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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-17
(54)【発明の名称】組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20230510BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20230510BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230510BHJP
A61P 15/08 20060101ALI20230510BHJP
A61K 35/48 20150101ALI20230510BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N1/04
C12Q1/04
A61P15/08
A61K35/48
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022560233
(86)(22)【出願日】2021-04-02
(85)【翻訳文提出日】2022-11-24
(86)【国際出願番号】 EP2021058809
(87)【国際公開番号】W WO2021198517
(87)【国際公開日】2021-10-07
(31)【優先権主張番号】20168012.1
(32)【優先日】2020-04-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522386840
【氏名又は名称】イノセルズ ベーフェー
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＯＣＥＬＬＳ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｇａｅｔａｎｏ Ｍａｒｔｉｎｏｌａａｎ ６３ａ ６２２９ ＧＳ Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100121083
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 宏義
(74)【代理人】
【識別番号】100138391
【弁理士】
【氏名又は名称】天田 昌行
(74)【代理人】
【識別番号】100132067
【弁理士】
【氏名又は名称】岡田 喜雅
(74)【代理人】
【識別番号】100137903
【弁理士】
【氏名又は名称】菅野 亨
(72)【発明者】
【氏名】アフマド アコンディ モハマド メフディ
(72)【発明者】
【氏名】アイ ジャファル
(72)【発明者】
【氏名】エブラヒミ バラ ソマイエ
(72)【発明者】
【氏名】モハマディ ゾーレ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ06
4B063QQ08
4B063QX01
4B065AA93X
4B065BA22
4B065BD09
4B065BD12
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB61
4C087BB64
4C087CA04
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA81
(57)【要約】
本発明は、卵巣反応不良の処置のための方法における使用のための子宮内膜幹細胞、特に子宮内膜間葉系幹細胞（ＥｎＭＳＣ）を含む組成物、および子宮内膜幹細胞、特に子宮内膜間葉系幹細胞のバンキングのための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
卵巣反応不良の処置のための方法における使用のための子宮内膜幹細胞を含む組成物であって、前記子宮内膜幹細胞が、子宮内膜組織試料に由来する、組成物。
【請求項2】
前記子宮内膜幹細胞が、ヒト自己子宮内膜幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記子宮内膜幹細胞が、子宮内膜間葉系幹細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記子宮内膜間葉系幹細胞が、ＣＤ９０、ＣＤ１４６およびＣＤ１０５マーカーに対して陽性、かつＣＤ３４およびＣＤ３１マーカーに対して陰性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記子宮内膜間葉系幹細胞が、Ｏｃｔ－４、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ－１を発現する、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項6】
前記組成物が、卵巣内に、または少なくとも一方の卵巣に投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物が、７．２～７．４のｐＨの、以下：ＰＢＳ溶液、自己血清、無菌生理食塩水または細胞培養培地から選択される生理学的に適切な溶液をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記子宮内膜幹細胞が、５０万～１０００万細胞数／ｍＬ、好ましくは９５万～８００万細胞数／ｍＬ、最も好ましくは１５０万～６５０万細胞数／ｍＬの濃度である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物が、１用量あたり５０万～２００万細胞数、好ましくは１用量あたり８０万～１３０万細胞数の量で、１～５用量、好ましくは２～４用量投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
卵巣反応不良を処置する方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の子宮内膜幹細胞を含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項11】
本発明による子宮内膜幹細胞または組成物のバンキングのための方法であって、ａ．対象から子宮内膜幹細胞を得ること；
ｂ．細菌、酵母または真菌汚染についてチェックすること；
ｃ．好ましくはＧｉｂｃｏのＭｙｃｏＴｅｃｔキット（カタログ番号１５６７２－０１７）を使用して、マイコプラズマについて子宮内膜幹細胞の試料を試験すること；
ｄ．前記子宮内膜幹細胞が対数後期に達した後、５００００００～２０００００００個細胞／ｍＬで前記子宮内膜幹細胞を凍結培地に再懸濁させること；
ｅ．５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ内、１０００ｇで１５分間、前記再懸濁された子宮内膜幹細胞を遠心分離すること；
ｆ．遠心分離された子宮内膜幹細胞から上清を吸引し、凍結培地を添加し、均質になるまで細胞を粉砕すること；
ｇ．ステップｆ．から得られた前記子宮内膜幹細胞の１ｍＬをバイアルに等分し、バイアルを－２０℃のフリーザーで、容器中、３時間凍結すること；
ｈ．前記容器を－８０℃のフリーザーに移し、終夜貯蔵すること；
ｉ．液体Ｎ２タンク中のラックにおいて、ステップｆ．から得られた前記バイアルを翌日貯蔵すること
を含む、方法。
【請求項12】
前記子宮内膜幹細胞が、子宮内膜間葉系幹細胞である、請求項１１に記載の子宮内膜幹細胞または組成物のバンキングのための方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、卵巣反応不良（ＰＯＲ）の処置のための方法における使用のための組成物、および子宮内膜幹細胞を含むそのような組成物を作製するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
例えば卵巣反応不良の結果として、女性対象のかなりの部分、例えばすべての年齢の不妊女性対象は、不妊症を経験している。卵巣反応不良（ＰＯＲ）は、回収された卵母細胞の数の低減をもたらす卵胞反応の低減によって特徴付けられる疾患である。
【0003】
Ｆｅｒｒａｒｅｔｔｉら［１］によって記載されるボローニャ基準によれば、ＩＶＦにおける反応不良を定義するために、以下の３つの特性の少なくとも２つが存在しなければならない：（ｉ）高齢の母親、またはＰＯＲについてのリスク因子のいずれか、（ｉｉ）以前の卵巣反応不良（従来の刺激プロトコールにより≦３卵母細胞）、および（ｉｉｉ）異常な卵巣予備能力試験（すなわち、＜３～６卵胞の胞状卵胞数（ＡＦＣ）、または＜０．５～１．１ｎｇ／ｍｌのＡＭＨ）。
【0004】
最大刺激後のＰＯＲの２つの出来事は、高齢の母親または異常な卵巣予備能力試験（ＯＲＴ）の非存在下での反応不良として患者を定義するのに十分である。定義によって、ＰＯＲという用語は、卵巣反応を指し、したがって、１回の刺激サイクルは、ＰＯＲの診断のために必須と考えられる。しかしながら、高齢および異常なＯＲＴの両方が、卵巣予備能力の低減を示し、卵巣刺激サイクルの結果の代替として作用し得るので、異常なＯＲＴの高齢の患者は、低反応者として分類され得る。
【0005】
多くの研究が、ゴナドトロピン投薬量の増加、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（５、６）の使用、テストステロン（７）、回収された卵母細胞数における成長ホルモン（８、９）、ＩＶＦ／ＩＣＳＩサイクルを通したＰＯＲの妊娠率および生児出生率などの異なる刺激プロトコールの効果（２～４）の調査を成し遂げている。しかしながら、有効性の欠如のために、より精密で有効な方法に従う必要がある。したがって、新たな戦略は、ＰＯＲの不妊症を管理し、卵母細胞／胚提供からそれらを救うための存在になるはずである。
