特表2023-547274マイクロＲＮＡ－２９の化合物、組成物、および治療法における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-09
(54)【発明の名称】マイクロＲＮＡ－２９の化合物、組成物、および治療法における使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20231101BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231101BHJP
A61P 19/04 20060101ALI20231101BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20231101BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20231101BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61P43/00 105
A61P19/04
A61K31/7105
A61K9/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023549131
(86)(22)【出願日】2021-10-25
(85)【翻訳文提出日】2023-06-16
(86)【国際出願番号】 EP2021079580
(87)【国際公開番号】W WO2022084561
(87)【国際公開日】2022-04-28
(31)【優先権主張番号】2016863.9
(32)【優先日】2020-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523150565
【氏名又は名称】コーズウェイ セラピューティクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ギルクライスト，デレク スチュワート
(72)【発明者】
【氏名】ミラー，ニール リンジィ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB11
4C076CC09
4C076CC26
4C076FF12
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA17
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA96
4C086ZB21
(57)【要約】
本発明は、新規マイクロＲＮＡ－２９（ｍｉＲ－２９）化合物、それを含む組成物、および治療法におけるそれらの使用に関する。特に、腱障害を含む腱損傷、ならびにペイロニー病およびデュピュイトラン病を含む組織線維症などの、局所的コラーゲン調節不全を伴う疾患の治療において特に有効かつ安全であるｍｉＲ－２９化合物および組成物が、本明細書で提供される。また、ｍｉＲ－２９化合物の有利な投与量および治療レジメンも提供される。
【選択図】図２０
【選択図】図２０
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）核酸塩基配列５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’（配列番号１）、または配列５’－ＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号８）の外側の３つ以下の位置において配列番号１と異なる核酸塩基配列を含むガイド鎖であって、少なくとも５０％のヌクレオシドが、２’－フルオロリボースを含みかつ３’末端での１つまたは２つのヌクレオシドがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルリボースを含む、ガイド鎖と；（ｂ）核酸塩基配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２）もしくは５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡ－３’（配列番号３）を含む、または３つ以下の位置において配列番号２と異なる核酸塩基配列を含む、パッセンジャー鎖であって、少なくとも１０の連続したヌクレオシドが交互に、２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび修飾されないリボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖、
を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項2】
前記ガイド鎖の前記３’末端における１つまたは２つのヌクレオシドがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルリボースを含みかつ：（ｉ）２’－修飾リボースを含む前記ガイド鎖の残りのヌクレオシドがそれぞれ、２’－フルオロリボースヌクレオシドである、または（ｉｉ）前記ガイド鎖の残りのヌクレオシドがそれぞれ、２’－フルオロリボースヌクレオシドまたは未修飾リボース部分である、請求項１に記載のｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項3】
（ｉ）前記ガイド鎖の各ヌクレオシドが、２’－修飾リボースを含む、（ｉｉ）前記ガイド鎖の各ヌクレオシドが、２’－Ｏ－メチルリボースまたは２’－フルオロリボースを含む、または（ｉｉｉ）前記ガイド鎖の前記３’末端における１つもしくは２つのヌクレオシドがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルリボースを含みかつ前記ガイド鎖の残りのヌクレオシドが、それぞれ２’－フルオロリボースヌクレオシドである、請求項１に記載のｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項4】
前記ガイド鎖および／または前記パッセンジャー鎖のヌクレオシド間連結のすべてが、ホスホジエステルヌクレオシド間連結である、先行請求項のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２９化合物または塩。
【請求項5】
前記ガイド鎖の前記核酸塩基配列が、配列番号１で定義されるとおりであり、かつ／または前記パッセンジャー鎖の前記核酸塩基配列が、配列番号２もしくは配列番号３で定義されるとおりである、先行請求項のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２９化合物または塩。
【請求項6】
前記ガイド鎖が、５’－ｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’であり、かつ／または前記パッセンジャーが、５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡ－３’である、先行請求項のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２９化合物または塩。
【請求項7】
前記パッセンジャー鎖の前記３’末端に共有結合により付着したコレステロール部分をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２９化合物または塩。
【請求項8】
先行請求項のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２９化合物またはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項9】
治療法における使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２９化合物もしくは塩、または請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
腱損傷または組織線維症の治療における使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２９化合物もしくは塩、または請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項11】
腱損傷、ペイロニー病、またはデュピュイトラン病の治療における使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のｍｉＲ－２９化合物もしくは塩、または請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項12】
対象における腱損傷の治療における使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩であって、前記治療が、前記対象の損傷された腱中への、前記ｍｉＲ－２９化合物の少なくとも４７μｇの用量、または同等用量のその塩の注射による単回投与を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項13】
対象におけるペイロニー病の治療における使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩であって、前記治療が、前記対象の白膜の患部中への、前記ｍｉＲ－２９化合物の少なくとも４７μｇの用量、または同等用量のその塩の注射による単回投与を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項14】
対象におけるデュピュイトラン病の治療における使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩であって、前記治療が、前記対象の手掌筋膜の患部中への、前記ｍｉＲ－２９化合物の少なくとも４７μｇの用量、または同等用量のその塩の注射による単回投与を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項15】
前記ｍｉＲ－２９化合物の用量が、少なくとも９５μｇ、少なくとも１９０μｇ、少なくとも４７５μｇ、少なくとも１４２０μｇ、少なくとも１９００μｇ、少なくとも４２７０μｇ、または同等用量のその塩である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項16】
前記ｍｉＲ－２９化合物の用量が、４７４０μｇ以下、または同等用量のその塩である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項17】
前記ｍｉＲ－２９化合物またはその塩が、滅菌水溶液の約１ｍｌの容量で投与される、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項18】
前記腱損傷が、腱障害である、請求項１２に記載の使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項19】
前記化合物またはその塩が、請求項１～７のいずれか一項に記載のとおりである、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【請求項20】
前記ｍｉＲ－２９化合物またはその塩のガイド鎖が、５’－ｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’であり、前記ｍｉＲ－２９化合物またはその塩のパッセンジャー鎖が、５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡ－３’でありかつ前記パッセンジャー鎖の３’末端に共有結合により付着されるコレステロール部分を含み、かつ前記コレステロール部分の重量を含む前記ｍｉＲ－２９化合物の用量が、５０μｇ～５０００μｇ、例えば２００μｇ、５００μｇ、１５００μｇまたは４５００μｇ、または同等用量のその塩である、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規マイクロＲＮＡ－２９（ｍｉＲ－２９）化合物、それを含む組成物、および治療法におけるそれらの使用に関する。特に、腱障害を含む腱損傷、ならびにペイロニー病およびデュピュイトラン病を含む組織線維症などの、局所的コラーゲン調節不全を伴う疾患の治療において特に有効かつ安全であるｍｉＲ－２９化合物および組成物が本明細書で提供される。また、ｍｉＲ－２９化合物の有利な投与量および治療レジメンも提供される。
【発明の概要】
【0002】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と連携して働いて相補的標的配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳を減少させるまたは防止する、小さい非コーディングＲＮＡである。
【0003】
ｍｉＲ－２９ファミリーのメンバーは、細胞外マトリックス、例えばコラーゲン、の転写後調節因子としての関与が示されている。コラーゲン合成の調節不全、特に１つ以上の種類のコラーゲンの過剰産生は、腱障害などの腱損傷、ペイロニー病およびデュピュイトラン病などの組織線維症などの、特定の疾患で見られる病理の一因である。
【0004】
発明者らによって以前に発表された研究（参考文献１、２、３）は、ｍｉＲ－２９が腱損傷におけるコラーゲン産生における主要な疾患経路を調節していることを確立した。例えば、健康な腱細胞では、ｍｉＲ－２９（例えば、ｍｉＲ－２９ａ、本明細書ではｍｉＲ２９ａとも呼ばれる）は、コラーゲン３（ｃｏｌ３）の過剰産生を抑制し、一方で腱疾患では、ｍｉＲ－２９レベルの低下およびｃｏｌ３の過剰産生があり、これは、さらなる損傷を受けやすい機械的に劣化された腱組織をもたらす。これらの研究において、本発明者らは、ｍｉＲ－２９ａ化合物による腱細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションがｃｏｌ３発現を顕著に減少させた一方で、ｃｏｌ１、すなわち腱における望ましい生体力学的に優れた形態のコラーゲン、のレベルはほとんど影響を受けないままであることを示した。本発明者らはまた、腱細胞中のｃｏｌ１転写産物の大部分は、別のポリアデニル化部位の利用によりｍｉＲ－２９に対する結合部位を欠いた一方で、腱細胞中のｃｏｌ３転写産物の大部分は、ｍｉＲ－２９結合部位を保持したことも示した。したがって、腱細胞中のＣｏｌ１転写産物は、ｍｉＲ－２９媒介下方制御に対して非感受性にされたが、ｍｉＲ－２９は、それらの細胞中でｃｏｌ３を特異的に抑制できた。これは、腱損傷のｉｎ ｖｉｖｏモデルで確認され、マウス（参考文献１、２）またはウマ（参考文献３）の損傷した腱へのｍｉＲ－２９ａ化合物の送達は、ｃｏｌ１レベルを維持しながら、ｃｏｌ３合成の減少をもたらしたことを示した。これまでの研究は、線維芽細胞において、ｍｉＲ－２９がｃｏｌ３のみでなくｃｏｌ１などの他のタイプのコラーゲンの発現も阻害することを示していた（例えば、参考文献４）。
【0005】
本発明は、治療法において特に有効でかつ安全な改善されたｍｉＲ－２９化合物を提供する。これらの化合物は、ｍｉＲ－２９（例えば、ｍｉＲ－２９ａ）の活性の増加を必要とするあらゆる状態の治療において有用である。これは、局所的コラーゲン調節不全を伴いかつコラーゲン３などの１つ以上のタイプのコラーゲンの発現の減少または阻害を必要とする状態を含み、これらに限定されないが、腱障害（例えば、テニス肘としても知られる外側上顆炎）を含む腱損傷、ならびにペイロニー病およびデュピュイトラン病などの組織線維症を含む。本明細書に記載の化合物は、天然のｍｉＲ－２９の活性を模倣し、一方で特定の化学修飾が、免疫原性の問題を引き起こすことなく、活性、安定性、および細胞取り込みの増加などの薬理学的特性の改善をもたらす。本明細書に記載の化合物および組成物のさらなる利点は、それらが単純な水性担体中で安定であり、かつ再構成または希釈を必要とすることなく、罹患部位に直接投与できることである。
【0006】
腱障害を含む腱損傷、ならびにペイロニー病およびデュピュイトラン病などの組織線維症などの疾患の治療におけるｍｉＲ－２９化合物の特に有利な投与量および治療レジメンもまた、本明細書で提供される。本発明者らは、損傷された腱へのｍｉＲ－２９化合物の局所（腱内）注射による投与が、例えば腱障害のマウスモデルにおいて、腱の治癒および腱線維の質を改善することを示した。驚くべきことに、治療的有効性は、１回の投与（すなわち、１回の用量）のみで達成できる。治療法（例えば、ヒトの治療法）に好適な投与量が、提供される。デュピュイトラン病およびペイロニー病などの組織線維症におけるｍｉＲ－２９化合物の治療的有効性を裏付けるデータもまた、入手可能である。ｍｉＲ－２９化合物は、単純な水性担体中で病変の部位にて局所的に（病巣内に）投与され得る。本明細書で提供されるデータは、局所病変内投与後の全身曝露または他の組織への分布が無視できるほどであり、それにより特に安全な治療法を提供することを示す。さらに、１回の投与が治療的に有効であり得るため、医療専門家への１回のみの訪問が必要とされ、それにより簡素でコスト効率が高く、迅速かつ有効な治療を可能にする。
【0007】
発明の開示
一態様では、本発明は、ｍｉＲ－２９化合物、それを含む組成物、および治療法におけるそれらの使用を提供する。したがって、本発明は、ガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖を含むｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供し、これらは、ネイティブｍｉＲ－２９ａの生物学的活性、例えばコラーゲン３発現の下方制御を模倣する。したがって、本発明の化合物は、コラーゲン３の発現を減少させるまたは阻害することができる。ｍｉＲ－２９ファミリー（ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ－１、ｍｉＲ－２９ｂ－２およびｍｉＲ－２９ｃ）の様々なメンバー間の生物学的活性は重複するため、本明細書で提供されるｍｉＲ－２９化合物は、他のｍｉＲ－２９ファミリーメンバーの生物学的活性を模倣することも可能である。したがって、ｍｉＲ－２９化合物は、ｍｉＲ－２９模倣体、またはｍｉＲ－２９模倣化合物とも呼ばれる。
一態様では、本発明は、ｍｉＲ－２９化合物、それを含む組成物、および治療法におけるそれらの使用を提供する。したがって、本発明は、ガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖を含むｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供し、これらは、ネイティブｍｉＲ－２９ａの生物学的活性、例えばコラーゲン３発現の下方制御を模倣する。したがって、本発明の化合物は、コラーゲン３の発現を減少させるまたは阻害することができる。ｍｉＲ－２９ファミリー（ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ－１、ｍｉＲ－２９ｂ－２およびｍｉＲ－２９ｃ）の様々なメンバー間の生物学的活性は重複するため、本明細書で提供されるｍｉＲ－２９化合物は、他のｍｉＲ－２９ファミリーメンバーの生物学的活性を模倣することも可能である。したがって、ｍｉＲ－２９化合物は、ｍｉＲ－２９模倣体、またはｍｉＲ－２９模倣化合物とも呼ばれる。
【0008】
ｍｉＲ－２９化合物のガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、オリゴヌクレオチドである。すなわち、それらはヌクレオシド間連結によって連結されたヌクレオシドを含む。ガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、典型的には、少なくとも１つの鎖中に多数のミスマッチおよびオーバーハングを含む二重鎖を形成する。本明細書に記載されるｍｉＲ－２９化合物は、典型的には化学修飾されており、これは、少なくとも１つの糖、ヌクレオシド間連結または核酸塩基が、天然に存在するｍｉＲ－２９中のものとは異なる化学構造を有することを意味する。化学修飾（複数可）は、例えばその活性および／または安定性を増強することにより、ｍｉＲ－２９化合物の薬理学的特性を改善するように選択できる。例示的な修飾糖は、２’－フルオロリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、または２’－デオキシリボースである。例示的な修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。例示的な修飾核酸塩基は、５－メチルシトシンである。ｍｉＲ－２９化合物は、典型的にはパッセンジャー鎖の３’末端において、コレステロール部分などの親油性部分にコンジュゲート（すなわち、共有結合により連結）されてもよい。親油性部分へのそのようなコンジュゲーションは、例えばその細胞取り込みを改善することによって、ｉｎ ｖｉｖｏ使用のためのｍｉＲ－２９化合物の特性を改善し得る。
【0009】
したがって、一実施形態では、本発明は、
（ａ）配列５’－ＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号８、シード配列である）の外側の５つ以下（または４つ以下、３つ、２つ、もしくは１つ）の位置で、および任意により、シード配列内の３つ以下（または２つ以下、または１つ）の位置において、５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’（配列番号１）とは異なる核酸塩基配列を含むガイド鎖であって、少なくとも１つのヌクレオシドは、２’－フルオロリボースを含み、任意により少なくとも１つのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルリボースを含む、ガイド鎖と；
（ｂ）５つ以下（または４つ以下、３つ、２つ、または１、例えば３つ以下）の位置において、５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２）とは異なる核酸塩基配列を含むパッセンジャー鎖であって、少なくとも１つのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルリボースを含み、少なくとも１つのヌクレオシドは、未修飾リボースを含む、パッセンジャー鎖、
を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供する。
（ａ）配列５’－ＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号８、シード配列である）の外側の５つ以下（または４つ以下、３つ、２つ、もしくは１つ）の位置で、および任意により、シード配列内の３つ以下（または２つ以下、または１つ）の位置において、５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’（配列番号１）とは異なる核酸塩基配列を含むガイド鎖であって、少なくとも１つのヌクレオシドは、２’－フルオロリボースを含み、任意により少なくとも１つのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルリボースを含む、ガイド鎖と；
（ｂ）５つ以下（または４つ以下、３つ、２つ、または１、例えば３つ以下）の位置において、５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２）とは異なる核酸塩基配列を含むパッセンジャー鎖であって、少なくとも１つのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルリボースを含み、少なくとも１つのヌクレオシドは、未修飾リボースを含む、パッセンジャー鎖、
を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供する。
【0010】
ある核酸塩基配列は、対応する位置に異なる核酸塩基、追加の核酸塩基、または欠落した核酸塩基が存在する場合、別の核酸塩基配列と「異なる」。ある数以下の位置で別の核酸塩基配列と異なる核酸塩基配列は、ゼロの位置で異なる核酸塩基配列も包含し、すなわち、核酸塩基配列は、同一であってよい。
【0011】
したがってガイド鎖の核酸塩基配列は、５つ以下の位置において、例えば、４つ以下の位置、３つ以下の位置、２つ以下の位置において、または１つ以下の位置において、好ましくは３つ以下の位置において、ネイティブｍｉＲ－２９ａ（ＡＧＣＡＣＣＡ，配列番号８）のシード配列の外側のネイティブｍｉＲ－２９ａ（配列番号１）の核酸塩基配列とは異なり得る。 一実施形態では、シード配列の外側のガイド鎖の核酸塩基配列は、配列番号１内の対応する位置と同一である。追加的にまたは代替的に、ｍｉＲ－２９化合物のガイド鎖のシード配列は、３つ以下の位置、例えば２つ以下の位置、または１つ以下の位置において、ネイティブｍｉＲ－２９ａのシード配列（ＡＧＣＡＣＣＡ、配列番号８）と異なり得る。好ましい実施形態では、シード配列は、配列番号８と同一である。
【0012】
パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、５つ以下の位置、例えば４つ以下の位置において、５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２）とは異なり得る。好ましい実施形態では、パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、３つ以下の位置において、配列番号２とは異なる。他の実施形態では、パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、２つ以下の位置において、配列番号２とは異なる。特定の実施形態では、パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、１つ以下の位置において、配列番号２とは異なる。これは、パッセンジャー鎖の核酸塩基配列が、配列番号２の配列、または配列番号２に対して１つの異なる、追加の、または欠落した核酸塩基を有する配列を有することを意味する。配列番号３は、配列番号２に対して欠落した核酸塩基を１つ有する。
【0013】
配列番号２および配列番号３は、１つの位置でのみ異なるため、上記のように、パッセンジャー鎖が５つ以下の位置などで配列番号３と異なる実施形態も、本明細書で提供される。
【0014】
ある実施形態では、パッセンジャー鎖は、上記配列番号２の下線で示す配列５’－ＵＵＵ－３’および／または５’－ＵＵＣＡ－３（これは、配列番号２の１０位～１２位および１８位～２１位に対応する）の外側の、５つ以下（例えば、４つ、３つ、２つまたは１つ以下、例えば３つ以下）の位置において、５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２）とは異なる核酸塩基配列を含む。ある実施形態では、パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、配列５’－ＵＵＵ－３’および５’－ＵＵＣＡ－３’の外側のみ配列番号２と異なる。例えば、パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、配列５’－ＵＵＵ－３’および５’－ＵＵＣＡ－３’の外側の２つ以下の位置において配列番号２と異なってもよい。特定の実施形態では、パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、配列５’－ＵＵＵ－３’および５’－ＵＵＣＡ－３’の外側の１つまたは２つ以下の位置、例えば、１つ以下の位置において配列番号２とは異なり得る。特定の実施形態では、そのようなパッセンジャー鎖は、本明細書に記載のフッ素化ガイド鎖（例えば、１つ以上の２’－フルオロリボヌクレオシドを含み、例えば、少なくとも５０％のヌクレオシドが、２’－フルオロリボヌクレオシドであり、または、好ましくは３’末端に位置する、１つまたは２つの２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドを除くすべてのヌクレオシドは、２’－フルオロリボヌクレオシドである）と組み合わされる。
【0015】
一実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１の核酸塩基配列の少なくとも７個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。例えば、ガイド鎖は、配列番号１の核酸塩基配列の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または少なくとも２１個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有してもよい。一実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１の核酸塩基配列の少なくとも１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。
【0016】
同じまたは他の実施形態において、パッセンジャー鎖は、配列番号２の核酸塩基配列の少なくとも７つの連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有してもよい。例えば、パッセンジャー鎖は、配列番号２の核酸塩基配列の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または少なくとも２１個の連続する核酸塩基を含む核酸塩基配列を有してもよい。一実施形態では、パッセンジャー鎖は、配列番号２の核酸塩基配列の少なくとも１８個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する。
【0017】
一実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１の全長にわたって少なくとも８５％同一である核酸塩基配列を含む。例えば、ガイド鎖は、配列番号１の全長にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である核酸塩基配列を含み得る。ある実施形態では、ガイド鎖は、前文で定義された核酸塩基配列を有し、それは、配列番号１の２～８位に対応する位置に配列５’－ＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号８）を含む。 それらの実施形態では、ガイド鎖の核酸塩基配列は、配列番号１の２位～８位の外側のみ配列番号１と異なり得る。差異は、上記のとおり、同一性パーセンテージまたは同一の／異なる核酸塩基の数によって定義され得る。
【0018】
