(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-16
(54)【発明の名称】血小板貯蔵方法および組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/19 20150101AFI20230309BHJP
A61K 35/14 20150101ALI20230309BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20230309BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230309BHJP
C07D 403/12 20060101ALI20230309BHJP
A61K 31/497 20060101ALI20230309BHJP
【ＦＩ】
A61K35/19 Z
A61K35/14 A
A61P7/04
A61K9/08
C07D403/12 CSP
A61K31/497
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022543443
(86)(22)【出願日】2021-01-13
(85)【翻訳文提出日】2022-08-15
(86)【国際出願番号】 US2021013315
(87)【国際公開番号】W WO2021146343
(87)【国際公開日】2021-07-22
(31)【優先権主張番号】62/961,602
(32)【優先日】2020-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522283169
【氏名又は名称】プレートフューズ、インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＬＡＴＥＦＵＳＥ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョン、イー
(72)【発明者】
【氏名】カンセラス、ホセ
【テーマコード（参考）】
4C063
4C076
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C063AA01
4C063BB09
4C063CC34
4C063DD06
4C063EE01
4C076AA12
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4C076DD23
4C076DD24
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4C076DD26Z
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4C076FF61
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC48
4C086GA07
4C086MA03
4C086MA05
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4C086MA66
4C086NA10
4C086NA14
4C086ZA53
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB38
4C087CA04
4C087DA02
4C087DA10
4C087MA66
4C087NA10
4C087NA14
4C087ZA53
(57)【要約】
血小板損傷を遅らせ、予防し、または逆転させるための、特に血液バンキング中または血小板の冷蔵中に起こり得る化合物および組成物が開示される。また、本明細書に開示されるのは、血小板を貯蔵するための方法、および本明細書に記載の１つ以上の化合物または組成物を輸血した際の血小板生存を改善するための方法である。
【選択図】図１Ｂ
【選択図】図１Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血小板貯蔵用組成物であって、血小板と、以下の化学構造によって表される化合物とを含む組成物【化1】
式中、化合物は、約１μＭ～約５０μＭの量で存在する。
【請求項2】
前記化合物は、約１μＭ～約２０μＭの量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記化合物は、約１μＭ～約９μＭの量で存在する、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記化合物は、約１μＭ～約５μＭの量で存在する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
血小板貯蔵用組成物であって、血小板と、以下の化学構造によって表される化合物とを含む組成物【化2】
式中、化合物の（Ｓ）形態は、少なくとも約９４％のエナンチオマー過剰率で存在する。
【請求項6】
血小板貯蔵用組成物であって、血小板と、以下の化学構造によって表される化合物とを含む組成物【化3】
（式中、前記組成物中の前記化合物の量は、７～２１日間の冷蔵後に、新鮮な末梢血血小板の約６５％を超える血小板生存および２４時間の回復を達成するのに十分である）。
【請求項7】
前記化合物は、約９７％のエナンチオマー過剰率で存在する、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
生理学的に許容される担体をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記担体は、緩衝液で請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記担体は、血小板添加溶液（ＰＡＳ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ハンクス緩衝生理食塩水、水、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項11】
前記担体は、電解質溶液を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項12】
前記組成物は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣ１２、クエン酸ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、Ｎａ３、クエン酸、ＮａＨＣＯ３、リン酸Ｎａ、酢酸Ｎａ、グルコン酸Ｎａ、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、および、それらの組合せから選択される添加剤を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項13】
前記添加剤は、約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ～約１５０ｍｍｏｌ／Ｌの量で存在する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
Ｄ－リボース、Ｄ－グルコース、ハンクス溶液、ヘペス溶液、ウシ血清アルブミン、チック抗凝固ペプチドおよび滅菌水、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の成分をさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項15】
ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤、ならびにそれらの組み合わせから選択される添加剤をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項16】
前記組成物は、約５～約８のｐＨを有する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項17】
