特表 2023-524669 改変免疫グロブリン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-13

(54)【発明の名称】改変免疫グロブリン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230606BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230606BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230606BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20230606BHJP

   C07K 14/545 20060101ALI20230606BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20230606BHJP

   C07K 14/56 20060101ALI20230606BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230606BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230606BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230606BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230606BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230606BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230606BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230606BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230606BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230606BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230606BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20230606BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20230606BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230606BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20230606BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20230606BHJP

   A61P 37/02 20060101ALN20230606BHJP

   A61P 19/02 20060101ALN20230606BHJP

   A61P 1/04 20060101ALN20230606BHJP

   A61P 17/06 20060101ALN20230606BHJP

   A61P 11/06 20060101ALN20230606BHJP

   A61P 25/00 20060101ALN20230606BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C07K16/46

C07K14/54

C07K14/545

C07K14/55

C07K14/56

C12N15/63 Z

C12N15/13

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12P21/02 Z

C12P21/02 K

C12P21/02 F

A61P43/00 121

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K38/19

A61K38/20

A61K47/68

A61K47/65

A61K45/06

A61P37/02

A61P19/02

A61P1/04

A61P17/06

A61P11/06

A61P25/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022565576

(86)(22)【出願日】2021-04-25

(85)【翻訳文提出日】2022-10-28

(86)【国際出願番号】 CN2021089649

(87)【国際公開番号】W WO2021218862

(87)【国際公開日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/087036

(32)【優先日】2020-04-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/073085

(32)【優先日】2021-01-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/085181

(32)【優先日】2021-04-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521213200

【氏名又は名称】バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094112

【弁理士】

【氏名又は名称】岡部 讓

(74)【代理人】

【識別番号】100136799

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 亜希

(74)【代理人】

【識別番号】100128668

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 正巳

(74)【代理人】

【識別番号】100189474

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 修

(72)【発明者】

【氏名】グオ ヤナン

(72)【発明者】

【氏名】リュウ バイホン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ユイ

(72)【発明者】

【氏名】シェン ユエレイ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG03

4B064AG04

4B064AG05

4B064AG09

4B064AG20

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

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4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076CC01

4C076CC07

4C076CC09

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC18

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA24

4C084BA44

4C084DA01

4C084DA12

4C084DA13

4C084DA14

4C084DA15

4C084DA16

4C084DA17

4C084DA18

4C084DA22

4C084NA05

4C084ZA02

4C084ZA59

4C084ZA61

4C084ZA68

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB31

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA03

4H045DA04

4H045DA16

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、第３のポリペプチドは第１のＣＨ３ドメインに融合している、ポリペプチド複合体を提供する。ポリペプチドを含む医薬組成物及びポリペプチド複合体を作製する方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、
第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチド
を含むポリペプチド複合体であって、
第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域において前記第１のＣＨ３ドメインに融合しているポリペプチド複合体。

【請求項2】

前記第３のポリペプチドは、前記第１のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、及び３８３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項3】

前記第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３５１位から３６２位までの領域において前記第１のＣＨ３ドメインに融合している、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項4】

前記第３のポリペプチドは、前記第１のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項３に記載のポリペプチド複合体。

【請求項5】

前記第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３５８位から３６２位までの領域において前記第１のＣＨ３ドメインに融合している、請求項１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項6】

前記第３のポリペプチドは、前記第１のＣＨ３ドメインの第１及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１のアミノ酸残基及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項５に記載のポリペプチド複合体。

【請求項7】

前記第１のＣＨ３ドメイン中の前記第１及び前記第２のアミノ酸残基間の野生型ＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸残基は、欠失している、請求項２、４又は６に記載のポリペプチド複合体。

【請求項8】

前記第１のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項9】

前記第２のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項10】

前記第１のポリペプチドは、重鎖可変ドメイン及び／又は重鎖ＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項11】

前記第２のポリペプチドは、重鎖可変ドメイン及び／又は重鎖ＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項12】

２つの軽鎖ポリペプチドを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項13】

ＩｇＧ様抗体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項14】

前記第３のポリペプチドは、リンカー配列を介して前記第１のポリペプチドに結合している、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項15】

前記リンカー配列は、５～２０個のアミノ酸残基を含む、請求項１４に記載のポリペプチド複合体。

【請求項16】

前記リンカー配列は、少なくとも４つのグリシン残基を含む、請求項１４又は１５に記載のポリペプチド複合体。

【請求項17】

前記リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項18】

前記第３のポリペプチドは、６つ超のアミノ酸残基を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項19】

前記第３のポリペプチドは、約６～５００個のアミノ酸残基を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項20】

前記第３のポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項21】

前記可溶性タンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、又はＩＬ－３６）である、請求項２０に記載のポリペプチド複合体。

【請求項22】

前記第３のポリペプチドは、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ－７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１３、ＩＬ１５、又はＩＬ２１である、請求項２１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項23】

前記第３のポリペプチドは、単鎖抗原結合ポリペプチド（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又は単一ドメイン抗体（ナノボディ））を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項24】

前記単鎖抗原結合ポリペプチドは、細胞抗原（例えば、エフェクター細胞抗原）に特異的に結合する、請求項２３に記載のポリペプチド複合体。

【請求項25】

前記第３のポリペプチドは、膜貫通タンパク質（例えば、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦｂＲ２））の可溶性部分（例えば、細胞外領域）又は分泌タンパク質を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項26】

前記第３のポリペプチドは、リガンド（例えば、ＡＴＯＲ１０１５－ＣＤ８６）である、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項27】

前記第３のポリペプチドは、ナノボディ（例えば、ＫＮ０３５）又はＶＨＨである、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項28】

前記ポリペプチド複合体中の前記第３のポリペプチドは、単離された第３のポリペプチドと比較してほぼ同じ又は高いレベルの生物学的活性を有する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項29】

親ポリペプチド複合体と比較してほぼ同じ又は高いレベルの標的への結合親和性を有する、請求項１～２８のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項30】

２つの抗原に特異的に結合し、その同じ２つの抗原に特異的に結合する二重特異性抗体の発現レベルと比較してほぼ同じ又は高い発現レベルを有する、請求項１～２９のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項31】

精製形態で凝集物を形成しない、請求項１～３０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項32】

単離形態の前記ポリペプチド複合体は、Ｆｃ受容体に結合し得る、請求項１～３１のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項33】

前記第３のポリペプチドは、ｓｃＦｖを含み、前記ｓｃＦｖは、単離されたｓｃＦｖの結合親和性と比較してほぼ同じ又は高いレベルの結合親和性を有する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項34】

第４のポリペプチド
をさらに含み、前記第４のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記第２のＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域において前記第２のＣＨ３ドメインに融合している、請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項35】

前記第４のポリペプチドは、前記第２のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記第２のＣＨ３ドメインの３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、及び３８３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項３４に記載のポリペプチド複合体。

【請求項36】

前記第４のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記第２のＣＨ３ドメインの３５１位から３６２位までの領域において前記第２のＣＨ３ドメインに融合している、請求項３４に記載のポリペプチド複合体。

【請求項37】

前記第４のポリペプチドは、前記第２のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記第２のＣＨ３ドメインの３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項３６に記載のポリペプチド複合体。

【請求項38】

前記第４のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記第２のＣＨ３ドメインの３５８位から３６２位までの領域において前記第２のＣＨ３ドメインに融合している、請求項３４に記載のポリペプチド複合体。

【請求項39】

前記第４のポリペプチドは、前記第２のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記第２のＣＨ３ドメインの３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項３８に記載のポリペプチド複合体。

【請求項40】

第５のポリペプチド
をさらに含み、前記第５のポリペプチドは、前記第１のポリペプチドのＣ末端に融合している、請求項１～３９のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項41】

前記第５のポリペプチドは、リンカー配列を介して前記第１のポリペプチドのＣ末端に融合している、請求項４０に記載のポリペプチド複合体。

【請求項42】

前記リンカー配列は、１０～４０個のアミノ酸残基を含む、請求項４１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項43】

前記リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項４２に記載のポリペプチド複合体。

【請求項44】

前記第５のポリペプチドは、１０個超のアミノ酸残基を有する、請求項４０～４３のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項45】

前記第５のポリペプチドは、約１０～５００個のアミノ酸残基を有する、請求項４０～４４のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項46】

前記第５のポリペプチドは、サイトカインである、請求項４０～４５のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項47】

前記サイトカインは、ＩＦＮａ４である、請求項４６に記載のポリペプチド複合体。

【請求項48】

第６のポリペプチド
をさらに含み、前記第６のポリペプチドは、前記第２のポリペプチドのＣ末端に融合している、請求項１～４７のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項49】

前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）技術を介してヘテロダイマーを形成する、請求項１～４８のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項50】

前記第１のポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと相互作用し、抗原結合部位を形成し、前記第２のポリペプチドは、前記軽鎖ポリペプチドと相互作用しない、請求項１～４９のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項51】

前記第１のポリペプチドは、第１の軽鎖ポリペプチドと相互作用し、第１の抗原結合部位を形成し、前記第２のポリペプチドは、第２の軽鎖ポリペプチドと相互作用し、第２の抗原結合部位を形成し、前記第１の抗原結合部位及び前記第２の抗原結合部位は、同じ抗原又は異なる抗原に特異的に結合する、請求項１～５０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項52】

前記ポリペプチド複合体中の前記第３のポリペプチドが前記第３のポリペプチドについての結合相手と相互作用しない場合、Ｆｃ受容体に結合し得る、請求項１～５１のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。

【請求項53】

バリアントＦｃを含むタンパク質であって、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３４４位から３８２位までの領域において前記バリアントＦｃに融合しているタンパク質。

【請求項54】

前記ポリペプチドは、前記バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、及び３８３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項５３に記載のタンパク質。

【請求項55】

前記ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３５１位から３６２位までの領域において前記バリアントＦｃに融合している、請求項５４に記載のタンパク質。

【請求項56】

前記ポリペプチドは、前記バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項５５に記載のタンパク質。

【請求項57】

前記ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３５８位から３６２位までの領域において前記バリアントＦｃに融合している、請求項５３に記載のタンパク質。

【請求項58】

前記ポリペプチドは、前記バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項５７に記載のタンパク質。

【請求項59】

バリアントＦｃを含むタンパク質であって、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３８３位から３９１位までの領域において前記バリアントＦｃに融合しているタンパク質。

【請求項60】

前記ポリペプチドは、前記バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、及び３９２位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項５９に記載のタンパク質。

【請求項61】

バリアントＦｃを含むタンパク質であって、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３８３位から３８５位までの領域において前記バリアントＦｃに融合しているタンパク質。

【請求項62】

前記ポリペプチドは、前記バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの３８２、３８３、３８４、３８５、及び３８６位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項６１に記載のタンパク質。

【請求項63】

バリアントＦｃを含むタンパク質であって、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの４１３位から４２２位までの領域において前記バリアントＦｃに融合しているタンパク質。

【請求項64】

前記ポリペプチドは、前記バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記バリアントＦｃの４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、及び４２３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項６３に記載のタンパク質。

【請求項65】

前記Ｆｃは、ＩｇＧ Ｆｃである、請求項５３～６４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項66】

前記Ｆｃは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４ Ｆｃである、請求項５３～６４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項67】

ＩｇＧ様抗体又は免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ）である、請求項５３～６４のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項68】

多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である、請求項５３～６７のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項69】

第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、
第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチド
を含むポリペプチド複合体であって、
第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３８３位から３９１位までの領域において前記第１のＣＨ３ドメインに融合している、ポリペプチド複合体。

【請求項70】

前記第３のポリペプチドは、前記第１のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、及び３９２位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項６９に記載のポリペプチド複合体。

【請求項71】

第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、
第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチド
を含むポリペプチド複合体であって、
第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３８３位から３８５位までの領域において前記第１のＣＨ３ドメインに融合している、ポリペプチド複合体。

【請求項72】

前記第３のポリペプチドは、前記第１のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの３８２、３８３、３８４、３８５、及び３８６位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項７１に記載のポリペプチド複合体。

【請求項73】

第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、
第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチド
を含むポリペプチド複合体であって、
第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの４１３位から４２２位までの領域において前記第１のＣＨ３ドメインに融合している、ポリペプチド複合体。

【請求項74】

前記第３のポリペプチドは、前記第１のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合しており、前記第１及び前記第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って前記第１のＣＨ３ドメインの４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、及び４２３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項７３に記載のポリペプチド複合体。

【請求項75】

第１の非ネイティブポリペプチド配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；
第２の重鎖ポリペプチド；
第１の軽鎖ポリペプチド；及び
第２の軽鎖ポリペプチド
を含む改変抗体であって、前記第１の重鎖ポリペプチド及び前記第１の軽鎖ポリペプチドは、互いに会合し、第１の抗原結合領域を形成し、
前記第２の重鎖ポリペプチド及び前記第２の軽鎖ポリペプチドは、互いに会合し、第２の抗原結合領域を形成し、
前記第１の非ネイティブポリペプチド配列は、ＥＵ番号付けに従って前記第１の重鎖ポリペプチドの３４４位から３８２位までの領域において前記第１の重鎖ポリペプチドに融合している改変抗体。

【請求項76】

前記第２の重鎖ポリペプチドは、第２の非ネイティブポリペプチド配列を含み、前記第２の非ネイティブポリペプチド配列は、ＥＵ番号付けに従って前記第２の重鎖ポリペプチドの３４４位から３８２位までの領域において前記第２の重鎖ポリペプチドに融合している、請求項７５に記載の改変抗体。

【請求項77】

前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域は、同じ抗原に特異的に結合する、請求項７５又は７６に記載の改変抗体。

【請求項78】

前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域は、異なる抗原に特異的に結合する、請求項７５又は７６に記載の改変抗体。

【請求項79】

前記第１の抗原結合領域及び／又は前記第２の抗原結合領域は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する、請求項７５又は７６に記載の改変抗体。

【請求項80】

前記第１の非ネイティブポリペプチド配列及び／又は前記第２の非ネイティブポリペプチド配列（例えば、ｓｃＦＶ又はナノボディ）は、細胞抗原（例えば、エフェクター細胞抗原）に特異的に結合する抗原結合部位を含む、請求項７５又は７６に記載の改変抗体。

【請求項81】

機能ポリペプチドは、前記第１の重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合している、請求項７５～８０のいずれか一項に記載の改変抗体。

【請求項82】

機能ポリペプチドは、前記第２の重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合している、請求項７５～８１のいずれか一項に記載の改変抗体。

【請求項83】

ＣＨ２、及びＣＨ３の第１の部分を含む第１の領域；
非ネイティブポリペプチド配列を含む第２の領域；
ＣＨ３の第２の部分を含む第３の領域
を含む融合ポリペプチドであって、
ＣＨ３の前記第１の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３４１～３４３を含み、ＣＨ３の前記第２の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８３～４４７を含む、融合ポリペプチド。

【請求項84】

ＣＨ３の前記第１の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３４１～３５０を含み、ＣＨ３の前記第２の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３６３～４４７を含む、請求項８３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項85】

ＣＨ３の前記第１の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３４１～３５７を含み、ＣＨ３の前記第２の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３６３～４４７を含む、請求項８３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項86】

前記第１の領域は、ＶＨ及び／又はＣＨ１をさらに含む、請求項８３～８５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項87】

２つの軽鎖ポリペプチド；及び
請求項８３～８６のいずれか一項に記載の融合重鎖ポリペプチドの２つ
を含む改変抗体。

【請求項88】

第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部位、
第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含む多重特異性抗体であって、
前記第２の抗原結合部位が前記第２の抗原に特異的に結合する場合、前記多重特異性抗体のエフェクター機能が阻害又は低減される、多重特異性抗体。

【請求項89】

重鎖ＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記重鎖ＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域において前記重鎖ＣＨ３ドメインに融合している、請求項８８に記載の多重特異性抗体。

【請求項90】

重鎖ＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記重鎖ＣＨ３ドメインの３５１位から３６２位までの領域において前記重鎖ＣＨ３ドメインに融合している、請求項８８に記載の多重特異性抗体。

【請求項91】

重鎖ＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位から３６２位までの領域において前記重鎖ＣＨ３ドメインに融合している、請求項８８に記載の多重特異性抗体。

【請求項92】

前記第１の抗原は、腫瘍細胞からのものであり、前記第２の抗原は、エフェクター細胞からのものである、請求項８８～９１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項93】

前記エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ミクロファージ、樹状細胞、又は好中球である、請求項９２に記載の多重特異性抗体。

【請求項94】

前記第１の抗原結合部位が第１の抗原に特異的に結合し、前記第２の抗原結合部位が前記第２の抗原に結合しない場合、前記エフェクター機能を誘導する、請求項８８～９３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項95】

前記エフェクター機能は、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰである、請求項８８～９４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項96】

前記第２の抗原結合部位は、単鎖抗原結合ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ又はナノボディ）を含むポリペプチド内に局在する、請求項８８～９５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項97】

前記第２の抗原結合部位は、前記多重特異性抗体のＣＨ３ドメインにおいて融合しているｓｃＦｖ又はナノボディ内に局在する、請求項８８～９６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項98】

前記第１の抗原結合部位は、ＣＨ１ドメイン又はＣＨ２ドメインのＮ末端に結合しているｓｃＦｖ又はナノボディである、請求項８８～９７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項99】

前記第１の抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬにより形成される、請求項８８～９８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項100】

二重特異性抗体である、実施形態８８～９９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項101】

抗原に特異的に結合する抗原結合部位、
結合相手と特異的に相互作用する結合ポリペプチド
を含む改変抗体であって、
前記抗原結合部位は、前記改変抗体に融合しているポリペプチド内に局在し、前記抗原結合部位が前記受容体に特異的に結合する場合、前記改変抗体のエフェクター機能が阻害又は低減される改変抗体。

【請求項102】

（１）前記結合ポリペプチドは、リガンドであり、前記結合相手は、前記リガンドについての受容体であるか、又は
（２）前記結合ポリペプチドは、受容体の可溶性部分であり、前記結合相手は、前記受容体と特異的に相互作用するリガンドである、
請求項１０１に記載の改変抗体。

【請求項103】

重鎖ＣＨ３ドメインを含み、前記ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記重鎖ＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域において前記重鎖ＣＨ３ドメインに融合している、請求項１０１又は１０２に記載の改変抗体。

【請求項104】

重鎖ＣＨ３ドメインを含み、前記ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記重鎖ＣＨ３ドメインの３５１位から３６２位までの領域において前記重鎖ＣＨ３ドメインに融合している、請求項１０１又は１０２に記載の改変抗体。

【請求項105】

重鎖ＣＨ３ドメインを含み、前記ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って前記重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位から３６２位までの領域において前記重鎖ＣＨ３ドメインに融合している、請求項１０１又は１０２に記載の改変抗体。

【請求項106】

請求項１～１０５のいずれか一項に記載のポリペプチド、ポリペプチド複合体、又は抗体を含む医薬組成物。

【請求項107】

請求項１～１０５のいずれか一項に記載のポリペプチド、ポリペプチド複合体、又は抗体をコードする核酸。

【請求項108】

請求項１０７に記載の核酸を含むベクター。

【請求項109】

請求項１０７に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項110】

ポリペプチド、ポリペプチド複合体、又は抗体を産生する方法であって、前記ポリペプチド、前記ポリペプチド複合体、又は前記抗体を産生するために好適な条件下で請求項１０９に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０２０年４月２６日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０８７０３６号、２０２１年１月２１日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７３０８５号、及び２０２１年４月２日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８５１８１号の利益を主張する。上記の全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、改変免疫グロブリンに関する。

【背景技術】

【0003】

抗体は、特異的抗原に結合する免疫学的タンパク質である。一般に、抗体は標的に特異的であり、免疫エフェクター機序を媒介する能力を有し、長い血清半減期を有する。このような特性により抗体は強力な治療薬になる。モノクローナル抗体は、種々の病態、例として、癌、感染性疾患、自己免疫性疾患、及び炎症性障害の処置のために治療的に使用される。

【0004】

多くの新たな抗体フォーマットが種々の処置目的のために提案されている。例えば、二重特異性抗体は、２つの異なる標的又は標的上の２つの異なるエピトープに結合し得、個々の抗体の効果を上回る相加的又は相乗的効果を作出する。イムノサイトカインは、抗体－サイトカイン融合タンパク質であり、腫瘍病変上に優先的に局在化し、疾患部位において抗癌免疫を活性化させる潜在性を有する。これらの概念的な利点にかかわらず、それらの抗体フォーマットは製造困難であり、それらを薬物として開発することが難しい。これらの抗体フォーマットのための多くの既存の製造アプローチは低い効率を抱え、複雑な精製プロセスにより制限される。多くの他のタンパク質操作及び分子生物学技術が提案されてきた。しかしながら、これらの公知の操作抗体フォーマットが採用されると、それらの分子は通常、それらの好ましい生化学的及び／又は生物物理学的特性、血清半減期、及び／又は安定性を損失し、不十分な有効性、不安定性及び高い免疫原性をもたらす。特に、多くの二重特異性抗体フォーマットが低い発現レベルを伴うことが広く公知である。安定的で、医薬的使用に好適であり、高い発現レベルにおいて安定的に発現させることができる改善された抗体フォーマットを提供することが必要とされ続けている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示は、改変免疫グロブリンを提供する。本開示は、部分的には、機能タンパク質全体を免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン中の特定の領域に融合させることができ、その改変免疫グロブリンは安定的であり、高いレベルにおいて安定的に発現させることができるという予期されない発見に基づく。

【0006】

一態様において、本明細書において、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むポリペプチド複合体が提供される。一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域において第１のＣＨ３ドメインに融合している。

【0007】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、第１のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。

【0008】

一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、及び３８３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0009】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３５１位から３６２位までの領域において第１のＣＨ３ドメインに融合している。

【0010】

一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0011】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３５８位から３６２位までの領域において第１のＣＨ３ドメインに融合している。

【0012】

一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0013】

一部の実施形態において、第１のＣＨ３ドメイン中の第１及び第２のアミノ酸残基間の野生型ＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸残基は、欠失している。

【0014】

一部の実施形態において、第１のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインをさらに含む。

【0015】

一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインをさらに含む。

【0016】

一部の実施形態において、第１のポリペプチドは、重鎖可変ドメイン及び／又は重鎖ＣＨ１ドメインをさらに含む。

【0017】

一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、重鎖可変ドメイン及び／又は重鎖ＣＨ１ドメインをさらに含む。

【0018】

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、２つの軽鎖ポリペプチドを含む。

【0019】

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、ＩｇＧ様抗体である。

【0020】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、リンカー配列を介して第１のポリペプチドに結合している。

【0021】

一部の実施形態において、リンカー配列は、５～２０個のアミノ酸残基を含む。

【0022】

一部の実施形態において、リンカー配列は、少なくとも４つのグリシン残基を含む。

【0023】

一部の実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）と少なくとも８０％同一である配列を含む。

【0024】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、約又は少なくとも６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、又は５０個のアミノ酸残基を有する。

【0025】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、約６～５００個のアミノ酸残基（例えば、１０～５００、又は２０～３００個のアミノ酸残基）を有する。

【0026】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである。

【0027】

一部の実施形態において、可溶性タンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、又はＩＬ－３６）である。

【0028】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ－７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１３、ＩＬ１５、又はＩＬ－２１である。

【0029】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、単鎖抗原結合ポリペプチド（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は単一ドメイン抗体（ナノボディ））を含む。

【0030】

一部の実施形態において、単鎖抗原結合ポリペプチドは、細胞抗原（例えば、エフェクター細胞抗原）に特異的に結合する。

【0031】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、膜貫通タンパク質（例えば、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦｂＲ２））の可溶性部分（例えば、細胞外領域）又は分泌タンパク質を含む。

【0032】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、リガンド（例えば、ＡＴＯＲ１０１５－ＣＤ８６）である。一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、ナノボディ（例えば、ＫＮ０３５）又はＶＨＨである。

【0033】

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体中の第３のポリペプチドは、単離された第３のポリペプチドと比較してほぼ同じ又は高いレベルの生物学的活性を有する。

【0034】

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、親ポリペプチド複合体と比較してほぼ同じ又は高いレベルの標的への結合親和性を有する。

【0035】

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、２つの抗原に特異的に結合し、ポリペプチド複合体は、その同じ２つの抗原に特異的に結合する二重特異性抗体の発現レベルと比較してほぼ同じ又は高い発現レベルを有する。

【0036】

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、（例えば、精製形態で）凝集物を形成しない。

【0037】

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、ポリペプチド複合体中の第３のポリペプチドが標的タンパク質と相互作用しない場合、Ｆｃ受容体に結合し得る。一部の実施形態において、単離形態のポリペプチド複合体は、Ｆｃ受容体に結合し得る。

【0038】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態において、ｓｃＦｖは、単離されたｓｃＦｖの結合親和性と比較してほぼ同じ又は高いレベルの結合親和性を有する。

【0039】

一部の実施形態において、本明細書において、第４のポリペプチドをさらに含むポリペプチド複合体が提供される。一部の実施形態において、第４のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って第２のＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域において第２のＣＨ３ドメインに融合している。

【0040】

一部の実施形態において、第４のポリペプチドは、第２のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。

【0041】

一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って第２のＣＨ３ドメインの３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、及び３８３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0042】

一部の実施形態において、第４のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って第２のＣＨ３ドメインの３５１位から３６２位までの領域において第２のＣＨ３ドメインに融合している。

【0043】

一部の実施形態において、第４のポリペプチドは、第２のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。

【0044】

一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って第２のＣＨ３ドメインの３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0045】

一部の実施形態において、第４のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って第２のＣＨ３ドメインの３５８位から３６２位までの領域において第２のＣＨ３ドメインに融合している。

【0046】

一部の実施形態において、第４のポリペプチドは、第２のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。

【0047】

一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って第２のＣＨ３ドメインの３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0048】

一部の実施形態において、本明細書において、第５のポリペプチドをさらに含むポリペプチド複合体が提供される。一部の実施形態において、第５のポリペプチドは、第１のポリペプチドのＣ末端に融合している。

【0049】

一部の実施形態において、第５のポリペプチドは、リンカー配列を介して第１のポリペプチドのＣ末端に融合している。

【0050】

一部の実施形態において、リンカー配列は、１０～４０個のアミノ酸残基を含む。

【0051】

一部の実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）と少なくとも８０％同一である配列を含む。

【0052】

一部の実施形態において、第５のポリペプチドは、１０個超のアミノ酸残基を有する。

【0053】

一部の実施形態において、第５のポリペプチドは、約１０～５００個のアミノ酸残基を有する。

【0054】

一部の実施形態において、第５のポリペプチドは、サイトカインである。

【0055】

一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＦＮａ４である。

【0056】

一部の実施形態において、本明細書において、第６のポリペプチドをさらに含むポリペプチド複合体が提供される。一部の実施形態において、第６のポリペプチドは、第２のポリペプチドのＣ末端に融合している。

【0057】

一部の実施形態において、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ）（ＫＩＨ）技術を介してヘテロダイマーを形成する。

【0058】

一部の実施形態において、第１のポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと相互作用し、抗原結合部位を形成する。一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと相互作用しない。

【0059】

一部の実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の軽鎖ポリペプチドと相互作用し、第１の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の軽鎖ポリペプチドと相互作用し、第２の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態において、第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位は、同じ又は異なる抗原に特異的に結合する。

【0060】

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、ポリペプチド複合体中の第３のポリペプチドが第３のポリペプチドについての結合相手と相互作用しない場合、Ｆｃ受容体に結合し得る。

【0061】

一態様において、本明細書において、バリアントＦｃを含むタンパク質が提供される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３４４位から３８２位までの領域においてバリアントＦｃに融合している。

【0062】

一部の実施形態において、ポリペプチドは、バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、及び３８３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0063】

一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３５１位から３６２位までの領域においてバリアントＦｃに融合している。

【0064】

一部の実施形態において、ポリペプチドは、バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0065】

一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３５８位から３６２位までの領域においてバリアントＦｃに融合している。

【0066】

一部の実施形態において、ポリペプチドは、バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0067】

一態様において、本明細書において、バリアントＦｃを含むタンパク質が提供される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３８３位から３９１位までの領域においてバリアントＦｃに融合している。

【0068】

一部の実施形態において、ポリペプチドは、バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、及び３９２位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0069】

一態様において、本明細書において、バリアントＦｃを含むタンパク質が提供される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３８３位から３８５位までの領域においてバリアントＦｃに融合している。

【0070】

一部の実施形態において、ポリペプチドは、バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの３８２、３８３、３８４、３８５、及び３８６位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0071】

一態様において、バリアントＦｃを含むタンパク質が提供される。一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの４１３位から４２２位までの領域においてバリアントＦｃに融合している。

【0072】

一部の実施形態において、ポリペプチドは、バリアントＦｃの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従ってバリアントＦｃの４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、及び４２３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0073】

一部の実施形態において、Ｆｃは、ＩｇＧ Ｆｃである。一部の実施形態において、Ｆｃは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４ Ｆｃである。一部の実施形態において、タンパク質は、ＩｇＧ様抗体又は免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ）である。一部の実施形態において、タンパク質は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。

【0074】

一態様において、本明細書において、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むポリペプチド複合体が提供される。一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３８３位から３９１位までの領域において第１のＣＨ３ドメインに融合している。

【0075】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、第１のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、及び３９２位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0076】

一態様において、本明細書において、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むポリペプチド複合体が提供される。一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３８３位から３８５位までの領域において第１のＣＨ３ドメインに融合している。

【0077】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、第１のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの３８２、３８３、３８４、３８５、及び３８６位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0078】

一態様において、本明細書において、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含むポリペプチド複合体が提供される。一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの４１３位から４２２位までの領域において第１のＣＨ３ドメインに融合している。

【0079】

一部の実施形態において、第３のポリペプチドは、第１のＣＨ３ドメインの第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基に結合している。一部の実施形態において、第１及び第２のアミノ酸残基は、ＥＵ番号付けに従って第１のＣＨ３ドメインの４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、及び４２３位におけるアミノ酸残基からなる群から選択される。

【0080】

一態様において、本明細書において、第１の非ネイティブポリペプチド配列を含む第１の重鎖ポリペプチド；第２の重鎖ポリペプチド；第１の軽鎖ポリペプチド；及び第２の軽鎖ポリペプチドを含む改変抗体が提供される。一部の実施形態において、第１の重鎖ポリペプチド及び第１の軽鎖ポリペプチドは、互いに会合し、第１の抗原結合領域を形成する。

【0081】

一部の実施形態において、第２の重鎖ポリペプチド及び第２の軽鎖ポリペプチドは、互いに会合し、第２の抗原結合領域を形成する。一部の実施形態において、第１の非ネイティブポリペプチド配列は、ＥＵ番号付けに従って第１の重鎖ポリペプチドの３４４位から３８２位までの領域において第１の重鎖ポリペプチドに融合している。

【0082】

一部の実施形態において、第２の重鎖ポリペプチドは、第２の非ネイティブポリペプチド配列を含む。一部の実施形態において、第２の非ネイティブポリペプチド配列は、ＥＵ番号付けに従って第２の重鎖ポリペプチドの３４４位から３８２位までの領域において第２の重鎖ポリペプチドに融合している。

【0083】

一部の実施形態において、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、同じ抗原に特異的に結合する。

【0084】

一部の実施形態において、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、異なる抗原に特異的に結合する。

【0085】

一部の実施形態において、第１の抗原結合領域及び／又は第２の抗原結合領域は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する。

