特表2023-542417ＫＲＡＳ変異に特異的Ｔ細胞受容体のスクリーニング及び抗腫瘍用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-06
(54)【発明の名称】ＫＲＡＳ変異に特異的Ｔ細胞受容体のスクリーニング及び抗腫瘍用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230929BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20230929BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230929BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230929BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230929BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230929BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230929BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20230929BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/725 ZNA
C12N15/867 Z
C12N5/10
C12P21/02 C
A61P35/00
A61K48/00
A61K38/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023519189
(86)(22)【出願日】2021-09-29
(85)【翻訳文提出日】2023-05-26
(86)【国際出願番号】 CN2021121576
(87)【国際公開番号】W WO2022068850
(87)【国際公開日】2022-04-07
(31)【優先権主張番号】202011047695.0
(32)【優先日】2020-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517121939
【氏名又は名称】中国科学院微生物研究所
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】高福
(72)【発明者】
【氏名】譚曙光
(72)【発明者】
【氏名】盧丹
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA05
4B065AA92X
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4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA06
4C084AA13
4C084BA44
4C084NA14
4C084ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA22
4H045FA74
(57)【要約】
本発明はＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｖ又はＧ１２Ｃ変異のエピトープを標的とする２種類の特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗腫瘍用途を提供し、前記２種類のＴ細胞受容体はそれぞれα鎖とβ鎖という２本のペプチド鎖からなる。また、本発明は、前記ＴＣＲの抗原結合断片、それらをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、並びにＫＲＡＳのＧ１２Ｖ変異に特異的なＴＣＲまたはその抗原結合断片を製造する方法を提供する。本発明の特異的ＴＣＲおよびその抗原結合断片は、生体の免疫応答を刺激する免疫賦活剤として使用することができ、これにより腫瘍などの疾患への対抗効果を発生させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合断片であって、前記ＴＣＲは、α鎖可変領域とβ鎖可変領域を含み、
前記ＴＣＲまたはその抗原結合断片は、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ８－１６（ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ）エピトープとＨＬＡ－Ａ１１との複合体、またはＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ８－１６（ＶＶＧＡＣＧＶＧＫ）エピトープとＨＬＡ－Ａ１１との複合体、またはＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ８－１６（ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ）エピトープとＨＬＡ－Ａ０３との複合体と結合することができ、以下のα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）とβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合断片：
配列番号３に記載のα鎖相補性決定領域ＣＤＲ１；
配列番号４に記載のα鎖相補性決定領域ＣＤＲ２；
配列番号５に記載のα鎖相補性決定領域ＣＤＲ３；
配列番号８に記載のβ鎖相補性決定領域ＣＤＲ１；
配列番号９に記載のβ鎖相補性決定領域ＣＤＲ２；及び
配列番号１０に記載のβ鎖相補性決定領域ＣＤＲ３、
または
配列番号１３に記載のα鎖相補性決定領域ＣＤＲ１；
配列番号１４に記載のα鎖相補性決定領域ＣＤＲ２；
配列番号１５に記載のα鎖相補性決定領域ＣＤＲ３；
配列番号１８に記載のβ鎖相補性決定領域ＣＤＲ１；
配列番号１９に記載のβ鎖相補性決定領域ＣＤＲ２；及び
配列番号２０に記載のβ鎖相補性決定領域ＣＤＲ３。
【請求項2】
配列番号２に記載のα鎖可変領域、及び配列番号７に記載のβ鎖可変領域；
または
配列番号１２に記載のα鎖可変領域、及び
配列番号１７に記載のβ鎖可変領域；
を含む、請求項１に記載のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記ＴＣＲは、鼠由来ＴＣＲ、ヒトー鼠キメラＴＣＲまたはヒト化ＴＣＲである、請求項１または２に記載のＴＣＲまたはその抗原結合断片。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＣＲまたはその抗原結合断片をコードし、配列番号１、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６からなる群より選ばれる１つまたは複数の配列である、ポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含み、レンチウイルスベクターである、発現ベクター。
【請求項6】
請求項５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項7】
以下のステップを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＣＲまたはその抗原結合断片を製造する方法：１）請求項６に記載の宿主細胞を培養するステップ；及び
２）前記宿主細胞またはその培地から、請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＣＲまたはその抗原結合断片を回収するステップ。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＣＲまたはその抗原結合断片、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項9】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＣＲまたはその抗原結合断片の、Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮ－γサイトカインのレベルを高めるための医薬の製造における、使用であって、前記医薬は、例えばタンパク質系医薬、ＡＤＣ医薬、またはＴＣＲと抗原を組み合わせた医薬である、使用。
【請求項10】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＣＲまたはその抗原結合断片の、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ８－１６（ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ）またはＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ８－１６（ＶＶＧＡＣＧＶＧＫ）変異を発現する腫瘍細胞を検出する試薬の製造における、使用、または腫瘍を検出又は診断する試薬の製造における、使用であって、好ましくは、前記ＴＣＲまたはその抗原結合断片は、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ８－１６（ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ）／ＨＬＡ－Ａ１１、またはＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ８－１６（ＶＶＧＡＣＧＶＧＫ）／ＨＬＡ－Ａ１１、またはＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ８－１６（ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ）エピトープ及びＨＬＡ－Ａ０３と特異的に結合し、または
前記ＴＣＲまたはその抗原結合断片は、ＨＬＡ－Ａ１１またはＨＬＡ－Ａ０３と類似した抗原結合特性を有するＨＬＡ分子、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ８－１６（ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ）、またはＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ８－１６（ＶＶＧＡＣＧＶＧＫ）変異ポリペプチドと特異的に結合し、ここで、前記ＨＬＡ分子は、好ましくはＨＬＡ－Ａ３１、ＨＬＡ－Ａ３３、ＨＬＡ－Ａ６８またはＨＬＡ－Ａ３０である、使用。
【請求項11】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＴＣＲまたはその抗原結合断片の、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｖ及びＧ１２Ｃ変異を有する腫瘍の患者を治療するための抗腫瘍薬の製造における、使用であって、前記腫瘍は、好ましくは膵臓癌、大腸癌、肺癌であり、前記肺癌は、好ましくは非小細胞肺癌であり、
好ましくは、前記ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｖ及びＧ１２Ｃ変異はＫＲＡＳ遺伝子のＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｖ８－１６（ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ）変異又はＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｃ８－１６（ＶＶＧＡＣＧＶＧＫ）変異である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は医薬分野に属し、具体的には腫瘍KRAS遺伝子G１２VとG１２C変異の抗原ポリペプチドを特異的に識別できるT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片に関する。
【0002】
背景技術
２０１１年、癌は心臓病を上回り、世界第１位の死亡原因となった。WHOは２０１３年１２月に世界の年間新規癌患者数は１４００万例を超えたと公布し、これは２００８年の統計結果１２７０万例に比べて大幅に増加した。２０２０年までに、癌は毎年９６０万例の死亡を造成し、世界では毎年約１兆ドルが癌診療に投入されている。
２０１１年、癌は心臓病を上回り、世界第１位の死亡原因となった。WHOは２０１３年１２月に世界の年間新規癌患者数は１４００万例を超えたと公布し、これは２００８年の統計結果１２７０万例に比べて大幅に増加した。２０２０年までに、癌は毎年９６０万例の死亡を造成し、世界では毎年約１兆ドルが癌診療に投入されている。