【0006】
ＰＯＲと診断された対象は、一般に、その年齢の健康な女性対象と比較して、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）レベルの減少、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の増加、胞状卵胞数（ＡＦＣ）の減少および低い卵母細胞の質を有する。さらに、ＰＯＲ対象は、卵胞反応の低減および卵母細胞を産生する卵巣の能力の低減を示した。ＰＯＲの女性対象によって産生される卵母細胞は、典型的には、良好な卵巣予備能力を有する女性によって産生される卵母細胞と比較して、質が劣っている。ＰＯＲの発生は、卵胞の枯渇のプロセスおよび卵母細胞の質の低下に関連し、かなりの数のＰＯＲ対象は、血のつながった子孫に対する熱望がある。現在、これらの対象において妊娠を達成する唯一の方法は、体外受精（ＩＶＦ）などの生殖補助医療（ＡＲＴ）の手段によるものであり、これは、高用量のゴナドトロピンによる卵巣刺激を必要とする。生殖補助技術を受けているＰＯＲの対象における結果を改善するために、さまざまなモダリティが試みられている。これらとして、高用量ＦＳＨ処置、黄体形成ホルモン（ＬＨ）補充、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アンタゴニストサイクル、ならびにエストラジオールプライミング、成長ホルモン、Ｌ－アルギニンおよびデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）などの補助処置の使用が挙げられる。これらのゴナドトロピン処置および妊孕性処置は、腹部痛、悪心、嘔吐、体重増加、ざ瘡、乳房痛または圧痛、および気分変動などの負の副作用があり、これらは、処置の中止をもたらし得る。さらに、ゴナドトロピン処置は、初期胞状卵胞の排卵前期への発達を促進するために広く使用されているが、多くのＰＯＲ対象は、ゴナドトロピン治療に反応しない。ＰＯＲの女性対象は、卵母細胞の回収の間に卵母細胞の数が少ないことがあり、そのため、正常な卵巣予備能力を有する女性対象と比較した場合に、移植のための胚が少なく、受胎の可能性が低い。これらのＰＯＲ対象は、卵胞発達がないことに起因して、回収された卵母細胞の欠如に起因して、受精の成功の欠如、または妊娠失敗の増加（例えば、高い流産率、これは、ＰＯＲ対象において見出される最初の低い卵母細胞の質に起因すると考えられる）のいずれかで、ＩＶＦサイクルの中途でのキャンセルが必要なことがある。このため、多くのＰＯＲ対象を、ドナー卵母細胞プログラムまたは養子縁組プログラムのいずれかに頼ることになる。
【0007】
Ｚａｆａｒｄｏｕｓｔら［１０］は、ＰＯＲ対象における妊娠率を改善するための自己月経血由来間葉系間質細胞の適用を記載している。しかしながら、子宮内膜組織に由来するＥｎＳＣは、月経幹細胞と比較して、より高いテロメラーゼ活性、より低い壊死細胞パーセンテージ、低汚染物質および／またはより高い細胞増殖性を有し得る。本発明によって、子宮内膜組織からこれらの細胞を調製するための方法、およびＰＯＲ対象を処置するためのその有利な使用が提示される。
【0008】
ＰＯＲの対象を管理することは不妊症の専門家にとって難題であり、ほとんどの対象が血のつながった子孫に対する熱望がある。そのため、以下の利点：負の副作用が少ない、自己卵母細胞の許容、新しい卵母細胞形成、卵母細胞の質の向上、体外受精ではない受胎、自然受胎の許容、ＰＯＲ状態と比較してより低いＦＳＨ血清レベルの再確立（正常な血清レベルの方へ）、ＰＯＲ状態と比較してより高いＡＭＨ血清レベルの再確立（正常な血清レベルの方へ）、およびＰＯＲ状態と比較してより高いエストラジオール（Ｅ２）血清レベルの再確立（正常な血清レベルの方へ）のうちの少なくとも１つを有するＰＯＲ処置に対する要望がある。血清レベルは、血液の血清レベルを意味することが理解される。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、卵巣反応不良の処置のための方法における使用のための子宮内膜幹細胞、好ましくは子宮内膜間葉系幹細胞を含む組成物を提供する。本発明は、子宮内膜幹細胞、特に子宮内膜間葉系幹細胞を含む組成物を作製するためおよびバンキングのための方法にさらに関する。
【0010】
驚くべきことに、本発明による組成物が、生殖細胞様の細胞を生じさせ、ならびに／またはある特定のホルモン血清レベル、例えば以下：ＡＭＨ、ＦＳＨおよびエストラジオールの血清レベルのうちの少なくとも１つを、非ＰＯＲ血清レベルに（正常な血清レベルの方へ）再確立させることを見出した。
【0011】
本発明の組成物は、以下の利点：負の副作用が少ない、自己卵母細胞の許容、新しい卵母細胞形成、卵母細胞品質の増加、体外受精ではない受胎、自然受胎の許容、卵巣機能の再生、卵形成、ＰＯＲ状態と比較してより低いＦＳＨ血清レベルの再確立（正常な血清レベルの方へ）、ＰＯＲ状態と比較してより高いＡＭＨ血清レベルの再確立（正常な血清レベルの方へ）、およびＰＯＲ状態と比較してより高いエストラジオール（Ｅ２）血清レベルの再確立（正常な血清レベルの方へ）のうちの少なくとも１つを有する。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、卵巣反応不良の処置のための方法における使用のための子宮内膜幹細胞を含む組成物であって、前記子宮内膜幹細胞が、子宮内膜組織試料に由来する、組成物を提供する。
【0013】
組成物は、好ましくは自己およびヒトの子宮内膜間葉系幹細胞を含む。
【0014】
定義
本明細書において使用される「マーカー」または「バイオマーカー」（「生物学的マーカー」または「分子マーカー」または「遺伝子マーカー」または「タンパク質マーカー」などとしても公知）という用語は、いくつかの生物学的状態または状況または疾患または疾患に関連する合併症の測定可能な指標を指す。バイオマーカーは、血液中を循環しているまたは血清、生体液もしくは組織中に存在する任意の分子（無機もしくは有機分子、タンパク質またはヌクレオチド配列）または物質、あるいは特定の組織または細胞において発現される遺伝子またはポリヌクレオチドであり得る。本発明の実施形態において、マーカーは、ヒト対象のもしくは対象の血液の血清、またはヒト対象もしくは対象由来の子宮内膜細胞もしくは幹細胞中に存在するかまたは発現される、タンパク質および／またはホルモンである。
本明細書において使用される「マーカー」または「バイオマーカー」（「生物学的マーカー」または「分子マーカー」または「遺伝子マーカー」または「タンパク質マーカー」などとしても公知）という用語は、いくつかの生物学的状態または状況または疾患または疾患に関連する合併症の測定可能な指標を指す。バイオマーカーは、血液中を循環しているまたは血清、生体液もしくは組織中に存在する任意の分子（無機もしくは有機分子、タンパク質またはヌクレオチド配列）または物質、あるいは特定の組織または細胞において発現される遺伝子またはポリヌクレオチドであり得る。本発明の実施形態において、マーカーは、ヒト対象のもしくは対象の血液の血清、またはヒト対象もしくは対象由来の子宮内膜細胞もしくは幹細胞中に存在するかまたは発現される、タンパク質および／またはホルモンである。
【0015】
本明細書において使用される「エストラジオール」（「エストロゲン」または「オエストラジオール」または「Ｅ２」または「１７β－エストラジオール」などとしても公知）という用語は、いくつかの生物学的状態の測定可能な指標を指す。
【0016】
本明細書において使用される「継代」（「細胞継代」などとしても公知）という用語は、継代培養を指す。継代数は、細胞培養物が継代培養されている回数である。
【0017】
適用される方法において言及されるすべての数は、一般に、約１０％の偏差を有することがさらに認識されるであろう。
【0018】
ＰＯＲ
ＰＯＲ対象は、同等の年齢の女性対象と比較して、卵巣刺激への反応または生殖能力が低減している女性対象である。
ＰＯＲ対象は、同等の年齢の女性対象と比較して、卵巣刺激への反応または生殖能力が低減している女性対象である。
【0019】
ＰＯＲは、Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１５［１１］によって定義されるように、閉経または早期卵巣機能不全（ＰＯＦ、原発性卵巣機能不全（ＰＯＩ）とも称される）とは異なる。ＰＯＩ／ＰＯＦと診断された女性対象は、４０歳未満であり、閉経後のＦＳＨ血清レベルと３～６カ月の月経なし（例えば、続発性無月経または希発月経）を有する。ＰＯＩ／ＰＯＦ対象において、ＦＳＨ血清レベルは少なくとも２つの異なる場合で４０ｍｌＵ／ｍＬを上回り、ＡＭＨ血清レベルは１ｎｇ／ｍＬを下回り、ＡＦＣは３未満である。
【0020】
ＰＯＲは、ＩＶＦ刺激に対する反応不良、１０ｍｌＵ／ｍＬを上回るＦＳＨ血清レベル、１．１ｎｇ／ｍＬを下回るＡＭＨ血清レベル、および３～６未満のＡＦＣによって特徴付けられる。ＰＯＲは、クロミフェンチャレンジテストの間の卵胞期前期（たとえば、月経周期の開始の２～３日目）において測定された高いＦＳＨおよび／もしくは高いエストラジオール血清レベル、ならびに／または卵巣体積の減少によりさらに診断することができる。
【0021】