【0086】

一部の実施形態において、第１の非ネイティブポリペプチド配列及び／又は第２の非ネイティブポリペプチド配列（例えば、ｓｃＦＶ又はナノボディ）は、細胞抗原（例えば、エフェクター細胞抗原）に特異的に結合する抗原結合部位を含む。

【0087】

一部の実施形態において、機能ポリペプチドは、第１の重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合している。

【0088】

一部の実施形態において、機能ポリペプチドは、第２の重鎖ポリペプチドのＣ末端に結合している。

【0089】

一態様において、本明細書において、ＣＨ２、及びＣＨ３の第１の部分を含む第１の領域；非ネイティブポリペプチド配列を含む第２の領域；ＣＨ３の第２の部分を含む第３の領域を含む融合ポリペプチドが提供される。一部の実施形態において、ＣＨ３の第１の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３４１～３４３を含み、ＣＨ３の第２の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８３～４４７を含む。

【0090】

一部の実施形態において、ＣＨ３の第１の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３４１～３５０を含み、ＣＨ３の第２の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３６３～４４７を含む。一部の実施形態において、ＣＨ３の第１の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３４１～３５７を含み、ＣＨ３の第２の部分は、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３６３～４４７を含む。

【0091】

一部の実施形態において、第１の領域は、ＶＨ及び／又はＣＨ１をさらに含む。

【0092】

一態様において、本明細書において、２つの軽鎖ポリペプチド；及び本明細書に記載の融合重鎖ポリペプチドの２つを含む改変抗体が提供される。

【0093】

一態様において、本明細書において、第１の抗原に特異的に結合する第１の抗原結合部位、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む多重特異性抗体が提供される。一部の実施形態において、第２の抗原結合部位は、多重特異性抗体に融合しているポリペプチド内に局在する。一部の実施形態において、第２の抗原結合部位が第２の抗原に特異的に結合する場合、多重特異性抗体のエフェクター機能が阻害又は低減される。

【0094】

一部の実施形態において、多重特異性抗体は、ＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域においてＣＨ３ドメインに融合している。

【0095】

一部の実施形態において、多重特異性抗体は、ＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインの３５１位から３６２位までの領域においてＣＨ３ドメインに融合している。

【0096】

一部の実施形態において、多重特異性抗体は、ＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインの３５８位から３６２位までの領域においてＣＨ３ドメインに融合している。

【0097】

一部の実施形態において、第１の抗原は、腫瘍細胞からのものであり、第２の抗原は、エフェクター細胞からのものである。一部の実施形態において、エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ミクロファージ、樹状細胞、又は好中球である。

【0098】

一部の実施形態において、第１の抗原結合部位が第１の抗原に特異的に結合し、第２の抗原結合部位が第２の抗原に結合しない場合、多重特異性抗体は、エフェクター機能を誘導する。

【0099】

一部の実施形態において、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰである。

【0100】

一部の実施形態において、第２の抗原結合部位は、単鎖抗原結合ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ又はナノボディ）を含むポリペプチド内に局在する。

【0101】

一部の実施形態において、第２の抗原結合部位は、多重特異性抗体のＣＨ３ドメインにおいて融合しているｓｃＦｖ又はナノボディ内に局在する。

【0102】

一部の実施形態において、第１の抗原結合部位は、ＣＨ１ドメイン又はＣＨ２ドメインのＮ末端に結合しているｓｃＦｖ又はナノボディである。

【0103】

一部の実施形態において、第１の抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬにより形成される。

【0104】

一部の実施形態において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

【0105】

一態様において、本明細書において、抗原に特異的に結合する抗原結合部位、及び受容体に特異的に結合する受容体（例えば、サイトカイン受容体）結合部位を含む改変抗体であって、受容体結合部位は、改変抗体に融合しているポリペプチド内に局在し、受容体結合部位が受容体に特異的に結合する場合、改変抗体のエフェクター機能が阻害又は低減される改変抗体が提供される。

【0106】

一態様において、本明細書において、抗原に特異的に結合する抗原結合部位、及びリガンドに特異的に結合するリガンド（例えば、サイトカインリガンド又は受容体リガンド）結合部位を含む改変抗体であって、リガンド結合部位は、改変抗体に融合しているポリペプチド内に局在し、リガンド結合部位がリガンド受容体に特異的に結合する場合、改変抗体のエフェクター機能が阻害される改変抗体が提供される。

【0107】

一態様において、本開示は、抗原に特異的に結合する抗原結合部位、結合相手と特異的に相互作用する結合ポリペプチドを含む改変抗体であって、受容体結合部位は、改変抗体に融合しているポリペプチド内に局在し、受容体結合部位が受容体に特異的に結合する場合、改変抗体のエフェクター機能が阻害される改変抗体を提供する。一部の実施形態において、結合ポリペプチドは、リガンドであり、結合相手は、リガンドについての受容体である。一部の実施形態において、結合ポリペプチドは、受容体の可溶性部分であり、結合相手は、受容体と特異的に相互作用するリガンドである。

【0108】

一部の実施形態において、改変抗体は、ＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域においてＣＨ３ドメインに融合している。

【0109】

一部の実施形態において、改変抗体は、ＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインの３５１位から３６２位までの領域においてＣＨ３ドメインに融合している。

【0110】

一部の実施形態において、改変抗体は、ＣＨ３ドメインを含み、ポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従ってＣＨ３ドメインの３５８位から３６２位までの領域においてＣＨ３ドメインに融合している。

【0111】

一態様において、本明細書において、本明細書に記載のポリペプチド、ポリペプチド複合体、又は抗体を含む医薬組成物が提供される。

【0112】

一態様において、本明細書において、本明細書に記載のポリペプチド、ポリペプチド複合体、又は抗体をコードする核酸が提供される。

【0113】

一態様において、本明細書において、本明細書に記載の核酸を含むベクターが提供される。

【0114】

一態様において、本明細書において、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞が提供される。

【0115】

一態様において、本明細書において、ポリペプチド、ポリペプチド複合体、又は抗体を産生する方法であって、ポリペプチド、ポリペプチド複合体、又は抗体を産生するために好適な条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養することを含む方法が提供される。

【0116】

本明細書において使用されるとき、「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、又は６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、免疫グロブリン軽鎖からの３つのＣＤＲのいずれか又は免疫グロブリン重鎖からの３つのＣＤＲのいずれか）を含有し、エピトープに特異的に結合し得る任意の抗原結合分子を指す。抗体の非限定的な例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、及びヒト化抗体が挙げられる。一部の実施形態において、抗体は、ヒト抗体のＦｃ領域を含有する。抗体という用語には、誘導体、例えば、抗原断片から形成される二重特異性抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、線状抗体、及び多重特異性抗体も含まれる。

【0117】

本明細書において使用されるとき、「ＩｇＧ様」という用語は、ＩｇＧ抗体と大部分が類似する分子を指す。ＩｇＧ様分子の非限定的な例としては、ＩｇＧ抗体に付加された１つ以上の非ネイティブポリペプチドを有するＩｇＧ抗体が挙げられる。一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、ＩｇＧ様分子を含み、又はそれからなる。

【0118】

本明細書において使用されるとき、「抗原結合断片」という用語は、全長抗体の一部を指し、抗体のその一部は、抗原に特異的に結合し得る。一部の実施形態において、抗原結合断片は、少なくとも１つの可変ドメイン（例えば、重鎖の可変ドメイン又は軽鎖の可変ドメイン）を含有する。抗体断片の非限定的な例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片が挙げられる。

【0119】

本明細書において使用されるとき、「ヒト抗体」という用語は、ヒトに存在する内在性核酸（例えば、再構成されるヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座）によりコードされる抗体を指す。一部の実施形態において、ヒト抗体は、ヒトから回収され、又はヒト細胞培養物（例えば、ヒトハイブリドーマ細胞）中で産生される。一部の実施形態において、ヒト抗体は、非ヒト細胞（例えば、マウス又はハムスター細胞系）中で産生される。

【0120】

本明細書において使用されるとき、「キメラ抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗体（例えば、２つの異なる哺乳類種からの抗体、ヒト及びマウス抗体）中に存在する配列を含有する抗体を指す。キメラ抗体の非限定的な例は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の可変ドメイン配列（例えば、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメイン配列の全部又は一部）及びヒト抗体の定常領域を含有する抗体である。キメラ抗体の追加の例は、本明細書に記載され、当該技術分野において公知である。

【0121】

本明細書において使用されるとき、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する最小配列を含有し、ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含有する非ヒト抗体を指す。非限定的な例において、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、レシピエント抗体の超可変（例えば、ＣＤＲ）領域残基が非ヒト抗体（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、又はウサギ抗体からの超可変（例えば、ＣＤＲ）領域残基により置き換えられたヒト抗体（レシピエント抗体）である。一部の実施形態において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン残基により置き換えられている。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含有し得る。これらの改変は、抗体性能をさらにリファインするために行うことができる。

【0122】

本明細書において使用されるとき、「単鎖抗体」という用語は、抗原に特異的に結合し得る少なくとも２つの免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、哺乳類免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の可変ドメイン）を含有する単一ポリペプチドを指す。単鎖抗体の非限定的な例は、本明細書に記載される。

【0123】

本明細書において使用されるとき、「多重特異性抗体」という用語は、２つ以上の異なる抗原又はエピトープに特異的に結合し得る抗体を指す。一部の実施形態において、多重特異性抗体は、１つの標的分子（例えば、ＰＤ－１）を、哺乳類細胞（例えば、ヒトＴ細胞）の表面上の少なくとも１つの第２の標的分子（例えば、ＣＴＬＡ－４）に架橋し得る。一部の実施形態において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

【0124】

抗体を指す場合、本明細書において使用されるとき、「特異的に結合すること」及び「特異的に結合する」という語句は、抗体が、好ましくは他の分子に対してその標的分子（例えば、ＰＤ－１）と相互作用することを意味し、それというのも、その相互作用は、標的分子上の特定の構造（すなわち、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存的であるためであり；換言すると、試薬は、一般に全ての分子ではなく特異的構造を含む分子を認識しており、それに結合している。標的分子に特異的に結合する抗体は、標的特異的抗体と称することができる。例えば、ＰＤ－１分子に特異的に結合する抗体は、ＰＤ－１特異的抗体又は抗ＰＤ－１抗体と称することができる。

【0125】

本明細書において使用されるとき、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書全体にわたり互換的に使用され、本発明の方法による処置が提供される動物、ヒト又は非ヒトを説明する。獣医学的及び非獣医学的用途が、本発明により企図される。ヒト患者は、成人ヒト又は若年ヒト（例えば、１８歳の年齢未満のヒト）であり得る。ヒトに加え、患者としては、限定されるものではないが、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌ、及び霊長類が挙げられる。例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、齧歯類（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ目、イノシシ科（例えば、ブタ、ミニブタ）、ウマ科、イヌ科、ネコ科、ウシ属、及び他の飼育動物、家畜、及び動物園動物が含まれる。

【0126】

本明細書において使用されるとき、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸の任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。

【0127】

本明細書において使用されるとき、「ポリペプチド複合体」という用語は、会合してある機能を発揮する１つ以上のポリペプチドを含む複合体を指す。ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体重鎖及び／若しくは軽鎖であり、又は抗体に由来する。

【0128】

本明細書において使用されるとき、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、及び「核酸配列」という用語は、少なくとも２つのヌクレオチドの任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指すために本明細書において互換的に使用され、それとしては、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びそれらの改変物が挙げられる。

【0129】

本明細書において使用されるとき、「融合」又は「融合している」という用語は、アミノ酸配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）に関して使用される場合、天然に存在しない単一アミノ酸配列への、例えば、化学結合又は組換え手段による２つ以上のアミノ酸配列の組合せを指す。融合アミノ酸配列は、２つのコードポリヌクレオチド配列の遺伝子組換えにより産生することができ、組換えポリヌクレオチドを含有する構築物を宿主細胞中に導入する方法により発現させることができる。

【0130】

本明細書において使用されるとき、「結合している」という用語は、アミノ酸配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）に関して使用される場合、化学結合（例えば、ペプチド結合、ジスルフィド結合、ビス－スルホンリンカー）による２つ以上のアミノ酸配列の組合せを指す。

【0131】

本明細書において使用されるとき、「全長抗体」という用語は、野生型抗体と比較してインタクト構造を有する抗体を指す。一部の実施形態において、全長抗体は、２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を有する抗体である。

【0132】

本明細書において使用されるとき、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して３０％、２５％、２０％、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％ほど変動する量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量又は長さを指す。一部の実施形態において、「約」又は「およそ」という用語は、数値又はレベルに先行する場合、その値プラスマイナス１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。「ほぼ同じレベル」という用語は、そのレベルプラスマイナス１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。

【0133】

本明細書において使用されるとき、「作動可能に結合する」又は「作動可能に結合している」という用語は、２つ以上の目的生物学的配列が、それらが意図される様式で機能することを可能とする関係にあるようにスペーサー又はリンカー配列あり又はなしで並列していることを指す。ポリペプチドに関して使用される場合、結合産物が意図される生物学的機能を有することを可能とするようにポリペプチド配列が結合していることを意味するものとする。例えば、抗体可変領域を定常領域に作動可能に結合させて抗原結合活性を有する安定的産物を提供することができる。この用語は、ポリヌクレオチドに関して使用することもできる。一例では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に結合している場合、ポリヌクレオチドからのポリペプチドの調節発現を可能とするようにポリヌクレオチド配列が結合していることを意味するものとする。

【0134】

本明細書において使用されるとき、「結合相手」という用語は、別の分子の特異的構造特徴を認識し得る分子のペアのメンバーを指し、結合相手は、特異的、非共有結合的又は共有結合的相互作用により互いに相互作用する。このような結合相手及び対応する分子又は組成物の例としては、限定されるものではないが、免疫タイプ結合ペアのクラスのいずれか、例えば、抗原／抗体；及びさらには非免疫タイプ結合ペアのクラスのいずれか、例えば、リガンド／受容体、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニンＦ（ａｂ’）２、葉酸／葉酸結合タンパク質、相補的核酸セグメント、プロテインＡ若しくはＧ／免疫グロブリン、レクチン／炭水化物、基質／酵素、阻害剤／酵素、又はウイルス／細胞受容体が挙げられる。

【0135】

特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明における使用のための方法及び材料が本明細書に記載され；当該技術分野において公知の他の好適な方法及び材料を使用することもできる。材料、方法、及び例は説明にすぎず、限定的なものではない。本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、及び他の参照文献は、参照により全体として組み込まれる。矛盾する場合、定義を含め、本明細書が優先される。

【0136】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0137】

【図1】レーン６のＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＨＣ及びレーン１１のＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＬＣを示す電気泳動の画像である。

【図2】レーン１０のＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－ＫＩＨを示す電気泳動の画像である。レーン１１はタンパク質マーカーである。

【図3】ＥＵ番号付けに従って、抗体の重鎖ＣＨ３ドメインを示す模式図である。４つの融合部位が、四角又は円によって強調表示される。

【図4】ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ｈＩｇＧ１－ＣＨ；配列番号１）、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域（ｈＩｇＧ２－ＣＨ；配列番号２）及びヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（ｈＩｇＧ４－ＣＨ；配列番号３）の配列アラインメントである。ＣＨ２領域は点線によって示され、ＣＨ３領域は実線によって示される。

【図5A】表５に示される精製タンパク質を示す電気泳動の画像である。

【図5B】ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３ＡのＳＥＣ－ＨＰＬＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）結果を示す画像である。

【図5C】ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す画像である。

【図6】ＰＢＳ（ブランク）、ｍＩＬ７タンパク質、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４、又はＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａによって処置されたマウス脾臓細胞におけるフローサイトメトリーにより決定されたｐＳＴＡＴ５シグナルを示す。

【図7】ＰＢＳ（ブランク）、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ、又はＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４によって処置されたマウス脾臓細胞におけるフローサイトメトリーにより決定されたｐＳＴＡＴ１シグナルを示す。

【図8A】種々のＦｃ受容体に対するＰＤＬ１－アベルマブ、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４、及びＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａの結合親和性の概要を示す。

【図8B】種々のＦｃ受容体に対するＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ１、ＡＢ－ＩｇＧ１、ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４、及びＡＢ－ＩｇＧ４の結合親和性の概要を示す。

【図9A】精製タンパク質を示す電気泳動の画像である。

【図9B】図９Ａの結果について、レーン番号、相当するタンパク質名（貯蔵温度）、理論分子量（ＭＷ）及び見掛け分子量を示す表である。

【図9C】図９Ｂに示すタンパク質のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果である。

【図10A】いくつかの精製タンパク質を示す電気泳動の画像である。

【図10B】図１０Ａの結果について、レーン番号、及び相当するタンパク質名を示す表である。

【図11A】レーン１０の３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａを示すゲル画像である。

【図11B】レーン番号、相当するタンパク質名、及び理論分子量（ＭＷ）を示す表である。

【図11C】３Ｆ２－ｈＩＬ７－３ＡのＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果である。

【図12A】レーン８の３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４を示すゲル画像である。

【図12B】レーン番号、相当するタンパク質名、理論分子量（ＭＷ）及び見掛け分子量を示す表である。

【図12C】３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果である。

【図13】ＰＢＳ（ブランク）、ｈＩＬ７タンパク質、３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ、又は３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４によって処置されたマウス脾臓細胞における、フローサイトメトリーによって決定されたｐＳＴＡＴ５レベルを示す。

【図14A】レーン１３のＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－ＨＣを示すゲル画像である。

【図14B】レーン番号及び相当するタンパク質名を示す表である。

【図15A】レーン１の３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａを示すゲル画像である。

【図15B】レーン番号及び相当するタンパク質名を示す表である。

【図15C】３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３ＡのＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果である。

【図16A】レーン１４の３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４を示すゲル画像である。

【図16B】レーン番号及び相当するタンパク質名を示す表である。

【図16C】３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果である。

【図17】ＰＢＳ（ブランク）、ｈＩＬ２１タンパク質、３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ、又は３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４によって処置されたマウス脾臓細胞における、フローサイトメトリーによって決定されたｐＳＴＡＴ３レベルを示す。

【図18A】レーン１のＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａを示すゲル画像である。

【図18B】レーン番号、相当するタンパク質名、理論分子量（ＭＷ）及び見掛け分子量を示す表である。

【図18C】ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡのＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果である。

【図19】いくつかの修飾免疫グロブリンのＡＤＣＣ作用を示す。

【図20A】異なる修飾免疫グロブリンフォーマットを示す。

【図20B】異なる修飾免疫グロブリンフォーマットを示す。

【図20C】異なる修飾免疫グロブリンフォーマットを示す。

【図20D】異なる修飾免疫グロブリンフォーマットを示す。

【図21】ヒトＩｇＧ（ＨｕＩｇＧ）、ヒトＩｇＡ（ＨｕＩｇＡ）、ヒトＩｇＭ（ＨｕＩｇＭ）、ヒトＩｇＥ（ＨｕＩｇＥ）、カリフォルニアネコザメ（ＨＳｈｒｋ；Ｈｅｔｅｒｏｄｏｎｔｕｓ ｆｒａｎｓｃｉｓｃｉ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）（Ｘｅｎ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、及びアカゲザル（Ｍａｑ；Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）のＣＨ３ドメイン部分の配列アラインメント結果を示す。

【図22】精製ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ（レーン１）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｂ（レーン２）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｃ（レーン３）、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｄ（レーン４）を示すゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図23】精製ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ（レーン１）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ－ＩｇＧ４（レーン２）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＦ１（レーン３）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＦ２（レーン４）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＦ３（レーン５）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＲ１（レーン６）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＲ２（レーン７）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＲ３（レーン８）、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＲ４（レーン９）を示すゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図24】精製ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３Ａ－ＩｇＧ４（レーン１）、ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＦ１（レーン２）、ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＦ２（レーン３）、ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＦ３（レーン４）、ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＲ１（レーン５）、ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＲ２（レーン６）、ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＲ３（レーン７）、及びＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＲ４（レーン８）を示すゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図25A】精製ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ（レーン１）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１（レーン２）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ２（レーン３）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ３（レーン４）、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ４（レーン５）を示すゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図25B】レーン１の精製ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１（新たなバッチ）を示すゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図26】精製ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ（レーン１）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１（レーン２）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ２（レーン３）、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ３（レーン４）、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ４（レーン５）を示すゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図27】精製ＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ（レーン１）、ＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＩｇＧ４（レーン２）、ＰＤ１－ＫＮ０３５－３Ａ－ＩｇＧ１（レーン３）、ＰＤ１－ＫＮ０３５－３Ａ（レーン４）、ＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ１（レーン５）、ＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ（レーン６）、ＣＴ４－ＫＮ０３５－３Ａ－ｋｎｏｂ（レーン７）、及びＣＴ４－ＫＮ０３５－３Ａ－ｈｏｌｅ（レーン８）を示すゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図28】精製ＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＩｇＧ１（レーン１）、ＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＩｇＧ４（レーン２）、及びＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＴＧＦｂＲ２（レーン３）を示すゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図29】いくつかの修飾免疫グロブリンのＡＤＣＣ作用を示す。

【図30A】精製ＰＤＬ１－３Ｆ２（レーン１）、３Ｆ２－ｈＩＬ３－３Ａ（レーン２）、３Ｆ２－ｈＩＬ３－ＨＣ（レーン３）、３Ｆ２－ｈＩＬ４－３Ａ（レーン４）、３Ｆ２－ｈＩＬ４－ＨＣ（レーン５）、３Ｆ２－ｈＩＬ５－３Ａ（レーン６）、３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣ（レーン７）、３Ｆ２－ｈＩＬ６－３Ａ（レーン８）、及び３Ｆ２－ｈＩＬ６－ＨＣ（レーン９）を示す天然ゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図30B】精製ＰＤＬ１－３Ｆ２（レーン１）、３Ｆ２－ｈＩＬ８－３Ａ（レーン２）、３Ｆ２－ｈＩＬ８－ＨＣ（レーン３）、３Ｆ２－ｈＩＬ９－３Ａ（レーン４）、３Ｆ２－ｈＩＬ９－ＨＣ（レーン５）、３Ｆ２－ｈＩＬ１３－３Ａ（レーン６）、３Ｆ２－ｈＩＬ１３－ＨＣ（レーン７）、３Ｆ２－ｈＩＬ１５－３Ａ（レーン８）、及び３Ｆ２－ｈＩＬ１５－ＨＣ（レーン９）を示す天然ゲル画像である。Ｍはタンパク質マーカーである。

【図31A】３Ｆ２－ｈＩＬ５－３Ａ及び３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣのＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。

【図31B】３Ｆ２－ｈＩＬ９－３Ａ及び３Ｆ２－ｈＩＬ９－ＨＣのＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。

【図31C】３Ｆ２－ｈＩＬ１３－３Ａ及び３Ｆ２－ｈＩＬ１３－ＨＣのＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。

【図31D】３Ｆ２－ｈＩＬ１５－３Ａ及び３Ｆ２－ｈＩＬ１５－ＨＣのＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す。

【図32A】３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣの質量分析結果を示す。

【図32B】３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣの抗体二次ペプチドカバー率マッピング結果を示す。括弧内の領域は、３Ｆ－ｈＩＬ５－ＨＣの重鎖Ｃ末端の欠失配列を示す。

【図33】ヒトＩｇＤ、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＡ、及びヒトＩｇＭ間の配列アラインメントの結果を示す。アスタリスクマーク（「＊」）は、単一の、完全に保存された残基を有する位置を示す。ピリオドマーク（「．」）は、弱く類似する特性群の間での保存を示す － Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおける、スコアリング≦０．５及び＞０におおむね等しい。コロンマーク（「：」）は、強く類似する特性群の間での保存を示す － Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおける、スコアリング＞０．５におおむね等しい。

【図34】ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、及びヒトＩｇＧ２間の配列アラインメントの結果を示す。

【図35】ラットＩｇＧ２Ｃ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、ラットＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２Ａ、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２Ｂ、ラットＩｇＧ２Ｂ、マウスＩｇＧ２Ａ、及びマウスＩｇＧ２Ｃ間の配列アラインメントの結果を示す。

【図36】ヒトＩｇＧ１、サルＩｇＧ３、サルＩｇＧ１、及びサルＩｇＧ２間の配列アラインメントの結果を示す。

【図37】ヒトＩｇＧ１、イヌＩｇＧ２、イヌＩｇＧ３、イヌＩｇＧ１、及びイヌＩｇＧ４間の配列アラインメントの結果を示す。

【図38A】３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａの概略的構造を示す。

【図38B】３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａの修飾重鎖、軽鎖及びＩＬ１２ｂをコードするプラスミドの模式図を示す。

【図39A】３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４の概略的構造を示す。

【図39B】３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４の修飾重鎖、軽鎖及びＩＬ１２ｂをコードするプラスミドの模式図を示す。Ｌはリンカー配列を示す。

【図40】３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ及び３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。

【図41A】３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３ＡのＳＥＣ結果を示す。

【図41B】３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４のＳＥＣ結果を示す。

【図42】マウス結腸癌細胞ＭＣ３８が注入され、且つＰＤＬ１－３Ｆ２、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、又は３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４で処置された二重ヒト化ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１マウスの時間の経過による体重を示すグラフである。生理食塩水溶液がコントロールとして注入された。

【図43】マウス結腸癌細胞ＭＣ３８が注入され、且つＰＤＬ１－３Ｆ２、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、又は３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４で処置された二重ヒト化ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１マウスの時間の経過による体重を示すグラフである。生理食塩水溶液がコントロールとして注入された。

【図44】マウス結腸癌細胞ＭＣ３８が注入され、且つＰＤＬ１－３Ｆ２、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、又は３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４で処置された二重ヒト化ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１マウスの異なるグループにおける平均腫瘍容積を示すグラフである。生理食塩水溶液がコントロールとして注入された。

【図45A】ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞が注入され、且つモノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、単一特異性抗体（Ｇ４）の組み合わせ、又は二重特異性抗体（Ｇ５及びＧ６）で処置された、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの時間の経過による体重を示すグラフである。ＰＢＳ溶液がコントロールとして投与された（Ｇ１）。

【図45B】ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞が注入され、且つモノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、単一特異性抗体（Ｇ４）の組み合わせ、又は二重特異性抗体（Ｇ５及びＧ６）で処置された、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの時間の経過による体重変化を示すグラフである。ＰＢＳ溶液がコントロールとして注入された（Ｇ１）。

【図45C】ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞が注入され、且つモノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、単一特異性抗体（Ｇ４）の組み合わせ、又は二重特異性抗体（Ｇ５及びＧ６）で処置された、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの時間の経過による腫瘍容積を示すグラフである。ＰＢＳ溶液がコントロールとして注入された（Ｇ１）。

【図46A】モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、二重特異性抗体１Ａ７－セリクレルマブ（ｓｅｌｉｃｒｅｌｕｍａｂ）－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）又は１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）が注入された、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの時間の経過による体重を示すグラフである。ＰＢＳ溶液がコントロールとして注入された（Ｇ１）。

【図46B】モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、二重特異性抗体１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）又は１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）が注入されたＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの時間の経過による体重変化を示すグラフである。ＰＢＳ溶液がコントロールとして注入された（Ｇ１）。

【図47A】ＰＢＳ（Ｇ１）、モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、二重特異性抗体１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）又は１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）が注入された、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの異なるグループにおけるグループ化後７日目のマウス血中ＡＬＴレベルを示す。

【図47B】ＰＢＳ（Ｇ１）、モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、二重特異性抗体１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）又は１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）が注入された、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの異なるグループにおけるグループ化後７日目のマウス血中ＡＳＴレベルを示す。

【図48A】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図48B】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図48C】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図48D】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図48E】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図48F】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図48G】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図48H】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図48I】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図48J】本開示で考察されるいくつかの配列を提供する。

【図49】Ｋａｂａｔ番号付けに従って、抗ＣＴＬＡ４抗体４Ｇ１２、抗ＯＸ４０抗体９Ｈ３、抗ＰＤ－Ｌ１抗体３Ｆ２及び抗ＰＤ－１抗体１Ａ７のＣＤＲ配列を提供する。

【図50】Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けに従って、抗ＣＴＬＡ４抗体４Ｇ１２、抗ＯＸ４０抗体９Ｈ３、抗ＰＤ－Ｌ１抗体３Ｆ２及び抗ＰＤ－１抗体１Ａ７のＣＤＲ配列を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0138】

二重特異性抗体は、治療抗体の新たなカテゴリーとなるべく発展中である。それらは、異なる２つの標的又は標的上の２つの異なるエピトープに結合し、個々の抗体の作用よりも優れた相加作用又は相乗作用を生じ得る。免疫サイトカインは、抗体－サイトカイン融合タンパク質であり、腫瘍病変上に優先的に局在化し、且つ疾患部位での抗癌免疫を活性化する可能性を有する。二重特異性抗体及び免疫サイトカインの既存の多くの製造アプローチには、低い効率性、不安定性及び凝集の問題がある。

【0139】

本開示は、Ｆｃ領域における選択領域に融合される融合ポリペプチドを有する免疫グロブリンが、非常に安定であり、且つ高レベルで安定に発現され得ることを示す。さらに、免疫グロブリンへのポリペプチドの融合は、免疫グロブリンの結合親和性又は融合ポリペプチドの生物活性に影響を及ぼさない。さらに、修飾免疫グロブリンは、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）修飾と適合性であり、他の多くの抗体エンジニアリング技術によってさらに修飾され得る。この修飾によって、向上した抗体フォーマットが提供され、それを用いて、種々の二重特異性抗体、多重特異性抗体、及び免疫サイトカインを産生することができる。

【0140】

修飾免疫グロブリン
本開示は、免疫グロブリンのＦｃ領域における選択領域にポリペプチドが融合される、修飾免疫グロブリンを提供する。一態様において、本開示は、Ｆｃ領域における選択領域に機能性タンパク質が融合される、修飾Ｆｃ領域を提供する。

【0141】

一般に、免疫グロブリン（抗体とも呼ばれる）は、ポリペプチド鎖、軽鎖及び重鎖の２つのクラスで構成される。本開示の抗体の非制限的な例は、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む、インタクトな４つの免疫グロブリン鎖抗体であり得る。

【0142】

それぞれが１つの可変ドメイン（又は可変領域、ＶＨ）と複数の定常ドメイン（又は定常領域）を含有する重鎖が、その定常ドメイン内でジスルフィド結合を介して互いに結合し、抗体の「幹」を形成する。それぞれが１つの可変ドメイン（又は可変領域、ＶＬ）及び１つの定常ドメイン（又は定常領域）を含有する軽鎖はそれぞれ、スルフィド結合を介して１つの重鎖に結合する。各軽鎖の可変領域が、それが結合される重鎖の可変領域とアラインメントされる。軽鎖及び重鎖両方の可変領域が、より保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）間に挟まれる３つの超可変領域を含有する。相補性決定領域（ＣＤＲ）として公知のこれらの超可変領域は、抗体の抗原結合性表面を含むループを形成する。４つのフレームワーク領域は大部分が、βシートコンフォメーションの形をとり、ＣＤＲは、βシート構造を結合するループ、場合によっては、βシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によって接近して維持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗原結合領域の形成に寄与する。

