特表 2023-537600 がんを処置するための複製ストレス経路剤組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-04

(54)【発明の名称】がんを処置するための複製ストレス経路剤組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20230828BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230828BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230828BHJP

   A61K 31/7068 20060101ALI20230828BHJP

   A61K 31/17 20060101ALI20230828BHJP

   A61K 31/4545 20060101ALI20230828BHJP

   A61K 31/497 20060101ALI20230828BHJP

   A61K 31/522 20060101ALI20230828BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20230828BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20230828BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230828BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20230828BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K31/7068

A61K31/17

A61K31/4545

A61K31/497

A61K31/522

A61K31/5377

A61K31/506

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K31/517

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023510340

(86)(22)【出願日】2021-08-11

(85)【翻訳文提出日】2023-04-10

(86)【国際出願番号】 US2021045556

(87)【国際公開番号】W WO2022035970

(87)【国際公開日】2022-02-17

(31)【優先権主張番号】63/064,555

(32)【優先日】2020-08-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/168,120

(32)【優先日】2021-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523048158

【氏名又は名称】バウンドレス バイオ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ハッシグ，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ハンセン，リャン

(72)【発明者】

【氏名】ミルティノヴィッチ，スネジャナ

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアンセン，ジェイソン

(72)【発明者】

【氏名】ホーンビー，ザカリー

(72)【発明者】

【氏名】チョードリー，スディール

(72)【発明者】

【氏名】セレステ，アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】ターナー，クリステン

(72)【発明者】

【氏名】ウィルキンソン，ディープティ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C084AA20

4C084NA05

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE03

4C085GG01

4C086AA01

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4C086BC46

4C086BC48

4C086BC73

4C086CB05

4C086CB06

4C086EA17

4C086MA02

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4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206HA26

4C206MA02

4C206MA04

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZB26

4C206ZC75

(57)【要約】

【解決手段】
本明細書に提供されるのは、対象の、染色体外ＤＮＡ陽性（ｅｃＤＮＡ陽性）であるかまたは治療耐性があるがんを処置する方法であり、この方法は、治療上有効な量の複製ストレス（ＲＳ）経路剤を単独または標的治療剤と組み合わせて対象に投与することを含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の腫瘍または腫瘍細胞を処置する方法であって、前記方法は、
前記腫瘍または前記腫瘍細胞における複製ストレスを誘導するのに十分な量の複製ストレス経路薬剤（ＲＳＰＡ）を投与すること、および、
がん標的治療剤を投与すること、
を含み、
前記腫瘍または前記腫瘍細胞にｅｃＤＮＡシグネチャを有しており、
前記腫瘍の成長またはサイズ、あるいは、前記腫瘍細胞の成長または数が減少する、方法。

【請求項2】

前記ｅｃＤＮＡシグネチャは、遺伝子増幅、ｐ５３の機能喪失型変異、微小サテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）が存在しないこと、低レベルのＰＤ－Ｌ１発現、低レベルの腫瘍燃焼シグネチャ（ＴＩＳ）、低レベルの腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、アレルの置換、挿入、もしくは欠失（インデル）の頻度の増加、または、これらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記遺伝子増幅は、がん遺伝子の増幅、薬剤耐性遺伝子の増幅、治療の標的遺伝子の増幅、またはチェックポイント阻害遺伝子の増幅を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記がん標的治療剤は、標的遺伝子のタンパク質産物の活性を対象としており、ならびに、前記がん標的治療剤および前記ＲＳＰＡによる処置は、前記腫瘍または前記腫瘍細胞における標的遺伝子の増幅または発現を減少させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記がん標的治療剤および前記ＲＳＰＡによる処置は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約１ヵ月、少なくとも約６週間、少なくとも約２ヵ月、少なくとも約４ヵ月、または少なくとも約６か月間、前記腫瘍または前記腫瘍細胞における前記標的遺伝子の増幅または発現を減少させる、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記がん標的治療剤は、前記ＲＳＰＡの前に投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞は、前記がん標的治療剤の投与後に前記ｅｃＤＮＡシグネチャを発現させる、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記がん標的治療剤は、前記ＲＳＰＡと同時に投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞は、治療前に前記ｅｃＤＮＡシグネチャを発現させる、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞におけるｅｃＤＮＡの増加を防止する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記がん標的治療剤は、前記がん遺伝子のタンパク質産物を標的とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記がん遺伝子は、点突然変異、挿入、欠失、融合、または、それらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記がん標的治療剤は、ＡＢＣＢ１、ＡＫＴ、ＡＬＫ、ＡＲ、ＢＣＬ－２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＢ２、ＦＡＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＧＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＣＬ－１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ／Ｂ、ＰＩＫ３Ｃδ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１からなる群から選択される遺伝子を標的とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞は、第１の遺伝子またはその一部の増幅を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項15】

前記第１の遺伝子は、がん遺伝子または薬剤耐性遺伝子である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記増幅がｅｃＤＮＡ上に存在する、請求項１４または１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第１の遺伝子は、ＡＢＣＢ１、ＡＫＴ、ＡＬＫ、ＡＲ、ＢＣＬ－２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＢ２、ＡＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＧＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＣＬ－１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ／Ｂ、 ＰＩＫ３Ｃδ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１からなる群から選択される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記がん標的治療剤は、前記第１の遺伝子を対象とする、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記対象は、以前に前記がん標的治療剤による処置を受けたことがない、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞は、以前に前記がん標的治療剤による処置を受けていない、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞における前記ｅｃＤＮＡの増加を防止する、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞は、前記がん標的治療剤および前記ＲＳＰＡによる処置の前に、従来の治療剤に対し耐性を有しているか、または、有していない、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞は、以前に前記従来の治療剤による処置を受けていない、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記対象は、以前に前記従来の治療剤による処置を受けていない、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記がん標的治療剤は、前記標的遺伝子のタンパク質産物の活性を対象とし、前記がん標的治療剤、および前記ＲＳＰＡによる処置は、前記腫瘍または前記腫瘍細胞における前記標的遺伝子の増幅または発現を減少させる、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記標的遺伝子は、がん遺伝子、薬剤耐性遺伝子、治療標的遺伝子、またはチェックポイント阻害遺伝子である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記標的遺伝子は、ＡＢＣＢ１、 ＡＫＴ、 ＡＬＫ、 ＡＲ、 ＢＣＬ－２、 ＢＣＲ－ＡＢＬ、 ＢＲＡＦ、 ＣＤＫ４、 ＣＤＫ６、 ｃ－ＭＥＴ、 ＥＧＦＲ、 ＥＲ、 ＥＲＢＢ３、 ＥＲＲＢ２、 ＡＫ、 ＦＧＦＲ１、 ＦＧＦＲ２、 ＦＧＦＲ３、 ＦＧＦＲ４、 ＦＬＴ３、 ＧＲ、 ＨＲＡＳ、 ＩＧＦ１Ｒ、 ＫＩＴ、 ＫＲＡＳ、 ＭＣＬ－１、 ＭＤＭ２、 ＭＤＭ４、 ＭＴＯＲ、 ＭＹＣ、 ＭＹＣＬ、 ＭＹＣＮ、 ＮＲＡＳ、 ＮＲＧ１、 ＮＴＲＫ１、 ＮＴＲＫ２、 ＮＴＲＫ３、 ＰＤＧＦＲ、 ＰＩＫ３ＣＡ／Ｂ、 ＰＩＫ３Ｃδ、 ＲＥＴ、およびＲＯＳ１からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ｅｃＤＮＡシグネチャは、前記腫瘍または前記腫瘍細胞の処置の開始前に把握される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ｅｃＤＮＡシグネチャは、腫瘍または腫瘍細胞の処置の開始後に把握される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＲＳＰＡが欠如した状態での前記がん標的治療剤による処置と比較して、他覚的奏効率を改善し、および／または、処置応答の期間を延ばす、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ＲＳＰＡが欠如した状態での前記がん標的治療剤による処置と比較して、無増悪生存期間の期間を延ばす、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

ｅｃＤＮＡに関連する腫瘍または腫瘍細胞を処置する方法であって、
ｅｃＤＮＡを有する腫瘍または腫瘍細胞を有していると特定された対象にＲＳＰＡおよびがん標的治療剤を投与すること
を含み、
腫瘍の成長またはサイズ、あるいは腫瘍細胞の成長または数が減少する、方法。

【請求項33】

前記対象の腫瘍または前記腫瘍細胞は、ｅｃＤＮＡシグネチャを有していると特定される、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ｅｃＤＮＡシグネチャは、遺伝子増幅、Ｐ５３の機能喪失変異型、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）の欠如、低レベルのＰＤ－Ｌ１発現、 低レベルの腫瘍炎症シグネチャ（ＴＩＳ）、 低レベルの腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、アレルの置換、挿入、もしくは欠失（インデル）の頻度の増加、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記遺伝子増幅は、がん遺伝子、薬剤耐性遺伝子、治療標的遺伝子、またはチェックポイント阻害遺伝子の増幅を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞には、細胞中のｅｃＤＮＡを画像化（ｉｍａｇｉｎｇ）すること、がん遺伝子結合剤によるｅｃＤＮＡを検出すること、またはＤＮＡシーケンシングによって、前記ｅｃＤＮＡを有していると特定される、請求項３２に記載の方法。

【請求項37】

前記ｅｃＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡにおいて特定される、請求項３２に記載の方法。

【請求項38】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞は、固形腫瘍によって構成される、請求項３２に記載の方法。

【請求項39】

前記固形腫瘍中のｅｃＤＮＡの存在は、処置の結果、減少するか、または消失する、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ｅｃＤＮＡのレベルは、処置前のｅｃＤＮＡレベルと比較して、処置後に前記固形腫瘍中で低下する、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記固形腫瘍中のがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルは、処置前の前記固形腫瘍中の前記がん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルと比較して、処置後に低下する、請求項３８に記載の方法。

【請求項42】

前記腫瘍または前記腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記循環腫瘍細胞中のｅｃＤＮＡの存在は、処置の結果、減少するか、または消失する、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記循環腫瘍細胞における前記ｅｃＤＮＡレベルは、処置前のｅｃＤＮＡのレベルと比較して、処置後に低下させられる、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

前記固形腫瘍におけるがん遺伝子増幅のレベル、および／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルは、処置前の前記固形腫瘍中のがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルと比較して、処置後に低下する、請求項４２に記載の方法。

【請求項46】

前記ｅｃＤＮＡの存在またはレベルは、前記循環腫瘍ＤＮＡ中で特定される、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記ＲＳＰＡは、ＲＮＲ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、ＷＥＥ１阻害剤、およびＰＡＲＧ阻害剤からなる群から選択される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、トリアピン、５－クロロ－２－（ｎ－（（１Ｓ、２Ｒ）－２－（６－フルオロ－２、３－ジメチルフェニル）－１－（５－オキソ－４、５－ジヒドロ－１、３、４－オキサジアゾール－２－イル）プロピル）スルファモイル）ベンズアミド、クロファラビン、フルダラビン、フルオラビン、モテキサフィンガドリニウム、クラドリビン、テザシタビン、およびＣＯＨ２９（Ｎ－［４－（３、４－ジヒドロキシフェニル）－５－フェニル－１、３－チアゾール－２－イル］－３、４－ジヒドロキシベンズアミドからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記ＣＨＫ１阻害剤は、ＧＤＣ－０５７５、プレキサセルチブ、ＬＹ－２８８００７０、ＳＲＡ７３７、ＸＣＣＳ－６０５Ｂ、ラブセルチブ（ＬＹ－２６０３６１８）、ＳＣＨ－９００７７６、ＲＧ－７６０２、ＡＺＤ－７７６２、ＰＦ－４７７７３６、およびＢＥＢＴ－２６０からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。

【請求項50】

前記ＷＥＥ１阻害剤は、ＡＺＤ１７７５（ＭＫ１７７５）、ＺＮ－ｃ３、Ｄｅｂｉｏ ０１２３、ＩＭＰ７０６８、ＳＤＲ－７９９５、ＳＤＲ－７７７８、ＮＵＶ－５６９、ＰＤ０１６６２８５、ＰＤ０４０７８２４、ＳＣ－０１９１、ＤＣ－８５９／Ａ、ボスチニブ、およびＢｏｓ－Ｉからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。

【請求項51】

前記ＡＴＲ阻害剤は、ＲＰ－３５００、Ｍ－６６２０、ｂｅｒｚｏｓｅｒｔｉｂ（Ｍ－６６２０、ＶＸ－９７０； ＶＥ－８２２）、ＡＺＺ－６７３８、ＡＺ－２０、Ｍ－４３４４（ＶＸ－８０３）、ＢＡＹ－１８９５３４４、Ｍ－１７７４、ＩＭＰ－９０６４、ｎＬｓ－ＢＧ－１２９、ＳＣ－０２４５、ＢＫＴ－３００、ＡＲＴ－０３８０、ＡＴＲＮ－１１９、ＡＴＲＮ－２１２、ＮＵ－６０２７からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。

【請求項52】

前記がん標的治療剤は、アベマシクリブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アレクチニブ、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＭＧ２３２、ＡＭＧ－５１０、アパチニブ、ＡＲＳ－３２４８、ＡＸＬ１７１７、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、セリチニブ、セツキシマブ、ＣＧＭ０９７、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダサチニブ、ドキソルビシン、ＤＳ－３０３２ｂ、エンコラフェニブ、エントレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ファムトラスツズマブデルクステカン、フィギツムマブ、ゲフィチニブ、ゴシポール、ＨＤＭ２０１、イダサヌトリン、イマチニブ、インフィグラチニブ、イニパリブ、ラパチニブ、ラロトレクチニブ、ＬＥＥ０１１、レンバチニブ、ＬＧＸ８１８、ロルラチニブ、ＭＥＫ１６２、ＭＫ－８２４２、ＳＣＨ－９００２４２、ＭＲＴＸ８４９、ナビトクラックス、ネシツムマブ、ニロチニブ、オバトクラックス、オラパリブ、ＯＳＩ－９０６、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パニツムマブ、ＰＤ－０３３２９９１、ペリソフィネ、ペルツズマブ、ＰＬ２２５Ｂ、レポトレクチニブ、リボシクリブ、ＲＯ５０４５３３７、サリノマイシン、サリラシブ、ＳＡＲ４０５８３８ ＭＩ－７７３０１、ソラフェニブ、ソトラシブ、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、チピファルニブ、チバニタブ、トファシチニブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、ツカチニブ、ＵＰＲ１３７６、ＶＡＬ－０８３、ベムラフェニブ、ビンタフォリデ、およびゾプタレリンドキソルビシンからなる群から選択される、請求項１～５１のいずれかに記載の方法。

【請求項53】

前記ＲＳＰＡは、ＲＮＡ阻害剤であり、前記ＲＳＰＡは、その単剤としての推奨使用量を下回る治療用量で投与される、前記１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＲＮＲ阻害剤はゲムシタビンである、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ＲＮＲ阻害剤はゲムシタビンでもヒドロキシウレアでもない、請求項５３に記載の方法。

【請求項56】

前記ＲＳＰＡはゲムシタビンではない、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記がん標的治療剤がＥＧＦＲ阻害剤である場合、前記ゲムシタビンではない、請求項５６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（相互参照）
本出願は、２０２０年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０６４、５５５号、および、２０２１年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１６８、１２０号の利益を主張し、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

がんは、がん患者の無増悪生存期間を延ばすための苛烈な苦労を伴う、がん治療に用いられる治療法に耐性を示すことが多い。ある場合には、治療耐性化したがんが、増幅されたがん遺伝子を時折含有している染色体外ＤＮＡに陽性であり、治療耐性に寄与することが観察される。