前記組成物は、等張性で請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物中に前記血小板を貯蔵することを含む、血小板を貯蔵するための方法。
【請求項19】
７～２１日間の冷蔵貯蔵後の血小板生存率は、約６５％を超える、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記貯蔵は、約０℃～約２０℃の温度で実施される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記貯蔵は、約０℃～約１０℃の温度で実施される、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記貯蔵は、約１℃～約６℃の温度で実施される、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記貯蔵は、約２℃の温度で実施される、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
輸血時の血小板生存を改善するための方法であって：血小板を、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物または、その薬学的に許容される塩、または請求項１８～２３のいずれか１項に記載の方法に従って貯蔵された血小板と接触させること；および、
前記接触させた血小板を対象に注入すること、
を含む方法。
【請求項25】
前記化合物は、約１μＭ～約２０μＭの濃度で存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記血小板は、約１℃～約２５℃の温度で前記化合物の存在下で貯蔵される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
前記血小板は、化合物の存在下で約１～約２１日間貯蔵される、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
血小板を生理学的に許容される担体とさらに接触させる、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物中に前記血小板を貯蔵することを含む、インビトロで血小板を貯蔵する使用。
【請求項30】
血小板生存率は、１０～１４日間の冷蔵貯蔵期間後に約６５％を超える、請求項２９に記載の使用。
【請求項31】
前記貯蔵は、約０℃～約２０℃の温度で実施される、請求項２９または３０に記載の使用。
【請求項32】
前記貯蔵は、約０℃～約１０℃の温度で実施される、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項33】
前記貯蔵は、約１℃～約６℃の温度で実施される、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項34】
前記貯蔵は、約２℃の温度で行われる、請求項２９～３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項35】
輸血における使用のための血小板生存の改善方法：血小板を、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組成物もしくはその薬学的に許容される塩、または請求項１８～２３のいずれか１項に記載の方法に従って貯蔵された血小板と接触させることを含む、方法。
【請求項36】
前記化合物は、約１μＭ～約２０μＭの濃度で存在する、請求項３５に記載の使用。
【請求項37】
前記血小板は、前記化合物の存在下、約１℃～約２５℃の温度で貯蔵される、請求項３５または３６に記載の使用。
【請求項38】
前記血小板は、前記化合物の存在下で約１～約２１日間貯蔵される、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項39】
血小板を生理学的に許容される担体とさらに接触させる、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の参照）
本特許出願は、２０２０年１月１５日に出願された米国仮出願第６２／９６１，６０２号に対する優先権の利益を主張する。前述の出願の全ては、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。
本特許出願は、２０２０年１月１５日に出願された米国仮出願第６２／９６１，６０２号に対する優先権の利益を主張する。前述の出願の全ては、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【0002】
（連邦政府出資の研究開発に関する記述）
資金援助の一部は、ＮＩＨ Ｒ０１ ＨＬ１４７５３６、Ｒ４３ ＨＬ１２３１０３、ＵＨ５４ＨＬ１１９８１０（ＮＣＡＩ－ＣＣ）によるものであった。
資金援助の一部は、ＮＩＨ Ｒ０１ ＨＬ１４７５３６、Ｒ４３ ＨＬ１２３１０３、ＵＨ５４ＨＬ１１９８１０（ＮＣＡＩ－ＣＣ）によるものであった。
【0003】
（技術分野）
本出願は、化学、生物学、および医学の分野に関する。本明細書には、化学組成物およびその使用方法が開示される。より詳細には、本明細書には化合物、血小板貯蔵のための組成物、血小板貯蔵の方法、およびそのような貯蔵された血小板を使用する方法が開示される。
本出願は、化学、生物学、および医学の分野に関する。本明細書には、化学組成物およびその使用方法が開示される。より詳細には、本明細書には化合物、血小板貯蔵のための組成物、血小板貯蔵の方法、およびそのような貯蔵された血小板を使用する方法が開示される。
【背景技術】
【0004】
血小板輸血は、化学療法を受けている癌患者を含む、低血小板数または機能不全血小板を有する患者において、出血を治療するため、または出血を予防するための一般的な救命処置である。最近、蘇生中の大量の血小板の適用は、外傷患者の生存を有意に改善することが示されている。米国単独では、毎年約３００万用量の血小板が使用されている。しかしながら、血小板の現在の供給は主に、他の血液細胞とは異なり、血小板を室温でのみ貯蔵することができるが、冷蔵では貯蔵することができないため、需要の増加に効果的に対処することができない。
【0005】
室温貯蔵は細菌増殖に有利であり、血小板濃縮輸血の細菌感染のリスクは、冷蔵赤血球製品のそれよりも５０倍高いと推定される。したがって、米国ＦＤＡは血小板の室温貯蔵を７日までに制限し、実際の貯蔵寿命はわずか２．５～３日であり、ドナーからの血小板採取後の微生物学的汚染についてＦＤＡが義務付けた試験のリストが増えている。平均２０％までの血小板製剤が、呼気のために廃棄される。しかし、外科手術、化学療法、および外傷状況における使用の予測不可能な増加に起因して、一定の血小板不足が存在する。短期間の貯蔵寿命は血小板製品を有効な商品に変換するための主要な障害であり、長期間にわたってヒト血小板を安全に貯蔵するための有効な方法は広範囲に研究されているが、依然として解決策がない、世界的に満たされていない医学的ニーズである。
【0006】
冷凍血小板（１－６℃）は止血的に活性であるが、輸血後に循環から急速にクリアランスされ、このクリアランス系のメカニズムは長年の謎であった。Ｕ．Ｓ．ＣＦＲは、外傷患者のための３日間までの貯蔵のための低温血小板の使用を可能にする（２１ ＣＦＲ ６４０．２４および６４０．２５）。
【0007】
長期間の冷蔵時の血小板損傷を防止する方法の開発は非常に必要であり、血液バンキングの前に長い間求められてきた。このような開発は、血小板貯蔵の現在の方法に革命をもたらす。
【発明の概要】
【0008】
（概要）
いくつかの実施形態は、血小板および以下の化学構造によって表される化合物を含む血小板貯蔵のための組成物を提供する、
または、その薬学的に許容される塩である。
いくつかの実施形態は、血小板および以下の化学構造によって表される化合物を含む血小板貯蔵のための組成物を提供する、
【化1】
【0009】
