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特表2023-526172マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-21
(54)【発明の名称】マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/569 20060101AFI20230614BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230614BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230614BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230614BHJP
【ＦＩ】
G01N33/569 F
G01N33/68
C12Q1/04
C12M1/34 B
C12M1/34 F
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022562351
(86)(22)【出願日】2021-04-09
(85)【翻訳文提出日】2022-11-11
(86)【国際出願番号】 EP2021059316
(87)【国際公開番号】W WO2021209339
(87)【国際公開日】2021-10-21
(31)【優先権主張番号】20382291.1
(32)【優先日】2020-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522397765
【氏名又は名称】ネイカー， インスティテュート バスコ デ インベスティガシオン イ デサロージョ アグラーリオ， エス．アー．
(71)【出願人】
【識別番号】522397776
【氏名又は名称】セリダ， セルビシオ リージョナル デ インベスティガシオン イ デサロージョ アグロアリメンタリオ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アロンソ フェルナンデス－パチェコ マルタ
(72)【発明者】
【氏名】カセイス ゴヨス ロサ
(72)【発明者】
【氏名】ジュステ ジョルダン ラモン
(72)【発明者】
【氏名】ブランコ バスケス クリスティーナ
(72)【発明者】
【氏名】カニヴェ ルイス マリア
(72)【発明者】
【氏名】イグレシアス ベステイロ ナタリア
【テーマコード（参考）】
2G045
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045DA36
4B029AA07
4B029BB01
4B029BB17
4B029FA03
4B029FA12
4B063QA19
4B063QQ05
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR72
4B063QR74
4B063QS33
4B063QX01
4B063QX02
(57)【要約】
マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法。本発明は、マイコバクテリウム種に感染した対象、特にマイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（ＭＡＰ）に感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。ＭＡＰは、パラ結核症（ＰＴＢ）の病原微生物である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がマイコバクテリウム種に感染していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項2】
マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに感染した対象を診断する、請求項１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がマイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに感染していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項3】
対象においてパラ結核症を診断する、請求項１又は２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がパラ結核症に罹患していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた生体試料中のタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がパラ結核症に罹患していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた生体試料中のタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がパラ結核症に罹患していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた生体試料中の、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）前記先行して言及されたタンパク質のいずれかについて得られた濃度が、確立されたカットオフ値を超える場合、これは、前記対象がパラ結核症に罹患していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項7】
潜在性又は開存性パラ結核症、好ましくは潜在性パラ結核症を診断する、請求項１～６のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項8】
前記生体試料は、血清、血漿、又は血液を含む体液である、請求項１～７のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項9】
前記対象は、畜牛、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、シカ、ウサギ、イノシシ、バイソン、リャマ、アルパカ、オポッサム、アナグマ、ゾウ、又はヒトからなる群より選択される哺乳類であり、好ましくは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、シカ、リャマ、又はアルパカからなる群より選択される牧畜動物である、請求項１～８のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項10】
マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するための、タンパク質ＡＢＣＡ１３、タンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］、又はタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項11】
マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに感染した対象を診断するための、請求項１０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項12】
パラ結核症を診断するための、請求項１０又は１１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項13】
潜在性又は開存性パラ結核症、好ましくは潜在性パラ結核症を診断するための、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項14】
マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するための、タンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を特定する道具又は試薬を備える、キットの使用。
【請求項15】
マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するための、タンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］又はタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度を特定する道具又は試薬を備える、請求項１４に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療又は獣医学の分野に関する。特に、本発明は、マイコバクテリウム（Mycobacterium）種に感染した対象、特にマイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）（ＭＡＰ）に感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。ＭＡＰは、パラ結核症（ＰＴＢ）の病原微生物である。
【背景技術】
【0002】
ＭＡＰは、マイコバクテリウム属に属する病原性細菌である。ＭＡＰは、ヨーネ病すなわちＰＴＢを引き起こし、これは主に畜牛等の反芻動物が罹患するとともに、一部のヒト疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は結腸直腸癌等にも関連するとされてきた［非特許文献１］［非特許文献２］。そのうえ、ＭＡＰは、炎症性／自己免疫疾患：類肉腫症、ブラウ症候群、橋本甲状腺炎、自己免疫性糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、狼瘡、及びパーキンソン病にも関連するとされてきており、その一覧は長く増えるばかりである［非特許文献３］。
【0003】
ＭＡＰの感染は、主に、ＭＡＰで汚染された糞便、初乳、又は母乳の摂取を通じた糞口経路により生じる。感染症は通常、動物の生涯の最初の数ヶ月以内に生じるが、平均で２年～５年間は無症候のままである。摂取された後、ＭＡＰは、腸粘膜で上皮下マクロファージにより貪食されながら、腸粘膜を横断して慢性感染症を確立する。ＭＡＰは、アポトーシス及びファゴソーム酸性化を阻害することにより、並びに免疫系に対する抗原提示を妨げることにより、ファゴソーム内で生存及び増殖することができる。感染症が進行するにつれて、腸管及び腸間膜リンパ節の病変はより重篤になっていく。肉芽腫性浸潤物は、限局性ではなく、びまん性になり、粘膜の構造及び機能を破壊するとともに、空腸及び回腸を冒す。肉芽腫性浸潤物の位置及び伸展性に従って、感染動物の腸管組織に存在する組織病変は、限局性、多巣性、及びびまん性のカテゴリーに分類される［非特許文献４］。限局性病変は、小型肉芽腫からなり、それらは主に、空腸リンパ節及び回腸リンパ節に位置する。多巣性病変は、腸管リンパ組織及び同じく腸管粘膜固有層の十分に境界明瞭な肉芽腫からなる。びまん性病変は、重篤な肉芽腫性腸炎及びリンパ節炎から特徴付けられた。浸潤物に存在する炎症細胞の型及び抗酸性桿菌（ＡＦＢ）の量に従って、びまん性病変は、びまん性リンパ形質細胞性又は少菌型（paucibacillary）病変、中間型病変、及びびまん性組織球性又は多菌型（multibacillary）病変に細分化された［非特許文献５］。びまん性リンパ形質細胞性病変型では、細胞性浸潤物は、広範囲にわたり広がるリンパ球で主に構成され、希少ＡＦＢを含有し、肉眼でも明白に視認される。びまん性組織球性病変型は、腸管の広い範囲を冒している多数の類上皮細胞、リンパ球、マクロファージ、及びＡＦＢを大量に持つ多数のラングハンス巨細胞からなり、腸壁の肥厚化という様相を呈して、腸管の開腸に際して容易に視認される。びまん性中間型はまた、腸管の広範囲を冒していることが肉眼で観察でき、リンパ球、マクロファージ、及び少数のＡＦＢを持つわずかなラングハンス巨細胞で構成される粘膜の肥厚化を顕微鏡により認めることができる。
【0004】
ＰＴＢは、乳生産量の低下、管理費用の増大、及び臨床疾患による早期淘汰のため、世界規模で、泌乳家畜群における相当な経済損失の一因となっている。複数の研究から、米国及び欧州において泌乳牛群の５０％超がＭＡＰ抗体について陽性であり、したがって、これらの地域では、ウシＰＴＢを風土病と見なすことが可能であることが実証されている。市販のウシＰＴＢ不活化ワクチンは、感染した農場において、ワクチン接種していない農場と比べた場合、糞便及び組織に存在するＭＡＰの減少、並びに乳生産量及び畜牛の生産寿命両方の増大において大きな成果をおさめている。しかしながら、加熱死不活化ワクチンを用いたＰＴＢワクチン接種は、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）検出検査に干渉することを理由に、欧州の大部分の国で許可されていない。したがって、ＰＴＢ防疫は、現在のところ、検査及び選抜除去に加えて、適切な衛生防疫戦略を用いた感受性動物へのＭＡＰ感染の予防に基づいている。しかしながら、「検査及び選抜除去」方針に基づく防疫プログラムの効率は、初期感染症を同定するのに使用される検査の感度に強く条件づけられる。現在、糞便培養が、ＭＡＰ感染症の死前診断の「絶対的標準」検査と見なされている。しかしながら、個別の糞便培養は、費用がかさみ、時間がかかり、しかもＭＡＰ感染症の自然経過中に糞便排菌が発生するのは比較的遅いため進行した感染症しか検出しない。実際、糞便培養の感度は、ＰＴＢ関連の臨床兆候を持つ動物では７０％だが、無症候感染症の動物では２３％～２９％しかなく、こうした動物は、ＭＡＰを糞便及び乳汁中に断続的及び少数で排菌して、環境を汚染し、他の動物を感染させる可能性がある。