基礎ＦＳＨ血清レベルは、残っている卵胞プールのサイズの良好な予測因子であり得る。基礎血清ＦＳＨレベルの上昇はＰＯＲを示し、基礎ＦＳＨ血清レベルの増加を有する女性対象は、高頻度で、ＩＶＦプログラムにおいて回収された卵母細胞が減少している。月経周期の２～３日目のＦＳＨおよびＬＨの基礎血清レベルは、好ましくは、卵巣予備能力のスクリーニングのために試験するために使用される。月経周期の１日目は、月経の初日であると理解される。月経周期の前半は卵胞期であり、黄体期である後半に続き、両期は、２８日の平均月経周期ではおよそ１４日続く。黄体期は「分泌期」とも称される。ＦＳＨ血清レベルは、ゴナドトロピンの増加の原因として非連続的な卵巣活動を除外するために、さまざまな場合において測定されるべきである。しかしながら、卵巣予備能力の評価が不妊症の管理に関するものである限り、ＦＳＨ血清レベルの増加のみでは、有用性は限定的である。
【0022】
健康な非ＰＯＲ対象における大部分のエストラジオールは、アンドロステンジオン（卵胞膜細胞において産生される）のエストロンへの芳香族化、それに続く１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによるエストロンのエストラジオールへの変換によって、卵巣の顆粒膜細胞によって産生される。
【0023】
例えばＰＯＲ処置などにおける卵巣機能障害の回復は、処置後および処置前の血清Ｅ２レベル間の統計比較を使用して、例えば１週間、６週間、１カ月、３カ月、６カ月などの所定の時間間隔にわたる動物およびヒト対象における血清Ｅ２レベルを使用して評価され得る。
【0024】
本発明による組成物の投与後の基礎血清Ｅ２レベルの増加は、以下：ＦＳＨ血清レベルの減少、ＡＭＨ血清レベルの増加、および胞状卵胞数の増加のうちの少なくとも１つに加えて、処置有効性の正の徴候として考えられ得る。
【0025】
動物およびヒト対象の血液の血清中のエストラジオール（Ｅ２）の量は、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）技法を使用して測定されてもよい。
【0026】
ＡＭＨは、好ましくは、卵巣反応不良についての別のマーカーである。健康な非ＰＯＲ対象におけるＡＭＨは、卵嚢（卵巣中の卵胞）の発達の際に細胞によって分泌される。２～６ｎｇ／ｍＬの間のＡＭＨ血清レベルは正常と考えられる。１．１ｎｇ／ｍＬを下回る血清ＡＭＨレベルは、ＰＯＲをさらに示し得る。
【0027】
ＥｎＳＣ
子宮内膜は、月経の脱落後の１～２ｍｍの厚さから月経周期の分泌期（すなわち、黄体期）において１４ｍｍの厚さに再成長し、出産後、およびエストラジオール補充療法に曝露された場合の閉経後の女性対象において完全に再生され得る。切除などの広範囲の医原性破壊的手順後でさえ、子宮内膜は、出血し続ける一部の女性対象において（女性対象の約２５～７５％において）再成長する。
子宮内膜は、月経の脱落後の１～２ｍｍの厚さから月経周期の分泌期（すなわち、黄体期）において１４ｍｍの厚さに再成長し、出産後、およびエストラジオール補充療法に曝露された場合の閉経後の女性対象において完全に再生され得る。切除などの広範囲の医原性破壊的手順後でさえ、子宮内膜は、出血し続ける一部の女性対象において（女性対象の約２５～７５％において）再成長する。
【0028】
子宮内膜は、機能層および基底層の２つの層からなる。機能層は、緩い血管新生間質によって囲まれた腺の上３分の２を含む。それぞれの月経周期において新しい機能層の置き換えのための胚供給元である基底層は、腺、間質および大血管の下３分の１で構成される。機能層は、ホルモンレベルの変化から生じる月経血とともに毎月脱落し、月経後に迅速に再構築される。
【0029】
この大規模な再生能力は、子宮内膜が、組織の維持／再成長をサポートする幹細胞の土台を有することを示唆する。子宮内膜幹細胞（ＥｎＳＣ）は、最初は、基底層にのみ位置していると思われていた。新しい証拠は、子宮内膜の機能層中にいくつかの幹細胞が存在することを示している。
【0030】
ＥｎＳＣは、細胞増殖性、長期培養能力、多系列分化能、および幹細胞マーカーの発現などの性質に基づいて特定されている。上皮前駆細胞、子宮内膜間葉系幹細胞（ＥｎＭＳＣ）および内皮幹細胞の３種類の子宮内膜幹細胞が子宮内膜中に存在する。上皮前駆細胞集団は、基底層の残余腺内に位置する。ＣＤ１４６およびＣＤ１４０ｂ／ＰＤＧＦＲｂを発現する子宮内膜幹細胞の亜集団は、好ましくは、子宮内膜間葉系幹細胞である。それらは、主に、機能層および基底層中の小血管の近くに位置する。
【0031】
上皮前駆細胞は、それらが月経血中に存在しないので、月経血から得ることはできない。上皮前駆細胞は、マーカーとしてのＳＳＥＡ－１およびＬＧＲ５に対して陽性であることによって特徴付けられる。上皮前駆細胞は、ＦＧＦ２およびＥＧＦなどの成長因子を放出する。ＦＧＦ２およびＥＧＦなどの成長因子は、子宮内膜組織試料から同時単離された他の細胞の増殖に影響を及ぼす。
【0032】
子宮内膜組織試料は、好ましくは少なくとも基底層、最も好ましくは基底層および機能層を含む。子宮内膜組織試料は、好ましくは、対象の月経周期の分泌期からの新鮮な組織試料である。対象の月経周期の分泌期からの新鮮な組織試料は、組成物を著しく改善すると思われる。子宮内膜組織試料は、無菌条件で得ることができる。子宮内膜組織試料および由来する幹細胞は、好ましくは、膣微生物で汚染された月経血およびその由来する幹細胞と比較して汚染物質が少ない。子宮内膜組織試料は、好ましくは、月経血試料よりも壊死細胞のパーセンテージが低い。子宮内膜組織試料は、好ましくは、上皮前駆細胞、子宮内膜間葉系幹細胞（ＥｎＭＳＣ）および内皮幹細胞を含む。子宮内膜間葉系幹細胞は、月経幹細胞よりも高い細胞増殖性を有する。上皮前駆細胞は、高い増殖率およびテロメラーゼ活性を有し、好ましくは、子宮内膜組織試料中のＥｎＳＣおよび子宮内膜組織試料に由来するＥｎＭＳＣをサポートしている。増殖率およびテロメラーゼ活性を定量化するための方法は、例えば、ｈＴＥＲＴなどのテロメアマーカーについてのリアルタイムＰＣＲ、および［１２］において述べられた増殖についてのＫＩ６７染色である。子宮内膜組織に由来するＥｎＭＳＣはまた、ｈＴＥＲＴレベルの増加、したがってテロメラーゼ活性の増加を示し得る。子宮内膜組織試料取得の方法は、当技術分野において公知である。
【0033】
本発明において使用されるＥｎＭＳＣおよびＥｎＳＣは、好ましくは、月経血に由来する月経幹細胞よりもむしろ子宮内膜組織に由来する子宮内膜幹細胞である。子宮内膜組織に由来するＥｎＳＣは、月経幹細胞と比較して、より高いテロメラーゼ活性、より低い壊死細胞パーセンテージ、低汚染物質および／またはより高い細胞増殖性を有し得る。月経幹細胞は、ＳＯＸ２およびＣＤ１１７マーカーに対して陽性である。さらに、ＥｎＳＣは、少なくともＳＯＸ２およびＣＤ１１７マーカーの非存在（陰性）によって、ならびに／または少なくともＳＵＳＤ２、Ｗ５Ｃ５およびＬＧＲ５マーカーの存在（陽性）によって特徴付けられ得る。
【0034】
ＥｎＳＣは、ＳＵＳＤ２、Ｗ５Ｃ５およびＬＧＲ５マーカーに加えて、ＳＳＥＡ４およびｈＴＥＲＴマーカーに対して陽性であることによって特徴付けられ得る。
【0035】
ＥｎＳＣは、さらに、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＳＴＲＯ１、ＬＧＲ５（ＥｎＳＣ）、ＳＳＥＡ－４（ＥｎＳＣ）、ｈ－ＴＥＲＴ、ＳＵＳＤ２、Ｎ－カドヘリンおよびＮａｎｏｇマーカーに対して陽性、かつＳＯＸ２およびＣＤ１１７マーカーに対して陰性であることによって特徴付けられ得る。
【0036】
ＥｎＭＳＣまたは組成物は、さらに、ＣＤ１４６、またはＣＤ１４６およびＰＤＧＦＲｂマーカーに対して陽性であることよって特徴付けられ得る。
【0037】
ＥｎＭＳＣまたは組成物は、さらに、前記子宮内膜間葉系幹細胞がＯｃｔ－４、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ－１を発現することを特徴とし得る。
【0038】
ＥｎＭＳＣまたは組成物は、ＣＤ９０、ＣＤ１４６およびＣＤ１０５マーカーに対して陽性、かつＣＤ３４およびＣＤ３１マーカーに対して陰性であり得る。
【0039】
ＥｎＭＳＣは、さらに、少なくともＳＯＸ２およびＣＤ１１７マーカーの非存在（陰性）によって、ならびに／または少なくともＳＵＳＤ２、Ｗ５Ｃ５およびＬＧＲ５マーカーの存在（陽性）によって特徴付けられ得る。
【0040】
ＥｎＭＳＣは、さらに、ＳＳＥＡ４およびｈＴＥＲＴマーカーに対して陽性であることによって特徴付けられ得る。
【0041】
ＥｎＭＳＣは、容易にアクセス可能で、低コストであり、最小限の倫理的障害、低免疫原性および／または低腫瘍原性を有する。ＥｎＭＳＣの分化能力は、好ましくは、他の幹細胞の分化能力よりも高い。ＥｎＭＳＣは、例えば、他の間葉系幹細胞よりも良好に、軟骨形成、脂肪生成および骨形成系列にインビトロで分化し得る。
【0042】
ＥｎＭＳＣは、さらに、以下：プラスチック接着、線維芽細胞様であること、多系列分化能を有すること、古典的間葉系幹細胞表面マーカーの発現、および培養における安定な核型のうちの１つまたは複数によって特徴付けられる。
【0043】
ＥｎＭＳＣは、驚くべきことに、生殖細胞様の細胞を生じさせ、ならびに／または例えばＡＭＨ、ＦＳＨおよびエストラジオールなどのある特定のホルモン血清レベルを、非ＰＯＲ血清レベルに（正常な血清レベルの方へ）再確立させることが見出された。
【0044】
ＥｎＭＳＣは、好ましくは、自己である。自己は、ＰＯＲ対象由来を意味することが理解される。自己幹細胞移植は、対象から取り出され、同じ対象に戻し移植される、取り出しと移植との間に任意選択のバンキングを有する、幹細胞の移植である。
