(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-13
(54)【発明の名称】核酸マススペクトル数値処理方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20230406BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 D
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022535644
(86)(22)【出願日】2020-12-09
(85)【翻訳文提出日】2022-06-09
(86)【国際出願番号】 CN2020134810
(87)【国際公開番号】W WO2021159833
(87)【国際公開日】2021-08-19
(31)【優先権主張番号】202010084107.4
(32)【優先日】2020-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522097588
【氏名又は名称】浙江迪譜診断技術有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＤＩＧＥＮＡ ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】２ｎｄ Ｆｌｏｏｒ， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｎｏ． ９， ３５５ Ｘｉｎｇｚｈｏｎｇ Ｒｏａｄ，Ｙｕｈａｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｈａｎｇｚｈｏｕ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１１１００ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】▲樹▼ 建▲偉▼
(72)【発明者】
【氏名】相 双▲紅▼
(72)【発明者】
【氏名】汪 松炯
【テーマコード（参考）】
2G041
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA03
2G041FA11
2G041LA01
2G041LA10
(57)【要約】
核酸マススペクトル数値処理方法は、単一のマススペクトルを再校正するステップであって、サンプルの各検測点に対して、検測点の異なる位置に対応する複数のマススペクトルを得て、各マススペクトルには、一組の予想質量電荷比を有する特殊なピークであるアンカーピークで再校正が行われる必要があるステップＳ１と、マススペクトルを合成するステップであって、ステップＳ１を基に、検測点の異なる位置に対応する複数のマススペクトルを当該検測点の単一マススペクトルに合成するステップＳ２と、ウェーブレットでフィルタリングするステップであって、ステップＳ２を基に、ウェーブレットベースデジタルフィルターで高周波ノイズとベースラインを除去するステップＳ３と、ピーク特徴値を抽出するステップであって、ステップＳ３を基に、ピークのフィットを行い、マススペクトルのフィットされた曲線に基づいて、ピーク高さと、ピーク幅と、ピーク面積と、マスオフセットと、信号対ノイズ比とを得るステップＳ４と、を含む。当該方法は、核酸マススペクトルのデータ採取の信頼性を向上させ、且つヌクレオチド検測の正確性を向上させる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一のマススペクトルを再校正するステップであって、サンプルの各検測点に対して、検測点の異なる位置に対応する複数のマススペクトルを得て、各マススペクトルは、一組の予想質量電荷比を有する特殊なピークであるアンカーピークで再校正が行われる、ステップＳ１と、マススペクトルを合成するステップであって、ステップＳ１を基に、検測点の異なる位置に対応する複数のマススペクトルを当該検測点の単一マススペクトルに合成するステップＳ２と、
ウェーブレットでフィルタリングするステップであって、ステップＳ２を基に、ウェーブレットベースデジタルフィルターで高周波ノイズとベースラインを除去するステップＳ３と、
ピーク特徴値を抽出するステップであって、ステップＳ３を基に、ピークのフィットを行い、マススペクトルのフィットされた曲線に基づいて、ピーク高さと、ピーク幅と、ピーク面積と、マスオフセットと、信号対ノイズ比とを得るステップＳ４と、