式中、化合物は、約１μＭ～約５０μＭの量で存在する。いくつかの実施形態において、化合物は、約１μＭ～約２０μＭの量で存在する。いくつかの実施形態において、化合物は、約１μＭ～約９μＭの量で存在する。いくつかの実施形態において、化合物は、約１μＭ～約５μＭの量で存在する。
【0010】
いくつかの実施形態は、血小板および
の化学構造によって表される化合物または、その薬学的に許容される塩を含む血小板貯蔵のための組成物を提供し、ここで、化合物の（Ｓ）形態は、少なくとも約９４％のエナンチオマー過剰率で存在する。
【化2】
【0011】
いくつかの実施形態は、血小板および以下の化学構造によって表される化合物を含む血小板貯蔵のための組成物を提供する、
または、その薬学的に許容される塩であって、前記組成物中の前記化合物の量が７～２１日間の冷蔵後に、新鮮な末梢血血小板の約６５％を超える血小板生存および２４時間の回復を達成するのに十分で前記化合物または、その薬学的に許容される塩。いくつかの実施形態では、化合物が約９７％のエナンチオマー過剰率で存在する。いくつかの実施形態では、組成物が生理学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、担体は緩衝液である。いくつかの実施形態では、担体が血小板添加溶液（ＰＡＳ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水、ハンクス緩衝生理食塩水、水、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、担体は電解質溶液を含む。いくつかの実施形態では、組成物がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣ１２、クエン酸ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、Ｎａ３、クエン酸、ＮａＨＣＯ３、リン酸Ｎａ、酢酸Ｎａ、グルコン酸Ｎａ、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、およびそれらの組合せから選択される添加剤を含む。いくつかの実施形態では、添加剤が約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ～約１５０ｍｍｏｌ／Ｌの量で存在する。いくつかの実施形態では、添加剤がＤ－リボース、Ｄ－グルコース、ハンクス溶液、ヘペス溶液、ウシ血清アルブミン、チック抗凝固ペプチドおよび滅菌水、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の成分を含む。いくつかの実施形態では、添加剤がｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤、ならびにそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、組成物が約５～約８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、組成物は等張性である。
【化3】
【0012】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の化合物または組成物による組成物中に前記血小板を貯蔵することを含む、血小板を貯蔵するための方法に関する。いくつかの実施形態では、血小板生存率が７～２１日の冷蔵貯蔵期間後に約６５％を超える。いくつかの実施形態では、貯蔵が約０℃～約２０℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、貯蔵が約０℃～約１０℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、貯蔵が約１℃～約６℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、貯蔵が約２℃の温度で実施される。
【0013】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、輸血時の血小板生存を改善するための方法を含む。いくつかの実施形態では、方法が血小板を、本明細書に記載の化合物もしくは組成物のいずれか１つの組成物、または本明細書に記載の方法に従って貯蔵された血小板と接触させること、および前記接触させた血小板を対象に注入することを含む。いくつかの実施形態において、化合物は、約１μＭ～約２０μＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、血小板は、化合物の存在下、約１℃～約２５℃の温度で貯蔵される。いくつかの実施形態では、血小板が化合物の存在下で約１～約２１日間貯蔵される。いくつかの実施形態では、血小板を生理学的に許容される担体とさらに接触させる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、実施形態が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料もまた、実施形態の実施またはテストにおいて使用され得るが、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。
【0020】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「血小板」への言及は複数のそのような血小板を含み、「担体」への言及は、１つ以上の担体および当業者に公知のその等価物への言及を含む、などである。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「血小板」への言及は複数のそのような血小板を含み、「担体」への言及は、１つ以上の担体および当業者に公知のその等価物への言及を含む、などである。
【0021】
値の範囲が提供される場合、上限および下限、ならびに範囲の上限と下限との間の各介在値は、実施形態内に包含されることが理解される。
【0022】
用語「約」または「およそ」は当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差の範囲内の手段であり、これは、部分的には値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定系の限界に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の実施に従って、１または１を超える標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」が所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、および１％までの範囲を意味し得る。あるいは特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は１桁以内、５倍以内、および２倍以内の値を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、用語「約」は、その特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。
【0023】
本明細書で使用するとき、用語「有効量」は、所望の作用を示すのに充分な１つ以上の活性成分の量を手段させる。これには、治療効果および予防効果の両方が含まれる。単独で投与した個々の活性成分についていう場合は、この語は該成分のみをさす。組み合わせたものについていう場合はこの語が活性成分を組み合わせて、順番に、または一度に投与したかにかかわらず、治療学的効果を示す活性成分の合計量をいう。
【0024】
本明細書に記載される方法および製剤は、開示される実施形態の化合物の薬学的に許容される塩および／または配座異性体、ならびに同じタイプの活性を有するこれらの化合物の代謝産物および活性代謝産物の使用を含むことが理解される。配座異性体は、配座異性体である構造である。立体配座異性は同じ構造式を有するが、回転する結合の周りの原子の異なる立体配座（配座異性体）を有する分子の現象である。同様に、本明細書に記載の化合物は本明細書に記載の任意の形態（例えば、薬学的に許容される塩、エナンチオマー形態、互変異性体形態など）の化合物を含むことが理解される。