【0005】
初期段階診断法、例えば、ＩＦＮ－γ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）等は、マイコバクテリウム抗原に反応してＴ細胞性免疫応答が誘発されているかどうかを検出する。ＩＧＲＡ法は、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、特異的抗原（ＭＡＰ抽出物）及び非特異的抗原（Ｍ．ｐｈｌｅｉ抽出物）により活性化された全血試料のＩＦＮ－γシグナルの差を測定することにより、ＭＡＰに対する細胞反応を検出する（ＩＤ Ｖｅｔ）。ＩＧＲＡは、ＭＡＰ曝露を反映するだけであり、したがって、限定感染症（controlled infection）である個体と無症候性疾患である個体を識別することができない。
【0006】
ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、ＭＡＰに対して産生された特異的抗体を検出するものであり、これは、ＰＴＢの診断に今日広く使用されている。しかしながら、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡには、高率の偽陰性結果（低感度）が伴う［非特許文献６］。このことは、潜伏感染している対象のうち高パーセンテージが、なおも検査陰性になることを意味する。偽陰性結果は、防疫又は除菌対策の実施を妨害するため、懸念事項である。
【0007】
したがって、ＭＡＰ感染症、主に無症候性感染症を、細菌が排菌されて群の仲間及び可能性としてヒトに感染する前に、検出することは、依然として満たされていない要求である。言い換えると、ＭＡＰ感染症を、主に感染症の初期段階で及び長い慢性期の間に、疾患の臨床病期に先行して検出する、高い感度及び特異度を持つ新規道具が必要とされている。
【0008】
本発明は、上記した問題の解決に焦点を合わせており、本明細書中、ＭＡＰに感染した対象を診断する新規戦略を提供する。これは、高い感度及び特異度を提供するものであり、ＭＡＰ感染症の初期段階又は長い慢性期中での診断を提供するものでもある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Pierce ES et al., 2018. Could Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis cause Crohn's disease, ulcerative colitis…and colorectal cancer? Infect Agent Cancer. 2018 Jan 4;13:1. doi: 10.1186/s13027-017-0172-3. eCollection 2018
【非特許文献2】Garvey M et al., 2018. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis: A possible causative agent in human morbidity and risk to public health safety. Open Vet J. 2018;8(2):172-181. doi: 10.4314/ovj.v8i2.10. Epub 2018 May 19
【非特許文献3】Dow CT et al., 2020. Proposing BCG Vaccination for Mycobacterium avium ss. paratuberculosis (MAP) Associated Autoimmune Diseases. Microorganisms. 2020 Feb 5;8(2). PMID: 32033287 PMCID: PMC7074941
【非特許文献4】Gonzalez J et al., 2005. Histopathological classification of lesions associated with natural paratuberculosis infection in cattle. J Comp Pathol. 2005 Aug-Oct;133(2-3):184-96. PMID: 16045917 DOI: 10.1016/j.jcpa.2005.04.007
【非特許文献5】Balseiro et al., 2018. Chronic regional intestinal inflammatory disease: A trans-species slow infection? Comp. Immunol., Microbiol., Infect. Dis. 2018. 62:88-100. DOI: https://doi.org/j.cimid.2018.12.001
【非特許文献6】Vazquez et al., 2014. Latent infections are the most frequent form of paratuberculosis in slaughtered Friesian cattle. Spanish Journal of Agricultural Research 2014 12(4): 1049-1060. http://dx.doi.org/10.5424/sjar/2014124-5978
【発明の概要】
【0010】
上記で説明してきたとおり、本発明は、マイコバクテリウム種に感染した対象、特にＭＡＰに感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。ＭＡＰは、ＰＴＢの病原微生物である。
【0011】
ＲＮＡ－Ｓｅｑにより同定される多数のバイオマーカーのうち５種は、病変を持たない対照動物を基準として限局性又はびまん性組織病変を持つ動物において発現レベルが高いことに従い、それら５種を、診断を目的とする新規ＥＬＩＳＡの開発用に選択した。
【0012】
表１は、検出される病変のない対照動物と対比させた、限局性及びびまん性組織病変を持つホルスタイン畜牛の末梢血のＲＮＡ－Ｓｅｑ分析後に選択された宿主バイオマーカー遺伝子の差示的発現を示す。平均Ｌｏｇ２変化倍率は、比較される２つの群間の遺伝子発現の差の指標である。
【0013】
【表1】
【0014】
ウシタンパク質ＭＭＰ８（マトリックスメタロペプチダーゼ８）及びＡＢＣＡ１３（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１３）をコードする遺伝子は、限局性病変を持つ動物において発現の顕著な上昇を示したが、ウシタンパク質ＦＡＭ８４Ａ（配列類似性を持つファミリー８４－メンバーＡ）、ＳＰＡＲＣ（酸性及びシステイン豊富な分泌タンパク質）及びＤＥＳ（デスミン）をコードする遺伝子は、びまん性病変を示す動物で上方制御された。バイオマーカーの選択は、発現レベルの高さ、細胞での位置（血清に存在する細胞外タンパク質は、ＥＬＩＳＡによる検出に好適な選択であった）、及びその特異的検出に市販のＥＬＩＳＡキットが利用可能であることに基づいていた。
【0015】
ＭＭＰ８、ＡＢＣＡ１３、ＦＡＭ８４Ａ、ＳＰＡＲＣ、及びＤＥＳを検出するように設計された５種のＥＬＩＳＡの診断可能性を、腸組織に明確な組織病変を持ち、疾患の様々なステージを呈している感染ウシ由来の血清試料を用いて研究した。本研究に含まれる動物を分類するのに用いた絶対的標準すなわち参照技法は、動物の腸管組織に存在する組織病変の種類であった。意味深いことに、以下で提示する結果から分かるとおり、ＰＴＢの診断に関してバイオマーカーを利用した５種のＥＬＩＳＡの正当性を立証することは不可能であった。実際、対照群と、限局性病変を持つ動物を識別することができたのはバイオマーカーを利用した５種のＥＬＩＳＡのうち３種、多巣性病変を持つ動物を識別することができたのはバイオマーカーを利用した５種のＥＬＩＳＡのうち２種、びまん性病変を持つ動物を識別することができたのはバイオマーカーを利用した５種のＥＬＩＳＡのうち２種、及び全ての感染動物を識別することができたのはバイオマーカーを利用した５種のＥＬＩＳＡのうち３種に限られた。実際、ＦＡＭ８４Ａ及びＤＥＳを検出するＥＬＩＳＡは、感染動物のどの群も識別しなかった（それらのＡＵＣは、常に０．７未満であった）。
【0016】
注目すべきは、タンパク質ＡＢＣＡ１３及び／又はＳＰＡＲＣ及び／又はＭＭＰ８を検出するＥＬＩＳＡが、特に、限局性病変を持つ動物の群及び全ての病変の群（この群は、限局性病変、多巣性病変、及びびまん性組織病変を持つ全ての動物を含む）の識別について、優れた成績を示したことであった。以下で提示する結果から分かるとおり、ＡＢＣＡ１３を検出するＥＬＩＳＡは、限局性病変を持つ動物の検出（ＡＵＣ値０．８６６、ｐ＜０．００１）及びいずれかの種類の組織病変を持つ動物の総合検出（ＡＵＣ値０．８２５、ｐ＜０．００１）両方に最も正確な診断性能を示した。すなわち、ＡＢＣＡ１３を検出するＥＬＩＳＡは、限局性病変を持つ動物を検出し、いずれかの種類の組織病変を持つ動物を総合検出する正確な方法である。
【0017】
それゆえに、ＡＢＣＡ１３は、本明細書中、ＰＴＢの診断に現在使用されている方法の信頼できる代替法として提示される。実際、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、ＰＴＢの診断に今日広く使用されているものの、この方法は、高率の偽陰性結果（低い感度）を伴う。このことは、感染している対象のうち高パーセンテージが、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡの低感度ゆえに、なおも検査陰性になることを意味する。この問題が、本発明により解決される。なぜなら、例えば本明細書中で説明されるとおり、ＡＢＣＡ１３は、高い感度及び特異度を示したからである。
【0018】
したがって、本発明の第１の実施の形態は、マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）対象から得られた生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を測定することを含み、ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度の上昇が同定される場合、これは、対象がマイコバクテリウム種に感染していることを示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。
【0019】
好適な実施の形態において、本発明は、ＭＡＰに感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）対象から得られた生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を測定することを含み、ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度の上昇が同定される場合、これは、対象がＭＡＰに感染していることを示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。
【0020】
好適な実施の形態において、本発明は、対象においてＰＴＢを診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）対象から得られた生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を測定することを含み、ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度の上昇が同定される場合、これは、対象がＰＴＢに罹患していることを示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。
【0021】
好適な実施の形態において、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、ａ）対象から得られた生体試料中のタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］の濃度を測定することを含み、ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］の濃度の上昇が同定される場合、これは、対象がＰＴＢに罹患していることを示す。
【0022】