同じまたは他の実施形態において、パッセンジャー鎖は、配列番号２または３の全長にわたって少なくとも８５％同一である核酸塩基配列を含み得る。例えば、パッセンジャー鎖は、配列番号２または３の全長にわたって少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である核酸塩基配列を含み得る。ある実施形態では、パッセンジャー鎖は、前文で定義された核酸塩基配列を有し、それは、配列番号２の１０位～１２位および１８位～２１位に対応する位置に、配列５’－ＵＵＵ３’および／または５’－ＵＵＣＡ－３’を含む。それらの実施形態では、パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、配列番号２の１０位～１２位および／または１８位～２１位の外側のみ配列番号２と異なり得る。特定の実施形態では、パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、配列番号２の１０位～１２位および１８位～２１位の外側のみ配列番号２と異なり得る。差異は、上記のとおり、同一性パーセンテージまたは同一の／異なる核酸塩基の数によって定義され得る。特定の実施形態では、そのようなパッセンジャー鎖は、本明細書に記載のフッ素化ガイド鎖（例えば、１つ以上の２’－フルオロリボヌクレオシドを含み、例えば、少なくとも５０％のヌクレオシドが、２’－フルオロリボヌクレオシドであり、またはここで、好ましくは３’末端に位置する、１つまたは２つの２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドを除くすべてのヌクレオシドは、２’－フルオロリボヌクレオシドである）と組み合わされる。
【0019】
さらなる実施形態では、ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖は、上記の核酸塩基配列から成り得る。特定の実施形態では、ガイド鎖は、核酸塩基配列５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’（配列番号１）を含むか、またはそれからなり、かつ／またはパッセンジャー鎖は、核酸塩基配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（または、配列番号２）または５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡ－３’（配列番号３）を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、ガイド鎖は、核酸塩基配列５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’（配列番号１）を含むか、またはそれからなり、かつ／またはパッセンジャー鎖は、核酸塩基配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡ－３’（配列番号３）を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、ガイド鎖は、核酸塩基配列５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’（配列番号１）を含み、かつパッセンジャー鎖は、核酸塩基配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡ－３’（配列番号３）を含む。特定の実施形態では、ガイド鎖は、核酸塩基配列５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’（配列番号１）からなり、かつパッセンジャー鎖は、核酸塩基配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡ－３’（配列番号３）からなる。これらの実施形態のいずれにおいても、「からなる」という用語は、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖に付着される他の（非ヌクレオシド）部分が存在することを排除するものではなく、例えば、パッセンジャー鎖は、例えばリンカーを介して、典型的にはパッセンジャー鎖の３’末端において、親油性部分、例えば、コレステロール部分に連結され得る。
【0020】
ある実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端における核酸塩基は、ＡまたはＧである。ある実施形態では、パッセンジャー鎖の３’末端における核酸塩基は、Ａである。
【0021】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、ガイド鎖の少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のヌクレオシドは、２’－フルオロリボースを含み得る。例えば、ガイド鎖の少なくともまたは約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個のヌクレオシドは、２’－フルオロリボースヌクレオシドである。ある実施形態では、ガイド鎖の２０個以下または２１個以下のヌクレオシドが、２’－フルオロリボースヌクレオシドである。
【0022】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、ガイド鎖の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または少なくとも９５％のヌクレオシドは、２’－フルオロリボースを含む。いくつかの実施形態では、ガイド鎖の少なくとも１つのヌクレオシドは、２’－フルオロリボース以外の糖（修飾された糖であってもよい）を含む。特定の実施形態では、ガイド鎖の少なくとも５０％（または少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または少なくとも９５％）のヌクレオシドは、２’－フルオロリボースを含み、ガイド鎖の少なくとも１つのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルリボースを含む。別の実施形態では、ガイド鎖の少なくとも５０％（または少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または少なくとも９５％）のヌクレオシドは、２’－フルオロリボースを含み、ガイド鎖の少なくとも２つのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルリボースを含む。例えば、ガイド鎖の１つまたは２つのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルリボースを含み得る。２’－Ｏ－メチルリボースを含むガイド鎖のヌクレオシドは、ガイド鎖の３’末端に位置し得る。
【0023】
一実施形態では、ガイド鎖の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のヌクレオシドは、２’－フルオロリボースヌクレオシドであり、および／またはガイド鎖の９１％以下、もしくは９５％以下のヌクレオシドは、２’フルオロリボースヌクレオシドである。例えば、ガイド鎖の少なくとも５０％かつ９１％以下のヌクレオシドは、２’－フルオロリボースヌクレオシドである。
【0024】
一実施形態では、２’－Ｏ－メチルリボースおよび未修飾リボースを含むパッセンジャー鎖のヌクレオシドが、交互に配置される。例えば、パッセンジャー鎖中の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または少なくとも２０個の連続するヌクレオシドは、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドであり得る。したがって、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖中の少なくとも１０個の連続ヌクレオシドが、存在し得る。交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖中の少なくとも１２個の連続ヌクレオシドが、存在し得る。交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖中の少なくとも１４個の連続ヌクレオシドが、存在し得る。交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖中の少なくとも１６個の連続ヌクレオシドが、存在し得る。好ましい実施形態では、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖中の少なくとも１８個の連続ヌクレオシドが、存在し得る。パッセンジャー鎖の１つ以上のヌクレオシドは、デオキシリボースを含み得る。このようなヌクレオシドは、パッセンジャー鎖の３’末端に位置し得る。
【0025】
一実施形態では、パッセンジャー鎖の少なくとも５、６、７、８または９個のヌクレオシドが、２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドであり、かつ／またはパッセンジャー鎖の１０個以下のヌクレオシドが、２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドである。
【0026】
一実施形態では、パッセンジャー鎖の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または４５％のヌクレオシドが、２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオチドであり、かつ／またはパッセンジャー鎖の５０％以下のオリゴヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオチドである。
【0027】
したがって、本発明は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるガイド鎖、および本明細書の実施形態のいずれかに記載されるパッセンジャー鎖を含むｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供する。
【0028】
したがって、一実施形態では、本発明は、
（ａ）核酸塩基配列５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’（配列番号１）または配列５’－ＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号８）の外側の５つ以下の位置において、および任意によりその配列内の３つ以下の位置において、配列番号１と異なる核酸塩基配列を含むガイド鎖であって、ここで少なくとも５０％のヌクレオシドが、２’－フルオロリボースを含み、１つまたは２つのヌクレオシドが、好ましくは３’末端で、それぞれ２’－Ｏ－メチルリボースを含む、ガイド鎖と；
（ｂ）核酸塩基配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２）もしくは５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡ－３’（配列番号３）を含む、または３つ以下の位置において配列番号２と異なる核酸塩基配列を含むパッセンジャー鎖であって、ここで少なくとも１０個の連続したヌクレオシドが、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖、
を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供する。
（ａ）核酸塩基配列５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’（配列番号１）または配列５’－ＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号８）の外側の５つ以下の位置において、および任意によりその配列内の３つ以下の位置において、配列番号１と異なる核酸塩基配列を含むガイド鎖であって、ここで少なくとも５０％のヌクレオシドが、２’－フルオロリボースを含み、１つまたは２つのヌクレオシドが、好ましくは３’末端で、それぞれ２’－Ｏ－メチルリボースを含む、ガイド鎖と；
（ｂ）核酸塩基配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２）もしくは５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡ－３’（配列番号３）を含む、または３つ以下の位置において配列番号２と異なる核酸塩基配列を含むパッセンジャー鎖であって、ここで少なくとも１０個の連続したヌクレオシドが、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖、
を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供する。
【0029】
特定の実施形態では、本発明は、
（ａ）核酸塩基配列５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’または配列５’－ＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号８）の外側の３つ以下の位置において配列番号１とは異なる核酸塩基配列を含むガイド鎖であって、ここで少なくとも５０％のヌクレオシドが、２’フルオロリボースを含み、３’末端の１つまたは２つのヌクレオシドがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルリボースを含む、ガイド鎖と；
（ｂ）核酸塩基配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２）もしくは５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡ－３’（配列番号３）を含む、または３つ以下の位置において配列番号２と異なる核酸塩基配列を含むパッセンジャー鎖であって、ここで少なくとも１０個の連続したヌクレオシドが、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖、
を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供する。
（ａ）核酸塩基配列５’－ＵＡＧＣＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＡＵＣＧＧＵＵＡ－３’または配列５’－ＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号８）の外側の３つ以下の位置において配列番号１とは異なる核酸塩基配列を含むガイド鎖であって、ここで少なくとも５０％のヌクレオシドが、２’フルオロリボースを含み、３’末端の１つまたは２つのヌクレオシドがそれぞれ、２’－Ｏ－メチルリボースを含む、ガイド鎖と；
（ｂ）核酸塩基配列５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡＧ－３’（配列番号２）もしくは５’－ＡＣＵＧＡＵＵＵＣＵＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＡ－３’（配列番号３）を含む、または３つ以下の位置において配列番号２と異なる核酸塩基配列を含むパッセンジャー鎖であって、ここで少なくとも１０個の連続したヌクレオシドが、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである、パッセンジャー鎖、
を含む、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供する。
【0030】
この実施形態による例示的な化合物は、Ｔｅｎｏ１５、Ｔｅｎｏ１８、Ｔｅｎｏ１９、Ｔｅｎｏ２０、Ｔｅｎｏ２９、Ｔｅｎｏ３２、Ｔｅｎｏ３３およびＴｅｎｏ３４であり、これらは以下の実施例において記載される。
【0031】
上記のとおり、パッセンジャー鎖中の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または少なくとも２０個の連続するヌクレオシドは、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドであり得る。例えば、パッセンジャー鎖中の少なくとも１２個の連続ヌクレオシドが、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである。例えば、パッセンジャー鎖中の少なくとも１４個の連続ヌクレオシドが、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドある。例えば、パッセンジャー鎖中の少なくとも１６個の連続ヌクレオシドが、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである。ある実施形態では、例えば、パッセンジャー鎖中の少なくとも１８個の連続ヌクレオシドが、交互に２’－Ｏ－メチルリボースヌクレオシドおよび未修飾リボース部分を有するヌクレオシドである。
【0032】
好ましくは、それぞれ２’－Ｏメチルリボースを含むパッセンジャー鎖中の少なくとも１つまたは２つのヌクレオシドは、パッセンジャー鎖の３’末端に位置する。しかし、これは必須ではない。
【0033】
ある実施形態では、ガイド鎖の３’末端における１つまたは２つのヌクレオシドが、それぞれ２’－Ｏ－メチルリボースを含み得、かつ：（ｉ）２’－修飾リボースを含むガイド鎖の残りのヌクレオシドがそれぞれ、２’－フルオロリボースヌクレオシドである、または（ｉｉ）ガイド鎖の残りのヌクレオシドがそれぞれ、２’－フルオロリボースヌクレオシドまたは未修飾リボース部分である。
【0034】
ある実施形態では、（ｉ）ガイド鎖の各ヌクレオシドが、２’－修飾リボースを含む、（ｉｉ）ガイド鎖の各ヌクレオシドが、２’－Ｏ－メチルリボースまたは２’－フルオロリボースを含む、または（ｉｉｉ）ガイド鎖の３’末端における１つもしくは２つのヌクレオシドが、それぞれ２’－Ｏ－メチルリボースを含み、かつガイド鎖の残りのヌクレオシドが、それぞれ２’－フルオロリボースヌクレオシドである。
【0035】
ある実施形態では、ガイド鎖および／またはパッセンジャーのヌクレオシド間連結はいずれも化学修飾されていない。したがって、ある実施形態では、ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖のヌクレオシド間連結のすべては、ホスホジエステルヌクレオシド間連結である。
【0036】
ある実施形態では、ガイド鎖および／またはパッセンジャーの核酸塩基はいずれも化学修飾されていない。例えば、ある実施形態では、ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖の核酸塩基はいずれも５－メチルシトシンを含まない。
【0037】
ある実施形態では、ガイド鎖の核酸塩基配列は、配列番号１で定義されるとおりであり、かつ／またはパッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、配列番号２もしくは配列番号３で定義されるとおりである。
【0038】
ある実施形態では、ガイド鎖の核酸塩基配列は、配列番号１で定義されるとおりであり、かつ／またはパッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、配列番号３で定義されるとおりである。
【0039】
ある実施形態では、ガイド鎖は、５’－ｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’であり；パッセンジャーは、５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡ－３’であり；ここでヌクレオシドに先行する「ｆ」＝２’－デオキシ－フルオロリボヌクレオシド（－Ｆ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｍ」＝２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド（－Ｏ－Ｍｅ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｒ」＝未修飾リボース部分（ＯＨ）を有するヌクレオシドであり；ヌクレオシドに先行する「ｄ」＝２’－デオキシリボヌクレオシド（－Ｈ）である。この実施形態による例示的な化合物は、以下の実施例で説明される、Ｔｅｎｏ１８である。
【0040】
ある実施形態では、ガイド鎖は、５’－ｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’であり；パッセンジャーは、５’－ｍＡｍＣｒＵｍＧｒＡｍＵｒＵｍＵｒＣｍＵｒＵｍＵｒＵｍＧｒＧｍＵｒＧｍＵｒＵｍＣｍＡｍＧ－３’であり；ここでヌクレオシドに先行する「ｆ」＝２’－デオキシ－フルオロリボヌクレオシド（－Ｆ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｍ」＝２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド（－Ｏ－Ｍｅ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｒ」＝未修飾リボース部分（ＯＨ）を有するヌクレオシドである。この実施形態による例示的な化合物は、以下の実施例で説明される、Ｔｅｎｏ２０である。
【0041】
ある実施形態では、ガイド鎖は、５’－ｆＵｒＡｒＧｆＣｒＡｆＣｆＣｒＡｆＵｆＣｆＵｒＧｒＡｒＡｒＡｆＵｆＣｒＧｒＧｆＵｆＵｍＡ－３であり；パッセンジャーは、５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｍＡｄＧ－３’であり；ここでヌクレオシドに先行する「ｆ」＝２’－デオキシ－フルオロリボヌクレオシド（－Ｆ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｍ」＝２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド（－Ｏ－Ｍｅ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｒ」＝未修飾リボース部分（ＯＨ）を有するヌクレオシドであり；ヌクレオシドに先行する「ｄ」＝２’－デオキシリボヌクレオシド（－Ｈ）である。この実施形態による例示的な化合物は、以下の実施例で説明される、Ｔｅｎｏ３３である。
【0042】
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、パッセンジャー鎖の３’末端に共有結合により付着されたコレステロール部分をさらに含み得る。コレステロール部分は、トリエチレングリコールコレステロール部分であってよい。例示的なコレステロール部分は、３’ホスホプロピル－２－オール，２，２’－［エタン－１，２－ジイルビス（オキシ）］ジ（エタン－１－オール），１０－Ｏ－［１－プロピル－３－Ｎ－カルバモイルコレステリル］である。
【0043】
例示的実施形態では、ガイド鎖は、５’－ｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’であり；パッセンジャーは、５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡｃｈｏｌ－３であり；ヌクレオシドに先行する「ｆ」＝２’－デオキシ－フルオロリボヌクレオシド（－Ｆ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｍ」＝２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド（－Ｏ－Ｍｅ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｒ」＝未修飾リボース部分（ＯＨ）を有するヌクレオシドであり；ヌクレオシドに先行する「ｄ」＝２’－デオキシリボヌクレオシド（－Ｈ）であり；ｃｈｏｌは、コレステロール部分を示す。この実施形態による例示的な化合物は、コレステロールコンジュゲートＴｅｎｏ１８（ＣＷＴ－００１）であり、これは、以下の実施例で説明される。
【0044】
これらの実施形態のいずれかにおいて、ガイド鎖の５’末端のヌクレオシドの糖の５’位にリン酸基（「５’Ｐｈｏｓ」）があってもよい。
【0045】
したがって一実施形態では、ガイド鎖は、５’－ＰｈｏｓｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’であり；パッセンジャー鎖は、５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡ－３であり；ここでガイド鎖およびパッセンジャー鎖のすべてのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結である。この実施形態による例示的な化合物は、以下の実施例で説明される、Ｔｅｎｏ１８である。
【0046】
別の実施形態では、ガイド鎖は、５’－ＰｈｏｓｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’であり；パッセンジャーは、５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡｃｈｏｌ－３であり；ここでｃｈｏｌは、コレステロール部分、例えばトリエチレングリコールコレステロール部分であり、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖のすべてのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結である。この実施形態による例示的な化合物は、コレステロールコンジュゲートＴｅｎｏ１８（ＣＷＴ－００１）であり、これは、以下の実施例で説明する。
【0047】
本発明はまた、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物またはその塩を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は典型的には、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。ある実施形態では、薬学的に許容される担体または希釈剤は、滅菌溶液である。薬学的に許容される担体または希釈剤は、非経口的に許容される水溶液である。例えば、薬学的に許容される担体または希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。薬学的に許容される担体または希釈剤は、ＥＤＴＡなどの追加の物質を、例えば０．００１％～０．００５％、例えば０．００３％（１００μＭ）の最終濃度で含んでもよい。ある実施形態では、医薬組成物は、非液体担体を含まず、例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、移植可能な足場などの固体担体に含まれない、または固体担体中に、固体担体に対して、もしくは固体担体と共に投与されない。
【0048】
本発明はさらに、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物またはその塩を含む容器を提供する。ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は典型的には、治療的有効量で提供される。治療的有効量は、対象に投与されるとコラーゲン３を減少させるかまたは阻害し、典型的には疾患症状の改善、例えば、疼痛または活動不能の軽減、機能性の改善、および／または疾患の進行の遅延をもたらす、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の量である。容器は典型的には、容器に貼付されたラベルを含む。容器は、本明細書に記載の医薬組成物を含むガラスバイアル（例えば、使い捨てガラスバイアル）であってもよい。容器は、シリンジまたは注射器であってもよい。
【0049】
本発明はまた、治療法における使用のための、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物もしくはその塩、または医薬組成物を提供する。
【0050】
したがって、医薬品の製造のための、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物もしくはその塩の使用、または医薬組成物の使用もまた、本明細書で提供される。
【0051】
また、それを必要とする対象に、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物もしくはその塩、または医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む、疾患または状態を治療する方法も提供される。
【0052】
「治療法」、「医薬品」、「治療する」、および「治療」などの用語は、治癒的方法および予防的方法を含む。
【0053】
したがって、好ましい実施形態では、例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の注射による病変内投与（例えば、単回の病変内投与）を含む、治療法における使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩が、本明細書で提供され、ここでｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、ガイド鎖５’－ｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’およびパッセンジャー鎖５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡ－３’を含み、任意により親油性（例えば、コレステロール）部分は、パッセンジャー鎖の３’末端に共有結合により付着される。
【0054】
ある実施形態において、治療は、コラーゲン調節不全、特にコラーゲンの過剰産生、例えばコラーゲン３の過剰産生に対するものである。「過剰産生」という用語は、対応する健康な組織と比較して、増加されたコラーゲン産生を指す。過剰産生は典型的には、局所的である。例えば、腱障害などの腱損傷は、コラーゲン３の局所的過剰産生が関与する。ペイロニー病およびデュピュイトラン病などの線維性状態もまた、コラーゲン３の局所的過剰産生が関与する。したがって、一実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物もしくはその塩、または医薬組成物は、腱障害などの腱損傷、またはペイロニー病もしくはデュピュイトラン病などの組織線維症を治療することにおける使用のためである。一実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物もしくはその塩、または医薬組成物は、腱損傷を治療することにおける使用のためである。腱損傷は、腱障害であり得る。腱損傷は、慢性腱障害であり得る。腱損傷は、外側上顆炎であり得る。
【0055】
対象は典型的には、ヒトである。しかし、別の好ましい対象はウマ、特にスポーツ用に飼育されたウマである。
【0056】
別の態様では、本発明は、ｍｉＲ－２９化合物、その塩、およびそれらを含む医薬組成物の投与量および治療レジメンを提供する。本明細書で提供される投与量および治療レジメンは、一連のｍｉＲ－２９化合物に好適である。すなわち、本明細書の投与量および治療レジメンの本開示の適用可能性は、本明細書に提供される新規ｍｉＲ－２９化合物を含むが、これらに限定されない。それにも関わらず、本発明者らはこの投与量および治療レジメンがこれらの化合物に特に好適であることを見出したため、この投与量および治療レジメンは好ましくは、新規ｍｉＲ－２９化合物を含む。
