ホーム > 特許ランキング > ＡＣＣＥＬＬＴＡ ＬＴＤ．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-26
(54)【発明の名称】遅延胚由来の哺乳類家畜多能性幹細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0735 20100101AFI20230719BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20230719BHJP
A23L 13/00 20160101ALI20230719BHJP
A23L 13/40 20230101ALI20230719BHJP
C12M 3/00 20060101ALN20230719BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20230719BHJP
C07K 14/50 20060101ALN20230719BHJP
C07K 14/54 20060101ALN20230719BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20230719BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20230719BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0735 ZNA
C12N5/077
A23L13/00 A
A23L13/40
C12M3/00 Z
C07K14/78
C07K14/50
C07K14/54
C07K14/705
C07K19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580505
(86)(22)【出願日】2021-07-01
(85)【翻訳文提出日】2023-02-21
(86)【国際出願番号】 IL2021050817
(87)【国際公開番号】W WO2022003700
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】63/047,375
(32)【優先日】2020-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519016262
【氏名又は名称】アクセルタ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＣＥＬＬＴＡ ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｍａｌａｔ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３ｒｄ Ｆｌｏｏｒ， Ｃａｍｐｕｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｏｎ， Ｈａｉｆａ， Ｉｓｒａｅｌ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アミット ミハエル
【テーマコード（参考）】
4B029
4B042
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA21
4B029BB11
4B042AC04
4B042AD03
4B042AD20
4B042AD21
4B042AE03
4B042AK20
4B042AP14
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BB19
4B065CA41
4H045AA10
4H045AA20
4H045CA40
4H045EA60
(57)【要約】
哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出する方法であって、（ａ）受精から少なくとも７日後の哺乳類家畜胚を、受精から少なくとも４日であり、２１日以内の培養期間に渡りｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を含む胚を得、（ｂ）胚からエピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を単離し、（ｃ）エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を未分化哺乳類家畜多能性幹細胞の増殖に適した条件下で培養して、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団を得、哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出することを含む方法が提供される。単離哺乳類家畜多能性幹細胞およびそこから分化した細胞も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出する方法であって、（ａ）受精から少なくとも７日後の哺乳類家畜胚を、受精から少なくとも４日であり、２１日以内の培養期間に渡りｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を含む胚を得、
（ｂ）前記胚から前記エピブラスト細胞および／または前記後期多能性幹細胞を単離し、
（ｃ）前記エピブラスト細胞および／または前記後期多能性幹細胞を、未分化哺乳類家畜多能性幹細胞の増殖に適した条件下で培養して、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団を得、
前記哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出することを含む、方法。
【請求項2】
前記哺乳類家畜多能性幹細胞が、脂肪生成性分化誘導剤の不存在下で脂肪細胞へ自発的に分化可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記哺乳類家畜多能性幹細胞が、デキサメタゾンを含まない培地で培養したときに脂肪細胞へ自発的に分化可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記胚が、直径約０．４ミリメートル（ｍｍ）から約１ｍｍによって特徴づけられるシストを発生したら、前記単離を実行する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記エピブラスト細胞および／または前記後期多能性幹細胞が前記胚の盤様構造に含まれており、前記単離が、前記盤様構造を取り囲む、栄養外胚葉細胞または前記栄養外胚葉細胞から分化した細胞を除去することをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記哺乳類家畜胚の培養の前に、前記胚の透明帯を除去することをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記哺乳類家畜胚培養が、前記培養期間中に、前記哺乳類家畜胚を新鮮なフィーダー細胞層上または新鮮な細胞外マトリックス上に再プレーティングすることをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記再プレーティングの前に、前記哺乳類家畜胚から周辺の線維芽細胞を除去することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記エピブラスト細胞および／または前記後期多能性幹細胞が、大きな核対細胞質比によって特徴づけられる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
哺乳類家畜多能性幹細胞の前記集団を少なくとも２代にわたり機械的に継代し、前記哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団を得ることをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
哺乳類家畜多能性幹細胞の前記集団を少なくとも約４～６代にわたり機械的に継代し、前記哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団を得ることをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団の前記継代を５～１０日毎に行う、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団の前記継代を、酵素的継代によって行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団の前記継代を、機械的継代によって行う、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記哺乳類家畜胚の前記培養を二次元培養システムで行う、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記哺乳類家畜胚の培養をフィーダー細胞上で行う、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記エピブラスト細胞および／または前記後期多能性幹細胞の前記培養を二次元培養システム上で行う、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記二次元培養システムがフィーダー細胞無しのマトリックスを含む、請求項１５または１７に記載の方法。
【請求項19】
前記フィーダー細胞無しのマトリックスが、マトリゲル（商標）マトリックス、フィブロネクチンマトリックス、ラミニンマトリックス、およびビトロネクチンマトリックスからなる群より選ばれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記エピブラスト細胞および／または前記後期多能性幹細胞の前記単離を、ステレオスコープ下で注射針を用いて実施する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記哺乳類家畜胚の前記培養を、限定された胎仔哺乳類家畜血清を含む培養培地で行う、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記培養培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫＯ－ＤＭＥＭおよびＤＭＥＭからなる群より選ばれる基本培地を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記哺乳類家畜胚の前記培養を、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地で行う、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記エピブラスト細胞および／または前記後期多能性幹細胞の前記培養を、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地で行う、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記培養培地が塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
前記培養培地が血清代替物をさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項27】
前記哺乳類家畜胚の前記培養を、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを含む培養培地で行う、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記エピブラスト細胞および／または前記後期多能性幹細胞の前記培養を、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを含む培養培地で行う、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記培養培地が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および白血病抑制因子（ＬＩＦ）をさらに含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項30】
前記培養培地が、血清代替物をさらに含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項31】
前記哺乳類家畜胚が、哺乳類家畜卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの受精によって得られる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記哺乳類家畜胚が、哺乳類家畜細胞の核移植（ＮＴ）によって得られる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記哺乳類家畜胚が、単性生殖によって得られる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
２７ｇの針または引き伸ばしたパスツールピペットを用いて前記哺乳類家畜胚を前記二次元培養システムに静置する、請求項１５に記載の方法。
【請求項35】
２７ｇの針または引き伸ばしたパスツールピペットを用いて前記哺乳類家畜胚を前記フィーダー細胞上に静置する、請求項１６に記載の方法。
【請求項36】
前記培養の前に、前記哺乳類家畜胚を一滴の細胞外マトリックスで覆う、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の細胞が、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の胚性生殖層に分化可能である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の細胞が、胚様体に分化可能である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の細胞が、培養培地で約１４～２１日間継代することで脂肪生成細胞系統に自発的に分化する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記培養培地が血清を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記培養培地がＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項42】
前記哺乳類家畜が反芻哺乳類家畜である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記哺乳類家畜が不反芻哺乳類家畜である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記反芻哺乳類家畜が、ウシ亜科、ヒツジ、ヤギ、シカおよびラクダからなる群より選ばれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項45】
前記ウシ亜科の前記反芻哺乳類家畜が畜牛またはヤクである、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記ウシ亜科の前記反芻哺乳類家畜が畜牛である、請求項４４に記載の方法。
【請求項47】
前記畜牛がバッファロー、バイソンまたは乳牛（ウシ）である、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項48】
前記畜牛が乳牛（ウシ）である、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項49】
前記不反芻哺乳類家畜が、ブタ、ウサギ、およびウマからなる群より選ばれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項50】
前記不反芻哺乳類家畜がウマである、請求項４３に記載の方法。
【請求項51】
請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法によって作製された単離哺乳類家畜多能性幹細胞であって、前記単離哺乳類家畜多能性幹細胞が外胚葉、中胚葉、および外胚葉の胚性生殖層に分化可能であり、且つデキサメタゾンを含まない培地で培養した際に脂肪生成細胞へ自発的に分化可能である、単離哺乳類家畜多能性幹細胞。
【請求項52】
請求項５１に記載の単離哺乳類家畜多能性幹細胞または請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法で得られた哺乳類家畜多能性幹細胞集団を、脂肪生成系統への化学またはホルモン誘導無しの培養培地で少なくとも１０日、６０日以下の期間、継代無しに培養し、脂肪細胞を作製する、脂肪細胞の作製方法。
【請求項53】
前記培養培地がデキサメタゾンを含まない、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記培養培地が血清を含む、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項55】
前記培養培地がＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項56】
請求項５２に記載の方法で作製した脂肪細胞を食品に導入し、食品を製造することを含む、食品の製造方法。
【請求項57】
請求項５２に記載の方法で作製した脂肪細胞を含む食品。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は、２０２０年７月２日出願の米国仮特許出願第６３／０４７，３７５号の優先権を主張するものであり、その全内容を、本参照をもって本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
本願は、２０２０年７月２日出願の米国仮特許出願第６３／０４７，３７５号の優先権を主張するものであり、その全内容を、本参照をもって本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0002】
配列表の記載
本願の出願と同時に提出された、２０２１年７月１日作成の４０，９６０バイトのＡＳＣＩＩファイル「８７１３４Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」を、本参照をもって本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
本願の出願と同時に提出された、２０２１年７月１日作成の４０，９６０バイトのＡＳＣＩＩファイル「８７１３４Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」を、本参照をもって本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【背景技術】
【0003】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、単離した哺乳類家畜多能性幹細胞およびその作製方法に関し、より具体的には、培養哺乳類家畜（例：ウシ）多能性幹細胞およびそこから分化した細胞に関するが、これらに限定されるものではない。
【0004】
胚発生は、受精の直後に卵割球の卵割、増殖および分化と共に開始する。発生途中の哺乳類胚の中の卵割球は、桑実胚収縮ステージまでは全能性である。収縮胚において、卵割球は極性化を開始し、その結果、２つの異なる細胞集団がもたらされる：胚体（ｅｍｂｒｙｏ ｐｒｏｐｅｒ）に寄与する内部細胞隗（ＩＣＭ）と、胚外体層に発生する外部栄養外胚葉層である。着床の達成直後にＩＣＭは、胚外内胚葉をもたらす原始内胚葉の層と、胚体およびいくつかの胚外胚誘導体をもたらす原始外胚葉の層とに分離する［Gardner 1982］。着床および原腸胚形成後に、細胞は徐々に特定の系統に限定されるため、その多能性は失われ、複能性前駆細胞とみなされる。従って、多能性胚性幹細胞はインタクトな胚において一定の期間しか増殖および複製しない点に着目すべきである。
【0005】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）株は、胚盤胞ステージの哺乳類胚から誘導した多能性株である。ヒトＥＳＣは単離および特徴づけられている［Thomson et al. 1998、Reubinoff et al. 2000］が、着床時と原腸胚形成工程との間の非培養ヒト着床後胚細胞の多能性について研究されたことはない。
【0006】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏのヒト胚を９日目まで培養する能力については既に報告されており、そこでは増殖性および健常なＩＣＭが示された［Edwards and Surani, 1978］が、これらの報告は、着床後の胚に未だ多能性幹細胞が存在するのか、これらの特徴付けを可能にするために単離して連続的に培養することが適切かといった、いくつかの重要な質問に対する回答を提供しなかった。
【0007】
国際公開第２００６／０４０７６３号は、ブラキュリ（ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）の発現および内胚葉、中胚葉、および外胚葉組織のそれぞれの誘導体へと分化する能力によって特徴づけられる、単離霊長類胚細胞を開示する。大きなシストが発生するまで、受精後９～１４日間にわたり、ヒト胚盤胞をＭＥＦ上で全胚として培養し、単離細胞を作製した。
【0008】
ウシ胚性幹細胞（ＥＳＣ）の導出については、成功率が低いことが報告されており（Mitalipova et al, 2001）、特徴づけられたウシＥＳＣの導出については、僅かな研究のみが報告している。
【0009】
近年、Bogliotti Y.S., et al., 2018（PNAS, 115: 2090-2095）が、ＦＧＦ２およびＷＮＴシグナル伝達阻害剤（ＩＷＲ１）を添加したＴｅＳＲ１－基本培地を用いた、ウシ胚盤胞由来の安定なプライム多能性胚性幹細胞の導出について記載しており、その導出率は４４～５８％であった。得られたウシＥＳＣは、ＳＯＸ２＋／ＯＣＴ４＋／ＣＤＸ２－／ＧＡＴＡ６－発現署名を示したが、ヒトＥＳＣおよびマウスＥｐｉＳＣに特徴的な、明確に判別されるコロニーの境界を示さなかった。
【0010】
しかし、エピブラストステージのＰＳＣまたは後期胚のＰＳＣをウシ等の哺乳類家畜から導出したという過去の報告はない。
【発明の概要】
【0011】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出する方法であって、
（ａ）受精から少なくとも７日後の哺乳類家畜胚を、受精から少なくとも４日であり、２１日以内の培養期間に渡りｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を含む胚を得、
（ｂ）胚からエピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を単離し、
（ｃ）エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を、未分化哺乳類家畜多能性幹細胞の増殖に適した条件下で培養して、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団を得、
哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出することを含む、方法が提供される。
（ａ）受精から少なくとも７日後の哺乳類家畜胚を、受精から少なくとも４日であり、２１日以内の培養期間に渡りｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を含む胚を得、
（ｂ）胚からエピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を単離し、
（ｃ）エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を、未分化哺乳類家畜多能性幹細胞の増殖に適した条件下で培養して、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団を得、
哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出することを含む、方法が提供される。
【0012】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、本発明のいくつかの実施形態の方法によって作製された単離哺乳類家畜多能性幹細胞であって、単離哺乳類家畜多能性幹細胞は外胚葉、中胚葉、および外胚葉の胚性生殖層に分化可能であり、且つデキサメタゾンを含まない培地で培養した際に脂肪生成細胞へ自発的に分化可能である、単離哺乳類家畜多能性幹細胞が提供される。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、本発明のいくつかの実施形態の単離哺乳類家畜多能性幹細胞、または本発明のいくつかの実施形態の方法で得られた哺乳類家畜多能性幹細胞集団を、脂肪生成系統への化学またはホルモン誘導無しの培養培地で少なくとも１０日であり、６０日以下の期間、継代無しに培養し、脂肪細胞を作製する、脂肪細胞の作製方法が提供される。
【0014】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、本発明のいくつかの実施形態の方法で作製した脂肪細胞を食品に導入して食品を製造することを含む、食品の製造方法が提供される。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、本発明のいくつかの実施形態の方法で作製した脂肪細胞を含む食品が提供される。
【0016】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞は、脂肪生成性分化誘導剤の不存在下で脂肪細胞へ自発的に分化可能である。
