(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-31
(54)【発明の名称】蛍光融合に基づく異種ペプチド製造
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20231024BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20231024BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20231024BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20231024BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20231024BHJP
C07K 4/04 20060101ALN20231024BHJP
C07K 4/12 20060101ALN20231024BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231024BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231024BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 C ZNA
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/21
C07K4/04
C07K4/12
C12N15/12
C12N15/31
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023528999
(86)(22)【出願日】2021-11-16
(85)【翻訳文提出日】2023-07-13
(86)【国際出願番号】 IB2021060587
(87)【国際公開番号】W WO2022101885
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】2020/07119
(32)【優先日】2020-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】ZA
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523179005
【氏名又は名称】ステレンボッシュ ユニヴァーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン スターデン、アントン デュ プリーズ
(72)【発明者】
【氏名】スミス、カリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ニコラス、ドミニク
(72)【発明者】
【氏名】ディックス、レオン ミルナー セオドア
(72)【発明者】
【氏名】ヴァーミューレン、ロス レイン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA26X
4B065AA26Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA41
4H045CA11
4H045CA50
4H045EA60
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、宿主細胞中で目的の異種ポリペプチドを製造する方法に関し、ここで、該方法は、目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質を、プロモーターに作動可能に連結された溶解タンパク質をコードする核酸を含むように改変された宿主細胞中で発現させることを含み、ここで、溶解タンパク質の翻訳は、ＲＮＡサーモメータの制御下にある。また、融合タンパク質を発現させ、プロモーターに作動可能に連結された溶解タンパク質をコードする核酸を含む大腸菌細胞も提供され、ここで、溶解タンパク質の翻訳は、ＲＮＡサーモメータによって調節されている。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
宿主細胞中で１つ以上の目的の異種ポリペプチドを製造する方法であって、該方法は：（ｉ）目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供すること；
（ｉｉ）宿主細胞を工程（ｉ）の発現ベクターで形質転換することであって、ここで、宿主細胞および／または発現ベクターは、プロモーター、溶解タンパク質、およびＲＮＡサーモメータをコードする核酸を含むように改変されており、さらにここで、溶解タンパク質をコードする核酸の発現は、プロモーターによって調節されており、溶解タンパク質の翻訳は、ＲＮＡサーモメータによって調節されている、形質転換すること；
（ｉｉｉ）宿主細胞中で融合タンパク質を発現させること；
（ｉｖ）溶解タンパク質の発現を誘導するために、宿主細胞の温度を変更することであって、ここで、溶解タンパク質の発現は、宿主細胞の溶解をもたらす、変更すること；並びに
（ｖ）宿主細胞から融合タンパク質を回収すること
を含む、方法。
【請求項2】
融合タンパク質が１つ以上の精製タグを含み、方法が回収された融合タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項3】
精製タグがヒスチジン（Ｈｉｓ）タグおよび／またはグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグである、請求項２の方法。
【請求項4】
融合タンパク質がプロテアーゼ切断部位を含み、方法が回収後に蛍光融合パートナーを目的の異種ポリペプチドから切断する工程をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項の方法。
【請求項5】
プロテアーゼ切断部位が、配列ＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧ（配列番号２）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＷＥＬＱ（配列番号１）を有するＷＥＬＱｕｔ部位、配列ＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号４）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＬＶＰＲ（配列番号３）を有するトロンビンまたはトリプシン切断部位、配列ＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＧＣ（配列番号６）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＡＳＰＲ（配列番号５）を有するｎｉｓＰまたはトリプシン切断部位、配列ＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＧＣ（配列番号８）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７）を有するＴＥＶ切断部位、配列ＡＴＴＧＡＡＧＧＴＣＧＴ（配列番号１０）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＩＥＧＲ（配列番号９）を有する第Ｘａ因子切断部位、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４の方法。
【請求項6】
融合タンパク質が分泌シグナルペプチドを含む、請求項１から５のいずれか一項の方法。
【請求項7】
蛍光融合パートナーが、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項の方法。
【請求項8】
緑色蛍光タンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる、請求項７の方法。
【請求項9】
赤色蛍光タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるｍＣｈｅｒｒｙである、請求項７の方法。
【請求項10】
目的の異種ポリペプチドが、ナイシン、エピランシン１５ＸおよびＰｅｐ５を含むランチペプチド；プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡを含むバクテリオシン；リステリオリシンＯ；ＡｃｔＡ；並びにオートファジーペプチドＸからなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一項の方法。
【請求項11】
溶解タンパク質が、配列番号１５若しくは配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６若しくは配列番号１８のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる溶解タンパク質を含む、エンドリシンまたは細菌性ムレインヒドロラーゼである、請求項１から１０のいずれか一項の方法。
【請求項12】
ＲＮＡサーモメータが配列番号１９～２７または配列番号１０５～１１１のいずれか１つの核酸配列を有し、プロモーターが、定常期プロモーターであり、配列番号７４～７６のいずれか１つの核酸配列、並びに配列番号７７～１００のいずれか１つに示される配列を有する組合せを含む、定常期プロモーターおよびＲＮＡサーモメータの組合せを含む、請求項１から１１のいずれか一項の方法。
【請求項13】
溶解タンパク質の発現が、引き続く細胞の凍結融解および溶解緩衝液中での再懸濁の際に宿主細胞の溶解をもたらす、請求項１から１２のいずれか一項の方法。
【請求項14】
宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項１から１３のいずれか一項の方法。
【請求項15】
大腸菌細胞であって、該細胞は：（ｉ）目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つの発現ベクター；並びに
（ｉｉ）溶解タンパク質およびＲＮＡサーモメータに作動可能に連結されたプロモーターをコードする核酸
を含み、ここで、ＲＮＡサーモメータは、溶解タンパク質の翻訳を調節することができる、細胞。
【請求項16】
融合タンパク質が精製タグを含む、請求項１５の細胞。
【請求項17】
精製タグがヒスチジン（Ｈｉｓ）タグまたはグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグである、請求項１６の細胞。
【請求項18】
融合タンパク質がプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１５から１７のいずれか一項の細胞。
【請求項19】
プロテアーゼ切断部位が、配列ＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧ（配列番号２）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＷＥＬＱ（配列番号１）を有するＷＥＬＱｕｔ部位、配列ＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号４）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＬＶＰＲ（配列番号３）を有するトロンビンまたはトリプシン切断部位、配列ＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＧＣ（配列番号６）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＡＳＰＲ（配列番号５）を有するｎｉｓＰまたはトリプシン切断部位、配列ＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＧＣ（配列番号８）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７）を有するＴＥＶ切断部位、配列ＡＴＴＧＡＡＧＧＴＣＧＴ（配列番号１０）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＩＥＧＲ（配列番号９）を有する第Ｘａ因子切断部位、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１８の細胞。
【請求項20】
融合タンパク質が分泌シグナルペプチドを含む、請求項１５から１９のいずれか一項の細胞。
【請求項21】
蛍光融合パートナーが、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項１５から２０のいずれか一項の細胞。
【請求項22】
緑色蛍光タンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる、請求項２１の細胞。
【請求項23】
赤色蛍光タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるｍＣｈｅｒｒｙである、請求項２１の細胞。
【請求項24】
目的の異種ポリペプチドが、ナイシン、エピランシン１５ＸおよびＰｅｐ５を含むランチペプチド；プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡを含むバクテリオシン；リステリオリシンＯ；ＡｃｔＡ；並びにオートファジーペプチドＸからなる群から選択される、請求項１５から２３のいずれか一項の細胞。
【請求項25】
溶解タンパク質が、配列番号１５若しくは配列番号１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６若しくは配列番号１８のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる溶解タンパク質を含む、エンドリシンまたは細菌性ムレインヒドロラーゼである、請求項１５から２４のいずれか一項の細胞。
【請求項26】
ＲＮＡサーモメータが配列番号１９～２７または配列番号１０５～１１１のいずれか１つの核酸配列を有し、プロモーターが、定常期プロモーターであり、配列番号７４～７６のいずれか１つの核酸配列、並びに配列番号７７～１００のいずれか１つに示される配列を有する組合せを含む、定常期プロモーターおよびＲＮＡサーモメータの組合せを含む、請求項１５から２５のいずれか一項の細胞。
【請求項27】
溶解タンパク質の発現が、引き続く細胞の凍結融解および溶解緩衝液中での再懸濁の際に宿主細胞の溶解をもたらす、請求項１５から２６のいずれか一項の細胞。
【請求項28】
目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質を発現させるための少なくとも１つの発現ベクター；並びに大腸菌細胞
を含み、ここで、細胞および／または発現ベクターは、溶解タンパク質およびＲＮＡサーモメータに作動可能に連結されたプロモーターをコードする核酸を含み、ここで、ＲＮＡサーモメータは、溶解タンパク質の翻訳を調節することができる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の背景
本発明は、宿主細胞中で目的の異種ポリペプチドを製造する方法に関し、ここで、該方法は、目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質を、ＲＮＡサーモメータ（ＲＮＡ ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）の制御下の、溶解タンパク質をコードする核酸を含むように改変された宿主細胞中で発現させることを含む。本発明はさらに、融合タンパク質を発現させ、ＲＮＡサーモメータの制御下の溶解タンパク質をコードする核酸を含む大腸菌細胞に関する。
本発明は、宿主細胞中で目的の異種ポリペプチドを製造する方法に関し、ここで、該方法は、目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質を、ＲＮＡサーモメータ（ＲＮＡ ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）の制御下の、溶解タンパク質をコードする核酸を含むように改変された宿主細胞中で発現させることを含む。本発明はさらに、融合タンパク質を発現させ、ＲＮＡサーモメータの制御下の溶解タンパク質をコードする核酸を含む大腸菌細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
ペプチドは、生理学的システムにおいて遍在しており、ここで、それらは、生命にとって基本的な機能を果たしている。ヒトの生理機能においてだけでも、ペプチドは、ホルモン、神経伝達物質、増殖因子、イオンチャネルリガンドまたは抗菌剤として機能し、これが、それらを魅力的な治療資源とする。
【0003】
新しい医薬品および工業用酵素についてのニーズは高まっており、これが、次世代シークエンシングの結果として、薬学的または工業的特性について試験したいペプチドまたはタンパク質を観察する研究者の市場を作り出している。さらに、価値ある組換えタンパク質の現在の製造は、収量および生産性の両方を向上させ得る技術に常に利点を見出すであろう。従って、タンパク質合成および異種タンパク質発現のような技術が、応用されるようになってきている。
【0004】
目的のペプチドおよび低分子タンパク質はしばしば、化学的に合成され、これは、異種発現と比較してはるかに優れた収量をもたらす。異種発現は、異種宿主を利用する確立された技術であり、高収量製造により適しているが、依然としてタンパク質フォールディングまたは翻訳後修飾を導くとらえどころのない物理法則によって支配されている。異種発現は従って、遺伝子設計図から物理的構造を提供することにより、化学合成と連携して機能するはずであり、このことは、この分野における多くの人にとって明白である。しかしながら、生理活性タンパク質は、そもそもそれらを良好な医薬品および酵素候補品とするそれらの固有の物理的特性のため、発現させることが困難である。従って、これらのタンパク質の発現は、特別な専門知識および技術を必要とし、多くの場合、複数回の反復の化学合成または古典的な精製についての優先をもたらす。どちらのアプローチも、医薬品の特性評価について必要とされる時間およびリソースにおける増加をもたらし得る。本発明は、標的の多様性および収量の両方において異種発現の限界を押し上げるための堅固なかつ迅速なプラットフォームを提供することを目的とする。具体的には、本願の発明者らは、広範囲の組換えタンパク質を製造する方法を開発した。該方法は、それが製造するさまざまな組換えタンパク質の製造を増加させるために、それを多用途でかつ費用対効果の高いものとする、互いにリンクした３つの主要な技術に依存する。本発明の方法は、毒性を抑え、溶解度を高め、翻訳後修飾を促進することを通して大腸菌の能力を広げる、安定化したペプチド発現を可能にすることを目的とする蛍光タンパク質融合パートナーを使用する。融合パートナーの自己蛍光が、前例のないリアルタイムのインビボおよび堅固なインビトロフィードバックを提供することによって収量を押し上げる迅速な最適化を可能とする。さらに、自己消化の転写後温度調節が、製造コスト、時間および労力を削減させ、該方法を、従来の方法よりも高速かつ費用対効果の高いものとする。本発明の方法を使用して、本発明者らは、それらが、１）以前は無駄であると考えられていた場所で発現される組換えタンパク質の範囲および収量を増加させること；２）蛍光融合タンパク質のインビボ検出により発現の最適化を簡単にすること；３）製造中の任意の時点で蛍光タンパク質を素早く視覚化することができる能力を通して、トラブルシューティングに対して費やす時間を短縮させること、並びに４）高価な誘導物質を必要としない自己消化技術の導入を通して、タンパク質製造コストを削減し、収量を増加させること、ができることを示した。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、宿主細胞中で目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質を発現させることを含む、宿主細胞、特に大腸菌細胞中で目的の異種ポリペプチドを製造する方法に関する。特に、宿主細胞は、ＲＮＡサーモメータ（ＲＮＡ ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）の制御下にある溶解タンパク質をコードする核酸を含むように改変される。本発明はまた、本発明の融合タンパク質を発現させ、ＲＮＡサーモメータの制御下にある溶解タンパク質をコードする核酸を含む、改変大腸菌細胞に関する。
【0006】
本発明の第１の態様によれば、宿主細胞中で１つ以上の、目的の異種ポリペプチドを製造する方法が提供され、該方法は：
（ｉ）目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供すること；
（ｉｉ）宿主細胞を工程（ｉ）の発現ベクターで形質転換することであって、ここで、宿主細胞および／または発現ベクターは、溶解タンパク質に作動可能に連結されたプロモーター（構成的例えば定常期プロモーター、または誘導性例えばＴ７であり得る）、およびＲＮＡサーモメータをコードする核酸を含むように改変されており、さらにここで、溶解タンパク質をコードする核酸の発現は、プロモーターによって調節されており、溶解タンパク質の翻訳は、ＲＮＡサーモメータによって調節されている、形質転換すること；
（ｉｉｉ）宿主細胞中で融合タンパク質を発現させること；
（ｉｖ）溶解タンパク質の発現を誘導するために、宿主細胞の温度を変更することであって、ここで、溶解タンパク質の発現は、宿主細胞の溶解をもたらす、変更すること；並びに
（ｖ）宿主細胞から融合タンパク質を回収すること
を含むかまたはからなる。
（ｉ）目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供すること；
（ｉｉ）宿主細胞を工程（ｉ）の発現ベクターで形質転換することであって、ここで、宿主細胞および／または発現ベクターは、溶解タンパク質に作動可能に連結されたプロモーター（構成的例えば定常期プロモーター、または誘導性例えばＴ７であり得る）、およびＲＮＡサーモメータをコードする核酸を含むように改変されており、さらにここで、溶解タンパク質をコードする核酸の発現は、プロモーターによって調節されており、溶解タンパク質の翻訳は、ＲＮＡサーモメータによって調節されている、形質転換すること；
（ｉｉｉ）宿主細胞中で融合タンパク質を発現させること；
（ｉｖ）溶解タンパク質の発現を誘導するために、宿主細胞の温度を変更することであって、ここで、溶解タンパク質の発現は、宿主細胞の溶解をもたらす、変更すること；並びに
（ｖ）宿主細胞から融合タンパク質を回収すること
を含むかまたはからなる。
【0007】
好ましくは、ＲＮＡサーモメータをコードする核酸は、プロモーターに転写的に融合されており、溶解タンパク質をコードする核酸に転写的にまたは翻訳的に融合されている。より好ましくは、ＲＮＡサーモメータをコードする核酸は、溶解タンパク質をコードする核酸の上流にある。さらに、プロモーター、溶解タンパク質およびＲＮＡサーモメータをコードする核酸は、ＲＮＡが天然に認識し制御するヌクレオチド配列などの、ＲＮＡサーモメータによって認識されるヌクレオチド配列を含み得る。
【0008】
該方法の第１の実施態様においては、融合タンパク質は、精製タグを含み得、該方法はさらに、回収した融合タンパク質を精製する工程を含み得る。任意の既知の精製タグを使用し得ることが、当業者によって理解されるであろう。好ましくは、精製タグは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製における使用のためのヒスチジン（Ｈｉｓ）タグまたはプルダウンアッセイにおける使用のためのグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグであり得る。あるいは、融合タンパク質は、ＩＭＡＣ精製における使用のためのヒスチジン（Ｈｉｓ）タグおよびプルダウンアッセイにおける使用のためのグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグなどの、２つ以上の精製タグを含み得る。