好適な実施の形態において、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、ａ）対象から得られた生体試料中のタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度を測定することを含み、ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度の上昇が同定される場合、これは、対象がＰＴＢに罹患していることを示す。
【0023】
好適な実施の形態において、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、ａ）対象から得られた生体試料中のタンパク質濃度を測定することを含み、先行して言及されたタンパク質のいずれかについて得られた濃度が、確立されたカットオフ値を超える（≧）場合、これは、対象がＰＴＢに罹患していることを示す。
【0024】
好適な実施の形態において、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、潜在性又は開存性ＰＴＢ、好ましくは潜在性ＰＴＢを診断することを含む。
【0025】
好適な実施の形態において、生体試料は、好ましくは、血清、血漿、又は血液を含む体液である。
【0026】
好適な実施の形態において、対象は、畜牛、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、シカ、ウサギ、イノシシ、バイソン、リャマ、アルパカ、オポッサム、アナグマ、ゾウ、又はヒトからなる群より選択される哺乳類であり、好ましくは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、シカ、リャマ、又はアルパカからなる群より選択される牧畜動物である。
【0027】
好適な実施の形態において、上記の方法は、免疫アッセイ、好ましくは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。
【0028】
本発明の第２の実施の形態は、マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するための、タンパク質ＡＢＣＡ１３、タンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］、又はタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。
【0029】
好適な実施の形態において、タンパク質は、ＭＡＰに感染した対象を診断するために使用される。
【0030】
好適な実施の形態において、タンパク質は、ＰＴＢを診断するために使用される。
【0031】
好適な実施の形態において、タンパク質は、潜在性又は開存性ＰＴＢ、好ましくは潜在性ＰＴＢを診断するために使用される。
【0032】
本発明の第３の実施の形態は、上記の方法のいずれかを行うのに適合したキットに関し、本キットは、タンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を特定する道具又は試薬を備える。
【0033】
好適な実施の形態において、キットは、タンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］又はタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度を特定する道具又は試薬を備える。
【0034】
好適な実施の形態において、本発明は、マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するための上記キットの使用に関する。
【0035】
本発明の第４の実施の形態は、治療上有効な用量又は量の組成物を適用することにより、マイコバクテリウム種、特にＭＡＰに感染した対象を治療する方法に関し、組成物は、細菌に感染した対象に陽性の治療反応をもたらす。意味深いことは、本方法は、上記の方法のいずれかを用いることにより、対象を診断する第一工程を含むことである。
【0036】
第５の実施の形態は、或るバッチの乳汁が、ＭＡＰに感染していないメスに由来するものであること、したがって、その製品が、上述のヒト疾患のいずれを引き起こす顕著なリスクをどのようなものも伴わずにヒトが消費することにふさわしいことを保証する方法に関する。
【0037】
本発明の目的に関して、以下の用語を以下のとおり定義する：
「非感染対照である対象において測定されたタンパク質の濃度」という語句は、そのタンパク質の濃度の「基準値」を示す。この「基準値」を基準にして、タンパク質の濃度の「上昇」が特定される（すなわち、濃度が基準値より有意に高い）場合、これは、対象が細菌に感染していることを示す。
「基準値」は、閾値又はカットオフ値とすることができる。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的、経験的、又は理論的に決定することができる。当業者によって認識されるように、「カットオフ値」はまた、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択され得る。検査の機能及びベネフィット／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に応じて最適な感度及び特異度を得るには、「カットオフ値」を決定しなければならない。典型的には、最適な感度及び特異度（したがって閾値）は、実験データに基づく受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、基準群においてバイオマーカーのレベルを決定した後、検査対象の生体試料中のバイオマーカーの測定濃度の統計的処理にアルゴリズム分析を使用して、試料分類に有意性を有する分類基準を取得することができる。ＲＯＣ曲線は、主に臨床生化学的診断検査に使用される。ＲＯＣ曲線は、真陽性率（感度）及び偽陽性率（１－特異度）の連続変数を反映する包括的な指標である。ＲＯＣ曲線は、画像合成法によって感度と特異度との関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、診断検査の陽性結果と陰性結果との間の境界値）は、一連の感度及び特異度の値を計算するための連続変数として設定される。次いで、感度を垂直座標として使用し、特異度を水平座標として使用して曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、診断／予後の正確度が高くなる。ＲＯＣ曲線では、座標図の左上端に最も近い点が、高感度及び高特異度の両方の値を持つ臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は１．０～０．５である。ＡＵＣが０．５超である場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて、診断結果はますます良くなる。ＡＵＣが０．５～０．７の場合、正確度は低くなる。ＡＵＣが０．７～０．９の場合、正確度は良好である。ＡＵＣが０．９より大きい場合、正確度は非常に高くなる。このアルゴリズム的方法は、好ましくはコンピュータを用いて行われる。当該技術分野における既存のソフトウェア又はシステムをＲＯＣ曲線の描画に使用することができる。
「含む」とは、「含む」という言葉を伴うものを包含するがこれに限定されないことを意味する。したがって、「含む」という用語の使用は、列挙された要素が要求される又は必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよいことを示す。
「のみからなる」とは、「のみからなる」という句を伴うものを「包含し、限定する」という意味である。したがって、「のみからなる」という句は、列挙された要素が要求される又は必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
ＰＴＢの治療用組成物の「治療上有効な用量又は量」は、投与された場合、ＰＴＢに罹患している対象に陽性の治療反応をもたらす量であることを意図する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全体的な状態、治療される症状の重篤度、投与様式等に応じて、対象ごとに変化することになる。個別の症例のいずれであっても、適切な「有効」量は、本明細書中において提供される情報に基づき、常用実験を用いて、当業者が決定することができる。
「潜在性」及び「開存性」は、ＭＡＰを原因とする感染症で起こり得る２種類を示す。「潜在性」ＰＴＢは、感染症の微生物学的又は免疫学的証拠の頻度が低度又は中度である限局性病変の存在を示す。「潜在性」感染症は、疾患の慢性又は無症候性所見を生じさせる可能性があり、この場合、臨床兆候は、依然として知覚できない。対照的に、「開存性」ＰＴＢは、感染症の微生物学的又は免疫学的証拠の頻度が高い、多巣性又はびまん性の炎症性病変の存在を示す。「開存性」感染症は、概して、疾患の臨床所見を生じさせる可能性があり、この場合、臨床兆候は知覚できる。
「非感染対照である対象において測定されたタンパク質の濃度」という語句は、そのタンパク質の濃度の「基準値」を示す。この「基準値」を基準にして、タンパク質の濃度の「上昇」が特定される（すなわち、濃度が基準値より有意に高い）場合、これは、対象が細菌に感染していることを示す。
「基準値」は、閾値又はカットオフ値とすることができる。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的、経験的、又は理論的に決定することができる。当業者によって認識されるように、「カットオフ値」はまた、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択され得る。検査の機能及びベネフィット／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に応じて最適な感度及び特異度を得るには、「カットオフ値」を決定しなければならない。典型的には、最適な感度及び特異度（したがって閾値）は、実験データに基づく受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、基準群においてバイオマーカーのレベルを決定した後、検査対象の生体試料中のバイオマーカーの測定濃度の統計的処理にアルゴリズム分析を使用して、試料分類に有意性を有する分類基準を取得することができる。ＲＯＣ曲線は、主に臨床生化学的診断検査に使用される。ＲＯＣ曲線は、真陽性率（感度）及び偽陽性率（１－特異度）の連続変数を反映する包括的な指標である。ＲＯＣ曲線は、画像合成法によって感度と特異度との関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、診断検査の陽性結果と陰性結果との間の境界値）は、一連の感度及び特異度の値を計算するための連続変数として設定される。次いで、感度を垂直座標として使用し、特異度を水平座標として使用して曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、診断／予後の正確度が高くなる。ＲＯＣ曲線では、座標図の左上端に最も近い点が、高感度及び高特異度の両方の値を持つ臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は１．０～０．５である。ＡＵＣが０．５超である場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて、診断結果はますます良くなる。ＡＵＣが０．５～０．７の場合、正確度は低くなる。ＡＵＣが０．７～０．９の場合、正確度は良好である。ＡＵＣが０．９より大きい場合、正確度は非常に高くなる。このアルゴリズム的方法は、好ましくはコンピュータを用いて行われる。当該技術分野における既存のソフトウェア又はシステムをＲＯＣ曲線の描画に使用することができる。
「含む」とは、「含む」という言葉を伴うものを包含するがこれに限定されないことを意味する。したがって、「含む」という用語の使用は、列挙された要素が要求される又は必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよいことを示す。
「のみからなる」とは、「のみからなる」という句を伴うものを「包含し、限定する」という意味である。したがって、「のみからなる」という句は、列挙された要素が要求される又は必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
ＰＴＢの治療用組成物の「治療上有効な用量又は量」は、投与された場合、ＰＴＢに罹患している対象に陽性の治療反応をもたらす量であることを意図する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全体的な状態、治療される症状の重篤度、投与様式等に応じて、対象ごとに変化することになる。個別の症例のいずれであっても、適切な「有効」量は、本明細書中において提供される情報に基づき、常用実験を用いて、当業者が決定することができる。