【0017】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞は、デキサメタゾンを含まない培地で培養したときに脂肪細胞へ自発的に分化可能である。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態によると、胚が直径約０．４ミリメートル（ｍｍ）から約１ｍｍによって特徴づけられるシストを発生したら、単離を実行する。
【0019】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞は胚の盤様構造に含まれており、単離は、盤様構造を取り囲む、栄養外胚葉細胞または栄養外胚葉細胞から分化した細胞を除去することをさらに含む。
【0020】
本発明のいくつかの実施形態によると、当該方法は、哺乳類家畜胚の培養の前に、当該胚の透明帯を除去することをさらに含む。
【0021】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚培養は、培養期間中に哺乳類家畜胚を新鮮なフィーダー細胞層上または新鮮な細胞外マトリックス上に再プレーティングすることをさらに含む。
【0022】
本発明のいくつかの実施形態によると、当該方法は、再プレーティングの前に、哺乳類家畜胚から周辺の線維芽細胞を除去することをさらに含む。
【0023】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞は、大きな核対細胞質比によって特徴づけられる。
【0024】
本発明のいくつかの実施形態によると、当該方法は、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団を少なくとも２代にわたり機械的に継代し、哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団を得ることをさらに含む。
【0025】
本発明のいくつかの実施形態によると、当該方法は、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団を少なくとも約４～６代にわたり機械的に継代し、哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団を得ることをさらに含む。
【0026】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団の継代を５～１０日毎に行う。
【0027】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団の継代を、酵素的継代によって行う。
【0028】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団の継代を、機械的継代によって行う。
【0029】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚の培養を二次元培養システムで行う。
【0030】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚の培養をフィーダー細胞上で行う。
【0031】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養を二次元培養システム上で行う。
【0032】
本発明のいくつかの実施形態によると、二次元培養システムはフィーダー細胞無しのマトリックスを含む。
【0033】
本発明のいくつかの実施形態によると、フィーダー細胞無しのマトリックスは、マトリゲル（商標）マトリックス、フィブロネクチンマトリックス、ラミニンマトリックス、およびビトロネクチンマトリックスからなる群より選ばれる。
【0034】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の単離を、ステレオスコープ下で注射針を用いて実施する。
【0035】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚の培養を、限定された胎仔哺乳類家畜血清を含む培養培地で行う。
【0036】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫＯ－ＤＭＥＭおよびＤＭＥＭからなる群より選ばれる基本培地を含む。
【0037】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚の培養を、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地で行う。
【0038】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養を、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地で行う。
【0039】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む。
【0040】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は血清代替物をさらに含む。
【0041】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚の培養を、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを含む培養培地で行う。
【0042】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養を、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを含む培養培地で行う。
【0043】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および白血病抑制因子（ＬＩＦ）をさらに含む。
【0044】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は、血清代替物をさらに含む。
【0045】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚は、哺乳類家畜卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの受精によって得られる。
【0046】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚は、哺乳類家畜細胞の核移植（ＮＴ）によって得られる。
【0047】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚は、単性生殖によって得られる。
【0048】
本発明のいくつかの実施形態によると、ウシ胚は、ウシ卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの受精によって得られる。
【0049】
本発明のいくつかの実施形態によると、ウシ胚は、ウシ細胞の核移植（ＮＴ）によって得られる。
【0050】
本発明のいくつかの実施形態によると、ウシ胚は、単性生殖によって得られる。
【0051】
本発明のいくつかの実施形態によると、２７ｇの針または引き伸ばしたパスツールピペットを用いて哺乳類家畜胚を二次元培養システムに静置する。
【0052】
本発明のいくつかの実施形態によると、２７ｇの針または引き伸ばしたパスツールピペットを用いて哺乳類家畜胚をフィーダー細胞上に静置する。
【0053】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養の前に、哺乳類家畜胚を一滴の細胞外マトリックスで覆う。
【0054】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の細胞は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の胚性生殖層に分化可能である。
【0055】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の細胞は、胚様体に分化可能である。
【0056】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の細胞は、培養培地で約１４～２１日間継代することで脂肪生成細胞系統に自発的に分化する。
【0057】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は血清を含む。
【0058】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地はＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む。
【0059】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地はデキサメタゾンを含まない。
【0060】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は血清を含む。
【0061】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地はＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む。
【0062】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜は反芻哺乳類家畜である。
【0063】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜は不反芻哺乳類家畜である。
【0064】
本発明のいくつかの実施形態によると、反芻哺乳類家畜は、ウシ亜科、ヒツジ、ヤギ、シカおよびラクダからなる群より選ばれる。
【0065】
本発明のいくつかの実施形態によると、ウシ亜科の反芻哺乳類家畜は畜牛またはヤクである。
【0066】
本発明のいくつかの実施形態によると、ウシ亜科の反芻哺乳類家畜は畜牛である。
【0067】
本発明のいくつかの実施形態によると、畜牛はバッファロー、バイソンまたは乳牛（ウシ）である。
【0068】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜は乳牛（ウシ）である。
【0069】
本発明のいくつかの実施形態によると、畜牛は乳牛（ウシ）である。
【0070】
本発明のいくつかの実施形態によると、不反芻哺乳類家畜は、ブタ、ウサギ、およびウマからなる群より選ばれる。
【0071】
本発明のいくつかの実施形態によると、不反芻哺乳類家畜はウマである。
【0072】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する当業界における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と類似するもの、または等価であるものを、本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含み、本特許明細書に従うものとする。さらに、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、必ずしも限定を意図するものではない。
【0073】
本発明の一部の実施形態を、添付の図面を参照しながら、ほんの一例としてここで説明する。ここで、特に図面を詳細に参照するが、ここで示す詳細は例示に過ぎず、本発明の実施形態の具体的な考察を目的としたものであることを強調する。これに関して、図面と共に行われる説明は、本発明の実施形態をどのように実行することができるかを当業者に明らかにするものである。
【図面の簡単な説明】
【0074】
【図1】図１のＡ～Ｃは、遅延胚盤胞からのウシ多能性幹細胞株（ｂＰＳＣ株）の導出を示す画像である。図１のＡ：媒精後８日の、顕著な内部細胞塊（ＩＣＭ）を有するウシ芽細胞。図１のＢ：媒精後１１日の、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）と共にプレーティングした全胚。顕著なシストが発生した。図１のＣ：媒精後１４日の同じ胚。シストがさらに増殖し、二次シストが発生した。サイズバー：図１のＡは１ｍｍ（ミリメートル）、図１のＢは１ｍｍ、図１のＣは１ｍｍ。
【図2-1】図２のＡ～Ｄは、異なる培養条件で培養したｂＰＳＣコロニーの形態を示す画像である。図２のＡ：血清を含む培養培地（「培地Ｘ」）の存在下、ＭＥＦ上で培養したｂＰＳＣコロニー。図２のＢ：無血清培養培地（ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ）の存在下、マトリゲル（商標）マトリックス上で培養したｂＰＳＣコロニー。図２のＣ：血清代替物（ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ）を添加した培養培地の存在下、ＭＥＦ上で培養したｂＰＳＣコロニー。図２のＤ：図２のＡの画像の拡大画像。図２のＡ（そしてより明確には、拡大された図２のＤ）および図２のＣにおいて、コロニー内の細胞の間に隙間が認められ、細胞は多能性幹細胞（ＰＳＣ）の典型的な特徴である大きな核対細胞質比を有する。サイズバー：図２のＡは１ｍｍ、図２のＢは１ｍｍ、図２のＣは１ｍｍ、図２のＤは１ｍｍ。
【図2-2】同上
【図3】図３のＡ～Ｂは、鍵となる多能性マーカーであるＯＣＴ４の免疫蛍光染色を示す画像である。図３のＡ：図３のＢと同じ視野のＤＡＰＩ染色。図３のＢ：Ｏｃｔ４の陽性染色（赤色）。サイズバー：図３のＡは１００μｍ（マイクロメートル）、図３のＢは１００μｍ。
【図4】図４のＡ～Ｃは、１０～２０％ｖ／ｖのＦＢＳが富化されたＤＭＥＭ等の培養培地の存在下で培養した際に自発的に分化した、３継代目のｂＰＳＣの形態を示す画像である。図４のＡおよび図４のＢは、分化している細胞からなるｂＰＳＣコロニーの例を示す。図４のＣ：血清を含む培養培地（「培地Ｘ」）で培養したｂＰＳＣによって形成されたシスト性ＥＢ。サイズバー：図４のＡは１００μｍ、図４のＢは５０μｍ、図４のＣは１００μｍ。
【図5】図５のＡ～Ｄは、培養中のｂＰＳＣの自発的分化に続く、鍵となる分化マーカーの免疫蛍光染色を示す画像であり、３つの胚性生殖層の代表的な細胞を表す。図５のＡ： アルファ－フェトプロテイン（内胚葉生殖層を示す）の陽性染色、図５のＢ：図５のＡの同じ染色をＤＡＰＩ（核）染色と重ね合わせたもの。図５のＣ～Ｄ：図５のＤは、ＥＭＯＳ（赤色、中胚葉生殖層を示す）および３－ベータ－チューブリン（緑色、外胚葉生殖層を示す）の、ＤＡＰＩ（青色、核染色）との共染色を表す。図５のＣは、図５のＤに示したものと同じ顕微鏡視野のＤＡＰＩ核染色のみを表す。サイズバー：図５のＡは１００μｍ、図５のＢは１００μｍ、図５のＣは５０μｍ、図５のＤは５０μｍ。
【図6】図６のＡ～Ｂは、ウシ多能性細胞の脂肪細胞への自発的分化を示す画像である。ウシＰＳＣを血清添加培地（培地Ｘ）、継代なしで少なくとも１４日間培養したところ、脂質液滴を示す脂肪細胞へと自発的に分化した。図６のＡ～Ｂの細胞内の脂質液滴（白い矢印）はオイルレッド染色によって陽性に染色された。サイズバー：図６のＡは２０μｍ、図６のＢは５０μｍ。
【図7】図７のＡ～Ｂは、遅延ウシ胚盤胞からのウシ多能性幹細胞（ｂＰＳＣ）株ＢＶＮ６の導出を示す画像である。図７のＡ：ウシ芽細胞、媒精後８日、図７のＢ：ＭＥＦとプレーティングした全胚、媒精後１６日。顕著なシストが発生した（図７のＢの白い矢印）。ウシ遅延胚盤胞細胞株の導出に使用した培養培地は培地Ｘである。スケールバー：図７のＡは５０μｍ、図７のＢは２００μｍ。
【図8】図８のＡ～Ｄは、遅延胚盤胞からのウマＰＳＣ株の導出を示す画像である。図８のＡ：顕著な内部細胞塊（ＩＣＭ、白い矢印）を有するウマ伸長胚盤胞、媒精後８日。図８のＢ：マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）と共にプレーティングした全ウマ胚、媒精後１６日。顕著なシストが発生した（矢印）。顕微鏡の焦点はシストにある。図８のＣ：図８のＢと同じ視野であるが、顕微鏡の焦点は細胞にある。図８のＤ：培地Ｘで培養した、２継代目の導出した細胞コロニー。スケールバー：図８のＡは２００μｍ、図８のＢは１００μｍ、図８のＣは－１００μｍ、そして図８のＤは５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【0075】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、単離した哺乳類家畜多能性幹細胞およびその作製方法に関し、より具体的には、培養哺乳類家畜（例：ウシ、ウマ）多能性幹細胞およびそこから分化した細胞に関するが、これらに限定されるものではない。
【0076】
本発明の少なくとも１種の実施形態を詳細に説明する前に、本発明はその適用において、以下の説明で示すまたは実施例で例示する詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態を可能とするか、または様々な方法で実施もしくは実行することができる。
【0077】
ウシ胚性幹細胞の導出は、成功率が低いと報告されており（Mitalipova et al, 2001）、特徴的なウシＥＳＣの導出については、僅かな研究のみが報告している。
【0078】
近年、Bogliotti Y.S., et al., 2018（PNAS, 115: 2090-2095）が、ＦＧＦ２およびＷＮＴシグナル伝達阻害剤（ＩＷＲ１）を添加したＴｅＳＲ１－基本培地を用いた、ウシ胚盤胞由来の安定なプライム多能性胚性幹細胞の導出について記載しており、その導出率は４４～５８％であった。得られたウシＥＳＣは、ＳＯＸ２＋／ＯＣＴ４＋／ＣＤＸ２－／ＧＡＴＡ６－発現署名を示したが、ヒトＥＳＣおよびマウスＥｐｉＳＣ（エピブラスト幹細胞）に特徴的な、明確に判別されるコロニーの境界を示さなかった。
【0079】
しかし、エピブラストステージのＰＳＣまたは後期胚のＰＳＣをウシまたはウマ等の哺乳類家畜から導出したという過去の報告はない。
【0080】
本発明者らは、驚くべきことに、胚盤胞ステージ（受精後７日）を超えて少なくとも４日且つ受精後２１日以内の期間に渡りｅｘ－ｖｉｖｏで培養した哺乳類家畜胚（ウシまたはウマの胚）から哺乳類家畜多能性幹細胞（ｂＰＳＣ）が単離できることを見出した。後述する実施例の項の実施例１は、受精（ｉｎ－ｖｉｖｏ）から７日以内と考えられる、媒精後７日の種々のウシ胚からの数種のウシ多能性幹細胞株の導出を示す。通常、受精は、雌の哺乳類家畜（例：乳牛またはウマ）の媒精後０～２４時間以内にｉｎ－ｖｉｖｏ（子宮内）で起こる。媒精後７日齢の胚は初期胚盤胞または胚盤胞ステージである。乳牛の子宮から胚を洗浄により除去し、次に６～１３日間ｅｘ－ｖｉｖｏで培養した（よって、媒精後１３～２０日齢の胚となった）。媒精後１３～２０日齢の胚を顕微鏡で観察し、エピブラストおよび後期多能性幹細胞を含む盤様構造の形成について評価した。各胚から盤様構造を除去し、盤様構造に含まれていた単離細胞を４～１０日毎に連続的に継代しながらｉｎ－ｖｉｔｒｏで培養し、ウシ多能性幹細胞集団を得た。ウシ多能性幹細胞株を「ＢＶＮ１」、「ＢＶＮ２」、「ＢＶＮ５」、および「ＢＶＮ６」と命名した。ＢＶＮ１の胚は媒精後７日間ｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、ＢＶＮ２の胚は媒精後１２日間ｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、ＢＶＮ５の胚は媒精後１３日間ｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、ＢＶＮ６の胚は媒精後１１日間ｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、その後、盤様構造（エピブラストおよび後期多能性幹細胞を含む）を除去し、エピブラストおよび後期多能性幹細胞を４～１０日毎に連続的に継代しながらｉｎ－ｖｉｔｒｏで培養したことに留意されたい。
【0081】
後述する実施例の項は、ウシＰＳＣが、フィーダー細胞層（図２のＡ、図２のＣおよび図２のＤ）またはマトリックス（例：マトリゲル（商標）、図２のＢ）上で培養され、ＯＣＴ４（図３のＡ～Ｂ）、ＴＲＡ１－６０およびＴＲＡ１－８１（図１０のＡ～Ｄ）によって実証されたように、多能性を維持していたことを示す。
【0082】
後述する実施例の項の実施例２は、ｅｘ－ｖｉｖｏで８日間培養した媒精後８日のウマ（雌）胚（よって、媒精後１６日齢の胚）からのウマ多能性幹細胞株の導出を示し、その後、エピブラストおよび後期多能性幹細胞を含む盤様構造を胚から除去し、単離細胞を５～１０日毎に連続的に継代しながらｉｎ－ｖｉｔｒｏで培養し、ウマ多能性幹細胞集団を得た。ウマ多能性幹細胞株を「ＨＲＳ１」と命名した。
【0083】
後述する実施例の項は、フィーダー細胞層またはその支持マトリックスから除去する際、および血清含有培地（例：「培地Ｘ」）の存在下では、ｂＰＳＣ（ウシ多能性幹細胞）は胚様体に自発的に分化し（図４のＡ～Ｃ）、それは３種の胚性生殖層、即ち、中胚葉，外胚葉および内胚葉の全てに分化した細胞を含んでいる（図５のＡ～Ｄ）ことをさらに示す。
【0084】
加えて、２次元培養システム上、脂肪生成性分化剤（デキサメタゾン等）を含まない培地でｂＰＳＣを継代無しで１４～２１日間放置すると、細胞は、オイルレッド染色で陽性に染色される脂肪細胞に自発的に分化した（図６のＡ～Ｂ）。
【0085】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出する方法であって、
（ａ）受精から少なくとも７日後の哺乳類家畜胚を、受精から少なくとも４日であり、２１日以内の培養期間に渡りｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を含む胚を得、
（ｂ）胚からエピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を単離し、
（ｃ）エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を、未分化哺乳類家畜多能性幹細胞の増殖に適した条件下で培養して、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団を得、
哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出することを含む、方法が提供される。
（ａ）受精から少なくとも７日後の哺乳類家畜胚を、受精から少なくとも４日であり、２１日以内の培養期間に渡りｅｘ－ｖｉｖｏで培養し、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を含む胚を得、
（ｂ）胚からエピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を単離し、
（ｃ）エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を、未分化哺乳類家畜多能性幹細胞の増殖に適した条件下で培養して、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団を得、
哺乳類家畜多能性幹細胞株を導出することを含む、方法が提供される。
【0086】
本願で使用する語句「幹細胞」とは、特定の、特徴的な機能を有する他の種類の細胞（例：完全に分化した細胞）に誘導されるまで、培養中に長期にわたり未分化の状態（例：全能性、多能性または複能性の幹細胞）を維持する細胞を意味する。
【0087】
語句「多能性幹細胞」とは、３種の胚性生殖層（すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉）の全ての細胞に分化することができる、あるいは未分化状態を維持することのできる細胞を指す。
【0088】
「哺乳類家畜多能性幹細胞株」に対して本願で使用する語句「導出する」とは、単一の哺乳類家畜胚（例：ｅｘ－ｖｉｖｏ培養したウシ胚）から単離した少なくとも１種の幹細胞（例：エピブラスト細胞または後期多能性幹細胞）から哺乳類家畜多能性幹細胞集団を作製することを意味する。
【0089】
本発明のいくつかの実施形態の方法によると、受精後少なくとも７日の哺乳類家畜胚をｅｘ－ｖｉｖｏで培養する。受精後７日の哺乳類家畜胚は胚盤胞ステージであり、内部細胞塊（ＩＣＭ）、栄養芽層およびシストの存在によって特徴づけられることに留意されたい。
【0090】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚は、胚が子宮に着床する前に得られる。
【0091】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚は、哺乳類家畜卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの受精によって得られる。
【0092】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚は、哺乳類家畜細胞の核移植（ＮＴ）によって得られる。核移植の方法は当業界で知られており、例えば、Steven L. Stice., et al., 1996（“Pluripotent Bovine Embryonic Cell Lines Direct Embryonic Development Following Nuclear Transfer”; BIOLOGY OF REPRODUCTION 54, 100-110）に記載されており、その内容の全体を本参照によって援用するものとする。当該方法には、例えば、卵母細胞への核移植、またはレシピエント細胞が有糸分裂で止まった時の接合子への核移植が含まれる。
【0093】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚は、単性生殖によって得られ、単性生殖は、例えば、Kitai Kim et al., 2007（“Histocompatible Embryonic Stem Cells by Parthenogenesis”; SCIENCE, VOL 315; pages: 482-486）に記載されている、未授精卵子（単為生殖生物）の刺激で行い、その内容の全体を本参照によって援用するものとする。