【発明の概要】

【0003】

一態様では、対象の腫瘍または腫瘍細胞を処置するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍または腫瘍細胞内の複製ストレスを誘導するのに十分な量の複製ストレス経路剤（ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ｐａｔｈｗａｙ ａｇｅｎｔ）（ＲＳＰＡ）を投与すること、および、がん標的治療剤を投与することを含み、腫瘍または腫瘍細胞は、ｅｃＤＮＡシグネチャを有しており、腫瘍の成長またはサイズ、あるいは、腫瘍細胞の成長または数が減少する。いくつかの実施形態では、ｅｃＤＮＡシグネチャは、遺伝子増幅、ｐ５３の機能喪失変異型（ｐ５３ ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）の欠如、低レベルのＰＤ－Ｌ１発現、低レベルの腫瘍炎症シグネチャ（ＴＩＳ）、低レベルの腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、アレルの置換、挿入もしくは欠失（インデル）の頻度の増加、および、これらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子増幅は、がん遺伝子、薬剤耐性遺伝子、治療標的遺伝子、またはチェックポイント阻害遺伝子の増幅を含む。いくつかの実施形態では、がん標的治療剤は、標的遺伝子のタンパク質産物の活性を対象としており、がん標的治療剤、およびＲＳＰＡを用いる治療は、腫瘍または腫瘍細胞内の標的遺伝子の増幅または発現を減少させる。いくつかの実施形態では、がん標的治療剤は、ＲＳＰＡの前に投与される。いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞は、がん標的治療剤が投与された後にｅｃＤＮＡシグネチャを生じさせる（ｄｅｖｅｌｏｐ）。いくつかの実施形態では、がん標的治療剤は、ＲＳＰＡと同時に投与される。いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞は、治療前に、ｅｃＤＮＡシグネチャを発現させる。いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍または腫瘍細胞内のｅｃＤＮＡの増加を防ぐ。いくつかの実施形態では、がん標的治療剤は、がん遺伝子のタンパク質産物を標的とする。いくつかの実施形態では、がん遺伝子は、点突然変異、挿入、欠失、融合、または、これらのあらゆる組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、がん標的治療剤は、ＡＢＣＢ１、ＡＫＴ、ＡＬＫ、ＡＲ、ＢＣＬ－２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＢ２、ＡＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＧＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＣＬ－１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ３Ｃδ、ＰＩＫ３ＣＡ／Ｂ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１からなる群から選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞は、第１の遺伝子、またはその一部の増幅を含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、がん遺伝子または薬剤耐性遺伝子である。いくつかの実施形態では、増幅は、ｅｃＤＮＡ上で見られる。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子は、ＡＢＣＢ１、ＡＫＴ、ＡＬＫ、ＡＲ、ＢＣＬ－２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＢ２、ＡＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＧＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＣＬ－１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ３Ｃδ、ＰＩＫ３ＣＡ／Ｂ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がん標的治療剤は、第１の遺伝子を対象としている。いくつかの実施形態では、対象は、以前にがん標的治療剤のよる処置を受けたことがない。いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞は、以前にがん標的治療剤による処置を受けていない。いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍または腫瘍細胞内のｅｃＤＮＡの増加を防止する。いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞は、がん標的治療剤およびＲＳＰＡを用いた治療の前の、従来の治療剤に耐性を有しているか、または有していない。いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞は、以前に、従来の治療剤による処置を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、以前に従来の治療剤による処置を受けている。いくつかの実施形態では、がん標的治療剤は、標的遺伝子のタンパク質産物の活性を対象としており、がん標的治療剤、およびＲＳＰＡを用いた治療は、腫瘍または腫瘍細胞内の標的遺伝子の増幅または発現を減少させる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、がん遺伝子、薬剤耐性遺伝子、治療標的遺伝子、またはチェックポイント阻害遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ＡＢＣＢ１、ＡＫＴ、ＡＬＫ、ＡＲ、ＢＣＬ－２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＢ２、ＡＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＧＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＣＬ－１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ３Ｃδ、ＰＩＫ３ＣＡ／Ｂ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｅｃＤＮＡシグネチャは、腫瘍または腫瘍細胞の治療を開始する前に、把握される。いくつかの実施形態では、ｅｃＤＮＡシグネチャは、腫瘍または腫瘍細胞の治療を始めた後に分かる。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＳＰＡが欠如した状態での、がん標的治療剤を用いる治療と比較して、奏効率を改善し、および／または、処置応答の期間を延ばす。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＳＰＡが欠如した状態での、がん標的治療剤を用いる治療と比較して、無増悪生存期間の期間を増やす。

【0004】

別の態様では、ｅｃＤＮＡが存在する腫瘍または腫瘍細胞を有すると特定される対象に、ＲＳＰＡおよびがん標的治療剤を投与することを含む、ｅｃＤＮＡを伴う腫瘍または腫瘍細胞を処置するための方法が提供され、治療の結果、腫瘍の成長またはサイズ、あるいは、腫瘍細胞の成長または数が減少する。いくつかの実施形態では、対象の腫瘍または腫瘍細胞は、ｅｃＤＮＡシグネチャを有していると特定される。いくつかの実施形態では、ｅｃＤＮＡシグネチャは、遺伝子増幅、Ｐ５３の機能喪失変異型、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）の欠如、低レベルのＰＤ－Ｌ１発現、低レベルの腫瘍炎症シグネチャ（ＴＩＳ）、低レベルの腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、アレルの置換、挿入、もしくは欠失（インデル）の頻度の増加、および、これらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子増幅は、がん遺伝子、薬剤耐性遺伝子、治療標的遺伝子あるいはチェックポイント阻害遺伝子の増幅を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞は、細胞内のｅｃＤＮＡを画像化（ｉｍａｇｉｎｇ）すること、がん遺伝子結合剤を用いてｅｃＤＮＡを検出すること、またはＤＮＡシーケンシングによって、ｅｃＤＮＡを有していると特定される。いくつかの実施形態では、ｅｃＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡにおいて特定される。

【0005】

本明細書に記載の方法の様々な様態において、いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞は、固形腫瘍によって構成される。いくつかの実施形態では、固形腫瘍に存在するｅｃＤＮＡは、処置の結果、減少されるか、または消失させられる。いくつかの実施形態では、ｅｃＤＮＡレベルは、処置前のｅｃＤＮＡレベルと比較して、処置後に固形腫瘍において低下させられる。いくつかの実施形態では、固形腫瘍におけるがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルは、処置の前に固形腫瘍におけるがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルと比較して、処置後に減少させられる。いくつかの実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、循環腫瘍細胞内に存在するｅｃＤＮＡは、処置の結果、減少されるか、または消失させられる。いくつかの実施形態では、ｅｃＤＮＡレベルは、処置前のｅｃＤＮＡレベルと比較して、処置後に循環腫瘍細胞において低下させられる。いくつかの実施形態では、固形腫瘍におけるがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルは、処置の前に固形腫瘍におけるがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルと比較して、処置後に低下させられる。いくつかの実施形態では、ｅｃＤＮＡの存在、あるいはレベルは、循環腫瘍ＤＮＡにおいて特定される。いくつかの実施形態では、ＲＳＰＡは、ＲＮＲ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、ＷＥＥ１阻害剤、およびＰＡＲＧ阻害剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、トリアピン、５－クロロ－２－（ｎ－（（１Ｓ、２Ｒ）－２－（６－フルオロ－２、３－ジメチルフェニル）－１－（５－オキソ－４、５－ジヒドロ－１、３、４－オキサジアゾール－２－イル）プロピル）スルファモイル）ベンズアミド、クロファラビン、フルオラビン、モテキサフィンガドリニウム、クラドリビン、テザシタビン、およびＣＯＨ２９（Ｎ－［４－（３、４－ジヒドロキシフェニル）－５－フェニル－１、３－チアゾール－２－イル］－３、４－ジヒドロキシベンズアミドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＨＫ１阻害剤は、ＧＤＣ－０５７５、プレキサセルチブ、ＬＹ－２８８００７０、ＳＲＡ７３７、ＸＣＣＳ－６０５Ｂ、ラブセルチブ（ＬＹ－２６０３６１８）、ＳＣＨ－９００７７６、ＲＧ－７６０２、ＡＺＤ－７７６２、ＰＦ－４７７７３６、およびＢＥＢＴ－２６０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、ＷＥＥ１阻害剤は、ＡＺＤ１７７５（ＭＫ１７７５）、ＺＮ－ｃ３、Ｄｅｂｉｏ ０１２３、ＩＭＰ７０６８、ＳＤＲ－７９９５、ＳＤＲ－７７７８、ＮＵＶ－５６９、ＰＤ０１６６２８５、ＰＤ０４０７８２４、ＳＣ－０１９１、ＤＣ－８５９／Ａ、ボスチニブおよびＢｏｓ－Ｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＴＲ阻害剤は、ＲＰ－３５００、Ｍ－６６２０、ベルゾセルチブ（ｂｅｒｚｏｓｅｒｔｉｂ）（Ｍ－６６２０、ＶＸ－９７０；ＶＥ－８２２）、ＡＺＺ－６７３８、ＡＺ－２０、Ｍ－４３４４（ＶＸ－８０３）、ＢＡＹ－１８９５３４４、Ｍ－１７７４、ＩＭＰ－９０６４、ｎＬｓ－ＢＧ－１２９、ＳＣ－０２４５、ＢＫＴ－３００、ＡＲＴ－０３８０、ＡＴＲＮ－１１９、ＡＴＲＮ－２１２、ＮＵ－６０２７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がん標的治療剤は、アベマシクリブ、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アレクチニブ、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＭＧ２３２、ＡＭＧ－５１０、アパチニブ、ＡＲＳ－３２４８、ＡＸＬ１７１７、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、セリチニブ、セツキシマブ、ＣＧＭ０９７、クリゾチニブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダサチニブ、ドキソルビシン、ＤＳ－３０３２ｂ、エンコラフェニブ、エントレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ファム－トラスツズマブデルクステカン、フィギツムマブ、ゲフィチニブ、ゴシポール、ＨＤＭ２０１、イダサヌトリン、イマチニブ、インフィグラチニブ、イニパリブ、ラパチニブ、ラロトレクチニブ、ＬＥＥ０１１、レンバチニブ、ＬＧＸ８１８、ロルラチニブ、ＭＥＫ１６２、ＭＫ－８２４２（ＳＣＨ－９００２４２）、ＭＲＴＸ８４９、ナビトクラックス、ネシツムマブ、ニロチニブ、オバトクラックス、オラパリブ、ＯＳＩ－９０６、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パニツムマブ、ＰＤ－０３３２９９１、ペリソフィネ、ペルツズマブ、ＰＬ２２５Ｂ、レポトレクチニブ、リボシクリブ、ＲＯ５０４５３３７、サリノマイシン、サリラシブ、ＳＡＲ４０５８３８（ＭＩ－７７３０１）、ソラフェニブ、ソトラシブ、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、チピファルニブ、チバニタブ（ｔｉｖａｎｉｔａｂ）、トファシチニブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、ツカチニブ、ＵＰＲ１３７６、ＶＡＬ－０８３、ベムラフェニブ、ベムラフェニブ、ヴィンタフォリデ、およびゾプタレリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＳＰＡは、ＲＮＡ阻害剤であり、ならびに、ＲＳＰＡは、単剤として推奨される使用量を下回る治療量で投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビンである。いくつかの実施形態では、ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビンでもヒドロキシウレアでもない。いくつかの実施形態では、ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビンではない。いくつかの実施形態では、ＲＳＰＡは、がん標的治療剤がＥＧＦＲ阻害剤である場合、ゲムシタビンではない。

【0006】

一態様では、治療を必要とする対象のがんを処置するための方法が提供される。ある場合には、方法は、治療上有効な量の複製ストレス（ＲＳ）経路阻害剤（さらに、本明細書では、複製ストレス経路剤、あるいはＲＳＰＡと呼ばれる）を対象に投与することを含み、がんは、染色体外ＤＮＡ陽性（ｅｃＤＮＡ陽性）であると把握されている。ある場合には、ＲＳ経路阻害剤は、ＲＮＲ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、Ｅ２Ｆ阻害剤、ＷＥＥ１阻害剤、ＰＡＲＧ阻害剤、またはＲＲＭ２阻害剤を含む。ある場合には、ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、トリアピン、または、５－クロロ－２－（ｎ－（（１Ｓ、２Ｒ）－２－（６－フルオロ－２、３－ジメチルフェニル）－１－（５－オキソ－４、５－ジヒドロ－１、３、４－オキサジアゾール－２－イル）プロピル）スルファモイル）ベンズアミドを含む。ある場合には、ＣＨＫ１阻害剤は、ＧＤＣ－０５７５、プレキサセルチブ、またはＳＲＡ７３７を含む。ある場合には、ｅｃＤＮＡ陽性のがんは、ｅｃＤＮＡ上の増幅されたがん遺伝子を含む。ある場合には、がん遺伝子は、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－Ｍｙｃ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢ２、ＦＧＦＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、および、ＮＲＡＳの１つ以上を含む。ある場合には、方法は、増幅されたがん遺伝子のタンパク質産物を阻害する標的治療剤を、治療上有効な量で対象に投与することをさらに含む。ある場合には、標的治療剤は、アベマシクリブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アレクチニブ、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＭＧ２３２、ＡＭＧ－５１０、アパチニブ、ＡＲＳ－３２４８、ＡＸＬ１７１７、ＡＺＤ－３７５９、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、セリチニブ、セツキシマブ、ＣＧＭ０９７、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダサチニブ、ＤＳ－３０３２ｂ、エンコラフェニブ、エントレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ファム－トラスツズマブデルクステカン、フィギツムマブ、ゲフィチニブ、ゴシポール、ＨＤＭ２０１、イダサヌトリン、イマチニブ、インフィグラチニブ（ｉｎｆｉｇｒａｔｉｎｉｂ）、イニパリブ、ラパチニブ、ラロトレクチニブ、ＬＥＥ０１１、レンバチニブ、ＬＧＸ８１８、ロルラチニブ、ＭＥＫ１６２、ＭＫ－８２４２ ＳＣＨ ９００２４２、ＭＲＴＸ８４９、ナビトクラックス、ネシツムマブ、ニロチニブ、オバトクラックス、オラパリブ、ＯＳＩ－９０６、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パニツムマブ、ＰＤ－０３３２９９１、ペリソフィネ、ペルツズマブ、ＰＬ２２５Ｂ、レポトレクチニブ、リボシクリブ、ＲＯ５０４５３３７、サリノマイシン、サリラシブ、ＳＡＲ４０５８３８ ＭＩ－７７３０１、ソラフェニブ、ソトラシブ、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、チピファルニブ、チバニタブ、トファシチニブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、ツカチニブ、ＵＰＲ１３７６、ＶＡＬ－０８３、ベムラフェニブ、ベムラフェニブ、ヴィンタフォリデ、またはゾプタレリンドキソルビシン。ある場合には、ＲＳ経路阻害剤および、標的治療剤は、併用して投与される。ある場合には、ＲＳ経路阻害剤および、標的治療剤は、別々に投与される。

【0007】

一態様では、対象の治療耐性がんを処置するための方法が提供される。ある場合には、方法は、治療上有効な量の（ａ）複製ストレス（ＲＳ）経路阻害剤および（ｂ）標的治療剤を対象に投与することを含む。ある場合には、ＲＳ経路阻害剤はＲＮＲ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、ＷＥＥ１阻害剤、Ｅ２Ｆ阻害剤、またはＲＲＭ２阻害剤を含む。ある場合には、ＲＮＲ阻害剤はゲムシタビン、ヒドロキシウレア、トリアピン、または５－クロロ－２－（ｎ－（（１Ｓ、２Ｒ）－２－（６－フルオロ－２、３－ジメチルフェニル）－１－（５－オキソ－４、５－ジヒドロ－１、３、４－オキサジアゾール－２－イル）プロピル）スルファモイル）ベンズアミドを含む。ある場合には、ＣＨＫ１阻害剤は、ＧＤＣ－０５７５、プレキサセルチブ、またはＳＲＡ７３７を含む。ある場合には、治療耐性がんは、ｅｃＤＮＡ陽性である。ある場合にはｅｃＤＮＡ陽性のがんは、ｅｃＤＮＡ上の増幅されたがん遺伝子を含む。ある場合には、増幅されたがん遺伝子は、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－Ｍｙｃ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢ２、ＦＧＦＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、およびＮＲＡＳの１つ以上を含む。ある場合には、方法は、増幅されたがん遺伝子のタンパク質産物を阻害する標的治療剤を、治療上有効な量で対象に投与することをさらに含む。ある場合には、標的治療剤は、アベマシクリブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アレクチニブ、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＭＧ２３２、ＡＭＧ－５１０、アパチニブ、ＡＲＳ－３２４８、ＡＸＬ１７１７、ＡＺＤ－３７５９、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、セリチニブ、セツキシマブ、ＣＧＭ０９７、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダサチニブ、ＤＳ－３０３２ｂ、エンコラフェニブ、エントレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ファム－トラスツズマブデルクステカン、フィギツムマブ、ゲフィチニブ、ゴシポール、ＨＤＭ２０１、イダサヌトリン、イマチニブ、インフィグラチニブ、イニパリブ、ラパチニブ、ラロトレクチニブ、ＬＥＥ０１１、レンバチニブ、ＬＧＸ８１８、ロルラチニブ、ＭＥＫ１６２、ＭＫ－８２４２ ＳＣＨ ９００２４２、ＭＲＴＸ８４９、ナビトクラックス、ネシツムマブ、ニロチニブ、オバトクラックス、オラパリブ、ＯＳＩ－９０６、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パニツムマブ、ＰＤ－０３３２９９１、ペリソフィネ、ペルツズマブ、ＰＬ２２５Ｂ、レポトレクチニブ、リボシクリブ、ＲＯ５０４５３３７、サリノマイシン、サリラシブ、ＳＡＲ４０５８３８ ＭＩ－７７３０１、ソラフェニブ、ソトラシブ、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、チピファルニブ、チバニタブ、トファシチニブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、ツカチニブ、ＵＰＲ１３７６、ＶＡＬ－０８３、ベムラフェニブ、ベムラフェニブ、ヴィンタフォリデ、またはゾプタレリンドキソルビシンを含む。ある場合には、ＲＳ経路阻害剤および、標的治療剤は、併用して投与される。ある場合には、ＲＳ経路阻害剤および、標的治療剤は、別々に投与される。