【0045】
方法
本発明は、さらに、子宮内膜幹細胞、特に間葉系幹細胞を含む組成物を作製するための方法であって、
ａ．平衡塩溶液に子宮内膜組織試料を浸漬するステップ；
ｂ．ステップａ．から得られた子宮内膜組織試料を緩衝生理食塩水溶液で洗浄するステップ；
ｃ．刻まれた子宮内膜組織試料が生成するようにステップｂ．から得られた子宮内膜組織試料を刻むステップ；
ｄ．上皮細胞および幹細胞を含む消化物が生成するようにステップｃ．から得られた刻まれた子宮内膜組織試料を消化するステップ；
ｅ．ステップｄ．から得られた消化物を遠心分離するステップ；
ｆ．ステップｅ．から得られた消化物を濾過により上皮細胞画分および幹細胞画分に分離し、任意選択でＣＤ１４６および／またはＣＤ１０５および／またはＣＤ９０などの特異的間葉系幹細胞マーカーを使用することによって幹細胞を選別するステップ；
ｇ．培地中でステップｆ．からの子宮内膜間葉系幹細胞を培養するステップ；
ｈ．フローサイトメトリーによる子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価ステップであって、前記子宮内膜間葉系幹細胞が、ＣＤ９０、ＣＤ１４６およびＣＤ１０５マーカーに対して陽性、かつＣＤ３４およびＣＤ３１マーカーに対して陰性である、ステップ；
ｉ．骨細胞および脂肪細胞への分化などの多分化能の性質による子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価ステップ
を含む、方法に関する。
本発明は、さらに、子宮内膜幹細胞、特に間葉系幹細胞を含む組成物を作製するための方法であって、
ａ．平衡塩溶液に子宮内膜組織試料を浸漬するステップ；
ｂ．ステップａ．から得られた子宮内膜組織試料を緩衝生理食塩水溶液で洗浄するステップ；
ｃ．刻まれた子宮内膜組織試料が生成するようにステップｂ．から得られた子宮内膜組織試料を刻むステップ；
ｄ．上皮細胞および幹細胞を含む消化物が生成するようにステップｃ．から得られた刻まれた子宮内膜組織試料を消化するステップ；
ｅ．ステップｄ．から得られた消化物を遠心分離するステップ；
ｆ．ステップｅ．から得られた消化物を濾過により上皮細胞画分および幹細胞画分に分離し、任意選択でＣＤ１４６および／またはＣＤ１０５および／またはＣＤ９０などの特異的間葉系幹細胞マーカーを使用することによって幹細胞を選別するステップ；
ｇ．培地中でステップｆ．からの子宮内膜間葉系幹細胞を培養するステップ；
ｈ．フローサイトメトリーによる子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価ステップであって、前記子宮内膜間葉系幹細胞が、ＣＤ９０、ＣＤ１４６およびＣＤ１０５マーカーに対して陽性、かつＣＤ３４およびＣＤ３１マーカーに対して陰性である、ステップ；
ｉ．骨細胞および脂肪細胞への分化などの多分化能の性質による子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価ステップ
を含む、方法に関する。
【0046】
子宮内膜間葉系細胞が調製される場合、ＣＤ１４６および／またはＣＤ１０５および／またはＣＤ９０などの特異的間葉系幹細胞マーカーを使用することによって幹細胞を選別する任意選択のステップが適用される。
【0047】
子宮内膜幹細胞、好ましくは子宮内膜間葉系幹細胞を含む組成物を作製するための方法は、好ましくは、自己子宮内膜幹細胞を含む。
【0048】
組成物を作製するための方法のステップａ．は、例えば移動培地として、平衡塩溶液に子宮内膜組織試料を浸漬することを含む。
【0049】
子宮内膜組織試料は、好ましくは、対象の月経周期の分泌期からの新鮮な組織試料である。
【0050】
平衡塩溶液は、好ましくはハンクス液であり、これは、０．５～４ｗｔ％のペニシリン、０．５～４ｗｔ％のストレプトマイシンおよび０．２５～１．５ｗｔ％のアンフォテリシン、好ましくは１．７５～２．２５ｗｔ％のペニシリン、１．７５～２．２５ｗｔ％のストレプトマイシンおよび０．７５～１．２５ｗｔ％のアンフォテリシンを含む。ハンクス液についての代替物は、ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（子宮内膜組織試料を得た後２４時間）またはＰＢＳ（子宮内膜組織試料を得た後４～６時間）であり得る。
【0051】
組成物を作製するための方法のステップｂ．は、ステップａから得られた子宮内膜組織試料を緩衝生理食塩水溶液で洗浄することを含む。
【0052】
緩衝生理食塩水溶液は、好ましくはＰＢＳ緩衝リン酸生理食塩水であり、これは、０．５～４ｗｔ％のペニシリン、０．５～４ｗｔ％のストレプトマイシンおよび０．２５～１．５ｗｔ％のアンフォテリシン、好ましくは１．７５～２．２５ｗｔ％のペニシリン、１．７５～２．２５ｗｔ％のストレプトマイシンおよび０．７５～１．２５ｗｔ％のアンフォテリシンを含む。ＰＢＳ緩衝リン酸生理食塩水についての代替物は、無菌生理食塩水（例えば、ＮａＣｌ ０．９ｗｔ％）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２などの細胞培養培地であり得る。
【0053】
組成物を作製するための方法のステップｃ．は、刻まれた子宮内膜組織試料が生成するようにステップｂから得られた子宮内膜組織試料を刻むことを含む。
【0054】
ステップｃ．における子宮内膜組織試料は、刻まれた子宮内膜組織試料が生成するように、例えば、メス、かみそりまたははさみを使用して刻まれ得る。
【0055】
組成物を作製するための方法のステップｄ．は、上皮細胞および幹細胞を含む消化物が生成するようにステップｃ．から得られた子宮内膜組織試料を消化することを含む。
【0056】
ステップｄ．における消化は、例えばコラゲナーゼＡなどのタンパク分解性コラゲナーゼ１を用いて実施されてもよい。例えばコラゲナーゼＡなどのコラゲナーゼ１による消化は、３０～１２０分間、好ましくは３５～９０分間、より好ましくは４５～７５分間、最も好ましくは４６～６０分間であり得る。
【0057】
ステップｄ．における消化は、ＰＢＳ緩衝リン酸生理食塩水中で実施されてもよく、これは、０．５～４ｗｔ％のペニシリン、０．５～４ｗｔ％のストレプトマイシンおよび０．２５～１．５ｗｔ％のアンフォテリシン、好ましくは１．７５～２．２５ｗｔ％のペニシリン、１．７５～２．２５ｗｔ％のストレプトマイシンおよび０．７５～１．２５ｗｔ％のアンフォテリシンを含む。ＰＢＳ緩衝リン酸生理食塩水についての代替物は、無菌生理食塩水（例えば、ＮａＣｌ ０．９ｗｔ％）であり得る。
【0058】
例えばコラゲナーゼＡなどのコラゲナーゼ１は、動物由来材料を含まない培養物から得られ得る。コラゲナーゼ調製物は、コラゲナーゼ、カゼイナーゼ、クロストリパインおよびトリプシンを含むいくつかのプロテアーゼの活性を含有する。コラゲナーゼＡは、１型および２型コラゲナーゼに類似のタンパク分解活性のレベルを含有する。
【0059】
組成物を作製するための方法のステップｅ．は、ステップｄ．から得られた消化物を遠心分離することを含む。ステップｅ．における消化物は、室温（例えば、２０℃）で、１～１５分間、好ましくは２～１０分間、最も好ましくは４～８分間、５００～５０００ｒｐｍ、好ましくは８００～１５００ｒｐｍ、最も好ましくは１０００～１３００ｒｐｍで遠心分離されてもよい。任意の好適な遠心分離機、例えばＨｅｔｔｉｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ３２０遠心分離機を使用することができる。遠心分離ステップにおいて使用される培地は、１０ｗｔ％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２であってもよい。
【0060】
組成物を作製するための方法のステップｆ．は、消化物を濾過により上皮細胞画分および幹細胞画分に分離することを含む。
【0061】
濾過は、７０μｍおよび４０μｍの細胞ストレーナーによるか、または消化物の選別機としてＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）システムを使用することによる消化物の濾過を含んでいてもよい。本発明により使用される細胞ストレーナーの例は、ＢＤ無菌細胞ストレーナー４０ミクロン（ＢＤ ３５２３４０）およびＢＤ無菌細胞ストレーナー７０ミクロン（ＢＤ ３５２３５０）であり得る。
【0062】
ステップｆ．の後に、得られた幹細胞画分の例えば１２００～１５００ｒｐｍ、室温で５分間の遠心分離を含むサブステップｆ２．が続いてもよい。
【0063】
７０μｍの第１の細胞ストレーナーは、細胞残屑および未消化組織を分離するために使用されてもよく、４０μｍの第２の細胞ストレーナーは、上皮細胞を分離するために使用されてもよい。
【0064】
組成物を作製するための方法のステップｇ．は、培地中でステップｆ．からの子宮内膜間葉系幹細胞を培養することを含む。
【0065】
ステップｇ．における子宮内膜間葉系幹細胞の培養は、インキュベーターにおいて、３５～３８℃、２～１０％のＣＯ２および９５％の空気湿度で２週間、好ましくは３７℃、５％のＣＯ２および９５％の空気湿度で２週間、最も好ましくは３７℃で、培地中、５％のＣＯ２および９５％の空気湿度で２週間であり得る。
【0066】
子宮内膜間葉系幹細胞を含む組成物を作製するための方法では、ステップｇ．において、培地は、好ましくは、３日ごとに交換される。
【0067】