【0009】
本発明の方法の第２の実施態様によれば、融合タンパク質は、プロテアーゼ切断部位を含み得、該方法はさらに、回収後に蛍光融合パートナーを目的の異種ポリペプチドから切断する工程を含み得る。プロテアーゼによる切断については、任意の既知のプロテアーゼ切断部位を企図し得ることが、当業者によって理解されるであろう。特に、プロテアーゼ切断部位は、配列ＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧ（配列番号２）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＷＥＬＱ（配列番号１）を有するＷＥＬＱｕｔ部位、配列ＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号４）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＬＶＰＲ（配列番号３）を有するトロンビンまたはトリプシン切断部位、配列ＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＧＣ（配列番号６）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＡＳＰＲ（配列番号５）を有するｎｉｓＰまたはトリプシン切断部位、配列ＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＧＣ（配列番号８）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７）を有するＴＥＶ切断部位、配列ＡＴＴＧＡＡＧＧＴＣＧＴ（配列番号１０）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＩＥＧＲ（配列番号９）を有する第Ｘａ因子切断部位、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択し得る。
【0010】
本発明の方法の第３の実施態様においては、融合タンパク質は、分泌ペプチドを含み得る。使用し得るシグナルペプチドは、Ｓｅｃ（一般分泌）、ＳＲＰ（シグナル認識粒子）またはＴＡＴ（ツインアルギニン転座）経路を介して分泌を指示するものを含み得るが、これらに限定されない。Ｓｅｃ依存性分泌については、ＬａｍＢ、ＭａｌＥ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴまたはＰｈｏＡからの配列を、使用し得る。ＳＲＰ依存性分泌については、ＤｓｂＡ、ＳｆｍＣ、ＴｏｌＢまたはＴｏｒＴからの配列を、使用し得る。ＴＡＴ依存性分泌については、シグナルペプチドは、可変であり得、Ｐ－Ｒ－Ｒ－ｘ－Ｈ－Ｈモチーフ（ここで、Ｐ、Ｒ、ｘおよびＨは、それぞれ、極性残基、アルギニン、任意の残基および疎水性残基を示す）を含有し得る。シグナルペプチドは、大腸菌、またはＰｅｌＢ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）およびＳｐＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ブドウ球菌）などの他の種からの異種配列と相同であり得る。
【0011】
本発明の方法の第４の実施態様によれば、蛍光融合パートナーは、好ましくは単量体であり、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択し得る。多数の蛍光融合タンパク質が知られており、当技術分野において知られている任意の蛍光融合タンパク質を使用し得ることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、蛍光融合パートナーは、配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる、緑色蛍光タンパク質であり得る。あるいは、蛍光融合パートナーは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるｍＣｈｅｒｒｙなどの、赤色蛍光タンパク質であり得る。本発明の方法が任意の時点で蛍光融合パートナーを検出する工程を含み得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【0012】
本発明の方法のさらなる実施態様においては、目的の異種ポリペプチドは、任意の、目的の異種ポリペプチド、特に、ナイシン（Ｎｉｓｉｎ）、エピランシン１５ＸおよびＰｅｐ５を含むランチペプチド（ｌａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅ）；プランタリシン４２３およびムンドティシン（ｍｕｎｄｔｉｃｉｎ）ＳＴ４ＳＡを含むバクテリオシン；リステリオリシンＯ；ＡｃｔＡ；並びにオートファジーペプチドＸからなる群から選択される、目的の異種ポリペプチドであり得る。
【0013】
本発明の方法の別の実施態様においては、溶解タンパク質は、当技術分野において知られている任意の溶解タンパク質であり得、例えば溶解タンパク質は、エンドリシンまたは細菌性ムレインヒドロラーゼであり得る。１つの非限定的な例においては、溶解タンパク質は、ファージＤＮＡに由来し、配列番号１５若しくは１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６若しくは１８のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる。
【0014】
本発明の方法のなおさらなる実施態様においては、ＲＮＡサーモメータは、配列番号１９～２７または配列番号１０５～１１１のいずれか１つの核酸配列を有するＲＮＡサーモメータを含み得るが、これらに限定されない。ＲＮＡサーモメータは、ラムダファージおよび細菌において見出されるものなど、天然に存在し得、または新規配列として合成し得る。さらに、構成的プロモーター（例えば定常期プロモーター）または誘導性プロモーター（例えばＴ７）の使用は、ＲＮＡサーモメータをコードする核酸および溶解遺伝子の転写を制御するために使用し得る。定常期プロモーターの使用は、ＲＮＡサーモメータおよび溶解遺伝子からなるｍＲＮＡの遅延した転写をもたらし得る。これが、ｍＲＮＡの安定性を増大させ、溶解遺伝子の遅延した発現を通して細胞上の代謝負荷を低下させる。適切な定常期プロモーターは、配列番号７４～７６のいずれか１つの核酸配列を有するプロモーターを含み得る。さらに、プロモーターおよびＲＮＡサーモメータの適切な組合せは、配列番号７７～１００のいずれか１つに示す配列を有する組合せを含み得る。
【0015】
本発明の方法のさらなる実施態様によれば、宿主細胞は、大腸菌細胞であり得る。
【0016】
本発明の第２の態様によれば、（ｉ）目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質をコードする少なくとも１つの発現ベクター（配列番号１０１または配列番号１０２に示す配列を有するベクターを含む）；並びに（ｉｉ）溶解タンパク質およびＲＮＡサーモメータに作動可能に連結されたプロモーターをコードする核酸を含み、ここで、ＲＮＡサーモメータは、溶解タンパク質の翻訳を調節することができる、大腸菌細胞が提供される。一つの実施態様においては、（ｉｉ）における核酸は、（ｉ）の発現ベクター上に提供し得る。代替の実施態様においては、（ｉｉ）の核酸は、（ｉ）の発現ベクターと適合し、同時に形質転換される、異なる発現ベクター上に提供し得る。
【0017】
本発明の細胞の第１の実施態様においては、融合タンパク質は、融合タンパク質を精製することにおける使用のための精製タグを含み得る。任意の既知の精製タグを使用し得ることが、当業者によって理解されるであろう。好ましくは、精製タグは、ＩＭＡＣ精製における使用のためのヒスチジン（Ｈｉｓ）タグまたはプルダウンアッセイにおける使用のためのグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグであり得る。あるいは、融合タンパク質は、ＩＭＡＣ精製における使用のためのヒスチジン（Ｈｉｓ）タグおよびプルダウンアッセイにおける使用のためのグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグなどの、２つ以上の精製タグを含み得る。
【0018】
本発明の細胞の第２の実施態様によれば、融合タンパク質は、蛍光融合パートナーを目的の異種ポリペプチドから切断することにおける使用のためのプロテアーゼ切断部位を含み得る。任意の既知のプロテアーゼ切断部位をプロテアーゼによる切断のために使用し得ることが、当業者によって理解されるであろう。特に、プロテアーゼ切断部位は、配列ＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧ（配列番号２）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＷＥＬＱ（配列番号１）を有するＷＥＬＱｕｔ部位、配列ＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号４）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＬＶＰＲ（配列番号３）を有するトロンビンまたはトリプシン切断部位、配列ＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＧＣ（配列番号６）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＡＳＰＲ（配列番号５）を有するｎｉｓＰまたはトリプシン切断部位、配列ＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＡＧＧＣ（配列番号８）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７）を有するＴＥＶ切断部位、配列ＡＴＴＧＡＡＧＧＴＣＧＴ（配列番号１０）を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列ＩＥＧＲ（配列番号９）を有する第Ｘａ因子切断部位、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択し得る。
【0019】
本発明の細胞の第３の実施態様においては、融合タンパク質は、分泌ペプチドを含み得る。
【0020】
本発明の細胞の第４の実施態様によれば、蛍光融合パートナーは、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質からなる群から選択し得る。多数の蛍光融合タンパク質が知られており、当技術分野において知られている任意の蛍光融合タンパク質を使用し得ることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、蛍光融合パートナーは、配列番号１１のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされる、緑色蛍光タンパク質であり得る。あるいは、蛍光融合パートナーは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされるｍＣｈｅｒｒｙなどの、赤色蛍光タンパク質であり得る。
【0021】
本発明の細胞のさらなる実施態様においては、目的の異種ポリペプチドは、任意の、目的の異種ポリペプチド、例えば、Ｎｉｓｉｎ、エピランシン１５ＸおよびＰｅｐ５を含むランチペプチド；プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡを含むバクテリオシン；リステリオリシンＯ；ＡｃｔＡ；並びにオートファジーペプチドＸからなる群から選択される、目的の異種ポリペプチドであり得る。
【0022】
本発明の細胞のさらなる実施態様によれば、溶解タンパク質は、当技術分野において知られている任意の溶解タンパク質であり得、例えば溶解タンパク質は、エンドリシンまたは細菌性ムレインヒドロラーゼであり得る。１つの非限定的な例においては、溶解タンパク質は、ファージＤＮＡに由来し、配列番号１５若しくは１７のアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１６若しくは１８のヌクレオチド配列によってコードされる。
【0023】
本発明の細胞のなおさらなる実施態様においては、ＲＮＡサーモメータは、配列番号１９～２７または配列番号１０５～１１１のいずれか１つの核酸配列を有するＲＮＡサーモメータを含み得るが、これらに限定されない。ＲＮＡサーモメータは、ラムダファージおよび細菌において見出されるものなど、天然に存在し得、または新規配列として合成し得る。ＲＮＡサーモメータおよび溶解タンパク質の発現を制御するプロモーターは、構成的プロモーター（例えば配列番号７４～７６のいずれか１つに示す配列を有する定常期プロモーター）または誘導性プロモーター（例えばＴ７）であり得る。さらに、プロモーターおよびＲＮＡサーモメータの適切な組合せは、配列番号７７～１００のいずれか１つに示す配列を有する組合せを含み得る。
【0024】
本発明の第３の態様によれば、（ｉ）目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質を発現させるための少なくとも１つの発現ベクター；並びに（ｉｉ）大腸菌細胞を含むかまたはからなり、ここで、細胞および／または発現ベクターは、溶解タンパク質、およびＲＮＡサーモメータに作動可能に連結されたプロモーター（構成的プロモーター例えば定常期プロモーター、または誘導性プロモーター例えばＴ７を含む）をコードする核酸を含み、ここで、ＲＮＡサーモメータは、溶解タンパク質の翻訳を調節することができる、キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0025】
本発明の非限定的な実施態様を次に、例としてのみ、以下の図を参照して説明する。
【図1】異種タンパク質製造の方法の概略図。Ａ）ベクター構築；Ｂ）形質転換；Ｃ）発現；Ｄ）細胞溶解；Ｅ）精製およびＦ）視覚化。蛍光融合パートナーおよび目的のペプチド（ＰｏＩ）をコードする核酸分子を、ベクター中にクローニングする。ベクターは、大腸菌細胞中で発現させる。具体的には、蛍光融合パートナーの発現を、その蛍光をモニタリングすることによって検出し、これが、目的のタンパク質の発現のしるしを提供する。蛍光融合パートナーの検出によって示されるように、いったん目的のペプチドが蓄積すると、溶解タンパク質の温度依存性発現を、温度を上げることによって開始させる。溶解タンパク質の存在は、凍結融解サイクルの際に細胞膜崩壊および細胞溶解を引き起こし、これが、目的のペプチドおよび蛍光融合パートナーの放出をもたらす。目的のペプチドおよび蛍光融合パートナーは、任意に精製し得る。目的のペプチドの収量は、精製産物の視覚化を含めて、全ての段階で蛍光融合パートナーを検出することによってモニタリングし得る。
【図2】ＭＣＳ－１における前駆体ナイシン（ｎｉｓｉｎ）およびＭＣＳ－２におけるｎｉｓＢに融合したＧＦＰを有するｐＲＳＦ Ｄｕｅｔ－１のプラスミドマップ。関連する制限部位およびＷＥＬＱｕｔプロテアーゼ部位を示す。
【図3】関連する制限部位およびプロテアーゼ切断部位を含む、ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎの配列（配列番号２９および配列番号３１）。対応するアミノ酸配列を示す（配列番号２８および配列番号３０）。ｈＮｉｓＰ（ＡＶＰＲ）およびトロンビン（ＡＳＰＲ）についての切断部位のアミノ酸およびヌクレオチドの変化を示す。ＧＦＰおよびプレニシンのアミノ酸配列は、プレニシンリーダー配列に下線を引いて示す。
【図4】トリプシンで切断したＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎおよびＨｉｓｐＮｉｓｉｎについての最適化および活性の結果（Ａ）ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎについての温度、誘導時間、およびＩＰＴＧ濃度の最適化。（Ｂ）さまざまな温度で発現させた、ＩＭＡＣ精製および脱塩したＨｉｓｐＮｉｓｉｎ（蛍光融合なし）の可溶性／不溶性大腸菌画分の活性。抗菌活性は、ラティラクトバチルス・サケイ（Ｌｂ．ｓａｋｅｉ）に対して試験した。
【図5】トロンビン切断した（Ａ）ＧＦＰ－ｐＰｅｐ５並びに（Ｂ）ＩＭＡＣ精製および脱塩したＨｉｓ－ｐＰｅｐ５の可溶性／不溶性大腸菌画分のカルノーサスブドウ球菌（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）に対する抗菌活性。
【図6】トロンビンおよびｈＮｉｓＰを使用したＧＦＰ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅの切断最適化。それぞれ、（Ａ）４時間および（Ｂ）２０時間切断後のＧＦＰ－ｐＰｅｐ５、並びに（Ｃ）４時間および（Ｄ）２０時間切断後のＧＦＰｐＮｉｓｉｎ。ＧＦＰ－ｐＰｅｐ５活性は、Ｓ．カルノーサスに対して試験し、ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎ活性は、Ｌｂ．サケイに対して試験した。ｈＮｉｓＰは、０．０１、５、１０、５０および７０ｎｇ／μＬの濃度で添加した。トロンビンは、０．７５、４．５、３および６Ｕで添加した。
【図7】トロンビンおよびｈＮｉｓＰを用いたＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎの切断を表す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ染色ゲルおよびＧＦＰ蛍光画像。（Ａ）ｈＮｉｓＰおよび（Ｂ）トロンビンの濃度系列を用いたＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎの切断について、上の画像は、染色ゲルを表し、下の画像は、固定および染色前のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおけるＧＦＰ蛍光を表す。（Ｃ）ｈＮｉｓＰおよび（Ｄ）トロンビンの最適濃度でのＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎの切断については、左側の画像は、染色ゲルを表し、右側のそれらは、固定および染色前のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおけるＧＦＰの蛍光（上）を、ゲル上にロードした非切断および切断サンプルの活性（下）とともに表す。活性は、Ｌｂ．サケイに対して試験した。Ｌ＝はしご；ＵＣ＝非切断サンプル；Ｃ＝切断サンプル；１＝非切断ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎ；２＝切断ＧＦＰ；および３＝ｎｉｓｉｎ。
【図8】ＧＦＰ－ＭｕｎＸのＴ７制御異種発現についてのｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸのプラスミドマップ。ＷＥＬＱｕｔプロテアーゼを使用したムンドティシンＳＴ４ＳＡの遊離。
【図9】ＷＥＬＱｕｔプロテアーゼ切断配列を示す（灰色の矢印）、ＧＦＰ－ＭｕｎＸについてのアミノ酸配列（配列番号３２）。対応するヌクレオチド配列も示す（配列番号３３）。
【図10】ＧＦＰ－ＰｌａＸのＴ７制御異種発現についてのｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＰｌａＸのプラスミドマップ。ＷＥＬＱｕｔプロテアーゼを使用したプランタリシン４２３の遊離。
【図11】ＷＥＬＱｕｔプロテアーゼ切断配列を示す（灰色の矢印）、ＧＦＰ－ＰｌａＸについてのアミノ酸配列（配列番号３４）。対応するヌクレオチド配列も示す（配列番号３５）。
【図12】１８℃、２６℃、および３７℃での、ＧＦＰ－ＭｕｎＥｘを発現する大腸菌ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＥｘの蛍光強度。（Ａ）０、２４、および４８時間後のインビボ蛍光測定値。（Ｂ）４８時間発現のタンパク質抽出およびＮｉ－ＮＴＡ精製後に計算した、ＧＦＰ－ＭｕｎＥｘの総相対量。蛍光強度は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した。棒上の異なる文字は、ボンフェローニ事後検定による、互いに有意に異なる平均値を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図13-1】２６℃での経時的なＧＦＰ－ＭｕｎＸ発現についてのＩＰＴＧ濃度の最適化、蛍光強度を、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した。（Ａ）２５分ごとに取得したインビボＲＦＵ測定値は、ｎ＝３（技術的トリプリケートで測定した生物学的トリプリケート）であった。そして、各点は、誤差バーによって示すＳＥＭを有する平均を表す。
【図13-2】２６℃での経時的なＧＦＰ－ＭｕｎＸ発現についてのＩＰＴＧ濃度の最適化、蛍光強度を、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した。（Ｂ）示された範囲のＩＰＴＧ濃度にわたる１９時間インキュベーション後のＧＦＰ－ＭｕｎＸ発現についての平均ＲＦＵ出力の比較。矢印は、０．１および０．２ｍＭが全ての他の試験よりも有意に高いＲＦＵ出力を産生することを確認する、Ｔｕｋｅｙの多重比較試験の結果を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図14】さまざまなＷＥＬＱｕｔ：サンプル比でのプランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡの抗菌活性。それぞれ、Ｎｉ－ＮＴＡ精製ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸタンパク質から切断した、プランタリシン４２３（Ａ）およびムンドティシンＳＴ４ＳＡ（Ｂ）の抗菌活性。切断は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するスポットプレート技術を使用して評価した。ＷＥＬＱｕｔ：サンプルの切断比（ｍＬ：ｍＬ）は、パネルの上部上に示す。切断は、２８℃で１６時間実施した。切断後、１００ｍＬのＧＦＰ－ＰｌａＸ（Ａ）および１０ｍＬのＧＦＰ－ＭｕｎＸ（Ｂ）を、各切断反応からスポットした。非切断ＧＦＰ－ＰｌａＸ（Ａ）およびＧＦＰ－ＭｕｎＸ（Ｂ）は、抗リステリア活性を示さなかった。
【図15】ＷＥＬＱｕｔ切断ＧＦＰ－ＰｌａＸ（ａ、ｂ）およびＧＦＰ－ＭｕｎＸ（ｃ、ｄ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（ａ、ｃ）は、蛍光撮影した非染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを表す。（ｂ、ｄ）は、（ａ、ｃ）の染色ゲルを表す。レーン：１－ラダー、２－非切断サンプル、３から６ ＷＥＬＱｕｔ切断サンプル、サンプル比を示す。バンドＩ－非切断ＧＦＰ－ＰｌａｎｔＥｘ、ＩＩ－推定上のＷＥＬＱｕｔおよびＧＦＰ複合体、ＩＩＩ－ＷＥＬＱｕｔ、ＩＶ－非切断ＧＦＰ－ＭｕｎＸ、Ｖ－推定上のＷＥＬＱｕｔおよびＧＦＰ複合体、ＶＩ－ＷＥＬＱｕｔ。
【図16】ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した、遊離したムンドティシンＳＴ４ＳＡおよびプランタリシン４２３の切断後の抗リステリア活性を観察した。（ａ）抗リステリア活性を示すバンドのサイズを示す、二重ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離の重ね合わせ。（ｂ）Ｉ－ＧＦＰ－ＰｌａＸ、ＩＩ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸ、ＩＩＩ－ムンドティシンＳＴ４ＳＡおよびＩＶ－プランタリシン４２３に相関する位置でのＷＥＬＱｕｔ切断後の活性を示す、抗リステリアＳＤＳ－ＰＡＧＥオーバーレイ。（ｃ）（ａ）における蛍光バンドの位置。
