(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-20
(54)【発明の名称】低エンドトキシンゼラチン－（メタ）アクリロイル
(51)【国際特許分類】
C07K 14/78 20060101AFI20230613BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230613BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20230613BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20230613BHJP
A61L 27/52 20060101ALI20230613BHJP
A61L 27/40 20060101ALI20230613BHJP
C09K 3/00 20060101ALI20230613BHJP
【ＦＩ】
C07K14/78
A61K47/42
A61K9/06
A61L27/22
A61L27/52
A61L27/40
C09K3/00 103L
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022570316
(86)(22)【出願日】2021-05-19
(85)【翻訳文提出日】2022-11-16
(86)【国際出願番号】 EP2021063257
(87)【国際公開番号】W WO2021233981
(87)【国際公開日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】BE2020/5347
(32)【優先日】2020-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】BE
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522448986
【氏名又は名称】ルスロ・ベーフェー
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ビョルン・ヴェルグエン
(72)【発明者】
【氏名】エルケ・デ・クラーク
【テーマコード（参考）】
4C076
4C081
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076EE42
4C081AB12
4C081BB06
4C081CD15
4C081DA12
4C081DC01
4C081EA02
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA52
(57)【要約】
本発明は、低発熱活性、特に低リポ多糖含有量を有するメタクリロイル-ゼラチン及びアクリロイル-ゼラチンに関する。(メタ)アクリロイル-ゼラチンは更に、低(メタ)アクリル酸含有量を特徴とする。本発明は更に、前記(メタ)アクリロイル-ゼラチンを調製する方法であって、透析工程を必要としない方法にも関する。本発明は更に、本(メタ)アクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲル、並びに組織工学応用のためのその使用及びバイオインク又はバイオ樹脂としてのその使用にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
メタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾されており、100EU/g未満、好ましくは50EU/g未満、より好ましくは20EU/g未満、更により好ましくは10EU/g未満、更により好ましくは5EU/g未満、更により好ましくは2EU/g未満、最も好ましくは1EU/g未満のリポ多糖含有量を有し、メタクリル酸若しくはアクリル酸含有量を水に溶解しているゼラチンの試料で決定して、30ppm未満のメタクリル酸若しくはアクリル酸、又はメタクリル酸若しくはアクリル酸含有量を50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解しているゼラチンの試料で決定して、100ppm未満のメタクリル酸若しくはアクリル酸を含む、ゼラチン。
【請求項2】
低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質、有鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスRNA、及び非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNAを有し、好ましくは低含有量のグラム陽性菌由来及び有鞭毛細菌由来の発熱物質を有し、より好ましくは低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質を有する、請求項1に記載のゼラチン。
【請求項3】
Aタイプゼラチンである、請求項1又は2に記載のゼラチン。
【請求項4】
20%～100%、好ましくは50%～100%、より好ましくは80%～100%のメタクリルアミド置換度又はアクリルアミド置換度を有し、10%未満のメタクリレート置換度を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載のゼラチン。
【請求項5】
アセチル基若しくは部分、フェノール基若しくは部分、チオール基若しくは部分、ノルボルネン基若しくは部分、テトラジン基若しくは部分、アジド基若しくは部分、フラン基若しくは部分、又はそれらの任意の組合せで更に修飾されている、請求項1から4のいずれか一項に記載のゼラチン。
【請求項6】
請求項1から5のいずれか一項に記載のメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾されているゼラチンと、架橋剤とを含むヒドロゲル。
【請求項7】
請求項6に記載のヒドロゲルを含むフィルム。
【請求項8】
請求項1から5のいずれか一項に記載のメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾されているゼラチンを調製する方法であって、a)ゼラチンをメタクリル無水物又はアクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンをメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾する工程と、
b)反応媒体のpHを、2.0～4.0、好ましくは3.0～4.0、より好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
c)0.01～1.5w/w%のミセル形成性界面活性剤を酸性反応媒体に添加する工程と、
d)工程c)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を回収する工程と
を含む。方法。
【請求項9】
請求項1から5のいずれか一項に記載のメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾されているゼラチンを調製する方法であって、a)ゼラチンをメタクリル無水物又はアクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンをメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾する工程と、
b1)反応媒体のpHを、4.0～9.0、好ましくは4.0～6.0、より好ましくは4.0～6.0、更により好ましくは4.5～5.5の値に下げる工程と、
c)0.01～1.5w/w%のミセル形成性界面活性剤を反応媒体に添加する工程と、
b2)工程c)の媒体のpHを2.0～4.0、好ましくは3.0～4.0、より好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
d)工程b2)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を回収する工程と
を含む、方法。
【請求項10】
透析工程を含まない、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項11】
前記ミセル形成性界面活性剤が、非イオン界面活性剤を含み、好ましくは界面活性剤が、Triton X-100若しくはTriton X-102、又はそれらの混合物である、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記固体吸着剤が、疎水性吸着剤、好ましくは活性炭である、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を乾燥させる工程を更に含む、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
医薬における使用のための、請求項1から5のいずれか一項に記載のゼラチン又は請求項6に記載のヒドロゲル。
【請求項15】
組織若しくは器官、又はそれらの一部分、コーティング、スキャフォールド、或いは放出制御剤形等の生物学的構築物を製造するための、請求項1から5のいずれか一項に記載のゼラチン又は請求項6に記載のヒドロゲルのインビトロでの又はインビボでの使用。
【請求項16】
請求項1から5のいずれか一項に記載のゼラチン又は請求項6に記載のヒドロゲルの、バイオインク又はバイオ樹脂としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、一般に、化学的に官能化されているゼラチン、特にメタクリロイル-ゼラチン及びアクリロイル-ゼラチンに関する。更に詳細には、本発明は、低発熱活性、特に低リポ多糖含有量のメタクリロイル-ゼラチン及びアクリロイル-ゼラチン、前記メタクリロイル-ゼラチン又はアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲル、前記メタクリロイル-ゼラチン及びアクリロイル-ゼラチンを調製する方法並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
臨床、診断又は医薬品研究のための機能性生体組織の再構成、生体インプラント、及び細胞ベースの多臓器モデルは、高い注目を浴びる。ヒドロゲルは、天然細胞外マトリックスに対するその類似性のためにさまざまな組織工学応用の有力候補として現れた。
【0003】
ゼラチンヒドロゲルは、その生体適合性及び生分解性のため特に魅力的である。ゼラチンは、体内に最も大量に存在するタンパク質及び細胞外マトリックスの最も広く行き渡っている分子であるコラーゲンの部分加水分解によって生成される。細胞認識配列アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)が大量に存在することによって、細胞のゼラチンへの付着が促進され、細胞の拡散及び増殖を促進する。これらの細胞-マトリックス相互作用は、複合組織の構造にきわめて重大である。ゼラチンは、医薬品業界内で信頼を受けた添加物として長い歴史があるため、最高水準の安全性及び規制順守を満たしている。更に、遊離アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシレート基が存在すれば、化学修飾によって、特定の用途に所望の特性を達成することが可能になる。
【0004】
ゼラチンヒドロゲルは、ゼラチンポリマーを、事前の修飾なしに又はそれらの側基の官能化後に架橋することによって製作される。ゼラチン主鎖への官能基付加は、ヒドロゲル設計及び特性を高度に制御する架橋の戦略である。ゼラチンを架橋するために最も広範囲に使用され、研究された修飾は、メタクリロイル化である。MA修飾ゼラチンは、一般にgelMAと呼ばれる。十分に確立したメタクリロイル-ゼラチンに代わりうるものは、アクリロイル-ゼラチンである(Billietら、2013、「Quantitative Contrasts in the Photopolymerization of Acrylamide and Methacrylamide-Functionalized Gelatin Hydrogel Building Blocks」、Macromolecular Bioscience、13:1531-45)。(メタ)アクリロイル化度及びポリマー濃度に応じて、ゼラチン-(メタ)アクリロイルヒドロゲルの物理的特性(架橋密度、膨潤及び剛性)が作製されうる。それによって、この材料は、さまざまな組織工学応用にとって用途の広い基盤になる。架橋は、使用される光開始剤(例えば、Irgacure(登録商標) 2959又はフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP))に応じてUV又は可視光によって発生されるラジカルによって開始される。
