ホーム > 特許ランキング > テオキサン エスエー
特表2023-520942少なくとも２種類のグリコサミノグリカンに基づく組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-22
(54)【発明の名称】少なくとも２種類のグリコサミノグリカンに基づく組成物
(51)【国際特許分類】
C08B 37/08 20060101AFI20230515BHJP
A61K 8/73 20060101ALI20230515BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230515BHJP
A61K 31/728 20060101ALI20230515BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230515BHJP
【ＦＩ】
C08B37/08 Z
A61K8/73
A61Q19/00
A61K31/728
A61P17/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022562111
(86)(22)【出願日】2021-04-12
(85)【翻訳文提出日】2022-12-07
(86)【国際出願番号】 EP2021059432
(87)【国際公開番号】W WO2021205037
(87)【国際公開日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】2003628
(32)【優先日】2020-04-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522396506
【氏名又は名称】テオキサン エスエー
(74)【代理人】
【識別番号】100118599
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 博司
(74)【代理人】
【識別番号】100160738
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 由加里
(72)【発明者】
【氏名】ブルドン，フランソワ
【テーマコード（参考）】
4C083
4C086
4C090
【Ｆターム（参考）】
4C083AD331
4C083CC02
4C086AA01
4C086EA25
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA89
4C090AA02
4C090BA67
4C090BB02
4C090BB18
4C090BB22
4C090BB33
4C090BB35
4C090BB36
4C090BB53
4C090BD07
4C090BD08
4C090BD10
4C090BD36
4C090BD37
4C090DA22
4C090DA26
(57)【要約】
本発明は、架橋ヒアルロン酸と、ヒアルロン酸の総質量に対して３０～７０質量％の水溶性ヒアルロン酸とを含む、ヒアルロン酸ベースの水性ゲルに関する。本発明は、架橋されたヒアルロン酸と架橋されてないヒアルロン酸とを少なくとも含む水性ゲルの調製方法に関する。本発明はまた、上記方法の組成物によって得られうる水性ゲル、該水性ゲルを含む化粧用組成物及び／又は皮膚用組成物、並びに該水性ゲル又は該組成物を含む予め充填されたシリンジを備えているキットに関する。これらのゲル及び組成物は、皮膚の表面外観における変化を処置する為に、及び／又は軟組織を増大及び／又は充填する為に特に有用である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
架橋されたヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ベースの水性ゲルであって、該ゲルが、ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％～７０質量％の量の、０．０２ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含むことを特徴とし、
該水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定されることを特徴とする、
前記水性ゲル。
【請求項2】
前記ゲルが軟質ゲルであり、該軟質ゲルが、周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引を適用する、コーン／プレート構造を使用して、５Ｐａの応力について室温で測定された、１５°～５０°の位相角（δ）と、１５０Ｐａ以下、好ましくは２０～１５０Ｐａ、の弾性率Ｇ’とを有し、並びに、外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する内径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、約１２．５ｍｍ／分の固定速度で、室温で測定された、１８Ｎ以下、好ましくは１５Ｎ未満、の押し出し力とを有する、請求項１に記載の水性ゲル。
【請求項3】
前記水性ゲルの総質量に対して３５質量％～６５質量％の「ｓＨＡ ＬＭＷ」を含む、請求項１又は２に記載の水性ゲル。
【請求項4】
「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる前記水溶性ヒアルロン酸が、０．０４ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、好ましくは０．０４ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の水性ゲル。
【請求項5】
「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる前記水溶性ヒアルロン酸が、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の水性ゲル。
【請求項6】
前記水性ゲルの総質量に対して１０質量％～３０質量％、好ましくは１５質量％～２０質量％、の「ｓＨＡ ＨＭＷ」を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の水性ゲル。
【請求項7】
前記架橋されたヒアルロン酸が、前記水性ゲルの総質量に対して少なくとも５ｍｇ／ｇの量で存在する、請求項１～６のいずれか１項に記載の水性ゲル。
【請求項8】
「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる前記水溶性ヒアルロン酸が、前記水性ゲルの総質量に対して少なくとも３ｍｇ／ｇ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｇ、の量で存在する、請求項１～７のいずれか１項に記載の水性ゲル。
【請求項9】
前記総ヒアルロン酸濃度が、前記水性ゲルの総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇ、好ましくは１５～３５ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０～３０ｍｇ／ｇ、である、請求項１～８のいずれか１項に記載の水性ゲル。
【請求項10】
前記全ヒアルロン酸の修飾度が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、である、請求項１～９のいずれか１項に記載の水性ゲル。
【請求項11】
前記架橋されたヒアルロン酸は、前記水性ゲルの総質量に対して６ｍｇ／ｇ～１２ｍｇ／ｇの量で存在し、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる前記水溶性ヒアルロン酸は、前記水性ゲルの総質量に対して１２ｍｇ／ｇ～２０ｍｇ／ｇの量で存在し、
「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる前記水溶性ヒアルロン酸は、前記水性ゲルの総質量に対して３ｍｇ／ｇ～６ｍｇ／ｇの量で存在し、
前記水性ゲルは、前記水性ゲルの総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの総ヒアルロン酸濃度を含む、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の水性ゲル。
【請求項12】
前記水性ゲルは、例えばオートクレーブ内で、加熱滅菌工程に付されることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか１項に記載の水性ゲル。
【請求項13】
少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸と少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸とを含む水性ゲルを調製する方法であって、該方法が、ａ）０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、
ｂ）０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、並びに
ｃ）工程ａ）及びｂ）の前記溶液の全て又は一部の均質混合物を形成すること
の工程を少なくとも含み、
前記方法が、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１の、ヒアルロン酸の使用を含むことを特徴とする、
上記の方法
【請求項14】
前記「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」は、８質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは２質量％未満、の架橋率で調製される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」の生成の為に使用される前記架橋剤が、二官能性若しくは多官能性のエポキシ架橋剤、好ましくは１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、であることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項16】
「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸を使用することを更に含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」の全て又は一部が、工程ｂ）の前記水性溶液において使用されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
工程ｃ）において、前記「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」の前記水性溶液、及び工程ｂ）の前記水性溶液が、工程ａ）の前記水性溶液と同時に混合される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
工程ｃ）が、前記形成された混合物を、少なくとも１つのグリッドを通じて押し出す少なくとも１つの工程を含むことを特徴とする、請求項１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記方法が、前記水性ゲルの総重量に対して少なくとも５ｍｇ／ｇの「架橋されたＨＭＷ ＨＡ」を使用することを含むことを特徴とする、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記方法が、前記水性ゲルの総重量に対してて少なくとも３ｍｇ／ｇ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｇ、の「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」を使用することを含むことを特徴とする、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記水性ゲルが、該水性ゲルの総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇ、好ましくは１５～３５ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０～３０ｍｇ／ｇ、の総ヒアルロン酸濃度を有する、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記方法が、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３、好ましくは１：２～５：３、の質量比でヒアルロン酸を使用することを含むことを特徴とする、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記水性ゲルが、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の該ヒアルロン酸の修飾度を有する、請求項１３～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記方法が、工程ａ）において、５～１５ｍｇ／ｇの「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液、
工程ｂ）において、５０～６０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」及び５～２０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液
を使用すること、
ここで、形成された該ゲルは、その総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの総ヒアルロン酸濃度を有すること
を特徴とする、請求項１３～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
無菌の且つ注射可能なゲルを調製する為の、請求項１３～２５のいずれか１項に記載の方法であって、請求項１３～２５のいずれか１項に記載の方法従って得られた水性ゲルを使用すること又は請求項１～１２のいずれか１項に記載の水性ゲルを使用することのうちの少なくとも１つ、及び加熱滅菌すること、例えばオートクレーブ内で滅菌すること、の工程を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項27】
前記ゲルが、その滅菌前に、シリンジ内にパッケージされることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
請求項１３～２７のいずれか１項に記載の方法によって得られうる、ヒアルロン酸の水性ゲル。
【請求項29】
前記ゲルが、軟質ゲル、すなわち周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引を適用する、コーン／プレート構造を有するレオメーターを使用して、５Ｐａの応力について室温で測定された、１５°～５０°の位相角（δ）と、１５０Ｐａ以下、好ましくは２０～１５０Ｐａ、の弾性率Ｇ’とを有し、並びに外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する内径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、約１２．５ｍｍ／分の固定速度で、室温で測定された、１８Ｎ以下、好ましくは１５Ｎ未満、の押し出し力とを有する上記ゲルである、請求項２８に記載の水性ゲル。
【請求項30】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の水性ゲル、又は請求項２８若しくは２９に記載の水性ゲルを含む、化粧用組成物及び／又は皮膚用組成物。
【請求項31】
皮膚の表面外観の変化を予防及び／又は処置する為の、請求項１～１２のいずれか１項に記載の水性ゲル、又は請求項２８若しくは２９に記載の水性ゲル、又は請求項３０に記載の皮膚用組成物。
【請求項32】
軟組織を増大及び／又は充填する為の、請求項１～１２のいずれか１項に記載の水性ゲル、又は請求項２８若しくは２９に記載の水性ゲル、又は請求項３０に記載の皮膚用組成物。
【請求項33】
皮膚の表面外観における変化を予防及び／又は処置する為の、請求項１～１２のいずれか１項に記載の水性ゲル、又は請求項２８若しくは２９に記載の水性ゲル、又は請求項３０に記載の化粧用組成物の非治療的な化粧的使用。
【請求項34】
軟組織を増大及び／又は充填する、特に皺を充填する、為の、請求項１～１２のいずれか１項に記載の水性ゲル、又は請求項２８若しくは２９に記載の水性ゲル、又は請求項３０に記載の化粧用組成物の非治療的な化粧的使用。
【請求項35】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の水性ゲル、又は請求項２８若しくは２９に記載の水性ゲル、又は請求項３０に記載の化粧用組成物及び／又は皮膚用組成物を含む予め充填されたシリンジと、使用の為の説明書とを備えているキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、少なくとも架橋されたヒアルロン酸と少なくとも１つの種類の水溶性ヒアルロン酸とを含む、ヒアルロン酸ベースの水性ゲルに関する。本発明は更に、軟質の、安定な、無菌の、且つ注射可能なグリコサミノグリカンに基づく、特にヒアルロン酸に基づく、補充された組成物を調製する方法に関する。こうして得られた水性ゲル及び組成物は、架橋されていない高モル質量グリコサミノグリカン及び少なくとも１種の架橋されていない低モル質量グリコサミノグリカンから調製された、特に少なくとも１種の架橋されていない高モル質量ヒアルロン酸及び少なくとも１種の架橋されていない低モル質量ヒアルロン酸から調製された、少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカン、特に少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、を含む少なくとも２つの種類のグリコサミノグリカンを含む。
【背景技術】
【0002】
多糖、例えばグリコサミノグリカン、は、生物医学分野で広く使用されている。特に、審美的及び／又は化粧的施与の為に販売されている殆どの製品が、ヒアルロン酸に基づいている。
【0003】
修飾されていないヒアルロン酸ゲルは、完全に生体適合性であるという利点を有するので、皮膚の質を改善する為に魅力的である。しかしながら、該修飾されていないヒアルロン酸ゲルは、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の移植後に、非常に急速に分解する。従って、このようなゲルの効果は、持続期間がごく短い。
【0004】
ヒアルロン酸は、イン・ビボでのその耐久性及び分解に対する耐性を増加する為に、通常、架橋によって修飾される。架橋されたヒアルロン酸ゲルは、様々な調製方法によって得られることができる。多糖、例えばヒアルロン酸は、様々な架橋剤、例えばエポキシ剤、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）又はポリアミン、を用いて架橋されることができる。現在、ヒアルロン酸を架橋する為に使用されている最も一般的な薬剤は、エポキシ剤である１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である。
【0005】
これらの架橋プロセスは、２つの主な工程、すなわち該多糖の水和及び架橋、を必要とする。
【0006】
こうして調製されたヒアルロン酸に基づく商品は一般的に、それらの効能に従って、わずかな架橋されたヒアルロン酸及び１％～１０％の修飾度を含む。
【0007】
それにもかかわらず、ヒアルロン酸の架橋の増加は、より化学的に修飾されたゲルの調製物をもたらし、それ故に、生体適合性が潜在的に低くなる可能性がある。他方では、これらの組成物の機械性能は制限されており、高弾性の及び／又は脆弱な最終製品をもたらす。
【0008】
しかしながら、製品の安定性及び性能の理由で、可能な限り自然のものであり、殆ど修飾されていない、従って殆ど架橋されていない、生体適合性の多糖を含む耐久性のあるイン・ビボ組成物を有することに関心が集まっている。
【0009】
架橋度に加えて、使用されるグリコサミノグリカンの濃度も、組成物の機械特性及び耐性特性を決定する非常に重要なパラメーターである。従って、多糖ベースの組成物のイン・ビボ耐久性及び分解耐性を増加する為の代替法は、最終組成物における該グリコサミノグリカンの全濃度を増加することである。
【0010】
しかしながら、該グリコサミノグリカンの全濃度の増加は、該組成物の耐性及び該組成物の耐久性を増加することに加えて、該組成物の粘度の有意な増加と共に該組成物の増粘をもたらす。従って、この粘度増加により、該ゲルは、注射しにくくなり、組織に自然に統合しにくくなる。特に、総ヒアルロン酸濃度の増加は、注射後の丘疹の発生源になることが知られている。
【0011】
従って、これらの全ての理由で、現在までに販売された殆どの架橋されたヒアルロン酸製品は、総ヒアルロン酸濃度がわずか約２５ｍｇ／ｇ又は約２６ｍｇ／ｇである。しかしながら、このようなゲルは、皮膚の嵩を増す充填（filling）施与の為には潜在的に有用であるが、機械的充填が求められている主な効果ではなく、皮膚の表層帯域への注射を必要とする皮膚の再生及び外観改善の皮膚施与には、好適でない。後者の種類の注射の為には、軟質であり、注射し易く、且つ組織に容易に拡散する、より低い弾性（Ｇ’）及び粘性（Ｇ’’）係数を有するゲルを調製することが、実際望ましい。