を含む核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項2】
前記ステップＳ１の単一のマススペクトルを再校正するステップは、候補参照ピークの選択ステップであって、ピーク値が必ず特定区間の質量範囲内に位置にあるとの一つ目の基準と、特定区間の質量範囲内に隣接する参照ピークがないとの二つ目の基準で、全ての可能な予想ピークから一組の参照ピークを選択するステップＳ１１と、
ピークの位置決めステップであって、幅が９である重み行列畳み込みフィルターをマススペクトルに応用し、行列として（－４，０，１，２，２，２，１，０，－４）を用い、マススペクトルの所定点について、当該フィルタリングが応用された強度値が周囲９つの値の加重和に等しく、以下の式で示され、
【数1】
マススペクトルのピークをフィットするステップＳ１３と、
最終アンカーピークの選択ステップであって、検測されたピーク値リストに対して、まずカットオフＳＮＲである最小ＳＮＲを見つけて、検測されたピークを候補参照ピークリストとマッチングして、質量が候補参照ピークの特定範囲内にあり且つＳＮＲがカットオフＳＮＲより高いピークのみ選択するステップＳ１４と、
再校正するステップであって、得られたアンカーピーク及びこれらの予想質量に合わせ、非線性フィットの方法を利用して校正係数を算出し、ここで、質量分析計とｍ／ｚ（質量電荷比）との間のマッピング関数がＢｒｕｃｋ関数であると仮定し、関数形態が
【数2】
【請求項3】
複数のマススペクトルを合成するステップは、「自己加重平均値」方法を使用し、前記ステップＳ２は、
当該マススペクトルが異なるの校正係数を有する場合、マススペクトルからアンカーピークが一番多い最優マススペクトルを選択するステップと、
最優マススペクトルで加算されたマススペクトルを初期化するステップと、
校正係数と最優スペクトルの校正係数が条件を満たす場合のみ、当該マススペクトルの絶対強度または平方強度ともう一つのマススペクトルの絶対強度または平方強度との和を求めるステップと、を含む、請求項１に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項4】
前記ステップＳ３は、高周波ノイズとベースラインとを除去するために、ウェーブレットベースフィルタリングが合成されたマススペクトルで完成され、その後当該フィルタリング後のマススペクトルに対して再校正をもう一回行い（同ステップＳ１）、これに合わせてｍ／ｚ値を調整する、請求項１に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項5】
前記ステップＳ４は、ピークをフィットするステップであって、ステップＳ１３と同様であるステップＳ４１と、
一、フィットされたピーク値の中心のベースライン以上の高度Ｈｆと、
二、フィット線幅λｆと、
三、ピークオフセット（フィットされたピーク値の中心と予想ピーク値の中心の距離）であるδｆ＝Ｍｆ－Ｍｅと、
四、４λｆ範囲内でフィットされたピークとベースラインとの間の面積Ａと、
五、ＳＮＲ＝Ｈｆ／Ｎ（Ｍｆ）である信号対ノイズ比と、
六、Ｖ＝Ａ／ＳＮＲである面積分散と、
七、フィット面積差Δであるフィットされた強度と測定強度との二乗の差の和の平方根と、の特徴を記録するステップＳ４２と、を含む、請求項１に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項6】
前記ステップＳ１３のピークをフィットするステップは、予想線幅を確定するステップＳ１３１と、
予想信号の領域がＮＮ個の予想線幅の間隔内で遮蔽され、ＮＮが４であるステップＳ１３２と、
ＭＭλｍ区間内のマススペクトルの強度ｙｉの平均値をインプリシットベースラインとして算出し、当該区間の遮蔽領域内において、線形補間でｙｉの値を提供し、λｍが当該区間内の一番小さい推定線幅であり、ＭＭが８０であるステップＳ１３３と、
（信号－ベースライン）の作動の有効値（ＲＭＳ）をノイズレベルとして算出するステップＳ１３４と、
点の遮蔽ステップであって、ピーク領域内において、ＳＮＲ（ピーク高さとノイズの比をＳＮＲとして算出する）が所定値より高く且つノイズが所定値より高い点がさらに遮蔽されるステップＳ１３５と、
各ピークの特定数の推定線幅内がフィット領域として確定され、重ねるピークがない場合、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムで単一のガウスピークをフィットし、指定パラメータを見つけて最適化関数を最小化させるステップＳ１３６と、を含む、請求項２に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項7】