【0008】

一態様では、複製ストレス（ＲＳ）経路阻害剤および標的治療剤を含む組成物が提供される。ある場合には、ＲＳ経路阻害剤はＲＮＲ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、ＷＥＥ１阻害剤、Ｅ２Ｆ阻害剤またはＲＲＭ２阻害剤を含む。ある場合には、ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、トリアピン、または５－クロロ－２－（ｎ－（（１Ｓ、２Ｒ）－２－（６－フルオロ－２、３－ジメチルフェニル）－１－（５－オキソ－４、５－ジヒドロ－１、３、４－オキサジアゾール－２－イル）プロピル）スルファモイル）ベンズアミドを含む。ある場合には、ＣＨＫ１阻害剤は、ＧＤＣ－０５７５、プレキサセルチブ、またはＳＲＡ７３７を含む。ある場合には、標的治療剤は、がん遺伝子のタンパク質産物を標的とする。ある場合には、がん遺伝子はＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－Ｍｙｃ ＥＧＦＲ、ＥＲＢ２、ＦＧＦＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＭＥＴ、またはＮＲＡＳを含む。ある場合には、標的治療剤はアベマシクリブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アレクチニブ、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＭＧ２３２、ＡＭＧ－５１０、アパチニブ、ＡＲＳ－３２４８、ＡＸＬ１７１７、ＡＺＤ－３７５９、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、セリチニブ、セツキシマブ、ＣＧＭ０９７、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダサチニブ、ＤＳ－３０３２ｂ、エンコラフェニブ、エントレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ファム－トラスツズマブデルクステカン、フィギツムマブ、ゲフィチニブ、ゴシポール、ＨＤＭ２０１、イダサヌトリン、イマチニブ、インフィグラチニブ、イニパリブ、ラパチニブ、ラロトレクチニブ、ＬＥＥ０１１、レンバチニブ、ＬＧＸ８１８、ロルラチニブ、ＭＥＫ１６２、ＭＫ－８２４２ ＳＣＨ ９００２４、ＭＲＴＸ８４９、ナビトクラックス、ネシツムマブ、ニロチニブ、オバトクラックス、オラパリブ、ＯＳＩ－９０６、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パニツムマブ、ＰＤ－０３３２９９１、ペリソフィネ、ペルツズマブ、ＰＬ２２５Ｂ、レポトレクチニブ、リボシクリブ、ＲＯ５０４５３３７、サリノマイシン、サリラシブ、ＳＡＲ４０５８３８ ＭＩ－７７３０１、ソラフェニブ、ソトラシブ、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、チピファルニブ、チバニタブ、トファシチニブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、ツカチニブ、ＵＰＲ１３７６、ＶＡＬ－０８３、ベムラフェニブ、ベムラフェニブ、ヴィンタフォリデ、またはゾプタレリンドキソルビシンを含む。ある場合には、ＲＳ経路阻害剤はＣＨＫ１阻害剤であり、ならびに、標的治療剤はＥＧＦＲ阻害剤である。ある場合には、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。

【0009】

一態様では、対象のがんを処置するための方法が提供される。ある場合には、方法は、対象のがんが第１の標的治療剤に対する耐性を獲得するまで、第１の標的治療剤を治療上有効な量で対象に投与すること、続いて、対象に治療上有効な量の複製ストレス（ＲＳ）経路阻害剤を投与することで、がんを治療することを含む。ある場合には、第１の標的治療剤は、アベマシクリブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アレクチニブ、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＭＧ２３２、ＡＭＧ－５１０、アパチニブ、ＡＲＳ－３２４８、ＡＸＬ１７１７、ＡＺＤ－３７５９、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、セリチニブ、セツキシマブ、ＣＧＭ０９７、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダサチニブ、ＤＳ－３０３２ｂ、エンコラフェニブ、エントレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ファム－トラスツズマブデルクステカン、フィギツムマブ、ゲフィチニブ、ゴシポール、ＨＤＭ２０１、イダサヌトリン、イマチニブ、インフィグラチニブ、イニパリブ、ラパチニブ、ラロトレクチニブ、ＬＥＥ０１１、レンバチニブ、ＬＧＸ８１８、ロルラチニブ、ＭＥＫ１６２、ＭＫ－８２４２ ＳＣＨ ９００２４２、ＭＲＴＸ８４９、ナビトクラックス、ネシツムマブ、ニロチニブ、オバトクラックス、オラパリブ、ＯＳＩ－９０６、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パニツムマブ、ＰＤ－０３３２９９１、ペリソフィネ、ペルツズマブ、ＰＬ２２５Ｂ、レポトレクチニブ、リボシクリブ、ＲＯ５０４５３３７、サリノマイシン、サリラシブ、ＳＡＲ４０５８３８ ＭＩ－７７３０１、ソラフェニブ、ソトラシブ、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、チピファルニブ、チバニタブ、トファシチニブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、ツカチニブ、ＵＰＲ１３７６、ＶＡＬ－０８３、ベムラフェニブ、ベムラフェニブ、ヴィンタフォリデ、またはゾプタレリンドキソルビシンを含む。ある場合には、ＲＳ経路阻害剤はＲＮＲ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、ＷＥＥ１阻害剤、Ｅ２Ｆ阻害剤、ＲＲＭ１阻害剤、またはＲＲＭ２阻害剤を含む。ある場合には、ＲＮＲ阻害剤はゲムシタビン、ヒドロキシウレア、トリアピン、または５－クロロ－２－（ｎ－（（１Ｓ、２Ｒ）－２－（６－フルオロ－２、３－ジメチルフェニル）－１－（５－オキソ－４、５－ジヒドロ－１、３、４－オキサジアゾール－２－イル）プロピル）スルファモイル）ベンズアミドを含む。ある場合には、ＣＨＫ１阻害剤は、ＧＤＣ－０５７５、プレキサセルチブ、またはＳＲＡ７３７を含む。ある場合には、がんは、ＲＳ経路阻害剤を投与する前に、ｅｃＤＮＡ陽性であると判定される。ある場合には、ｅｃＤＮＡは、増幅されたがん遺伝子を含む。ある場合には、増幅されたがん遺伝子は、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－Ｍｙｃ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢ２、ＦＧＦＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、およびＮＲＡＳの１つ以上を含む。ある場合には、方法は、増幅されたがん遺伝子のタンパク質産物を阻害する第２の標的治療剤を投与することをさらに含む。ある場合には、第２の標的治療剤は、アベマシクリブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アレクチニブ、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＭＧ２３２、ＡＭＧ－５１０、アパチニブ、ＡＲＳ－３２４８、ＡＸＬ１７１７、ＡＺＤ－３７５９、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、セリチニブ、セツキシマブ、ＣＧＭ０９７、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダサチニブ、ＤＳ－３０３２ｂ、エンコラフェニブ、エントレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ファム－トラスツズマブデルクステカン、フィギツムマブ、ゲフィチニブ、ゴシポール、ＨＤＭ２０１、イダサヌトリン、イマチニブ、インフィグラチニブ、イニパリブ、ラパチニブ、ラロトレクチニブ、ＬＥＥ０１１、レンバチニブ、ＬＧＸ８１８、ロルラチニブ、ＭＥＫ１６２、ＭＫ－８２４２ ＳＣＨ ９００２４２、ＭＲＴＸ８４９、ナビトクラックス、ネシツムマブ、ニロチニブ、オバトクラックス、オラパリブ、ＯＳＩ－９０６、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パニツムマブ、ＰＤ－０３３２９９１、ペリソフィネ、ペルツズマブ、ＰＬ２２５Ｂ、レポトレクチニブ、リボシクリブ、ＲＯ５０４５３３７、サリノマイシン、サリラシブ、ＳＡＲ４０５８３８ ＭＩ－７７３０１、ソラフェニブ、ソトラシブ、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、チピファルニブ、チバニタブ、トファシチニブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、ツカチニブ、ＵＰＲ１３７６、ＶＡＬ－０８３、ベムラフェニブ、ベムラフェニブ、ヴィンタフォリデ、またはゾプタレリンドキソルビシンを含む。ある場合には、第１の標的治療剤は、ＲＳ阻害剤、第２の標的治療剤、またはこれら両方と組み合わせて投与される。

【0010】

参照による援用
本明細書で言及される公報、特許、および特許出願のすべては、個々の公報、特許、または特許出願のそれぞれが参照によって援用されていると具体的かつ個別に表示されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書に援用される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

本特許ファイル、または本出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面付きの本特許または本特許出願公開のコピーは、請求および必要料金の支払いに応じて、米国特許商標庁によって提供されるであろう。

【0012】

本発明の特徴および利点についての理解は、本発明の原理が活用されている例示的実施形態を記載している以下の詳細な説明、および以下の添付図面を参照することにより得られるであろう。

【図1】ｅｃＤＮＡは、がん細胞が、がん遺伝子依存を変更することにより治療圧力（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）に対する耐性を獲得することを可能にし、ならびに、このことは、ゲムシタビンおよび別の治療を用いたＲＮＲ阻害との併用処置によって克服できることを示す。

【図2】大腸がん（ＣＲＣ）モデルにおいて、選択的ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｃ阻害であるアダグラシブによる処置に対する前臨床耐性（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（インビトロおよびインビボ）を早急に獲得することが、ｅｃＤＮＡと強く関係していることを示す。

【図3】複製ストレス応答における、リボヌクレオチドリダクターゼ（ＲＮＲ）の機能、およびＣＨＫ１の機能を示す。

【図4】ｅｃＤＮＡ駆動の腫瘍細胞が、ＲＮＲまたはＣＨＫ１の阻害に、より感受性が強いことを示す。

【図5】３Ｄコロニー形成アッセイにおけるｅｃＤＮＡ陽性（ｅｃＤＮＡ（＋））とｅｃＤＮＡ陰性（ｅｃＤＮＡ（－））のコホートの、ゲムシタビンを用いるＲＮＲ阻害への異なる感受性を示す。

【図6】モデルアッセイにおける、ヒーラメトトレキサート耐性（ＭＴＸ－Ｒ）ｅｃＤＮＡを示す。

【図7】ヒーラＭＴＸ－Ｒモデルにおける、ＣＨＫ１標的検証を示す。

【図8】ｅｃＤＮＡが、標的治療剤に対する耐性の重要かつ臨床的に異なるメカニズムに介在することを示す。

【図9】親ヒーラ細胞（左パネル）とＭＴＸ－Ｒヒーラ細胞（右パネル）の蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＦＩＳＨ）画像を示す。

【図10】既存に対して、新たなｅｃＤＮＡを媒介とした耐性メカニズムの解明のために、バーコーディングおよび単細胞ＲＮＡｓｅｑを用いた研究を例示する。

【図11】既存に対して、新たなｅｃＤＮＡを媒介とした耐性の解明をするために、メトトレキサート耐性を獲得する個体群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を複製するとともに、バーコーディングを用いた研究を例示する。

【図12】構造的に異なるＲＮＲ阻害剤が、ｅｃＤＮＡおよび相対感受性に相関して、Ｃｏｌｏ３２０システムにおける複製ストレスマーカーを誘導することを示す。

【図13】ｅｃＤＮＡ＋細胞が、ＣＨＫ１阻害剤（ＣＨＫ１ｉ）に対する感受性がｅｃＤＮＡ－細胞よりも高いことを示す。

【図14】ｅｃＤＮＡに依存する、ＣＨＫ１阻害剤に対する感受性のアッセイおよび腫瘍細胞モデルを示す。

【図15】様々な薬剤を用いて処置されたマウスにおける、ＫＲＡＳ阻害剤（ＫＲＡＳｉ）耐性腫瘍の成長を示す。

【図16】様々な薬剤を用いて処置されたマウスの腫瘍におけるｅｃＤＮＡを示す。

【図17】様々な薬剤を用いて処置されたマウスにおける腫瘍の成長を示す。

【図18】様々な薬剤を用いて処置されたマウスにおける無イベント生存率を示す。

【図19】様々な薬剤を用いて処置されたマウスの腫瘍から得た細胞におけるｅｃＤＮＡ数を示す。

【図20】耐性腫瘍細胞をエクスビボで増殖させることを提供するＫＲＡＳ ｅｃＤＮＡを示す。

【図21】ＫＲＡＳｉであるアダグラシブによって、および、アダグラシブと、ＲＮＲｉであるゲムシタビンの組み合わせによって、マウスの腫瘍の成長が阻害されることを示す。

【図22】ＲＮＲｉであるゲムシタビン、およびＫＲＡＳｉであるアダグラシブによって、マウスの腫瘍の成長が阻害されることを示す。

【図23】ＲＮＲｉであるゲムシタビン、ＫＲＡＳｉであるアダグラシブ、およびＣＨＫ１ｉであるプレキサセルチブによって、マウスの腫瘍の成長が阻害されることを示す。

【図24】インフィグラチニブに耐性があるＳＮＵ１６細胞の成長およびＳＮＵ１６細胞内のｅｃＤＮＡ量を示す。

【図25】様々な薬剤の存在下で、ＦＧＦＲ２ ｅｃＤＮＡ－駆動のＳＮＵ１６細胞の成長を示す。

【図26】様々な薬剤の存在下で、ＥＧＦＲ ｅｃＤＮＡ－駆動のＳＮＵ１６細胞の成長を示す。

【図27】ｅｃＤＮＡ＋細胞株およびｅｃＤＮＡ－細胞株のＷＥＥ１阻害に対する感受性を示す。

【図28】ｅｃＤＮＡ＋細胞において、アダボセルチブがメトトレキサート耐性を失うことを示す。

【図29】ｅｃＤＮＡ＋細胞において、ＰＤ０１６６２８５がメトトレキサート耐性を失うことを示す

【図30】アダボセルチブが、ＳＮＵ１６細胞のインフィグラチニブ処置耐性を妨げることを示す。

【図31】ｅｃＤＮＡ＋細胞のＷＥＥ１阻害に対する感受性を示す。

【図32】ＷＥＥ１阻害は、メトトレキサート耐性を妨げることを示す。

【図33】ヒーラｅｃＤＮＡ＋細胞およびヒーラｅｃＤＮＡ細胞のＷＥＥ１ノックアウトに対する感受性の比較を示す。

【図34】ＰＡＲＧ阻害が、ＳＮＵ１６細胞のインフィグラチニブ処置に対する耐性の形成を遅らせることを示す。

【図35】ＰＡＲＧ阻害が、メトトレキサート耐性を妨げる。

【図36】ｅｃＤＮＡ＋細胞株およびｅｃＤＮＡ－細胞株のＡＴＲ阻害剤に対する感受性を示す。

【図37】ＡＴＲ阻害剤が、メトトレキサート耐性を妨げることを示す。

【図38】ｅｃＤＮＡ＋細胞の複製ストレスを示す。

【図39A】ｅｃＤＮＡ＋細胞およびｅｃＤＮＡ－細胞の複製フォーク速度を示す。

【図39B】ｅｃＤＮＡ＋細胞およびｅｃＤＮＡ－細胞の複製フォーク速度を示す。

【図40A】ＲＮＲ阻害が、ｅｃＤＮＡ－腫瘍細胞と比較して、ｅｃＤＮＡ＋腫瘍細胞において、ヌクレオチド合成を阻止し、複製ストレスを増強し、および、細胞形質転換を抑制したことを示す。ＲＮＲ阻害が、細胞増殖／細胞形質転換を変更することを示す。

【図40B】ＲＮＲ阻害が、ｅｃＤＮＡ－腫瘍細胞と比較して、ｅｃＤＮＡ＋腫瘍細胞において、ヌクレオチド合成を阻止し、複製ストレスを増強し、および、細胞形質転換を抑制したことを示す。ｅｃＤＮＡが運ぶ、増幅したがん遺伝子数における変化を定量化したＦＩＳＨ画像を示す。

【図40C】ＲＮＲ阻害が、ｅｃＤＮＡ－腫瘍細胞と比較して、ｅｃＤＮＡ＋腫瘍細胞において、ヌクレオチド合成を阻止し、複製ストレスを増強し、および、細胞形質転換を抑制したことを示す。ＲＮＲ阻害が、ヌクレオチド合成の阻止および複製ストレスの増強をもたらすことを示す。

【図41A】ｅｃＤＮＡ＋細胞が、ＣＨＫ１ｉに応じて複製ストレスを増加させたことを示す。ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、ｅｃＤＮＡ＋細胞が、ＣＨＫ１阻害に対する感受性を増加させたことを示す。

【図41B】ｅｃＤＮＡ＋細胞が、ＣＨＫ１ｉに応じて複製ストレスを増加させたことを示す。ＣＨＫ１経路阻害剤によって、ｓｓＤＮＡ損傷が、複製ストレスを誘導することを示す。

【図42A】ＲＮＲ経路阻害によって、ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、ｅｃＤＮＡ＋がん細胞における複製フォーク機能不全が増加したことを示す。ＲＮＲ阻害剤を用いて処置された、ｅｃＤＮＡ＋細胞およびｅｃＤＮＡ－細胞のＤＮＡファイバー分析を示す。

【図42B】ＲＮＲ経路阻害によって、ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、ｅｃＤＮＡ＋がん細胞における複製フォーク機能不全が増加したことを示す。ＲＮＲ阻害剤を用いて処置された、ｅｃＤＮＡ＋細胞およびｅｃＤＮＡ－細胞の複製フォーク速度を示す。

【図43A】ＣＨＫ１経路阻害によって、ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、ｅｃＤＮＡ＋細胞における複製フォーク機能不全が増加したことを示す。図４２Ｂは、ＣＨＫ１阻害剤を用いて処置された、ｅｃＤＮＡ＋細胞およびｅｃＤＮＡ－細胞の複製フォーク速度を示す。

【図43B】ＣＨＫ１経路阻害によって、ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、ｅｃＤＮＡ＋細胞における複製フォーク機能不全が増加したことを示す。ＣＨＫ１阻害剤を用いて処置された、ｅｃＤＮＡ＋細胞およびｅｃＤＮＡ－細胞のＤＮＡファイバー分析を示す。

【図44】腫瘍性タンパク質阻害剤を用いて処置された細胞における、ＲＲＭ２タンパク質レベルの低下を示す。

【図45】ＷＥＥ１ｉであるアダボセルチブかＰＤ０１６６２８５、ＫＲＡＳｉであるアダグラシブ、およびその組み合わせによる、マウスの腫瘍の成長の阻害を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