【0012】
更に、グリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸、に基づく製品の耐性及び持続性を増加するこの状況において、ヒアルロン酸に関して保護特性を有する様々な化合物を添加することも提案されてきた。従って、熱の下でのヒアルロン酸の分解に対して、国際公開第２０１４／０３２８０４号パンフレットは、リン酸アスコルビルマグネシウムの添加を提案しており、国際公開第２０１３／１８６４９３号パンフレットは、オクタ硫酸スクロースの添加を、国際公開第２００７／０７７３９９号パンフレットは、グリセロールの添加を提案している。しかしながら、この種類の安定化する化合物の添加は、製品の生体適合性に関して不確実性を増加する。
【0013】
結果的に、軟質であり、注射し易く、且つ組織に容易に拡散すると同時に、皮膚の再生及び／又は外観改善の為に十分に耐久性があり且つ有効な、グリコサミノグリカンに基づく、より特にはヒアルロン酸に基づく、無菌ゲルが依然として必要である。
【0014】
特に依然として、従来技術の問題を克服する為に、グリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸、に基づく組成物の耐性及び耐久性を増加する必要がある。本発明は、これらの必要を満たすことを提案する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0015】
第１の観点に従うと、本発明は、架橋されたヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ベースの水性ゲルであって、該ゲルが、
ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％～７０質量％の量の、０．０２ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含むことを特徴とし、
該水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ：multiangle light scattering）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーション（chromathography pumping station）を用いて分析することによって決定されることを特徴とする、
上記のヒアルロン酸ベースの水性ゲルに関する。
ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％～７０質量％の量の、０．０２ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含むことを特徴とし、
該水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ：multiangle light scattering）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーション（chromathography pumping station）を用いて分析することによって決定されることを特徴とする、
上記のヒアルロン酸ベースの水性ゲルに関する。
【0016】
本発明の本文は、少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカンと少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンとを含む水性ゲルを調製する方法であって、
ａ）０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の架橋されていないグリコサミノグリカンと、架橋剤とから形成された、「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカンを含む水性溶液を用意すること、
ｂ）０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、またより好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１０ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンを含む水性溶液を用意すること、並びに
ｃ）工程ａ）及びｂ）からの該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成すること
の工程を少なくとも含む、上記の方法を記載する。
ａ）０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の架橋されていないグリコサミノグリカンと、架橋剤とから形成された、「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカンを含む水性溶液を用意すること、
ｂ）０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、またより好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１０ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンを含む水性溶液を用意すること、並びに
ｃ）工程ａ）及びｂ）からの該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成すること
の工程を少なくとも含む、上記の方法を記載する。
【0017】
第２の観点に従うと、本発明は、少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸と少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸とを含む水性ゲルを調製する方法であって、該方法が、
ａ）０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、
ｂ）０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、並びに
ｃ）工程ａ）及びｂ）の該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成すること
の工程を少なくとも含み、
上記の方法が、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１の、ヒアルロン酸の使用を含むことを特徴とする、
上記の方法に関する。
ａ）０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、
ｂ）０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、並びに
ｃ）工程ａ）及びｂ）の該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成すること
の工程を少なくとも含み、
上記の方法が、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１の、ヒアルロン酸の使用を含むことを特徴とする、
上記の方法に関する。
【0018】
予想外に、本発明者等は、少なくとも１種の架橋されていない高モル質量グリコサミノグリカンから調製された少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカンを含む組成物への、少なくとも１種の架橋されていない低モル質量グリコサミノグリカンの補充、特に少なくとも１種の架橋されていない高モル質量ヒアルロン酸から調製された少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸を含む組成物への、少なくとも１種の架橋されていない低モル質量ヒアルロン酸の補充、により、最終組成物の耐性が増幅することを見出した。
【0019】
以下の例において示されている通り、該結果は、
架橋されていない低モル質量グリコサミノグリカンを添加されていない、より特には架橋されていない低モル質量ヒアルロン酸を添加されていない、同じ組成物と比較して、分解に対して改善された耐性、並びに
同じ全濃度のグリコサミノグリカン、更に特にはヒアルロン酸、及び同じ架橋度の架橋されたグリコサミノグリカン、更に特には架橋されたヒアルロン酸、の画分を有する組成物と比較して、分解に対してより良好な耐性
である。
架橋されていない低モル質量グリコサミノグリカンを添加されていない、より特には架橋されていない低モル質量ヒアルロン酸を添加されていない、同じ組成物と比較して、分解に対して改善された耐性、並びに
同じ全濃度のグリコサミノグリカン、更に特にはヒアルロン酸、及び同じ架橋度の架橋されたグリコサミノグリカン、更に特には架橋されたヒアルロン酸、の画分を有する組成物と比較して、分解に対してより良好な耐性
である。
【0020】
分解に対するこの改善された耐性により、本発明に従う組成物は、加熱滅菌に対する耐性がより高い。従って、滅菌前に類似のレオロジー特性を有する２種類の無菌の且つ注射可能な組成物、すなわち一方が本発明に従う組成物と、他方が従来技術の教示に従って調製された組成物との間では、前者は、滅菌後に後者よりも優れたレオロジー特性を示す。
【0021】
本発明に従う組成物は、分解に対するそれらの増加された耐性のおかげで、有利なことには、特にそれらの輸送及び保存中の可変温度に耐えることができる。
【0022】
更に、少なくとも１種の架橋されていない低モル質量グリコサミノグリカン、特に少なくとも１種の架橋されていない低モル質量ヒアルロン酸、の補充により、増加された全グリコサミノグリカン濃度を有する、従って皮膚の生理に対して１以上の有意な生体力学的及び／又は生物学的効果を有する、軟質であり、注射し易く、且つ容易に拡散する組成物を調製することが可能になる。
【0023】
更に、本発明に従って調製された組成物の使用は、処置される部位におけるグリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸、の生理学的効果の多様化を促す様々なモル質量の該グリコサミノグリカン、特に該ヒアルロン酸、の同時投与を可能にする。
【0024】
第３の観点に従うと、本発明は、本発明に従う方法に従って得ることができるグリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸、の水性ゲルに関する。
【0025】
第４の観点に従うと、本発明は、本発明において定義されている通りの水性ゲルを含む、化粧用組成物及び／又は皮膚用組成物に関する。
【0026】
本発明はまた、本発明に従う方法に従って得られた組成物に関する。
【0027】
本発明はまた、皮膚の粘弾性特性又は生体力学的特性の変化の予防及び／又は処置において使用する為の、本発明に従う水性ゲル又は本発明に従う組成物に関する。
【0028】
本発明はまた、例えば外部要因、例えばストレス、大気汚染、タバコ又は紫外（ＵＶ）光への長期間の曝露、によって誘発された皮膚の表面外観の変化の予防及び／又は処置において使用する為の、本発明に従う水性ゲル又は本発明に従う皮膚用組成物に関する。
【0029】
好ましくは、本発明は、軟組織の増大及び／又は充填において使用する為の、本発明に従う水性ゲル又は本発明に従う皮膚用組成物に関する。
【0030】
本発明はまた、皮膚の表面外観の変化、例えば経時的老化の皮膚徴候、を予防及び／又は処置する為の、本発明において定義されている通りの水性ゲル又は本発明において定義されている通りの化粧組成物の、非治療的な化粧的使用に関する。
【0031】
本発明はまた、軟組織を増大及び／又は充填する、特に皺を充填する、為の、本発明において定義されている通りの水性ゲル又は本発明において定義されている通りの化粧組成物の、非治療的な化粧的使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】図１は、試料１－１～試料１－３のオートクレーブ滅菌時の弾性率（Ｇ’）の喪失（ΔＧ’（％））、架橋されていない低モル質量ヒアルロン酸の濃度、並びに架橋された高モル質量ヒアルロン酸及び架橋されていない高モル質量ヒアルロン酸の濃度のグラフ表示である。
【図2】図２は、それぞれ０．０４ＭＤａ、０．１０ＭＤａ、０．２０ＭＤａ及び１．５０ＭＤａのモル質量の、架橋されていないヒアルロン酸が添加されていない試料３－５及び添加された架橋されていないヒアルロン酸を含む試料３－６～試料３－９、のオートクレーブ滅菌時の弾性率（Ｇ’）の喪失（ΔＧ’（％））を示すグラフである。
【図3】図３は、それぞれ０．０４ＭＤａ、０．１０ＭＤａ、０．２０ＭＤａ及び１．５０ＭＤａのモル質量の、架橋されていないヒアルロン酸が添加されていない試料３－５及び添加された架橋されていないヒアルロン酸を含む試料３－６～試料３－９、のオートクレーブ滅菌時の弾性率（Ｇ’）の喪失の改善パーセンテージを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0033】
詳細な説明
本発明に従う用語の定義
「グリコサミノグリカン」は、２つの炭水化物残基の一方が、アミノ炭水化物（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）であり、第２の炭水化物残基が、ウロン（グルクロン又はイズロン）酸又はガラクトースである、繰り返す二糖単位から構成された長鎖として定義されている。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、ヘパロサン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸を包含する。特には好ましいグリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸である。
本発明に従う用語の定義
「グリコサミノグリカン」は、２つの炭水化物残基の一方が、アミノ炭水化物（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）であり、第２の炭水化物残基が、ウロン（グルクロン又はイズロン）酸又はガラクトースである、繰り返す二糖単位から構成された長鎖として定義されている。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、ヘパロサン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸を包含する。特には好ましいグリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸である。
【0034】
「ヒアルロン酸」は、ヒアルロン酸、又はヒアルロナン、及びその誘導体を意味する。結果的に、語「ヒアルロン酸」はまた、ヒアルロン酸塩、例えばヒアルロン酸ナトリウム、及び例えば酸化、還元、脱アセチル化、硫酸化又はアミド化によって化学的に修飾されたヒアルロン酸を包含する。ヒアルロン酸は、交互のβ－１，３グリコシド結合及びβ－１，４グリコシド結合によって連結された、交互のＤ－グルクロン酸単位及びＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン単位を有する、線状多糖である。
【0035】
【化1】
【0036】
ヒアルロン酸は、ヒトの身体の幾つかの組織に自然に存在し、やはり体内に存在する酵素であるヒアルロニダーゼによって、及び／又は酸化機序を介して、分解される。
【0037】
「水溶性ヒアルロン酸」又は「可溶性ヒアルロン酸」又は「抽出可能なヒアルロン酸」は、「ｓＨＡ」と呼ばれ、ヒアルロン酸ベースのゲルが、過剰の水性媒体で膨潤している場合、該ヒアルロン酸ベースのゲルから抽出されることができるヒアルロン酸を意味する。可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージは、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される。実際、該希釈工程の為の該移動相におけるゲルの濃度、及び該ＳＥＣにおける注入体積は、シグナル対ノイズ（bruise）比を最大限にし、カラム過負荷を回避する為に、上清組成物の関数として、当業者によって適切に調整される。
【0038】
それとは逆に、「非水溶性ヒアルロン酸」又は「不溶性ヒアルロン酸」又は「抽出不可能なヒアルロン酸」は、「ｎｓＨＡ」とも呼ばれ、ヒアルロン酸ベースのゲルが、過剰の水性媒体で膨潤している場合、該ヒアルロン酸ベースのゲルから抽出されることができないヒアルロン酸を意味する。
【0039】
グリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸、のｇ／モル又はＤａで表され、Ｍｗと略される「質量平均モル質量」は、使用されたグリコサミノグリカン分子の質量平均モル質量を云う。グリコサミノグリカンの質量平均モル質量は、当業者に既知の様々な方法によって、例えばキャピラリー電気泳動法によって、サイズ排除クロマトグラフィーによって、又は固有粘度の測定から、決定されることができる。本発明の本文において、表現「モル質量」、「平均モル質量」、「質量平均モル質量」又は「質量モル質量」は、交換可能に使用されうる。
【0040】
グリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸、のｍＬ／ｇ又はｍ３／ｋｇで表される「固有粘度」（［η］）は、溶液の粘度への、該グリコサミノグリカンの寄与を云う。固有粘度は、毛細管粘度計を通して流すことによって、測定されることができる。固有粘度は、ポリマーの流体力学的比体積を表す。グリコサミノグリカンの該固有粘度が低いほど、該グリコサミノグリカンのモル質量は低い。所与のグリコサミノグリカンについて、該固有粘度は、経験的関係式であるＭａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋ関係式によってモル質量に関係付けられ、該式は、当業者によって理解されることができ、該式は以下である：
［η］＝Ｋ×Ｍｗα
ここで、
Ｋは、該研究されたポリマー、該使用された溶媒及び該温度の定数関数であり、特にＫは、該研究されたポリマーの鎖の寸法に関し、
αは、該研究されたポリマー、該使用された溶媒及び該温度の定数関数であり、特にαは、該研究されたポリマーのコンフォメーションに関し、
Ｍｗは、ダルトン（Ｄａ）で表される、該ポリマーの質量平均モル質量である。
［η］＝Ｋ×Ｍｗα
ここで、
Ｋは、該研究されたポリマー、該使用された溶媒及び該温度の定数関数であり、特にＫは、該研究されたポリマーの鎖の寸法に関し、
αは、該研究されたポリマー、該使用された溶媒及び該温度の定数関数であり、特にαは、該研究されたポリマーのコンフォメーションに関し、
Ｍｗは、ダルトン（Ｄａ）で表される、該ポリマーの質量平均モル質量である。
【0041】
「低モル質量グリコサミノグリカン」は、「グリコサミノグリカンＬＭＷ」又は「ＬＭＷグリコサミノグリカン」とも呼ばれ、０．０４～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤＡ、またより好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１０ＭＤａ、の質量平均モル質量を有する原材料としてのグリコサミノグリカンを意味する。
【0042】
「低モル質量ヒアルロン酸」は、「ヒアルロン酸ＬＭＷ」又は「ＨＡ ＬＭＷ」又は「ＬＭＷヒアルロン酸」又は「ＬＭＷ ＨＡ」とも呼ばれ、０．０４～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８～０．１５ＭＤａ、のモル質量の原材料としてのヒアルロン酸を意味し、該ヒアルロン酸は、欧州薬局方（０１／２０１７版：１４７２）によって示された方法に従って測定された、低い固有粘度の、すなわち０．１０～０．８ｍ３／ｋｇ、好ましくは０．２～０．５ｍ３／ｋｇ、より好ましくは０．２～０．４ｍ３／ｋｇ、の固有粘度のヒアルロン酸に対応する。
【0043】
「低モル質量水溶性ヒアルロン酸」又は「低モル質量可溶性ヒアルロン酸」は、「ｓＨＡ ＬＭＷ」又は「ＬＭＷ ｓＨＡ」とも呼ばれ、請求項１に詳説されている方法に従って、すなわち該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって最終的なゲルで測定された、０．０２ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０４ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０４ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、のモル質量の可溶性ヒアルロン酸を意味する。実際、該希釈工程の為の該移動相におけるゲルの濃度、及び該ＳＥＣにおける注入体積は、シグナル対ノイズ比を最大限にし、カラム過負荷を回避する為に、上清組成物の関数として、当業者によって適切に調整される。
【0044】
「高モル質量グリコサミノグリカン」は、「グリコサミノグリカンＨＭＷ」又は「ＨＭＷグリコサミノグリカン」とも呼ばれ、０．５０ＭＤａ超、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの、のモル質量の原材料としてのグリコサミノグリカンを意味する。
【0045】