【0005】
(バイオ)医療用途向けのゼラチンベースのヒドロゲルの大きな欠点の1つは、従来から製造されているゼラチン中に(本明細書ではリポ多糖とも呼ばれる)エンドトキシンが存在していることである。エンドトキシンは、大型の高免疫原性分子であり、グラム陰性菌の外膜の主要成分である。それらは、高耐熱性であり、不活性化が困難になる。免疫系に曝露されると、エンドトキシンは、免疫応答を開始させ、組織炎症、他のアレルゲンに対する感受性の増加、及び致死的ショックのリスクを引き起こすおそれがある。大部分の研究は、高エンドトキシンレベルのゼラチンをベースにするgelMAを用いて現在実施されている。
【0006】
従来から製造されているゼラチンは、エンドトキシン以外の微生物成分でも汚染されるおそれがあり、それらの一部は、エンドトキシンのように、ヒトにおいて有害な免疫応答を引き起こすおそれがある。非エンドトキシン発熱物質としては、例えばグラム陽性菌に起源をもつリポテイコ酸(LTA)、並びに真菌、酵母、ウイルス、細菌、及び寄生虫に起源をもつ他の化合物等の物質が挙げられる(Hasiwaら、(2013)、「Evidence for the detection of non endotoxin pyrogens by the whole blood monocyte activation test」、ALTEX 30:169-208)。これらの非エンドトキシン発熱物質、好ましくは一般発熱物質又は病原体関連分子パターン(PAMP)は、自然免疫受容体の活性化時における望ましくない副作用を予防するために、ゼラチンベースのヒドロゲルの(バイオ)医療用途に対して最小値に維持されるべきでもある。
【0007】
更に、ゼラチンのゼラチンヒドロゲルへの官能化及び架橋の間に、いくつかの試薬が使用される。試薬及び反応生成物の残渣が、gelMA中に存在しうる。例えば、ゼラチンをメタクリル酸無水物と反応させると、有害と考えられるメタクリル酸無水物(MAAH)及び/又はメタクリル酸(MAA)がgelMA中に存在しうる。MAAは、曝露の濃度及び頻度又は時間に応じて、適用部位において有害作用を引き起こすおそれがある。無希釈の酸は、SIDS初期評価プロファイル(SIAM 11、2001)によって、皮膚及び眼腐食並びに気道病変を引き起こすということが示された。未反応のメタクリル酸無水物及びメタクリル酸は、蒸留水透析により反応混合物から除去されうる。典型的に、透析は1週間行われるが、本明細書ではより短期間及びより長期間の透析も想定される。したがって、この時間消費型の工程は、gelMAの大規模生産にとって効率的でない。更に、この(1週間の)透析の間に、微生物汚染及びゼラチン分解のリスクが増加し、全体的に見て、プロセスを難しくする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】WO 2016/085345
【特許文献2】WO 2009/15440
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Billietら、2013、「Quantitative Contrasts in the Photopolymerization of Acrylamide and Methacrylamide-Functionalized Gelatin Hydrogel Building Blocks」、Macromolecular Bioscience、13:1531-45
【非特許文献2】Hasiwaら、(2013)、「Evidence for the detection of non endotoxin pyrogens by the whole blood monocyte activation test」、ALTEX 30:169-208
【非特許文献3】Olijveら、2000、Journal of Colloid and Interface Science、243: 476-482
【非特許文献4】Habeeb、1996、Anal. Biochem.、14:328-336
【非特許文献5】Hochら、2012、Chemical tailoring of gelatin to adjust its chemical and physical properties for functional bioprinting、J. Mater. Chem. B、1:5675
【非特許文献6】Burger-Kentischerら、(2010) A new cell-based innate immune receptor assay for the examination of receptor activity, ligand specificity, signaling pathways and the detection of pyrogens、J Immunol Methods、358: 93-103
【非特許文献7】Van Den Bulckeら、2000、Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels、Biomacromolecules、1:31-38
【非特許文献8】Pahoffら(2019、J. Mater Chem. B、7:1761-1772
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
ゼラチンベースのヒドロゲルの(バイオ)医療用途では、所望の機械的特性(例えば、強度及び弾性)を有するヒドロゲルを作製することができる生体適合性(メタ)アクリロイルゼラチン(例えば、生体組織に対して非毒性であり、非免疫原性である)が必要とされている。そのような(メタ)アクリロイルゼラチンを、工業規模の生産を可能にする効率的方法によって製造する必要もある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、先行技術の上記の課題の1つ又は複数を解決する。特に、発熱物質含有量が低く、特にエンドトキシン含有量が低く、メタクリル酸又はアクリル酸の汚染が低い、メタクリロイル-ゼラチン及びアクリロイル-ゼラチンが提供される。(メタ)アクリロイル-ゼラチンは、発熱物質含有量が低く、特にエンドトキシン含有量が低いために、改善された生体適合性を有する。本発明の(メタ)アクリロイル-ゼラチンは、架橋プロセスに干渉することが示されているメタクリル酸又はアクリル酸による汚染が低いために、架橋するのに特に有用である。また有利なことに、(メタ)アクリロイル-ゼラチンは、(非常に長い)透析工程を必要としない簡単な製造方法によって調製されうる。
【0012】
本発明は、特に下記の番号を付した態様及び実施形態(i)から(xvi)のいずれか1つによって、又はそれらの1つ若しくは複数の任意の組合せによって理解される。
【0013】
(i)メタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾されており、100EU/g未満、好ましくは50EU/g未満、より好ましくは20EU/g未満、更により好ましくは10EU/g未満、更により好ましくは5EU/g未満、更により好ましくは2EU/g未満、最も好ましくは1EU/g未満のリポ多糖含有量を有し、メタクリル酸若しくはアクリル酸含有量を、水に溶解しているゼラチンの試料で決定して、30ppm未満のメタクリル酸若しくはアクリル酸を含み、又はメタクリル酸若しくはアクリル酸含有量を、50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解しているゼラチンの試料で決定して、100ppm未満のメタクリル酸若しくはアクリル酸を含む、ゼラチン。
【0014】
(ii)低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質、有鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスRNA、及び非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNAを有し、好ましくは低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質及び有鞭毛細菌由来の発熱物質を有し、より好ましくは低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質を有する、(i)に記載のゼラチン。
【0015】
(iii)Aタイプゼラチンである、(i)又は(ii)に記載のゼラチン。
【0016】
(iv)20%～100%、好ましくは50%～100%、より好ましくは80%～100%のメタクリルアミド置換度又はアクリルアミド置換度を有し、10%未満のメタクリレート置換度を有する、(i)から(iii)のいずれか1つに記載のゼラチン。
【0017】
(v)アセチル基若しくは部分、フェノール基若しくは部分、チオール基若しくは部分、ノルボルネン基若しくは部分、テトラジン基若しくは部分、アジド基若しくは部分、フラン基若しくは部分、又はそれらの任意の組合せで更に修飾されている、(i)から(iv)のいずれか1つに記載のゼラチン。
【0018】
(vi)(i)から(v)のいずれか1つに記載のメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾されているゼラチンと、架橋剤とを含むヒドロゲル。
【0019】
(vii)(vi)に記載のヒドロゲルを含むフィルム。
【0020】
(viii)(i)から(v)のいずれか1つに記載のメタクリロイル基又はアクリロイルで修飾されているゼラチンを調製する方法であって、
a)ゼラチンをメタクリル無水物又はアクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンをメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾する工程と、
b)反応媒体のpHを、2.0～4.0、好ましくは2.0～3.5又は3～4、より好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
c)0.01～1.5w/w%のミセル形成性界面活性剤を酸性反応媒体に添加する工程と、
d)工程c)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を回収する工程と
を含む、方法。
a)ゼラチンをメタクリル無水物又はアクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンをメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾する工程と、
b)反応媒体のpHを、2.0～4.0、好ましくは2.0～3.5又は3～4、より好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
c)0.01～1.5w/w%のミセル形成性界面活性剤を酸性反応媒体に添加する工程と、
d)工程c)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を回収する工程と
を含む、方法。
【0021】
(ix)(i)から(v)のいずれか1つに記載のメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾されているゼラチンを調製する方法であって、
a)ゼラチンをメタクリル無水物又はアクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンをメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾する工程と、