【0094】
本発明のいくつかの実施形態によると、２７ｇの針または引き伸ばしたパスツールピペットを用いて、哺乳類家畜胚を二次元培養システムまたはフィーダー細胞上に静置する。
【0095】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養の前に、哺乳類家畜胚を一滴の細胞外マトリックスで覆う。
【0096】
細胞外マトリックスは、基底膜由来の成分および／または接着分子の受容体－リガンドカップリングの一部を形成する細胞外マトリックス成分から構成され得る。マトリゲル（登録商標）（米国、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、本発明における使用が適切な市販のマトリックスの一例である。マトリゲル（登録商標）は、基底膜を再構成するために室温でゲル化するＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性調製物であり、マトリゲル（登録商標）は減増殖因子調製物としても提供されている。本発明における使用に適切な他の細胞外マトリックス成分および成分混合物としては、包皮マトリックス、ラミニンマトリックス、フィブロネクチンマトリックス、プロテオグリカンマトリックス、エンタクチンマトリックス、ヘパラン硫酸マトリックス、コラーゲンマトリックス等の、それぞれ単独またはそれらの種々の組み合わせが挙げられる。
【0097】
本発明のいくつかの実施形態によると、マトリックスはゼノフリーである。
【0098】
用語「ゼノ」は、ギリシャ語「Ｘｅｎｏｓ」、すなわち、他者、に基づく接頭辞である。本明細書で使用する語句「ゼノフリー」とは、異る（ｘｅｎｏｓ）（すなわち、同種ではなく、外来の）種に由来するいかなる成分／夾雑物も含まないことを指す。これら成分は、異る種と関連する（例：感染した）病原体等の夾雑物、異種の種の細胞成分、または異種の種の非細胞成分（例：体液）であり得る。
【0099】
完全にゼノフリーな培養条件が望まれる場合、マトリックスは、好ましくは胚と同じ原料、例えば、哺乳類家畜（例：ウシ）に由来するものである、あるいは組換え技術で合成したものである。このようなマトリックスとしては、例えば、組換えフィブロネクチン、組換えラミニン、合成フィブロネクチンマトリックス、ビトロネクチンマトリックス、および／またはコラーゲンマトリックスが挙げられる。合成フィブロネクチンマトリックスは、米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａより入手可能である。
【0100】
本発明のいくつかの実施形態によると、方法は、哺乳類家畜胚をｅｘ－ｖｉｖｏで培養する前に、哺乳類家畜胚の透明帯を除去することをさらに含む。
【0101】
透明帯を除去する方法としては、化学消化（例：タイロードの酸性溶液による）、酵素消化（例：トリプシン様酵素またはコラゲナーゼを使用）、または、例えば、マイクロピペットまたはマイクロマニピュレーター（例：レーザーを使用）を用いる機械的方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0102】
本発明のいくつかの実施形態によると、透明帯はタイロードの酸性溶液による化学消化で除去する。
【0103】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養は、二次元培養システムで行う。
【0104】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養は、フィーダー細胞上で行う。
【0105】
二次元培養システム上またはフィーダー細胞層上に一度置くと、哺乳類家畜胚は二次元培養システムまたはフィーダー細胞層の表面に自発的に付着し、ｅｘ－ｖｉｖｏで増殖し続け、発生する。
【0106】
本発明のいくつかの実施形態の方法によると、哺乳類家畜胚は、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を含む胚が得られるように、哺乳類家畜子宮の外で、そのさらなる発生が可能な条件下において、ｅｘ－ｖｉｖｏで培養される。
【0107】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜子宮の外で、そのさらなる発生が可能な条件としては、培養システム（例：フィーダー細胞層またはマトリックス）、および哺乳類家畜胚の内部に含まれるエピブラスト細胞および後期多能性幹細胞の未分化増殖を可能にする適切な培養培地が挙げられる。
【0108】
上述したように、本発明のいくつかの実施形態における方法は、哺乳類家畜胚を培養培地中で少なくとも４日間ｅｘ－ｖｉｖｏ培養することを含む。
【0109】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養に使用する培養培地は、基本培地と血清を含む。
【0110】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養を、限定された胎仔ウシ血清を含む培養培地で行う。
【0111】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫＯ－ＤＭＥＭおよびＤＭＥＭからなる群より選ばれる基本培地を含む。
【0112】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養に使用する培養培地は無血清である。
【0113】
本明細書で使用する語句「無血清」とは、ヒトまたは動物の血清を含まないことを指す。
【0114】
培養プロトコルにおける血清の機能は、培養細胞に、ｉｎ ｖｉｖｏで存在するのと類似した環境（すなわち、細胞が由来する生物の中の環境、例えば、胚の胚盤胞）を提供することであることに留意されたい。しかしながら、動物由来の血清（例えば、哺乳類家畜（例： ウシ）の血清）またはヒト由来の血清（ヒト血清）の使用は、個体間の血清成分の顕著なばらつき、および（他の種の血清を使用した場合の）異種夾雑物の混入といったリスクによって制限される。
【0115】
本発明のいくつかの実施形態によると、無血清培養培地は、血清またはその一部を含まない。
【0116】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養を、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地で行う。
【0117】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養のための培養培地は、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを約１００ｐｇ／ｍ～約３００ｐｇ／ｍｌ（例：約１００ｐｇ／ｍｌ）の濃度で含む。
【0118】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養のための培養培地はＩＬ６ＲＩＬ６キメラを約１００ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ（例：約１００ｎｇ／ｍｌ）の濃度で含む。
【0119】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む。
【0120】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養のためのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地は、ｂＦＧＦを約２０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ（例：約５０ｎｇ／ｍｌ、例：約１００ｎｇ／ｍｌ）の濃度でさらに含む。
【0121】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地は、血清代替物をさらに含む。
【0122】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および血清代替物をさらに含む。
【0123】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養を、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを含む培養培地で行う。
【0124】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養のための培養培地は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドを約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ（例：約１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度で含む。
【0125】
本発明のいくつかの実施形態によると、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを含む培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む。
【0126】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養のためのＷＮＴ３Ａポリペプチドを含む培養培地は、ｂＦＧＦを約２０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ（例：約５０ｎｇ／ｍｌ）の濃度で含む。
【0127】
本発明のいくつかの実施形態によると、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを含む培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）をさらに含む。
【0128】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養のためのＷＮＴ３Ａポリペプチドを含む培養培地は、ＬＩＦを約１０００Ｕ／ｍｌ（ミリリットル当たりの単位）～約３０００Ｕ／ｍｌ（例：約３０００Ｕ／ｍｌ）の濃度で含む。
【0129】
本発明のいくつかの実施形態によると、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを含む培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および白血病抑制因子（ＬＩＦ）をさらに含む。
【0130】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養のための培養培地は、５～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内のＷｎｔ３ａポリペプチド、２０～１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内のｂＦＧＦおよび１０００～３０００Ｕ／ｍｌの濃度範囲内のＬＩＦを含む。
【0131】
本願で使用する語句「培養培地」とは、細胞の増殖を支持する液状物質を意味する。いくつかの実施形態において本発明で使用される培養培地は、塩類、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質（例えば、サイトカイン、増殖因子およびホルモン）等の物質の組合せを含む水性培地であってもよく、これら物質は全て細胞増殖および／または分化に必要なものである。
【0132】
例えば、本発明のいくつかの実施形態の一態様における培養培地は、ダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、例えば、米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（例えば、イスラエル国、ベイエメック、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから入手可能）、ＭＥＭアルファ（例えば、イスラエル国、ベイエメック、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから入手可能）、ＨａｍのＦ－１２（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）、Ｋｏ－ＤＭＥＭ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能）、またはイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、例えば、米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能）等の基本培地に、詳細に後述する必須添加物を添加した合成組織培養培地であり得る。基本培地の濃度は、後述するように、血清代替物等の他の培地原料の濃度に依存する。
【0133】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は限定培養培地である。
【0134】
「限定」培養培地とは、特定濃度の公知の成分から製造された、化学的に限定された培養培地である。例えば、限定培養培地は、非条件培養培地である。
【0135】
条件培地は、ある特定の培養期間後に存在する単層細胞培養物（すなわち、フィーダー細胞）の増殖培地である。条件培地は、培養物中の単層細胞によって分泌される増殖因子およびサイトカインを含む。
【0136】
条件培地は、培養物中で単層を形成する様々な細胞から回収することができる。例としては、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）条件培地、包皮条件培地、ヒト胚性線維芽細胞条件培地、ヒトファローピウス管上皮細胞条件培地などが挙げられる。
【0137】
一定期間の培養の経過後、フィーダー細胞またはマトリックスは、ｅｘ－ｖｉｖｏの哺乳類家畜胚の増殖および発生を支持するために同じ種類の新鮮なフィーダー細胞層または新鮮マトリックスと置換する必要がある点を留意されたい。
【0138】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜（例：ウシ）胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養は、培養期間中に、哺乳類家畜胚を新鮮なフィーダー細胞層上または新鮮な細胞外マトリックス上に再プレーティングすることをさらに含む。
【0139】
本発明のいくつかの実施形態によると、当該方法は、新鮮なフィーダー細胞層上または新鮮な細胞外マトリックス上への再プレーティングの前に、哺乳類家畜胚から周辺の線維芽細胞を除去することをさらに含む。
【0140】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養期間は、少なくとも４日の培養であり、例えば、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日であって、胚が受精後２１日に達しない期間である。
【0141】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜胚のｅｘ－ｖｉｖｏ培養期間は、少なくとも４日の培養であり、例えば、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日であって、胚が受精後２１日に達しない期間、受精後２０日に達しない期間、受精後１９日に達しない期間、受精後１８日に達しない期間、受精後１７日に達しない期間である。
【0142】
本発明者らは、ｅｘ－ｖｉｖｏで培養した哺乳類家畜胚が（例：図１のＢ～Ｃに示すような）特定の大きさのシストを発生すると、多能性幹細胞株の導出のために胚に含まれるエピブラスト細胞または後期多能性幹細胞を単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養できることを見出した。
【0143】
本発明のいくつかの実施形態によると、ｅｘ－ｖｉｖｏ培養哺乳類家畜胚のシストが直径約０．４ｍｍから約１ｍｍによって特徴づけられたら、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を単離し、ｉｎ－ｖｉｔｒｏで培養することができる。
【0144】
本発明のいくつかの実施形態によると、胚が直径約０．６～１ｍｍのシストを発生したら、単離を実行する。
【0145】
本願で使用する語句「エピブラスト細胞」とは、胚性エピブラストの細胞を意味する。これら細胞は多能性であり、よって全３種の胚性生殖層に分化可能である。
【0146】
本願で使用する語句「後期多能性幹細胞」とは、原腸胚形成までの後期エピブラストステージから導出した細胞を意味する。これら細胞は多能性であり、よって全３種の胚性生殖層に分化可能である。
【0147】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞は、大きな核対細胞質比によって特徴づけられる。
【0148】
本発明のいくつかの実施形態によると、ｅｘ－ｖｉｖｏ培養した哺乳類家畜胚の中では、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞は胚の盤様構造に含まれている。
【0149】
エピブラスト細胞または後期多能性幹細胞の単離は、ｅｘ－ｖｉｖｏ培養した胚から盤様構造を除去し、盤様構造に含まれる細胞をマトリックスまたはフィーダー細胞層で被覆した新鮮な培養皿に移すことで実施することができる。
【0150】
Ｅｘ－ｖｉｖｏ培養した哺乳類家畜胚からのエピブラスト細胞または後期多能性幹細胞の単離は、種々の技術、好ましくは顕微鏡またはステレオスコープの使用によって実施することができる。
【0151】
例えば、エピブラスト細胞または後期多能性幹細胞は、ステレオスコープ下で注射針で捕捉することができる。
【0152】
本発明のいくつかの実施形態によると、盤様構造の細胞を培養皿（または培養容器）で培養する前に、盤様構造を取り囲む栄養外胚葉細胞、または栄養外胚葉細胞から分化した細胞を除去することをさらに含む。
【0153】
次にエピブラスト細胞または後期多能性幹細胞は、細胞を多能性で未分化の状態に維持する適切な培養培地の存在下、二次元培養システム内のフィーダー細胞層またはマトリックス上で培養することができる。
【0154】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養を二次元培養システム上で行う。
【0155】
本発明のいくつかの実施形態によると、二次元培養システムはフィーダー細胞無しのマトリックスを含む。
【0156】
上述したように、哺乳類家畜胚から一旦エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞を単離したら、これら単離細胞は、培養培地の存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏでさらに培養される。
【0157】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養を、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地で行う。
【0158】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期哺乳類家畜多能性幹細胞を培養するための培養培地は、５０～３００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約１００ｐｇ／ｍｌの濃度）のＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む。
【0159】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期哺乳類家畜多能性幹細胞を培養するための培養培地は、５０～３００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約１００ｎｇ／ｍｌの濃度）のＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む。
【0160】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養は、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および血清代替物を含む培養培地で行う。
【0161】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期哺乳類家畜多能性幹細胞を培養するための培養培地は、５０～３００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約１００ｐｇ／ｍｌの濃度）のＩＬ６ＲＩＬ６キメラ、２０～１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約５０ｎｇ／ｍｌの濃度）のｂＦＧＦ、および１０－２０％ｖ／ｖの濃度範囲（例：約１５％ｖ／ｖ）の血清代替物を含む。
【0162】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期哺乳類家畜多能性幹細胞を培養するための培養培地は、５０～３００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約１００ｎｇ／ｍｌの濃度）のＩＬ６ＲＩＬ６キメラ、２０～１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約５０ｎｇ／ｍｌの濃度）のｂＦＧＦ、および１０～２０％ｖ／ｖの濃度範囲（例：約１５％ｖ／ｖ）の血清代替物を含む。
【0163】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養は、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを含む培養培地で行う。
【0164】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期哺乳類家畜多能性幹細胞を培養するための培養培地は、５～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約１０ｎｇ／ｍｌの濃度）のＷｎｔ３ａポリペプチドを含む。
【0165】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養は、Ｗｎｔ３ａポリペプチドおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地で行う。
【0166】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期哺乳類家畜多能性幹細胞を培養するための培養培地は、５～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約１０ｎｇ／ｍｌの濃度）のＷｎｔ３ａポリペプチドおよび２０～１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約５０ｎｇ／ｍｌの濃度）のｂＦＧＦを含む。
【0167】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養は、Ｗｎｔ３ａポリペプチドおよび白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培養培地で行う。
【0168】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期哺乳類家畜多能性幹細胞を培養するための培養培地は、５～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約１０ｎｇ／ｍｌの濃度）のＷｎｔ３ａポリペプチドおよび１０００～３０００ｕ／ｍｌの濃度範囲内（例：約３０００ｕ／ｍｌの濃度）のＬＩＦを含む。本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養は、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培養培地で行う。
【0169】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期哺乳類家畜多能性幹細胞を培養するための培養培地は、５～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約１０ｎｇ／ｍｌの濃度）のＷｎｔ３ａポリペプチド、２０～１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内（例：約５０ｎｇ／ｍｌの濃度）のｂＦＧＦ、および１０００～３０００ｕ／ｍｌの濃度範囲内（例：約３０００ｕ／ｍｌの濃度）のＬＩＦを含む。
【0170】
本発明のいくつかの実施形態によると、エピブラスト細胞および／または後期多能性幹細胞の培養に使用する培地は、血清代替物をさらに含む。
【0171】
本明細書で使用する語句「血清代替物」とは、多能性幹細胞に、その増殖および生存にとって必要な成分を提供することによって血清機能の代用となる、規定の製剤を指す。
【0172】
様々な血清代替物製剤が当業界で公知であり、商業的に入手可能である。
【0173】
例えば、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、カタログ番号１０８２８０２８）は、培養物中の未分化ＥＳ細胞を増殖させ、維持するために最適化された、規定の無血清製剤である。ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔの製剤は、動物由来であるＡｌｂｕｍａｘ（脂質に富むウシ血清アルブミン）を含むことに留意すべきである（Price, P.J. et alの国際公開第９８／３０６７９号）。しかしながら、Crook et al., 2007による最近の刊行物（Crook JM., et al., 2007, Cell Stem Cell, 1: 490-494）は、ＦＤＡ認可済みの臨床等級の包皮線維芽細胞を使用して、ｃＧＭＰに従って製造されたＫｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、カタログ番号０４－００９５）中で作製した６種の臨床等級のｈＥＳＣ系を記載している。