「高モル質量ヒアルロン酸」は、「ヒアルロン酸ＨＭＷ」又は「ＨＡ ＨＭＷ」又は「ＨＭＷヒアルロン酸」又は「ＨＭＷ ＨＡ」とも呼ばれ、０．５０ＭＤａ超、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの、のモル質量の原材料としてのヒアルロン酸を意味し、該ヒアルロン酸は、欧州薬局方（０１／２０１７版：１４７２）によって示された方法に従って測定された、高い固有粘度の、すなわち０．８ｍ３／ｋｇ超、好ましくは１．２ｍ３／ｋｇ超、より好ましくは１．２ｍ３／ｋｇ～３．５ｍ３／ｋｇの、の固有粘度のヒアルロン酸に対応する。
【0046】
「高モル質量可溶性ヒアルロン酸」又は「高モル質量水溶性ヒアルロン酸」は、「ｓＨＡ ＨＭＷ」又は「ＨＭＷ ｓＨＡ」とも呼ばれ、請求項１に詳説されている方法に従って、すなわち該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって最終的なゲルで測定された、０．３０ＭＤａよりも高く、好ましくは０．３０ＭＤａよりも高く、且つ４．００ＭＤａ以下、のモル質量の可溶性ヒアルロン酸を意味する。実際、該希釈工程の為の該移動相におけるゲルの濃度、及び該ＳＥＣにおける注入体積は、シグナル対ノイズ比を最大限にし、カラム過負荷を回避する為に、上清組成物の関数として、当業者によって適切に調整される。
【0047】
「架橋されたグリコサミノグリカン」は、架橋反応中に架橋剤で修飾されたグリコサミノグリカンを云う。それとは逆に、「架橋されていないグリコサミノグリカン」は、架橋剤で修飾されておらず、それ故に架橋反応を受けていないグリコサミノグリカンを云う。
【0048】
「架橋されたヒアルロン酸」は、架橋反応中に架橋剤で修飾されたヒアルロン酸を云う。それとは逆に、「架橋されていないヒアルロン酸」は、架橋剤で修飾されておらず、それ故に架橋反応を受けていないヒアルロン酸を云う。
【0049】
「架橋されていない」（Non-crosslinked）及び「架橋されていない」（uncrosslinked）は、同義語であり、本発明の本文において交換可能に使用されうる。
【0050】
表現「グリコサミノグリカンＨＭＷ」又は「ＨＭＷグリコサミノグリカン」は、該水性ゲル中に存在する場合、「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」成分及び「架橋されていないグリコサミノグリカンＨＭＷ」成分を云う。
【0051】
表現「ヒアルロン酸ＨＭＷ」は、「ＨＡ ＨＭＷ」又は「ＨＭＷ ＨＡ」とも呼ばれ、該水性ゲル中に存在する場合、「架橋されたヒアルロン酸ＨＭＷ」（「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」又は「架橋されたＨＭＷ ＨＡ」とも呼ばれる）成分、適用できる場合は「架橋されていないヒアルロン酸ＨＭＷ」（「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」又は「架橋されていないＨＭＷ ＨＡ」とも呼ばれる）成分を云う。
【0052】
「架橋されたグリコサミノグリカン」、特に「架橋されたヒアルロン酸」、の調製中に適用される「架橋率」は、架橋剤の質量（又は重量）と、該架橋されたグリコサミノグリカン、特に該架橋されたヒアルロン酸、を調製する為に使用されるグリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸、の質量との比に対応する。該架橋率は、パーセンテージとして表される。
【0053】
架橋されたグリコサミノグリカン、及びこのような架橋されたグリコサミノグリカン、特に架橋されたヒアルロン酸、を含む組成物、及びこのような架橋されたヒアルロン酸を含む組成物は、それらの「修飾度」（ＭＯＤ）によって定性されることができる。この修飾度は、該グリコサミノグリカンに、その末端の１以上によって連結している修飾性薬物のモル量に対応し、該組成物におけるグリコサミノグリカンの二糖繰り返し単位１００モル、特に該組成物におけるヒアルロン酸の二糖繰り返し単位１００モル、当たりで表される。この修飾度を決定する為の基準方法は、核磁気共鳴分光法（１Ｈ ＮＭＲ）である。該修飾度は、該グリコサミノグリカン二糖単位のシグナルを上回る該架橋剤のシグナルのモル比によって決定される（グリコサミノグリカンが架橋に関与していようといまいと）。
【0054】
「架橋された高モル質量（ＨＭＷ）グリコサミノグリカン」又は「crosslinked high-molar-mass (HMW) glycosaminoglycan」は、架橋されていない高モル質量グリコサミノグリカンから調製された、架橋されたグリコサミノグリカンを云う。好ましくは、架橋されたＨＭＷグリコサミノグリカンは、８％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％未満、の架橋率を有する。
【0055】
「架橋された高モル質量（ＨＭＷ）ヒアルロン酸」又は「crosslinked high-molar-mass (HMW) hyaluronic acid」は、架橋されていない高モル質量ヒアルロン酸から調製された架橋されたヒアルロン酸を云う。好ましくは、架橋されたＨＭＷヒアルロン酸は、８％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％未満、の架橋率を有する。
【0056】
「皮膚生理に対するグリコサミノグリカンの生体力学的及び生物学的特性」は、特に、水和及び線維芽細胞活性化を包含する。例えば、ヒアルロン酸は、その生体力学的及び生物学的特性に起因して、皮膚の再構築、再生及び／又は若返りに関与する。
【0057】
組成物の「補充」は、この組成物への、少なくとも１種の架橋されていない低モル質量グリコサミノグリカンの添加を表す。好ましくは、補充は、組成物への、少なくとも１種の架橋されていない低モル質量ヒアルロン酸の添加に対応する。
【0058】
「全グリコサミノグリカン濃度」は、架橋された高モル質量グリコサミノグリカン及び任意的に架橋されていない高モル質量グリコサミノグリカンの濃度と、補充の為に使用されたグリコサミノグリカンの濃度との合計を意味する。この濃度は、ゲル１グラム当たりのグリコサミノグリカンのミリグラムで表される。
【0059】
「総ヒアルロン酸濃度」は、架橋された高モル質量ヒアルロン酸及び任意的に架橋されていない高モル質量ヒアルロン酸の濃度と、補充の為に使用されたヒアルロン酸の濃度との合計を意味する。この濃度は、ゲル１グラム当たりのグリコサミノグリカンのミリグラムで表される。
【0060】
溶液は、その色、視覚的外観及び粘度が、肉眼により及び触覚により均一であると知覚される場合、「均質」とみなされる。
【0061】
「水性媒体」は、溶媒として少なくとも水を含有し、グリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸、を溶解する特性を有する、任意の液体媒体を意味する。
【0062】
「架橋剤」は、様々なグリコサミノグリカン鎖の間に架橋を導入することができる任意の化合物を意味する。本発明の実行に好適な架橋剤として、特に二官能性若しくは多官能性のエポキシ架橋剤、又は非エポキシ架橋剤が挙げられうる。該エポキシ剤の中でも、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、ジエポキシオクタン、１，２－ビス（２，３－エポキシプロピル）－２，３－エチレン、１，２－ビス（２，３－エポキシプロピル）－２，３－エミレン（emylene）及びそれらの混合物が挙げられうる。該非エポキシ剤の中でも、内因性ポリアミン、例えばスペルミン、スペルミジン及びプトレシン、アルデヒド、カルボジイミド、並びにジビニルスルホンが挙げられうる。
【0063】
「水性ゲル」は、他に特定されない場合には、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲル又は本発明に従う水性ゲルの両方を意味する。
【0064】
「軟質ゲル」は、粘弾性分布が中程度に弾性のままである、すなわち周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引（oscillation stress sweep）を適用する、コーン／プレート構造（円錐角１°／プレート直径４０ｍｍ）を有するレオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ２）を使用して、５Ｐａの応力について室温で測定された、１５°～５０°の位相角（δ）と、低弾性率Ｇ’、換言すれば１５０Ｐａ以下、好ましくは２０～１５０Ｐａ、のＧ’とを有し、並びに外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する内径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、約１２．５ｍｍ／分の固定速度で、室温で測定された、１８Ｎ以下、好ましくは１５Ｎ未満、の押し出し力とを有する、十分に粘性のままである、上記のゲルを意味する。
【0065】
「注射しやすい」は、外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する外径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、ダイナモメーターを約１２．５ｍｍ／分の固定速度で用いて室温で測定された場合、１８Ｎ未満、好ましくは１５Ｎ未満、の平均押し出し力を有するゲルを意味する。
【0066】
「組織に容易に拡散した」組成物又はゲルは、皮膚の表層帯域、すなわち上層及び中層真皮、に注射した後に丘疹の形成を促進しない、皮膚の再生及び外観改善の皮膚施与の為の組成物を意味する。
【0067】
「イン・ビボ耐久性」は、ゲルの注射後に、処置された部位に経時的に残存するゲルの能力を意味する。イン・ビボで耐久性があるゲルは、該処置された部位に、少なくとも１カ月間、好ましくは少なくとも３カ月間、より好ましくは少なくとも６カ月間、残存することができる、すなわち施与後に少なくとも１カ月間、好ましくは少なくとも３カ月間、より好ましくは少なくとも６カ月間、全体的な審美的改善を維持することができる、言い換えれば１．非常に改善された、２．改善された、３．変化なし、４．悪化した、５．非常に悪化した、の５つのグレードを含む全体的な審美的改善の主観的評価尺度に基づいて、施与後に少なくともグレード１又は２の改善を、少なくとも１カ月間、好ましくは少なくとも３カ月間、より好ましくは少なくとも６カ月間、維持することができる、ゲルである。
【0068】
語「安定性」は、少なくとも１年間の保存中、その仕様に従って物理化学的特性（色、ｐＨ、均質性、濁度、レオロジー等）を維持する、組成物の能力を特徴付ける。組成物の安定性は一般的に、その物理化学的パラメーターの１以上、特にそのレオロジーパラメーター、例えばその弾性率（Ｇ’）又は粘度（η）、の１以上を観察し、及び／又は測定することによってモニタリングされる。
【0069】
「無菌ゲル」は、皮膚の表層領域、すなわち上層及び中層真皮、内に又はそれを介して投与するのに安全なゲルを意味する。特に、注射技術によって投与されるべき該ゲルが、宿主生物において望ましくない二次反応を惹起するおそれがある如何なる混入物も含まないことが必須である。
【0070】
語「添加剤」、「追加成分」及び「賦形剤」は、交換可能に使用され、皮膚内及び／又は皮膚上での施与と適合する任意の成分を云う。使用される添加剤の量は、該成分の性質、所望の効果、及び本発明に従う組成物の使用に応じて決まる。この添加剤は、以下の成分の１種又はその誘導体の１種：麻酔剤、抗酸化剤、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、コエンザイム、アドレナリン誘導体、リン酸二水素ナトリウム一水和物及び／又は二水和物、又は塩化ナトリウムであることができる。
【0071】
「麻酔剤」として、アムブカイン、アモキセカイン、アミレイン（Amylein）、アプリンジン、アプトカイン（Aptocaine）、アルチカイン、ベンゾカイン、ベトキシカイン（Betoxycaine）、ブピバカイン、ブタカイン、ブタムベン、ブタニリカイン、クロロブタノール、クロロプロカイン、シンコカイン、クロダカイン、コカイン、クリオフルオラン、シクロメチカイン、デキシバカイン、ジアモカイン、ジペロドン、ジクロニン、エチドカイン、ユープロシン（Euprocine）、フェブエリン（Febuerine）、フォモカイン（Fomocaine）、グアフェカイノール、ヘプタカイン（Heptacaine）、ヘキシルカイン、ヒドロキシプロカイン、ヒドロキシテトラカイン（Hydroxytetracaine）、イソブタンベン、ロイシノカイン（Leucinocaine）、レボブピバカイン、レボキサドロール、リダミジン、リドカイン、ロツカイン（Lotucaine）、メングリタート（Menglytate）、メピバカイン、メプリルカイン、ミルテカイン（Myrtecaine）、オクタカイン、オクトドリン、オキセタカイン、オキシブプロカイン、パレトキシカイン（Parethoxycaine）、パリドカイン（Paridocaine）、フェナカイン、ピペロカイン、ピリドカイン（Piridocaine）、ポリドカノール、プラモカイン、プリロカイン、プロカイン、プロパノカイン、プロピポカイン（Propipocaine）、プロポキシカイン、プロキシメタカイン、ピロカイン、カタカイン（Quatacaine）、キニソカイン、リソカイン、ロドカイン、ロピバカイン、テトラカイン、トリカイン、トリメカイン、及びその塩が挙げられうる。
【0072】
「抗酸化剤」として、グルタチオン、エラグ酸、スペルミン、レスベラトロール、レチノール、Ｌ－カルニチン、ポリオール、ポリフェノール、フラボノール、テアフラビン、カテキン、カフェイン、ユビキノール、ユビキノン、アルファ－リポ酸が挙げられうる。
【0073】
「アミノ酸」として、アルギニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、グリシン、バリン、スレオニン、プロリン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、システインが挙げられうる。
【0074】
「ビタミン」として、ビタミンＥ、Ａ、Ｃ、Ｂ、特にビタミンＢ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ８、Ｂ９、Ｂ７、Ｂ１２、好ましくはピリドキシン、が挙げられうる。
【0075】
「ミネラル」として、亜鉛、マグネシウム、カルシウム、カリウム、マンガン、ナトリウム、銅、の塩が挙げられうる。
【0076】
「コエンザイム」として、コエンザイムＱ１０、ＣｏＡ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰが挙げられうる。
【0077】
「アドレナリン誘導体」として、アドレナリン及びノルアドレナリンが挙げられうる。
【0078】
最後に、示されている全ての数値は、厳密なものとはみなされず、一般的な慣例に従う近似であり、すなわち該数値の示されている末尾の桁は、該測定の精度に対応すると理解される。例えば、０．０４ＭＤａのモル質量について、誤差範囲は、０．０３５～０．０４４ＭＤａである。
【0079】
本発明に従う方法
前述で特定された通り、本発明の本文は、一方では、高モル質量の架橋されていないグリコサミノグリカンと架橋剤とから形成されることから「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」とも呼ばれる、少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカンを含む水性溶液を必要とし、他方では、「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」と呼ばれる低モル質量の少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンを含む水性溶液を必要とする水性ゲルを調製する為の、且つ該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成する為の、方法を記載する。
前述で特定された通り、本発明の本文は、一方では、高モル質量の架橋されていないグリコサミノグリカンと架橋剤とから形成されることから「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」とも呼ばれる、少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカンを含む水性溶液を必要とし、他方では、「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」と呼ばれる低モル質量の少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンを含む水性溶液を必要とする水性ゲルを調製する為の、且つ該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成する為の、方法を記載する。
【0080】
本発明に従う方法において使用される該グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、ヘパロサン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びそれらの混合物から選択されうる。
【0081】
本発明の方法において使用される該グリコサミノグリカンは、同じ又は異なる化学的性質でありうる。
【0082】
特定の実施態様において、本発明の方法において使用される該グリコサミノグリカンは、同一の化学的性質であり、好ましくは全てがヒアルロン酸である。
【0083】
更に特には、本発明は、一方では、高モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と架橋剤とから形成されることから「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」とも呼ばれる、少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸を含む水性溶液を必要とし、他方では、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる低モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸を含む水性溶液を必要とする水性ゲルを調製する為の、且つ該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成する為の方法であって、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１であるヒアルロン酸の使用を含むことを特徴とする、該方法に関する。
【0084】
特定の実施態様において、本発明の方法において使用される該ヒアルロン酸は、化学的に修飾されていない。
【0085】
既に示されている通り、本発明に従う方法は、特には本発明に従う方法の工程ａ）及びｂ）に定義されている通り、水性溶液の形態のこれらのグリコサミノグリカン、好ましくはこれらのヒアルロン酸、を使用する。
【0086】
グリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸、のこれらの溶液は、有利なことには均質である。
【0087】
それらは、慣用的な方法に従って、例えば、水性媒体、例えばリン酸緩衝食塩水での、架橋された又は架橋されていないグリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸、の可溶化及び／又は希釈によって調製されることができる。これらの調製は、有利なことには、室温で、好ましくは１５℃～２５℃の温度で、機械又は手動による撹拌下で行われる。
【0088】
工程Ａ）
工程ａ）で考慮される「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」、特に「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」、の水性溶液に関して、該溶液は、最初に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンを、少なくとも１種の架橋剤で架橋することによって得られ、特に該溶液は、最初に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸を、少なくとも１種の架橋剤で架橋することによって得られる。
工程ａ）で考慮される「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」、特に「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」、の水性溶液に関して、該溶液は、最初に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンを、少なくとも１種の架橋剤で架橋することによって得られ、特に該溶液は、最初に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸を、少なくとも１種の架橋剤で架橋することによって得られる。
【0089】
このような架橋の実現は、明らかに当業者の権能の範囲内である。
【0090】
有利なことには、該架橋剤は、８質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは２質量％未満、の架橋率で導入される。
【0091】
有利なことには、該架橋剤は、グリコサミノグリカン単位の総モル数に対して、特にヒアルロン酸単位の総モル数に対して、特に０．００１～０．２５のモル比で導入される。
【0092】