b1)反応媒体のpHを、4.0～9.0、好ましくは4.0～6.0、より好ましくは4.0～6.0、更により好ましくは4.5～5.5の値に下げる工程と、
c)0.01～1.5w/w%のミセル形成性界面活性剤を反応媒体に添加する工程と、
b2)工程c)の媒体のpHを2.0～4.0、好ましくは3.0～4.0、より好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
d)工程b2)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を回収する工程と
を含む、方法。
a)ゼラチンをメタクリル無水物又はアクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンをメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾する工程と、
b1)反応媒体のpHを、4.0～9.0、好ましくは4.0～6.0、より好ましくは4.0～6.0、更により好ましくは4.5～5.5の値に下げる工程と、
c)0.01～1.5w/w%のミセル形成性界面活性剤を反応媒体に添加する工程と、
b2)工程c)の媒体のpHを2.0～4.0、好ましくは3.0～4.0、より好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
d)工程b2)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を回収する工程と
を含む、方法。
【0022】
(x)透析工程を含まない、(viii)又は(ix)に記載の方法。
【0023】
(xi)前記ミセル形成性界面活性剤が、非イオン界面活性剤を含み、好ましくは界面活性剤が、Triton X-100若しくはTriton X-102、又はそれらの混合物である、(viii)から(x)のいずれか1つに記載の方法。
【0024】
(xii)前記固体吸着剤が、疎水性吸着剤、好ましくは活性炭である、(viii)から(xi)のいずれか1つに記載の方法。
【0025】
(xiii)メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を乾燥させる工程を更に含む、(viii)から(xii)のいずれか1つに記載の方法。
【0026】
(xiv)医薬における使用のための、(i)から(v)のいずれか1つに記載のゼラチン又は(vi)に記載のヒドロゲル。
【0027】
(xv)組織若しくは器官、又はそれらの一部分、コーティング、スキャフォールド、或いは放出制御剤形等の生物学的構築物を製造するための、(i)から(v)のいずれか1つに記載のゼラチン又は(vi)に記載のヒドロゲルの試験管内又は生体外での使用。
【0028】
(xvi)(i)から(v)のいずれか1つに記載のゼラチン又は(vi)に記載のヒドロゲルのバイオインク又はバイオ樹脂としての使用。
【0029】
本出願の教示を以下に示す図によって説明するが、これらの図は、例示としてのみ考慮すべきあって、特許請求の範囲を決して限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】gelMA中の汚染MAAの、gelMAベースのヒドロゲルの貯蔵弾性率(G')に対する効果を示す図である。0、100、300又は600ppmの遊離MAAがドープされたgelMA溶液をベースとするヒドロゲルの、20℃における最終G'(Pa、最後の10分の平均)。
【発明を実施するための形態】
【0031】
別段の定義がない限り、科学技術用語を含めて、本発明を開示する際に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術の当業者が通常理解している意味を有する。更なる指針によって、用語の定義が、本発明の教示をよりよく理解するために含まれる。
【0032】
本明細書では単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈上からそうでないことがはっきりしていない限り単数の指示物も複数の指示物も含む。
【0033】
本明細書では用語「～を含んでいる(comprising)」、「～を含む(comprises)」及び「～からなる(comprised of)」は、「～を含んでいる(including)」、「～を含む(includes)」又は「～を含んでいる(containing)」、「～を含む(contains)」と同義であり、包括的又は非限定的であり、列挙されていない追加の部材、構成要素又は方法工程を排除しない。いくつかの構成要素又は工程を含む実施形態が言及されている場合、列挙された構成要素又は工程から本質的になる実施形態も包含される。
【0034】
終点による数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に包含されるすべての数値及び分数、並びに列挙された終点を含む。
【0035】
パラメータ、量、時間的期間等の測定可能な値を参照するとき本明細書で使用される用語「約」は、指定された値のまたそれからの+/-10%以下、好ましくは+/-5%以下、より好ましくは+/-1%以下、更により好ましくは+/-0.1%以下のばらつきを、開示された本発明においてそのようなばらつきが機能することが適切である限り包含することになっている。修飾語「約」が指す値はそれ自体も、具体的に好ましくは開示されていることを理解すべきである。
【0036】
本明細書に引用されたすべての文献は、参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる。
【0037】
本出願は、一般に、ゼラチンを架橋して、例えばゼラチンベースのヒドロゲル及びフィルムを調製するための官能化ゼラチンに関する。更に詳細には、本出願は、メタクリロイル-ゼラチン及びアクリロイル-ゼラチンに関する。
【0038】
ゼラチンは、コラーゲンに由来する水溶性タンパク質の混合物である。ゼラチンは、当技術分野において公知のように、例えばウシ、ブタ、家禽又は魚由来の皮膚、腱、靱帯、骨等の水性抽出によって得られたコラーゲンの例えば酸又はアルカリ条件での部分加水分解によって、或いは酵素加水分解によって得られる。酸処理によって得られたゼラチンは、「Aタイプゼラチン」と呼ばれるが、「Bタイプゼラチン」はアルカリベースのプロセスに由来する。Bタイプゼラチンにおけるアスパラギン及びグルタミンのより広範な脱アミノ化のために、Aタイプゼラチン及びBタイプゼラチンは、それぞれpH7.0～9.0及びpH4.9～5.1に等電点(IEP)があり、中性の生理的pHにおいては正及び負に帯電することができる。好ましい実施形態において、本発明は、Aタイプゼラチンに関する。
【0039】
ゼラチンは、均一なタンパク質分子を構成しないが、不定量の、不定の長さのタンパク質分子を含む。好ましくは、本明細書で使用されるゼラチンは、1500Da～300kDaの範囲内、好ましくは2000Da～300kDa、4000Da～300kDa、5000Da～300kDa、10kDa～300kDa、又は20kDa～300kDa、より好ましくは50kDa～300kDa、最も好ましくは100kDa～300kDa、例えば100kDa～275kDa又は100kDa～250kDaの平均分子量を有する。ゼラチンの分子量分布は、通常サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(HPLC)技法によって測定され、溶離した画分は、UV吸着で検出され、測定されたデータは、好適なソフトウェアによって評価され、すべての技法は当技術分野において公知である。例えば、Olijveら(2000、Journal of Colloid and Interface Science、243: 476-482)を参照のこと。
【0040】
本明細書では用語「ゼラチン」は、化学修飾ゼラチンを含めて「ゼラチン誘導体」も包含する。本明細書では表現「化学基又は部分(例えば、メタクリロイル基又はアクリロイル基、アセチル基若しくは部分、フェノール基若しくは部分等)で修飾されているゼラチン」は、例えばゼラチンの少なくとも1つのアミン基、少なくとも1つのヒドロキシル基、少なくとも1つのカルボキシル基及び/又は少なくとも1つのフェノール基に結合している前記化学基又は部分(例えば、メタクリロイル基又はアクリロイル基、アセチル基若しくは部分、フェノール基若しくは部分等)を含むゼラチンを表す。
【0041】
本明細書では「メタクリロイル基で修飾されているゼラチン」は、本明細書では「メタクリロイル修飾ゼラチン」、「メタクリロイル置換ゼラチン」又は「メタクリロイル-ゼラチン」又は「ゼラチンメタクリロイル」又は「gelMA」とも呼ばれ、少なくとも1つのメタクリルアミド基及び/又は少なくとも1つのメタクリレート基で置換されている遊離アミン及び/又は遊離ヒドロキシルを有するゼラチンと定義される。本明細書では「アクリロイル基で修飾されているゼラチン」は、本明細書では「アクリロイル修飾ゼラチン」、「アクリロイル置換ゼラチン」又は「アクリロイル-ゼラチン」又は「ゼラチンアクリロイル」とも呼ばれ、少なくとも1つのアクリルアミド基及び/又は少なくとも1つのアクリレート基で置換されている遊離アミン及び/又は遊離ヒドロキシルを有するゼラチンと定義される。ゼラチンは、アミノ酸を含み、それらの一部は、アミン(例えば、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン)又はヒドロキシル(例えば、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、ヒドロキシプロリン)を末端とする側鎖を有する。これらの末端のアミン及び/又はヒドロキシルの1つ又は複数は、(メタ)アクリロイル基で置換されて、それぞれ(メタ)アクリルアミド基及び/又は(メタ)アクリラート基を含む(メタ)アクリロイル-ゼラチンを生成することができる。
【0042】
ゼラチンの「官能化度(DoF)」は、一般に、官能化されている第一級アミン基及び/又はヒドロキシル基/第一級アミン基及び/又はヒドロキシル基の全体の百分率を指す。本明細書では「(メタ)アクリルアミド置換度度」は、(メタ)アクリルアミド基で置換されているゼラチン中の遊離アミン基の百分率を指す。本明細書では「(メタ)アクリレート置換度」は、(メタ)アクリラート基で置換されているゼラチン中の遊離ヒドロキシル基の百分率を指す。ゼラチンの(メタ)アクリルアミド置換度及び/又は(メタ)アクリレート置換度等の官能化度は、それ自体公知の方法によって決定されうる。例えば、Fe(III)-アセトヒドロキサム酸法は、ヒドロキシル基における(メタ)アクリレート化を決定するのに使用されうる。Habeeb法((メタ)アクリルアミドのトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)ベースの吸光光度決定;Habeeb、1996、Anal. Biochem.、14:328-336)、1H-NMR及びフルオロアルデヒドアッセイ((メタ)アクリルアミドのo-フタルジアルデヒド(OPA)ベースの蛍光光度決定としても知られている)は、アミン基における(メタ)アクリレート化を決定するのに使用されうる。アミン基転化率を定量するフルオロアルデヒドアッセイと(メタ)アクリラート基を定量するFe(III)-アセトヒドロキサム酸法の組合せ等上記の方法の組合せを使用することもでき、(メタ)アクリラートの(メタ)アクリルアミド基に対する比を決定することができる。実施形態において、フルオロアルデヒドアッセイは、(メタ)アクリルアミド置換度を決定するのに使用される。
【0043】
本明細書に開示される(メタ)アクリロイル-ゼラチンにおいて、(メタ)アクリロイル化は、好ましくは遊離アミン基において行われる。実施形態において、メタクリロイル-ゼラチンは、20%～100%、好ましくは50%～100%、より好ましくは80%～100%、例えば85%～100%、90%～100%又は95%～100%のメタクリルアミド置換度を有する。実施形態において、メタクリロイル-ゼラチンは、20%未満、好ましくは10%、9%、8%、7%又は6%未満、より好ましくは5%、4%、3%、2%又は1%未満のメタクリレート置換度を有する。実施形態において、メタクリロイル-ゼラチンは、20%～100%のメタクリルアミド置換度及び20%未満のメタクリレート置換度、好ましくは20%～100%のメタクリルアミド置換度及び10%未満のメタクリレート置換度、より好ましくは50%～100%のメタクリルアミド置換度及び10%未満のメタクリレート置換度、更により好ましくは80%～100%のメタクリルアミド置換度及び10%未満のメタクリレート置換度を有する。