【0174】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）血清代替物の濃度は約１％［容積／容積（ｖ／ｖ）］～約５０％（ｖ／ｖ）の範囲内、例えば、約５％（ｖ／ｖ）～約４０％（ｖ／ｖ）、例えば、約５％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）～約２５％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１５％（ｖ／ｖ）、例えば、約２０％（ｖ／ｖ）、例えば、約３０％（ｖ／ｖ）である。
【0175】
別の商業的に入手可能な血清代替物は、ビタミンＡを含まないＢ２７補給物質であり、これは米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、カタログ番号１２５８７－０１０から入手可能である。Ｂ２７補給物質は、ｄ－ビオチン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の脂肪酸不含画分Ｖ、カタラーゼ、Ｌ－カルニチンＨＣｌ、コルチコステロン、エタノールアミンＨＣｌ、Ｄ－ガラクトース（無水物）、グルタチオン（還元型）、組換えヒトインスリン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン－２－ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ－３／アルブミン複合体、ＤＬアルファ－トコフェロールおよびＤＬアルファトコフェロールアセテートを含む無血清製剤である。
【0176】
本発明のいくつかの実施形態によると、血清代替物はゼノフリーである。
【0177】
例えば、ゼノフリー血清代替物は、インスリン、トランスフェリンおよびセレンの組合せを含んでもよい。
【0178】
商業的に入手可能なゼノフリー血清代替物組成物の非限定的な例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＩＴＳ（インスリン、トランスフェリンおよびセレン）プレミックス（ＩＴＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号５１５００－０５６）が挙げられる。
【0179】
本発明のいくつかの実施形態によると、ＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＳＲ３（Ｓｉｇｍａ）ゼノフリー血清代替物製剤は、１×の作用濃度を達成するために１対１００の比率で希釈する。
【0180】
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜多能性幹細胞を未分化状態で培養するための適切な培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＫＯ－ＤＭＥＭ等の基本培地（例：約８０％ｖ／ｖ）に血清（例：限定胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、例：約２０％ｖ／ｖ）を添加したものである。本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、および１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸ストックをさらに含む。この培養培地は、５～１０日毎に継代しながら、ＭＥＦ等のフィーダー細胞上で培養されたウシＰＳＣの未分化の増殖を支持することができる点に留意されたい。しかし、ウシＰＳＣが高密度（例：少なくとも１４日間継代無し）でＭＥＦまたはフィーダー無しの培養システムで培養されると、ウシＰＳＣの少なくとも２５％が脂肪生成細胞系統に自発的に分化する。例えば、ウシＰＳＣが高密度（例：少なくとも２１日間継代無し）でＭＥＦまたはフィーダー無しの培養システムで培養されると、ウシＰＳＣの少なくとも５０％が脂肪生成細胞系統に自発的に分化する。
【0181】
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜多能性幹細胞を未分化状態で培養するための適切な培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＫＯ－ＤＭＥＭ等の基本培地（例：約８５％ｖ／ｖ）にｋｏ－血清代替物（約１５％ｖ／ｖ）、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ（５０～１５０ｐｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば、約１００ｐｇ／ｍｌの濃度）、ｂＦＧＦ（４０～６０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度）を添加したものである。本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、および１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸ストックをさらに含む。
【0182】
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜多能性幹細胞を未分化状態で培養するための適切な培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＫＯ－ＤＭＥＭ等の基本培地（例：約８５％ｖ／ｖ）にｋｏ－血清代替物（約１５％ｖ／ｖ）、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ（５０～１５０ｐｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば、約１００ｐｇ／ｍｌの濃度）、ｂＦＧＦ（４０～６０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度）を添加したものである。本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、および１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸ストックをさらに含む。
【0183】
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜多能性幹細胞を未分化状態で培養するための適切な培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＫＯ－ＤＭＥＭ等の基本培地（例：約８５％ｖ／ｖ）にｋｏ－血清代替物（約１５％ｖ／ｖの濃度）、ＷＮＴ３Ａ（５～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度）、ｂＦＧＦ（２０～１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度）、および白血病抑制因子（ＬＩＦ）（１０００～３０００Ｕ／ｍｌの濃度範囲、例えば、約３０００Ｕ／ｍｌの濃度）を添加したものである。本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地は、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、および１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸ストックをさらに含む。
【0184】
培養中は、哺乳類家畜多能性幹細胞集団を得るために、エピブラスト細胞または後期多能性幹細胞を継代することができる。
【0185】
本願で使用する「継代」または「継代する」という用語は、培養容器内の細胞を２またはそれ以上の培養容器に分けることを意味し、典型的には新鮮培養培地の添加も含む。継代は、典型的には、培養物が一定の密度に達したときに行う。
【0186】
本発明のいくつかの実施形態によると、継代は機械的継代で行う。
【0187】
本明細書で使用する語句「機械的解離」とは、酵素活性ではなく、物理的な力を用いることにより、多能性幹細胞塊を単一細胞に分離することを指す。
【0188】
機械的解離のために、（細胞の遠心分離によって得られる）多能性幹細胞のペレットまたは単離された多能性幹細胞塊を、少量（例えば、０．２～１ｍｌ）の培地中で細胞を上下にピペッティングすることによって、解離することができる。例えば、ピペッティングは、２００μｌまたは１０００μｌのピペットチップを使用して、数回（例えば、３～２０回）実施することができる。
【0189】
上記の代わりに、または上記に加えて、大きい多能性幹細胞塊の機械的解離は、塊を所定のサイズに破壊するように設計されたデバイスを使用して実施することができる。そのようなデバイスは、スウェーデン国、ゲーテボルグ、ＣｅｌｌＡｒｔｉｓから入手することができる。上記の代わりに、または上記に加えて、機械的解離は、倒立顕微鏡下で塊を見ながら、針、例えば２７ｇの針（アイルランド国、ドロヘダ、ＢＤ Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ）、を使用して、手動で実施することができる。
【0190】
本発明のいくつかの実施形態によると、継代は、酵素的解離の無い条件下で実施される。
【0191】
本発明のいくつかの実施形態によると、方法は、哺乳類家畜多能性幹細胞が富化された集団を得るために、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の少なくとも２～６回、例えば、少なくとも２～５回、例えば、少なくとも２～４回の機械的継代をさらに含む。
【0192】
本発明のいくつかの実施形態によると、継代は、細胞塊の酵素的解離によって行う。
【0193】
多能性幹細胞塊の酵素的消化は、塊またはコロニーを、ＩＶ型コラゲナーゼ（米国、ニュージャージ州、レイクウッド、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および／またはジスパーゼ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）などの酵素に供することによって実施することができる。酵素とのインキュベーションの時間は、細胞培養液中に存在する細胞塊およびコロニーのサイズに依存する。典型的には、培養中の多能性幹細胞細胞塊を５～７日毎に解離する場合、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼと２０～６０分間インキュベートすることにより、未分化の状態でさらに培養することができる小さい細胞塊が得られる。上記の代わりに、多能性幹細胞塊を１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼと共に約２５分間インキュベートした後、１ｍｇ／ｍｌのジスパーゼと５分間インキュベートすることができる。
【0194】
本発明のいくつかの実施形態によると、方法は、哺乳類家畜多能性幹細胞が富化された集団を得るために、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の少なくとも２～６回、例えば、少なくとも２～５回、例えば、少なくとも２～４回の酵素的継代をさらに含む。
【0195】
本願で使用する語句「哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団」とは、少なくとも７０％の哺乳類家畜多能性幹細胞を含む細胞集団を意味する。
【0196】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団は、少なくとも７１％の未分化で多能性の哺乳類家畜幹細胞を含み、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上の未分化で多能性の哺乳類家畜幹細胞を含む。
【0197】
一度得られたら、哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団は、連続的に継代しながら培養することができる。
【0198】
本発明のいくつかの実施形態によると、多能性幹細胞の集団は、連続的に継代しながら延長された期間に渡り、未分化状態で増殖される。
【0199】
本発明のいくつかの実施形態によると、延長された期間は少なくとも２週間、例えば、少なくとも１ヶ月、例えば、少なくとも３、４、５、６、７ヶ月またはそれ以上の培養である。
【0200】
本発明のいくつかの実施形態によると、一度得られたら、哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団は、１０％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（例えば、米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａより入手可能）、１０％ｖ／ｖの胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（例えば、米国、ユタ州、Ｈｙｃｌｏｎｅより入手可能）および８０％ｖ／ｖのＤＭＥＭ／Ｆ１２（例えば、イスラエル国、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓより入手可能）からなる溶液といった凍結溶液を用いて、液体窒素で凍結することができる。
【0201】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞が富化された集団の連続継代は、４～１０日毎、例えば、５～７日毎に行う。
【0202】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞が富化された集団の継代は、酵素的継代（例えば、ＩＶ型コラゲナーゼ、ジスパーゼ、ＴｒｙＰＬＥトリプシンを使用）で行う。
【0203】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞が富化された集団の継代は、機械的継代で行う。
【0204】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞が富化された集団の継代は、酵素的継代なしの機械的継代で行う。
【0205】
よって、本発明のいくつかの実施形態の方法は、哺乳類家畜多能性幹細胞に富んだ集団を含む哺乳類家畜多能性幹細胞株をもたらす。
【0206】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の胚性生殖層に分化可能である。
【0207】
本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜多能性幹細胞の内胚葉、中胚葉および外胚葉の胚性生殖層への分化は、細胞倍中の直接分化、胚様体への分化、および／またはテラトーマ形成によって行うことができる。
【0208】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞の集団の細胞は、胚様体に分化可能である。
【0209】
本願で使用する語句「胚様体」（ＥＢ）とは、胚性生殖層の分化および未分化の細胞誘導体の三次元多細胞凝集体である。
【0210】
胚様体は、フィーダー層、フィーダー細胞無しの培養システム、または未分化および多能性状態に細胞を維持することのできる培養培地等の未分化状態に維持する条件から多能性幹細胞を除去した際に形成される。フィーダー細胞またはフィーダー細胞無しのマトリックスからの多能性幹細胞の除去は、限定された時間のＩＶ型コラゲナーゼ処理によって実施することができる。培養表面からの解離に続き、細胞は、血清およびアミノ酸を添加した培養培地を含む組織培養プレートに移される。
【0211】
培養期間中、ＥＢはその分化状態についてモニタリングされる。細胞分化は、分化の指標として知られる細胞または組織特異的マーカーの調査によって決定することができる。例えば、ＥＢ誘導性分化した細胞は、外胚葉細胞系に特徴的なマーカーである神経フィラメント６８ＫＤを発現し得る。
【0212】
ＥＢ細胞の分化レベルは、ＯＣＴ－４発現の喪失、並びにα－フェトプロテイン、ＮＦ－６８ｋＤａ、α－心臓マーカーおよびアルブミンといった他のマーカーの発現増加を追うことでモニタリングすることができる。特定の遺伝子の発現レベルのモニタリングに有用な方法は当業界で広く知られており、ＲＴ－ＰＣＲ、半定量的ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡインシチュハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット解析、および免疫組織化学が挙げられる。
【0213】
テラトーマ
本発明のいくつかの実施形態の多能性幹細胞の多能性能は、ＳＣＩＤマウスに細胞を注射することでも確認することができ［Evans MJ and Kaufman M (1983) Pluripotential cells grown directly from normal mouse embryos. Cancer Surv. 2: 185-208］、注射によってテラトーマが形成される。テラトーマは４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒドで固定し、３種の胚性生殖層（即ち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）について組織学的に検査する。
本発明のいくつかの実施形態の多能性幹細胞の多能性能は、ＳＣＩＤマウスに細胞を注射することでも確認することができ［Evans MJ and Kaufman M (1983) Pluripotential cells grown directly from normal mouse embryos. Cancer Surv. 2: 185-208］、注射によってテラトーマが形成される。テラトーマは４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒドで固定し、３種の胚性生殖層（即ち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）について組織学的に検査する。
【0214】
分化状態のモニタリングに加えて、幹細胞は、その細胞学的正倍数性（ｅｕｐｌｏｉｄｉｔｙ）、即ち全ての染色体が存在し、培養時に検出可能なほどの変化がないこと、を確認するために、核型についてもモニタリングされることが多い。培養幹細胞の核型は、標準ギムザ染色によって決定し、対応する種の出版済みの核型と比較することによって、決定することができる。
【0215】
多能性幹細胞は、効果的な量の脂肪生成性分化誘導剤の存在下で直接誘導することで脂肪生成系統に分化するように誘導可能であることが当業界で広く知られている。例えば、直接分化は、Qi-Qun Tang, 2004［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(26): 9607-9611 “Commitment of C3H10T1/2 pluripotent stem cells to the adipocyte lineage”］に実質的に記載されているように、多能性幹細胞を骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の存在下で培養する方法で達成することができる。加えて、または代わりに、胚様体（ＥＢ）分化によって多能性幹細胞を脂肪生成細胞に分化させることもできる。例えば、１０日齢のＥＢを２０％ｖ／ｖのＫＳＲ（ノックアウト血清代替物）を含む培地（例：ＤＭＥＭ／Ｆ１２）の入ったゼラチン被覆プレートにプレーティングし、さらに１０日後に派生物を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２と、ＩＢＭＸ（１－メチル－３－イソブチルキサンチン、例：０．５ｍＭの濃度）、デキサメタゾン（例：０．２５μＭ）、Ｔ３（例：０．２ｎＭ）、インスリン（例：１μｇ／ｍｌ）およびロシグリタゾン（例：１μＭ）を添加した１０％ｖ／ｖのＫＳＲとを含む培地で、実質的に本参照をもって全体を援用するTala Mohsen-Kanson et al., 2014（Stem Cells, 32: 1459-1467）に記載のように培養することができる。
【0216】
本願で使用する語句「脂肪生成性分化誘導剤」とは、ｉｎ－ｖｉｔｒｏの培養中の多能性幹細胞に加えたときに細胞の脂肪生成細胞系統への分化を誘導し、最終的に脂肪細胞の作製をもたらす物質、例えば、ホルモンおよび／または化学試薬を意味する。
【0217】
本発明のいくつかの実施形態によると、脂肪生成性分化誘導剤は、二次元培養システム（例：マトリックス上またはフィーダー細胞層上）で培養されている多能性幹細胞の脂肪生成系統への分化を誘導する。
【0218】
公知の脂肪生成性分化誘導剤の非限定的な例としては、ＩＢＭＸ（本願で代替的に使用される１－メチル－３－イソブチルキサンチンまたは３－イソブチル－１－メチルキサンチン）、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）、Ｔ３（トリヨードチロニン）、インドメタシン、およびモノ不飽和オメガ５（例：ミリストレイン酸）、モノ不飽和オメガ７（例：パルミトレイン酸）、モノ不飽和オメガ９（例：エルカ酸、エライジン酸、オレイン酸）等の脂肪酸または分岐脂肪酸（例：フィタン酸およびプリスタン酸）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらは実質的にF. Mehta et al 2019 Sissel Beate Ronning (ed.), Myogenesis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1889, Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2019に記載のものである。
【0219】
ヒトＥＳＣまたはｉＰＳＣ等の多能性幹細胞の脂肪生成分化の誘導に適切な例示的な有効濃度範囲を以下に示す。脂肪生成分化培地は、０．０１～１ｍＭのｏｆ３－イソブチル－１－メチルキサンチン、０．１～１０μＭのヒドロコルチゾン、０．０１～１ｍＭのインドメタシン、０．４～０．６ｍＭのＩＢＭＸ、０．２～０．３μＭのデキサメタゾン、０．１５～０．３ｎＭのＴ３、１～２μｇ／ｍｌのインスリンおよび１～２μＭのロシグリタゾンを含み得る。
【0220】
既に同定されている多能性幹細胞と比べて、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜ＰＳＣ（例：ウシＰＳＣ）は、脂肪生成系統への分化を誘導する任意の脂肪生成性分化誘導剤（例：ホルモンまたは化学薬品）の添加無しに脂肪細胞に自発的に分化することができる。
【0221】
後述する実施例の項の実施例１および図６のＡ～Ｂは、本発明のいくつかの実施形態におけるウシ多能性幹細胞が、任意の脂肪生成性分化誘導剤（例：ホルモンまたは化学薬品）の添加無しに脂肪細胞へ自発的に分化し得ることを示す。脂肪細胞の存在は、オイルレッド染色で陽性に染色された油滴の可視化によって確認することができる。
【0222】
本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜ＰＳＣは、フィーダー細胞（例：ＭＥＦフィーダー層）上、「培地Ｘ」またはＩＬ６ＲＩＬ６キメラ培地（無血清培地である）といった、いずれも脂肪生成性分化誘導剤を含まない培養培地の存在下で培養し、バックグラウンド分化として、または１０日超、例えば、１４日超、継代無しで放置したときに、脂肪細胞へと自発的に分化し得る。
【0223】
よって、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜ＰＳＣは、血清の不存在下、即ち、無血清培養培地中で、脂肪細胞へと分化可能である。
【0224】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞は、脂肪生成性分化誘導剤の不存在下で、脂肪細胞への自発的分化が可能である。
【0225】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞は、脂肪生成性分化誘導剤の不存在下および無血清培養培地中で、脂肪細胞への自発的分化が可能である。
【0226】
本願で脂肪生成性分化誘導剤に対して使用する成句「不存在下で」とは、有効量の上述した脂肪生成剤が含まれていないことを意味する。
【0227】
脂肪生成性分化誘導剤を含まない培養培地は、有効量ではないため、継代なしで約１４～２１日間培養したヒト胚性幹細胞またはヒト胚様体に加えても脂肪細胞への分化が起こらないトレース量の脂肪生成性分化誘導剤を含んでもよいことに留意されたい。
【0228】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞は、デキサメタゾンを含まない培地で継代無しで少なくとも１０日間、例えば、１４日超培養すると、脂肪細胞への自発的分化が可能である。
【0229】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞は、ＩＢＭＸ（１－メチル－３－イソブチルキサンチン）を含まない培地で継代無しで少なくとも１０日間、例えば、１４日超培養すると、脂肪細胞への自発的分化が可能である。
【0230】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞は、ＢＭＰを含まない培地で継代無しで少なくとも１０日間、例えば、１４日超培養すると、脂肪細胞への自発的分化が可能である。