【0143】

重鎖は、アイソタイプに応じて、可変（ＶＨ）ドメインと、いくつかの定常（ＣＨ）ドメイン：ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤにおける３つのＣＨドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、及びＩｇＭ及びＩｇＥにおける４つのＣＨドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）など、４～５個のドメインを有する。抗原結合性断片（Ｆａｂ）は、軽鎖（ＶＬ及びＣＬ）と、重鎖（ＶＨ及びＣＨ１）の最初の２つのドメインによって形成され、抗原結合に特異的に関与する。Ｉｇ Ｆｃ（断片結晶性）部分は、ＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインによって、任意にＣＨ４定常ドメインと共に、各重鎖から形成される。Ｆｃ領域は、各抗体が、Ｆｃ受容体の特異的クラスに結合することによって、所定の抗原に対する適切な免疫応答、並びに補体タンパク質などの他の免疫分子を産生することを確実にする。これが行われることによって、オプソニン化粒子（ＦｃγＲに結合する）の認識、細胞（補体に結合する）の溶解、及びマスト細胞、好塩基球、及び好酸球（ＦｃεＲに結合する）の脱顆粒など、様々な生理学的作用が仲介される。

【0144】

免疫グロブリンにおけるすべてのドメインは同様な構造を有し、２つのβシートから構成される。そのシートは、ジスルフィド架橋によって連結され、βバレルとして公知のおよそバレル形の構造を共に形成する。免疫グロブリンタンパク質ドメインの固有の折り畳み構造は免疫グロブリンフォールドとして公知である。定常ドメインは、４つのストランドが１つのβシートを形成し、３つのストランドが第２のシートを形成するように配置された、７つのβストランドから構成される。βストランドを連結するループは比較的短く、結果として、ドメインの残基の大部分が２つのβシートに含有される。これらのストランドとしては、Ａ－ストランド、Ｂ－ストランド、Ｃ－ストランド、Ｄ－ストランド、Ｅ－ストランド、Ｆ－ストランド、及びＧ－ストランドが挙げられる。βストランドを連結する配列としては、ＡＢ－ターン、ＢＣ－ループ、ＣＤ－ストランド、ＤＥ－ターン、及びＥＦ－ターンが挙げられる。定常ドメインの構造の詳細な説明は、例えばＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，“ＩＭＧＴＲ（登録商標）ａｎｄ ３０ ｙｅａｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖ ａｎｄ Ｃ ｄｏｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８．２（２０１９）：２９に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0145】

本開示から、非天然ポリペプチドを、免疫グロブリンのＦｃ領域における特定の領域に融合することができることが実証される。本明細書において使用される、「非天然」ポリペプチドとは、野生型免疫グロブリンのＦｃ領域に見出すことができないポリペプチドを意味する。本開示のこの特定の領域は、「３Ａ部位」と呼ばれる。３Ａ部位は、ＣＨ３ドメインに位置し、３４４位から３８２位へと開始する（ＥＵ番号付け）。非天然ポリペプチドの融合によって、優れた結果が提供され得る。一部の他の修飾免疫グロブリンと比較すると、この修飾を有する免疫グロブリンは非常に安定であり、且つこの部位で融合された非天然ポリペプチドを有する免疫グロブリンは、高レベルで発現し得て、凝集塊を形成しない。ＣＨ３ドメインの機能及び安定性に重要であると思われる、３Ａ部位がＡ－ストランド及びＢ－ストランドに位置するため、この融合部位の特性は予想外である。本開示の結果から、この免疫グロブリンが、ＣＨ３ドメインにおける一部の他の位置と比較して、３Ａ部位にて非天然配列に対してかなり高い耐性を有することが実証された。

【0146】

ＣＨ３ドメインの配列アラインメントから、図２１に示すように、３Ａ部位が種間で、且つ異なる免疫グロブリン間で比較的保存されることが分かる。したがって、ヒト及び非ヒト動物などの異なる動物からの抗体に、同様な修飾を加えることができる。非ヒト動物としては、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌ、及び霊長類が挙げられる。一部の実施形態において、抗体は、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ等）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ（ｒａｂｂｉｔ））、ウサギ（ｌａｇｏｍｏｒｐｈｓ）、ブタ（例えば、ブタ、ミニチュアピッグ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、及び他の家畜及び動物園動物由来である。一部の実施形態において、ヒト、げっ歯類（例えば、ラット、マウス）、ラクダ科の動物、イヌ、カリフォルニアネコザメ、アフリカツメガエル、サル（例えば、アカゲザル）、ネコ、又はウサギ由来の抗体に修飾が加えられる。一部の実施形態において、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＡに修飾が加えられる。したがって、一態様において、本開示は、第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチドと、第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む、修飾Ｆｃ領域又はポリペプチド複合体を提供する。一部の実施形態において、ＣＨ３ドメインは重鎖ＣＨ３ドメインである。２つのポリペプチドは互いに相互作用し、ホモ二量体又はヘテロ二量体を形成し得る。１つ又は２つの非天然ポリペプチドを、３Ａ部位にて１つ又は２つのポリペプチドの重鎖ＣＨ３ドメインに融合することができる。３Ａ部位は、３４４位から３８２位（ＥＵ番号付け）へと開始する。一部の実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９個のアミノ酸と置き換わり、或いはこの融合部位にて２つのアミノ酸のいずれかの間に挿入される。一部の実施形態において、非天然ポリペプチドが融合部位にて２つの非連続アミノ酸の間に挿入された場合、それは、２つの非連続アミノ酸の間のすべてのアミノ酸と置き換わる。一部の実施形態において、非天然ポリペプチドは、修飾免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３ドメインの２つのアミノ酸残基に連結される。２つのアミノ酸残基は連続し得る、又は非連続であり得る。

【0147】

一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、第１の重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド、第２の重鎖ＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチドを含み、第３ポリペプチドが、ＥＵ番号付けに従って第１の重鎖ＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域にて第１の重鎖ＣＨ３ドメインに融合される。一部の実施形態において、ポリペプチド複合体は、第１の重鎖ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖ポリペプチド、第２の重鎖ＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖ポリペプチドを含み、第３ポリペプチドが、ＥＵ番号付けに従って第１の重鎖ＣＨ３ドメインの３４４位から３８２位までの領域にて第１の重鎖ＣＨ３ドメインに融合される。

【0148】

一部の実施形態において、非天然ポリペプチドが、修飾免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３ドメインの２つのアミノ酸残基に連結される。一部の実施形態において、２つの残基は、ＥＵ番号付けに従った重鎖ＣＨ３ドメインの３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、及び３８３位のいずれか２つから選択される。非天然ポリペプチドは、重鎖ＣＨ３ドメインにおける開始アミノ酸及び末端アミノ酸に連結される。本開示は、３Ａ部位での開始アミノ酸及び末端アミノ酸のすべての異なる組み合わせも提供する。例えば、非天然ポリペプチドが、３４３及び３８３位に位置するアミノ酸残基に連結される場合、３Ａ部位全体（３４４～３８２位）が、非天然ポリペプチドによって置き換えられる。非天然ポリペプチドが、例えば３５７及び３５８位に位置する２つの連続するアミノ酸残基に連結される場合、非天然ポリペプチドは、２つの連続するアミノ酸残基の間に挿入される。重鎖ＣＨ３ドメインの３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、及び３８３位（ＥＵ番号付け）のいずれか２つのアミノ残基の特定の組み合わせが提供される。

【0149】

一部の実施形態において、開始アミノ酸が、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、又は３５６位から選択される。一部の実施形態において、開始アミノ酸は、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、又は３６２から選択される。一部の実施形態において、末端アミノ酸は、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、又は３８３位から選択される。一部の実施形態において、末端アミノ酸は、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、又は３６３位から選択される。

【0150】

一部の実施形態において、融合部位は、３５１から３６２位（ＥＵ番号付け）の領域に位置する。一部の実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位にて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個又はすべてのアミノ酸（例えば、３５１～３６２）と置き換わり、或いはこの融合部位での２つのアミノ酸のいずれかの間に挿入され、例えば３５１～３５２、３５２～３５３、３５３～３５４、３５４～３５５、３５５～３５６、３５６～３５７、３５７～３５８、３５８～３５９、３５９～３６０、３６０～３６１、又は３６１～３６２位に挿入される。

【0151】

一部の実施形態において、２つの残基は、ＥＵ番号付けによる重鎖ＣＨ３ドメインの３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位のいずれか２つから選択される。これらの開始アミノ酸と末端アミノ酸の組み合わせを以下の表に示す。例えば、非天然ポリペプチドが、３５０及び３６３位に位置するアミノ酸残基に連結される場合、この融合部位（３５１～３６２位）のアミノ酸は、非天然ポリペプチドによって置き換えられる。非天然ポリペプチドが、例えば３５０位及び３５１位に位置する、連続する２つのアミノ酸残基に連結される場合、非天然ポリペプチドは、連続する２つのアミノ酸残基間に挿入される。

【0152】

【表1】

【0153】

一部の実施形態において、融合部位は、３５８～３６２位（ＥＵ番号付け）の領域に位置する。一部の実施形態において、非天然ポリペプチドが、融合部位の１、２、３、４、５個若しくはすべてのアミノ酸と置き換わり、又はこの融合部位での２つのアミノ酸のいずれかの間に挿入され、例えば３５８～３５９、３５９～３６０、３６０～３６１、又は３６１～３６２位に挿入される。

【0154】

一部の実施形態において、２つの残基は、ＥＵ番号付けによる重鎖ＣＨ３ドメインの３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、及び３６３位のいずれか２つから選択される。これらの開始アミノ酸と末端アミノ酸の組み合わせを以下の表に示す。

【0155】

【表2】

【0156】

したがって、いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５７位及び３５８位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５７位及び３５９位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５７位及び３６０位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５７位及び３６１位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５７位及び３６２位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５７位及び３６３位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位及び３５９位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位及び３６０位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位及び３６１位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位及び３６２位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位及び３６３位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５９位及び３６０位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５９位及び３６１位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５９位及び３６２位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３５９位及び３６３位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３６０位及び３６１位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３６０位及び３６２位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３６０位及び３６３位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３６１位及び３６２位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３６１位及び３６３位である。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３６２位及び３６３位である。

【0157】

３Ａ部位での非天然ポリペプチドの融合は、免疫グロブリンの抗原結合部位に干渉しない。加えて、融合された非天然ポリペプチドは、その生物活性を維持することができる。さらに、３Ａ部位での修飾は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、又はＦｃＲｎ受容体に対するＦｃの結合親和性に有意には影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、又はＦｃＲｎ受容体に対する修飾されたＦｃの結合親和性は、あらゆる修飾前の同じ免疫グロブリンと比較して、ほぼ同じである。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、又はＦｃＲｎ受容体に対する修飾されたＦｃの結合親和性は、あらゆる修飾前の同じ免疫グロブリンと比較して、高い（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％）。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、又はＦｃＲｎ受容体に対する修飾されたＦｃの結合親和性は、あらゆる修飾前の同じ免疫グロブリンと比較して、低い（例えば、わずか１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％低い）。

【0158】

いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、又はアポトーシス活性の少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態において、３Ａ部位の融合ポリペプチドが標的タンパク質と相互作用する場合、Ｆｃは、立体効果のために、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、又はＦｃγＲＩＩＩＢ受容体に結合しない。したがって、３Ａ部位の融合ポリペプチドが標的タンパク質と相互作用する場合、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣ効果は低下する。これは、いくつかの利点を提供することができる。例えば、二重特異性抗体について、二重特異性抗体は、腫瘍関連抗原及び免疫細胞抗原を標的とするようにデザインすることができる。二重特異性抗体が免疫細胞抗原にだけ結合する場合、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣ効果は、その効果により免疫細胞を死滅させてしまうので、望ましくないと思われる。しかしながら、この問題は、修飾免疫グロブリンの構成によって容易に解決することができる。いくつかの実施形態において、抗原結合部位は、腫瘍抗原に結合することができ、ｓｃＦｖは、免疫細胞抗原を標的とするように融合部位に導入することができる。一旦、修飾免疫グロブリンが腫瘍細胞に結合し、それと同時に、３Ａ部位のｓｃＦｖが、免疫細胞に結合しなければ、修飾免疫グロブリンは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣ効果を引き起こすことができる。しかし、３Ａ部位のｓｃＦｖが免疫細胞に結合する場合、望ましくないＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣ効果を、低下させる又は排除することができる。

【0159】

さらに、３Ａ部位での非天然ポリペプチドの融合は、非天然ポリペプチドの機能に干渉しない。特に、修飾免疫グロブリンにおける非天然ポリペプチドは、単離された非天然ポリペプチドと比較して、ほぼ同じ又はさらには高いレベルの生物学的活性を有することができる。いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンにおける非天然ポリペプチドの生物学的活性は、単離された非天然ポリペプチドの少なくとも又は約８５％、９０％、９５％、又は１００％とすることができる。

【0160】

３Ａ部位での非天然ポリペプチドの融合は、修飾免疫グロブリンの結合親和性に干渉しない。特に、修飾免疫グロブリンは、親免疫グロブリンと比較して、ほぼ同じ又はさらには高いレベルの結合親和性を有することができる。本明細書において使用されるように、用語「親」分子は、本明細書において記載される任意の非天然ポリペプチドが分子に融合される又は任意の他の修飾が分子に対してなされる前の分子を指す。いくつかの実施形態において、結合親和性は、親免疫グロブリンの少なくとも又は約８５％、９０％、９５％、又は１００％とすることができる。

【0161】

３Ａ部位での非天然ポリペプチドの融合は、発現レベルに干渉せず、発現収量を低下させない。特に、修飾免疫グロブリンは、非常に高い発現レベルを有する。いくつかの実施形態において、発現レベルは、同様の二重特異性抗体（例えば、同じ標的に結合する抗体）又はイムノサイトカイン（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ）（例えば、ＦｃのＣ末端にサイトカインが連結された抗体）の発現レベルよりも、少なくとも又は約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％高いものとすることができる。いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンは、容易には、凝集体を形成しない。いくつかの実施形態において、精製された形態における凝集体のパーセンテージ（例えば、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製された後）は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満である。

【0162】

加えて、修飾免疫グロブリンには、二重特異性抗体の場合のように、誤対合の問題がない。したがって、典型的な二重特異性抗体よりも、修飾免疫グロブリンを作製し、精製することは、容易であり、収量は、かなり高くすることができる。

【0163】

さらに、修飾免疫グロブリンは、安定しており、容易には、凝集体を形成しない又は分解しない。いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンは、室温で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２週間又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヵ月間、安定している。

【0164】

本開示はまた、Ｆｃ領域のいくつかの他の部位の修飾をも提供する。これらの部位は、「３Ｂ」部位、「３Ｃ」部位、及び「３Ｄ」部位を含む。１つ又は２つの非天然ポリペプチドを、３Ｂ部位の１つ又は２つのポリペプチドの重鎖ＣＨ３ドメインに融合することができる。３Ｂ部位は、３８３位から開始し、３９１位までである（ＥＵナンバリング）。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、３Ｂ部位で、アミノ酸配列全体を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、この融合部位で、任意の２つのアミノ酸の間に挿入される。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、修飾免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３ドメインの２つのアミノ酸残基に連結される。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３８２位、３８３位、３８４位、３８５位、３８６位、３８７位、３８８位、３８９位、３９０位、３９１位、及び３９２位から選択され、これらの２つのアミノ酸残基のすべての考え得る組み合わせもまた、提供される。

【0165】

いくつかの実施形態において、１つ又は２つの非天然ポリペプチドを、３Ｃ部位の１つ又は２つのポリペプチドの重鎖ＣＨ３ドメインに融合することができる。３Ｃ部位は、３８３位から開始し、３８５位までである（ＥＵナンバリング）。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位で、１、２、３、又は４アミノ酸を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、３Ｃ部位で、アミノ酸配列全体を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、この融合部位で、任意の２つのアミノ酸の間に挿入される。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、修飾免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３ドメインの２つのアミノ酸残基に連結される。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３８２位、３８３位、３８４位、３８５位、及び３８６位から選択され、これらの２つのアミノ酸残基のすべての考え得る組み合わせもまた、提供される。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの３８４位及び３８５位である。

【0166】

いくつかの実施形態において、１つ又は２つの非天然ポリペプチドを、３Ｄ部位の１つ又は２つのポリペプチドの重鎖ＣＨ３ドメインに融合することができる。３Ｄ部位は、４１３位から開始し、４２２位までである（ＥＵナンバリング）。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、３Ｄ部位で、アミノ酸配列全体を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、この融合部位で、任意の２つのアミノ酸の間に挿入される。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、修飾免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３ドメインの２つのアミノ酸残基に連結される。いくつかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵナンバリングに従う重鎖ＣＨ３ドメインの４１２位、４１３位、４１４位、４１５位、４１６位、４１７位、４１８位、４１９位、４２０位、４２１位、４２２位、及び４２３位から選択され、これらの２つのアミノ酸残基のすべての考え得る組み合わせもまた、提供される。

【0167】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される免疫グロブリンは、１つ又は２つの重鎖（例えば、本明細書において記載されるインタクトな、一部分の、又は修飾された重鎖）を有し、１つ又は２つの非天然ポリペプチドは、１つ又は２つの重鎖のＮ末端又はＣ末端に融合することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される免疫グロブリンは、Ｆｃ領域（例えば、本明細書において記載される任意の野生型又は修飾されたＦｃ領域）を有し、１つ又は２つの非天然ポリペプチドは、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に融合することができる。

【0168】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される免疫グロブリンは、１つ又は２つの軽鎖（例えば、本明細書において記載されるインタクトな、一部分の、又は修飾された軽鎖）を有し、１つ又は２つの非天然ポリペプチドは、１つ又は２つの軽鎖のＮ末端又はＣ末端に融合することができる。

【0169】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。いくつかの実施形態において、ヒト免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＧである。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。ヒトＩｇＤのアミノ酸２６９～３７５（配列番号１０２）、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０７）、ヒトＩｇＧ３のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０６）、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０４）、ヒトＩｇＧ２のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０５）、ヒトＩｇＡのアミノ酸２２４～３３３（配列番号１０１）、及びヒトＩｇＭのアミノ酸３２４～４３３（配列番号１０３）の間の配列アラインメントを、図３３に示す。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）；及びヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭにおける対応する残基を、囲み線で標識する。非天然ポリペプチドは、この部位に同様に融合することができる。詳細には、重鎖ＣＨ３ドメインの融合部位は、以下のアミノ酸配列を有する：ＬＴＫＮＱ（ヒトＩｇＧ１；配列番号１３０）；ＭＴＫＮＱ（ヒトＩｇＧ２；配列番号１３１）；ＭＴＫＮＱ（ヒトＩｇＧ３；配列番号１３２）；及びＭＴＫＮＱ（ヒトＩｇＧ４；配列番号１３３）。ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＭにおける融合部位についてのアミノ残基は、それぞれ、ＬＡＬＮＥＬ（配列番号１３４）、ＤＰＰＥＡＡ（配列番号１３５）、及びＬＮＬＲＥＳ（配列番号１３６）である。上記のアラインメントの結果は、重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）が、ヒト免疫グロブリン全体でそれほど保存されていないことを示す。そのため、本明細書において記載される領域内での本明細書において記載される修飾（例えば、非天然ポリペプチドの融合）は、タンパク質の発現、安定性、及び／又は機能に影響を及ぼすことなく、実行することができる。いくつかの実施形態において、ＣＨ３領域は、免疫グロブリン重鎖由来の、ＣＨＳ領域（ある場合）のないＣＨ３エキソンコード化領域に対応する定常ドメインである。いくつかの実施形態において、ＣＨＳ領域は、ＣＨ３の端にある。ＣＨＳ領域は、分泌された免疫グロブリン重鎖のＣ末端部のコード化領域である。詳細は、全体が参照によって本明細書において援用されるｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）において見つけることができる。同様に、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０７）、ヒトＩｇＧ３のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０６）、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０４）、及びヒトＩｇＧ２のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０５）の間の配列アラインメントを、図３４に示す。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）に標識する。いくつかの実施形態において、１つ又は２つの非天然ポリペプチドは、融合部位で、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＭの重鎖ＣＨ３ドメインに融合することができる。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位で、アミノ酸配列全体を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、この融合部位で、任意の２つのアミノ酸の間に挿入される。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、修飾免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３ドメインの２つのアミノ酸残基に連結される。

【0170】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される免疫グロブリンは、げっ歯類免疫グロブリン（例えば、マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ）である。いくつかの実施形態において、ラット免疫グロブリンは、ラットＩｇＧ１、ラットＩｇＧ２Ａ、ラットＩｇＧ２Ｂ、又はラットＩｇＧ２Ｃである。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される免疫グロブリンは、マウス免疫グロブリンである。いくつかの実施形態において、マウス免疫グロブリンは、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２Ａ、マウスＩｇＧ２Ｂ、マウスＩｇＧ２Ｃ、又はマウスＩｇＧ３である。ラットＩｇＧ２ＣのＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１１１）、マウスＩｇＧ３のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１１６）、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０４）、ラットＩｇＧ１のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０８）、ラットＩｇＧ２ＡのＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０９）、マウスＩｇＧ１のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１１２）、マウスＩｇＧ２ＢのＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１１４）、ラットＩｇＧ２ＢのＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１１０）、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１１３）、及びマウスＩｇＧ２ＣのＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１１５）の間の配列アラインメントを、図３５に示す。ヒトＩｇＧ１の重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）並びにマウスＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃ、又はＩｇＧ３）及びラットＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、又はＩｇＧ２Ｃ）における対応する残基を、括弧によって標識する。詳細には、重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）に対応するアミノ酸残基は、ＭＳＫＮＫ（ラットＩｇＧ２Ｃ；配列番号１３７）、ＭＳＫＫＫ（マウスＩｇＧ３；配列番号１３８）、ＭＴＱＮＥ（ラットＩｇＧ１；配列番号１３９）、ＭＴＱＳＱ（ラットＩｇＧ２Ａ；配列番号１４０）、ＭＡＫＤＫ（マウスＩｇＧ１；配列番号１４１）、ＬＳＲＫＤ（マウスＩｇＧ２Ｂ；配列番号１４２）、ＬＴＥＱＴ（ラットＩｇＧ２Ｂ；配列番号１４３）、ＭＴＫＫＱ（マウスＩｇＧ２Ａ；配列番号１４４）、及びＭＴＫＫＥ（マウスＩｇＧ２Ｃ；配列番号１４５）である。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される免疫グロブリンは、サル免疫グロブリン（例えば、サルＩｇＧ）である。いくつかの実施形態において、サル免疫グロブリンは、サルＩｇＧ１、サルＩｇＧ２、又はサルＩｇＧ３である。ヒトＩｇＧ１のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０４）、サルＩｇＧ３のＣＨ３領域（配列番号１１９）、サルＩｇＧ１のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１１７）、及びサルＩｇＧ２のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１１８）の間の配列アラインメントを、図３６に示す。ヒトＩｇＧ１の重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）並びにサルＩｇＧにおける対応する残基（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３）を、括弧によって標識する。詳細には、重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）に対応するアミノ酸残基は、ＬＴＫＮＱ（サルＩｇＧ３；配列番号１４６）、ＬＴＫＮＱ（サルＩｇＧ１；配列番号１４７）、及びＬＴＫＮＱ（サルＩｇＧ２；配列番号１４８）である。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される免疫グロブリンは、イヌ属（Ｃａｎｉｓ）（例えばイヌ）免疫グロブリン（例えばイヌＩｇＧ）である。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、イヌ科（Ｃａｎｉｎｅ）ＩｇＧ１、イヌ科ＩｇＧ２、イヌ科ＩｇＧ３、又はイヌ科ＩｇＧ４である。ヒトＩｇＧ１のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１０４）、イヌ科ＩｇＧ２のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１２１）、イヌ科ＩｇＧ３のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１２２）、イヌ科ＩｇＧ１のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１２０）、及びイヌ科ＩｇＧ４のＣＨ３～ＣＨＳ領域（配列番号１２１）の間の配列アラインメントを、図３７に示す。ヒトＩｇＧ１の重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）並びにイヌ科ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）における対応する残基を、括弧によって標識する。詳細には、重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）に対応するアミノ酸残基は、ＬＳＫＮＴ（イヌ科ＩｇＧ２；配列番号１４９）、ＭＳＫＮＴ（イヌ科ＩｇＧ３；配列番号１５０）、ＬＳＳＳＤＴ（イヌ科ＩｇＧ１；配列番号１５１）、及びＬＳＳＳＤＴ（イヌ科ＩｇＧ４；配列番号１５２）である。ヒトＩｇＧ１の重鎖ＣＨ３ドメインの３５８位～３６２位（ＥＵナンバリングに従う）に対応する部位は、非天然ペプチドに対する融合部位として使用することができる。いくつかの実施形態において、１つ又は２つの非天然ポリペプチドは、これらの融合部位に融合することができる。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位で、アミノ酸配列全体を置き換える。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、この融合部位で、任意の２つのアミノ酸の間に挿入される。いくつかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、修飾免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３ドメインの２つのアミノ酸残基に連結される。

【0171】

抗体の構成
修飾免疫グロブリンは、種々の形態又は構成を有することができる。いくつかの実施形態において、あらゆる修飾の前の親抗体は、インタクトな免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）とすることができる。ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）は、高度に保存されており、それらの定常領域において、特に、それらのヒンジ及び上部のＣＨ２ドメインにおいて異なる。これらの免疫グロブリンのＥＵナンバリング、ＩｇＧサブクラスの配列及び違いは、当技術分野において知られており、例えば、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，“ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（２０１４）；Ｉｒａｎｉ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７．２（２０１５）：１７１－１８２；Ｓｈａｋｉｂ，Ｆａｒｏｕｋ，ｅｄ．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１６；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，“ＩＭＧＴ（登録商標） ａｎｄ ３０ ｙｅａｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖ ａｎｄ Ｃ ｄｏｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８．２（２０１９）：２９において記載されており、これらのそれぞれは、全体が参照によって本明細書において援用される。

【0172】

抗体はまた、任意の種（例えば、ヒト、げっ歯類、ラット、マウス、ラクダ科の動物、イヌ、ネコザメ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、アカゲザル、ネコ、ウサギ）に由来する免疫グロブリン分子とすることもできる。本明細書において開示される抗体はまた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、及び別のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体を含むが、これらに限定されない。用語「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合断片」は、インタクトな抗体の特異的な結合活性を保持する、抗体の一部分、すなわち、インタクトな抗体の標的分子上のエピトープに特異的に結合することが可能である抗体の任意の一部分である。これは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びこれらの断片の変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異性抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディ、直線状の抗体、単鎖抗体分子、抗体断片から形成される多重特異性抗体、及び抗体結合ドメインである又はそれと相同である結合ドメインを含む任意のポリペプチドとすることができる。抗原結合ドメインの非限定的な例は、例えば、インタクトな抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖ＣＤＲ、インタクトな抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域、インタクトな抗体の完全長重鎖若しくは軽鎖、又はインタクトな抗体の重鎖若しくは軽鎖由来の個々のＣＤＲを含む。

【0173】

抗体の断片は、本明細書において記載される方法における使用に適しており、さらに提供される。Ｆａｂ断片は、軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン並びに重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、Ｆａｂ断片の間でヒンジシステインによってＦａｂ断片のカルボキシ末端の近くで通常共有結合で連結している一対のＦａｂ断片を含む。抗体断片の他の化学的カップリングもまた、当技術分野において知られている。

【0174】

いくつかの実施形態において、抗体の重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、若しくはＩｇＤを含む任意のアイソタイプ又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２を含むサブアイソタイプ等とすることができる。軽鎖は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖とすることができる。抗体は、軽鎖の２つの同一の複製物及び重鎖の２つの同一の複製物を含むことができる。

【0175】

修飾免疫グロブリンは、種々の抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗原は、融合タンパク質、酵素、可溶性タンパク質、構造タンパク質、転写調節タンパク質、受容体、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経活性ペプチド、免疫調節タンパク質、血液成分のタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、タンパク質のいずれか１つの機能的断片、タンパク質のいずれか１つのエピトープ断片、及びその任意の組み合わせである。

【0176】

いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンは、抗原に結合し、修飾免疫グロブリンは、同じ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体と比較して、ほぼ同じ又は高い発現レベルを有する。いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンは、２つの抗原に結合し、修飾免疫グロブリンは、同じ２つの抗原に特異的に結合する二重特異性抗体と比較して、ほぼ同じ又は高い発現レベルを有する。いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンは、３つの抗原に結合し、修飾免疫グロブリンは、同じ３つの抗原に特異的に結合する三重特異性抗体と比較して、ほぼ同じ又は高い発現レベルを有する。いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンは、４つの抗原に結合し、修飾免疫グロブリンは、同じ４つの抗原に特異的に結合する四重特異性抗体と比較して、ほぼ同じ又は高い発現レベルを有する。

【0177】

いくつかの実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原である。本明細書において使用されるように、用語「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞表面にある又は提示され得る及び腫瘍細胞上に又は内に位置する抗原を指す。いくつかの他の実施形態において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞に限って発現され得る又は非腫瘍細胞と比較した腫瘍特異的突然変異のことを表してもよい。いくつかの他の実施形態において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の両方において見つけることができるが、非腫瘍細胞と比較した場合に、腫瘍細胞で過剰発現している又は非腫瘍組織と比較して腫瘍組織の構造がそれほどコンパクトではないために、腫瘍細胞において抗体が結合しやすい。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、腫瘍の血管系に位置する。腫瘍関連表面抗原の例証となる例は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲ、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤＣＰ１、デルリン１（Ｄｅｒｌｉｎ１）、テネイシン、ｆｒｉｚｚｌｅｄ１～１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、ＰＤＧＦＲ－アルファ（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ－ベータ（ＣＤ１４０ｂ）エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍ１～８、及びＴｉｅ２である。さらなる例は、Ａ３３、ＣＡＭＰＡＴＨ－１（ＣＤｗ５２）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、Ｅｐ－ＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ－２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（メラノーマ関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、及びＴＡＧ－７２を含んでいてもよい。

【0178】

いくつかの実施形態において、抗原は、エフェクター細胞についての抗原である。本明細書において使用されるように、用語「エフェクター細胞」は、刺激に対して能動的に応答し、なんらかの変化を生み出す細胞を指す。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ミクロファージ、樹状細胞、又は好中球である。したがって、抗原は、免疫細胞抗原とすることができる。本明細書において使用されるように、用語「免疫細胞抗原」は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）上に主に提示される抗原を指す。ある実施形態において、抗原は、ＣＤ３、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＥＡ、ｃｄＨ３、ＥｐＣＡＭ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＥＧＦＲの突然変異形態）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｄＬＬ３、ＢＣＭＡ、シアリル－Ｌｅａ、５Ｔ４、ＲＯＲ１、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、メソテリン、葉酸受容体１、ＶＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｎｅｕ、Ｇ２５０、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ、プロテオグリカン、ＶＥＧＦ、ＦＧＦＲ、アルファＶベータ３－インテグリン、ＨＬＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＡＳＣ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ｃ－ｅｒｂ－２、ＣＡＬＬＡ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ６、ｐ９７、ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＴ１ｂ、ＧＴ３、ＧＱ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＦＸ２、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４ Ｔｒｐ２、ｇｐ１００、チロシナーゼ、Ｍｕｃ－１、テロメラーゼ、サバイビン、Ｇ２５０、ｐ５３、ＣＡ１２５ ＭＵＣ、Ｗｕｅ抗原、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、ＨＳＰ－２７、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－７２、ＨＳＰ－９０、Ｐｇｐ、ＭＣＳＰ、ＥｐＨＡ２、及び細胞表面標的ＧＣ１８２、ＧＴ４６８、又はＧＴ５１２である。