従って、好ましい実施態様に従うと、該「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」は、８質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは２質量％未満、の架橋率で調製される。
【0093】
この架橋は、期待された修飾度を得る為に、様々な温度及び時間で行われる。
【0094】
従って、室温、すなわち１５℃～２５℃で変わる温度、で行われる架橋は、５時間超又は更には１０時間以上、の反応時間を必要としうる。
【0095】
他方では、刺激要素、例えば加熱、ＵＶ曝露、マイクロ波曝露又は触媒により、好ましくは加熱の使用により、刺激された架橋は、有意に増加された架橋度及び５時間未満の持続期間を有することができる。
【0096】
特定の実施態様において、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の架橋されていないグリコサミノグリカン、特に架橋されていないヒアルロン酸、の架橋は、４０℃超、好ましくは５０℃超、更に特には４５℃～６０℃、又は更に良くは５０℃～５５℃、の温度で行われる。
【0097】
このような架橋は、有利なことには、３０～３００分、好ましくは１００～２４０分、の持続期間を有する。
【0098】
特には好ましい実施態様において、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の架橋されていないヒアルロン酸の架橋は、室温、すなわち１５℃～２５℃の温度、で行われる。
【0099】
このような架橋は、有利なことには、５時間超、又は更には１０時間超、特に１０時間～１００時間、の反応時間を有する。
【0100】
好ましくは、本発明に従う方法において使用される該架橋剤は、エポキシ架橋剤、好ましくは１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、である。
【0101】
使用される該架橋剤が、二官能性又は多官能性エポキシ架橋剤、例えばＢＤＤＥ、である特定の実施態様において、該水性媒体のｐＨは、該架橋反応を活性化する為に、塩基性又は酸性にされる。特定の実施態様に従うと、該水性媒体は、一般的に水酸化ナトリウムを含む溶液で塩基性にされ、好ましくは該水性媒体のｐＨは、１１以上であり、より好ましくは該水性媒体のｐＨは、１２以上である。
【0102】
好ましい実施態様に従うと、工程ａ）の該水性媒体の「架橋されたＨＭＷグリコサミノグリカン」、更に特には「架橋されたＨＭＷ ＨＡ」、の濃度は、工程ｃ）の最後に、「架橋されたＨＭＷグリコサミノグリカン」、更に特には「架橋されたＨＭＷ ＨＡ」、の濃度が該水性ゲルの総質量に対して少なくとも５ｍｇ／ｇになる水性ゲルを形成するように調整される。
【0103】
好ましくは、本発明に従う方法は、５～１５ｍｇ／ｇの「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液を使用する。
【0104】
工程Ｂ）
本発明の方法の工程ｂ）は、その一部について、少なくとも１種の「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」、特に少なくとも１種の「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」、を含む水性溶液を用意することを必要とする。
本発明の方法の工程ｂ）は、その一部について、少なくとも１種の「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」、特に少なくとも１種の「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」、を含む水性溶液を用意することを必要とする。
【0105】
好ましくは、工程ｂ）の該水性溶液において考慮される「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」、特に「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」、の濃度は、工程ｃ）の最後に、該「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」濃度、特に「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」濃度、が該水性ゲルの総質量に対して少なくとも３ｍｇ／ｇ、好ましくは１０ｍｇ／ｇ、になる水性ゲルを形成するように調整される。
【0106】
好ましくは、本発明に従う方法は、５０～６０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」を含む水性溶液を使用する。
【0107】
以下に詳説される通り、本発明に従う方法はまた、工程ａ）及びｂ）について定義されたものとは異なるグリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸、の使用を含みうる。
【0108】
工程Ｃ）
前述の通り、工程ｃ）は、工程ａ）及びｂ）において得られた該溶液の少なくとも一部又は全てから、均質混合物を形成することにある。
前述の通り、工程ｃ）は、工程ａ）及びｂ）において得られた該溶液の少なくとも一部又は全てから、均質混合物を形成することにある。
【0109】
工程ｃ）において考慮される均質混合物の形成は、有利なことには、少なくとも１つの均質化工程を含む。
【0110】
該均質化は、有利なことには、使用された該グリコサミノグリカン鎖の分解を予防する為に、穏やかな条件下で行われる。
【0111】
少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカン及び少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカン、特に少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸及び少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、の均質混合物を形成するこの工程ｃ）は、慣用的な均質化方法、例えば三次元撹拌、パドルミキサー撹拌、ヘラ撹拌及び／又は少なくとも１つのグリッドを通す押し出し工程、に従って行われることができる。
【0112】
優先的な実施態様に従うと、工程ｃ）は、該形成された混合物を、少なくとも１つのグリッドを通じて押し出す少なくとも１つの工程を含む。このようなグリッドの特徴の調整は、当業者の一般知識の一部である。古典的には、該グリッドは、形成されることになる混合物に期待される特性の関数として、グリコサミノグリカンの該溶液、特にヒアルロン酸の該溶液、のそれぞれの特異性を考慮して、それらを結び付けて選択される。
【0113】
従って、特定の実施態様に従うと、この工程ｃ）は、パドルミキサーを用いて均質化する少なくとも１つの工程に続いて、少なくとも１つのグリッドを通して該混合物を押し出す少なくとも１つの工程を含む。
【0114】
均質化は、得られたゲルが巨視的に、肉眼に及び触覚に対して均質な色、均一な粘度を有し、凝集物を含まない場合、満足であるとみなされる。該均質化の持続期間は、当業者の一般知識に従って当業者によって評価される。該均質化は、特に、該ゲルにおける該グリコサミノグリカン、特に該ヒアルロン酸、の均質化の質を評価する為に、任意的に休止期によって時間を隔てられた幾つかのサイクルを含みうる。
【0115】
更に特には、本発明に従う工程ｃ）は、全持続期間が２００分未満、好ましくは１５０分未満、又は更には５～１００分の持続期間、である均質化を含みうる。
【0116】
架橋されていないＨＭＷグリコサミノグリカン、特に架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸
特定の実施態様において、本発明に従う方法はまた、「架橋されていないＨＭＷグリコサミノグリカン」と呼ばれる、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの、のモル質量の少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンの使用、特に「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸の使用、を考慮する。
特定の実施態様において、本発明に従う方法はまた、「架橋されていないＨＭＷグリコサミノグリカン」と呼ばれる、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの、のモル質量の少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンの使用、特に「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸の使用、を考慮する。
【0117】
好ましくは、該「架橋されていないＨＭＷグリコサミノグリカン」、特に該「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」は、水性溶液内で使用される。この水性溶液は、工程ａ）及びｂ）で考慮された該水性溶液の１種とは異なっていてもよく、又は共通していてもよい。
【0118】
代替の実施態様に従うと、該「架橋されていないグリコサミノグリカンＨＭＷ」、特に該「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」、の全て又は一部は、工程ｂ）の該水性溶液において使用される。
【0119】
別の代替実施態様に従うと、該「架橋されていないＨＭＷグリコサミノグリカン」、特に該「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」、の全て又は一部は、工程ａ）及びｂ）の該水性溶液とは異なる水性溶液の形態で使用される。この代替に従って、該「架橋されていないＨＭＷグリコサミノグリカン」、特に該「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」、の全て又は一部を含む該水性溶液、及び工程ｂ）の該水性溶液は、工程ａ）の該水性溶液と同時に又は逐次的に混合される。
【0120】
好ましくは、本発明に従う方法は、工程ｂ）において、５～１５ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液を使用する。
【0121】
添加剤
特定の実施態様において、本発明は、麻酔剤、抗酸化剤、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、コエンザイム、アドレナリン誘導体、リン酸二水素ナトリウム一水和物及び／又は二水和物、並びに塩化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１種の添加剤を使用することを更に含む、上記の方法に関する。
特定の実施態様において、本発明は、麻酔剤、抗酸化剤、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、コエンザイム、アドレナリン誘導体、リン酸二水素ナトリウム一水和物及び／又は二水和物、並びに塩化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１種の添加剤を使用することを更に含む、上記の方法に関する。
【0122】
滅菌
従って、本発明の一つの観点に従うと、該ゲルの無菌性を維持する為には、使用される原料は無菌であり、その投与デバイスへのそのパッケージングを含む該ゲルの調製は、制御された大気条件下で行われる。
従って、本発明の一つの観点に従うと、該ゲルの無菌性を維持する為には、使用される原料は無菌であり、その投与デバイスへのそのパッケージングを含む該ゲルの調製は、制御された大気条件下で行われる。
【0123】
別の観点に従うと、本発明は、無菌の且つ注射可能な水性ゲルを調製する方法であって、本発明に従う方法によって得られた水性ゲルを使用すること又は本発明において定義されている通りの水性ゲルを使用することのうちの少なくとも１つ、及び、滅菌すること、特にオートクレーブ内で滅菌すること、の工程を含む、上記の方法に関する。
【0124】
更に特には、本発明に従う水性ゲルを調製する方法は、
ａ）０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の架橋されていないグリコサミノグリカンと、架橋剤とから形成された、「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカンを含む水性溶液を用意すること、
ｂ）０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンを含む水性溶液を用意すること、
ｃ）工程ａ）及びｂ）からの該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成し、それが、特にオートクレーブ内で滅菌されること
の工程を少なくとも含む。
ａ）０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の架橋されていないグリコサミノグリカンと、架橋剤とから形成された、「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカンを含む水性溶液を用意すること、
ｂ）０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンを含む水性溶液を用意すること、
ｃ）工程ａ）及びｂ）からの該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成し、それが、特にオートクレーブ内で滅菌されること
の工程を少なくとも含む。
【0125】
更に特には、本発明に従う水性ゲルを調製する方法は、
ａ）０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、
ｂ）０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、
ｃ）工程ａ）及びｂ）の該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成し、それが、特にオートクレーブ内で滅菌されること
の工程を少なくとも含み、
「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１の、ヒアルロン酸の使用を含むことを特徴とする、
上記の方法に関する。
ａ）０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、
ｂ）０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸を含む水性溶液を用意すること、
ｃ）工程ａ）及びｂ）の該溶液の全て又は一部の均質混合物を形成し、それが、特にオートクレーブ内で滅菌されること
の工程を少なくとも含み、
「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１の、ヒアルロン酸の使用を含むことを特徴とする、
上記の方法に関する。
【0126】
この滅菌は好ましくは、その投与デバイス、一般的にシリンジ、内に予めパッケージされた製品に対して行われる。
【0127】
従って、有利なことには、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルは、その滅菌の前にシリンジにパッケージされる。
【0128】
好ましくは、該方法は、単一滅菌工程を含む。
【0129】
好ましくは、該滅菌工程は、熱的手段によって、例えばオートクレーブ内で、特に１２０℃～１４０℃の温度で、行われる。
【0130】
特に、該滅菌工程は、オートクレーブ内で、湿式加熱条件下、１２１℃以上、好ましくは１２１℃～１３５℃、のプラトー温度で１５超のＦ０（滅菌値）で行われる。本発明に従って、該滅菌値Ｆ０は、滅菌されるべき該製品に存在する微生物の集団の９０％を１２１℃で不活性化するのに必要な時間（分）に対応する。
【0131】
水性ゲル
先に言及されている通り、本発明の一つの観点は、架橋されたヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ベースの水性ゲルであって、該ゲルが、
ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％～７０質量％の量の、０．０２ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含むことを特徴とし、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定されることを特徴とする、
上記のヒアルロン酸ベースの水性ゲルである。
先に言及されている通り、本発明の一つの観点は、架橋されたヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ベースの水性ゲルであって、該ゲルが、
ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％～７０質量％の量の、０．０２ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含むことを特徴とし、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定されることを特徴とする、
上記のヒアルロン酸ベースの水性ゲルである。
【0132】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲルは、軟質ゲル、すなわち周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引を適用する、コーン／プレート構造（円錐角１°／プレート直径４０ｍｍ）を有するレオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ２）を使用して、５Ｐａの応力について室温で測定された、１５°～５０°の位相角（δ）と、１５０Ｐａ以下、好ましくは２０～１５０Ｐａ、の弾性率Ｇ’とを有し、並びに外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する内径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、約１２．５ｍｍ／分の固定速度で、室温で測定された、１８Ｎ以下、好ましくは１５Ｎ未満、の押し出し力とを有する上記のゲルである。
【0133】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲルは、該水性ゲルの総質量に対して３５質量％～６５質量％の「ｓＨＡ ＬＭＷ」を含む。
【0134】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲル中、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる該水溶性ヒアルロン酸は、０．０４ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、好ましくは０．０４ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量を有する。
【0135】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲル中、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる該水溶性ヒアルロン酸は、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する。
【0136】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲルは、該水性ゲルの総質量に対して１０質量％～３０質量％、好ましくは１５質量％～２０質量％、の「ｓＨＡ ＨＭＷ」を含む。
【0137】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲル中、該架橋されたヒアルロン酸は、該水性ゲルの総質量に対して少なくとも５ｍｇ／ｇの量で存在する。
【0138】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲル中、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる該水溶性ヒアルロン酸は、該水性ゲルの総質量に対して少なくとも３ｍｇ／ｇ、好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｇ、の量で存在する。
【0139】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲル中、該総ヒアルロン酸濃度は、該水性ゲルの総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇ、好ましくは１５～３５ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０～３０ｍｇ／ｇ、である。
【0140】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲル中、該全ヒアルロン酸の修飾度は、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、である。
【0141】
特定の実施態様に従うと、本発明において定義されている通りの水性ゲル中、
該架橋されたヒアルロン酸は、該水性ゲルの総質量に対して６ｍｇ／ｇ～１２ｍｇ／ｇの量で存在し、