培養するステップｇ．における培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、８～１２ｗｔ％のＦＢＳ、および０．２５～１．５ｗｔ％のペニシリン、０．２５～１．５ｗｔ％のストレプトマイシン、好ましくは０．７５～１．２５ｗｔ％のペニシリン、０．７５～１．２５ｗｔ％のストレプトマイシンを含み得る。培養するステップｇ．における培地は、好ましくは、それが成長するために、血液および内皮細胞を阻害するか、またはそれらに好適ではない。
【0068】
細胞培養物が２倍になる培養時間は、４９．９時間であり得る。増殖曲線の例を図１に示す。
【0069】
子宮内膜間葉系幹細胞は、細胞が特性評価および投与される前に、１～８回、好ましくは２～５回、最も好ましくは３回継代され得る。ある特定の継代数、例えば３回の継代の後、子宮内膜間葉系幹細胞は、サイドポピュレーション細胞、内皮細胞または非増殖性細胞を過増殖させている可能性がある。例えば、３回の継代において、およびその後に、細胞培養物は均質である。
【0070】
組成物を作製するための方法のステップｈ．は、フローサイトメトリーにより、培養された幹細胞画分からの子宮内膜間葉系幹細胞を特性評価することを含み、前記子宮内膜間葉系幹細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ１４６およびＣＤ１０５マーカーに対して陽性、かつＣＤ３４およびＣＤ３１マーカーに対して陰性である。
【0071】
特性評価は、フローサイトメーターを使用して実施することができる。
【0072】
ステップｈ．において、細胞は、１０ｗｔ％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．２５～１．５ｗｔ％のペニシリン、０．２５～１．５ｗｔ％のストレプトマイシンおよび０．２５～１．５ｗｔ％のアンフォテリシン、好ましくは０．７５～１．２５ｗｔ％のペニシリン、０．７５～１．２５ｗｔ％のストレプトマイシンおよび０．７５～１．２５ｗｔ％のアンフォテリシンを有するハンクス液中にあり得る。
【0073】
ステップｈ．の後に、１２００～１５００ｒｐｍ、室温で５分間の遠心分離を含むサブステップｈ２．が続いてもよい。
【0074】
組成物を作製するための方法のステップｉ．は、骨細胞および脂肪細胞への分化などの多分化能の性質による子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価を含む。
【0075】
骨細胞への分化などの多分化能の性質による子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価は、アリザリンレッドＳ染色によって確認されてもよい。アリザリンレッドＳは、カルシウム沈着について染色するために使用されるアントラキノン色素であり、これは、成熟骨細胞の指標である。
【0076】
脂肪細胞への分化などの多分化能の性質による子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価は、オイルレッドＯ染色によって確認されてもよい。オイルレッドＯは、脂質を強く染色する色素である。
【0077】
子宮内膜間葉系幹細胞を含む組成物を作製するための方法であって、
ａ．ハンクス液に子宮内膜組織試料を浸漬するステップ；
ｂ．ステップａ．から得られた子宮内膜組織試料を、ペニシリン、アンフォテリシンおよびストレプトマイシンを含むＰＢＳ緩衝リン酸生理食塩水溶液で洗浄するステップ；
ｃ．刻まれた子宮内膜組織試料が生成するようにステップｂ．から得られた子宮内膜組織試料を刻むステップ；
ｄ．上皮細胞および幹細胞を含む消化物が生成するように、タンパク分解性コラゲナーゼでステップｂ．から得られた子宮内膜組織試料を消化するステップ；
ｅ．ステップｄ．から得られた消化物を遠心分離するステップ；
ｆ．７０μｍおよび４０μｍの細胞ストレーナーを使用して、消化物を濾過により上皮細胞画分および幹細胞画分に分離するステップ；あるいはＣＤ１４６および／またはＣＤ１０５および／またはＣＤ９０などの特異的間葉系幹細胞マーカーを使用することによって幹細胞を選別するステップ；
ｇ．インキュベーターにおいて、３７℃で、培地中、５％のＣＯ２および９５％の空気湿度で２週間、ステップｆ．からの子宮内膜間葉系幹細胞を培養するステップ；
ｈ．フローサイトメトリーによる子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価ステップであって、前記子宮内膜間葉系幹細胞が、ＣＤ９０、ＣＤ１４６およびＣＤ１０５マーカーに対して陽性、かつＣＤ３４およびＣＤ３１マーカーに対して陰性である、ステップ；
ｉ．骨細胞および脂肪細胞への分化などの多分化能の性質による子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価ステップ
を含む、方法がさらに好ましい。
ａ．ハンクス液に子宮内膜組織試料を浸漬するステップ；
ｂ．ステップａ．から得られた子宮内膜組織試料を、ペニシリン、アンフォテリシンおよびストレプトマイシンを含むＰＢＳ緩衝リン酸生理食塩水溶液で洗浄するステップ；
ｃ．刻まれた子宮内膜組織試料が生成するようにステップｂ．から得られた子宮内膜組織試料を刻むステップ；
ｄ．上皮細胞および幹細胞を含む消化物が生成するように、タンパク分解性コラゲナーゼでステップｂ．から得られた子宮内膜組織試料を消化するステップ；
ｅ．ステップｄ．から得られた消化物を遠心分離するステップ；
ｆ．７０μｍおよび４０μｍの細胞ストレーナーを使用して、消化物を濾過により上皮細胞画分および幹細胞画分に分離するステップ；あるいはＣＤ１４６および／またはＣＤ１０５および／またはＣＤ９０などの特異的間葉系幹細胞マーカーを使用することによって幹細胞を選別するステップ；
ｇ．インキュベーターにおいて、３７℃で、培地中、５％のＣＯ２および９５％の空気湿度で２週間、ステップｆ．からの子宮内膜間葉系幹細胞を培養するステップ；
ｈ．フローサイトメトリーによる子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価ステップであって、前記子宮内膜間葉系幹細胞が、ＣＤ９０、ＣＤ１４６およびＣＤ１０５マーカーに対して陽性、かつＣＤ３４およびＣＤ３１マーカーに対して陰性である、ステップ；
ｉ．骨細胞および脂肪細胞への分化などの多分化能の性質による子宮内膜間葉系幹細胞の特性評価ステップ
を含む、方法がさらに好ましい。
【0078】
製剤
卵巣反応不良の処置のための方法における使用のための子宮内膜間葉系幹細胞を含む組成物は、７．２～７．４の間のｐＨを有していてもよい。
卵巣反応不良の処置のための方法における使用のための子宮内膜間葉系幹細胞を含む組成物は、７．２～７．４の間のｐＨを有していてもよい。
【0079】
卵巣反応不良の処置のための方法における使用のための子宮内膜間葉系幹細胞を含む組成物は、以下：ＰＢＳ溶液、自己血清、無菌生理食塩水（例えば、ＮａＣｌ ０．９ｗｔ％）、または細胞培養培地、例えば、好ましくは７．２～７．４のｐＨの培養において使用されるＤＭＥＭ／Ｆ１２から選択される生理学的に適切な溶液を含んでいてもよく、好ましくは、溶液は、７．２～７．４のｐＨのＰＢＳ溶液である。
【0080】
生理学的に適切なＰＢＳ溶液の例は、７．４のｐＨの１３７ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４および１．８ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ２ＰＯ４を含む水溶液である。
【0081】
本発明による組成物は、５０万～１０００万細胞数／ｍＬ、好ましくは９５万～８００万細胞数／ｍＬ、最も好ましくは１５０万～６５０万細胞数／ｍＬの濃度で子宮内膜間葉系幹細胞を含んでいてもよい。
【0082】
医薬としての使用のための本発明による組成物は、移植後最長で６か月まで、１．１ｎｇ／ｍＬを上回るＡＭＨの血清レベルの増加、および／またはそれぞれの卵巣における成熟卵胞数の増加、および／またはエストラジオール（Ｅ２）血清レベルの増加、および／またはＦＳＨ血清レベルの減少、および／または卵巣体積の増加、および／または胞状卵胞数の増加というその効果によって定義され得る。
【0083】
組成物の投与
本発明による組成物は、新鮮に、または凍結された後に投与され得る。投与がクライオ凍結後に起こる場合、解凍プロセス後の再培養が行われてもよい。再培養の間、細胞は、成長の対数期に達してもよく、次いで投与することができる。
本発明による組成物は、新鮮に、または凍結された後に投与され得る。投与がクライオ凍結後に起こる場合、解凍プロセス後の再培養が行われてもよい。再培養の間、細胞は、成長の対数期に達してもよく、次いで投与することができる。
【0084】
本発明による組成物は、動脈、卵巣動脈、卵巣内または少なくとも一方の卵巣に投与されてもよい。卵巣内に投与される場合、細胞は、好ましくは、例えば超音波誘導を使用して、膣を通して注射される。
【0085】
本発明による組成物は、好ましくは、１用量あたり５０万～２００万細胞数、好ましくは１用量あたり８０万～１３０万細胞数の量で、１～５用量、好ましくは２～４用量投与される。
【0086】
バンキング
本発明は、本発明による子宮内膜幹細胞、特に子宮内膜間葉系幹細胞または組成物のバンキングのための方法にさらに関する。
本発明は、本発明による子宮内膜幹細胞、特に子宮内膜間葉系幹細胞または組成物のバンキングのための方法にさらに関する。
【0087】
本発明は、本発明による子宮内膜間葉系幹細胞または組成物のバンキングのための方法であって、
ａ．対象から子宮内膜間葉系幹細胞を得ること；