「潜在性」及び「開存性」は、ＭＡＰを原因とする感染症で起こり得る２種類を示す。「潜在性」ＰＴＢは、感染症の微生物学的又は免疫学的証拠の頻度が低度又は中度である限局性病変の存在を示す。「潜在性」感染症は、疾患の慢性又は無症候性所見を生じさせる可能性があり、この場合、臨床兆候は、依然として知覚できない。対照的に、「開存性」ＰＴＢは、感染症の微生物学的又は免疫学的証拠の頻度が高い、多巣性又はびまん性の炎症性病変の存在を示す。「開存性」感染症は、概して、疾患の臨床所見を生じさせる可能性があり、この場合、臨床兆候は知覚できる。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】腸管組織に異なる種類の組織病変を示すホルスタイン・フリーシアン（Holstein Friesian）畜牛の血清中のバイオマーカー濃度を示す図であり、限局性（ｎ＝５５）、多巣性（ｎ＝１７）、及びびまん性（ｎ＝１５）である。対照動物（ｎ＝６１）は、ＰＴＢ非感染農場の動物であった。ＡＢＣＡ１３について分析した、限局性病変、多巣性病変、びまん性病変、又はいずれかの種類の病変を持つ動物の個体数は、それぞれ、５３、１６、１４、及び８３であった。MyBioSource（サンディエゴ、ＣＡ、米国）が供給する特異的ＥＬＩＳＡにより、ウシ血清中のバイオマーカーを検出及び定量した。ａ）ＦＡＭ８４Ａ、配列類似性を持つウシファミリー８４－メンバーＡ；ｂ）ＤＥＳ、ウシデスミン；ｃ）ＡＢＣＡ１３、ウシＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１３；ｄ）ＭＭＰ８、ウシマトリックスメタロペプチダーゼ８；ｅ）ＳＰＡＲＣ、酸性及びシステイン豊富なウシ分泌タンパク質；ｆ）ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ。データは、散布図として表し、各点は、１頭の動物を表す。各組織学的群の平均を、黒色粗点で表し、標準偏差を垂線で表す。アスタリスクは、各組織学的群と対照との間の差が有意であるか否かを示す（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＞０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図2】ＰＴＢ非感染農場の対照動物（ｎ＝６１）と対比させた、腸管組織に限局性（ｎ＝５５）、多巣性（ｎ＝１７）、又はびまん性（ｎ＝１５）組織病変を持つホルスタイン・フリーシアンウシの選択されたバイオマーカーの受信者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す図である。ＡＢＣＡ１３について分析した、限局性病変、多巣性病変、びまん性病変、又はいずれかの種類の病変を持つ動物の個体数は、それぞれ、５３、１６、１４、及び８３であった。ａ）ＦＡＭ８４Ａ、配列類似性を持つウシファミリー８４－メンバーＡ；ｂ）ＤＥＳ、ウシデスミン、ｃ）ＡＢＣＡ１３、ウシＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１３；ｄ）ＭＭＰ８、ウシマトリックスメタロペプチダーゼ８；ｅ）ＳＰＡＲＣ、酸性及びシステイン豊富なウシ分泌タンパク質；ｆ）ＩＤＥＸＸ血清ＥＬＩＳＡ。
【発明を実施するための形態】
【0039】
以下の実施例は、本発明を実行する好適なやり方を開示するが、本発明の保護範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【0040】
実施例１．方法論
実施例１．１ 動物及び倫理規定
この現地調査には２群の動物が含まれていた：屠殺群）ホルスタイン・フリーシアンウシ９３頭（年齢範囲０．８１歳～１２．６６歳）は、アストゥリアス州（スペイン北西部）に位置する２６ヶ所の農場出身であった。アストゥリアスでは、２０１７年に、牛群の２５％及び動物の１．９％が、血清ＥＬＩＳＡで陽性であった（データは地域政府の記録から得た）。具体的には、動物５５頭は１ヶ所の酪農場出身で、この酪農場は、牛群の平均頭数が１０５頭（２０１６年～２０１９年）であり、サンプリング期間中、血清ＥＬＩＳＡ検査（IDEXX laboratories、ホーフトドルプ、オランダ）に基づき、ＰＴＢの平均感染率が６．３０％であった。別の３４頭の動物は、地域の畜殺場で屠殺されたウシから無作為に選択されたものであり（２４ヶ所の異なる農場出身）、残りの４頭のウシは、ＳＥＲＩＤＡのフリーシアンウシ飼育場（２０１８年～２０１９年の期間中の平均ＰＴＢ感染率３％）出身であった。屠殺時のこれら９３頭の動物のＰＴＢ感染状況は、組織病理検査、血清ＥＬＩＳＡ検査、並びに組織及び糞便の、微生物培養及び特異的リアルタイムＰＣＲにより特定した。ＰＴＢ関連臨床兆候、例えば、緩徐体重減少、下痢、及び乳生産量の低下等の存在に関する情報は、可能な場合には農場従事者から得た；並びにＰＴＢ非感染群）アストゥリアスのＰＴＢ非感染農場出身の動物６１頭（年齢範囲０．５０歳～１０．０８歳）を、本研究の対照群として使用した。この対照農場のＰＴＢ非感染状況は、毎年のＩＤＥＸＸ血清ＥＬＩＳＡ、２０１６年～２０２０年の期間中に臨床例が存在しないこと、並びに２０１９年に糞便微生物培養及びＰＣＲで陽性結果が出ていないことにより、実証した。
実施例１．１ 動物及び倫理規定
この現地調査には２群の動物が含まれていた：屠殺群）ホルスタイン・フリーシアンウシ９３頭（年齢範囲０．８１歳～１２．６６歳）は、アストゥリアス州（スペイン北西部）に位置する２６ヶ所の農場出身であった。アストゥリアスでは、２０１７年に、牛群の２５％及び動物の１．９％が、血清ＥＬＩＳＡで陽性であった（データは地域政府の記録から得た）。具体的には、動物５５頭は１ヶ所の酪農場出身で、この酪農場は、牛群の平均頭数が１０５頭（２０１６年～２０１９年）であり、サンプリング期間中、血清ＥＬＩＳＡ検査（IDEXX laboratories、ホーフトドルプ、オランダ）に基づき、ＰＴＢの平均感染率が６．３０％であった。別の３４頭の動物は、地域の畜殺場で屠殺されたウシから無作為に選択されたものであり（２４ヶ所の異なる農場出身）、残りの４頭のウシは、ＳＥＲＩＤＡのフリーシアンウシ飼育場（２０１８年～２０１９年の期間中の平均ＰＴＢ感染率３％）出身であった。屠殺時のこれら９３頭の動物のＰＴＢ感染状況は、組織病理検査、血清ＥＬＩＳＡ検査、並びに組織及び糞便の、微生物培養及び特異的リアルタイムＰＣＲにより特定した。ＰＴＢ関連臨床兆候、例えば、緩徐体重減少、下痢、及び乳生産量の低下等の存在に関する情報は、可能な場合には農場従事者から得た；並びにＰＴＢ非感染群）アストゥリアスのＰＴＢ非感染農場出身の動物６１頭（年齢範囲０．５０歳～１０．０８歳）を、本研究の対照群として使用した。この対照農場のＰＴＢ非感染状況は、毎年のＩＤＥＸＸ血清ＥＬＩＳＡ、２０１６年～２０２０年の期間中に臨床例が存在しないこと、並びに２０１９年に糞便微生物培養及びＰＣＲで陽性結果が出ていないことにより、実証した。
【0041】
実験手順は、ＳＥＲＩＤＡ動物倫理委員会により承認され、Regional Consejeria de Agroganaderia y Recursos Autoctonos del Principado de Asturias（スペイン）により承認された（承認番号ＰＲＯＡＥ２９／２０１５及びＰＲＯＡＥ６６／２０１９）。全ての手順は、欧州議会指令２０１２／６３／ＥＵに準拠して行われた。
【0042】
実施例１．２．組織及び糞便のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
組織及び糞便からのゲノムＤＮＡ単離は、ＭａｇＭａｘ全核酸単離キットを用いて、製造元説明書に従って行った（TermoFisher Scientifc、リシュー、フランス）。ＭＡＰ ＤＮＡの検出には、ＬＳＩ ＶｅｔＭａｘ ＴｒｉｐｌｅｘリアルタイムＰＣＲを、製造元説明書に従って使用した（TermoFisher Scientifc、リシュー、フランス）。このキットは、糞便、液体培養物、及び組織又はコロニーから抽出されたＤＮＡ中のＭａｐ ＩＳ９００遺伝子及びＦ５７遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検出を可能にする。リアルタイムＰＣＲ増幅を、ＭＸ３０００ＰリアルタイムＰＣＲ検出システム（Stratagene、サンディエゴ、米国）を用いて行い、システムには以下の条件を用いた：５０℃で２分間のサイクルを１回、９５℃で１０分間のサイクルを１回、９５℃で１５秒間の変性サイクルを４５回、及び６０℃で６０秒間のアニーリング／伸長。
組織及び糞便からのゲノムＤＮＡ単離は、ＭａｇＭａｘ全核酸単離キットを用いて、製造元説明書に従って行った（TermoFisher Scientifc、リシュー、フランス）。ＭＡＰ ＤＮＡの検出には、ＬＳＩ ＶｅｔＭａｘ ＴｒｉｐｌｅｘリアルタイムＰＣＲを、製造元説明書に従って使用した（TermoFisher Scientifc、リシュー、フランス）。このキットは、糞便、液体培養物、及び組織又はコロニーから抽出されたＤＮＡ中のＭａｐ ＩＳ９００遺伝子及びＦ５７遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検出を可能にする。リアルタイムＰＣＲ増幅を、ＭＸ３０００ＰリアルタイムＰＣＲ検出システム（Stratagene、サンディエゴ、米国）を用いて行い、システムには以下の条件を用いた：５０℃で２分間のサイクルを１回、９５℃で１０分間のサイクルを１回、９５℃で１５秒間の変性サイクルを４５回、及び６０℃で６０秒間のアニーリング／伸長。
【0043】
実施例１．３．組織及び糞便の微生物培養
微生物培養のため、回盲リンパ節、遠位空腸リンパ節、回盲弁（ＩＣＶ）、及び遠位空腸のプール（２ｇｒ）に対して、最終濃度０．７５％のヘキサ－デシルピリジニウムクロリド３８ｍＬ（Sigma、セントルイス、ＭＯ）で除染し、ｓｔｏｍａｃｈｅｒブレンダーでホモジナイズした。室温で３０分間インキュベートした後、懸濁液１５ｍＬを新たな試験管に移し、除染及び沈降のため一晩インキュベートした。懸濁液約２００μｌを、沈降物近くの層から採取し、ハロルド卵黄培地（ＨＥＹＭ；Becton Dickinson、スパークス、ＭＤ）の２つの傾斜面及びレーベンシュタイン・イェンセン培地（ＬＪ；Difco、デトロイト、ＭＩ）の２つの傾斜面に播種した。培地は両方とも、２ｍｇ／ＬのＭｙｃｏｂａｃｔｉｎ Ｊ（ID.vet Innovative Diagnostics、グラベル、フランス）が補充されていた。屠殺の時点で、各動物の直腸から糞便を採取し、４℃に維持し、検査所に到着してから４８時間以内に処理した。組織培養について上記したとおりに、糞便試料（各２ｇ）を除染し、ｓｔｏｍａｃｈｅｒでブレンドし、ＨＥＹＭ及びＬＪで培養した。
微生物培養のため、回盲リンパ節、遠位空腸リンパ節、回盲弁（ＩＣＶ）、及び遠位空腸のプール（２ｇｒ）に対して、最終濃度０．７５％のヘキサ－デシルピリジニウムクロリド３８ｍＬ（Sigma、セントルイス、ＭＯ）で除染し、ｓｔｏｍａｃｈｅｒブレンダーでホモジナイズした。室温で３０分間インキュベートした後、懸濁液１５ｍＬを新たな試験管に移し、除染及び沈降のため一晩インキュベートした。懸濁液約２００μｌを、沈降物近くの層から採取し、ハロルド卵黄培地（ＨＥＹＭ；Becton Dickinson、スパークス、ＭＤ）の２つの傾斜面及びレーベンシュタイン・イェンセン培地（ＬＪ；Difco、デトロイト、ＭＩ）の２つの傾斜面に播種した。培地は両方とも、２ｍｇ／ＬのＭｙｃｏｂａｃｔｉｎ Ｊ（ID.vet Innovative Diagnostics、グラベル、フランス）が補充されていた。屠殺の時点で、各動物の直腸から糞便を採取し、４℃に維持し、検査所に到着してから４８時間以内に処理した。組織培養について上記したとおりに、糞便試料（各２ｇ）を除染し、ｓｔｏｍａｃｈｅｒでブレンドし、ＨＥＹＭ及びＬＪで培養した。
【0044】
実施例１．４．動物の組織学的分類
上述したとおり、本研究に含まれた動物を、動物の腸管組織に存在する組織病変の種類に従って分類した。遠位空腸、ＩＣＶ、及び空腸、並びにＩＣＶリンパ節の組織切片を、屠殺されたウシ９３頭から収集し、１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、標準手順を用いて、パラフィンワックスに包埋及び切片化した。その後、４μｍ切片を、特異的抗酸菌検出用に、ヘマトキシリン・イオシン（ＨＥ）及びチール・ネールゼン（ＺＮ）染色により評価した。切片は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ－２光学顕微鏡を用いて観察し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ－１２デジタルカメラを用いて撮影した。染色した切片を、病理学的病変の検出及び分類のため並びに抗酸菌（ＡＦＢ）の存在について光学顕微鏡法で検査した。
上述したとおり、本研究に含まれた動物を、動物の腸管組織に存在する組織病変の種類に従って分類した。遠位空腸、ＩＣＶ、及び空腸、並びにＩＣＶリンパ節の組織切片を、屠殺されたウシ９３頭から収集し、１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、標準手順を用いて、パラフィンワックスに包埋及び切片化した。その後、４μｍ切片を、特異的抗酸菌検出用に、ヘマトキシリン・イオシン（ＨＥ）及びチール・ネールゼン（ＺＮ）染色により評価した。切片は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ－２光学顕微鏡を用いて観察し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ－１２デジタルカメラを用いて撮影した。染色した切片を、病理学的病変の検出及び分類のため並びに抗酸菌（ＡＦＢ）の存在について光学顕微鏡法で検査した。