「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる該水溶性ヒアルロン酸は、該水性ゲルの総質量に対して１２ｍｇ／ｇ～２０ｍｇ／ｇの量で存在し、
「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる該水溶性ヒアルロン酸は、該水性ゲルの総質量に対して３ｍｇ／ｇ～６ｍｇ／ｇの量で存在し、
該水性ゲルは、該水性ゲルの総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの総ヒアルロン酸濃度を含む。
該架橋されたヒアルロン酸は、該水性ゲルの総質量に対して６ｍｇ／ｇ～１２ｍｇ／ｇの量で存在し、
「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる該水溶性ヒアルロン酸は、該水性ゲルの総質量に対して１２ｍｇ／ｇ～２０ｍｇ／ｇの量で存在し、
「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる該水溶性ヒアルロン酸は、該水性ゲルの総質量に対して３ｍｇ／ｇ～６ｍｇ／ｇの量で存在し、
該水性ゲルは、該水性ゲルの総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの総ヒアルロン酸濃度を含む。
【0142】
特定の実施態様において、本発明に従う水性ゲルは、例えばオートクレーブ内で、加熱滅菌工程に付される。
【0143】
ヒアルロン酸は、強酸性及びアルカリ性ｐＨ、高温（例えば、加熱滅菌中）、酸化（例えば、活性酸素種）及び酵素活性に対して感度が高いことが知られている（Stern R，Kogan G，Jedrzejas MJ，et al．The many ways to cleave hyaluronan．Biotechnol Adv 2007;25:537-57）。
【0144】
結果として、架橋されたヒアルロン酸を含む組成物を製造する為の製造方法、とりわけ適用された架橋条件、はヒアルロン酸鎖を分解して、可溶性ＬＭＷヒアルロン酸を放出する傾向がある。このようなＬＭＷヒアルロン酸の断片は、使用された架橋剤によって、例えばＢＤＤＥによって、少なくとも部分的に修飾される。
【0145】
それとは対照的に、該調製方法中に添加された、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸由来の可溶性ヒアルロン酸は、ＢＤＤＥで修飾されない。
【0146】
ＢＤＤＥによる修飾は、修飾度測定（ＭＯＤ）によって可視化されうる。この状況において、可溶性ヒアルロン酸のＭＯＤが高いほど、該研究されるゲルの調製方法中に生じたＬＭＷヒアルロン酸の断片の割合が高く、該調製方法中に添加されたＬＭＷヒアルロン酸由来の可溶性ヒアルロン酸の割合が低い。
【0147】
これは、実施例７において示されている。
【0148】
前述のヒアルロン酸の切断は、熱による滅菌の前の、ゲルにおける添加されたヒアルロン酸のモル質量が、滅菌されたゲルにおいて測定された可溶性ヒアルロン酸のモル質量よりも高いことを説明する。
【0149】
このような感度はまた、他のグリコサミノグリカンについても当てはまる。
【0150】
実際、「ｓＨＡ」は、
該ゲルの調製方法中、該架橋工程ａ）後に添加された架橋されていないＨＡ ＬＭＷ、及び
存在する場合には、該ゲルの調製方法中、架橋工程ａ）後に添加された架橋されていないＨＡ ＨＭＷ、及び
該ゲルの調製方法中に放出されたＨＡ断片（該ＨＡ断片は、架橋剤、例えばＢＤＤＥ、で少なくとも部分的に修飾されている）
に対応する。
該ゲルの調製方法中、該架橋工程ａ）後に添加された架橋されていないＨＡ ＬＭＷ、及び
存在する場合には、該ゲルの調製方法中、架橋工程ａ）後に添加された架橋されていないＨＡ ＨＭＷ、及び
該ゲルの調製方法中に放出されたＨＡ断片（該ＨＡ断片は、架橋剤、例えばＢＤＤＥ、で少なくとも部分的に修飾されている）
に対応する。
【0151】
従って、「ｓＨＡ ＬＭＷ」の量は、
該ゲルの調製方法中、架橋工程ａ）後に添加された架橋されていないＨＡ ＬＭＷと、
存在する場合には、該ゲルの調製方法中、架橋工程ａ）後に添加された架橋されていないＨＡ ＨＭＷと
の量に少なくとも等しい。
該ゲルの調製方法中、架橋工程ａ）後に添加された架橋されていないＨＡ ＬＭＷと、
存在する場合には、該ゲルの調製方法中、架橋工程ａ）後に添加された架橋されていないＨＡ ＨＭＷと
の量に少なくとも等しい。
【0152】
それとは対照的に、「ｎｓＨＡ」は、架橋されたＨＡに対応する。
【0153】
特定の実施態様に従うと、本発明に従う水性ゲルは、
ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％～７０質量％の量の、０．０４ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。特定の実施態様に従うと、本発明に従う水性ゲルは、
ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％～７０質量％の量の、０．０４ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。
ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％～７０質量％の量の、０．０４ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。特定の実施態様に従うと、本発明に従う水性ゲルは、
ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％～７０質量％の量の、０．０４ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。
【0154】
特定の実施態様に従うと、本発明に従う水性ゲルは、
ヒアルロン酸の総質量に対して３５質量％～６５質量％の量の、０．０２ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。
ヒアルロン酸の総質量に対して３５質量％～６５質量％の量の、０．０２ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。
【0155】
特定の実施態様に従うと、本発明に従う水性ゲルは、
ヒアルロン酸の総質量に対して３５質量％～６５質量％の量の、０．０４ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。
ヒアルロン酸の総質量に対して３５質量％～６５質量％の量の、０．０４ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。
【0156】
特定の実施態様に従うと、本発明に従う水性ゲルは、
ヒアルロン酸の総質量に対して３５質量％～６５質量％の量の、０．０４ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。先に言及されている通り、本発明はまた、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルに関する。
ヒアルロン酸の総質量に対して３５質量％～６５質量％の量の、０．０４ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸、及び
任意的に、０．３０ＭＤａ超且つ４．００ＭＤａ以下の質量平均モル質量を有する、「ｓＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる水溶性ヒアルロン酸
を少なくとも含み、
全水溶性ヒアルロン酸が、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の修飾度を有し、
可溶性ヒアルロン酸のそれぞれのパーセンテージが、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２の溶液内で、２５℃において５日間希釈し、そして、それを４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、そのように希釈されたゲルを０．４５ｍｍで濾過して濾液を得、次に該濾液を、マルチアングル光散乱（ＭＡＬＳ）検出器と、屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）が０．１６５ｍＬ／ｇに設定された屈折率（ＲＩ）検出器とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー計器を用いて分析すること、及び０．３ｍＬ／分の流量でｐＨ７．２の硝酸ナトリウム移動相を用いる、０．００１Ｄａ～２０ＭＤａから構成された質量平均モル質量を有する分子に適合させられたデュアルセットのサイズ排除カラムを備えている液体クロマトグラフィーポンピングステーションを用いて分析することによって決定される
ことを特徴とする。先に言及されている通り、本発明はまた、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルに関する。
【0157】
工程ｃ）の最後に、少なくとも１種の「架橋されていないＬＭＷグリコサミノグリカン」、及び少なくとも１種の「架橋されたＨＭＷグリコサミノグリカン」を含む「ＨＭＷグリコサミノグリカン」、を含む均質な水性ゲルが得られる。
【0158】
有利なことには、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルは、その総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇ、好ましくは１５～３５ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０～３０ｍｇ／ｇ、の全グリコサミノグリカン濃度を含む。
【0159】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルはまた、「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」と「グリコサミノグリカンＨＭＷ」との質量比が１：４～４：１、好ましくは１：３～５：３、より好ましくは１：２～２：１、であることによって特徴付けられうる。
【0160】
特定の実施態様に従うと、該水性ゲルは、該グリコサミノグリカンの修飾度が５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満、である。
【0161】
更に特には、工程ｃ）の最後に、少なくとも１種の「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」、及び少なくとも１種の「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」を含む「ＨＡ ＨＭＷ」、を含む均質な水性ゲルが得られる。
【0162】
有利なことには、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルは、その総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇ、好ましくは１５～３５ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０～３０ｍｇ／ｇ、の総ヒアルロン酸濃度を含む。
【0163】
一つの実施態様に従うと、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルはまた、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３、好ましくは１：２～５：３、であることによって特徴付けられる。
【0164】
特定の実施態様に従うと、該水性ゲルは、５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、の該ヒアルロン酸の修飾度を有する。
【0165】
別の特定の実施態様に従うと、本発明に従う方法によって得られた該水性ゲルは、軟質ゲル、すなわち周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引を適用する、コーン／プレート構造（円錐角１°／プレート直径４０ｍｍ）を有するレオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ２）を使用して、５Ｐａの応力について室温で測定された、１５°～５０°の位相角（δ）と、１５０Ｐａ以下、好ましくは２０～１５０Ｐａ、の弾性率Ｇ’とを有し、並びに外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する内径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、約１２．５ｍｍ／分の固定速度で、室温で測定された、１８Ｎ以下、好ましくは１５Ｎ未満、の押し出し力とを有する上記のゲルである。
【0166】
本発明の一つの実施態様に従うと、該水性ゲルは、
工程ａ）において、５～１５ｍｇ／ｇの「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」を含む水性溶液、
工程ｂ）において、５０～６０ｍｇ／ｇの「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」及び５～２０ｍｇ／ｇの「架橋されていないグリコサミノグリカンＨＭＷ」を含む水性溶液
を使用する方法の最後に得られ、形成された該ゲルは、その総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの全グリコサミノグリカン濃度を有する。
工程ａ）において、５～１５ｍｇ／ｇの「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」を含む水性溶液、
工程ｂ）において、５０～６０ｍｇ／ｇの「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」及び５～２０ｍｇ／ｇの「架橋されていないグリコサミノグリカンＨＭＷ」を含む水性溶液
を使用する方法の最後に得られ、形成された該ゲルは、その総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの全グリコサミノグリカン濃度を有する。
【0167】
本発明の一つの実施態様に従うと、該水性ゲルは、
工程ａ）において、５～１５ｍｇ／ｇの「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液、
工程ｂ）において、５０～６０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」及び５～２０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液
を使用する方法の最後に得られ、形成された該ゲルは、その総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの総ヒアルロン酸濃度を有する。
工程ａ）において、５～１５ｍｇ／ｇの「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液、
工程ｂ）において、５０～６０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」及び５～２０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液
を使用する方法の最後に得られ、形成された該ゲルは、その総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの総ヒアルロン酸濃度を有する。
【0168】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルであって、その総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇ、好ましくは１５～３５ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０～３０ｍｇ／ｇ、の全グリコサミノグリカン濃度を有する上記水性ゲルの代表は、特に、
０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」と呼ばれる、少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンから形成された少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカン、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、またより好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１０ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカン、及び
任意的に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されていないグリコサミノグリカンＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカン
を使用することから得られる。
０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」と呼ばれる、少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカンから形成された少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカン、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、またより好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１０ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカン、及び
任意的に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、のモル質量の、「架橋されていないグリコサミノグリカンＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないグリコサミノグリカン
を使用することから得られる。
【0169】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルであって、その総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの総ヒアルロン酸濃度を有する上記水性ゲルの代表は、特に、
工程ａ）において、５～１５ｍｇ／ｇの「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液、
工程ｂ）において、５０～６０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」及び５～２０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液
を使用することから得られる。
工程ａ）において、５～１５ｍｇ／ｇの「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液、
工程ｂ）において、５０～６０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」及び５～２０ｍｇ／ｇの「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」を含む水性溶液
を使用することから得られる。
【0170】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルの代表は、特に、
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
【0171】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルの代表は、特に、
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
【0172】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルの代表は、特に、
質量平均モル質量０．５０ＭＤａ以上の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量０．５０ＭＤａ以上の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３で使用される。
質量平均モル質量０．５０ＭＤａ以上の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量０．５０ＭＤａ以上の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３で使用される。
【0173】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルの代表は、特に、
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３で使用される。