【0044】
実施形態において、メタクリロイル-ゼラチンは、メタクリルアミド置換及びメタクリラレート置換を含み、メタクリルアミド置換のメタクリラレート置換に対する比は、80:20～99:1、好ましくは90:10～99:1、より好ましくは95:5～99:1である。
【0045】
実施形態において、アクリロイル-ゼラチンは、20%～100%、好ましくは50%～100%、より好ましくは80%～100%、例えば85%～100%、90%～100%又は95%～100%のアクリルアミド置換度を有する。実施形態において、アクリロイル-ゼラチンは、20%未満、好ましくは10%、9%、8%、7%又は6%未満、より好ましくは5%、4%、3%、2%又は1%未満のアクリレート置換度を有する。実施形態において、アクリロイル-ゼラチンは、20%～100%のアクリルアミド置換度及び20%未満のアクリレート置換度、好ましくは20%～100%のアクリルアミド置換度及び10%未満のアクリレート置換度、より好ましくは50%～100%のアクリルアミド置換度及び10%未満のアクリレート置換度、更により好ましくは80%～100%のアクリルアミド置換度及び10%未満のアクリレート置換度を有する。
【0046】
実施形態において、アクリロイル-ゼラチンは、アクリルアミド置換及びアクリレート置換を含み、アクリルアミド置換のアクリレート置換に対する比は、80:20～99:1、好ましくは90:10～99:1、より好ましくは95:5～99:1である。
【0047】
本明細書に開示される(メタ)アクリロイル-ゼラチンは、更に修飾及び/又は官能化されうる。実施形態において、(メタ)アクリロイル-ゼラチンは、アセチル基若しくは部分、フェノール基若しくは部分、チオール基若しくは部分、ノルボルネン基若しくは部分、テトラジン基若しくは部分、アジド基若しくは部分、フラン基若しくは部分、ガラクトシル基若しくは部分、又はそれらの任意の組合せ、好ましくはアセチル基で更に修飾される。二重化学的官能化ゼラチン(メタ)アクリロイルアセチルは、Hochら(2012、Chemical tailoring of gelatin to adjust its chemical and physical properties for functional bioprinting、J. Mater. Chem. B、1:5675)に記載されているように生成されうる。
【0048】
本明細書に開示されるgelMA及びアクリロイル-ゼラチンは、低発熱活性を有する。発熱活性は、当技術分野において公知の単球活性化試験(MAT)アッセイを使用して測定されうる。MATアッセイによって、エンドトキシン発熱物質レベルと非エンドトキシン発熱物質レベルの両方を定量することができるが、PAMP汚染のタイプは区別されない。細胞ベース発熱物質検出アッセイ(PAMPアッセイ)が、さまざまなPAMP、更に非エンドトキシンの検出及び定量化のためにFraunhofer Institute for Interfacial Engineering and Biotechnology IGB社によって開発された。この細胞ベースの試験システムは、ヒトToll様受容体(TLR)を使用してPAMPを検出する(Burger-Kentischerら、(2010) A new cell-based innate immune receptor assay for the examination of receptor activity, ligand specificity, signaling pathways and the detection of pyrogens、J Immunol Methods、358: 93-103)。更に詳細には、細胞、例えばNIH3T3細胞は、さまざまなPAMPの検出を可能にするさまざまなTLR組合せを発現する。例えば、受容体組合せTLR1/2、TLR2/6、TLR4/CD14、TLR5、TLR7及びTLR9を有する細胞系は、グラム陽性菌(TLR1/2、TLR2/6)由来の発熱物質、有鞭毛細菌(TLR5)由来の発熱物質、一本鎖ウイルスRNA(TLR7)の検出を可能にし、細胞系TLR4/CD14は、グラム陰性菌由来のエンドトキシンの検出を可能にし、TLR9細胞系は、非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNAを検出する。実施形態において、本明細書に開示されるgelMA及びアクリロイル-ゼラチンは、低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質、有鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスRNA、グラム陰性菌由来のエンドトキシン、及び非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNAを有する。
【0049】
特定の実施形態において、gelMA及びアクリロイル-ゼラチンは、低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質及び有鞭毛細菌由来の発熱物質を有し、更に詳細には低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質を有する。
【0050】
特定の実施形態において、本明細書に開示されるgelMA及びアクリロイル-ゼラチンは、低エンドトキシン含有量又はリポ多糖(LPS)含有量、特に100EU/g未満、より好ましくは50EU/g未満、更により好ましくは20EU/g未満、更により好ましくは10EU/g未満、更により好ましくは5EU/g未満、更により好ましくは2EU/g未満、最も好ましくは1EU/g未満のLPS含有量を特徴とする。別の特定の実施形態において、本明細書に開示されるgelMA及びアクリロイル-ゼラチンは、Aタイプゼラチン(由来)であり、100EU/g未満、より好ましくは50EU/g未満、更により好ましくは20EU/g未満、更により好ましくは10EU/g未満、更により好ましくは5EU/g未満、更により好ましくは2EU/g未満、最も好ましくは1EU/g未満のLPS含有量を特徴とする。他の別の特定の実施形態において、本明細書に開示されるgelMA及びアクリロイル-ゼラチンは、Bタイプゼラチン(由来)であり、20EU/g未満、好ましくは10EU/g未満、より好ましくは5EU/g未満、更により好ましくは2EU/g未満、最も好ましくは1EU/g未満のLPS含有量を特徴とする。用語EUは、当技術分野において公知であり、「エンドトキシン単位」を反射する。1EUは、100pgの大腸菌リポ多糖におよそ等しく、約104～105細菌中に存在する量である。本明細書では用語EU/gは、ゼラチン/gelMAの乾燥質量1g当たりのEU数を反映する。リムルスアッセイ(LAL)は、LPSのサブプログラム量までを測定するための当技術分野において周知のバイオアッセイである。リムルスアメボサイトライセート(LAL)は、カブトガニ(リムルス・ポリフェムス(Limulus polyphemus))由来の血球(アメボサイト)の水性抽出物である。LALは、細菌エンドトキシン又はリポ多糖と反応する。この反応は、LAL試験の基礎であり、その場合細菌エンドトキシンの検出及び定量化に使用される。例えば、LPSレベルを定量するのに適したLAL法は、例えばCharles River USA社からの発色Endosafe法である。認められ推奨される他の方法は、Hyglos GmbH社(Germany)からのEndoZyme組換えC因子法である。前記方法は共に、同様又は同一の測定値をもたらし、したがって同義に使用されうる。
【0051】
また有利なことに、本明細書に開示されるgelMA及びアクリロイル-ゼラチンは、試薬及び反応生成物を実質的に含まない。実施形態において、本明細書に開示されるメタクリロイル-ゼラチンは、150ppm未満のMAA又は100ppm未満のMAA又は50ppm未満のMAA、好ましくは30ppm未満のMAA、より好ましくは25ppm未満のMAA、更により好ましくは20ppm未満のMAAを含む。実施形態において、本明細書に開示されるメタクリロイル-ゼラチンは、150ppm未満のMAA、例えば140ppm未満のMAA、130ppm未満のMAA、120ppm未満のMAA又は110ppm未満のMAA、好ましくは100ppm未満のMAA、例えば90ppm未満のMAA、80ppm未満のMAA、70ppm未満又は60ppm未満を含み、MAA含有量は、50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解しているメタクリロイル-ゼラチンの試料で決定される。実施形態において、本明細書に開示されるメタクリロイル-ゼラチンは、100ppm未満のMAA又は50ppm未満のMAA、好ましくは30ppm未満のMAA、より好ましくは25ppm未満のMAA、更により好ましくは20ppm未満のMAAを含み、MAA含有量は、水に溶解しているメタクリロイル-ゼラチンの試料で決定される。実施形態において、本明細書に開示されるアクリロイル-ゼラチンは、100ppm未満のアクリル酸又は50ppm未満のアクリル酸、好ましくは30ppm未満のアクリル酸、より好ましくは25ppm未満のアクリル酸、更により好ましくは20ppm未満のアクリル酸を含む。MAAは、実施例に詳述されるように、特にgelMA又はアクリロイル-ゼラチンの試料を水又は50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解し、溶解された試料の(例えば、10kDaのAmicon超遠心濾過機を使用した)限外濾過及び濾液のHPLC分析によって測定されうる。本発明者らによって示されるように、gelMA中のメタクリル酸の残渣は、gelMA分子の架橋に干渉するおそれがある。本明細書に開示されるgelMAは、そのメタクリル酸含有量が低いために、架橋して、ヒドロゲル又はフィルムを形成するのに特に適している。
【0052】
したがって、別の態様は、本明細書に開示される架橋gelMA又は架橋アクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルに関する。前記ヒドロゲルに由来する生成物、例えばフィルム、生体接着剤等が、本明細書に更に開示される。
【0053】
本明細書では用語「ヒドロゲル」は、ゲルを形成する、架橋gelMA又は架橋アクリロイル-ゼラチン等親水性ポリマー鎖の網目を指す。用語「ゲル」は、定常状態のとき流動を示さない実質的に希薄な架橋系を表す。
【0054】
gelMA及びアクリロイル-ゼラチンを架橋するプロセスは、当技術分野において周知である。典型的に、光開始剤の存在下で露光時に、あるゼラチン分子の(メタ)アクリロイル基は別のゼラチン分子の(メタ)アクリロイル基と反応して、(メタ)アクリロイルゼラチンを架橋することができる。
【0055】
本明細書では用語「光開始剤」は、光、例えば紫外線(UV)又は可視光(VIS)に曝露するとフリーラジカルに分解する任意の化学化合物、又は化合物の混合物を指す。紫外光開始剤の非限定例としては、1-[4-(2-ヒドロキシエトキシ)-フェニル]-2-ヒドロキシ-2-メチル-l-プロパン-1-オン(販売名Irgacure(登録商標) 2959でも知られている)及びフェニル-2,4,6-トリ-メチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)が挙げられる。可視光光開始剤は、可視光に曝露されるとフリーラジカルを生成する。可視光光開始剤を励起させるのに有用な可視光の例示的な範囲としては、緑、青、インジゴ、及び紫が挙げられる。好ましくは、可視光は、450～550nmの範囲の波長を有する。可視光光開始剤の非限定例としては、エオシンY、リボフラビン/トリエタノールアミン、ビニルカプロラクタム、dl-2,3-ジケト-1,7,7-トリメチルノルカンファン(CQ)、1-フェニル-1,2-プロパジオン(PPD)、2,4,6-トリメチルベンゾイル-ジフェニルホスフィンオキシド(TPO)、ビス(2,6-ジクロロベンゾイル)-(4-プロピルフェニル)ホスフィンオキシド(Ir819)、4,4'-ビス(ジメチルアミノ)ベンゾフェノン、4,4'-ビス(ジエチルアミノ)ベンゾフェノン、2-クロロチオキサンテン-9-オン、4-(ジメチルアミノ)ベンゾフェノン、フェナントレンキノン、フェロセン、ジフェニル(2,4,6-トリメチルベンゾイル)ホスフィンオキシド/2-ヒドロキシ-2-メチルプロピオフェノン(50/50ブレンド)、ジベンゾスベレノン、(ベンゼン)トリカルボニルクロム、レサズリン、レゾルフィン、ベンゾイルトリメチルゲルマン(Ivocerin(登録商標))、それらの誘導体、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