【図17】ＧＦＰ－ＭｕｎＸから遊離したムンドティシンＳＴ４ＳＡのＨＰＬＣ精製および正確な質量決定。（Ａ）抗リステリア活性が分画１３および１４において確認されたＷＥＬＱｕｔ切断ＧＦＰ－ＭｕｎＸ混合物のＨＰＬＣ分画。（Ｂ）＋５電荷（［Ｍ＋５Ｈ］Ｃ５ 予想ｍ／ｚ ８５８．０２３２）を有するムンドティシンＳＴ４ＳＡの観察されたｍ／ｚ同位体エンベロープを示す生の質量スペクトルのセグメント。（Ｂ）におけるモノアイソトピックピークは、矢印で示しており、４２５８．１３５５Ｄａの正確な質量測定値に対応し、これは、１つのジスルフィド結合を有するムンドティシンＳＴ４ＳＡの正確な質量（４２８５．０７９６Ｄａ）と一致する。
【図18】上のパネル－赤血球溶解アッセイにおいて使用した精製ＧＦＰ－ＬＬＯおよびＬＬＯのＳＤＳ－ＰＡＧＥ。左：染色ゲル。右：ＧＦＰ－ＬＬＯおよびＧＦＰの蛍光画像、Ｌ：ラダー（ＮＥＢラダー＃Ｐ７７１２）、１：未切断（ｕｎｃｕｔ）ＧＦＰ－ＬＬＯ、２：切断し、ＩＭＡＳ精製および脱塩したＬＬＯ。Ａ：ＧＦＰ－ＬＬＯ、Ｂ：ＬＬＯ。下のパネル－さまざまなｐＨでのＧＦＰ－ＬＬＯ曝露後の赤血球の溶血。相対ヘモグロビン吸光度を、５４０ｎｍで収集し、陽性対照のパーセンテージとして表した値、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）、ｔ検定を介した分析は、未処理に対して＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＝ｐ＜０．０００１の結果となった。
【図19】ＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴ精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。左：染色ゲル、右：ＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴおよびＧＦＰの蛍光画像。Ｌ：ラダー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ ＃２６６３２）、１：ＩＭＡＣフロースルー、２：ＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴを含有するＩＭＡＣ溶出、３：ＧＳＴ精製前のＩＭＡＣ溶出の希釈、４：ＧＳＴカラムについてのフロースルー、５：ＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴを含有するＧＳＴカラムからの溶出、６：ＧＳＴカラムから溶出したＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴのＷＥＬＱｕｔプロテアーゼ切断、７：ＷＥＬＱｕｔ消化後のＡｃｔＡ－ＧＳＴを含有するＩＭＡＣカラムからのフロースルー、８：ＩＭＡＣフロースルーから得られた脱塩し濃縮したＡｃｔＡ－ＧＳＴ。Ａ：ＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴ、Ｂ：ＡｃｔＡ－ＧＳＴ、Ｃ：ＧＦＰ。分解産物を、ボックス（囲み枠）で示す。
【図20】１８℃の発現温度（初期）からの取出し直後に取得した、細胞培養物の光学密度。引き続く読取値を、２６℃または３７℃のいずれかでの３時間、６時間および９時間インキュベーション後に取得した。光学密度読取値を、マイクロプレートリーダーを使用して５９５ｎｍで取得した。ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰ＝ＧＦＰを発現するｐＲＳＦＧＦＰを保有する細胞。ＧＦＰＲＴＧＰＲ＝ＲＮＡサーモメータによって調節されるＧＦＰおよびＧｐＲを発現するｐＴＡＰＧＦＰ－ＧＰＲを保有する細胞。ＧＦＰＧＰＲ＝ＧＦＰおよびＧｐＲを発現するｐＲＳＦＧＦＰ－ＧｐＲを保有する細胞。
【図21】凍結融解サイクルおよび溶解緩衝液中での再懸濁後の細胞の溶解。発現後２６℃または３７℃で９時間インキュベートした細胞を、凍結し、融解させて、ＳＢまたは１％ＳＤＳを補ったＳＢ中に再懸濁し、３７℃でインキュベートした。光学密度読取値を、マイクロプレートリーダーを使用して５９５ｎｍで取得した。ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰ＝ｐＲＳＦＧＦＰを保有する細胞。ＧＦＰＲＴＧＰＲ＝ｐＴＡＰＧＦＰ－ＧＰＲを保有する細胞およびＧＦＰＧＰＲ＝ｐＲＳＦＧＦＰ－ＧｐＲを保有する細胞。
【図22】小規模のＨｉｓタグ精製のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。Ａ）染色ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル（矢印は、ＧＦＰに対応するバンドを示す）。Ｂ）（Ａ）からのＳＤＳ ＰＡＧＥにおけるＧＦＰの蛍光。１＝ラダー；２＝ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰ ２６℃；３＝ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰ ３７℃；４＝ＧＦＰＲＴＧＰＲ ２６℃；５＝ＧＦＰＲＴＧＰＲ ３７℃；６＝ＧＦＰＧＰＲ ２６℃および７＝ＧＦＰＧＰＲ ３７℃。Ｃ）異なるサンプル間のＧＦＰバンド強度倍数変化の比較。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して決定した。ＦｌｕｏｒＳｅｅプロトタイプを使用し、蛍光用のＡｍｂｅｒフィルターを有する白色光または青色光と使用して取得した画像。
【図23】ＧＦＰＴＡＴＢおよびＴＡＴＢｍＣｈｅｒｒｙを表す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ染色ゲルおよびＧＦＰ蛍光画像。左は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色ゲル；右の画像は、青色光の下で取得した。
【図24】２６℃（実線）および３７℃（破線）で増殖させたさまざまな大腸菌コンストラクトの光学密度読取値。影付きの灰色のブロックは、２６℃から３７℃でさらなる５時間の増殖の間増殖させたサンプルの動きを示す。
【図25】２６℃（実線）および３７℃（破線）で増殖させたさまざまな大腸菌コンストラクトの光学密度読取値の対数グラフ。影付きの灰色のブロックは、２６℃から３７℃でさらなる５時間の増殖の間増殖させたサンプルの動きを示す。
【図26】１回の凍結融解サイクル後の、さまざまな温度で増殖させたさまざまな大腸菌コンストラクト（溶解後）の光学密度読取値。２６℃（実線）および３７℃（破線）。影付きの灰色のブロックは、２６℃から３７℃でさらなる５時間の増殖の間増殖させたサンプルの動きを示す。
【図27】１回の凍結融解サイクル後の、さまざまな温度で増殖させたさまざまな大腸菌コンストラクト（溶解後）の対数光学密度読取値。２６℃（実線）および３７℃（破線）。影付きの灰色のブロックは、２６℃から３７℃でさらなる５時間の増殖の間増殖させたサンプルの動きを示す。
【図28】１回の凍結融解サイクル後の、さまざまな温度で増殖させたサンプルＧ５の溶解率。破線の四角は、２６℃から３７℃でさらなる５時間の増殖の間増殖させたサンプルの移動を示す。
【図29】１回の凍結融解サイクル後の、さまざまな温度で増殖させたサンプルＧ８の溶解率。破線の四角は、２６℃から３７℃でさらなる５時間の増殖の間増殖させたサンプルの動きを示す。
【図30】１回の凍結融解サイクル後の、さまざまな温度で増殖させたサンプルＧ１５の溶解率。破線の四角は、２６℃から３７℃でさらなる５時間の増殖の間増殖させたサンプルの動きを示す。
【図31】１回の凍結融解サイクル後の、さまざまな温度で増殖させたサンプルＧ１７の溶解率。破線の四角は、２６℃から３７℃でさらなる５時間の増殖の間増殖させたサンプルの動きを示す。
【図32】１回の凍結融解サイクル後の、さまざまな温度で増殖させたサンプルＧ１８の溶解率。破線の四角は、２６℃から３７℃でさらなる５時間の増殖の間増殖させたサンプルの動きを示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
発明の詳細な説明
本発明を次に、本発明の全てではないがいくつかの実施態様を示す、添付の図面を参照して、以下により十分に説明する。
本発明を次に、本発明の全てではないがいくつかの実施態様を示す、添付の図面を参照して、以下により十分に説明する。
【0027】
説明する本発明は、開示する特定の実施態様に限定されるべきではなく、修正および他の実施態様が本発明の範囲内に含まれることを意図する。特定の用語を本明細書において使うが、それらは、一般的かつ説明的な意味においてのみ使用し、限定の目的のために使用するのではない。
【0028】
この明細書の全体にわたっておよび後続する特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないように示さない限り、複数形を含む。
【0029】
本明細書において使用する用語および表現は、説明の目的のためであり、限定するものとしてみなされるべきではない。本明細書において使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」、「有する」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びにそれらの変形の使用は、その後に列挙する項目およびそれらの等価物並びに追加の項目を包含することを意味する。
【0030】
本発明は、宿主細胞中で目的の異種ポリペプチドおよび蛍光融合パートナーを含む融合タンパク質を発現させることを含む、宿主細胞中で目的の異種ポリペプチドを製造する方法に関する。宿主細胞は、溶解タンパク質をコードする核酸を含むように改変されている。溶解タンパク質によって課せられる代謝負荷を低下させるために、このタンパク質は、ＲＮＡサーモメータの制御下にある。本発明はまた、融合タンパク質を発現し、ＲＮＡサーモメータの制御下の溶解タンパク質をコードする核酸を含む、大腸菌細胞に関する。
【0031】
本発明者らは、融合パートナーとしてのＧＦＰの使用が発現の最適化においていくつかの利点を提供することを示した。これは、（ｉ）より効果的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）をもたらす、前駆体ペプチドのサイトゾル中の修飾酵素との増加した接触時間；（ｉｉ）最適化時間を実質的に低下させ得る、インビボでの蛍光読取値を使用して発現を評価する可能性；および（ｉｉｉ）ＧＦＰ融合体の蛍光特性をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析と組み合わせることによって、タンパク質分解的切断をより正確にモニタリングすることを含む。発現宿主としての大腸菌の使用は、増加した組換えタンパク質収量、安価な培地上での迅速な増殖、並びに広範囲に特徴付けられた発現株およびクローニングツールの入手可能性などの、さらなる利点を提供する。さらに、ペプチドを融合パートナーとともに発現させることは、代謝フラックスの一部分をペプチド合成から外れるように向け直すが、有毒ペプチドの製造の場合においては、融合は、大腸菌に対する毒性を抑えることによって、全体の収量を増加させる。さらに、ＲＮＡサーモメータの使用はまた、追加の組換えタンパク質を溶解タンパク質の温度依存性発現を制御するために必要としないという点で、細胞を溶解するために必要とされる追加の溶解遺伝子を含むことの代謝負荷も低下させる。本発明の方法のさらなる利点は、維持された蛍光が、発現、抽出、精製、および分析プロセス全体にわたって標的タンパク質の明瞭な視覚化を提供することで、迅速な最適化およびトラブルシューティングを可能にすることである。蛍光強度は、それがＧＦＰ融合タンパク質の量に相関するため、最適化を導くための代理として機能する。
【0032】
本発明の方法を、以下に簡単に提供する。
【0033】
融合タンパク質ベクター設計：蛍光融合タンパク質をコードする融合コンストラクトは、標準的なクローニング技術を使用して、蛍光融合パートナー、例えばｍＣｈｅｒｒｙまたは緑色（Ｇｒｅｅｎ）蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を目的のタンパク質またはペプチド（ＰｏＩ）に融合することによって得られる。目的のペプチドは、蛍光融合パートナーのＮまたはＣ末端に融合し得る。特定のプロテアーゼ切断部位を、蛍光融合パートナーと目的のペプチドとの間に含み得る。任意のプロテアーゼを、使用し得る（例えばＷＥＬＱｕｔ、トロンビン、ＴＥＶ、ＮｉｓＰ）。蛍光融合タンパク質はさらに、精製を促進するために、融合タンパク質のＮおよび／またはＣ末端に位置するタグを含み得る。タグはまた、蛍光融合タンパク質内に存在し得る。使用し得るタグは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用する精製を促進するヒスチジンタグまたはプルダウンアッセイにおける使用のためのグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むが、これらに限定されない。プロテアーゼ部位をまた、タグを除去するために含み得る。さらに、蛍光融合タンパク質は、細胞外培地からの精製のための、融合タンパク質の分泌を促進するための、特定の分泌配列を含み得る。融合コンストラクトは、ベクター中にクローニングする。ベクターは、イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用する誘導性発現において使用するＴ７プロモーター（例えばｐＲＳＦ／ｐＡＣＹＣ／ｐＸＨベクター）を含み得るか；または特定の培地を使用して自己誘導性であり得る。ベクターはさらに、修飾酵素などの追加のタンパク質を含み得るか、または標的ペプチドの翻訳後修飾のための追加のタンパク質を保有する適合するベクターと、同時に形質転換し得る。
【0034】
クローニングおよび発現：融合タンパク質ベクターは、異種発現宿主、すなわち大腸菌ＢＬ２１中に形質転換させる。大腸菌ＢＬ２１からの発現は、特定の細菌光学密度でのＩＰＴＧを用いる誘導を通して達成される。ＩＰＴＧに加えて、特定の自己誘導培地を使用することができ、これが、組換えタンパク質を製造するコストを低下させ、収量を増加させ得る。インキュベーション期間全体にわたって、融合タンパク質の発現は、分光光度計または融合タンパク質パートナーの蛍光を測定することができる特注の検出システムを使用して、インビボでモニタリングすることができる。
【0035】
細胞溶解：大腸菌ＢＬ２１異種宿主は、そのゲノム中に溶解タンパク質を含むように改変するか、発現ベクター上に含める。エンドリシンまたは細菌性ムレインヒドロラーゼなどの溶解タンパク質は、細胞内で発現した融合タンパク質を取得するための溶解プロセスを簡単にし、安価にするために含める。ＲＮＡサーモメータは、大腸菌における溶解タンパク質の、転写後の温度依存性発現を導くために使用する。ＲＮＡサーモメータによって形成される二次構造は、リボソーム結合部位をブロックすることによりリボソーム結合を妨害し、これが順番に、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を妨げる。自己消化タンパク質の発現は、ＲＮＡ転写物の温度誘導巻き戻しおよび引き続く翻訳に依存するため、どちらも、高価な誘導物質を必要としない。使用するＲＮＡサーモメータに依存して、それは、厳密にオンまたはオフのいずれかであり得るか、またはそれによってそれらが低温でのタンパク質の翻訳を低下させる調光器として作用し得る。ＲＮＡサーモメータは、さまざまな温度の範囲に応答するように設計することができ、必要に応じて応答するようにカスタマイズ可能である。さらに、構成的プロモーター（例えば定常期プロモーター）または誘導性プロモーター（例えばＴ７）の使用は、ＲＮＡサーモメータをコードする核酸および溶解遺伝子の転写を制御するために使用し得る。定常期プロモーターの使用は、ＲＮＡサーモメータおよび溶解遺伝子からなるｍＲＮＡの遅延した転写をもたらし得る。これは、ｍＲＮＡの安定性を増大させ、溶解遺伝子の遅延した発現を通して細胞上の代謝負荷を低下させるであろう。蛍光融合パートナーを検出することによってモニタリングしながら、いったん標的タンパク質の発現が起こると、細胞を、溶解タンパク質の翻訳を誘導するために変更した温度でインキュベートする。あるいは、細胞を、遠心分離によって回収し、溶解促進緩衝液中に再懸濁し、高温でインキュベートして、溶解タンパク質の翻訳を誘導し得る。この溶解発現期間の後、細胞を、遠心分離によって回収し、細胞壁をさらに分解するために凍結し得る（＜－２０℃）。細胞を次いで融解し、１％ＳＤＳまたは０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００などの界面活性剤または細胞透過性化学薬品を含有する緩衝液を、必要に応じて添加する。さらに、他の機械的ストレスまたは界面活性剤もまた使用して、細胞溶解を促進し得る。ＲＮＡサーモメータに導かれる自己溶解は、細胞を凍結することによって誘導される細胞損傷の際に、溶解タンパク質の、細胞のペプチドグリカン層との接触を通した、細胞の溶解をもたらす。細胞破片は、遠心分離を使用して融合タンパク質から分離し得、融合タンパク質は、その後精製し得る。
【0036】
精製：精製は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して達成し得る。使用する精製方法は、使用するタグに依存する。Ｈｉｓタグ融合タンパク質については、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを、使用し得る。最も一般的には、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を結合するニッケル樹脂を、使用する。この精製においては、タンパク質は、ニッケル樹脂に結合させ、ｐＨを下げることまたはイミダゾールの濃度を増大させることのいずれかによって溶出させる。代替の実施態様においては、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを、融合タンパク質において使用し得、この場合においては、ＧＳＴについて高い親和性を有するグルタチオン樹脂を使用し得る。ＧＳＴ融合タンパク質は、還元型グルタチオンの濃度を増大させることを使用して、樹脂から取り出す。あるいは、２つの異なるタグを、融合タンパク質において使用し得、それは、二重精製プロセスにおいて、まず１つの方法を使用し、その後別の方法を使用して精製することができる。重要なことに、融合タンパク質は、蛍光融合パートナーの蛍光特性を利用することにより、精製プロセス全体にわたってモニタリングし得る。ほとんどの場合において、融合タンパク質は、直接視覚化することができる（例えばＧＦＰの場合においては緑色蛍光を観察することによって）。融合タンパク質は、上で概説したプロセスの１つ、または融合タンパク質を視覚化する能力によって支援される、当業者に知られている任意の精製を使用して、手動で精製し得る。あるいは、融合タンパク質は、自動システムを使用して精製し得る。そのような自動システムの例は、２５４ｎｍの波長でタンパク質を検出すること、並びに蛍光融合パートナータンパク質を検出することの両方が可能なシステムを含むが、これに限定されない。該システムはさらに、流速を制御するための可変速度が可能な蠕動ポンプ、並びにタンパク質（２５４ｎｍの波長で）およびその励起時の蛍光融合パートナーを測定することができる検出システムを含み得る。使用する蛍光融合パートナーに依存して、蛍光融合パートナーの励起は、特定の励起波長および発光フィルターを使用して達成し得る。
【0037】
精製したタンパク質は次いで、塩を除去するために透析し、適切な緩衝液中に置き得る。陽イオン交換、陰イオン交換または疎水性相互作用などの精製方法を使用して、組換えタンパク質をさらに精製し得る。
【0038】
分析および視覚化：蛍光融合パートナーの特性のため、それは、本明細書においてより詳細に説明するＳＤＳ ＰＡＧＥ法を使用して容易に検出することができる。この方法の一つの実施態様においては、融合タンパク質の蛍光融合パートナー部分を、適切なＬＥＤ波長およびフィルターを有するＬＥＤトランスイルミネーターを使用して、直接視覚化し得る。
【0039】
本明細書において使用する用語「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、互換的に使用され、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、天然または非天然のアミノ酸またはアミノ酸類似体を含む、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指す。アミノ酸はすなわち、ペプチド結合によって一緒に連結した、任意の長さのポリマー形態である。
【0040】
本明細書において使用する用語「目的の異種ペプチド」または「目的のペプチド」または「目的のタンパク質」は、宿主細胞タイプにおいて天然に存在しない任意のポリペプチドを指す。目的の異種ポリペプチドは、本発明の方法を使用した、細菌細胞、例えば大腸菌細胞中での発現について意図している。本発明の方法は、ウイルスタンパク質、細菌毒素、および哺乳類タンパク質の製造を企図する。目的の異種ポリペプチドの非限定的な例は：本発明の方法に従って製造することができる薬理学的ポリペプチド（例えば、医療用途用、細胞および組織培養用）または工業用ポリペプチド（例えば酵素、増殖因子）を含み得る。目的の異種ポリペプチドは、ワクチンとしてまたはワクチンにおいて、並びに他の試薬または診断において、有用であり得る。特に、目的の異種ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのウイルスコートおよびスパイクタンパク質、ＨＩＶタンパク質を含む、ウイルス由来のポリペプチドであり得る。あるいは、目的の異種ポリペプチドは、リステリオリシンＯを含む、細菌毒素タンパク質；インスリンまたはオートファジー誘導タンパク質などの、哺乳類タンパク質 ＩｇＧなどの、抗体；インターロイキン１０などの、サイトカイン；タバコエッチウイルス由来のＴＥＶプロテアーゼ、ラクトコッカス・ラクティス由来のＮｉｓＰプロテアーゼ、黄色ブドウ球菌由来のセリンプロテアーゼを含む、プロテアーゼ；抗結核および抗リステリアペプチドなどの、抗菌ペプチド；ラッカーゼなどの工業用酵素；リガーゼ、ポリメラーゼ、制限酵素を含む、分子酵素；タンパク質精製において使用される、エンドリシンなどの、溶解酵素であり得る。
【0041】
本明細書において使用する用語「蛍光融合パートナー」は、目的の異種ポリペプチドのＮ末端、目的の異種ポリペプチドのＣ末端、または目的の異種ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端のそれぞれに融合した、蛍光ペプチドを指す。いくつかの実施態様においては、本発明の「蛍光融合パートナー」は、限定なしに、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含み得る。
【0042】
本明細書において使用する用語「融合タンパク質」は、少なくとも蛍光融合パートナーおよび目的の異種ポリペプチドを含むポリペプチドを指す。本発明の融合タンパク質はさらに、精製タグ、プロテアーゼ切断部位、または分泌配列を含む、追加のアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施態様は、限定なしに、前述の融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【0043】
本発明の融合タンパク質は、目的の異種ポリペプチドからの蛍光融合パートナーのまたは精製タグの分離を可能にするプロテアーゼ切断部位を含み得る。プロテアーゼ切断部位は、部位特異的プロテアーゼについての認識配列であり得る。多くの市販のプロテアーゼを含む、多くの部位特異的ペプチダーゼが、当技術分野において知られている。これらは、ＷＥＬＱｕｔ、トロンビン、トリプシン、ｎｉｓＰ、第Ｘａ因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、エンテロキナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ（Ｇｌｕ－Ｃ）およびＴＥＶを含むが、これらに限定されない。
【0044】