【0025】
用語「医薬組成物」は、本明細書に開示される１つ以上の化合物と、希釈剤または担体などの他の化学成分との混合物を指す。医薬組成物は、生物への化合物の投与を容易にする。医薬組成物は一般に、特定の意図される投与経路に合わせて調整される。
【0026】
用語「薬学的に許容される塩」は、それが投与される生物に対して有意な刺激を引き起こさず、化合物の生物学的活性および特性を抑止しない化合物の塩を指す。いくつかの実施形態において、塩は、化合物の酸付加塩である。医薬塩は化合物をハロゲン化水素酸（例えば、塩酸または臭化水素酸）、硫酸、硝酸およびリン酸などの無機酸と反応させることによって得ることができる。医薬塩はまた、化合物を有機酸、例えば脂肪族または芳香族カルボン酸またはスルホン酸、例えばギ酸、酢酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸またはナフタレンスルホン酸と反応させることによって得ることができる。医薬塩はまた、化合物を塩基と反応させて、アンモニウム塩、ナトリウムまたはカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムまたはマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｃ１－Ｃ７アルキルアミン、シクロヘキシルアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミンなどの有機塩基の塩、およびアルギニンおよびリジンなどのアミノ酸との塩を形成することによって得ることができる。
【0027】
本明細書で使用される場合、「担体」は、細胞または組織への化合物の送達を促進する化合物を指す。例えば、限定するものではないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は対象の細胞または組織への多くの有機化合物の取り込みを容易にする、一般的に利用される担体である。
【0028】
本明細書で使用される場合、「賦形剤」は、組成物にバルク、コンシステンシー、安定性、結合能、潤滑性、崩壊能などを提供するために、医薬組成物に添加される不活性物質を指す。「希釈剤」は、賦形剤の一種である。
【0029】
本明細書で使用するとき、用語「重量パーセント」は、成分を指すとき、成分の重量を、成分を含む組成物の重量で割ったものに１００％を乗じたものである。例えば、部品Ａの５グラムが部品Ｂの９５グラムに添加されるときの部品Ａの重量パーセントは５％である（例えば、５ｇ Ａ／（５ｇ Ａ＋９５ｇ Ｂ）×１００％）。
【0030】
組成
冷蔵貯蔵は、血小板膜の特定のマイクロドメイン上に糖タンパク質－Ｉｂ（ＧＰＩｂ）受容体をクラスター化させる温度の低下に起因して、血小板寿命を短縮すると考えられている。本出願人は、マクロファージβ２インテグリンおよび肝細胞Ａｓｈｗｅｌｌ－Ｍｏｒｅｌｌ受容体によるクラスター化糖タンパク質上の特定の糖化／シアリル化残基の認識が宿主による血小板食作用および循環からの除去をもたらすことを見出した。したがって、本出願人は、化学的介入のための有用な標的として、糖タンパク質クラスタリングの予防を同定した。
冷蔵貯蔵は、血小板膜の特定のマイクロドメイン上に糖タンパク質－Ｉｂ（ＧＰＩｂ）受容体をクラスター化させる温度の低下に起因して、血小板寿命を短縮すると考えられている。本出願人は、マクロファージβ２インテグリンおよび肝細胞Ａｓｈｗｅｌｌ－Ｍｏｒｅｌｌ受容体によるクラスター化糖タンパク質上の特定の糖化／シアリル化残基の認識が宿主による血小板食作用および循環からの除去をもたらすことを見出した。したがって、本出願人は、化学的介入のための有用な標的として、糖タンパク質クラスタリングの予防を同定した。
【0031】
血小板糖タンパク質は、細胞内細胞骨格と密接に関連している。血小板糖タンパク質のクラスター化は血小板膜における脂質ラフトの形成に依存し、これは、アクトミオシンの集合／分解の高度に調節されたプロセスの動態に依存する。ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２を含むＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅはＦ－アクチン重合／解重合の中心的調節因子であり、脂質ラフト形成および組成を制御することが示されているＧＴＰ結合酵素のクラスである。したがって、本出願人は、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性の変化が血小板膜脂質ラフトアセンブリおよび糖タンパク質組成に影響を及ぼし得ると仮定する。小分子阻害剤によるＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼの可逆的標的化は血小板における細胞骨格依存性冷蔵貯蔵病変を予防し、血小板生存の増加をもたらし得る。
【0032】
低温が血小板生存にどのように影響するかのメカニズムは完全には理解されていないが、過去１０年間にかなりの情報が収集されている。血小板に対する低温の影響は複雑であり、形状変化、細胞骨格再編成、活性化、細胞表面タンパク質クラスタリング、および表面糖タンパク質の炭水化物構造の変化を含むと考えられている。糸状仮足または葉状仮足を含む冷凍誘導性変化は、ポリマー状態（Ｆ－アクチン）における総細胞アクチンの画分の増加および末梢微小管コイルの消失を伴う。コルヒチンを用いた微小管重合の単離された防止は、活性化時の形状変化防止をもたらさなかった。サイトカラシンＢを用いた単離されたアクチン動態の予防は、円盤状の形状の復帰をもたらすが（１８）、ヒヒにおける血小板生存の改善をもたらさず、アクチン重合の不可逆的遮断が冷蔵損傷を妨げないことを示唆する。
【0033】
血小板低温受容体の存在は、血小板が１６℃未満の温度に供される場合の恒常性および臨床効果の両方の説明として仮定されている。低温が脂質ラフト中のＧＭ１ガングリオシドを隔離するＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基を露出させる糖タンパク質Ｉｂ外部ドメインの脱グリコシル化を誘導すると考えられている。ラフト関連糖タンパク質Ｉｂａは１４－３－３ｚアダプタータンパク質がその細胞質尾部に結合するとクラスターを形成し、これはミトコンドリア損傷およびＰＳ曝露（アポトーシス様）を伴うプロセスである（２４）。血小板クリアランスのメカニズムは脂質ラフト関連ＧＰＩｂクラスタリングに関連し、クラスタリングの予防は血小板クリアランスを妨げると考えられている。細胞内細胞骨格と密接に関連しているＧＰＩｂクラスタリングは血小板膜におけるマイクロドメイン（いわゆる「脂質ラフト」）の形成に依存し、これは、次に、複数のレベルでのアクト－ミオシン集合／分解の高度に調節されたプロセスの動力学に依存する。
【0034】
脂質ラフトおよび脂質ラフトにおけるＧＰＩｂクラスター形成に関与するアクチン細胞骨格再編成は、Ｆ－アクチンの重合および脱重合、アクトミオシン収縮、チューブリン重合、ならびにスペクトリン固定の調節における特定の下流エフェクターを制御するＣｄｃ４２、Ｒａｃ１およびＲｈｏＡ ＧＴＰａｓｅの協調的活性に依存する。ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼは、血小板受容体から血小板機能を駆動する細胞内シグナル伝達経路へのシグナルの空間的／時間的伝達および増幅におけるシグナル伝達スイッチとして作用するＧＴＰ結合酵素のクラスである。直接Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼエフェクターの中で、Ｆ－アクチン重合／解重合を制御するＷＡＳＰ、ホルミンおよびＰＡＫは、脂質ラフト形成および組成ならびに血小板の管状重合の制御において重要であることが示されている。したがって、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性の変化は、血小板膜ミクロドメインアセンブリおよび糖タンパク質組成に影響を及ぼし得る。Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１のドミナントネガティブ変異体を用いた以前の研究では寒冷誘発性血小板損傷の予防に対する効果は見出されなかったが（２８）、使用されるツールの制限は研究者がアクチン／アクトミオシン動態を特定の可逆的様式で操作することを妨げている。