【0056】
光照射時間は、ポリマーの架橋を可能にするのに適した任意の時間とすることができる。例えば、照射時間は、10秒～20分、好ましくは1分～20分、より好ましくは2～15分(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15分)の範囲とすることができる。
【0057】
ゼラチンベースのヒドロゲルの機械的特性は、例えば使用されたゼラチンの分子量によって、(メタ)アクリロイル置換度、gelMA又はアクリロイル-ゼラチン濃度、光開始剤の量、及び露光時間を変更することによってさまざまな用途に調整されうる。
【0058】
本明細書では、(メタ)アクリロイル置換ゼラチンの濃度は、溶媒の体積で割った(メタ)アクリロイル置換ゼラチンの質量(w/v)と定義され、百分率として表される。溶媒は、薬学的に許容される担体とすることができる。ヒドロゲルの実施形態において、メタクリロイル置換ゼラチン又はアクリロイル置換ゼラチンは、5%～25w/v%、17%～25w/v%、17%～23w/v%、又は約20w/v%の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、メタクリロイル置換ゼラチン又はアクリロイル置換ゼラチンは、5%～15w/v%、8%～12w/v%、又は約10w/v%の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、メタクリロイル置換ゼラチン又はアクリロイル置換ゼラチンは、10%～40w/v%、15%～35w/v%、20%～30w/v%、又は約5%、10%、15%、20%、若しくは25w/v%の濃度で存在する。
【0059】
本発明による化学修飾ゼラチン、特にメタクリロイル-ゼラチン及びアクリロイル-ゼラチン、並びにヒドロゲルは、ヒト又は非ヒト動物の組織(例えば、軟骨、軟部組織)の製造又は修復、及び生物学的構築物の3次元バイオファブリケーション又は3次元バイオプリンティングのためのバイオインク又はバイオ樹脂としての使用を含むがこれらに限定されずに、さまざまな用途に使用されうる。生物学的構築物は、バイオファブリケーション又はバイオプリンティング技法を使用して製造することができる任意の動物組織若しくは器官、又はその部分、例えば多孔性でも、非多孔性でもよい細胞を含むスキャフォールドとすることができる。
【0060】
用語「バイオインク」は、特定の形状又は構築物に3D印刷、3Dプロット又は製作することができ、細胞適合性であるヒドロゲルを指す。ヒドロゲルは、生細胞及び/又は増殖因子等を組み込む又は組み込まない可能性がある。
【0061】
用語「バイオ樹脂」は、レーザー若しくは光投影ベースの光ステレオリソグラフィー、又は同様のリソグラフィー技法を使用して、特定の形状又は構築物に3D印刷又は製作することができ、細胞適合性であるヒドロゲルを表す。ヒドロゲルは、生細胞、薬物及び/又は増殖因子等を組み込む又は組み込まない可能性がある。
【0062】
したがって、態様は、医薬における使用のための、本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチン、又は本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルに関する。別の態様は、ヒト又は非ヒト動物における組織若しくは器官、又はそれらの一部分の修復における使用のための、本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチン、又は本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルに関する。実施形態において、組織又は器官は、骨組織、軟骨及び血管組織から選択される。実施形態において、本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチン、又は本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルが、生体接着剤又は生体糊としての使用のために本明細書に提供される。本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチン、又はgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルは、例えば整形外科用途、歯科矯正用途、又は美容及び形成外科のために使用されうる。
【0063】
関連態様は、本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチン、又は本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルの、組織若しくは器官、又はそれらの一部分を製造するための試験管内(in vitro)又は生体外(in vivo)での使用を対象にする。実施形態において、組織又は器官は、骨組織、軟骨及び血管組織から選択される。本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチン、又は本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルを含む組織工学的組織若しくは器官、又はその一部分も本明細書に開示される。
【0064】
別の態様は、本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチン、又は本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルの、放出制御剤形又は生物学的構築物を製造するための試験管内又は生体外での使用を対象にする。生物学的構築物は、例えば細胞の接着及び増殖に適している(固体)支持体のコーティング、又は細胞、又は薬物及び/若しくはベクターを含むのに適しているスキャフォールドとすることができる。
【0065】
更に別の態様は、本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチン、又は本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルの、バイオインク又はバイオ樹脂としての使用に関する。別の実施形態において、バイオインク又はバイオ樹脂は、生物学的構築物の3次元バイオファブリケーション又は3次元バイオプリンティングに使用される。生物学的構築物は、動物組織若しくは器官、又はその一部分とすることができる。生物学的構築物は、細胞を含むのに適しているスキャフォールド、又は(例えば、薬物送達/遺伝子治療用途向けの)例えば薬物及び/若しくはベクターを含むのに適しているスキャフォールドとすることもできる。生物学的構築物は、生体吸収性ネジ又は他の生体材料(例えば、生体接着剤)とすることもできる。実施形態において、生物学的構築物は、細胞を含むのに適しているスキャフォールドである。実施形態において、生物学的構築物はコーティングである。本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチン、又は本明細書に開示されるgelMA若しくはアクリロイル-ゼラチンを含むヒドロゲルを含む生物学的構築物も本明細書に開示される。
【0066】
更に別の態様は、本明細書に開示されるようにメタクリロイル-ゼラチン及びアクリロイル-ゼラチンを調製する方法に関する。本発明者らは、驚くべきことに、WO 2016/085345に記載される方法に従った、gelMA又はアクリロイル-ゼラチンの水性反応媒体の精製によって、リポ多糖が媒体から除去されるだけでなく、他の発熱物質並びにそれぞれメタクリロイル化反応及びアクリロイル化反応の間に形成されるメタクリル酸及びアクリル酸も除去されることを見出した。したがって、反応媒体の透析は必要とされず、本明細書の他の箇所に指定される低LPS含有量、低発熱物質含有量及び低メタクリル酸又はアクリル酸含有量を有するgelMAを提供する、より速い方法が得られる。
【0067】
したがって、別の態様において、本発明は、本明細書に開示されるように(メタ)アクリロイル-ゼラチンを調製する方法であって、
a)ゼラチンを(メタ)アクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンを(メタ)アクリロイル基で修飾する工程と、
b)反応媒体のpHを、2.0～5.0、好ましくは2.0～4.0、より好ましくは3.0～4.0又は2.0～3.5、更により好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
c)ミセル形成性界面活性剤を反応媒体に添加する工程と、
d)工程c)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイル-ゼラチンを含む媒体を回収する工程と、
g)工程f)の(メタ)アクリロイル-ゼラチンを含む媒体を場合によって乾燥させる工程と
を含む、方法に関する。
a)ゼラチンを(メタ)アクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンを(メタ)アクリロイル基で修飾する工程と、
b)反応媒体のpHを、2.0～5.0、好ましくは2.0～4.0、より好ましくは3.0～4.0又は2.0～3.5、更により好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
c)ミセル形成性界面活性剤を反応媒体に添加する工程と、
d)工程c)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイル-ゼラチンを含む媒体を回収する工程と、
g)工程f)の(メタ)アクリロイル-ゼラチンを含む媒体を場合によって乾燥させる工程と
を含む、方法に関する。
【0068】
本明細書に開示されるように(メタ)アクリロイル-ゼラチンを調製する代替方法は、
a)ゼラチンを(メタ)アクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンを(メタ)アクリロイル基で修飾する工程と、
b1)反応媒体のpHを、4.0～9.0、好ましくは4.0～6.0、より好ましくは4.0～6.0、更により好ましくは4.5～5.5の値に下げる工程と、
c)ミセル形成性界面活性剤を反応媒体に添加する工程と、
b2)工程c)の媒体のpHを、2.0～4.0、好ましくは3.0～4.0又は2.0～3.5、より好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
d)工程b2)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイル-ゼラチンを含む媒体を回収する工程と、
g)工程f)の(メタ)アクリロイル-ゼラチンを含む媒体を場合によって乾燥させる工程と
を含む。
a)ゼラチンを(メタ)アクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンを(メタ)アクリロイル基で修飾する工程と、
b1)反応媒体のpHを、4.0～9.0、好ましくは4.0～6.0、より好ましくは4.0～6.0、更により好ましくは4.5～5.5の値に下げる工程と、
c)ミセル形成性界面活性剤を反応媒体に添加する工程と、
b2)工程c)の媒体のpHを、2.0～4.0、好ましくは3.0～4.0又は2.0～3.5、より好ましくは3.0～3.5の値に下げる工程と、