ｂ．例えば顕微鏡下で、細菌、酵母または真菌汚染についてチェックすること；
ｃ．好ましくはＧｉｂｃｏのＭｙｃｏＴｅｃｔキット（カタログ番号１５６７２－０１７）を使用して、マイコプラズマについて子宮内膜間葉系幹細胞の試料を試験すること；
ｄ．子宮内膜間葉系幹細胞が対数後期に達した後、５００００００～２０００００００個細胞／ｍＬで子宮内膜間葉系幹細胞を凍結培地に再懸濁させること；
ｅ．５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ内、１０００ｇで１５分間、再懸濁された子宮内膜間葉系幹細胞を遠心分離すること；
ｆ．遠心分離された子宮内膜間葉系幹細胞から上清を吸引し、凍結培地を添加し、均質になるまで細胞を粉砕すること；
ｇ．ステップｆ．から得られた子宮内膜間葉系幹細胞の１ｍＬをバイアルに等分し、バイアルを－２０℃のフリーザーで、容器中、３時間凍結すること；
ｈ．容器を－８０℃のフリーザーに移し、終夜貯蔵すること；
ｉ．液体Ｎ２タンク中のラックにおいて、ステップｆ．から得られたバイアルを翌日貯蔵すること
を含む、方法にさらに関する。
ａ．対象から子宮内膜間葉系幹細胞を得ること；
ｂ．例えば顕微鏡下で、細菌、酵母または真菌汚染についてチェックすること；
ｃ．好ましくはＧｉｂｃｏのＭｙｃｏＴｅｃｔキット（カタログ番号１５６７２－０１７）を使用して、マイコプラズマについて子宮内膜間葉系幹細胞の試料を試験すること；
ｄ．子宮内膜間葉系幹細胞が対数後期に達した後、５００００００～２０００００００個細胞／ｍＬで子宮内膜間葉系幹細胞を凍結培地に再懸濁させること；
ｅ．５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ内、１０００ｇで１５分間、再懸濁された子宮内膜間葉系幹細胞を遠心分離すること；
ｆ．遠心分離された子宮内膜間葉系幹細胞から上清を吸引し、凍結培地を添加し、均質になるまで細胞を粉砕すること；
ｇ．ステップｆ．から得られた子宮内膜間葉系幹細胞の１ｍＬをバイアルに等分し、バイアルを－２０℃のフリーザーで、容器中、３時間凍結すること；
ｈ．容器を－８０℃のフリーザーに移し、終夜貯蔵すること；
ｉ．液体Ｎ２タンク中のラックにおいて、ステップｆ．から得られたバイアルを翌日貯蔵すること
を含む、方法にさらに関する。
【0088】
本発明による子宮内膜幹細胞全般または組成物を同等の方法でバンキングする方法は、同様に、本発明の一部である。
【0089】
本発明による組成物は、添加剤などの組成物の前に言及された構成要素とは異なる任意選択の構成要素をさらに含んでいてもよく、前に言及された構成要素および任意選択の構成要素の合計は、総組成物の１００ｗｔ％である。したがって、本発明は、前に言及された構成要素および任意選択の構成要素からなる組成物に関する。
【0090】
本発明が、本明細書に記載される特性のすべての可能な組み合わせに関すること、特に特許請求の範囲内に存在する特性の組み合わせが好ましいことに留意されたい。したがって、本発明による組成物に関する特性のすべての組み合わせ、本発明による方法に関する特性のすべての組み合わせ、ならびに本発明による組成物に関する特性および本発明による方法に関する特性のすべての組み合わせが本明細書に記載されていることが認識されるであろう。
【0091】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」という用語が他の要素の存在を排除しないことにさらに留意されたい。しかしながら、ある特定の構成要素を含む生成物／組成物に対する記載がこれらの構成要素からなる生成物／組成物も開示することも理解されるべきである。これらの構成要素からなる生成物／組成物は、生成物／組成物の調製のためのより単純でより経済的な方法を提供するという点で有利であり得る。同様に、ある特定のステップを含む方法に対する記載が、これらのステップからなる方法も開示することも理解されるべきである。これらのステップからなる方法は、より単純で、より経済的な方法を提供するという点で有利であり得る。
【0092】
値がパラメーターについての下限および上限について言及される場合、下限の値および上限の値の組み合わせによって作り出される範囲も開示されていると理解される。
【0093】
本発明は、以下の例によってここに明らかにするが、しかしながら、それらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【0094】
【図1】７日間の細胞培養後のＥｎＭＳＣについての増殖曲線。
【図2】したがって、図２は、（Ａ）形態学的特徴およびヒトＥｎＭＳＣの間葉系列へのインビトロ分化を示す。（ａ）ヒトＥｎＭＳＣ（継代３回）は、（ｂ）アリザリンレッドＳで染色される石灰化する細胞に分化している。（ｃ）オイルレッドＯで染色された脂肪細胞（スケールバー：５０μｍ）。（Ｂ）間葉系幹細胞（ＣＤ９０、ＣＤ１０５）、子宮内膜幹細胞（ＣＤ１４６）、造血性（ＣＤ３４）、および内皮（ＣＤ３１）マーカーについての単離されたヒトＥｎＭＳＣにおけるフローサイトメトリー分析。青線は、ＣＤ３１についてはアイソタイプ対照のＩｇＧ１により、ならびにＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１４６およびＣＤ３４についてはＩｇＧ２ａにより得られたバックグラウンド蛍光を示す。
【実施例】
【0095】
ＥｎＭＳＣ
非ＰＯＲ対象からのヒト子宮内膜組織試料を黄体期に採取した。ハンクス液に浸漬された機能層および基底層を含むヒト子宮内膜組織試料を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（２ｗｔ％のペニシリン、２ｗｔ％のストレプトマイシンおよび１ｗｔ％のアンフォテリシン）中で洗浄し、刻み、次いでコラゲナーゼ１、すなわちコラゲナーゼＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中、撹拌しながら３７℃で３０～４５分間消化した。次いで、得られた消化物を、Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ３２０遠心分離機において遠心分離した。得られたペレットを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。次いで、得られた遠心分離された上皮細胞および幹細胞を含む消化物を、７０μＭおよび４０μＭのストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国、９３０７０）に通過させるか、または選別して、腺上皮構成要素を除去した。子宮内膜幹細胞（ＥｎＳＣ）を、プラスチックフラスコ（２５ｃｍ２）中、１０ｗｔ％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１ｗｔ％の抗生物質のペニシリン、１ｗｔ％のストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養し、次いで加湿チャンバー（５％のＣＯ２および９５％の空気湿度）において３７℃でインキュベートし、コンフルエンスまで複製させた（図１）。フローサイトメトリー分析を、間葉系幹細胞（ＣＤ９０、ＣＤ１０５）、子宮内膜幹細胞（ＣＤ１４６）、造血性（ＣＤ３４）、および内皮（ＣＤ３１）マーカーについて得られたヒトＥｎＭＳＣにおいて行った。形態学的に特性評価し、ヒトＥｎＭＳＣ（図２Ａの（ａ））の間葉系列へのインビトロ分化を示すために、ヒトＥｎＭＳＣ（継代３回後）を、石灰化する細胞への分化を示すアリザリンレッドで染色し（図２Ａの（ｂ））、脂肪細胞への分化を示すオイルレッドＯで染色した（図２Ａの（ｃ））。
非ＰＯＲ対象からのヒト子宮内膜組織試料を黄体期に採取した。ハンクス液に浸漬された機能層および基底層を含むヒト子宮内膜組織試料を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（２ｗｔ％のペニシリン、２ｗｔ％のストレプトマイシンおよび１ｗｔ％のアンフォテリシン）中で洗浄し、刻み、次いでコラゲナーゼ１、すなわちコラゲナーゼＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中、撹拌しながら３７℃で３０～４５分間消化した。次いで、得られた消化物を、Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ３２０遠心分離機において遠心分離した。得られたペレットを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。次いで、得られた遠心分離された上皮細胞および幹細胞を含む消化物を、７０μＭおよび４０μＭのストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国、９３０７０）に通過させるか、または選別して、腺上皮構成要素を除去した。子宮内膜幹細胞（ＥｎＳＣ）を、プラスチックフラスコ（２５ｃｍ２）中、１０ｗｔ％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１ｗｔ％の抗生物質のペニシリン、１ｗｔ％のストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養し、次いで加湿チャンバー（５％のＣＯ２および９５％の空気湿度）において３７℃でインキュベートし、コンフルエンスまで複製させた（図１）。フローサイトメトリー分析を、間葉系幹細胞（ＣＤ９０、ＣＤ１０５）、子宮内膜幹細胞（ＣＤ１４６）、造血性（ＣＤ３４）、および内皮（ＣＤ３１）マーカーについて得られたヒトＥｎＭＳＣにおいて行った。形態学的に特性評価し、ヒトＥｎＭＳＣ（図２Ａの（ａ））の間葉系列へのインビトロ分化を示すために、ヒトＥｎＭＳＣ（継代３回後）を、石灰化する細胞への分化を示すアリザリンレッドで染色し（図２Ａの（ｂ））、脂肪細胞への分化を示すオイルレッドＯで染色した（図２Ａの（ｃ））。