【0057】
本明細書に開示の投与量および治療レジメンでの使用のためのｍｉＲ－２９化合物は、上述のように、化学修飾され得る。これは、少なくとも１つの糖、ヌクレオシド間連結、または核酸塩基が、また上述のとおり、天然に存在するｍｉＲ－２９のものとは異なる化学構造を有することを意味する。ある実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、修飾糖を含むが、修飾ヌクレオシド間連結または修飾核酸塩基を含まない（ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、修飾ヌクレオシド間連結を含まず、かつそれは、修飾核酸塩基を含まない）。例えば、ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖のヌクレオシド間連結のすべては、ホスホジエステルヌクレオシド間連結であり得る。ｍｉＲ－２９化合物は、典型的にはパッセンジャー鎖の３’末端で、コレステロール部分などの親油性部分にコンジュゲートされてよい（すなわち、共有結合により連結される）。ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、本明細書に記載の特定の化合物または塩の任意の１つであり得るか、またはそれは、異なるｍｉＲ－２９化合物もしくはその塩であり得る。
【0058】
したがって、この態様の一実施形態では、本発明は、ある用量のｍｉＲ－２９化合物またはその塩の注射による単回病変内投与を含む治療法における使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供する。医薬品を製造するための対応する使用および対応する治療方法もまた、上記および下記のとおり、提供される。
【0059】
ある実施形態では、治療は、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の注射による２回以下、または３回以下の病変内投与を含む。他の実施形態では、治療は、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の注射による単回の病変内投与を含む。
【0060】
治療は、腱損傷（例えば、腱障害）に対するものであり得、投与は、腱の損傷領域（腱内（ｉｎｔｒａ－ｔｅｎｄｏｎ）または腱内（ｉｎｔｒａｔｅｎｄｉｎｏｕｓ））に行われる。
【0061】
治療は、ペイロニー病に対するものであり得、投与は、対象の白膜の患部領域内に行われる。
【0062】
治療は、デュピュイトラン病に対するものであり得、投与は、対象の手掌筋膜の患部領域内に行われる。
【0063】
これらの実施形態のいずれかにおいて、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１０μｇ～５０００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。以下にさらに詳細に説明するが、特に明記のない限り、用量は、遊離酸としてのガイド鎖およびパッセンジャー鎖のオリゴヌクレオチド部分（すなわち、コレステロール部分などの任意のコンジュゲート基を除く）の重量を指す。
【0064】
したがって、単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１０μｇ～４５００μｇ、１０μｇ～４０００μｇ、１０μｇ～３５００μｇ、１０μｇ～３０００μｇ、もしくは１０μｇ～２５００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。
【0065】
単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の４７μｇ～４７４０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の４７μｇ～４２７０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の４７μｇ～１９００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の４７μｇ～１４２０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の４７μｇ～４７５μｇ、または同等用量のその塩であり得る。
【0066】
単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の９５μｇ～４７４０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の９５μｇ～４２７０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の９５μｇ～１９００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の９５μｇ～１４２０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の９５μｇ～４７５μｇ、または同等用量のその塩であり得る。
【0067】
単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１９０μｇ～４７４０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１９０μｇ～４２７０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１９０μｇ～１９００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１９０μｇ～１４２０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１９０μｇ～４７５μｇ、または同等用量のその塩であり得る。
【0068】
単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の４７５μｇ～４７４０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の４７５μｇ～４２７０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の４７５μｇ～１９００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の４７５μｇ～１４２０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。
【0069】
単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１４２０μｇ～４７４０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１４２０μｇ～４２７０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１４２０μｇ～１９００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。
【0070】
ある実施形態では、単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１９０μｇ～１４２０μｇ、または同等用量のその塩である。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の約１９０μｇ、４７５μｇ、１４２０μｇもしくは４２７０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。例えば、単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の約１９０μｇ、４７５μｇもしくは１４２０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。これは、単回用量が約ｍｉＲ－２９化合物の１９０μｇ、または同等用量のその塩であり得ることを意味する。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の約４７５μｇ、または同等用量のその塩であり得る。単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の約１４２０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。
【0071】
好ましい実施形態では、単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の約１９０μｇ～約４７５μｇ、または同等用量のその塩である。例えば、単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の約１９０μｇ、または同等用量のその塩であり得る。また、単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の約４７５μｇ、または同等用量のその塩であり得る。好ましい実施形態では、単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の約１９０μｇ、または同等用量のその塩である。
【0072】
一実施形態ではしたがって、本発明は、対象における腱損傷の治療における使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供し、治療は、対象の損傷した腱中への、ｍｉＲ－２９化合物の少なくとも４７μｇの用量、または同等用量のその塩の注射による単回投与を含む。
【0073】
別の実施形態では、本発明は、対象におけるペイロニー病の治療における使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供し、治療は、対象の白膜の患部中への、ｍｉＲ－２９化合物の少なくとも４７μｇの用量、または同等用量のその塩の注射による単回投与を含む。
【0074】
さらなる実施形態では、本発明は、対象におけるデュピュイトラン病の治療における使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供し、治療は、対象の手掌筋膜の患部中への、ｍｉＲ－２９化合物の少なくとも４７μｇの用量、または同等用量のその塩の注射による単回投与を含む。
【0075】
ある実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、少なくとも９５μｇ、少なくとも１９０μｇ、少なくとも４７５μｇ、少なくとも１４２０μｇ、少なくとも１９００μｇ、少なくとも４２７０μｇ、または同等用量のその塩である。
【0076】
例えば、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の少なくとも９５μｇ（または少なくとも１９０μｇ、少なくとも４７５μｇ、少なくとも１４２０μｇ、少なくとも１９００μｇ、少なくとも４２７０μｇ）かつ４７４０μｇ以下または同等用量のその塩であり得る。したがって、単回投与量は、上記のような特定の範囲内にあり得る。
【0077】
より一般的には、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の少なくとも約１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、４７μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２２０μｇ、２４０μｇ、２６０μｇ、２８０μｇ、３００μｇ、３２０μｇ、３４０μｇ、３５０μｇ、３６０μｇ、３８０μｇ、４００μｇ、４２０μｇ、４４０μｇ、４６０μｇ、４７０μｇ、４７５μｇ、４８０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、１０００μｇ、１１００μｇ、１２００μｇ、１３００μｇ、１４００μｇ、１４２０μｇ、１５００μｇ、１６００μｇ、１７００μｇ、１８００μｇ、１９００μｇまたは２０００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。ある実施形態では、４０００μｇ～４５００μｇ、例えば４２７０μｇなどの、より高い用量が使用され得る。
【0078】
本明細書に記載の他の実施形態と組み合わせることができる、ある実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、ｍｉＲ－２９化合物の１９０μｇ以下、２００μｇ、２２０μｇ、２４０μｇ、２６０μｇ、２８０μｇ、３００μｇ、３２０μｇ、３４０μｇ、３５０μｇ、３６０μｇ、３８０μｇ、４００μｇ、４２０μｇ、４４０μｇ、４６０μｇ、４７０μｇ、４７５μｇ、４８０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、１０００μｇ、１１００μｇ、１２００μｇ、１３００μｇ、１４００μｇ、１４２０μｇ、１５００μｇ、１６００μｇ、１７００μｇ、１８００μｇ、１９００μｇ、２０００μｇ、２２００μｇ、２４００μｇ、２６００μｇ、２８００μｇ、３０００μｇ、３２００μｇ、３４００μｇ、３６００μｇ、３８００μｇ、４０００μｇ、４２００μｇ、４２７０μｇ、４４００μｇ、４６００μｇ、４７４０μｇ、４８００μｇまたは５０００μｇ、または同等用量のその塩である。特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、１９０μｇ以下、または同等用量のその塩である。特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、４７５μｇ以下、または同等用量のその塩である。特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、１４２０μｇ以下、または同等用量のその塩である。特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、１９００μｇ以下、または同等用量のその塩である。特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物の単回用量は、４２７０μｇ以下、または同等用量のその塩である。
【0079】
腱損傷が治療される場合、腱損傷は、腱障害であり得る。腱損傷は、慢性腱障害であり得る。腱損傷は、外側上顆炎、内側上顆炎、腱板腱障害、総伸筋起始筋腱障害、総屈筋起始筋腱障害、臀部腱障害（大転子痛症候群、ＧＴＰＳ）、膝蓋腱障害、ジャンパー膝、足底筋膜炎、アキレス腱障害、腓骨筋腱障害、棘上筋症候群、またはそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、腱損傷は、上肢腱障害（外側上顆炎、ゴルフ肘、腱板腱障害、およびデケルヴァン病など）である。特定の実施形態では、腱損傷は、外側上顆炎である。
【0080】
対象は典型的には、ヒトである。しかし、別の好ましい対象は、ウマ、特にスポーツ用に飼育されたウマである。
【0081】
ある実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、０．５ｍｌ～５ｍｌ、例えば、０．５ｍｌ～１．５ｍｌ、例えば、０．８ｍｌ～１．２ｍｌ、例えば、０．９ｍｌ～１．１ｍｌの容量で投与される。例えば、容量は、約０．５ｍｌ、０．７５ｍｌ、１ｍｌ、１．２５ｍｌ、１．５ｍｌ、１．７５ｍｌ、２ｍｌ、２．５ｍｌ、３ｍｌ、３．５ｍｌ、４ｍｌ、４．５ｍｌまたは約５ｍｌであり得る。特定の実施形態では、容量は、約１ｍｌである。例えば、一実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、約１ｍｌの滅菌水溶液の容量で投与される。
【0082】
ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、上記の投与量のいずれかに対応する濃度で投与され得る。例えば、投与量が１９０μｇのｍｉＲ－２９化合物である場合、化合物は、１９０μｇ／ｍｌの濃度で投与され得る。
【0083】
ある実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、本明細書に提供される特定のｍｉＲ－２９化合物またはその塩のいずれか１つである。
【0084】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、ある用量のｍｉＲ－２９化合物またはその塩の注射による単回病変内投与を含む治療法における使用のためのｍｉＲ－２９化合物またはその塩を提供し、ここでガイド鎖は、５’ －ｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’であり、パッセンジャー鎖は、５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡ－３’であり、パッセンジャー鎖（５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡｃｈｏｌ－３’）の３’末端に共有結合により付着されるコレステロール部分を含み、ｍｉＲ－２９化合物の用量（コレステロール部分の重量を含む）は、５０μｇ～５０００μｇ、例えば、２００μｇ～４５００μｇ、例えば、２００μｇ～１５００μｇ、２００μｇ～５００μｇ、５００μｇ～１５００μｇ、または１５００μｇ～４５００μｇ（例えば、約１００μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、５００μｇ、１０００μｇ、１５００μｇまたは約４５００μｇ）、または同等用量のその塩であり；ここでヌクレオシドに先行する「ｆ」＝２’－デオキシ－フルオロリボヌクレオシド（－Ｆ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｍ」＝２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド（－Ｏ－Ｍｅ）であり；ヌクレオシドに先行する「ｒ」＝未修飾リボース部分（－ＯＨ）を有するヌクレオシドであり；ヌクレオシドに先行する「ｄ」＝２’－デオキシリボヌクレオシド（－Ｈ）である。好ましい実施形態において、ｍｉＲ－２９化合物の用量（コレステロール部分の重量を含む）は、約２００μｇ～約５００μｇ、または同等用量のその塩である。例えば、ｍｉＲ－２９化合物の用量（コレステロール部分の重量を含む）は、約２００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。また、ｍｉＲ－２９化合物の用量（コレステロール部分の重量を含む）は、約５００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物の用量（コレステロール部分の重量を含む）は、約２００μｇ、または同等用量のその塩である。
【0085】
そのため、一実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩のガイド鎖は、５’－ｆＵｆＡｆＧｆＣｆＡｆＣｆＣｆＡｆＵｆＣｆＵｆＧｆＡｆＡｆＡｆＵｆＣｆＧｆＧｆＵｍＵｍＡ－３’であり、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩のパッセンジャー鎖は、５’－ｍＡｒＣｍＵｒＧｍＡｒＵｍＵｒＵｍＣｒＵｍＵｒＵｍＵｒＧｍＧｒＵｍＧｒＵｍＵｒＣｄＡ－３’であり、パッセンジャー鎖の３’末端に共有結合により付着されるコレステロール部分を含み、コレステロール部分の重量を含むｍｉＲ－２９化合物の用量は、５０μｇ～５０００μｇ、例えば２００μｇ、５００μｇ、１５００μｇまたは４５００μｇ、または同等用量のその塩である。これは、コレステロール部分の重量を含むｍｉＲ－２９化合物の用量が、約２００μｇ、または同等用量のその塩であり得ることを意味する。また、コレステロール部分の重量を含むｍｉＲ－２９化合物の用量は、約５００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。また、コレステロール部分の重量を含むｍｉＲ－２９化合物の用量は、約１５００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。また、コレステロール部分の重量を含むｍｉＲ－２９化合物の用量は、約４５００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。好ましい実施形態において、ｍｉＲ－２９化合物の用量（コレステロール部分の重量を含む）は、約２００μｇ～約５００μｇ、または同等用量のその塩である。例えば、ｍｉＲ－２９化合物の用量（コレステロール部分の重量を含む）は、約２００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。また、ｍｉＲ－２９化合物の用量（コレステロール部分の重量を含む）は、約５００μｇ、または同等用量のその塩であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物の用量（コレステロール部分の重量を含む）は、約２００μｇ、または同等用量のその塩である。この治療法は、ペイロニー病またはデュピュイトラン病などの、組織線維症に対するものであり得る。この治療法は、腱損傷に対するものであり得る。腱損傷は、腱障害であり得る。腱損傷は、慢性腱障害であり得る。腱損傷は、外側上顆炎であり得る。ｍｉＲ－２９化合物は、塩として、例えばナトリウム塩として投与され得る。担体は、非経口的に許容される滅菌水溶液、例えばＰＢＳであってよい。
【0086】
別の態様では、本発明は、本発明によるｍｉＲ－２９化合物を作製するためのプロセスを提供する。本発明はまた、本発明によるｍｉＲ－２９化合物を提供することとその化合物を薬学的に許容される担体または希釈剤と混合することを含む、医薬組成物を作製するためのプロセスを提供する。
【0087】
マイクロＲＮＡ－２９化合物
本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ－２９」化合物は、天然の内因性ｍｉＲ－２９の生物学的機能を有するオリゴヌクレオチドを指し、これは、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ（ｍｉＲ－２９ｂ－１およびｍｉＲ－２９ｂ－２を含む）およびｍｉＲ－２９ｃを含む。その機能は、ｍｉＲ－２９に対する１つ以上の結合部位（例えば、ｍｉＲ－２９ａに対する１つ以上の結合部位）を含む任意の標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）への相補的結合（ハイブリダイズ）によるｍＲＮＡの標的化を含み、それによりその分解および／または翻訳抑制を引き起こす。ｍｉＲ－２９に対する結合部位を保持する標的ｍＲＮＡは典型的には、コラーゲン、例えばコラーゲン３（ｃｏｌ３ａ１）などの、特定の細胞外マトリックスタンパク質をコードする。本明細書に記載されるｍｉＲ－２９化合物は、天然ｍｉＲ－２９の生物学的機能を模倣するが、例えば、その活性、安定性、および／または細胞取り込みを増強するように、しかし免疫原性を引き起こさずに、天然ｍｉＲ－２９（例えば、天然ｍｉＲ－２９ａ）に対して修飾されてよい。修飾は、核酸塩基配列の修飾、および／または１つ以上の糖部分、ヌクレオシド間連結、および／または核酸塩基における化学修飾を含み得る。修飾はまた、例えば親油性部分へのコンジュゲーションも含む。一実施形態では、化合物は、ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａの生物学的機能を有する、すなわち、それは、ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａの模倣体である。
本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ－２９」化合物は、天然の内因性ｍｉＲ－２９の生物学的機能を有するオリゴヌクレオチドを指し、これは、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ（ｍｉＲ－２９ｂ－１およびｍｉＲ－２９ｂ－２を含む）およびｍｉＲ－２９ｃを含む。その機能は、ｍｉＲ－２９に対する１つ以上の結合部位（例えば、ｍｉＲ－２９ａに対する１つ以上の結合部位）を含む任意の標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）への相補的結合（ハイブリダイズ）によるｍＲＮＡの標的化を含み、それによりその分解および／または翻訳抑制を引き起こす。ｍｉＲ－２９に対する結合部位を保持する標的ｍＲＮＡは典型的には、コラーゲン、例えばコラーゲン３（ｃｏｌ３ａ１）などの、特定の細胞外マトリックスタンパク質をコードする。本明細書に記載されるｍｉＲ－２９化合物は、天然ｍｉＲ－２９の生物学的機能を模倣するが、例えば、その活性、安定性、および／または細胞取り込みを増強するように、しかし免疫原性を引き起こさずに、天然ｍｉＲ－２９（例えば、天然ｍｉＲ－２９ａ）に対して修飾されてよい。修飾は、核酸塩基配列の修飾、および／または１つ以上の糖部分、ヌクレオシド間連結、および／または核酸塩基における化学修飾を含み得る。修飾はまた、例えば親油性部分へのコンジュゲーションも含む。一実施形態では、化合物は、ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａの生物学的機能を有する、すなわち、それは、ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａの模倣体である。
【0088】
本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、ｍｉＲ－２９に対する１つ以上の結合部位、例えば、ｍｉＲ－２９ａに対する１つ以上の結合部位を保有するｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現を減少させるまたは阻害することができる。例えば、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、コラーゲンの発現、例えばコラーゲン３（ｃｏｌ３ａ１）の発現を減少させるまたは阻害することができる。ｍｉＲ－２９化合物は、ネイティブｍｉＲ－２９ａよりも大きな程度にコラーゲンの発現を減少させ得る。例えば、ｍｉＲ－２９化合物は、ネイティブｍｉＲ－２９ａと比較して、コラーゲンの発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％、またはそれより多く減少させ得る。コラーゲン（ｃｏｌ３ａ１）発現の減少を評価するための好適なアッセイは、以下の実施例１に記載のルシフェラーゼアッセイまたはｑＰＣＲアッセイなど、当業者に知られている。タンパク質レベルは、当技術分野で周知の方法（例えば、ウエスタンブロット）によって評価され得る。
【0089】
本明細書に記載されるｍｉＲ－２９化合物は、細胞取り込みが可能であり、例えば、それらは、トランスフェクション剤またはリポソームなどの他のトランスフェクションビヒクルを使用することなく、標的細胞（腱細胞または線維芽細胞など）によりｉｎ ｖｉｖｏで取り込まれ得る。ｍｉＲ－２９化合物とコレステロール部分などの親油性部分とのコンジュゲーションは、細胞取り込みを増強する。細胞取り込みの能力は、当業者に知られている方法、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏコラーゲン３ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてｍｉＲ－２９活性を測定することにより評価できる。
【0090】
本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、安定である。安定なｍｉＲ－２９化合物は、３７℃で３ヶ月間保存後にｉｎ ｖｉｔｒｏコラーゲン３ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて活性を実質的に保持する。
【0091】
本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物はまた、未修飾（天然）ｍｉＲ－２９と比較して、それらが２’糖修飾の結果としてより長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するという意味でも安定である。
【0092】
二本鎖ＲＮＡは、哺乳動物において自然免疫応答を刺激できる。例えば、ｍｉＲ－２９ａは、免疫細胞中のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーの受容体に結合し炎症反応を引き起こし得ることが記載されている（参考文献５）。免疫刺激は、ｍｉＲＮＡ治療法のｉｎ ｖｉｖｏ適用を大幅に制限し得る。したがって、ｍｉＲＮＡ活性を効果的に媒介できるが免疫活性化を回避または最小限に抑えることができる化合物が望ましい。本明細書で提供されるｍｉＲ－２９化合物は、対象、例えばヒト対象に投与された場合、非免疫原性である。非免疫原性を評価するための好適なアッセイは、以下の実施例１に記載されるヒトマクロファージを使用するＴＮＦ－αアッセイなど、当業者に知られている。好ましい化合物は、化合物による処置の２４時間後に培養初代ヒトマクロファージの上清中で測定した場合、ＴＮＦ－αの発現を誘導しないか、またはそれらは１０ｐｇ／ｍｌ以下のＴＮＦ－αの発現を誘導する。
【0093】
本明細書に記載の化合物は望ましくない免疫応答を誘導しないため、化合物は、リポソーム中へのカプセル化または同様の手段により免疫系による認識から保護される必要はない。したがって、本明細書に記載の化合物は、単純な水性担体、例えばＰＢＳ中で投与される場合であっても、ｉｎ ｖｉｖｏで有効である。これは、治療法の調製および投与を大幅に簡素化し、安全性への懸念を生じ得る、対象中へのさらなる外来成分の導入を回避する。したがって、本明細書に記載の化合物は、天然のｍｉＲ－２９（例えば、ｍｉＲ－２９ａ）の機能を効果的に模倣するがより高い活性および安定性を有し、かつ非免疫原性である利点を有する。実施例はまた、化合物が抗炎症性であり得ることを示す。
【0094】
したがって、実施例に記載される例示的なｍｉＲ－２９化合物は、改善された安定性、活性および細胞取り込みを有するｍｉＲ－２９の化学的に合成された模倣体であり、一方で非免疫原性である。化合物の核酸塩基配列は、ｍｉＲ－２９ａのものに最も近いが、上記のとおり機能的模倣は、他のｍｉＲ－２９ファミリーメンバーにも及び得る。ｍｉＲ－２９化合物は、水性担体中で安定であり、３７℃で３ヶ月間保存後であっても活性を維持する。安定性および活性を高めるために、特定のｍｉＲ－２９化合物は、ガイド鎖に２’－フルオロ基および２’－Ｏ－メチル基、パッセンジャー鎖に２’－Ｏ－メチル基を導入することにより、化学修飾されている。パッセンジャー鎖は、細胞取り込みを高めるために３’コレステロール基をさらに含み得る。