【0231】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞は、Ｔ３を含まない培地で継代無しで少なくとも１０日間、例えば、１４日超培養すると、脂肪細胞への自発的分化が可能である。
【0232】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜多能性幹細胞集団の細胞は、培養培地で約１０～１４日間、継代無しで培養すると、脂肪生成細胞系統に自発的に分化する。
【0233】
本発明のいくつかの実施形態によると、脂肪生成系統への自発的分化に使用する培養培地は、血清を含む。
【0234】
本発明のいくつかの実施形態によると、脂肪生成系統への自発的分化に使用する培養培地は、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む。
【0235】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、本発明のいくつかの実施形態の方法で作製した単離哺乳類家畜多能性幹細胞であって、単離哺乳類家畜多能性幹細胞が外胚葉、中胚葉および外胚葉胚性生殖層に分化可能であり、脂肪生成性分化誘導剤を含まない培地で培養されたときに脂肪生成細胞に自発的に分化可能である細胞が提供される。
【0236】
本発明のいくつかの実施形態によると、単離哺乳類家畜多能性幹細胞は、ＯＣＴ４（多能性幹細胞マーカー）の陽性発現によって特徴づけられる。
【0237】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、脂肪細胞の作製方法であって、本発明のいくつかの実施形態の単離哺乳類家畜多能性幹細胞または本発明のいくつかの実施形態の方法で得られた哺乳類家畜多能性幹細胞集団を、脂肪生成性分化誘導剤を含まない培養培地で、少なくとも４日間で６０日以下の期間継代無しで、例えば、少なくとも１０日間で６０日以下の期間継代無しで、例えば、少なくとも１４日で５０日以下の期間継代無しで、例えば、少なくとも１４日で４０日以下の期間継代無しで、例えば、少なくとも１４日で３０日以下の期間継代無しで、例えば、少なくとも１４日で２５日日以下の期間継代無しで培養し、脂肪細胞を作製する方法が提供される。
【0238】
本願で使用する語句「哺乳類家畜」とは、家畜化した哺乳類動物、典型的には、肉および／または乳といった食品原料に使用するものを意味する。
【0239】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜は反芻哺乳類家畜である。
【0240】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜は不反芻哺乳類家畜である。
【0241】
本発明のいくつかの実施形態によると、反芻哺乳類家畜は、ウシ亜科、ヒツジ、ヤギ、シカおよびラクダからなる群より選ばれる。
【0242】
本発明のいくつかの実施形態によると、ウシ亜科の反芻哺乳類家畜は畜牛またはヤクである。
【0243】
本発明のいくつかの実施形態によると、ウシ亜科の反芻哺乳類家畜は畜牛である。
【0244】
本発明のいくつかの実施形態によると、畜牛はバッファロー、バイソンまたは乳牛（ウシ）である。
【0245】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜は乳牛（ウシ）である。
【0246】
本発明のいくつかの実施形態によると、畜牛は乳牛（ウシ）である。
【0247】
本発明のいくつかの実施形態によると、不反芻哺乳類家畜は、ブタ、ウサギ、およびウマからなる群より選ばれる。
【0248】
本発明のいくつかの実施形態によると、哺乳類家畜はウマである。
【0249】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、本発明のいくつかの実施形態の方法で作製した脂肪細胞を食品に導入し、食品を製造することを含む、食品の製造方法が提供される。
【0250】
本発明のいくつかの実施形態によると、食品は、培養肉を得るために他の物質と組み合わされる培養肉または培養細胞を含む。
【0251】
本願で使用する用語「培養肉」とは、肉の感覚受容性および食感を与えるために加工された、ｉｎ－ｖｉｔｒｏで培養した動物細胞を意味する。
【0252】
培養肉製品は種々の細胞を含むことができ、細胞としては、脂肪細胞、筋肉細胞、血液細胞、軟骨細胞、骨細胞、結合組織細胞、線維芽細胞および／または心筋細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0253】
本発明のいくつかの実施形態によると、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した動物細胞は哺乳類家畜細胞である。
【0254】
本発明のいくつかの実施形態によると、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した動物細胞はウシ細胞である（しかし、他の細胞、例えば、魚類、ブタ、鳥類が含まれてもよい）。
【0255】
本発明のいくつかの実施形態によると、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した動物細胞はウマ細胞である（しかし、他の細胞、例えば、魚類、ブタ、鳥類が含まれてもよい）。本発明のいくつかの実施形態によると、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した動物細胞は、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜多能性幹細胞の自発的分化で得られた脂肪細胞である。
【0256】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養肉は、有害な微生物または寄生虫の混入を実質的に含まない。
【0257】
上述したように、培養肉は、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜（例：ウシ）多能性幹細胞から自発的に分化した脂肪細胞を含む。
【0258】
より脂肪の多い肉の方が一般的によりおいしいが、より大きな脂肪含有量は、心臓疾患などの望ましくない健康被害をもたらすより大きな危険性を含むことに留意されたい。
【0259】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養肉は、最適な味と健康効果を有する肉製品を製造するために調節可能な、筋肉細胞／脂肪細胞比を有する。例えば、このような比は、初めに培地に植え付ける所望の細胞によって調節するか、あるいは哺乳類家畜多能性幹細胞の筋肉細胞、軟骨細胞、血液細胞または脂肪細胞への分化を制御することで調節することができる。
【0260】
分化は、培養肉の構造および／または食感を支持するための支持層上で生じてもよい。
【0261】
本発明のいくつかの実施形態によると、細菌、真菌、ウイルス、プリオン、原虫、またはこれらの任意の組み合わせ等の有害な微生物を実質的に含まない肉製品を得るために、細胞培養に無菌技術を用いてもよい。有害な微生物としては、サルモネラ、カンピロバクター、大腸菌０１５６：Ｈ７等の病原性の微生物を挙げることができる。無菌技術は、肉製品が生物学的製造ラインから外れて梱包される際にも用いることができる。このような品質保証は、当業界で公知の微生物または薬品のための標準的なアッセイでモニタリングしてもよい。「実質的に含まない」とは、微生物または寄生虫の濃度が臨床的に有意なレベルのコンタミネーション未満である、即ち、食飲によって疾患または望ましくない健康状態が生じるレベル未満であることを意味する。
【0262】
本発明のいくつかの実施形態によると、動物の体から得た肉製品には通常欠けているビタミン類等の他の栄養素を添加して、肉の栄養価を上げてもよい。これは、増殖培地への栄養素の直接添加、または遺伝子工学的技術によって達成することができる。例えば、特定のビタミン、例えば、ビタミンＤ、Ａ、または異なるビタミンＢ類の複合体の生合成を担う酵素の一または複数の遺伝子を培養筋肉細胞に形質導入して特定のビタミンを製造させてもよい。
【0263】
本発明のいくつかの実施形態によると、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養細胞から導出した肉製品は種々の肉製品の誘導体を含んでもよい。このような誘導体は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖した組織を挽くか削り、ミートボール、フィッシュボール、ハンバーガーパティ等のための適切な味付けと混合して製造することもできる。また、誘導体は、組織の層から切り出し、例えば、ビーフジャーキー、ボローニャソーセージ、サラミ等のためのスパイスを施して製造することもできる。よって、本発明の肉製品は、動物の肉から製造するいかなる食品の製造に使用してもよい。
【0264】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によると、本発明のいくつかの実施形態の方法で作製した脂肪細胞を含む食品が提供される。
【0265】
上述したように、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜多能性幹細胞は、種々の細胞系統および細胞型に分化するよう誘導することができる。次に、本発明のいくつかの実施形態の哺乳類家畜多能性幹細胞を分化させるための非限定的な方法を示す。
【0266】
赤血球への分化： 多能性幹細胞は、種々のプロトコルを使用して、赤血球等の造血細胞へと分化するように誘導することができる。
【0267】
例えば、造血細胞への分化は、多能性幹細胞の胚様体（ＥＢ）への分化によって達成することができる。
【0268】
多能性幹細胞は、本参照をもって全体が援用されるH. Lapillonne, et al., 2010［haematologica, 95(10): 1651-1659; “Red blood cell generation from human induced pluripotent stem cells: perspectives for transfusion medicine”］に実質的に記載されているよう、胚様体（ＥＢ）への自発的分化によって造血細胞へと分化するように誘導することができる。まとめると、ＥＢへの分化を、ヒト血漿を含むイスコーブの変法ダルベッコ培地－グルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）のような培養培地の存在下、幹細胞因子（ＳＣＦ、例：約１００ｎｇ／ｍＬ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ、例：約１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＬＴ３リガンド（例：約１００ｎｇ／ｍＬ）、組換えヒト骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４、例：約１０ｎｇ／ｍＬ）、組換えヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ－Ａ１６５、例：約５ｎｇ／ｍＬ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３、例：約５ｎｇ／ｍＬ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６、例：約５ｎｇ／ｍＬ）およびエリスロポイエチン（Ｅｐｏ、例：約３Ｕ／ｍＬ）の存在下で行う。培養約２０日後に得られる胚様体は、初期赤血球コミットメントを有する細胞を含む。ＥＢの細胞を次に単細胞に解離し、血漿（例：約１０％ｖ／ｖ）、インスリン（例：約１０μｇ／ｍｌ）およびヘパリン（例：約３Ｕ／ｍＬ）と、ＳＣＦ（例：約１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－３（例：約５ｎｇ／ｍＬ）およびＥｐｏ（例：約３Ｕ／ｍＬ）等の追加因子とを含む培養培地でさらに培養する。８日間の培養に続き、培地をＳＣＦ（例：約１００ｎｇ／ｍＬ）およびＥｐｏ（例：約３Ｕ／ｍＬ）を添加した培養培地に交換し、さらに３日間培養する。１１日～２５日目に、細胞を、Ｅｐｏ（３Ｕ／ｍＬ）を添加した培地で培養することができる。このプロトコルは、機能的な四量体の形状の胎仔ヘモグロビンを含む除核赤血球まで成熟することのできる最終的な赤血球をもたらすことができる。
【0269】
代わりに、多能性幹細胞は、本参照をもってその内容の全体が援用されるBin Mao et al.（2016, Stem Cell Reports, Vol. 7, pp 869-883）に実質的に記載されているように、最終的な赤芽球に直接分化させることもできる。まとめると、二次元マトリックスまたはフィーダー細胞上で培養された多能性幹細胞の培養培地を、ｈＰＳＣ維持培地から造血発生誘導培地に変更することで造血系統への分化を誘導することができる。例えば、造血発生誘導培地は、胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、例：約１０％ｖ／ｖ）（例：Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸、アスコルビン酸（例：約５０ｍｇ／ｍＬ）、およびＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子、例：約２０ｎｇ／ｍＬ）を添加したイスコーブの変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）であり得、培養は、約１～１２日の培養期間であり得、造血前駆体および赤血球前駆体が得られる。１０～１２日目に共培養物を回収し、幹細胞因子（ＳＣＦ、例：約１００ｎｇ／ｍＬ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６、例：約１００ｎｇ／ｍＬ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３、例：約５ｎｇ／ｍＬ）、胎仔肝臓（例：約１０ｎｇ／ｍＬ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ、例：約１０ｎｇ／ｍＬ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ、例：約４ＩＵ／ｍＬ）およびＶＥＧＦ（例：約２０ｎｇ／ｍＬ）を添加した無血清増殖培地の入った超低付着プレートに６日間移し、続いて、幹細胞因子、インターロイキン－３（ＩＬ－３）およびエリスロポイエチンを添加した無血清培地でさらに７～８日間培養する。最後に、本参照をもってその内容の全体が援用されるGiarratana, M.C., 2005（Nat. Biotechnol. 23, 69-74）に実質的に記載されているように、赤芽細胞の成熟のために、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）を添加した無血清ＲＢＣ培地で細胞を約１～２週間培養する。成熟赤芽球（多能性幹細胞から誘導したもの）は、より高いレベルのベータ－グロブリン発現と、中胚葉性および内皮性の性質の段階的な喪失を示すＧＰＡ＋ＣＤ３６ｌｏｗ／＋並びに末端で抑制されたＣＤ３６によって同定することが可能な点に留意されたい。
【0270】
加えて、または代わりに、本参照をもってその内容の全体が援用されるKenichi Miharada et al., 2006（“Efficient Enucleation of Erythroblasts Differentiated in Vitro From Hematopoietic Stem and Progenitor Cells”; Nat. Biotechnol. 24(10):1255-6）に記載のように、一度ＣＤ３４＋細胞が得られるまたは単離されたら、フィーダー細胞無しの培養条件で除核赤血球を得ることができる。まとめると、ＣＤ３４＋細胞を一代目は幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）を含む培養培地で培養し、次にＳＣＦおよびＥＰＯのみを添加した培地で２継代目および３継代目を培養して、約７７％の核化赤血球を得る。
【0271】
心筋細胞への分化： 多能性幹細胞は、本参照によってそれぞれの内容の全体を援用するものとする、P.W. Burridge et al.,（2014; Nat Methods. 11: 855-860; “Chemically defined generation of human cardiomycytes”）、I. Batalov et al.,（2015; Biomarker Insights 2015:10(S1); “Differentiation of Cardiomycytes from Human Pluripotent Stem Cells Using Monolayer Culture”）、およびP.W. Burridge et al. 2013 (Chapter 12 In: Methods in Molecular Biology 997; Uma Lakshmipathy and Mohan C. Vemuri Editors; Pluripotent Stem Cells, Methods and Protocols; “Highly Efficient Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Cardiomyocytes”）に記載の種々の公知の方法を用いて、心筋細胞への分化を誘導することができる。例えば、心筋細胞への分化のために、多能性幹細胞を、胚様体（ＥＢ）の形成が可能な条件培地で培養し、次に細胞の付着および収縮性の心筋細胞の形成のために、血清含有培地（例：胎仔ウシ血清）に曝露する。
【0272】
平滑筋細胞への分化： 多能性幹細胞は、種々の公知の方法を用いて、平滑筋細胞への分化を誘導することができる。例えば、平滑筋細胞へと成功裏に分化する多能性血管原性周皮細胞を使用する、本参照によってその内容の全体を援用するものとする、Dar A., et al., 2012（Circulation. 125: 87-99; “Multipotent Vasculogenic Pericytes From Human Pluripotent Stem Cells Promote Recovery of Murine Ischemic Limb”）に実質的に記載の方法を用いて、平滑筋細胞への分化を誘導することができる。まとめると、多能性幹細胞はＥＢへと自発的に分化し、ＣＤ１０５＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ７３＋／ＣＤ３１－多能性クローン原性中胚葉性前駆体であるＥＢの細胞をＭＡＣＳマイクロビーズで単離して、周皮細胞が発生すると、さらに増殖して、平滑筋細胞へとさらに分化することができる。
【0273】
加えて、または代わりに、本参照によってその内容の全体を援用するELLIOT W. SWARTZ, et al., 2016（“A Novel Protocol for Directed Differentiation of C9orf72-AssociatedHumanInduced Pluripotent Stem Cells Into Contractile Skeletal Myotubes”; STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE 2016;5:1461-1472）に実質的に記載されているように、多能性幹細胞をホスホイノシチジ３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害剤およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ３ｂ）の阻害剤を含む化学的に限定された培養培地で培養し、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）および線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を添加することは、３６日目までに約６０％以下の細胞を、ＭＹＯＧ＋細胞集団によって示される筋原性プログラムへと変換する。
【0274】
多能性幹細胞の筋肉細胞への分化を誘導するためのさらなる適切な方法は、本参照によってそれぞれの内容の全体を援用する、Jerome Chal et al., 2016（“Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro”; Nature protocols; VOL.11: 1833-1850）、Nunnapas Jiwlawat et al., 2018（“Current Progress and Challenges for Skeletal Muscle Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells Using Transgene-Free Approaches”; Stem Cells International, Volume 2018, pp: 1-18）に記載されている。
【0275】
軟骨細胞への分化： 多能性幹細胞、例えば、本参照によってその内容の全体を援用するものとする、Sergey P. Medvedev et al., 2011（“Human Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Fetal Neural Stem Cells Successfully Undergo Directed Differentiation into Cartilage”; STEM CELLS AND DEVELOPMENT, Volume 20, Number 6: 1099-1112）に実質的に記載されているように、胚様体の形成を介して軟骨細胞へと分化させることができる。まとめると、多能性幹細胞を８～１５日間、胚様体へと自発的に分化させる。直接軟骨へと分化させるときは、胚様体を、ＤＭＥＭを含み、ウシ血清（例：約５％ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（例：約１０ｎＭ）、アスコルビン酸（例：約５０μｇ／ｍＬ）、Ｌ－プロリン（例：約４０μｇ／ｍＬ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ３（ＴＧＦβ３；例：約１０ｎｇ／ｍＬ）および骨形態形成タンパク質－２（ＢＭＰ２；例：約１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した軟骨形成培地でさらに２１日間培養する。さらなる軟骨の自己組織化のためには、ＥＢを（例えば、トリプシンを使用して）脱凝集化させ、（例えば、アガロースで被覆された）９６穴プレートに、ウェル当たり１０５細胞の密度でさらに移し、同じ培地でさらに培養することができる。
【0276】
加えて、または代わりに、本参照によってその全内容を援用するものとするMichal Lach et al., 2014. Journal of Tissue Engineering Volume 5: 1-9で説明されているような種々のプロトコルを用いて、軟骨形成誘導培養培地の存在下でマトリックス上に細胞をプレーティングすることで多能性幹細胞を軟骨細胞に直接分化させることもできる。例えば、多能性幹細胞は、本参照によってその内容の全体を援用する、Oldershaw RA, et al. 2010（“Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes”; Nat Biotechnol 28(11): 1187-1194）に実質的に記載されているように、ＷＮＴ－３ａ、アクチビン、フォリスタチン、ＢＭＰ４、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、増殖／分化因子５（ＧＤＦ５）およびニューロトロフィン４（ＮＴ４）といった種々の増殖因子を添加した培地中、マトリックス上で培養することができる。
【0277】
加えて、または代わりに、多能性幹細胞は、本参照によってその内容の全体を援用する、Yang S-L, et al. 2012（“Compound screening platform using human induced pluripotent stem cells to identify small molecules that promote chondrogenesis”. Protein Cell, 3(12): 934-942）に実質的に記載されているように、ＷＮＴ－３ａ、アクチビン、フォリスタチン、ＢＭＰ４，線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、および増殖／分化因子５（ＧＤＦ５）の６種の増殖因子のみを含む培地で培養することができる。これらのプロトコルは、対照細胞株と比較して、高いＣＯＬ２Ａ１（ＩＩ型コラーゲンアルファ１）およびＳＲＹ（性別決定領域Ｙ）－ボックス９（ＳＯＸ９）の発現、並びに低い多能性マーカー発現を示す、軟骨細胞様細胞に分化することができる。
【0278】
神経前駆細胞
本発明のいくつかの実施形態のＥＢを神経前駆体に分化させるためには、４日齢のＥＢを５ｍｇ／ｍｌのインスリン、５０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、３０ｎＭの塩化セレンおよび５ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ＴＳＦｎ培地、Okabe, S. et al., 1996, Mech. Dev. 59: 89-102）の入った組織培養皿で５～１２日間培養する。Ｉｎ ｖｉｖｏで神経細胞を作製するために、得られた神経前駆体をさらに移植することができる（Brustle, O. et al., 1997. In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 14809-14814）。尚、移植前には、神経前駆体をトリプシン処理し、０．１％のＤＮａｓｅの存在下ですりつぶして単一細胞懸濁液とするものとする。