【0003】
２０世紀８０年代初期、Allisonや他の研究者はT細胞表面で抗原識別を担当しているαβ T細胞受容体（TCR）の遺伝子構造を確定した。８０年代後期、Boone、Rosenberg、Oldらはそれぞれ研究を通じて、異なる腫瘍患者の体内には、いずれもいくつかの腫瘍特異性抗原が存在し、T細胞に識別され、腫瘍細胞を特異的に殺傷することができることを発現した。それによって、腫瘍免疫治療の希望を再燃させ、大量の研究は腫瘍治療性ワクチンの研究と開発に力を入れた。２０１３年、免疫抗癌療法はScience雑誌に年度１０大科学技術突破のトップに選ばれた。
【0004】
近年、幹細胞生物学、免疫学、分子技術、組織工学技術などの急速な発展に伴い、細胞免疫治療は安全で有効な治療手段として、腫瘍などの治療における役割がますます際立っている。現在、新型細胞治療技術の研究と開発は腫瘍などの関連疾患を解決する重要な研究分野となっている。
【0005】
養子T細胞療法（Adoptive cell therapy、ACT）は、高度に個性化された癌治療法であり、癌患者の体内に欠損しているまたは弱い免疫系を再建することで、抗腫瘍効果を達成することができる。ACT療法とは、腫瘍患者の体内から免疫活性細胞を分離し、体外で増幅と機能同定を行った後、患者に返送することで、腫瘍を直接殺傷したり、生体の免疫応答を刺激して腫瘍細胞を殺傷する目的を達成することである。ACT療法の制限要因は、正常の必須組織ではなく癌組織にのみ発現する抗原を探すことである。
【0006】
現在、ACT療法はT細胞受容体エンジニアリング細胞（TCR-T）治療技術とキメラ抗原受容体エンジニアリングT細胞（CAR-T）治療技術を含んで実現することができる。これらの方法により、ACTはメラノーマ、子宮頸癌、リンパ腫、白血病、総胆管癌、神経芽細胞腫などの多種の癌に対して良い治療効果を有する。
【0007】
現在、CAR-Tは急性/慢性粒細胞性白血病、リンパ腫などの疾病の治療においても重大な突破を実現し、患者の生存率と生存品質を大幅に高めた。しかし、固形腫瘍治療の研究では、特異的な標的が限られているため、CAR-T細胞の治療の見込みは明らかではない。
【0008】
CAR-T細胞が抗体を用いて細胞外抗原を標的とするのと異なり、TCRはすべてのT細胞表面の特徴的な標識であり、非共有結合でCD３と結合し、TCR-CD３複合体を形成する。TCRはα、β２本のペプチド鎖からなり、免疫グロブリン超家族に属し、抗原特異性はV領域（CDR１、CDR２、CDR３）に存在し、CDR３はTCRの抗原結合特異性を直接決定した。末梢血中、T細胞の９０～９５%がTCRを発現する。トランスジェニックされたTCRのT細胞は、腫瘍細胞表面上の抗原分子を特異的に識別し、さらに腫瘍細胞に対して免疫反応を起こすことができる。
【0009】
TCR-T細胞免疫治療は近年発展してきた細胞治療の新技術であり、典型的な「精密医療」治療技術である。現在、この技術は骨髄腫、メラノーマ、食道癌、肝臓癌などの治療に積極的な治療の見込みを示している。TCR-T細胞免疫治療は２０世紀末にHIVの治療に初めて使用され、近年の研究により、MART-１、MAGE-A４、NY-ESO-１、WT-１などの腫瘍抗原に特異的なTCRに基づいてエンジニアリングされた自己免疫細胞はメラノーマ、食道癌、多発性骨髄腫、滑膜細胞肉腫などの治療において良好な開発見込みを示していることを発現した。
【0010】
特に、２０１５年の報道によると、多発性骨髄腫の臨床I/II期患者２０例がNY-ESO-１特異的TCRエンジニアリング細胞の免疫治療を受け、８０%の患者がTCR-T治療を受けた後、積極的な臨床治療効果を示した。現在、TCR-T細胞免疫治療技術はすでに国際腫瘍及び感染症治療研究のホットスポット領域となり、一部の技術と製品はすでに臨床前或いは臨床研究段階に入った。
【0011】
KRAS遺伝子（Kirstenラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ、Kirsten rat sarcoma virus oncogene homolog）がコードするタンパク質は、小型GTP酵素（small GTPse）であり、RASタンパク質超家族に属し、細胞内の信号伝達に関与する。KRASタンパク質は１８８個のアミノ酸を有し、分子量は２１．６KDであり、GTPase酵素活性を持つグアニンヌクレオシド結合タンパク質である。細胞内において、KRASタンパク質は不活性化状態と活性化状態との間で変換され、KRASはグアニンヌクレオシド二リン酸（GDP）と結合したとき、不活性化状態になり、グアニンヌクレオシド三リン酸（GTP）と結合したとき、活性化状態になり、かつMAPK信号経路、PI３K信号経路、Ral-GEFS信号経路を含む下流信号経路を活性化することができる。これらの信号経路は、細胞の生存、増殖、サイトカイン放出を促進する方面で重要な役割を果たしている。
【0012】
ヒト癌の中で、KRASは腫瘍学分野で最も有名な発癌遺伝子の一つであり、かつて「不可成薬」の標的とされていた。KRAS遺伝子変異は膵臓癌の９０%近く、結腸癌の３０-４０%、子宮内膜癌の１７%、肺癌（小葉性肺癌を含む）の１５-２０%、及び胆管癌、子宮頸癌、膀胱癌などに発生する。KRASの遺伝子変異はRAS遺伝子変異総数の８６%を占めている。KRASの遺伝子変異では、９７%が第１２号または第１３号アミノ酸残基で変異を起こした。その中で最も主要なのは、第１２号アミノ酸がアスパラギン（G１２D）に、第１２号アミノ酸がバリン（G１２V）に、第１２号アミノ酸がシステイン（G１２C）に、第１３号アミノ酸がアスパラギン（G１３D）に変化するといういくつかの変異である。
【0013】
構造学的研究により、これらの遺伝子変異の多くはKRAS加水分解GTPの能力を妨害することが明らかになった。KRASにG１２D、G１２V、G１３Dといういくつかの変異が発生すると、GAP活性を破壊することでKRASはずっとGTPと結合し、KRASをチロシンキナーゼの活性状態にロックし、下流信号経路（例えば、PI３K、RAF-MEK-ERK（MAPK）、RAL-GEFなど）を不断的に活性化する。これらの下流信号経路が開かれると、細胞の増殖、移動を刺激し、最終的に腫瘍の発生を促進する。
【0014】
近年、KRAS変異体に対して、共有結合抑制剤を研究開発した。これは、アロステリックサイトを通じてKRAS変異体を標的にし、KRAS変異体とGTPの親和力を低下させて、その活性を「ロック」する目的を達成する。例えば、Amgen社のKRAS-G１２C阻害剤AMG５１０である。MiratiTherapeutics社のまだ臨床前開発段階にあるKRAS-G１２C阻害剤MRTX１２５７である。他のKRAS変異に対しては、現在、関連する治療薬はなく、生体の免疫メカニズムを利用して検出及び治療を行う腫瘍薬も不足している。
【0015】
発明の概要
ヒト癌において、KRAS遺伝子変異は膵臓癌の９０%近く、結腸癌の３０-４０%、子宮内膜癌の１７%、肺癌の１５-２０%に発生する。KRASの遺伝子変異では、９７%が第１２号または第１３号アミノ酸残基で変異を起こした。その中で最も主要なのはG１２D、G１２V、G１２C、G１３Dといういくつかの変異である。KRASは、変異後、細胞中のMHC分子によって細胞表面に提示（presenting）され、T細胞によって識別され、T細胞免疫反応を刺激し、さらにKRAS変異を有する腫瘍細胞を除去することができる。
ヒト癌において、KRAS遺伝子変異は膵臓癌の９０%近く、結腸癌の３０-４０%、子宮内膜癌の１７%、肺癌の１５-２０%に発生する。KRASの遺伝子変異では、９７%が第１２号または第１３号アミノ酸残基で変異を起こした。その中で最も主要なのはG１２D、G１２V、G１２C、G１３Dといういくつかの変異である。KRASは、変異後、細胞中のMHC分子によって細胞表面に提示（presenting）され、T細胞によって識別され、T細胞免疫反応を刺激し、さらにKRAS変異を有する腫瘍細胞を除去することができる。
【0016】
具体的には、KRAS変異ポリペプチドを抗原として用いた場合、CD８+ CTL（cytoxic lymphocyte、細胞毒性Tリンパ球）反応を機体に発生させることができる。KRASポリペプチド中のいくつかのアミノ酸残基で起こる変異は、HLA分子によって提示され、T細胞によって識別されることができる。
【0017】
本発明の一実施形態は、特異的T細胞受容体（TCR）単細胞スクリーニング技術により、腫瘍KRAS遺伝子のKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）変異（以下、G１２V、G１２V変異、またはKRAS遺伝子のG１２V変異とも略称する）、KRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）（以下、G１２C、G１２C変異、またはKRAS遺伝子のG１２C変異とも略称する）を特異的に標的とする２種類のTCRをスクリーニングすることをを含む。
【0018】
本発明の一実施形態は、KRAS遺伝子のG１２VまたはG１２C変異のエピトープを標的とする特異的T細胞受容体およびその抗原結合断片を提供することを含む。本発明の別の実施形態は、KRAS遺伝子のG１２V及びG１２C変異を有する腫瘍を治療するための医薬の製造における、上記T細胞受容体及びその抗原結合断片の使用を含む。
【0019】
本発明は上述の原理に基づいて作られ、本発明におけるKRAS変異ポリペプチドに特異的なTCRまたはその抗原結合断片は、KRASのG１２V変異ポリペプチド（VVGAVGVGK）とHLA-A１１の複合体分子および／またはKRASのG１２C変異ポリペプチド（VVGACGVGK）とHLA-A１１の複合体分子、またはKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）エピトープとHLA-A０３複合体分子と特異的に結合することにより、T細胞の活性化を刺激し、T細胞のIFN-γなどサイトカインの分泌を誘導し、さらにKRAS変異ポリペプチドを発現する腫瘍細胞（特に、KRAS遺伝子のG１２Vおよび/またはG１２C変異陽性の腫瘍細胞）を殺傷する。
【0020】
本発明において、「KRAS変異ポリペプチドに特異的なTCR」または「鼠由来KRAS変異ポリペプチドに特異的なTCR」という表現は、KRAS変異ポリペプチド中のHLA-A１１制限的CTLエピトープポリペプチド（その配列はVVGAVGVGKおよび／またはVVGACGVGK）に対する鼠由来TCRであり、本発明の具体的な実施形態においては１－２C TCRまたは１－２C、３－２E TCRまたは３－２Eと呼ばれる。
【0021】
本願は、KRAS変異ポリペプチド由来の第１２位アミノ酸変異のVVGAVGVGK及び/又はVVGACGVGKポリペプチドとHLA-A１１との複合体分子と特異的に結合するTCR又は誘導体を含み、元のTCRと実質的に同じ機能を示す抗原特異的TCR断片も含む。「TCRの断片」または「抗原結合断片」とは、TCRの抗原結合断片およびTCR類似物を指し、これは通常、親TCRの抗原結合領域または可変領域の少なくとも一部、例えば１つまたは複数のCDRを含む。TCRの断片は、親TCRの少なくともいくつかの結合特異性を維持する。
【0022】
リガンド/受容体、抗体/抗原または他の結合対を言及する場合、「特異的な」結合とは、タンパク質および/または他の生物試薬の異種集団において、上記タンパク質（例えば、VVGAVGVGKおよび/またはVVGACGVGKポリペプチド）とHLA-A１１複合体分子との結合反応が存在するかどうかを確定することを指す。したがって、指定された条件下では、特定のリガンド/抗原は特定の受容体/抗体と結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質と有意な量で結合しない。
【0023】
本発明はまた、本発明のKRAS変異ポリペプチドに特異的なTCR中の１種または２種、またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物を製造するために、KRAS変異ポリペプチドに特異的なTCRまたはその抗原結合断片を薬用ベクターまたは賦形剤と混合することにより、様々な所望の剤型に製造することができる。本発明の医薬組成物の剤型の種類としては、例えば、経口剤としての錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟/硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下錠、膏剤など、非経口剤としての注射剤、座薬、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤などが挙げられる。当業者は、投与経路や投与対象などに応じて適切な剤型を選択することができる。