【0095】
コラーゲン調節不全部位、例えば損傷した腱または線維性組織への本化合物の投与は、ｍｉＲ－２９ａ機能を回復させる。本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、明確に定義された作用様態を有する。化合物は、腱障害などの腱損傷およびコラーゲン（特にコラーゲン３）の産生の減少または阻害を必要とする他の疾患、例えば組織線維症を含む、様々な病原性状態に関連するコラーゲン産生における重要な経路を直接標的とする。さらに、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物による治療は、侵襲的処置を必要とせず、かつ最初の診断の時点で送達され得、それにより非常に早期において回復を開始させる。
【0096】
実施例に記載のとおり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物が、例えば腱細胞および線維芽細胞において、コラーゲン３の発現を有意に減少させ得ることを実証した。実施例はまた、ｍｉＲ－２９化合物の単回腱内注射が、マウス腱損傷モデルにおいて、コラーゲン３の発現を顕著に減少させ、かつ腱構造を改善したことを示す。
【0097】
安全性の観点から、ラットおよびイヌにおける試験は、臨床観察、体重、血液学、凝固または臨床化学パラメーター、急性期および１４日間の追跡調査後の肉眼的剖検所見を含む様々な特徴を監視した。これらの試験はまた、安全性薬理効果を示すように設計され、ラットにおけるＩｒｗｉｎ行動プロファイルまたは遠隔計測されたイヌにおける何らかの心血管の効果にも変化は見られなかった。ラットにおける呼吸パラメーターは、影響を受けないままであった。実施例はまた、局所的（病巣内）投与後に、他の組織における無視できる程度の分布が観察され、かつ何らかの全身性ｍｉＲ２９ａは急速に分解されることを示す。単離されたヒトマクロファージおよびマウス腱損傷モデルにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏデータの両方は、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物が非免疫原性であるというエビデンスを提供した。さらに、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物による治療は、いかなるオフターゲット効果も示さなかった。
【0098】
本発明者らは、二本鎖ｍｉＲ－２９化合物（ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む）が一本鎖ｍｉＲ－２９化合物（ガイド鎖のみを含む；例えば、実施例１のＴｅｎｏ３６）よりも活性であることを見出した。したがって、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、典型的には二本鎖である。２つの鎖は、それらが二重鎖を形成するように互いに実質的に相補的である。
【0099】
長さ
ガイド鎖は、長さが２０～２４の連結ヌクレオシドであり得る。例えば、ガイド鎖は、長さが２０、２１、２２、２３または２４の連結ヌクレオシドであり得る。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２０～２３の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２０～２２の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２１～２３の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２１または２２の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２２または２３の連結ヌクレオシドである。好ましい実施形態では、ガイド鎖は、長さが２２の連結ヌクレオシドである。
ガイド鎖は、長さが２０～２４の連結ヌクレオシドであり得る。例えば、ガイド鎖は、長さが２０、２１、２２、２３または２４の連結ヌクレオシドであり得る。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２０～２３の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２０～２２の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２１～２３の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２１または２２の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、ガイド鎖は、長さが２２または２３の連結ヌクレオシドである。好ましい実施形態では、ガイド鎖は、長さが２２の連結ヌクレオシドである。
【0100】
パッセンジャー鎖は、長さが１９～２３、または２０～２４の連結ヌクレオシドであり得る。例えば、パッセンジャー鎖は、長さが１９、２０、２１、２２、２３または２４の連結ヌクレオシドであり得る。一実施形態では、パッセンジャー鎖は、長さが１９～２２の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、パッセンジャー鎖は、長さが１９～２１の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、パッセンジャー鎖は、長さが２０または２１の連結ヌクレオシドである。一実施形態では、パッセンジャー鎖は、長さが２１または２２の連結ヌクレオシドである。好ましい実施形態では、パッセンジャー鎖は、長さが２１の連結ヌクレオシドである。
【0101】
オーバーハング
ｍｉＲ－２９化合物のガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖のそれぞれのオリゴヌクレオチド間の配列相補性の部分により二重鎖を形成する。ガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、ガイド鎖がパッセンジャー鎖に対して、例えば２つのヌクレオシドの３’オーバーハングを有し、パッセンジャー鎖が、ガイド鎖に対して、例えば１つのヌクレオシドの３’オーバーハングを有するように二重鎖を形成し得る。ガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、ガイド鎖が、パッセンジャー鎖に対して、例えば２つのヌクレオシドの３’オーバーハングを有するように二重鎖を形成し得る。
ｍｉＲ－２９化合物のガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖のそれぞれのオリゴヌクレオチド間の配列相補性の部分により二重鎖を形成する。ガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、ガイド鎖がパッセンジャー鎖に対して、例えば２つのヌクレオシドの３’オーバーハングを有し、パッセンジャー鎖が、ガイド鎖に対して、例えば１つのヌクレオシドの３’オーバーハングを有するように二重鎖を形成し得る。ガイド鎖およびパッセンジャー鎖は、ガイド鎖が、パッセンジャー鎖に対して、例えば２つのヌクレオシドの３’オーバーハングを有するように二重鎖を形成し得る。
【0102】
ミスマッチ
アラインさせたとき、すなわち二重鎖のとき、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の対応する核酸塩基間にミスマッチが存在し得る。ミスマッチは、対応する核酸塩基が相補的でない場合に存在する。相補的核酸塩基は、ＵとＡ、およびＣとＧである。例えば、３～８のミスマッチ、例えば３、４、５、６、７または８のミスマッチが存在し得る。一実施形態では、３～６のミスマッチが存在する。一実施形態では、５または６のミスマッチが存在する。一実施形態では、６のミスマッチが存在する。例えば、ミスマッチは、３位、１０位～１２位、１８位および２０位（パッセンジャー鎖に対する番号付け）にあり得る。本発明者らは驚くべきことに、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の間にミスマッチを含むｍｉＲ－２９化合物は、ミスマッチがより少ないか全くないｍｉＲ－２９化合物と比較して、より高い活性（例えば、コラーゲン３ルシフェラーゼアッセイで測定した場合）を有することを見出した。
アラインさせたとき、すなわち二重鎖のとき、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の対応する核酸塩基間にミスマッチが存在し得る。ミスマッチは、対応する核酸塩基が相補的でない場合に存在する。相補的核酸塩基は、ＵとＡ、およびＣとＧである。例えば、３～８のミスマッチ、例えば３、４、５、６、７または８のミスマッチが存在し得る。一実施形態では、３～６のミスマッチが存在する。一実施形態では、５または６のミスマッチが存在する。一実施形態では、６のミスマッチが存在する。例えば、ミスマッチは、３位、１０位～１２位、１８位および２０位（パッセンジャー鎖に対する番号付け）にあり得る。本発明者らは驚くべきことに、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の間にミスマッチを含むｍｉＲ－２９化合物は、ミスマッチがより少ないか全くないｍｉＲ－２９化合物と比較して、より高い活性（例えば、コラーゲン３ルシフェラーゼアッセイで測定した場合）を有することを見出した。
【0103】
コンジュゲート体
本明細書に記載されるｍｉＲ－２９化合物は、化合物のオリゴヌクレオチド（複数可）に共有結合により付着される１つ以上のコンジュゲート基を含み得る。例示的なコンジュゲート基は、コレステロール部分であるが、オリゴヌクレオチドの薬理学的特性（例えば、細胞取り込み）を改善する他のコンジュゲート部分が、当技術分野で知られており、コレステロール部分の代わりに使用されてよい。したがって、コンジュゲート基は典型的には、親油性部分である。
本明細書に記載されるｍｉＲ－２９化合物は、化合物のオリゴヌクレオチド（複数可）に共有結合により付着される１つ以上のコンジュゲート基を含み得る。例示的なコンジュゲート基は、コレステロール部分であるが、オリゴヌクレオチドの薬理学的特性（例えば、細胞取り込み）を改善する他のコンジュゲート部分が、当技術分野で知られており、コレステロール部分の代わりに使用されてよい。したがって、コンジュゲート基は典型的には、親油性部分である。
【0104】
一実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物は、ｍｉＲ－２９化合物の１つ以上のオリゴヌクレオチド鎖に共有結合により付着されるコレステロール部分を含む。一実施形態では、コレステロール部分は、パッセンジャー鎖に共有結合により付着される。一実施形態では、コレステロール部分は、パッセンジャー鎖に共有結合により付着され、ガイド鎖は、コンジュゲートされない。一実施形態では、コレステロール部分は、パッセンジャー鎖の３’末端に共有結合により付着される。これらの実施形態のいずれにおいても、コレステロール部分は、リンカー、例えばトリエチレングリコールを介して付着され得る。したがって、一実施形態では、コレステロール部分は、トリエチレングリコールコレステロール部分である。例示的なコレステロール部分は、３’ホスホプロピル－２－オール，２，２’－［エタン－１，２－ジイルビス（オキシ）］ジ（エタン－１－オール），１０－Ｏ－［１－プロピル－３－Ｎ－カルバモイルコレステリル］である。
【0105】
塩
本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、塩として提供できる。したがって、用語「化合物」は、その化合物の塩を含む。塩は、薬学的に許容される塩である、すなわち、塩は、化合物の生物学的活性を保持し、それに毒物学的影響を与えない。薬学的に許容される塩の例としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられる。一実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物は、ナトリウム塩である。
本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、塩として提供できる。したがって、用語「化合物」は、その化合物の塩を含む。塩は、薬学的に許容される塩である、すなわち、塩は、化合物の生物学的活性を保持し、それに毒物学的影響を与えない。薬学的に許容される塩の例としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられる。一実施形態では、ｍｉＲ－２９化合物は、ナトリウム塩である。
【0106】
ＣＷＴ－００１
実施例に記載される特定のｍｉＲ－２９化合物は、ＣＷＴ－００１である。ＣＷＴ－００１は、少なくともｍｉＲ－２９ａの二本鎖化学修飾模倣体であり、１：１の比率でガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖を含む。ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の核酸塩基配列および化学修飾は、「Ｔｅｎｏ１８」（Ｔ１８）のものに対応する。
実施例に記載される特定のｍｉＲ－２９化合物は、ＣＷＴ－００１である。ＣＷＴ－００１は、少なくともｍｉＲ－２９ａの二本鎖化学修飾模倣体であり、１：１の比率でガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖を含む。ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の核酸塩基配列および化学修飾は、「Ｔｅｎｏ１８」（Ｔ１８）のものに対応する。
【0107】
ＣＷＴ－００１ガイド鎖
ＣＷＴ－００１は、コラーゲン３を含む、天然に存在するｍｉＲ－２９ａと少なくとも同じ標的遺伝子の発現を阻害する。糖残基は、２’フルオロ基および２’－Ｏ－メチル基の導入により化学修飾され、これらは、化合物の安定性および活性を高める。ＣＷＴ－００１のガイド鎖は、ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａ（「ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ」）の天然に存在するガイド鎖と同じ核酸塩基配列を有し、それは：
5’ －UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3’（配列番号１）
である。
ＣＷＴ－００１は、コラーゲン３を含む、天然に存在するｍｉＲ－２９ａと少なくとも同じ標的遺伝子の発現を阻害する。糖残基は、２’フルオロ基および２’－Ｏ－メチル基の導入により化学修飾され、これらは、化合物の安定性および活性を高める。ＣＷＴ－００１のガイド鎖は、ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａ（「ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ」）の天然に存在するガイド鎖と同じ核酸塩基配列を有し、それは：
5’ －UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3’（配列番号１）
である。
【0108】
各ヌクレオシドは、２’－置換ヌクレオシドであり、これは、ヌクレオシドがＨまたはＯＨ以外の少なくとも１つの２’置換基を含む糖部分を含むことを意味する。ＣＷＴ－００１のガイド鎖は、次式を有する：
5’-fUfAfGfCfAfCfCfAfUfCfUfGfAfAfAfUfCfGfGfUmUmA-3’
式中、「ｆ」は、リボース環の２’位にフッ素を含むヌクレオシドを表し、「ｍ」は、リボース環の２’位にＯ－メチル基を含むヌクレオシドを表す。
5’-fUfAfGfCfAfCfCfAfUfCfUfGfAfAfAfUfCfGfGfUmUmA-3’
式中、「ｆ」は、リボース環の２’位にフッ素を含むヌクレオシドを表し、「ｍ」は、リボース環の２’位にＯ－メチル基を含むヌクレオシドを表す。
【0109】
ヌクレオシド間連結は、全体的にホスホジエステルヌクレオシド間連結である。
【0110】
ＣＷＴ－００１ガイド鎖の化学名は、任意により塩、例えばナトリウム塩として、次のとおりである；
ＲＮＡ（５’ホスホ（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｇ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｇ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｇ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｇ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’Ｏメチル）Ｕ－（２’Ｏメチル）Ａ）。
ＲＮＡ（５’ホスホ（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｇ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｇ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ａ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｃ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｇ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｇ－（２’デオキシ－２’フルオロ）Ｕ－（２’デオキシ－２’Ｏメチル）Ｕ－（２’Ｏメチル）Ａ）。
【0111】
遊離酸としてのＣＷＴ－００１ガイド鎖の構造式を以下に示す：
【化1】
【0112】
イオン化形態（すなわち、塩のアニオン）のＣＷＴ－００１ガイド鎖の構造式を以下に示す：
【化2】
【0113】
【0114】
ＣＷＴ－００１パッセンジャー鎖
ＣＷＴ－００１のパッセンジャー鎖は、３’末端のＧがＣＷＴ－００１中に存在しないことを除いて、ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａの天然に存在するパッセンジャー鎖（「ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ」）と同じ核酸塩基配列を有する。したがって、ＣＷＴ－００１パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、次のとおりである：
5’-ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCA-3’（配列番号３）。
ＣＷＴ－００１のパッセンジャー鎖は、３’末端のＧがＣＷＴ－００１中に存在しないことを除いて、ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａの天然に存在するパッセンジャー鎖（「ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ」）と同じ核酸塩基配列を有する。したがって、ＣＷＴ－００１パッセンジャー鎖の核酸塩基配列は、次のとおりである：
5’-ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCA-3’（配列番号３）。
【0115】
パッセンジャー鎖は、修飾糖部分（２’－Ｏ－メチル）を含むヌクレオシド、未修飾糖部分を含むヌクレオシド、およびデオキシリボース糖部分を含むヌクレオシドを含む。ＣＷＴ－００１のパッセンジャー鎖は、次式を有する；
5’-mArCmUrGmArUmUrUmCrUmUrUmUrGmGrUmGrUmUrCdA-3’
式中、「ｍ」は、リボース環の２’位にＯ－メチル基を含むヌクレオシドを意味し、「ｒ」は、リボヌクレオシド、すなわちリボース環の２’位にＯＨ基を含むヌクレオシドを意味し、「ｄ」は、デオキシリボースヌクレオシドを意味する。
5’-mArCmUrGmArUmUrUmCrUmUrUmUrGmGrUmGrUmUrCdA-3’
式中、「ｍ」は、リボース環の２’位にＯ－メチル基を含むヌクレオシドを意味し、「ｒ」は、リボヌクレオシド、すなわちリボース環の２’位にＯＨ基を含むヌクレオシドを意味し、「ｄ」は、デオキシリボースヌクレオシドを意味する。
【0116】
ヌクレオシド間連結は、全体的にホスホジエステルヌクレオシド間連結である。
【0117】
ＣＷＴ－００１のパッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖の３’末端に共有結合により付着されるコレステロール部分、例えばトリエチレングリコールコレステロール部分を含む。コレステロール部分は、ｍｉＲ－２９ａ化合物の薬理学的特性を改善し、例えば、コレステロール部分は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増加させる。
【0118】
ＣＷＴ－００１パッセンジャー鎖のナトリウム塩としての化学名は次のとおりである：
ＲＮＡ（（２’ＯＭメチル）Ａ－Ｃ－（（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｇ－（２’ＯＭメチル）Ａ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｃ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｇ－（２’ＯＭメチル）Ｇ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｇ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｃ－（２’デオキシ）Ａ－３’ホスホプロピル－２－オール，２，２’－［エタン－１，２－ジイルビス（オキシ）］ジ（エタン－１－オール）、１０－Ｏ－［１－プロピル－３－Ｎ－カルバモイルコレステリル］（任意により塩、例えばナトリウム塩として）。
ＲＮＡ（（２’ＯＭメチル）Ａ－Ｃ－（（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｇ－（２’ＯＭメチル）Ａ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｃ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｇ－（２’ＯＭメチル）Ｇ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｇ－Ｕ－（２’ＯＭメチル）Ｕ－Ｃ－（２’デオキシ）Ａ－３’ホスホプロピル－２－オール，２，２’－［エタン－１，２－ジイルビス（オキシ）］ジ（エタン－１－オール）、１０－Ｏ－［１－プロピル－３－Ｎ－カルバモイルコレステリル］（任意により塩、例えばナトリウム塩として）。
【0119】
したがって、パッセンジャー鎖の３’末端に共有結合により付着されるコレステロール部分（例えば、トリエチレングリコールコレステロール部分）を含むパッセンジャー鎖は、次式によって表すこともできる：
5’-mArCmUrGmArUmUrUmCrUmUrUmUrGmGrUmGrUmUrCdAchol-3
5’-mArCmUrGmArUmUrUmCrUmUrUmUrGmGrUmGrUmUrCdAchol-3
【0120】
遊離酸としてのＣＷＴ－００１パッセンジャー鎖の構造式を以下に示す：
【化4】
【0121】
イオン化形態（すなわち、塩のアニオン）のＣＷＴ－００１パッセンジャー鎖の構造式を以下に示す：
【化5】
【0122】
【0123】
ＣＷＴ－００１の詳細について、次表Ａに記載する。
【表1】
【0124】
マイクロＲＮＡ－２９化合物および組成物の治療の方法および治療的使用
本明細書に記載の化合物および組成物は、１つ以上のタイプのコラーゲン線維の局所的過剰産生を特徴とする、コラーゲンの局所的調節不全を伴う疾患の治療において特に好適である。例えば、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、例えばルシフェラーゼアッセイにおいて評価されるとおり、コラーゲン３の発現を減少させるかまたは阻害する。したがって、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、１つ以上のタイプのコラーゲン線維、例えばコラーゲン３（ｃｏｌ３ａ１）の発現の減少または阻害を必要とする疾患の治療において有用であり得る。
本明細書に記載の化合物および組成物は、１つ以上のタイプのコラーゲン線維の局所的過剰産生を特徴とする、コラーゲンの局所的調節不全を伴う疾患の治療において特に好適である。例えば、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、例えばルシフェラーゼアッセイにおいて評価されるとおり、コラーゲン３の発現を減少させるかまたは阻害する。したがって、本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、１つ以上のタイプのコラーゲン線維、例えばコラーゲン３（ｃｏｌ３ａ１）の発現の減少または阻害を必要とする疾患の治療において有用であり得る。
【0125】
３つの例示的な疾患、腱損傷（特に腱障害）、ペイロニー病およびデュピュイトラン病を、以下で説明する。ペイロニー病およびデュピュイトラン病は、組織線維症の例である。
【0126】
腱損傷
腱は、筋肉を骨に取り付ける結合組織である。腱組織は、様々な種類の細胞、特に腱細胞を含む細胞外マトリックス内に埋め込まれた約３０％のコラーゲンと２％（湿重量）のエラスチンで構成される。主なコラーゲンは、タイプ１コラーゲンであり、これは、大きい直径（４０～６０ｎｍ）を有し、互いに連結して緊密な線維束を形成する。タイプ３コラーゲンも存在し、これは、直径が小さく（１０～２０ｎｍ）、より緩やかな網状束を形成する。健康な腱は、整然と配置されたコラーゲン１（ｃｏｌ１）線維束を主に含み（約９５％）、生体力学的に劣る少量のコラーゲン３（ｃｏｌ３）線維（約５％）が点在する。健康な腱細胞では、ｍｉＲ－２９（例えば、ｍｉＲ－２９ａ）は、それぞれＣｏｌ３ａ１、ＶＥＧＦＡ、ＡＫＴ３、およびＴＧＦＢ２を標的とすることにより、コラーゲン３の過剰産生、血管新生、腱細胞の過剰増殖および癒着形成を直接抑制する。ｍｉＲ－２９ａの配列およびこれらの標的ｍＲＮＡ中におけるその結合部位は、哺乳動物種において保存される。
腱は、筋肉を骨に取り付ける結合組織である。腱組織は、様々な種類の細胞、特に腱細胞を含む細胞外マトリックス内に埋め込まれた約３０％のコラーゲンと２％（湿重量）のエラスチンで構成される。主なコラーゲンは、タイプ１コラーゲンであり、これは、大きい直径（４０～６０ｎｍ）を有し、互いに連結して緊密な線維束を形成する。タイプ３コラーゲンも存在し、これは、直径が小さく（１０～２０ｎｍ）、より緩やかな網状束を形成する。健康な腱は、整然と配置されたコラーゲン１（ｃｏｌ１）線維束を主に含み（約９５％）、生体力学的に劣る少量のコラーゲン３（ｃｏｌ３）線維（約５％）が点在する。健康な腱細胞では、ｍｉＲ－２９（例えば、ｍｉＲ－２９ａ）は、それぞれＣｏｌ３ａ１、ＶＥＧＦＡ、ＡＫＴ３、およびＴＧＦＢ２を標的とすることにより、コラーゲン３の過剰産生、血管新生、腱細胞の過剰増殖および癒着形成を直接抑制する。ｍｉＲ－２９ａの配列およびこれらの標的ｍＲＮＡ中におけるその結合部位は、哺乳動物種において保存される。
【0127】
腱の生体力学的特性、特にその引張強度は、断面積（すなわち、厚さ）、コラーゲン含有量、および異なるタイプのコラーゲン間の比率に関連する。
【0128】
上述のとおり、健康な腱は、整然と配置されたコラーゲン１（ｃｏｌ１）線維束を主に含み（約９５％）、生体力学的に劣る少量のコラーゲン３（ｃｏｌ３）線維（約５％）が点在する。急性損傷後に、腱障害中に、および腱損傷の治癒中に、コラーゲン合成において、タイプ１コラーゲンからタイプ３コラーゲンへのシフトが生じる。タイプ３コラーゲン合成が継続的に増加することにより、コラーゲン比の長期的不均衡が生じる。これは、腱の生体力学的特性に対し重大かつ有害な影響を有する。特に、それは、腱の引張強度を低下させ、その最終的な破断強度を低下させ、そのため後の断裂を起こりやすくする。
【0129】
腱損傷は、外部外傷、機械的ストレス（過剰使用など）、変性、炎症、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、多数の要因によって引き起こされ得るか、またはそれらに関連し得る。腱障害は、腱の過剰使用および損傷に関連する疾患の医学名である。
【0130】
過剰使用腱障害は、腱の複雑な多面的病状であり、活動関連疼痛、機能低下、および場合によっては腱の局所的な腫脹が徐々に発症した後に、臨床的に診断される。過剰使用、繰り返しの緊張または外傷は、腱中のコラーゲン線維の破壊を生じる。この損傷に応答して、腱細胞は、修復応答を開始し、それらは、腱の機能を迅速に回復するための「パッチ」として作用する高レベルのコラーゲン３を最初に産生する。時間の経過とともに、コラーゲン３は、徐々にコラーゲン１に置き換わる。しかし、コラーゲン３は生体力学的にコラーゲン１よりも劣るため、腱はさらに損傷を受ける傾向があり、より多いコラーゲン３の産生を引き起こす。腱障害では、さらなる損傷および治癒の減少の悪循環が、コラーゲン３の増加（約３０％）、細胞密度、血管新生、炎症および癒着形成を特徴とする病変をもたらす。
【0131】
ステロイド注射などの腱障害に対する従来の治療法は、一般に疼痛および炎症に対抗するために経験的に採用されるが、それらは腱の組織構造を変化させない。しかし、これらの治療は、完全に満足できるものではなく、症状の再発は、一般的である。
【0132】
以下の実施例はとりわけ、本明細書で提供されるｍｉＲ－２９化合物が、腱障害のマウスモデルを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでコラーゲン３の発現を減少させるまたは阻害させることにおいて安全でかつ有効であることを示す。例えば、マウスモデルを使用して、図４は、本発明による例示的なｍｉＲ－２９化合物（ＣＷＴ－００１）による治療が、腱疾患において、コラーゲン３発現の抑制を介して腱線維のアライメントおよびコラーゲンの産生を顕著に改善したことを示す。さらに、本発明者らは、ウマのコラゲナーゼ誘導腱障害（ＳＤＦＴ）モデルが、腱損傷後のｍｉＲ－２９ａ発現の減少およびそれに伴うｃｏｌ３：ｃｏｌ１比の増加を伴い、ヒト腱障害を反映することを以前に示した。ｍｉＲ－２９化合物の単回の病変内注射は、コラーゲン３の発現および病変サイズを減少させ、腱構造を改善した（参考文献３を参照）。まとめて、これらのデータは、本明細書で提供されるｍｉＲ－２９化合物を含む、ｍｉＲ－２９化合物を使用する安全でかつ有効なヒト治療法の理論的根拠を提供する。本明細書に記載の実験（実施例を参照）を考慮して、μｇおよび低ｍｇの範囲の用量は、動物種において十分に許容されると予想され、容易にかつ安全に注射できる容量（例えば、約１ｍｌ）で投与され得る。外側上顆炎のヒト対象における第１相無作為化二重盲検プラセボ対照試験では、１ｍｌ容量中で投与された２００μｇ、５００μｇ、および１５００μｇのＣＷＴ－００１の用量が安全でかつ有効であると見出された（実施例７参照）。