d)工程b2)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイル-ゼラチンを含む媒体を回収する工程と、
g)工程f)の(メタ)アクリロイル-ゼラチンを含む媒体を場合によって乾燥させる工程と
を含む。
【0069】
例えばウシ、ブタ、家禽又は魚起源のいずれのタイプのゼラチンも、例えばAタイプ又はBタイプのゼラチンも、本明細書に記載される方法において使用されうる。実施形態において、Aタイプゼラチンが使用される。他の実施形態において、Bタイプゼラチンが使用される。
【0070】
ゼラチンのメタクリロイル化及びアクリロイル化は、ゼラチンをそれぞれメタクリル酸無水物及びアクリル酸無水物と、好適な緩衝液中、例えばpH9.0の炭酸緩衝液中又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、50℃の温度で60～180分間、例えば60分間又は120～180分間反応させることによって行われうる。gelMAの(メタ)アクリロイル化度は、(メタ)アクリル酸無水物:ゼラチン比を、Shirahamaら(2016)に記載されているように変動させることによって調整されうる。反応中に、gelMA及びアクリロイル-ゼラチンが、それぞれメタクリル酸又はアクリル酸と同様に形成される。
【0071】
反応媒体のpHは、ミセル形成性界面活性剤を添加する前に、2.0～5.0、好ましくは2.0～4.0、より好ましくは3.0～4.0の値、例えば約3.5又は2.0～3.5の値、例えば約3.0、更により好ましくは3.0～3.5の値に下げることができる(本明細書に記載される方法における工程b))。或いは、反応媒体のpHは、ミセル形成性界面活性剤を添加する前に4.0～9.0、好ましくは4.0～6.0、より好ましくは4.0～6.0、更により好ましくは4.5～5.5の値に下げてもよく(本明細書に記載される方法における工程b1))、ミセル形成性界面活性剤をした後、媒体を固体吸着剤と接触させる前に、2.0～4.0、より好ましくは3.0～4.0の値、例えば約3.5又は2.0～3.5の値、例えば約3.0、更により好ましくは3.0～3.5の値に更に下げてもよい(本明細書に記載される方法における工程b2))。有利なことには、次の方法工程を低pHで行うと、LPS、発熱物質及びメタクリル酸又はアクリル酸がより効率的に除去される。
【0072】
本明細書に記載される方法において、ミセル形成性界面活性剤が反応媒体に添加される。ミセル形成性界面活性剤は、ミセル(可溶性強凝集体)を溶液状態で形成することができる。ミセル形成性界面活性剤は、当技術分野において公知であり、例えばWO 2009/15440に記載されている。ミセル形成性界面活性剤は、カチオン又はアニオン界面活性剤等のイオン性界面活性剤とすることができる。好ましくは、界面活性剤は、非イオン界面活性剤である。というのは、そのような界面活性剤は、イオン性界面活性剤と比較して低い濃度でミセルを形成する傾向があるからである。更に、イオン性界面活性剤は、イオン結合によってゼラチンと相互作用する可能性があり、除去することがより困難である。好ましくは、ミセル形成性非イオン界面活性剤は、エトキシ化界面活性剤、好ましくはアルキルフェノールエトキシレートであり、アルキルフェノールエトキシレートは、好ましくは式CxH2x-i-C6H4-O-(C2H4O)nH[式中、xは、4～12であり、nは、7.5～14であり、Xは、好ましくは8であり、nは、好ましくは8～13、より好ましくは8.5～12.5、最も好ましくは9～12である]によって表され、特にTriton X-100、Triton X-102、又はそれらの混合物である。非イオン性界面活性剤のTriton X-シリーズは、オクチルフェノールとエチレンオキシドの反応によって調製される。生成物は、通常はアルキルアリールポリエーテルアルコールとして記載されるタイプの生成物であり、以下の構造式を有する:C8H17C6H5(CH2CH2O)9.7(Triton X-100)及びC9H19C6H5(CH2CH2O)12.3(Triton X-102)。好適な他の非イオン界面活性剤は、ノニルフェノキシポリエトキシエタノールC15H24O(C2H4O)n[nは、3～40である]、例えばノノキシノール-4、ノノキシノール-15及びノノキシノール-30、又はC12～C18脂肪酸のポリエチレングリコールソルビタンモノエステル、例えばTWEENを含む。CHAPSO(3-([3-コラミドプロピル]ジメチルアンモニオ)-2-ヒドロキシル-1-プロパンスルホネートは、別の好適な非イオン界面活性剤である。
【0073】
WO 2009/15440に記載されているように、ミセル形成性界面活性剤を添加した結果として、LPSはモノマー化され、前記モノマーは、界面活性剤と相互作用し、界面活性剤及びLPSを含むミセル複合体を形成すると考えられる。
【0074】
LPSの効率的な除去、好ましくは更に他の発熱物質、特にグラム陽性菌由来の発熱物質及び有鞭毛細菌由来の発熱物質、更に詳細にはグラム陽性菌由来の発熱物質の効率的な除去を可能にするために、ゼラチン、特にgelMA又はアクリロイル-ゼラチンの、添加された界面活性剤、特に非イオン界面活性剤に対する質量比は、好ましくは2000:1以下、より好ましくは500:1以下、更により好ましくは250:1以下、最も好ましくは50:1以下である。実際に、より高い質量比、すなわちゼラチンが相対的に多く存在する場合、すべてのLPSが界面活性剤によって結合されるわけではない。好ましくは、界面活性剤は、反応媒体に0.01～1.5w/w%、好ましくは0.015～1.0w/w%、より好ましくは0.020～0.50w/w%の濃度で添加される。
【0075】
本明細書に記載される方法の工程d)において、界面活性剤、LPS及びそのモノマー並びに/又は他の発熱物質、特にグラム陽性菌由来の発熱物質及び有鞭毛細菌由来の発熱物質、更に詳細にはグラム陽性菌由来の発熱物質を含む可溶性強凝集体を含有する可能性がある、工程c)の媒体又は工程b2)の媒体は、固体吸着剤と接触される。界面活性剤を結合すること、好ましくは更にLPSを結合することに加えて、吸着剤は、好ましくは他の発熱物質、特にグラム陽性菌由来の発熱物質、有鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスRNA、及び非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNA、並びにメタクリル酸又はアクリル酸も結合する。
【0076】
固体吸着剤は、界面活性剤、好ましくは更にLPS、他の発熱物質及び(メタ)アクリル酸を結合することができる、当業者に公知の任意の好適な吸着剤、例えば疎水性吸着剤とすることができる。吸着剤は、好ましくは不溶性であり、好適な吸着剤は、クレイ、例えば(活性化)珪藻土又はクレイ、フィロケイ酸塩、例えばフィロケイ酸アルミニウム、スメクタイト鉱物、及び疎水性吸着剤、例えば活性炭、例えばNorit SX Plus若しくはNorit ROX 0.8(Cabot社、オランダ)、又は例えばR55S若しくはR30L3Sタイプの3M ZetaCarbonフィルターカートリッジ(3M社、USA)を含む。1種又は複数の吸着剤の混合物も適用されうる。好ましい実施形態において、固体吸着剤は活性炭である。媒体を固体吸着剤と接触させることは、例えば粒子状吸着剤を媒体に添加することによって、又は前記吸着剤を含むフィルターエレメント若しくは吸着剤が積み重ねられたカラムに媒体を通すことによって、又は媒体を、吸着剤が外部表面に存在する担体と共にインキュベートすることによって行われうる。
【0077】
固体吸着剤は、好ましくは少なくとも2.5:1、より好ましくは少なくとも3.0:1、最も好ましくは少なくとも3.5:1の、界面活性剤に対する質量比で媒体に添加される。固体吸着剤は、好ましくは媒体に0.1～3w/w%、好ましくは0.5～1w/w%の濃度で添加される。フィルターエレメント又はシステムが使用される場合、フィルターシステムにおいて同様の量の吸着剤を使用することが好ましいことがある。
【0078】
接触させる工程は、界面活性剤の適切な吸着を可能にし、界面活性剤並びに界面活性剤に結合しているLPS及び/又は他の発熱物質、特にグラム陽性菌由来の発熱物質及び有鞭毛細菌由来の発熱物質、更に詳細にはグラム陽性菌由来の発熱物質が除去されるのに十分な時間、好ましくは更に吸着剤に結合している(メタ)アクリル酸、LPS及び他の発熱物質、特にグラム陽性菌由来の発熱物質、有鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスRNA、及び非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNA、並びにメタクリル酸の吸着を可能にするのに十分な時間行われる。好ましくは、吸着剤を(水性)媒体と5分～1時間、より好ましくは10～30分間接触させる。
【0079】
本明細書に記載される方法の次の工程(e))において、固体吸着剤は媒体から除去される。当業者は、水性媒体を固体吸着剤と接触させ、吸着剤を媒体から分離するのに適した方式を認識している。前記分離は、吸着剤が微粒子として媒体に添加される場合、例えば遠心又は濾過を含むことができ、産業上の利用可能性を考えると濾過が好ましい。例えば、固体吸着剤は、(工程c)又は工程b2)の媒体に添加することができ、界面活性剤、好ましくは更にLPS、他の発熱物質及びMAA又はアクリル酸が吸着剤に結合することができた後、吸着剤は、例えば濾過、沈降又は遠心等によって除去されうる。別の実施例において、固体吸着剤はフィルター中に存在することがあり、(本明細書に記載される方法の工程c)又は工程b2)の)媒体は、前記フィルター又は一連のそのようなフィルターに通され、フィルターは、濾液の収量を最適化するために場合によって洗浄されうる。このように、本明細書に記載される方法の工程d)、e)及びf)は、単一の濾過工程において組み合わされうる。
【0080】
固体吸着剤の分離後に、メタクリロイル-ゼラチン又はアクリロイル-ゼラチンを含む媒体は回収される。
【0081】
好ましくは、本明細書に記載される方法の工程c)～f)は、使用された界面活性剤の曇り点を下回る温度で行われる。本明細書では用語「曇り点」は、界面活性剤が媒体中で不溶性凝集体を形成する温度を指す。前記温度は、塩濃度等媒体の条件に依存する。特定の条件が与えられていないとき、曇り点は、1w/w%の水性溶液が不溶性凝集体を形成する温度として本明細書に定義される。したがって、温度が界面活性剤の曇り点を下回ると記載されている場合、前記温度は、68～69℃(すなわち、1w/w%のTriton X-100溶液の場合)であるが、16～25w/w%のNaCl溶液の場合に、前記曇り点は室温である。曇り点は、好都合なことに、界面活性剤を添加せずに溶液の吸光度を620nmで決定することによって、所与の状況で決定することができ、想定量の界面活性剤が添加されると吸光度が増加するかどうかチェックすることができる。曇り点を超えると、吸光度は増加される。
【0082】
実施形態において、工程c)～f)は、65℃以下、より好ましくは62℃以下、更により好ましくは60℃以下の温度で行われる。実施形態において、工程c)～f)は、30℃～65℃、好ましくは30℃～60℃、より好ましくは30℃～50℃又は30℃～40℃、更により好ましくは30℃～35℃の温度で行われる。
【0083】
実施形態において、媒体のpHは、方法工程c)～f)全体にわたって2.0～5.0、好ましくは2.0～4.0、より好ましくは3.0～4.0、例えば約3.5又は2.0～3.5、例えば約3.0、更により好ましくは3.0～3.5である。そのようなpHにおいて、温度は、好ましくは35℃未満、より好ましくは30℃～35℃、例えば約30℃である。
【0084】
他の実施形態において、媒体のpHは、方法工程d)～f)全体にわたって2.0～5.0、好ましくは2.0～4.0、より好ましくは3.0～4.0、例えば約3.5又は2.0～3.5、例えば約3.0、更により好ましくは3.0～3.5である。そのようなpHにおいて、温度は、好ましくは35℃未満、より好ましくは30℃～35℃、例えば約30℃である。
【0085】
メタクリロイル-ゼラチン又はアクリロイル-ゼラチンを含む媒体の回収後に、方法は、媒体のpHを3.5～9.0、好ましくは4.0～8.0、より好ましくは5.0～7.0に上げる工程を更に含むことができる。