「自己加重平均値」方法を使用して、複数のマススペクトルを合成し、以下の式で表され、【数3】
【請求項8】
前記ステップＳ１３１の予想線幅は、λｅ＝ＬＡ＋ＬＢ・Ｍとの式で表され、ＬＡとＬＢがデフォルトパラメータであり、Ｍが所定のピーク値（Ｄａ）である、請求項６に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項9】
前記ステップＳ１３６の最適化関数は、以下の式で表され、【数4】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は核酸マススペクトル（ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＵＭ）技術分野に属し、具体的に核酸マススペクトル数値処理方法に関する。
【背景技術】
【0002】
マススペクトル技術は、迅速、正確、高感度などの利点があり、近年では、生物学的分析に広く使用されている。生命の基本物質である核酸は、生物体の生長、発育、繁殖、遺伝および変異などの重大生命現象において重要な役割を果たしている。現代バイオテクノロジーでは、大部分の生理的または疾患的性状がいずれも一連の核酸配列に存在する遺伝子調節によって発現されることを発見した。したがって、核酸に対して、正確なヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）検測が特に重要である。マススペクトル数値処理は、ヌクレオチド検測の前に必要不可欠な部分として、その重要さは自明である。現在、類似な方法において、データ採取転化率が低く、データ不均衡などの問題が存在し、これらの問題がヌクレオチド検測の結果に深刻な影響を及ぼしており、この点についてはさらなる研究が必要である。
【発明の概要】
【0003】
本発明の目的は、マススペクトルデータの採取プロセスに存在する低転化率、データ不均衡などの問題に対し、遺伝子分析前に信頼性の高い特徴値を抽出する核酸マススペクトル数値処理方法を提供することにある。当該方法は、先行技術の制限を改善し、ヌクレオチド検測の正確性を向上させることを目標とする核酸マススペクトル数値処理方法である。
【0004】
本発明は、以下の技術方案を通じて実現したものである。
【0005】
核酸マススペクトル数値処理方法は、ステップＳ１、ステップＳ２、ステップＳ３、ステップＳ４を含む。
【0006】
ステップＳ１：単一のマススペクトルの再校正ステップであり、サンプルの各検測点に対し、検測点の異なる位置に対応する複数のマススペクトルを得る。各マススペクトルは、一組の予想質量電荷比を有する特殊なピークであるアンカーピークで再校正が行われる必要がある。
【0007】
ステップＳ２：マススペクトルの合成ステップであり、ステップＳ１を基に、検測点の同じ位置に対応する複数のマススペクトルで当該検測点の単一マススペクトルを合成する。
【0008】
ステップＳ３：ウェーブレットのフィルタリング（ｗａｖｅｌｅｔ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）ステップであり、ステップＳ２を基に、ウェーブレットベースデジタルフィルターで高周波ノイズとベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を除去する。
【0009】
ステップＳ４：ピーク特徴値の抽出ステップであり、ステップＳ３を基に、ピークのフィット（ｐｅａｋ ｆｉｔｔｉｎｇ）を行い、マススペクトルのフィットされた曲線に基づいて、ピーク高さと、ピーク幅と、ピーク面積と、マスオフセットと、信号対ノイズ比（Ｓｉｇｎａｌ ｔｏ Ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ、ＳＮＲ）とを得る。
【0010】
好ましくは、上記ステップＳ１において、単一のマススペクトルに対して再校正を行うステップは、ステップＳ１１乃至ステップＳ１５を含む：
【0011】
ステップＳ１１：候補参照ピークの選択ステップであり、ピーク値が特定区間の質量範囲内に位置しなければらなないとの一つ目の基準と、特定区間の質量範囲内に隣接する参照ピークがないとの二つ目の基準で、全ての可能な予想ピークから一組の参照ピークを選択する。
【0012】