【0179】

いくつかの実施形態において、抗原は、免疫チェックポイント分子である。免疫チェックポイントは、免疫系のレギュレーターである。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－Ｈ３、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、又はＣＤ４０である。いくつかの実施形態において、抗原は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ－３）、Ｂ及びＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、Ｉｇドメイン及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、グルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、又はＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４若しくはＯＸ４０）である。

【0180】

修飾において使用することができる治療用抗体の例は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ、ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（例えば、米国特許第５，７３６，１３７号明細書を参照されたい）、非ホジキンリンパ腫を治療するために承認されたキメラ抗ＣＤ２０抗体；ＨｕＭａｘ－ＣＤ２０、Ｇｅｎｍａｂによって現在開発されている抗ＣＤ２０、米国特許第５，５００，３６２号明細書において記載される抗ＣＤ２０抗体、ＡＭＥ－１３３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、ｈＡ２０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ＨｕｍａＬＹＭ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）、及びＰＲＯ７０７６９（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（例えば米国特許第５，６７７，１７１号明細書を参照されたい）、乳癌を治療するために承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって現在開発されているペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ－２Ｃ４、Ｏｍｎｉｔａｒｇ）；米国特許第４，７５３，８９４号明細書において記載される抗Ｈｅｒ２抗体；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）（米国特許第４，９４３，５３３号明細書；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０２１０）、いろいろな癌について治験中のキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；Ａｂｇｅｎｉｘ－Ｉｍｍｕｎｅｘ－Ａｍｇｅｎによって現在開発されているＡＢＸ－ＥＧＦ（米国特許第６，２３５，８８３号明細書）；Ｇｅｎｍａｂによって現在開発されているＨｕＭａｘ－ＥＧＦｒ（米国特許第７，２４７，３０１号明細書）；４２５、ＥＭＤ５５９００、ＥＭＤ６２０００、及びＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）（米国特許第５，５５８，８６４号明細書；Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５２（２）：５４９－６０；Ｒｏｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５（４）：３１５－２０；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３－８３）；ＩＣＲ６２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２００４５；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２（１－３）：１２９－４６；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６７（２）：２４７－５３；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３（２）：２２８－３５；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０５（２）：２７３－８０）；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈＲ３（ＹＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎａｄａ及びＣｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｃｕｂａ（米国特許第５，８９１，９９６号明細書；米国特許第６，５０６，８８３号明細書；Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．３（１）：７１－８１）；ｍＡｂ－８０６（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ－Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）（Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（２）：６３９－４４）；ＫＳＢ－１０２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）；ＭＲ１－１（ＩＶＡＸ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１６２９３１）；並びにＳＣ１００（Ｓｃａｎｃｅｌｌ）（ＰＣＴ ＷＯ０１／８８１３８）；アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病の治療のために現在承認されているヒト化ｍＡｂ；ムロモナブ－ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３）、Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆Ｊｏｈｎｓｏｎによって開発された抗ＣＤ３抗体、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ）、ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧによって開発された抗ＣＤ２０抗体、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈによって開発された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ）、Ｂｉｏｇｅｎによって開発された抗ＬＦＡ－３ Ｆｃ融合物）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｌｉｌｌｙによって開発されたアブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発されたバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発されたパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、Ａｂｂｏｔｔによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体、Ｈｕｍｉｃａｄｅ、Ｃｅｌｌｔｅｃｈによって開発された抗ＴＮＦアルファ抗体、ゴリムマブ（ＣＮＴＯ－１４８）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された完全ヒトＴＮＦ抗体、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、Ｉｍｍｕｎｅｘ／Ａｍｇｅｎによって開発されたｐ７５ ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物、レネルセプト、Ｒｏｃｈｅによって以前に開発されたｐ５５ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物、ＡＢＸ－ＣＢＬ、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発されている抗ＣＤ１４７抗体、ＡＢＸ－ＩＬ８、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発されている抗ＩＬ８抗体、ＡＢＸ－ＭＡ１、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発されている抗ＭＵＣ１８抗体、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（Ｒ１５４９、９０Ｙ－ｍｕＨＭＦＧ１）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中の抗ＭＵＣ１、Ｔｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されている抗ＭＵＣ１抗体、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されているＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されているＨｕＢＣ－１、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発されているチオプラチン（Ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ）（ＡＳ１４０７）、Ａｎｔｅｇｒｅｎ（ナタリズマブ）、Ｂｉｏｇｅｎによって開発されている抗－アルファ－４－ベータ－１（ＶＬＡ－４）及びアルファ－４－ベータ－７抗体、ＶＬＡ－１ ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによって開発されている抗ＶＬＡ－１インテグリン抗体、ＬＴＢＲ ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによって開発されている抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体、ＣＡＴ－１５２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発されている抗ＴＧＦ－．ベータ．２抗体、ＡＢＴ ８７４（Ｊ６９５）、Ａｂｂｏｔｔによって開発されている抗ＩＬ－１２ ｐ４０抗体、ＣＡＴ－１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＧｅｎｚｙｍｅによって開発されている抗ＴＧＦ．ベータ．１抗体、ＣＡＴ－２１３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発されている抗エオタキシン１抗体、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ－Ｂ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．によって開発されている抗Ｂｌｙｓ抗体、ＴＲＡＩＬ－ＲｌｍＡｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によって開発されている抗ＴＲＡＩＬ－Ｒ１抗体、アバスチンベバシズマブ、ｒｈｕＭＡｂ－ＶＥＧＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されている抗ＶＥＧＦ抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されている抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、抗組織因子（ＡＴＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されている抗組織因子抗体、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されている抗ＩｇＥ抗体、Ｒａｐｔｉｖａ（エファリズマブ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＸｏｍａによって開発されている抗ＣＤ１１ａ抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＭｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されているＭＬＮ－０２抗体（かつてはＬＤＰ－０２）、ＨｕＭａｘ ＣＤ４、Ｇｅｎｍａｂによって開発されている抗ＣＤ４抗体、ＨｕＭａｘ－ＩＬ１５、Ｇｅｎｍａｂ及びＡｍｇｅｎによって開発されている抗ＩＬ１５抗体、Ｇｅｎｍａｂ及びＭｅｄａｒｅｘによって開発されているＨｕＭａｘ－Ｉｎｆｌａｍ、ＨｕＭａｘ－Ｃａｎｃｅｒ、Ｇｅｎｍａｂ及びＭｅｄａｒｅｘ及びＯｘｆｏｒｄ ＧｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって開発されている抗ヘパラナーゼＩ抗体、Ｇｅｎｍａｂ及びＡｍｇｅｎによって開発されているＨｕＭａｘ－Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｇｅｎｍａｂによって開発されているＨｕＭａｘ－ＴＡＣ、ＩＤＥＣ－１３１、並びにＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ＩＤＥＣ－１５１（クレノリキシマブ）、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗ＣＤ４抗体、ＩＤＥＣ－１１４、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗ＣＤ８０抗体、ＩＤＥＣ－１５２、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗ＣＤ２３、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されている抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体、ＢＥＣ２、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発されている抗イディオタイプ抗体、ＩＭＣ－１Ｃ１１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発されている抗ＫＤＲ抗体、ＤＣ１０１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発されている抗ｆｌｋ－１抗体、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発されている抗ＶＥカドヘリン抗体、ＣＥＡ－Ｃｉｄｅ（ラベツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されている抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（エピラツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されている抗ＣＤ２２抗体、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されているＡＦＰ－Ｃｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されているＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されているＬｋｏＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されているＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ、ＭＤＸ－０１０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発されている抗ＣＴＬＡ４抗体、ＭＤＸ－０６０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発されている抗ＣＤ３０抗体、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発されているＭＤＸ－０７０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発されているＭＤＸ－０１８、Ｏｓｉｄｅｍ（ＩＤＭ－１）、並びにＭｅｄａｒｅｘ及びＩｍｍｕｎｏ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓによって開発されている抗Ｈｅｒ２抗体、ＨｕＭａｘ－ＣＤ４、Ｍｅｄａｒｅｘ及びＧｅｎｍａｂによって開発されている抗ＣＤ４抗体、ＨｕＭａｘ－ＩＬ１５、Ｍｅｄａｒｅｘ及びＧｅｎｍａｂによって開発されている抗ＩＬ１５抗体、ＣＮＴＯ １４８、Ｍｅｄａｒｅｘ及びＣｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発されている抗ＴＮＦ．アルファ．抗体、ＣＮＴＯ １２７５、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊ、ＭＯＲ１０１、及びＭＯＲ１０２によって開発されている抗サイトカイン抗体、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発されている抗細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）（ＣＤ５４）抗体、ＭＯＲ２０１、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発されている抗線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ－３）抗体、Ｎｕｖｉｏｎ（ビジリズマブ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発されている抗ＣＤ３抗体、ＨｕＺＡＦ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発されている抗ガンマインターフェロン抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発されている抗α５β１インテグリン、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓによって開発されている抗ＩＬ－１２、ＩＮＧ－１、Ｘｏｍａによって開発されている抗Ｅｐ－ＣＡＭ抗体、Ｘｏｌａｉｒ（オマリズマブ） Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＮｏｖａｒｔｉｓによって開発されたヒト化抗ＩｇＥ抗体、並びにＭＬＮ０１、Ｘｏｍａによって開発されている抗ベータ２インテグリン抗体を含むが、これらに限定されない。別の実施形態において、治療薬は、ＫＲＮ３３０
（Ｋｉｒｉｎ）；ｈｕＡ３３抗体（Ａ３３、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；ＣＮＴＯ ９５（アルファＶインテグリン、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ＭＥＤＩ－５２２（アルファＶ．ベータ．３インテグリン、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；ボロシキシマブ（アルファＶ．ベータ．１インテグリン、Ｂｉｏｇｅｎ／ＰＤＬ）；ヒトｍＡｂ ２１６（Ｂ細胞グリコシル化エピトープ、ＮＣＩ）；ＢｉＴＥ ＭＴ１０３（二重特異性ＣＤ１９ ＣＤ３、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；４Ｇ７ Ｈ２２（二重特異性Ｂ細胞×ＦｃガンマＲ１、Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｍｅｒｃｋ ＫＧａ）；ｒＭ２８（二重特異性ＣＤ２８×ＭＡＰＧ、欧州特許番号ＥＰ１４４４２６８）；ＭＤＸ４４７（ＥＭＤ ８２６３３）（二重特異性ＣＤ６４ ＥＧＦＲ、Ｍｅｄａｒｅｘ）；カツマキソマブ（ｒｅｍｏｖａｂ）（二重特異性ＥｐＣＡＭ抗ＣＤ３、Ｔｒｉｏｎ／Ｆｒｅｓ）；エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ）（ＣＡ－１２５、ＶｉＲｅｘｘ）；Ｒｅｎｃａｒｅｘ（ＷＸ Ｇ２５０）（カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、Ｗｉｌｅｘ）；ＣＮＴＯ ８８８（ＣＣＬ２、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ＴＲＣ１０５（ＣＤ１０５（エンドグリン）、Ｔｒａｃｏｎ）；ＢＭＳ－６６３５１３（ＣＤ１３７アゴニスト、Ｂｒｙｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ＭＤＸ－１３４２（ＣＤ１９、Ｍｅｄａｒｅｘ）；シプリズマブ（ＭＥＤＩ－５０７）（ＣＤ２、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；オファツムマブ（Ｈｕｍａｘ－ＣＤ２０）（ＣＤ２０、Ｇｅｎｍａｂ）；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）（ＣＤ２０、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ベルツズマブ（ｈＡ２０）（ＣＤ２０、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；エピラツズマブ（ＣＤ２２、Ａｍｇｅｎ）；ルミリキシマブ（ＩＤＥＣ １５２）（ＣＤ２３、Ｂｉｏｇｅｎ）；ムロモナブ－ＣＤ３（ＣＤ３、Ｏｒｔｈｏ）；ＨｕＭ２９１（ＣＤ３ ｆｃ受容体、ＰＤＬ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）；ＨｅＦｉ－１、ＣＤ３０、ＮＣＩ）；ＭＤＸ－０６０（ＣＤ３０、Ｍｅｄａｒｅｘ）；ＭＤＸ－１４０１（ＣＤ３０、Ｍｅｄａｒｅｘ）；ＳＧＮ－３０（ＣＤ３０、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｎｔｉｃｓ）；ＳＧＮ－３３（リンツズマブ）（ＣＤ３３、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｎｔｉｃｓ）；ザノリムマブ（ＨｕＭａｘ－ＣＤ４）（ＣＤ４、Ｇｅｎｍａｂ）；ＨＣＤ１２２（ＣＤ４０、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＳＧＮ－４０（ＣＤ４０、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｎｔｉｃｓ）；Ｃａｍｐａｔｈｌｈ（アレムツズマブ）（ＣＤ５２、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；ＭＤＸ－１４１１（ＣＤ７０、Ｍｅｄａｒｅｘ）；ｈＬＬ１（ＥＰＢ－１）（ＣＤ７４．３８、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ガリキシマブ（ＩＤＥＣ－１４４）（ＣＤ８０、Ｂｉｏｇｅｎ）；ＭＴ２９３（ＴＲＣ０９３／Ｄ９３）（切断コラーゲン、Ｔｒａｃｏｎ）；ＨｕＬｕｃ６３（ＣＳ１、ＰＤＬ Ｐｈａｒｍａ）；イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）（ＣＴＬＡ４、Ｂｒｙｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；トレメリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ、ＣＰ－６７５、２）（ＣＴＬＡ４、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＨＧＳ－ＥＴＲ１（マパツズマブ）（ＤＲ４ ＴＲＡＩＬ－Ｒ１アゴニスト、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）；ＡＭＧ－６５５（ＤＲ５、Ａｍｇｅｎ）；Ａｐｏｍａｂ（ＤＲ５、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；Ｃｓ－１００８（ＤＲ５、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）；ＨＧＳ－ＥＴＲ２（レクサツムマブ）（ＤＲ５ ＴＲＡＩＬ－Ｒ２アゴニスト、ＨＧＳ）；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（ＥＧＦＲ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＩＭＣ－１１Ｆ８、（ＥＧＦＲ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ニモツズマブ（ＥＧＦＲ、ＹＭ Ｂｉｏ）；パニツムマブ（Ｖｅｃｔａｂｉｘ）（ＥＧＦＲ、Ａｍｇｅｎ）；ザルツムマブ（ＨｕＭａｘＥＧＦｒ）（ＥＧＦＲ、Ｇｅｎｍａｂ）；ＣＤＸ－１１０（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＡＶＡＮＴ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）（ＭＴ２０１）（Ｅｐｃａｍ、Ｍｅｒｃｋ）；エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ、１７－１Ａ）（Ｅｐｃａｍ、Ｇｌａｘｏ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ＭＯＲＡｂ－００３（葉酸受容体ａ、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｃｈ）；ＫＷ－２８７１（ガングリオシドＧＤ３、Ｋｙｏｗａ）；ＭＯＲＡｂ－００９（ＧＰ－９、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｃｈ）；ＣＤＸ－１３０７（ＭＤＸ－１３０７）（ｈＣＧｂ、Ｃｅｌｌｄｅｘ）；トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（ＨＥＲ２、Ｃｅｌｌｄｅｘ）；ペルツズマブ（ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４）（ＨＥＲ２（ＤＩ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；アポリズマブ（ＨＬＡ－ＤＲベータ鎖、ＰＤＬ Ｐｈａｒｍａ）；ＡＭＧ－４７９（ＩＧＦ－１Ｒ、Ａｍｇｅｎ）；抗ＩＧＦ－１Ｒ Ｒ１５０７（ＩＧＦ１－Ｒ、Ｒｏｃｈｅ）；ＣＰ ７５１８７１（ＩＧＦ－Ｒ、Ｐｆｉｚｅｒ）；ＩＭＣ－Ａ１２（ＩＧＦ１－Ｒ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＢＩＩＢ０２２（ＩＧＦ－１Ｒ、Ｂｉｏｇｅｎ）；Ｍｉｋ－ベータ－１（ＩＬ－２Ｒｂ（ＣＤ１２２）、Ｈｏｆｆｍａｎ ＬａＲｏｃｈｅ）；ＣＮＴＯ ３２８（ＩＬ６、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；抗ＫＩＲ（１－７Ｆ９）（キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）、Ｎｏｖｏ）；Ｈｕ３Ｓ１９３（Ｌｅｗｉｓ（ｙ）、Ｗｙｅｔｈ、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；ｈＣＢＥ－１１（ＬＴＢＲ、Ｂｉｏｇｅｎ）；ＨｕＨＭＦＧ１（ＭＵＣ１、Ａｎｔｉｓｏｍａ／ＮＣＩ）；ＲＡＶ１２（Ｎ結合型炭水化物エピトープ、Ｒａｖｅｎ）；ＣＡＬ（副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨ－ｒＰ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＣＴ－０１１（ＰＤ１、ＣｕｒｅＴｅｃｈ）；ＭＤＸ－１１０６（ｏｎｏ－４５３８）（ＰＤ１、Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｏｎｏ）；ＭＡｂ ＣＴ－０１１（ＰＤ１、Ｃｕｒｅｔｅｃｈ）；ＩＭＣ－３Ｇ３（ＰＤＧＦＲａ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；バビツキシマブ（ホスファチジルセリン、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）；ｈｕＪ５９１（ＰＳＭＡ、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）；ｍｕＪ５９１（ＰＳＭＡ、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）；ＧＣ１００８（ＴＧＦｂ（ｐａｎ）阻害剤（ＩｇＧ４）、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（ＴＮＦ．アルファ．、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；Ａ２７．１５（トランスフェリン受容体、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＩＮＳＥＲＮ 国際公開第２００５／１１１０８２号パンフレット）；Ｅ２．３（トランスフェリン受容体、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）（ＶＥＧＦ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＨｕＭＶ８３３（ＶＥＧＦ、Ｔｓｕｋｕｂａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０００／０３４３３７、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ）；ＩＭＣ－１８Ｆ１（ＶＥＧＦＲ１、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＩＭＣ－１１２１（ＶＥＧＦＲ２、Ｉｍｃｌｏｎｅ）を含む。これらの抗体の多くは、例えば、国際公開第２０１９０５７１２２Ａ１号パンフレットにおいて記載される。これらの参考文献は、全体が参照によって本明細書において援用される。

【0181】

いくつかの実施形態において、親免疫グロブリン又は修飾免疫グロブリンは、下記の表３において示される構成を有することができる。これらの抗体の構成についての詳細な説明は、例えば、全体が参照によって本明細書において援用されるＢｒｉｎｋｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．” ＭＡｂｓ．Ｖｏｌ．９．Ｎｏ．２．Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１７において見つけることができる。いくつかの実施形態において、親免疫グロブリン又は修飾免疫グロブリンは、図２０Ａ～２０Ｄにおいて示される構成を有することができる。

【0182】

【表3】

【0183】

抗原に対する抗体の結合親和性は、ＣＤＲによって決定される。ＣＤＲは、免疫グロブリン（抗体）及びＴ細胞受容体における可変鎖の一部である。抗体のアミノ酸配列を解析することによって抗体のＣＤＲ領域を同定する方法は、よく知られており、ＣＤＲについての多くの定義が、一般的に使用されている。Ｋａｂａｔの定義は、配列の可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造のループ領域の位置に基づく。これらの方法及び定義は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ，” Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００１．４２２－４３９；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｋａｂａｔ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｃｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ，” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５．１４（２００８）：３８３２－３８３９；Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（１９７０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１－２５０；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１－５３（１９９１）；Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．６８（１－３）：９－１６（Ｏｃｔ．１９９７）；Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２７５（２）：２６９－９４（Ｊａｎ ．１９９８）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２５２）：８７７－８３（Ｄｅｃ．１９８９）；Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：６４（２００７）において記載されており、これらのそれぞれは、全体が参照によって本明細書において援用される。

【0184】

ＣＤＲは、抗原のエピトープの認識にとって重要である。本明細書において使用されるように、「エピトープ」は、抗体の抗原結合ドメインが特異的に結合することが可能な標的分子の最も小さな部分である。エピトープの最小サイズは、約３、４、５、６、又は７アミノ酸であってもよいが、これらのアミノ酸は、抗原の一次構造の連続する直線状の配列中にある必要はなく、エピトープは、抗原の二次構造及び三次構造に基づく抗原の３次元立体配置に依存してもよい。

【0185】

非天然ポリペプチドは、種々の修飾免疫グロブリン、抗体、抗体様の分子、又はＩｇＧ様の分子に、これらの分子が重鎖ＣＨ３ドメインを有する限り、融合することができる。

【0186】

いくつかの実施形態において、抗体は、多重特異性抗体である。抗体の多量体化は、抗体の自然の凝集を通して又は当技術分野において知られている化学的技術若しくは組換え連結技術を通して実現されてもよい。例えば、精製された抗体調製物（例えば、精製されたＩｇＧ１分子）の若干のパーセンテージは、抗体ホモ二量体及び他のさらに高次の抗体多量体を含有するタンパク質凝集体を自発的に形成する。

【0187】

いくつかの実施形態において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするために一対の抗体分子の間の境界面を操作することによって作製することができる。例えば、境界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含有することができる。この方法において、第１の抗体分子の境界面の１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。この大きな側鎖と等しい又は同様のサイズの、埋め合わせとなる「くぼみ」が、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２の抗体分子の境界面に作られる。これは、ホモ二量体などの他の不用な最終産物に対して、ヘテロ二量体の収量を増加させるメカニズムを提供する。この方法は、例えば、全体が参照によって援用される国際公開第９６／２７０１１号パンフレットにおいて記載される。修飾はＦｃ領域に対してなされるが、本開示はまた、修飾がノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ）と相容れるものがあることをも示す。「ノブ・イン・ホール」アプローチは、一方の重鎖における大きな側鎖を有するアミノ酸に対する突然変異及び他方の重鎖における小さな側鎖を有するアミノ酸に対する突然変異を導入する。したがって、同じ重鎖は、互いに結びつく可能性が低く、２つの異なる重鎖は、互いに結びつく見込みが高い。「ノブ・イン・ホール」アプローチは、例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊｏｈｎ ＢＢ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｇ．Ｐｒｅｓｔａ，ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｃａｒｔｅｒ．“‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ９．７（１９９６）において記載され、これは、全体が参照によって本明細書において援用される。いくつかの実施形態において、ＩｇＧのＣＨ３ドメインにおける１つ以上のアミノ酸残基は、置換される。いくつかの実施形態において、一方の重鎖は、以下の置換Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗの１つ以上を有する。他方の重鎖は、以下の置換Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖの１つ以上を有することができる。いくつかの実施形態において、一方の重鎖は、Ｔ３６６Ｙ（ノブ）置換を有し、他方の重鎖は、Ｙ４０７Ｔ（ホール）置換を有する。いくつかの実施形態において、一方の重鎖は、Ｔ３６６Ｙ（ノブ）置換を有し、他方の重鎖は、これらの置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（ホール）のうちの１つ、２つ、又は３つを有する。

【0188】

いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、ＤＶＤ－Ｉｇ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＢｉＴＥ等の構成を有する。これらの構成は、例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７．２（２０１５）：９５－１０６において記載されており、これは、全体が参照によって本明細書において援用される。ある実施形態において、本明細書において提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、Ｔｒｉｏｍａｂ；ハイブリッドハイブリドーマ（クアドローマ）；多重特異性ａｎｔｉｃａｌｉｎプラットフォーム（Ｐｉｅｒｉｓ）；ダイアボディ；単鎖ダイアボディ；タンデム型単鎖Ｆｖ断片；ＴａｎｄＡｂ、三重特異性Ａｂ；Ｄａｒｔ（デュアルアフィニティーリターゲティング（ｄｕａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）；Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）；二重特異性Ｘｍａｂ（Ｘｅｎｃｏｒ）；二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）（Ｂｉｔｅ；Ａｍｇｅｎ；５５ｋＤａ）；トリプルボディ（Ｔｒｉｐｌｅｂｏｄｙ）；Ｔｒｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）融合タンパク質（ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏｌａｂｓ）多機能組換え抗体誘導体；Ｄｕｏｂｏｄｙプラットフォーム（Ｇｅｎｍａｂ）；Ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋプラットフォーム；ヒト化二重特異性ＩｇＧ抗体（ＲＥＧＮ１９７９）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；Ｍａｂ２二重特異性抗体（Ｆ－Ｓｔａｒ）；ＤＶＤ－Ｉｇ（デュアル可変ドメイン免疫グロブリン）（Ａｂｂｖｉｅ）；カッパ－ラムダボディ；ＴＢＴＩ（四価二重特異性タンデム型Ｉｇ）；及びＣｒｏｓｓＭａｂから選択される二重特異性の構成に基づく。ある実施形態において、本明細書において提供される二重特異性ポリペプチド複合体は、全ＩｇＧ又はＩｇＧ様の分子などの「全」抗体の構成並びにタンデム型単鎖可変断片分子（ｔａＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｂ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、及びこれらの種々の他の誘導体並びにＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）などの小さな組換えの構成に基づく。

【0189】

「ＭＡｂ－Ｆｖ」又は「ＩｇＧ－Ｆｖ」は、一方のＦｃ鎖のＣ末端へのＶＨの融合及び別々に発現された又は他方のＣ末端に融合されたＶＬドメインによって形成され、二重特異性三価ＩｇＧ－Ｆｖ（ｍＡｂ－Ｆｖ）融合タンパク質をもたらし、Ｆｖは、ドメイン間ジスルフィド結合によって安定化されている融合タンパク質を指す。

【0190】

「ＳｃＦａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ２」及び「ＳｃＦａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ」は、Ｆｃ及びジスルフィド安定化Ｆｖドメインとの単鎖Ｆａｂの融合によって形成される融合タンパク質を指す。

【0191】

「付加型ＩｇＧ」は、二重特異性（Ｆａｂ）２－Ｆｃの構成を形成するように、ＦａｂアームがＩｇＧに融合された融合タンパク質を指す。これにより、Ｆａｂが、コネクターあり又はなしでＩｇＧ分子のＣ末端又はＮ末端に融合された「ＩｇＧ－Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ－ＩｇＧ」を形成することができる。

【0192】

「ＤＶＤ－Ｉｇ」は、ＩｇＧ重鎖及び軽鎖への、第２の特異性を持つ追加のＶＨドメイン及びＶＬドメインの融合によって形成されるデュアル可変ドメイン抗体を指す。「ＣＯＤＶ－Ｉｇ」は、２つのＶＨ及び２つのＶＬドメインが、可変ＶＨ－ＶＬドメインの対合の入れ換えを可能にする方法で連結され、ＶＨ Ａ－ＶＨ Ｂ及びＶＬ Ｂ－ＶＬ Ａの順に又はＨＶ Ｂ－ＨＶ Ａ及びＶＬ Ａ－ＶＬ Ｂの順に並べられた（Ｎ末端からＣ末端に）、関連する構成を指す。

【0193】

「ＣｒｏｓｓＭａｂ」は、無修飾軽鎖の対応する無修飾重鎖との対合及び修飾軽鎖の対応する修飾重鎖との対合の技術を指し、したがって、軽鎖における誤対合が低下した抗体がもたらされる。

【0194】

「ＢｉＴＥ」は、ＶＨ－ＶＬの配向をした第２の特異性を有する第２のｓｃＦｖに連結されたＶＬ－ＶＬの配向をした第１の抗原特異性を有する第１のｓｃＦｖを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子である。

【0195】

本開示の修飾免疫グロブリンはまた、所望のエフェクター機能又は血清半減期を提供するために、Ｆｃ領域において修飾することもできる。

【0196】

本明細書において記載される抗体又は抗原結合断片のいずれも、安定化分子（例えば、対象における又は溶液における修飾免疫グロブリンの半減期を増加させる分子）に抱合することができる。安定化分子の非限定的な例は、以下を含む：ポリマー（例えばポリエチレングリコール）又はタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン）。安定化分子の抱合は、インビトロにおいて（例えば、組織培養において若しくは医薬組成物として保存された場合に）又はインビボにおいて（例えば、ヒトにおいて）、抗体又は抗原結合断片の半減期を増加させることができる又は生物学的活性を延長することができる。

【0197】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される抗体又は抗原結合断片は、治療剤に抱合することができる。修飾免疫グロブリンを含む抗体－薬剤抱合体は、治療剤に共有結合で又は非共有結合で結合することができる。いくつかの実施形態において、治療剤は、細胞傷害性の又は細胞増殖抑制性の作用物質（例えば、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、ＤＭ－１及びＤＭ－４などのマイタンシノイド、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、並びにシクロホスファミド並びに類似体）である。

【0198】

いくつかの実施形態において、治療剤は、本明細書において記載されるように、非天然ポリペプチドに連結することができる。例えば、１つ以上の治療剤は、非天然ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸（例えば側鎖）に共有結合で連結することができる（例えば、本明細書において記載されるように、様々な融合部位に融合することができる）。

【0199】

一態様において、少なくとも１、２、３、４、５、又は６つのポリペプチドは、修飾免疫グロブリンに融合される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基の修飾免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、重鎖ＣＨ３ドメインの１つのアミノ酸残基に融合される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、重鎖ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基に融合される。

【0200】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、多重特異性抗原結合タンパク質に追加することができる。いくつかの実施形態において、多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）は、以下を含み：（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第１の抗原結合部分、ＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する並びに（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む第２の抗原結合部分、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される。いくつかの実施形態において、ＭＡＢＰは、それぞれｓｄＡｂを含む１、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上の異なる抗原結合部分のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、２つの同一のｓｄＡｂは、互いに融合され、ｓｄＡｂは、第１の抗原結合部分にさらに融合される。いくつかの実施形態において、２つの異なるｓｄＡｂは、互いに融合され、ｓｄＡｂは、第１の抗原結合部分にさらに融合される。いくつかの実施形態において、以下を含む多重特異性（二重特異性など）抗原結合タンパク質が、提供され：（ａ）それぞれ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第１の抗原結合部分の２つの複製物、ＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する並びに（ｂ）第２のエピトープに特異的に結合するｓｄＡｂを含む第２の抗原結合部分の単一の複製物、第２の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分の２つの複製物のうちの１つに融合される。いくつかの実施形態において、以下を含む多重特異性（二重特異性など）抗原結合タンパク質が、提供され：（ａ）それぞれ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む第１の抗原結合部分の２つの複製物、ＶＨ及びＶＬは、第１のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を一緒に形成する並びに（ｂ）第１のエピトープと異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する、複数の（２、３、又は４つなど）同一の又は異なるｓｄＡｂ、ｓｄＡｂは、互いに及び／又は第１の抗原結合部分に融合される。種々の多重特異性抗原結合タンパク質は、国際公開第２０１８０１４８５５Ａ１号パンフレットにおいて記載され、これは、全体が参照によって本明細書において援用される。

【0201】

図２０Ａ～２０Ｄは、いくつかの例証的な免疫グロブリンの構成をさらに提供する。図２０Ａにおいて示されるように、ＨＣの構成において、非天然ポリペプチドは、抗体の重鎖のＣ末端に連結される。対照的に、ＬＣの構成において、非天然ポリペプチドは、抗体の軽鎖のＣ末端に連結される。ＨＣの構成を有する修飾免疫グロブリンの例は、実施例２におけるＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＨＣ、実施例６におけるＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－ＨＣ、実施例７及び９におけるＭ７８２４；並びに実施例２３における１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４を含む。ＬＣの構成を有する修飾免疫グロブリンの例は、実施例２におけるＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＬＣを含む。