多数のがん遺伝子指向治療は、変異融合がん遺伝子標的あるいは活性化融合がん遺伝子標的に対する臨床的有効性を実証しているが、しかしながら、これらの同じ治療は、特に同じがん遺伝子が増幅される場合、必ずしも腫瘍に対する良好な奏効率（ＯＲＲ）あるいは無増悪生存期間（ＰＦＳ）をもたらすわけではない。相当な苦労にもかかわらず、腫瘍学分野は、この満たされていない重要なニーズである、増幅されたがん遺伝子によって特徴付けられるがん母集団の対処に失敗している。データによると、これらの増幅のかなりの割合は、染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）上で起こる場合がある局所的な増幅であり、および、このｅｃＤＮＡの現象は、処置不成功の原因になり得ることが、明らかになった。

【0014】

図１に示されるＳＮＵ１６胃がんモデルは、ＦＧＦＲ２増幅がんの場合における、標的ＦＧＦＲ阻害剤治療に対する「非反応性」の臨床的観察を要約する。腫瘍細胞は、主に、ＭＹＣおよびＦＧＦＲ２が増幅されたｅｃＤＮＡを有する。ここに示されていないが、腫瘍細胞は、処置開始後最初の２週間で大幅な細胞減少することに加え、ＦＧＦＲ阻害剤治療に対する初期の感受性を示す。しかしながら、細胞株は５週目までに、再び通常通りに成長しており、かつ、ＦＧＦＲ阻害に対して完全に耐性ができている。この迅速に耐性ができることは、ｅｃＤＮＡ上のＦＧＦＲ２の減少、および、ｅｃＤＮＡ上のＥＧＦＲの著しい増加と相関関係がある。基本的なｅｃＤＮＡ機構は、標的治療圧力に応じて、がん遺伝子のレパートリーが迅速に変化することを可能にする。インビトロのこの進化の動態は、元の腫瘍母集団の大部分がＦＧＦＲ阻害に対して感受性があるにもかかわらず、臨床的「ノンレスポンダー」発現型と一致している。これらの発見は、これらのがん遺伝子が増幅によって活性化される際に、がん遺伝子を対象とする治療（例えば、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ）について実証された臨床的有効性が欠落していることが観察された理由を説明するのに役立つ。基本的なｅｃＤＮＡ機構を治療的に標的とすることは、がん遺伝子増幅腫瘍に関係する治療耐性を克服するための、先例のない直交的戦略を構成する。したがって、図２５は、インフィグラチニブを用いたＦＧＦＲ２の阻害と、ＲＮＲ阻害剤であるゲムシタビンを用いたｅｃＤＮＡの阻害を同時に行うことが、細胞成長を完全に阻害し、かつ耐性の出現を防止することを示す。同様に、図２６は、インフィグラチニブに耐性が出来た細胞が、主に、ｅｃＤＮＡ上のＥＧＦＲ増幅によって稼働されるようになり、および、ＥＧＦＲ阻害剤であるエルロチニブに対して初期に感受性があるが、３週間以内に第２の耐性が出現することを示す。しかしながら、エルロチニブによるＥＧＦＲの阻害と、ゲムシタビンによるＲＮＲの阻害を同時に行うことは、細胞成長を完全に阻害し、かつ第２の耐性の出現を防止する。重要なことに、インフィグラチニブおよびエルロチニブによってそれぞれ、ＦＧＦＲ２の阻害と、ＥＧＦＲの阻害を同時に行うことは、単に、耐性の出現を遅らせる。

【0015】

図２に示された第２のインビボモデルは、ｅｃＤＮＡと関係している別の耐性メカニズムを例示するものであって、活性化突然変異体ＫＲＡＳ^Ｇ１２Ｃに対する標的治療剤は、選択的ＫＲＡＳＧ１２Ｃ阻害剤であるＭＲＴＸ８４９を用いることで、初期腫瘍の減少をもたらし、次に、迅速な耐性かつ再成長をもたらす。初期腫瘍は、多大なｅｃＤＮＡを有していないが、耐性腫瘍は、ｅｃＤＮＡが増幅されたＫＲＡＳＧ^１２Ｃを抱えているという明確な証拠を示す。公表前のデータは、ＢＲＡＦ突然変異体大腸がんのＥＧＦＲ阻害剤およびＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性を駆動させる、ｅｃＤＮＡが介在する似たようながん遺伝子増幅現象と一致する。これらの結果は、突然変異体活性化ＭＡＰＫ経路阻害と関係している主要な耐性メカニズムに対処するためのｅｃＤＮＡ指向治療のユニークな効用を示す。

【0016】

腫瘍学分野では、ＡＴＲ、ＣＨＫ１およびＷＥＥ１を含む複製ストレス（ＲＳ）標的治療剤を上手く展開するために、適切な遺伝的背景／感受性シグネチャを発見することに苦労してきた。ＡＴＲ阻害剤は、ＡＴＭ突然変異体前立腺がんにいくつかの可能性を示すが、研究は進行中である。がん遺伝子増幅に関係する合成致死性は、他の遺伝的改変および／またはＨＰＶ＋に関係する合成致死性とともに、提示されてきた（特に、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＬ、ＣＮＥ１などであり、それらはＲＳの増加に関係しているからである）。これらの依存性を裏付けるデータは、決定的と言うには程遠く、かつあまりにも異質なものであった。本明細書では、ｅｃＤＮＡ指向性阻害（複製ストレス経路成分の阻害）が、がん標的治療剤による合成致死性を示す方法が提供される。ある場合には、ＲＳを標的とした薬剤による合成致死性は、がん標的治療剤の、複製ストレス経路成分の阻害による合成致死性、例えば、リボヌクレオチドリダクターゼ（ＲＮＲ）、またはＣＨＫ１阻害剤による合成致死性などを含む。ある場合には、腫瘍バックグラウンドは、複製ストレス経路阻害剤に対して過度の感受性があることが識別され、耐量を有効にするのに十分な治療指数を可能にする。ある場合には、複製ストレス経路成分の阻害は、ｅｃＤＮＡコピー数の減少、およびｅｃＤＮＡ陽性細胞の細胞毒性の増強をもたらす。ある場合には、細胞毒性の増強は、複製ストレス経路成分の阻害と、がん遺伝子などのがん標的とした阻害との組み合わせに起因する。

【0017】

処置法
一態様では、対象のがんを処置するための方法、例えば、対象の腫瘍または腫瘍細胞を処置するための方法が本明細書に提供される。ある場合には、本明細書の方法は、腫瘍または腫瘍細胞における複製ストレスを誘導するのに十分な量の複製ストレス経路剤（ＲＳＰＡ）を投与することを含む。ある場合には、方法は、がん標的治療剤を投与することをさらに含む。ある場合には、腫瘍または腫瘍細胞は、染色体外のデオキシリボ核酸（ｅｃＤＮＡ）シグネチャを有する。ある場合には、腫瘍の成長または腫瘍のサイズ、腫瘍細胞の成長またはサイズが減少する。

【0018】

本明細書の方法の一態様では、腫瘍または腫瘍細胞は、ｅｃＤＮＡシグネチャを有すると判定される。ある場合には、腫瘍または腫瘍細胞は、ｅｃＤＮＡ＋腫瘍またはｅｃＤＮＡ＋腫瘍細胞に関係している特性を１つ以上持つ場合に、ｅｃＤＮＡシグネチャを有すると判定される。例えば、ある場合には、ｅｃＤＮＡシグネチャは、遺伝子増幅、ｐ５３の機能喪失変異、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）の欠如、低レベルのＰＤ－Ｌ１発現、低レベルの腫瘍炎症シグネチャ（ＴＩＳ）、低レベルの腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、アレルの置換、挿入、もしくは欠失（インデル）の頻度の増加、および、これらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される。

【0019】

本明細書の方法の一態様では、方法は、標的遺伝子のタンパク質産物の活性を対象とする、がん標的治療剤を投与することをさらに含む。ある場合には、がん標的治療剤およびＲＳＰＡによる処置は、腫瘍または腫瘍細胞における標的遺伝子の増幅または発現を減少させる。ある場合には、がん標的治療剤はＲＳＰＡの前に投与される。ある場合には、がん標的治療剤はＲＳＰＡと同時に投与される。ある場合には、がん標的治療剤はＲＳＰＡの前に投与される。

【0020】

本明細書の方法の一態様では、腫瘍または腫瘍細胞は、ｅｃＤＮＡシグネチャを有する。ある場合には、腫瘍または腫瘍細胞は、がん標的治療剤の投与の後にｅｃＤＮＡシグネチャを発現させる。ある場合には、腫瘍または腫瘍細胞は、処置前にｅｃＤＮＡシグネチャを発現させる。ある場合には、方法は、腫瘍または腫瘍細胞におけるｅｃＤＮＡの増加を防止する。

【0021】

本明細書で提供される方法の一態様では、がん標的治療剤は、がん遺伝子のタンパク質産物を標的とする。ある場合には、がん遺伝子は、点突然変異、挿入、欠失、融合、またはそれらの組み合わせを含む。ある場合には、がん標的治療剤は、ＡＫＴ、ＡＬＫ、ＡＲ、ＢＣＬ－２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＲＢ２、ＦＡＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＧＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＣＬ－１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ／Ｂ、ＰＩＫ３Ｃδ、ＲＥＴおよびＲＯＳ１からなる群から選択される遺伝子を標的とする。ある場合には、がん標的治療剤は、表１に提供される１つ以上の遺伝子を標的とする。

【0022】

本明細書で提供される方法の一態様では、腫瘍または腫瘍細胞は、第１の遺伝子またはその一部の増幅を含む。ある場合には、第１の遺伝子は、がん遺伝子である。ある場合には、第１の遺伝子は、薬剤耐性遺伝子である。ある場合には、増幅は、ｅｃＤＮＡ上に存在する。ある場合には、第１の遺伝子は、ＡＫＴ、ＡＬＫ、ＡＲ、ＢＣＬ－２、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＥＲＲＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＡＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＧＲ、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ１Ｒ、ＫＲＡＳ、ＫＩＴ、ＭＣＬ－１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４ＭＴＯＲ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲ、ＲＥＴおよびＲＯＳ１からなる群から選択される。ある場合には、第１の遺伝子は、表１に提供される１つ以上の遺伝子を含む。ある場合には、がん標的治療剤は、第１の遺伝子を対象とする。ある場合には、対象は、以前にがん標的治療剤による処置を受けたことがない。ある場合には、腫瘍または腫瘍細胞は、以前にがん標的治療剤による処置を受けていない。ある場合には、方法は、腫瘍または腫瘍細胞におけるｅｃＤＮＡの増加を防止する。ある場合には、方法は、第１の遺伝子の増幅のさらなる増加を防ぐ。ある場合には、そのようなさらなる増幅は、がん標的治療剤のみが投与される場合は、発現するが、しかし、処置ががん標的治療剤およびＲＳＰＡの両方を含んでいる場合、さらなる増幅の増加は、阻害または防止される。

【0023】

本明細書に提供される方法の一態様では、腫瘍または腫瘍細胞は、がん標的治療剤およびＲＳＰＡによる処置に、従来の治療剤に対し耐性を有しているか、または、有していない。ある場合には、腫瘍または腫瘍細胞は、以前に従来の治療剤による処置を受けている。ある場合には、対象は、以前に従来の治療剤による処置を受けている。ある場合には、腫瘍あるいは腫瘍細胞は、従来の治療剤による処置の期間の後に、そのような従来の薬剤に対して耐性または非耐性ができ、ならびに、本明細書の方法によって、そのような腫瘍または腫瘍細胞が、がん標的治療剤（つまり、場合によっては、従来の治療剤とは異なる薬剤）、およびＲＳＰＡによる処置を受ける場合、腫瘍細胞の成長は、阻害される。ある場合には、処置は、処置される腫瘍あるいは腫瘍細胞におけるｅｃＤＮＡの量またはレベルを減少させるか、あるいは、ｅｃＤＮＡの量またはレベルがさらに増加することを防止する。

【0024】

本明細書に提供される方法の一態様では、がん標的治療剤は、標的遺伝子のタンパク質産物の活性を対象とする。ある場合には、がん標的治療剤およびＲＳＰＡによる処置は、腫瘍または腫瘍細胞内の標的遺伝子の増幅または発現を抑制する。ある場合には、標的遺伝子は、がん遺伝子、薬剤耐性遺伝子、治療標的遺伝子、またはチェックポイント阻害遺伝子である。ある場合には、標的遺伝子は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ＰＤＧＦＲ、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＡＫ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＭＣＬ－１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＲＲＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＤＭ２、ＭＴＯＲ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＡＫＴ、ＢＣＬ－２、ＡＲ、ＥＲ、ＧＲ、およびＭＤＭ４からなる群から選択される。ある場合には、標的遺伝子は、表１に提供される１つ以上の遺伝子を含む。ある場合には、標的遺伝子は、ｅｃＤＮＡ上で発見されるか、ｅｃＤＮＡ上で増幅されていることが発見され、ならびに、がん標的治療剤およびＲＳＰＡによる処置は、標的遺伝子のコピーを含んでいるｅｃＤＮＡを含むｅｃＤＮＡを減少させる。

【0025】

本明細書に提供される方法の様々な態様では、腫瘍または腫瘍細胞のｅｃＤＮＡシグネチャは、ある場合には、腫瘍または腫瘍細胞の処置開始前に把握される。例えば、腫瘍または腫瘍細胞は、生検が実施されるか、そうでなければ、収集され、かつ１つ以上のｅｃＤＮＡシグネチャについてアッセイが実施される。ある場合には、どのように腫瘍または腫瘍細胞を処置するかの判定は、ｅｃＤＮＡシグネチャが全体的あるいは部分的に存在するか、または欠如しているかに基づいている。ある場合には、ｅｃＤＮＡシグネチャは、腫瘍または腫瘍細胞の処置開始後に把握される。

【0026】

本明細書に提供される方法の一態様では、がん標的治療剤およびＲＳＰＡによる処置方法は、ＲＳＰＡが欠如した状態でのがん標的治療剤による処置と比較して、奏効率を改善し、および／または、処置反応の期間を延ばす。ある場合には、方法は、ＲＳＰＡが欠如している、がん標的治療剤による処置と比べて、無増悪生存期間の期間を増加させる。

【0027】

一態様では、ｅｃＤＮＡに関係する腫瘍または腫瘍細胞を処置するための方法が提供される。
ある場合には、方法は、ｅｃＤＮＡを包含する腫瘍または腫瘍細胞を有すると特定される対象に、ＲＳＰＡおよびがん標的治療剤を投与することを含む。ある場合には、処置の結果、腫瘍の成長またはサイズ、あるいは、腫瘍細胞の成長または数が減少する。

【0028】

本明細書に提供される方法の一態様では、対象の腫瘍または腫瘍細胞は、ｅｃＤＮＡシグネチャを有すると特定される。ある場合には、ｅｃＤＮＡシグネチャは、遺伝子増幅、Ｐ５３の機能喪失変異型、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）の欠如、低レベルのＰＤ－Ｌ１発現、低レベルの腫瘍炎症シグネチャ（ＴＩＳ）、低レベルの腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、アレルの置換、挿入もしくは欠失（インデル）の頻度の増加、および、これらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される。

【0029】

本明細書に提供される方法の一態様では、腫瘍または腫瘍細胞は、細胞内のｅｃＤＮＡのイメージング、がん遺伝子結合剤によるｅｃＤＮＡの検出、またはＤＮＡシーケンシングによってｅｃＤＮＡを有するものとして特定される。いくつかの場合において、ｅｃＤＮＡは循環腫瘍ＤＮＡにおいて特定される。

【0030】

本明細書に記載の方法の様々な様態では、腫瘍または腫瘍細胞は、固形腫瘍によって構成される。ある場合には、固形腫瘍中に存在するｅｃＤＮＡは、がん標的治療剤およびＲＳＰＡによる処置の結果、減少させられるか、または消失させられる。ある場合には、固形腫瘍中のｅｃＤＮＡレベルは、処置前のｅｃＤＮＡレベルと比べて、処置後に低下させられる。いくつかの場合では、固形腫瘍におけるがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルは、がん標的治療剤およびＲＳＰＡによる処置前の固形腫瘍におけるがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルと比べて処置後に低下させられる。

【0031】

本明細書に提供される方法のいくつかの態様では、腫瘍または腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞を含む。ある場合には、循環腫瘍細胞内に存在するｅｃＤＮＡは、がん標的治療剤およびＲＳＰＡによる処置の結果、減少させられるか、または消失させられる。ある場合には、循環腫瘍細胞中のｅｃＤＮＡレベルは、処置前のｅｃＤＮＡレベルと比べて、処置後に低下させられる。ある場合には、循環腫瘍細胞におけるがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルは、処置前の循環腫瘍細胞におけるがん遺伝子増幅のレベルおよび／またはコピー数多型（ＣＮＶ）のレベルと比べて、処置後に低下させられる。ある場合には、ｅｃＤＮＡの存在、あるいはレベルは、循環腫瘍ＤＮＡにおいて特定される。