【0096】
骨形成分化：子宮内膜間葉系幹細胞を、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で、拡大増殖および継代した。骨形成分化は、１ｃｍ２あたり２×１０４個細胞でＥｎＭＳＣを播種することによって３回目の継代細胞において誘導し、細胞をコンフルエンスに達するようにし、次いでさらに２４時間インキュベートした。次いで、培地を、１０％のＦＢＳと、１０ｍＭのβ－グリセロホスフェート、０．１μＭのデキサメタゾンおよび２００μＭのアスコルビン酸－２－ホスフェートとが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有する分化培地に交換した。分化培地を、３～４日ごとに２１日間交換した。
【0097】
アリザリンレッドＳ染色：細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒド中で固定した。１５分後、アリザリンレッドＳ ２％（ｐＨ４．１）をそれぞれのフラスコに添加した。フラスコを、室温で２０分間インキュベートし、次いでそれらを、ｄＨ２Ｏで４回、５分間振とうして洗浄した。石灰化したＥＣＭの分泌が、アリザリンレッドＳ染色による赤色の小結節として観察された。
【0098】
脂肪生成分化：子宮内膜の全単離物に由来する細胞を、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で、拡大増殖および継代した。脂肪生成分化は、１ｃｍ２あたり２×１０４個細胞でＥｎＭＳＣを蒔くことによって３回目の継代細胞において誘導し、細胞をコンフルエンスに達するようにし、次いでさらに２４時間インキュベートした。次いで、培地を、１０％のＦＢＳとインスリン（１０ｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１Ｍ）、インドメタシン（２００Ｍ）およびイソブチルメチルキサンチン（０．５ｍＭ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有する分化培地に交換した。分化培地を、３～４日ごとに２１日間交換した。
【0099】
オイルレッドＯ染色：オイルレッドＯ染色を使用して、分化細胞中の脂質の存在を確認した。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２％のパラホルムアルデヒド、０．２％のグルタルアルデヒド中で１５分間固定し、次いでＰＢＳですすいだ。次いで、それらをオイルレッドＯ（イソプロパノール中で再構成）で１０分間染色し、６０％のイソプロパノール、続いてＰＢＳ中ですすいだ。脂肪滴は、光学顕微鏡下、赤色で可視化された。
【0100】
インビトロモデル
例えば卵形成／卵巣機能の再生（例えば、卵母細胞の発達ならびに／またはエストラジオールおよびＡＭＨなどのホルモン分泌）のためのヒトＥｎＭＳＣの生殖細胞様の細胞への分化。
ヒト子宮内膜間葉系幹細胞を、培養培地中、３７℃、９５％の空気湿度および５％のＣＯ２で７日間のインキュベーションにより分化するように誘導した。培養培地は、１０ｗｔ％のＦＢＳ、１ｗｔ％のペニシリン、１ｗｔ％のストレプトマイシン、ならびに４つの異なる濃度：５、１０、１５および２０μＭ（図Ｂ３ｂ～ｅ）のレチノイン酸（ＲＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）であった。ヒトＥｎＭＳＣを、他の４試料と同じ時間分化誘導因子としてのＲＡなしのＤＭＥＭ中で培養した対照群を調製した（図Ｂ３ｆ）。培養において、ＤＭＥＭ培地を１日おきに交換した。７日後、培養されたヒトＥｎＭＳＣは、ＤＡＰＩ、ＤＡＺＬおよびＤＤＸ４について染色する免疫蛍光法によって、生殖細胞様の細胞に分化することを示した（図３Ａ）。
例えば卵形成／卵巣機能の再生（例えば、卵母細胞の発達ならびに／またはエストラジオールおよびＡＭＨなどのホルモン分泌）のためのヒトＥｎＭＳＣの生殖細胞様の細胞への分化。
ヒト子宮内膜間葉系幹細胞を、培養培地中、３７℃、９５％の空気湿度および５％のＣＯ２で７日間のインキュベーションにより分化するように誘導した。培養培地は、１０ｗｔ％のＦＢＳ、１ｗｔ％のペニシリン、１ｗｔ％のストレプトマイシン、ならびに４つの異なる濃度：５、１０、１５および２０μＭ（図Ｂ３ｂ～ｅ）のレチノイン酸（ＲＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）であった。ヒトＥｎＭＳＣを、他の４試料と同じ時間分化誘導因子としてのＲＡなしのＤＭＥＭ中で培養した対照群を調製した（図Ｂ３ｆ）。培養において、ＤＭＥＭ培地を１日おきに交換した。７日後、培養されたヒトＥｎＭＳＣは、ＤＡＰＩ、ＤＡＺＬおよびＤＤＸ４について染色する免疫蛍光法によって、生殖細胞様の細胞に分化することを示した（図３Ａ）。
【0101】
インビボモデル
本発明による組成物を、ＰＯＲラットモデルにおけるＰＯＲを処置する方法において使用した。加えて、ブランク（すなわち、＋または陽性）および陰性対照を実行した。
本発明による組成物を、ＰＯＲラットモデルにおけるＰＯＲを処置する方法において使用した。加えて、ブランク（すなわち、＋または陽性）および陰性対照を実行した。
【0102】
ラットを以下の３つの群に無作為に割り当てた。
・ＰＯＲラット群（表１において幹細胞移植群と呼ばれる）（ｎ＝１０）。ＰＯＲラットモデルを、初日の２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＴＸ）のラットへの腹腔内注射、および次いで１５日連続して８ｍｇ／ｋｇ／日の腹腔内注射によって確立した。ＰＯＲラットモデルを確立してから２週間後、ＰＯＲラットに、ＥｎＭＳＣ（１００μＬ、１×１０６／ｍＬの濃度）を含むヒトＥｎＳＣを含む組成物をマイクロインジェクターで尾静脈内に注射した。
・ブランク対照群（表１において対照＋と呼ばれる）（ｎ＝１０）。これらは、非ＰＯＲラット、すなわちＰＯＲラット群のＰＯＲラットモデル確立後２週間、どんな処置も施さない正常なラットであった。
・ＰＯＲラットモデルの陰性対照群（表１において対照－と呼ばれる）（ｎ＝１０）。ＰＯＲラットモデルを、初日の２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＴＸ）のラットへの腹腔内注射、および次いで１５日連続して８ｍｇ／ｋｇ／日の腹腔内注射によって確立した。ＰＯＲラット群のＰＯＲラットモデル確立後２週間、処置を施さなかった。
・ＰＯＲラット群（表１において幹細胞移植群と呼ばれる）（ｎ＝１０）。ＰＯＲラットモデルを、初日の２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＴＸ）のラットへの腹腔内注射、および次いで１５日連続して８ｍｇ／ｋｇ／日の腹腔内注射によって確立した。ＰＯＲラットモデルを確立してから２週間後、ＰＯＲラットに、ＥｎＭＳＣ（１００μＬ、１×１０６／ｍＬの濃度）を含むヒトＥｎＳＣを含む組成物をマイクロインジェクターで尾静脈内に注射した。
・ブランク対照群（表１において対照＋と呼ばれる）（ｎ＝１０）。これらは、非ＰＯＲラット、すなわちＰＯＲラット群のＰＯＲラットモデル確立後２週間、どんな処置も施さない正常なラットであった。
・ＰＯＲラットモデルの陰性対照群（表１において対照－と呼ばれる）（ｎ＝１０）。ＰＯＲラットモデルを、初日の２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＴＸ）のラットへの腹腔内注射、および次いで１５日連続して８ｍｇ／ｋｇ／日の腹腔内注射によって確立した。ＰＯＲラット群のＰＯＲラットモデル確立後２週間、処置を施さなかった。
【0103】
処置の１週間および６週間後、血清ＦＳＨ、エストラジオール（Ｅ２）およびＡＭＨ血清レベルを測定した。ＭＳＣ処置は、ＰＯＲラットにおいて、非ＰＯＲ、例えばＦＳＨ、エストラジオール（Ｅ２）およびＡＭＨの正常な血清レベルの再確立をもたらした。
【0104】
ＥｎＭＳＣを含む組成物によるＰＯＲラットの処置は、処置なしのＰＯＲラットと比較して、血清ＦＳＨの血清レベルの減少をもたらした。ＭＳＣによるＰＯＲラットの処置は、処置なしのＰＯＲラットと比較して、血清ＡＭＨおよびエストラジオールの血清レベルの増加をもたらした。
【0105】
臨床データ
以下の参加基準を満たす女性ヒト対象（本明細書の以下で対象と呼ぶ）を採用する：卵巣反応不良と診断された、２０ＩＵ／Ｌを上回る血清ＦＳＨレベルまたは１ｎｇ／ｍＬ未満のＡＭＨ血清レベル、男性不妊症の証拠なし、正常な核型、ＩＶＦ失敗歴または以前の乏しい反応を有する、従来の卵巣刺激プロトコール後に的確に３以下の卵母細胞。さらに、対象は、以下の除外基準を有さなかった：原発性無月経、異常核型（例えば、ターナー症候群、脆弱Ｘ症候群）、甲状腺機能障害、重度の子宮内膜症、妊娠の禁忌、卵巣がんの以前の個人歴、乳がんの以前の個人歴、重度の薬物アレルギーまたはアレルギー体質の病歴、自己免疫疾患、重度の家族遺伝性疾患の病歴、ＨＩＶ＋、Ｂ型肝炎＋、Ｃ型肝炎＋、精神疾患、情報伝達の障害、およびアルコールまたは他の薬物の乱用。本発明による自己ＥｎＭＳＣを含む組成物を対象に卵巣内投与する。