ステップＳ１２：ピークの位置決めステップであり、幅が９である重み行列畳み込みフィルターをマススペクトルに応用し、行列として（－４，０，１，２，２，２，１，０，－４）が好ましい。マススペクトルの所定点に対して、当該フィルタリングが応用された強度値が周囲９つの値の加重和に等しく、以下の式で示される。
【0013】
【数1】
【0014】
フィルタリング後の強度値に基づいて、総マススペクトルを特定点の間隔に分解し、各間隔に対して、局所ノイズを認識し、局所ノイズの４倍以上であり且つ全般の最小値以上の強度を有するものを候補ピークとして認識し、最小値として、０．０１×最大局所最大値が好ましい。
【0015】
ステップＳ１３：マススペクトルのピークをフィットするステップである。
【0016】
ステップＳ１４：最終アンカーピークの選択ステップであり、検測されたピーク値リストに対して、まずカットオフＳＮＲ（ｃｕｔ－ｏｆｆ ＳＮＲ）である最小ＳＮＲを見つけて、検測されたピークを候補参照ピークリストとマッチングして、質量が候補参照ピークの特定範囲内にあり且つＳＮＲがカットオフＳＮＲより高いピークのみ選択する。
【0017】
ステップＳ１５：再校正するステップであり、得られたアンカーピーク及びこれらの予想質量に合わせ、非線性フィットの方法を利用して校正係数を算出する。ここで、質量分析計とｍ／ｚ（質量電荷比）との間のマッピング関数がＢｒｕｃｋ関数（ブルカー関数）であり、関数形態が以下のとおりであると仮定する。
【0018】
【数2】
【0019】
さらに、上記ステップＳ１３において、ピークフィットステップは、具体的にステップＳ１３１乃至ステップＳ１３６を含む：
ステップＳ１３１：予想線幅を確定する。
ステップＳ１３２：予想信号の領域がＮＮ個の予想線幅の間隔内で遮蔽され、ＮＮが４であることが好ましい。
ステップＳ１３３：ＭＭλｍ区間内のマススペクトルの強度ｙｉの平均値をインプリシットベースラインとして算出し、ここでλｍは当該区間内の一番小さい推定線幅であり、ここでＭＭが８０であることが好ましい。当該区間の遮蔽領域内において、線形補間でｙｉの値を提供する。
ステップＳ１３４：（信号－ベースライン）の作動の有効値（Ｒｏｏｔ Ｍｅａｎ Ｓｑｕａｒｅ、ＲＭＳ）をノイズレベルとして算出する。
ステップＳ１３５：点の遮蔽ステップであり、ピーク領域内において、ＳＮＲ（ピーク高さとノイズの比をＳＮＲとして算出する）が所定値より高く且つノイズが所定値より高い点がさらに遮蔽される。
ステップＳ１３６：各ピークの特定数の推定線幅内がフィット領域として確定され、重ねるピークがない場合、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムで単一のガウスピーク（Ｇａｕｓｓｉａｎ ｐｅａｋ）をフィットし、指定パラメータを見つけて最適化関数を最小化させる。
ステップＳ１３１：予想線幅を確定する。
ステップＳ１３２：予想信号の領域がＮＮ個の予想線幅の間隔内で遮蔽され、ＮＮが４であることが好ましい。
ステップＳ１３３：ＭＭλｍ区間内のマススペクトルの強度ｙｉの平均値をインプリシットベースラインとして算出し、ここでλｍは当該区間内の一番小さい推定線幅であり、ここでＭＭが８０であることが好ましい。当該区間の遮蔽領域内において、線形補間でｙｉの値を提供する。
ステップＳ１３４：（信号－ベースライン）の作動の有効値（Ｒｏｏｔ Ｍｅａｎ Ｓｑｕａｒｅ、ＲＭＳ）をノイズレベルとして算出する。
ステップＳ１３５：点の遮蔽ステップであり、ピーク領域内において、ＳＮＲ（ピーク高さとノイズの比をＳＮＲとして算出する）が所定値より高く且つノイズが所定値より高い点がさらに遮蔽される。
ステップＳ１３６：各ピークの特定数の推定線幅内がフィット領域として確定され、重ねるピークがない場合、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムで単一のガウスピーク（Ｇａｕｓｓｉａｎ ｐｅａｋ）をフィットし、指定パラメータを見つけて最適化関数を最小化させる。
【0020】
さらに、上記ステップＳ１３１において、予想線幅を確定するステップは、具体的に、
λｅ＝ＬＡ＋ＬＢ・Ｍとの式で表し、
ここで、ＬＡとＬＢがデフォルトパラメータであり、Ｍが所定のピーク値（Ｄａ）であるステップを含む。
λｅ＝ＬＡ＋ＬＢ・Ｍとの式で表し、
ここで、ＬＡとＬＢがデフォルトパラメータであり、Ｍが所定のピーク値（Ｄａ）であるステップを含む。
【0021】
さらに、上記ステップＳ１３６において、最適化関数は、以下のとおりである。
【0022】
【数3】
【0023】
