２細胞（図８Ｈ）および黒色腫細胞（図８Ｉ）と直接共培養したときに、標的細胞は、高度にＧＦＰ陽性となり、タンパク質の移入を示した。これは、エキソソームのような分泌された小胞は、この非グランザイム媒介移入の原因ではなく、むしろ直接的な細胞接触が必要であることを示している。

【0294】

ここでは、ＣＡＳ９－ｓｇＲＮＡ複合体がエフェクターから標的細胞に移入されることが確認されたため、ＲＮＡ－タンパク質複合体が、標的細胞中で遺伝子編集を行う能力も評価した。ＹＴＳおよびＴ細胞には、本明細書で上述したＲＮＡ－タンパク質複合体を、エレクトロポレートした。標的Ｋ５６２細胞および黒色腫細胞を、切断標的領域にＥＭＸ１配列を有するＰＮＡレポータープラスミドで、（それぞれ）エレクトロポレートまたはトランスフェクトした。エフェクター細胞および標的細胞を４時間共培養した後、レポータープラスミドのＲＦＰシグナルに基づいて標的細胞を選別した。選別された標的細胞を３日間培養し、ＲＦＰゲート細胞中でのＧＦＰシグナルの存在に基づいて、編集を前述のとおり測定した。ＲＮＡ－タンパク質複合体は、グランザイムを含んでいなかったが、ＣＡＳ９複合体は移入され、そのｓｇＲＮＡを保持し、標的細胞中に編集を誘導することができた（図９Ａ）。エフェクター細胞として使用したＹＴＳ細胞およびＴ細胞、ならびに標的細胞として使用した黒色腫およびＫ５６２細胞について、同様の結果が観察された。重要なことに、内因性グランザイムＢがノックアウトされ、したがって細胞傷害性が低下したＹＴＳ細胞は、標的細胞での移入、ｓｇＲＮＡの保持、および編集を行う能力を有していた（図９Ｂ）。

【0295】

次に、骨髄細胞が、標的細胞中で遺伝子編集を実行できるＲＮＡ－タンパク質複合体を移入できるかを調べた。Ｔ細胞およびＹＴＳ細胞で行ったように、Ｋ５６２細胞にＣＡＳ９－ｓｇＲＮＡ複合体を形質導入した。次いで、それらを、編集レポータープラスミドを発現する黒色腫細胞と共培養し、標的細胞中で依然として編集が起こっていることが観察された（図９Ｃ）。これは、骨髄細胞、および実際に他のパーフォリン／グランザイム発現細胞がカーゴを移入することができ、実際に機能的なゲノム編集タンパク質／複合体を特異的に送達できることを示している。

【0296】

外因性ＰＮＡプラスミドの編集を示したので、ＲＮＰの送達による内因性ゲノムの編集について試験を行った。Ｔ細胞、ＹＴＳ細胞、グランザイムＢ ＫＯ ＹＴＳ細胞、およびＫ５６２細胞はすべて、ＲＮＰ送達およびゲノム編集の試験を行うためのエフェクター細胞として使用した。黒色腫細胞、Ｋ５６２細胞、およびマウスＰ８１５細胞は、すべて標的細胞として使用した。編集イベントは、標的遺伝子座の次世代シーケンシングにより、本明細書で上述したように定量化した。内因性遺伝子編集の結果を表７にまとめる。これらの結果では、ＲＮＰが移入されるのみでなく、移入中にガイドＲＮＡがＣＡＳ９タンパク質と会合したままであり、複合体が、標的細胞の核内でゲノム編集を実行できることが確認される。

【表7】

【0297】

本発明をその特定の実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替形態、修正形態、および変形形態が当業者には明らかであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に含まれるすべてのこうした代替形態、修正形態および変形形態を包含することが意図されている。

【図1-1】

【図1-2】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C-1】

【図3C-2】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【国際調査報告】