本発明の一つの実施態様においては、融合タンパク質は、「精製タグ」を含み得る。精製タグは、本明細書においては、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製を可能にするヒスチジン残基の直鎖配列を指す、「ポリＨｉｓタグ」または「Ｈｉｓタグ」であり得る。あるいは、ポリＨｉｓタグを使用して、抗ポリＨｉｓタグ抗体を使用して組換えポリペプチドを検出し得る。ポリＨｉｓタグは、６、７、８、９または１０個の連続したヒスチジン残基を含み得る。精製タグは、「ＧＳＴタグ」であり得る。さらに、融合タンパク質は、融合タンパク質の二重精製のために、例えば、ＨｉｓタグおよびＧＳＴタグであるが、これらに限定されない、２つ以上のタグを含み得る。
【0045】
本明細書において使用する用語「形質転換された宿主細胞」は、異種ポリペプチド、例えば溶解タンパク質を発現するために安定に形質転換された、または宿主細胞中で異種ポリペプチドを一過性に発現する少なくとも１つの発現ベクターが浸潤した、のいずれかの宿主細胞を指す。
【0046】
本明細書において使用する用語「溶解タンパク質」は、細胞膜の崩壊を引き起こし、細胞を溶解させるタンパク質を指す。多くの溶解タンパク質が、当技術分野において知られている。これらは、例えば、バクテリオファージまたはプロファージによって発現される、エンドリシンおよび細菌性ムレインヒドロラーゼを含む。例は、リゾチーム、配列番号１６のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号１５のアミノ酸配列を有するＧｐＲ、および配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号１７のアミノ酸配列を有するＧｐＥを含むが、これらに限定されない。溶解（ｌｙｓｉｎ）タンパク質は、ホーリングエンドリシン（ｈｏｌｉｎｇ－ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ）システムに基づいており、このシステムは、孔形成タンパク質および細胞壁分解酵素で構成されている。細胞壁分解タンパク質は、発現し、細胞質中でその活性形態であり、孔形成ホーリングによって孔が形成され、エンドリシンが、細胞壁を分解し始めることができるペリプラズム空間に入ることができるようになって初めて、細胞壁を分解し始め得る。このシステムは、それが細胞壁に遭遇し得るまで細胞質中で不活性のままであるであろうエンドリシンの発現を可能にするため、本発明における応用にとって理想的である。
【0047】
溶解タンパク質の発現は、温度に依存し得、例えば、溶解タンパク質の発現は、ＲＮＡサーモメータによって調製し得る。本明細書において使用する用語「ＲＮＡサーモメータ（ＲＮＡ ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）」は、温度における変化に応答して溶解タンパク質の発現を調節する温度感受性の非コードＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡサーモメータに依存して、それは、選択した温度で厳密にオンまたはオフであり得るか、またはそれによってそれがより低い温度でタンパク質の翻訳を低下させる調光器として作用し得る。ＲＮＡサーモメータは、さまざまな温度の範囲に応答するように設計することができ、必要に応じて応答するようにカスタマイズ可能である。構成的プロモーター（例えば定常期プロモーター）または誘導性プロモーター（例えばＴ７）の使用は、ＲＮＡサーモメータをコードする核酸および溶解遺伝子の転写を制御するために使用し得る。定常期プロモーターの使用は、ＲＮＡサーモメータおよび溶解遺伝子からなるｍＲＮＡの遅延した転写をもたらし得る。これは、ｍＲＮＡの安定性を増大させ、溶解遺伝子の遅延した発現を通して細胞上の代謝負荷を低下させるであろう。定常期プロモーターは、後期指数増殖期および定常期を含む細菌増殖の後期段階中により活性であるプロモーターである。
【0048】
用語「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書においては互換的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の両方を包含する。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。核酸が一本鎖である場合、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。核酸分子は、天然に存在する若しくは非天然に存在するヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体若しくは誘導体を含む、２つ以上共有結合したヌクレオチドの任意の鎖であり得る。用語「ＤＮＡ」は、２つ以上共有結合した、天然に存在するまたは修飾されたデオキシリボヌクレオチドの配列を指す。
【0049】
用語「単離された」は、本明細書において使用され、自然環境から取り出されたことを意味する。
【0050】
用語「精製された」は、汚染または汚染物質が実質的にない形態での分子または化合物の単離に関する。汚染物質は通常、自然環境中の分子または化合物に関連しており、精製されたはすなわち、元の組成物の他の成分から分離された結果としての純度における増加を有することを意味する。用語「精製核酸」は、それが通常その天然の状態において関連している、ポリペプチド、脂質および炭水化物を含むがこれらに限定されない他の化合物から分離された核酸配列を説明する。
【0051】
用語「相補的」は、ワトソン・クリック塩基対を形成して、２つの核酸分子間に二本鎖の領域を産生することができる、２つの核酸分子を指す。核酸分子中の各ヌクレオチドが、二本鎖を形成するために反対の相補鎖中のヌクレオチドと、一致したワトソン・クリック塩基対を形成する必要がないことが、当業者によって理解されるであろう。１つの核酸分子はすなわち、それが高ストリンジェンシーの条件下で第２の核酸分子とハイブリダイズする場合、該第２の核酸分子に対して「相補的」である。本発明による核酸分子は、両方の相補的な分子を含む。
【0052】
本明細書において使用する「実質的に同一」の配列は、１つ以上の保存的置換によって、または１つ以上の発現した融合タンパク質の若しくは核酸分子によってコードされるポリペプチドの抗原性を破壊しない若しくは実質的に低下させない配列の位置に位置する１つ以上の非保存的置換、欠失、若しくは挿入によってのみ参照配列と異なるアミノ酸またはヌクレオチド配列である。配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知識の範囲内にあるさまざまな方法で達成することができる。これらは、例えば、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷまたはＢＬＡＳＴソフトウェアなどのコンピューターソフトウェアを使用することを含む。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを容易に決定することができる。本発明の一つの実施態様においては、本明細書において記載する配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が、提供される。
【0053】
あるいは、またはさらに、２つの核酸配列は、それらが高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合、「実質的に同一」であり得る。ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、一般に、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する、経験的計算である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方で、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がそれらの融解温度より低い環境中に存在するとき、変性したＤＮＡの再アニーリングする能力に依存する。そのような「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件の典型的な例は、穏やかに振とうしながら６５℃で１８時間行うハイブリダイゼーション、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ（０．５％ＳＤＳ；２ＸＳＳＣ）中６５℃で１２分間の第１の洗浄、およびＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（０．１％ＳＤＳ；０．５％ＳＳＣ）中６５℃で１０分間の第２の洗浄であろう。
【0054】
ポリペプチド、ペプチドおよびペプチド類似体は、組換えＤＮＡ技術を使用して、それらの対応する核酸分子から調製することができる。
【0055】
本明細書において使用する用語「遺伝子」は、機能的産物、例えばＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を指す。遺伝子は、機能的産物をコードする配列の上流または下流に調節配列を含み得る。
【0056】
本明細書において使用する用語「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。他方、「調節配列」は、コード配列の上流、下流または内のいずれかに位置するヌクレオチド配列を指す。一般に、調節配列は、転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、エフェクター結合部位、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、ＲＮＡプロセシング部位、ステムループ構造、翻訳リーダー配列等を含むが、これらに限定されない。
【0057】
いくつかの実施態様においては、本発明の方法において使用する核酸分子は、他の配列に作動可能に連結し得る。「作動可能に連結」によって、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子および調節配列が、適切な分子が調節配列に結合したときにタンパク質の発現を可能にするように接続されていることを意味する。そのような作動可能に連結した配列は、発現のために宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトすることができる、ベクターまたは発現コンストラクト中に含有し得る。任意のベクター（単数）またはベクター（複数）を、本発明の融合タンパク質を発現させる目的のために使用することができることが、理解されるであろう。
【0058】
用語「プロモーター」は、核酸コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、全体に天然遺伝子に基づき得るか、またはそれは、天然に見出だされる異なるプロモーターからの異なる要素で構成し得る。異なるプロモーターは、異なる細胞型において、または発生の異なる段階で、または異なる環境若しくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示することができる。「構成的プロモーター」は、ほとんどの宿主細胞型において、ほとんどの場合にまたは特定の増殖期に目的の遺伝子の発現を指示するプロモーターである。
【0059】
用語「組換え」は、何かが組み換えられたことを意味する。核酸コンストラクトに関連して使用するとき、該用語は、分子生物学的技術によって一緒に結合されるかまたは産生される核酸配列を含む分子を指す。用語「組換え」は、タンパク質またはポリペプチドに関連して使用するとき、分子生物学的技術によって作り出された組換え核酸コンストラクトから発現されるタンパク質またはポリペプチド分子を指す。組換え核酸コンストラクトは、それが天然ではライゲーションされない、またはそれが天然では異なる位置でライゲーションされる、核酸配列にライゲーションしている、またはライゲーションされるように操作されているヌクレオチド配列を含み得る。従って、組換え核酸コンストラクトは、核酸分子が、遺伝子工学を使用して、すなわち人間の介入によって操作されたことを示す。組換え核酸コンストラクトは、形質転換によって宿主細胞中に導入し得る。そのような組換え核酸コンストラクトは、同じ宿主細胞種由来または異なる宿主細胞種由来の配列を含み得る。
【0060】
用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列を細胞中に導入することができる手段を指す。プラスミド、ウイルス、バクテリオファージおよびコスミドを含む、当技術分野において知られているさまざまなタイプのベクターがある。一般に、ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列は、カセットによってベクター中に導入する。用語「カセット」は、ベクターから発現されるポリヌクレオチドまたは遺伝子配列、例えば、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子配列を指す。カセットは一般に、ベクター中に挿入された、いくつかの実施態様においては、蛍光融合タンパク質を発現させるための制御配列を提供する、遺伝子配列を含む。他の実施態様においては、ベクターは、アシルトランスフェラーゼポリペプチドの発現のための調節配列を提供する。さらなる実施態様においては、ベクターは、いくつかの調節配列を提供し、ヌクレオチドまたは遺伝子配列は、他の調節配列を提供する。「調節配列」は、プロモーター、転写終結配列、エンハンサー、スプライスアクセプター、ドナー配列、イントロン、リボソーム結合配列、ポリ（Ａ）付加配列、および／または複製の起点を含むが、これらに限定されない。
【0061】
いくつかの実施態様においては、本発明による融合タンパク質または組成物は、使用のための説明書と一緒に、キットで提供し得る。
【0062】
以下の実施例は、例示として提供され、限定として提供されるものではない（全ての緩衝液組成を、表７に列挙する）。
【実施例】
【0063】
実施例１
大腸菌におけるＧＦＰ融合クラスＩランチペプチド（Ｌａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅ）の異種発現
ｐＲＳＦＧＦＰ－ＮｉｓＢバックボーンおよびｐＡＣＹＣ－ＮｉｓＣの構築
この実施例において使用した全てのＰＣＲプライマーを、以下の表１に提供する。表２は、この実施例において使用したまたは生成したそれぞれのプラスミドの説明を提供する。プラスミドｐＲＳＦＧＦＰを構築するために、ｍｇｆｐ５遺伝子を、ＧＦＰ、Ｅｒｙ（プライマー＝配列番号４１および４２）を含有するプラスミドであるｐＴＲＫＨ３－ｅｒｍＧＦＰ（Ｍｉｃｈｅｌａ Ｌｉｚｉｅｒより、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃２７１６９）からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物およびｐＲＳＦ Ｄｕｅｔ－１を、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩで消化し、Ｔ４リガーゼを使用してライゲーションした。これが、Ｃ末端ＷＥＬＱ部位を有するＨｉｓタグ融合ＧＦＰをもたらした。ｎｉｓＢおよびｎｉｓＣ遺伝子は、Ｌ．ラクティスｇＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって増幅した（プライマー＝配列番号４５～４８）。
大腸菌におけるＧＦＰ融合クラスＩランチペプチド（Ｌａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅ）の異種発現
ｐＲＳＦＧＦＰ－ＮｉｓＢバックボーンおよびｐＡＣＹＣ－ＮｉｓＣの構築
この実施例において使用した全てのＰＣＲプライマーを、以下の表１に提供する。表２は、この実施例において使用したまたは生成したそれぞれのプラスミドの説明を提供する。プラスミドｐＲＳＦＧＦＰを構築するために、ｍｇｆｐ５遺伝子を、ＧＦＰ、Ｅｒｙ（プライマー＝配列番号４１および４２）を含有するプラスミドであるｐＴＲＫＨ３－ｅｒｍＧＦＰ（Ｍｉｃｈｅｌａ Ｌｉｚｉｅｒより、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃２７１６９）からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物およびｐＲＳＦ Ｄｕｅｔ－１を、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩで消化し、Ｔ４リガーゼを使用してライゲーションした。これが、Ｃ末端ＷＥＬＱ部位を有するＨｉｓタグ融合ＧＦＰをもたらした。ｎｉｓＢおよびｎｉｓＣ遺伝子は、Ｌ．ラクティスｇＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって増幅した（プライマー＝配列番号４５～４８）。
【0064】
ｎｉｓＣおよびｎｉｓＢについてのＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片としてそれぞれ、ｐＡＣＹＣ Ｄｕｅｔ－１およびｐＲＳＦＧＦＰ中にクローニングした。コンストラクトを、ケミカルコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換し、それぞれ、ｐＲＳＦおよびｐＡＣＹＣコンストラクトについての選択的抗生物質としてカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）またはクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を補ったＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上にプレーティングした。単一コロニーを、選択し使用して、それぞれの抗生物質を補ったＬＢブロスに接種し、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡを、単離し、配列決定反応（Ｃｅｎｔｒａｌ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｆａｃｉｌｉｔｙ， ＣＡＦ， Ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、クローニングおよび形質転換のために使用した。
【0065】
ランチペプチド発現株の構築
ｎｉｓＡ遺伝子を、Ｌ．ラクティスゲノムＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって増幅した。Ｐｅｐ５およびエピランシン１５Ｘを、それらのそれぞれのプライマーを使用して増幅した（表１）。Ｐｅｐ５およびエピランシン１５Ｘを増幅するために使用したフォワードプライマーは、ナイシンリーダーの３’領域と相同な５’オーバーハングを組み込んだ。ナイシンリーダーを、以下の表１中のプライマー９（配列番号４９）および１４（配列番号５４）を用い、トロンビンプロテアーゼ部位（Ｓ－３Ｖ）についてコードするヌクレオチド配列を組み込むリバースプライマーを用いて、Ｌ．ラクティスＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって増幅した。
ｎｉｓＡ遺伝子を、Ｌ．ラクティスゲノムＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって増幅した。Ｐｅｐ５およびエピランシン１５Ｘを、それらのそれぞれのプライマーを使用して増幅した（表１）。Ｐｅｐ５およびエピランシン１５Ｘを増幅するために使用したフォワードプライマーは、ナイシンリーダーの３’領域と相同な５’オーバーハングを組み込んだ。ナイシンリーダーを、以下の表１中のプライマー９（配列番号４９）および１４（配列番号５４）を用い、トロンビンプロテアーゼ部位（Ｓ－３Ｖ）についてコードするヌクレオチド配列を組み込むリバースプライマーを用いて、Ｌ．ラクティスＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって増幅した。
【0066】
融合ＰＣＲについては、ナイシンリーダーＰＣＲ産物およびそれぞれのＰｅｐ５／エピランシン１５Ｘ ＰＣＲ産物（それぞれプライマー１０～１１（配列番号５０～５１）および１２～１３（配列番号５２～５３）を使用を、混合し、Ｐｅｐ５についてはプライマー９および１１（配列番号４９および配列番号５１）、またはエピランシン１５Ｘについてはプライマー９および１３（配列番号４９および配列番号５３）を使用して、増幅した。最終の融合ＰＣＲは、コアランチペプチドのナイシンリーダーへの融合をもたらした。最終の融合前駆体ランチペプチド（ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅｓ）およびｐＲＳＦ Ｄｕｅｔ－１を、ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔ４リガーゼを使用してライゲーションした。ｐＲＳＦ中のｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅを、ＰｓｔＩ／ＮｏｔＩで消化し、ｐＲＳＦＧＦＰ－ＮｉｓＢにおける対応する部位中にライゲーションした。
【0067】
前駆体Ｐｅｐ５（ｐＰｅｐ５）および前駆体エピランシン１５Ｘ（ｐＥｐｉｌａｎｃｉｎ１５Ｘ）におけるプロテアーゼ部位のトロンビン（ＡＶＰＲ）からｈＮｉｓＰ部位（ＡＳＰＲ）への変更もまた、融合ＰＣＲで行った。鋳型ＤＮＡは、トロンビンプロテアーゼ部位を有するそれぞれのｐＲＳＦＧＦＰ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅｓ－ＮｉｓＢコンストラクトからであった。ナイシンリーダーは、プライマー９（配列番号４９）および１６（配列番号５６）を使用して増幅し、リバースプライマーは、ＧＴＡ（バリン）からＴＣＡ（セリン）へのヌクレオチドサブステーションをもたらす。それぞれのコアペプチドを、フォワードプライマー１５（配列番号５５）およびそれらのそれぞれのリバースプライマー（Ｐｅｐ５については配列番号５１およびエピランシン１５Ｘについては配列番号５３）を使用して増幅した。リーダーおよびコアペプチドについてのＰＣＲ産物を混合し、融合ＰＣＲを、ナイシンリーダーについてはフォワードプライマー（配列番号５０）およびそれぞれのペプチドについてはリバースプライマーを使用して実施した。最終の産物を、上記のように消化しライゲーションして、ｐＲＳＦ－ＧＦＰｐＮｉｓｉｎ－ＮｉｓＢを得た（図２および３）。
【0068】
プレナイシンコンストラクトにおけるＮｉｓＰ部位のトロンビン部位への置換を、上記のように融合ＰＣＲを使用して達成した。使用したプライマーの組合せは、ｐＲＳＦＧＦＰｐＮｉｓｉｎ－ＮｉｓＢ ｐＤＮＡを鋳型として使用して、プライマー９（配列番号４９およびプライマー１８（配列番号５８）；プライマー１７（配列番号５７）およびプライマー４（配列番号４４）；並びにプライマー９（配列番号４９）およびプライマー４（配列番号４４）を含んだ。
【0069】
結果として得られたコンストラクトを、ケミカルコンピテントな（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補ったＬＢ寒天上にプレーティングした。単一コロニーを、選択し使用して、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補ったＬＢブロスに接種し、３０℃で一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡを、単離し、引き続く配列決定反応（ＣＡＦ， Ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ）およびクローニング／形質転換のために使用した。それぞれのコンストラクトを引き続き、ｐＡＣＹＣＮｉｓＣと、ケミカルコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に同時に形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を補ったＬＢ寒天上にプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを、単離し、引き続く発現実験において使用した。