【0024】
本発明の医薬組成物の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによって異なり、剤型の種類、投与方法、患者の年齢と体重、患者の症状などを考慮し、医師の判断に基づいて確定することができる。
【0025】
本発明の医薬組成物は、細胞毒剤、細胞生長抑制剤、抗血管形成薬または抗代謝薬、標的腫瘍薬、免疫刺激剤または免疫調節剤、または細胞毒剤、細胞生長抑制剤または他の毒性薬と結合したTCRを含むがこれらに限定されない他の薬剤も含むことができる。
【0026】
具体的には、本発明は以下の方案を提供する。
【0027】
１、T細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片であって、
前記TCRまたはその抗原結合断片は、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）エピトープとHLA-A１１との複合体、またはKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）エピトープとHLA-A１１との複合体、またはKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）エピトープとHLA-A０３との複合体と結合することができ、かつ前記TCRはα鎖可変領域とβ鎖可変領域を含み、前記TCRまたはその抗原結合断片は、以下のα鎖相補性決定領域とβ鎖相補性決定領域を含む：
配列番号３に記載のα鎖相補性決定領域CDR１；
配列番号４に記載のα鎖相補性決定領域CDR２；
配列番号５に記載のα鎖相補性決定領域CDR３；
配列番号８に記載のβ鎖相補性決定領域CDR１；
配列番号９に記載のβ鎖相補性決定領域CDR２；及び
配列番号１０に記載のβ鎖相補性決定領域CDR３、
または
配列番号１３に記載のα鎖相補性決定領域CDR１；
配列番号１４に記載のα鎖相補性決定領域CDR２；
配列番号１５に記載のα鎖相補性決定領域CDR３；
配列番号１８に記載のβ鎖相補性決定領域CDR１；
配列番号１９に記載のβ鎖相補性決定領域CDR２；及び
配列番号２０に記載のβ鎖相補性決定領域CDR３。
前記TCRまたはその抗原結合断片は、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）エピトープとHLA-A１１との複合体、またはKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）エピトープとHLA-A１１との複合体、またはKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）エピトープとHLA-A０３との複合体と結合することができ、かつ前記TCRはα鎖可変領域とβ鎖可変領域を含み、前記TCRまたはその抗原結合断片は、以下のα鎖相補性決定領域とβ鎖相補性決定領域を含む：
配列番号３に記載のα鎖相補性決定領域CDR１；
配列番号４に記載のα鎖相補性決定領域CDR２；
配列番号５に記載のα鎖相補性決定領域CDR３；
配列番号８に記載のβ鎖相補性決定領域CDR１；
配列番号９に記載のβ鎖相補性決定領域CDR２；及び
配列番号１０に記載のβ鎖相補性決定領域CDR３、
または
配列番号１３に記載のα鎖相補性決定領域CDR１；
配列番号１４に記載のα鎖相補性決定領域CDR２；
配列番号１５に記載のα鎖相補性決定領域CDR３；
配列番号１８に記載のβ鎖相補性決定領域CDR１；
配列番号１９に記載のβ鎖相補性決定領域CDR２；及び
配列番号２０に記載のβ鎖相補性決定領域CDR３。
【0028】
２、配列番号２に記載のα鎖可変領域、及び
配列番号７に記載のβ鎖可変領域；
または
配列番号１２に記載のα鎖可変領域、及び
配列番号１７に記載のβ鎖可変領域；
を含む、項１に記載のT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片。
配列番号７に記載のβ鎖可変領域；
または
配列番号１２に記載のα鎖可変領域、及び
配列番号１７に記載のβ鎖可変領域；
を含む、項１に記載のT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片。
【0029】
３、前記TCRは、鼠由来TCR、ヒトー鼠キメラTCRまたはヒト化TCRである、項１または２に記載のTCRまたはその抗原結合断片。
【0030】
４、項１～３のいずれか１項に記載のTCRまたはその抗原結合断片をコードし、配列番号１、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６からなる群より選ばれる１つまたは複数の配列である、ポリヌクレオチド。
【0031】
５、項４に記載のポリヌクレオチドを含み、好ましくは、レンチウイルスベクターである、発現ベクター。
【0032】
６、項５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【0033】
７、項１～３のいずれか１項に記載のTCRまたはその抗原結合断片を製造する方法であって、
前記方法は、以下のステップを含む：
１）項６に記載の宿主細胞を培養するステップ；および
２）前記宿主細胞またはその培地から、項１～３のいずれか１項に記載のTCRまたはその抗原結合断片を回収するステップ。
前記方法は、以下のステップを含む：
１）項６に記載の宿主細胞を培養するステップ；および
２）前記宿主細胞またはその培地から、項１～３のいずれか１項に記載のTCRまたはその抗原結合断片を回収するステップ。
【0034】
８、項１～３のいずれか１項に記載のTCRまたはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【0035】
９、項１～３のいずれか１項に記載のTCRまたはその抗原結合断片の、T細胞のIFN-γサイトカインの分泌レベルを高めるための医薬の製造における、使用であって、
前記医薬は、例えばタンパク質系医薬、ADC医薬、またはTCRと抗原を組み合わせた医薬である、使用。
前記医薬は、例えばタンパク質系医薬、ADC医薬、またはTCRと抗原を組み合わせた医薬である、使用。
【0036】
１０、項１～３のいずれか１項に記載のTCRまたはその抗原結合断片の、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）またはKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異を発現する腫瘍細胞の検出試薬の製造における、使用、または腫瘍を検出又は診断する試薬の製造における、使用であって、
好ましくは、前記TCRまたはその抗原結合断片は、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１、またはKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）/HLA-A１１と特異的に結合し、または
前記TCRまたはその抗原結合断片は、HLA-A１１またはHLA-A０３と類似した抗原結合特性を有するHLA分子、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）またはKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異ポリペプチドと特異的に結合し、ここで、前記HLA分子は、好ましくはHLA-A３１、HLA-A３３、HLA-A６８、HLA-A３０である、使用。
好ましくは、前記TCRまたはその抗原結合断片は、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１、またはKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）/HLA-A１１と特異的に結合し、または
前記TCRまたはその抗原結合断片は、HLA-A１１またはHLA-A０３と類似した抗原結合特性を有するHLA分子、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）またはKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異ポリペプチドと特異的に結合し、ここで、前記HLA分子は、好ましくはHLA-A３１、HLA-A３３、HLA-A６８、HLA-A３０である、使用。
【0037】
１１、項１～３のいずれか１項に記載のTCRまたはその抗原結合断片の、KRAS遺伝子のG１２V及びG１２C変異を有する腫瘍の患者を治療するための抗腫瘍薬の製造における、使用であって、
前記腫瘍は、例えば膵臓癌、大腸癌、肺癌であり、前記肺癌は、例えば非小細胞肺癌であり、
好ましくは、前記KRAS遺伝子のG１２V及びG１２C変異はKRAS遺伝子のKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）変異又はKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異である、使用。
前記腫瘍は、例えば膵臓癌、大腸癌、肺癌であり、前記肺癌は、例えば非小細胞肺癌であり、
好ましくは、前記KRAS遺伝子のG１２V及びG１２C変異はKRAS遺伝子のKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）変異又はKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異である、使用。
【0038】
本発明の利点
本発明のKRAS遺伝子のG１２VまたはG１２C変異に特異的なTCRを利用して、該TCRを発現するTリンパ球（TCR-T）を製造することにより、KRAS遺伝子のG１２VまたはG１２C変異陽性の腫瘍細胞を効果的に識別し、殺すことができ、さらに腫瘍、特に固形腫瘍の生長を抑制し、腫瘍治療の効果を達成することが期待できる。
本発明のKRAS遺伝子のG１２VまたはG１２C変異に特異的なTCRを利用して、該TCRを発現するTリンパ球（TCR-T）を製造することにより、KRAS遺伝子のG１２VまたはG１２C変異陽性の腫瘍細胞を効果的に識別し、殺すことができ、さらに腫瘍、特に固形腫瘍の生長を抑制し、腫瘍治療の効果を達成することが期待できる。
【0039】
本発明のKRAS遺伝子のG１２VまたはG１２C変異のエピトープを標的とする２種類の特異的T細胞受容体およびそれらを発現するT細胞は感染効率が高く、結合特性が高い特性を有するため、それを利用して医薬の前期研究を行うことができ、試験モデルなどの中で腫瘍の生長と進展に関連する変異を標的とする医薬を開発することができる。したがって、KRAS遺伝子変異を発現する各種腫瘍の様々な時期の診断、治療の医薬の製造、特に変異頻度の高い固形腫瘍を治療する医薬の製造に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】KRASの異なる変異体ポリペプチドとHLA-A１１複合体タンパク質のモレキュラーシーブクロマトグラフィー及びビオチン化レベルの検出結果。
【図2】KRAS-G１２V／HLA-A１１四量体特異的なT細胞の単細胞選別。A図は、KRAS-G１２Vポリペプチドで免疫したマウス脾臓細胞中の特異的なT細胞のELISPOT検出図を示す。そのうち、mockは無刺激物の陰性対照であり、KRAS-G１２V８-１６はポリペプチド刺激検出孔であり、ホルボールエステル（PMA）は陽性対照であり、T１-T６、TF１-TF６はマウス番号である。B図はポリペプチドで免疫したマウス脾臓細胞中のエピトープ特異的なT細胞の選別を示し、WTは非免疫マウスの陰性対照であり、横座標はKRAS-G１２V８-１６/HLA-A１１四量体染色であり、縦座標はCD８陽性染色であり、KRAS-G１２V８-１６/HLA-A１１四量体陽性細胞は図中の四角の枠で囲まれた部分である。
【図3】３－２Eおよび１－２C TCRのKRAS-G１２V８-１６/HLA-A１１との特異的な結合の検証。Aは、３－２Eまたは１－２C TCRにより２９３T細胞を一過性トランスフェクションした後、KRAS-G１２V８-１６/HLA-A１１四量体に特異的に結合した結合実験のフローサイトメトリー結果を示す。Bは、１－２Cまたは３－２E TCRにより２９３T細胞を一過性トランスフェクションした後、KRAS-G１２V７-１６/HLA-A１１四量体に特異的に結合した結合実験のフローサイトメトリー結果を示す。
【図4】１－２Cおよび３－２E TCRとKRAS-G１２V８-１６/HLA-A３との交差識別。A図は、KRAS-G１２V８-１６/HLA-A１１と、１－２Cまたは３－２E TCRを発現する２９３T細胞四量体の染色分析のフローサイトメトリー結果を示す。B図は、KRAS-G１２V８-１６/HLA-A０３と、１－２Cまたは３－２E TCRを発現する２９３T細胞四量体の染色分析のフローサイトメトリー結果を示す。