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３で使用される。
【0174】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルの代表は、特に、
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３で使用される。
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３で使用される。
【0175】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルの代表は、特に、
質量平均モル質量０．５０ＭＤａ以上の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量０．５０ＭＤａ以上の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：２～５：３で使用される。
質量平均モル質量０．５０ＭＤａ以上の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量０．５０ＭＤａ以上の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：２～５：３で使用される。
【0176】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルの代表は、特に、
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：２～５：３で使用される。
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：２～５：３で使用される。
【0177】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルの代表は、特に、
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：２～５：３で使用される。
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：２～５：３で使用される。
【0178】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルであって、その総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇ、好ましくは１５～３５ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０～３０ｍｇ／ｇ、の全ヒアルロン酸を有する上記水性ゲルの代表は、特に、
０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
【0179】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルであって、その総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇの全ヒアルロン酸を有する上記水性ゲルの代表は、特に、
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
【0180】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルであって、その総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの全ヒアルロン酸を有する上記水性ゲルの代表は、特に、
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、質量平均モル質量１．００ＭＤａ超の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
【0181】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルであって、その総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇの全ヒアルロン酸を有する上記水性ゲルの代表は、特に、
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
【0182】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルであって、その総質量に対して２０～３０ｍｇ／ｇの全ヒアルロン酸を有する上記水性ゲルの代表は、特に、
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａの質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～２：１で使用される。
【0183】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルであって、その総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇ、好ましくは１５～３５ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０～３０ｍｇ／ｇ、の全ヒアルロン酸を有する水性ゲルの上記代表は、特に、
０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３で使用される。
０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：３～５：３で使用される。
【0184】
本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルであって、その総質量に対して１０～４０ｍｇ／ｇ、好ましくは１５～３５ｍｇ／ｇ、より好ましくは２０～３０ｍｇ／ｇ、の全ヒアルロン酸を有する上記水性ゲルの代表は、特に、
０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：２～５：３で使用される。
０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸と、架橋剤とから形成された、「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されたヒアルロン酸、
０．０４ＭＤａ～０．３０ＭＤａ、好ましくは０．０８ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１５ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸、及び
任意的に、０．５０ＭＤａ以上、好ましくは１．００ＭＤａ超、より好ましくは１．００ＭＤａ～４．００ＭＤａ、の質量平均モル質量の、「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」と呼ばれる少なくとも１種の架橋されていないヒアルロン酸
を使用することから得られ、
ここで、該ヒアルロン酸は、「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」と「ＨＡ ＨＭＷ」との質量比が１：２～５：３で使用される。
【0185】
当然のことながら、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲルはまた、この種類の調合物において慣用的に考慮される１以上の添加剤、特に先に定義されている通りの１以上の添加剤を含みうる。
【0186】
当然のことながら、１以上の添加剤の選択及び量は、本発明に従うゲルにおいて使用されるその他の化合物との、特に該ヒアルロン酸との、不適合性の如何なるリスクも上昇させないように、且つ下記の通りの使用と適合するように、調整される。これらの調整は、当業者の一般権能内である。
【0187】
特定の実施態様において、本発明はまた、本発明に従って定義されている通りの少なくとも１つの水性ゲル、及び必要であれば麻酔剤、抗酸化剤、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、コエンザイム、アドレナリン誘導体、リン酸二水素ナトリウム一水和物及び／又は二水和物、並びに塩化ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１種の添加剤を含む組成物に関する。
【0188】
好ましい実施態様において、該添加剤は、先に定義されている通りの麻酔剤、特にリドカイン、メピバカイン又はその塩、例えば塩酸塩、である。
【0189】
本発明の方法に従って得られたゲル及び本発明に従う水性ゲルは、皮膚の表面外観の変化の予防及び／又は処置において使用する為の組成物として、特には有用である。
【0190】
本発明に従う組成物は、化粧組成物及び／又は皮膚用組成物であることができる。
【0191】
これらの組成物は、局所的に投与されることができるが、特に皮膚の表層帯域における、すなわち上層及び中層真皮における、注射によっても投与されることができる。
【0192】
注射が考慮される場合、当然のことながら、該組成物及び／又は水性ゲルは無菌であり、注射可能であることが必要である。
【0193】
本発明に従う組成物が局所組成物である場合、該組成物は、その施与に好適な任意のガレノス形態、例えばクリーム、軟膏、ローション、セラム、ゲル又は分散液の形態、であることができる。
【0194】
当業者に周知の任意の好適な賦形剤が、望まれる徴候に応じた適量で、本発明に従う組成物に含まれることができる。
【0195】
更に別の観点に従うと、本発明は、前述の通りの滅菌プロセスに従って滅菌された、注射可能な水性ゲルに関する。
【0196】
本発明に従う方法によって得ることができるこのような水性ゲルの代表は、特に、
該水性ゲルの総質量に対して０．６～０．８質量％の少なくとも１種の「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」、
該水性ゲルの総質量に対して１．４～１．８質量％の少なくとも１種の「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」、及び
該水性ゲルの総質量に対して０．２～０．４質量％の少なくとも１種の「架橋されていないグリコサミノグリカンＨＭＷ」
を含み、
全グリコサミノグリカン濃度が２０～３０ｍｇ／ｇであり、周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引を適用する、コーン／プレート構造（円錐角１°／プレート直径４０ｍｍ）を有するレオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ２）を使用して、５Ｐａの応力について室温で測定された、１５°～５０°の位相角（δ）と、２０～１５０ＰａのＧ’とを有し、並びに外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する外径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、ダイナモメーターを約１２．５ｍｍ／分の固定速度で用いて室温で測定された場合に、１５Ｎ以下の押し出し力とを有する、
上記の水性ゲルである。
該水性ゲルの総質量に対して０．６～０．８質量％の少なくとも１種の「架橋されたグリコサミノグリカンＨＭＷ」、
該水性ゲルの総質量に対して１．４～１．８質量％の少なくとも１種の「架橋されていないグリコサミノグリカンＬＭＷ」、及び
該水性ゲルの総質量に対して０．２～０．４質量％の少なくとも１種の「架橋されていないグリコサミノグリカンＨＭＷ」
を含み、
全グリコサミノグリカン濃度が２０～３０ｍｇ／ｇであり、周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引を適用する、コーン／プレート構造（円錐角１°／プレート直径４０ｍｍ）を有するレオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ２）を使用して、５Ｐａの応力について室温で測定された、１５°～５０°の位相角（δ）と、２０～１５０ＰａのＧ’とを有し、並びに外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する外径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、ダイナモメーターを約１２．５ｍｍ／分の固定速度で用いて室温で測定された場合に、１５Ｎ以下の押し出し力とを有する、
上記の水性ゲルである。
【0197】
本発明に従う方法によって得ることができるこのような水性ゲルの代表は、特に、
該水性ゲルの総質量に対して０．６～１．０質量％の少なくとも１種の「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」
該水性ゲルの総質量に対して１．４～１．８質量％の少なくとも１種の「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」、及び
該水性ゲルの総質量に対して０．２～０．６質量％の少なくとも１種の「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」
を含み、
総ヒアルロン酸濃度が２０～３０ｍｇ／ｇであり、周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引を適用する、コーン／プレート構造（円錐角１°／プレート直径４０ｍｍ）を有するレオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ２）を使用して、５Ｐａの応力について室温で測定された、１５°～５０°の位相角（δ）と、２０～１５０ＰａのＧ’とを有し、並びに外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する外径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、ダイナモメーターを約１２．５ｍｍ／分の固定速度で用いて室温で測定された場合、１８Ｎ以下の押し出し力とを有する、
上記の水性ゲルである。
該水性ゲルの総質量に対して０．６～１．０質量％の少なくとも１種の「架橋されたＨＡ ＨＭＷ」
該水性ゲルの総質量に対して１．４～１．８質量％の少なくとも１種の「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」、及び
該水性ゲルの総質量に対して０．２～０．６質量％の少なくとも１種の「架橋されていないＨＡ ＨＭＷ」
を含み、
総ヒアルロン酸濃度が２０～３０ｍｇ／ｇであり、周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引を適用する、コーン／プレート構造（円錐角１°／プレート直径４０ｍｍ）を有するレオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ２）を使用して、５Ｐａの応力について室温で測定された、１５°～５０°の位相角（δ）と、２０～１５０ＰａのＧ’とを有し、並びに外径０．３ｍｍ（３０Ｇ）以下及び長さ１／２インチのニードルを有する外径６．３ｍｍ以上のシリンジにおいて、ダイナモメーターを約１２．５ｍｍ／分の固定速度で用いて室温で測定された場合、１８Ｎ以下の押し出し力とを有する、
上記の水性ゲルである。
【0198】
キット
特に、本発明は、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲル、又は本発明において定義されている通りの水性ゲル、又は本発明に従う化粧組成物及び／又は皮膚用組成物を含む予め充填されたシリンジ（pre-filled syringe）に関する。
特に、本発明は、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲル、又は本発明において定義されている通りの水性ゲル、又は本発明に従う化粧組成物及び／又は皮膚用組成物を含む予め充填されたシリンジ（pre-filled syringe）に関する。
【0199】
更なる一つの観点に従うと、本発明は、本発明に従う方法によって得ることができる水性ゲル、又は本発明において定義されている通りの水性ゲル、又は本発明に従う化粧組成物及び／又は皮膚用組成物を含む予め充填されたシリンジと、使用の為の使用説明書とを備えているキットに関する。
【0200】
使用
別の観点に従うと、本発明は、皮膚の表面外観の変化の予防及び／又は処置において使用する為の、本発明に従う水性ゲル又は本発明に従う皮膚用組成物に関する。好ましくは、本発明は、軟組織の増大及び／又は充填において使用する為の、本発明に定義されている通りの水性ゲル又は本発明に定義されている通りの皮膚用組成物に関する。
別の観点に従うと、本発明は、皮膚の表面外観の変化の予防及び／又は処置において使用する為の、本発明に従う水性ゲル又は本発明に従う皮膚用組成物に関する。好ましくは、本発明は、軟組織の増大及び／又は充填において使用する為の、本発明に定義されている通りの水性ゲル又は本発明に定義されている通りの皮膚用組成物に関する。
【0201】
また、皮膚の粘弾性特性又は生体力学的特性の変化の予防及び／又は処置において使用する為の、本発明において定義されている通りの水性ゲル又は本発明に従う皮膚用組成物が記載されている。
【0202】
また、外部要因、例えばストレス、大気汚染、タバコ又は紫外（ＵＶ）光への長期間の曝露、によって誘発された皮膚徴候の予防及び／又は処置において使用する為の、本発明において定義されている通りの水性ゲル又は本発明に従う皮膚用組成物が記載されている。
【0203】
本発明はまた、皮膚の表面外観の変化を予防及び／又は処置する為の、例えば経時的老化の皮膚徴候を予防及び／又は処置する為の、本発明において定義されている通りの水性ゲル又は本発明に従う化粧組成物の、非治療的な化粧的使用に関する。
【0204】
本発明はまた、軟組織を増大及び／又は充填する、特に皺を充填する、為の、本発明において定義されている通りの水性ゲル又は本発明に従う化粧組成物の、非治療的な化粧的使用に関する。
【0205】
本発明はまた、皮膚の表面外観の変化を予防及び／又は処置する為の方法であって、有効量の本発明において定義されている通りの水性ゲル又は本発明に従う皮膚用組成物を、対象、例えばそれを必要とする患者、に局所施与する少なくとも１つの工程、又は対象、例えばそれを必要とする患者、の体内に注射によって投与する工程を含む、該方法に関する。
【0206】
本発明はまた、軟組織を増大及び／又は充填する為、特に皺を充填する為、の方法であって、有効量の本発明において定義されている通りの水性ゲル又は本発明に従う化粧組成物及び／又は皮膚用組成物を、対象、例えばそれを必要とする患者、に局所施与する少なくとも１つの工程、又は対象、例えばそれを必要とする患者、の体内に注射によって投与する工程を含む、該方法に関する。
【0207】
［実施例］
材料
別々の組の試料が、以下の様々な実施例の為に調製された。これらの連続の間には、とりわけ様々なバッチのヒアルロン酸の使用又は様々な滅菌サイクルに起因して、不可避の変動性がある。結果的に、これらの連続の間の実施例間での比較は、適切でないことに留意することが重要である。
材料
別々の組の試料が、以下の様々な実施例の為に調製された。これらの連続の間には、とりわけ様々なバッチのヒアルロン酸の使用又は様々な滅菌サイクルに起因して、不可避の変動性がある。結果的に、これらの連続の間の実施例間での比較は、適切でないことに留意することが重要である。
【0208】
方法
該実施例において分析された該組成物の粘弾性特性を研究する為に、以下のプロトコルが適用される。
該実施例において分析された該組成物の粘弾性特性を研究する為に、以下のプロトコルが適用される。
【0209】
試料のレオロジーの特徴付け
組成物の粘弾性特性は、レオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ２）を用いて、コーン／プレート構造（円錐角１°／プレート直径４０ｍｍ）を用いて室温で測定される。周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引測定が実施される。弾性率（Ｇ’（Ｐａ））、位相角（δ（°））及び複素粘度（η＊）は、５Ｐａの応力について測定される。
組成物の粘弾性特性は、レオメーター（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＨＲ２）を用いて、コーン／プレート構造（円錐角１°／プレート直径４０ｍｍ）を用いて室温で測定される。周波数１Ｈｚにおいてオシレーション応力掃引測定が実施される。弾性率（Ｇ’（Ｐａ））、位相角（δ（°））及び複素粘度（η＊）は、５Ｐａの応力について測定される。
【0210】
試料の押し出し力の特徴付け
試料の押し出し力は、３０Ｇの１／２インチニードルを有する内径６．４ｍｍの１ｍＬのＣＯＣシリンジ中、２５ｍｍの液滴路中、１２．５ｍｍ／分の固定速度においてダイナモメーターを使用して、室温で決定される。
試料の押し出し力は、３０Ｇの１／２インチニードルを有する内径６．４ｍｍの１ｍＬのＣＯＣシリンジ中、２５ｍｍの液滴路中、１２．５ｍｍ／分の固定速度においてダイナモメーターを使用して、室温で決定される。
【0211】
熱の下での経時的な試料分解耐性の特徴付け
ヒアルロン酸注射可能なゲルの滅菌は、一般的に、オートクレーブ（湿式加熱滅菌プロセス）によって行われる。
ヒアルロン酸注射可能なゲルの滅菌は、一般的に、オートクレーブ（湿式加熱滅菌プロセス）によって行われる。
【0212】