【0032】

ＲＳＰＡおよびがん標的治療剤による処置を採用する、本明細書に提供される方法の様々な態様では、ＲＳＰＡは、ＲＮＲ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、ＷＥＥ１阻害剤、およびＰＡＲＧ阻害剤からなる群から選択される。ある場合には、ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、トリアピン、５－クロロ－２－（ｎ－（（１Ｓ、２Ｒ）－２－（６－フルオロ－２、３－ジメチルフェニル）－１－（５－オキソ－４、５－ジヒドロ－１、３、４－オキサジアゾール－２－イル）プロピル）スルファモイル）ベンズアミド、クロファラビン、フルダラビン、モテキサフィンガドリニウム、クラドリビン、テザシタビン、およびＣＯＨ２９（Ｎ－［４－（３、４－ジヒドロキシフェニル）－５－フェニル－１、３－チアゾール－２－イル］－３、４－ジヒドロキシベンズアミド）からなる群から選択される。ある場合には、ＣＨＫ１阻害剤は、ＧＤＣ－０５７５、プレキサセルチブ、ＬＹ－２８８００７０、ＳＲＡ７３７、ＸＣＣＳ－６０５Ｂ、ラブセルチブ（ＬＹ－２６０３６１８）、ＳＣＨ－９００７７６、ＲＧ－７６０２、ＡＺＤ－７７６２、ＰＦ－４７７７３６およびＢＥＢＴ－２６０からなる群から選択される。ある場合には、ＷＥＥ１阻害剤は、ＡＺＤ１７７５（ＭＫ１７７５）、ＺＮ－ｃ３、Ｄｅｂｉｏ ０１２３、ＩＭＰ７０６８、ＳＤＲ－７９９５、ＳＤＲ－７７７８、ＮＵＶ－５６９、ＰＤ０１６６２８５、ＰＤ０４０７８２４、ＳＣ－０１９１、ＤＣ－８５９／Ａ、ボスチニブ、およびＢｏｓ－Ｉからなる群から選択される。ある場合には、ＡＴＲ阻害剤は、ＲＰ－３５００、Ｍ－６６２０、ベルゾセルチブ（Ｍ－６６２０、ＶＸ－９７０；ＶＥ－８２２）、ＡＺＺ－６７３８、ＡＺ－２０、Ｍ－４３４４（ＶＸ－８０３）、ＢＡＹ－１８９５３４４、Ｍ－１７７４、ＩＭＰ－９０６４、ｎＬｓ－ＢＧ－１２９、ＳＣ－０２４５、ＢＫＴ－３００、ＡＲＴ－０３８０、ＡＴＲＮ－１１９、ＡＴＲＮ－２１２、およびＮＵ－６０２７からなる群から選択される。

【0033】

がん標的治療剤およびＲＳＰＡのよる処置を採用する、本明細書に提供される方法の様々な様態では、がん標的治療剤は、アベマシクリブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アレクチニブ、ＡＬＲＮ－６９２４、ＡＭＧ２３２、ＡＭＧ－５１０、アパチニブ、ＡＲＳ－３２４８、ＡＸＬ１７１７、ＡＺＤ－３７５９、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、カプマチニブ、セリチニブ、セツキシマブ、ＣＧＭ０９７、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダスチニブ、ＤＳ－３０３２ｂ、エンコラフェニブ、エントレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ファム－トラスツズマブデルクステカン、フィギツムマブ、ゲフィチニブ、ゴシポール、ＨＤＭ２０１、イダサヌトリン、イマチニブ、インフィグラチニブ、イニパリブ、ラパチニブ、ラロトレクチニブ、ＬＥＥ０１１、レンバチニブ、ＬＧＸ８１８、ロルラチニブ、ＭＥＫ１６２、ＭＫ－８２４２ ＳＣＨ ９００２４２、ＭＲＴＸ８４９、ナビトクラックス、ネシツムマブ、ニロチニブ、オバトクラックス、オラパリブ、ＯＳＩ－９０６、オシメルチニブ、パルボシクリブ、パニツムマブ、ＰＤ－０３３２９９１、ペリソフィネ、ペルツズマブ、ＰＬ２２５Ｂ、レポトレクチニブ、リボシクリブ、ＲＯ５０４５３３７、サリノマイシン、サリラシブ、ＳＡＲ４０５８３８ ＭＩ－７７３０１、ソラフェニブ、ソトラシブ、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、チピファルニブ、チバニタブ、トファシチニブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、ツカチニブ、ＵＰＲ１３７６、ＶＡＬ－０８３、ベムラフェニブ、ベムラフェニブ、ヴィンタフォリデ、およびゾプタレリンドキソルビシンからなる群から選択される。ある場合には、がん標的治療剤は、表１に提供される遺伝子のうちの１つ以上によってコード化されたタンパク質を標的とする。

【0034】

【表1-1】

【0035】

【表1-2】

【0036】

本明細書に提供される方法の一態様では、ＲＳＰＡはＲＮＲ阻害剤であり、ならびに、ＲＳＰＡは、単剤として推奨される使用量を下回る治療量が投与される。ある場合には、ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビンである。代替的に、ＲＮＲ阻害剤は、ゲムシタビンでもヒドロキシウレアでもない。

【0037】

本明細書に提供される方法の一態様では、ＲＳＰＡは、ゲムシタビンではない。ある場合には、ＲＳＰＡは、がん標的治療剤がＥＧＦＲ阻害剤である場合、ゲムシタビンではない。

【0038】

本発明の様々な実施形態が本明細書に示され、および記載される一方、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者にとって明白であろう。多数の変異、変化、および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者が想到し得るものである。本明細書に記載される本発明の様々な代替実施形態が、本明細書に採用され得ると解すべきである。

【0039】

特定の定義
本明細書に用いられる際には、用語「約」または「おおよそ」は、当業者によって判定される、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内であることを意味し、このことは、その値がどのように測定または判定されるか、つまり、測定システムの制約次第であり得る。例えば、「約」とは、各技術分野の慣例により、１以内の標準偏差、または１を超える標準偏差を意味することができる。別の例として、「約」は、所定の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、１％までの範囲を意味することができる。生物学的システムまたは生物学的プロセスに関して、用語「約」は、値の５倍以内または値の２倍以内などのように１桁以内であることを意味することができる。特定値が本出願と本願特許請求の範囲に記載され、他に述べられていない場合、用語「約」は、特定値に対する許容可能な誤差以内であることを意味する。

【0040】

用語「対象」は、本明細書で用いられる際には、一般に哺乳動物（例えば人間）のような脊椎動物を指す。哺乳動物は、ネズミ、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペット（例えば、犬または猫）を含むが、これらに限定されない。組織、細胞、およびインビボで得られたまたはインビトロで培養された生物学的実体の子孫も網羅される。いくつかの実施形態では、対象は患者である。いくつかの実施形態では、対象は、疾病（例えば、がん）に関する症状を示す。ある場合には、代わりに、対象は、疾病に関する症状を示さない。ある場合には、対象は罹患していない。

【0041】

用語「生物学的サンプル」は、本明細書で用いられる際に、一般に、哺乳動物（例えば、人間）のような対象に由来する、またはその対象から採取されたサンプルを指す。生物学的サンプルは、毛、指の爪、皮膚、汗、涙、眼液、鼻腔用ぬぐい液または鼻咽頭洗浄液、唾液、咽頭ぬぐい液、唾液、粘液、血液、血清、血漿、プラセンタ液、羊水、臍帯血、気泡液体（ｅｍｐｈａｔｉｃ ｆｌｕｉｄｓ）、キャビティー流体（ｃａｖｉｔｙ ｆｌｕｉｄｓ）、耳垢、油、腺分泌物、胆汁、リンパ、膿、微生物叢、胎便、母乳、骨髄、骨、ＣＮＳの組織、脳脊髄液、脂肪組織、滑液、便、胃液、尿、精液、膣分泌物、胃、小腸、大腸、直腸、膵臓、肝臓、腎臓、膀胱、肺、および対象に由来したか、対象から採取された他の組織や流体を含むが、これらに限定されない。

【0042】

用語「処置する」は、本明細書に使用される際、一般に、薬剤を投与すること、または、効果を得るための手段を実行することを指す。ある場合には、効果は、完全にまたは部分的に疾病や症状を防止するという点では予防的であり、ならびに／あるいは、効果は、疾病、および／または疾病の１つ以上の症状を部分的または完全に治癒するという点で処置的である。「処置」は、本明細書に使用される際、哺乳動物、特にヒトにおける腫瘍の処置を含み得、および、「処置」は、（ａ）疾病または疾病の症状が、罹患する傾向があり得るがまだ罹患していると診断されていない対象に現れることを防止すること （例えば、原疾病と関係があり得、または、原疾病によって引き起こされ得る疾病を含む） （ｂ）疾病を抑制する、つまり、その発現を捕捉すること、および、（ｃ）疾病を和らげる、つまり、疾病の退行を引き起こすこと、を含む。処置は、減退、寛解、症状を軽減すること、または、患者が疾病を我慢できるような状態にすること、変性率または減少率を示すこと、あるいは、最終変性点（ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）がより下がること、などを含むがんの処置、改善、または防止の成功に関するあらゆる指標を指し得る。処置または症状の改善は、医師による検診の結果を含む、１つ以上の客観的または主観的なパラメーターに基づいている。したがって、用語「処置」は、がんまたは他の疾病に関係する症状または状態の発現を防止する、遅らせる、緩和する、捕捉、または抑制するために、本発明の化合物あるいは薬剤を投与することを含む。用語「治療効果」は、疾病の低減、除去、または予防、疾病の症状、あるいは対象の疾病の副作用を指す。

【0043】

用語「腫瘍」または「腫瘍細胞」は、本明細書に使用される際、一般に、必要以上に成長および分裂する、あるいは死ぬべき時に死なない細胞を指す。ある場合には、腫瘍細胞は、固形腫瘍のような固体塊に存在し、または、ある場合には、腫瘍細胞は、白血病においてなど、非固体で見つかる。腫瘍または腫瘍細胞は、転移または転移性細胞も含むことができる、がん細胞が原発（初発）腫瘍から分離し、身体の他の器官または組織において新しい腫瘍を形成し得る。

【0044】

用語「がん遺伝子」は、本明細書で使用される際、一般に、不適切に活性化された場合にがんを引き起こす可能性がある遺伝子を指す。腫瘍または腫瘍細胞では、これらの遺伝子は頻繁に。負の調節ドメインを除去するよう変異されるか、または高いレベルで表現される。

【0045】

用語「ｅｃＤＮＡシグネチャ」は、本明細書で使用される際、一般に、ｅｃＤＮＡ＋である腫瘍または腫瘍細胞に共通する１つ以上の特徴を指す。ある場合には、ｅｃＤＮＡシグネチャは、遺伝子増幅、ｐ５３の機能喪失変異型、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）の欠如、低レベルのＰＤ－Ｌ１発現、低レベルの腫瘍炎症シグネチャ（ＴＩＳ）、低レベルの腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）、アレルの置換、または、挿入や欠失（インデル）の頻度の増加、および、これらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される。ある場合には、ｅｃＤＮＡシグネチャは、画像化技術を用いたｅｃＤＮＡの検出または識別を含む。ある場合には、ｅｃＤＮＡシグネチャは、ｅｃＤＮＡを画像化することと直接検出することのいずれも含まない。

【0046】

用語「複製ストレス経路剤」、「ＲＳＰＡ」、「複製ストレス経路阻害剤」、および「ＲＳ経路阻害剤」は、本明細書で使用される際、一般に、腫瘍細胞などの細胞において複製ストレスを引き起こす薬剤を指す。いくつかの場合では、ＲＳＰＡは、複製ストレス経路成分の阻害剤であり、ここで、阻害は複製ストレスを増大させる。複製ストレスは、本明細書で使用される際、ＤＮＡ複製およびまたはＤＮＡ合成に影響を与えるストレスを指し、複製フォークの進行および／またはＤＮＡ合成の妨害の減速または失速を含むがこれらに限定されない。例示的な複製ストレス経路剤は、ＲＮＲ（リボヌクレオチドレダクターゼ）、ＣＨＫ１（チェックポイントキナーゼ１）、ＡＴＲ（Ｒａｄ３関連タンパク質）、ＷＥＥ１、Ｅ２Ｆ、ＰＡＲＧ（ポリ（ＡＤＰリボース）グリコヒドロラーゼ）、またはＲＲＭ２（リボヌクレオチドレダクターゼ調節サブユニット２）を阻害する薬剤が含むがこれらに限定されない。

【0047】

用語「少なくとも」、「よりも大きい」、または「以上」が、一連の２つ以上の数値における最初の数値の前に来るときはいつでも、「少なくとも」、「よりも大きい」、または「以上」という用語は、その一連の数値のそれぞれに適用される。例えば、１、２、または３以上であることは、１以上、２以上、または３以上であることと同等である。

【0048】

「わずかに」、「未満である」、または「以下である」という用語が、一連の２つ以上の数値における最初の数値の前に来るときはいつでも、「わずかに」、「未満である」、または「以下である」という用語は、その一連の数値のそれぞれに適用される。例えば、３、２、または１以下であることは、３以下、２以下、１以下であることと同等である。

【実施例】

【0049】

以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例証する目的で提供され、本明細書の本開示をいかなる様式においても制限する意図しないものである。本実施例は、本明細書に記載される方法とともに、現時点では、好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的であり、かつ本明細書の本開示の範囲を制限する意図はない。特許請求の範囲によって画定される本開示の主旨の範囲内に含まれる変更および他の使用は、当業者が想到するであろう。

【0050】

実施例１：ｅｃＤＮＡ陽性がんにおけるＲＳ経路の阻害
図３は、ＨＰＶ７（Ｅ７）、ｄＮＴＰ枯渇、および他の例などのがん遺伝子による症例において活性化させられる複製ストレス経路を例示する。

【0051】

ＣＨＫ１およびＲＮＲは、ＤＮＡ損傷応答ネットワークにおける複製ストレス（ＲＳ）応答経路において機能する。腫瘍細胞の一連の要因は、複製ストレスの間に増殖および生存を維持するためにＲＳ経路を活性化させ得る。この経路における標的の阻害は、ＲＳのレベルを毒性レベルまで上昇させることによって、これらの腫瘍細胞において合成致死性をもたらし得る。ＲＮＲおよびＣＨＫ１の両方は不可欠であり、したがって、ＲＮＲ阻害剤およびＣＨＫ１阻害剤の臨床開発における２つの関連する課題は、患者選択と治療指数である。

【0052】

図１２は、ｅｃＤＮＡ駆動の腫瘍細胞がＲＮＲまたはＣＨＫ１の阻害に対してより感受性が高いことを例示する。ＲＮＲおよびＣＨＫ１の複数の構造的に異なる阻害剤は、ｅｃＤＮＡ駆動の腫瘍細胞における毒性を、対応するｅｃＤＮＡ非保有細胞と比較して、５～１０倍高めることを実証する。ＲＮＲ阻害剤を用いる処置は、ＭＹＣをコードするｅｃＤＮＡのコピーを減少させることをもたらす。

【0053】

Ｃｏｌｏ３２０ ｅｃＤＮＡ＋（細胞株ＣＯＬＯ３２０ ＤＭ）およびＣｏｌｏ３２０ｅｃＤＮＡ－（染色体が増幅された、細胞株ＣＯＬＯ３２０ ＨＳＲ）細胞（大腸腺がん細胞株、ＡＴＣＣ）は、３つの構造的に異なるＲＮＲ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレ（ＨＵ）、または化合物１（ｃｏｍｐ－１（５－クロロ－２－（ｎ－（（１Ｓ、２Ｒ）－２－（６－フルオロ－２、３－ジメチルフェニル）－１－（５－オキソ－４、５－ジヒドロ－１、３、４－オキサジアゾール－２－イル）プロピル）スルファモイル）ベンズアミド）を用いて処置された。図１２に示すように、ｅｃＤＮＡ陽性細胞（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）は、ｅｃＤＮＡ陰性細胞株（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）と比較して、ＲＮＲ阻害剤に対する感受性が５～１０倍高い。全てのＲＮＲ阻害剤は、複製ストレスマーカーである、ＣＨＫ１のセリン位置３１７および３４５でのリン酸化を誘発し、および、ｅｃＤＮＡ陽性細胞は、一般に、この複製ストレスマーカーの誘発を、ｅｃＤＮＡ陰性細胞と比較して増加させた。ＲＮＲ阻害剤ヒドロキシウレ（ＨＵ）により処置されたｅｃＤＮＡ＋（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）細胞、および対照細胞（処置されたビヒクル）は、ｅｃＤＮＡについて評価された。ビヒクルにより処置された細胞株は、予想通り、高いレベルのｅｃＤＮＡを有した一方、ＲＮＲ阻害剤であるヒドロキシウレによる処置の後、ｅｃＤＮＡコピー数は、著しく減少した。

【0054】

ｅｃＤＮＡ＋細胞株（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）のｅｃＤＮＡ－細胞株（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）と比較して、４つの構造的に異なるＣＨＫ１阻害剤に対する感受性が判定された。２つの細胞株は、ＧＤＣ０５７５、プレキサセルチブ、ラブセルチブ、またはＳＲＡ７３７を用いて７日間、処置された。図１３に示すように、Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ ｅｃＤＮＡ＋細胞のＣＨＫ１阻害剤への感受性が約５～１０倍高まったことが示された。対照的に、ＣＣＴ２４１５３３によるＣＨＫ２の阻害、ＡＺＤ０１５６によるＤＤＲ標的であるＡＴＭの阻害との間には、感受性に差異がないことを明らかにした。