【図5】１－２Cまたは３－２E TCR-T細胞の感染効率の検出。第１行（横方向）は、陰性対照として、TCRレンチウイルスに感染していないD１とD２の２名のボランティアPBMC由来の四量体検出を示し、第２行（横方向）と第３行（横方向）はそれぞれD１（第２行（横方向））またはD２（第３行（横方向））ボランティアのPBMCまたはCD８ T細胞を用いて製造されたTCR-T細胞であり、KRAS-G１２V８-１６/HLA-A１１四量体を用いてフローサイトメトリー染色を行い、象限中の数値はそのTCRの発現陽性率を示す。
【図6】１－２Cまたは３－２E TCR-T細胞とKRASの異なる変異体ポリペプチドとの反応。A図とB図は、PBMC細胞を用いて製造した１－２Cまたは３－２E TCR-T細胞とKRAS-G１２野生型および異なる変異体ポリペプチドのELISPOTの画像と直方統計図を示し、D１またはD２はボランティアの番号である。図Cは、１－２Cまたは３－２E TCR-T細胞とKRAS-G１２野生型および異なる変異体ポリペプチドをインキュベーションした後に産生されるIFN-γレベルのELISA統計図を示し、TCR-T細胞と培地のインキュベーションを陰性対照（mock）とし、PMA刺激を陽性対照とする。図D、E、Fはそれぞれ１－２Cまたは３－２E TCR-T細胞とKRAS-G１２野生型および異なる変異体ポリペプチドのELISPOTの画像、図D結果の直方統計図、これらの細胞中のIFN-γレベルのELISA統計図を示す。
【図7】１－２Cおよび３－２Eの２種類のTCRタンパク質の体外復元性及び精製結果。A図とB図はそれぞれ１－２C TCR分子がイオンカラムとモレキュラーシーブクロマトグラフィーを経た後の精製結果を示す。C図とD図はそれぞれ３－２E TCR分子がイオンカラムとモレキュラーシーブクロマトグラフィーを経た後の精製結果を示す。小図はアスタリスクで標識されたピーク値タンパク質のSDS-PAGE結果である。
【図8】１－２Cまたは３－２E TCRとKRAS-G１２の異なる変異体ポリペプチドとHLA-A１１の結合特性。A-D図は、１－２C TCRとKRAS-G１２野生型及び異なる変異体ポリペプチドとHLA-A１１複合体タンパク質の親和力検出を示し、E-H図は、３－２E TCRとKRAS-G１２野生型および異なる変異体ポリペプチドとHLA-A１１複合体タンパク質の親和力検出を示す。
【図9】NCG免疫不全マウス腫瘍モデルにおける１－２C TCR-T細胞の腫瘍抑制効果の評価。A図はマウス腫瘍抑制実験のフローチャートを示す。PANC-１腫瘍細胞を第０日（D０）に接種し、TCR-T細胞を第７日に腫瘍内に注射した後、３～４日ごとに観察測定した。B図は実験終了時に分離された腫瘍重量の異なる治療群間の比較を示す。C図は異なる治療群の腫瘍体積の生長状況と比較を示し、各点はこの時点の各群のマウス腫瘍体積の平均値±標準差を示す。D-G図は各群内のシングルマウス腫瘍体積の生長状況を示す。群間の統計差異はT検査によって計算され、ここで**：p<０．０１、***：p<０．００１、ns, p >０．０５。
【0041】
発明の詳細な説明
本発明は、具体的な実施形態及び図面を通じて本発明の技術案をさらに説明するが、当業者は、以下の具体的な実施形態及び実施例は、本発明を説明するためのものであり、いかなる態様でも本発明を限定してはならないことを理解できる。当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、本発明に対して多くの補正が可能であり、そのような補正も本発明の範囲に入ることが知られている。
本発明は、具体的な実施形態及び図面を通じて本発明の技術案をさらに説明するが、当業者は、以下の具体的な実施形態及び実施例は、本発明を説明するためのものであり、いかなる態様でも本発明を限定してはならないことを理解できる。当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、本発明に対して多くの補正が可能であり、そのような補正も本発明の範囲に入ることが知られている。
【0042】
下記の実験方法は特に説明がない限り、すべて本分野の通常の実験方法であり、使用される実験材料は特に説明がない限り、すべて商業会社から容易に入手できる実験材料に属する。
【0043】
実施例１、KRAS-G１２変異ポリペプチドに特異的なT細胞の選別及びTCR遺伝子のクローニング
本実施例は、まずKRAS-G１２変異を有すると予測したHLA-A１１制限性エピトープポリペプチドを合成し、これらのポリペプチドを用いてマウスを免疫し、ELISPOT実験によりT細胞反応スクリーニングを行い、その中から免疫原性を有する変異ポリペプチドを選出した。同時に、これらのKRAS変異ポリペプチドとHLA-A１１の四量体を製造し、CD３、CD８抗体を用いて染色することで、免疫後マウス脾臓細胞からCD３+CD８+T細胞を選択し、選別することにより、その中のKRAS-G１２変異ポリペプチドに特異的なT細胞を得た。
本実施例は、まずKRAS-G１２変異を有すると予測したHLA-A１１制限性エピトープポリペプチドを合成し、これらのポリペプチドを用いてマウスを免疫し、ELISPOT実験によりT細胞反応スクリーニングを行い、その中から免疫原性を有する変異ポリペプチドを選出した。同時に、これらのKRAS変異ポリペプチドとHLA-A１１の四量体を製造し、CD３、CD８抗体を用いて染色することで、免疫後マウス脾臓細胞からCD３+CD８+T細胞を選択し、選別することにより、その中のKRAS-G１２変異ポリペプチドに特異的なT細胞を得た。
【0044】
１、KRAS-G１２変異ポリペプチドのHLA制限性エピトープ予測
NetMHC-４.０オンライン予測システムにより、KRAS-G１２変異が発生したポリペプチドに対して、HLA-A１１制限性T細胞エピトープ予測を行った。その結果、KRAS-G１２VエピトープはHLA-A１１と強い親和力を持つことを発現した。
NetMHC-４.０オンライン予測システムにより、KRAS-G１２変異が発生したポリペプチドに対して、HLA-A１１制限性T細胞エピトープ予測を行った。その結果、KRAS-G１２VエピトープはHLA-A１１と強い親和力を持つことを発現した。
【0045】
委託された会社（Sclight Biotechnology LLC）は、KRAS-G１２野生型ポリペプチド８-１６（配列番号３４に記載）、G１２V８-１６（配列番号３５に記載）、G１２D８-１６（配列番号３６に記載）、G１２C８-１６（配列番号３７に記載）変異ポリペプチド、KRAS-G１２野生型ポリペプチド７-１６（配列番号３８に記載）、G１２V７-１６（配列番号３９に記載）、G１２D７-１６（配列番号４０に記載）、G１２C７-１６（配列番号４１に記載）を合成した。
【0046】
２、KRAS-G１２V／HLA-A１１四量体の製造
これらのポリペプチドとHLA-A１１の結合特性及び特異的なT細胞反応、及び特異的TCRに対して評価、スクリーニングを行った。
これらのポリペプチドとHLA-A１１の結合特性及び特異的なT細胞反応、及び特異的TCRに対して評価、スクリーニングを行った。
【0047】
通常の方法でβ２m（β２－ミクログロブリン、HLA-A１１の軽鎖遺伝子）（Uniprot：P６１７６９）及びHLA-A１１重鎖遺伝子（IMGT/HLA Aｃｃ No：HLA０００４３）に対して、原核コドン最適化を行い、得られたβ２m核酸配列は配列番号４８に記載され、それがコードしたアミノ酸配列は配列番号４７に記載され、得られるHLA-A１１重鎖遺伝子は配列番号４４に記載され、それがコードしたアミノ酸配列は配列番号４３に記載される。HLA-A１１重鎖遺伝子について、配列番号４４に記載の重鎖遺伝子のC端にビオチンに特異的な結合ポリペプチドを発現する配列（Biotin-tag、アミノ酸配列は配列番号３３に記載される）を加えた。
【0048】
委託された会社はそれぞれこれらのDNA配列（Nanjing GenScript）を合成し、それぞれ制限酵素認識部位Nde IとXho Iを導入し、そのうちNde I制限酵素認識部位は配列の５’端に位置し、制限酵素認識部位Xho Iは配列の３’端に位置する。制限酵素認識部位Nde IとXho Iを用いて、合成されたβ２mとHLA-A１１重鎖遺伝子のDNA配列をそれぞれ発現ベクターpET-２１a（Invitrogen社）にクローニングし、β２m及びHLA-A１１重鎖タンパク質の原核組換え発現プラスミドβ２m-pET２１aとHLA-A１１-pET２１aを構築した。
【0049】
２種類の発現プラスミドをそれぞれ熱刺激でE. coli. BL２１(DE３)コンピテント細胞（TIANDZ Biotechから購入）に導入し、IPTGを添加して発現を誘導し、大腸菌を粉砕し、ホモジネートして封入体を抽出し、封入体状態のβ２mとHLA-A１１重鎖の封入体タンパク質を得た。
【0050】
１mlのβ２m封入体(３０mg/mlを６M Gua-HCl、５０mM Tris pH８．０、１００mM NaCl、１０mM EDTA及び１０mM DTTを含む溶解液に溶解する)を、それぞれ５mgの上記で製造したKRAS-G１２野生型ポリペプチド８-１６、G１２V８-１６、G１２D８-１６、G１２C８-１６変異ポリペプチド、KRAS-G１２野生型ポリペプチド７-１６、G１２V７-１６、G１２D７-１６、G１２C７-１６ポリペプチド（Sclight Biotechnology LLCから合成）を含む１L復元液（２０mM Tris-HCL、４００mM L-アルギニン、EDTA ２mM、GSH/GSSG ５mM/１mM）に１時間ゆっくり滴下した後、β２m：HLA-A１１重鎖＝１：１のモル比で、HLA-A１１の重鎖封入体を上記復元液にゆっくり滴下し、８時間以上復元した。
【0051】
限外濾過カップを用いて、復元した試料を１０kDa濾過膜に通して試料を濃縮し、濃縮を通じて、２０mM Tris-Cl、５０mM NaCl、pH８．０の緩衝液に液交換する。液交換を２回行う。試料を約２０mlに濃縮した後、２０mM Tris-Cl、５０mM NaCl、pH８．０を含む緩衝液２００mlに添加する。その後、約２０mlに濃縮した後、再び２０mM Tris-Cl、５０mM NaCl、pH８．０の緩衝液に１００mlとなるように添加し、最終的に約１０-２０mlの体積に濃縮した。サンプルを取り出した後、４℃、１２０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を限外濾過管に移して約０．５-１mlに濃縮し、superdex ２００モレキュラーシーブ（GE Healthcareから購入）を通してKRAS-G１２野生型または変異ポリペプチド／HLA-A１１複合体の精製を行った。２８０nmの光吸収値に基づいて、KRAS-G１２野生型または変異ポリペプチド//HLA-A１１複合体タンパク質ピーク（ピーク値は約１５．８mLである）を収集した。
【0052】
モレキュラーシーブを通して精製した後のKRAS-G１２野生型または変異ポリペプチド／／HLA-A１１複合体タンパク質試料を限外濾過濃縮管に集め、約５００μLに濃縮した後、４℃で遠心分離して沈殿物を除去し、KRAS-G１２野生型または変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体タンパク質試料を得た。
【0053】
（２）ビオチン化反応
ステップ（１）で得られたKRAS-G１２V／HLA-A１１複合体タンパク質試料を用いて、それぞれ以下のビオチン化反応系（５００μl)を調製する。
ステップ（１）で得られたKRAS-G１２V／HLA-A１１複合体タンパク質試料を用いて、それぞれ以下のビオチン化反応系（５００μl)を調製する。
【0054】
ビオチン化反応系（AVIDITY社から購入）：合計５００μl
KRAS-G１２野生型および変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体タンパク質試料１mg/ml ２００μl、
緩衝液A（N-ビス（ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液）５０μl、
緩衝液B（ATP、ビオチン）５０μl、
２００μMビオチン、Bir-A酵素（３mg/ml）２０μl、
２０mM Tris-Cl、５０mM NaCl、pH８．０ （５００μlまで補充）。
KRAS-G１２野生型および変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体タンパク質試料１mg/ml ２００μl、
緩衝液A（N-ビス（ヒドロキシエチル）グリシン緩衝液）５０μl、
緩衝液B（ATP、ビオチン）５０μl、
２００μMビオチン、Bir-A酵素（３mg/ml）２０μl、
２０mM Tris-Cl、５０mM NaCl、pH８．０ （５００μlまで補充）。
【0055】
配合した後、混合し、氷上に置き、４℃の冷凍庫で一晩インキュベーションした。