【0035】
理論によって制限されることを意図するものではないが、化学阻害剤によるＧＴＰａｓｅの複数のＲｈｏファミリーの可逆的阻害はアクトミオシン動態および膜マイクロドメインとの干渉によって冷蔵貯蔵後の血小板生存および輸血機能を有意に改善し、ＧＰＩｂクラスタリングを防止することができると考えられる。
【0036】
一態様では、血小板貯蔵のための組成物が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、血小板貯蔵のための組成物は、以下の化学構造によって表される化合物を含む：
または、その薬学的に許容される塩である。
【化4】
【0037】
いくつかの実施形態では、化合物の（Ｓ）形態が少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のエナンチオマー過剰率で存在するか、または前述の値を含むおよび／もしくはその範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、化合物の（Ｓ）形態は、少なくとも約７０％のエナンチオマー過剰率で存在する。いくつかの実施形態において、化合物の（Ｓ）形態は、少なくとも約７５％のエナンチオマー過剰率で存在する。いくつかの実施形態において、化合物の（Ｓ）形態は、少なくとも約８５％のエナンチオマー過剰率で存在する。いくつかの実施形態において、化合物の（Ｓ）形態は、少なくとも約９０％のエナンチオマー過剰率で存在する。いくつかの実施形態において、化合物の（Ｓ）形態は、少なくとも約９４％のエナンチオマー過剰率で存在する。いくつかの実施形態において、化合物の（Ｓ）形態は、少なくとも約９６％のエナンチオマー過剰率で存在する。
【0038】
いくつかの実施形態では、化合物が０．１μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、８μＭ、９μＭ、１２μＭ、１５μＭ、１６μＭ、２０μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２８μＭ、３０μＭ、３４μＭ、３５μＭ、３６μＭ、３８μＭ、４０μＭ、４２μＭ、４５μＭ、４６μＭ、５０μＭ、５２μＭ、５５μＭ、５６μＭ、５８μＭ、６０μＭ、６２μＭ、６５μＭ、６６μＭ、６８μＭ、７０μＭ、７４μＭ以上の量で存在する。５μＭ、７６μＭ、８０μＭ、８２μＭ、８４μＭ、８６μＭ、８８μＭ、９０μＭ、９２μＭ、９５μＭ、９６μＭ、９８μＭ、１００μＭ、１０５μＭ、１１０μＭ、１１５μＭ、１２５μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、２００μＭ、または前述の値を含むおよび／またはそれに及ぶ範囲。一部の実施形態では化合物が約１μＭ～約１００μＭの量で存在し、一部の実施形態では化合物が約１μＭ～約７０μＭの量で存在し、一部の実施形態では化合物が約１μＭ～約２０μＭの量で存在し、一部の実施形態では化合物が約１μＭ～約１０μＭの量で存在し、一部の実施形態では化合物が約１μＭ～約９μＭの量で存在する。いくつかの実施形態において、化合物は、約１μＭ～約５μＭの量で存在する。いくつかの実施形態では化合物は約５μＭ～約１００μＭの量で存在し、いくつかの実施形態では化合物は約５μＭ～約７０μＭの量で存在し、いくつかの実施形態では化合物は約５μＭ～約２０μＭの量で存在し、いくつかの実施形態では化合物は約５μＭ～約１０μＭの量で存在し、いくつかの実施形態では化合物は約５μＭ～約９μＭの量で存在する。いくつかの実施形態において、化合物は約１０μＭ～約１００μＭの量で存在し、いくつかの実施形態において、化合物は約１０μＭ～約７０μＭの量で存在し、いくつかの実施形態において、化合物は、約１０μＭ～約２０μＭの量で存在する。
【0039】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物が血小板生存を達成するのに十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物が貯蔵後に血小板機能を達成するのに十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物が冷蔵貯蔵後に血小板機能を達成するのに十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物が血小板クリアランスを改善するのに十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物が血小板生存率を達成するのに十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物が改善された血小板半減期を達成するのに十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物が血小板生存率を改善するのに十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物がインビトロ血小板生存を達成するのに十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物が低温貯蔵においてインビトロ血小板生存を達成するのに十分である。
【0040】
いくつかの実施形態では、血小板の生存または機能が貯蔵後、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％を超えるか、または前述の値を含む、および／またはそれに及ぶ範囲である。いくつかの実施形態では、血小板の生存または機能が貯蔵後に約５０％を超える。いくつかの実施形態では、血小板生存率が貯蔵後に約５５％を超える。いくつかの実施形態では、血小板の生存または機能が貯蔵後に約６０％を超える。いくつかの実施形態では、血小板の生存または機能が貯蔵後に約６５％を超える。いくつかの実施形態では、血小板の生存または機能が貯蔵後に約７０％を超える。いくつかの実施形態では、血小板の生存または機能が貯蔵後に約７５％を超える。いくつかの実施形態では、血小板の生存または機能が貯蔵後に約８０％を超える。いくつかの実施形態では、血小板の生存または機能が貯蔵後に約８５％を超える。
【0041】
いくつかの実施形態では、血小板の生存または機能が貯蔵期間後に維持され得る。いくつかの実施形態では、血小板生存または機能が１～７日間、１～１４日間、４～７日間、４～１４日間、７～１４日間、１０～１４日間、７～２１日間、１０～２１日間、または前述の値を含むおよび／もしくはそれに及ぶ範囲の貯蔵期間にわたって維持され得る。いくつかのそのような実施形態では、血小板の生存または機能が冷蔵の間、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、または前述の値を含むおよび／もしくはそれに及ぶ範囲で、２４時間の回復の間維持され得る。
【0042】