【0055】

図５は、軟寒天で実施される３次元のコロニー形成アッセイにおけるｅｃＤＮＡ陽性がん細胞とｅｃＤＮＡ陰性がん細胞の、ゲムシタビンを用いたＲＮＲの阻害に対する異なる感受性を例示する。ｅｃＤＮＡ＋およびｅｃＤＮＡ－細胞株のパネルは、二週間の軟寒天薬剤感受性アッセイ（ａ ｔｗｏ－ｗｅｅｋ ｓｏｆｔ－ａｇａｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ）において照合された（ｉｎｔｅｒｏｇａｔｅｄ）。すべての株は、五段階の用量範囲（ ｆｉｖｅ－ｐｏｉｎｔ ｄｏｓｅ ｒａｎｇｅ）のゲムシタビンを用いて２週間処置され、および、ＩｍａｇｅＪ解析により個々のコロニー数を定量化するために（図５の底部パネルにプロットされる）クリスタルバイオレットで染色された（図５の上部パネル）。すべてのｅｃＤＮＡ＋細胞株（ＳＮＵ１６、Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ、Ｈ７１６、およびＨ２１７０）は、ｅｃＤＮＡ－細胞株（ＤＬＤ１、Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ、Ｌｏｖｏ、およびＳＷ４８）と比較して、ゲムシタビンに対する感受性が５～１０倍高まったことが表された。

【0056】

図３１は、軟寒天で実施される三次元のコロニー形成アッセイにおける、アダボセルチブを用いたＷＥＥ１の阻害に対するｅｃＤＮＡ＋細胞の感受性を示す。ｅｃＤＮＡ＋細胞株のパネルは、二週間の軟寒天薬物感受性アッセイにおいて照合された。すべての細胞株は、五段階の用量範囲のアダボセルチブを用いて２週間処置され、および、個々のコロニー数を定量化するためにクリスタルバイオレットで染色された。すべての細胞株は、アダボセルチブに対する感受性を示した。

【0057】

図３２は、コロニー形成アッセイを介したヒーラ細胞において、アダボセルチブ（ＭＫ－１７７５）を介したＷＥＥ１阻害によって、メトトレキサートに対する耐性形成の抑止を示す。図３２の左パネルにおいて、１００個の細胞は、メトトレキサートなしで１０日間播種され、その後、ＤＭＳＯ、プレキサセルチブ（ＩＣ５０、１／３ＩＣ５０、または１／９ＩＣ５０）、あるいはａｄａｖｏｓｅｒｔｉｂ（ＭＫ－１７７５）（ＩＣ５０、１／３ＩＣ５０、または１／９ＩＣ５０）を用いて処置される。図３２、右パネルにおいて、１００００個の細胞をメトトレキサートで２１日間播種し、同時にＤＭＳＯ、プレキサセルチブ（ＩＣ５０、１／３ ＩＣ５０、または１／９ ＩＣ５０）、またはアダボセルチブ （ＭＫ－１７７５） （ＩＣ５０、１／３ ＩＣ５０、または１／９ ＩＣ５０）を用いて処置される。

【0058】

ｅｃＤＮＡ＋（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）細胞株モデルおよびｅｃＤＮＡ－（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）細胞株モデルの感受性は、濃度が増加したプレキサセルチブ（ＣＨＫ１ｉ）を用いて、それぞれの上記細胞株を７日間にわたり処置することにより把握した。細胞増殖がＭＴＳアッセイ（図１４、左上パネル）を用いて判明される一方、細胞毒性はＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏアッセイ（図１４、右上パネル）を用いて死細胞プロテアーゼ活性を測定することにより判明される。Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭを保有するｅｃＤＮＡは、増殖と細胞毒性の変化を分析した場合、Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、ＣＨＫ１ｉによる処置に対する感受性が２００倍および１３．７１倍高まったことを示した。

【0059】

１μＭのアダグラシブが存在する場合と存在しない場合における、親ＣＴ２６ＷＴ Ｅ３細胞（ｅｃＤＮＡ－細胞株）およびアダグラシブ耐性ＣＴ２６ＷＴ Ｅ３細胞（ｅｃＤＮＡ＋）の、濃度が増加したプレキサセルチブ（ＣＨＫ１ｉ）に対する ５日間にわたる感受性は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－ｇｌｏアッセイを用いて判明した。図１４の底部パネルに示すように、アダグラシブ耐性ＣＴ２６ＷＴ Ｅ３ ｅｃＤＮＡ＋細胞は、ｅｃＤＮＡ非保有の親ＣＴ２６ＷＴ Ｅ３細胞と比較して、ＣＨＫ１阻害に対する感受性が約１０倍高まったことを示した。

【0060】

ヒーラ細胞は、ＣＨＫ１阻害剤である１０ｎＭのＧＤＣ－０５７５を単独、１００ｎＭのメトトレキサートを単独、または、１０ｎＭのＧＤＣ－０５７５と１００ｎＭのメトトレキサートとの組み合わせで３週間にわたって処置された。細胞コンフルエンスは、時間経過とともにハイコンテンツ顕微鏡（ｈｉｇｈ－ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって測定された。ＧＤＣ－０５７５は、細胞の成長に影響を与えなかった。メトトレキサートは当初、細胞の成長をもたらさなかったが、２週間の培養後、細胞は耐性を発現し始め、および細胞成長が再開された。対照的に、ＣＨＫ１阻害剤と組み合わせることは、メトトレキサート耐性の発現を防止した。この効果は、８週目の研究終了まで持続した。図６は、ｅｃＤＮＡ陽性メトトレキサート耐性ヒーラがん細胞に関連するデータを示す。ＲＮＲ阻害剤は、メトトレキサート処置に対する迅速なｅｃＤＮＡ媒介耐性を抑止し、これは、観察された合成致死性をもたらす。図９は、親ヒーラ細胞（左パネル）およびメトトレキサート耐性ヒーラ細胞（右パネル）のＦＩＳＨ画像を示す。このデータは、未処置のヒーラ細胞は、ｅｃＤＮＡ陽性細胞が非常に少ないことを示す。対照的に、メトトレキサート耐性ヒーラ細胞は、ｅｃＤＮＡのレベルを増加させている。メトトレキサート耐性ヒーラ細胞における、予備的なＣＨＫ１標的検証が、図７に示されている。このデータは、ライブセル顕微鏡（ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｍｉｃｒｏｓｐｙ）が、ヒーラ細胞におけるｅｃＤＮＡ上のＤＨＦＲ増幅によるメトトレキサート耐性の形成において、ＣＨＫ１阻害による合成致死性の可能性を示唆していることを示す。

【0061】

ｅｃＤＮＡ＋（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）細胞株モデルおよびｅｃＤＮＡ－（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）細胞株モデルの感受性は、濃度が増加したアダボセルチブまたはＰＤ０１６６２８５を用いて、それぞれの細胞株を７日間にわたり処置することにより判明した。細胞増殖は、ＭＴＳアッセイ（図２７、上部パネル）を用いて判明された一方、生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ｇｌｏアッセイ（図２７、下部パネル）を用いて判明された。Ｃｏｌｏ３２０ ｅｃＤＮＡ＋細胞は、Ｃｏｌｏ３２０ ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、増殖および生存率の変化を分析する際に、アダボセルチブおよびＰＤ０１６６２８５による処置に対する感受性が高まっていることを示した。

【0062】

ｅｃＤＮＡ＋（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）細胞株モデルおよびｅｃＤＮＡ－（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）細胞株モデルのＡＴＲ阻害に対する感受性は、濃度が増加したＡＺＤ６７３８またはＢＡＹ１８９５３４４を用いて、それぞれの細胞株を７日間にわたり処置することにより判明した。細胞増殖はＭＴＳアッセイを用いて判明した（図３６、上部パネル）一方、生存率はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ｇｌｏアッセイを用いて判明した（図３６、下部パネル）。Ｃｏｌｏ３２０ ｅｃＤＮＡ＋細胞は、Ｃｏｌｏ３２０ ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、増殖および生存率の変化を分析する際に、ＡＺＤ６７３８およびＢＡＹ１８９５３４４による処置に対する感受性が高まっていることを示した。

【0063】

ヒーラ細胞を、ＷＥＥ１阻害剤である０．０１～０．３μＭのアダボセルチブ単独、１ｎＭ～１００ｎＭのＰＤ０１６６２８５、１００ｎＭのメトトレキサート単独、０．０１～０．３μＭのアダボセルチブと１００ｎＭのメトトレキサートの組み合わせ、または１ｎＭ～１００ｎＭのＰＤ０１６６２８５と１００ｎＭのメトトレキサートの組み合わせを用いて、３週間にわたって処置した。細胞コンフルエンスは、時間経過とともにハイコンテンツ顕微鏡で測定された。メトトレキサートは当初、細胞成長をもたらさなかったが、２週間の培養後、細胞は耐性を発現し、および細胞成長が再開された。対照的に、アダボセルチブと組み合わせることは、メトトレキサート耐性の発現を防止した。図２８は、ＮｕｃＲｅｄによって測定される、ｅｃＤＮＡ陽性メトトレキサート耐性ヒーラがん細胞において、アダボセルチブ（ＭＫ１７７５）がメトトレキサート耐性を抑止することに関連するデータを示す。図２８は、ｅｃＤＮＡ陽性メトトレキサート耐性ヒーラがん細胞において、ＰＤ０１６６２８５がメトトレキサート耐性を抑止することに関連するデータを示す。

【0064】

ヒーラ細胞は、ＰＡＲＧ阻害剤である３～１００μＭのＰＤ０００１７２７３を１００ｎＭのメトトレキサートと併用（図３５、上部パネル）、または併用せず（図３５、下部パネル）に用いて、３週間にわたって処置された。細胞コンフルエンスは、時間経過とともにハイコンテンツ顕微鏡で測定された。トトレキサートは当初、細胞成長をもたらさなかったが、２週間の培養後、細胞は耐性を発現し、および細胞の成長が再開された。対照的に、アダボセルチブと組み合わせることは、メトトレキサート耐性の発現を防止した。

【0065】

ヒーラ細胞は、ＡＴＲは阻害剤である３～１００μＭのＡＺＤ６７３８、または１０～３００ｎＭのＢＡＹ１８９５３４４を、１００ｎＭのメトトレキサートと併用（図３５、上部パネル）、または併用せず（図３５、下部パネル）に用いて、３週間にわたって処置された。細胞コンフルエンスは、時間経過とともにハイコンテンツ顕微鏡で測定された。ＡＺＤ６７３８は、１００ｎＭのメトトレキサートと併用することで、合成致死性を示したが、ＡＺＤ６７３８それ自身ではヒーラ細胞の成長に影響を与えなかった。しかしながら、ＢＡＹ１８９５３４４は、１０ｎＭを超えると、毒性を示した。

【0066】

ｅｃＤＮＡが、標的治療剤に対する耐性の重要かつ臨床的に異なるメカニズムに介在することを示す。これためのモデルは図８に示される。このデータは、１つ以上のＲＳ経路標的薬剤の使用など、ｅｃＤＮＡを対象とする処置の効用がすぐに得られることを示唆し、これらの薬剤は、単剤として、または他の処置との組み合わせにより、ＲＮＲ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、およびＷＥＥ１を標的とするものを含むが、これらに限定されない。第１に、承認された標的治療剤が存在しない突然変異でない増幅されたがん遺伝子を有する腫瘍（例えばＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ２の増幅）。第２に、標的遺伝子自体のｅｃＤＮＡに基づいた増幅などの局地増幅の結果として、特定のがん遺伝子の突然変異体が活性化することを直接阻害する場合に、がんの獲得耐性が発現する、１つ以上の標的薬剤を用いて処置された腫瘍（例えば、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ）。

【0067】

実施例２
ｅｃＤＮＡ陽性がんにおける耐性への道筋
処置に対する耐性の発現のメカニズムを理解するために、ｅｃＤＮＡによって介在された、ｅｃＤＮＡを保有する耐性クローンが事前に存在していたものかどうか、または、治療圧力下で新たに形成されるかどうかが判明した。バーコーディング実験はヒーラ細胞において実施され、このヒーラ細胞は、ＤＨＦＲを保有するｅｃＤＮＡの生成を通じ、ＤＨＦＲ阻害剤であるメトトレキサート（ＭＴＸ）による長期間の処置に対して耐性ができ、それゆえＭＴＸ圧力を克服した。

【0068】

単細胞ＲＮＡｓｅｑ解析と組み合わせてバーコーディングすること。
初期のナイーブ細胞個体群は、安定したレンチウイルスを媒介して、バーコード配列が各細胞のゲノムに組み込まれることによって、バーコーディングされた。このバーコードは、各細胞のＲＮＡにも発現されるであろう。細胞の単細胞ＲＮＡｓｅｑ解析は、ｅｃＤＮＡ上に余分なＤＨＦＲのコピーが存在していることを表している高いＤＨＦＲ発現を有する細胞（バーコードによって）を特定する。数週間のＭＴＸ圧力と耐性細胞の生成後、単細胞ＲＮＡｓｅｑ（解析）は、処置前に高いＤＨＦＲ発現を示したバーコードを有しており、耐性ができて、ＭＴＸ圧力下を生き残った細胞を特定するために再び実施された。このことは、高いＤＨＦＲを発現する耐性細胞の個体群が事前に存在していたことを示す。あるいは、処置前に高いＤＨＦＲ発現を示さなかったが、処置後は高い発現を示す細胞の特定は、新しいｅｃＤＮＡの生成を示す。

【0069】

パラレル耐性複製（ｐａｒａｌｌｅｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を用いてバーコーディングすること。

【0070】

ヒーラ細胞の初期のナイーブ個体群は、安定したレンチウイルスを媒介してユニークなバーコード配列が各細胞のゲノムに組み込まれることによって、バーコーディングされ、そしてユニークにバーコーディングされた約２００、０００個のヒーラ細胞。このバーコーディングされた細胞個体群は、パラレルで行われた８つの耐性実験に広げられ、分けられた。これらのパラレル複製における細胞は、耐性細胞の個体群を産出するために、数週間、１００ｎＭのＭＴＸを用いて処置された。その後、耐性細胞個体群のそれぞれは、どのバーコードが耐性を有したかを判定するためにシーケンシングされる。共通のバーコードは、複製の間で耐性細胞において特定され、その結果、これらの細胞は、事前に存在するｅｃＤＮＡに起因して、耐性細胞を抱えていたことが示された。さらに、バーコードの一部は個々の複製に対してユニークであり、耐性が新たに形成された。（図１１）。

【0071】

実施例３：マウスのＫＲＡＳ突然変異腫瘍の処置
マウスは、ＣＴ２６ＷＴ Ｅ３ Ｇ１２Ｃ ＫＲＡＳ突然変異体腫瘍細胞が注入された。一旦腫物が平均体積３５０ｍｍ^３になると、マウスは、ＫＲＡＳ阻害剤（アダグラシブ）および／またはＲＮＲ阻害剤（ゲムシタビン）を用いて、（１）ビヒクルのみ、（２）ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与、（３）ＲＮＲ（ゲムシタビン）１０ｍｇ／ｋｇ、１日おきに腹腔内、（４）ＲＮＲｉ（ゲムシタビン）１２０ｍｇ／ｋｇ １週間に１回腹腔内（５）ＲＮＲｉ（ゲムシタビン）１０ｍｇ／ｋｇ １日おきに腹腔内、および、ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与、または（６）ＲＮＲｉ（ゲムシタビン）１２０ｍｇ／ｋｇ １週間１回、腹腔内、および、ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与、の治療レジュメのうちの一つから開始した。

【0072】

単剤として、ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）のみが、腫瘍の成長を著しく遅らせることをもたらせた。しかしながら、１４日目までに、腫瘍は、ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）に対する耐性を表し始め、腫瘍の成長が再開された。ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）がＲＮＲ阻害剤（ゲムシタビン）と結合する場合、腫瘍の成長は研究３０日目まで継続して阻害された。組み合わせの効果をさらに評価するために、ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）処置において耐性を発現した４匹のマウスは、処置５に切り替えられた。これらのマウスの腫瘍の成長は、単剤処置に残ったマウスと比較して、阻害された。これらの実験の結果を例証するデータは、図１５に提供される。

【0073】

ｅｃＤＮＡは、犠牲になったマウスから得られた腫瘍からもたらされたエクスビボ培養物から調製された中期スプレッドにおいて測定された。ｅｃＤＮＡ数は、マウスのＫＲＡＳのＦＩＳＨを用いて判定された。図１６に示すように、ＫＲＡＳに増幅されたｅｃＤＮＡは、処置１または３において見られなかった。対照的に、ＫＲＡＳｉ耐性をもたらした処置は、処置群終了（Ｄ２１）またはＤ１６において、高いレベルのＫＲＡＳ ｅｃＤＮＡを蓄積した。Ｄ１６において単離された腫瘍からのＫＲＡＳ阻害剤およびＲＮＲ阻害剤の組み合わせを用いて処置されたマウスのＫＲＡＳ ｅｃＤＮＡレベルは、著しく低かった。

【0074】

実施例４：マウスのＫＲＡＳ突然変異腫瘍の処置
マウスにＣＴ２６ＷＴ Ｅ３ Ｇ１２Ｃ ＫＲＡＳ突然変異体腫瘍細胞が注入された。
一旦腫瘍が平均体積３５０ｍｍ^３になると、マウスは、ＫＲＡＳ阻害剤（アダグラシブ）および／またはＲＮＲ阻害剤（ゲムシタビン）を用いて、（１）ビヒクルのみ、（２）ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与、（３）ＲＮＲｉ（ゲムシタビン）２０ｍｇ／ｋｇ、２日に１回腹腔内、（４）ＲＮＲｉ（ゲムシタビン）１０ｍｇ／ｋｇ、２日に１回、および、ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与、または、（５）ＲＮＲｉ（ゲムシタビン）２０ｍｇ／ｋｇ、２日に１回腹腔内、および、ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与、の治療レジュメのうちの１つを開始した。