【0056】
上記ビオチン化反応系試料をSuperdex ２００モレキュラーシーブに通し、ビオチン化後の複合体精製を行い、余分なビオチンを除去し、上記と同様に操作して、ビオチン化KRAS-G１２変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体タンパク質約０．１-０．２mgを得た。KRAS-G１２野生型または変異ポリペプチド//HLA-A１１複合体タンパク質ピーク値は約１５．８mLであった（図１に示す）。
【0057】
ビオチン化効率検出：
上記ビオチン化KRAS-G１２/HLA-A１１複合体を約５００μlに濃縮し、サンプリングしてSDS-PAGE shift試験を行い、ビオチン化効果を検証する。
上記ビオチン化KRAS-G１２/HLA-A１１複合体を約５００μlに濃縮し、サンプリングしてSDS-PAGE shift試験を行い、ビオチン化効果を検証する。
【0058】
１つの試料と２つの対照を設定する：
A．ビオチン化KRAS-G１２/HLA-A１１複合体試料８μl+モレキュラーシーブ緩衝液２μl；
B．ビオチン化KRAS-G１２/HLA-A１１複合体試料８μl+ストレプトマイシン２μl（２０mg/ml）；
C．ストレプトマイシン２μl+モレキュラーシーブ緩衝液８μl。
A．ビオチン化KRAS-G１２/HLA-A１１複合体試料８μl+モレキュラーシーブ緩衝液２μl；
B．ビオチン化KRAS-G１２/HLA-A１１複合体試料８μl+ストレプトマイシン２μl（２０mg/ml）；
C．ストレプトマイシン２μl+モレキュラーシーブ緩衝液８μl。
【0059】
上記３つの試料を氷上で３０分間インキュベーションした後、SDS-PAGE鑑定を行い、結果を図１に示す。
【0060】
その結果、ビオチン化KRAS-G１２/HLA-A１１複合体はストレプトアビジンと結合して高分子になることができるため、SDS-PAGEにおけるベンドが遅れている。各群のポリペプチドビオチン化前後SDS-PAGEベンドグレースケール比（KRAS-G１２/HLA-A１１複合体にストレプトマイシンを添加した後のベンドグレースケール／KRAS-G１２/HLA-A１１複合体原始タンパク質ベンドグレースケール）を比較することにより、これらKRAS-G１２野生型または変異ポリペプチドはいずれも高効率的にビオチン化できる（図１に示す）と判断することができる。
【0061】
（３）KRAS-G１２野生型及び変異ポリペプチド／HLA-A１１-PE四量体の製造
ビオチン化KRAS-G１２野生型及び変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体分子を限外濾過濃縮し、ストレプトアビジン-PE：KRAS-G１２野生型及び変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体=１：５のモル比で、ビオチン化KRAS-G１２野生型または変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体分子にストレプトアビジン-PEを加えて四量化し、最後に４℃で一晩インキュベーションし、それぞれKRAS-G １２野生型８-１６（VVGAGGVGK）ポリペプチド、G１２V８-１６（VVGAVGVGK）、G１２D８-１６（VVGADGVGK）、G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異ポリペプチド、KRAS-G１２野生型７-１６（VVVGAVGVGK）、G１２D７-１６（VVVGADGVGK）、G１２C７-１６（VVVGACGVGK）/HLA-A１１-PE四量体（予備用）を得た。
ビオチン化KRAS-G１２野生型及び変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体分子を限外濾過濃縮し、ストレプトアビジン-PE：KRAS-G１２野生型及び変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体=１：５のモル比で、ビオチン化KRAS-G１２野生型または変異ポリペプチド/HLA-A１１複合体分子にストレプトアビジン-PEを加えて四量化し、最後に４℃で一晩インキュベーションし、それぞれKRAS-G １２野生型８-１６（VVGAGGVGK）ポリペプチド、G１２V８-１６（VVGAVGVGK）、G１２D８-１６（VVGADGVGK）、G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異ポリペプチド、KRAS-G１２野生型７-１６（VVVGAVGVGK）、G１２D７-１６（VVVGADGVGK）、G１２C７-１６（VVVGACGVGK）/HLA-A１１-PE四量体（予備用）を得た。
【0062】
３.KRAS-G１２Vポリペプチドで免疫したHLA-A１１トランスジェニックマウス
本ステップでは、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）変異ポリペプチドで免疫したHLA-A１１トランスジェニックマウス（Beijing Biocytogenに製造を委託）を用い、マウス体内にKRAS-G１２V８-１６変異ポリペプチドに特異的なT細胞を産生するように誘導し、さらにKRAS-G１２V８-１６変異ポリペプチドの特異的TCRを得る。
本ステップでは、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）変異ポリペプチドで免疫したHLA-A１１トランスジェニックマウス（Beijing Biocytogenに製造を委託）を用い、マウス体内にKRAS-G１２V８-１６変異ポリペプチドに特異的なT細胞を産生するように誘導し、さらにKRAS-G１２V８-１６変異ポリペプチドの特異的TCRを得る。
【0063】
具体的には、化学的に合成されたKRAS-G１２V８-１６変異ポリペプチド（Sclight Biotechnology LLC）１００μgを１００μL PBSに溶解し、等体積のフロイント完全アジュバントと混合して乳化した。乳化ポリペプチドとフロイント完全アジュバントの混合液を背部皮下多点注射法を採用して、HLA-A１１トランスジェニックマウスを免疫した。
【0064】
第１回の免疫開始から１週間後、同様の方法を利用してKRAS-G１２V８-１６変異ポリペプチド１００μgを１００μL PBSに溶解し、等体積のフロイント不完全アジュバントと混合して乳化し、同様の方法で注射を行って免疫強化を実施した。１週間後にマウスを処刑し、脾臓を採取し、研磨してマウス脾臓細胞を得た。
【0065】
４.KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１-PE四量体に特異的なT細胞選別及び単細胞TCR遺伝子増幅及びシークエンシング
PBS洗浄を経て再懸濁し、ステップ１においてKRAS-G１２V８-１６変異ポリペプチドで免疫して得られたマウス脾臓細胞約１x１０７を、２００-２５０ gで１０分間遠心分離した。０.５%BSAを含むPBSで３回洗浄し、２００-２５０gで１０分間遠心分離した。KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１-PE四量体（上記四量体製造により得られた）、PerCP-Cy５-CD８（BD社から購入）、FITC-CD３蛍光抗体（BD社から購入）を１：１：１のモル比でマウス脾臓細胞と一緒に２５℃条件下で２０分間インキュベーションした。０.５%BSAを含むPBSで３回洗浄し、２００-２５０gで１０分間遠心分離した。０.５%BSAを含むPBSを用いて細胞を再懸濁した。
PBS洗浄を経て再懸濁し、ステップ１においてKRAS-G１２V８-１６変異ポリペプチドで免疫して得られたマウス脾臓細胞約１x１０７を、２００-２５０ gで１０分間遠心分離した。０.５%BSAを含むPBSで３回洗浄し、２００-２５０gで１０分間遠心分離した。KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１-PE四量体（上記四量体製造により得られた）、PerCP-Cy５-CD８（BD社から購入）、FITC-CD３蛍光抗体（BD社から購入）を１：１：１のモル比でマウス脾臓細胞と一緒に２５℃条件下で２０分間インキュベーションした。０.５%BSAを含むPBSで３回洗浄し、２００-２５０gで１０分間遠心分離した。０.５%BSAを含むPBSを用いて細胞を再懸濁した。
【0066】
その後、上記細胞に対してフローサイトメトリー単細胞選別を行った。リンパ球亜群を選択し、CD３+ CD８+T細胞を選択し、選別を通じてKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１-PE四量体陽性のCD８+T細胞を得た（図２に示す、四角の枠に四量体陽性の細胞と割合を示す）。
【0067】
単一の陽性細胞を細胞分解液（Tiangen Bioから購入）とRNA酵素阻害剤（CW Bioから購入）を含む９６ウェルプレートに選別した。その後、各ウェル内のKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１-PE四量体陽性T細胞に対して総RNAを抽出し、５’RACE TCR遺伝子増幅を行い、具体的には以下の通りである。
【0068】
５’RACEは、逆転写（RT-PCR）、第１回PCR増幅、第２回PCR増幅の３つのステップに分けられる。以下、Takara社D３１５-FullRACEキットを使用し、説明書に従って操作した。
【0069】
（１）RT-PCR：使用される下流プライマーはTCR遺伝子定常領域特異性プライマーGSP１（Takara社から購入）であり、上流プライマーは３’末端にオリゴグアニンデオキシリボ核酸（Oligo dG）を有する標的スイッチングプライマー（target-switching primer）（Takara社）である。
【0070】
（２）第１回PCR：上記（１）で得られたTCRのcDNAをテンプレートとし、上流プライマーは外層リンカープライマー１（５’RACE outer Primer、Takara社）であり、下流プライマーは定常領域GSP１の上流のTCR定常領域の特異性プライマー（Takara社から購入）であり、TCRのα鎖またはβ鎖第１回PCR産物を得た。
【0071】
（３）第２回PCR：上記（２）で得られたTCRのα鎖またはβ鎖第１回PCR産物をテンプレートとし、上流プライマーは内層リンカープライマー２（５’RACE inner Primer、Takara社）であり、下流プライマーは定常領域GSP２上流のTCR定常領域特異性プライマー（Takara社から購入、D３１５-FullRACE Kit）であり、それぞれTCRのα鎖またはβ鎖第２回PCR産物を得た。
【0072】
増幅後のTCRα鎖とβ鎖可変領域遺伝子を含む第２回PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、５００bp位置でそれぞれTCRα鎖またはβ鎖可変領域目的遺伝子を得た。目的ベンドを回収し、目的遺伝子断片をT４リガーゼでTベクター（pMD１８T、Takara）に連結した。その後、連結産物によりDH５α細胞（Tiangen Biotechnologyから購入）を形質転換させ、モノクローナル遺伝子シークエンシング（Ruiboxingkeに委託）を行った。
【0073】
上述の過程を経て得られたKRAS-G１２V８-１６に特異的なT細胞に対して、単細胞TCR遺伝子増幅シークエンシングを行い、結果を分析した後、その中で高頻度に出現したα鎖とβ鎖の組み合わせを新しいTCRとして選択し、１-２Cおよび３-２E TCRと命名され、それに対してさらに結合及び機能検証を行った。
【0074】
ここで、１-２C TCRは、配列番号２に記載のα鎖可変領域、及び配列番号７に記載のβ鎖可変領域を含む。３-２E TCRは、配列番号１２に記載のα鎖可変領域、及び配列番号１７に記載のβ鎖可変領域を含む。
【0075】
実施例２.KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１四量体と１-２C及び３-２E TCRを発現する細胞との結合実験
本実施例において、発明者は、さらに、スクリーニングされた１-２Cおよび３-２E TCRがKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１に対する特異性識別を有することを確認した。これに加えて、本実施例では、１-２Cおよび３-２Eは、HLA-A１１によって提示されたKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）と結合することができるほか、HLA-A０３によって提示されたKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）とも結合することができることを発現した。