【0086】
先に指摘したように、本明細書に記載される方法は、低LPS含有量、特に100EU/g未満、より好ましくは50EU/g未満、更により好ましくは20EU/g未満、更により好ましくは10EU/g未満、更により好ましくは5EU/g未満、更により好ましくは2EU/g未満、最も好ましくは1EU/g未満のLPS含有量を有するメタクリロイル-ゼラチン又はアクリロイル-ゼラチンをもたらす。特に、gelMA又はアクリロイル-ゼラチンは、工程a)の出発原料として使用されたゼラチンのLPS含有量と比較して、少なくとも50分の1のLPS、好ましくは少なくとも100分の1、より好ましくは少なくとも150分の1、更により好ましくは少なくとも200分の1、最も好ましくは少なくとも250分の1のLPSを含む。LPS数は、例えば本明細書の他の箇所に記載されるLALアッセイを使用して、回収された媒体で決定されうる。
【0087】
得られたメタクリロイル-ゼラチン又はアクリロイル-ゼラチンは更に、低含有量の非エンドトキシン発熱物質、特に低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質、有鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスRNA、グラム陰性菌由来エンドトキシン、及び非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNA、更に詳細には低含有量のグラム陽性菌由来及び有鞭毛細菌由来の発熱物質、更により詳細には低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質を特徴とする。特に、gelMA又はアクリロイル-ゼラチンは、工程a)の出発原料として使用されたゼラチンのグラム陽性菌由来の発熱物質の含有量と比較して、少なくとも10分の1のグラム陽性菌由来の発熱物質、好ましくは少なくとも20分の1、より好ましくは少なくとも50分の1、更により好ましくは少なくとも100分の1、少なくとも150分の1、少なくとも200分の1又は少なくとも250分の1のグラム陽性菌由来の発熱物質を含む。特に、gelMA又はアクリロイル-ゼラチンは、工程a)の出発原料として使用されたゼラチンの有鞭毛細菌由来の発熱物質の含有量と比較して、少なくとも10分の1の有鞭毛細菌由来の発熱物質、好ましくは少なくとも20分の1、より好ましくは少なくとも50分の1、更により好ましくは少なくとも100分の1、少なくとも150分の1、少なくとも200分の1又は少なくとも250分の1の有鞭毛細菌由来の発熱物質を含む。特に、gelMA又はアクリロイル-ゼラチンは、工程a)の出発原料として使用されたゼラチンの非メチル化CpGモチーフに富む、より少ない細菌DNAの含有量と比較して、少なくとも10分の1の非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNA、好ましくは少なくとも20分の1、より好ましくは少なくとも50分の1、更により好ましくは少なくとも100分の1、少なくとも150分の1、少なくとも200分の1又は少なくとも250分の1の非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNAを含む。より少ない一本鎖ウイルスRNA。
【0088】
更に、本明細書に記載される方法は、好ましくは水に溶解しているメタクリロイル-ゼラチンの試料で決定して、低メタクリル酸含有量、特に100ppm未満、好ましくは50ppm未満、より好ましくは30ppm未満のメタクリル酸、又は50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解しているメタクリロイル-ゼラチンの試料で決定して、150ppm未満、好ましくは100ppm未満のメタクリル酸を有するメタクリロイル-ゼラチン、或いは低アクリル酸含有量、特に30ppm未満のアクリル酸を有するアクリロイル-ゼラチンをもたらす。したがって、本方法は、単回の上記(6又は7)工程a)～f)において精製されたgelMA又はアクリロイル-ゼラチンを提供する。
【0089】
本明細書に記載される方法は、透析工程を必要とすることなく、低(メタ)アクリル酸含有量を有する(メタ)アクリロイル-ゼラチンをもたらすので、好ましくは透析工程を含まない。そのような透析工程は、一般に時間消費型工程であり、したがって、本方法は、特に精製されたgelMA及びアクリロイル-ゼラチンの大規模生産により効率的である。
【0090】
実施形態において、方法は、gelMA又はアクリロイル-ゼラチンを含む回収された媒体を、媒体のpHを場合によって上げた後に、例えば白色多孔性フォームに凍結乾燥させることによって、乾燥させる工程を更に含む(Van Den Bulckeら、2000、Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels、Biomacromolecules、1:31-38)。
【0091】
次に、本発明を以下の非限定的な実施例によって更に説明する。
【実施例】
【0092】
(実施例1: gelMA調製方法及びgelMAの特性)
材料と方法
gelMAの合成
pH9.0の1.25M炭酸緩衝液中15～20%のゼラチン(ブタ皮膚、Aタイプ、ブルーム200)溶液とメタクリル酸無水物を1:1の比で、120～180分間50℃で反応させた。反応中、メタクリル酸が形成された。反応媒体のpHを、HClを使用してpH3.5に下げて、カーボネートを除去した。1.12%(ゼラチンの質量に対して)Triton-X100を媒体に添加し、媒体を撹拌下に1時間中維持した。次いで、活性炭を詰めたカラムで媒体を濾過した。
材料と方法
gelMAの合成
pH9.0の1.25M炭酸緩衝液中15～20%のゼラチン(ブタ皮膚、Aタイプ、ブルーム200)溶液とメタクリル酸無水物を1:1の比で、120～180分間50℃で反応させた。反応中、メタクリル酸が形成された。反応媒体のpHを、HClを使用してpH3.5に下げて、カーボネートを除去した。1.12%(ゼラチンの質量に対して)Triton-X100を媒体に添加し、媒体を撹拌下に1時間中維持した。次いで、活性炭を詰めたカラムで媒体を濾過した。
【0093】
LPS含有量の決定
EndoZyme IIアッセイキット(Hyglos社)を製造業者の指示書に従って使用して、LPS含有量を決定した。簡潔に言えば、超純水中gelMA溶液を、予想LPS含有量に応じて2.50w/w%、l0倍、20倍、50倍、l00倍等の希釈で調製した。100μLの各試料をマルチウェルプレートのウェルに添加し、製造業者の指示書に従って調製した100μLのアッセイ試薬と混合した。得られた混合物の蛍光強度をマイクロプレート螢光リーダー(BopTek社;励起/発光=380nm/455nm)でモニターした。エンドトキシン不含水において50EU/mLで再構成したエンドトキシン標準品(大腸菌055:B5)の希釈系列を較正標準として使用し、エンドトキシン不含水をブランクとして使用した。
EndoZyme IIアッセイキット(Hyglos社)を製造業者の指示書に従って使用して、LPS含有量を決定した。簡潔に言えば、超純水中gelMA溶液を、予想LPS含有量に応じて2.50w/w%、l0倍、20倍、50倍、l00倍等の希釈で調製した。100μLの各試料をマルチウェルプレートのウェルに添加し、製造業者の指示書に従って調製した100μLのアッセイ試薬と混合した。得られた混合物の蛍光強度をマイクロプレート螢光リーダー(BopTek社;励起/発光=380nm/455nm)でモニターした。エンドトキシン不含水において50EU/mLで再構成したエンドトキシン標準品(大腸菌055:B5)の希釈系列を較正標準として使用し、エンドトキシン不含水をブランクとして使用した。
【0094】
MAA含有量の決定
水又は50mMリン酸緩衝液(pH9.5)中8w/w%のgelMA試料溶液を作製した。試料を室温で15分間膨潤させ、次いで試料が目視で完全に溶解するまで、50℃で30分間置いた。0.5mLの試料溶液を、10kDaのAmicon超遠心濾過機(Milipore社)に添加し、50℃で(オーブン)10分間置き、その後12000xgで30分間40℃で遠心した。後に、濾液を、HPLC分析のために回収した。
水又は50mMリン酸緩衝液(pH9.5)中8w/w%のgelMA試料溶液を作製した。試料を室温で15分間膨潤させ、次いで試料が目視で完全に溶解するまで、50℃で30分間置いた。0.5mLの試料溶液を、10kDaのAmicon超遠心濾過機(Milipore社)に添加し、50℃で(オーブン)10分間置き、その後12000xgで30分間40℃で遠心した。後に、濾液を、HPLC分析のために回収した。
【0095】
水又は50mMリン酸緩衝液(pH9.5)中1w/w%のメタクリル酸を調製し、水又は50mMリン酸緩衝液(pH9.5)で2倍希釈液を作製することによって、0.1ppm～100ppmの範囲のメタクリル酸の希釈系列を作製し、標準品として使用した。
【0096】
DNA含有量の決定
0.1mg/mLのストック濃度のサケ精巣dsDNA標準品をTE緩衝液(10mM Tris-HCl及び水中1mM EDTA、pH=8)で調製し、10μg/mLのストック濃度に更に希釈した。
0.1mg/mLのストック濃度のサケ精巣dsDNA標準品をTE緩衝液(10mM Tris-HCl及び水中1mM EDTA、pH=8)で調製し、10μg/mLのストック濃度に更に希釈した。
【0097】
定量化のための標準品は、TE緩衝液中10μg/ml～0μg/mlの範囲である。TE緩衝液中10w/w%のゼラチン試料を調製した。試料を30分間膨潤させ、水浴を使用して40℃で溶解した。
【0098】
94μlのTE緩衝液及び1μlのSYBR Green(100x)を含むマスターミックス95μl、並びに試料又は標準品5μlを、黒色ウェル蛍光96ウェルプレートのウェルに添加し、上下にピペッティングすることによって混合した。96ウェルプレートをカバーし、37℃、700rpmで30分間インキュベートした。Synergy(商標) Mx蛍光光度計(BioTek社)を製造業者の指示書に従って25℃で使用して、蛍光をEx535nm/Em617nmで測定した。
【0099】
結果
【0100】
【表1】
【0101】
したがって、本発明によるメタクリロイル-ゼラチンは、例えば市販gelMAと比べて低エンドトキシン含有量及び低MAA含有量を特徴とする。それらは、低DNA含有量を更に特徴とし、核酸に基づく発熱活性が本発明のgelMAにおいて低いことを示す。
【0102】
(実施例2: 架橋)
汚染メタクリル酸のgelMAヒドロゲルレオロジー特性への影響を試験した。
汚染メタクリル酸のgelMAヒドロゲルレオロジー特性への影響を試験した。
【0103】
材料と方法
150mLのアルミニウム箔で包まれたFalconチューブ中、65gの10w/v%のgelMA(実施例1に従って調製した)溶液及び0.5w/v%のIrgacure(Irgacure 2959光開始剤(2-ヒドロキシ-4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン))を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4)で調製した。最初に、2×162.5mgのIrgarcureを2×29.1mlのPBSに溶解した。ミックスを数回上下にピペッティングすることによりIrgacure粉末をPBSに分散し、溶液を60℃の水浴に約20分間入れた。次いで、2×3.25gのgelMAを添加し、ボルテックスし、60℃の水浴中で保存した。ミックスを可溶化が完了するまで規則的にボルテックスした。両溶液を1本のチューブ中で混合し、ボルテックスした。
150mLのアルミニウム箔で包まれたFalconチューブ中、65gの10w/v%のgelMA(実施例1に従って調製した)溶液及び0.5w/v%のIrgacure(Irgacure 2959光開始剤(2-ヒドロキシ-4'-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン))を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4)で調製した。最初に、2×162.5mgのIrgarcureを2×29.1mlのPBSに溶解した。ミックスを数回上下にピペッティングすることによりIrgacure粉末をPBSに分散し、溶液を60℃の水浴に約20分間入れた。次いで、2×3.25gのgelMAを添加し、ボルテックスし、60℃の水浴中で保存した。ミックスを可溶化が完了するまで規則的にボルテックスした。両溶液を1本のチューブ中で混合し、ボルテックスした。