本発明のいくつかの実施形態のＥＢを神経前駆体に分化させるためには、４日齢のＥＢを５ｍｇ／ｍｌのインスリン、５０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、３０ｎＭの塩化セレンおよび５ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ＴＳＦｎ培地、Okabe, S. et al., 1996, Mech. Dev. 59: 89-102）の入った組織培養皿で５～１２日間培養する。Ｉｎ ｖｉｖｏで神経細胞を作製するために、得られた神経前駆体をさらに移植することができる（Brustle, O. et al., 1997. In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 14809-14814）。尚、移植前には、神経前駆体をトリプシン処理し、０．１％のＤＮａｓｅの存在下ですりつぶして単一細胞懸濁液とするものとする。
【0279】
オリゴデンドロサイトおよびミエリン化細胞
本発明のいくつかの実施形態のＥＢは、修飾ＳＡＴＯ培地、即ち、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ピルビン酸、プロジェストロン、プトレシン、チロキシン、トリヨードチロニン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、アミノ酸、ニュートロフィン３、繊毛神経栄養因子およびＨｅｐｅｓを含むＤＭＥＭで培養することで、オリゴデンドロサイトａｎｄミエリン化細胞に分化させることができる（Bottenstein, J. E. & Sato, G. H., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 514-517、Raff, M. C., Miller, R. H., & Noble, M., 1983, Nature 303: 390-396）。まとめると、０．２５％ｖ／ｖのトリプシン／ＥＤＴＡを用いてＥＢを解離させ（３７℃で５分）、すりつぶして単一細胞懸濁液とする。懸濁細胞を、５％ｖ／ｖのウマ血清および５％ｖ／ｖの胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）を添加したＳＡＴＯ培地を含むフラスコに植え付けた。培養４日後に、フラスコを緩く浸透して弱く付着している細胞（一次オリゴデンドロサイト）を懸濁させ、アストロサイトはフラスコに付着したまま残し、条件培地をさらに製造する。ＳＡＴＯ培地を含む新しいフラスコに、一次オリゴデンドロサイトをさらに２日間移す。合計６日間の培養後に、細胞移植のためにオリゴスフィアを部分的に解離してＳＡＴＯ培地に再懸濁するか、あるいは完全に解離して、以前の振盪工程から誘導したオリゴスフィア条件培地に植え付ける［Liu, S. et al., (2000). Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6126-6131］。
本発明のいくつかの実施形態のＥＢは、修飾ＳＡＴＯ培地、即ち、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ピルビン酸、プロジェストロン、プトレシン、チロキシン、トリヨードチロニン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、アミノ酸、ニュートロフィン３、繊毛神経栄養因子およびＨｅｐｅｓを含むＤＭＥＭで培養することで、オリゴデンドロサイトａｎｄミエリン化細胞に分化させることができる（Bottenstein, J. E. & Sato, G. H., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 514-517、Raff, M. C., Miller, R. H., & Noble, M., 1983, Nature 303: 390-396）。まとめると、０．２５％ｖ／ｖのトリプシン／ＥＤＴＡを用いてＥＢを解離させ（３７℃で５分）、すりつぶして単一細胞懸濁液とする。懸濁細胞を、５％ｖ／ｖのウマ血清および５％ｖ／ｖの胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）を添加したＳＡＴＯ培地を含むフラスコに植え付けた。培養４日後に、フラスコを緩く浸透して弱く付着している細胞（一次オリゴデンドロサイト）を懸濁させ、アストロサイトはフラスコに付着したまま残し、条件培地をさらに製造する。ＳＡＴＯ培地を含む新しいフラスコに、一次オリゴデンドロサイトをさらに２日間移す。合計６日間の培養後に、細胞移植のためにオリゴスフィアを部分的に解離してＳＡＴＯ培地に再懸濁するか、あるいは完全に解離して、以前の振盪工程から誘導したオリゴスフィア条件培地に植え付ける［Liu, S. et al., (2000). Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6126-6131］。
【0280】
マスト細胞
マスト細胞の分化のために、２週齢の本発明のいくつかの実施形態のＥＢを、１０％ｖ／ｖのＦＣＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０％（ｖ／ｖ）のＷＥＨＩ－３細胞条件培地および５０ｎｇ／ｍｌの組換えラット幹細胞因子（ｒｒＳＣＦ、Tsai, M. et al., 2000. In vivo immunological function of mast cells derived from embryonic stem cells: An approach for the rapid analysis of even embryonic lethal mutations in adult mice in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 97: 9186-9190）を添加したＤＭＥＭ培地の入った組織培養皿に移す。細胞を新しいフラスコに毎週移し、培養培地の半分を置換することで、培養物を増殖させる。
マスト細胞の分化のために、２週齢の本発明のいくつかの実施形態のＥＢを、１０％ｖ／ｖのＦＣＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０％（ｖ／ｖ）のＷＥＨＩ－３細胞条件培地および５０ｎｇ／ｍｌの組換えラット幹細胞因子（ｒｒＳＣＦ、Tsai, M. et al., 2000. In vivo immunological function of mast cells derived from embryonic stem cells: An approach for the rapid analysis of even embryonic lethal mutations in adult mice in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 97: 9186-9190）を添加したＤＭＥＭ培地の入った組織培養皿に移す。細胞を新しいフラスコに毎週移し、培養培地の半分を置換することで、培養物を増殖させる。
【0281】
血液リンパ系細胞
本発明のいくつかの実施形態のＥＢから血液リンパ系細胞（ｈｅｍａｔｏ－ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌ）を作製するには、酸素量の調整が可能なインキュベーターを使用し、２～３日齢のＥＢを７．５％のＣＯ２および５％のＯ２の存在下、ガス透過性の培養皿に移す。１５日間の分化に続き、細胞を回収し、どちらもスイス国、バーゼル、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄより入手可能なコラゲナーゼ（０．１単位／ｍｇ）およびジスパーゼ（０．８単位／ｍｇ）による弱い消化で解離させる。抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｍ１／９．３．４．ＨＬ．２およびヤギ抗ラット免疫グロブリン結合常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）をPotocnik, A.J. et al.,（Immunology Hemato-lymphoid in vivo reconstitution potential of subpopulations derived from in vitro differentiated embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, 94: 10295-10300）に記載のように使用して、ＣＤ４５陽性細胞を単離する。単離したＣＤ４５陽性細胞は、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に一回通すことで、さらに富化させることができる。
本発明のいくつかの実施形態のＥＢから血液リンパ系細胞（ｈｅｍａｔｏ－ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌ）を作製するには、酸素量の調整が可能なインキュベーターを使用し、２～３日齢のＥＢを７．５％のＣＯ２および５％のＯ２の存在下、ガス透過性の培養皿に移す。１５日間の分化に続き、細胞を回収し、どちらもスイス国、バーゼル、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄより入手可能なコラゲナーゼ（０．１単位／ｍｇ）およびジスパーゼ（０．８単位／ｍｇ）による弱い消化で解離させる。抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｍ１／９．３．４．ＨＬ．２およびヤギ抗ラット免疫グロブリン結合常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）をPotocnik, A.J. et al.,（Immunology Hemato-lymphoid in vivo reconstitution potential of subpopulations derived from in vitro differentiated embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, 94: 10295-10300）に記載のように使用して、ＣＤ４５陽性細胞を単離する。単離したＣＤ４５陽性細胞は、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に一回通すことで、さらに富化させることができる。
【0282】
ＥＢは複雑な構造であるため、特定の分化した細胞、組織または器官へのＥＢの分化は、ＥＢからの系統特異的細胞の単離を必要とする点を留意されたい。
【0283】
このような単離は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によるＥＢ細胞のソート、またはＥＢに含まれる細胞、組織および／または組織様構造の機械的分離によって行ってもよい。
【0284】
ＦＡＣＳ解析によってＥＢ由来分化細胞を単離する方法は当業界で知られている。一方法によると、トリプシンとＥＤＴＡとの溶液（それぞれ０．０２５％ｖ／ｖと０．０１％ｖ／ｖ）を用いてＥＢを脱凝集化し、リン酸化生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％ｖ／ｖ胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）で洗浄し、特定の細胞系統に特徴的な細胞表面抗原に対する蛍光標識抗体と共に、氷上で３０分間インキュベートする。例えば、内皮細胞は、Levenberg, S. et al.,（Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99: 4391-4396）に記載のように、血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ１）に対する抗体、例えば、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（米国、カリフォルニア州、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）より入手可能な蛍光標識ＰＥＣＡＭ１抗体（３０８８４Ｘ）を結合させることで単離する。造血細胞は、いずれもＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入手可能なＩｇＧ１であるＣＤ３４－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ３１－ＰＥ、ＣＤ３８－ＰＥ、ＣＤ９０－ＦＩＴＣ、ＣＤ１１７－ＰＥ、ＣＤ１５－ＦＩＴＣ、クラスＩ－ＦＩＴＣや、ＣＤ１３３／１－ＰＥ（ＩｇＧ１）（カリフォルニア州、オーバーン、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃより入手可）、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（フロリダ州、マイアミ）から入手可能なグリコホリンＡ－ＰＥ（ＩｇＧ１）等の、蛍光標識抗体を用いて単離する。生細胞（即ち、固定無し）は、死細胞を除くためにヨウ化プロピジウムを用い、ＰＣ－ＬＹＳＩＳまたはＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウエアのいずれかで、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析する。単離細胞は、Kaufman, D.S. et al.,（Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98: 10716-10721）に記載のように、磁気標識二次抗体および磁気分離カラム（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてさらに富化することができる。
【0285】
ＥＢからの拍動する心筋細胞の機械的単離の一例が、Ｘｕらの米国特許出願公開第２００３００２２３６７号明細書に開示されている。まとめると、４日齢の本発明のいくつかの実施形態のＥＢをゼラチン被覆プレートまたはチャンバースライドに移し、付着し分化させる。分化の８日目から見られる自発的に収縮する細胞を機械的に分離し、低カルシウム培地またはＰＢＳの入った１５ｍＬのチューブに回収する。コラゲナーゼ活性に応じて、３７℃で６０～１２０分のコラゲナーゼＢ消化で細胞を解離する。解離した細胞を分化ＫＢ培地（８５ｍＭのＫＣＩ、３０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、５ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのクレアチン、２０ｍＭのグルコース、２ｍＭのＮａ２ＡＴＰ、５ｍＭのピルビン酸、および２０ｍＭのタウリン、ｐＨ７．２に緩衝化、Maltsev et al., Circ. Res. 75:233, 1994）に再懸濁し、３７℃で１５～３０分間インキュベートする。解離に続き細胞をチャンバースライドに植え付け、分化培地で培養し、拍動可能な単一心筋細胞を作製す。
【0286】
単離された系統特異的細胞の分化および増殖に適切な培養条件には、種々の組織培養培地、増殖因子、抗生物質、アミノ酸等が含まれ、特定の細胞型および／または細胞系統を増殖させ、分化させるために適応すべき条件を決定することは、当業者の能力の範囲内であることに留意されたい［Fijnvandraat AC, et al., Cardiovasc Res. 2003; 58: 303-12、Sachinidis A, et al., Cardiovasc Res. 2003; 58: 278-91、Stavridis MP and Smith AG, 2003; Biochem Soc Trans. 31(Pt 1): 45-9に報告有］。
【0287】
本発明のいくつかの実施形態の細胞株は、当業界で公知の方法でによってＥＢ由来細胞を不死化することで製造することができ、このような方法としては、例えば、細胞のテロメラーゼ遺伝子を発現させる方法（Wei, W. et al., 2003. Mol Cell Biol. 23: 2859-2870）、または細胞をＮＩＨ ３Ｔ３ ｈｐｈ－ＨＯＸ１１レトロウィルス産生細胞と共培養する方法（Hawley, R.G. et al., 1994. Oncogene 9: 1-12）が挙げられる。
【0288】
以下、多能性幹細胞由来の分化しているおよび／または増殖している系統特異的細胞（例：ＥＳＣおよびｉＰＳ細胞）に適切な培養条件の非限定的な例である。
【0289】
ＣＤ７３陽性且つＳＳＥＡ－４陰性である間葉系幹細胞は、Trivedi P and Hematti P. Exp Hematol. 2008, 36(3):350-9に実質的に記載されているように、多能性幹細胞の培養物中に形成された線維芽細胞様分化細胞の割合を機械的に増加させることで、多能性幹細胞から作製することができる。まとめると、多能性幹細胞の分化を誘導するために、培地交換の間隔を３～５日に広げると、ＥＳＣコロニーの周辺の細胞が、錘型の線維芽細胞に見える細胞になる。この条件下で９～１０日後に培養中の細胞の約４０～５０％が線維芽細胞様の外見を獲得したら、多能性幹細胞コロニーの未分化の部分を物理的に除去し、残った分化した細胞を同じ条件下の新しい培養皿に継代する。
【0290】
多能性幹細胞のドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンへの分化を誘導するためには、Vazin T, et al., PLoS One. 2009 Aug 12; 4(8):e6606、およびElkabetz Y., et al., Genes Dev. 2008 January 15; 22: 152-165に実質的に記載されているように、細胞をマウス間質性細胞株ＰＡ６またはＭＳ５と共培養する、または間質性細胞由来因子１（ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ１２）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）およびエフィリンＢ１（ＥＦＮＢ１）の組み合わせと培養することができる。
【0291】
中脳ドーパミン（ｍｅｓＤＡ）ニューロンを作製するには、Friling S., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009, 106: 7613-7618に実質的に記載されているように、転写因子Ｌｍｘ１ａを発現するように多能性幹細胞を遺伝的に修飾することができる（例：ＰＧＫプロモーターとＬｍｘ１ａを含むレンチウィルスベクターを使用）。
【0292】
肺上皮（ＩＩ型肺細胞）を多能性幹細胞から作製するには、Rippon HJ., et al., Proc Am Thorac Soc. 2008; 5: 717-722に記載のように、多能性幹細胞を市販の細胞培養培地（Ｓｍａｌｌ Ａｉｒｗａｙ増殖培地、メリーランド州、カレッジパーク、Ｃａｍｂｒｅｘ）の存在下で培養する、または、代わりに、肺細胞の細胞株（例：Ａ５４９ヒト肺腺癌細胞株）から回収した条件培地の存在下で培養することができる。
【0293】
多能性幹細胞の神経細胞への分化を誘導するためには、Chambers SM., et al., Nat Biotechnol. 2009, 27: 275-280に実質的に記載されているように、多能性幹細胞をＴＧＦ－ｂ阻害剤（ＳＢ４３１５４２、Ｔｏｃｒｉｓ、例：１０ｎＭ）およびノギン（Ｒ＆Ｄ、例：５００ｎｇ／ｍｌ）を添加した血清代替物培地の存在下で約５日間培養し、続いて、５００ｎｇ／ｍＬのノギンの存在下、増加した量（例：２５％、５０％、７５％、２日毎に変更）のＮ２培地（Li XJ., et al., Nat Biotechnol. 2005, 23:215-21）で培養することができる。
【0294】
系統特異的一次培養に加え、本発明のＥＢは、培養中の制限なしの増殖が可能な系統特異的細胞株を作製するために使用することができる。
【0295】
本発明のいくつかの実施形態の細胞株は、当業界で公知の方法でによってＥＢ由来細胞を不死化することで製造することができ、このような方法としては、例えば、細胞のテロメラーゼ遺伝子を発現させる方法（Wei, W. et al., 2003. Mol Cell Biol. 23: 2859-2870）、または細胞をＮＩＨ ３Ｔ３ ｈｐｈ－ＨＯＸ１１レトロウィルス産生細胞と共培養する方法（Hawley, R.G. et al., 1994. Oncogene 9: 1-12）が挙げられる。
【0296】
本明細書で使用する用語「ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ」とは、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６－Ｒ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ８９４１０、配列番号１に記載のヒトＩＬ－６－Ｒ）の可溶性部分（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ８９４１０の１１２～３５５アミノ酸、配列番号２に記載の可溶性ＩＬ６受容体の一部）と、インターロイキン－６（ＩＬ６）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＧ２９２９２、配列番号３に記載のヒトＩＬ－６）またはその生物活性画分（例えば、受容体結合ドメイン）とを含むキメラポリペプチドを指す。本発明のこの態様による方法によって使用されるＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、ヒト多能性幹細胞の未分化増殖を、その多能性を維持しながら支援することができるものであることが好ましい。ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを構築する場合、２つの機能的部分（すなわち、ＩＬ６およびその受容体）を、互いに直接融合する（例えば、結合する、もしくは翻訳的に融合させる、すなわち、単一のオープンリーディングフレームによりコードされるようにする）か、または好適なリンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）を介してコンジュゲートする（結合する、もしくは翻訳的に融合させる）ことができることを理解されたい。好ましくは、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラポリペプチドは、天然に存在するＩＬ６およびＩＬ６受容体と類似する量およびパターンのグリコシル化を示す。例えば、好適なＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、配列番号４に示したもの、および参照により本明細書に完全に組み込まれるRevel M., et al.の国際公開第９９／０２５５２号の図１１に示したものである。
【0297】
本明細書で使用する用語「ＷＮＴ３Ａ」とは、ＷＮＴ遺伝子ファミリーのメンバーを指す。ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、分泌シグナル伝達タンパク質をコードする構造的に関連する遺伝子からなる。これらのタンパク質は、発がん性、ならびに細胞運命の調節および胚発生中のパターン形成を含むいくつかの発生プロセスへの関与が知られている。
【0298】
ＷＮＴ３Ａ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３１３１．３、配列番号５）は、ＷＮＴ３Ａポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿１４９１２２．１、配列番号６）をコードする。ＷＮＴ３Ａポリペプチドは、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ（例えば、カタログ番号５０３６－ＷＮ－０１０）などの様々な製造業者から入手することができる。
【0299】
本明細書で使用する用語「塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）」とは、ヘパリンに結合し、広範にわたるマイトジェン活性および血管形成活性を有する、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのポリペプチドを指す。ｂＦＧＦ遺伝子のｍＲＮＡは、複数のポリアデニル化部位を有し、非ＡＵＧ（ＣＵＧ）開始コドンとＡＵＧ開始コドンとから択一的に翻訳され、個別の特性を有する５つの異なるアイソフォームをもたらす。ＣＵＧにより開始されるアイソフォームは、核に局在化し、内分泌効果を担うが、ＡＵＧにより開始される形態の大部分が細胞質性であり、このＦＧＦの傍分泌および自己分泌効果を担う。
【0300】
ｂＦＧＦポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１９９７（配列番号７）で提供され、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（例えば、カタログ番号２３３－ＦＢ）、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅなどの様々な製造業者から入手することができる。
【0301】
ウシｂＦＧＦポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６４８１．２（配列番号１１）で提供され、配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７４０５６．４）によってコードされる。ウシｂＦＧＦは、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから、例えば、ウシＦＧＦｂａｓｉｃ／ＦＧＦ２／ｂＦＧＦ（ウシ脳由来、カタログ番号１３３－ＦＢ－０２５）または組換えウシＦＧＦｂａｓｉｃ／ＦＧＦ２／ｂＦＧＦ（大腸菌由来、カタログ番号２０９９－ＦＢ－０２５）として入手可能である。本明細書で使用する用語「白血病阻止因子（ＬＩＦ）」とは、造血分化の誘導、神経細胞分化の誘導、および腎臓の発生の際の間葉細胞から上皮細胞への転換の調節に関与し、母胎境界面での免疫寛容についても役割を担いうる、多機能サイトカインを指す。
【0302】
本発明の一部の実施形態の培養培地において使用されるＬＩＦは、精製、合成、または組換え発現されたＬＩＦタンパク質［例えば、ヒトＬＩＦポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２３００．１（配列番号８）、ヒトＬＩＦポリヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３０９．４（配列番号９）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７３９３１．１（配列番号１１）にコードされるウシＬＩＦポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６３５６．１（配列番号１０）］であってもよい。ゼノフリー培養培地の調製のためには、ＬＩＦは、組換え発現されたものが好ましいことに留意すべきである。組換えヒトＬＩＦは、米国、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（カタログ番号ＬＩＦ１０１００）およびＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（米国、ノースキャロライナ州２７６０４、ローリー、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＵＳ Ｉｎｃ．）などの様々な供給社から入手することができる。マウスＬＩＦ ＥＳＧＲＯ（登録商標）（ＬＩＦ）を、米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログ番号ＥＳＧ１１０７）から入手することができる。
【0303】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地中のＬＩＦの濃度は、約１０００単位／ｍｌ～約１０，０００単位／ｍｌであり、例えば、約２０００単位／ｍｌ～約１０，０００単位／ｍｌ、約２０００単位／ｍｌ～約８，０００単位／ｍｌ、例えば、約２０００単位／ｍｌ～約６，０００単位／ｍｌ、例えば、約２０００単位／ｍｌ～約５，０００単位／ｍｌ、例えば、約２０００単位／ｍｌ～約４，０００単位／ｍｌ、例えば、約２，５００単位／ｍｌ～約３，５００単位／ｍｌ、例えば、約２，８００単位／ｍｌ～約３，２００単位／ｍｌ、例えば、約２，９００単位／ｍｌ～約３，１００単位／ｍｌ、例えば、約３０００単位／ｍｌである。
【0304】
本発明のいくつかの実施形態によると、培養培地中のＬＩＦの濃度は、少なくとも約１０００単位／ｍｌであり、例えば、少なくとも約２０００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２１００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２２００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２３００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２４００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２５００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２６００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２７００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２８００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２９００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２９５０単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約３０００単位／ｍｌである。
【0305】
上述したように、本発明の一部の実施形態の培養培地中で使用する任意のタンパク質性因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ、ＷＮＴ３ａ、ＬＩＦ）は、組換え発現したもの、または生化学的に合成したものでもよい。加えて、ｂＦＧＦ、ＷＮＴ３ａ、ＬＩＦ等の天然に存在するタンパク質性因子は、生物学的試料（例：ヒト血清、培養細胞）から公知の方法で精製することができる。ゼノフリー培養培地の調製のためには、タンパク質性因子は組換え発現されたものが好ましいことに留意されたい。
【0306】
タンパク質性因子の生化学合成は、標準的な固相技術を使用して実施することができる。これらの方法としては、排他的固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合および古典的溶液合成が挙げられる。
【0307】
本発明のタンパク質性因子の組換え発現は、Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544、Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89、Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514、Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311、Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680、Brogli et al., (1984) Science 224:838-843、Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565およびWeissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463に記載の組換え技術を使用して作製することができる。具体的には、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを、参照により本明細書に完全に組み込まれる、Revel M., et al.およびChebath J, et al., 1997の国際公開第９９／０２５５２号に記載されたように作製することができる。
【0308】
上述したように、本発明のいくつかの実施形態の方法は、哺乳類家畜（例：ウシ）胚または幹細胞の、フィーダー細胞層上またはフィーダー細胞無しの培養システム上の培養を用いる。
【0309】
下記は、例示的且つ非限定的なフィーダー細胞層の説明である。
【0310】
マウスフィーダー層： 多能性幹細胞を培養するための最も一般的な方法は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、多能性幹細胞の増殖および多能性を支持する血清または白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む組織培養培地を添加したフィーダー細胞層とすることに基づく方法である［Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145-7、Reubinoff BE, Pera MF, Fong C, Trounson A, Bongso A. (2000). Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18: 399-404］。ＭＥＦ細胞は、胎仔ウシ血清を添加した培地中の１２～１３日目のマウス胚から誘導されるこれらの条件下では、マウスＥＳ細胞は、表現型および機能的な特徴を保存する多能性幹細胞として維持することができる。フィーダー細胞の使用は、製造費を実質的に増加させることに留意されたい。加えて、フィーダー細胞は、幹細胞以上に増殖しないように代謝的に不活性であるため、多能性幹細胞培養物を分割する際には都度、新鮮なフィーダー細胞が必要となる。
【0311】
多能性幹細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した血清代替物を使用して、無血清条件下のＭＥＦ上で培養することもできる［Amit M, Carpenter MK, Inokuma MS, Chiu CP, Harris CP, Waknitz MA, Itskovitz-Eldor J, Thomson JA. (2000). Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227: 271-8］。これらの条件下では、ＥＳ細胞のクローニング効率は胎仔ウシ血清の存在下よりも４倍高い。加えて、血清代替物の存在下で６カ月の培養後も、全３種の胚性生殖層を含むテラトーマを形成する能力によって示されるように、ＥＳ細胞は未だその多能性を維持する。このシステムはよりよく限定された培養条件を使用するものの、培養中のマウス細胞の存在は、多能性幹細胞培養物をマウスの病原に暴露することもあり得るため、細胞療法における使用が制限される。
【0312】
フィーダー細胞層としてのヒト胚性線維芽細胞または成人卵管上皮細胞： 胚性幹細胞は、ヒト胚性線維芽細胞または成人卵管上皮細胞を用いて増殖および維持することができる。これらヒトフィーダー細胞上で増殖させると、胚性幹細胞は正常な核型を示し、アルカリホスファターゼ活性を発揮し、Ｏｃｔ－４および他の胚性細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、およびＧＣＴＭ－２を含む）を発現し、テラトーマをｉｎ ｖｉｖｏで形成し、鍵となる形態学的特徴の全てを維持する［Richards M, Fong CY, Chan WK, Wong PC, Bongso A. (2002). Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20: 933-6］。
【0313】
包皮フィーダー層： 胚性幹細胞は、米国特許出願公開第１０／３６８，０４５号明細書に開示されたヒト包皮フィーダー層で培養することができる。包皮由来のフィーダー細胞層は、胚性幹細胞の培養に適切な完全に動物無しの環境からなる。加えて、包皮細胞は、それらの導出から長くて４２継代まで培養下に維持することができ、比較的一定の環境を胚性幹細胞に提供することができる。このような条件下において、胚性幹細胞は、代わりのプロトコル（例：ＭＥＦ）で増殖した細胞と機能的に変わらないことが見いだされた。分化に続き、胚性幹細胞は、３種すべての胚性生殖層に関連する遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで発現し、３種すべての胚性生殖層から発生した組織からなるテラトーマをｉｎ ｖｉｖｏで形成した。さらに、ヒト卵管上皮細胞またはヒト胚性線維芽細胞とは異なり、包皮フィーダー層上で培養したヒト胚性幹細胞は、多能性および未分化の状態で培養中に少なくとも８７継代にわたり維持された。しかし、包皮細胞が長期間（即ち、４２継代）培養下で維持されても、包皮培養システムはその個別のバッチ間の違い故に詳細に限定されたものとはならない。加えて、ヒトフィーダー層に基づく培養システムは、フィーダー層とｈＥＳ細胞の両方の同時増殖を未だに必要とする。よって、フィーダー細胞無しの培養システムが開発された。
【0314】
下記は、例示的且つ非限定的なフィーダー細胞無しの培養システムの説明である。
【0315】
幹細胞は、培養培地の存在下、細胞外マトリックス（例：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン）等の固体表面上で増殖することができる。フィーダー細胞と幹細胞の同時増殖を必要とし、混合細胞集団をもたらし得るフィーダーに基づく培養とは異なり、フィーダー細胞無しのシステムで増殖させた幹細胞は、表面から容易に分離される。幹細胞の増殖には、ＭＥＦ条件培地やｂＦＧＦといった、分化を効果的に阻害し、増殖を促進する因子を含む培養培地が用いられる。しかし、一般的に使用されるフィーダー細胞無しの培養システムは、マウスまたはウシの血清あるいはＭＥＦ条件培地［Xu C, et al. (2001). Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19: 971-4］を添加した動物ベースのマトリックス（例：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を利用するため、動物病原のヒトＥＳ細胞への交差移動のリスクを有し、それが将来の臨床使用の妨げとなっている。
【0316】
本発明のいくつかの実施形態によると、フィーダー細胞マトリックスは、マトリゲル（商標）マトリックス、フィブロネクチンマトリックス、ラミニンマトリックス、およびビトロネクチンマトリックスからなる群より選ばれる。
【0317】
本発明のいくつかの実施形態の多能性幹細胞、またはそこから分化した細胞（例：脂肪細胞、筋肉細胞、血液細胞、軟骨細胞、骨細胞、結合組織細胞、線維芽細胞および／または心筋細胞）は、これら細胞を特徴づける種々の発現マーカーを用いて同定することができる。発現マーカーはＲＮＡまたはタンパク質のレベルで同定することができる。
【0318】
ＲＮＡの発現レベルを検出するための方法としては、ノーザンブロット解析、ＲＴ－ＰＣＲ解析、ＲＮＡインシチュハイブリダイゼーション染色、インシチュＲＴ－ＰＣＲ染色、ＤＮＡマイクロアレイ／ＤＮＡチップおよびオリゴヌクレオチドイクロアレイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0319】
タンパク質の発現および／または活性を検出するための方法としては、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、脂肪細胞、筋肉細胞、血液細胞、軟骨細胞、骨細胞、結合組織細胞、線維芽細胞および／または心筋細胞をソートする蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学解析、およびインシチュ活性解析が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0320】
本明細書で使用する用語「約」とは、±１０％を指す。
【0321】
本発明のいくつかの実施形態によると、用語「約」とは、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．５％、±０．１％を指す。
【0322】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその活用形は、「限定されるものではないが、含む（が挙げられるが、これらに限定されない。）」を意味する。
【0323】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する。
【0324】
用語「実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物、方法または構造が、追加の成分、ステップ、および／または部分を含んでいてもよいが、当該追加の成分、ステップ、および／または部分が、特許請求の範囲に記載された組成物、方法、または構造の基本的および新規な特徴を物質的に変化させない場合に限られることを意味する。
【0325】
本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に記述しない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１種の化合物（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」には、複数の化合物（それらの混合物も）を含んでもよい。
【0326】
本出願の全体を通して、本発明の様々な実施形態を範囲の形で提示することができる。範囲の形の記載は、単なる便宜上および簡潔さのためであり、本発明の範囲の変更不可能な限定と解釈すべきではないことを理解されたい。したがって、ある範囲の記述は、その範囲に含まれうる全ての部分範囲のみならず、範囲内の個々の数値をも具体的に開示するものと見なすべきである。例えば、１から６などの範囲の記述は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５、および６を具体的に開示するものと見なすべきである。これは、範囲の幅とは無関係に適用される。
【0327】
数値範囲が本明細書で示される場合は、示される範囲内の任意の引用された数値（分数または整数）が常に含まれるものとする。第１指示数と第２指示数との「間の範囲」、さらには、第１指示数「から」第２指示数「の範囲」という文言は、本明細書では同義に使用され、第１および第２の指示数と、それらの間の全ての分数および整数を含むものとする。
【0328】
本明細書で使用される「方法」という用語は、所与の仕事を実現するための手法、手段、技法、および手順を意味し、化学、薬学、生物学、生化学、および医学の分野の当業者に公知の手法、手段、技法、および手順、または当該当業者が公知の手法、手段、技法、および手順から容易に開発可能な手法、手段、技法、および手順を含むが、これらに限定されるものではない。
【0329】
本明細書で用いられる用語「治療する」は、病態の進行を無効化する、実質的に阻害する、減速させる、または逆転させることであって、病態に伴う臨床症状または審美的症状の実質的な改善、または病態に伴う臨床症状または審美的症状の出現の実質的な防止を含む。
【0330】
特定の配列表に言及する場合、このような言及は、その相補的配列に実質的に対応する配列、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の変更に起因するわずかな配列の変化を有するものをも含むものであるが、但し、当該変更の頻度は、５０ヌクレオチド中１未満、あるいは、１００ヌクレオチド中１未満、あるいは、２００ヌクレオチド中１未満、あるいは、５００ヌクレオチド中１未満、あるいは、１０００ヌクレオチド中１未満、あるいは、５，０００ヌクレオチド中１未満、あるいは、１０，０００ヌクレオチド中１未満であることを理解されたい。
【0331】
本出願に開示する配列番号（配列番号）は、例えその配列番号の配列がＤＮＡ配列の形式のみまたはＲＮＡ配列の形式のみで表されている場合でも、その配列番号が記載される文脈に応じて、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列のいずれを示してもよいことを理解されたい。例えば、配列番号１３はＤＮＡ配列の形式で表されている（例えば、チミンを表すＴを記述している）が、それはウシｂＦＧＦ核酸配列に対応するＤＮＡ配列、またはＲＮＡ分子の核酸配列であるＲＮＡ配列を示してもよい。同様に、一部の配列は、ＲＮＡ配列の形式で（例えば、ウラシルを表すＵを記述している）が、記載される分子の実際の型に応じて、それは、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列でも、そこに示したＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列を示してもよい。いずれにしても、任意の置換を含む配列を有するＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方が想定される。
【0332】
本発明の特徴であって、明確にするために個別の実施形態のとして記載したものは、組み合わせて１つの実施形態としても提供可能であることを理解されたい。逆に、簡潔にするために１つの実施形態として記載した本発明の様々な特徴を、個別に、または任意の適切な部分組合せで、または本発明で記載した他の実施形態との適切な組み合わせとして提供することもできる。様々な実施形態に関連して記載された特徴は、その特徴なしでは実施形態が動作不能でない限り、それらの実施形態の必須要件とは見なさない。
【0333】
上記で詳細に説明し、下記の請求の範囲内で請求する発明の様々な実施形態および態様について、以下の実施例で実験的裏付けを示す。
【実施例】
【0334】
以下の実施例を次に参照するが、これらは上記説明と共に、本発明のいくつかの実施形態を限定することなく例示するものである。
【0335】
本明細書において使用される命名法および本発明に使用する実験手順としては、通常、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４，６６６，８２８号明細書、第４，６８３，２０２号明細書、第４，８０１，５３１号明細書、第５，１９２，６５９号明細書、および第５，２７２，０５７号明細書に記載された方法、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、第３，８３９，１５３号明細書、第３，８５０，７５２号明細書、第３，８５０，５７８号明細書、第３，８５３，９８７号明細書、第３，８６７，５１７号明細書、第３，８７９，２６２号明細書、第３，９０１，６５４号明細書、第３，９３５，０７４号明細書、第３，９８４，５３３号明細書、第３，９９６，３４５号明細書、第４，０３４，０７４号明細書、第４，０９８，８７６号明細書、第４，８７９，２１９号明細書、第５，０１１，７７１号明細書、および第５，２８１，５２１号明細書、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984)、"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)、"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)、"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press、"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照されたい。上記文献の全てが、本参照により本明細書に完全に組み込まれるものとする。その他の一般的な参考文献は、本明細書を通じて提供される。それらに記載の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。それらに含まれるすべての情報が、本参照により本明細書に組み込まれる。
【0336】
一般的材料および実験方法
ウシとウマの遅延胚盤胞の違いの１つは、ウシにおいては媒精後７日目のウシから胚（緊密化した胚または初期胚盤胞）を得るが、ウマの場合は媒精後８日目の胚（胚盤胞または増殖胚盤胞、通常、１つの胚のみ）から得られる点にある。
ウシとウマの遅延胚盤胞の違いの１つは、ウシにおいては媒精後７日目のウシから胚（緊密化した胚または初期胚盤胞）を得るが、ウマの場合は媒精後８日目の胚（胚盤胞または増殖胚盤胞、通常、１つの胚のみ）から得られる点にある。
【0337】
ウシの胚盤胞の培養：
子宮受精中のウシ（ホルスタイン種の畜牛）の子宮を洗浄することで、７日齢の胚を得た。胚を洗浄し、培養条件に移すまで、維持および移動培地（Ｈｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉｕｍ）（米国、ＢｉｏＬｉｆｅ、製品番号Ｃ１５Ｃ）を用いて維持した（最大１時間）。
子宮受精中のウシ（ホルスタイン種の畜牛）の子宮を洗浄することで、７日齢の胚を得た。胚を洗浄し、培養条件に移すまで、維持および移動培地（Ｈｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉｕｍ）（米国、ＢｉｏＬｉｆｅ、製品番号Ｃ１５Ｃ）を用いて維持した（最大１時間）。
【0338】
胚盤胞は以下の原料からも得ることができる。
－ 市販品（イスラエル国、Ｈａ’ｆｅｔｚ Ｈａ’ｉｍ、Ｓｉｏｎ）
－ ＩＶＦ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの卵母細胞の媒精
－ ウシ細胞の核移植（ＮＴ）
－ 単性生殖
－ 市販品（イスラエル国、Ｈａ’ｆｅｔｚ Ｈａ’ｉｍ、Ｓｉｏｎ）
－ ＩＶＦ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの卵母細胞の媒精
－ ウシ細胞の核移植（ＮＴ）
－ 単性生殖
【0339】
ウシＰＳＣ株の導出：
タイロードの酸性溶液（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で透明帯を消化した後、露出した胚盤胞をプレーティングした。２種の異なるプレーティング方法を使用した。
（ｉ）有糸分裂不活性マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）または有糸分裂不活性包皮線維芽細胞等のフィーダー層、
（ｉｉ）適切なマトリックス（マトリゲル（商標）マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、市販の細胞マトリックス）。
タイロードの酸性溶液（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で透明帯を消化した後、露出した胚盤胞をプレーティングした。２種の異なるプレーティング方法を使用した。
（ｉ）有糸分裂不活性マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）または有糸分裂不活性包皮線維芽細胞等のフィーダー層、
（ｉｉ）適切なマトリックス（マトリゲル（商標）マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、市販の細胞マトリックス）。
【0340】
以下の技術のいずれかを用いて胚を表面に付着させた。
（ｉ）２７ｇ針の使用、