いくつかの実施形態では、組成物が生理学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、担体は緩衝液である。いくつかの実施形態では、担体が血小板添加溶液（ＰＡＳ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水、ハンクス緩衝生理食塩水、水、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、担体は電解質溶液を含む。いくつかの実施形態では、組成物が薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物が安定剤をさらに含む。そのような材料は非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨げてはならない。薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、または安定剤は投与、例えば、静脈内または非経口投与に所望される調製物の形態に応じて、多種多様な形態をとり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＳがナトリウム、カリウム、マグネシウム、クロリド、アセテート、グルコネート、ブドウ糖、ＨＰＯ４
－２、シトレート、重炭酸塩、カルシウム、またはそれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＳがナトリウム、カリウム、マグネシウム、クロリド、アセテート、グルコネート、ブドウ糖、ＨＰＯ４
－２、シトレート、重炭酸塩、およびカルシウムの組合せを含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＳは、約１３０～２００ｍＭの範囲のナトリウム、約０～５ｍＭの範囲のカリウム、約０～３ｍＭの範囲のマグネシウム、約７５～１２５ｍＭの範囲の塩化物、約２１～４２ｍＭの範囲の酢酸塩、約０～２３ｍＭの範囲のグルコン酸塩、約０～３０ｍＭの範囲のグルコース、約０～３０ｍＭの範囲のＨＰＯ４
－２、約０～１５ｍＭの範囲のクエン酸塩、約０～４５ｍＭの範囲の重炭酸塩、および約０～１ｍＭの範囲のカルシウムの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＳが約５．４～約７．４の範囲のｐＨを有する。
【0043】
いくつかの実施形態において、担体の量（μＭ単位）は、約０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００、または、前述の値を含む、および/または、前述の値にまたがる範囲である。いくつかの実施形態では、組成物中の担体の濃度（μＭ単位）が約０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１０、０００、または、前述の値を含む、および/または、前述の値にまたがる範囲である。
【0044】
いくつかの実施形態において、担体（ｍｇ単位）の量は、約０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、または、前述の値を含む、および／または、前述の値にまたがる範囲である。いくつかの態様において、存在する担体の量（ｍｇ単位）は、約０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００以上、または、前述の値を含む、および／または、前述の値にまたがる範囲である。
【0045】
いくつかの実施形態では、組成物中の担体の重量パーセントが約０、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０以上、または、前述の値を含む、および/または、前述の値にまたがる範囲である。
【0046】
いくつかの実施形態では、組成物が添加剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、添加剤が１つまたは複数のｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤、安定剤、湿潤剤、およびそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、添加剤が１つ以上のｐＨ調整剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、添加剤がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣ１２、クエン酸ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、Ｎａ３、クエン酸、ＮａＨＣＯ３、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、およびそれらの組合せから選択され得る。いくつかの実施形態では、添加剤が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１．００ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、３５ｍｍｏｌ／Ｌ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ、５５ｍｍｏｌ／Ｌ、６０ｍｍｏｌ／Ｌ、７０ｍｍｏｌ／Ｌ、７５ｍｍｏｌ／Ｌ、８５ｍｍｏｌ／Ｌ、９０ｍｍｏｌ／Ｌ、９５ｍｍｏｌ／Ｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、１１０ｍｍｏｌ／Ｌ、１１５ｍｍｏｌ／Ｌ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ、１５０ｍｍｏｌ／０ｍｍｏｌ／Ｌ、１５５ｍｍｏｌ／０ｍｍｏｌ／Ｌ、１６０ｍｍｏｌ／０ｍｍｏｌ／Ｌ、１６５ｍｍｏｌ／Ｌ、１７０ｍｍｏｌ／Ｌ、１７５ｍｍｏｌ／Ｌ、１８０ｍｍｏｌ／Ｌ、１８５ｍｍｏｌ／Ｌ、１９０ｍｍｏｌ／Ｌ、１９５ｍｍｏｌ／Ｌ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ、たは、前述の値を含む、および/または、前述の値にまたがる範囲である。いくつかの実施形態では、添加剤が約０．５ｍｍｏｌ／Ｌ～約１５０ｍｍｏｌ／Ｌの量で存在する。
【0047】
いくつかの実施形態では、組成物がＤ－リボース、Ｄ－グルコース、ハンクス溶液、ヘペス溶液、ウシ血清アルブミン、チック抗凝固ペプチドおよび滅菌水、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の成分をさらに含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、組成物が約５、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８のｐＨ、または前述の値を含むおよび／またはそれらに及ぶ範囲を有する。いくつかの実施形態では、組成物は等張性である。
【0049】
いくつかの実施形態では、貯蔵が０℃、２℃、４℃、６℃、８℃、１０℃、１２℃、１４℃、１６℃、１８℃、２０℃、２２℃、２４℃、２６℃、２８℃、３０℃を超える温度、たは、前述の値を含む、および/または、前述の値にまたがる範囲で実施される。いくつかの実施形態では、貯蔵が約０℃～約２５℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、貯蔵が約０℃～約２０℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、低温貯蔵が約０℃～約１０℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、低温貯蔵が約１℃～約６℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、低温貯蔵が約２℃の温度で実施される。
【0050】
いくつかの実施形態は、血小板および以下の化学構造によって表される化合物を含む血小板貯蔵のための組成物に関する、
または、その薬学的に許容される塩であって、前記組成物中の前記化合物の量が７～２１日間の冷蔵後に、新鮮な末梢血血小板の約６５％を超える血小板生存および２４時間の回復を達成するのに十分である、前記化合物または、その薬学的に許容される塩。
【化5】
【0051】
いくつかの実施形態は、血小板を以下の化合物と接触させることを含む、輸血時の血小板生存を改善する方法に関する：