【0133】
したがって、本発明のｍｉＲ－２９化合物および組成物は、過剰使用による腱障害などの腱障害の治療に使用できる。対象は、ヒト対象であってもよい。対象者は、亜急性腱障害を有し得る。本発明の化合物および組成物による治療は、慢性腱障害への進行を軽減し得る。対象は、慢性腱障害を有し得る。対象は、活動による腱障害を有し得る。対象は、腱の部分的断裂を有し得る。治療は、腱の完全断裂への進行を軽減し得る。
【0134】
本発明の方法は、任意の損傷を受けた腱に適用され得る。ヒトにおいて腱障害を受ける主な腱は、アキレス腱、棘上筋腱、総屈筋腱、総伸筋腱、膝蓋腱、および臀部腱である。ウマ対象において腱障害を受ける主な腱は、表在屈筋腱である。特定の実施形態では、これらの腱の１つ以上が、治療の標的である。
【0135】
したがって、腱損傷は、外側上顆炎、内側上顆炎、腱板腱障害、総伸筋起始筋腱障害、総屈筋起始筋腱障害、臀部腱障害（大転子痛症候群、ＧＴＰＳ）、膝蓋腱障害、ジャンパー膝、足底筋膜炎、アキレス腱障害、腓骨筋腱障害、棘上筋症候群、またはそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、腱損傷は、上肢腱障害（外側上顆炎、ゴルフ肘、腱板腱障害、およびデケルヴァン病を含む）である。特定の実施形態では、腱損傷は、外側上顆炎である。
【0136】
ｍｉＲ－２９化合物による治療は、例えば腱、白膜または足底筋膜において、罹患組織の再生または修復を促進する。
【0137】
ｍｉＲ－２９化合物による治療は、治療の部位で、コラーゲン、例えばコラーゲン３の発現を減少させる。
【0138】
本発明の方法は、腱損傷のいずれの段階においても、または損傷した腱の治癒過程のいずれの段階においても適用され得る。一実施形態では、本発明のｍｉＲ－２９化合物および組成物は、最初の診断時点で対象に投与される。
【0139】
対象、例えばヒト対象は、以前の治療に応答しなかった、または不十分な応答を有したか、または以前の治療に耐えられなかった可能性がある。これは、対象の症状が治療にもかかわらず持続したことを意味する。腱障害の以前の治療は、理学療法、副子固定、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）による治療、罹患腱へのコルチコステロイドの局所注射の１つ以上を含んでもよい。対象は、保存的治療が奏効しなかった可能性がある、すなわち、治療にもかかわらず症状が３ヶ月以上持続した。
【0140】
腱損傷（例えば、肘腱障害などの腱障害）におけるｍｉＲ－２９治療の有効性は、以下の１つ以上に基づいて評価できる（実施例７も参照）：
－例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の投与後１４日、２８日および／または９０日に、例えば視覚的評価スケール（ＶＡＳ）を使用して測定される、疼痛の軽減；
－例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の投与後１４日、２８日および／または９０日において、例えば、Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍ，Ｓｈｏｕｌｄｅｒ，ａｎｄ Ｈａｎｄ（Ｑｕｉｃｋ ＤＡＳＨ）スコアおよび／またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｈｏｕｌｄｅｒ ａｎｄ Ｅｌｂｏｗ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ Ｅｌｂｏｗ（ＡＳＥＳ－Ｅを使用して測定される、活動不能および症状の改善；
－例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の投与後１４日、２８日および／または９０日において、例えばＰａｔｉｅｎｔ Ｒａｔｅｄ Ｔｅｎｎｉｓ Ｅｌｂｏｗ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＰＲＴＥＥ）によって測定される、疼痛および活動不能の改善；ならびに
－例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の投与後１４日、２８日および／または９０日において、超音波判定によって測定される、治療された腱（複数可）の改善。
－例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の投与後１４日、２８日および／または９０日に、例えば視覚的評価スケール（ＶＡＳ）を使用して測定される、疼痛の軽減；
－例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の投与後１４日、２８日および／または９０日において、例えば、Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍ，Ｓｈｏｕｌｄｅｒ，ａｎｄ Ｈａｎｄ（Ｑｕｉｃｋ ＤＡＳＨ）スコアおよび／またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｈｏｕｌｄｅｒ ａｎｄ Ｅｌｂｏｗ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ Ｅｌｂｏｗ（ＡＳＥＳ－Ｅを使用して測定される、活動不能および症状の改善；
－例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の投与後１４日、２８日および／または９０日において、例えばＰａｔｉｅｎｔ Ｒａｔｅｄ Ｔｅｎｎｉｓ Ｅｌｂｏｗ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＰＲＴＥＥ）によって測定される、疼痛および活動不能の改善；ならびに
－例えば、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の投与後１４日、２８日および／または９０日において、超音波判定によって測定される、治療された腱（複数可）の改善。
【0141】
デュピュイトラン病
デュピュイトラン病（ＤＤ）は、「筋膜」または「手掌筋膜」としても知られる、手掌および指の皮膚下にある組織の線維層に影響を与える。ＤＤの対象では、筋膜は、肥厚し、時間の経過とともに硬化する。これは、指が内側に、手掌に向かって引っ張られることを引き起こし、デュピュイトラン拘縮として知られる状態をもたらす。ＤＤの対象は、特定の日常活動を行うことができない場合がある。非外科的治療（例えば、ステロイドまたはコラゲナーゼ注射）および外科的治療の選択肢が、疾患の進行を緩徐にするかつ患部指の動きを改善するのを助けるために利用可能であるが、これらは、重大な副作用または合併症を有し得る。
デュピュイトラン病（ＤＤ）は、「筋膜」または「手掌筋膜」としても知られる、手掌および指の皮膚下にある組織の線維層に影響を与える。ＤＤの対象では、筋膜は、肥厚し、時間の経過とともに硬化する。これは、指が内側に、手掌に向かって引っ張られることを引き起こし、デュピュイトラン拘縮として知られる状態をもたらす。ＤＤの対象は、特定の日常活動を行うことができない場合がある。非外科的治療（例えば、ステロイドまたはコラゲナーゼ注射）および外科的治療の選択肢が、疾患の進行を緩徐にするかつ患部指の動きを改善するのを助けるために利用可能であるが、これらは、重大な副作用または合併症を有し得る。
【0142】
分子レベルでは、ＤＤは、線維芽細胞の異常な増殖プロセス、およびコラーゲン３を含む、のコラーゲンの過剰産生により特徴づけられる（参考文献６）。本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、筋膜における局所的なコラーゲン（例えば、コラーゲン３）の発現を特に有効かつ安全に阻害する、したがってこの疾患の特徴である線維性組織の形成に対抗する、それらの能力に基づき、デュピュイトラン病の治療において有効であると考えられる。
【0143】
デュピュイトラン病におけるｍｉＲ－２９治療の有効性は、活動不能および症状の改善に基づいて評価され得、例えば、Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍ，Ｓｈｏｕｌｄｅｒ，ａｎｄ Ｈａｎｄ（Ｑｕｉｃｋ ＤＡＳＨ）スコア、症状および／または疼痛の軽減（ＶＡＳスコア）、およびデュピュイトラン結節および索形成の減少の臨床判定（例えば、Ｔｕｂｉａｎａグレーディングシステムの改善による）を使用して測定される。例えば、参考文献７を参照のこと。
【0144】
ペイロニー病
ペイロニー病（ＰＤ）は、陰茎の白膜（ＴＡ）内の瘢痕またはプラークの形成を特徴とする進行性線維性疾患である。この状態は、陰茎の疼痛および陰茎の変形の進行により、身体的レベルおよび精神的レベルの両方で非常に衰弱させる。
ペイロニー病（ＰＤ）は、陰茎の白膜（ＴＡ）内の瘢痕またはプラークの形成を特徴とする進行性線維性疾患である。この状態は、陰茎の疼痛および陰茎の変形の進行により、身体的レベルおよび精神的レベルの両方で非常に衰弱させる。
【0145】
コラーゲン３および細胞外マトリックスの他の成分の過剰な局所的蓄積は、本疾患の特徴である。線維性組織は、正常なコラーゲン３／１比が、コラーゲン３の含有量の増加にシフトすることに関連する。例えば、ＰＤ動物は、コラーゲン３タンパク質の顕著な上方制御を伴う白膜および白膜下領域の線維症を発症したことが示されている。さらに、コラーゲン３／１比は、対照群と比較してＰＤ群で高かった（Ｐ＜０．０５）（参考文献８）。本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物は、ＴＡにおける局所的なコラーゲン３の発現を特に有効かつ安全に阻害する、したがってこの疾患の特徴である線維性組織の形成に対抗するそれらの能力に基づき、ペイロニー病の治療において有効であると考えられる。
【0146】
デュピュイトラン病およびペイロニー病の併発は、一般的であり（例えば、参考文献９）、両方の疾患は、コラーゲン３の過剰産生に関連する（参考文献１０）。データは、それらが共通の病態生理学を共有し、同じ治療レジメンに適応できることを示唆する。これは、ペイロニー病およびデュピュイトラン病の治療における本明細書に提供されるものを含む、ｍｉＲ－２９模倣体の治療的有効性をさらに裏付ける。
【0147】
ペイロニー病におけるｍｉＲ－２９治療の有効性は、活動不能、症状の改善および／または疼痛の軽減、陰茎湾曲の改善または進行の欠如、ならびに二重超音波検査での改善に基づき評価され得る。
【0148】
治療の対象
対象は典型的には、ヒトである。しかし、本発明の方法は、他の霊長類（特にゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンなどの大型類人猿のみでなく、旧世界ザルおよび新世界ザルなど）ならびにげっ歯類（マウスおよびラットを含む）を含む、任意の他の哺乳動物、ならびに他の一般的な実験動物、家畜および農業用動物（限定されないが、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギを含む）にも拡張できる。別の好ましい対象は、ウマ、特にウマのスポーツ用に飼育されたウマである。
対象は典型的には、ヒトである。しかし、本発明の方法は、他の霊長類（特にゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンなどの大型類人猿のみでなく、旧世界ザルおよび新世界ザルなど）ならびにげっ歯類（マウスおよびラットを含む）を含む、任意の他の哺乳動物、ならびに他の一般的な実験動物、家畜および農業用動物（限定されないが、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギを含む）にも拡張できる。別の好ましい対象は、ウマ、特にウマのスポーツ用に飼育されたウマである。
【0149】
医薬組成物および投与
本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、医薬組成物中で製剤化できる。これらの組成物は、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の物質を含んでよい。このような物質は、非毒性であり、ｍｉＲ－２９化合物の有効性を妨げない。
本明細書に記載のｍｉＲ－２９化合物またはその塩は、医薬組成物中で製剤化できる。これらの組成物は、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の物質を含んでよい。このような物質は、非毒性であり、ｍｉＲ－２９化合物の有効性を妨げない。
【0150】
したがって、一実施形態では、医薬組成物は、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩、および滅菌液体担体、例えば注射用溶液などの、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。薬学的に許容される担体または希釈剤は、生理食塩水を含んでよい。薬学的に許容される担体または希釈剤は、滅菌水溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。薬学的に許容される担体または希釈剤は、滅菌水溶液、例えば等張生理食塩水（例えば０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）などの塩化ナトリウム溶液であってもよい。一実施形態では、医薬組成物は、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩を含み、ＰＢＳおよび等張生理食塩水（例えば、０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）などの塩化ナトリウム溶液をさらに含む。
【0151】
治療される状態の局所的性質を考慮して、例えば局所注射による、局所投与が、特に好適である。したがって、本発明の化合物および組成物は、典型的には、罹患部位で局所的に（病変内に）投与される。例えば、注射は、患部腱内に送達され得る。患部腱内への注射は、腱内投与としても知られている。
【0152】
罹患部位での注射の場合、ｍｉＲ－２９化合物は、非経口的に許容される水溶液をさらに含む医薬組成物中に含まれ得る。溶液は、滅菌である。この溶液は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性、および安定性を有する。当業者は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液、乳酸リンゲル液などの等張ビヒクルを使用して、好適な溶液を調製できる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、および／または他の添加剤が含まれてもよい。例えば、ＥＤＴＡは、例えば０．００１％～０．００５％、例えば０．００３％（１００μＭ）の最終濃度で添加され得る。本発明の化合物の特定の製剤は、注射可能な溶液、例えば、本発明のｍｉＲ－２９化合物または塩およびＰＢＳを含み、任意によりＥＤＴＡをさらに含む溶液である。
【0153】
腱への注射は典型的には、例えば、「ｐｅｐ法（ｐｅｐｐｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」を用いて、超音波によって誘導される（参考文献１１）。「ｐｅｐ法」は、ニードルを皮膚から出すことなく、ニードルを抜き、向きを変え、再挿入することにより、少量の注射を複数回行う注射方法である。損傷した／慢性の腱の状況では、これは、治癒応答を刺激するために有利であり得る。したがって一実施形態では、単回用量のｍｉＲ－２９化合物が、損傷した腱内の異なる部位において複数のニードル注射の形態で腱内に投与される。
【0154】
日常的な技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２に見られる。
【0155】
投与量および治療レジメン
当業者は、投与量が様々な方法で示され得ることを知っている。特に明記のない限り、本明細書に示すｍｉＲ－２９化合物の用量は、遊離酸としての、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖のオリゴヌクレオチド部分（すなわち、コレステロール部分などの任意のコンジュゲート基を除く）の重量を指す。参照化合物は、遊離酸としての、かつトリエチレングリコールコレステロール部分を除く、ＣＷＴ－００１である。異なる分子量を有し得るｍｉＲ－２９化合物の、塩の、および／またはコンジュゲート形態の同等用量は、当業者によって計算され得る。同等用量は、モル量（例えば、ｎモル）またはモル濃度（例えば、ｎＭ）でも示されてもよい。当業者は、これらの異なる単位間で変換する方法を知っている。
当業者は、投与量が様々な方法で示され得ることを知っている。特に明記のない限り、本明細書に示すｍｉＲ－２９化合物の用量は、遊離酸としての、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖のオリゴヌクレオチド部分（すなわち、コレステロール部分などの任意のコンジュゲート基を除く）の重量を指す。参照化合物は、遊離酸としての、かつトリエチレングリコールコレステロール部分を除く、ＣＷＴ－００１である。異なる分子量を有し得るｍｉＲ－２９化合物の、塩の、および／またはコンジュゲート形態の同等用量は、当業者によって計算され得る。同等用量は、モル量（例えば、ｎモル）またはモル濃度（例えば、ｎＭ）でも示されてもよい。当業者は、これらの異なる単位間で変換する方法を知っている。
【0156】
以下に記載する実施例および図において、示される投与量は、化合物のコレステロールコンジュゲート形態の遊離酸を指す。したがって、実施例および図が２００μｇまたは２００μｇ／ｍｌに言及する場合、これは、約１９０μｇまたは１９０μｇ／ｍｌのコレステロール部分を除く遊離酸としての化合物に相当する；実施例が５００μｇまたは５００μｇ／ｍｌに言及する場合、これは、約４７５μｇまたは４７５μｇ／ｍｌのコレステロール部分を除く遊離酸としての化合物に相当する；実施例が１５００μｇまたは１５００μｇ／ｍｌに言及する場合、これは、約１４２０μｇまたは１４２０μｇ／ｍｌのコレステロール部分を除く遊離酸としての化合物に相当する；実施例が２０００μｇまたは２０００μｇ／ｍｌに言及する場合、これは、約１９００μｇまたは１９００μｇ／ｍｌのコレステロール部分などを除く遊離酸としての化合物に相当する、などである。コレステロール部分が除外される場合、これはまた、コレステロール部分と化合物のオリゴヌクレオチド部分の間のあらゆるリンカー（例えば、トリエチレングリコール）も除外する。
【0157】
投与は典型的には「治療的有効量」または「予防的有効量」（場合によっては、治療法は予防を含み得るが）であり、これは、対象に利益を示すのに十分である。例えば、治療的有効量は、対象に投与されたときに疾患症状の改善、例えば、疼痛または活動不能の軽減、機能性の改善、および／または疾患の進行を防止するかまたは遅延をもたらす、ｍｉＲ－２９化合物またはその塩の量である。
【0158】
ｍｉＲ－２９化合物は、損傷組織中に直接、すなわち病変内に投与できる。投与は典型的には、例えばニードルを使用した注射による。
【0159】
一実施形態では、治療的効果は、本明細書に記載の用量の単回の投与のみで達成され得る。「単回の」投与は、化合物の１用量のみが、治療的効果を達成するために必要とされることを意味する。したがって、対象は、典型的には、初回投与の投与部位での疾患症状の改善を経験するために、二回目目の投与に戻る必要はない。
【0160】
全般
本発明の実施は、別段に明記されない限り、当技術分野の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。
本発明の実施は、別段に明記されない限り、当技術分野の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。
【0161】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」も包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなってよく、または追加的な何か、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【0162】
数値ｘに関する「約」という用語は、任意であり、例えば、ｘ＋／－１０％を意味する。
【0163】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除しない。必要ならば、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略されてよい。
【0164】
２つのオリゴヌクレオチド配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アラインされたとき、核酸塩基のパーセンテージが、それらの配列の全長にわたり、２つの配列を比較して同じであることを意味する。
【0165】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明するために提供される。実施例は、例示的なものであり、決して本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0166】
【図1】（Ａ）ナトリウム塩としての、ＣＷＴ－００１ガイド（アンチセンス）鎖の構造。（Ｂ）ナトリウム塩としての、ＣＷＴ－００１パッセンジャー（アンチセンス）鎖の構造。
【図2】示されるようにヒトコラーゲン３ ｍｉＲ２９結合部位およびｍｉＲ２９ａ化合物を含むルシフェラーゼプラスミドおよび対照で共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞中のルシフェラーゼ活性（ｎ＝４）。ルシフェラーゼ活性は、ｍｉＲ２９ａ活性に反比例する。
【図3】（Ａ）選択されたｍｉＲ２９化合物を、初代ヒトマクロファージにおける炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－αの産生を誘導するそれらの能力を評価することにより、潜在的免疫原性について試験した。未処置細胞（「未処置」）を、陰性対照として使用した。２．５μｇ／ｍｌのイミキモド（「ＩＭＱ２．５」）で処置した細胞を、陽性対照として使用した。（Ｂ）選択したｍｉＲ２９化合物を、ヒト腱細胞におけるｃｏｌ３ａ１の発現をノックダウンするそれらの能力について試験した。スクランブルｍｉＲ２９ａ（「ｓｃｒ」）および未処置細胞（「ｕｎｔｒ」）を、陰性対照として使用した。（Ｃ）ヒトコラーゲン３ｍｉＲ２９結合部位を含むルシフェラーゼプラスミドと示されるように選択されたｍｉＲ－２９化合物を共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のルシフェラーゼ活性。スクランブルｍｉＲ２９ａ（「ｓｃｒ」）を、陰性対照として使用した。有意性を、一元配置分散分析検定を使用して評価した。＊＊＊Ｐ≦０．００１、Ｔｅｎｏ２０と比較、ｎ＝３。（Ｄ）示されたコレステロールコンジュゲートｍｉＲ－２９化合物による腱細胞処置後の定量的ＰＣＲにより測定されたＣｏｌ３ａ１転写レベル。値を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、未処置サンプルと比較した相対的発現として示す。スチューデントのｔ検定、＊Ｐ≦０．０５ ５日目にＴｅｎｏ３３と比較したＴｅｎｏ１８、ｎ＝３。（Ｅ）選択されたｍｉＲ－２９化合物を、マウス腱損傷モデルで試験した。化合物を、損傷した膝蓋腱中に直接注射し、マウスを、１日、３日、または７日間回復させた。Ｃｏｌ３ａ１転写産物の絶対数を、ｑ－ＰＣＲにより測定した。有意性を、一元配置分散分析検定を使用して評価した。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、各時点においてＴｅｎｏ２０と比較したＴｅｎｏ１８、ｎ＝４。
【図4】直後にＣＷＴ－００１により処置した腱損傷の誘導後のマウス腱の組織学的分析および分子分析。（Ａ）ＣＷＴ－００１またはＰＢＳの注射後１、３、および７日目のマウス膝蓋腱におけるｃｏｌ３ａ１ ｍＲＮＡの絶対コピー数（ｎ＝３）。（Ｂ）ＣＷＴ－００１（右）またはＰＢＳ対照（左）による７日間の治療後の損傷腱の代表的なＨ＆Ｅ染色切片。
【図5】ＥＬＩＳＡにより測定した、ＣＷＴ－００１、スクランブル陰性対照、またはポリＩＣ陽性対照による処置の２４時間後の培養初代ヒトマクロファージの上清中の炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－ａ）のレベル。
【図6】ｑＰＣＲによって測定しかつ未処置対照（左のバー）に対する倍率変化として表す、ＣＷＴ－００１（中央のバー）またはポリＩＣ陽性対照（右のバー）による処置２４時間後の培養初代ヒトマクロファージにおけるインターフェロン誘導性遺伝子ＯＡＳ２（Ａ）、ＩＮＦａ（Ｂ）、ＩＦＴＭ１（Ｃ）、ＭＸ１（Ｄ）、ＩＲＦ９（Ｅ）およびＯＡＳ１（Ｆ）の発現レベル。「ＴＦなし」＝トランスフェクション試薬なし（細胞取り込みは、コレステロール部分によって増強された）。
【図7】ｑＰＣＲによって測定しかつ１８Ｓの１０６コピーあたりのインターフェロン応答遺伝子の絶対コピー数として表す、ＣＷＴ－００１またはＰＢＳ陰性対照の腱内注射後０、１、３、７日後のマウス腱でのインターフェロン誘導性遺伝子ＭＸ１（Ａ）、ＯＡＳ２（Ｂ）、ＩＦＩＴＭ１（Ｃ）およびＩＲＦ９（Ｄ）の発現レベル。
【図8】ｑＰＣＲによって測定し、対照中のＣｅｌ３９スパイクに対して正規化し、未処置サンプルと比較した相対的発現として示す、０、２、２０、および１００μｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１と３７℃で０、６、１２、および２４時間インキュベートした新鮮ヒト血清中のｍｉＲ２９ａのレベル（ｎ＝３）。
【図9】ｑＰＣＲによって測定し、対照中のＣｅｌ３９スパイクに対して正規化し、未処置サンプルに対する倍率変化として表す、０、２、２０、および１００μｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１と３７℃で０分、１５分、３０分、４５分、１時間、６時間、１２時間および２４時間インキュベートした新鮮ヒト血清中のｍｉＲ２９ａのレベル（ｎ＝３）。
【図10】ｑＰＣＲによって測定した、ＣＷＴ－００１の静脈注射の０、１、４、および７日後に採取したマウスの腎臓（Ａ）、脾臓（Ｂ）、肝臓（Ｃ）、血清（Ｄ）、肺（Ｅ）、筋肉（Ｆ）、および心臓（Ｇ）中のｍｉＲ２９ａレベル。臓器ｍｉＲ２９ａ発現レベルを、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、未処置対照と比較して相対的倍率変化として示し、血清ｍｉＲ２９ａ発現レベルを、対照のＣｅｌ３９スパイクに対して正規化し、ＰＢＳ対照に対する倍率変化として示した（ｎ＝４）。
【図11】ｑＰＣＲで測定し、対照におけるＣｅｌ３９スパイクに対して正規化し、ＰＢＳ処置対照に対する倍率変化として表した、膝蓋腱中へのＣＷＴ－００１の注射後の０分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、７２時間にマウスから採取した血液中のｍｉＲ２９ａの血清レベル（ｎ＝４）。
【図12】ｑＰＣＲによって測定した、４、２０、４０、および５０ｍｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１、またはＰＢＳ対照の静脈内注射の７日後に採取したマウス血清（Ａ）、肺（Ｂ）、腱注射近位の皮膚（Ｃ）、腎臓（Ｄ）、脾臓（Ｅ）、筋肉（Ｆ）、肝臓（Ｇ）、心臓（Ｈ）、および骨髄（Ｉ）中のｍｉＲ２９ａのレベル。臓器ｍｉＲ２９ａ発現レベルを、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、未処置対照と比較して相対的倍率変化として示し、血清ｍｉＲ２９ａ発現レベルを、対照のＣｅｌ３９スパイクに対して正規化し、ＰＢＳ対照に対する倍率変化として示した（ｎ＝４）。
【図13】外側上顆炎を有するヒト対象におけるＣＷＴ－００１注射の単回漸増用量の安全性、忍容性および薬物動態を評価する第１相ランダム化二重盲検プラセボ対照試験の試験デザイン。
【図14】ＣＷＴ－００１の総伸筋腱への投与中のプローブの配置を示す超音波画像（ＡおよびＢ）。橈骨頭（ｒ）、橈骨上腕関節（ｊ）、外側上顆、および総伸筋腱を、可視化する。プローブを、総伸筋腱の長手方向軸に平行な肘の側面に沿って配置する。
【図15】ｑＰＣＲによって測定した、健康なヒト筋膜組織およびデュピュイトランのヒト筋膜組織におけるｍｉＲ２９ａのレベルの比較（ｎ＝４の健康、ｎ＝３のデュピュイトラン）。
【図16】ｑＰＣＲにより測定した、５μＭのｍｉＲ２９ａ模倣体、ｍｉＲ２９ｂ模倣体、ｍｉＲ２９ｃ模倣体、ＣＷＴ－００１、ｍｉＲ２９ａ ａｎｔａｇｏｍｉｒ、またはスクランブルｍｉＲ２９ａ対照によるトランスフェクション後のヒトデュピュイトラン線維芽細胞中のコラーゲン１（Ａ）およびコラーゲン３（Ｂ）のレベル。ｍｉＲ２９ａ発現レベルを、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、スクランブル対照（ｎ＝３）と比較した相対的倍率変化として示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５対スクランブル対照。（スチューデントのｔ検定）。
【図17】第Ｉ相ランダム化二重盲検試験では、外側上顆炎を有するヒト対象は、腱内注射により投与された単回の２００μｇ（ｎ＝６）（Ａ）、５００μｇ（ｎ＝６）（Ｂ）、もしくは１５００μｇ（ｎ＝６）（Ｃ）の用量のＣＷＴ－００１または一致するプラセボ（ｎ＝２）（３：１）を受けた。対象は、治療後最初の１４日間、１日１回１００ｍｍ視覚的評価スケール（ＶＡＳ）を使用して疼痛を評価し、直前の２４時間の疼痛を評価した。１４日目以降、対象は、注射後９０日目まで毎週疼痛日誌をつけた。水平「ＭＣＩＤ」線は、外側上顆炎の治療におけるＶＡＳについて確立された最小臨床重要度差（ＭＣＩＤ）を示す。任意の用量のＣＷＴ－００１を投与されたすべての対象（ｎ＝１８）のＶＡＳスコアの平均変化を、プラセボ（Ｄ）を投与されたすべての対象（ｎ＝６）のＶＡＳスコアの平均変化と比較し、かつ別の研究（Ｅ）において、ＣＷＴ－００１の任意の用量を受けたすべての対象のＶＡＳスコアの平均変化率を、コルチコステロイド（ｎ＝５０）、多血小板血漿（ＰＲＰ）（ｎ＝５０）、またはキシロカイン（ｎ＝５０）により治療された対象のＶＡＳスコアの平均変化率と比較した。
【図18】第Ｉ相ランダム化二重盲検試験では、外側上顆炎を有するヒト対象は、腱内注射により投与された単回の２００μｇ（ｎ＝６）（Ａ）、５００μｇ（ｎ＝６）（Ｂ）、もしくは１５００μｇ（ｎ＝６）（Ｃ）の用量のＣＷＴ－００１または一致するプラセボ（ｎ＝２）（３：１）を受けた。対象は、ＱｕｉｃｋＤＡＳＨインデックスを使用して自分の身体機能および症状を報告し、ＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコアの変化を、投与前１日目から１４日目、２８日目、および９０日目にプロットした。任意の用量のＣＷＴ－００１を投与されたすべての対象（ｎ＝１８）のＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコアの平均変化を、プラセボを投与されたすべての対象（ｎ＝６）のＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコアの平均変化と比較した（Ｄ）。水平「ＭＣＩＤ」線は、上肢筋骨格系障害患者におけるＱｕｉｃｋＤＡＳＨに対して確立されたＭＣＩＤを示す。