これらの組成物の保存安定性は、高温での強制分解試験（ＡＳＴＭ Ｆ１９８０－１６）により、加速方式で評価されることができる。
【0213】
ゲルの分解は、有意な弾性率喪失（Ｇ’）によって特徴付けられる。
【0214】
この状況において、滅菌時のＧ’の喪失パーセンテージ（ΔＧ’（％））は、加熱滅菌下での経時的な分解に対する、該ゲルの耐性の関連指標である。
【0215】
この為に、滅菌時のＧ’の変化は、以下の通り計算される：
ΔＧ’（％）＝［（滅菌後のＧ’－滅菌前のＧ’）／滅菌前のＧ’］×１００
ΔＧ’（％）＝［（滅菌後のＧ’－滅菌前のＧ’）／滅菌前のＧ’］×１００
【0216】
加えて、Ｇ’の改善パーセンテージは、以下の通り定義されている：
Ｇ’改善（％）＝［（参照試料のΔＧ’－研究された試料のΔＧ’）／参照試料のΔＧ’］×１００
Ｇ’改善（％）＝［（参照試料のΔＧ’－研究された試料のΔＧ’）／参照試料のΔＧ’］×１００
【0217】
酵素分解に対する試料の耐性の特徴付け
酵素分解に対する試料の耐性を研究する為に、該試験されたゲル２ｇが、リン酸緩衝食塩水中ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）溶液（ゲル１ｍＬ当たり０．５Ｕ）と接触させられ、ホモジナイズさせられ、次にオーブンに３７℃において２４時間入れられる。
酵素分解に対する試料の耐性を研究する為に、該試験されたゲル２ｇが、リン酸緩衝食塩水中ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）溶液（ゲル１ｍＬ当たり０．５Ｕ）と接触させられ、ホモジナイズさせられ、次にオーブンに３７℃において２４時間入れられる。
【0218】
各試料は、酵素的処理の前及び後に、レオロジー測定によって特徴付けられ、分解前／後のＧ’の変化は、以下の通り計算される：ΔＧ’＝［（最終Ｇ’－初期Ｇ’）／初期Ｇ’］×１００。このＧ’の変化は、ＨＡａｓｅの存在下でのゲル分解度の直接的な指数である。
【0219】
試料中に存在する水溶性及び非水溶性ヒアルロン酸のサイズ及び分布の特徴付け
ＨＡゲルから放出されたｓＨＡのＭｗ及び量は、マルチアングルレーザー光散乱検出器（Ｄａｗｎ Ｎｅｏｎ ＭＡＬＳ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ）と、屈折率検出器（Ｏｐｔｉｌａｂ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ）とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定された。計測手段は、広範な質量平均モル質量（０．００１ＭＤａ～２０ＭＤａ）を網羅する、連続流で保持されるデュアルセットのサイズ排除カラムＯＨｐａｋ ＬＢ－８０６Ｍ（Ｓｈｏｄｅｘ）を備えているＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムを使用した。溶離液として、１５０ｍＭ硝酸ナトリウム（０．０２％のＮａＮ３を含む）のｐＨ７．２の移動相が、０．３ｍＬ／分の流量で使用された。屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）は、これらの条件下で０．１６５ｍＬ／ｇに設定された。クロマトグラムが得られ、ＡＳＴＲＡソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ）を使用して分析された。
ＨＡゲルから放出されたｓＨＡのＭｗ及び量は、マルチアングルレーザー光散乱検出器（Ｄａｗｎ Ｎｅｏｎ ＭＡＬＳ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ）と、屈折率検出器（Ｏｐｔｉｌａｂ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ）とを備えているサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定された。計測手段は、広範な質量平均モル質量（０．００１ＭＤａ～２０ＭＤａ）を網羅する、連続流で保持されるデュアルセットのサイズ排除カラムＯＨｐａｋ ＬＢ－８０６Ｍ（Ｓｈｏｄｅｘ）を備えているＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムを使用した。溶離液として、１５０ｍＭ硝酸ナトリウム（０．０２％のＮａＮ３を含む）のｐＨ７．２の移動相が、０．３ｍＬ／分の流量で使用された。屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）は、これらの条件下で０．１６５ｍＬ／ｇに設定された。クロマトグラムが得られ、ＡＳＴＲＡソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ）を使用して分析された。
【0220】
試料調製は、該水性ゲルを、０．０２％のＮａＮ３を含む１５０ｎＭの硝酸ナトリウムのｐＨ７．２溶液で、２５℃で５日間希釈し、次に４４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、該ゲルを０．４５ｍｍで濾過して、濾液を得、次に該濾液を、前述の通りに備えられた該ＳＥＣで分析することにある。
【0221】
該希釈工程の為の該移動相におけるゲルの濃度、及び該ＳＥＣにおける注入体積は、シグナル対ノイズ比を最大限にし、カラム過負荷を回避する為に、上清組成物の関数として適切に調整された。
【0222】
決定されるｓＨＡパーセンテージは、該試料におけるＨＡの総質量に対する水溶性ＨＡの質量に対応する。
【0223】
試料中に存在する水溶性ヒアルロン酸の
１
Ｈ ＮＭＲによる修飾度
各試料３ｇが、注入の為の水１０ｍＬを用いて室温で５日間インキュベートされた。次に、該試料はわずかに遠心分離されて（４４００ｒｐｍ、１０分）、該ゲルが該上清（該水溶性ＨＡを含む）から分離され、０．４５ｍｍで濾過されて、不溶性ゲル凝集物が除去された。該上清は、フリーズドライさせられ、Ｄ２Ｏ１ｍＬで溶解させられた。該１Ｈ ＮＭＲ分析は、５００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ分光計で実施される。該修飾度は、ＨＡ二糖単位シグナル（ＨＡは架橋されているか又は架橋されていない）を上回る該架橋剤シグナルのモル比によって決定された。
各試料３ｇが、注入の為の水１０ｍＬを用いて室温で５日間インキュベートされた。次に、該試料はわずかに遠心分離されて（４４００ｒｐｍ、１０分）、該ゲルが該上清（該水溶性ＨＡを含む）から分離され、０．４５ｍｍで濾過されて、不溶性ゲル凝集物が除去された。該上清は、フリーズドライさせられ、Ｄ２Ｏ１ｍＬで溶解させられた。該１Ｈ ＮＭＲ分析は、５００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ分光計で実施される。該修飾度は、ＨＡ二糖単位シグナル（ＨＡは架橋されているか又は架橋されていない）を上回る該架橋剤シグナルのモル比によって決定された。
【0224】
［実施例１］
架橋されたＨＭＷヒアルロン酸組成物への架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の補充の効果
研究された試料は、以下に提示されている。
架橋されたＨＭＷヒアルロン酸組成物への架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の補充の効果
研究された試料は、以下に提示されている。
【0225】
比較用試料１－１は、シリンジに入れられてオートクレーブ内で滅菌され、ＨＭＷヒアルロン酸（４．００ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）及びＢＤＤＥ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９５％）から調製された、総ヒアルロン酸濃度２０ｍｇ／ｇ及び修飾度２％の、架橋されたヒアルロン酸ゲルである。
【0226】
本発明に従う試料１－２は、シリンジに入れられてオートクレーブ内で滅菌され、滅菌前の試料１－１と、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸ナトリウム（０．１０ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の２０ｍｇ／ｇ溶液との１：１混合物から調製された、総ヒアルロン酸濃度２０ｍｇ／ｇの、架橋されたヒアルロン酸ゲルである。
【0227】
比較用試料１－３は、シリンジに入れられてオートクレーブ内で滅菌され、滅菌前の試料１－１と、架橋されていないヒアルロン酸を含まないリン酸緩衝食塩水の溶液との１：１混合物から調製された、総ヒアルロン酸濃度１０ｍｇ／ｇの、架橋されたヒアルロン酸ゲルである。
【0228】
該試料の特徴、それらのＧ’及び滅菌時のそれらのＧ’喪失は、下記の表１及び図１にまとめられている。
【0229】
【表1】
【0230】
該結果は、同じ総ヒアルロン酸濃度であるが、ＬＭＷヒアルロン酸を含まない組成物（試料１－１（参照））と比較して、ＬＭＷヒアルロン酸を含む組成物（本発明に従う試料１－２）についてのより良好な分解耐性を示している。
【0231】
更に、架橋されたＨＭＷヒアルロン酸の濃度が高いほど、該組成物の安定性が高くなると思われる。従って、試料１－３（比較用、１０ｍｇ／ｇのＨＭＷヒアルロン酸）は、２０ｍｇ／ｇのＨＭＷヒアルロン酸を含む試料１－１（比較用）（ΔＧ’＝－１０．８％）よりも大きいＧ’の喪失（ΔＧ’＝－２１．６％）を示す。それにもかかわらず、この安定性の増加は、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸を含む試料１－２（本発明）について見出されたもの（ΔＧ’＝－２．４％）よりも、はるかに低い。
【0232】
結果的に、該組成物の分解耐性の増加と関連するのは、該総ヒアルロン酸濃度の単なる増加ではなく、むしろ、該関連するＨＭＷヒアルロン酸組成物の補充である。
【0233】
［実施例２］
架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸を任意的に含む、架橋されたＨＭＷヒアルロン酸に基づく組成物へのＬＭＷヒアルロン酸の補充の効果
試料２－１は、以下の通り調製される。
架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸を任意的に含む、架橋されたＨＭＷヒアルロン酸に基づく組成物へのＬＭＷヒアルロン酸の補充の効果
試料２－１は、以下の通り調製される。
【0234】
架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸（ＨＴＬ、４．００ＭＤａ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）からの、ＢＤＤＥにより架橋されたヒアルロン酸ゲルの、塩基性媒体における調製。生じた架橋された画分は、中和され、リン酸緩衝食塩水で膨潤させられて、１５ｍｇ／ｇのＮａＨＡを含む最終的なゲルが得られる。次に、該ゲルは透析される。この段階で、該ゲルは、約８０Ｐａ～１２０Ｐａの弾性率Ｇ’及び７°～１０°の位相角δを有する。
【0235】
架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸ナトリウム（４．００ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の１５ｍｇ／ｇ溶液が、該架橋された画分に添加されて、該組成物中、ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％の割合が達成される。該ゲルはホモジナイズされ、グリッドを通して押し出され、１ｍＬのＣＯＣシリンジに充填される。最後に、該ゲルはオートクレーブ処理される。
【0236】
試料２－２は、試料２－１と同様に調製されるが、使用された該架橋されていないヒアルロン酸ゲルの該組成物は、該最終的なゲルが１０ｍｇ／ｇの架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸（０．１０ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）を更に含むように、修正された。
【0237】
試料２－３は、試料２－１として調製されるが、架橋されていない４．００ＭＤａのヒアルロン酸を含まない。
【0238】
試料２－４は、試料２－１として調製されるが、該使用された架橋されていない４．００ＭＤａのヒアルロン酸が、０．１０ＭＤａのヒアルロン酸で置き換えられている。
【0239】
これらの試料のそれぞれについて、Ｇ’の変動（パーセンテージ）が計算される。得られた結果は、下記の表にまとめられている。
【0240】
表２は、架橋されたヒアルロン酸と架橋されていないヒアルロン酸との混合物の安定化を示す。
【0241】
【表2】
【0242】
表３は、架橋されたヒアルロン酸単独の安定化を示す。
【0243】
【表3】
【0244】
該結果は、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸のオートクレーブ滅菌中の保護効果が、架橋されたＨＭＷヒアルロン酸単独を含む組成物（試料２－４対試料２－３）と、架橋されたＨＭＷヒアルロン酸及び架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸の混合物を含む組成物（試料２－２対試料２－１）との両方について観察されることを示している。
【0245】
従って、架橋されたＨＭＷヒアルロン酸単独を含む組成物（試料２－４）又は架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸との混合物（試料２－２）への、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の添加は、有利なことには、それらの分解耐性を増加する。
【0246】
［実施例３］
異なるモル質量の架橋されていないヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ゲルのレオロジー及び安定性の研究
異なるモル質量のヒアルロン酸溶液のレオロジー
様々なモル質量の架橋されていないヒアルロン酸（０．０４ＭＤａ、０．１０ＭＤａ、０．２０ＭＤａ及び１．５０ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の１０ｍｇ／ｇ（１％）溶液が、リン酸緩衝食塩水中で調製される。これらの画分のそれぞれの弾性率（Ｇ’）及び複素粘度（η＊）が決定され、下記の表４に詳説される。
異なるモル質量の架橋されていないヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ゲルのレオロジー及び安定性の研究
異なるモル質量のヒアルロン酸溶液のレオロジー
様々なモル質量の架橋されていないヒアルロン酸（０．０４ＭＤａ、０．１０ＭＤａ、０．２０ＭＤａ及び１．５０ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の１０ｍｇ／ｇ（１％）溶液が、リン酸緩衝食塩水中で調製される。これらの画分のそれぞれの弾性率（Ｇ’）及び複素粘度（η＊）が決定され、下記の表４に詳説される。
【0247】
【表4】
【0248】
先の結果は、０．２０ＭＤａ以下のモル質量の架橋されていないヒアルロン酸単独に基づく、１％で濃縮されたゲルが、有意な弾性特性を有しておらず、粘度が非常に低いことを示している。
【0249】
機械的寄与
架橋されたＨＭＷヒアルロン酸と架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸との混合物、すなわち試料３－５（参照）は、以下の通り調製される。架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸（４．００ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）からの、ＢＤＤＥにより架橋されたヒアルロン酸ゲルの、塩基性媒体における調製。生じた架橋された画分は、中和され、リン酸緩衝食塩水で膨潤させられて、１５ｍｇ／ｇのＮａＨＡを含む最終的なゲルが得られる。次に、該ゲルは透析される。この段階で、該ゲルは、約８０Ｐａ～１２０Ｐａの弾性率Ｇ’及び７°～１０°の位相角δを有する。架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸ナトリウム（４．００ＭＤａ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の１５ｍｇ／ｇ溶液が、該架橋された画分に添加されて、該組成物中、ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％の割合が達成される。該ゲルはホモジナイズされ、グリッドを通して押し出され、１ｍＬのＣＯＣシリンジに充填される。最後に、該ゲルはオートクレーブ処理される。
架橋されたＨＭＷヒアルロン酸と架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸との混合物、すなわち試料３－５（参照）は、以下の通り調製される。架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸（４．００ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）からの、ＢＤＤＥにより架橋されたヒアルロン酸ゲルの、塩基性媒体における調製。生じた架橋された画分は、中和され、リン酸緩衝食塩水で膨潤させられて、１５ｍｇ／ｇのＮａＨＡを含む最終的なゲルが得られる。次に、該ゲルは透析される。この段階で、該ゲルは、約８０Ｐａ～１２０Ｐａの弾性率Ｇ’及び７°～１０°の位相角δを有する。架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸ナトリウム（４．００ＭＤａ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の１５ｍｇ／ｇ溶液が、該架橋された画分に添加されて、該組成物中、ヒアルロン酸の総質量に対して３０質量％の割合が達成される。該ゲルはホモジナイズされ、グリッドを通して押し出され、１ｍＬのＣＯＣシリンジに充填される。最後に、該ゲルはオートクレーブ処理される。
【0250】
試料３－６～試料３－９は、試料３－５と同様に調製されるが、該組成物の総質量に対して１０ｍｇ／ｇの固定濃度（１％）の追加の架橋されていないヒアルロン酸を更に含む、架橋されていないヒアルロン酸ゲルを用いる。
【0251】
この添加の為に、異なるモル質量の架橋されていないヒアルロン酸、すなわち順に０．０４ＭＤａ、０．１０ＭＤａ、０．２０ＭＤａ及び１．５０ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレードの試料３－６～試料３－９、が使用される。
【0252】
これらの試料のレオロジーの特徴は、各試料の６つのシリンジで、滅菌前及び滅菌後に決定される。滅菌後の結果は、下記の表５及び図２にまとめられている。
【0253】
【表5】
【0254】
該架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の制限された機械的寄与のおかげで、試料３－６～試料３－８は、軟質ゲル、すなわち１５°～４５°のδ、１５０Ｐａ以下のＧ’及び１８Ｎ以下の押し出し力を有するゲル、のままである。
【0255】
追加のＬＭＷヒアルロン酸の存在、従って本発明に従うゲルにおいて増加されたヒアルロン酸濃度は、それらの可撓性に影響を及ぼさないことに留意されたい。
【0256】
他方では、追加のＨＭＷヒアルロン酸を含む該比較用試料３－９は、非常に有意に増加されたレオロジーの特徴を示し、もはや軟質ゲルとしてみなされることができない（Ｇ’＞１５０Ｐａ）。
【0257】
分解耐性
各試料の熱分解に対する耐性は、同じオートクレーブサイクルｌを受けた後に喪失したＧ’パーセンテージを計算することによって研究される。
各試料の熱分解に対する耐性は、同じオートクレーブサイクルｌを受けた後に喪失したＧ’パーセンテージを計算することによって研究される。
【0258】
【0259】
【表6】
【0260】
図２において示されている通り、実行された滅菌条件（試験された全ての試料について同一）下で、該参照試料３－５は、約２０％の喪失を被る。
【0261】
架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸の添加（１．５０ＭＤａ、試料３－９）は、滅菌時のＧ’の喪失を改善せず、参照試料３－５の喪失（２０％）よりも依然として高い。
【0262】
それとは対照的に、本発明に従う補充、すなわち０．０４ＭＤａ～０．２０ＭＤａ、より好ましくは０．０８ＭＤａ～０．１０ＭＤａ、のモル質量のヒアルロン酸の添加は、滅菌時のＧ’の喪失の低下（試料３－６～試料３－８と試料３－５との比較）の源、すなわち該組成物の分解耐性の増加の源である。
【0263】
それ故に、本発明に従うＬＭＷヒアルロン酸を補充された組成物は、同一の総ヒアルロン酸濃度、同じ架橋率の該架橋されたＨＭＷヒアルロン酸画分を有するが補充されていない組成物と比較して、より良好な分解耐性を有する。
【0264】
この改善は最小限ではあるが、使用された該最低モル質量（０．０４ＭＤａ）のヒアルロン酸（試料３－６）において、既に目立っている。この改善は、０．１０ＭＤａ及び０．２０ＭＤａのヒアルロン酸（試料３－７及び試料３－８）で有意である。
【0265】