ここで、総和は指定の区間において全ての｛ｙｉ，ｍｉ｝に対して和を求めるものであり、Ｈｆは点Ｍｆに対応するベースライン上方のフィット高度にであり、パラメータＭｆ、λｆはフィット質量、フィット線幅を示し、σｉは条件応じて特定のパラメータに所定する。
【0024】
さらに好ましい態様として、上記ステップＳ４において、特徴値を抽出するステップは、具体的に、ステップＳ４１乃至ステップＳ４２を含む。
ステップＳ４１：ピークをフィットするステップとして、ステップＳ１３と同じである。
ステップＳ４２：
一、フィットされたピーク値の中心のベースライン以上の高度Ｈｆと、
二、フィット線幅λｆと、
三、ピークオフセット（フィットされたピーク値の中心と予想ピーク値の中心の距離）であるδｆ＝Ｍｆ－Ｍｅと、
四、４λｆ範囲内でフィットされたピークとベースラインとの間の面積Ａと、
五、ＳＮＲ＝Ｈｆ／Ｎ（Ｍｆ）である信号対ノイズ比と、
六、Ｖ＝Ａ／ＳＮＲである面積分散と、
七、フィット面積差Δであるフィットされた強度と測定強度との二乗の差の和の平方根と、
の特徴を記録するステップである。
ステップＳ４１：ピークをフィットするステップとして、ステップＳ１３と同じである。
ステップＳ４２：
一、フィットされたピーク値の中心のベースライン以上の高度Ｈｆと、
二、フィット線幅λｆと、
三、ピークオフセット（フィットされたピーク値の中心と予想ピーク値の中心の距離）であるδｆ＝Ｍｆ－Ｍｅと、
四、４λｆ範囲内でフィットされたピークとベースラインとの間の面積Ａと、
五、ＳＮＲ＝Ｈｆ／Ｎ（Ｍｆ）である信号対ノイズ比と、
六、Ｖ＝Ａ／ＳＮＲである面積分散と、
七、フィット面積差Δであるフィットされた強度と測定強度との二乗の差の和の平方根と、
の特徴を記録するステップである。
【0025】
本発明には、以下のような利点がある。
１、本発明の核酸マススペクトル数値処理方法は、遺伝子分析前に信頼性の高い特徴値を抽出して、先行技術の制限を改善し、ヌクレオチド検測の正確性を向上させることを目標とする。
２、核酸マススペクトル数値処理方法は、核酸マススペクトルデータ採取の信頼性の向上させる。
１、本発明の核酸マススペクトル数値処理方法は、遺伝子分析前に信頼性の高い特徴値を抽出して、先行技術の制限を改善し、ヌクレオチド検測の正確性を向上させることを目標とする。
２、核酸マススペクトル数値処理方法は、核酸マススペクトルデータ採取の信頼性の向上させる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
次に、図と実施例を参照して、本発明の内容をさらに詳しく説明する。
【0028】
本発明は、核酸マススペクトル数値処理方法であり、ステップＳ１乃至ステップＳ４を含む。
【0029】
ステップＳ１：単一のマススペクトルの再校正ステップである。単一のサンプルに対し、サンプル検測点の異なる位置に対応する複数の（通常ｎ＝５）マススペクトルを得る。各マススペクトルは、実質上、複数回のレーザー励起（通常、ｎ＝２０）のマススペクトルの和である。マススペクトルの初期係数は、質量分析計（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）とｍ／ｚ（質量電荷比）との間のマッピング関数が二次関数（関数形式がｍ＝Ａｔ２＋Ｂｔ＋Ｃである）であると仮定して生成されたもので、マススペクトルに対して和を算出する前に、マススペクトルの再校正を行う必要がある。再校正プロセスは、アンカーピーク（ａｎｃｈｏｒ ｐｅａｋ）と呼ばれる一組の特殊認識ピークをその予想質量をマッチングすることで実現し、ステップＳ１１乃至ステップＳ１５に従って行う。
【0030】
ステップＳ１１：候補参照ピークの選択ステップであり、
１、ピーク値が４０００Ｄａと９０００Ｄａの質量範囲内に位置しなければならないとの基準と、
２、ピーク値が質量±分解能で定義された質量範囲内に隣接する参照ピークがないとの基準で、
全ての可能な予想ピークからクリーンな参照ピーク（ｃｌｅａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｅａｋ）を一組選択する。
１、ピーク値が４０００Ｄａと９０００Ｄａの質量範囲内に位置しなければならないとの基準と、
２、ピーク値が質量±分解能で定義された質量範囲内に隣接する参照ピークがないとの基準で、
全ての可能な予想ピークからクリーンな参照ピーク（ｃｌｅａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｅａｋ）を一組選択する。
【0031】