【0202】

３Ａは、非天然ポリペプチドが抗体の３Ａ部位に融合されることを示す。ＦＶ３Ａは、融合された非天然ポリペプチドがｓｃＦｖであることを示す。３Ａ－ＨＣの構成において、機能ポリペプチドは、３Ａの構成の重鎖のＣ末端にさらに連結される。３Ａの構成を有する修飾免疫グロブリンの例は、実施例３におけるＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ；実施例５における３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ；実施例６における３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ；実施例７、９、及び１１におけるＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ；実施例９及び１１におけるＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ－ＩｇＧ４；実施例９におけるＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＦ１；実施例１２及び１３におけるＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ；実施例１２及び１３におけるＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＩｇＧ４；実施例１２におけるＰＤ１－ＫＮ０３５－３Ａ－ＩｇＧ１；実施例１２におけるＰＤ１－ＫＮ０３５－３Ａ；並びに実施例１６における３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａを含む。ＦＶ３Ａの構成を有する修飾免疫グロブリンの例は、実施例８及び１０におけるＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ；実施例８及び１０におけるＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４；実施例８及び１２におけるＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ１；並びに実施例２３における１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４を含む。３Ａ－ＨＣの構成を有する修飾免疫グロブリンの例は、実施例３におけるＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４；実施例５における３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４；実施例６における３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４；実施例１３におけるＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＴＧＦｂＲ２；並びに実施例１７における３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４を含む。

【0203】

Ｆａｂ－サイトカイン－ＫＩＨの構成において、重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、サイトカインによって置き換えられる。ＫＩＨは、ノブ－イン－ホール修飾が２つの重鎖に追加されていることを示す。Ｆａｂ－サイトカイン－ＫＩＨの構成を有する修飾免疫グロブリンの例は、実施例２におけるＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－ＫＩＨを含む。

【0204】

同様に、Ｆａｂ－ｈａｌｆ－３Ａ－ＫＩＨの構成において、重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、除去される。非天然ポリペプチドは、抗体の３Ａ部位に融合される。Ｆａｂ－ｈａｌｆ－３Ａ－ＫＩＨの構成を有する修飾免疫グロブリンの例は、実施例４におけるＰＤＬ１－ｍＩＬ７－Ｆａｂ－ｈａｌｆ－３Ａ－ＫＩＨを含む。

【0205】

３Ａ－ｈｏｌｅの構成において、非天然ポリペプチドは、ホール修飾を有する重鎖の３Ａ部位に融合される。対照的に、３Ａ－ｋｎｏｂの構成において、非天然ポリペプチドは、ノブ修飾を有する重鎖の３Ａ部位に融合される。３Ａ－ｈｏｌｅの構成を有する修飾免疫グロブリンの例は、実施例４におけるＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｈｏｌｅ；及び実施例１２におけるＣＴ４－ＫＮ０３５－３Ａ－ｈｏｌｅを含む。３Ａ－ｋｎｏｂの構成を有する修飾免疫グロブリンの例は、実施例４におけるＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｋｎｏｂ；及び実施例１２におけるＣＴ４－ＫＮ０３５－３Ａ－ｋｎｏｂを含む。これらの構成は、互いに及び本明細書において記載される種々の修飾と組み合わせることができる。

【0206】

３Ａ－ＨＣの構成は、１、２、３、４、５、又は６つの抗原結合部位（すなわち、第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の抗原結合部位）を有することができる。いくつかの実施形態において、抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合部位は、ＶＨＨを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合部位は、本明細書において記載される抗体又はその抗原結合断片（例えばｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の抗原結合部位は、同じ抗原を標的とする。いくつかの実施形態において、第１及び第２の抗原結合部位は、異なる抗原を標的とする。いくつかの実施形態において、第３及び第４の抗原結合部位は、同じ抗原を標的とする。いくつかの実施形態において、第３及び第４の抗原結合部位は、異なる抗原を標的とする。いくつかの実施形態において、第５及び第６の抗原結合部位は、同じ抗原を標的とする。いくつかの実施形態において、第５及び第６の抗原結合部位は、異なる抗原を標的とする。いくつかの実施形態において、構成は、図２０Ｃにおいて示される。

【0207】

いくつかの実施形態において、３Ａ－ＨＣの構成は、２つの重鎖の３Ａ部位に融合される２つの非天然ポリペプチド（例えば、それぞれ、Ｅ及びＦを標的とする）；並びに２つの重鎖のＣ末端に融合される２つの非天然ポリペプチド（例えば、それぞれ、Ｇ及びＨを標的とする）を有することができる。３Ａ－ＨＣの構成はまた、Ａを標的とする第１の抗原結合部位及びＢを標的とする第２の抗原結合部位を有することもできる。加えて、３Ａ－ＨＣの構成は、２つの軽鎖のＣ末端に融合される２つの非天然ポリペプチド（例えば、それぞれ、Ｃ及びＤを標的とする）を有することができる。Ｋを標的とするＦａｂドメインもまた、３Ａ－ＨＣにおいて、抗原結合部位の１つに融合することができる。図２０Ｂは、例証的な免疫グロブリンの構成を提供する。

【0208】

いくつかの実施形態において、１つ又は２つの非天然ポリペプチドは、変異体Ｆｃの３Ａ部位に融合することができる。図２０Ｄは、本明細書において記載されるように変異体Ｆｃを含むタンパク質の例証的な構成を提供する。

【0209】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される修飾免疫グロブリンは、二重特異性抗体、例えば、ＰＤ－１及びＣＤ４０を標的とする二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、３Ａの構成を有する二重特異性抗体（例えば１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４）の毒性は、ＨＣの構成を有する対応する二重特異性抗体（例えば１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４）と比較して、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、又は１０％未満である。いくつかの実施形態において、毒性は、血液生化学的試験（例えば、ＡＬＴ及び／若しくはＡＳＴレベルを測定することによって）又は肝臓の病理組織学的検査によって判定される。

【0210】

融合ポリペプチド
種々のポリペプチドは、修飾免疫グロブリンに融合することができる。ポリペプチドは、本明細書において記載される任意の部位（例えば、重鎖の３Ａ部位及び／又はＣ末端）に融合することができる。本開示において示されるように、ポリペプチドがＦｃ領域に融合された後に、融合ポリペプチドは、適した立体構造の形をとることができ、その生物活性を維持することができる。

【0211】

本明細書において使用されるように、本開示における用語「融合タンパク質」は、ペプチドのそれらのそれぞれの主鎖を介して共有結合によって連結される２つ以上のタンパク質又はその断片を含む分子を指し、より好ましくは、融合タンパク質は、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現によって生成される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質である。

【0212】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、融合タンパク質、酵素、可溶性タンパク質、構造タンパク質、転写調節タンパク質、受容体、翻訳調節タンパク質、クロマチンタンパク質、ホルモン、細胞周期調節タンパク質、Ｇタンパク質、神経活性ペプチド、免疫調節タンパク質、血液成分のタンパク質、熱ショックタンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、抗生物質耐性タンパク質、タンパク質のいずれか１つの機能的断片、タンパク質のいずれか１つのエピトープ断片、及びその任意の組み合わせである。

【0213】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合断片（例えばｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、通常、１つ重鎖可変ドメイン及び１つ軽鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、２つの重鎖可変ドメイン及び２つの軽鎖可変ドメインを有する。

【0214】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）としても知られている単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。全抗体の様に、単一ドメイン抗体は、特異抗原に選択的に結合することができる。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ラクダ科の動物において見つけられる重鎖抗体を操作したものであり、ＶＨＨ断片と呼ばれる。本明細書において使用されるように、「ＶＨＨ」は、重鎖のみの抗体の抗原結合断片を指す。

【0215】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、サイトカインである。本明細書において使用されるように、用語「サイトカイン」は、任意のタンパク質又はペプチド、その類似体又は機能的断片を指し、これは、哺乳類において、前もって選ばれた細胞型、例えば、癌細胞又はウイルス感染した細胞に対する細胞破壊性の免疫応答を刺激する又は誘発することが可能である。したがって、いろいろなサイトカインを、本明細書において記載される部位でＦｃに融合することができることが想定される。有用なサイトカインは、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、リンホカイン（Ｌ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）を含み、そのような細胞破壊性の免疫応答を刺激する又は誘発することが可能であるその種変異体、切断型類似体を含む。有用な腫瘍壊死因子は、例えば、ＴＮＦを含む。有用なリンホカインは、例えば、ＬＴを含む。有用なコロニー刺激因子は、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ及びＭ－ＣＳＦを含む。有用なインターロイキンは、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８を含む。有用なインターフェロンは、例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮ－γを含む。いくつかの実施形態において、インターフェロンは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－τ、ＩＦＮ－δ、ＩＦＮ－Ν、ＩＦＮ－ω、又はＩＦＮ－γである。いくつかの実施形態において、インターフェロンは、ＩＦＮａ１、ＩＦＮａ２、ＩＦＮａ４、ＩＦＮａ５、ＩＦＮａ６、ＩＦＮａ７、ＩＦＮａ８、ＩＦＮａ１０、ＩＦＮａ１３、ＩＦＮａ１４、ＩＦＮａ１６、ＩＦＮａ１７、又はＩＦＮａ２１である。いくつかの実施形態において、インターフェロンは、マウスＩＦＮａ４（ｍＩＦＮａ４）である。いくつかの実施形態において、ｍＩＦＮａ４は、配列番号１０又はＮＣＢＩ整理番号ＮＰ＿０３４６３４．１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、インターフェロンは、ヒトＩＦＮａ４（ｈＩＦＮａ４）である。いくつかの実施形態において、ｈＩＦＮａ４は、配列番号１２９又はＮＣＢＩ整理番号ＮＰ＿０６６５４６．１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。

【0216】

いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、又はＩＬ－３６である。

【0217】

いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＬ４、ＩＬ６、又はＩＬ１０である。いくつかの好ましいサイトカインは、下記の表に掲げられる。

【0218】

【表4】

【0219】

いくつかの実施形態において、サイトカインは、例えば、配列番号９３において記載される配列を有するＩＬ３（例えばヒトＩＬ３）である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、配列番号９４において記載される配列を有するＩＬ４（例えばヒトＩＬ４）である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、配列番号９５において記載される配列を有するＩＬ５（例えばヒトＩＬ５）である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、配列番号９６において記載される配列を有するＩＬ６（例えばヒトＩＬ６）である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、配列番号９７において記載される配列を有するＩＬ８（例えばヒトＩＬ８）である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、配列番号９８において記載される配列を有するＩＬ９（例えばヒトＩＬ９）である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、配列番号９９において記載される配列を有するＩＬ１３（例えばヒトＩＬ１３）である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、配列番号１００において記載される配列を有するＩＬ１５（例えばヒトＩＬ１５）である。

【0220】

したがって、いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンは、イムノサイトカインである。本明細書において使用されるように、用語「イムノサイトカイン」は、（ｉ）前もって選ばれた抗原、例えば細胞型特有の抗原に対する結合特異性を有し、それに結合することが可能である抗体結合部位及び（ｉｉ）典型的に癌又はウイルス感染した細胞に対して細胞破壊性の免疫応答を誘発する又は刺激することが可能であるサイトカインの融合物を指す。前もって選ばれた抗原の例は、癌細胞又はウイルス感染した細胞上などの細胞表面抗原及び例えば、細胞膜に付着した状態を維持し得る、壊死細胞の不溶性細胞内抗原を含む。好ましい抗原は、腫瘍特異的抗原などの、腫瘍細胞に特徴的である標的抗原である。したがって、イムノサイトカインは、サイトカインが、標的細胞に対する局所的な免疫応答を媒介することができるように、インビボにおいて、標的（典型的に細胞である）にサイトカインを選択的に送達することが可能である。

【0221】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、ＩＬ７（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０００８７１．１）、ＩＬ２１（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０６８５７５．１）、ＩＬ４（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０００５８０．１）、ＩＬ６（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０００５９１．１）、又はＩＬ１０（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０００５６３．１）の全体又は一部分（例えば可溶性部分）を含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、ＴＧＦｂＲ２（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿００３２３３．４）の可溶性領域を含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、ＴＧＦＢ１（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０００６５１．３、例えば、ＮＰ＿０００６５１．３のアミノ酸２９２～３９０）、ＡＰＲＩＬ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿００３７９９．１、例えば、ＮＰ＿００３７９９．１のアミノ酸１１５～２５０）、ＣＤ１６１（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿００２２４９．１、例えば、ＮＰ＿００２２４９．１のアミノ酸６８～２２５）、ＳＯＳＴ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０７９５１３．１、例えば、ＮＰ＿０７９５１３．１の８２～１６２）、Ｂ７Ｈ４（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０７８９０２．２、例えば、ＮＰ＿０７８９０２．２のアミノ酸２９～２５８）、ＳＩＧＬＥＣ１５（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿９９８７６７．１、例えば、ＮＰ＿９９８７６７．１のアミノ酸２０～２６３）、ＤＬＬ３（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿９８２３５３．１、例えば、ＮＰ＿９８２３５３．１のアミノ酸２７～４９２）、及び／又はＭＣＳＦＲ（ＣＳＦ１Ｒ；ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿００３７９９．１、例えば、ＮＰ＿００３７９９．１のアミノ酸２０～５１２）の可溶性部分を含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、ＴＧＦＢ１（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０００６５１．３）、ＡＰＲＩＬ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿００３７９９．１）、ＣＤ１６１（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿００２２４９．１）、ＳＯＳＴ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０７９５１３．１）、Ｂ７Ｈ４（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０７８９０２．２）、ＳＩＧＬＥＣ１５（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿９９８７６７．１）、ＤＬＬ３（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿９８２３５３．１）、及び／又はＭＣＳＦＲ（ＣＳＦ１Ｒ；ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿００３７９９．１）の全体又は一部分を含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、これらの配列と少なくとも又は約７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％同一である。

【0222】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号１４の全体又は一部分を含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号１５の全体又は一部分を含む。

【0223】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、アゴニストである。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、アンタゴニストである。

【0224】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、可変単鎖断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、本明細書において記載されるように、任意の抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ４０に特異的に結合することができ、配列番号１６の全体又は一部分を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ４０に特異的に結合することができ、配列番号１３２の全体又は一部分を含む。

【0225】

いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ４０に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号１７又は配列番号１６の全体又は一部分を含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号１３２の全体又は一部分を含む。

【0226】

いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ８６に特異的に結合する。

【0227】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、対象において免疫応答を誘発するようにデザインされている抗原である。したがって、本開示はまた、対象において抗体を誘発するための方法をも提供する。方法は、対象に修飾免疫グロブリンを、任意選択でアジュバントと共に、投与することを含む。修飾免疫グロブリンは、抗原提示細胞を特異的に標的とし（例えば、抗原提示細胞上のマーカーを標的とすることによって）、抗原提示細胞に抗原を有効に送達し、それによって、この抗原に対する抗体を産生する効率を増加させることができる。

【0228】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、少なくとも又は約５ｋＤ、６ｋＤ、７ｋＤ、８ｋＤ、９ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ、５０ｋＤ、６０ｋＤ、７０ｋＤ、８０ｋＤ、９０ｋＤ、又は１００ｋＤの分子量を有する。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、５ｋＤ、６ｋＤ、７ｋＤ、８ｋＤ、９ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ、５０ｋＤ、６０ｋＤ、７０ｋＤ、８０ｋＤ、９０ｋＤ、又は１００ｋＤ以下の分子量を有する。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、機能的タンパク質であり、５０ｋＤ未満である。

【0229】

いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、少なくとも又は約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１０００アミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１０００以下のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、約５０～４００のアミノ酸残基、約５０～３００のアミノ酸残基、約５０～２００のアミノ酸残基、約１００～３００のアミノ酸残基、又は約１００～２００のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、機能的タンパク質であり、５００未満のアミノ酸残基を有する。

【0230】

リンカー配列
ポリペプチドは、本明細書において記載される任意のポリペプチド（例えば、ＣＨ３ドメインを有する重鎖を有するポリペプチド）の本明細書において記載される任意の部位（例えば、３Ａ部位及び／又はＣ末端）に、任意選択でリンカー配列を通して融合することができる。

【0231】

いくつかの実施形態において、リンカー配列は、少なくとも又は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、又は５０アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、少なくとも又は約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２５、３０、又は４０グリシン残基を含む。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、又は８セリン残基を含む。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、グリシン残基及びセリン残基を含む又はからなる。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２４）と少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％、少なくとも若しくは約９５％、少なくとも若しくは約９９％、又は１００％同一である配列を含む又はからなる。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号９０）と少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％、少なくとも若しくは約９５％、少なくとも若しくは約９９％、又は１００％同一である配列を含む又はからなる。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８つのリピートを含む。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、又は５０以下のアミノ酸残基を有する。

【0232】

一態様において、ポリペプチドは、修飾免疫グロブリンの重鎖ＣＨ３ドメインに融合される。いくつかの実施形態において、挿入ポリペプチドは、Ｎ末端リンカー配列及びＣ末端リンカー配列を含む。本明細書において使用されるように、用語「Ｎ末端リンカー配列」は、挿入又は融合ポリペプチドのＮ末端に位置するリンカー配列を指す。本明細書において使用されるように、用語「Ｃ末端リンカー配列」は、挿入又は融合ポリペプチドのＣ末端に位置するリンカー配列を指す。Ｎ末端リンカー配列及びＣ末端リンカー配列は、同一のもの又は異なるものとすることができ、本明細書において記載される任意のリンカー配列を含む又はからなることができる。

【0233】

抗体及び抗原結合断片
本開示は、本明細書において記載される種々の抗原に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は、免疫細胞抗原である。いくつかの実施形態において、抗原は、免疫チェックポイント分子である。

【0234】

いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、少なくともＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、アゴニストである。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、アンタゴニストである。

【0235】

本開示は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される抗体及び抗原結合断片は、ＣＴＬＡ４に結合することが可能であり、ＣＴＬＡ４阻害性経路を阻害し、したがって、免疫応答を増加させることができる。本開示は、マウス抗ＣＴＬＡ４抗体４Ｇ１２及びそのヒト化抗体を提供する。

【0236】

４Ｇ１２及び４Ｇ１２由来抗体についてのＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔナンバリングによって定義されるように、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号５４～５６及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号５７～５９を含む（図４９を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに基づくと、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号６６～６８において記載され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号６９～７１において記載される（図５０を参照されたい）。

【0237】

４Ｇ１２及び４Ｇ１２由来抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）についてのアミノ酸配列もまた、提供される。ヒト化４Ｇ１２抗体（例えばＣＴ４－４Ｇ１２－ＩｇＧ１）の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号４４において記載される。ヒト化ＣＴ４－４Ｇ１２抗体（例えばＣＴ４－４Ｇ１２－ＩｇＧ１）の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号４５において記載される。マウス４Ｇ１２抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号５０において記載される。マウス４Ｇ１２抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号５１において記載される。

【0238】

いくつかの実施形態において、ＣＴ４－４Ｇ１２－ＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３において記載される。いくつかの実施形態において、４Ｇ１２又は４Ｇ１２由来抗体（例えばヒト化抗体）は、ＩｇＧ１サブタイプ又はＩｇＧ４サブタイプを有する。

【0239】

ＣＴＬＡ４抗体４Ｇ１２の詳細は、例えば、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１０２８１６において見つけることができ、これは、全体が参照によって本明細書において援用される。

【0240】

本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される抗体及び抗原結合断片は、ＯＸ４０に結合することが可能であり、ＯＸ４０シグナル伝達経路を促進し、したがって、免疫応答を増加させることができる。本開示は、マウス抗ＯＸ４０抗体９Ｈ３及びそのヒト化抗体を提供する。

【0241】

９Ｈ３及び９Ｈ３由来抗体についてのＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔナンバリングによって定義されるように、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号６０～６２及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号６３～６５を含む（図４９を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに基づくと、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号７２～７４において記載され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号７５～７７において記載される（図５０を参照されたい）。

【0242】

９Ｈ３及び９Ｈ３由来抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）についてのアミノ酸配列もまた、提供される。ヒト化９Ｈ３抗体（例えばＯ４０－９Ｈ３－ＩｇＧ１）の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号４８において記載される。ヒト化９Ｈ３抗体（例えば９Ｈ３－ＩｇＧ１）の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号４９において記載される。マウス９Ｈ３抗体の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号５２において記載される。マウス９Ｈ３抗体の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号５３において記載される。

【0243】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるｓｃＦｖは、９Ｈ３及び９Ｈ３由来抗体に由来する。いくつかの実施形態において、９Ｈ３又は９Ｈ３由来抗体（例えばヒト化抗体）は、ＩｇＧ１サブタイプを有する。

【0244】

抗ＯＸ４０抗体９Ｈ３の詳細は、例えば、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１１２８３２で見つけることができ、これは、全体が参照によって本明細書において援用される。

【0245】

本開示は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される抗体及び抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１に結合することが可能であり、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路を遮断し、したがって、免疫応答を増加させることができる。本開示は、マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体３Ｆ２及びそのヒト化抗体を提供する。

【0246】

３Ｆ２及び３Ｆ２由来抗体についてのＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔナンバリングによって定義されるように、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号１８～２０及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号２１～２３を含む（図４９を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに基づくと、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号７８～８０において記載され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号８１～８３において記載される（図５０を参照されたい）。

【0247】

いくつかの実施形態において、ＰＤＬ１－３Ｆ２－ＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３６及び配列番号３７において記載される。

【0248】

いくつかの実施形態において、３Ｆ２又は３Ｆ２由来抗体（例えばヒト化抗体）は、ＩｇＧ１サブタイプ又はＩｇＧ４サブタイプを有する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるｓｃＦｖは、３Ｆ２及び３Ｆ２由来抗体に由来する。いくつかの実施形態において、３Ｆ２に由来するｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号１７において記載される。

【0249】

抗ＰＤ－Ｌ１抗体３Ｆ２の詳細は、例えば、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７５９８３で見つけることができ、これは、全体が参照によって本明細書において援用される。

【0250】

本開示は、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される抗体及び抗原結合断片は、ＰＤ－１に結合することが可能であり、ＰＤ１シグナル伝達経路を阻害し、したがって、免疫応答を増加させることができる。本開示は、マウス抗ＰＤ－１抗体１Ａ７及びそのヒト化抗体を提供する。

【0251】

１Ａ７及び１Ａ７由来抗体についてのＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔナンバリングによって定義されるように、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号２４～２６及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、配列番号２７～２９を含む（図４９を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングに基づくと、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号８４～８６において記載され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号８７～８９において記載される（図５０を参照されたい）。

【0252】

１Ａ７及び１Ａ７由来抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）についてのアミノ酸配列もまた、提供される。ヒト化１Ａ７抗体（例えばＰＤ１－１Ａ７－ＩｇＧ４）の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号４０において記載される。ヒト化１Ａ７抗体（例えばＰＤ１－１Ａ７－ＩｇＧ４）の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号４１において記載される。

【0253】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるｓｃＦｖは、１Ａ７及び１Ａ７由来抗体に由来する。いくつかの実施形態において、１Ａ７又は１Ａ７由来抗体（例えばヒト化抗体）は、ＩｇＧ１サブタイプ又はＩｇＧ４サブタイプを有する。

【0254】

抗ＰＤ－１抗体１Ａ７の詳細は、例えば、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７７０１６で見つけることができ、これは、全体が参照によって本明細書において援用される。

【0255】

本開示は、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される抗体及び抗原結合断片は、ＣＤ４０に結合することが可能であり、ＣＤ４０シグナル伝達経路を促進し、したがって、免疫応答を増加させることができる。本開示は、マウス抗ＣＤ４０抗体６Ａ７及びそのヒト化抗体を提供する。

【0256】

６Ａ７及び６Ａ７由来抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）についてのアミノ酸配列もまた、提供される。ヒト化６Ａ７抗体（例えばＣ４０－６Ａ７－ＩｇＧ２）の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号９１において記載される。ヒト化６Ａ７抗体（例えばＣ４０－６Ａ７－ＩｇＧ２）の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号９２において記載される。

【0257】

いくつかの実施形態において、６Ａ７又は６Ａ７由来抗体（例えばヒト化抗体）は、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、又はＩｇＧ４サブタイプを有する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるｓｃＦｖは、６Ａ７及び６Ａ７由来抗体に由来する。いくつかの実施形態において、６Ａ７に由来するｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号１６において記載される。いくつかの実施形態において、６Ａ７に由来するｓｃＦｖは、ｓｃＦｖの安定性を増加させるために、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０の突然変異を含む。

【0258】

抗ＣＤ４０抗体６Ａ７の詳細は、例えば、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９６４９４で見つけることができ、これは、全体が参照によって本明細書において援用される。

【0259】

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４０抗体（例えばセリクレルマブ）の重鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号１３０において記載される。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４０抗体（例えばセリクレルマブ）の軽鎖可変領域についてのアミノ酸配列は、配列番号１３１において記載される。

【0260】

ＩＬ１２経路を標的とするタンパク質複合体
本開示は、ＩＬ１２経路を標的とするタンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態において、タンパク質複合体は、修飾免疫グロブリンである。いくつかの実施形態において、修飾免疫グロブリンは、サイトカインを含む。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＬ１２（例えばヒトＩＬ１２）である。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、ＩＬ１２ａである。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ａは、マウスＩＬ１２ａ（ｍＩＬ１２ａ）である。いくつかの実施形態において、ｍＩＬ１２ａは、配列番号１２５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍＩＬ１２ａは、ＮＣＢＩ整理番号ＮＰ＿００１１５２８９６．１又はＮＰ＿０３２３７７．１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ａは、ヒトＩＬ１２ａ（ｈＩＬ１２ａ）である。いくつかの実施形態において、ｈＩＬ１２ａは、配列番号１２７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ｈＩＬ１２ａは、ＮＣＢＩ整理番号ＮＰ＿０００８７３．２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、インターロイキン１２は、ＩＬ１２ｂである。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ｂは、マウスＩＬ１２ｂ（ｍＩＬ１２ｂ）である。いくつかの実施形態において、ｍＩＬ１２ｂは、配列番号１２６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ｍＩＬ１２ｂは、ＮＣＢＩ整理番号ＮＰ＿００１２９０１７３．１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ｂは、ヒトＩＬ１２ｂ（ｈＩＬ１２ｂ）である。いくつかの実施形態において、ｈＩＬ１２ｂは、配列番号１２８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ｈＩＬ１２ｂは、ＮＣＢＩ整理番号ＮＰ＿００２１７８．２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、インターロイキン１２ポリペプチドは、任意選択で本明細書において記載されるリンカー配列と連結された、ＩＬ１２ａ及びＩＬ１２ｂの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ａ及びＩＬ１２ｂは、非共有結合性の相互作用によって互いに結びつき、機能的ＩＬ１２ユニットを形成する。

【0261】

一態様において、本開示は、免疫調節成分と融合されたターゲティング成分を含むタンパク質複合体に関する。いくつかの実施形態において、（ａ）ターゲティング成分は、ＰＤ－１リガンドに特異的に結合する；及び（ｂ）免疫調節成分は、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ１２Ｒ）に特異的に結合する。本明細書において使用されるように、「ターゲティング成分」は、局在して、特異的な分子又は細胞成分に結合する能力を有する分子を指す。ターゲティング成分は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆｃ含有ポリペプチド、融合抗体、ポリペプチド、ペプチド、アプタマー、リガンド、核酸、又はその任意の組み合わせとすることができる。いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、細胞又は組織中に存在する分子に結合することができる。いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、患部の細胞又は組織、例えば癌細胞又は腫瘍における分子に結合することができる。いくつかの実施形態において、ターゲティング分子は、正常な細胞又は組織、例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞に結合することができる。いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、免疫応答を調整する細胞の又は細胞外の分子に結合することができる。いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ＰＤ－１リガンド（例えばＰＤ－Ｌ１）に結合する。本明細書において使用されるように、「免疫調節成分」は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、骨髄サプレッサー細胞、又は樹状細胞）の特異的な構成成分に結合し且つ免疫細胞の数又は機能を調整するリガンド、ペプチド、ポリペプチド、又はＦｃ含有ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、「免疫調節成分」は、免疫系を調整するサイトカイン、サイトカイン受容体、共刺激分子、又は共阻害分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ＩＬ－１２Ｒに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、結合した分子の機能を増加させるアゴニストである。

【0262】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ＩＬ１２Ｒに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｃ含有ポリペプチド、又は融合タンパク質を含む。

【0263】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ＩＬ１２Ｒアゴニストである。

【0264】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ＩＬ１２を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、ＩＬ１２ａ（例えばヒトＩＬ１２ａ）、ＩＬ１２ｂ（例えばヒトＩＬ１２ｂ）、及び／又はその変異体を含む。

【0265】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ＰＤ－１リガンドに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｃ含有ポリペプチド、又は融合タンパク質を含む。

【0266】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、完全長抗体を含む。

【0267】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ＰＤ－１の細胞外ドメインを含む。

【0268】

いくつかの実施形態において、ＰＤ－１リガンドは、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２である。

【0269】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ＰＤ－１とＰＤ－１リガンドとの間の相互作用を遮断する。

【0270】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ＰＤ－１リガンドと１×１０－８Ｍ未満又は１×１０－９Ｍ未満のＫＤを有する。

【0271】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合される。

【0272】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合される。

【0273】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ＣＨ３ドメインに融合される。

【0274】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分及び免疫調節成分は、足場タンパク質（例えばアルブミン）に融合される。

【0275】

いくつかの実施形態において、タンパク質複合体は、二重特異性抗体を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＰＤ－１リガンド及びＩＬ１２Ｒに結合する。

【0276】

いくつかの実施形態において、タンパク質複合体は、ＩＬ１２Ｒに特異的に結合する２つ以上の免疫調節成分を含む。

【0277】

いくつかの実施形態において、タンパク質複合体は、ＰＤ－１リガンドに特異的に結合する２つ以上のターゲティング成分を含む。

【0278】

いくつかの実施形態において、タンパク質複合体は、２つのＣＨ３ドメインを含むＦｃを含む。

【0279】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、Ｆｃにおける２つのＣＨ３ドメインのうちの１つのＣＨ３ドメインに連結される。

【0280】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、２つのＣＨ３ドメインのうちの１つのＣＨ３ドメインのＣ末端に連結される。

【0281】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ＥＵナンバリングに従うＣＨ３ドメインの３４４位～３８２位の領域でＦｃにおける２つのＣＨ３ドメインのうちの１つのＣＨ３ドメインに融合される。

【0282】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ＩＬ１２ａ及びＩＬ１２ｂを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ａは、Ｆｃに連結される。

【0283】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、ＩＬ１２ａ及びＩＬ１２ｂを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ｂは、Ｆｃに連結される。

【0284】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、Ｆｃにおける２つのＣＨ３ドメインのうちの１つのＣＨ３ドメインに連結される。

【0285】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、Ｆｃにおける２つのＣＨ３ドメインのうちの１つのＣＨ３ドメインのＣ末端に連結される。

【0286】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ＥＵナンバリングに従うＣＨ３ドメインの３４４位～３８２位の領域でＦｃにおける２つのＣＨ３ドメインのうちの１つのＣＨ３ドメインに融合される。

【0287】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、ｓｃＦｖ（例えば、ＰＤ－１リガンドを標的とするｓｃＦｖ）を含む。