【0104】
gelMA及びIrgarcure溶液を15mLのアルミニウム箔で包まれたFlaconチューブに8×7mLで分割し、0μl(MAAなし)、0.7μl(100ppmのMAA)、2.1μl(300ppmのMAA)又は4.2μl(600ppmのMAA)のメタクリル酸(11.67M)をチューブに2回繰り返して添加した。チューブをボルテックスし、40℃の水浴中に90分間保存し、その後、水浴から取り出し、室温で終夜放置した。
【0105】
分析より20分前に、試料を40℃の水浴中で再溶融し、各試料について、3×2mlの溶液をチューブから、機械で較正しておいた3本のElastosens(商標)試料保持器中に移した。1滴の界面活性剤を各試料保持器に添加し、UV光(365nm)を試料に室温で20分間当てた(365nmに設定されたUV灯(UVMLS-38 EL Series 3UV-254/302/365nm/8W、0.16A))。このUV硬化の直後に、試料保持器をElastosens(商標) Bio2計器に入れ、レオロジー分析を20℃で45分間、15秒毎に測定して実施した。
【0106】
結果
図1に示されるように、最終の貯蔵弾性率(G')が低下すると共にMAAの濃度が上昇する。これは、汚染MAAがgelMA中に存在すると、gelMAベースのヒドロゲルの弾性が減少することを示す。
図1に示されるように、最終の貯蔵弾性率(G')が低下すると共にMAAの濃度が上昇する。これは、汚染MAAがgelMA中に存在すると、gelMAベースのヒドロゲルの弾性が減少することを示す。
【0107】
(実施例3: 本発明の実施形態による方法及び透析に基づく方法によって調製されたgelMAの比較)
材料及び方法
2つのタイプのゼラチン:Aタイプ(250ブルーム)及びBタイプ(250ブルーム)のゼラチンを、Pahoffら(2019、J. Mater Chem. B、7:1761-1772)に記載されている方法に従って、最大で40%の官能化度にメタクリロイル修飾した。A及びBタイプのプロセスから得られた出発ゼラチンを、それぞれゼラチン1グラム当たり1046及び4782エンドトキシン単位(EU)(Hyglos endozyme)で汚染した。メタクリル酸残基及びLPS汚染を、実施例1に記載されているように、それぞれppm、及びゼラチン1グラム当たりのEUの単位で測定した。MAA含有量を決定するために、gelMAを50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解した。
材料及び方法
2つのタイプのゼラチン:Aタイプ(250ブルーム)及びBタイプ(250ブルーム)のゼラチンを、Pahoffら(2019、J. Mater Chem. B、7:1761-1772)に記載されている方法に従って、最大で40%の官能化度にメタクリロイル修飾した。A及びBタイプのプロセスから得られた出発ゼラチンを、それぞれゼラチン1グラム当たり1046及び4782エンドトキシン単位(EU)(Hyglos endozyme)で汚染した。メタクリル酸残基及びLPS汚染を、実施例1に記載されているように、それぞれppm、及びゼラチン1グラム当たりのEUの単位で測定した。MAA含有量を決定するために、gelMAを50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解した。
【0108】
比較の方法において、メタクリル酸副生物を超純水(MilliQ、Merck Millipore社)透析によりgelMA溶液から除去した。gelMA溶液を20ミリリットルずつ、5本の透析チューブ(透析チュービングセルロースメンブラン、MWCO 14kDa、カタログ番号:D9527-100FT、Sigma-Aldrich社)に移し、これらのそれぞれを2.5リットルの水に浸漬した。透析は、40℃で進行し、水は、24時間毎に交換した。1日、2日、3日、4日、及び7日目に、1本のチューブを取り出し、そのメタクリル酸及びLPS含有量を実施例1に記載されているように測定した。MAA含有量を決定するために、gelMAを50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解した。
【0109】
本発明の実施形態による方法において、希HClを添加することによって、5つの40mlずつのgelMA溶液を2.0、2.5、3.0、3.5、及び4.0のpH(すべて40℃で測定)にpH調整し、(ゼラチン含有量に対して)0.1%のTriton-X100を各一定分量に添加した。次いで、各一定分量を二分し、それらの1つは、メタクリル酸含有量及びLPS汚染に対するpH低減及びTriton-X100添加の効果に対して陰性対照の働きをする。5グラムのNorit活性炭粉末(S268、活性炭NoritSXプラス8013-1)を実験用チューブのそれぞれに添加し、これらのチューブを回転式振盪機上にて、40℃で1時間インキュベートした。次に、これらのチューブを2000rpmで30分間遠心し、上澄みを濾過し(0.45μm)、そのメタクリル酸及びLPS含有量について、実施例1に記載されているように分析した。MAA含有量を決定するために、gelMAを50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解した。
【0110】
結果
Table 2(表2)は、透析に基づく方法又は本発明の実施形態による方法によって得られた精製gelMAのMAA含有量(ppm)及びLPS含有量(EU/g)を示す。
Table 2(表2)は、透析に基づく方法又は本発明の実施形態による方法によって得られた精製gelMAのMAA含有量(ppm)及びLPS含有量(EU/g)を示す。
【0111】
【表2】
【0112】
(実施例4: GelMA調製方法)
材料及び方法
以下の修正を加えて、gelMAを実施例1に記載されているように合成した。Triton-X100を添加する前に、反応媒体のpHをpH5.5に下げ、撹拌下で1時間インキュベートした後、HClを使用して、媒体のpHをpH3.5に更に下げ、その後、媒体を活性炭を詰めたカラムで濾過した。得られたgelMAのメタクリル酸残基及びLPS汚染を、実施例1に記載されているように、それぞれppm、及びゼラチン1グラム当たりのEUの単位で測定した。MAA含有量を決定するために、gelMAを50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解した。
材料及び方法
以下の修正を加えて、gelMAを実施例1に記載されているように合成した。Triton-X100を添加する前に、反応媒体のpHをpH5.5に下げ、撹拌下で1時間インキュベートした後、HClを使用して、媒体のpHをpH3.5に更に下げ、その後、媒体を活性炭を詰めたカラムで濾過した。得られたgelMAのメタクリル酸残基及びLPS汚染を、実施例1に記載されているように、それぞれppm、及びゼラチン1グラム当たりのEUの単位で測定した。MAA含有量を決定するために、gelMAを50mMリン酸緩衝液(pH9.5)に溶解した。
【0113】
結果
【0114】
【表3】
【0115】
ステートメント
本発明は、特に下記の番号を付した態様及び実施形態のいずれか1つによって、又はそれらの1つ若しくは複数と他のいずれかの態様、ステートメント及び/若しくは実施形態との任意の組合せによって理解される。
本発明は、特に下記の番号を付した態様及び実施形態のいずれか1つによって、又はそれらの1つ若しくは複数と他のいずれかの態様、ステートメント及び/若しくは実施形態との任意の組合せによって理解される。
【0116】
態様1:メタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾されており、100EU/g未満、好ましくは50EU/g未満、より好ましくは20EU/g未満、更により好ましくは10EU/g未満、更により好ましくは5EU/g未満、更により好ましくは2EU/g未満、最も好ましくは1EU/g未満のリポ多糖含有量を有する、ゼラチン。
【0117】
態様2:30ppm未満のメタクリル酸又はアクリル酸を含む、態様1に記載のゼラチン。
【0118】
態様3:低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質、有鞭毛細菌由来の発熱物質、一本鎖ウイルスRNA、及び非メチル化CpGモチーフに富む細菌DNAを有し、好ましくは低含有量のグラム陽性菌由来及び有鞭毛細菌由来の発熱物質を有し、より好ましくは低含有量のグラム陽性菌由来の発熱物質を有する、態様1又は2に記載のゼラチン。
【0119】
態様4:Aタイプゼラチンである、態様1から3のいずれか1つに記載のゼラチン。
【0120】
態様5:20%～100%、好ましくは50%～100%、より好ましくは80%～100%のメタクリルアミド置換度又はアクリルアミド置換度を有し、10%未満のメタクリレート置換度を有する、態様1から4のいずれか1つに記載のゼラチン。
【0121】
態様6:前記ゼラチンが、アセチル基で更に修飾されている、態様1から5のいずれか一態様に記載のゼラチン。
【0122】
態様7:態様1から5のいずれか1つに記載のメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾されているゼラチンと、架橋剤とを含むヒドロゲル。
【0123】
態様8:態様7に記載のヒドロゲルを含むフィルム。
【0124】
態様9:態様1から6のいずれか1つに記載のメタクリロイル基又はアクリロイルで修飾されているゼラチンを調製する方法であって、
a)ゼラチンをメタクリル無水物又はアクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンをメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾する工程と、
b)反応媒体のpHを、3～4の値に下げる工程と、
c)0.01～1.5w/w%のミセル形成性界面活性剤を酸性反応媒体に添加する工程と、
d)工程c)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を回収する工程と
を含む、方法。
a)ゼラチンをメタクリル無水物又はアクリル無水物と反応させることによって、ゼラチンをメタクリロイル基又はアクリロイル基で修飾する工程と、
b)反応媒体のpHを、3～4の値に下げる工程と、
c)0.01～1.5w/w%のミセル形成性界面活性剤を酸性反応媒体に添加する工程と、
d)工程c)の媒体を固体吸着剤と接触させる工程と、
e)工程d)の固体吸着剤を媒体から分離する工程と、
f)メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を回収する工程と
を含む、方法。
【0125】
態様10:前記ミセル形成性界面活性剤が、非イオン界面活性剤を含み、好ましくは界面活性剤が、Triton X-100若しくはTriton X-102、又はそれらの混合物である、態様9に記載の方法。
【0126】
態様11:前記固体吸着剤が、疎水性吸着剤、好ましくは活性炭である、態様9又は10に記載の方法。
【0127】
態様12:メタクリロイルゼラチン又はゼラチン-アクリロイルを含む媒体を乾燥させる工程を更に含む、態様9から11のいずれか1つに記載の方法。
【0128】
態様13:医薬における使用のための、態様1から6のいずれか1つに記載のゼラチン又は態様7に記載のヒドロゲル。
【0129】
態様14:組織若しくは器官、又はそれらの一部分、コーティング、スキャフォールド、或いは放出制御剤形等の生物学的構築物を製造するための、態様1から6のいずれか1つに記載のゼラチン又は態様7に記載のヒドロゲルの試験管内又は生体外での使用。
【0130】
態様15:態様1から6のいずれ1つに記載のゼラチン又は態様7に記載のヒドロゲルのバイオインク又はバイオ樹脂としての使用。
【図1】
【国際調査報告】