ステップＳ１２：ピークの位置決めステップであり、幅が９である重み行列畳み込みフィルターをマススペクトルに応用し、行列として（－４，０，１，２，２，２，１，０，－４）が好ましい。マススペクトルの所定点について、当該フィルタリングが応用された強度値が周囲９つの値の加重和に等しく、以下の公式で示される。
【0032】
【数4】
【0033】
フィルタリング後の強度値に基づいて、比較的に小さなスライドウィンドウ（ｎ＝±３）を使用して局所最大値を認識する。その後、マススペクトル全体を５００個点ごとに一つの区間に分けて、各区間に対して、周囲１５００点ウィンドウ（±区間一つ）内の局所最大値の３３％を局所ノイズとして認識する。局所ノイズの四倍以上であり且つ全般の最小値以上である強度を持つピークを候補ピークとして認識し、最小値が０．０１×最大局所最大値であることが好ましい。認識されたピークリストに対して、一定の範囲内に隣接候補ピークが存在し、ＳＮＲ（フィルタリング後の強度値と局所ノイズの比）≦２及び質量値が予め指定された候補参照ピーク範囲外であるピークが除去させる。最後に、原始強度に基づいてピーク値指数を調整する。フィルター応用前後のマススペクトルとして、図１、図２を参照する。
【0034】
ステップＳ１３：マススペクトルのピークをフィットするステップであり、図３を参照し、具体的な実現ステップとして、以下のようである。
【0035】
ステップＳ１３１：予想線幅を確定するステップであり、予想線幅は、
λｅ＝ＬＡ＋ＬＢ・Ｍとの式で確定する。
ここで、ＬＡとＬＢがデフォルトパラメータ（デフォルト値がそれぞれ２．５、０．０００５である）であり、Ｍが所定のピーク値（Ｄａ）である。
λｅ＝ＬＡ＋ＬＢ・Ｍとの式で確定する。
ここで、ＬＡとＬＢがデフォルトパラメータ（デフォルト値がそれぞれ２．５、０．０００５である）であり、Ｍが所定のピーク値（Ｄａ）である。
【0036】
ステップＳ１３２：予想信号の領域がＮＮ個の予想線幅の間隔内で遮蔽され、ＮＮが４であることが好ましい。
【0037】
ステップＳ１３３：ＭＭλｍ区間内のマススペクトルの強度ｙｉの平均値をインプリシットベースラインとして算出し、ここでλｍは当該区間内の一番小さい推定線幅であり、ＭＭが８０であることが好ましい。当該区間の遮蔽領域内において、線形補間を使用してｙｉの値を提供する。
【0038】
ステップＳ１３４：（信号－ベースライン）の作動の有効値（ＲＭＳ）をノイズレベルとして算出する。
【0039】
ステップＳ１３５：ピーク領域内において、ＳＮＲ（ピーク高さとノイズの比をＳＮＲとして算出する）が５を超え且つノイズが１を超える点がさらに遮蔽される。
【0040】
ステップＳ１３６：各ピークの４個の推定線幅内がフィット領域として確定され、重ねるピークがない場合、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムで単一のガウスピークをフィットし、最適化関数（関数の原型は以下の通り）を最小化させるパラメータＭｆ、λｆ（フィット質量、フィット線幅）を見つける。
【0041】
【数5】
【0042】
総和は指定の区間において全ての｛ｙｉ，ｍｉ｝に対して和を求めるものであり、Ｈｆは点Ｍｆのベースライン上方のフィット高度に該当する。ピーク値の中心から０．５λｅ以内の点について、σｉを１とし、ピーク値の中心から０．５λｅ以外の点について、σｉを０．２または０．４とする。
【0043】
ステップＳ１４：最終アンカーピークの選択ステップであり、検測されたピーク値リストに対して、まずカットオフＳＮＲ（即ち最小ＳＮＲ）を見つけ出し、検測されたピークを候補参照ピークリストとマッチングして、質量が候補参照ピーク±２５Ｄａ内にあり且つＳＮＲがカットオフＳＮＲより高いピークのみ選択する。
【0044】
ステップＳ１５：再校正ステップであり、得られたアンカーピーク及びそれらの予想質量に合わせ、非線性フィットの方法を利用して校正係数を算出する。ここで、質量分析計とｍ／ｚ（質量電荷比）との間のマッピング関数がＢｒｕｃｋ関数であり、関数形態が以下の通りであると仮定する。
【0045】
【数6】
【0046】
ステップＳ２：マススペクトルの合成ステップであり、ステップＳ１を基に、点の異なる位置に対応するいくつかのマススペクトルを総集して当該検測点の唯一なマススペクトルとする。複数のマススペクトルを合成する方法が「自己加重平均値（ｓｅｌｆ－ｗｅｉｇｈｔｅｄ ａｖｅｒａｇｅ）」であり、以下の式で表現できる。
【0047】
【数7】
【0048】
ここで、ｎがマススペクトルの数であり、Ｉ－