【0075】

図１７に示すように、かなりの腫瘍の成長が処置１～３において見られ、単剤のＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）は、腫瘍が耐性を獲得し、および腫瘍の成長が加速する前に、腫瘍の成長を約２週間遅らせた。ＫＲＡＳｉとＲＮＲｉの組み合わせは、腫瘍の成長を著しく阻害し、腫瘍の体積を０に近づけた。ＲＮＲｉ（処置４）のより低い用量では、８匹のマウスのうちの７匹は完全寛解に達し、および、７匹のマウスのうちの７匹はＲＮＲｉ（処置５）のより高い用量で完全寛解に達した。この研究における処置の生存プロットは、図１８に示される。

【0076】

処置群のマウスから採取した腫瘍から樹立した中期停止・固定されたエクスビボ株から中期スプレッドを調製し、および、ｅｃＤＮＡを、マウスＫＲＡＳについてＦＩＳＨにより可視化した。ＫＲＡＳにより増幅されたｅｃＤＮＡは、手作業および／または認証されたコンピューターアルゴリズムであるｅｃＳＥＧ（ソフトウェアパッケージであり、Ｒａｊｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｓｅｍａｎｔｉｃ Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｐｈａｓｅ Ｉｍａｇｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ、 ｉＳｃｉｅｎｃｅ、 Ｖｏｌｕｍｅ ２１、 ２２ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１９、 ｐ ４２８－４３５の方法に基づいて開発された）によって定量化された。

【0077】

図１９に示すように、ビヒクルにより処置されたマウスおよびＲＮＲｉにより処置されたマウス（処置１および３）から採取された腫瘍では、ｅｃＤＮＡはほとんど観測されなかった（９２／１００ビヒクル、７８／９５ＲＮＲｉ）。ｅｃＤＮＡが存在する場合、コピー数は低く、中期スプレッドあたり１～３である。対照的に、ＫＲＡＳｉで処置されたマウス（処置グループ２）では、急速に成長する腫瘍から採取されたサンプルは、ｅｃＤＮＡの広い普及を示し（１１７／１６１の中期スプレッド、ＫＲＡＳｅｃＤＮＡまたはｅｃＤＮＡ、およびＫＲＡＳ染色体の増幅）、著しく高いｅｃＤＮＡ数（中期スプレッドを含むｃＤＮＡにおける、平均１６個のＫＲＡＳｅｃＤＮＡ）を伴った。ｅｃＤＮＡは、処置群４および５のいくつかのマウスに対して評価され、それらのマウスは４０日後に処置から取り除かれた。予期されるように、これらの腫瘍においては、非常に低いｅｃＤＮＡが存在し、および、ｅｃＤＮＡが存在する場合、コピー数は中期スプレッド当たり１～７つのｅｃＤＮＡだった。このデータは、ＲＮＲｉが抗ｅｃＤＮＡ治療として作用するメカニズムについて認識を強化する。

【0078】

実施例５：耐性腫瘍細胞のエクスビボの増殖は、インビトロ耐性を提供するＫＲＡＳ ｅｃＤＮＡを維持する。
ＫＲＡＳｉに耐性ができたＣＴ２６ＷＴ Ｅ３ Ｇ１２Ｃ ＫＲＡＳ突然変異体腫瘍由来の細胞を、インビトロで１μＭのＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）の存在下で、成長された。細胞は、薬物の存在下で成長し続け、薬物耐性を確認した。親ＣＴ２６ ＷＴ Ｅ３株は、培養内で薬物に感受性があるままであった。ｅｃＤＮＡは、ＦＩＳＨ画像化によって観察され、および、手作業集計とｅｃＳＥＧによって測定された。図２０に示すように、薬剤耐性細胞は、高いレベルのｅｃＤＮＡを有する一方、親株は測定可能なｅｃＤＮＡを示さなかった。

【0079】

実施例６：インビボにおける、ＫＲＡＳｉおよびＲＮＲｉによる腫瘍の成長の阻害
実施例５のエクスビボで培養されたＫＲＡＳｉ耐性腫瘍細胞を、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスへ注入された。群ＢおよびＣのマウスはすべて、ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）を用いて処置され、この処置は注入の日から始まった。腫瘍が平均２００ｍｍ^３に到達したとき、群Ｃのマウスは、組み合わせ処置にうつされる。処置群は、（Ａ）ビヒクルのみ、（Ｂ）ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回、または（Ｃ）ＲＮＲｉ（ゲタシタビン）２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔、１日おき、およびＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回、である。図２１に示すように、ＫＲＡＳｉおよびＲＮＲｉの組み合わせは動物の腫瘍の成長を阻害した。

【0080】

ＲＮＲｉ単独、およびＫＲＡＳｉとの組み合わせによる処置の有効性を検証するために、注入は同様の条件で繰り返された。上記のように、マウスは、ＫＲＡＳ耐性の腫瘍細胞を注入された。腫瘍が２９０ｍｍ^３に到達した際、マウスは、翌日から、（Ａ）ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回、（Ｂ）ＲＮＲｉ（ゲタシタビン）１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔、１日おき、あるいは（Ｃ）ＲＮＲｉ（ゲタシタビン）１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔、１日おき、およびＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回、というかたちで処置された。ＲＮＲｉ単独とＫＲＡＳｉとの組み合わせを共に用いることは、図２２に示すように、マウスの腫瘍の成長を阻害した。

【0081】

ＫＲＡＳｉと組み合わせてＣＨＫ１ｉを用いる処置の有効性を検証するために、実験は同様の条件で繰り返された。マウスは、ＫＲＡＳ耐性の腫瘍細胞を、上記のように注入された。腫瘍が約１８０ｍｍ^３に到達したとき、マウスは、（Ａ）ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回、（Ｂ）ＣＨＫ１ｉ（プレキサセルチブ）２０ｍｇ／ｋｇ、皮下、７日ごとに３日間、１日２回、あるいは（Ｃ）ＲＮＲｉ（ゲムシタビン）１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔、１日おき、およびＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回、処置された。ＣＨＫｉおよびＲＮＲｉとのＫＲＡＳｉとの組み合わせは、どちらも、マウスの腫瘍の成長を阻害した（図２３）。

【0082】

ＫＲＡＳｉと組み合わせてＷＥＥ１ｉを用いる処置の有効性を検証するために、実験はで繰り返された。マウスは、ＫＲＡＳ耐性の腫瘍細胞を、上記のように注入された。腫瘍が１８０ｍｍ^３に到達したとき、マウスは、（Ａ）ＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回、（Ｂ）ＷＥＥ１ｉ（アダボセルチブ）６０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回、（Ｃ）ＷＥＥ１ｉ（アダボセルチブ）６０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日おき、およびＫＲＡＳｉ（アダグラシブ）５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日１回、あるいは（Ｄ）ＷＥＥ１ｉ（ＰＤ０１６６２８５）０．３ｍｇ／ｋｇ、腹腔１日１回、の処置を受けた。ＷＥＥ１ｉとＫＲＡＳｉとの組み合わせを併用することは、ＷＥＥ１ｉであるアダボセルチブを単独で用いるのと同様、どちらもマウスの腫瘍の成長を阻害したが、最大の阻害はアダグラシブとアダボセルチブで観察された（図４５を参照せよ）。

【0083】

実施例７：インビトロでのＳＮＵ１６細胞の処置
中期のＳＮＵ１６細胞（ヒト胃未分化がん細胞株（ＡＴＣＣ））は、ＭＹＣおよびＦＧＦＲ２の存在について、ＦＩＳＨによって分析された。ｅｃＤＮＡも定量化された。図２４に示すように、ＭＹＣおよびＦＧＦＲ２を含んでいる高いレベルのｅｃＤＮＡが細胞に存在し、１つのサブセットがＭＹＣおよびＦＧＦＲ２の両方を含有している。

【0084】

ＳＮＵ１６細胞を、１μＭのＦＧＦＲ阻害剤（インフィグラチニブ）で９週間処置した。ＤＮＡは、３日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、および６３日目に採取され、ｑＰＣＲが、各時点におけるＭＹＣ、ＦＧＦＲ２、およびＥＧＦＲのコピー数を評価するために実行された。インフィグラチニブによる処置の８週間後の細胞は、および未処置のＳＵＮ１６対照細胞もまた、ＥＧＦＲについてＦＩＳＨによりアッセイされた。図２４に示すように、細胞がＦＧＦＲ阻害剤に対する耐性ができるにつれて（したがって、インフィグラチニブで生存し続ける）、ＥＧＦＲのコピー数は増加したが、一方で初期のＳＮＵ１６細胞においてすでに増幅されているＭＹＣおよびＦＧＦＲ２のコピー数は比較的一定であった。図２４のＦＩＳＨによって示されるように、ＥＧＦＲ増幅は、これらの処置された細胞におけるｅｃＤＮＡに局在した。

【0085】

インフィグラチニブ耐性の発現全体を通してのｅｃＤＮＡコピー数の動態を評価するために、ＤＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡは抽出され、Ｔａｑｍａｎコピー数アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、ＤＮＡは増幅された。ＥＧＦＲ ＴａｑｍａｎアッセイＩＤは、Ｈｓ００９９７４２４＿ｃｎであり、ＧＦＧＲ２アッセイＩＤは、Ｈｓ０５１８２４８２＿ｃｎであり、および、ＭＹＣアッセイＩＤはＨｓ０３６６０９６４＿ｃｎであった。サイクルの閾値は、ＲＮａｓｅ Ｐ Ｔａｑｍａｎアッセイの内部に対して正規化され、ならびに、遺伝子コピー数は、ΔΔＣｔ法を用いて算出され、および二倍体対照細胞株由来のＤＮＡはＤＬＤ１であるＤＮＡである。

【0086】

蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のための中期細胞を収集するために、Ｔｕｒｎｅｒｅｔ ａｌ、 ２０１９に記載されたとおりの基本プロトコルに従った。簡単に言えば、細胞をコルセミドで少なくとも３時間インキュベートし、次に塩化カリウム低張液で処置し、Ｃａｒｎｏｙの溶液（３：１メタノール：氷酢酸ｖ／ｖ）を用いて固定した。固定された中期細胞は、加湿されたスライドに滴下され、その後、昇順のエタノールシリーズで脱水された。ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、およびＭＹＣにハイブリダイズするＦＩＳＨプローブは、Ｅｍｐｉｒｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社から購入した。プローブのハイブリダイゼーション後、スライドを０．４Ｘ ＳＳＣ／０．３％ ＩＧＥＰＡＬ緩衝溶液で洗浄し、次に２Ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＩＧＥＰＡＬで最終洗浄をした。ＤＡＰＩを含むマウンティング培地をスライドに塗布し、カバースリップを加え、メタフェーズの細胞を、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８００顕微鏡を用いて６３０倍の総倍率で画像化した。

【0087】

ＦＩＳＨアッセイからの画像を用いて、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、またはＭＹＣを含むｅｃＤＮＡの数を定量した。画像は、Ｂｏｕｎｄｌｅｓｓ Ｂｉｏ、 Ｉｎｃ．が開発したｅｃＳＥＧソフトウェアにアップロードした。

【0088】

実施例８：ＲＮＲｉは、ＳＮＵ１６細胞における一次耐性および二次耐性の発現を防止する。
図２５は、インフィグラチニブによるＦＧＦＲ２の阻害とＲＮＲ阻害剤ゲムシタビンによるｅｃＤＮＡの阻害の同時阻害が、インフィグラチニブに対する一次耐性の発現を完全に阻害することを示す。２ｘ１０^６個のＳＮＵ１６細胞を６群に分け、１ｕＭのインフィグラチニブ、１ｕＭのエロチニブ、１０ｎＭのゲムシタビン、１ｕＭのインフィグラチニブと１ｕＭのエロチニブ、１ｕＭのインフィグラチニブと１０ｎＭのゲムシタビンで処置し、１２週間にわたって細胞の成長を記録した。各処置群は、細胞数が５ｘ１０^６に達した時点で終了とした。エルロチニブ処置は、それ自体では細胞の成長に影響を与えなかった。ゲムシタビンは最初の２週間は細胞の成長を遅らせたが、その後、細胞は急速に増殖した。インフィグラチニブは５週間、細胞の成長を強く抑制したが、その後、細胞は耐性を発現し、急速に成長した。エルロチニブとインフィグラチニブの併用処置は、最初の５週間は強い成長抑制効果を示したが、その後、細胞は耐性を獲得し始め、試験期間中は成長速度が上昇した。しかし、インフィグラチニブとゲムシタビンの併用処置は、試験期間中、細胞の成長を完全に抑制し、耐性を発現できた細胞は存在しなかった。

【0089】

図２６は、ＲＮＲ阻害剤がＳＮＵ１６細胞におけるエルロチニブに対する二次耐性の発現を防止することを示す。インフィグラチニブ耐性ＳＮＵ１６細胞（図２５に示すように生成される）を６群に細分化し、１×１０^６細胞の各群を１ｕＭのインフィグラチニブ、１ｕＭのエルロチニブ、１０ｎＭゲムシタビン、あるいは１ｕＭのエルロチニブと１０ｎＭのゲムシタビンによる処置に供し、細胞の成長を５週間にわたり記録した。各処置群は、細胞数が５ｘ１０^６に達した時点で終了した。インフィグラチニブ処置は、それ自体では細胞増殖に影響を与えなかった。ゲムシタビンは、エルロチニブと同様に、最初の２週間は細胞の成長を遅らせたが、その後、細胞は急速に成長した。エルロチニブとインフィグラチニブの併用処置は、最初の３週間は中程度の成長抑制効果を示したが、その後、細胞は耐性を発現し始め、試験の残りの期間は成長速度が増加した。しかし、エルロチニブとゲムシタビンの併用処置は、試験の全期間において細胞成長を完全に阻害し、耐性を発現することができる細胞は存在しなかった。

【0090】

図３０は、ＷＥＥ１阻害剤であるアダボセルチブが、ＳＮＵ１６細胞におけるインフィグラチニブ処置における耐性形成を防止することを示す。ＳＮＵ１６細胞を５群に細分化し、１×１０^６細胞の各群を、１μＭのインフィグラチニブ、１μＭのエルロチニブ、１μＭのインフィグラチニブと１μＭのエルロチニブ、０．１μＭのアダボセルチブで処置し、９週間にわたって細胞の成長を記録した。インフィグラチニブは一過性の成長抑制をもたらし、エルロチニブ処置は単独では細胞の成長に影響を与えなかった。インフィグラチニブとエルロチニブの併用処置は、約６週間細胞の成長を遅らせたが、その後、細胞は急速に成長した。しかし、インフィグラチニブとアダボセルテルティブの併用処置では、試験期間中、細胞成長が完全に阻害され、耐性を発現することができる細胞は存在しなかった。

【0091】

図３４は、ＰＡＲＧ阻害剤であるＰＤ０００１７２７３が、ＳＮＵ１６細胞におけるインフィグラチニブ処置時の耐性形成を著しく遅らせることを示す。ＳＮＵ１６細胞を５群に細分化し、１×１０^６細胞の各群を、インフィグラチニブ、エルロチニブ、ＰＤ０００１７２７３、インフィグラチニブとエルロチニブ、又はインフィグラチニブとＰＤ０００１７２７３で処置し、９週間にわたって細胞の成長を記録した。ＰＤ０００１７２７３とエルロチニブは、単独では細胞の成長にほとんど、あるいはまったく影響を与えなかったが、インフィグラチニブでは約３週間にわたり一過性の成長抑制が認められた。インフィグラチニブとエルロチニブの併用処置では、約６週間、細胞の成長が遅延したが、その後、細胞は急速に成長しつづけた。しかし、インフィグラチニブとＰＤ０００１７２７３の併用処置では、細胞成長が抑制され、試験期間中、低レベルに維持された。

【0092】

方法
ＳＮＵ１６対照細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の標準組織培養条件下で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。低継代コントロール細胞を、９週間にわたって１μＭのインフィグラチニブで処置した。細胞は必要に応じて継代し、培地とインフィグラチニブは少なくとも１週間に１回交換された。ＤＮＡは３日目、ならびに２、４、６、８、および９週目に採取した。中期細胞は、コントロールとインフィグラチニブ耐性細胞の両方から８週目に収集された。

【0093】

ＳＮＵ１６（ＣＲＬ－５９７４）細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。ＳＮＵ１６細胞は、１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で成長した。耐性実験のために、ＳＮＵ１６細胞をＴ７５フラスコあたり２００万でプレーティングし、１μＭのインフィグラチニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１μＭのエロチニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１０ｎＭのゲムシタビン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、または組み合わせのいずれかで処置した。培地は少なくとも１週間に１回交換し、新鮮な薬剤を添加した。数週間のスパンで細胞をカウントし、細胞成長を測定した。