または、その薬学的に許容される塩と、前記接触した血小板を対象に注入する工程と、を含む、方法。
【化6】
【0052】
いくつかの実施形態において、化合物は、約１μＭ～約２０μＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、血小板は、化合物の存在下、約１℃～約２５℃の温度で貯蔵される。いくつかの実施形態では、血小板が化合物の存在下で、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、または前述の値を含むおよび／もしくはそれに及ぶ範囲の期間貯蔵される。いくつかの実施形態では、血小板が化合物の存在下で約１～約１４日間貯蔵される。いくつかの実施形態では、血小板を生理学的に許容される担体とさらに接触させる。いくつかの実施形態では、血小板が化合物の存在下で約４～約１４日間貯蔵される。いくつかの実施形態では、血小板が化合物の存在下で約７～約１４日間貯蔵される。いくつかの実施形態において、血小板は、化合物の存在下で約１０～約１４日間貯蔵される。いくつかの実施形態では、血小板が化合物の存在下で約７～約２１日間貯蔵される。
【0053】
いくつかの実施形態は、化学構造によって表される化合物を含む組成物に関する、
または、その薬学的に許容される塩、および血小板添加剤溶液（ＰＡＳ）であって、ＰＡＳの各々１００ｍＬは、塩化ナトリウム０．４０５ｇ、塩化カリウム０．０３７ｇ、塩化マグネシウム６Ｈ２Ｏ ０．０３０ｇ、酢酸塩３Ｈ２Ｏ ０．４４２ｇ、クエン酸ナトリウム２Ｈ２Ｏ ０．３１８ｇ、リン酸二水素ナトリウム１Ｈ２Ｏ ０．０９３ｇ、リン酸二ナトリウム１２Ｈ２Ｏ ０．７６９ｇ、および注射用水１００ｍＬを含む。
【化7】
【0054】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、実施形態が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料もまた、実施形態の実施またはテストにおいて使用され得るが、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。
【0055】
本明細書に開示される化合物は、１つ以上の結晶形態または非晶質形態で存在し得る。特に明記しない限り、全てのそのような形態は、任意の多形形態を含む、本明細書に開示される化合物の範囲に含まれる。さらに、本明細書に開示される化合物のいくつかは、水（すなわち、水和物）または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成し得る。特に明記しない限り、そのような溶媒和物は、本明細書に開示される化合物の範囲に含まれる。
【0056】
当業者は本明細書に記載されるいくつかの構造が速度論的にであっても、他の化学構造によってかなり表され得る化合物の共鳴形態または互変異性体であり得ることを認識するのであろう；当業者はそのような構造がそのような化合物の試料の非常にわずかな部分のみを表し得ることを認識するのであろう。そのような化合物は描写される構造の範囲内であると考えられるが、そのような共鳴形態または互変異性体は本明細書では表されない。
【0057】
同位体は、記載される化合物中に存在し得る。化合物構造において表されるような各化学元素は、前記元素の任意の同位体を含み得る。例えば、化合物構造において、水素原子は、化合物中に存在すると明示的に開示または理解され得る。水素原子が存在し得る化合物の任意の位置において、水素原子は水素－１（プロチウム）および水素－２（ジュウテリウム）を含むがこれらに限定されない、水素の任意の同位体であり得る。したがって、本明細書における化合物への言及は文脈が明らかに別段の指示をしない限り、すべての潜在的な同位体形態を包含する。
【実施例】
【0058】
（Ｓ）Ｇ０４の合成
（Ｓ）Ｇ０４は、以下のスキームに従って合成した：
（Ｓ）Ｇ０４は、以下のスキームに従って合成した：
【化8】
【0059】
合成により淡黄色の固形物を得た；ＮＭＲ解析により、生成物がＳ－Ｇ０４であることが確認された；ＬＣ／ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋は３５９．３０であり、純度は＞９５％であった。キラル純度は９７％であった。
【0060】
上記の合成は、立体特異性を達成するために行われた。同様に、（Ｒ）Ｇ０４は、Ｄ－トリプトファンを用いて合成することができる。さらに、この方法および手順は、米国特許に詳述されている。２０１８年７月２４日に発行されたＺｈｅｎｇらの米国特許第１０，０２８，５０３号に記載されている。当業者は、類似の合成スキームを用いて類似の化合物を合成できることを認識するのであろう。当業者は、本実施形態の化合物が他の合成スキームを用いて合成され得ることを認識するのであろう。
【0061】
コラーゲン誘導血小板凝集の阻害
洗浄血小板の血小板形状変化を、アゴニストの添加後に、アグリゴメーターおよび光透過率の減少を用いてモニターした（Ｈｕｚｏｏｒら、１９９３）。この分析の目的のために、コラーゲンをアゴニストとして使用した。簡単に説明すると、洗浄したヒト血小板懸濁液を、Ｌｕｍｉ－Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ（Ｃｈｒｏｎｏ－Ｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中、９００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃でインキュベートし、続いて、対照ビヒクルとしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または（Ｓ）Ｇ０４もしくは（Ｒ）Ｇ０４（図１Ａ）を含有するＤＭＳＯを添加した。（Ｓ）Ｇ０４および（Ｒ）Ｇ０４を、１、５、１０、３０および５０μＭの濃度で試験した。
洗浄血小板の血小板形状変化を、アゴニストの添加後に、アグリゴメーターおよび光透過率の減少を用いてモニターした（Ｈｕｚｏｏｒら、１９９３）。この分析の目的のために、コラーゲンをアゴニストとして使用した。簡単に説明すると、洗浄したヒト血小板懸濁液を、Ｌｕｍｉ－Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ（Ｃｈｒｏｎｏ－Ｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中、９００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃でインキュベートし、続いて、対照ビヒクルとしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または（Ｓ）Ｇ０４もしくは（Ｒ）Ｇ０４（図１Ａ）を含有するＤＭＳＯを添加した。（Ｓ）Ｇ０４および（Ｒ）Ｇ０４を、１、５、１０、３０および５０μＭの濃度で試験した。
【0062】
試料をそれぞれの化合物と共に２分間インキュベートした後、コラーゲン（１μｇ／ｍｌ）を添加することによって血小板凝集を誘導し、誘導後６分で相対凝集値を読み取った。各化合物の用量応答を導出した。これらのデーターを用いて、５０％凝集が達成されるＩＣ５０濃度を決定した。
【0063】
（Ｓ）Ｇ０４および（Ｒ）Ｇ０４についてのこれらの実験の結果を図１Ｂに示す。これらの実験では、４μｇ／ｍｌのコラーゲン濃度を使用した。（Ｒ）Ｇ０４および（Ｓ）Ｇ０４について計算されたＩＣ５０は、それぞれ４０μＭおよび４μＭである。
【0064】
（Ｓ）Ｇ０４の薬物動態（ＰＫ）試験
標準（Ｓ）Ｇ０４を、ＤＭＳＯストック（５０ｍＭ）からＰＡＳ緩衝液で１０および５０μＭに希釈し、ＩＶ注射によりマウスに投与し、血清試料を１、３、１０、３０分の時点で収集し、分析前に－８０℃で貯蔵した。マウス血清からのＰＫ試料（眼窩後出血）は、通常２０～１００μＬであった。
標準（Ｓ）Ｇ０４を、ＤＭＳＯストック（５０ｍＭ）からＰＡＳ緩衝液で１０および５０μＭに希釈し、ＩＶ注射によりマウスに投与し、血清試料を１、３、１０、３０分の時点で収集し、分析前に－８０℃で貯蔵した。マウス血清からのＰＫ試料（眼窩後出血）は、通常２０～１００μＬであった。