従って、滅菌後の各製品の６つのシリンジでの、６つの測定からの平均の比較は、試料３－７及び試料３－８が、試料３－５よりも有意に高いＧ’値を有することを示している（図２及び３）。
【0266】
Ｇ’のこの増加は、該調合物において使用された該ＬＭＷ ＨＡと該ＨＭＷヒアルロン酸との相互作用と、特に該組成物におけるＬＭＷ ＨＡの存在と関連する改善された分解耐性の効果（滅菌時のＧ’の喪失値の改善によって目に見える）と、の両方に関連している。
【0267】
従って、架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸の添加（例えば、１．５０ＭＤａ）は、該組成物の分解耐性を有意に改善することなく、該組成物の機械特性を増加する一方、架橋されていないＬＭＷ ＨＡの補充は、軟質ゲルの機械特性を維持しながら、ゲルの分解耐性を増加する。
【0268】
［実施例４］
補充の変動の影響
この実施例について、該比較用試料４－１は、実施例３において調製された試料３－５（比較用）と同一である。異なる濃度の架橋されていないＬＭＷ ＨＡの効果を研究する為に、異なる試料が調製された。
補充の変動の影響
この実施例について、該比較用試料４－１は、実施例３において調製された試料３－５（比較用）と同一である。異なる濃度の架橋されていないＬＭＷ ＨＡの効果を研究する為に、異なる試料が調製された。
【0269】
試料４－１は、使用された該架橋されていないヒアルロン酸ゲルの該組成物が、増加する濃度の架橋されていないＬＭＷ ＨＡ（０．１０ＭＤａのＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）を更に含むことを除いて類似の方式で調製された、試料４－２～４－４と比較される。
【0270】
架橋されていないＬＭＷ ＨＡ（０．１０ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の割合は、該組成物における、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の質量と、架橋されたＨＭＷヒアルロン酸の質量との比に対応する（％）。
【0271】
該試料のレオロジーの特徴、及び滅菌時のそれらのＧ’の喪失、すなわちΔＧ’（％）は、下記の表７及び図４にまとめられている。
【0272】
【表7】
【0273】
補充の安定化効果は、本発明に従う全ての試料４－２～試料４－４において目に見える。
【0274】
それ故に、少なくとも１種の架橋されたＨＭＷヒアルロン酸を含むゲルに、多かれ少なかれある量の架橋されていないＬＭＷ ＨＡを補充することの有利な効果を得ることが可能である。
【0275】
更に、先の結果は、低い割合の架橋されていないＬＭＷ ＨＡ（約５０％）又はより高い割合の架橋されていないＬＭＷ ＨＡ（約１５０％）の何れを使用しても、依然として軟質であり、容易に注射可能である、高度に濃縮されたヒアルロン酸組成物（３０ｍｇ／ｇまでの全ヒアルロン酸）が達成されることを示している。
【0276】
［実施例５］
該ＨＭＷヒアルロン酸濃度の変動の影響
この実施例について、該比較用試料５－１は、実施例３において調製された試料３－５（比較用）と同じ方式で調製される。異なる濃度の架橋されたＨＭＷヒアルロン酸及び架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸の組成物に対する、固定濃度の架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の効果を研究する目的の為に、以前の実施例よりも低濃度のＨＭＷヒアルロン酸を含む、本発明に従う試料５－２及び５－３が調製された。
該ＨＭＷヒアルロン酸濃度の変動の影響
この実施例について、該比較用試料５－１は、実施例３において調製された試料３－５（比較用）と同じ方式で調製される。異なる濃度の架橋されたＨＭＷヒアルロン酸及び架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸の組成物に対する、固定濃度の架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の効果を研究する目的の為に、以前の実施例よりも低濃度のＨＭＷヒアルロン酸を含む、本発明に従う試料５－２及び５－３が調製された。
【0277】
試料５－２は、試料５－１と同様に調製されるが、標的濃度は、該架橋されたヒアルロン酸画分について１２ｍｇ／ｇであり、該架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸溶液について１２ｍｇ／ｇであり、それに、最終組成物中１６ｍｇ／ｇの濃度の０．１０ＭＤａの架橋されていないヒアルロン酸をもたらすのに十分な量の、０．１０ＭＤａの架橋されていないヒアルロン酸（ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）が添加される。
【0278】
試料５－３はまた、該参照試料と同様に調製されるが、標的濃度は、該架橋されたＨＭＷヒアルロン酸画分について９ｍｇ／ｇであり、該架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸溶液について９ｍｇ／ｇであり、それに、最終組成物中１６ｍｇ／ｇの濃度の０．１０ＭＤａの架橋されていないヒアルロン酸をもたらすのに十分な量の、０．１０ＭＤａの架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸（ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）が添加される。
【0279】
試料５－１～５－３のレオロジーの特徴、それらの架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の割合（％）及び滅菌時のそれらのＧ’の喪失（ΔＧ’（％））は、下記の表８にまとめられている。
【0280】
【表8】
【0281】
架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の添加のおかげで、架橋されたＨＭＷヒアルロン酸及び架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸の画分を１５ｍｇ／ｇから１２ｍｇ／ｇに低減し、Ｇ’のごくわずかな低減を観察することが可能である（試料５－１（比較用）対試料５－２（本発明））。
【0282】
更に、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の添加のおかげで、軟質ゲルの機械特性を維持しながら、１５ｍｇ／ｇのヒアルロン酸を含むゲルから、２８ｍｇ／ｇのヒアルロン酸を含むゲルに移行することが可能である（試料５－１（比較用）対試料５－２（本発明））。
【0283】
非常に少量の架橋されたＨＭＷヒアルロン酸及び架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸を用いて調製された試料５－３は、滅菌時に最小限のＧ’の喪失を示す（わずか－４％）。
【0284】
架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の存在は、有利なことには、軟質ゲルを調製する為に必要とされる架橋されたヒアルロン酸の量を低減する。また、該総ヒアルロン酸濃度を増加することが可能である。従って換言すれば、該補充は、潜在的に増加された生体適合性（使用される架橋されたヒアルロン酸の割合の低減）を有する軟質ゲルを得ることを可能にし、生体力学的及び／又は生物学的視点からも有効にする。
【0285】
［実施例６］
酵素分解に対する耐性
試料６－１は、実施例３において調製された試料３－５（比較用）と同じプロトコルを使用して調製される。
酵素分解に対する耐性
試料６－１は、実施例３において調製された試料３－５（比較用）と同じプロトコルを使用して調製される。
【0286】
試料６－２も、類似の方式で調製されるが、使用された該架橋されていないヒアルロン酸ゲルの該組成物は、該最終的なゲルが１０ｍｇ／ｇの架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸（０．１０ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）を更に含むように、修正された。
【0287】
試料６－３も、試料６－１と同様に調製されるが、使用された該架橋されていないヒアルロン酸ゲルの該組成物は、該最終的なゲルが１０ｍｇ／ｇの架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸（１．５０ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）を更に含むように、修正された。
【0288】
これら全ての試料は、ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）を用いる酵素分解試験に供される。
【0289】
該試料のレオロジーの特徴及び酵素分解に対するそれらのＧ’の喪失は、下記の表９及び図５にまとめられている。
【0290】
【表9】
【0291】
試料６－２及び試料６－３（それぞれ０．１０ＭＤａ及び１．５０ＭＤａのモル質量を有するヒアルロン酸を含む）は、非常に異なる出発特性を有することに留意されたい。試料６－３の特性は、皮膚再生及び／又は皮膚改善施与には望ましくない（δ、Ｇ’及びＦを参照）。
【0292】
酵素分解に対するＧ’の喪失は、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸が存在する方が、存在しないよりも低く（試料６－２対試料６－１）、架橋されていないＨＭＷヒアルロン酸が存在するよりも更に低い（試料６－２対試料６－３）。それ故に、本発明に従うものとして提示された該組成物（試料６－２）の増加された耐性は、架橋されていないヒアルロン酸の単なる添加とは関連しておらず、具体的には、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の添加と関連している。
【0293】
それ故に、本発明に従って補充された組成物は、同じ総ヒアルロン酸濃度、同じ架橋率の該架橋されたＨＭＷヒアルロン酸画分を有するがＨＭＷヒアルロン酸だけを含む組成物と比較して、酵素分解に対してより良好な耐性を有する。
【0294】
ヒアルロニダーゼによる分解に対する耐性のこの増加は、本発明に従う組成物の、増加されたイン・ビボ耐久性を示唆している。
【0295】
最後に、先の結果は、架橋されていないＬＭＷヒアルロン酸の保護効果を強調しており、従って、少なくとも１種の架橋されたグリコサミノグリカンに基づく組成物を補充する有益な効果を強調している。
【0296】
［実施例７］
試料中に存在する水溶性ヒアルロン酸及び非水溶性ヒアルロン酸の特徴付け
幾つかの滅菌された試料の水溶性ヒアルロン酸及び非水溶性ヒアルロン酸（ｓＨＡ及びｎｓＨＡ）が、前述の通り特徴付けられた。欧州薬局方の医薬品／医療グレードのＨＡ原材料は、ＨＴＬから得られる。
試料中に存在する水溶性ヒアルロン酸及び非水溶性ヒアルロン酸の特徴付け
幾つかの滅菌された試料の水溶性ヒアルロン酸及び非水溶性ヒアルロン酸（ｓＨＡ及びｎｓＨＡ）が、前述の通り特徴付けられた。欧州薬局方の医薬品／医療グレードのＨＡ原材料は、ＨＴＬから得られる。
【0297】
以下の組成物が、参照とみなされる。
試料７－１：架橋されたＨＡ ＨＭＷ：リン酸緩衝液において４．００ＭＤａのＨＡ単独を用いて調製された、架橋されたＨＡゲル。この架橋されたＨＡは、試料２－１の該架橋されたＨＡ部分として調製されるが、該ゲルの総質量に対して１０．５ｍｇ／ｇの濃度のＮａＨＡを含むゲルを得る為に膨潤させられる、
試料７－２：架橋されていないＨＡ ＨＭＷ：該ゲルの総質量に対して４．５ｍｇ／ｇの濃度のＮａＨＡを用いて、リン酸緩衝液において４．００ＭＤａ単独を用いて調製された、架橋されていないＨＡ、
試料７－３：架橋されていないＨＡ ＬＭＷ：該ゲルの総質量に対して１０ｍｇ／ｇの濃度のＮａＨＡを用いて、リン酸緩衝液において０．１０ＭＤａのＨＡ単独を用いて調製された、架橋されていないＨＡ。
試料７－１：架橋されたＨＡ ＨＭＷ：リン酸緩衝液において４．００ＭＤａのＨＡ単独を用いて調製された、架橋されたＨＡゲル。この架橋されたＨＡは、試料２－１の該架橋されたＨＡ部分として調製されるが、該ゲルの総質量に対して１０．５ｍｇ／ｇの濃度のＮａＨＡを含むゲルを得る為に膨潤させられる、
試料７－２：架橋されていないＨＡ ＨＭＷ：該ゲルの総質量に対して４．５ｍｇ／ｇの濃度のＮａＨＡを用いて、リン酸緩衝液において４．００ＭＤａ単独を用いて調製された、架橋されていないＨＡ、
試料７－３：架橋されていないＨＡ ＬＭＷ：該ゲルの総質量に対して１０ｍｇ／ｇの濃度のＮａＨＡを用いて、リン酸緩衝液において０．１０ＭＤａのＨＡ単独を用いて調製された、架橋されていないＨＡ。
【0298】
以下の３種の試料は、該方法中に添加された可変割合のＨＭＷ ＨＡ及びＬＭＷ ＨＡを有する。
【0299】
試料７－４：滅菌前に、４．００ＭＤａのＨＡ単独を用いて調製された、架橋されたＨＡ ＨＭＷ、及び０．１０ＭＤａのＨＡを用いて調製された、架橋されていないＨＡ ＬＭＷを含む、試料２－４として既に提示されたゲル、
試料７－５：滅菌前に、４．００ＭＤａのＨＡ ＨＭＷ単独を用いて調製された、架橋されたＨＡ、及び０．１０ＭＤａのＨＡを用いて調製された、架橋されていないＨＡ ＬＭＷ、及び４．００ＭＤａのＨＡを用いて調製された、架橋されていないＨＡ ＨＭＷ、を含むゲル。該ゲルは、該ゲルの総質量に対して１０ｍｇ／ｇの固定濃度（１％）の０．１０ＭＤａの追加の架橋されていないＨＡ ＬＭＷを更に含む、試料２－１に対応する、
試料７－６：４．００ＭＤａのＨＡを用いて調製された架橋されたＨＡ ＨＭＷ及び４．００ＭＤａの架橋されていないＨＡ ＨＭＷを含む、試料２－１として既に提示されたゲル。
試料７－５：滅菌前に、４．００ＭＤａのＨＡ ＨＭＷ単独を用いて調製された、架橋されたＨＡ、及び０．１０ＭＤａのＨＡを用いて調製された、架橋されていないＨＡ ＬＭＷ、及び４．００ＭＤａのＨＡを用いて調製された、架橋されていないＨＡ ＨＭＷ、を含むゲル。該ゲルは、該ゲルの総質量に対して１０ｍｇ／ｇの固定濃度（１％）の０．１０ＭＤａの追加の架橋されていないＨＡ ＬＭＷを更に含む、試料２－１に対応する、
試料７－６：４．００ＭＤａのＨＡを用いて調製された架橋されたＨＡ ＨＭＷ及び４．００ＭＤａの架橋されていないＨＡ ＨＭＷを含む、試料２－１として既に提示されたゲル。
【0300】
全ての試料７－１～試料７－６が、＞１５分のＦ０でオートクレーブ処理されることによって滅菌される（湿式加熱）。
【0301】
加えて、Ａｌｌｅｒｇａｎによって市販されている製品であるＪｕｖｅｄｅｒｍ Ｖｏｌｉｆｔが、試料７－７として試験される。この製品は、Ｖｙｃｒｏｓｓの架橋技術を使用して製造され、該技術は、大きい割合のＬＭＷ ＨＡを含む様々な質量平均モル質量のヒアルロン酸を用いて調製された、架橋されたヒアルロン酸に関して知られている。該製品は、リドカインＨＣｌ、１７．５ｍｇ／ｇの全ＨＡ濃度を含み、湿式加熱によって滅菌される。
【0302】
【表10】
【0303】
試料７－１（ＨＡの１００％が、架橋された反応物に関与した）は、ＭＯＤが１７％のｓＨＡを示す一方、試料７－２及び試料７－３（滅菌された架橋されていないＨＡ単独）は、論理的に如何なるＭＯＤも示していない。該架橋された試料７－１は、該架橋剤で高度に修飾されているｓＨＡ断片（主にＬＭＷ）を放出する。４．００ＭＤａの架橋されていないＨＡ原材料を用いて製造された試料７－２は、０．３０ＭＤａよりも高いｓＨＡがその最大割合で存在する一方、０．１０ＭＤａの架橋されていないＨＡ原材料を使用して製造された試料７－３は、０．３０ＭＤａよりも低いｓＨＡがその全割合で存在する。
【0304】
本発明に従う補充された組成物は、該架橋されていないＬＭＷ（０．１０ＭＤａ）ＨＡが、該ｓＨＡにおけるＨＡ二糖単位のモル量を増加し、従ってＭＯＤ値を低減することに起因して、補充なしで調製された組成物よりも低いＭＯＤを有するｓＨＡを有する（試料７－４対７－１、試料７－５対試料７－６）。本発明に従うゲル（試料７－３及び試料７－４）は、該試料７－５、試料７－６、及び試料７－７と比較して、０．３ＭＤａよりも低いＬＭＷ ｓＨＡがより高い割合で存在することに注目すべきである。特に、架橋の為に、大きい割合の架橋されていないＬＭＷ ＨＡを用いて製造された該市販試料７－７は、このような多量のＬＭＷ ｓＨＡを示していない。
【0305】
本発明者等は、架橋されていないＨＡ ＬＭＷを補充された、架橋されたＨＡ ＨＭＷを含む組成物が、
該組成物におけるＨＡの総質量に対する、架橋されていないＨＡ ＬＭＷのパーセンテージと、
該架橋された部分単独について測定されたＨＡ総質量に対する、総ｓＨＡのパーセンテージと
の合計に等しい総ｓＨＡパーセンテージを有することを、理論的に予測することができる。
該組成物におけるＨＡの総質量に対する、架橋されていないＨＡ ＬＭＷのパーセンテージと、
該架橋された部分単独について測定されたＨＡ総質量に対する、総ｓＨＡのパーセンテージと
の合計に等しい総ｓＨＡパーセンテージを有することを、理論的に予測することができる。
【0306】
試料７－１（ＨＡの１００％が、架橋された反応物に関与した）は、該組成物におけるＨＡの総質量に対して２０．６％の総ｓＨＡを示し、従って本発明者等は、試料７－３（試料７－１と同じベースの架橋されたＨＡであるが、架橋されていないＨＡ ＬＭＷを更に含む）が、該組成物におけるＨＡの総質量に対して約３０＋２０．６＝５０．６％のｓＨＡを有することを、理論的に予測することができる。
【0307】
しかしながら、試料７－３について測定された総ｓＨＡパーセンテージは、それよりも約１０ポイント低い（４０．５％）。このことは、本発明に従う補充が、製造方法中にＨＡ鎖を保護してＬＭＷ ｓＨＡの放出を低減すること、換言すれば、該組成物の分解耐性を増加すること、を示唆している。
【0308】
結論として、ＳＥＣ及び１Ｈ ＮＭＲ技術は、ゲルのｓＨＡを特徴付け、本発明に従うゲルを標準のゲルと区別する一助にする為に、上手く使用されることができる。
【0309】
［実施例８］
「ＨＡ ＨＭＷ」を上回る「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」の質量比の影響
研究された試料は、以下に提示されている。
「ＨＡ ＨＭＷ」を上回る「架橋されていないＨＡ ＬＭＷ」の質量比の影響
研究された試料は、以下に提示されている。
【0310】
本発明に従う試料８－１は、シリンジにおいてオートクレーブ処理によって滅菌され（＞１５分のＦ０）、２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸全濃度を有し、滅菌前に１：１の割合の
架橋されていないＨＡ ＨＭＷ（４．００ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）及びＢＤＤＥ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９５％）を用いて調製された、リン酸緩衝液において２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸全濃度及び２％の架橋率を有する、架橋されたヒアルロン酸ゲルと、
２０ｍｇ／ｇの架橋されていないＨＡ ＬＭＷ（０．１０ＭＤａ、Ａｌｔｅｒｇｏｎ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の架橋されていないヒアルロン酸溶液と
の混合から生じる、架橋されたヒアルロン酸のゲルである。
架橋されていないＨＡ ＨＭＷ（４．００ＭＤａ、ＨＴＬ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）及びＢＤＤＥ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９５％）を用いて調製された、リン酸緩衝液において２０ｍｇ／ｇのヒアルロン酸全濃度及び２％の架橋率を有する、架橋されたヒアルロン酸ゲルと、
２０ｍｇ／ｇの架橋されていないＨＡ ＬＭＷ（０．１０ＭＤａ、Ａｌｔｅｒｇｏｎ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の架橋されていないヒアルロン酸溶液と
の混合から生じる、架橋されたヒアルロン酸のゲルである。
【0311】
試料８－２は、試料８－１として調製された比較用ゲルであるが、２０ｍｇ／ｇの架橋されていないＨＡ ＬＭＷ（０．１０ＭＤａ、Ａｌｔｅｒｇｏｎ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の架橋されていないヒアルロン酸溶液の代わりに、リン酸緩衝液における２ｍｇ／ｇの架橋されていないＨＡ ＬＭＷ（０１０ＭＤａ、Ａｌｔｅｒｇｏｎ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の架橋されていないヒアルロン酸溶液を用いる。
【0312】
試料８－３は、架橋されたＨＭＷ ＨＡの濃度が該ゲルの総質量に対して１０ｍｇ／ｇである参照ゲルである。試料８－３は、試料８－１として調製されるが、２０ｍｇ／ｇの架橋されていないＨＡ ＬＭＷ（０．１０ＭＤａ、Ａｌｔｅｒｇｏｎ、欧州薬局方の医薬品／医療グレード）の架橋されていないヒアルロン酸溶液の代わりに、リン酸緩衝液単独を使用する。
【0313】
【表11】
【0314】
試料８－１は、良好なＧ’の改善パーセンテージを有しているが、試料８－２は、それよりも低い。従って、有意なＧ’の改善パーセンテージを有する為には、十分な割合のＬＭＷ ＨＡが必要とされると推測されることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】