【0045】
実施例１．５ 選択したバイオマーカーを検出する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ Ｚ血清凝固アクチベータプラスチック管（serum clot activator Plastic tube）（Vacuette、クレムスミュンスター、オーストリア）を用いて、本研究に含まれているウシ全頭の尾静脈から末梢血を採取した。凝固後、室温で２５００ｇにて２０分間遠心することにより血清を分離させ、使用するまで－２０℃で貯蔵した。各動物の血清中の選択したバイオマーカー濃度を、市販されているＥＬＩＳＡを用いて、製造元説明書に従って測定した。定量的サンドイッチＥＬＩＳＡキットウシマトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）（検出範囲３．１２ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ）；ウシタンパク質ＦＡＭ８４Ａ ＥＬＩＳＡキット（検出範囲６２．５ｐｇ／ｍＬ～２０００ｐｇ／ｍＬ）、ウシＳＰＡＲＣ ＥＬＩＳＡキット（検出範囲０．７８ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ）、及び競合ウシＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１３（ＡＢＣＡ１３）ＥＬＩＳＡキット（検出範囲０ｐｇ／ｍＬ～５０００ｐｇ／ｍＬ）及びウシデスミン（ＤＥＳ）ＥＬＩＳＡキット（検出範囲０ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ）を、それぞれ、ＭＭＰ８、ＦＡＭ８４Ａ、ＡＢＣＡ１３、ＳＰＡＲＣ、及びＤＥＳの特異的検出用に用いた（MyBioSource、サンディエゴ、ＣＡ、米国）。
ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ Ｚ血清凝固アクチベータプラスチック管（serum clot activator Plastic tube）（Vacuette、クレムスミュンスター、オーストリア）を用いて、本研究に含まれているウシ全頭の尾静脈から末梢血を採取した。凝固後、室温で２５００ｇにて２０分間遠心することにより血清を分離させ、使用するまで－２０℃で貯蔵した。各動物の血清中の選択したバイオマーカー濃度を、市販されているＥＬＩＳＡを用いて、製造元説明書に従って測定した。定量的サンドイッチＥＬＩＳＡキットウシマトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ８）（検出範囲３．１２ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ）；ウシタンパク質ＦＡＭ８４Ａ ＥＬＩＳＡキット（検出範囲６２．５ｐｇ／ｍＬ～２０００ｐｇ／ｍＬ）、ウシＳＰＡＲＣ ＥＬＩＳＡキット（検出範囲０．７８ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ）、及び競合ウシＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー１３（ＡＢＣＡ１３）ＥＬＩＳＡキット（検出範囲０ｐｇ／ｍＬ～５０００ｐｇ／ｍＬ）及びウシデスミン（ＤＥＳ）ＥＬＩＳＡキット（検出範囲０ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬ）を、それぞれ、ＭＭＰ８、ＦＡＭ８４Ａ、ＡＢＣＡ１３、ＳＰＡＲＣ、及びＤＥＳの特異的検出用に用いた（MyBioSource、サンディエゴ、ＣＡ、米国）。
【0046】
バイオマーカーＡＢＣＡ１３の特異的検出のアッセイ手順をより詳細に記載すると、以下のとおりである：
１．適切なウェルに、血清試料及び標準物質を１００μＬ加える。ブランク対照ウェルにＰＢＳ、１００μＬ（ｐＨ７．０～７．２）を加える。
２．各ウェルに複合体５０μＬを加える（ブランク対照ウェルには加えない）。十分に混合する。プレートを被覆し、３７℃で１時間インキュベートする。
３．自動ワッシャーを用いて、プレートを、希釈した１倍洗浄液で５回洗う（３５０μＬ／ウェル／洗浄～４００μＬ／ウェル／洗浄）。ワッシャーは、各洗浄の間の浸漬時間を１０秒及び震盪時間を５秒に設定することが推奨される。
４．ブランク対照ウェルも含めて各ウェルに、基質Ａ、５０μＬ及び基質Ｂ、５０μＬを加える。引き続き、被覆し３７℃で１５分間インキュベートする（日光を遮光し、１５分後に呈色が濃くなっていなければ、インキュベーション時間を延長すること、ただし最長でも３０分である）。
５．ブランク対照ウェルも含めて各ウェルに、停止液５０μＬを加える。ウェルを混合する。
６．直ちに、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度（Ｏ．Ｄ．）を特定する。
１．適切なウェルに、血清試料及び標準物質を１００μＬ加える。ブランク対照ウェルにＰＢＳ、１００μＬ（ｐＨ７．０～７．２）を加える。
２．各ウェルに複合体５０μＬを加える（ブランク対照ウェルには加えない）。十分に混合する。プレートを被覆し、３７℃で１時間インキュベートする。
３．自動ワッシャーを用いて、プレートを、希釈した１倍洗浄液で５回洗う（３５０μＬ／ウェル／洗浄～４００μＬ／ウェル／洗浄）。ワッシャーは、各洗浄の間の浸漬時間を１０秒及び震盪時間を５秒に設定することが推奨される。
４．ブランク対照ウェルも含めて各ウェルに、基質Ａ、５０μＬ及び基質Ｂ、５０μＬを加える。引き続き、被覆し３７℃で１５分間インキュベートする（日光を遮光し、１５分後に呈色が濃くなっていなければ、インキュベーション時間を延長すること、ただし最長でも３０分である）。
５．ブランク対照ウェルも含めて各ウェルに、停止液５０μＬを加える。ウェルを混合する。
６．直ちに、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度（Ｏ．Ｄ．）を特定する。
【0047】
標準曲線を使用して、血清試料中のバイオマーカーの濃度を特定した（各標準物質の平均ＯＤを、横軸の濃度に対して縦軸にプロットし、最適当てはめから回帰曲線を作成する）。標準物質及び試料は、２つ組で試験した。生ＯＤ値の平均値からブランク対照の平均値を差し引いた後、結果を解釈した。最適化のため、血清の希釈度を変えて試験し（例えば、希釈せず、１：２、１：４、及び１：８）、標準曲線範囲内に含まれる測定値を持つ試料の数をより多く示した希釈物を、最適であると判断した。ほとんどの場合、最適希釈は１：２であったが、特定のバイオマーカーを高濃度で含む試料は、より高い希釈度でアッセイしなければならなかった。
【0048】
実施例１．６ 統計分析
各ＥＬＩＳＡのＡＵＣ（曲線下面積）及び最適カットオフ値を、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析により特定した。感度及び特異度に関する最適カットオフ値は、最大ユーデン指数（Ｊ＝Ｓｅ＋Ｓｐ－１）に基づくものであった。
各ＥＬＩＳＡのＡＵＣ（曲線下面積）及び最適カットオフ値を、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析により特定した。感度及び特異度に関する最適カットオフ値は、最大ユーデン指数（Ｊ＝Ｓｅ＋Ｓｐ－１）に基づくものであった。
【0049】
各バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡが異なる組織学的群と対照群を識別する識別力を、［Muller, M.P., Tomlinson, G., Marrie, T.J., Tang, P.., McGeer, A., Low, D.E., Detsky, A.S., Gold, W.L. (2005). Can routine laboratory tests discriminate between severe acute respiratory syndrome and other causes of community-acquired pneumonia? Clin Infect Dis. 40(8):1079-86. https://doi.org/10.1086/428577］［Park HE., Park, H-T., Jung YH., Yoo, HS. (2017). Establishment a real-time reverse transcription PCR based on host biomarkers for the detection of the sub-clinical cases of Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis. PLoS One. 25;12(5):e0178336. doi: 10.1371/journal.pone.0178336］に従って、以下のとおり特定した：ＡＵＣスコア≧０．９を、卓越した識別力；０．８≦ＡＵＣ＜０．９を、良好な識別力；０．７≦ＡＵＣ＜０．８を一応の識別力；及びＡＵＣ＜０．７を、不十分な識別力を有すると見なした（Muller et al., 2005）。ＡＵＣスコアが高いほど、良好な識別力を示すと見なした。
【0050】
多変量二項ロジスティック回帰モデル（ＲのＣａｒｅｔパッケージ）を用いて、複数のバイオマーカーを同時使用することの診断能力、ＡＵＣの提供、並びに異なるバイオマーカー組み合わせについての感度及び特異度のような値について評価した。ＲＯＣの曲線下面積（同じ症例から由来）間の差の統計的有意性を検定するＲＯＣ曲線比較を、不十分、良好、及び卓越ＡＵＣ値（ＡＵＣ≧０．７）を持つバイオマーカーについて、DeLong et al. (1998)の方法を用いて行った［DeLong ER, DeLong DM, Clarke-Pearson DL (1988): Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach. Biometrics 44:837-845］。２つの組織学的群間の定量的変数（例えば、年齢）の統計的有意差は、ステューデントのｔ検定（正規性を満たす）又はウィルコクソンの検定（正規性を満たさない）を用いて検定した。
【0051】
全データを、ｐＲＯＣ、ＯｐｔｉｍａｌＣｕｔｐｏｉｎｔｓ、及びＣａｒｅｔ［Max Kuhn(2020). caret: Classification and Regression Training. R package version 6.0-85. https://CRAN.R-project.org/package=caret］ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ Ｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．６．０［R Core Team (2018). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Austria. URL https://www.R-project.org/］を用いて分析した。信頼区間は９５％とした。
【0052】
実施例２．結果
実施例２．１ ＭＡＰ感染状況の組織学的、免疫学的、及び微生物学的評価
本研究に含まれた全動物（屠殺された動物ｎ＝９３及びＰＴＢ非感染農場由来の対照動物ｎ＝６１）の組織学的、免疫学的、及び微生物学的特性を、表２にまとめる。
実施例２．１ ＭＡＰ感染状況の組織学的、免疫学的、及び微生物学的評価
本研究に含まれた全動物（屠殺された動物ｎ＝９３及びＰＴＢ非感染農場由来の対照動物ｎ＝６１）の組織学的、免疫学的、及び微生物学的特性を、表２にまとめる。
【0053】
すなわち、表２は、本研究に含まれた１５４頭のホルスタイン・フリーシアンウシのＭＡＰ感染状況の評価を示す。腸管組織切片の病理検査から、動物を４つの群に分類することができた：限局性（ｎ＝５５、５９．１４％）、多巣性（ｎ＝１７、１８．２８％）、びまん性（ｎ＝１５、１６．１２％）、及び病変なし（ｎ＝６、６．４５％）。
【0054】
【表2】
【0055】
限局性病変を持つ動物群中、７６．３６％が、１種以上の診断法（チール・ネールゼン法、糞便及び組織のリアルタイムＰＣＲ、糞便及び組織の微生物培養、並びに血清ＥＬＩＳＡ）によって陽性であり、残部の２３．６４％は、アッセイした試験全てで陰性であった（ｎ＝１３）。具体的には、チール・ネールゼン法で４９．０９％、糞便リアルタイムＰＣＲで９．０９％、組織リアルタイムＰＣＲ及び組織微生物培養で２７．２７％、並びに糞便微生物培養及び血清ＥＬＩＳＡで５．４５％が陽性であった。限局性群の動物に、ＰＴＢに関する臨床兆候を示すものは１頭もおらず、そのため、限局性病変を持つ動物は、無症候性感染症であると見なされた。