【0288】

いくつかの実施形態において、タンパク質複合体は、２つの軽鎖を含む。

【0289】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、２つの軽鎖のうちの１つに連結される。

【0290】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、２つの軽鎖のうちの１つに連結される。

【0291】

いくつかの実施形態において、タンパク質複合体は、インターフェロン（例えば、ＩＦＮａ１、ＩＦＮａ２、ＩＦＮａ３、ＩＦＮａ４、及び／又はＩＦＮγ）をさらに含む。

【0292】

いくつかの実施形態において、タンパク質複合体は、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及び／又はＩＬ２１）をさらに含む。

【0293】

いくつかの実施形態において、インターフェロン又はサイトカインは、リンカー配列によってタンパク質複合体に連結される。

【0294】

いくつかの実施形態において、タンパク質複合体は、リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含む。いくつかの実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、又は８とすることができる。

【0295】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片を含む。

【0296】

いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４）である。

【0297】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）並びにＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0298】

いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、及び３アミノ酸配列及び選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、及び３アミノ酸配列は、以下のうちの１つである：
（１）選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１、２、３において記載される及び選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４、５、６において記載される；並びに
（２）選択されたＶＨ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７、８、９において記載される及び選択されたＶＬ ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１０、１１、１２において記載される。

【0299】

いくつかの実施形態において、ターゲティング成分は、配列番号１３、１４、１５、又は１６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号１７、１８、又は１９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0300】

いくつかの実施形態において、免疫調節成分は、配列番号２８と少なくとも８０％同一である配列及び配列番号２９と少なくとも８０％同一である配列を含む。

【0301】

一態様において、本開示は、癌を有する対象を治療するための方法であって、本明細書において記載されるタンパク質複合体を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法に関する。

【0302】

いくつかの実施形態において、対象は、ＰＤ－Ｌ１を発現している癌を有する。

【0303】

いくつかの実施形態において、癌は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体による治療に対して抵抗性である。

【0304】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の有効量を対象に投与することをさらに含む。

【0305】

一態様において、本開示は、対象における腫瘍微小環境において免疫応答を増加させるための方法であって、本明細書において記載されるタンパク質複合体を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法に関する。

【0306】

一態様において、本開示は、対象の腫瘍微小環境においてＴ細胞を活性化させるための方法であって、本明細書において記載されるタンパク質複合体を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法に関する。

【0307】

一態様において、本開示は、ＩＬ１２を対象に送達する場合に、ＩＬ１２の毒性を低下させるための方法であって、本明細書において記載されるタンパク質複合体を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法に関する。

【0308】

一態様において、本開示は、治療剤に共有結合で結合された、本明細書において記載されるタンパク質複合体を含む、単離された分子に関する。

【0309】

いくつかの実施形態において、治療剤は、細胞傷害性の又は細胞増殖抑制性の作用物質である。

【0310】

一態様において、本開示は、本明細書において記載されるタンパク質複合体；及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。

【0311】

一態様において、本開示は、本明細書において記載されるタンパク質複合体をコードする核酸に関する。

【0312】

一態様において、本開示は、本明細書において記載される核酸を含むベクターに関する。

【0313】

一態様において、本開示は、本明細書において記載される核酸を含む宿主細胞に関する。

【0314】

一態様において、本開示は、タンパク質複合体を産生するための方法であって、タンパク質複合体を産生するのに適した条件下で本明細書において記載される宿主細胞を培養することを含む方法に関する。

【0315】

いくつかの実施形態において、本開示は、融合ポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、ＩＬ１２ａ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ：ＮＰ＿０００８７３．２）の全体又は一部分を含む。

【0316】

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるサイトカインは、ＩＬ１２である。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、ＩＬ１２ｂ（例えばヒトＩＬ１２ｂ）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、ＩＬ１２ａ及び／又はＩＬ１２ｂの変異体（例えば、融合タンパク質又はその切断型タンパク質）を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、シグナルペプチド（例えば、ＩＬ１２ａ又はＩＬ１２ｂのシグナルペプチド）を含まない。

【0317】

修飾免疫グロブリンを作製するための方法
本開示はまた、本明細書において開示される単離されたポリヌクレオチド（例えば、本明細書において開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む組換えベクター（例えば発現ベクター）、組換えベクターが導入された宿主細胞（すなわち、宿主細胞は、ポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドを含むベクターを含有する）、並びに組換え技術による修飾免疫グロブリンの産生をも提供する。

【0318】

本明細書において使用されるように、「ベクター」は、ベクターが宿主細胞に導入された場合に、関心のある１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することが可能な任意の構築物である。「発現ベクター」は、関心のある１つ以上のポリヌクレオチドを送達し、発現ベクターが導入された宿主細胞において、コードされたポリペプチドとして発現することが可能である。したがって、発現ベクターにおいて、関心のあるポリヌクレオチドは、ベクター内で又は関心のあるポリヌクレオチドの統合部位の若しくはその近くの若しくはその側面に位置する、宿主細胞のゲノムにおいて、プロモーター、エンハンサー、及び／又はポリＡテールなどの調節エレメントと作動可能に連結することによって、関心のあるポリヌクレオチドが、発現ベクターが導入された宿主細胞において翻訳されるように、ベクターにおいて、発現のために配置される。

【0319】

ベクターは、当技術分野において知られている方法、例えば、エレクトロポレーション、化学的トランスフェクション（例えばＤＥＡＥ－デキストラン）、形質転換、トランスフェクション、並びに感染及び／又は形質導入（例えば、組換えウイルスにより）によって、宿主細胞に導入することができる。したがって、ベクターの非限定的な例は、ウイルスベクター（組換えウイルスを生成するために使用することができる）、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ファージベクター、及び陽イオン縮合剤と結びついたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクターを含む。

【0320】

発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことができる。そのようなマーカーは、例えば、真核細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の細菌における培養についてはテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、ストレプトマイセス細胞、及びサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２細胞及びスポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、及びＨＫ２９３細胞などの動物細胞；並びに植物細胞を含むが、これらに限定されない。本明細書において記載される宿主細胞に適切な培養培地及び条件は、当技術分野において知られている。

【0321】

小胞体内腔への、細胞膜周辺腔への、又は細胞外環境への翻訳タンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルは、発現されたポリペプチドの中に組み込まれてもよい。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性のものであってもよい又はシグナルは異種のシグナルであってもよい。

【0322】

抗体又は抗原結合断片の追加の改変を行うことができる。例えば、（１つ以上の）システイン残基をＦｃ領域中に導入することができ、それによりこの領域中の鎖間ジスルフィド結合形成を可能とする。こうして生成されたホモダイマー抗体は、任意の増加したインビトロ及び／又はインビボ半減期を有し得る。増加したインビトロ及び／又はインビボ半減期を有するホモダイマー抗体は、例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．”Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３．１１（１９９３）：２５６０－２５６５に記載のヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。或いは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を操作することができる。

【0323】

一部の実施形態において、改変免疫グロブリンに対して共有結合的改変を行うことができる。これらの共有結合的改変は、化学的若しくは酵素的合成により、又は酵素的若しくは化学的開裂により行うことができる。抗体又は抗体断片の共有結合的改変の他のタイプは、抗体又は断片の標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることにより分子中に導入される。

【0324】

一部の実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着しているフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、そのような抗体組成物中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号パンフレットに記載のとおりＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により測定してＡｓｎ２９７に付着している全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の総和に対するＡｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け；又はＫａｂａｔ番号付けにおける３１４位）に局在するアスパラギン残基を指し；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体中のマイナーな配列変異に起因して２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち、２９４～３００位にも局在し得る。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。一部の実施形態において、グリカン不均一性を低減させるため、抗体のＦｃ領域をさらに操作して２９７位におけるアスパラギンをアラニンに置き換えることができる（Ｎ２９７Ａ）。

【0325】

一部の実施形態において、Ｆａｂ－アーム交換を回避することにより産生効率を容易にするため、抗体のＦｃ領域をさらに操作してＩｇＧ４の２２８位（ＥＵ番号付け）におけるセリンをプロリンに置き換えた（Ｓ２２８Ｐ）。Ｓ２２８突然変異に関する詳細な説明は、例えば、参照により全体として組み込まれるＳｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｓ２２８Ｐ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩｇＧ４ Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９０．９（２０１５）：５４６２－５４６９に記載されている。

【0326】

本開示はまた、本明細書に記載の任意のヌクレオチド配列と少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である核酸配列、及び本明細書に記載の任意のアミノ酸配列と少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を提供する。

【0327】

一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の任意のペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の任意のヌクレオチド配列によりコードされる任意のアミノ酸配列に関する。一部の実施形態において、核酸配列は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、又は６００個未満のヌクレオチドである。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は５００個未満のアミノ酸残基である。

【0328】

一部の実施形態において、アミノ酸配列は（ｉ）アミノ酸配列を含み；又は（ｉｉ）アミノ酸配列からなり、アミノ酸配列は、本明細書に記載の配列のいずれか１つである。

【0329】

一部の実施形態において、核酸配列は、（ｉ）核酸配列を含み；又は（ｉｉ）核酸配列からなり、核酸配列は、本明細書に記載の配列のいずれか１つである。

【0330】

２つのアミノ酸配列の、又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列を最適比較目的のためにアラインする（例えば、最適アラインメントのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占有される場合、その分子はその位置において同一である（本明細書において使用されるとき、アミノ酸又は核酸「同一性」は、アミノ酸又は核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適アラインメントのための導入が必要なギャップの数、及びそれぞれのギャップの長さを考慮する、それらの配列により共有される同一位置の数の関数である。例えば、配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコア行列を１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、及び５のフレームシフトギャップペナルティで使用して達成することができる。

【0331】

処置方法
本明細書に記載の改変免疫グロブリンは、種々の治療目的のために使用することができる。

【0332】

一態様において、本開示は、対象における癌を処置する方法、対象における腫瘍容積の増加の速度を経時的に低減させる方法、転移を発症するリスクを低減させる方法、又は対象における追加の転移を発症するリスクを低減させる方法を提供する。一部の実施形態において、処置は、癌の進行を休止させ、減速させ、遅滞させ、又は阻害し得る。一部の実施形態において、処置は、対象における癌の１つ以上の症状の数、重症度、及び／又は継続期間の低減をもたらし得る。

【0333】

一態様において、本開示は、治療有効量の本明細書に開示される改変免疫グロブリンをそれが必要とされる対象（例えば、癌、例えば、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、カルチノイド癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、神経膠腫、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌、又は血液学的悪性腫瘍を有し、又は有すると特定若しくは診断される対象に投与することを含む方法を特徴とする。一部の実施形態において、癌は、切除不能黒色腫又は転移性黒色腫、非小細胞肺癌、（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、膀胱癌、又は転移性ホルモン抵抗性前立腺癌である。一部の実施形態において、対象は、固形腫瘍を有する。一部の実施形態において、癌は、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、又は結腸直腸癌である。一部の実施形態において、対象は、ホジキンリンパ腫を有する。一部の実施形態において、対象は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、胃癌、尿路上皮癌、メルケル細胞癌、又は頭頸部癌を有する。一部の実施形態において、癌は、黒色腫、膵臓癌、中皮腫、血液学的悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、又は進行固形腫瘍である。

【0334】

一部の実施形態において、本明細書に開示される組成物及び方法は、癌のリスクがある患者の処置に使用することができる。癌を有する患者は、当該技術分野において公知の種々の方法で特定することができる。

【0335】

一態様において、本開示は、異常又は不所望な免疫応答に伴う障害、例えば、自己免疫性障害を処置し、予防し、又はその発症リスクを低減させる方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法を使用して炎症を処置することができる。一部の実施形態において、炎症性又は自己免疫性疾患は、関節炎、大腸炎、乾癬、喘息、クローン病、又は多発性硬化症である。

【0336】

本明細書において使用されるとき、「有効量」は、有益な又は所望の結果、例として、疾患、例えば、癌又は自己免疫性疾患の進行の休止、減速、遅滞、又は阻害を生じさせるために十分な量又は投与量を意味する。有効量は、例えば、治療剤を投与すべき対象の年齢及び体重、症状の重症度及び投与経路に応じて変動し、したがって、投与は個別に決定することができる。

【0337】

有効量は、１回以上の投与で投与することができる。例として、改変免疫グロブリンの有効量は、患者における自己免疫性疾患又は癌の進行を改善し、停止させ、安定化させ、好転させ、阻害し、減速させ、及び／若しくは遅延させるために十分な量であり、又は細胞（例えば、生検細胞、本明細書に記載の癌細胞のいずれか、細胞系（例えば、癌細胞系））のインビトロ増殖を改善し、停止させ、安定化させ、好転させ、減速させ、及び／又は遅延させるために十分な量である。当該技術分野において理解されるとおり、改変免疫グロブリンの有効量は、とりわけ、患者の病歴並びに他の要因、例えば、使用される治療剤のタイプ（及び／又は投与量）に応じて変動し得る。

【0338】

本明細書に記載の改変免疫グロブリン、及び／又は組成物の投与のための有効量及びスケジュールは、実験的に決定することができ、そのような決定は当業者の技能の範囲内である。当業者は、投与しなければならない投与量が、例えば、本明細書に開示される改変免疫グロブリン、及び／又は組成物を受ける哺乳類、投与経路、使用される本明細書に開示される改変免疫グロブリン、及び／又は組成物の特定のタイプ、並びに哺乳類に投与されている他の薬物に応じて変動することを理解する。

【0339】

改変免疫グロブリンの有効量の典型的な１日投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重１ｋｇ当たりのｍｇ）である。一部の実施形態において、投与量は、１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ未満であり得る。一部の実施形態において、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、又は０．０１ｍｇ／ｋｇ超であり得る。一部の実施形態において、投与量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇである。

【0340】

本明細書に記載の方法のいずれにおいても、改変免疫グロブリン、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載の改変免疫グロブリン、又は医薬組成物のいずれか）、及び任意選択で、少なくとも１つの追加の治療剤を対象に少なくとも週１回（例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、１日１回、１日２回、又は１日３回）投与することができる。一部の実施形態において、少なくとも１つの改変免疫グロブリン及び少なくとも１つの追加の治療剤を、同じ組成物（例えば、液体組成物）中で投与する。一部の実施形態において、少なくとも１つの改変免疫グロブリン及び少なくとも１つの追加の治療剤を、２つの異なる組成物（例えば、少なくとも１つの改変免疫グロブリンを含有する液体組成物及び少なくとも１つの追加の治療剤を含有する固体経口組成物）中で投与する。一部の実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤を、ピル剤、錠剤、又はカプセル剤として投与する。一部の実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤を、徐放経口配合物中で投与する。

【0341】

一部の実施形態において、１つ以上の追加の治療剤を、対象に改変免疫グロブリンの投与前、又はその後に投与することができる。一部の実施形態において、１つ以上の追加の治療剤及び少なくとも１つの改変免疫グロブリンを、対象に、対象における１つ以上の追加の治療剤及び少なくとも１つの改変免疫グロブリンの生物活性期間が重複するように投与する。

【0342】

一部の実施形態において、対象に、少なくとも１つの改変免疫グロブリンを長期間（例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１年、２年、３年、４年、又は５年の期間にわたり）にわたり投与することができる。医療従事者は、処置の有効性の診断又は追跡（例えば、癌の少なくとも１つの症状の観察）のために本明細書に記載の方法のいずれかを使用して処置期間の長さを決定することができる。

【0343】

一部の実施形態において、１つ以上の追加の治療剤を対象に投与することができる。追加の治療剤は、Ｂ－Ｒａｆの阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫの阻害剤、ＥＲＫの阻害剤、Ｋ－Ｒａｓの阻害剤、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤、Ａｋｔの阻害剤、ｍＴＯＲの阻害剤、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤、並びにイソクエン酸脱水素酵素１（ＩＤＨ１）及び／又はイソクエン酸脱水素酵素２（ＩＤＨ２）の阻害剤からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を含み得る。一部の実施形態において、追加の治療剤は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１）（ＩＤＯ１）の阻害剤（例えば、エパカドスタット）である。一部の実施形態において、追加の治療剤は、ＨＥＲ３の阻害剤、ＬＳＤ１の阻害剤、ＭＤＭ２の阻害剤、ＢＣＬ２の阻害剤、ＣＨＫ１の阻害剤、活性化ヘッジホッグシグナリング経路の阻害剤、及びエストロゲン受容体を選択的に分解する薬剤からなる群から選択される１つ以上の阻害剤を含み得る。

【0344】

一部の実施形態において、追加の治療剤は、トラベクテジン、ｎａｂ－パクリタキセル、トレバナニブ、パゾパニブ、セジラニブ、パルボシクリブ、エベロリムス、フルオロピリミジン、ＩＦＬ、レゴラフェニブ、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ、Ａｌｉｍｔａ、Ｚｙｋａｄｉａ、Ｓｕｔｅｎｔ、テムシロリムス、アキシチニブ、エベロリムス、ソラフェニブ、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ、パゾパニブ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ－００３、カボザンチニブ、ビンフルニン、Ｈｓｐ９０阻害剤、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ、テマゾロミド（Ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンブラスチン、Ｔｈａｌｏｍｉｄ、ダカルバジン、シクロホスファミド、レナリドミド、アザシチジン、レナリドミド、ボルテゾミド（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｄ）、アムルビシン、カルフィルゾミブ、プララトレキサート、及びエンザスタウリンからなる群から選択される１つ以上の治療剤を含み得る。

【0345】

一部の実施形態において、追加の治療剤は、アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ、ＩＬ－１、ＨＭＧＢ１、ＩＬ－１０アンタゴニスト、ＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－１３アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＨＶＥＭアンタゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＣＸ３ＣＬ１を標的化する処置、ＣＸＣＬ９を標的化する処置、ＣＸＣＬ１０を標的化する処置、ＣＣＬ５を標的化する処置、ＬＦＡ－１アゴニスト、ＩＣＡＭ１アゴニスト、及びセレクチンアゴニストからなる群から選択される１つ以上の治療剤を含み得る。一部の実施形態において、カルボプラチン、ｎａｂ－パクリタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、ペメトレキセド、ゲムシタビン、ＦＯＬＦＯＸ、又はＦＯＬＦＩＲＩを対象に投与する。

【0346】

一部の実施形態において、追加の治療剤は、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、又は抗ＧＩＴＲ抗体である。

【0347】

医薬組成物及び投与経路
本明細書において、本明細書に記載の改変免疫グロブリンの少なくとも１つ（例えば、１、２、３、又は４つ）を含有する医薬組成物も提供される。本明細書に記載の改変免疫グロブリンのいずれかの２つ以上（例えば、２、３、又は４つ）が、任意の組合せで医薬組成物中に存在し得る。医薬組成物は、当該技術分野において公知の任意の様式で配合することができる。

【0348】

「薬学的に許容可能な担体」は、許容可能な生物活性及び対象に非毒性である、活性成分以外の医薬配合物中の成分を指す。本明細書に開示される医薬組成物中の使用のための薬学的に許容可能な担体としては、例えば、薬学的に許容可能な液体、ゲル、又は固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、酸化防止剤、麻酔剤、懸濁化／ディスペンディング剤（ｄｉｓｐｅｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、封鎖又はキレート化剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は非毒性補助物質、当該技術分野において公知の他の構成成分、又はそれらの種々の組合せを挙げることができる。一部の好適な構成成分としては、例えば、酸化防止剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、滑沢剤、香味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤又は安定剤、例えば、糖及びシクロデキストリンを挙げることができる。好適な酸化防止剤としては、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチルヒドロキサニソール（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘａｎｉｓｏｌ）、ブチルヒドロキシトルエン、及び／又は没食子酸プロピルを挙げることができる。本明細書に開示されるとおり、本明細書に提供される医薬組成物中の１つ以上の酸化防止剤、例えば、メチオニンの包含は、ポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体の酸化を減少させる。酸化のこの低減は、結合親和性の損失を妨害し、又は低減させ、それによりタンパク質安定性を改善し、保存期間を最大化する。したがって、ある実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチド複合体又は二重特異性ポリペプチド複合体及び１つ以上の酸化防止剤、例えば、メチオニンを含む組成物が提供される。

【0349】

医薬組成物は、その意図される投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）と適合性になるようにも配合される。組成物の製剤を配合し、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、又は複数回用量バイアル中に封入することができる。要求される場合（例えば、注射用配合物におけるように）、適切な流動性を、例えば、コーティング、例えば、レシチン、又は界面活性剤の使用により維持することができる。改変免疫グロブリンの吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることにより延長させることができる。或いは、生分解性、生物適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸）を含み得るインプラント及びマイクロカプセル化送達系により制御放出を達成することができる。

【0350】

本明細書に記載の改変免疫グロブリンのいずれかの１つ以上を含有する組成物は、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）投与のために、単位剤形（すなわち、投与の簡便性及び投与量の均一性のための、所定量の活性化合物を含有する物理的に区別された単位）で配合することができる。

【0351】

非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは、無菌であり、実質的に等張性であり、適正製造規範（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与のための投与量）で提供することができる。注射のため、改変免疫グロブリンを水溶液中で、好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液中で配合して注射部位における不快感を低減させることができる。

【0352】

例示的な用量としては、対象の体重１キログラム当たりの本明細書に記載の改変免疫グロブリンのいずれかのミリグラム又はマイクログラム量（例えば、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ；約１００μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ；約１００μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ；約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ；約１０μｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ；約１μｇ／ｋｇ～約５０μｇ／ｋｇ；約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ；又は約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ）が挙げられる。これらの用量が広範囲をカバーする一方、当業者は、治療剤が、改変免疫グロブリンを含め、その効力について変動し、有効量を当該技術分野において公知の方法により決定することができることを理解する。典型的には、比較的低い用量を最初に投与し、担当ヘルスケア従事者又は獣医従事者（治療用途の場合）又は研究者（依然として開発段階において機能する場合）は続いて及び徐々に適切な応答が得られるまで用量を増加させることができる。さらに、任意の特定の対象についての規定の用量レベルは、種々の要因、例として、用いられる規定の化合物の活性、年齢、体重、全身健康状態、性別、及び対象の食事、投与時間、投与経路、排泄速度、及び改変免疫グロブリンのインビボ半減期に依存することが理解される。

【0353】

医薬組成物は、容器、パック、又は分注器中に、投与用指示書と一緒に含めることができる。本開示はまた、本明細書に記載の種々の使用のための改変免疫グロブリンを製造する方法を提供する。

【実施例】

【0354】

本発明は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を制限することのない、以下の実施例にさらに説明される。

【0355】

実施例１．抗体の作製及び精製の方法
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ，ＧＩＢＣＯ，カタログ番号Ａ２９１３３）に、抗体重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドをコトランスフェクトした（モル比１：１）。振盪インキュベータ内でトランスフェクト細胞を３５℃及び８％ＣＯ２で培養した。１２日後に、細胞培養液から上清を採取した。次いで、タンパク質Ａビーズで充填され、ＡＫＴＡ（商標）ＡＶＡＮＴ１５０システムに接続された、クロマトグラフィーカラムによって抗体を精製した。

【0356】

実施例２．Ｃ末端又はＦａｂ領域でのＰＤ－Ｌ１抗体修飾
多くの二重特異性抗体フォーマット及び免疫サイトカインフォーマットは、様々な治療目的に提唱される（例えば、図２０Ａ～２０Ｄを参照されたい）。その概念上の利点にもかかわらず、これらの抗体を作製及び製造することは難しい。これらの抗体フォーマットに対する多くの既存の製造アプローチは、効率が低く、企図される精製プロセスによって制限される。ノブ・イン・ホール修飾を有する二重特異性抗体でさえ、誤対合及び低収率の問題をまだ抱えていた。

【0357】

これらの二重特異性抗体及び免疫サイトカインの発現効率及び安定性を評価するために、実験を行った。プラスミドは、抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１抗体の重鎖Ｃ末端で連結される、マウスインターロイキン７（ｍＩＬ７、分子量：１７．５ｋＤａ）を含む融合タンパク質を発現するように作製された（ＰＤＬ１－アベルマブ；重鎖配列番号３５及び軽鎖配列番号４）。融合タンパク質はＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＨＣと呼ばれ、その構造はＨＣとして図２０Ａで図解される。サイトカイン（例えば、ｍＩＬ７）が、重鎖のＣ末端に連結される。

【0358】

プラスミドはまた、抗ＰＤ－Ｌ１抗体軽鎖のＣ末端にｍＩＬ７を連結するように作製された（ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＬＣ）。ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＬＣ融合タンパク質の概略的構造は図２０ＡにＬＣとして示される。サイトカイン（例えば、ｍＩＬ７）は、軽鎖のＣ末端に結合される。

【0359】

２種類の融合タンパク質の発現レベルを評価した。具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞をプラスミドによってトランスフェクトし、発現された融合タンパク質を精製し、ゲル電気泳動によって分析した。図１に示すように、レーン６のＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＨＣ融合タンパク質は、天然ゲルにおいて複数の非標的バンドを示した。レーン１１のＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＬＣ融合タンパク質は、天然ゲルにおいて可視バンドを持たず、発現レベルが低いことを意味する。

【0360】

非対称抗体も発現させて、ＰＤ－Ｌ１抗体のＦａｂアーム１本を、配列番号１２に記載の配列（ＮＰ＿０６８５７５．１のアミノ酸２５～１６２）を有するヒトインターロイキン２１（ｈＩＬ２１）と置き換えた。ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）修飾も、Ｆｃ領域に導入した。融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－ＫＩＨ構造を図２０ＡにＦａｂ－サイトカイン－ＫＩＨとして示し、円はｈＩＬ２１を表す。それは、重鎖のヒンジ領域に連結され、精製され、ゲル電気泳動によって分析された。図２の結果から、レーン１０のＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－ＫＩＨが、天然ゲルにおいて複数の非標的バンドを示したことが分かった。

【0361】

要約すれば、対称構造を有する修飾抗体（例えば、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＨＣ、又はＰＤＬ１－ｍＩＬ７－ＬＣ）の発現レベルは、様々なプロジェクト間で大きく異なった。発現レベルは低く、発現された試料は非標的タンパク質を有した。同様に、非対称構造を有する修飾抗体（例えば、ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－ＫＩＨ）は、試料中の非標的タンパク質の量が多いため、精製するのが難しかった。

【0362】

実施例３．３Ａ部位で融合されたＰＤ－Ｌ１抗体
図３に示すように、抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）の３Ａ部位に融合された、マウスインターロイキン７ドメインを含む融合タンパク質を発現するように、プラスミドを作製した。融合部位が、ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖ＣＨ３ドメインの３Ａ部位内に位置するため、融合タンパク質をＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａと名付けた（３Ａとして図２０Ａに示す構造、重鎖は配列番号５である）。

【0363】

抗体の重鎖ＣＨ３ドメインの他の融合部位も試験した（図３）。例えば、３Ｂ部位（配列番号６）；３Ｃ部位（配列番号７）；及び３Ｄ部位（配列番号８）でＩＬ７が融合された。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４（配列番号１～３）重鎖定常領域間の配列アラインメントを図４に示し、アミノ酸配列は以下の通りに示す（配列及びＥＵ番号付けは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際免疫遺伝学情報システム（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＩＭＧＴ）に記載されている）。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のアイソフォーム（配列番号３２～３４）を図４８に示す。

【化1】

【0364】

さらに、マウスインターフェロンα４（ｍＩＦＮａ４）（配列番号１０）が、リンカー配列（配列番号９）を介してｍＩＬ７－融合抗ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖のＣ末端に連結された（３Ａ－ＨＣとして図２０Ａに示す構造）。構築物を用いて、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、発現レベルを評価した。以下の表に示すように、３Ａ融合部位は、３Ｂ、３Ｃ又は３Ｄ部位での融合を有する抗体と比較して、最も高い発現レベルを示した。

【0365】

【表5】

【0366】

タンパク質Ａクロマトグラフィーによって、融合タンパク質を精製し、天然ゲルによって分析した。図５Ａに示すように、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ（レーン１）、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４（レーン５）及びＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ｂ－ｍＩＦＮａ４（レーン６）はそれぞれ、明確なバンドを示し、表に決定される発現レベルが確認された。ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ｄ（レーン４）が、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ｂ－ｍＩＦＮａ４（レーン６）と同等の発現レベルを有すると決定されたが、図５Ａにおいて１つの明確なバンドを示さず、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ｄは凝集を有したことを意味する。ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ｂ、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４及びＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ｂ－ｍＩＦＮａ４はすべて、１つの明確なバンドを有し、これらの修飾抗体は比較的高い純度を有したことを意味する。

【0367】

ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ及びＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４の結果はさらに、図５Ｂ～５Ｃにおけるサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって確認された。図５Ｂ～５Ｃに示すように、ＳＥＣ－ＨＰＬＣからの結果は、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ及びＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４に関して主要な１つのピークを有するのみであり、これらの修飾抗体は高純度と共に高い発現レベルを有し、発現産物は安定であり、凝集体を形成しなかったことを示す。

【0368】

ＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合親和性の決定
予め固定化されたタンパク質Ａセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ（商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）Ｔ２００バイオセンサーを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、精製６Ｘヒスチジンタグ付きヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤＬ１－Ｈｉｓ）及びＰＤＬ１－アベルマブ、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ、又はＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４の間の結合親和性を測定した。ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａにおいて、ｍＩＬ７は３Ａ部位に融合された。ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４において、ｍＩＦＮａ４は、抗体ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３ＡのＣ末端に連結された。

【0369】

融合タンパク質（１μｇ／ｍＬ）をＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００バイオセンサーに１０μＬ／分で２０秒間注入して、目的のタンパク質密度を達成した。次いで、６Ｘヒスチジンタグ付きヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ｈＰＤＬ１－Ｈｉｓ）を３０μＬ／分で１８０秒間注入した。解離を３００秒間モニターした。各滴定の最後の注入後に、チップをグリシンで再生した（ｐＨ２．０、３０μＬ／分で５秒間）。当業者であれば理解されるように、パラメーター（例えば、抗体濃度）の適切な調節を用いた同じ方法が、各試験抗体に関して行われた。試験抗体の結果を以下の表に示す。

【0370】

【表6】

【0371】

結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）が、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェア３．０を使用して１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにデータを一括で適合することによって同時に得られた（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６．９９－１１０）。親和性は、動態学的速度定数（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）の商から計算された。この結果から、未修飾の親抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）と比較して、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ及びＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する同様な結合親和性を有することが示された。

【0372】

サイトカイン活性の検証
以下の材料を使用した。

【0373】

Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから赤血球溶解バッファーを購入した（カタログ番号Ｃ３７０２）。

【0374】

抗ＣＤ１６／３２（ａＣＤ１６／３２）抗体をＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入した。

【0375】

ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ，Ｌｔｄから購入した。

【0376】

ホスホ－ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）モノクローナル抗体（ＳＲＢＣＺＸ）ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号１７－９０１０－４１）から購入した。

【0377】

ホスホ－ＳＴＡＴ１（Ｓｅｒ７２７）組換えウサギモノクローナル抗体（Ｓｔａｔ１Ｓ７２７－Ｃ６）、ＰＥをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号ＭＡ５－２８０５６）から購入した。

【0378】

ＣＤ８ａモノクローナル抗体（５３－６．７）、ＦＩＴＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号１１－００８１－８２）から購入した。