【図19】第Ｉ相ランダム化二重盲検試験では、外側上顆炎を有するヒト対象は、腱内注射により投与された単回の２００μｇ（ｎ＝６）（Ａ）、５００μｇ（ｎ＝６）（Ｂ）、もしくは１５００μｇ（ｎ＝６）（Ｃ）の用量のＣＷＴ－００１または一致するプラセボ（ｎ＝２）（３：１）を受けた。ＰＲＴＥＥ（ｐａｔｉｅｎｔ ｒａｔｅｄ ｔｅｎｎｉｓ ｅｌｂｏｗ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を使用して、試験対象における知覚された疼痛および活動不能を測定し、ＰＲＴＥＥスコアの変化を、投与前１日目から１４日目、２８日目、および９０日目にプロットした。任意の用量のＣＷＴ－００１を投与されたすべての対象（ｎ＝１８）のＰＲＴＥＥスコアの平均変化を、プラセボを投与されたすべての対象（ｎ＝６）のＰＲＴＥＥスコアの平均変化と比較した（Ｄ）。
【図20】第Ｉ相ランダム化二重盲検試験では、外側上顆炎を有するヒト対象は、腱内注射により投与された単回の２００μｇ（ｎ＝６）、５００μｇ（ｎ＝６）、もしくは１５００μｇ（ｎ＝６）の用量のＣＷＴ－００１または一致するプラセボ（ｎ＝２）（３：１）を受けた。超音波組織特性評価（ＵＴＣ）を使用して、腱構造を可視化し、かつ腱の完全性に関連する４つの異なるエコータイプへのグレースケールの腱基質の変化を定量化した。タイプＩおよびＩＩは、組織化された基質を表す；タイプＩＩＩおよびＩＶは、無秩序な基質を表す（Ａ）。肘外側の代表的な超音波画像を、注射前（Ｂ）、２８日目（Ｃ）、および９０日目（Ｄ）にプラセボを投与された対象、ならびに注射前（Ｅ）、２０日目（Ｆ）、および９０日目（Ｇ）に２００μｇのＣＷＴ－００１を投与された対象について提供する。ＵＴＣタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの腱組織のパーセンテージ（率）と、修復腱（ＵＴＣタイプＩおよびＩＩ）対変性腱（ＵＴＣタイプＩＩＩおよびＩＶ）の合計パーセンテージ（率）を、２００μｇ（Ｈ、Ｉ）、５００μｇ（Ｊ、Ｋ）、または１５００μｇ（Ｌ、Ｍ）の用量のＣＷＴ－００１または一致するプラセボを投与された対象について定量化した。任意の用量のＣＷＴ－００１を投与されたすべての対象（ｎ＝１８）の修復腱および変性腱の平均率を、プラセボを投与されたすべての対象（ｎ＝６）の修復腱および変性腱の平均率と比較した（Ｎ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【0167】
実施例
実施例１：ｍｉＲ－２９化合物の評価および一次薬理試験（図１～３）
様々な組み合わせで様々な化学修飾（２’－フルオロリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、デオキシリボース、および／またはホスホロチオエート）を含むｍｉＲ－２９模倣化合物のライブラリを、作製した。１つ（Ｔｅｎｏ３６）を除くすべての化合物は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む二本鎖化合物である。各化合物のガイド鎖は、天然ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａのガイド鎖（ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ；配列番号１）と同一である核酸塩基配列を有する。パッセンジャー鎖は、天然ヒト成熟ｍｉＲ２９ａのパッセンジャー鎖（ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ；配列番号２）と同一であるか、またはそれは、３’Ｇヌクレオチド（配列番号３）を欠き得るか、かつ／またはそれは、天然のｍｉＲ２９ａパッセンジャー鎖（配列番号４～６）の配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換を有し得る、核酸塩基配列を有する。表１ｂを参照のこと。 配列番号２の逆配列（配列番号７）を表す陰性対照パッセンジャー鎖も、試験した。 任意の糖およびヌクレオシド間連結（主鎖）修飾を伴う核酸塩基配列を、表１ａに示す。各化合物について、１行目は、ガイド鎖を示し、２行目は、パッセンジャー鎖を示す。すべての配列は、５’から３’の方向に示される。配列番号は、核酸塩基配列を示す（すなわち、化学修飾を除く）。Ｔｅｎｏ４６は化学修飾を含まず、そのためネイティブ成熟ｍｉＲ－２９ａに相当する。Ｔｅｎｏ３９は、以前に説明された（参考文献２）。ナトリウム塩としての例示的な化合物であるＴｅｎｏ１８の構造は、パッセンジャー鎖が３’末端でコレステロール部分にコンジュゲートされており、図１Ａ（ガイド鎖）および１Ｂ（パッセンジャー鎖）に示される。
実施例１：ｍｉＲ－２９化合物の評価および一次薬理試験（図１～３）
様々な組み合わせで様々な化学修飾（２’－フルオロリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、デオキシリボース、および／またはホスホロチオエート）を含むｍｉＲ－２９模倣化合物のライブラリを、作製した。１つ（Ｔｅｎｏ３６）を除くすべての化合物は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む二本鎖化合物である。各化合物のガイド鎖は、天然ヒト成熟ｍｉＲ－２９ａのガイド鎖（ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ；配列番号１）と同一である核酸塩基配列を有する。パッセンジャー鎖は、天然ヒト成熟ｍｉＲ２９ａのパッセンジャー鎖（ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ；配列番号２）と同一であるか、またはそれは、３’Ｇヌクレオチド（配列番号３）を欠き得るか、かつ／またはそれは、天然のｍｉＲ２９ａパッセンジャー鎖（配列番号４～６）の配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換を有し得る、核酸塩基配列を有する。表１ｂを参照のこと。 配列番号２の逆配列（配列番号７）を表す陰性対照パッセンジャー鎖も、試験した。 任意の糖およびヌクレオシド間連結（主鎖）修飾を伴う核酸塩基配列を、表１ａに示す。各化合物について、１行目は、ガイド鎖を示し、２行目は、パッセンジャー鎖を示す。すべての配列は、５’から３’の方向に示される。配列番号は、核酸塩基配列を示す（すなわち、化学修飾を除く）。Ｔｅｎｏ４６は化学修飾を含まず、そのためネイティブ成熟ｍｉＲ－２９ａに相当する。Ｔｅｎｏ３９は、以前に説明された（参考文献２）。ナトリウム塩としての例示的な化合物であるＴｅｎｏ１８の構造は、パッセンジャー鎖が３’末端でコレステロール部分にコンジュゲートされており、図１Ａ（ガイド鎖）および１Ｂ（パッセンジャー鎖）に示される。
【表2】
【0168】
したがって、以下のパッセンジャー鎖核酸塩基配列を試験した（表１ｂを参照）。配列番号２は、ネイティブヒトｍｉＲ－２９ａパッセンジャー鎖配列を表す。配列番号３は、下線で示されるように、１つの位置において配列番号２と異なる。配列番号４は、５つの位置において配列番号２と異なる。配列番号５は、６つの位置において配列番号２と異なる。配列番号６は、７つの位置において配列番号２と異なる。配列番号７は、配列番号２の逆配列であり、陰性対照を表す。
【表3】
【0169】
以下の表１ｃは、各化合物における２’糖修飾、核酸塩基配列（配列番号として）、およびヌクレオシド間連結の組み合わせを示す。Ｔｅｎｏ１～Ｔｅｎｏ４９は、５種類のガイド鎖（以下Ｇ１～Ｇ５と示す）の１つと、１１種類のパッセンジャー鎖（以下Ｐ１～Ｐ１１と示す）の１つを含む。Ｔｅｎｏ３６は、パッセンジャー鎖を含まないため例外である。すべての配列は、５’から３’の方向に示される。
【0170】
Ｔｅｎｏ１を例として挙げると、表１ｃは、それが配列番号１の核酸塩基配列を有する「Ｇ１」ガイド鎖を含むことを示し、ここで３’末端の３つのヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシドであり、残りのヌクレオシドは、未修飾リボヌクレオシドであり、すべてのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルである。パッセンジャー鎖は、「Ｐ１」であり、配列番号２の核酸塩基配列を有し、ここですべてのヌクレオシドは、交互に２’－Ｏ－メチルおよび未修飾リボヌクレオシドであり、すべてのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルである。Ｔｅｎｏ２は、Ｔｅｎｏ１と同じガイド鎖（「Ｇ１」）を含むが、異なるパッセンジャー鎖（「Ｐ２」）を含む、などである。
【表4】
【0171】
表１ｄは、パッセンジャー鎖に従って化合物をグループ化している。
【表5】
【0172】
化合物を、Ｉｎ ｖｉｔｒｏコラーゲン３ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、ネイティブヒト成熟ｍｉＲ２９ａと相対的な活性について試験した。このアッセイの基礎は、コラーゲン３由来のｍｉＲ２９ａ結合部位を含むルシフェラーゼレポーター遺伝子である。このアッセイでは、ルシフェラーゼ活性は、ｍｉＲ２９ａ活性に反比例する。これは、高いｍｉＲ２９ａ活性がコラーゲン３発現をより強力に抑制することを意味し、それは、より低いルシフェラーゼシグナルをもたらす。ルシフェラーゼアッセイを、トランスフェクション剤によるｍｉＲ－２９化合物のトランスフェクション後に、ＨＥＫ２９３細胞で実施した。ｍｉＲ－２９化合物のルシフェラーゼ活性を、市販のヒトネイティブｍｉＲ２９ａ陽性対照（「ｍｉｒ２９ａ＋ｖｅ」）およびスクランブルｍｉＲ２９ａ陰性対照（「スクランブル」）で処置した細胞と比較する（ｎ＝４）。結果を図２に示す。
【0173】
図２での「Ｃｈｏｌ．ｃｏｎｊ．」への言及は、パッセンジャー鎖の３’末端のコレステロール部分にコンジュゲートされ、かつトランスフェクション剤を使用せずにＨＥＫ２９３細胞に添加された、市販のｍｉＲ２９ａ陽性対照を指す。図２は、コレステロールコンジュゲート化合物が細胞に侵入しコラーゲン３の発現を抑制できることを示す。非コンジュゲートｍｉＲ２９ａ陽性対照と比較して、コレステロールコンジュゲート化合物による高いルシフェラーゼシグナルは、非コンジュゲートｍｉＲ２９ａ陽性対照のトランスフェクションに使用されたトランスフェクション剤の効果を反映していると考えられ、一方でトランスフェクション剤は、コレステロールコンジュゲート化合物をトランスフェクトした場合には存在しなかった。
【0174】
様々な化合物（Ｔｅｎｏ２、Ｔｅｎｏ５、Ｔｅｎｏ６、Ｔｅｎｏ７、Ｔｅｎｏ１１、Ｔｅｎｏ１２、Ｔｅｎｏ１３、Ｔｅｎｏ１５、Ｔｅｎｏ１８、Ｔｅｎｏ１９、Ｔｅｎｏ２０、Ｔｅｎｏ２５、Ｔｅｎｏ２６、Ｔｅｎｏ２７、Ｔｅｎｏ３２、Ｔｅｎｏ３３およびＴｅｎｏ３４）を、初代ヒトマクロファージにおいて炎症誘発性サイトカインＴＮＦαの産生を誘導するそれらの能力を試験することにより、潜在的免疫原性について試験した。自然免疫系の重要な構成要素としてｄｓ－ＲＮＡ分子に対して感受性がある培養初代ヒトマクロファージを、０．３５μｇ／ｍｌのｍｉＲ－２９化合物により２４時間処置し（ｎ＝４）、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ＴＬＲ７／８アゴニストであるイミキモド（ＩＭＱ）を、陽性対照（２．５μｇ／ｍｌ）として使用した。結果を図３Ａに示す。１０ｐｇ／ｍｌを超えるＴＮＦ－αの発現を誘導する化合物は、先に進めなかった。しかし、Ｔｅｎｏ１２は、それがホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含むガイド鎖を含む、試験対象（Ｔｅｎｏ１１、Ｔｅｎｏ１２、およびＴｅｎｏ１３）の中で最も低い免疫原性を有するｍｉＲ－２９化合物であっため、先に進めた。
【0175】
したがって、様々な化合物（Ｔｅｎｏ２、Ｔｅｎｏ９、Ｔｅｎｏ１２、Ｔｅｎｏ１５、Ｔｅｎｏ１８、Ｔｅｎｏ１９、Ｔｅｎｏ２０、Ｔｅｎｏ３３およびＴｅｎｏ３８）を、ヒト腱細胞におけるｃｏｌ３ａ１の発現を阻害する能力について試験した。結果を図３Ｂに示す。これは、３つのｍｉＲ－２９化合物：Ｔｅｎｏ１８、Ｔｅｎｏ２０、およびＴｅｎｏ３３の選択をもたらした。
【表6】
【0176】
Ｔｅｎｏ１８、Ｔｅｎｏ２０、およびＴｅｎｏ３３の安定性を、３７℃で３ヶ月間保管後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏコラーゲン３ルシフェラーゼレポーターアッセイで活性を測定することによって確認した。すべての化合物は安定であった。Ｔｅｎｏ１８およびＴｅｎｏ３３は、保管後に最も高い活性を示し、その後Ｔｅｎｏ２０が続いた（図３Ｃ）。
【0177】
上記のデータに基づき、Ｔｅｎｏ１８およびＴｅｎｏ３３を、ヒト腱細胞およびマウス腱損傷モデルでのｉｎ ｖｉｖｏ活性試験に進めた。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞取り込みを高めるために、コレステロール部分を、各化合物のパッセンジャー鎖の３’末端にコンジュゲートした（例えば、Ｔｅｎｏ１８については図１Ｂを参照）。Ｔｅｎｏ１８およびＴｅｎｏ３３の両方は、ヒト腱細胞（図３Ｄ）およびマウス腱損傷モデル（図３Ｅ）においてｃｏｌ３ａ１発現を効果的にノックダウンした。Ｔｅｎｏ１８による処置は、ヒト腱細胞では５日目の時点で（図３Ｄ）、かつマウス腱損傷モデルでは１日目および３日目の時点で（図３Ｅ）、最も効果的にｃｏｌ３ａ１発現をノックダウンした。
【0178】
したがって、Ｔｅｎｏ１８を、以下の実施例に記載する、さらなるｉｎ ｖｉｖｏ試験の臨床候補として選択した。
【0179】
原薬（コレステロールコンジュゲートＴｅｎｏ１８、ＣＷＴ－００１と呼ばれる）を、日常的な方法（固相合成）を使用して合成し、凍結乾燥粉末として提供する。薬物製品は、透明ガラスバイアル中で、典型的にはｐＨ７．３で、５ｍｇ／ｍＬのＣＷＴ－００１を含む滅菌溶液として提供でき、これは、投与前に注射用生理食塩水で希釈される。あるいは、ＣＷＴ－００１は、投与用の最終濃度で（例えば、約２００μｇ／ｍｌ、５００ μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、４５００μｇ／ｍｌ、または５０００μｇ／ｍｌ、例えば、約２００μｇ／ｍｌ、５００ μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、または４５００μｇ／ｍｌ）滅菌溶液として提供され得る。原薬の安定性を最適化するために、ＥＤＴＡを、例えば最終濃度０．００１％～０．００５％、例えば約０．００３％（１００μＭ）で添加できる。
【0180】
薬物製品バイアルは、－２０℃で保管および輸送でき、単回使用を意図される。凍結したバイアルは、白く曇って見える。室温への解凍時に、医薬品有効成分（ＡＰＩ）が可溶化し、無色透明の溶液になる。
【0181】
【0182】
実施例２：Ｉｎ Ｖｉｖｏ一次薬理学試験（図４）
げっ歯動物は、腱障害を起こしやすい腱（アキレス腱、膝蓋腱、棘上筋腱）を含む、ヒトと同様の四肢の解剖学的構造を有するため（参考文献１２）、検証されたマウス腱損傷モデルを、ＣＷＴ－００１による治療がコラーゲン３の発現を有意に減少させかつ腱の治癒を改善するか否かを試験するために選択した。これらの実験では、腱損傷を、直径０．７５ｍｍの生検ニードルを使用して誘導し、その直後に損傷部位に０．３５μｇ／ｍｌＣＷＴ－００１を注射した。マウスを１、３、または７日間回復させ、腱を、組織学的および分子分析のために取り出した。
げっ歯動物は、腱障害を起こしやすい腱（アキレス腱、膝蓋腱、棘上筋腱）を含む、ヒトと同様の四肢の解剖学的構造を有するため（参考文献１２）、検証されたマウス腱損傷モデルを、ＣＷＴ－００１による治療がコラーゲン３の発現を有意に減少させかつ腱の治癒を改善するか否かを試験するために選択した。これらの実験では、腱損傷を、直径０．７５ｍｍの生検ニードルを使用して誘導し、その直後に損傷部位に０．３５μｇ／ｍｌＣＷＴ－００１を注射した。マウスを１、３、または７日間回復させ、腱を、組織学的および分子分析のために取り出した。
【0183】
【0184】
実施例３：二次薬理学（図５～７）
実施例３ａ－ＣＷＴ－００１の潜在的オフターゲット効果のバイオインフォマティクス分析
マイクロＲＮＡは、その性質上、ほとんどの場合６～８ヌクレオチドのシード配列の塩基対形成を介して、多数の標的ｍＲＮＡ種と相互作用する。ＣＷＴ－００１のガイド鎖の配列は、天然ｍｉＲ２９ａの配列と同一であり、ＣＷＴ－００１がＲＩＳＣ依存機構を介して天然分子と同じｍＲＮＡを標的にすることを意味する。潜在的ハイブリダイゼーション依存のオフターゲット効果の可能性に対処するために、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方のバイオインフォマティクス分析を、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓａｆｅｔｙ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｇｕｉｄａｎｃｅにより推奨されるとおり実施した（参考文献１３を参照）。この分析は、以下に詳述する５２の遺伝子のリストを生成し、それらはＣＷＴ－００１のガイド鎖およびパッセンジャー鎖と理論的にハイブリダイズし得る。これらの遺伝子の１３個中の変異は、以下で詳述するように、既知のヒト疾患と関連していた。
実施例３ａ－ＣＷＴ－００１の潜在的オフターゲット効果のバイオインフォマティクス分析
マイクロＲＮＡは、その性質上、ほとんどの場合６～８ヌクレオチドのシード配列の塩基対形成を介して、多数の標的ｍＲＮＡ種と相互作用する。ＣＷＴ－００１のガイド鎖の配列は、天然ｍｉＲ２９ａの配列と同一であり、ＣＷＴ－００１がＲＩＳＣ依存機構を介して天然分子と同じｍＲＮＡを標的にすることを意味する。潜在的ハイブリダイゼーション依存のオフターゲット効果の可能性に対処するために、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方のバイオインフォマティクス分析を、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓａｆｅｔｙ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｇｕｉｄａｎｃｅにより推奨されるとおり実施した（参考文献１３を参照）。この分析は、以下に詳述する５２の遺伝子のリストを生成し、それらはＣＷＴ－００１のガイド鎖およびパッセンジャー鎖と理論的にハイブリダイズし得る。これらの遺伝子の１３個中の変異は、以下で詳述するように、既知のヒト疾患と関連していた。
【0185】
Ａ１）前駆体マイクロＲＮＡ配列におけるＣＷＴ－００１ガイド鎖の潜在的ハイブリダイゼーション依存傾向のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価
Ｑ－ＰＣＲ分析を、ＣＷＴ－００１による処置後の初代ヒト腱細胞におけるｍｉＲＮＡの発現レベルについて実施した。潜在的クロスハイブリダイゼーション標的を、ｈｓａ－ｍｉＲ２９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ２９ｃ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１３０２－４、ｈｓａ－ｍｉｒ－３６５７、ｈｓａ－ｍｉｒ－３６５７およびｈｓａ－ｍｉｒ－４６４７として同定した。センス（＋）方向の最上位ヒットは、標的マイクロＲＮＡｍｉＲ２９ａおよびｍｉＲ２９ｃである（ｍｉＲ２９ｂは、この分析に使用したバイオインフォマティクスパラメーターを考慮して、同定されなかった）。潜在的クロスハイブリダイゼーションの標的は、相補的（－）方向である。最上位の相補的マイクロＲＮＡ配列は、あまり特徴が明らかになっていないマイクロＲＮＡ ｈｓａ－ｍｉｒ－３６５７およびｈｓａ－ｍｉｒ－４６４７である。これらのマイクロＲＮＡの両方は、機能を有しないｉｎ ｓｉｌｉｃｏアーティファクトを示し得る。さらに、これらの配列の両方は、完全に中断された同一性の限定領域（１０ｂｐ）を共有し、ｉｎ ｖｉｖｏでの生理的濃度においてｍｉＲ２９ａ模倣体による立体阻害により強く調節されるのに十分な親和性を有する可能性は低い。
Ｑ－ＰＣＲ分析を、ＣＷＴ－００１による処置後の初代ヒト腱細胞におけるｍｉＲＮＡの発現レベルについて実施した。潜在的クロスハイブリダイゼーション標的を、ｈｓａ－ｍｉＲ２９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ２９ｃ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１３０２－４、ｈｓａ－ｍｉｒ－３６５７、ｈｓａ－ｍｉｒ－３６５７およびｈｓａ－ｍｉｒ－４６４７として同定した。センス（＋）方向の最上位ヒットは、標的マイクロＲＮＡｍｉＲ２９ａおよびｍｉＲ２９ｃである（ｍｉＲ２９ｂは、この分析に使用したバイオインフォマティクスパラメーターを考慮して、同定されなかった）。潜在的クロスハイブリダイゼーションの標的は、相補的（－）方向である。最上位の相補的マイクロＲＮＡ配列は、あまり特徴が明らかになっていないマイクロＲＮＡ ｈｓａ－ｍｉｒ－３６５７およびｈｓａ－ｍｉｒ－４６４７である。これらのマイクロＲＮＡの両方は、機能を有しないｉｎ ｓｉｌｉｃｏアーティファクトを示し得る。さらに、これらの配列の両方は、完全に中断された同一性の限定領域（１０ｂｐ）を共有し、ｉｎ ｖｉｖｏでの生理的濃度においてｍｉＲ２９ａ模倣体による立体阻害により強く調節されるのに十分な親和性を有する可能性は低い。
【0186】
Ａ２）ＮＣＢＩの参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＲＮＡ配列におけるＣＷＴ－００１ガイド鎖の潜在的ハイブリダイゼーション依存傾向のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価
Ｑ－ＰＣＲ分析を、ＣＷＴ－００１による処置後の初代ヒト腱細胞における潜在的オフターゲット遺伝子の発現レベルについて実施した。潜在的クロスハイブリダイゼーション標的を、ＬＡＭＡ２、ＰＤＥ７Ｂ、ＬＲＲＣ７３、ＮＥＴＯ１、ＦＨＬ５、ＬＩＮＣ００３０９、ＤＯＣＫ８、ＦＩＬＩＰ１、ＣＵＬ９、ＣＮＯＴ８、ＬＯＣ１００１３２０７７、ＳＣＰ２およびＰＲＯＸ２として同定した。簡潔に言えば、クロスハイブリダイゼーションに好適な相補的配向で、配列に対して１３～１４ｂｐの連続相補性を有する複数の固有の遺伝子を同定した。クロスハイブリダイゼーションの可能性を制限する、１４ｂｐを超える連続相補性を有するＲＮＡは存在しなかった。３つの遺伝子（ＬＡＭＡ２、ＤＯＣＫ８、およびＳＣＰ２）中の変異は、既知のヒトの疾患に関連している。
Ｑ－ＰＣＲ分析を、ＣＷＴ－００１による処置後の初代ヒト腱細胞における潜在的オフターゲット遺伝子の発現レベルについて実施した。潜在的クロスハイブリダイゼーション標的を、ＬＡＭＡ２、ＰＤＥ７Ｂ、ＬＲＲＣ７３、ＮＥＴＯ１、ＦＨＬ５、ＬＩＮＣ００３０９、ＤＯＣＫ８、ＦＩＬＩＰ１、ＣＵＬ９、ＣＮＯＴ８、ＬＯＣ１００１３２０７７、ＳＣＰ２およびＰＲＯＸ２として同定した。簡潔に言えば、クロスハイブリダイゼーションに好適な相補的配向で、配列に対して１３～１４ｂｐの連続相補性を有する複数の固有の遺伝子を同定した。クロスハイブリダイゼーションの可能性を制限する、１４ｂｐを超える連続相補性を有するＲＮＡは存在しなかった。３つの遺伝子（ＬＡＭＡ２、ＤＯＣＫ８、およびＳＣＰ２）中の変異は、既知のヒトの疾患に関連している。
【0187】
Ｂ１）前駆体マイクロＲＮＡ配列におけるＣＷＴ－００１パッセンジャー鎖の潜在的ハイブリダイゼーション依存傾向のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価
ｑＰＣＲ分析を、ＣＷＴ－００１による処置後の初代ヒト腱細胞におけるｍｉＲＮＡの発現レベルについて実施した。潜在的クロスハイブリダイゼーションタ標的を、ｈｓａ－ｍｉＲ２９ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－５１８６、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ａｔ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２８３－２、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５４、ｈｓａ－ｍｉｒ－４７８２、ｈｓａ－ｍｉｒ－５１５－１、ｈｓａｍｉｒ５１５－２、ｈｓａ－ｍｉｒ－５６９１として同定した。最上位の相補的マイクロＲＮＡ配列は、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ａｔ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２８３－２、およびｈｓａ－ｍｉｒ－５１５ファミリーである。すべてのこれらの配列は、完全に中断された同一性の限定領域（１１ｂｐまたはそれ以下）を共有し、ｉｎ ｖｉｖｏでの生理的濃度においてＣＷＴ－００１による立体阻害により強く調節されるのに十分な親和性を有する可能性は低い。
ｑＰＣＲ分析を、ＣＷＴ－００１による処置後の初代ヒト腱細胞におけるｍｉＲＮＡの発現レベルについて実施した。潜在的クロスハイブリダイゼーションタ標的を、ｈｓａ－ｍｉＲ２９ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－５１８６、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ａｔ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２８３－２、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５４、ｈｓａ－ｍｉｒ－４７８２、ｈｓａ－ｍｉｒ－５１５－１、ｈｓａｍｉｒ５１５－２、ｈｓａ－ｍｉｒ－５６９１として同定した。最上位の相補的マイクロＲＮＡ配列は、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ａｔ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２８３－２、およびｈｓａ－ｍｉｒ－５１５ファミリーである。すべてのこれらの配列は、完全に中断された同一性の限定領域（１１ｂｐまたはそれ以下）を共有し、ｉｎ ｖｉｖｏでの生理的濃度においてＣＷＴ－００１による立体阻害により強く調節されるのに十分な親和性を有する可能性は低い。
【0188】
Ｂ２）ＮＣＢＩの参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＲＮＡ配列におけるＣＷＴ－００１パッセンジャー鎖の潜在的ハイブリダイゼーション依存傾向のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価
ｑＰＣＲ分析を、ＣＷＴ－００１による処置後の初代ヒト腱細胞における潜在的オフターゲット遺伝子の発現レベルについて実施した。潜在的クロスハイブリダイゼーション標的を、ＰＤＣＤ１０、ＩＴＧＢ６、ＬＰＧＡＴ１、ＢＰＴＦ、ＣＴＴＮＢＰ２、ＥＩＦ４Ａ３、ＫＩＡＡ１２１０、ＳＬＣ７Ａ１１－ＡＳ１、ＴＨＳＤ４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＮＫＬＥ２、ＡＲＬ４Ａ、ＡＴＧ１４、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＣＤＣ８３、ＣＤＨ４、ＣＬＶＳ１、ＤＫＦＺｐ４３４Ｌ１９２、ＥＴＶ７、ＦＢＸＯ４５、ＫＣＮＪ１、ＬＩＮＣ０１９７３、ＭＣＦ２Ｌ２、ＭＥＴＴＬ５、ＮＢＮ、ＰＯＣ１Ｂ、ＲＡＶＥＲ２、ＲＰＡ２、ＺＮＦ４４１、ＺＮＦ６６７およびＯＰＣＭＬとして同定した。９つの遺伝子（ＡＮＫＬＥ２、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＰＴＦ、ＥＩＦＡ３、ＩＴＧＢ６、ＫＣＮＪ１、ＮＢＮ、ＰＤＣＤ１０、ＰＯＣ１Ｂ、＆ＴＮＦＡＩＰ３）中の変異は、既知のヒトの疾患に関連している。
ｑＰＣＲ分析を、ＣＷＴ－００１による処置後の初代ヒト腱細胞における潜在的オフターゲット遺伝子の発現レベルについて実施した。潜在的クロスハイブリダイゼーション標的を、ＰＤＣＤ１０、ＩＴＧＢ６、ＬＰＧＡＴ１、ＢＰＴＦ、ＣＴＴＮＢＰ２、ＥＩＦ４Ａ３、ＫＩＡＡ１２１０、ＳＬＣ７Ａ１１－ＡＳ１、ＴＨＳＤ４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＡＮＫＬＥ２、ＡＲＬ４Ａ、ＡＴＧ１４、ＢＣＬ１１Ａ、ＣＣＤＣ８３、ＣＤＨ４、ＣＬＶＳ１、ＤＫＦＺｐ４３４Ｌ１９２、ＥＴＶ７、ＦＢＸＯ４５、ＫＣＮＪ１、ＬＩＮＣ０１９７３、ＭＣＦ２Ｌ２、ＭＥＴＴＬ５、ＮＢＮ、ＰＯＣ１Ｂ、ＲＡＶＥＲ２、ＲＰＡ２、ＺＮＦ４４１、ＺＮＦ６６７およびＯＰＣＭＬとして同定した。９つの遺伝子（ＡＮＫＬＥ２、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＰＴＦ、ＥＩＦＡ３、ＩＴＧＢ６、ＫＣＮＪ１、ＮＢＮ、ＰＤＣＤ１０、ＰＯＣ１Ｂ、＆ＴＮＦＡＩＰ３）中の変異は、既知のヒトの疾患に関連している。
【0189】
Ｃ）ヒト腱細胞における試験
予測された潜在的相互作用のいずれかが生じたかを確認するために、２４時間１００μｇ／ｍｌ ＣＷＴ－００１で処置したヒト腱細胞中における潜在的オフターゲットｍＲＮＡの発現レベルのｑＰＣＲによる測定を、実施した。５２の潜在的オフターゲット遺伝子のうち、１２のみが腱細胞中で発現され、このうちヒト疾患に関連することが知られている遺伝子の４つのみ（ＡＮＫＬＥ２、ＳＣＰ２、ＢＰＴＦ、ＥＩＦＡ３）が、腱細胞中で発現された。重要なことに、ＣＷＴ－００１による処置は、ＣＷＴ－００１の潜在的オフターゲットとして強調される遺伝子のいずれの発現にも変化を与えなかった。
予測された潜在的相互作用のいずれかが生じたかを確認するために、２４時間１００μｇ／ｍｌ ＣＷＴ－００１で処置したヒト腱細胞中における潜在的オフターゲットｍＲＮＡの発現レベルのｑＰＣＲによる測定を、実施した。５２の潜在的オフターゲット遺伝子のうち、１２のみが腱細胞中で発現され、このうちヒト疾患に関連することが知られている遺伝子の４つのみ（ＡＮＫＬＥ２、ＳＣＰ２、ＢＰＴＦ、ＥＩＦＡ３）が、腱細胞中で発現された。重要なことに、ＣＷＴ－００１による処置は、ＣＷＴ－００１の潜在的オフターゲットとして強調される遺伝子のいずれの発現にも変化を与えなかった。
【0190】
データは、ＣＷＴ－００１による処置が、初代ヒト腱細胞においてオフターゲット効果を生じないことを示す。
【0191】