【0070】
上で詳述したように、本発明の発明者らはすなわち、多くの前駆体ペプチドについての「プラグアンドプレイ」システムとして使用することができるであろうバックボーンプラスミドを作り出した（図２および３）。
【0071】
非ＧＦＰタグ付きＨｉｓ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅの構築を、実施した。簡単に言うと、前述のように、ｎｉｓＡ遺伝子を、Ｌ．ラクティスｇＤＮＡから増幅し、ｎｉｓＢおよびｎｉｓＣを、増幅し、クローンニングした。Ｈｉｓ－ｐｒｅＰｅｐ５および－ｐｒｅＥｐｉｌａｎｃｉｎ１５Ｘの生成については、それぞれのｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅを、フォワードプライマー３（配列番号４３）並びにＰｅｐ５（配列番号５１）およびエピランシン１５Ｘ（配列番号５３）についてのそれぞれのリバースプライマーを使用して、ｐＲＳＦＧＦＰ－ｐＰｅｐ５Ｔｈ－ＮｉｓＢ／ｐＥｐｉｌａｎｃｉｎ１５ＸＴｈ－ＮｉｓＢから増幅した。それぞれのＰＣＲ産物およびｐＲＳＦ Ｄｕｅｔ－１を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔ４リガーゼを使用してライゲーションし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きプレランチペプチドを生成した。ｐＲＳＦ中のＨｉｓ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅを、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで消化し、ｐＲＳＦ－ＮｉｓＢ中の対応する部位中にライゲーションした。形質転換および細胞培養は、上記のように実施した。
【0072】
【表1】
【0073】
【表2】
【0074】
ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎ発現の最適化
全ての場合において、ｐＲＳＦＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の一晩培養物を使用して、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を補った２００ｍＬのｔｅｒｉｆｆｉｃブロスを含有するフラスコに接種した（１．０％ｖ／ｖ）。培養物を、０．６のＯＤ６００ｎｍに達するまで３７℃でインキュベートし、誘導し、さらにインキュベートした。温度については、培養物を、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、さらに４つの異なる温度（１８℃、２６℃、３０℃または３７℃）で４８時間インキュベートした。ＩＰＴＧ濃度を、４つの異なる濃度（０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭおよび１ｍＭ）で評価し、誘導培養物を、２６℃で２４時間インキュベートした。誘導（１ｍＭ ＩＰＴＧ）後のインキュベーションを、２６℃で３つの異なる時間（１２時間、２４時間および４８時間）で評価した。細胞を、溶解し、精製し、活性について試験した。
全ての場合において、ｐＲＳＦＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の一晩培養物を使用して、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を補った２００ｍＬのｔｅｒｉｆｆｉｃブロスを含有するフラスコに接種した（１．０％ｖ／ｖ）。培養物を、０．６のＯＤ６００ｎｍに達するまで３７℃でインキュベートし、誘導し、さらにインキュベートした。温度については、培養物を、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、さらに４つの異なる温度（１８℃、２６℃、３０℃または３７℃）で４８時間インキュベートした。ＩＰＴＧ濃度を、４つの異なる濃度（０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭおよび１ｍＭ）で評価し、誘導培養物を、２６℃で２４時間インキュベートした。誘導（１ｍＭ ＩＰＴＧ）後のインキュベーションを、２６℃で３つの異なる時間（１２時間、２４時間および４８時間）で評価した。細胞を、溶解し、精製し、活性について試験した。
【0075】
非ＧＦＰ融合Ｈｉｓ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅの発現および精製
ｐＲＳＦ－Ｈｉｓ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅｓ－ＮｉｓＢおよびｐＡＣＹＣ－ＮｉｓＣで同時に形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を補ったＬＢブロス中で通気下、３０℃で一晩インキュベートした。一晩培養物を使用して、抗生物質を補った１００ｍＬのｔｅｒｉｆｆｉｃブロス（ＴＢ）に接種した（１．０％ｖ／ｖ）。これらの培養物を、０．６のＯＤ６００に達するまで、通気下、３７℃でインキュベートした。培養物を、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、それらのそれぞれの誘導温度に移し、１８時間発現させた。Ｈｉｓ－ｐＮｉｓｉｎ培養物を、１８℃、２６℃および３７℃（一晩）で発現させ、Ｈｉｓ－ｐＰｅｐ５／ｐＥｐｉｌａｎｃｉｎ １５Ｘ培養物を、１８℃（一晩）で発現させた。発現後、細胞を、遠心分離（６１６４×ｇ、２０分、４℃）によって回収した。
ｐＲＳＦ－Ｈｉｓ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅｓ－ＮｉｓＢおよびｐＡＣＹＣ－ＮｉｓＣで同時に形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を補ったＬＢブロス中で通気下、３０℃で一晩インキュベートした。一晩培養物を使用して、抗生物質を補った１００ｍＬのｔｅｒｉｆｆｉｃブロス（ＴＢ）に接種した（１．０％ｖ／ｖ）。これらの培養物を、０．６のＯＤ６００に達するまで、通気下、３７℃でインキュベートした。培養物を、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、それらのそれぞれの誘導温度に移し、１８時間発現させた。Ｈｉｓ－ｐＮｉｓｉｎ培養物を、１８℃、２６℃および３７℃（一晩）で発現させ、Ｈｉｓ－ｐＰｅｐ５／ｐＥｐｉｌａｎｃｉｎ １５Ｘ培養物を、１８℃（一晩）で発現させた。発現後、細胞を、遠心分離（６１６４×ｇ、２０分、４℃）によって回収した。
【0076】
可溶性画分については、細胞ペレットを、リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮＡｓｅ（１Ｕ／ｍＬ）およびＲＮＡｓｅ（６Ｕ／ｍＬ）を補った１０ｍＬ ＳＢ中に再懸濁した。細胞を、氷上で３０分間インキュベートし、引き続き氷上で超音波処理（３分間７０％出力、５０％パルスで３回）により崩壊させた。溶解サンプルを、１５８７０×ｇ、４℃で６０分間遠心分離した。結果として得られた上清を、可溶性画分の精製のために使用し、ペレットを、１０ｍＬの開始緩衝液尿素（Ｓｔａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ Ｕｒｅａ）（ＳＢＵ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。再懸濁したペレットを、室温で３０分間溶解させ、その後超音波処理し、１５８７０×ｇ、４℃で６０分間で遠心分離した。タンパク質の精製は、製造業者の説明書に従って、プレパックされたＨｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰカラムを使用するＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ精製システムを使用して達成した。結果として得られた溶出液（ｅｌｕｅｎｔ）を、プレパックしたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを使用してＰＢＳ緩衝液に対して脱塩した。脱塩したサンプルを、引き続く活性試験およびＳＤＳＰＡＧＥゲル分離において使用した。
【0077】
初期抗菌活性
初期抗菌効果試験については、ＧＦＰ融合および非ＧＦＰ融合ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅの両方を、ロードし（ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎおよびＧＦＰ－ｐＰｅｐ５）、トリプシン（ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎについて５μｇ／ｍＬ）またはトロンビン（ＧＦＰ－ｐＰｅｐ５について３Ｕ／１００μＬ）を用いてウェル中で直接切断した。抗菌活性は、ナイシンについてはラクトバチルス・サケイに対して、ＧＦＰ－ｐＰｅｐ５についてはＳ．カルノーサスに対して評価した。プレートを、目に見える透き通ったゾーンが観察されるまで、３０℃で一晩インキュベートした。ラクトバチルス・サケイは、ＭＲＳブロスまたは寒天中で培養し、Ｓ．カルノーサスは、ミューラーヒントンブロスまたは寒天中で培養した。
初期抗菌効果試験については、ＧＦＰ融合および非ＧＦＰ融合ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅの両方を、ロードし（ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎおよびＧＦＰ－ｐＰｅｐ５）、トリプシン（ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎについて５μｇ／ｍＬ）またはトロンビン（ＧＦＰ－ｐＰｅｐ５について３Ｕ／１００μＬ）を用いてウェル中で直接切断した。抗菌活性は、ナイシンについてはラクトバチルス・サケイに対して、ＧＦＰ－ｐＰｅｐ５についてはＳ．カルノーサスに対して評価した。プレートを、目に見える透き通ったゾーンが観察されるまで、３０℃で一晩インキュベートした。ラクトバチルス・サケイは、ＭＲＳブロスまたは寒天中で培養し、Ｓ．カルノーサスは、ミューラーヒントンブロスまたは寒天中で培養した。
【0078】
活性データから、第一に、ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎが大腸菌中で首尾よく発現した（すなわち、修飾された）ことが、第二に、発現を、ある範囲の温度、誘導時間およびＩＰＴＧ濃度で実施したときに活性が検出されたため、発現が堅固であることが確立された。最も高い活性（トリプシンでの切断後）は、発現を１８℃で実施したとき、可溶性および不溶性画分から精製したＨｉｓタグ付き前駆体ナイシン（ＨｉｓｐＮｉｓｉｎ）について観察された。発現を２６℃および３７℃で実施したとき、それぞれ、活性における減少および実質的な損失が、観察された（図４）。しかしながら、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した可溶性および不溶性画分の電気泳動分離は、より高いレベルのＨｉｓ－ｐＮｉｓｉｎがより高い温度で得られることを示した。増加した発現率および毒性の可能性のため、Ｈｉｓタグ付き前駆体ペプチドは、封入体に隔離し、これが、それぞれの修飾酵素との接触時間を減少させる。ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎの場合においては、最高の活性（コアペプチドの遊離後）は、２６℃で観察された（図４）－これは、より高い温度であっても、サイトゾル中のそれぞれの修飾酵素との接触時間が増大した結果として、より効果的な脱水および環化反応をもたらした可能性がある。予備的な収量結果は、本発明を使用して、約１．９９ｍｇ／Ｌの抗菌活性ナイシン（ナイシンプロテアーゼでの切断、ＮｉｓＰ、およびＨＰＬＣ精製後）が４８時間の誘導後に取得し得るであろうことを示す。ＥＳＩ－ＭＳによれば、約０．６７～１．０８ｍｇ／Ｌの得られた抗菌活性産物は、完全に修飾されたナイシンに相当した。
【0079】
活性は、トロンビンでの切断後、ＧＦＰ－ｐＰｅｐ５について検出されたが、切断がない場合は活性は何ら検出されなかった（図５）。完全に修飾されたＰｅｐ５はまた、切断および精製後にも（ＥＳＩ－ＭＳを使用して）検出することができた。
【0080】
プロテアーゼ消化
ペプチドのプロテアーゼ消化を使用して、それらのそれぞれのＧＦＰリーダーペプチド融合体からのコアペプチドの跡のない除去を達成することができるかどうかを確立した。これは、ランチペプチドの産生について異種発現を利用するとき、または融合タグを使用するときに考慮すべき重要な一面である。いくつかの市販のプロテアーゼは、跡のない切断が可能であるが、高価であり、ＰＴＭの近くでは効果的に切断しない可能性がある。本発明者らはすなわち、ＧＦＰ融合前駆体ランチペプチド（ＧＦＰ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅ）を切断するＮｉｓＰの能力を評価した。
ペプチドのプロテアーゼ消化を使用して、それらのそれぞれのＧＦＰリーダーペプチド融合体からのコアペプチドの跡のない除去を達成することができるかどうかを確立した。これは、ランチペプチドの産生について異種発現を利用するとき、または融合タグを使用するときに考慮すべき重要な一面である。いくつかの市販のプロテアーゼは、跡のない切断が可能であるが、高価であり、ＰＴＭの近くでは効果的に切断しない可能性がある。本発明者らはすなわち、ＧＦＰ融合前駆体ランチペプチド（ＧＦＰ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅ）を切断するＮｉｓＰの能力を評価した。
【0081】
ＧＦＰ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅを、トロンビンまたはｈＮｉｓＰを用いて、３７℃で４時間および２０時間切断した。異種発現したｈＮｉｓＰを、０．０１ｎｇ／μＬ、５ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬおよび７０ｎｇ／μＬの濃度に添加した。トロンビンは、０．７５Ｕ、４．５Ｕ、３Ｕおよび６Ｕで添加した。切断反応は、１００μＬの反応物中で実施し、ＧＦＰ－ｐＬａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅのタンパク質濃度を、０．９ｍｇ／ｍＬに調整したＧＦＰ－ｐＰｅｐ５Ｔｈを除き、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度に調整した。切断反応は、プロテアーゼ阻害剤の添加によって停止した。抗菌活性を、ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎ（３０μＬ）およびＧＦＰ－ｐＰｅｐ５（８０μＬ）について、それぞれ、Ｌｂ．サケイおよびＳ．カルノーサスに対して評価した。プレートを、目に見える透明なゾーンが観察されるまで３０℃で一晩インキュベートした。サンプルを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離した。
【0082】
トロンビンおよびｈＮｉｓＰの両方での切断は、切断の４時間および２０時間後に活性ランチペプチドの遊離をもたらした（図６）。興味深いことに、トロンビンおよびｈＮｉｓＰの両方での濃度および切断時間を増加させることは、最もおそらくは、ランチオニン／メチルランチオニン架橋によって保護されていないコアペプチド内の非特異的ｈＮｉｓＰ切断部位のため、Ｐｅｐ５の抗菌活性上に悪影響を有した。
【0083】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
電気泳動分離後のＧＦＰ蛍光を視覚化するために、サンプルを、サンプル緩衝液中で煮沸せず、３７℃で３０分間インキュベートした。引き続き７μＬのサンプルを、２０％トリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウェル中にロードした。熱の発生を抑え、より小さなペプチドの分離を助けるために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、８℃で実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおけるＧＦＰ蛍光の視覚化のために、ＵＶ光（３１２ｎｍ）に曝露したサンプルの直接写真画像を、デジタルカメラまたはＭｉｎｉＢＩＳ Ｐｒｏ ＤＮＲ Ｂｉｏ－ｉｍａｇｉｎｇシステム（ＤＮＲ Ｂｉｏ－ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ、イスラエル）を使用して撮影した。ＵＶイメージング後、ゲルを、ｄＨ２Ｏで洗浄し、５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド中で１時間固定した。固定後、ゲルを、ｄＨ２Ｏで洗浄し、タンパク質バンドを視覚化することができるまでＢｌｕｅ ｓｉｌｖｅｒ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を使用して染色した。
電気泳動分離後のＧＦＰ蛍光を視覚化するために、サンプルを、サンプル緩衝液中で煮沸せず、３７℃で３０分間インキュベートした。引き続き７μＬのサンプルを、２０％トリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウェル中にロードした。熱の発生を抑え、より小さなペプチドの分離を助けるために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、８℃で実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおけるＧＦＰ蛍光の視覚化のために、ＵＶ光（３１２ｎｍ）に曝露したサンプルの直接写真画像を、デジタルカメラまたはＭｉｎｉＢＩＳ Ｐｒｏ ＤＮＲ Ｂｉｏ－ｉｍａｇｉｎｇシステム（ＤＮＲ Ｂｉｏ－ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ、イスラエル）を使用して撮影した。ＵＶイメージング後、ゲルを、ｄＨ２Ｏで洗浄し、５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド中で１時間固定した。固定後、ゲルを、ｄＨ２Ｏで洗浄し、タンパク質バンドを視覚化することができるまでＢｌｕｅ ｓｉｌｖｅｒ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を使用して染色した。
【0084】
伝統的には、切断効率は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して評価されるであろう。しかしながら、従来の染色法は、切断効率のはっきりしたイメージを常に提供するとは限らない。本発明の発明者らは、ＧＦＰｆｕｓｉｏｎを使用して可能となる代替評価方法を提示する。ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎの蛍光特性を利用することにより、切断効率を、ＵＶイメージングおよび従来のＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色の両方を使用することによって、切断されたおよび非切断のＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎの移動を追跡することにより、より明確に視覚化することができた（図７）。この組み合わせた方法を使用して、本発明者らは、ＵＶおよび染色画像を重ね合わせることによって、非切断のおよび切断されたＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎをバックグラウンドタンパク質から明確に区別することができた。非切断サンプルにおいては、２つの蛍光バンドが検出されたが、これは、抗菌活性が非切断サンプルにおいては存在しないため、部分的に切断されたＧＦＰｐＮｉｓｉｎを示さない（図７ＣおよびＤ）。満足のいく切断が、試験したトロンビンおよびｈＮｉｓＰ濃度で、ＧＦＰ－ｐＮｉｓｉｎについて観察された（図７ＡおよびＢ）。
【0085】
上記の実施例１において説明した方法を使用して、本発明者らは、抗菌活性のある翻訳後修飾されたランチペプチドを発現させた。本発明者らはまた、修飾酵素活性を妨げない蛍光融合体を有する蛍光融合ＰｏＩとともに追加の修飾酵素を発現する可能性を例示した。さらに、本発明者らは、少なくとも２つの異なるプロテアーゼを使用して、それらの蛍光融合パートナーから活性ランチペプチドを遊離させるための、プロテアーゼの首尾よくいった使用を例示する。
【0086】
実施例２
大腸菌におけるＧＦＰ融合サブクラスＩＩａバクテリオシンの異種発現
プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡ ＧＦＰバクテリオシン発現ベクターの構築
この実施例において使用した全てのＰＣＲプライマーを、以下の表３に提供する。表４は、この実施例において使用したまたは生成したそれぞれのプラスミドの説明を提供する。実施例１において説明したのと同じｐＲＳＦＧＦＰバックボーンプラスミドを、ここで使用した。
大腸菌におけるＧＦＰ融合サブクラスＩＩａバクテリオシンの異種発現
プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡ ＧＦＰバクテリオシン発現ベクターの構築
この実施例において使用した全てのＰＣＲプライマーを、以下の表３に提供する。表４は、この実施例において使用したまたは生成したそれぞれのプラスミドの説明を提供する。実施例１において説明したのと同じｐＲＳＦＧＦＰバックボーンプラスミドを、ここで使用した。
【0087】
Ｌ．プランタルム４２３およびＥ．ムンドティ（ｍｕｎｄｔｉｉ）ＳＴ４ＳＡからのゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、それぞれＧＦＰ－ＰｌａＸ＿Ｐｓｔ＿Ｆｗｄ／ＧＦＰ－ＰｌａＸ＿Ｈｉｎｄ＿Ｒｅｖ（配列番号５９および配列番号６０）およびＧＦＰ－ＭｕｎＸ＿Ｐｓｔ＿Ｆｗｄ／ＧＦＰ－ＭｕｎＸ＿Ｈｉｎｄ＿Ｒｅｖ（配列番号６１および配列番号６２）プライマーセットを使用して、成熟プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡバクテリオシン遺伝子を増幅した。これらのプライマーセットは、成熟プランタリシン４２３（ｐｌａＡ）またはムンドティシンＳＴ４ＳＡ（ｍｕｎＳＴ４ＳＡ）遺伝子をｐＲＳＦＤｕｅｔ－１においてＧＦＰ融合体としてクローニングするために、５’ＰｓｔＩおよび３’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を追加した。増幅したバクテリオシン遺伝子を、ＧｅｎｅＪｅｔ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製し、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化混合物は、製造業者の説明書に従ってＧｅｎｅＪｅｔ ＰＣＲ精製キットを使用して再度精製し、引き続くクローニング実験において使用した。
【0088】