【0056】
多巣性病変を持つ動物群では、試料の１００％が、以下の６種の技法のうち少なくとも１種で陽性であった：チール・ネールゼン法、糞便及び組織のリアルタイムＰＣＲ、糞便及び組織の微生物培養、並びに血清ＥＬＩＳＡ。詳細には、動物のうち９４．１１％はチール・ネールゼン法で、２３．５２％は血清ＥＬＩＳＡで、２９．４１％は糞便リアルタイムＰＣＲで、４１．１７％は組織リアルタイムＰＣＲで、１７．６４％は糞便培養で、及び４１．１７％は組織培養で陽性であった。この群では、より高いパーセンテージの動物（１５．３８％）が臨床兆候を示し、その中には、臨床兆候を持つ最も若い動物が含まれた（２．７２年齢）。びまん性群では、動物のうち１００％がチール・ネールゼン法で陽性であり、７３．３３％が血清ＥＬＩＳＡで並びに糞便及び組織リアルタイムＰＣＲで陽性であり、２０％が糞便培養で、及び６６．６６％が組織培養で陽性であった。この群では、動物の６４．２８％が、ＰＴＢ関連臨床兆候を有した。
【0057】
組織病理学検査により分析した動物９４頭のうち６頭だけが、その腸管組織に組織病変を示さなかった。これらの動物は、糞便及び組織のＭＡＰ特異的ＰＣＲ並びに微生物培養で、並びに血清ＥＬＩＳＡで陰性であった。病変を持たない動物を見つけ出す難しさを考慮して、試料規模を拡大し、結果の統計的有意性を上昇させる目的で、アストゥリアスのＰＴＢ非感染農場出身の動物６１頭を、対照群として使用することを決定した。この対照農場のＰＴＢ非感染状況は、毎年４回のＩＤＥＸＸ血清ＥＬＩＳＡ、２０１６年～２０１９年の期間中に臨床例が存在しないこと、並びに２０１９年に糞便の微生物培養及び特異的リアルタイムＰＣＲにより、実証した。しかしながら、これら動物は１頭も組織学的に検査しなかった、なぜなら組織学的検査は死後検査であり、これらの動物は依然として生存しているからである。
【0058】
限局性群（５．７２±２．１６歳）とＰＴＢ非感染対照群（３．６２±２．４１歳）間の年齢（ｐ＜０．００１）；及び多巣性群（５．５０±１．８５歳）とＰＴＢ非感染対照群（３．６２±２．４１歳）間の年齢（ｐ＝０．００９）に有意差が見られた。しかしながら、びまん性群（４．９８±１．５８歳）と対照群（３．６２±２．４１歳）（ｐ＝０．１４１）、限局性群とびまん性群（ｐ＝０．６５）、多巣性群とびまん性群（ｐ＝０．９０５）、及び多巣性群と限局性群（０．９８２）の年齢の間に有意差は見られなかった。
【0059】
実施例２．２ 選択したバイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡのＲＯＣ分析
各バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡが各種組織群と対照群を識別する診断正確度を、ＲＯＣ分析により計算した（図１及び図２）。限局性病変を持つ動物５５頭、多巣性病変を持つ動物１７頭、及びびまん性病変を持つ動物１５頭由来の血清試料８７本を用いて、ＦＡＭ８４Ａ、ＤＥＳ、ＭＭＰ８、及びＳＰＡＣＲを検出するバイオマーカーに基づく４種のＥＬＩＳＡから得られたデータのＲＯＣ分析を行った。限局性病変を持つ動物５３頭、多巣性病変を持つ動物１６頭、及びびまん性病変を持つ動物１４頭由来の血清試料８３本を用いて、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡのＲＯＣ分析を行った。上述したとおり、この分析に使用した対照群は、アストゥリアスのＰＴＢ非感染農場出身の動物６１頭からなるものであった。バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、従来型ＰＴＢ診断法、例えば、特異的抗ＭＡＰ抗体ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ）のものとも比較した。図１は、特定の組織学的群に分類されたホルスタイン・フリーシアン畜牛の１頭ごとの血清中の各バイオマーカー濃度を示し、図２は、各組織群についてバイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡそれぞれで得られたデータのＲＯＣ曲線を示す。
各バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡが各種組織群と対照群を識別する診断正確度を、ＲＯＣ分析により計算した（図１及び図２）。限局性病変を持つ動物５５頭、多巣性病変を持つ動物１７頭、及びびまん性病変を持つ動物１５頭由来の血清試料８７本を用いて、ＦＡＭ８４Ａ、ＤＥＳ、ＭＭＰ８、及びＳＰＡＣＲを検出するバイオマーカーに基づく４種のＥＬＩＳＡから得られたデータのＲＯＣ分析を行った。限局性病変を持つ動物５３頭、多巣性病変を持つ動物１６頭、及びびまん性病変を持つ動物１４頭由来の血清試料８３本を用いて、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡのＲＯＣ分析を行った。上述したとおり、この分析に使用した対照群は、アストゥリアスのＰＴＢ非感染農場出身の動物６１頭からなるものであった。バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、従来型ＰＴＢ診断法、例えば、特異的抗ＭＡＰ抗体ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ）のものとも比較した。図１は、特定の組織学的群に分類されたホルスタイン・フリーシアン畜牛の１頭ごとの血清中の各バイオマーカー濃度を示し、図２は、各組織群についてバイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡそれぞれで得られたデータのＲＯＣ曲線を示す。
【0060】
実施例２．２．１．限局性組織病変を持つ動物の検出（表３）
バイオマーカーＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ８、及びＳＰＡＲＣを検出する３種のＥＬＩＳＡは、限局性群と対照群の間で良好な識別力を有した（０．８≦ＡＵＣ＜０．９）。しかしながら、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡが最も正確な診断性能を示し（ＡＵＣ値０．８６６、ｐ＜０．００１）、感度７９．２５％及び９３．４４％という高い特異度であった。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡの組み合わせは、０．９５１というわずかに高くなったＡＵＣ値を与え、感度９３．４４％及び特異度（８０．７７％）であった。限局性病変を持つ動物を検出するＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断性能は、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ（ＡＵＣ値０．５３６）よりも良好であり、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、感度１４．５０％及び特異度１００．００％を有した。ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ８、及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡのＲＯＣ曲線間で有意差は観察されなかった（ＡＢＣＡ１３対ＭＭＰ８、ｐ＝０．３８６；ＡＢＣＡ１３対ＳＰＡＲＣ、ｐ＝０．３７２、及びＭＭＰ８対ＳＰＡＲＣ、ｐ＝０．７８１）。
バイオマーカーＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ８、及びＳＰＡＲＣを検出する３種のＥＬＩＳＡは、限局性群と対照群の間で良好な識別力を有した（０．８≦ＡＵＣ＜０．９）。しかしながら、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡが最も正確な診断性能を示し（ＡＵＣ値０．８６６、ｐ＜０．００１）、感度７９．２５％及び９３．４４％という高い特異度であった。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡの組み合わせは、０．９５１というわずかに高くなったＡＵＣ値を与え、感度９３．４４％及び特異度（８０．７７％）であった。限局性病変を持つ動物を検出するＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断性能は、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ（ＡＵＣ値０．５３６）よりも良好であり、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、感度１４．５０％及び特異度１００．００％を有した。ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ８、及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡのＲＯＣ曲線間で有意差は観察されなかった（ＡＢＣＡ１３対ＭＭＰ８、ｐ＝０．３８６；ＡＢＣＡ１３対ＳＰＡＲＣ、ｐ＝０．３７２、及びＭＭＰ８対ＳＰＡＲＣ、ｐ＝０．７８１）。
【0061】
表３は、腸管組織に限局性組織病変を持つ畜牛を診断する選択したバイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの診断性能を示す。診断性能が最良であったＥＬＩＳＡを、太字で示す。
【0062】
【表3】
【0063】
実施例２．２．２．多巣性組織病変を持つ動物の検出（表４）
多巣性群において、ＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡは、最も正確な診断性能を示した。ＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡは、多巣性群と対照群の間で良好な識別力を有し（ＡＵＣ値０．８６５、ｐ＜０．００１）、感度６６．７０％及び特異度９５．１０％であった。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡを用いた結果を組み合わせると、ＡＵＣは０．９００となり、感度９８．３６％及び特異度６４．７１％であった。ＳＰＡＲＣの検出に基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのものとも比較した。多巣性病変を持つ動物を検出するＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡの診断性能は、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ（ＡＵＣ値０．５９４）のものより良好であり、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、感度２７．８０％及び特異度１００．００％であった。ＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡのＲＯＣ曲線間に有意差は存在しなかった（ＭＭＰ８対ＳＰＡＲＣ、ｐ＝０．７７１）。
多巣性群において、ＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡは、最も正確な診断性能を示した。ＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡは、多巣性群と対照群の間で良好な識別力を有し（ＡＵＣ値０．８６５、ｐ＜０．００１）、感度６６．７０％及び特異度９５．１０％であった。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡを用いた結果を組み合わせると、ＡＵＣは０．９００となり、感度９８．３６％及び特異度６４．７１％であった。ＳＰＡＲＣの検出に基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのものとも比較した。多巣性病変を持つ動物を検出するＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡの診断性能は、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ（ＡＵＣ値０．５９４）のものより良好であり、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、感度２７．８０％及び特異度１００．００％であった。ＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡのＲＯＣ曲線間に有意差は存在しなかった（ＭＭＰ８対ＳＰＡＲＣ、ｐ＝０．７７１）。
【0064】
表４は、腸管組織に多巣性組織病変を持つ畜牛を診断する選択したバイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの診断性能を示す。診断性能が最良であったＥＬＩＳＡを、太字で示す。