本実施例において、発明者は、さらに、スクリーニングされた１-２Cおよび３-２E TCRがKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１に対する特異性識別を有することを確認した。これに加えて、本実施例では、１-２Cおよび３-２Eは、HLA-A１１によって提示されたKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）と結合することができるほか、HLA-A０３によって提示されたKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）とも結合することができることを発現した。
【0076】
１.１-２Cおよび３-２E TCRの結合特異性の検証
まず、１-２Cと３-２E TCRのα鎖とβ鎖可変領域（V領域）（１-２C：核酸配列は配列番号１に記載され、アミノ酸配列は配列番号６に記載され、３-２E：核酸配列は配列番号７に記載され、アミノ酸配列は配列番号１１に記載される）遺伝子とヒトTCRのα鎖とβ鎖定常領域（C領域）遺伝子（Hongxun Biotechnology Co., Ltd.で合成）を連結し、１-２Cと３-２EキメラTCRα鎖とβ鎖配列を得た。キメラ配列の具体的な配列を以下の表１に示す。
まず、１-２Cと３-２E TCRのα鎖とβ鎖可変領域（V領域）（１-２C：核酸配列は配列番号１に記載され、アミノ酸配列は配列番号６に記載され、３-２E：核酸配列は配列番号７に記載され、アミノ酸配列は配列番号１１に記載される）遺伝子とヒトTCRのα鎖とβ鎖定常領域（C領域）遺伝子（Hongxun Biotechnology Co., Ltd.で合成）を連結し、１-２Cと３-２EキメラTCRα鎖とβ鎖配列を得た。キメラ配列の具体的な配列を以下の表１に示す。
【0077】
【表1】
そして、１-２Cおよび３-２E TCRのα鎖とβ鎖の中間はT２A配列（T２A配列のアミノ酸配列は配列番号４２に記載される）で連結され、レンチウイルス発現プラスミドpCDH（Invitrogenから購入）を出発プラスミドとし、それぞれ１-２Cおよび３-２E TCRレンチウイルス発現ベクター、すなわちレンチウイルス発現ベクター１-２C-pCDHおよびレンチウイルス発現ベクター３-２E-pCDHを構築した。
【0078】
１-２Cまたは３-２E-pCDHレンチウイルス発現ベクターと、CD３およびCD８を発現するCD３-CD８-pCDHプラスミド（Nanjing GenScriptから購入）とを、１：１の数量割合でHEK-２９３T細胞（ATCCから購入）にコトランスフェクションした。２４時間コトランスフェクションした後、細胞を２００-２５０gで１０分間遠心分離した。０.５%BSAを含むPBSで３回洗浄し、２００-２５０gで１０分間遠心分離し、１-２Cまたは３-２E TCRを発現するHEK-２９３T細胞を得た。
【0079】
その後、本発明者は、１-２Cまたは３-２E TCRとKRAS-G１２野生型ポリペプチドおよびその他の変異ポリペプチドとの結合をさらに検証するために、上記で製造したKRAS-G１２野生型ポリペプチド８-１６（VVGAGGVGK）、G１２V８-１６（VVGAVGVGK）、G１２D８-１６（VVGADGVGK）、G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異ポリペプチド／HLA-A１１の四量体と、１-２Cまたは３-２E TCRを発現する２９３T細胞を染色分析し、その結合特異性を評価した。
【0080】
具体的には、このコトランスフェクションにより得られたHEK-２９３T細胞、上記で製造したKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１-PE四量体、およびPerCP-Cy５-CD８とFITC-CD３抗体（BD社）を、１：１：１モル比で３０分間共同インキュベーションした。０.５%BSAを含むPBSで３回洗浄し、２００-２５０gで１０分間遠心分離した。０.５%BSAを含むPBSを用いて細胞を再懸濁して、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１陽性のT細胞頻度を検出する。フローサイトメトリーを用いて分析した（図３Aに示す）。
【0081】
図３A中の第１、２行（横方向）は、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１-PE四量体によって、コトランスフェクションされたHEK-２９３T細胞に対して染色分析したフローサイトメトリー図である。その結果、１-２Cまたは３-２E TCRをトランスフェクションした２９３T細胞において、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１-PE四量体と結合できる細胞がCD８陽性細胞に占める割合は約２５.９%である。
【0082】
KRAS-G１２野生型ポリペプチド及びその他の変異ポリペプチド/HLA-A１１四量体結合特異性の検出により、１-２C又は３-２E TCRを発現する２９３T細胞は、KRAS-G１２野生型ポリペプチド（VVGAGGVGK）又はG１２D８-１６（VVGADGVGK）とHLA-A１１で形成された四量体とは結合が不可能であるが、G１２C８-１６（VVGACGVGK）とHLA-A１１で形成された四量体とは結合できることを確認した（図３A）。
【0083】
これから分かるように、細胞レベルの結合実験によれば、１-２Cまたは３-２E TCRはG１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１に特異的に結合できるほか、G１２C８-１６（VVGACGVGK）/HLA-A１１複合体にも特異的に結合できる。
【0084】
２.１-２C及び３-２E TCRとKRAS-G１２ １０ペプチドとの結合特異性の検出
本発明者は、CD８ T細胞エピトープポリペプチドの長さが一般的に９-１０アミノ酸であることを考慮し、また上記検出されたポリペプチドはいずれも９アミノ酸のポリペプチド（９ペプチド）であることに鑑みて、１-２Cと３-２E TCRが１０アミノ酸のポリペプチド（１０ペプチド）と結合できるか否かの可能性を排除することはできないと考えた。
本発明者は、CD８ T細胞エピトープポリペプチドの長さが一般的に９-１０アミノ酸であることを考慮し、また上記検出されたポリペプチドはいずれも９アミノ酸のポリペプチド（９ペプチド）であることに鑑みて、１-２Cと３-２E TCRが１０アミノ酸のポリペプチド（１０ペプチド）と結合できるか否かの可能性を排除することはできないと考えた。
【0085】
HLA-A１１結合ポリペプチドのモチーフによって、そのN端で１つのアミノ酸を前に移動しても依然としてT細胞エピトープ、すなわちKRAS-G１２野生型ポリペプチド７-１６（配列番号３８に記載される）、G１２V７-１６（配列番号３９に記載される）、G１２D７-１６（配列番号４０に記載される）、G１２C７-１６（配列番号４１に記載される）になる可能性があることを発現した。本実施例では、実施例１と同じ条件と操作を用いて、さらにこれらの長さが１０であるポリペプチドを四量体に製造し、１-２Cまたは３-２E TCRを発現する２９３T細胞と細胞結合実験分析を行い、各操作と条件は上記G１２D８-１６ポリペプチドと同じであり、フローサイトメトリーの結果を図３Bに示す。
【0086】
その結果、フローチャートの右上象限によると、１０ペプチドKRAS野生型及び変異体ポリペプチドから製造した四量体はいずれも１-２C又は３-２E TCRを発現する２９３T細胞と結合できないことが分かった。したがって、本発明の１-２Cまたは３-２E TCRは、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）およびKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）ポリペプチドエピトープを高度に特異的に識別できることをさらに証明した。
【0087】
３.１-２Cおよび３-２E TCRとHLA-A０３によって提示されたKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）の交差識別の検出
HLA-A１１はHLA-A３超家族分子メンバーに属することが知られており、HLA-A３超家族分子メンバーはHLA-A０３、HLA-A３１、HLA-A３３、HLA-A６８などが含まれており、HLA-A３超家族分子は類似の抗原提示特徴を有する。HLA-A３超家族分子の抗原提示は、提示されたポリペプチドC端が一般的にリシン（K）またはアルギニン（R）であり、ポリペプチドN端から始まる２つのアミノ酸とC端のアミノ酸がHLA分子のポリペプチド結合槽に挿入され、ポリペプチド中間部分のアミノ酸が暴露されてTCRに識別されることを特徴とする。次に、HLA-A０３、HLA-A３１、HLA-A３３およびHLA-A６８などのHLA-A３超家族分子がTCRと相互作用可能なα１とα２螺旋保守性は７０%を超えている。
HLA-A１１はHLA-A３超家族分子メンバーに属することが知られており、HLA-A３超家族分子メンバーはHLA-A０３、HLA-A３１、HLA-A３３、HLA-A６８などが含まれており、HLA-A３超家族分子は類似の抗原提示特徴を有する。HLA-A３超家族分子の抗原提示は、提示されたポリペプチドC端が一般的にリシン（K）またはアルギニン（R）であり、ポリペプチドN端から始まる２つのアミノ酸とC端のアミノ酸がHLA分子のポリペプチド結合槽に挿入され、ポリペプチド中間部分のアミノ酸が暴露されてTCRに識別されることを特徴とする。次に、HLA-A０３、HLA-A３１、HLA-A３３およびHLA-A６８などのHLA-A３超家族分子がTCRと相互作用可能なα１とα２螺旋保守性は７０%を超えている。
【0088】
したがって、実施例１でスクリーニングして得られたTCRも、HLA-A０３、HLA-A３１、HLA-A３３、およびHLA-A６８などのHLA-A３超家族分子とKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）またはその他の変異ポリペプチドで形成された複合体を識別する能力を有することができる。本実施例では、HLA-A０３とKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）を用いて四量体を製造し、フローサイトメトリー検出方法により、上記でスクリーニングされた１-２Cと３-２E TCRとの結合能力を検出し、それと他のHLA-A３超家族分子によって提示されたKRAS-G１２変異ポリペプチドとの特異的な結合能力を確定した。
【0089】
したがって、本実施例では、１-２Cおよび３-２E TCRとHLA-A０３によって提示されたKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）の交差識別能力を検出した。
【0090】
ここで使用されるHLA-A０３重鎖遺伝子は配列番号４６に記載され、それがコードしたアミノ酸配列は配列番号４５に記載される。残りの使用される材料と操作は、いずれもHLA-A１１で使用されているものと同じである。
【0091】
本実施例は、上述の実施例１の方法を用いて同様にHLA-A０３（IMGT/HLA Acc No：HLA０００３７）とKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）ポリペプチドの四量体タンパク質を製造し、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１四量体とともに、それぞれ１-２Cまたは３-２E TCRを発現する２９３T細胞を染色分析した（図４）。
【0092】
その結果、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A０３四量体は１-２Cまたは３-２E TCRを発現する２９３T細胞と有意に結合できる（図４B、右上象限）。
【0093】
したがって、１-２Cまたは３-２E TCRは、HLA-A１１によって提示されたKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）ポリペプチドに結合することができるほか、HLA-A０３によって提示されたKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）ポリペプチドに結合することができ、より広範な人々の間で広範な使用価値を持つことができることを示唆する。
【0094】
実施例３.１-２Cおよび３-２E TCR-T細胞の製造及びそれとKRASの異なる変異ポリペプチドの反応