ｐＪＥＴ－ＧＦＰプラスミドを、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩで消化し；ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１ベクターを、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。直鎖ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１ベクターおよび消化されたＧＦＰ断片を、アガロースゲル電気泳動を使用して精製し、ゲル切除し、回収した。たった１回のライゲーション反応において、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ ＧＦＰ断片およびＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩバクテリオシン断片を、直鎖ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１ベクター（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）中にライゲーションした。断片は、１：３：３のＶｅｃｔｏｒ：Ｉｎｓｅｒｔ＿ＧＦＰ：Ｉｎｓｅｒｔ＿Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎモル比（ｍｏｌａｒ ｅｎｄ ｒａｔｉｏ）を使用してライゲーションした。結果として得られたコンストラクト、ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＰｌａＸ（図１０および１１）、およびｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸ（図８および９）を使用して、ケミカルコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸプラスミドは、表現型的に緑色蛍光のカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）耐性の、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコロニーから抽出した。成熟プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡ遺伝子は、ＭＣＳ１＿Ｒｅｖプライマー（配列番号６３）を使用してｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸプラスミドにおいて配列決定し、正しいことを確認した。
【0089】
【表3】
【0090】
【表4】
【0091】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＧＦＰ－バクテリオシン融合タンパク質の過剰発現
５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する３０ｍＬ ＬＢブロスのスターター培養物に、ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＰｌａＸまたはｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸコンストラクトを含有するそれぞれの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を接種した。スターター培養物を、一定の撹拌をしながら３７℃で１２時間インキュベートした。スターター培養物を、それぞれ、ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸの発現のための接種材料として使用した（１％ｖ／ｖ）。０．６～０．６５のＯＤ６００ｎｍで、それぞれのＧＦＰ融合タンパク質の発現を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを使用して誘導した。
５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する３０ｍＬ ＬＢブロスのスターター培養物に、ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＰｌａＸまたはｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸコンストラクトを含有するそれぞれの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を接種した。スターター培養物を、一定の撹拌をしながら３７℃で１２時間インキュベートした。スターター培養物を、それぞれ、ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸの発現のための接種材料として使用した（１％ｖ／ｖ）。０．６～０．６５のＯＤ６００ｎｍで、それぞれのＧＦＰ融合タンパク質の発現を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを使用して誘導した。
【0092】
新たに生成したＧＦＰ融合タンパク質、ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸは、ＧＦＰの自己蛍光特性を保持しながら大腸菌中で首尾よく発現した。
【0093】
ＧＦＰ－ＭｕｎＸおよびＧＦＰ－ＰｌａＸタンパク質のＮｉ－ＮＴＡ精製
誘導された細胞を、８０００ｇ、４℃での２０分間の遠心分離により回収した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１ｍｇ／ｍＬリゾチームを補った１５ｍＬ／ｇ湿重量ＳＢ緩衝液中に再懸濁し、８℃で４５分間撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション後、溶解した細胞を、Ｏｍｎｉ Ｒｕｐｔｏｒ４００（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して超音波処理（５０％振幅、２秒パルス、２秒休止、６分）に供した。ＲＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩを、それぞれ１０および５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、溶解物を、室温で１５分間インキュベートした。細胞溶解物を次いで、２０，０００ｇ、４℃で９０分間遠心分離し；無細胞上清を、収集した。イミダゾールを、無細胞上清に１０ｍＭの最終濃度まで添加した。
誘導された細胞を、８０００ｇ、４℃での２０分間の遠心分離により回収した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１ｍｇ／ｍＬリゾチームを補った１５ｍＬ／ｇ湿重量ＳＢ緩衝液中に再懸濁し、８℃で４５分間撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション後、溶解した細胞を、Ｏｍｎｉ Ｒｕｐｔｏｒ４００（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して超音波処理（５０％振幅、２秒パルス、２秒休止、６分）に供した。ＲＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩを、それぞれ１０および５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、溶解物を、室温で１５分間インキュベートした。細胞溶解物を次いで、２０，０００ｇ、４℃で９０分間遠心分離し；無細胞上清を、収集した。イミダゾールを、無細胞上清に１０ｍＭの最終濃度まで添加した。
【0094】
Ｈｉｓタグ付きＧＦＰ－バクテリオシン融合タンパク質、ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸを、バッチ精製についてのＱｉａｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔハンドブックの説明書に従って、Ｎｉ－ＮＴＡスーパーフロー樹脂を使用して、ＩＭＡＣで精製した。ＡＥＫＴＡ精製システムを、サンプルをＳＢ５００からＷＥＬＱｕｔカット緩衝液に交換するために、カラム（１６×６５ｍｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に詰めたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂と組み合わせて使用した。タンパク質の首尾よい精製の後、ＧＦＰの蛍光特性を使用して、蛍光出力の観点から増加した収量産生のための最適な発現条件を評価した。これは、それぞれ、異なる温度、発現時間およびＩＰＴＧ濃度を含む。
【0095】
ＧＦＰ－ＭｕｎＸ発現についてのインキュベーション温度最適化
切断したＧＦＰ－ＭｕｎＸがより高い比活性を有するため、ＧＦＰ－ＭｕｎＸ発酵のみを、温度最適化した。ＧＦＰＭｕｎＸ発現温度の最適化は、ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸプラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の３つの生物学的反復を用いて１８℃、２６℃、および３７℃で実施した。大腸菌ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸの３つの生物学的反復を使用して、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有するｔｅｒｒｉｆｉｃブロスの３つの４００ｍＬフラスコに接種した。培養物を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを使用して誘導し、０．６～０．６５のＯＤ６００ｎｍまで３７℃で増殖させた。各４００ｍＬ培養物を、３つの１００ｍＬ培養物に分割し、それらを、それぞれ、１８℃、２６℃、および３７℃で４８時間インキュベートした。
切断したＧＦＰ－ＭｕｎＸがより高い比活性を有するため、ＧＦＰ－ＭｕｎＸ発酵のみを、温度最適化した。ＧＦＰＭｕｎＸ発現温度の最適化は、ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸプラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の３つの生物学的反復を用いて１８℃、２６℃、および３７℃で実施した。大腸菌ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸの３つの生物学的反復を使用して、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有するｔｅｒｒｉｆｉｃブロスの３つの４００ｍＬフラスコに接種した。培養物を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを使用して誘導し、０．６～０．６５のＯＤ６００ｎｍまで３７℃で増殖させた。各４００ｍＬ培養物を、３つの１００ｍＬ培養物に分割し、それらを、それぞれ、１８℃、２６℃、および３７℃で４８時間インキュベートした。
【0096】
インビボでのＧＦＰ－ＭｕｎＸ発現を測定するために、各フラスコからの１ｍＬのサンプルを、誘導の時に３回収集し；サンプルを、２４時間および４８時間時点で再び収集し、－８０℃で凍結した。収集後、サンプルを、融解し、遠心分離し、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。ＧＦＰ－ＭｕｎＸのインビボでの発現は、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ Ｍ１０（商標）（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、オーストリア）を使用して、４８８ｎｍ（励起）および５０９ｎｍ（発光）で相対蛍光単位（ＲＦＵ）で蛍光分析的に測定した。
【0097】
４８時間後、各サンプルについての総ＧＦＰ－ＭｕｎＸ ＲＦＵ産生を、８０ｍＬの培養物から誘導細胞を回収すること（８０００×ｇ、４℃での２０分間の遠心分離）によって計算した。各細胞ペレットの質量を次いで測定し、１５ｍＬ／ｇ湿重量ＳＢ緩衝液中に再懸濁した。各サンプル中のＧＦＰ－ＭｕｎＸを、前述のようにＩＭＡＣを使用して抽出し、精製した。簡単に言うと、各無細胞溶解物からの５ｍＬを、５ｍｌ Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカートリッジを使用して、精製した。各Ｎｉ－ＮＴＡ精製ＧＦＰ－ＭｕｎＸサンプルのＲＦＵを、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０（商標）Ｓｐａｒｋ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、オーストリア）を使用して測定した。ＲＦＵｓ／ｇを次いで、測定したＲＦＵを、精製のために溶解した細胞の等価湿重量（ｇ）（すなわち、５ｍＬ中の溶解細胞のグラム）で割ることによって、各サンプルについて計算した。各サンプルについて産生した総ＲＦＵを、ＲＦＵ／ｇに、各サンプルにおいて回収した細胞の総湿重量を掛けることによって計算した。
【0098】
有意により高い蛍光強度が、それぞれ、発現の２４時間後および４８時間後に、３７℃と比較して１８℃および２６℃でインビボで測定された（図１２）。しかしながら、これらのインビボ測定値は、総湿細胞重量を考慮しておらず、各温度での総標的タンパク質発現を正確には表していない。相対蛍光単位（ＲＦＵ）の観点からの総標的タンパク質発現の測定については、以下の式（１）を使用した。
【0099】
【数1】
【0100】
ＧＦＰ－ＭｕｎＸについての総ＲＦＵ産生を図１２Ｂに表し、ここでは、有意により高いＲＦＵが、１８℃で生じた。この蛍光強度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を使用した切断後の抗菌活性の存在と相関していた。
【0101】
誘導についてのＩＰＴＧ濃度の最適化
蛍光強度を使用して、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ Ｍ１０ＴＭ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、オーストリア）の動力学的インキュベーションプログラムおよび９６ウェルマイクロタイタープレートにおける湿度カセットを使用して、ＧＦＰ－ＭｕｎＸ発現についてのＩＰＴＧ誘導濃度を最適化した。ｐＲＳＦ－ＧＦＰＭｕｎＸプラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の３つの生物学的反復を、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを補った２００ｍＬフィルター滅菌ｔｅｒｒｉｆｉｃブロスを含有する３つの１Ｌ三角フラスコ中に接種し、３７℃でインキュベートした。いったん０．５５のＯＤ６００ｎｍに達したら、各培養物を、氷浴中で冷やした。培養アリコートを次いで、９６ウェルマイクロタイタープレート中で３回、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、および２ｍＭ ＩＰＴＧ（最終濃度）とともにインキュベートした。マイクロタイタープレートを、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ Ｍ１０（商標）による湿度チャンバー内で２６℃で２０時間インキュベートした。２０分ごとに、マイクロタイタープレートを、３０秒間振盪し、１０秒間静置させ、ＲＦＵを次いで、４８８ｎｍでの励起後に、５０９ｎｍ（発光）で測定した。
蛍光強度を使用して、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ Ｍ１０ＴＭ（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．、オーストリア）の動力学的インキュベーションプログラムおよび９６ウェルマイクロタイタープレートにおける湿度カセットを使用して、ＧＦＰ－ＭｕｎＸ発現についてのＩＰＴＧ誘導濃度を最適化した。ｐＲＳＦ－ＧＦＰＭｕｎＸプラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の３つの生物学的反復を、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを補った２００ｍＬフィルター滅菌ｔｅｒｒｉｆｉｃブロスを含有する３つの１Ｌ三角フラスコ中に接種し、３７℃でインキュベートした。いったん０．５５のＯＤ６００ｎｍに達したら、各培養物を、氷浴中で冷やした。培養アリコートを次いで、９６ウェルマイクロタイタープレート中で３回、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１、および２ｍＭ ＩＰＴＧ（最終濃度）とともにインキュベートした。マイクロタイタープレートを、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ Ｍ１０（商標）による湿度チャンバー内で２６℃で２０時間インキュベートした。２０分ごとに、マイクロタイタープレートを、３０秒間振盪し、１０秒間静置させ、ＲＦＵを次いで、４８８ｎｍでの励起後に、５０９ｎｍ（発光）で測定した。
【0102】
誘導したサンプルの蛍光測定出力は、時間とともに増加し、誘導について使用したＩＰＴＧ濃度によって有意に影響された（図１３Ａ）。０．１および０．２ｍＭのＩＰＴＧ濃度は、他のＩＰＴＧ濃度と比較して、２６℃での１８時間インキュベート後に、有意により高い蛍光を誘導した（図１３Ｂ）。
【0103】
濃度推定
１ミリリットルのＮｉ－ＮＴＡ精製し、緩衝液交換したＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸ溶出液を、凍結乾燥し、３回分析的に秤量して、総タンパク質質量を推定した。精製したＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸサンプルを、トリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して電気泳動的に分離して、サンプルの純度を推定した（Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ、１９８７）。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色中の飽和を避けるために、ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸの１０倍希釈物を使用して、タンパク質純度を推定した。Ｇｅｌ ａｎａｌｙｚｅｒ ２０１０ａを使用して、それぞれのレーンにおける各染色バンドのピクセル密度を決定し、使用して、サンプル純度を推定した（Ｌａｚｅｒ ａｎｄ ＧｅｌＡｎａｌｙｚｅｒ、２０１０）。
１ミリリットルのＮｉ－ＮＴＡ精製し、緩衝液交換したＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸ溶出液を、凍結乾燥し、３回分析的に秤量して、総タンパク質質量を推定した。精製したＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸサンプルを、トリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して電気泳動的に分離して、サンプルの純度を推定した（Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ、１９８７）。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色中の飽和を避けるために、ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸの１０倍希釈物を使用して、タンパク質純度を推定した。Ｇｅｌ ａｎａｌｙｚｅｒ ２０１０ａを使用して、それぞれのレーンにおける各染色バンドのピクセル密度を決定し、使用して、サンプル純度を推定した（Ｌａｚｅｒ ａｎｄ ＧｅｌＡｎａｌｙｚｅｒ、２０１０）。
【0104】
ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸのスケールアップ産生
大規模発現のＧＦＰ融合系の収量に対する影響を決定するために、本発明者らは、Ｍｉｎｉｆｏｒｓ ５Ｌ発酵槽を使用して、それぞれ最適化された条件下で実験を実施した。プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡ ＧＦＰ融合タンパク質のスケールアップした異種発現は、５Ｌ発酵槽（Ｍｉｎｉｆｏｒｓ、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ；３Ｌの最大推奨容量）を使用して実施した。０．００５％の消泡剤２０４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（２．７Ｌ）を、調製し、オートクレーブ処理した。いったん冷却したら、３００ｍＬの滅菌１０×ＴＢ緩衝液およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬの最終濃度）を、無菌的に添加した。ブロスを、３７℃に加熱し、滅菌圧縮空気を１Ｌ／分で通気し、３００ＲＰＭで撹拌した。ｐＨおよび溶存酸素レベルは、制御しなかった。
大規模発現のＧＦＰ融合系の収量に対する影響を決定するために、本発明者らは、Ｍｉｎｉｆｏｒｓ ５Ｌ発酵槽を使用して、それぞれ最適化された条件下で実験を実施した。プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡ ＧＦＰ融合タンパク質のスケールアップした異種発現は、５Ｌ発酵槽（Ｍｉｎｉｆｏｒｓ、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ；３Ｌの最大推奨容量）を使用して実施した。０．００５％の消泡剤２０４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（２．７Ｌ）を、調製し、オートクレーブ処理した。いったん冷却したら、３００ｍＬの滅菌１０×ＴＢ緩衝液およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬの最終濃度）を、無菌的に添加した。ブロスを、３７℃に加熱し、滅菌圧縮空気を１Ｌ／分で通気し、３００ＲＰＭで撹拌した。ｐＨおよび溶存酸素レベルは、制御しなかった。
【0105】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびｐＲＳＦ－ＧＦＰ－ＭｕｎＸのスターター培養物を、それぞれの発現について１％ｖ／ｖの接種材料として使用した。０．６～０．６５のＯＤ６００ｎｍで、それぞれのＧＦＰ融合タンパク質の発現を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して誘導した。それぞれの発酵物を次いで、１８℃に冷却し、４８時間インキュベートした。
【0106】
ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸタンパク質の抽出、Ｎｉ－ＮＴＡ精製および緩衝液交換後、３９ｍＬのＧＦＰ－ＰｌａＸおよび４２ｍＬのＧＦＰ－ＭｕｎＸ溶出液を、得た。１ｍＬのＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸの凍結乾燥後、それぞれ、１２．９６ｍｇおよび１７．９６ｍｇの残留質量を、測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から、ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸの純度は、約７２および６１％であり、それぞれ、９．３３および１０．９５ｍｇ／ｍＬのおおよその濃度を産生する。これらの純度では、ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸのおおよその収量は、それぞれ１２１．２９ｍｇ／Ｌの培養物および１５３．３０ｍｇ／Ｌの培養物であった。
【0107】
抗菌活性アッセイ