ｉが質量ｉの平均強度であり、Ｉｉｊがｊ個目のマススペクトルの質量ｉに由来する強度である。当該マススペクトルが異なるの校正係数を有する場合、マススペクトルからアンカーピークが一番多い最優マススペクトルを選択する。最優マススペクトルで、加算されたマススペクトルを初期化する。当該校正係数と最優スペクトルの校正係数が条件（Ａが１％内で変化する。Ｂが１０％以内で変化する。Ｃが当該２０Ｄａ以内で変化する）を満たす場合のみに、当該マススペクトルをもう一つのマススペクトルの絶対強度または平方強度と和を求める。
【0049】
ステップＳ３：ウェーブレットフィルタリングステップであり、高周波ノイズとベースラインとを除去するために、ウェーブレットベースフィルタリングが合成されたマススペクトルで完成される。その後当該フィルタリング後のマススペクトルに対してもう一回の再校正を行う。今回の再校正の後、新たなＡＢＣ係数を合成マススペクトルに分配し、これに合わせてｍ／ｚ値を調整する。
【0050】
ステップＳ４：ピーク特徴値の抽出ステップであり、図３を参照し、フィットプロセスは、以下のようなステップに従う。
【0051】
ステップＳ４１：ピークをフィットするステップとして、ステップＳ１３と同様である。
【0052】
ステップＳ４２：フィットするには、
一、フィットされたピーク値の中心のベースライン以上の高度Ｈｆと、
二、フィット線幅λｆと、
三、ピークオフセット（フィットされたピーク値の中心と予想ピーク値の中心の距離）であるδｆ＝Ｍｆ－Ｍｅと、
四、４λｆ範囲内において、フィットされたピークとベースラインとの間の面積Ａと、
五、ＳＮＲ＝Ｈｆ／Ｎ（Ｍｆ）である信号対ノイズ比と、
六、Ｖ＝Ａ／ＳＮＲである面積分散と、
七、フィット面積差Δであるフィットされた強度と測定強度との二乗の差の和の平方根と、の特徴を成功的に記録する。
一、フィットされたピーク値の中心のベースライン以上の高度Ｈｆと、
二、フィット線幅λｆと、
三、ピークオフセット（フィットされたピーク値の中心と予想ピーク値の中心の距離）であるδｆ＝Ｍｆ－Ｍｅと、
四、４λｆ範囲内において、フィットされたピークとベースラインとの間の面積Ａと、
五、ＳＮＲ＝Ｈｆ／Ｎ（Ｍｆ）である信号対ノイズ比と、
六、Ｖ＝Ａ／ＳＮＲである面積分散と、
七、フィット面積差Δであるフィットされた強度と測定強度との二乗の差の和の平方根と、の特徴を成功的に記録する。
【0053】
本発明の核酸マススペクトル数値処理方法は、遺伝子分析前に信頼性の高い特徴値を抽出し、先行技術の制限を改善し、ヌクレオチド検測の正確性を向上させることを目標とする。核酸マススペクトル数値処理方法は、核酸マススペクトルデータ採取の信頼性を向上させる。
【図1】
【図2】
【図3】
【手続補正書】
【提出日】2022-06-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一のマススペクトルを再校正するステップであって、サンプルの各検測点に対して、検測点の異なる位置に対応する複数のマススペクトルを得て、複数のマススペクトルの各マススペクトルは、一組の予想質量電荷比を有するアンカーピークで再校正が行われる、ステップＳ１と、マススペクトルを合成するステップであって、ステップＳ１を基に、検測点の異なる位置に対応する複数のマススペクトルを当該検測点の単一マススペクトルに合成するステップＳ２と、
検測点の単一マススペクトルにおいてウェーブレットでフィルタリングするステップであって、ステップＳ２を基に、ウェーブレットベースデジタルフィルターで高周波ノイズとベースラインを除去するステップＳ３と、
ピーク特徴値を抽出するステップであって、ステップＳ３を基に、ピークのフィットを行い、検測点の単一マススペクトルのフィットされた曲線を得て、前記フィットされた曲線に基づいて、ピーク高さと、ピーク幅と、ピーク面積と、マスオフセットと、信号対ノイズ比とを得るステップＳ４と、を含む核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項2】
前記ステップＳ１の単一のマススペクトルの再校正するステップは、一組の参照ピークの選択ステップであって、ピーク値が必ず特定区間の質量範囲内に位置にあるとの一つ目の基準と、特定区間の質量範囲内に隣接する参照ピークがないとの二つ目の基準で、全ての可能な予想ピークから前記一組の参照ピークを選択するステップＳ１１と、
ピークの位置決めステップであって、幅が９である重み行列畳み込みフィルターを単一のマススペクトルに応用し、行列として（－４，０，１，２，２，２，１，０，－４）を用い、単一のマススペクトルの所定点について、当該フィルタリングが応用された強度値が周囲９つの値の加重和に等しく、以下の式で示され、