本実施例では、HLA-A１１遺伝背景の健康ボランティアから単離された末梢血単核細胞（PBMC）または単離されたCD８ T細胞に１-２Cまたは３-２E TCR遺伝子を導入してTCR-T効果細胞とする。KRAS-G１２野生型ポリペプチド８-１６（VVGAGGVGK）、G１２V８-１６（VVGAVGVGK）、G１２D８-１６（VVGADGVGK）、G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異ポリペプチドをそれぞれ上記TCR-T効果細胞の系に加えて共同培養し、効果細胞とKRAS野生型及び変異体ポリペプチドを提示する標的細胞とが作用して分泌されたFN-γのレベルを検出し、１-２Cまたは３-２E TCRとKRAS野生型および変異体ポリペプチド/HLA-A１１を発現する標的細胞との作用を評価した。具体的な操作は以下の通りである。
本実施例では、HLA-A１１遺伝背景の健康ボランティアから単離された末梢血単核細胞（PBMC）または単離されたCD８ T細胞に１-２Cまたは３-２E TCR遺伝子を導入してTCR-T効果細胞とする。KRAS-G１２野生型ポリペプチド８-１６（VVGAGGVGK）、G１２V８-１６（VVGAVGVGK）、G１２D８-１６（VVGADGVGK）、G１２C８-１６（VVGACGVGK）変異ポリペプチドをそれぞれ上記TCR-T効果細胞の系に加えて共同培養し、効果細胞とKRAS野生型及び変異体ポリペプチドを提示する標的細胞とが作用して分泌されたFN-γのレベルを検出し、１-２Cまたは３-２E TCRとKRAS野生型および変異体ポリペプチド/HLA-A１１を発現する標的細胞との作用を評価した。具体的な操作は以下の通りである。
【0095】
１.１-２Cおよび３-２E TCRを発現するレンチウイルスの製造
実施例２における１-２Cおよび３-２E TCRレンチウイルス発現プラスミド（１-２C-pCDH及び３-２E-pCDH）及びレンチウイルスパッキングプラスミドPLP１、PLP２及びVSVG（Addgene社から購入）をPLP１：PLP２:VSVG:TCR-pCDH = ２０:１３:５:２０の割合で混合し、２０ulをDMEM培地（１.２５ml）に希釈して、DNA溶液とする。２０ulポリエーテルイミド（PEI、１μg/μl）をDMEM（１.２５ml）に添加し、上述のPEI／DMEM溶液をすべて配合済みDNA溶液に添加し、室温で１５分間インキュベーションした後、１５cmディスクで培養した２９３T細胞（Cell Bank, Shanghai)に添加し、混合した。６時間後、培養液を慎重に吸出し、２５mlの新しい培養液を加えて培養を続けた。７２時間後、ウイルスを含む上清、すなわち１-２Cまたは３-２E TCRを発現するレンチウイルス上清を収集した。
実施例２における１-２Cおよび３-２E TCRレンチウイルス発現プラスミド（１-２C-pCDH及び３-２E-pCDH）及びレンチウイルスパッキングプラスミドPLP１、PLP２及びVSVG（Addgene社から購入）をPLP１：PLP２:VSVG:TCR-pCDH = ２０:１３:５:２０の割合で混合し、２０ulをDMEM培地（１.２５ml）に希釈して、DNA溶液とする。２０ulポリエーテルイミド（PEI、１μg/μl）をDMEM（１.２５ml）に添加し、上述のPEI／DMEM溶液をすべて配合済みDNA溶液に添加し、室温で１５分間インキュベーションした後、１５cmディスクで培養した２９３T細胞（Cell Bank, Shanghai)に添加し、混合した。６時間後、培養液を慎重に吸出し、２５mlの新しい培養液を加えて培養を続けた。７２時間後、ウイルスを含む上清、すなわち１-２Cまたは３-２E TCRを発現するレンチウイルス上清を収集した。
【0096】
２.１-２Cおよび３-２E TCR-T細胞の製造及びTCR発現効率の検出
２名の健康ボランティア（D１とD２）の末梢血リンパ球を採集し、PBMCを得た後、PBMCの一部を取って、その中のCD８T細胞をマグネチックビーズ（Biolegend社）によってネガティブ選択分離した。anti-CD３/anti-CD２８を被覆した微小球（ThermoFisher）を１：１の数量割合でPBMCまたはCD８ T細胞に添加して一晩活性化培養した後、１-２Cまたは３-２E TCRレンチウイルスを１：１の体積比でPBMCまたはCD８ T細胞に添加した後、混合し、ウイルス感染孔を設けて対照とし、３７℃、５%CO２インキュベーターに入れて培養した。２４時間後、完全培地に交換して第１０日まで培養を続けた。
２名の健康ボランティア（D１とD２）の末梢血リンパ球を採集し、PBMCを得た後、PBMCの一部を取って、その中のCD８T細胞をマグネチックビーズ（Biolegend社）によってネガティブ選択分離した。anti-CD３/anti-CD２８を被覆した微小球（ThermoFisher）を１：１の数量割合でPBMCまたはCD８ T細胞に添加して一晩活性化培養した後、１-２Cまたは３-２E TCRレンチウイルスを１：１の体積比でPBMCまたはCD８ T細胞に添加した後、混合し、ウイルス感染孔を設けて対照とし、３７℃、５%CO２インキュベーターに入れて培養した。２４時間後、完全培地に交換して第１０日まで培養を続けた。
【0097】
anti-CD３/anti-CD２８の微小球を磁場条件下で除去し、細胞培養と同じ培地を用いて２回洗浄し、本実施例の１-２Cまたは３-２E TCR-T効果細胞を得た。
【0098】
上述のPBMCまたはCD８ T細胞を用いて製造した１-２Cまたは３-２E TCR-T細胞（１０日間まで培養した）を培養し、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１四量体染色を用いて実施例２と同様にフローサイトメトリー検出を行い、１-２Cまたは３-２E TCRの発現を確認した（図５、右上象限）。
【0099】
その結果、PBMCまたはCD８+ T細胞を用いて製造したボランティアD１及びD２由来の１-２C、３-２E TCR-T細胞において、いずれも０.２６%-２.３８%の異なる陽性率を有する四量体陽性T細胞を検出でき、そのうち、PBMCにおいてそれぞれ１-２C：０.２６%、０.７７%、３-２E：１.０３%、０.５５%であり、CD８+ T細胞においてそれぞれ１-２C：０.６８%、０.９１%、３-２E：２.３８%、２.３７%であった。
【0100】
これらの本発明のTCR-T効果細胞は、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１に特異的に結合することができることが分かった。
【0101】
３.１-２Cおよび３-２E TCR-T細胞とKRAS野生型及び変異体ポリペプチドの免疫反応の検出
その後、それぞれ異なるT細胞検出方法（IFN-γ-MELISPOTとIFN-γ-ELISA）を利用して、１-２Cまたは３-２E TCR-T細胞とKRAS野生型および変異体ポリペプチドを提示する標的細胞とが作用して分泌されるIFN-γのレベルを検出した。
その後、それぞれ異なるT細胞検出方法（IFN-γ-MELISPOTとIFN-γ-ELISA）を利用して、１-２Cまたは３-２E TCR-T細胞とKRAS野生型および変異体ポリペプチドを提示する標的細胞とが作用して分泌されるIFN-γのレベルを検出した。
【0102】
D１とD２の２名ボランティアのPBMCまたはCD８ T細胞を用いて製造した１-２Cまたは３-２E TCR-T細胞を、それぞれの由来と対応的にD１とD２の２名ボランティアのPBMCと１:１の割合で混合して抗原提示細胞とし、１００μl体積１x１０５細胞数/ウェルで、anti-IFN-γ抗体が予被覆されたELISPOTプレートに添加し、同時KRAS野生型及び変異体ポリペプチド（１００μl体積、１０μg/ml）を添加し、３７℃、１００%湿度、５%CO２インキュベーターで１８時間培養を継続し、PMA/イオノマイシン（ION）（１００μl体積、１μg/ml）刺激を施したもの及び１００μl培地のみを含む試料をそれぞれ陽性および陰性対照とした。IFN-γを生成する特異的なT細胞に対してELISPOTスポット分析を行い、結果を図６A-B、D-Eに示す。
【0103】
さらに、D１とD２の２名ボランティアのPBMCまたはCD８ T細胞を利用して製造した１-２Cまたは３-２E TCR-T細胞を、D１とD２の２名ボランティアのPBMCと１:１の割合で混合し、抗原提示細胞とする。用意した細胞懸濁液を１ウェルあたり１００μl細胞懸濁液（２×１０５個細胞）で９６ウェルプレート内に敷き、１ウェル当たり３回繰り返す。そのうちPMA/イオノマイシン（ION）群は２５０μl細胞培地あたりに１μl PMA/イオノマイシン混合液（２５０×）を添加して、前もって作業液に希釈し、陽性刺激対照とする。１-２Cまたは３-２E TCRレンチウイルスに感染していないT細胞（D１ mockおよびD２ mock）を平行に添加して、陰性対照とする。３７℃で２０h培養した後、９６ウェルプレート培養孔の上清を取って、５００gの回転速度で５分間遠心分離して残存細胞を除去し、上清を抗IFN－γ抗体（BD社）で被覆されたのELISA検出プレート（BD社）に添加し、上清中のIFN－γレベルを検出し、結果を図６CとFに示す。
【0104】
ELISPOT実験の結果、D１とD２ボランティアのPBMCを用いて製造した１-２Cまたは３-２E TCR-T細胞は、いずれもKRAS-G１２V変異ポリペプチドに対して強いT細胞免疫反応を産生することができ、KRAS-G１２C変異ポリペプチドに対しても一定レベルの交差反応を有する。一方、KRAS野生型およびKRAS-G１２D変異ポリペプチドに対するT細胞反応は検出されなかった（図６A-B）。D１とD２ボランティアのCD８ T細胞を用いて製造した１-２C又は３-２E TCR-T細胞において、PBMCで製造したTCR-T細胞と類似したT細胞免疫反応を検出することができる（図６D-E）。
【0105】
IFN-γレベルのELISA実験の結果、D１とD２ボランティアのPBMCまたはCD８ T細胞を用いて製造した１-２Cまたは３-２E TCR-T細胞は、いずれもKRAS-G１２V変異ポリペプチドに対して強いT細胞免疫反応を産生することができ、IFN-γレベルは上昇したが、KRAS野生型及びKRAS-G１２D変異ポリペプチドに対するT細胞反応は検出されなかった（図６CとF）。
【0106】
したがって、１-２Cおよび３-２E TCR-T細胞は、KRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１を提示する標的細胞を特異的に識別することができ、KRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）を提示する標的細胞に対して一定の交差反応を有し、サイトカインIFN-γを特異的に分泌することができる。CD８+ T細胞の標的細胞に対する潜在的な細胞毒性作用に鑑みて、本発明の１-２C及び３-２E TCR-T細胞は潜在的な標的細胞殺傷活性と腫瘍治療価値を有することを示唆する。
【0107】
実施例４.１-２Cおよび３-２E TCRのKRAS変異体ポリペプチドエピトープに対するの結合特性分析
１-２Cおよび３-２E TCRとKRASの異なる変異体ポリペプチド／HLA-A１１複合体タンパク質の結合特性と親和力を正確に測定するために、発明者はさらに表面プラズマ共鳴実験（SPR）を利用してタンパク質レベルの親和力を検出した。１-２Cまたは３-２E TCRの機能領域は細胞外領域であり、膜貫通領域を含まない細胞外領域は可溶性タンパク質であるため、１-２Cまたは３-２E TCRの細胞外領域を合成した。具体的な操作は以下の通りである。
１-２Cおよび３-２E TCRとKRASの異なる変異体ポリペプチド／HLA-A１１複合体タンパク質の結合特性と親和力を正確に測定するために、発明者はさらに表面プラズマ共鳴実験（SPR）を利用してタンパク質レベルの親和力を検出した。１-２Cまたは３-２E TCRの機能領域は細胞外領域であり、膜貫通領域を含まない細胞外領域は可溶性タンパク質であるため、１-２Cまたは３-２E TCRの細胞外領域を合成した。具体的な操作は以下の通りである。
【0108】
１.TCRタンパク質の発現と精製
１-２Cまたは３-２E TCRα鎖とβ鎖の細胞外領域遺伝子を原核コドンによって最適化し、それぞれ１-２Cと３-２E TCRキメラα鎖とβ鎖の細胞外領域のDNA配列（１-２C：α鎖、配列番号２９に記載され、β鎖、配列番号３０に記載され、３-２E:α鎖、配列番号３１に記載され、β鎖、配列番号３２に記載される）を合成した。ここで、１-２C TCRは、配列番号２に記載のα鎖可変領域、及び配列番号７に記載のβ鎖可変領域を含む。３-２E TCRは、配列番号１２に記載のα鎖可変領域、及び配列番号１７に記載のβ鎖可変領域を含む。それぞれ制限酵素認識部位Nde IとXho Iを導入し、そのうちNde I制限酵素認識部位は配列の５’端に位置し、制限酵素認識部位Xho Iは配列の３’端に位置する。制限酵素認識部位Nde IとXho Iを用いて、合成された１-２Cまたは３-２E TCRα鎖とβ鎖の細胞外領域のDNA配列をそれぞれ発現ベクターpET２１a（Invitrogen社）にクローニングし、１-２Cまたは３-２E TCRα鎖とβ鎖の細胞外領域タンパク質の原核組換え発現プラスミドを構築した。