それぞれのバクテリオシンをＧＦＰに融合して、蛍光複合体を産生する一方で、抗菌活性が遊離したバクテリオシンに起因することを決定することが重要であった。プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡの抗菌活性を、７．５ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）上で増殖させたリステリア・モノサイトゲネスＥＤＧ－ｅに対して評価した。スポットプレート法を、リステリア・モノサイトゲネスＥＤＧ－ｅを播種した固体培地（１％ｗ／ｖ寒天）上で実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離を、リステリア・モノサイトゲネスＥＤＧ－ｅを播種した寒天二重層中でポリアクリルアミドゲルをキャストすることによって活性についてアッセイした。キャストすることの前に、ポリアクリルアミドゲルを、２５％イソプロパノール、１０％酢酸固定溶液中で２０分間固定し、次いで滅菌超純水で３×１５分すすいだ。
それぞれのバクテリオシンをＧＦＰに融合して、蛍光複合体を産生する一方で、抗菌活性が遊離したバクテリオシンに起因することを決定することが重要であった。プランタリシン４２３およびムンドティシンＳＴ４ＳＡの抗菌活性を、７．５ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）上で増殖させたリステリア・モノサイトゲネスＥＤＧ－ｅに対して評価した。スポットプレート法を、リステリア・モノサイトゲネスＥＤＧ－ｅを播種した固体培地（１％ｗ／ｖ寒天）上で実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離を、リステリア・モノサイトゲネスＥＤＧ－ｅを播種した寒天二重層中でポリアクリルアミドゲルをキャストすることによって活性についてアッセイした。キャストすることの前に、ポリアクリルアミドゲルを、２５％イソプロパノール、１０％酢酸固定溶液中で２０分間固定し、次いで滅菌超純水で３×１５分すすいだ。
【0108】
切断パラメーターは、製造業者が供給したものを修正した方法を使用して最適化した。ＷＥＬＱｕｔのサンプルへの比を、ＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸの５０μＬサンプルについて、それぞれ、１：１００、１：５０、１：２５、１：５（ｖ／ｖ）に設定し、ＷＥＬＱｕｔカット緩衝液中で２５０μＬの最終体積まで希釈した。４６６．５μｇのＧＦＰ－ＰｌａＸに対するＷＥＬＱのおおよその対応単位は、それぞれ２．５Ｕ、５Ｕ、１０Ｕおよび５０Ｕであった。５４７．５μｇのＧＦＰ－ＭｕｎＸに対するＷＥＬＱのおおよその対応単位は、それぞれ２．５Ｕ、５Ｕ、１０Ｕおよび５０Ｕであった。切断反応を２８℃でインキュベートし、サンプルを、それぞれ、２時間、４時間、８時間、および１６時間の時点で５０μＬの収集した。切断は、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ－ｅを播種したＢＨＩ固体培地（１％ｗ／ｖ寒天）を使用するスポットプレート法によって評価した。
【0109】
１６時間後にＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸ切断について最大の抗リステリア活性を産生した切断比は、それぞれ、１：１０および１：２５（ｍＬ：ｍＬ）のＷＥＬＱｕｔのサンプルへの比で確認された（図１４）。
【0110】
ＧＦＰを融合パートナーとして使用することの重要な利点は、電気泳動分離後の蛍光バンドの移動パターンを視覚化することによりプロテアーゼ切断を評価する能力である。異種的に産生したバクテリオシン融合体の活性の観点から最適な切断条件を決定することは、多くの変数に依存している。そういうものとして、本発明者らは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動後のＧＦＰの維持された蛍光特性を利用することによって、最適な切断についての結果を確認した。蛍光バンドは、ＧＦＰ－ＰｌａＸ、ＧＦＰ－ＭｕｎＸ、およびＧＦＰについて、それぞれ、切断前および切断後に観察された。これらのバンドを次いで、同じＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上の染色バンドと相関させた（図１５）。
【0111】
非切断のＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰ－ＭｕｎＸの蛍光バンドの強度は、ＷＥＬＱｕｔ：サンプル比が増加するにつれて減少する（図１５）。完全な切断が、ＧＦＰ－ＰｌａＸについて観察され、観察された最も高いスポット活性に相当する。ＧＦＰ－ＭｕｎＸについては、非切断ＧＦＰ－ＭｕｎＸの位置にわずかな蛍光バンドが観察され、完全な切断は、達成されなかった。
【0112】
セミネイティブ条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、分離したゲル上の蛍光ＧＦＰ融合タンパク質の位置を、写真撮影し、染色および抗リステリアゲルのオーバーレイ上に重ね合わせることができた（図１６）。抗リステリア活性は、ＷＥＬＱｕｔで切断したＧＦＰ－ＰｌａＸおよびＧＦＰＭｕｎＸサンプルについての透明なゾーンとして観察された。図１６中の抗リステリアゾーンＩＩＩおよびＩＶは、それぞれ、ムンドティシンＳＴ４ＳＡ（４２８５Ｄａ）およびプランタリシン４２３（３９２８Ｄａ）の位置に対応し、それらのそれぞれのＧＦＰ融合パートナーからのコアペプチドの遊離を示す。しかしながら、抗リステリア活性の２つの追加ゾーン（図１６中のＩおよびＩＩ）が観察され、これらは、蛍光ＧＦＰ－ＭｕｎＸ（３１８７４Ｄａ）およびＧＦＰ－ＰｌａＸ（３１５２０Ｄａ）のおおよそのサイズおよび位置に対応する。
【0113】
ＨＰＬＣおよびＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ
ムンドティシンＳＴ４ＳＡおよびプランタリシン４２３を、最適な切断条件下で、それぞれ、１ミリリットルのＨｉｓタグ精製ＧＦＰ－ＭｕｎＸおよびＧＦＰ－ＰｌａＸから切断した。切断反応物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製し、単一ピークを、抗リステリア活性についてスポット試験した。
ムンドティシンＳＴ４ＳＡおよびプランタリシン４２３を、最適な切断条件下で、それぞれ、１ミリリットルのＨｉｓタグ精製ＧＦＰ－ＭｕｎＸおよびＧＦＰ－ＰｌａＸから切断した。切断反応物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製し、単一ピークを、抗リステリア活性についてスポット試験した。
【0114】
ＨＰＬＣ精製ムンドティシンＳＴ４ＳＡに対して実施したエレクトロスプレーイオン化ＭＳは、成熟ムンドティシンＳＴ４ＳＡに対応する質量を有するペプチドの存在を確認した（図１７）。４２８５．１３５５Ｄａの正確な質量を、［Ｍ＋５Ｈ］＋５種の同位体エンベロープからムンドティシンＳＴ４ＳＡについて決定したが、生のスペクトル内のこの荷電種の存在量は、低かった（図１７）。しかしながら、正確な質量測定値は、４２８５．０７９６Ｄａの理論上のモノアイソトピック質量（１つのジスルフィド架橋の形成に相当）とほぼ一致している。
【0115】
ムンドティシンＳＴ４ＳＡ活性が単一のピークから観察されたが、一方で、プランタリシン４２３は、低レベルの活性で複数の活性ピークを産生した。ムンドティシンＳＴ４ＳＡ画分を凍結乾燥し、残留質量を秤量した。ＧＦＰ－ＭｕｎＸの最適な切断は、０．８８ｍｇの活性ムンドティシンＳＴ４ＳＡを産出し、これは、１２．４ｍｇ／ＬムンドティシンＳＴ４ＳＡに相当するおおよそ３７．３ｍｇを３Ｌ発酵から得ることができたことを示す。
【0116】
上記の実施例２において説明した方法を使用して、本発明者らは、抗菌活性のあるバクテリオシンを発現させた。本発明者らはまた、より大規模な発酵反応器を使用することによってシステムをスケールアップする可能性を例示した。本発明者らはまた、インビトロおよびインビボでの融合タンパク質の蛍光特性を利用することにより、発現を正確にかつ素早く評価することができた。
【0117】
実施例３
大腸菌におけるＧＦＰ融合細菌毒素リステリオリシン（ＬＬＯ）およびＡｃｔＡの製造
本発明の発明者らは、細菌毒素リステリオリシンＯ（図１８）およびＡｃｔＡ（図１９）の首尾よくいった発現を示した。
大腸菌におけるＧＦＰ融合細菌毒素リステリオリシン（ＬＬＯ）およびＡｃｔＡの製造
本発明の発明者らは、細菌毒素リステリオリシンＯ（図１８）およびＡｃｔＡ（図１９）の首尾よくいった発現を示した。
【0118】
プラスミド設計
リステリア・モノサイトゲネス エフェクターＬＬＯおよびＡｃｔＡを、翻訳的に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合させ、大腸菌中で発現させた。Ｎ末端６×ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）およびＣ末端ＷＥＬＱｕｔプロテアーゼ部位を含むｍｇｆｐ５を含有するバックボーンプラスミドの生成は、実施例１および２において説明したとおりに行った。ＬＬＯ遺伝子を、Ｎ末端シグナルペプチド（配列番号６６～６７）を除外するように設計したフォワードプライマーと、表５に列挙したプライマーを使用してＬ．モノサイトゲネスＥＤＧ－ｅゲノムＤＮＡから増幅させた。消化（ＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ）し、精製したＬＬＯを、Ｔ４リガーゼを使用してＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ断片上のｐＲＳＦ－ＧＦＰ中にクローニングし、これが、ＬＬＯの、配列番号３７のアミノ酸配列および配列番号３８のヌクレオチド配列を有するＨｉｓタグ付きＧＦＰへの翻訳的融合をもたらした。結果として得られたｐＲＳＦＧＦＰ－ＬＬＯコンストラクトを、ケミカルコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中に形質転換した。
リステリア・モノサイトゲネス エフェクターＬＬＯおよびＡｃｔＡを、翻訳的に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合させ、大腸菌中で発現させた。Ｎ末端６×ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）およびＣ末端ＷＥＬＱｕｔプロテアーゼ部位を含むｍｇｆｐ５を含有するバックボーンプラスミドの生成は、実施例１および２において説明したとおりに行った。ＬＬＯ遺伝子を、Ｎ末端シグナルペプチド（配列番号６６～６７）を除外するように設計したフォワードプライマーと、表５に列挙したプライマーを使用してＬ．モノサイトゲネスＥＤＧ－ｅゲノムＤＮＡから増幅させた。消化（ＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ）し、精製したＬＬＯを、Ｔ４リガーゼを使用してＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ断片上のｐＲＳＦ－ＧＦＰ中にクローニングし、これが、ＬＬＯの、配列番号３７のアミノ酸配列および配列番号３８のヌクレオチド配列を有するＨｉｓタグ付きＧＦＰへの翻訳的融合をもたらした。結果として得られたｐＲＳＦＧＦＰ－ＬＬＯコンストラクトを、ケミカルコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中に形質転換した。
【0119】
【表5】
【0120】
いくつかのプラスミドコンストラクトが、ＡｃｔＡの発現および精製中に観察される分解産物のため、ＡｃｔＡの発現について生成した。最終コンストラクトは、ＡｃｔＡの、配列番号３９のアミノ酸配列および配列番号４０のヌクレオチド配列を有するそのＮ末端上のＨｉｓタグ付きＧＦＰおよびＣ末端上のＧＳＴタグへの翻訳的融合をもたらした。ＡｃｔＡは、ＮおよびＣ末端シグナルペプチド並びに膜貫通ドメインを、それぞれ除外するように設計したプライマー（配列番号６８～６９）を用いてＬ．モノサイトゲネスＥＤＧ－ｅ ｇＤＮＡから増幅させた。ＧＳＴタグは、表５（配列番号６４～６５）に列挙したプライマーを使用してｐＥＴ４１ａ（＋）から増幅させた。精製したＡｃｔＡ ＰＣＲ産物を、ＰｓｔＩ／ＮｏｔＩで消化し、前もってＰｓｔＩ／ＮｏｔＩで消化したｐＲＳＦＧＦＰ中にライゲーションした。ライゲーション産物を、形質転換し、精製した。結果として得られたｐＲＳＦＧＦＰ－ＡｃｔＡコンストラクトを、ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで消化し、ＧＳＴタグ（ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで消化）とのライゲーション反応において使用した。ライゲーション反応からの産物を使用して、ケミカルコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換し、前述のようにｐＤＮＡを単離した。発現中のＡｃｔＡの安定性は、低温適応シャペロニンＣｐｎ１０およびＣｐｎ６０を保有する大腸菌株ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓを使用して増加させた。ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓの形質転換および培養は、ｃｐｎ１０およびｃｐｎ６０を保有するプラスミドを維持するためにゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を含めたことを除き、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）について説明したように実施した。
【0121】
タンパク質の合成および精製
リステリオリシン－Ｏ：ＧＦＰ－ＬＬＯを発現する大腸菌を、実施例１および２において説明したのと同様の方法で実施した。Ｈｉｓタグ精製からの溶出液を、１０ｋＤａスピンカラムを使用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して脱塩した。脱塩タンパク質の収量決定のためのタンパク質濃度は、ＢＣＡ タンパク質アッセイを使用して決定した。
リステリオリシン－Ｏ：ＧＦＰ－ＬＬＯを発現する大腸菌を、実施例１および２において説明したのと同様の方法で実施した。Ｈｉｓタグ精製からの溶出液を、１０ｋＤａスピンカラムを使用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して脱塩した。脱塩タンパク質の収量決定のためのタンパク質濃度は、ＢＣＡ タンパク質アッセイを使用して決定した。
【0122】
最適な切断条件を使用して、ＬＬＯをさらに精製して、ＧＦＰおよびＷＥＬＱｕｔ（これらもまたＨｉｓタグ付き）を除去した（図１８）。イミダゾールを、１０ｍＭで添加し、平衡化したＨｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰ Ｎｉ－ＮＴＡカラムに適用した。フロースルーを含有するＬＬＯを収集し、精製したＬＬＯを、１０ｋＤａタンパク質濃縮器を使用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で脱塩した。
【0123】
アクチン集合体誘導タンパク質：ＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴの精製を、追加のＧＳＴタグ精製工程を除いて、ＧＦＰ－ＬＬＯのそれと同様の方法で行った（図１９）。ＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴを発現する大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するＬＢブロス中に接種し、撹拌下３０℃で一晩インキュベートした。これを、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有する５００ｍＬのＴＢ（２％ｖ／ｖ）中に接種した。フラスコを、０．５のＯＤ６００ｎｍに達するまで、振盪しながら３０℃でインキュベートした。細胞を、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、２６℃で１８時間撹拌しながら発現させた。細胞を、６１６４×ｇ、１０℃で２０分間の遠心分離を介して収集し、前述のように溶解させた。全ての引き続く精製工程は、ＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴの分解を低下させるために、氷上で行った。ＩＭＡＣを介したタンパク質単離の前に、Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰ Ｎｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓタグカラムを、プロテアーゼ阻害剤を補った２０ｍＭイミダゾール（ＳＢ２０）を含有するＳＢで平衡化し、その後上清を適用した。カラムを、２回、まずプロテアーゼ阻害剤を含有するＳＢ２０で、その後２０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ２０）で洗浄し、ＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴを１２５ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳで溶出させた。溶出液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１：１に希釈し、５ｍＭの最終濃度でジチオスレイトール（ＤＴＴ）を補った。希釈した溶出液を、グルタチオンアガロース（２ｍＬ）を詰めたカラムに適用し、１時間循環させて、ＧＳＴタグ付きタンパク質を適切に結合させた。カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、結合したＧＦＰ－ＡｃｔＡ－ＧＳＴを、１０ｍＭの還元型グルタチオンを含有するＰＢＳ（ｐＨ８）で溶出させた。
【0124】
ＧＦＰからのＡｃｔＡ－ＧＳＴの遊離は、ＷＥＬＱｕｔ切断で達成した（図１９）。ＧＳＴタグ精製溶出液を、１ミリリットルの溶出液あたり１０Ｕ ＷＥＬＱｕｔプロテアーゼで切断し、８℃で１６時間インキュベートした。切断後、イミダゾールを１０ｍＭで添加し、１０ｍＭイミダゾールで予め平衡化したＨｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰ Ｎｉ－ＮＴＡカラムに適用した。遊離したＡｃｔＡ－ＧＳＴフロースルーを、収集し、１０ｋＤａタンパク質濃縮器を使用して４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＫＣｌ；ｐＨ７．５）中で脱塩し、タンパク質収量を、決定した。サンプルを、実施例１および２において説明したように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析のために、精製および切断反応全体にわたって収集した。
【0125】
上記の実施例３において説明した方法を使用して、本発明者らは、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）を、従来技術において報告されたものより１５倍（５１ｍｇ／Ｌ対３．４～８ｍｇ／Ｌ）多い収量で発現させた。最適化されていない条件（１Ｌの培地）を使用して、本発明者らは、純粋なＬＬＯを製造することができた。さらに、その蛍光パートナーに融合したＬＬＯがいまだ活性を有することが示された。該方法の多用途性、およびそれを他のペプチドについての最適化についていかに素早く使用することができるかをさらに実証するために、本発明の発明者らは、本明細書において説明する方法を使用して、分解しやすい別の細菌毒素ＡｃｔＡを製造した（図１９）。具体的には、本発明の発明者らは、目的のタンパク質が分解されていることを蛍光融合パートナーの蛍光をモニタリングすることによって素早く評価することができ、この観察に基づいて、純粋な生成物を得るために二重精製セットアップを履行することによって分解を防ぐことができた。
【0126】
実施例４
大腸菌における溶解タンパク質の発現
本発明者らは、ラムダファージから２つの高活性溶解タンパク質、すなわちＧｐＲ（配列番号１５）およびＧｐＥ（配列番号１７）を同定した。概念の実証のために、ＧｐＲを使用して、大腸菌の溶解を誘導するＧｐＲの能力を決定した。ｇｐＲ遺伝子（エンドリシンＲ－ＮＰ＿０４０６４５．１）を、ＧｐＲ－ＦおよびＧｐＲ－Ｒプライマー（配列番号７０および７１）を使用してラムダファージからＰＣＲ増幅させた。ｇｐＥ遺伝子（リゾチームムレインヒドロラーゼ－ＹＰ＿００２８５４０８４．１）を、ＧｐＥ－ＦおよびＧｐＥ－Ｒプライマー（配列番号７２および７３）を使用してＴ４ファージからＰＣＲ増幅させた。増幅産物を、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩを使用してｐＲＳＦＧＦＰの第２のマルチクローニングサイト中にクローニングして、ｐＲＳＦＧＦＰＧｐＲを得、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩを使用してｐＲＳＦＧＦＰＧｐＥを得た。
大腸菌における溶解タンパク質の発現
本発明者らは、ラムダファージから２つの高活性溶解タンパク質、すなわちＧｐＲ（配列番号１５）およびＧｐＥ（配列番号１７）を同定した。概念の実証のために、ＧｐＲを使用して、大腸菌の溶解を誘導するＧｐＲの能力を決定した。ｇｐＲ遺伝子（エンドリシンＲ－ＮＰ＿０４０６４５．１）を、ＧｐＲ－ＦおよびＧｐＲ－Ｒプライマー（配列番号７０および７１）を使用してラムダファージからＰＣＲ増幅させた。ｇｐＥ遺伝子（リゾチームムレインヒドロラーゼ－ＹＰ＿００２８５４０８４．１）を、ＧｐＥ－ＦおよびＧｐＥ－Ｒプライマー（配列番号７２および７３）を使用してＴ４ファージからＰＣＲ増幅させた。増幅産物を、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩを使用してｐＲＳＦＧＦＰの第２のマルチクローニングサイト中にクローニングして、ｐＲＳＦＧＦＰＧｐＲを得、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩを使用してｐＲＳＦＧＦＰＧｐＥを得た。
【0127】
【表6】
【0128】
実施例５
ＲＮＡサーモメータを使用した溶解タンパク質発現の制御についての概念の実証
大腸菌細胞におけるＧｐＲの代謝負荷を低下させるためのＲＮＡサーモメータの使用についての概念の実証を例示するために、本発明者らは、組換えＨｉｓタグ付きＧＦＰの製造についてＲＮＡサーモメータＵ７Ｔａｐ（配列番号１９）を利用した。ｐＲＳＦ－Ｄｕｅｔ１を、ｐＴＡＰ（ＲＮＡサーモメータバックボーンベクター）の生成のためのバックボーンプラスミドとして使用した。選択したＲＮＡサーモメータは、より低い温度では遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらし、より高い温度では増加した翻訳をもたらす。ＧｐＲを、ＢｇｌＩＩ－ＸｈｏＩを使用してｐＲＳＦＧＦＰＧｐＲから消化し、自己溶解素をＰ７プロモーターおよび含まれるＲＮＡサーモメータの制御下に置く、新たに生成したｐＴＡＰ（配列番号３６）プラスミド中にＢｇｌＩＩ－ＸｈｏＩ部位上でクローニングした。ライゲーションおよび形質転換後、細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補ったＢＨＩ寒天上にプレーティングした。陽性クローンを、同定し、さらなる検証のために使用した。
ＲＮＡサーモメータを使用した溶解タンパク質発現の制御についての概念の実証
大腸菌細胞におけるＧｐＲの代謝負荷を低下させるためのＲＮＡサーモメータの使用についての概念の実証を例示するために、本発明者らは、組換えＨｉｓタグ付きＧＦＰの製造についてＲＮＡサーモメータＵ７Ｔａｐ（配列番号１９）を利用した。ｐＲＳＦ－Ｄｕｅｔ１を、ｐＴＡＰ（ＲＮＡサーモメータバックボーンベクター）の生成のためのバックボーンプラスミドとして使用した。選択したＲＮＡサーモメータは、より低い温度では遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらし、より高い温度では増加した翻訳をもたらす。ＧｐＲを、ＢｇｌＩＩ－ＸｈｏＩを使用してｐＲＳＦＧＦＰＧｐＲから消化し、自己溶解素をＰ７プロモーターおよび含まれるＲＮＡサーモメータの制御下に置く、新たに生成したｐＴＡＰ（配列番号３６）プラスミド中にＢｇｌＩＩ－ＸｈｏＩ部位上でクローニングした。ライゲーションおよび形質転換後、細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補ったＢＨＩ寒天上にプレーティングした。陽性クローンを、同定し、さらなる検証のために使用した。