【数1】
単一のマススペクトルのピークをフィットするステップＳ１３と、
最終アンカーピークの選択ステップであって、検測されたピーク値リストに対して、まずカットオフ信号対雑音比を見つけて、検測されたピークを参照ピークリストとマッチングして、質量が参照ピークの特定範囲内にあり且つ信号対雑音比がカットオフ信号対雑音比より高いピークのみ選択するステップＳ１４と、
再校正するステップであって、アンカーピーク及びこれらの予想質量に合わせ、非線性フィットの方法を利用して校正係数を算出し、ここで、質量分析計と質量電荷比との間のマッピング関数がＢｒｕｃｋ関数であり、関数形態が
【数2】
【請求項3】
前記複数のマススペクトルを合成するステップは、自己加重平均値方法を使用し、前記ステップＳ２は、
当該マススペクトルが異なるの校正係数を有する場合、マススペクトルからアンカーピークが一番多い最優マススペクトルを選択するステップと、
複数のマススペクトルにおいて自己加重平均値方法を使用して合成されたマススペクトルを、最優マススペクトルで初期化するステップと、
校正係数と最優スペクトルの校正係数が条件を満たす場合のみ、当該マススペクトルの絶対強度または平方強度ともう一つのマススペクトルの絶対強度または平方強度との和を求めるステップと、を含む、請求項１に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項4】
前記ステップＳ３は、高周波ノイズとベースラインとを除去してフィルタリング後のマススペクトルを得るために、ウェーブレットベースフィルタリングが検出点の単一マススペクトルで完成され、その後、前記フィルタリング後のマススペクトルに対して再校正をもう一回行い、これに合わせて質量電荷比値を調整する、請求項１に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項5】
前記ステップＳ４は、単一マススペクトルのピークをフィットしてフィットされたピークを得るステップＳ４１と、
一、前記フィットされたピーク値の中心のベースライン以上の高度Ｈｆと、
二、フィット線幅λｆと、
三、ピークオフセットであるフィットされたピーク値の中心と予想ピーク値の中心の距離であるδｆ＝Ｍｆ－Ｍｅと、
四、４λｆ範囲内でフィットされたピークとベースラインとの間の面積Ａと、
五、ＳＮＲ＝Ｈｆ／Ｎ（Ｍｆ）である信号対ノイズ比と、
六、Ｖ＝Ａ／ＳＮＲである面積分散と、
七、フィット面積差Δであるフィットされた強度と測定強度との二乗の差の和の平方根と、の特徴を記録するステップＳ４２と、を含む、請求項１に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項6】
前記ステップＳ１３のピークをフィットするステップは、予想線幅を確定するステップＳ１３１と、
予想信号の領域がＮＮ個の予想線幅の間隔内で遮蔽され、ＮＮが４であるステップＳ１３２と、
ＭＭλｍ区間内の単一のマススペクトルの強度ｙｉの平均値をインプリシットベースラインとして算出し、当該ＭＭλ ｍ 区間の遮蔽領域内において、線形補間でｙｉの値を提供し、λｍが当該ＭＭλ ｍ 区間内の一番小さい推定線幅であり、ＭＭが８０であるステップＳ１３３と、
信号－ベースラインの作動の有効値をノイズレベルとして算出するステップＳ１３４と、
点の遮蔽ステップであって、ピーク領域内において、ピーク高さとノイズの比として算出する信号対雑音比が当該比の所定値より高く且つノイズが当該ノイズの所定値より高い点がさらに遮蔽されるステップＳ１３５と、
各ピークの特定数の推定線幅内がフィット領域として確定され、重ねるピークがない場合、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムで単一のガウスピークをフィットし、指定パラメータを見つけて最適化関数を最小化させるステップＳ１３６と、を含む、請求項２に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項7】
前記自己加重平均値方法は以下の式で表され、【数3】
【請求項8】
前記ステップＳ１３１の予想線幅は、λｅ＝ＬＡ＋ＬＢ・Ｍとの式で表され、ＬＡとＬＢがデフォルトパラメータであり、Ｍが所定のピーク値である、請求項６に記載の核酸マススペクトル数値処理方法。
【請求項9】
前記ステップＳ１３６の最適化関数は、以下の式で表され、【数4】
【国際調査報告】