（ｉｉ）引き伸ばしたパスツールピペットの使用、
（ｉｉｉ）一滴の適切なマトリックスによる胚の被覆、または
（ｉｖ）胚が自発的に表面に付着するまで胚を放置する。
（ｉ）２７ｇ針の使用、
（ｉｉ）引き伸ばしたパスツールピペットの使用、
（ｉｉｉ）一滴の適切なマトリックスによる胚の被覆、または
（ｉｖ）胚が自発的に表面に付着するまで胚を放置する。
【0341】
付着したウシ胚盤胞を、大きなシストが発生するまで全胚としてＭＥＦ上で受精後７～２１日間培養した（例：図１のＣに示すように媒精後１４日）。ＭＥＦまたはマトリックスの品質故に必要であれば、２７ゲージの注射針を用いて、僅かな周辺の線維芽細胞を残しながら、胚全体を新しいＭＥＦ被覆プレートに移す。胚がシストを発生したら、盤様構造をそこから単離し、新鮮なＭＥＦまたはマトリックス被覆プレートに個別にプレーティングする。幹細胞形態を有する細胞（大きな核を有する小さな細胞）を機械的に継代した。数継代（４～６継代）後、ウシ多能性幹細胞に富んだ集団の培養が達成したら、１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて細胞を５～１０日毎に定期的に継代する。
【0342】
培養培地：
候補１： 培地Ｘ、８０％ｖ／ｖのＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＫＯ－ＤＭＥＭに２０％ｖ／ｖ限定胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（米国、ユタ州、ＨｙＣｌｏｎｅ）、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸ストック（全て米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加したものからなる培地。
候補１： 培地Ｘ、８０％ｖ／ｖのＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＫＯ－ＤＭＥＭに２０％ｖ／ｖ限定胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（米国、ユタ州、ＨｙＣｌｏｎｅ）、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸ストック（全て米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加したものからなる培地。
【0343】
培地ＸはＭＥＦ等のフィーダー細胞上で培養されるウシＰＳＣの未分化増殖を支持することができる。しかし、この培地で高密度（例：少なくとも１４日間継代無し）のウシＰＳＣをＭＥＦ上で培養すると、ウシＰＳＣは自発的に分化する。加えて、この培地でウシＰＳＣをフィーダー細胞無しの培養システムで培養すると、ウシＰＳＣは自発的に分化する。
【0344】
候補２： ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ培地、８５％ｖ／ｖのＤＭＥＭ／Ｆ１２（またはＫＯ－ＤＭＥＭ）に、１５％ｖ／ｖのｋｏ－血清代替物、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６－ＩＬ６受容体キメラ（キメラ、ｂｉｏｔｅｓｔ）および５０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（ＩＬ６－ＩＬ６受容体キメラ以外の全商品が米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加したものからなる培地を用いて細胞を培養した。細胞を、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ）、１０％ｖ／ｖのＦＢＳ（米国、ユタ州、ＨｙＣｌｏｎｅ）および８０％ｖ／ｖのＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる凍結溶液を用いて液体窒素で凍結した。
【0345】
候補３： Ｗｎｔ３ａ培地、８５％ｖ／ｖのＤＭＥＭ／Ｆ１２（またはＫＯ－ＤＭＥＭ）に、１５％ｖ／ｖのｋｏ－血清代替物、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸ストック、１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、１００ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および白血病抑制因子（ＬＩＦ）を３０００Ｕ／ｍｌ（特に記載がない限り、全商品が米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加したものからなる培地を用いて細胞を培養した。細胞を、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ）、１０％ｖ／ｖのＦＢＳ（米国、ユタ州、ＨｙＣｌｏｎｅ）および８０％ｖ／ｖのＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる凍結溶液を用いて液体窒素で凍結した。
【0346】
ウマの胚盤胞の培養：
子宮受精中のウマの子宮を洗浄することで、８日齢の胚を得た。胚を洗浄し、培養条件に移すまで維持および移動培地（Ｈｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉｕｍ）（米国、ＢｉｏＬｉｆｅ、製品番号Ｃ１５Ｃ）を用いて維持した（最大１時間）。
子宮受精中のウマの子宮を洗浄することで、８日齢の胚を得た。胚を洗浄し、培養条件に移すまで維持および移動培地（Ｈｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉｕｍ）（米国、ＢｉｏＬｉｆｅ、製品番号Ｃ１５Ｃ）を用いて維持した（最大１時間）。
【0347】
胚盤胞は以下の原料からも得ることができる。
－ 市販品
－ Ｉｎ ｖｉｔｒｏの受精（ＩＶＦ）ｉｎ ｖｉｔｒｏの卵母細胞の媒精
－ ウマ細胞の核移植（ＮＴ）
－ 単性生殖
－ 市販品
－ Ｉｎ ｖｉｔｒｏの受精（ＩＶＦ）ｉｎ ｖｉｔｒｏの卵母細胞の媒精
－ ウマ細胞の核移植（ＮＴ）
－ 単性生殖
【0348】
ウマＰＳＣ株の導出：
タイロードの酸性溶液（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で透明帯を消化した後、露出した胚盤胞をプレーティングした。プレーティング方法には２つの可能性がある。（ｉ）有糸分裂不活性マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）または有糸分裂不活性包皮線維芽細胞等のフィーダー層、（ｉｉ）適切なマトリックス（マトリゲル（商標）マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、市販の細胞マトリックス）。２７ｇ針、または引き伸ばしたパスツールピペット、または一滴の適切なマトリックスによる胚の被覆、または胚が自発的に表面に付着するまで胚を放置することで、胚を表面に付着させた。付着した胚盤胞を、大きなシストが発生するまで全胚としてＭＥＦ上で受精後８～２１日間（例：ＨＲＳ１の特定の胚は、図８のＢに示すように媒精後１６日）培養した。ＭＥＦまたはマトリックスの品質故に必要であれば、２７ゲージの注射針を用いて、僅かな周辺の線維芽細胞を残しながら、胚全体を新しいＭＥＦ被覆プレートに移す。胚がシストを発生したら、盤様構造をそこから単離し、新鮮なＭＥＦまたはマトリックス被覆プレートに個別にプレーティングした。幹細胞形態を有する細胞（大きな核を有する小さな細胞）を機械的に継代した。数継代（３～６継代）後、均一な培養が達成されたら、１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて細胞を５～１０日毎に定期的に継代する。
タイロードの酸性溶液（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で透明帯を消化した後、露出した胚盤胞をプレーティングした。プレーティング方法には２つの可能性がある。（ｉ）有糸分裂不活性マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）または有糸分裂不活性包皮線維芽細胞等のフィーダー層、（ｉｉ）適切なマトリックス（マトリゲル（商標）マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、市販の細胞マトリックス）。２７ｇ針、または引き伸ばしたパスツールピペット、または一滴の適切なマトリックスによる胚の被覆、または胚が自発的に表面に付着するまで胚を放置することで、胚を表面に付着させた。付着した胚盤胞を、大きなシストが発生するまで全胚としてＭＥＦ上で受精後８～２１日間（例：ＨＲＳ１の特定の胚は、図８のＢに示すように媒精後１６日）培養した。ＭＥＦまたはマトリックスの品質故に必要であれば、２７ゲージの注射針を用いて、僅かな周辺の線維芽細胞を残しながら、胚全体を新しいＭＥＦ被覆プレートに移す。胚がシストを発生したら、盤様構造をそこから単離し、新鮮なＭＥＦまたはマトリックス被覆プレートに個別にプレーティングした。幹細胞形態を有する細胞（大きな核を有する小さな細胞）を機械的に継代した。数継代（３～６継代）後、均一な培養が達成されたら、１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて細胞を５～１０日毎に定期的に継代する。
【0349】
培養培地：
上述した培地Ｘ。
上述した培地Ｘ。
【0350】
ＥＢの形成：
胚様体（ＥＢ）の形成のために、４穴プレート中の４つのコンフルエントなウェルの内の２つを使用した。コンフルエントな状態なるように分割することなく細胞を１４日間放置し、ＥＢを自発的に形成させた。いくつかは培養表面に付着したままであり、いくつかは浮遊ＥＢであった（図３のＡ～Ｂ）。ＥＢは培地Ｘを用いて増殖させた。
胚様体（ＥＢ）の形成のために、４穴プレート中の４つのコンフルエントなウェルの内の２つを使用した。コンフルエントな状態なるように分割することなく細胞を１４日間放置し、ＥＢを自発的に形成させた。いくつかは培養表面に付着したままであり、いくつかは浮遊ＥＢであった（図３のＡ～Ｂ）。ＥＢは培地Ｘを用いて増殖させた。
【0351】
免疫染色：
室温で細胞を固定し、一次抗体に暴露した。次に細胞を二次抗体とインキュベートした。下記表１に反応条件および抗体をまとめた。
室温で細胞を固定し、一次抗体に暴露した。次に細胞を二次抗体とインキュベートした。下記表１に反応条件および抗体をまとめた。
【0352】
【表1】
【0353】
表１． 免疫染色条件、使用した抗体、および抗体によって同定される抗原を提供する。抗原の陽性発現を示す細胞の特徴も提供する。例えば、ＯＣＴ４は、未分化多能性幹細胞マーカーである。「宿主血清」は、抗体を製造した宿主動物と同じ種に由来する血清である。「ＮＡ」は、該当しない。
【0354】
脂肪細胞への自発的分化： ウシＰＳＣを（デキサメタゾンを含まない）「培地Ｘ」で、１４～２１日間にわたり細胞継代無しで培養し、その後、オイルレッド染色による脂質滴の評価のためにパラホルムアルデヒドで固定した。
【0355】
オイルレッド染色:
細胞を４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒ（ＰＦＡ）によって、２０分間室温（ＲＴ）で固定した。ＰＦＡをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い流した後、細胞をオイルレッドＯ溶液（Ｓｉｇｍａ）とＲＴで１０分インキュベートした。培養物を水で洗浄し、位相差顕微鏡で可視化した。
細胞を４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒ（ＰＦＡ）によって、２０分間室温（ＲＴ）で固定した。ＰＦＡをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い流した後、細胞をオイルレッドＯ溶液（Ｓｉｇｍａ）とＲＴで１０分インキュベートした。培養物を水で洗浄し、位相差顕微鏡で可視化した。
【0356】
実施例１
伸長胚盤胞からのウシ多能性幹細胞の導出
実験結果
上記「一般的材料および実験方法」に記載した導出方法を使用し、本発明者は、４種のウシ細胞株（ＢＶＮ１、ＢＶＮ２、ＢＶＮ５およびＢＶＮ６）の導出を示した。
伸長胚盤胞からのウシ多能性幹細胞の導出
実験結果
上記「一般的材料および実験方法」に記載した導出方法を使用し、本発明者は、４種のウシ細胞株（ＢＶＮ１、ＢＶＮ２、ＢＶＮ５およびＢＶＮ６）の導出を示した。
【0357】
ウシ多能性幹細胞株ＢＶＮ１の導出：
本発明者は受精後７日の２種のウシ胚、即ち、不完全偽芽細胞である１種と、正常胚盤胞の１種を使用した。ＭＥＦ上のｉｎ ｖｉｔｒｏで正常ウシ胚が受精後１３日目まで増殖したが、不完全な胚はｉｎ ｖｉｔｒｏでは発生を継続しなかった。よって、実験は正常胚盤胞で継続した。
本発明者は受精後７日の２種のウシ胚、即ち、不完全偽芽細胞である１種と、正常胚盤胞の１種を使用した。ＭＥＦ上のｉｎ ｖｉｔｒｏで正常ウシ胚が受精後１３日目まで増殖したが、不完全な胚はｉｎ ｖｉｔｒｏでは発生を継続しなかった。よって、実験は正常胚盤胞で継続した。
【0358】
伸長胚盤胞からのウシ多能性幹細胞株の導出： 受精後７日のウシ胚を培地Ｘの存在下、ＭＥＦ上で受精後１３日まで（即ち、ＭＥＦ上、ｉｎ ｖｉｔｒｏで６日間）全胚として、大きなシストが発生するまで培養した（図１のＡ～Ｃ）。
【0359】
胚がシストを発生した後、盤様構造を胚から単離し、新鮮ＭＥＦまたはマトリックス被覆プレート上に個別にプレーティングした（図１のＡ～Ｃ）。継代のとき、２つのコロニーをＩＬ６ＲＩＬ６キメラ培地およびマトリゲル（商標）に移した。幹細胞形態（大きな核を有する小さな細胞）を有する細胞を機械的に継代した。数継代（４～６継代）後、培養ウシ多能性幹細胞に富んだ集団が達成されたら、５～１０日毎に、１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて細胞を定期的に継代した。
【0360】
「ｂＰＳＣ」と命名された、得られたウシ多能性幹細胞は、伸長胚盤胞培養技術によって得られた最初のウシ多能性幹細胞であり、最初の系統を「ＢＶＮ１」とした。
【0361】
ウシ多能性幹細胞はヒトＥＳＣ系と類似した形態を示す： 図１のＡ～Ｃに示されるように、光学顕微鏡はｂＰＳＣの形成したコロニーがｈＥＳＣ系統と類似した形態、例えば、細胞間に空隙のある丸いコロニーと、比較的大きな核と明確な核正体、を提示することを示した。
【0362】
ウシ多能性幹細胞は種々の培養培地で、フィーダー細胞層上に維持可能である： 図２のＡ～Ｃに示されるように、ｂＰＳＣは異なる培養条件で培養され、ｂＰＳＣコロニーの形態を維持した。例えば、ｂＰＳＣは、血清を含む培養培地（「培地Ｘ」）の存在下、ＭＥＦ等のフィーダー細胞上で培養された（図２のＡ）。
【0363】
加えて、ｂＰＳＣは、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ培養培地等の無血清培養培地の存在下でも、ＭＥＦ上での培養に成功した（図２のＣ）。
【0364】
【0365】
ウシ多能性幹細胞は、フィーダー細胞無し培養システムにおいて、無血清培養培地で維持することができる： 無血清培養培地（ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ）の存在下、マトリゲル（商標）マトリックス上で培養したとき、フィーダー細胞無しの培養条件におけるｂＰＳＣの培養に成功した。
【0366】
継代しながらＷｎｔ３ａ含有培地またはＩＬ６ＲＩＬ６キメラ培地のいずれかで培養したウシＰＳＣは、未分化状態のままであったことに留意されたい（図２のＡ～Ｃ、およびデータは示さない）。
【0367】
伸長胚盤胞由来のウシ多能性幹細胞は、多能性細胞表現型を示す： 胚性多能性マーカーＯｃｔ４によるｂＰＳＣの免疫染色は、陽性染色を示した（図３のＡ～Ｂ）。
【0368】
伸長胚盤胞由来のウシ多能性幹細胞は、胚様体へ分化可能である： 培地Ｘ（２０％ｖ／ｖの限定胎仔ウシ血清を添加した８０％ｖ／ｖのＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＫＯ－ＤＭＥＭからなるもの）の存在下、４穴プレートにｂＰＳＣを移した。コンフルエントな培養になるまで、細胞を分割することなく１４日間放置し、ＥＢを自発的に形成させた。いくつかは培養表面に付着したままであり、いくつかは浮遊ＥＢであった（図４のＡ～Ｃ）。
【0369】
ウシ多能性幹細胞から作製した胚様体は、全３種の胚性生殖層を代表する分化した細胞を含む： 分化マーカーの免疫染色は、全３種の胚性生殖層を代表する細胞へと分化する能力を明らかにした（図５のＡ～Ｄ）。
【0370】
ウシ多能性幹細胞は、脂肪細胞へと自発的に分化可能である： 培地ＸまたはＩＬ６ＲＩＬ６キメラ培地の存在下、ＭＥＦフィーダー層上でウシＰＳＣを培養したところ、バックグラウンドの分化として、または継代無しで１４日以上放置したときに、脂肪細胞に自発的に分化した。オイルレッド染色による油滴の染色によって自発的分化は認識された。脂肪生成系統への強制的な誘導が行われなかった点に留意されたい。自発的分化に使用した培地は、幹細胞の脂肪生成系統への誘導剤として知られるデキサメタゾンを含んでいなかった。
【0371】
本願に記載したウシＰＳＣとは非常に対照的に、国際公開第２００６／０４０７６３号に記載のヒト遅延胚盤胞細胞は、ＥＢ形成または脂肪細胞分化培地による誘導と、ＭＥＦフィーダー層の除去なしに脂肪細胞へと自発的に分化することは全くなかった。図６のＡ～Ｂに示されるように、ウシ多能性細胞の脂肪細胞への自発的分化は、オイルレッド染色で染色される細胞内の脂質液滴によって明らかとなった。これらの結果は、化学物質またはホルモンによる誘導の使用無しにｂＰＳＣが脂肪細胞に自発的に分化する能力を明らかにした。
【0372】
遅延ウシ胚盤胞株ＢＶＮ６からのウシ多能性幹細胞の導出：
媒精後８日のウシ胚盤胞を入手し、全胚をフィーダー細胞（マウス胚性線維芽細胞）上に媒精後１６日までプレーティングした（図７のＡ～Ｂ）。図７のＢに示されるように、顕著なシストが媒精後１６日で発生し、その後、盤様構造を胚から単離して個別に新鮮ＭＥＦ上にさらにプレーティングした。ウシ遅延胚盤胞細胞株の導出のために、細胞を培養培地（培地Ｘ）でさらに培養した。
媒精後８日のウシ胚盤胞を入手し、全胚をフィーダー細胞（マウス胚性線維芽細胞）上に媒精後１６日までプレーティングした（図７のＡ～Ｂ）。図７のＢに示されるように、顕著なシストが媒精後１６日で発生し、その後、盤様構造を胚から単離して個別に新鮮ＭＥＦ上にさらにプレーティングした。ウシ遅延胚盤胞細胞株の導出のために、細胞を培養培地（培地Ｘ）でさらに培養した。
【0373】
ＢＶＮ１株、ＢＶＮ２株およびＢＶＮ５株のウシ多能性幹細胞（ｂＰＳＣ）コロニーの形態学的特徴付け： 図９のＡ～Ｄに示されるように、ｂＰＳＣ株ＢＶＮ１、ＢＶＮ２およびＢＶＮ５の細胞は、培地Ｘなどの培養培地での培養（例：培地Ｘで１５継代まで）において、典型的な多能性幹細胞の形態であるそれぞれが大きな核を有する小さな細胞を、種々の継代数（８、９および３０継代）で維持した。長期の培養および継代にはＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む培養培地を使用した。
【0374】
遅延ウシ胚盤胞由来のウシ細胞株ＢＶＮ５における多能性マーカーＴＲＡ１－６０およびＴＲＡ１－８１の発現： ＴＲＡ１－６０（赤色）およびＴＲＡ１－８１（緑色）の陽性染色によって立証されるように、ｂＰＳＣのＢＶＮ５株は培地Ｘの存在下で少なくとも８継代培養した際に未分化且つ多能性状態を維持したことを、図１０のＡ～Ｄは示す。
【0375】
実施例２
伸長胚盤胞からのウマ多能性幹細胞の導出
実験結果
上記「一般的材料および実験方法」に記載した導出方法を使用し、本発明者は、１種のウマ細胞株（ＨＲＳ１）の導出を示した。
伸長胚盤胞からのウマ多能性幹細胞の導出
実験結果
上記「一般的材料および実験方法」に記載した導出方法を使用し、本発明者は、１種のウマ細胞株（ＨＲＳ１）の導出を示した。
【0376】
ウマ遅延胚盤胞細胞株の導出： 本発明者は受精後８日のウマ胚を使用した。図８のＡに示されるように、顕著な内部細胞塊（ＩＣＭ、白い矢印）を有するウマ伸長胚盤胞が媒精後８日に観察された。全ウマ胚をマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）と共にプレーティングし、顕著なシストが発生した媒精後１６日目まで、培地Ｘの存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した（図８のＢ）。図８のＢおよびＣは、媒精後１６日目の同じ胚を異なる顕微鏡の焦点で示す。媒精後１６日目には盤様構造を胚から単離し、個別に、培地Ｘを用いて新鮮ＭＥＦ上にさらにプレーティングした。図８のＤに示されるように、導出した細胞は、大きな核を有する小さな細胞によって特徴づけられる多能性幹細胞のコロニーを形成した。
【0377】
本発明をその特定の実施形態との関連で記載してきたが、多数の変更、修正および変化が当業者には明らかであろう。従って、そのような変更、修正および変化の全ては、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に含まれることを意図するものである。
【0378】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願のそれぞれが具体的および個別に参照により本明細書に組み込まれる場合と同程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、本明細書中の任意の参考文献の引用または特定は、それらの参考文献が本発明の先行技術として使用できることの容認として解釈されるべきではない。また、各節の表題が使用される範囲において、必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。さらに本願の基礎出願に係る書類も、本参照をもってその全体を本明細書に援用する完全に組み込まれたものとする。
【0379】
参考文献
（さらなる参考文献は本文中に引用している。）
Bogliotti YS, Wu J, Vilarino M, Okamur et al. Efficient derivation of stable primed pluripotent embryonic stem cells from bovine blastocysts. PNAS, 115 (9): 2090-2095, 2018.
Edwards R.G., Surani M.A.H. (1978). The primate blastocyst and its environment. Upsala Journal of Medical Sciences 22: 39-50.
Gardner RL. Investigation of cell lineage and differentiation in the extraembryonic endoderm of the mouse embryo. J. Embryological Experiment and Morphology 1982;
Mitalipova M, Beyham Z, and First N. Pluripotency of Bovine Embryonic Cell Line Derived from Precompacting Embryos Cloning, 3 (2):59-, 2001.
Reubinoff, B.E., Pera, M.F., Fong, C. Trounson, A., Bongso, A. (2000). Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404.
Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147 [erratum in Science (1998) 282, 1827].
（さらなる参考文献は本文中に引用している。）
Bogliotti YS, Wu J, Vilarino M, Okamur et al. Efficient derivation of stable primed pluripotent embryonic stem cells from bovine blastocysts. PNAS, 115 (9): 2090-2095, 2018.
Edwards R.G., Surani M.A.H. (1978). The primate blastocyst and its environment. Upsala Journal of Medical Sciences 22: 39-50.
Gardner RL. Investigation of cell lineage and differentiation in the extraembryonic endoderm of the mouse embryo. J. Embryological Experiment and Morphology 1982;
Mitalipova M, Beyham Z, and First N. Pluripotency of Bovine Embryonic Cell Line Derived from Precompacting Embryos Cloning, 3 (2):59-, 2001.
Reubinoff, B.E., Pera, M.F., Fong, C. Trounson, A., Bongso, A. (2000). Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404.
Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147 [erratum in Science (1998) 282, 1827].
【配列表フリーテキスト】
【0380】
配列番号４： ＩＬ６ＲＩＬ６キメラのアミノ酸配列
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】