【0094】

実施例９：ヒーラｅｃＤＮＡ＋対ヒーラｅｃＤＮＡ－キノームＣＲＩＳＰＲスクリーンにおけるＷＥＥ１ガイドの脱落。
図３３は、プールされたＣＲＩＳＰＲスクリーンにおけるＷＥＥ１ノックアウトに対するヒーラｅｃＤＮＡ＋細胞のヒーラｅｃＤＮＡ－細胞を上回る感受性の増加を示す。ＷＥＥ１を標的とする異なる１０種類のガイドについての正規化ｓｇＲＮＡガイドドロップスコアのレベルを、ヒーラｅｃＤＮＡ－細胞（ＷＴ）、およびｅｃＤＮＡ上で増幅したＤＨＦＲを保有するヒーラｅｃＤＮＡ＋細胞について示す。ヒーラｅｃＤＮＡ＋は、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングの期間中、１ｕＭのメトトレキサートの非存在下（－ＭＴＸ）または存在下（＋ＭＴＸ）のいずれかで成長した。プールされたガイドライブラリーの内の元のレベルに対するガイド脱落スコアが、７日目、１４日目および２１日目のＮＧＳシーケンシングによって３つのアームすべてについて判明した。破線の横線は、ｅｃＤＮＡ＋株とｅｃＤＮＡ－株の最も効果的なＷＥＥ１ガイドの示差ドロップスコアを示し、ＷＥＥ１ノックアウトに対するｅｃＤＮＡ＋株の感受性がより高いことを示し、これらの細胞の複製ストレス誘導因子に対する感受性が高いことをさらに裏付けている。

【0095】

実施例１０：ｅｃＤＮＡ＋細胞において、塩基複製ストレスマーカーが上昇され、ＲＳ誘導物質に対する感受性が高まった。
図３８は、ｅｃＤＮＡ＋細胞が塩基複製ストレスのレベルを高めていることを示している。内在性一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）損傷誘発複製ストレスを判明するために、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）３２の過リン酸化形態Ｓｅｒ４／Ｓｅｒ８が、未処置および固定したｅｃＤＮＡ＋（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）およびｅｃＤＮＡ－（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）細胞株モデルの免疫蛍光によって検出された。ｅｃＤＮＡ＋細胞およびｅｃＤＮＡ－細胞において免疫蛍光法により検出された全ｐ－ＲＰＡ３２ Ｓ４／Ｓ８フォーシスの細胞定量化（最小閾値＞３点／細胞）を示す代表的な箱ひげ図である。＞３点／細胞である５０００個のｅｃＤＮＡ－細胞と６０００個のｅｃＤＮＡ＋細胞の合計を処置し、分析した。統計的有意性は、ノンパラメトリックｔ検定を用いて計算した。ｅｃＤＮＡ＋細胞は、高められた基礎的な複製ストレスを有することが見出される。

【0096】

図３９Ａ～３９Ｂは、ｅｃＤＮＡ＋細胞が、染色体上の同等のＭＹＣ遺伝子増幅を有するｅｃＤＮＡ－細胞に対して、ＤＮＡ複製フォーク速度が本質的に低下していることを示す。図３９Ａにおいて、フォーク速度の測定を含む複製路の分析を可能にするために、未処置のｅｃＤＮＡ＋（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）およびｅｃＤＮＡ－（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）細胞株モデルにおいてＤＮＡファイバー分析が実施された。２つの細胞モデルを、チミジンアナログであるクロロデオキシウリジン（ＣｌｄＵ）およびヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）でそれぞれ３０分間パルス標識した。細胞を溶解し、ＤＮＡファイバーを散らばらせ、ＣｌｄＵおよびＩｄＵに対する特異的な抗体を用いて免疫染色した。図３９Ｂに示すように、Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭを有するｅｃＤＮＡは、Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ ｅｃＤＮＡ－細胞と比較して、平均的に低下したフォーク速度を示した。ｅｃＤＮＡ＋細胞とｅｃＤＮＡ－細胞の間の複製フォーク速度において－０．１８ｋｂ／ｍｉｎの差が観察された。統計的有意性は、ノンパラメトリックのコルモゴロフスミルノフ検定を用いて算出した。

【0097】

図４０Ａ～４０Ｃは、ＲＮＲの阻害がヌクレオチド合成をブロックし、ｅｃＤＮＡ－腫瘍細胞と比較してｅｃＤＮＡ＋腫瘍細胞において複製ストレスの悪化および細胞形質転換の減少を引き起こすことを示す。実証されたように、ＲＮＲの阻害によりｅｃＤＮＡ＋ＣＯＬＯ３２０－ＤＭ細胞で観察された複製ストレスの悪化は、図４０Ａにおいて細胞増殖／形質転換の変化をもたらす。図４０Ｂに示すデータは、代表的なＦＩＳＨ画像と、増幅されたがん遺伝子を持つｅｃＤＮＡの数の変化の定量化である。図４０Ｃに示すデータは、ＲＮＲｉによる複製ストレスへの影響が、ヌクレオチド枯渇の結果であることを示すものである。図４０Ａにおいて、細胞形質転換を評価するために、インビトロ軟寒天コロニー形成アッセイが行われ、ｅｃＤＮＡを有するＣＯＬＯ３２０－ＤＭおよびＳＮＵ１６細胞モデルが、この３Ｄ－フォーマットアッセイにおいてｅｃＤＮＡ－細胞モデル、ＣＯＬＯ３２０－ＨＤＲおよびＤＬＤ１と共に２１日間成長させられた。細胞は、増加させたＲＮＲｉである（５－クロロ－２－［［ｒａｃ－（１Ｓ、２Ｒ）－２－（６－フルオロ－２、３－ジメチルフェニル）－１－（２－オキソ－３Ｈ－１、３、４－オキサジアゾール－５－イル）プロピル］スルファモイル］ベンズアミド）の容量で、細胞播種の日に１度だけ個別に処置された。図４０Ｂにおいて、ｅｃＤＮＡを保有するＭＹＣ増幅されたがん遺伝子数における変化を決定するために、ｅｃＤＮＡ＋（ＣＯＬＯ３２０－ＤＭ）細胞を、ＩＣ－９０用量（１０ｕＭ）のＲＮＲｉで２１日間処置した。対数成長期（ｌｏｇ－ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ）の細胞は中期で停止した。ＭＹＣがん遺伝子のＦＩＳＨ（蛍光インシトゥハイブリデーション法）を、固定された中期スプレッド対して行い、核をＤＡＰＩで対比染色した。図４０Ｃにおいて、ＲＮＲの阻害時にｅｃＤＮＡ＋ＣＯＬＯ３２０－ＤＭ細胞で観察された複製ストレスの悪化が、枯渇した細胞ヌクレオチドプールに起因するかどうかを決定するために、ｅｃＤＮＡ＋ＣＯＬＯ３２０－ＤＭ細胞を、ＲＮＲｉの単一のＩＣ－７０用量（７ｕＭ）、および外因性ヌクレオシドの増加用量（ＡＴＧＵＣ）で１６時間同時に処置した。細胞を溶解し、ｓｓＤＮＡ損傷による複製ストレスのマーカーとしてｐＲＰＡ３２－Ｓ３３抗体で免疫ブロットした。ＲＮＲを阻害すると、ヌクレオチド合成が阻害され、ｅｃＤＮＡ＋腫瘍細胞ではｅｃＤＮＡ（－）と比較して複製ストレスが増強され、細胞形質転換が抑制されることが判明した。

【0098】

図４１Ａ～４１Ｂは、ｅｃＤＮＡ＋細胞が、複数のモデルにわたって、ＣＨＫ１ｉに応答して複製ストレスの強化を示すことを示す。図４１Ａに示すように、ヒーラｅｃＤＮＡ＋細胞は、ＧＤＣ０５７５によるＣｈｋ１阻害に対してヒーラｅｃＤＮＡ－細胞よりも増加した感受性を示す。ＤＨＦＲ ｅｃＤＮＡを保有し、抵抗性を維持するために１ｕＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下で増殖させた（ＭＴＸ－Ｒ）ヒーラｅｃＤＮＡ＋細胞において、ＤＨＦＲタンパク質レベルが顕著に向上した（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）。２００ｎＭのＧＤＣ０５７５を用いて２４時間処置すると、ヒーラｅｃＤＮＡ＋細胞はｅｃＤＮＡ－細胞よりもはるかに強いＲＳとＤＮＡ損傷のマーカー誘導を示した。Ｓ３４５におけるＣｈｋ１リン酸化の増加は、ＲＳ活性化ＡＴＲキナーゼの高い活性化を示し、ｇＨ２ＡＸの増加は、複製ストレスによって引き起こされるＤＮＡ二本鎖切断に起因する損傷の増加を示す。図４１Ｂは、ＣＨＫ１経路の阻害時に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）損傷で誘発される複製ストレスを把握する実験を示す。複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）３２ Ｓｅｒ４／Ｓｅｒ８の過リン酸化形態は、ＣＨＫ１ｉ ＧＤＣ－０５７５で１６時間前処置した固定ｅｃＤＮＡ＋（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）およびｅｃＤＮＡ－（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）細胞株モデルにおいて免疫蛍光により検出した。代表的な棒グラフは、ｅｃＤＮＡ＋細胞およびｅｃＤＮＡ－細胞において免疫蛍光法で検出されたＰ－ＲＰＡ３２ Ｓ４／Ｓ８フォーシ（３点／核以上の最小閾値）に対して陽性な全核の％を表す。ＣＨＫ１阻害は、ｅｃＤＮＡ＋（ＤＭ）細胞において、マッチしたｅｃＤＮＡ－（ＨＳＲ）細胞に対してｐＲＰＡレベルを増加させることが判明した。

【0099】

４２Ａ～４２Ｂは、ｅｃＤＮＡ（＋）がん細胞における内在性複製フォーク機能不全が、ｅｃＤＮＡ（－）細胞と比較してＲＮＲ阻害によってさらに損なわれることを示す。フォーク速度の測定を含む、ＲＮＲ経路の阻害に伴う複製路の分析を可能にするために、ＲＮＲｉゲムシタビンで１６時間処置したｅｃＤＮＡ＋（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）およびｅｃＤＮＡ－（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）細胞株モデルにおいてＤＮＡファイバー分析を実施した。次に、２つの細胞モデルを、チミジンアナログのクロロデオキシウリジン（ＣｌｄＵ）およびヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）でそれぞれ３０分間パルス標識した（図４２Ａ）。細胞を溶解し、ＤＮＡ繊維を広げ、ＣｌｄＵおよびＩｄＵに対する特異抗体を用いて免疫染色した。図４２Ｂに示すように、ｅｃＤＮＡ＋がん細胞における内在性複製フォーク機能不全は、ｅｃＤＮＡ－細胞と比較してＲＮＲ阻害によりさらに低下するが、複製フォーク速度の低下は、ＲＮＲｉでの処置によりＣｏｌｏ３２０ ＨＳＲ ｅｃＤＮＡ－細胞でも観察された。ＲＮＲｉで処置したｅｃＤＮＡ＋細胞とｅｃＤＮＡ－細胞の間で、複製フォーク速度に－０．１３ｋｂ／ｍｉｎの差が観察された。統計的有意性はノンパラメトリックのコルモゴロフスミルノフ検定を用いて算出した。

【0100】

図４３Ａ～４３Ｂは、ｅｃＤＮＡ＋がん細胞における内在性複製フォーク機能不全が、ｅｃＤＮＡ－細胞と比較してＣＨＫ１阻害によってさらに損なわれることを示している。フォーク速度の測定を含むＣＨＫ１経路の阻害時の複製路の分析を可能にするために、ＣＨＫ１ｉ プレキサセルチブで１６時間処置したｅｃＤＮＡ＋（Ｃｏｌｏ３２０ ＤＭ）およびｅｃＤＮＡ－（Ｃｏｌｏ３２０ ＨＳＲ）細胞株モデルにおいてＤＮＡファイバー分析を実施した。次に、２つの細胞モデルを、チミジンアナログのクロロデオキシウリジン（ＣｌｄＵ）およびヨードオキシウリジン（ＩｄＵ）でそれぞれ３０分間パルス標識した（図４３Ａ）。細胞を溶解し、ＤＮＡファイバーを広げ、ＣｌｄＵおよびＩｄＵに対する特異抗体を用いて免疫染色した。図４３Ｂに示すように内在性複製フォーク機能不全は、ＣＨＫ１阻害によりｅｃＤＮＡ（－）細胞と比較して、さらに損なわれるが、複製フォーク速度の低下は、ＣＨＫ１ｉでの処置によりＣｏｌｏ３２０ ＨＳＲ ｅｃＤＮＡ－細胞でも観察された。ＣＨＫ１ｉで処置したｅｃＤＮＡ＋細胞とｅｃＤＮＡ－細胞の間では、複製フォーク速度に－０．１ｋｂ／分の差が観察された。統計的有意性は、ノンパラメトリックのコルモゴロフ－スミノフテストを用いて計算した。

【0101】

図４４は、がん細胞における主要ながん原性ドライバーの薬理学的阻害を用いる標的療法が、ＲＮＲのＲＲＭ２サブユニットのタンパク質レベルの減少をもたらすことを示す。ｅｃＤＮＡまたはＨＳＲのいずれかで増幅されたがん遺伝子を保有するか、または増幅を欠くことが以前に決定されている４つの細胞株が示されている（ＣＴ２６）。腫瘍性タンパク質を阻害すると、２４～４８時間以内にＲＲＭ２タンパク質レベルが急速に低下したことから、これらの阻害剤は間接的にｄＮＴＰｓレベルの低下と複製ストレスの誘発をもたらす可能性が示唆された。この仮説と一致して、Ｈ２１７０細胞とＳＮＵ１６細胞でそれぞれｅｃＤＮＡ増幅ＨＥＲ２とＦＧＦＲ２を阻害すると、複製フォークの崩壊とＤＮＡ損傷のマーカーとして知られているｇＨ２ＡＸが同時に増加した。興味深いことに、ＨＳＲとしてＦＧＦＲ２増幅を保有するＫＡＴＯＩＩＩ細胞や、がん遺伝子増幅を保有しないＣＴ２６細胞では、ＲＲＭ２量が減少したにもかかわらずｇＨ２ＡＸの増加が見られなかったことから、ｅｃＤＮＡ保有細胞はＲＲＭ２量の減少や複製ストレスに対して特に感受性があるということがさらに証明された。さらに、ＳＮＵ１６細胞におけるこのＲＲＭ２レベルの減少は、５～６週間という長期間にわたって維持されることが示され、ＲＮＲ活性を維持するための代償機構がないことが示唆された。これらの知見は、ｅｃＤＮＡを持つがんにおいて、標的治療剤とＲＳ誘導物質の組み合わせの合理性を強調するものである。

【0102】

実施例１１：ｅｃＤＮＡ＋細胞とｅｃＤＮＡ－細胞における標的治療剤に対する耐性
表２（下記）は、ｅｃＤＮＡ＋細胞対ｅｃＤＮＡ－細胞における耐性発現の時系列を示す。経時的な成長動態を測定するために、各細胞株は、増幅されたがん遺伝子に対する標的阻害剤で週に１回又は２回処置した。ＳＫＢＲ３およびＣａｌｕ－３の場合、イルビニチニブは、相対ＥＣ５０の２倍から始めて、相対ＥＣ５０の４倍に増加させ、合計６週間にわたり、経時的に増加させた。Ｈ２１７０の場合、イルビニチニブをＥＣ９０（５００ｎＭ）で先行使用し、細胞の成長を３週間モニターしたところ、その時点でＤＭＳＯ対照細胞と同程度の速度で増殖していた。ＳＮＵ１６およびＫＡＴＯＩＩＩの場合、インフィグラチニブをＥＣ９０（１ｕＭ）で添加し、細胞成長をそれぞれ６週間および１１週間モニターした。

【0103】

これらの長期成長曲線について、標的療法のＥＣ５０は、まず短期５日間生存率アッセイで決定された。イルビニチニブのＥＣ５０を決定するために、Ｈ２１７０細胞を９６ウェルプレートに３０００細胞／ウェルでプレーティングした。ＳＫＢＲ３およびＣａｌｕ－３細胞は、９６ウェルプレートに３５００細胞／ウェルでプレーティングされた。すべての細胞にＤＭＳＯコントロールとともにイルビニチニブを５日間連続投与した（１２ｎＭから１ｕＭまでの範囲の連続希釈）。ＥＣ５０曲線は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存率に基づき決定した。インフィグラチニブのＥＣ５０を決定するために、ＳＮＵ１６およびＫＡＴＯＩＩＩ細胞を９６ウェルプレートに１０００細胞／ウェルでプレーティングし、ＤＭＳＯコントロールとともにインフィグラチニブで５日間連続処理した（４ｎＭから１ｕＭまでの連続希釈）。ＥＣ５０曲線は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ２．０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞生存率に基づいて決定された。ドライバーがん遺伝子に対する標的療法は、がん遺伝子の増幅のタイプによって効果に差が見られた。Ｈ２１７０やＳＮＵ１６のようにｅｃＤＮＡ上でがん遺伝子が増幅している細胞株は、ＳＫＢＲ３、Ｃａｌｕ－３、ＫＡＴＯＩＩＩのように染色体上でがん遺伝子が増幅している細胞株に比べて、標的治療剤の存在下で抵抗性を獲得し、成長を続ける能力が著しく優れていた（表２）。

【0104】

【表2】

【0105】

本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、および記載されてきたが、そのような実施形態が例示としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換が当業者に生じるであろう。本明細書に記載された実施形態に対する様々な代替案が採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が実施形態の範囲を定義し、これらの請求項の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物がそれによってカバーされることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37-1】

【図37-2】

【図38】

【図39A】

【図39B】

【図40A】

【図40B】

【図40C】

【図41A】

【図41B】

【図42A】

【図42B】

【図43A】

【図43B】

【図44】

【図45】

【国際調査報告】