【0065】
【表4】
【0066】
実施例２．２．３．びまん性組織病変を持つ動物の検出（表５）
ＡＢＣＡ１３及びＭＭＰ８を検出する２種のＥＬＩＳＡは、びまん性群と対照群の間で良好な識別力を有した（０．８≦ＡＵＣ＜０．９）。しかしながら、ＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡが最も正確な診断性能を示し（ＡＵＣ値０．８６６、＜０．００１）、感度１００．００％及び特異度７７．１０％であった。この場合、バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの組み合わせは、ＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡにより個別に得られる結果を改善しない。ＭＭＰ８の検出に基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのものとも比較した。ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのびまん性群と対照群の間の識別力は、卓越しており、ＡＵＣ値０．９１７（ｐ＜０．００１）であった。びまん性組織病変を持つ動物を検出するＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡの診断性能は、バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡのものよりも良好であり、感度８６．７０％及び特異度９６．７０％であった。ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ８、及びＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのＲＯＣ曲線の比較から、３種のＲＯＣ曲線間に有意差は存在しないことが示された（ＡＢＣＡ１３対ＭＭＰ８、ｐ＝０．８４３；ＡＢＣＡ１３対ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ、ｐ＝０．４８２、及びＭＭＰ８対ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ、ｐ＝０．４４４）。
ＡＢＣＡ１３及びＭＭＰ８を検出する２種のＥＬＩＳＡは、びまん性群と対照群の間で良好な識別力を有した（０．８≦ＡＵＣ＜０．９）。しかしながら、ＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡが最も正確な診断性能を示し（ＡＵＣ値０．８６６、＜０．００１）、感度１００．００％及び特異度７７．１０％であった。この場合、バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの組み合わせは、ＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡにより個別に得られる結果を改善しない。ＭＭＰ８の検出に基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのものとも比較した。ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのびまん性群と対照群の間の識別力は、卓越しており、ＡＵＣ値０．９１７（ｐ＜０．００１）であった。びまん性組織病変を持つ動物を検出するＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡの診断性能は、バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡのものよりも良好であり、感度８６．７０％及び特異度９６．７０％であった。ＡＢＣＡ１３、ＭＭＰ８、及びＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのＲＯＣ曲線の比較から、３種のＲＯＣ曲線間に有意差は存在しないことが示された（ＡＢＣＡ１３対ＭＭＰ８、ｐ＝０．８４３；ＡＢＣＡ１３対ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ、ｐ＝０．４８２、及びＭＭＰ８対ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ、ｐ＝０．４４４）。
【0067】
表５は、腸管組織にびまん性組織病変を持つ畜牛を診断する選択したバイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの診断性能を示す。診断性能が最良であったＥＬＩＳＡを、太字で示す。
【0068】
【表5】
【0069】
実施例．２．２．４．いずれかの種類の組織病変を持つ動物の総合検出（表６）
本発明者らは、バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡがいずれかの種類の組織病変（限局性、多巣性、又はびまん性）を持つ感染ウシと対照群を識別する能力を比較した。３種の異なる組織学的群が等しく代表されてはいない（限局性ｎ＝５５、多巣性ｎ＝１７、及びびまん性ｎ＝１５）ことは考慮しなければならないが、これは、農場の現実の状況を反映している。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡ及びＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡは、病変を持つ動物と対照群の間で良好な識別力を有した（０．８≦ＡＵＣ＜０．９）。しかしながら、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡが最も正確な診断性能を示し（ＡＵＣ値０．８２５、ｐ＜０．００１）、感度７０．６０％及び特異度９１．８０％であった。ＡＢＣＡ１３の検出に基づくＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡで得られた結果を組み合わせると、ＡＵＣ値はわずかに高くなり（０．９３３）、感度８８．５２％及び特異度７９．７６％であった。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのものとも比較した。感染した動物を検出するＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断性能は、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ（ＡＵＣ値０．６１３）のものよりも良好であり、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、感度２８．４０％及び特異度１００．００％であった。
本発明者らは、バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡがいずれかの種類の組織病変（限局性、多巣性、又はびまん性）を持つ感染ウシと対照群を識別する能力を比較した。３種の異なる組織学的群が等しく代表されてはいない（限局性ｎ＝５５、多巣性ｎ＝１７、及びびまん性ｎ＝１５）ことは考慮しなければならないが、これは、農場の現実の状況を反映している。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡ及びＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡは、病変を持つ動物と対照群の間で良好な識別力を有した（０．８≦ＡＵＣ＜０．９）。しかしながら、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡが最も正確な診断性能を示し（ＡＵＣ値０．８２５、ｐ＜０．００１）、感度７０．６０％及び特異度９１．８０％であった。ＡＢＣＡ１３の検出に基づくＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡで得られた結果を組み合わせると、ＡＵＣ値はわずかに高くなり（０．９３３）、感度８８．５２％及び特異度７９．７６％であった。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのものとも比較した。感染した動物を検出するＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断性能は、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ（ＡＵＣ値０．６１３）のものよりも良好であり、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、感度２８．４０％及び特異度１００．００％であった。
【0070】
表６は、腸管組織に組織病変を持つ畜牛を診断する選択したバイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの診断性能を示す。診断性能が最良であったＥＬＩＳＡを、太字で示す。
【0071】
【表6】
【0072】
各組織学的群について最良の診断性能を持つＥＬＩＳＡの要約を、以下に提示する。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡは、限局性病変を持つ動物の検出に最も正確な診断性能を示した（ＡＵＣ値０．８６６、ｐ＜０．００１）。ＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡは、多巣性病変を持つ動物の検出に最も正確な診断性能を示した（ＡＵＣ値０．８６５、ｐ＜０．００１）。ＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡは、びまん性病変を持つ動物の検出に最も正確な診断性能を示した（ＡＵＣ値０．８６６、ｐ＜０．００１）が、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡの診断性能（ＡＵＣ値０．９１７、ｐ＜０．００１）の方がバイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡのものより良好であり、感度８６．７０％及び特異度９６．７０％であった。最後に、いずれかの種類の組織病変を持つ動物の総合検出について、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡは、最も正確な診断性能を示し（ＡＵＣ値０．８２５、ｐ＜０．００１）、感度７０．６０％及び特異度９１．８０％であった。そのうえさらに、限局性、多巣性、又はいずれかの種類の病変を持つ動物を検出するバオイオマーカーの組み合わせは、診断の感度を改善する可能性がある。まとめると、本発明者らの結果は、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡは、限局性病変を持つ動物の識別及びいずれかの種類の組織病変を持つ動物の総合検出に極めて正確な方法であることを示す。
【0073】
表７は、各種組織学的動物群を検出する最良のバイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡ及びＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡの診断性能を示す。限局性病変を持つ動物５５頭、多巣性病変を持つ動物１７頭、及びびまん性病変を持つ動物１５頭由来の血清試料８７本を用いて、ＭＭＰ８に基づくＥＬＩＳＡ及びＳＰＡＲＣに基づくＥＬＩＳＡ並びにＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡのＲＯＣ分析を行った。限局性病変を持つ動物５３頭、多巣性病変を持つ動物１６頭、及びびまん性病変を持つ動物１４頭由来の血清試料８３本を用いて、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡのＲＯＣ分析を行った：
【0074】
【表7】
【0075】
実施例２．２．５．限局性病変を持つ動物の診断に関する、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断性能と他の従来法の診断性能の比較
ＡＢＣＡ１３の検出に基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、従来型ＰＴＢ診断法、例えば、特異的抗ＭＡＰ抗体ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ）、並びに特異的糞便及び組織のリアルタイムＰＣＲ、並びに微生物培養等の診断性能とも比較した。
ＡＢＣＡ１３の検出に基づくＥＬＩＳＡの診断性能を、従来型ＰＴＢ診断法、例えば、特異的抗ＭＡＰ抗体ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ）、並びに特異的糞便及び組織のリアルタイムＰＣＲ、並びに微生物培養等の診断性能とも比較した。
【0076】