【0379】

挿入されたｍＩＬ７及びｍＩＦＮａ４の生物活性を測定した。マウス脾臓をＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドマウスから採取した。脾臓を粉砕し、フィルターに通した。フィルターを３ｍｌＰＢＳで洗浄し、粉砕された脾臓細胞を４００ｇ／分で３分間遠心した。遠心後、上清を廃棄し、赤血球溶解バッファー１ｍｌを添加して、４℃で１５分間、赤血球を溶解した。残りの細胞をＰＢＳ５ｍｌによって再懸濁し、次いで４００ｇ／分で３分間遠心し、続いて遠心後に上清を除去した。細胞の再懸濁、遠心、及び上清の除去を１回繰り返した。残りの細胞をＰＢＳ２００μｌによって再懸濁し、ａＣＤ１６／３２（抗マウスＣＤ１６／３２）抗体を添加して、細胞を４℃で１５分間ブロックした。ブロックされた細胞をさらに、ＰＢＳ１０ｍｌに希釈し、細胞数をカウントした。次いで、細胞を４００ｇ／分にて３分間遠心し、続いて上清を除去した。適切な体積のＲＰＭＩ １６４０培地を添加して、細胞力価を調節した。

【0380】

特定のサイトカイン（例えば、マウスインターロイキン７又はｍＩＬ７）、又はサイトカインドメインを含む融合タンパク質によって、細胞を処理した。具体的には、各ウェルが１０５細胞を有するように、細胞浮遊液２００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。次いで、ＰＢＳ（５μｌ）、ｍＩＬ７タンパク質（１００ｎｇ）、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ（５５０ｎｇ）又はＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４（６５０ｎｇ）を添加して、ウェルをそれぞれ分離した。ｍＩＬ７群、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ群、及びＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４群におけるｍＩＬ７はおよそ等しい。細胞を穏やかに混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。

【0381】

４％ホルムアルデヒド（最終濃度）－ＰＢＳ溶液によって、処理細胞を室温で１５分間透過処理した。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１００％氷冷メタノールに再懸濁し、氷浴中で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、ＰＢＳ（０．５％ＢＳＡで補充された）で細胞を３回洗浄した。

【0382】

１つの実験において、ｍＩＬ７活性を測定した。ＡＰＣ標識ホスホ－ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）モノクローナル抗体（ＳＲＢＣＺＸ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標））及びＦＩＴＣ標識ＣＤ８ａモノクローナル抗体（５３－６．７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標））を添加して、細胞を４℃で３０分間染色した。染色工程後、染色細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。ｍＩＬ７はＴｙｒ６９４にてマウス脾臓ＳＴＡＴ５をリン酸化することができるため、ｍＩＬ７の存在は、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）の蛍光シグナルの増加によって示される。図６に示すように、ＰＢＳ処理脾臓細胞（ブランク）と比べて、ｍＩＬ７タンパク質、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ及びＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４はすべて、ＡＰＣレベルの増加を示した。

【0383】

別個の実験において、同様な方法によってｍＩＦＮａ４活性を測定した。ホスホ－ＳＴＡＴ１（Ｓｅｒ７２７）組換えウサギモノクローナル抗体（Ｓｔａｔ１Ｓ７２７－Ｃ６）及びＦＩＴＣ標識ＣＤ８ａモノクローナル抗体（５３－６．７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標））を添加し、細胞を４℃で３０分間染色した。染色工程後、染色細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。ｍＩＦＮａ４はＳｅｒ７２７にてマウス脾臓ＳＴＡＴ１をリン酸化することができるため、ｍＩＦＮａ４の存在は、蛍光シグナルの増加によって示される。図７に示すように、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４のみがシグナルの増加を示したのに対して、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａは、ＰＢＳ処理脾臓細胞（ブランク）と比べてシグナルが変化しなかった。

【0384】

上記の実験から、修飾抗体における挿入ｍＩＬ７及びｍＩＦＮａ４はその生物活性を保持することが示された。

【0385】

Ｆｃ受容体に対する結合親和性の決定
予め固定化されたタンパク質Ａセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ（商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）Ｔ２００バイオセンサーを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、種々のＦｃ受容体に対するＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４、及びＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａの結合親和性を測定した。Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ－Ａｃｒｏ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＡ－Ｈ１６７－Ａｃｒｏ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｖ１７６－Ａｃｒｏ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＩＢ－ＮＡ１－Ａｃｒｏ）、ＦｃγＲＩ（ＦｃγＲＩ－Ｓｉｎｏ）、及びＦｃＲｎ（ＦｃＲｎ－Ａｃｒｏ）を含んだ。

【0386】

異なる実験において、種々のＦｃ受容体に対するＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ１、ＡＢ－ＩｇＧ１（ＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ１と同じＩｇＧ１サブタイプを有する対照抗体）、ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４、及びＡＢ－ＩｇＧ４（ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４と同じＩｇＧ４サブタイプを有する対照抗体）の結合親和性が、上述のＢｉａｃｏｒｅ（商標）を用いて測定された。Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＦｃγＲＩ－Ｓｉｎｏ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＡ－Ｈ１６７－Ａｃｒｏ及びＦｃγＲＩＩＡ－Ｒ１６７）、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｆ１７６及びＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｖ１７６－Ａｃｒｏ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＩＢ－ＮＡ１－Ａｃｒｏ）を含んだ。

【0387】

具体的には、ＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ１は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤＬ１－３Ｆ２（ＰＤＬ１－３Ｆ２－ＩｇＧ１、又は３Ｆ２）のＶＨ及びＶＬ配列を有するｓｃＦｖ（配列番号１７）を抗ＰＤ－１抗体ＰＤ１－１Ａ７－ＩｇＧ４の３Ａ部位（ＶＨ配列番号４０；ＶＬ配列番号４１）に融合し、続いてＩｇＧ１サブタイプでＩｇＧ４を置き換えることによって生成された。ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４は、抗ＣＤ４０抗体Ｃ４０－６Ａ７（６Ａ７）のＶＨ及びＶＬ配列を有するｓｃＦｖ（配列番号１６）をＰＤＬ１－アベルマブの３Ａ部位に融合し、続いてＩｇＧ４サブタイプでＩｇＧ１を置き換えることによって生成された。図２０Ａに、２つの融合タンパク質構造をＦＶ３Ａとして示す。

【0388】

【表7】

【0389】

この結果を図８Ａ～８Ｂに示し、抗ＰＤ－Ｌ１抗体でのｍＩＬ７及びｍＩＦＮａ４の融合によって、親抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ又はＦｃＲｎに対する抗体の結合親和性は実質的に変化しなかった。さらに、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプを有する融合ｓｃＦｖによって、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＩＢなどの種々のＦｃ受容体に対する抗体の結合親和性は実質的に変化しなかった。

【0390】

タンパク質の安定性試験
融合タンパク質ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａを－２０℃又は４０℃で１か月間保管し、次いで天然ゲル及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。結果を図９Ａ～９Ｃに示す。天然ゲルによって示される、各処理タンパク質の見掛け分子量（ＭＷ）は、理論値とも比較された（図９Ｂ）。

【0391】

－２０℃で保管されたタンパク質は明確な１つのバンドを示した。４０℃で１か月間保管した後、ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａは安定な状態を維持した。

【0392】

実施例４．３Ａ挿入とノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）との組み合わせ
３Ａ挿入とＫＩＨ修飾との適合性を試験した。４つの融合タンパク質がデザインされた（図１０Ｂ）。

【0393】

発現された融合タンパク質を精製し、ゲル電気泳動によって分析した。図１０Ａに示すように、ノブ鎖（ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｋｎｏｂ、３Ａ－ｋｎｏｂとして図２０Ａに示す構造）で、ホール鎖（ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－３Ａ－ｈｏｌｅ、３Ａ－ｈｏｌｅとして図２０Ａに示す構造）で、又は両方の鎖（ＰＤＬ１－ｍＩＬ７－Ｆａｂ－ｈａｌｆ－３Ａ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｈａｌｆ－３Ａ－ＫＩＨとして図２０Ａに示す構造）で、融合されたｍＩＬ７を有する融合タンパク質は１つの明確な主要なバンドを示した。したがって、３Ａ挿入は、ＫＩＨ修飾と併せて使用することができる。

【0394】

実施例５．ｈＩＬ７と融合されたＰＤ－Ｌ１抗体
ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１抗体ＰＤＬ１－３Ｆ２（ＰＤＬ１－３Ｆ２－ＩｇＧ１、又は３Ｆ２；重鎖配列番号３６；軽鎖配列番号３７）が、３Ａ部位（３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ）にてヒトインターロイキン７（ｈＩＬ７）と、又は３Ａ部位にてｈＩＬ７（配列番号１１）及び重鎖Ｃ末端（３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４）にてｍＩＦＮａ４（配列番号１０）とそれぞれ融合された。

【0395】

融合タンパク質、３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ及び３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４を精製し、ＳＥＣ及びゲル電気泳動によって分析した。その結果を図１１Ａ～１１Ｃ、及び１２Ａ～１２Ｃに示す。両方の融合タンパク質が、天然ゲルにおいて明確な主要なバンド、及びＳＥＣ結果で１つの明確な主要なピークを示した。

【0396】

精製ヒトＰＤ－Ｌ１と、３Ｆ２、３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ又は３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４との間の結合親和性が、予め固定化されたタンパク質Ａセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ（商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）Ｔ２００バイオセンサーを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。実施例３に記載のように実験を行い、試験されたタンパク質免疫サイトカイン（ＩＣＫ）についての結果を以下の表に示す。

【0397】

【表8】

【0398】

この結果から、修飾抗体が、未修飾親抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較して、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して同様な結合親和性を有することが示された。

【0399】

マウス脾臓細胞を用いてｈＩＬ７活性を評価するための実験も行った。具体的には、収集された細胞を最初に、ＰＢＳ、ｈＩＬ７タンパク質、３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ又は３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４で処理し、次いでホスホ－ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）モノクローナル抗体（ＳＲＢＣＺＸ）及びＣＤ８ａモノクローナル抗体（５３－６．７）で染色した。染色工程後、細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。ｈＩＬ７はＴｙｒ６９４にてマウス脾臓ＳＴＡＴ５をリン酸化することができるため、ｈＩＬ７活性は、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）シグナルの増加によって示される。図１３に示すように、ｈＩＬ７タンパク質、３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ、及び３Ｆ２－ｈＩＬ７－３Ａ－ｍＩＦＮａ４はすべて、ＰＢＳ処理脾臓細胞（ブランク）と比べてＡＰＣ（アロフィコシアニン）レベルの増加を示した。上記の実験から、抗体における挿入ｈＩＬ７がその生物活性を保持することが示された。

【0400】

実施例６．ｈＩＬ２１と融合されたＰＤ－Ｌ１抗体
図２０Ａ（ＨＣ構造参照）に示すように、ＰＤＬ１－アベルマブ重鎖のＣ末端に連結されるヒトインターロイキン２１（ｈＩＬ２１）（配列番号１２）を有する融合タンパク質を発現するように、プラスミドをデザインした。融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－ＨＣを精製し、ゲル電気泳動によって分析した。図１４Ａ～１４Ｂに示すように、非標的バンドが天然ゲル上に検出された。

【0401】

ヒトインターロイキン２１（ｈＩＬ２１）をＰＤＬ１－３Ｆ２抗体（３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ）の３Ａ部位で融合した。３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａの重鎖のＣ末端にｍＩＦＮａ４を付加した（３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４）。融合タンパク質、３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ及び３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４を精製し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びゲル電気泳動によって分析した。その結果を図１５Ａ～１５Ｃ、及び１６Ａ～１６Ｃに示す。どちらの融合タンパク質も、天然ゲルにおいて明確な主要なバンド、及びＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果において明確な主要なピークを示した。

【0402】

精製ヒトＰＤ－Ｌ１と、親ＰＤ－Ｌ１抗体（３Ｆ２）、３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ又は３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４との結合親和性をＳＰＲによって測定した。上述の方法において記載のように実験を行い、その結果を以下の表にまとめる。

【0403】

【表9】

【0404】

この結果から、３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ及び３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４が、親ＰＤ－Ｌ１抗体と比較して、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して同様な結合親和性を有することが示された。

【0405】

マウス脾臓細胞を用いて、ｈＩＬ２１活性も測定した。具体的には、収集された細胞を最初に、ＰＢＳ、ｈＩＬ２１タンパク質、３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ、又は３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４で処理し、次いでＡＰＣ標識ホスホ－ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体及びＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８ａモノクローナル抗体（５３－６．７）で染色した。染色工程後、細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。ｈＩＬ２１はマウス脾臓ＳＴＡＴ３をリン酸化することができるため、ｈＩＬ２１の存在は、ＡＰＣシグナルの増加によって示される。図１７に示すように、ｈＩＬ２１タンパク質、３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ、及び３Ｆ２－ｈＩＬ２１－３Ａ－ｍＩＦＮａ４はすべて、ＰＢＳ処理脾臓細胞（ブランク）と比べてＡＰＣ（アロフィコシアニン）レベルの増加を示した。上記の実験から、挿入ｈＩＬ２１がその生物活性を保持することが示された。

【0406】

実施例７．ＴＧＦｂＲ２と融合されたＰＤ－Ｌ１抗体
ＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）を、重鎖３Ａ部位にてヒトＴＧＦｂＲ２（トランスフォーミング増殖因子、β受容体ＩＩ）（配列番号１３）の細胞外ドメインと融合した。融合タンパク質、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａを精製し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びゲル電気泳動によって分析した。図１８Ａ～１８Ｃに示すように、融合タンパク質は、天然ゲルにおいて明確な主要なバンド及びＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果において明確な主要なピークを示した。

【0407】

ＴＧＦｂ１と精製Ｍ７８２４（重鎖：配列番号３８；軽鎖：配列番号３９）との結合親和性、及びＴＧＦｂ１とＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａとの結合親和性をＳＰＲによって測定した。Ｍ７８２４は、二機能性抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ融合タンパク質である。ＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインは、Ｍ７８２４において抗ＰＤＬ１抗体のＦｃのＣ末端で連結される。その結果を以下の表に示す。

【0408】

【表10】

【0409】

この結果から、３Ａ部位に融合されたＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインを有するＰＤ－Ｌ１抗体は、Ｍ７８２４と比較して、ＴＧＦｂ１タンパク質に対して同様な結合親和性を有することが示された。その融合は、修飾タンパク質の結合親和性に影響しなかった。

【0410】

実施例８．抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖと融合されたＰＤ－Ｌ１抗体
ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）の重鎖３Ａ部位で融合された抗ＣＤ４０単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（配列番号１６）を有する融合タンパク質を発現するように、プラスミドをデザインした。その融合タンパク質をＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａと名付ける。

【0411】

ＡＤＣＣ作用を評価するために、実験を行った。この結果から、３Ａ部位でのＣＤ４０へのｓｃＦｖの結合によって、立体効果のために、ＩｇＧ受容体とＦｃ受容体の親和性が低減される、又は失われることが示された。

【0412】

実験において、ＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤＬ１－アベルマブ（Ｇ１）を親抗体として使用した。ｈＩＬ７（ＰＤＬ１－ｈＩＬ７－３Ａ；Ｇ２）及び抗ＣＤ４０抗体Ｃ４０－６Ａ７（配列番号１６）（ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ；Ｇ３）のｓｃＦＶを３Ａ部位に組み込み、試験した。ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３ＡのＩｇＧ４サブタイプも作製した。ＩｇＧ４は、エフェクター機能を引き起こす、限定された能力を有し、ネガティブコントロール（ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４；Ｇ５）として使用された。

【0413】

ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤ１－１Ａ７（１Ａ７、又はＰＤ１－１Ａ７－ＩｇＧ４；ＶＨ配列番号４０；ＶＬ配列番号４１）もまた、親抗体として使用した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体３Ｆ２のｓｃＦＶ（配列番号１７）を、ＰＤ－１抗体（ＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ１；Ｇ４）のＩｇＧ１サブタイプの３Ａ部位にて融合した。ｈＣＤ１６発現性ジャーカット細胞及びＰＤ－Ｌ１発現性ＣＨＯ細胞を実験において使用した。ｈＣＤ１６発現性ジャーカット細胞は、ルシフェラーゼを発現するＬｕｃ遺伝子も含んだ。

【0414】

実験を以下のとおりに行った。ＣＨＯ細胞発現性ＰＤ－Ｌ１を３７℃で回収し、９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで添加した。次いで、ジャーカット細胞浮遊液を９６ウェルプレートに２５μｌ／ウェル（又は８×１０４細胞／ウェル）にて添加した。次に、Ｇ１～Ｇ５を２５μｌアッセイバッファーに希釈比１：３で希釈し、次いで９６ウェルプレートに最終濃度１００ｎＭで添加した。９６ウェルプレートを３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション後、色素生産性試薬を各ウェルに添加し、暗所で５分間インキュベートした。次いで、プレートを発光検出器に置き、各ウェルの生物発光シグナルを検出した。

【0415】

図１９に示すように、その結果から、３Ａ部位でのサイトカイン又はｓｃＦＶの融合は、修飾抗体のＡＤＣＣ活性に影響しないことが分かった。しかしながら、３Ａ部位で挿入されたｓｃＦＶが標的タンパク質（ＣＨＯ細胞上のＰＤ－Ｌ１）に結合した場合、標的細胞に対するＡＤＣＣ作用は、低減されるか、又は失われた。すなわち、３Ａ部位で挿入されたｓｃＦＶが標的タンパク質に結合した場合、立体効果によって、ＦｃがＦｃ受容体に結合して、ＡＤＣＣエフェクター機能の誘発が妨げられた。

【0416】

実施例９．３Ａ部位内のアミノ酸置換又は挿入範囲の試験
３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、又は３Ｄ部位にて可溶性ドメインと融合された抗体
ＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）が、ヒトＴＧＦｂＲ２（トランスフォーミング増殖因子、β受容体ＩＩ）の細胞外ドメインと、重鎖３Ａ部位にて（ＥＵ番号付けによる３５８位～３６２位のアミノ酸が、ヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置換された）、３Ｂ部位にて（ＥＵ番号付けによる３８３～３９１位のアミノ酸が、ヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置換された）、３Ｃ部位にて（ＥＵ番号付けによる３８４位から３８５位の間に、ＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインが挿入された）、又は３Ｄ部位にて（４１３位～４２２位のアミノ酸が、ヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置換された）融合された。

【0417】

相当する融合タンパク質、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｂ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｃ、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｄを精製し、ゲル電気泳動によって分析した。図２２及び表１１に示すように、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｃ、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｄのみが、天然ゲルにおいて明確な主要なバンドを示した。各融合タンパク質の発現レベルも決定した。以下の表に示すように、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｃ、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｄが発現されたが、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｂは発現されなかった。

【0418】

【表11】

【0419】

実施例３に示す結果と一致することから、融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａは安定に発現された。実施例３の結果と比較して、３Ａ部位での融合は、安定な発現を常に提供する。

【0420】

種々の開始及び末端位置を有する３Ａ部位で融合された抗体
ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）は、種々の開始及び末端位置を有する３Ａ部位でヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと融合された。具体的には、３５８～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインで置き換えることによって、融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａが得られ、融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ－ＩｇＧ４は、ＩｇＧ４サブタイプを有するＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１抗体を用いて同様に得られた。

【0421】

ＰＤＬ１－アベルマブは、種々の開始位置及び末端位置を有する３Ａ部位にてヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと融合された。例えば、融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＦ１は、３５１～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置き換えることによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＦ２は、３４７～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置き換えることによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＦ３は、３４４～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置き換えることによって得られた。例えば、融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＲ１は、３５８～３７２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置き換えることによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＲ２は、３５８～３７８位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置き換えることによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＲ３は、３５８～３８１位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置き換えることによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＲ４は、３７３～３７７位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインと置き換えることによって得られた。

【0422】

融合タンパク質を精製し、ゲル電気泳動によって分析した。図２３及び表１２に示すように、融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ（レーン１）及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ－ＩｇＧ４（レーン２）は、天然ゲルにおいて明確な主要なバンドを示した。各融合タンパク質の発現レベルも決定した。以下の表に示すように、試験された他の融合タンパク質の発現は検出されなかったが、融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ－ＩｇＧ４、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３ＡＦ１の発現を検出した。この結果から、ＩｇＧサブタイプは融合タンパク質の発現に対して影響を及ぼさないことが判明した。さらに３５１～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸を融合部位として使用することができる。

【0423】

【表12】

【0424】

種々の開始及び末端位置を有する３Ａ部位で融合された抗体
ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）は、種々の開始及び末端位置を有する３Ａ部位でヒトＩＬ２１（ｈＩＬ２１）と融合された。具体的には、融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３Ａ－ＩｇＧ４は、ＩｇＧ４サブタイプを有するＰＤＬ１－アベルマブを用いて、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン内の３５８～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＩＬ２１で置換することによって得られた。ＰＤＬ１－アベルマブは、種々の開始位置及び末端位置を有する３Ａ部位でヒトＩＬ２１と融合された。例えば、融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＦ１は、３５１～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＩＬ２１で置換することによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＦ２は、３４７～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＩＬ２１で置換することによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＦ３は、３４４～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＩＬ２１で置換することによって得られた。例えば、融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＲ１は、３５８～３７２位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＩＬ２１で置換することによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＲ２は、３５８～３７８位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＩＬ２１で置換することによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＲ３は、３５８～３８１位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＩＬ２１で置換することによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＲ４は、３７３～３７７位（ＥＵ番号付けによる）のアミノ酸をヒトＩＬ２１で置換することによって得られた。

【0425】

融合タンパク質を精製し、ゲル電気泳動によって分析した。図２４及び表１３に示すように、融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３Ａ－ＩｇＧ４（レーン１）及びＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＦ１（レーン２）は、天然ゲルにおいて明確な主要なバンドを示した。各融合タンパク質の発現レベルも決定した。以下の表に示すように、試験された他の融合タンパク質の発現は検出されなかったが、融合タンパク質ＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３Ａ－ＩｇＧ４及びＰＤＬ１－ｈＩＬ２１－３ＡＦ１の発現を検出した。

【0426】

【表13】

【0427】

上記の結果によれば、タンパク質発現を妨げることなく、３５１位から３６２位のＰＤ－Ｌ１抗体の３Ａ部位に、非天然ポリペプチドを融合することができる。

【0428】

３Ａ部位内でのヒトＴＧＦｂＲ２の挿入
ヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインを抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）の３Ａ部位に挿入した。具体的には、融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１は、３Ａ部位内の３５８位から３５９位（ＥＵ番号付けによる）の間にヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインを挿入することによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ２は、３Ａ部位内の３５９位から３６０位（ＥＵ番号付けによる）の間にヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインを挿入することによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ３は、３Ａ部位内の３６０位から３６１位（ＥＵ番号付けによる）の間にヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインを挿入することによって得られた。融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ４は、３Ａ部位内の３６１位から３６２位（ＥＵ番号付けによる）の間にヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインを挿入することによって得られた。

【0429】

融合タンパク質を精製し、ゲル電気泳動によって分析し、その発現レベルを決定した。図２５Ａ及び表１４に示すように、すべての融合タンパク質が、天然ゲルにおいて明確な主要なバンドを示した。各融合タンパク質の発現レベルも決定した。以下の表に示すように、試験されたすべての融合タンパク質の発現が検出された。

【0430】

【表14】

【0431】

非標的バンドがＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１（レーン２）で確認され、それはタンパク質分解によって生じ得る。これを検証するために、細胞の新たなバッチからＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１を精製し、天然ゲルにおいてすぐに分析した。以下の図２５Ｂ及び表１５に示すように、非標的バンドは確認されず、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１の貯蔵中にタンパク質分解が生じたことを意味する。

【0432】

【表15】

【0433】

新たに精製されたＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１を１０日間維持し、次いで表１４の精製ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ１－３Ａ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ１－３Ａ２、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ１－３Ａ３、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ１－３Ａ４と共に、同じ天然ゲルにローディングした。図２６のゲル電気泳動の結果から、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ１－３Ａ１（レーン２）における非標的バンドが示され、非標的バンドがタンパク質分解によって生じたことを意味する。

【0434】

上記の結果から、非天然ポリペプチドを用いて、３５１～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のいずれかのアミノ酸、特に３５８～３６２位（ＥＵ番号付けによる）のいずれかのアミノ酸を置き換える、又はそのアミノ酸の間に挿入することができる。しかしながら、３５８位と３５９位（ＥＵ番号付けによる）の間のヒトＴＧＦｂＲ２の細胞外ドメインの挿入は、他の挿入部位ほど安定ではなかった。３５９～３６０、３６０～３６１、又は３６１～３６２位での挿入を有する抗体、及び３Ａ部位での置換を有する抗体は非常に安定であった。

【0435】

融合タンパク質の熱安定性
得られた融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｃ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｄ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ２、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ３、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ４の熱安定性を、融解温度（Ｔｍ）の測定によって決定した。Ｍ７８２４をコントロールとして使用した。

【0436】

【表16】

【0437】

一般に、この結果から、３Ａ又は３Ｃ部位内でのアミノ酸置換又は挿入によって、Ｔｍが受ける影響は最小限であることが示された。ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｄは、おそらく純度が低い、又は不安定な構造のために、Ｍ７８２４と比較して相対的に低いＴｍを示した。

【0438】

ＴＧＦβ１に対する結合親和性の決定
得られた融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｃ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ｄ、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ１、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ２、ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ３、及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ４のヒトＴＧＦβ１に対する結合親和性を、予め固定化されたタンパク質Ａセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００バイオセンサーを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。その結果を以下の表に示す。

【0439】

【表17】

【0440】

この結果から、試験されたすべての融合タンパク質が、高い親和性と共に、ヒトＴＧＦβ１に対する特異的な結合を示した。したがって、この結果はさらに、３Ａ部位に挿入されたポリペプチドは適切に折り畳むことができ、依然として機能性であることを意味した。

【0441】

実施例１０．３Ａ及び３Ｃ部位にてｓｃＦｖと融合された抗体
発現レベル及び純度
抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）が、抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖと重鎖３Ａ部位にて融合され（ＥＵ番号付けによる３５８位から３６２位のアミノ酸が、抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖで置換された）、又は３Ｃ部位にて融合されて（ＥＵ番号付けによる３８４位から３８５位の間に抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖが挿入された）、融合タンパク質ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ及びＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ｃがそれぞれ産生された。ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４もまた、ＩｇＧ１をＩｇＧ４サブタイプで置き換えることによって得られた。

【0442】

さらに、３Ａ部位内で３５８位と３５９位（ＥＵ番号付けによる）の間に抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖを挿入することによって、融合タンパク質ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ１が得られた。３Ａ部位内で３５９位と３６０位（ＥＵ番号付けによる）の間に抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖを挿入することによって、融合タンパク質ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ２が得られた。３Ａ部位内で３６０位と３６１位（ＥＵ番号付けによる）の間に抗ＣＤ４０ ｓｃＦｖを挿入することによって、融合タンパク質ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ３が得られた。融合タンパク質を精製し、ゲル電気泳動によって分析した。試験されたすべての融合タンパク質が天然ゲルにおいて明確な主要なバンドを示した。

【0443】

ＣＤ４０に対する結合親和性の決定
得られた融合タンパク質ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ（ＩｇＧ１）、ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４、ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ｃ（ＩｇＧ１）、ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ１（ＩｇＧ１）、ＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ２（ＩｇＧ１）、及びＰＤＬ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ３（ＩｇＧ１）のヒトＣＤ４０に対する結合親和性を、予め固定化されたタンパク質Ａセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００バイオセンサーを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ｓｃＦＶがそれに由来する、元の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｃ４０－６Ａ７ＩｇＧ２（６Ａ７、ＶＨ配列番号９１、ＶＬ配列番号９２）をコントロールとして使用した。その結果を以下の表に示す。

【0444】

【表18】

【0445】

この結果から、試験されたすべての融合タンパク質が、高い親和性と共に、ヒトＣＤ４０に対する特異的な結合を示すことが分かった。

【0446】

実施例１１．Ｆｃ受容体に対する結合親和性の決定
ヒトＦｃ受容体に対する融合タンパク質ＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ（ＩｇＧ１）（又はＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ－ＩｇＧ１）及びＰＤＬ１－ＴＧＦｂＲ２－３Ａ－ＩｇＧ４の結合親和性を、予め固定化されたタンパク質Ａセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００バイオセンサーを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ－Ｓｉｎｏ、ＦｃγＲＩＩＡ－Ｒ１６７－Ｓｉｎｏ、ＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｆ１７６－Ｓｉｎｏ、ＦｃγＲＩＩＩＢ－Ｓｉｎｏ、及びＦｃγＲｎを含んだ。ヒト化ＣＴＬＡ４抗体ＣＴ４－４Ｇ１２－ＩｇＧ１（ＣＴ４－４Ｇ１２、又は４Ｇ１２；ＶＨ配列番号４４、ＶＬ配列番号４５）をコントロールとして使用して、ＦｃγＲｎへの結合親和性を試験した。ＰＤＬ１－アベルマブをコントロールとして使用して、ＦｃγＲＩ－Ｓｉｎｏ、ＦｃγＲＩＩＡ－Ｒ１６７－Ｓｉｎｏ、ＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｆ１７６－Ｓｉｎｏ、及びＦｃγＲＩＩＩＢ－Ｓｉｎｏへの結合親和性を試験した。その結果を以下の表に示す。

【0447】

【表19】

【0448】

この結果から、ＰＤ－Ｌ１抗体の３Ａ部位での非天然ポリペプチドの挿入がある場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性は著しく影響を受けないことが分かった。

【0449】

実施例１２．３Ａ部位内の様々なタイプの分子の置換
様々なタイプの分子、例えば、サイトカイン、受容体、ｓｃＦｖ、リガンド、ナノボディ、又はその断片は、以下の表に示すように、抗体重鎖の３Ａ部位（例えば、ＥＵ番号付けによる３５８位から３６２位のアミノ酸）にて融合され得る。抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブタイプであり得る。

【0450】

【表20】

【0451】

上記の表に示す以下の配列を例として使用した。例えば、サイトカインは、配列番号１２に記載の配列（ＮＰ＿０６８５７５．１のアミノ酸２５～１６２）を有し、ヒトＩＬ２１（ｈＩＬ２１）に由来し得る。受容体は、配列番号１３に記載の配列（ＮＰ＿００３２３３．４のアミノ酸２４～１５９）を有し、ＴＧＦｂＲ２に由来し得る。ｓｃＦｖは、配列番号１７に記載の配列を有し、ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤＬ１－３Ｆ２に由来し得る。リガンドは、配列番号１４に記載の配列を有し、ＡＴＯＲ１０１５－ＣＤ８６（ヒトＣＤ８６のＩｇ様Ｖ型ドメインの最適化バージョン）であり得る。ＡＴＯＲ１０１５－ＣＤ８６の詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８２０２６４９Ａ１号パンフレットに記載されている。ＡＴＯＲ１０１５－ＣＤ８６は、ＡＴＯＲ１０１５のＣＤ８６部分である。

【0452】

ナノボディは、配列番号１５に記載の可変領域配列を有するＫＮ０３５－ＰＤＬ１（又はＫＮ０３５）であり得る。ＫＮ０３５の詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８０２９１１０３Ａ１号明細書に記載されている。