実施例３ｂ－初代ヒトマクロファージにおけるＣＷＴ－００１の免疫原性評価
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ－ＲＮＡ）は、免疫応答を誘発し得る（参考文献１４）。ＣＷＴ－００１が免疫反応を誘発し得るかを試験するために、自然免疫系の重要な構成要素としてｄｓ－ＲＮＡ分子に対して感受性である培養初代ヒトマクロファージを、０．３５μｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１で２４時間処置し（ｎ＝４）、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、ＣＷＴ－００１処置細胞中においてＴＮＦαの誘導がないことを示した（図５）。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓ－ＲＮＡ）は、免疫応答を誘発し得る（参考文献１４）。ＣＷＴ－００１が免疫反応を誘発し得るかを試験するために、自然免疫系の重要な構成要素としてｄｓ－ＲＮＡ分子に対して感受性である培養初代ヒトマクロファージを、０．３５μｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１で２４時間処置し（ｎ＝４）、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、ＣＷＴ－００１処置細胞中においてＴＮＦαの誘導がないことを示した（図５）。
【0192】
インターフェロン誘導性遺伝子パネル（ＯＡＳ２、ＩＮＦα、ＩＦＴＭ１、ＭＸ１、ＩＲＦ９、およびＯＡＳ１）のｑＰＣＲ分析を、追加で実施した。サンプルを、１８Ｓ ｒＲＮＡレベルに対して正規化し、未処置対照と比較した倍率変化として表した（ｎ＝３）。ｑＰＣＲ分析は、ＣＷＴ－００１処置マクロファージの発現における変化を示さなかった（図６）。
【0193】
まとめると、これらのデータは、ＣＷＴ－００１がヒトマクロファージにおいて免疫原性を誘導しないことを示す。
【0194】
実施例３ｃ－マウスにおけるＣＷＴ－００１の免疫原性評価
ＣＷＴ－００１の免疫原性を、膝蓋腱中へのＣＷＴ－００１注射後のマウスにおいて試験した。動物に、５０μｌの０．３５μｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１またはＰＢＳを腱内注射した（ｎ＝３）。既知のインターフェロン応答遺伝子ＭＸ１、ＯＡＳ２、ＩＦＩＴＭ１、およびＩＲＦ９の発現を、１日目、３日目、７日目にｑＰＣＲにより測定し、ＰＢＳ対照と比較した。結果として得られたデータは、インターフェロン応答性遺伝子の発現の増加を示さず、ＣＷＴ－００１が非免疫原性であることを示唆する（図７）。実際に、データは、ＰＢＳ対照と比較してＣＷＴ－００１により処置したマウスにおけるインターフェロン応答性遺伝子のより低い発現レベルにより反映されるように、ＣＷＴ－００１が抗炎症活性を有することを示唆する。
ＣＷＴ－００１の免疫原性を、膝蓋腱中へのＣＷＴ－００１注射後のマウスにおいて試験した。動物に、５０μｌの０．３５μｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１またはＰＢＳを腱内注射した（ｎ＝３）。既知のインターフェロン応答遺伝子ＭＸ１、ＯＡＳ２、ＩＦＩＴＭ１、およびＩＲＦ９の発現を、１日目、３日目、７日目にｑＰＣＲにより測定し、ＰＢＳ対照と比較した。結果として得られたデータは、インターフェロン応答性遺伝子の発現の増加を示さず、ＣＷＴ－００１が非免疫原性であることを示唆する（図７）。実際に、データは、ＰＢＳ対照と比較してＣＷＴ－００１により処置したマウスにおけるインターフェロン応答性遺伝子のより低い発現レベルにより反映されるように、ＣＷＴ－００１が抗炎症活性を有することを示唆する。
【0195】
これらのデータは、ＣＷＴ－００１はマウス腱損傷モデルにおいて免疫原性を誘導せず、かつ抗炎症活性を有すると考えられることを示す。
【0196】
実施例４：薬物動態／トキシコキネティクス（図８～１２）
実施例４ａ－前臨床モデルにおけるＣＷＴ－００１の検出
ラットおよびイヌＲＮＡにおけるＣＷＴ－００１を検出するための２段階逆転写定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ＱＰＣＲ）法を、検証した。アッセイは、マトリックスＲＮＡの不在下で、１０８～１０３コピーで直線的であった。３名の分析者による、マトリックスごとに７回のアッセイ内およびアッセイ間の正確性および精度評価試験は、確立された範囲での本方法の堅牢性を実証した。
実施例４ａ－前臨床モデルにおけるＣＷＴ－００１の検出
ラットおよびイヌＲＮＡにおけるＣＷＴ－００１を検出するための２段階逆転写定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ＱＰＣＲ）法を、検証した。アッセイは、マトリックスＲＮＡの不在下で、１０８～１０３コピーで直線的であった。３名の分析者による、マトリックスごとに７回のアッセイ内およびアッセイ間の正確性および精度評価試験は、確立された範囲での本方法の堅牢性を実証した。
【0197】
各マトリックスのＲＮＡＱＣプールサンプルを、内因性ベースラインレベルを評価するための内因性対照として調製した。サンプル分析中に、ＲＮＡ ＱＣプールサンプルを、ＱＣサンプルのデータ正規化のために、および予想されるＣｔ値および決定されるコピー数を決定するために使用する。ＲＮＡ ＱＣプールのサンプルを、次の値以内に設定する：
－Ｃｔ２４．７７１～２６．６９７および／または６．６７Ｅ＋０３～３．３１Ｅ＋０４コピー／反応ラット血漿
－Ｃｔ２５．１９５～２７．４９６および／または１．３８Ｅ＋０３～２．７９Ｅ＋０４コピー／反応イヌ血漿
－ラット腱について、Ｃｔ２３．２８４～２４．３５２および／または５．４５Ｅ＋０４～８．８１Ｅ＋０４コピー／反応
－イヌ腱について、Ｃｔ２３．１３５～２４．３３９および／または５．４９Ｅ＋０４～９．８８Ｅ＋０４コピー／反応
－Ｃｔ２４．７７１～２６．６９７および／または６．６７Ｅ＋０３～３．３１Ｅ＋０４コピー／反応ラット血漿
－Ｃｔ２５．１９５～２７．４９６および／または１．３８Ｅ＋０３～２．７９Ｅ＋０４コピー／反応イヌ血漿
－ラット腱について、Ｃｔ２３．２８４～２４．３５２および／または５．４５Ｅ＋０４～８．８１Ｅ＋０４コピー／反応
－イヌ腱について、Ｃｔ２３．１３５～２４．３３９および／または５．４９Ｅ＋０４～９．８８Ｅ＋０４コピー／反応
【0198】
－８０℃を維持するように設定された冷凍庫に保管されたラットおよびイヌのスパイク腱サンプル中のＣＷＴ－００１の安定性を、評価し、それは、最長１ヶ月間の安定性を示した。
【0199】
これらの試験で使用された方法は、ラットおよびイヌのＲＮＡ中のＣＷＴ－００１の抽出および測定に適合していると考えられた。
【0200】
実施例４ｂ－ヒト血清におけるＣＷＴ－００１の検出可能性および安定性
ＣＷＴ－００１が体循環に入った場合、ヒト血清中の内因性ｍｉＲ２９ａのバックグラウンドレベルに対するＣＷＴ－００１の検出可能期間を、測定した。ＣＷＴ－００１を、成人ヒトでの静脈内（ＩＶ）送達直後に予測されるものと同等の濃度に希釈した（成人の平均血液量５リットルに基づき、血清１ｍｌ中１：５，０００）。０、２、２０、１００ｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１のサンプルを、０時間、６時間、１２時間および２４時間、３７℃で新鮮ヒト血清とインキュベートした。ＭｉＲ２９ａレベルを、ｑＰＣＲによって測定し、対照におけるＣｅｌ３９スパイクに対して正規化し、未処置サンプル（ｎ＝３）と比較した相対的発現として示した（図８）。ＣＷＴ－００１に起因するｍｉＲ２９ａの増加は、ＣＷＴ－００１の添加後１分未満で精製されたサンプルでのみ観察され、ｍｉＲ２９ａレベルは、６時間後に未処置レベル近くに戻った。このデータは、ＣＷＴ－００１が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト血清中で検出不可能なレベルに急速に分解されることを示している。
ＣＷＴ－００１が体循環に入った場合、ヒト血清中の内因性ｍｉＲ２９ａのバックグラウンドレベルに対するＣＷＴ－００１の検出可能期間を、測定した。ＣＷＴ－００１を、成人ヒトでの静脈内（ＩＶ）送達直後に予測されるものと同等の濃度に希釈した（成人の平均血液量５リットルに基づき、血清１ｍｌ中１：５，０００）。０、２、２０、１００ｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１のサンプルを、０時間、６時間、１２時間および２４時間、３７℃で新鮮ヒト血清とインキュベートした。ＭｉＲ２９ａレベルを、ｑＰＣＲによって測定し、対照におけるＣｅｌ３９スパイクに対して正規化し、未処置サンプル（ｎ＝３）と比較した相対的発現として示した（図８）。ＣＷＴ－００１に起因するｍｉＲ２９ａの増加は、ＣＷＴ－００１の添加後１分未満で精製されたサンプルでのみ観察され、ｍｉＲ２９ａレベルは、６時間後に未処置レベル近くに戻った。このデータは、ＣＷＴ－００１が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト血清中で検出不可能なレベルに急速に分解されることを示している。
【0201】
ヒト血清サンプル中におけるＣＷＴ－００１の動態をさらに定義するために、追加の試験を、より早い時点（０分、１５分、３０分、および４５分；１時間、６時間、１２時間、および２４時間）に焦点を当てて実施した。ＭｉＲ２９ａレベルを、ｑＰＣＲによって測定し、値を、対照におけるＣｅｌ３９スパイクに対して正規化し、未処置サンプル（ｎ＝３）と比較した相対的倍率変化として示した（図９）。データは、ＣＷＴ－００１レベルが、血清への添加直後に測定された場合、バックグラウンドの平均レベルの２７５倍に増加し、１５分後にはバックグラウンドの６１倍に低下することを示した。１時間までに、レベルは、バックグラウンドの１１倍に低下し、その後１２時間でバックグラウンドレベルに低下した。
【0202】
実施例４ｃ－ＩＶ投与後のＣＷＴ－００１の薬物動態および分布
静脈内注射後のＣＷＴ－００１のｉｎ ｖｉｖｏ分布を調査するために、マウスに５０ｍｇ／ｍｌ ＣＷＴ－００１ ５０μｌを注射し、血清、心臓、肝臓、腎臓、脾臓および筋肉を、０日、１日、４日、７日後に採取した。ＣＷＴ－００１レベルを、ｍｉＲ２９ａ ｑＰＣＲアッセイを使用して測定し、値を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、未処置対照と比較した相対倍率変化として示した。血清サンプルを、対照においてスパイクされたＣｅｌ３９に対して正規化し、未処置対照に対する倍率変化として示した（ｎ＝４）（図１０）。このデータは、生理食塩水対照と比較して、血清または臓器中のｍｉＲ２９ａレベルの増加をほとんどまたはまったく示さなかった。肺中のｍｉＲ２９ａレベルのわずかな増加が、１日目に観察され、それは４日目までにベースラインに戻った。
静脈内注射後のＣＷＴ－００１のｉｎ ｖｉｖｏ分布を調査するために、マウスに５０ｍｇ／ｍｌ ＣＷＴ－００１ ５０μｌを注射し、血清、心臓、肝臓、腎臓、脾臓および筋肉を、０日、１日、４日、７日後に採取した。ＣＷＴ－００１レベルを、ｍｉＲ２９ａ ｑＰＣＲアッセイを使用して測定し、値を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、未処置対照と比較した相対倍率変化として示した。血清サンプルを、対照においてスパイクされたＣｅｌ３９に対して正規化し、未処置対照に対する倍率変化として示した（ｎ＝４）（図１０）。このデータは、生理食塩水対照と比較して、血清または臓器中のｍｉＲ２９ａレベルの増加をほとんどまたはまったく示さなかった。肺中のｍｉＲ２９ａレベルのわずかな増加が、１日目に観察され、それは４日目までにベースラインに戻った。
【0203】
これらのデータは、ＣＷＴ－００１が、典型的な臨床用量レベルの２５倍（すなわち、１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１のヒト臨床用量のマウス相当量である、ｌ５０μｌの２ｍｇ／ｍの２５倍）で投与された場合でも、静脈内投与後に組織中で無視できる分布を有することを示している。
【0204】
実施例４ｄ－腱内注射後の循環中のＣＷＴ－００１の全身曝露
ＣＷＴ－００１の全身曝露の測定を、マウスの膝蓋腱内に２ｍｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１またはＰＢＳ対照の２５μｌを注射したマウスで実施し（各群ｎ＝４）、血液を、０、１５、３０分、１、２、４、６、２４、７２時間目に採取した。ＣＷＴ－００１レベルを、ｍｉＲ２９ａ ｑＰＣＲアッセイを使用して測定し、値を、対照においてＣｅｌ３９スパイクに対し正規化し、ＰＢＳ対照に対する倍率変化として表した（ｎ＝４）。
ＣＷＴ－００１の全身曝露の測定を、マウスの膝蓋腱内に２ｍｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１またはＰＢＳ対照の２５μｌを注射したマウスで実施し（各群ｎ＝４）、血液を、０、１５、３０分、１、２、４、６、２４、７２時間目に採取した。ＣＷＴ－００１レベルを、ｍｉＲ２９ａ ｑＰＣＲアッセイを使用して測定し、値を、対照においてＣｅｌ３９スパイクに対し正規化し、ＰＢＳ対照に対する倍率変化として表した（ｎ＝４）。
【0205】
腱内投与後に、注射２時間後および４時間後で血中のｍｉＲ２９ａレベルの増加が、見られた。ｍｉＲ２９ａレベルは、６時間でバックグラウンドレベルに戻った（図１１）。このデータは、ＣＷＴ－００１が腱内注射後に循環に入る一方で、それは、おそらく血清ヌクレアーゼによる分解および腎臓からの排泄により、急速に除去されることを示唆している。全身で観察される内因性ｍｉＲ２９ａの絶対レベルは、非常に低い（例えば、細胞中に存在する濃度と比較して）。したがって、ＣＷＴ－００１注射後２時間および４時間で観察された５～１４倍の全身ｍｉＲ２９レベルの相対的増加（図１１）は、依然として非常に低い絶対全身ｍｉＲ２９ａレベルに変換される。さらに、上記のとおり、血清ＣＷＴ－００１の大部分は、急速に除去される。ＣＷＴ－００１の１％未満が最終的に、血清を介して細胞により取り込まれる。全体として、これは、非常に低い絶対レベルの投与されたＣＷＴ－００１のみが、全身曝露により非標的細胞に侵入することを意味する。観察されたＣＷＴ－００１の全身的な増加はしたがって、その中へＣＷＴ－００１が投与される組織（例えば、腱）内の標的細胞以外の細胞において、何らかの薬力学的作用を及ぼしそうにない。
【0206】
このデータは、ＣＷＴ－００１が腱内注射後の制限された全身分布を有することを示している。
【0207】
実施例４ｅ－腱内投与後のＣＷＴ－００１の分布
腱内注射後のＣＷＴ－００１組織分布を理解するために、マウスの膝蓋腱に４、２０、４０、および５０ｍｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１またはＰＢＳ対照の５０μｌを注射した。臓器および末梢血を、７日後に採取した。ＣＷＴ－００１レベルを、ｍｉＲ２９ａ ｑＰＣＲアッセイを使用して測定し、値を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、未処置対照と比較した相対倍率変化として示した。血清サンプルを、対照においてスパイクされたＣｅｌ３９に対して正規化し、プラセボ（ｎ＝４）に対する倍率変化として示した。得られたデータ（図１２）は、プラセボと比較して、いかなる濃度においてもいずれの臓器においてもｍｉＲ２９ａレベルの有意な増加を示さなかった。脾臓中２つの最高用量において有意性の傾向が認められ、これらは、典型的な同等のヒトのいずれの臨床用量よりも高かった。
腱内注射後のＣＷＴ－００１組織分布を理解するために、マウスの膝蓋腱に４、２０、４０、および５０ｍｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１またはＰＢＳ対照の５０μｌを注射した。臓器および末梢血を、７日後に採取した。ＣＷＴ－００１レベルを、ｍｉＲ２９ａ ｑＰＣＲアッセイを使用して測定し、値を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、未処置対照と比較した相対倍率変化として示した。血清サンプルを、対照においてスパイクされたＣｅｌ３９に対して正規化し、プラセボ（ｎ＝４）に対する倍率変化として示した。得られたデータ（図１２）は、プラセボと比較して、いかなる濃度においてもいずれの臓器においてもｍｉＲ２９ａレベルの有意な増加を示さなかった。脾臓中２つの最高用量において有意性の傾向が認められ、これらは、典型的な同等のヒトのいずれの臨床用量よりも高かった。
【0208】
これらのデータは、ＣＷＴ－００１が、最も高い典型的なヒト臨床同等用量の最大２５倍である最高用量であっても、無視できる組織中分布を有することを示している。
【0209】
実施例４ｆ－単回用量毒性試験における腱内投与後のラットにおけるトキシコキネティクス
トキシコキネティクス評価を、１４日間の回復期間を伴うラットにおける腱内注射によるＣＷＴ－００１の単回投与毒性試験のデザインに組み込んだ（実施例５ｃ）。
トキシコキネティクス評価を、１４日間の回復期間を伴うラットにおける腱内注射によるＣＷＴ－００１の単回投与毒性試験のデザインに組み込んだ（実施例５ｃ）。
【0210】
ラットを、生理食塩水対照、１０ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１の３０μＬ注射（すなわち、総用量０、０．３または１．５ｍｇ）で処置した。血液サンプルを、投与後０．５、１、２、４、８および２４時間において、各群、各性別３匹の動物の頚静脈から採取し、血漿を、調製した。血漿サンプルを、検証済み分析手段（ＲＴ－ＱＰＣＲ）を使用して、ＣＷＴ－００１の濃度について分析した。
【0211】
トキシコキネティクスパラメーターを、この試験で腱内投与経路と一致する非コンパートメントアプローチを使用して推定した。トキシコキネティクスパラメーターの概要を、以下の表２に示す。
血漿ＣＷＴ－００１濃度対時間プロファイルは、急速な吸収相を示した（Ｔｍａｘは、すべてのプロファイルで０．５時間であった）。血漿ＣＷＴ－００１濃度は、投与後４時間まで多段階的に減少し、その後、雌では、濃度は、８時間までわずかに増加した（定量可能な最終濃度、０．３ｍｇ）か、またはサンプリング期間（２４時間）の終了時（１．５ｍｇ）まで比較的一定の状態のままであった。雄では、両方の用量の濃度は、４時間後、サンプリング期間の終了（２４時間）まで一定の状態のままであった。０．３ｍｇから１．５ｍｇへの用量の増加に伴い、ＣＷＴ－００１への全身曝露量は概して、雌では用量比例より少なく増加し、雄では用量比例よりも大きく増加した。ＣＷＴ－００１への全身曝露は、０．３ｍｇおよび１．５ｍｇの用量レベルの両方で雌よりも雄において高かった。
【表7】
【0212】
実施例４ｇ－単回用量毒性試験における腱内投与後のイヌにおけるトキシコキネティクス
トキシコキネティクス評価を、１４日間の回復期間を伴うイヌにおける腱内注射によるＣＷＴ－００１の単回投与毒性試験のデザインに組み込んだ（実施例５ｄ）。
トキシコキネティクス評価を、１４日間の回復期間を伴うイヌにおける腱内注射によるＣＷＴ－００１の単回投与毒性試験のデザインに組み込んだ（実施例５ｄ）。
【0213】
イヌを、生理食塩水対照、１０ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌのＣＷＴ－００１の２５０μＬ注射（すなわち、総用量０、２．５または１２．５ｍｇ）で処置した。血液サンプルを、投与後０．５、１、２、４、６および４８時間において、各群、各性別３匹の動物の頚静脈から採取し、血漿を、調製した。血漿サンプルを、検証済み分析手段（ＲＴ－ＱＰＣＲ）を使用して、ＣＷＴ－００１の濃度について分析した。
【0214】
トキシコキネティクスパラメーターを、この試験で腱内投与経路と一致する非コンパートメントアプローチを使用して推定した。トキシコキネティクスパラメーターの概要を以下に示す。
【表8】
【0215】
血漿ＣＷＴ－００１濃度対時間プロファイルは、急速な吸収相を示した（０．５時間または１時間のＴｍａｘの中央値）。これに続いて、濃度が二相的に減少し、最初に、投与後１時間または２時間まで急速に、次に定量可能な最終濃度まで緩やかな速度で減少した（投与後４～６時間で濃度のわずかな上昇を示した、１２．５ｍｇを投与された雌を除く）。用量を２．５ｍｇから１２．５ｍｇに増加させると、ＣＷＴ－００１への全身曝露は、雌では、概して用量比例より多く増加し、雄では、用量比例より少なく増加した。ＣＷＴ－００１への全身曝露は、２．５ｍｇの用量レベルでは、雌より雄の方が多かったが、１２．５ｍｇでは性別間で同等であった。
【0216】
実施例５：毒物学
実施例５ａ－ラットにおける単回腱内注射によるＣＷＴ－００１の忍容性試験
本試験の目的は、最大実行可能用量（ＭＦＤ）を確立および確認することを目的として、腱内注射によりラットに投与した場合のＣＷＴ－００１の潜在的毒性を決定することであった。試験デザインを以下の表４に示す。
実施例５ａ－ラットにおける単回腱内注射によるＣＷＴ－００１の忍容性試験
本試験の目的は、最大実行可能用量（ＭＦＤ）を確立および確認することを目的として、腱内注射によりラットに投与した場合のＣＷＴ－００１の潜在的毒性を決定することであった。試験デザインを以下の表４に示す。
【表9】
【0217】
各動物は、０．５ｍＬインスリンシリンジを使用して、右アキレス腱にＣＷＴ－００１の単回腱内投与（３０μＬ）を受けた。動物を、イソフルランを使用して麻酔し、腱を、後肢に小さい外科的切開を用いて露出させて、ＣＷＴ－００１の配置を可能にした。用量を投与後、動物を、縫合して閉じた。
【0218】
最高用量レベル（１．５ｍｇ）は、試験品の溶解度および腱に合理的に注射され得る容量によって制限される、この経路によって投与され得る実行可能な最大用量を表す。以下のパラメーターおよびエンドポイントを、本試験で評価した：臨床観察、体重、および肉眼的剖検所見。ＣＷＴ－００１に関連すると考えられる臨床徴候、体重の変化、肉眼的剖検所見はなかった。
【0219】
結論として、単回腱内投与によるＣＷＴ－００１の投与は、ＨａｎＷｉｓｔａｒラットにおいて１．５ｍｇまで良好な忍容性を示し、臨床観察、体重の変化、または肉眼的剖検所見は観察されなかった。
【0220】
実施例５ｂ－イヌにおける単回腱内注射によるＣＷＴ－００１の忍容性試験
本試験の目的は、イヌに単回腱内注射した場合のＣＷＴ－００１の潜在的毒性を決定し、その後の１４日間の毒性試験のための用量レベルの選択を裏付けるデータを提供することであった。試験デザインを以下の表５に示す。
本試験の目的は、イヌに単回腱内注射した場合のＣＷＴ－００１の潜在的毒性を決定し、その後の１４日間の毒性試験のための用量レベルの選択を裏付けるデータを提供することであった。試験デザインを以下の表５に示す。
【表10】
【0221】
各動物は、シリンジを使用して、右アキレス腱内にＣＷＴ－００１の単回腱内投与（２５０μＬ）を受けた。動物を、イソフルランを使用して麻酔し、腱を、後肢に小さい外科的切開を用いて腱を露出させて、ＣＷＴ－００１の配置を可能にした。用量を投与後、動物を、縫合して閉じた。
【0222】
使用した用量レベル（１２．５ｍｇ）は、試験品の溶解度および腱に合理的に注射され得る容量によって制限される、この経路によって投与され得る実行可能な最大用量を表す。次のパラメーターおよびエンドポイントを、この試験で評価した：臨床観察、体重、摂食量、臨床病理パラメーター（血液学、凝固および臨床化学）、肉眼的剖検所見および臓器重量。
【0223】
ＣＷＴ－００１の臨床観察はなく、体重、摂食量、血液学、凝固、臨床化学パラメーターの変化もなかった。さらに、ＣＷＴ－００１に関連すると考えられる肉眼的剖検所見または臓器重量の変化はなかった。結論として、ビーグル犬における単回腱内投与によるＣＷＴ－００１の投与は、１２．５ｍｇで良好な忍容性を示し、臨床観察は認められず、体重、摂食量または臨床病理学的パラメーターの変化はなく、肉眼的病理学または臓器重量所見の変化もなかった。
【0224】
実施例５ｃ－１４日間の回復期間を伴うラットにおける腱内注射によるＣＷＴ－００１の単回投与毒性試験
本試験の目的は、ラットに単回腱内注射した場合のＣＷＴ－００１の潜在的毒性を決定すること、かつ注射後の１４日間の回復期間にわたる任意の所見の潜在的可逆性を評価することであった。さらに、ＣＷＴ－００１のトキシコキネティクス特性を、決定した。試験デザインを以下の表６に示す。
次のパラメーターおよびエンドポイントを、本試験で評価した：臨床観察、体重、摂食量、眼科、行動観察（Ｉｒｗｉｎスコア）、呼吸測定、臨床病理学パラメーター（血液学、凝固、臨床化学、および尿検査）、生物分析およびトキシコキネティクスパラメーター、肉眼的剖検所見、臓器重量、および病理組織学的検査。
本試験の目的は、ラットに単回腱内注射した場合のＣＷＴ－００１の潜在的毒性を決定すること、かつ注射後の１４日間の回復期間にわたる任意の所見の潜在的可逆性を評価することであった。さらに、ＣＷＴ－００１のトキシコキネティクス特性を、決定した。試験デザインを以下の表６に示す。
【表11】
【0225】
最高用量レベル（１．５ｍｇ）は、試験品の溶解度およびラットの腱内に合理的に注射され得る容量によって制限される、この経路によって投与され得る実行可能な最大用量を表す（実施例５ａ参照）。すべての製剤分析結果は、理論濃度の１０％（個々の値は１５％以内）である許容基準以内であることがわかった。
【0226】
本試験の過程において予期せぬ死亡はなかった。ＣＷＴ－００１に関連すると考えられた臨床徴候、体重および摂食量、検眼鏡所見、行動観察の変化、呼吸パラメーターの変化、臓器重量の変化、肉眼的所見および組織病理学的所見はなかった。０．３ｍｇまたは１．５ｍｇでは、雄および雌の両方で、３日目に赤血球量（赤血球、ヘマトクリット、およびヘモグロビン）におけるわずかであるが用量依存的な減少、および網赤血球における増加があった。すべての変化は、１５日目までに回復を示した。
【0227】
結論として、単回腱内投与によるＣＷＴ－００１の投与は、１．５ｍｇまでＨａｎ Ｗｉｓｔａｒラットにおいて良好に許容され、３日目の赤血球量の一時的なわずかな低下および網状赤血球の増加と関連し、これは、１５日目までに回復を示した。ＣＷＴ－００１に関連する他の生存中のまたはいかなる病理組織学的な所見はなかった。
【0228】
実現可能な最大用量で投与したこの研究の結果に基づいて、１．５ｍｇのＣＷＴ－００１は、ラットにおいて無毒性量（ＮＯＡＥＬ）であると考えられた。
【0229】
実施例５ｄ－１４日間の回復期間を伴うイヌにおける腱内注射によるＣＷＴ－００１の単回投与毒性試験
【0230】
本試験の目的は、イヌに単回腱内注射した場合のＣＷＴ－００１の潜在的毒性を決定すること、かつあらゆる所見の潜在的可逆性を評価することであった。さらに、ＣＷＴ－００１のトキシコキネティクス特性を、決定した。
【0231】
各動物は、ＣＷＴ－００１の単回投与を受け、主要試験動物は、３日目に安楽死させ、回復動物は、１５日目に安楽死させた。試験デザインを以下の表７に示す。
次のパラメーターおよびエンドポイントを、本試験で評価した：臨床観察、体重、摂食量、眼科、心血管データ、臨床病理学パラメーター（血液学、凝固、臨床化学、および尿検査）、生物分析（血漿および腱）およびトキシコキネティクスパラメーター、肉眼的剖検所見、臓器重量、および病理組織学的検査。
【表12】
【0232】
最高用量レベル（１２．５ｍｇ）は、試験品の溶解度およびイヌの腱に合理的に注射され得る容量によって制限される、この経路によって投与され得る実行可能な最大用量を表す（実施例５ｂ参照）。すべての製剤分析結果は、理論濃度の１０％（個々の値は１５％以内）である許容基準以内であることがわかった。
【0233】
本試験の過程において予期せぬ死亡はなかった。ＣＷＴ－００１に関連すると考えられた臨床徴候、体重または摂食量の変化、検眼鏡所見、心電図所見、臨床病理学所見（血液学、凝固、臨床化学および尿検査）、臓器重量の変化、または肉眼的もしくは組織病理学的な所見はなかった。
【0234】
結論として、単回腱内投与によるＣＷＴ－００１の投与は、１２．５ｍｇまでビーグル犬において良好に許容され、投与処置に関連する所見のみと関連した。ＣＷＴ－００１に関連する生存中のまたは病理組織学的な所見はなかった。実現可能な最大用量で投与したこの研究の結果に基づいて、１２．５ｍｇのＣＷＴ－００１は、イヌにおいて無毒性量（ＮＯＡＥＬ）であると考えられた。
【0235】
実施例６：安全性薬理学
安全性薬理学エンドポイントを、中枢神経系、呼吸器および心臓血管への効果を評価するために、ラットおよびイヌの単回投与毒性試験（それぞれ実施例５ｃおよび５ｄ）のデザインに組み込んだ。
安全性薬理学エンドポイントを、中枢神経系、呼吸器および心臓血管への効果を評価するために、ラットおよびイヌの単回投与毒性試験（それぞれ実施例５ｃおよび５ｄ）のデザインに組み込んだ。
【0236】
実施例６ａ－ラットにおける中枢神経系（改定Ｉｒｗｉｎ観察）
各群からの最初の６匹の雄の主要試験動物を、投与後２時間、２４時間および４８時間で観察した。次のパラメーターを、観察に含めた：
－発声、常同行動、攻撃性、異常な歩行、ｓｔｒａｕｂ挙尾、振戦、けいれん、痙攣、体位、鎮静、カタレプシー、眼瞼下垂、眼球突出、唾液分泌、流涙、立毛、異常呼吸、排便、排尿および死の発生。
－自発的活動、接触応答、身体の緊張および瞳孔サイズの増加または減少。
匂いを嗅ぐ、グルーミング、スクラッチング、および立ち上がる行為の増加。
－低減された耳介反射、異常な牽引反応、および異常な握力。観察された何らかの追加の症状を、記録した。
－症状を示す動物の頻度および症状の重症度を、記録した。
－瞳孔サイズ：サイズをミリメートル単位で推定するためのガイダンスチャートを使用して測定した（投与前の瞳孔サイズデータを、投与日に記録した）。
－体温：肛門括約筋から約２ｃｍ挿入されたプローブを使用して測定した。投与前の体温も記録した。測定値のばらつきを低減するために、温度順応治験を、投与前の測定値を記録する前に温度プローブを挿入することにより実施したが、体温データは、この治験中に収集されなかった。
各群からの最初の６匹の雄の主要試験動物を、投与後２時間、２４時間および４８時間で観察した。次のパラメーターを、観察に含めた：
－発声、常同行動、攻撃性、異常な歩行、ｓｔｒａｕｂ挙尾、振戦、けいれん、痙攣、体位、鎮静、カタレプシー、眼瞼下垂、眼球突出、唾液分泌、流涙、立毛、異常呼吸、排便、排尿および死の発生。
－自発的活動、接触応答、身体の緊張および瞳孔サイズの増加または減少。
匂いを嗅ぐ、グルーミング、スクラッチング、および立ち上がる行為の増加。
－低減された耳介反射、異常な牽引反応、および異常な握力。観察された何らかの追加の症状を、記録した。
－症状を示す動物の頻度および症状の重症度を、記録した。
－瞳孔サイズ：サイズをミリメートル単位で推定するためのガイダンスチャートを使用して測定した（投与前の瞳孔サイズデータを、投与日に記録した）。
－体温：肛門括約筋から約２ｃｍ挿入されたプローブを使用して測定した。投与前の体温も記録した。測定値のばらつきを低減するために、温度順応治験を、投与前の測定値を記録する前に温度プローブを挿入することにより実施したが、体温データは、この治験中に収集されなかった。
【0237】