表８は、腸管組織に限局性病変を持つ動物を検出する従来型及び新規のバイオマーカーに基づく診断アッセイの診断性能を示す。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡは、限局性病変を持つ動物の検出及び識別について、試験したその他の診断法よりも良好な診断価値を示した。限局性病変を持つ動物５５頭のうち４４頭を陽性として（８０％感度）、及び対照６１頭のうち５７頭を陰性として（９３％特異度）検出することができた。その他の従来法の診断価値又は感度は、それより低かった。具体的には、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは特異度が１００％だったものの、陽性として検出できたのは、使用したカットオフ（５５％）が供給元により確立されたものであった場合に動物５５頭のうち３頭のみ（５．４５％感度）、又はＲＯＣ分析により計算したカットオフ点（２８．３９％）を用いた場合に５５頭のうち８頭のみ（１４．５４％）であった。
【0077】
【表8】
【0078】
実施例２．２．６．バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの組み合わせを試験して、ロジスティック回帰分析を用いてＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断価値を特定した
５種の選択されたバイオマーカーのうち一部の組み合わせに基づく診断モデルは、単一バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの診断価値をわずかに改善した（表９参照）。
５種の選択されたバイオマーカーのうち一部の組み合わせに基づく診断モデルは、単一バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡの診断価値をわずかに改善した（表９参照）。
【0079】
表９は、腸管組織に各種組織病変を持つ畜牛の診断について、様々なバイオマーカーの併用に基づくモデルの診断性能を、単一バイオマーカーに基づくＥＬＩＳＡで得られる性能と比較して示す。この分析は、限局性動物５５頭、多巣性動物１８頭、びまん性動物１５頭、及び対照動物６７頭を用いて行った。
【0080】
【表9】
【0081】
実施例２．２．７．ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの大規模検証
本発明者らは、ＡＢＣＡ１３を検出するＥＬＩＳＡが、限局性病変を持つ動物の検出及びいずれかの種類の組織病変を持つ動物の総合検出に正確な方法であることを示した。
本発明者らは、ＡＢＣＡ１３を検出するＥＬＩＳＡが、限局性病変を持つ動物の検出及びいずれかの種類の組織病変を持つ動物の総合検出に正確な方法であることを示した。
【0082】
これらの結果を更に裏付けるため、限局性病変を持つ感染動物４４５頭、多巣性病変を持つ感染動物５５頭、及びびまん性病変病変を持つ感染動物５８頭由来の血清試料５５６本を用いて、ＡＢＣ１３に基づくＥＬＩＳＡの大規模検証（ｎ＝６６１）を行った。非感染対照群は、アストゥリアスのＰＴＢ非感染農場２ヶ所を出身とする動物１０５頭からなるものであった。
【0083】
表１０は、腸管組織に各種の組織病変を持つ畜牛を診断するＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断性能を示す。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡの診断正確度は、ＲＯＣ曲線分析により計算した。
【0084】
【表10】
【0085】
ＡＢＣＡ１３を検出するＥＬＩＳＡは、限局性群と対照群（ＡＵＣ値０．８４３、ｐ＜０．０００１）及び全病変群と対照群（ＡＵＣ値０．８８３、ｐ＜０．０００１）の間で良好な識別力を有する。これらの結果は、ＡＢＣＡ１３を検出するＥＬＩＳＡが、限局性病変を持つ動物の検出及びいずれかの種類の組織病変を持つ動物の総合検出の正確な診断法であることを更に裏付ける。
【0086】
実施例２．２．８．ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡで得られた結果とＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡで得られた結果の比較（Ｎ＝６６１）
本発明者らが上述したとおり、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、ＰＴＢの診断に今日広く使用されているが、この方法は、高率の偽陰性結果（低感度）が伴う。このことを理由に、本発明者らは、大規模検証試験で使用した試料６６１本について、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡで得られた結果とＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡで得られた結果を比較した。
本発明者らが上述したとおり、ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡは、ＰＴＢの診断に今日広く使用されているが、この方法は、高率の偽陰性結果（低感度）が伴う。このことを理由に、本発明者らは、大規模検証試験で使用した試料６６１本について、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡで得られた結果とＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡで得られた結果を比較した。
【0087】
表１１は、各種組織学的群の検出について、新規ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡ及び従来型ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡの、感度、特異度、及び診断価値を示す。ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡ及びＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡの感度及び特異度を概算するのに用いたカットオフ値は、それぞれ、３．６６ｎｇ／ｍＬ及び５５％（ＯＤ試料／ＯＤ陽性対照の相対％）であった。感度の概算は、限局性病変を持つ動物４４５頭、多巣性病変を持つ動物５５頭、及びびまん性病変を持つ動物５８頭の分析に基づくものであった。特異度を計算するのに用いた対照群は、ＰＴＢ非感染農場２ヶ所出身の動物１０５頭からなるものであった。
【0088】
【表11】
【0089】
これらの知見は、本発明者らの先の結果を支持するものであり、ＡＢＣＡ１３に基づくＥＬＩＳＡが、限局性病変を持つ動物の識別及びいずれかの種類の組織病変を持つ動物の総合検出の非常に正確な方法であることを示す。具体的には、ＡＢＣ１３に基づくＥＬＩＳＡは、従来型診断法で検出することが困難である無症候性感染症を表している限局性病変を持つ動物の検出により高い感度を有する。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【手続補正書】
【提出日】2022-02-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた血清又は血漿のみからなる生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がマイコバクテリウム種に感染していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項2】
マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに感染した対象を診断する、請求項１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた血清又は血漿のみからなる生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がマイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに感染していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項3】
対象においてパラ結核症を診断する、請求項１又は２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた血清又は血漿のみからなる生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がパラ結核症に罹患していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた血清又は血漿のみからなる生体試料中のタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がパラ結核症に罹患していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた血清又は血漿のみからなる生体試料中のタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）非感染対照である対象において測定されたタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度を基準にして、工程（ａ）でタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度の上昇が同定される場合、これは、前記対象がパラ結核症に罹患していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、該方法は、ａ）前記対象から得られた血清又は血漿のみからなる生体試料中の、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質の濃度を測定すること、
を含み、
ｂ）前記先行して言及されたタンパク質のいずれかについて得られた濃度が、確立されたカットオフ値を超える場合、これは、前記対象がパラ結核症に罹患していることを示す、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項7】
潜在性又は開存性パラ結核症、好ましくは潜在性パラ結核症を診断する、請求項１～６のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項8】
前記対象は、畜牛、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、シカ、ウサギ、イノシシ、バイソン、リャマ、アルパカ、オポッサム、アナグマ、ゾウ、又はヒトからなる群より選択される哺乳類であり、好ましくは、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、シカ、リャマ、又はアルパカからなる群より選択される牧畜動物である、請求項１～７のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項9】
マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するための、血清又は血漿からなる生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３、タンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］、又はタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項10】
マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシスに感染した対象を診断するための、請求項９に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項11】
パラ結核症を診断するための、請求項９又は１０に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項12】
潜在性又は開存性パラ結核症、好ましくは潜在性パラ結核症を診断するための、請求項９～１１のいずれか１項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項13】
マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するための、血清又は血漿からなる生体試料中のタンパク質ＡＢＣＡ１３の濃度を特定する道具又は試薬を備える、キットの使用。
【請求項14】
マイコバクテリウム種に感染した対象を診断するための、タンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ］又はタンパク質［ＡＢＣＡ１３及びＳＰＡＲＣ及びＭＭＰ８］の濃度を特定する道具又は試薬を備える、請求項１３に記載のキットの使用。
【国際調査報告】