【0453】

発現レベル及び純度
以下の融合タンパク質は、抗体重鎖の３５８～３６２位（ＥＵ番号付けによる）に相当するアミノ酸を種々の非天然分子で置換することによって得られた。ＡＴＯＲ１０１５－ＣＤ８６をＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＤＬ１－アベルマブ）に融合して、ＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ（又はＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＩｇＧ１）が産生された。ＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＩｇＧ４は、ＩｇＧ１をＩｇＧ４サブタイプで置換することによって得られた。ＫＮ０３５をＰＤ－１抗体ＰＤ１－１Ａ７－ＩｇＧ４に融合して、ＰＤ１－ＫＮ０３５－３Ａ（又はＰＤ１－ＫＮ０３５－３Ａ－ＩｇＧ４）が産生された。ＰＤ１－ＫＮ０３５－３Ａ－ＩｇＧ１は、ＩｇＧ４をＩｇＧ１サブタイプで置換することによって得られた。抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖをＰＤ１－１Ａ７－ＩｇＧ４に融合して、ＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ（又はＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４）が産生された。ＰＤ１－ＰＬ１－３Ｆ２－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ１は、ＩｇＧ４をＩｇＧ１サブタイプで置換することによって得られた。ＫＮ０３５をＣＴＬＡ４抗体ＣＴ４－４Ｇ１２－ＩｇＧ１（ＣＴ４）にノブ鎖にて融合して（３Ａ－ｋｎｏｂとして図２０Ａに示す構造）、ＣＴ４－ＫＮ０３５－３Ａ－ｋｎｏｂ（又はＣＴ４－ＫＮ０３５－３Ａ－ｋｎｏｂ－ＩｇＧ１）が産生された。ＫＮ０３５をＣＴ４－４Ｇ１２－ＩｇＧ１にホール鎖にて融合して（３Ａ－ｈｏｌｅとして図２０Ａに示す構造）、ＣＴ４－ＫＮ０３５－３Ａ－ｈｏｌｅ（又はＣＴ４－ＫＮ０３５－３Ａ－ｈｏｌｅ－ＩｇＧ１）（図２０Ａ）が産生された。

【0454】

図２７及び表２１に示すように、各融合タンパク質は、６％天然ゲルにおいて４μｇ／レーンでローディングされた。明確な主要なバンドがすべての融合タンパク質で検出された。各融合タンパク質の発現レベルも決定した。以下の表に示すように、試験されたすべての融合タンパク質が安定に発現した。

【0455】

【表21】

【0456】

結合親和性の決定
ヒトＣＴＬＡ４（ｈＣＴＬＡ４－Ｈｉｓ）又はヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤＬ１）に対する融合タンパク質の結合親和性を、予め固定化されたタンパク質Ａセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００バイオセンサーを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。その結果を以下の表に示す。ＣＴＬＡ４抗体ＣＴ４－４Ｇ１２－ＩｇＧ１（ＣＴ４）をコントロールとして使用した。ＡＴＯＲ１０１５－ＣＤ８６（ＣＤ８６）及びＫＮ０３５－ＩｇＧ１（重鎖定常ドメインにおけるＤ２６５Ａ変異を有する）もまた、コントロールとして使用した。

【0457】

【表22】

【0458】

この結果から、ＰＤ－Ｌ１抗体に融合された後、ＡＴＯＲ１０１５－ＣＤ８６がヒトＣＴＬＡ４に対するその結合親和性を維持することが分かった。さらに、この結果から、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ４抗体に融合された後、ＫＮ０３５がヒトＰＤ－Ｌ１に対するその結合親和性を維持することが分かった。抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖは、ＰＤ－１抗体に融合された後、ＰＤ－Ｌ１に対する高い結合親和性も維持した。さらに、ＩｇＧのサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）は、融合分子の結合親和性に影響しなかった。

【0459】

実施例１３．３Ａ－ＨＣ、又は３Ａ構造を有する融合タンパク質の発現及び精製
ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインをＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＩｇＧ１重鎖のＣ末端（３Ａ－ＨＣとして図２０Ａに示す構造）に連結し、ＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＴＧＦｂＲ２を産生した。

【0460】

融合タンパク質ＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＩｇＧ１、ＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＩｇＧ４及びＰＤＬ１－ＣＤ８６－３Ａ－ＴＧＦｂＲ２を精製し、ゲル電気泳動によって分析した。図２８及び表２３に示すように、すべての融合タンパク質が天然ゲルにおいて明確な主要なバンドを示した。各融合タンパク質の発現レベルも決定した。以下の表に示すように、試験されたすべての融合タンパク質の発現が検出された。この結果から、３Ａ－ＨＣ構造を有する融合タンパク質が発現され、精製され得ることが示される。

【0461】

【表23】

【0462】

実施例１４．抗ＯＸ４０ ｓｃＦｖと融合されたＣＴＬＡ４抗体
ＣＴＬＡ４抗体ＣＴ４－４Ｇ１２－ＩｇＧ１の重鎖Ｃ末端にて連結される、又は３Ａ部位にて融合される、抗ＯＸ４０単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を有する融合タンパク質を発現するように、プラスミドをデザインした。融合タンパク質をＣＴ４－Ｏ４０－ＳＣＦＶ－ＨＣ及びＣＴ４－Ｏ４０－ＦＶ３Ａと名付け、配列番号４６及び配列番号４７それぞれに記載の相当する重鎖配列を有する。

【0463】

ＡＤＣＣ作用を評価するために実験を行った。その結果から、ＯＸ４０に対する重鎖Ｃ末端又は３Ａ部位でのｓｃＦｖの結合は、ＩｇＧとＦｃ受容体との親和性を維持することが示された。

【0464】

その実験において、ＣＴＬＡ４抗体ＣＴ４－４Ｇ１２－ＩｇＧ１（ＣＴ４）を親抗体として使用した。ｓｃＦＶは、ヒト化抗ＯＸ４０抗体ＯＸ４０－９Ｈ３（ＶＨ配列番号４８；ＶＬ配列番号４９）に由来した。ＯＸ４０抗体ＯＸ４０－９Ｈ３－ＩｇＧ１（Ｏ４０）もコントロールとして使用した。

【0465】

ｈＣＤ１６発現性ジャーカット細胞及びＯＸ４０発現性ＣＨＯ細胞を使用して、実施例８に記載のように実験を行った。ｈＣＤ１６発現性ジャーカット細胞は、ルシフェラーゼを発現する、Ｌｕｃ遺伝子も含んだ。

【0466】

図２９に示すように、この結果から、重鎖Ｃ末端に連結された、又は３Ａ部位にて融合されたｓｃＦｖは、標的タンパク質（ＣＨＯ細胞上のＯＸ４０）に結合し、標的細胞に対するＡＤＣＣ作用が維持され得ることが判明した。親抗体と比べてのＡＤＣＣ作用の減少は、立体効果によって起こり得る。

【0467】

実施例１５．異なるサイトカインと融合されたＰＤ－Ｌ１抗体
本明細書に記述されるように、サイトカイン（例えば、ＩＬ７又はＩＬ２１）を３Ａ部位に融合して、発現が容易であり、安定な、且つ機能性の多機能性融合タンパク質を産生することができる。融合されたサイトカインは、可溶性サイトカインと比較して同様な機能を示すことが判明した。さらに、サイトカイン融合は、特異的な抗原又はＦｃ受容体（例えば、ＦＣＲｎ）に対する親抗体の結合親和性に影響しなかった。この実施例において、融合タンパク質を産生するために、より多くのサイトカインが選択され、タンパク質発現が検出された。

【0468】

以下の配列が使用された。例えば、サイトカインは、配列番号９３に記載の配列を有するヒトＩＬ３（ｈＩＬ３）；配列番号９４に記載の配列を有するヒトＩＬ４（ｈＩＬ４）；配列番号９５に記載の配列を有するヒトＩＬ５（ｈＩＬ５）；配列番号９６に記載の配列を有するヒトＩＬ６（ｈＩＬ６）；配列番号９７に記載の配列を有するヒトＩＬ８（ｈＩＬ８）；配列番号９８に記載の配列を有するヒトＩＬ９（ｈＩＬ９）；配列番号９９に記載の配列を有するヒトＩＬ１３（ｈＩＬ１３）；及び配列番号１００に記載の配列を有するヒトＩＩＬ１５（ｈＩＬ１５）に由来し得る。

【0469】

ＰＤＬ１－３Ｆ２－ＩｇＧ１が親抗体として選択された。以下の融合タンパク質は、ＰＤＬ１－３Ｆ２－ＩｇＧ１抗体重鎖の３５８～３６２位（ＥＵ番号付けによる）に相当するアミノ酸をサイトカイン分子：３Ｆ２－ｈＩＬ３－３Ａ；３Ｆ２－ｈＩＬ４－３Ａ；３Ｆ２－ｈＩＬ５－３Ａ；３Ｆ２－ｈＩＬ６－３Ａ；３Ｆ２－ｈＩＬ８－３Ａ；３Ｆ２－ｈＩＬ９－３Ａ；３Ｆ２－ｈＩＬ１３－３Ａ；及び３Ｆ２－ｈＩＬ１５－３Ａで置換することによって得られた。

【0470】

さらに、リンカー配列（配列番号９）を介して親抗体重鎖のＣ末端にサイトカインが連結された（ＨＣとして図２０Ａに示す構造）。以下の融合タンパク質：３Ｆ２－ｈＩＬ３－ＨＣ；３Ｆ２－ｈＩＬ４－ＨＣ；３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣ；３Ｆ２－ｈＩＬ６－ＨＣ；３Ｆ２－ｈＩＬ８－ＨＣ；３Ｆ２－ｈＩＬ９－ＨＣ；３Ｆ２－ｈＩＬ１３－ＨＣ；及び３Ｆ２－ｈＩＬ１５－ＨＣが得られた。

【0471】

融合タンパク質をタンパク質Ａクロマトグラフィーによって精製し、次いでゲル電気泳動（天然ゲルを用いて）によって分析した。結果を３０Ａ～３０Ｂに示す。図３０Ａに示すように、試験されたすべての融合タンパク質が比較的高い純度を示した。しかしながら、図３０Ｂでは、ＨＣ構造を有する一部の融合タンパク質が、複数のバンド（例えば、レーン５、レーン７、及びレーン９）を示し、３Ａ構造を有する相当する融合タンパク質は、単一バンド（例えば、レーン４、レーン６、及びレーン８）を示した。

【0472】

さらに、３Ａ構造を有する抗体及びＨＣ構造を有する抗体の理論分子量はほぼ同じである。しかしながら、３Ｆ２－ｈＩＬ５－３Ａを示すバンド（図３０Ａのレーン６）は、３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣを示すバンド（図３０Ａのレーン７）よりも高く、３Ｆ２－ｈＩＬ５－３Ａが３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣよりも高い分子量を有することが示された。

【0473】

上述の融合タンパク質を更なる分析にかけた。ＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いて、タンパク質の純度を測定し、その結果を図３１Ａ～３１Ｄに示す。具体的には、３Ｆ２－ｈＩＬ５－３Ａ（純度：８９．０５％）は、３Ｆ－ｈＩＬ５－ＨＣ（純度：８６．８２％）と比較して、わずかに高い純度を有した。試験された他の融合タンパク質において、３Ａ構造は、相当するＨＣ構造よりも高い純度を示した。例えば、３Ｆ２－ｈＩＬ９－３Ａ（純度：９８．９０％）は、３Ｆ２－ｈＩＬ９－ＨＣ（純度：８１．８３％）よりも高い純度を有し；３Ｆ２－ｈＩＬ１３－３Ａ（純度：９８．２４％）は、３Ｆ２－ｈＩＬ１３－ＨＣ（純度：９３．３２％）よりも高い純度を有し；３Ｆ２－ｈＩＬ１５－３Ａ（純度：８３．７９％）は、３Ｆ２－ｈＩＬ１５－ＨＣ（純度：４８．６１％）よりも高い純度を有した。

【0474】

ＳＥＣ－ＨＰＬＣ上の３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣの保持時間（ＲＴ）が、３Ｆ２－ｈＩＬ５－３Ａよりも遅いため（図３１Ａ参照）、３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣの分子量は理論値よりも低いことが確認された。したがって、質量分析（ＭＳ）を用いて、３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣの分子量を測定し、この結果から、３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣの分子量が、理論値よりも低いことが確認された（図３２Ａ）。３Ｆ２－ｈＩＬ５－ＨＣの発現は不完全であった可能性がある。さらに、二次ペプチドカバー率マッピングの結果（図３２Ｂ）から、重鎖のＣ末端での配列欠失が存在することが判明した。

【0475】

実施例１６．ＰＤ－Ｌ１抗体の３Ａ部位で融合されたＩＬ１２ａ
図３８Ａに示すように、ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤＬ１－３Ｆ２の２本の重鎖それぞれの３Ａ部位（ＥＵ番号付けによる３５８位から３６２位）で融合された、マウスインターロイキン１２αサブユニット（ＩＬ１２ａ、又はＰ３５）を含む融合タンパク質を発現するように、プラスミドを作製した。ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１抗体は、配列番号３６に記載の配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３７に記載の配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む。具体的には、ＩＬ１２ａのＮ末端は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を介してＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１重鎖の３５７位（ＥＵ番号付けによる）に連結され、ＩＬ１２ａのＣ末端は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を介してＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１重鎖の３６３位（ＥＵ番号付けによる）に連結された。

【0476】

マウスインターロイキン１２βサブユニット（ＩＬ１２ｂ、又はＰ４０）及びＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１軽鎖が、別々のプラスミドによってコードされた。プラスミドの模式図を図３８Ｂに示す。ＩＬ１２（ＩＬ１２ａ及びＩＬ１２ｂなど）と融合された修飾ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１抗体を、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ（又は３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ＩｇＧ１）と名付けた。

【0477】

実施例１７．ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖Ｃ末端で連結されたＩＦＮａ４
リンカー配列（配列番号９）を介して３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａの２本の重鎖Ｃ末端のそれぞれに連結された、マウスインターフェロンα４（ＩＦＮａ４）（配列番号１０）をさらに含む融合タンパク質を発現するように、プラスミドを作製した。図３９Ａに示すように、ＩＬ１２（ＩＬ１２ａ及びＩＬ１２ｂなど）及びＩＦＮａ４と融合された修飾ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１抗体を３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４と名付けた。３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａと同様に、ＩＬ１２ｂ及び軽鎖が、別個のプラスミドによってコードされた。プラスミドの模式図を図３９Ｂに示す。

【0478】

実施例１８．多様な構造を有する融合タンパク質
以下に記載の融合タンパク質を発現するためにも、プラスミドを作製した。

【0479】

１）３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｋｎｏｂ
３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｋｎｏｂは、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１のノブ重鎖の３Ａ部位（ＥＵ番号付けによる３５８位から３６２位）で融合されたＩＬ１２ａを含む融合タンパク質である。具体的には、ＩＬ１２ａのＮ末端が、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を介してノブ重鎖の３５７位（ＥＵ番号付けによる）に連結され、ＩＬ１２ａのＣ末端が、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を介してノブ重鎖の３６３位（ＥＵ番号付けによる）に連結された。ＩＬ１２ｂ及び軽鎖が、別個のプラスミドによってコードされた。

【0480】

２）３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｈｏｌｅ
３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｈｏｌｅは、ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）変異を有するＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１のホール重鎖の３Ａ部位（ＥＵ番号付けによる３５８位から３６２位）で融合されたＩＬ１２ａを含む融合タンパク質である。具体的には、ＩＬ１２ａのＮ末端が、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を介してホール重鎖の３５７位（ＥＵ番号付けによる）に連結され、ＩＬ１２ａのＣ末端が、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を介してホール重鎖の３６３位（ＥＵ番号付けによる）に連結された。ＩＬ１２ｂ及び軽鎖が、別個のプラスミドによってコードされた。

【0481】

３）３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ＩｇＧ４
ＩｇＧ１定常領域がＩｇＧ４定常領域によって置き換えられていることを除いては、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ＩｇＧ４は、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａと同じ全体構造及び配列を含む融合タンパク質である。

【0482】

実施例１９．３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ及び３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４の精製
融合タンパク質３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ及び３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４を精製し、硫酸ドデシルナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。具体的には、融合タンパク質を発現するプラスミドを作製し、使用して、ＣＨＯ細胞を一過性にトランスフォームした。次いで、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を３７℃で６～７日間培養した。その後、培養上清を遠心分離によって収集し、タンパク質Ａアフィニティーカラムによって、融合タンパク質を最初に精製し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質純度をＳＥＣによってさらに測定した。

【0483】

６％アクリルアミドゲルを使用して、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。タンパク質試料を以下のように調製した。最初に、タンパク質試料を１ｍｇ／ｍｌに希釈した。希釈タンパク質試料２．４μｌを、トリス－グリシンＳＤＳ試料バッファー６μｌ（２×）及び蒸留水３．６μｌと混合した。次いで、混合物を２分間沸騰させ、ローディング前にすぐに遠心した。図４０に示すように、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ及び３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４の両方が、正確な分子量を有する単一のバンドを示した。

【0484】

Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣシステムに接続されたＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬ ＨＰＬＣカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ）を使用してＳＥＣによって、タンパク質純度をさらに測定した。タンパク質Ａ精製融合タンパク質試料をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析した。注入前に、試料を１ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いで０．２２μｍフィルターで濾過した。実験パラメーターは：流量：０．７ｍＬ／分；時間：３０分；及び検出波長：２８０ｎｍとして設定した。Ａｇｉｌｅｎｔ液体クロマトグラフィー分析ソフトウェアを用いて、データを分析した。試験された融合タンパク質のクロマトグラフ曲線が得られた。図４１Ａ～４１Ｂに示すように、検出された全ピーク面積パーセンテージ及び保持時間（ＲＴ）が記録された。一般に、タンパク質Ａ－精製融合タンパク質３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａの純度が、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４よりもわずかに高かった（純度８６．８８％、少量の不純物を含む）。

【0485】

実施例２０．ＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性の決定
精製ヒスタグ付きヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＬ１－Ｈｉｓ；ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４との間の結合親和性が、予め固定化されたタンパク質Ａセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ（商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）Ｔ２００バイオセンサーを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。

【0486】

融合タンパク質３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ及び３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４（１μｇ／ｍＬ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００バイオセンサーに１０μＬ／分にて３０秒間注入し、目的のタンパク質濃度（約６７ＲＵ）を達成した。次いで、濃度２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、及び１．５６２５ｎＭのヒスタグ付きヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＬ１－Ｈｉｓ）を３０μＬ／分にて１００秒間注入した。解離を４００秒間モニターした。グリシンでの各滴定の最後の注入後にチップを再生した（ｐＨ２．０，３０μＬ／分で１２秒間）。当業者であれば理解されるように、各試験融合タンパク質に関して、パラメーター（例えば、融合タンパク質濃度）の適切な調節を用いた同じ方法を行った。試験された融合タンパク質の結果を以下の表に示す。

【0487】

【表24】

【0488】

結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）が、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェア３．０を用いて、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにデータを一括で適合することによって同時に得られた（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ，Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６．９９－１１０）。親和性は、動態学的速度定数（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）の商から計算された。この結果から、試験された３種のすべての融合タンパク質ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、及び３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４が、同等な結合親和性でｈＰＬ１－Ｈｉｓに結合し得ることが分かった。非特異的な作用は確認されなかった。

【0489】

実施例２１．ＩＬ１２に対する結合親和性の決定
予め固定化されたタンパク質Ａセンサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ（商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ Ｎ．Ｊ．）Ｔ２００バイオセンサーを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、精製ヒスタグ付き組換えマウスＩＬ１２ＲＢ２タンパク質（ｍＩＬ１２Ｒ－Ｂ２－Ｈｉｓ；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，カタログ番号：５００９９－Ｍ０８Ｈ）と、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４との結合親和性が決定された。実施例５に記載の同様な方法によって実験を行った。試験された融合タンパク質の結果を以下の表に示す。

【0490】

【表25】

【0491】

この結果から、試験された融合タンパク質３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ及び３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４のどちらも、同等の結合親和性でｍＩＬ１２Ｒ－Ｂ２－Ｈｉｓに結合し得ることが分かった。非特異的な作用は確認されなかった。

【0492】

実施例２２．生体内（Ｉｎ ｖｉｖｏ）の薬理学的バリデーション
キメラＰＤ－１タンパク質及びａキメラＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現するために、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１マウスモデル（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手，カタログ番号１２０５２２）を遺伝子操作した。キメラＰＤ－１タンパク質は、相当するヒトＰＤ－１細胞外領域での、マウスＰＤ－１タンパク質の細胞外領域の一部の置換を含む。キメラＰＤ－Ｌ１タンパク質は、相当するヒトＰＤ－１細胞外領域での、マウスＰＤ－Ｌ１タンパク質の細胞外領域の一部の置換を含む。

【0493】

ヒト化マウスモデル（ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１）は、ヒトにおける、且つマウスＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を発現する通常のマウスにおいて、臨床結果の相違を著しく低減することによって、臨床設定において新たな治療的処置を試験する手段を提供する。ヒト化ＰＤ－１マウス、ＰＤ－Ｌ１マウス及びｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１マウスモデルに関する詳細な説明は、その全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９０３２０、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９９５７４、中国出願番号２０１７１０５０５５５４．０及び中国出願番号２０１７１０７５７０２２．６に記載されている。

【0494】

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１二重ヒト化マウス（５～８週齢）に、マウス結腸癌細胞ＭＣ３８（５×１０５／ＰＢＳ１００μｌ）を皮下注射し、腫瘍容積が約１００～１５０ｍｍ３に成長した場合に、腫瘍サイズに基づいて、マウスを１つの対照群と６つの処置群に分けた（ｎ＝７／群）。ヒト化抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１処置（１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ）、融合タンパク質３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ処置（１．８２ｍｇ／ｋｇ又は５．４６ｍｇ／ｋｇ）、又は融合タンパク質３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４処置（２．１１ｍｇ／ｋｇ又は６．３４ｍｇ／ｋｇ）に対して処置群をランダムに選択した。３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ及び３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４のモル投与量（例えば、モル／ｋｇ）は、ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１の投与量と等しかった。対照群マウスに、等しい体積の生理的食塩水（ＰＳ）を注入した。投与の頻度は、週に２回であった（合計で６回の投与）。腫瘍容積を週に２回測定し、マウスの体重も計量した。マウスの腫瘍容積が３０００ｍｍ３に達したら、安楽死を実施した。

【0495】

【表26】

【0496】

全体として、各群のマウスは健康であった。すべての処置群及び対照群マウスの体重が増加し、体重は明らかに、互いに差がなかった（図４２及び４３）。図４４に示すように、対照群における腫瘍は、実験期間中に成長し続けた。対照群マウスと比較した場合に、処置群における腫瘍容積は、対照群よりも小さかった。したがって、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１及び２つの融合タンパク質３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４は忍容性がよく、マウスにおける腫瘍成長を抑制した。

【0497】

以下の表に、グループ化当日（０日目）、グループ化から１４日後（１４日目）、及び実験の最終日（２５日目）の腫瘍容積；腫瘍不含マウスの数；マウスの生存率；腫瘍成長阻害値（ＴＧＩＴＶ）；及び処置群と対照群とのマウス腫瘍容積の統計学的差異（Ｐ値）を含む、この実験の結果をまとめる。

【0498】

【表27】

【0499】

実験の最終日（２５日目）に、各群の体重が増加し、処置群（Ｇ５を除く）及び対照群マウスの間に有意な差はなかった。Ｇ５群マウスの体重はＧ１群マウスの体重よりも少なかったが、Ｇ５群マウスは、実験期間全体を通して体重を増加し続け、体重は、実験の最終日には約１０％増加した。体重変化の明確な差は確認されなかった。Ｇ５群のマウスが実験最終日に低い腫瘍容積を有したことを考慮すると、Ｇ５群とＧ１群との体重の差は主に、腫瘍重量によって生じたものであった。この結果から、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１及び２種類の融合タンパク質３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４は、マウスに忍容性がよいことが示された。

【0500】

すべての処置群（Ｇ２～Ｇ７）の腫瘍容積は、対照群（Ｇ１）における腫瘍容積よりも小さかった。この結果から、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１及び２種類の融合タンパク質３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４は、用量依存性の異なる腫瘍抑制効果を有することも示された。同じ条件（例えば、投与量及び投与頻度）下にて、融合タンパク質（Ｇ４～Ｇ７）の抑制効果は、他の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｇ２及びＧ３）よりも優れていた。このことから、ＩＬ１２－ＰＤ－Ｌ１抗体の融合は、抗体の生体内有効性を向上させ得ることを意味する。さらに、同一用量にて、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａの作用は、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４の作用よりもわずかに優れており、インターフェロンα（例えば、ＩＦＮａ４）の融合は、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａの腫瘍抑制効果をさらに促進しないかもしれないことが示された。

【0501】

上記の結果から、２種類の融合タンパク質（３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ、３Ｆ２－ｍＩＬ１２－３Ａ－ｍＩＦＮａ４）が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１二重ヒト化マウスにおいてＰＤＬ１－３Ｆ２ ＩｇＧ１と比較して有意に優れた腫瘍成長抑制効果を示すことが判明した。さらに、これらの融合タンパク質は、マウスにおいて明らかな毒性作用はなかった。

【0502】

実施例２３．ＰＤ－１／ＣＤ４０ ＢｓＡＢについての生体内での結果
ＣＤ４０は、免疫システムにおいて抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に存在し、固有且つ適応性免疫システムメカニズムの活性化において重要な役割を果たす、主要な免疫共刺激経路受容体である。現在開発されている抗ＣＤ４０抗体としては、例えば、Ａｐｅｘｉｇｅｎによって開発されたＡＰＸ００５Ｍ、Ｒｏｃｈｅによって開発されたＲＧ７８７６（セリクレルマブ），Ｖｉｅｌａ Ｂｉｏによって開発されたＶＩＢ４９２０、及びＡｌｌｉｇａｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発されたＡＤＣ－１０１３が挙げられる。この実験において、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブ（ＶＨ配列番号１３０；ＶＬ配列番号１３１；ｓｃＦＶ配列番号１３２）が、重鎖３Ａ部位及び重鎖Ｃ末端にて抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４と組み合わせて二重特異性抗体が産生されるように選択された。得られた抗体を１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（配列番号１３３に記載の重鎖配列及び配列番号１３４に記載の軽鎖配列を有する）及び１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（配列番号１３５に記載の重鎖配列及び配列番号１３６に記載の軽鎖配列を有する）と名付けた。

【0503】

ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスモデル（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手，カタログ番号１２０５２６）を、キメラＰＤ－１タンパク質及びキメラＣＤ４０タンパク質を発現させるために遺伝子操作した。キメラＰＤ－１タンパク質は、相当するヒトＰＤ－１細胞外領域での、マウスＰＤ－１タンパク質の細胞外領域の一部の置換を含む。キメラＣＤ４０タンパク質は、相当するヒトＣＤ４０細胞外領域での、マウスＣＤ４０タンパク質の細胞外領域の一部の置換を含む。

【0504】

ヒト化マウスモデル（例えば、Ｂ－ｈＣＤ４０マウス、又は二重ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）は、ヒトにおける、且つマウスＣＤ４０又はＰＤ－Ｌ１を発現する通常のマウスにおいて、臨床結果の相違を著しく低減することによって、臨床設定において新たな治療的処置を試験する新たな手段を提供する。ヒト化ＣＤ４０、ヒト化ＰＤ－１及び二重ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウスモデルに関する詳細な説明は、その全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９１８４５及びＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９０３２０に記載されている。

【0505】

前出の生体内薬効性実験と同様に、結腸癌腫のマウスモデルにおいて生体内での腫瘍成長に対するその作用について抗体を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を発現するＭＣ－３８癌の腫瘍細胞（結腸腺癌細胞）を、二重ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍が容積約４００ｍｍ３に達した場合に、腫瘍容積に基づいて、マウスを異なる群にランダムに配置した（マウス８匹／群）。

【0506】

各群において、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブ（セリクレルマブ－ＩｇＧ２，Ｇ２）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ３）、１ｍｇ／ｋｇセリクレルマブを、１ｍｇ／ｋｇ １Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ４）、１．３５ｍｇ／ｋｇ １Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）、又は１．３５ｍｇ／ｋｇ １Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ６）と併せて、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与によって注入した。投与頻度は週に２回であった（合計６回の投与）。以下の表に詳細を示す。

【0507】

【表28】

【0508】

マウスの体重を全処置期間中、モニターした。異なる群のマウスの平均体重は、様々な程度にすべて増加した（図４５Ａ、及び図４５Ｂ）。処置期間の最後に、異なる群の中ですべてのマウスの体重が増えた。

【0509】

抗体で処置された群における腫瘍サイズを図４５Ｃに示す。以下の表に示すように、１７日目のＴＧＩＴＶ％（グループ化から１７日後）を計算した。以下の表におけるＰ値は、１７日目のデータに基づいて計算された。

【0510】

【表29】

【0511】

この結果から、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）及び１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ６）のどちらも、モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）及び抗体の組み合わせ（Ｇ４）よりも高いＴＧＩＴＶ％を有し（例えば、１７日目）、腫瘍成長を阻害したことが分かった。この結果から、ＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４及び１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４の融合タンパク質が、優れた有効性と共に、腫瘍成長を有意に阻害し得ることが示されている。

【0512】

他の実験において、ＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体の毒性をマウスにおいて試験した。二重ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（約７週齢）を、その体重に従って、異なる群（マウス３匹／群）にランダムに配置した。以下の抗体：抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブ（Ｇ２）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ３）、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）及び１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）の１つがランダムに選択され、グループ化の当日及びその後３日ごとに投与された。対照群（Ｇ１）にＰＢＳを注入した。

【0513】

【表30】

【0514】

図４６Ａ～４６Ｂに示すように、実験結果から、Ｇ２群マウスのみが有意な体重減少を示し、他の処置群のマウスの体重は、対照群マウスと比較して有意な差は示さないことが分かった。

【0515】

グループ化後７日目に、末梢血を採取して、アスパラギンアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の濃度を検出した。図４７Ａ～４７Ｂに示すように、ＡＬＴ及びＡＳＴ検出結果から、Ｇ２群マウス（抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブが投与された）は、ＡＬＴ及びＡＳＴアミノトランスフェラーゼ両方の最高濃度を有することが示された。二重特異性抗体群（Ｇ４～Ｇ５）におけるアミノトランスフェラーゼ濃度は、Ｇ２群よりも低かった。

【0516】

グループ化後１０日目に、マウス肝臓を単離し、顕微鏡下にて調べた。その結果を以下の表に示し、そこから、二重特異性抗体１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）の毒性が、モノクローナル抗体（Ｇ２－Ｇ３）及び１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）の毒性よりも低いことが分かった。

【0517】

この結果は、ＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体の３Ａ構造フォーマットが、抗ＣＤ４０抗体の毒性を有意に低減し得ることを意味する。さらに、この結果は、ＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体の３Ａ構造フォーマットが、ＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体のＨＣ構造フォーマットよりも低い毒性を示したことを意味する。

【0518】

【表31】

【0519】

他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて記載されているが、上述の説明は、例証することを意図し、本発明の範囲を制限するものではなく、それは、添付の特許請求の範囲によって定義されるものと理解されたい。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【図31D】

【図32A】

【図32B】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38A】

【図38B】

【図39A】

【図39B】

【図40】

【図41A】

【図41B】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45A】

【図45B】

【図45C】

【図46A】

【図46B】

【図47A】

【図47B】

【図48A】

【図48B】

【図48C】

【図48D】

【図48E】

【図48F】

【図48G】

【図48H】

【図48I】

【図48J】

【図49】

【図50】

【配列表】

2023524669000001.app

【国際調査報告】