【0065】
０～１μＭ、すなわち、０、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１μＭの範囲の検量線を、標準溶液（１０Ｍ（Ｓ）Ｇ０４／ＰＡＳ緩衝液）をブランクマウス血清にスパイクし、それに応じて連続希釈することによって調製した。
【0066】
ＱＣ試料は、０．０５および０．５μＭの最終濃度で同じ方法で調製した。
【0067】
試料は、以下の工程を実施することによって調製した。マウス血清（ＰＫ試料、キャリブレーターおよびＱＣ）２０μＬ、およびメタノール中の内部標準２０μＬを加え、３０秒間ボルテックスする。冷たいＭｅＯＨの１００μＬを加え、次いで１分間ボルテックスを加える。５分間静置した後、４℃で２１，１００×ｇ（ＲＣＦ）で１０分間遠心分離する。上清を１００μＬとり、オートサンプラーバイアルに移す（最大回収量、Ｗａｔｅｒｓ）。バイアルにキャップを付け、分析用ＵＰＬＣ－ＭＳオートサンプラーにバイアルをセットする。有機溶媒は室温で比較的速く蒸発するので、有機溶媒中の試料は、注入前６時間よりも長く室温に放置すべきではない。ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステム：クリーニングコーンを、製造業者のオペレーションＳＯＰ／文書に従ってセットアップする。ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステム上の注入量は、通常、３～１０μｌである。以下のパラメータを使用して、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳで試料を実行する。
【0068】
溶媒Ａ：水０．１％ギ酸
【0069】
溶媒Ｂ：アセトニトリル０．１％ギ酸
【0070】
注射容量はポジティブモードで５μＬであった
【0071】
勾配移動相を二元溶媒系と共に使用し、これを９５％溶媒Ａから０％溶媒Ａに５分間かけて変化させ、３分間保持し、次いで８．１分間で９５％溶媒Ａに変化させ、これを１１分間保持した。全実行時間は１１分であり、流速は０．２ｍＬ／分であった。
【0072】
カラム温度は３０℃に保った。毛細管電圧はＥＳ＋モードで１ＫＶ、コーン電圧は３５Ｖ、衝突２５Ｖ、脱溶媒温度３５０℃、脱溶媒ガス流量８００Ｌ／ｈ、電源温度１２０℃である。これらの実験の結果を図２に示す（上のラインは５０μＭであり、下のラインは１０μＭである）。これらの結果は、１分後の（Ｓ）Ｇ０４濃度の実質的な低下、およびその後の継続的な低下を実証する。（Ｓ）Ｇ０４には速いＰＫ：１分間の注入濃度の１００倍以上の減少がある。
【0073】
ヒト血小板回収試験
インビボでの血小板活性化の（Ｓ）Ｇ０４および（Ｒ）Ｇ０４予防を評価するために、長期（７日目、図３および１４日目、図４）貯蔵溶液の異種移植を、馴化ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｇｃ－／（ＮＳＧ）マウスに輸血し、輸血後２４時間追跡したＣＦＳＥ標識冷貯蔵ヒト血小板（アクロドース、４人のＡＢＯ同一ドナーからのプール血小板）のアリコート（１×１０６血小板に相当）を採取することによって行った。
インビボでの血小板活性化の（Ｓ）Ｇ０４および（Ｒ）Ｇ０４予防を評価するために、長期（７日目、図３および１４日目、図４）貯蔵溶液の異種移植を、馴化ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｇｃ－／（ＮＳＧ）マウスに輸血し、輸血後２４時間追跡したＣＦＳＥ標識冷貯蔵ヒト血小板（アクロドース、４人のＡＢＯ同一ドナーからのプール血小板）のアリコート（１×１０６血小板に相当）を採取することによって行った。
【0074】
４つの貯蔵条件を試験した。全ての貯蔵条件において、ビヒクルは血小板添加剤溶液ＰＡＳ－３Ｍ（Ｇｒｉｆｏｌｓ， Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）であった。貯蔵条件は、（１）車両のみの室温貯蔵（ＲＴ－Ｖｅｈｉｃｌｅ）、（２）車両のみの低温貯蔵（１－６℃、平均～２℃）（Ｃｏｌｄ－Ｖｅｈｉｃｌｅ）、（３）１０μＭの車両の低温貯蔵（Ｓ）Ｇ０４（Ｃｏｌｄ－Ｇ０４－Ｓ）、（４）７５μＭの車両の低温貯蔵（Ｒ）Ｇ０４（Ｃｏｌｄ－Ｇ０４－Ｒ）とした。
【0075】
図３Ａは、７日間貯蔵した血小板の異なる時点での回復を示す。図３Ｂは、図３Ａから得られたＡＵＣを示す。＊ｐ＜０．０５；低温貯蔵ビヒクルとＲＴビヒクル血小板との間の＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、３回の分析の平均として提示される。図４Ａは、１４日間貯蔵した血小板の異なる時点での回復を示す。図４Ｂは、図４Ａから得られたＡＵＣを示す。＊ｐ＜０．０５；低温貯蔵群とＲＴビヒクル血小板との間の＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、３回の分析の平均として提示される。
【0076】
ビヒクルのみにおける低温貯蔵血小板生存は、血小板回収（図３Ａおよび図４Ａ）および曲線下面積（ＡＵＣ、図３Ｂおよび３Ｂ）によって評価した場合、有意に減少した。（Ｓ）Ｇ０４ １０μＭまたは（Ｒ）Ｇ０４ ７５μＭの存在下での血小板の低温貯蔵は、低温（ビヒクル）で７または１４日間貯蔵された血小板の生存の減少を完全に防止した。これらのデータは、（Ｓ）Ｇ０４が低温貯蔵血小板食作用およびインビボクリアランスの強力な阻害剤であることを確認する。
【0077】
Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｌｏｔ形成試験
次に、Ｇ０４（（Ｓ）Ｇ０４および（Ｒ）Ｇ０４）がｉｎ ｖｉｖｏ血餅形成に及ぼす影響を調べた。コンジェニックマウス血小板を冷（１～６℃）で４時間貯蔵し、アスピリン投与後２４時間マウスに投与した。出血時間を、血小板なし、室温で貯蔵されたビヒクルのみの血小板、ビヒクルのみの低温貯蔵血小板、ビヒクル＋（Ｒ）Ｇ０４（７５μＭ）低温貯蔵血小板、およびビヒクル＋（Ｓ）Ｇ０４（１０μＭ）低温貯蔵血小板を受けたアスピリン化マウスについて測定した。結果を対照非アスピリン化マウス（Ｂａｓａｌ）と比較した。
次に、Ｇ０４（（Ｓ）Ｇ０４および（Ｒ）Ｇ０４）がｉｎ ｖｉｖｏ血餅形成に及ぼす影響を調べた。コンジェニックマウス血小板を冷（１～６℃）で４時間貯蔵し、アスピリン投与後２４時間マウスに投与した。出血時間を、血小板なし、室温で貯蔵されたビヒクルのみの血小板、ビヒクルのみの低温貯蔵血小板、ビヒクル＋（Ｒ）Ｇ０４（７５μＭ）低温貯蔵血小板、およびビヒクル＋（Ｓ）Ｇ０４（１０μＭ）低温貯蔵血小板を受けたアスピリン化マウスについて測定した。結果を対照非アスピリン化マウス（Ｂａｓａｌ）と比較した。
【0078】
（Ｓ）Ｇ０４（１０μＭ）の存在下でのコンジェニックマウス血小板の輸血は、血小板の投与後２４時間でアスピリン処理マウスの出血時間を完全に補正した（図５；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；基線と他の群の各々との間で＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＲＴ貯蔵および低温、（Ｒ）Ｇ０４（７５μＭ）貯蔵血小板も出血時間を有意に補正したが、（Ｓ）Ｇ０４（１０μＭ）の程度では補正しなかった。
【0079】
これらのデータは、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ阻害剤（Ｓ）Ｇ０４または（Ｒ）Ｇ０４がそれらの止血活性を維持しながら、冷蔵などのストレス条件下での血小板の活性化を防止することができることを実証する。この効果は、マウス血小板およびヒト血小板の両方において明らかである。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【国際調査報告】