１-２Cまたは３-２E TCRα鎖とβ鎖の細胞外領域遺伝子を原核コドンによって最適化し、それぞれ１-２Cと３-２E TCRキメラα鎖とβ鎖の細胞外領域のDNA配列（１-２C：α鎖、配列番号２９に記載され、β鎖、配列番号３０に記載され、３-２E:α鎖、配列番号３１に記載され、β鎖、配列番号３２に記載される）を合成した。ここで、１-２C TCRは、配列番号２に記載のα鎖可変領域、及び配列番号７に記載のβ鎖可変領域を含む。３-２E TCRは、配列番号１２に記載のα鎖可変領域、及び配列番号１７に記載のβ鎖可変領域を含む。それぞれ制限酵素認識部位Nde IとXho Iを導入し、そのうちNde I制限酵素認識部位は配列の５’端に位置し、制限酵素認識部位Xho Iは配列の３’端に位置する。制限酵素認識部位Nde IとXho Iを用いて、合成された１-２Cまたは３-２E TCRα鎖とβ鎖の細胞外領域のDNA配列をそれぞれ発現ベクターpET２１a（Invitrogen社）にクローニングし、１-２Cまたは３-２E TCRα鎖とβ鎖の細胞外領域タンパク質の原核組換え発現プラスミドを構築した。
【0109】
熱刺激法を用いて、発現プラスミドをE. coli.BL２１(DE３)コンピテント細胞に導入し、IPTGを添加して発現を誘導し、封入体状態の１-２Cおよび３-２E TCRα鎖とβ鎖の細胞外領域タンパク質を得た。
【0110】
１-２Cまたは３-２E TCRα鎖とβ鎖の細胞外領域の封入体（各封入体はいずれも３０mg/mlで、６M Gua-HCl、５０mM Tris pH８.０、１００mM NaCl、１０mM EDTA及び１０mM DTTを含む溶解液に溶解する）６mlを、２：１の質量比で、配合した復元液（５M尿素、２０mM Tris-HCL、４００mM L-アルギニン、EDTA ２mM、GSH/GSSG ５ mM/１mM）中に、２回に分けて滴下し、毎回３mLずつ滴下し、２回の滴下間隔は少なくとも８hであった。その後、濃縮カップ（Millipore社）を用いて濃縮を行った。
【0111】
濃縮後、それぞれ４L脱イオン水と４L １０mM Tris、ph８.０の透析液に入れて透析し、それぞれ２４時間透析した。その後、Source １５Qイオン交換クロマトグラフィーを用いて粗精製を行い、SDS-PAGEにより目的タンパク質を同定した。
【0112】
具体的には、目的タンパク質を濃縮カップ（Millipore社）で濃縮し、２０mM Tris-HCL、１５０mM NaCL、pH８.０の緩衝液で液交換し、濃縮後にSuperdex ２００pgモレキュラーシーブ（GE Healthcare）で精製し、約２-３mgの１-２Cまたは３-２E TCRタンパク質を得て、還元性（ジチオトレイトール（DTT）を含む）と非還元性（ジチオトレイトール（DTT）を含まない）SDS-PAGEによって目的タンパク質を検出する（図７）。
【0113】
その結果、１-２C TCRは１８.１９mS/cm条件下で溶出し、３-２E TCRは３-２E ２１.１９mS/cm条件下で溶出し、両者のモレキュラーシーブクロマトグラフィーは１５ mL溶出量時にタンパク質目的ピークが出現した。SDS-PAGE同定により、１-２Cまたは３-２Eはαβヘテロダイマーを呈し、DTTを加えない非還元条件のSDS-PAGEにおいてベンドサイズが約５２KDであり、DTTを加えた還元条件のSDS-PAGEにおいてα鎖とβ鎖間のジスルフィド結合が開かれ、それぞれ２４KDと２８KD程度の大きさのベンドが示された（図７）。
【0114】
２.SPR検出分析
実施例１と同様の操作で体外復元性実験を行って製造した１-２C及び３-２E TCRタンパク質、及び実施例１で製造したビオチン化KRAS野生型及び異なる変異体９ペプチド/HLA-A１１複合体タンパク質をSPR緩衝液（１０mM HEPES-HCl、１５０mM Na-Cl、０.００５% Tween-２０、pH７.４）に液交換した。KRAS野生型および異なる変異体９ペプチド/HLA-A１１複合体タンパク質を２０μg/mlに希釈し、SAチップ（GE Health）に固定し、その後勾配（０μM、６.２５μM、１２.５μM、２５μM、５０μM、１００μM）希釈された１-２C及び３-２E TCRタンパク質をそれぞれSAチップの各チャネルを流れ、BIA評価ソフトウェアを用いて結合動力学パラメータを分析し、親和力定数を計算する。１-２C及び３-２E TCRと野生型及びKRAS野生型及び異なる変異体９ペプチド／HLA-A１１複合体タンパク質との親和力を検出した（図８）。
実施例１と同様の操作で体外復元性実験を行って製造した１-２C及び３-２E TCRタンパク質、及び実施例１で製造したビオチン化KRAS野生型及び異なる変異体９ペプチド/HLA-A１１複合体タンパク質をSPR緩衝液（１０mM HEPES-HCl、１５０mM Na-Cl、０.００５% Tween-２０、pH７.４）に液交換した。KRAS野生型および異なる変異体９ペプチド/HLA-A１１複合体タンパク質を２０μg/mlに希釈し、SAチップ（GE Health）に固定し、その後勾配（０μM、６.２５μM、１２.５μM、２５μM、５０μM、１００μM）希釈された１-２C及び３-２E TCRタンパク質をそれぞれSAチップの各チャネルを流れ、BIA評価ソフトウェアを用いて結合動力学パラメータを分析し、親和力定数を計算する。１-２C及び３-２E TCRと野生型及びKRAS野生型及び異なる変異体９ペプチド／HLA-A１１複合体タンパク質との親和力を検出した（図８）。
【0115】
その結果、図８中の曲線から分かるように、１-２C TCRのKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１との結合は高速結合高速解離のモードを呈し、結合親和力（KD）は７.２１μMであり、KRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）/HLA-A１１との結合親和力（KD）は４６.２μMであり、KRAS-G１２V８-１６エピトープより有意に低い。
【0116】
一方、１-２CはKRAS野生型KRAS-G１２８-１６（VVGAGGVGK）/HLA-A１１及びKRAS-G１２D８-１６（VVGADGVGK）/HLA-A１１と結合することができない。３-２E TCRのKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１との結合親和力（KD）は３５.９μMであり、１-２Cの親和力より有意に低く、KRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）/HLA-A１１との結合親和力（KD）は５０.５μMであり、KRAS-G１２V８-１６と同じレベルにある。
【0117】
１-２Cと類似に、３-２E TCRはKRAS野生型KRAS-G１２８-１６（VVGAGGVGK）/HLA-A１１及びKRAS-G１２D８-１６（VVGADGVGK）/HLA-A１１と結合することができない。
【0118】
したがって、SPR結果から分かるように、１-２C TCRおよび３-２E TCRはKRAS-G１２V８-１６（VVGAVGVGK）/HLA-A１１に特異的に結合することができ、１-２C TCRとKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）/HLA-A１１は一定の交差反応があり、１-２C TCRとKRAS-G１２C８-１６（VVGACGVGK）/HLA-A１１の親和力はKRAS-G１２Vと同じレベルにある。したがって、１-２Cと３-２E TCRは良好な結合特性及び親和力を有し、１-２Cおよび３-２E TCRを抗腫瘍治療に用いると、遺伝子KRASのG１２VとG１２C変異を有する腫瘍細胞に対してIFN-γを産生させ，さらに腫瘍細胞を殺傷し、腫瘍を治療する役割を果たすと推測できる。
【0119】
実施例５.腫瘍マウスモデルにおける１-２C TCR-T細胞の腫瘍抑制活性
本実施例はNCG免疫不全マウスPANC-１腫瘍モデルを用いて、１-２C TCR-T細胞の腫瘍抑制効果を評価した。
本実施例はNCG免疫不全マウスPANC-１腫瘍モデルを用いて、１-２C TCR-T細胞の腫瘍抑制効果を評価した。
【0120】
TCR-T細胞のNCGマウス腫瘍抑制実験ステップは、以下を含む。
【0121】
１.NCGマウスPANC-１腫瘍モデルの構築
NCGマウスは南京大学-南京生物医薬研究院に由来し、各NCGマウスにKRAS-G１２V変異遺伝子を有するPANC-１腫瘍細胞（Beijing Union Cell Resource Center)を皮下接種し、NCGマウスにヒト免疫系を構築した：
a) PANC-１細胞の接種数量：４×１０６個細胞/２００μL/匹；
b) 接種部位：背部皮下。
NCGマウスは南京大学-南京生物医薬研究院に由来し、各NCGマウスにKRAS-G１２V変異遺伝子を有するPANC-１腫瘍細胞（Beijing Union Cell Resource Center)を皮下接種し、NCGマウスにヒト免疫系を構築した：
a) PANC-１細胞の接種数量：４×１０６個細胞/２００μL/匹；
b) 接種部位：背部皮下。
【0122】
２.１-２C TCR-T細胞治療
NCGマウスPANC-１腫瘍細胞を接種した第７日、腫瘍体積は約２００mm３まで生長し、実施例３においてD１とD２の２名ボランティアPBMCで製造した１-２C TCR-T細胞を腫瘍内多点注射を通じて、NCGマウスのPANC-１腫瘍内部に注射した：
a)１-２C TCR-T細胞の接種数量：３つ用量(dose)に従う：それぞれ１×１０７、１×１０６、１×１０５細胞/２００μL/匹；
b)接種部位：腫瘍内。
NCGマウスPANC-１腫瘍細胞を接種した第７日、腫瘍体積は約２００mm３まで生長し、実施例３においてD１とD２の２名ボランティアPBMCで製造した１-２C TCR-T細胞を腫瘍内多点注射を通じて、NCGマウスのPANC-１腫瘍内部に注射した：
a)１-２C TCR-T細胞の接種数量：３つ用量(dose)に従う：それぞれ１×１０７、１×１０６、１×１０５細胞/２００μL/匹；
b)接種部位：腫瘍内。
【0123】
３.グルーピング及び処理：
腫瘍細胞を注射した後約１週間後に、比較的均一な腫瘍を形成したマウスを選択してグルーピングし、その後１-２C TCR-T細胞腫瘍内注射治療を行った。本実施例において、TCRを導入していないT細胞（１×１０７）注射群は陰性対照であり、各群のマウスは６匹であり、そのうちD１とD２で製造したTCR-T細胞治療群は各３匹である。各グルーピング情報及び処理は次の表の通りである：
腫瘍形成後、３～４日ごとに腫瘍サイズを一回測定し、マウスの最大腫瘍体積が４０００mm３になる時、実験を終了し、マウスを処刑し、腫瘍を分離して重量を測定した。
腫瘍細胞を注射した後約１週間後に、比較的均一な腫瘍を形成したマウスを選択してグルーピングし、その後１-２C TCR-T細胞腫瘍内注射治療を行った。本実施例において、TCRを導入していないT細胞（１×１０７）注射群は陰性対照であり、各群のマウスは６匹であり、そのうちD１とD２で製造したTCR-T細胞治療群は各３匹である。各グルーピング情報及び処理は次の表の通りである：
【表2】
腫瘍形成後、３～４日ごとに腫瘍サイズを一回測定し、マウスの最大腫瘍体積が４０００mm３になる時、実験を終了し、マウスを処刑し、腫瘍を分離して重量を測定した。
【0124】
４.治療効果の観察：
１）腫瘍サイズ検出：
a）TCR-T細胞を注射した後、キャリパーを用いて直径を測定し、単位はmmであり、計算公式は：v=１/２×a×b×b（aは長径、bは短径）であり；
b）最後一回観察後に実験を終了し、腫瘍組織を分離して直接秤量する。
１）腫瘍サイズ検出：
a）TCR-T細胞を注射した後、キャリパーを用いて直径を測定し、単位はmmであり、計算公式は：v=１/２×a×b×b（aは長径、bは短径）であり；
b）最後一回観察後に実験を終了し、腫瘍組織を分離して直接秤量する。
【0125】
その結果、１×１０７高用量及び１×１０６中用量注射群の１-２C TCR-T細胞治療群の腫瘍体積は陰性対照群より有意に小さかった（T検定、p<０.０１）（図９C）。一方、１×１０５低用量群と陰性対照群の腫瘍体積に有意差はなかった（T検定、p>０.０５）。実験終了時、各群の腫瘍重量に対して分析し、その結果、高用量群の腫瘍重量は陰性対照群より有意に低かった（図９A）。本実施例の結果によると、１-２C TCR-T細胞は腫瘍生長を効果的に抑制でき、腫瘍抑制活性はTCR-T細胞数量と有意な用量依存効果を呈し、潜在的な腫瘍治療価値を有する（図９）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】