【0129】
概念の実証のために、ｐＲＳＦＧＦＰ（ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰ）；ｐＲＳＦＧＦＰＧｐＲ（ＧＦＰＧＰＲ）およびｐＴＡＰＧＦＰＧｐＲ（ＧＦＰＲＴＧＰＲ）を保有する細胞、全てのこれらのコンストラクトは、ＧＦＰＧＰＲおよびＧＦＰＲＴＧＰＲについて示した溶解タンパク質に加えて、組換えＨｉｓタグ付きＧＦＰを発現するであろう。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補ったＢＨＩブロス中に接種し、通気下で２６℃で１８時間インキュベートした。この培養物を次いで使用して、カナマイシンを補った２００ｍＬのｔｅｒｉｆｆｉｃブロスに接種し、通気下、２６℃でインキュベートした。ＯＤ６００ｎｍの読取値が０．１～０．２に達したとき、細胞を、１８℃に移動し、０．５５～０．６のＯＤに達するまでインキュベートした。細胞を引き続き、０．１２５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、１８℃で１２時間インキュベートした。インキュベーション後、異なるベクターを保有するそれぞれの培養物を、それぞれ２つのフラスコ中に分割し、これらを、それぞれ、２６℃および３７℃でインキュベートした。サンプルを、３時間、６時間、９時間の時点で収集し、さらなる使用まで８℃で置いた。各時点で、細胞を１／１０に希釈し、ＯＤ読取値を５９５ｎｍで取得して、細胞密度を決定した。９時間の時点で、サンプルを遠心分離し、ペレットを－２０℃で少なくとも１時間凍結させた。サンプル（それぞれ４００μＬ）を室温で融解させ、その後、ＳＢ緩衝液（表７）および１％ＳＤＳを補ったＳＢを、元の体積の半分（２００μＬ）に添加し、時折混合しながら３７℃で１～２時間独自にインキュベートした。インキュベーション後、ＯＤ読取値を５９５ｎｍで取得して、細胞溶解の程度を決定した。９時間インキュベートしたサンプルから得ることができたＨｉｓタグ付きＧＦＰの量を、固定化金属イオンクロマトグラフィーを使用して評価した。２ｍＬの各それぞれのサンプル（異なる温度およびコンストラクトサンプル）を遠心分離し、ペレットを－２０℃で少なくとも１時間凍結させた。サンプルを室温で融解させ、１ｍＬの緩衝液を添加した（ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰについては溶解緩衝液並びにＧＦＰＧＰＲおよびＧＦＰＲＴＧＰＲについては１％ＳＤＳを補ったＳＢ緩衝液）。全ての場合において、緩衝液にＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅを補い、時折混合しながら３７℃で１～２時間インキュベートした。ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰコンストラクトを含有するサンプルを、上述のように１％ＳＤＳを補ったＳＢ緩衝液を使用して溶解したＧＦＰＧＰＲおよびＧＦＰＲＴＧＰＲを用いて、実施例１において説明した標準的な手順に従って溶解させた。溶解後、サンプルを１２０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞破片および非溶解細胞をペレット化した。サンプルの上清を除去し、イミダゾールを５ｍＭおよび６００μＬの最終濃度まで添加し、引き続きＨｉｓＰｕｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）スピンカラムに添加して、Ｈｉｓタグ付きＧＦＰを結合させた。スピンカラムを、５ｍＭイミダゾールを補ったＳＢ緩衝液で３回洗浄した。最後に、ＧＦＰを、５００ｍＭイミダゾールを補った６００μＬ ＳＢ緩衝液で溶出させた。これらのサンプルを引き続き、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために使用した。
【0130】
ＲＮＡサーモメータ（ＧＦＰＲＴＧＰＲ）の包含は、ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰまたはＧＦＰＧＰＲコンストラクトのいずれかを保有する細胞と比較して、一貫してより高い光学密度読取値をもたらした（図２０）。さらに、ＧＦＰＧＰＲコンストラクトにおけるＲＮＡサーモメータの欠如は、一貫して、高い代謝負荷および潜在的な毒性を示す、より低い光学密度読取値をもたらした（図２０）。
【0131】
顕著な溶解が、細胞を２６℃で増殖させたかまたは３７℃で増殖させたかに関係なく、ＲＮＡサーモメータのないコンストラクトについて観察された（図２１）。しかしながら、ＧＦＰＲＴＧＰＲコンストラクトにおけるＲＮＡサーモメータの包含は、ＳＢ緩衝液中に再懸濁させたとき、３７℃と比較して２６℃で約２倍少ない溶解をもたらし、これは、細胞を２６℃で増殖させたときのＧｐＲ発現の首尾よくいった制限（ｔｈｒｏｔｔｌｉｎｇ）を示す（図２１）。ＧＦＰＧＰＲまたはＧＦＰＲＴＧＰＲコンストラクトを有する細胞のいずれかへの１％ＳＤＳの添加は、細胞の完全な溶解をもたらした（図２１）。これは、選択したＲＮＡサーモメータが、２６℃で発現を制限すること（ｔｈｒｏｔｔｌｉｎｇ）ができたが、この温度ではＧｐＲの翻訳を完全には阻害しないことを示す。これはまた、選択した自己溶解タンパク質の潜在力も示す。ただＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰコンストラクトを保有する細胞もまた、凍結融解およびＳＤＳの添加によって影響を受けたが、ＧＦＰＧＰＲまたはＧＦＰＲＴＧＰＲのいずれかを保有する細胞と同じ程度ではなかった。
【0132】
標準的な溶解プロトコルを使用した細胞の溶解は、不完全な溶解をもたらした。ＧＦＰＧＰＲおよびＧＦＰＲＴＧＰＲサンプルは両方とも、１％ＳＤＳの添加で完全な溶解を示し、細胞の不完全な溶解は何ら観察されなかった。ＲＮＡサーモメータの欠如は、ＧＦＰの実質的に低下した量をもたらし、これは、ＧＦＰのより低い発現を示した（図２２）。しかしながら、ＲＮＡサーモメータの添加は、ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰおよびＧＦＰＧＰＲコンストラクトの両方と比較して、より多くの組換えＧＦＰをもたらした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した分析は、温度およびＲＮＡサーモメータの添加が、得ることができるＧＦＰの量に影響を有することを示した（図２２）。全ての場合において、３７℃での細胞のインキュベーションは、低下したＧＦＰをもたらしたが、この温度でのＧＦＰの安定性に起因し得る。ＲＮＡサーモメータの包含は、ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰと比較して４倍までのおよび２．８倍より多いＧＦＰをもたらした（細胞を、それぞれ、２６℃または３７℃で増殖させたとき）。ＧＦＰＧＰＲサンプルと比較して、ＲＮＡサーモメータの包含は、ＧＦＰの量における３０倍および１１倍の増加をもたらした（細胞を、それぞれ、２６℃または３７℃で増殖させたとき）。
【0133】
実施例５において、本発明者らは、ＲＮＡサーモメータの包含が、ｉ）対照（ＣＯＮＴＲＯＬＧＦＰ）およびＲＮＡサーモメータを欠くＧＦＰＧＰＲコンストラクトから得ることができるものと比較して、Ｈｉｓタグ精製後の組換えＧＦＰの増加した収量、およびｉｉ）より高い温度での細胞の増加した溶解をもたらすことを例示した。ＲＮＡサーモメータの包含はまた、ＲＮＡサーモメータを欠くＧＦＰＧＰＲコンストラクトと比較したとき、組換えＨｉｓタグ付きＧＦＰの適切な発現並びに細胞の適切な増殖について不可欠であることも示された。異なる温度感受性を有するＲＮＡサーモメータを含めて、標準的な誘導または自己誘導制御に加えて、溶解タンパク質発現のストリンジェンシー、並びに制御された発現を必要とするであろう他の組換えタンパク質を変更することができる。
【0134】
実施例６
大腸菌におけるＧＦＰ融合およびｍＣｈｅｒｒｙ融合オートファジーペプチドＴＡＴＢｅｃｌｉｎの製造
上記の実施例１～５において記載した方法を使用して、本発明者らは、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの両方に融合したオートファジーペプチドＴＡＴＢｅｃｌｉｎを製造した（図２３）。このペプチドは、蛍光融合パートナーに付着している間でさえ生物活性があった、そして、これは、視覚化および追跡能力の観点から機能性を添加する。
大腸菌におけるＧＦＰ融合およびｍＣｈｅｒｒｙ融合オートファジーペプチドＴＡＴＢｅｃｌｉｎの製造
上記の実施例１～５において記載した方法を使用して、本発明者らは、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの両方に融合したオートファジーペプチドＴＡＴＢｅｃｌｉｎを製造した（図２３）。このペプチドは、蛍光融合パートナーに付着している間でさえ生物活性があった、そして、これは、視覚化および追跡能力の観点から機能性を添加する。
【0135】
ここでの目標は、それがＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙのいずれかに融合することができるようにＴＡＴ－Ｂｅｃｌｉｎコンストラクトを再構築することであった。ＧＦＰの場合においては、ＴＡＴＢｅｃｌｉｎ（３２．９６ｋＤａ）を、ＧＦＰとＴＡＴＢｅｃｌｉｎとの間のプロテアーゼ部位（ＷＥＬＱｕｔ）を用いてＧＦＰのＣ末端に融合させる。ｍＣｈｅｒｒｙについては、ＴＡＴＢｅｃｌｉｎを、Ｎ末端Ｈｉｓタグ付けし、ｍＣｈｅｒｒｙにそのＣ末端で（３４．３７ｋＤａ）融合させる。
【0136】
ＴＡＴＢｅｃｌｉｎは、中央に相同性を有する２つの長いプライマー（配列番号７４および７５）を使用することによって合成した。このコンストラクトを使用して、ＧＦＰ－ＴＡＴＢｅｃｌｉｎ（ＧＦＰＴＡＴＢ）（配列番号７６および７７）を生成した。
【0137】
これら２つのプライマーを、新鮮な１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で１００ｕＭストックに作り上げた。Ｋｌｅｎｏｗ（ＮＥＢ）を使用して、ヌクレオチド中で構築し、ＴａｔＢｅｃＦおよびＴａｔＢｅｃＲ（配列番号７４および７５）を融合させた。緩衝液Ｍ（１０×、Ｒｏｃｈｅ）、プライマーストック（それぞれ１ｕＬ；それぞれ２．２ｕｇに等しい）およびＫｌｅｎｏｗ（３ｕＬ）を使用して５０ｕＬの反応混合物を、作り上げ、３７Ｃで１時間インキュベートした。この後、反応物を、ＰＣＲ精製キットを使用して、精製し、濃縮した。精製した産物およびｐＲＳＦＧＦＰを、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）を用いて３７℃で一晩消化した。消化産物を、精製し、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）を使用して一緒にライゲーションした。結果として得られたライゲーション混合物を使用して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、これを引き続き、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補ったＬＢ寒天上にプレーティングし、目に見えるコロニーが形成されるまで３７℃でインキュベートした。コロニーを使用して、ＬＢブロスに接種し、通気下、３７℃で１８時間インキュベートした。プラスミド抽出を、一晩培養物に対して実施した。
【0138】
ＴＡＴＢｅｃｌｉｎのｍＣｈｅｒｒｙへの融合については、追加のプライマーを、必要とした（ＴＡＴＢｍＣｈｅｒｒｙ；配列番号７８および７９）。フォワードプライマーは、ＢａｍＨＩ部位（ＷＥＬＱｕｔプロテアーゼを有する）を有し、リバースプライマーは、ＮｏｔＩ部位を有する（表１）。ＴＡＴＢｅｃｌｉｎを、これらのプライマーを使用して、ｐＲＳＦ－ＧＦＰＴＡＴＢ（配列番号８０および８１）コンストラクトから増幅させた。結果として得られたＰＣＲ産物を、精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化した。同様に、Ｃ末端融合のためのｍＣｈｅｒｒｙを含有するプラスミドを、同じ制限酵素で消化した。消化したＴＡＴ－Ｂｅｃｌｉｎおよびプラスミドを、前述のように、精製し、ライゲーションし、形質転換した。
【0139】
ＴＡＴＢｅｃｌｉｎ融合体を、実施例１～２において説明したように、発現させ、精製した。溶出液を、それぞれ２０ｋＤａ透析カセット（２０ｋＤａカットオフ）または１０ｋＤａタンパク質濃縮器（１０ｋＤａカットオフ）を使用して、ＧＦＰＴＡＴＢｅｃｌｉｎおよびＴＡＴｍＣｈｅｒｒｙについて２５０ｍＭまたは１５０ｍＭＮａＣｌを有するＰＢＳ緩衝液に対して脱塩した。
【0140】
両方の融合体は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して、首尾よく発現させ、精製した。ＩＭＡＣ精製し、脱塩したサンプルの予備的な総タンパク質収量は、ＧＦＰＴＡＴＢについて１１３．８ｍｇ／Ｌ、およびＴＡＴＢｍＣｈｅｒｒｙについて４１．７ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ ＰＡＧＥによって決定したサンプルの相対純度は、ＧＦＰＴＡＴＢについて７０～８２％、ＴＡＴＢｍＣｈｅｒｒｙについて４８～５０％の範囲であった（図２３）。これらの収量および純度は、プロセスの最適化並びに特殊な菌株および技術の使用によってさらに増加させることができる。
【0141】
【表7】
【0142】
実施例７
追加のＲＮＡサーモメータの設計および定常期プロモーターの使用
概念の実証をさらに改善するために、さまざまなＲＮＡサーモメータ（ＲＮＡＴ）を、定常期プロモーターと組み合わせて使用することができる。ＲＮＡＴの例は、配列番号１９～２７および配列番号１０５～１１１を含み、プロモーターは、配列番号７４～７６を含んだ。これを例示するために、配列番号８１（Ｇ５）、配列番号８４（Ｇ８）、配列番号９１（Ｇ１５）、配列番号９３（Ｇ１７）および配列番号９４（Ｇ１８）のＲＮＡＴ／プロモーターの組合せを、予備的な例示のために使用した。異なるプロモーター／ＲＮＡＴの組合せを、制限酵素ＫａｓＩおよびＢａｍＨＩを使用して、ベクターｐＨＸｋ（配列番号１０１）中にクローニングした。ベクターｐＨＸｋは、カナマイシン耐性遺伝子、ＬａｃＩｑ（ｌａｃリプレッサー）遺伝子、ｐＵＣ１９複製起点並びにそれら自身のＴ７プロモーターおよびＬａｃＯオペレーター、その後の、それぞれ、転写停止配列Ｌ３Ｓ２Ｐ５６およびＢＢａ００１５を有する２つのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含むように設計した（ＭＣＳ１についての制限酵素部位－ＰａｃＩ、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨｉ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ ＭｆｅＩ；ＭＣＳ２－ＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ）。第２のベクターを、カナマイシンの代わりにクロラムフェニコール耐性マーカーを有する同じバックボーンプラスミドを使用して、設計した（配列番号１０２）。それらのそれぞれのプロモーター／オペレーターと開始コドンとの間の配列における変更、およびマルチクローニングサイトにおける違い（ＭＣＳ１は、ＢＢａ００１５転写ターミネーターを有し、ＭＣＳ２は、Ｔ７ターミネーターを有する）を有する、追加の２つのベクターを、上記と同じ基本ベクター配列を使用して、設計した（配列番号１０３～１０４）。引き続き、溶解タンパク質ＧＰＲを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを使用して、これらの新しいベクター中にクローニングした。これらの新しいベクターを次いで、大腸菌ＢＬ２１を形質転換するために使用し、予備的な評価のために使用した。
追加のＲＮＡサーモメータの設計および定常期プロモーターの使用
概念の実証をさらに改善するために、さまざまなＲＮＡサーモメータ（ＲＮＡＴ）を、定常期プロモーターと組み合わせて使用することができる。ＲＮＡＴの例は、配列番号１９～２７および配列番号１０５～１１１を含み、プロモーターは、配列番号７４～７６を含んだ。これを例示するために、配列番号８１（Ｇ５）、配列番号８４（Ｇ８）、配列番号９１（Ｇ１５）、配列番号９３（Ｇ１７）および配列番号９４（Ｇ１８）のＲＮＡＴ／プロモーターの組合せを、予備的な例示のために使用した。異なるプロモーター／ＲＮＡＴの組合せを、制限酵素ＫａｓＩおよびＢａｍＨＩを使用して、ベクターｐＨＸｋ（配列番号１０１）中にクローニングした。ベクターｐＨＸｋは、カナマイシン耐性遺伝子、ＬａｃＩｑ（ｌａｃリプレッサー）遺伝子、ｐＵＣ１９複製起点並びにそれら自身のＴ７プロモーターおよびＬａｃＯオペレーター、その後の、それぞれ、転写停止配列Ｌ３Ｓ２Ｐ５６およびＢＢａ００１５を有する２つのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含むように設計した（ＭＣＳ１についての制限酵素部位－ＰａｃＩ、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨｉ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ ＭｆｅＩ；ＭＣＳ２－ＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ）。第２のベクターを、カナマイシンの代わりにクロラムフェニコール耐性マーカーを有する同じバックボーンプラスミドを使用して、設計した（配列番号１０２）。それらのそれぞれのプロモーター／オペレーターと開始コドンとの間の配列における変更、およびマルチクローニングサイトにおける違い（ＭＣＳ１は、ＢＢａ００１５転写ターミネーターを有し、ＭＣＳ２は、Ｔ７ターミネーターを有する）を有する、追加の２つのベクターを、上記と同じ基本ベクター配列を使用して、設計した（配列番号１０３～１０４）。引き続き、溶解タンパク質ＧＰＲを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを使用して、これらの新しいベクター中にクローニングした。これらの新しいベクターを次いで、大腸菌ＢＬ２１を形質転換するために使用し、予備的な評価のために使用した。
【0143】
さまざまな大腸菌ＢＬ２１コンストラクトを使用した実験を、発現条件をシミュレートするために実施した。培養物を、５ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補った）に接種し、２６℃で一晩増殖させた。一晩培養物を引き続き使用して、１％ｖ／ｖで１５０ｍＬのＬＢブロスに接種し、培養物が０．６～０．８の間のＯＤ６００に達するまで２６℃でインキュベートした。引き続き、各培養物の５０ｍＬを、フラスコ中に分割し、２６℃または３７℃のいずれかで増殖させた。読取値を、２時間ごとに１２時間取得した。１５時間（総インキュベーション時間）後、細胞を、さらなる１１時間（合計２６時間）インキュベートした。２６時間後、２６℃で増殖させた全ての残りのサンプルを、移動させ、３７℃でさらなる５時間インキュベートした。
【0144】
全ての光学密度読取値を、キュベットおよびＳｍａｒｔＳＰｅｃ Ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して取得した。必要に応じて、サンプルを、ＯＤ６００値を１．０未満に保つためにＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中で希釈した。
【0145】
選択した時点で、１ｍＬの培養物を、採取し、８０００ｒｐｍで（２分間）遠心分離し、ペレットを－２０℃で少なくとも２時間凍結させた。凍結後、細胞ペレットを、室温で融解し、１ｍＬ溶解緩衝液（２５Ｕ／ｍＬ ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｕｃｌｅａｓｅを補ったＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４））中に再懸濁した。室温で５分間のインキュベート後、光学密度読取値を、上記のように取得した（上記のように必要に応じて希釈を行った）。
【0146】
溶解％を計算するために、各再懸濁した凍結融解ペレットから得られた光学密度読取値（ＯＤＦｒｅｅｚｅ）を、凍結前の元の培養物の光学密度読取値（ＯＤＯｒｉｇｉｎａｌ）で割った（式１）。
【0147】
式１：溶解％＝（１－ＯＤＦｒｅｅｚｅ／ＯＤＯｒｉｇｉｎａｌ）×１００
【0148】
２６℃で増殖させた大腸菌Ｂ２１プロモーター／ＲＮＡＴコンストラクトは、３時間で０．６～０．８のＯＤ６００に達し、３７℃でのコンストラクトの引き続く増殖は、２６℃で１５時間まで増殖させたものと比較して増加した光学密度値をもたらした（図２４および２５）。２６℃および３７℃で増殖させた細胞の２６時間時の光学密度値は、同様のＯＤ６００値を有していた。２６℃で増殖させ、さらなる５時間３７℃に移した細胞は、ＯＤ６００値におけるわずかな増加を示し、サンプルＧ５が最大の変化を示した。全体として、全てのコンストラクトが、平均７．２５（＋／－０．２２）の高いＯＤ６００に達し、１５時間後に初期定常期が達成された（図２４および２５）。
【0149】
サンプル（１ｍＬ）を、７、９、１１、１３、１５、２６および＋５（３１）時間のスピンダウンで収集し、－２０℃で凍結させた。これらのサンプルを次いで、溶解緩衝液中に再懸濁して、各培養物の元のＯＤ６００値の関数として溶解率を決定した（式１）。溶解は、２６℃で増殖させたサンプルについては一貫してより弱く、初期の時点でより多くの溶解が観察された（図２６～３２）。これは、最もおそらくは、基礎のＧＰＲ発現、および凍結融解サイクル後の膜損傷に対する若い細胞の増加した感受性のためである。サンプルＧ５、Ｇ８およびＧ１８は、１５時間まで＞９０％の溶解を示す、３７℃で増殖させた細胞との溶解における明らかな違いを示した（図２６～２７、２８、２９、３２）。２６時間の増殖後、溶解は、２６℃および３７℃で増殖させたサンプルについて減少し、最もおそらくは、凍結融解からの損傷に対してより耐性であるより古い細胞のより厚い細胞壁のためである。２６℃および３７℃で増殖させたサンプルの溶解の間の最大の違いはしかしながら、この遅い時点で観察され、３７℃で増殖させたサンプルは２６℃で増殖させたもの（１４～７４％）と比較してより多くの溶解（７０～８５％）を有した（図２６～３２）。このより遅い時点で、サンプルＧ５、Ｇ８およびＧ１８は、２６℃または３７℃で増殖させたサンプル間で溶解における最大の違いを有した（図２６～２７、２８、２９、３２）。事前に２６℃でインキュベートして増殖させた細胞を３７℃に移した後（さらなる５時間）、３７℃で増殖させたものと一致する溶解における増加が観察されたが－これは、ＧＰＲ溶解遺伝子の増加した発現／翻訳を示し、ＲＮＡＴの機能と一致する。
【0150】
これらの結果から、定常期プロモーターを有するＲＮＡＴの使用は、細胞を低温（２６℃）または高温（３７℃）のいずれかで増殖させたときに異なる溶解効率をもたらす。さらに、これらの予備的な結果は、後期定常期での細胞の低温から高温へのシフトが増加した溶解効率もたらし得ることを示す。該結果はまた、異なるＲＮＡＴが、より低い温度での溶解の発現／翻訳を制限する（ｔｈｒｏｔｔｌｅ）それらの能力の観点で異なる効率を有することを例示する。これは、特定のニーズ／用途に依存したＲＮＡＴの選択を可能にする。
【0151】
纏めると、これらの結果はさらに、組換え大腸菌細胞の溶解についてのＲＮＡＴ／定常期プロモーターの組合せの用途を例示する。
【0152】
【表8】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【配列表】
【国際調査報告】