以下の参加基準を満たす女性ヒト対象（本明細書の以下で対象と呼ぶ）を採用する：卵巣反応不良と診断された、２０ＩＵ／Ｌを上回る血清ＦＳＨレベルまたは１ｎｇ／ｍＬ未満のＡＭＨ血清レベル、男性不妊症の証拠なし、正常な核型、ＩＶＦ失敗歴または以前の乏しい反応を有する、従来の卵巣刺激プロトコール後に的確に３以下の卵母細胞。さらに、対象は、以下の除外基準を有さなかった：原発性無月経、異常核型（例えば、ターナー症候群、脆弱Ｘ症候群）、甲状腺機能障害、重度の子宮内膜症、妊娠の禁忌、卵巣がんの以前の個人歴、乳がんの以前の個人歴、重度の薬物アレルギーまたはアレルギー体質の病歴、自己免疫疾患、重度の家族遺伝性疾患の病歴、ＨＩＶ＋、Ｂ型肝炎＋、Ｃ型肝炎＋、精神疾患、情報伝達の障害、およびアルコールまたは他の薬物の乱用。本発明による自己ＥｎＭＳＣを含む組成物を対象に卵巣内投与する。
【0106】
対象は、下記の改善のうちの少なくとも１つを示す：
・本発明による組成物の投与（移植）後最長で６カ月、１ｎｇ／ｍＬを上回る（好ましくは最高で２．５ｎｇ／ｍＬ）ＡＭＨの血清レベルの増加；
・移植後最長で６カ月、それぞれの卵巣における成熟卵胞数の増加；
・移植後最長で６カ月、３０ｐｇ／ｍＬを上回るエストラジオール（Ｅ２）血清レベルの増加；
・移植後最長で６か月、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）血清レベルの減少；
・移植後最長で６カ月、卵巣体積の増加；
・移植後最長で６カ月、３～６への胞状卵胞数の増加。
・本発明による組成物の投与（移植）後最長で６カ月、１ｎｇ／ｍＬを上回る（好ましくは最高で２．５ｎｇ／ｍＬ）ＡＭＨの血清レベルの増加；
・移植後最長で６カ月、それぞれの卵巣における成熟卵胞数の増加；
・移植後最長で６カ月、３０ｐｇ／ｍＬを上回るエストラジオール（Ｅ２）血清レベルの増加；
・移植後最長で６か月、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）血清レベルの減少；
・移植後最長で６カ月、卵巣体積の増加；
・移植後最長で６カ月、３～６への胞状卵胞数の増加。
【0107】
言及されるデータはすべて、臨床試験の間に収集されるが、言及された基準のうちの１つの改善は、この薬物療法に対する正の卵巣反応を示し得る。
【0108】
より具体的には、自己子宮内膜幹細胞療法を受けている２人のＰＯＲ患者の臨床データは以下を提示する。
【0109】
１－方法
ＰＯＲ（卵巣反応不良）の最終診断を有する患者を除外基準および参加基準（表１）に従って選択した（表２）。
ＰＯＲ（卵巣反応不良）の最終診断を有する患者を除外基準および参加基準（表１）に従って選択した（表２）。
【表1】
【表2】
【0110】
患者は、表２に従って、右卵巣（より大きい卵巣）に自己子宮内膜間葉系幹細胞の卵巣内注射を受けた。
【表3】
【0111】
２－結果
１か月後、患者を表４および５に従って追跡した。
１か月後、患者を表４および５に従って追跡した。
【表4】
【表5】
【0112】
細胞移植の６か月後、最終結果を、表６に従って、この患者についての初期値と比較した。
【表6】
【0113】
参考文献
1- Ferraretti, A., La Marca, A., Fauser, B., Tarlatzis, B., Nargund, G., Gianaroli, L., & ESHRE working group on Poor Ovarian Response Definition. (2011). ESHRE consensus on the definition of ‘poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: The Bologna criteria. Human Reproduction, 26(7), 1616-1624.
2- Alsbjerg, B., Haahr, T., Elbaek, H. O., Laursen, R., Povlsen, B. B., & Humaidan, P. (2019). Dual stimulation using corifollitropin alfa in Bologna criteria poor ovarian responders-a case series. Reproductive Biomedicine Online, 38(5), 677-682.
3- Lin, L.-T., Vitale, S. G., Chen, S.-N., Wen, Z.-H., Tsai, H.-W., Chern, C.-U., & Tsui, K.-H. (2018). Luteal phase ovarian stimulation may improve oocyte retrieval and oocyte quality in poor ovarian responders undergoing in vitro fertilization: Preliminary results from a single-center prospective pilot study. Advances in Therapy, 35(6), 847-856.
4- Kuroda, K., Kitade, M., Kumakiri, J., Jinushi, M., Shinjo, A., Ozaki, R., Ikemoto, Y., Katoh, N., & Takeda, S. (2016). Minimum ovarian stimulation involving combined clomiphene citrate and estradiol treatment for in vitro fertilization of Bolognacriteria poor ovarian responders. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research, 42(2), 178-183.
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Dehydroepiandrosterone (DHEA) supplementation improves in vitro fertilization outcomes of poor ovarian responders, especially in women with low serum concentration of DHEA-S: A retrospective cohort study. Reproductive Biology and Endocrinology, 16(1), 90.
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9- Cai, M. H., Liang, X. Y.,Wu, Y. Q., Huang, R., & Yang, X. (2019).Six-week pretreatment with growth hormone improves clinical outcomes of poor ovarian responders undergoing in vitro fertilization treatment: A self-controlled clinical study. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research, 45(2), 376-381.
10. Zafardoust, S., Kazemnejad, S.,Darzi,S., Fahti-Kazerooni, M., Rastegai, H, Mohammadzadeh, A. Improvement of Pregnancy Rate and Live Birth Rate in Poor Ovarian Responders by Intraovarian Administration of Autologous Mentrual Blood Derived-Mesenchymal Stromal Cells: Phse I/II Clinical Trial; Stem Cell Reviews and Reports (2020) 16:755 - 763, https://doi.org/10.1007/s12015-020-09969-6
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[12] Valentijn AJ1, Palial K, Al-Lamee H, Tempest N, Drury J, Von Zglinicki T, Saretzki G, Murray P, Gargett CE, Hapangama DK. SSEA-1 isolates human endometrial basal glandular epithelial cells: phenotypic and functional characterization and implications in the pathogenesis of endometriosis.Hum Reprod. 2013; 28(10):2695-708. doi: 10.1093/humrep/det285.
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【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】