ＣＷＴ－００１の投与に関連すると考えられた所見は、改定Ｉｒｗｉｎ観察の間には認められなかった。いくつかの時点においていくらかの動物で握力の低下が時折観察されたが、これらの所見は対照群でも単一の時点で観察されたため、それらはＣＷＴ－００１の投与とは無関係であると考えられる。ＣＷＴ－００１の投与と関連した瞳孔サイズまたは体温における変化は、なかった。
【0238】
実施例６ｂ－ラットにおける呼吸測定
試験当日、動物をホームケージから取り出し、全身プレチスモグラフチャンバーに約４５分間入れ、この期間の最後の１５分間を対照期間として分類した。動物を次いで、対照または試験品の投与のためにチャンバーから取り出した。測定を次いで、投与後２～４時間、２４時間および５１時間後に行い、動物を、いずれの測定前にも少なくとも３０分間順応させるためにチャンバー中に置いた。一回換気量に対するチャンバーの温度および湿度の効果を、プレチスモグラフチャンバー内で補正した。換気パラメーターを、呼吸信号から決定した。サンプリング周波数を、５００Ｈｚに固定した。
試験当日、動物をホームケージから取り出し、全身プレチスモグラフチャンバーに約４５分間入れ、この期間の最後の１５分間を対照期間として分類した。動物を次いで、対照または試験品の投与のためにチャンバーから取り出した。測定を次いで、投与後２～４時間、２４時間および５１時間後に行い、動物を、いずれの測定前にも少なくとも３０分間順応させるためにチャンバー中に置いた。一回換気量に対するチャンバーの温度および湿度の効果を、プレチスモグラフチャンバー内で補正した。換気パラメーターを、呼吸信号から決定した。サンプリング周波数を、５００Ｈｚに固定した。
【0239】
ＣＷＴ－００１の投与に関連すると考えられた呼吸パラメーターの変化は、なかった。呼吸パラメーターにおける偶発的な統計的に有意な変動が、試験中に散発的に存在したが、これらは特定の時点における対照群の変動によるか、または最小限のおよび／もしくは一時的な変化であると考えられ、したがってＣＷＴ－００１の投与とは無関係であると考えられた。
【0240】
実施例６ｃ－イヌにおける心臓血管の評価
心血管評価を、治療前（１日目の前）に少なくとも２６時間、投与期間２日目に少なくとも２０時間（投与後２４時間～４４時間にデータを取得）、および回復期間１４日目に行った。各動物のＥＣＧおよび血圧を、ＰＡ－Ｃ１０－ＴＯＸ－ＬＡ送信機（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＤＳＩ（商標）（Ｓｔ Ｐａｕｌｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）と組み合わせたＪａｃｋｅｔｅｄ Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ（ＪＥＴ（商標））システムによって記録した。最初の記録セッションの前に、すべての動物を、ＪＥＴジャケットに順応させ、本処置に確実に耐えられるかを個別に観察した。データ取得日に、動物を、ホーム囲いから取り出し、ＥＣＧリード線の配置およびジャケット（および必要に応じて首輪）の取り付けのために処置室に連れて行った。電極の配置に必要な領域を、剃毛し、適切に準備した。動脈血圧、心拍数、および第ＩＩ誘導ＥＣＧ変数を、１分間のロギング速度を使用して連続的に取得した。治療前および回復については、ＥＣＧおよび血圧の記録を、少なくとも２６時間実施した。２日目には、ＥＣＧおよびＢＰの記録を、少なくとも２０時間実施した（投与後２４～４４時間にデータを取得）（Ｔ＝０は、試験品の投与終了に相当する）。動物は、投与処置が行われた場合を除き、拘束されなかった。試験投与段階開始前に、少なくとも２６時間にわたる治療前の遠隔測定データ取得を、すべての動物から記録した。これらの前処置信号のセクションを、必要に応じて、ＥＣＧ形態異常、信号の質、心拍数、動脈血圧、ＥＣＧ値（ＱＴｃａ計算［心拍数に対して補正されたＱＴ］を含む）の正常性について検討した。
心血管評価を、治療前（１日目の前）に少なくとも２６時間、投与期間２日目に少なくとも２０時間（投与後２４時間～４４時間にデータを取得）、および回復期間１４日目に行った。各動物のＥＣＧおよび血圧を、ＰＡ－Ｃ１０－ＴＯＸ－ＬＡ送信機（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＤＳＩ（商標）（Ｓｔ Ｐａｕｌｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）と組み合わせたＪａｃｋｅｔｅｄ Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ（ＪＥＴ（商標））システムによって記録した。最初の記録セッションの前に、すべての動物を、ＪＥＴジャケットに順応させ、本処置に確実に耐えられるかを個別に観察した。データ取得日に、動物を、ホーム囲いから取り出し、ＥＣＧリード線の配置およびジャケット（および必要に応じて首輪）の取り付けのために処置室に連れて行った。電極の配置に必要な領域を、剃毛し、適切に準備した。動脈血圧、心拍数、および第ＩＩ誘導ＥＣＧ変数を、１分間のロギング速度を使用して連続的に取得した。治療前および回復については、ＥＣＧおよび血圧の記録を、少なくとも２６時間実施した。２日目には、ＥＣＧおよびＢＰの記録を、少なくとも２０時間実施した（投与後２４～４４時間にデータを取得）（Ｔ＝０は、試験品の投与終了に相当する）。動物は、投与処置が行われた場合を除き、拘束されなかった。試験投与段階開始前に、少なくとも２６時間にわたる治療前の遠隔測定データ取得を、すべての動物から記録した。これらの前処置信号のセクションを、必要に応じて、ＥＣＧ形態異常、信号の質、心拍数、動脈血圧、ＥＣＧ値（ＱＴｃａ計算［心拍数に対して補正されたＱＴ］を含む）の正常性について検討した。
【0241】
次のパラメーターを、報告した：
・血圧波形から得られる収縮期血圧（ＳＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）、および平均動脈血圧（ＭＡＰ）、および心拍数（ＨＲ）。
・ＥＣＧパラメーター（個々の動物について補正されたＲＲ、ＰＲ、ＱＲＳ、ＱＴ、ＱＴｃａ間隔、ＱＡ間隔［血圧およびＥＣＧ波形から導出］）を、分析した。観察された何らかの第ＩＩ誘導ＥＣＧ異常または不整脈を、印刷し検討した。
・血圧波形から得られる収縮期血圧（ＳＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）、および平均動脈血圧（ＭＡＰ）、および心拍数（ＨＲ）。
・ＥＣＧパラメーター（個々の動物について補正されたＲＲ、ＰＲ、ＱＲＳ、ＱＴ、ＱＴｃａ間隔、ＱＡ間隔［血圧およびＥＣＧ波形から導出］）を、分析した。観察された何らかの第ＩＩ誘導ＥＣＧ異常または不整脈を、印刷し検討した。
【0242】
本試験の全過程において、ＣＷＴ－００１の投与に関連すると考えられた心血管パラメーターまたは波形形態の変化は、なかった。個々の動物において時折のまたは一時的な所見があったが、それらは対照動物でも観察されたか、または正常な動物間の変動によるものと考えられたため、試験品に関連するとは考えられなかった。
【0243】
実施例６ｄ－生殖および発生毒性
ラットおよびイヌにおける単回投与毒性試験は、何らかの処置に関連した臓器重量ならびに精巣および卵巣を含む生殖器官の組織病理学的変化を明らかにしなかった。
ラットおよびイヌにおける単回投与毒性試験は、何らかの処置に関連した臓器重量ならびに精巣および卵巣を含む生殖器官の組織病理学的変化を明らかにしなかった。
【0244】
実施例６ｅ－局所耐性
局所耐性は、ラットおよびイヌの両方における単回投与毒性試験において評価されており、注射部位での何らかの予期せぬ効果を明らかにしなかった。
局所耐性は、ラットおよびイヌの両方における単回投与毒性試験において評価されており、注射部位での何らかの予期せぬ効果を明らかにしなかった。
【0245】
実施例７：外側上顆炎を有するヒト対象への投与（図１３および図１４）
上記の実施例からの結果は、本明細書で提供されるｍｉＲ－２９化合物が、腱障害のマウスモデルを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでのコラーゲン３発現を減少させるまたは阻害することにおいて安全で有効であることを示す。さらに、本発明者らは、ウマコラゲナーゼ誘導腱障害（ＳＤＦＴ）モデルが、腱損傷後のｍｉＲ－２９ａ発現の減少およびそれに伴うｃｏｌ３：ｃｏｌ１比の増加を伴う、ヒト腱障害を反映することを以前に示した。ｍｉＲー２９化合物の単回病変内注射（１００ｎＭ、総量１．５ｍｌ中約２μｇ／ｍｌ、すなわち総用量３μｇ）は、コラーゲン３の発現および病変サイズを減少させ、かつ腱構造を改善した（参考文献３を参照）。まとめると、これらのデータは、本明細書で提供されるｍｉＲ－２９化合物を含む、ｍｉＲ－２９化合物を使用する安全でかつ有効なヒト治療法の理論的根拠を提供する。
上記の実施例からの結果は、本明細書で提供されるｍｉＲ－２９化合物が、腱障害のマウスモデルを含む、ｉｎ ｖｉｖｏでのコラーゲン３発現を減少させるまたは阻害することにおいて安全で有効であることを示す。さらに、本発明者らは、ウマコラゲナーゼ誘導腱障害（ＳＤＦＴ）モデルが、腱損傷後のｍｉＲ－２９ａ発現の減少およびそれに伴うｃｏｌ３：ｃｏｌ１比の増加を伴う、ヒト腱障害を反映することを以前に示した。ｍｉＲー２９化合物の単回病変内注射（１００ｎＭ、総量１．５ｍｌ中約２μｇ／ｍｌ、すなわち総用量３μｇ）は、コラーゲン３の発現および病変サイズを減少させ、かつ腱構造を改善した（参考文献３を参照）。まとめると、これらのデータは、本明細書で提供されるｍｉＲ－２９化合物を含む、ｍｉＲ－２９化合物を使用する安全でかつ有効なヒト治療法の理論的根拠を提供する。
【0246】
外側上顆炎を有する対象におけるＣＷＴ－００１注射の単回漸増用量の安全性、忍容性および薬物動態を評価する第１相ランダム化二重盲検プラセボ対照試験を、行った（試験デザインについては、図１３を参照）。
【0247】
外側上顆炎の治癒的処置の現在の第２選択（理学療法後の）標準は、長期的有益性に疑問が残るものの、依然として腱痛の領域へのコルチコステロイドの局所注射である。肘の総伸筋起始部の腱損傷領域へのＣＷＴ－００１の局所注射はしたがって、現在の標準的治癒を維持するが、改善された安全性および有効性を示す。超音波検査は多くの場合、腱の状態を評価するためのみでなく、注射療法をガイドするための選択肢である画像モダリティとして使用されるため、腱損傷領域への超音波ガイド下注射が、使用される（参考文献１５）。
【0248】
本試験の主な目的は、外側上顆炎を有するヒト対象におけるＣＷＴ－００１の単回漸増用量の安全性および忍容性を決定することである。
【0249】
本試験の第２の目的は、外側上顆炎を有するヒト対象におけるＣＷＴ－００１投与の単回投与薬物動態（ＰＫ）を決定すること、および外側上顆炎を有するヒト対象におけるＣＷＴ－００１投与の有効性を評価することである。
【0250】
本試験の主要評価項目は、注射後１４日目の有害事象（ＡＥ）の発生率、臨床検査の異常、バイタルサイン（血圧、体温、呼吸数、脈拍数）の変化、１２誘導心電図（ＥＣＧ）パラメーター、身体検査、および皮膚スコアの評価によって測定される、ＣＷＴ－００１とプラセボの安全性データの比較である。
【0251】
本試験の副次評価項目は、次のとおりである：
－最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、Ｃｍａｘまでの時間（ｔｍａｘ）、血漿対濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）によって示される、データの血漿ＰＫ濃度。
－投与前１日目～１４日目、２８日目および９０日目に視覚的評価スケール（ＶＡＳ）を使用して測定される、肘痛に対するＣＷＴ－００１の単回投与の有効性。
－投与前１日目～１４日目、２８日目および９０日目にＤＡＳＨ（Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍ，Ｓｈｏｕｌｄｅｒ，ａｎｄ Ｈａｎｄ）スコアを使用して測定される、活動不能および症状に対するＣＷＴ－００１の単回投与の有効性。
－投与前１日目～１４日目、２８日目および９０日目にのＰＲＴＥＥ（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｒａｔｅｄ Ｔｅｎｎｉｓ Ｅｌｂｏｗ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）によって測定される、疼痛および活動不能に対するＣＷＴ－００１の単回投与の有効性。
－投与前１日目～２８日目および９０日目にベースライン超音波評価からの変化によって測定される、肘外側腱に対するＣＷＴ－００１の単回投与の有効性。
－最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、Ｃｍａｘまでの時間（ｔｍａｘ）、血漿対濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）によって示される、データの血漿ＰＫ濃度。
－投与前１日目～１４日目、２８日目および９０日目に視覚的評価スケール（ＶＡＳ）を使用して測定される、肘痛に対するＣＷＴ－００１の単回投与の有効性。
－投与前１日目～１４日目、２８日目および９０日目にＤＡＳＨ（Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍ，Ｓｈｏｕｌｄｅｒ，ａｎｄ Ｈａｎｄ）スコアを使用して測定される、活動不能および症状に対するＣＷＴ－００１の単回投与の有効性。
－投与前１日目～１４日目、２８日目および９０日目にのＰＲＴＥＥ（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｒａｔｅｄ Ｔｅｎｎｉｓ Ｅｌｂｏｗ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）によって測定される、疼痛および活動不能に対するＣＷＴ－００１の単回投与の有効性。
－投与前１日目～２８日目および９０日目にベースライン超音波評価からの変化によって測定される、肘外側腱に対するＣＷＴ－００１の単回投与の有効性。
【0252】
用量の根拠
上に記載の実験を考慮して、μｇおよび低ｍｇの範囲のｍｉＲ－２９用量は、動物種において有効であり、かつ良好に許容されると予想され、かつ容易にかつ安全に注射できる容量（例えば、約１ｍｌ）で投与され得る。これらの用量レベルはまた、例えば、使用される動物モデルにおける腱の治癒を改善することにおいて、コラーゲンを標的とする作用機序を裏付ける。腱内投与を介した単回用量拡張毒性試験を、ＣＷＴ－００１を用いてラット（最大１．５ｍｇ、実施例５ａを参照）およびイヌ（最大１２．５ｍｇ、実施例５ｂを参照）において実施し、各試験の無毒性量は、実行可能な最大用量であった。ＣＷＴ－００１の単回腱内投与の前臨床評価は、例えばヒトの臨床用量２ｍｇと比較して、ラットおよびイヌにおけるそれぞれの用量の４１倍および２５倍であったレベルで有害な所見を生じなかった。
上に記載の実験を考慮して、μｇおよび低ｍｇの範囲のｍｉＲ－２９用量は、動物種において有効であり、かつ良好に許容されると予想され、かつ容易にかつ安全に注射できる容量（例えば、約１ｍｌ）で投与され得る。これらの用量レベルはまた、例えば、使用される動物モデルにおける腱の治癒を改善することにおいて、コラーゲンを標的とする作用機序を裏付ける。腱内投与を介した単回用量拡張毒性試験を、ＣＷＴ－００１を用いてラット（最大１．５ｍｇ、実施例５ａを参照）およびイヌ（最大１２．５ｍｇ、実施例５ｂを参照）において実施し、各試験の無毒性量は、実行可能な最大用量であった。ＣＷＴ－００１の単回腱内投与の前臨床評価は、例えばヒトの臨床用量２ｍｇと比較して、ラットおよびイヌにおけるそれぞれの用量の４１倍および２５倍であったレベルで有害な所見を生じなかった。
【0253】
対象を、コホート（コホートあたり対象８人）に分け、腱内注射により投与されるＣＷＴ－００１（ＰＢＳおよびＥＤＴＡ中のＣＷＴ－００１の５ｍｇ／ｍＬ溶液を、生理食塩水、すなわち、０．９％ｗ／ｖＮａＣｌを使用して様々な最終濃度に希釈した）または対応するプラセボ（生理食塩水、すなわち０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ）（３：１）の単回の１ｍｌ用量を受けるために無作為化した。ＣＷＴ－００１の開始用量は、２００μｇ／ｍＬである。用量を、５００μｇ／ｍＬ、次に１５００μｇ／ｍＬに漸増させた。ＶＡＳ疼痛評価の改善が見られない場合には、（最大で）４５００μｇ／ｍＬの追加用量を投与する予定であったが、これは必要なかった。
【0254】
各コホートでは、１名以下の対象が各用量レベルにおいて初めて活性ＣＷＴ－００１の用量を受けるように、最初の投与日に２名以下の対象（１名が活性物質、１名がプラセボ）に、投与した。以前に投与されたセンチネル対象の安全性および忍容性の評価後に、投与を、各コホート中で同じ用量レベルにて残りの対象（対象６名、実薬５名、プラセボ１名）において継続した。
【0255】
用量を、より低い用量からすべての安全性、忍容性、血漿ＰＫ、および有効性データ（入手可能な場合）の満足のいく検討後に、漸増方式で投与した。用量を、安全性、忍容性、血漿ＰＫ、および有効性データ（入手可能な場合）の進行中の評価に基づいて決定した。すべての用量を、患部領域内に超音波ガイド下で１ｍｌ注射として与えた。
【0256】
超音波検査を、ＬＯＧＩＱ Ｅ９超音波システムで５～７．５ＭＨｚのリニアアレイトランスデューサを使用して適用した。プローブを、総伸筋腱の長手方向軸に平行な肘の側面に沿って配置した。橈骨頭、橈骨上腕関節、外側上顆、総伸筋腱を、可視化した。皮膚を滅菌し、ＵＳＧプローブを滅菌カバーに入れた。正確な部位（低強度領域）でのニードルの先端の可視化後に、１ｍＬのＣＷＴ－００１またはプラセボを、注射した（図１４を参照）。
【0257】
ＣＷＴ－００１を、「ｐｅｐ法」を使用して腱に投与した（参考文献１１）。「ｐｅｐ法」は、注射方法であり、これにより針が腱領域に挿入された後、複数回の少量の注射を、ニードルを皮膚から出すことなく、ニードルを抜き、向きを変え、再挿入することにより行う。損傷した／慢性の腱の状況では、これは、治癒応答を刺激するために好ましいであろう。
【0258】
試験集団は、２４名の対象を含んだ。各対象は、本試験の選択基準をすべて満たし、除外基準をいずれも満たさなかった。
【0259】
対象は、本試験に含まれた以下の基準を満たす：
１．対象は、あらゆる人種的起源の、男性または女性である。
２．対象は、１８歳～７０歳であり、骨格が未成熟であるエビデンスはない。
３．対象は、１８～３５ｋｇ／ｍ２の肥満指数（ＢＭＩ）を有する。
４．対象者は、体重５０ｋｇ以上である。
５．対象は、外側上顆炎の臨床診断を有する。
６．外側上顆炎および以下の除外基準に挙げられるいずれの症状を除き、対象はさもなければ、病歴、身体検査、併用薬、バイタルサイン、１２誘導心電図、および臨床検査室の評価に基づき、責任医師により決定されるように、健康である。臨床検査値は、治験責任医師の裁量により１度再検査され得る。
７．対象の症状は、抵抗のある回外または手首の背屈（外側上顆の圧痛および椅子の後を持ち上げた徴候によって確認される）により再現できる。
８．対象の症状は、以下の１つまたは組み合わせを含む保存的治療にもかかわらず、少なくとも６週間～６ヶ月間持続している：
ａ．理学療法
ｂ．副子固定
ｃ．ＮＳＡＩＤ
９．対象は、自立しており、歩行可能であり、注射後のすべての評価および来院を遵守できる。
１０．男性対象は、パートナーが妊娠の可能性のある女性の場合、治験中および治験薬の最終投与後３ヶ月間はコンドームを使用しなければならない。さらに、妊娠の可能性のある彼らの女性パートナーは、投与の１ヶ月前から投与後３ヶ月まで、有効性の高い避妊のための追加の方法（一貫して正しく使用された場合、失敗率が年間１％未満に達し得る避妊法が、非常に有効な避妊法とみなされる）を使用する必要がある。
１１．妊娠の可能性のある女性対象は、治験中および投与後３ヶ月間、男性パートナーによるコンドームの使用と組み合わせて、投与１ヶ月前から非常に有効な避妊方法を使用することに同意する必要がある。対象は、スクリーニング時および１日目に妊娠検査が陰性でなければならない。
１２．書面によるインフォームドコンセントの提供。これは、同意書に列挙される要件および制限の遵守を含む。
１．対象は、あらゆる人種的起源の、男性または女性である。
２．対象は、１８歳～７０歳であり、骨格が未成熟であるエビデンスはない。
３．対象は、１８～３５ｋｇ／ｍ２の肥満指数（ＢＭＩ）を有する。
４．対象者は、体重５０ｋｇ以上である。
５．対象は、外側上顆炎の臨床診断を有する。
６．外側上顆炎および以下の除外基準に挙げられるいずれの症状を除き、対象はさもなければ、病歴、身体検査、併用薬、バイタルサイン、１２誘導心電図、および臨床検査室の評価に基づき、責任医師により決定されるように、健康である。臨床検査値は、治験責任医師の裁量により１度再検査され得る。
７．対象の症状は、抵抗のある回外または手首の背屈（外側上顆の圧痛および椅子の後を持ち上げた徴候によって確認される）により再現できる。
８．対象の症状は、以下の１つまたは組み合わせを含む保存的治療にもかかわらず、少なくとも６週間～６ヶ月間持続している：
ａ．理学療法
ｂ．副子固定
ｃ．ＮＳＡＩＤ
９．対象は、自立しており、歩行可能であり、注射後のすべての評価および来院を遵守できる。
１０．男性対象は、パートナーが妊娠の可能性のある女性の場合、治験中および治験薬の最終投与後３ヶ月間はコンドームを使用しなければならない。さらに、妊娠の可能性のある彼らの女性パートナーは、投与の１ヶ月前から投与後３ヶ月まで、有効性の高い避妊のための追加の方法（一貫して正しく使用された場合、失敗率が年間１％未満に達し得る避妊法が、非常に有効な避妊法とみなされる）を使用する必要がある。
１１．妊娠の可能性のある女性対象は、治験中および投与後３ヶ月間、男性パートナーによるコンドームの使用と組み合わせて、投与１ヶ月前から非常に有効な避妊方法を使用することに同意する必要がある。対象は、スクリーニング時および１日目に妊娠検査が陰性でなければならない。
１２．書面によるインフォームドコンセントの提供。これは、同意書に列挙される要件および制限の遵守を含む。
【0260】
以下のいずれかに該当する対象を、本試験への参加から除外した：
１．対象は、登録６ヶ月前以内に、患部肘にコルチコステロイド注射療法を受けたことがある。
２．対象は、ＩＭＰ投与前の少なくとも１週間から鎮痛剤（アヘン剤またはＮＳＡＩＤ）の使用を中止することを望まない、または中止できない。
３．対象は、以前に患部肘にＰＲＰ注射を受けたことがある。
４．対象は、骨格に影響を与えることが知られている医薬品（例えば、糖質コルチコイドの使用量が５ｍｇ／日を超える、フルオロキノロン系抗生物質）を使用している、または最近使用したことがある。
５．対象は、外側上顆炎の治療のために、患部肘に外科的介入を受けたことがある。
６．対象は、以下のいずれかの陽性の病歴を有する：
ａ．内側上顆炎
ｂ．橈骨管症候群
ｃ．手根管症候群
ｄ．登録前の過去２年以内の患部肘での化膿性関節炎または痛風関節炎
ｅ．登録前６ヶ月以内の頸椎根症
ｆ．過去６週間以内の患部肘への外傷
ｇ．機能測定（例えば、握力テスト）を行う能力を制限する、神経筋または一次性／二次性筋肉欠損
ｈ．軸性脊椎関節炎、乾癬性関節炎、および関節リウマチを含むがこれらに限定されない、偶然のリウマチ性炎症性疾患
ｉ．患部肘の変形性関節症
ｊ．応答の評価を損なうのに十分であると判断された線維筋痛症
７．対象は現在、注射部位に急性感染症を有する。
８．局所再発または転移の所見の有無に関係なくベースライン前の過去５年以内に治療されたまたは未治療である、リンパ増殖性疾患または既知の悪性腫瘍の病歴、または任意の臓器系の悪性腫瘍の病歴（過去５年間に再発の所見なく治療を受けている皮膚の基底細胞癌、扁平上皮癌、または光線角化症、子宮頸部上皮内癌、または切除された非浸潤性悪性結腸ポリープを除く）。
９．対象は、コンプライアンスを維持できない、またはその可能性が低いと治験責任医師が判断する程度に、身体的または精神的に損なわれている（例えば、現在精神障害、老人性認知症、アルツハイマー病などの治療を受けている）。
１０．対象は、注射処置の３０日以内、または試験のフォローアップ段階中に試験治療法または治験使用のために承認された治療法を受けたことがある。
１．対象は、登録６ヶ月前以内に、患部肘にコルチコステロイド注射療法を受けたことがある。
２．対象は、ＩＭＰ投与前の少なくとも１週間から鎮痛剤（アヘン剤またはＮＳＡＩＤ）の使用を中止することを望まない、または中止できない。
３．対象は、以前に患部肘にＰＲＰ注射を受けたことがある。
４．対象は、骨格に影響を与えることが知られている医薬品（例えば、糖質コルチコイドの使用量が５ｍｇ／日を超える、フルオロキノロン系抗生物質）を使用している、または最近使用したことがある。
５．対象は、外側上顆炎の治療のために、患部肘に外科的介入を受けたことがある。
６．対象は、以下のいずれかの陽性の病歴を有する：
ａ．内側上顆炎
ｂ．橈骨管症候群
ｃ．手根管症候群
ｄ．登録前の過去２年以内の患部肘での化膿性関節炎または痛風関節炎
ｅ．登録前６ヶ月以内の頸椎根症
ｆ．過去６週間以内の患部肘への外傷
ｇ．機能測定（例えば、握力テスト）を行う能力を制限する、神経筋または一次性／二次性筋肉欠損
ｈ．軸性脊椎関節炎、乾癬性関節炎、および関節リウマチを含むがこれらに限定されない、偶然のリウマチ性炎症性疾患
ｉ．患部肘の変形性関節症
ｊ．応答の評価を損なうのに十分であると判断された線維筋痛症
７．対象は現在、注射部位に急性感染症を有する。
８．局所再発または転移の所見の有無に関係なくベースライン前の過去５年以内に治療されたまたは未治療である、リンパ増殖性疾患または既知の悪性腫瘍の病歴、または任意の臓器系の悪性腫瘍の病歴（過去５年間に再発の所見なく治療を受けている皮膚の基底細胞癌、扁平上皮癌、または光線角化症、子宮頸部上皮内癌、または切除された非浸潤性悪性結腸ポリープを除く）。
９．対象は、コンプライアンスを維持できない、またはその可能性が低いと治験責任医師が判断する程度に、身体的または精神的に損なわれている（例えば、現在精神障害、老人性認知症、アルツハイマー病などの治療を受けている）。
１０．対象は、注射処置の３０日以内、または試験のフォローアップ段階中に試験治療法または治験使用のために承認された治療法を受けたことがある。
【0261】
対象は、各来院前の４８時間およびＣＲＵにいる間は、激しい運動を控えなければならない。対象はまた、治験薬（ＩＭＰ）の注射後少なくとも２４時間はいかなる自動車の運転も許可されない。
【0262】
対象は、次の制限を遵守することを求められた。
【0263】
・対象は、臨床研究施設（ＣＲＵ）から退院するまで各来院前４８時間からアルコールを控えなければならない。
・対象は、投与前の９０日間、試験の終了まで試験期間にわたり、タバコおよびニコチン含有製品（電子タバコを含む）を控えなければならない。
・対象者は、薬物乱用スクリーニングでの陽性結果を避けるため、スクリーニングおよび毎回の来院の４８時間前にケシの実の摂取を控えなければならない。
・対象は、投与前の９０日間、試験の終了まで試験期間にわたり、タバコおよびニコチン含有製品（電子タバコを含む）を控えなければならない。
・対象者は、薬物乱用スクリーニングでの陽性結果を避けるため、スクリーニングおよび毎回の来院の４８時間前にケシの実の摂取を控えなければならない。
【0264】
対象は、投与前の８時間、一晩絶食した。さらに、対象は、臨床検査室の評価が行われるあらゆる来院の少なくとも４時間前に絶食するように推奨される。
【0265】
スクリーニング時の超音波評価は、４週間のスクリーニング期間中の任意の時点で実施され、かつ反対側の肘のスキャンを含む。投与の少なくとも１週間前に、対象は、疼痛管理のために使用しているアヘン剤またはＮＳＡＩＤ薬のあらゆる使用を中止するよう求められた。－７日目～－１日目に、対象は、疼痛を管理するためにパラセタモール（４ｇ／日以下）を摂取するかアイスパックを使用することを許可された。
【0266】
対象は、適格性を確認し安全性および有効性のベースライン評価を受けるために、－２／－１日目、および１日目の投与前にＣＲＵに入院した。適格性の確認後、対象は、ランダム化され、ＣＷＴ－００１またはプラセボを投与された。注射後に、対象は、３０分間休息した。対象は、投与後の安全性およびＰＫの評価を受け、同日にＣＲＵから退院した。対象は、ＰＫサンプリング評価のため２日目に、および安全性およびＰＫの評価のため７日目にＣＲＵに戻った。対象は、安全性および有効性の評価のため１４日目、２８日目、および９０日目にＣＲＵに戻った（さらなる詳細を以下に記載する）。対象は、２８日目および９０日目に超音波評価を受けた。各対象の試験期間は、約１６週間である。
【0267】
患者の健康に関連する生活の質の様々な側面に対する腱障害の影響を、上肢腱障害における患者報告アウトカムツールとして承認され、検証された、以下の手段により評価した（参考文献１６）：注射後２８日目および９０日目における腱障害性疼痛強度（ＶＡＳ）、ＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコア、ＡＳＥＳ－Ｅスコア、ＰＲＴＥＥスコアの対象の評価、および腱の超音波評価。
【0268】
中止基準は、以下を含む：
・１名の対象における「重篤な」副作用、すなわち、少なくともおそらくＩＭＰ投与に関連すると考えられる重篤な有害事象（ＳＡＥ、下で定義される）。
・「重度の」非重篤な有害反応、すなわち、同じ系統器官クラス（ＳＯＣ）内か否かに関係なく、同じコホート中の２名の対象において、少なくともおそらくＩＭＰ投与に関連すると考えられる重度の非重篤ＡＥ。
・観察されたＡＥの性質、頻度、強度および／または臨床安全性モニタリングに基づき許容できない忍容性プロファイルがある場合。
・１名の対象における「重篤な」副作用、すなわち、少なくともおそらくＩＭＰ投与に関連すると考えられる重篤な有害事象（ＳＡＥ、下で定義される）。
・「重度の」非重篤な有害反応、すなわち、同じ系統器官クラス（ＳＯＣ）内か否かに関係なく、同じコホート中の２名の対象において、少なくともおそらくＩＭＰ投与に関連すると考えられる重度の非重篤ＡＥ。
・観察されたＡＥの性質、頻度、強度および／または臨床安全性モニタリングに基づき許容できない忍容性プロファイルがある場合。
【0269】
ＡＥは、医薬品との潜在的関係に関係なく、臨床試験中にスクリーニングから出現するかまたは悪化する、試験対象者における望ましくないあらゆる医療上の出来事である。ＡＥは、したがって、臨床的に重要な異常な検査所見、症状、または疾患を含む、あらゆる好ましくないまたは意図しない兆候であり得る。
【0270】
ＳＡＥは、あらゆる用量での、次のような好ましくない医療上の出来事である：
・結果的に死に至る、
・生命を脅かす。
－注記：「重篤な」の定義における「生命を脅かす」という用語は、その事象の発生時に対象が死亡のリスクにさらされた、事象を指す。それは、それがより深刻であったなら、仮に死に至っていたかもしれないという仮定的な事象を指すものではない。
・入院または既存の入院の延長を必要とする、
－注記：一般に、入院は、対象が、医師の診察室または外来診療の場で適切でなかったであろう観察および／または治療のために、病院または救急病棟に拘留された（通常は少なくとも一晩の滞在を伴う）ことがあることを意味する。入院中に発生する合併症は、ＡＥである。合併症が入院を長引かせる場合、または任意の他の重篤な基準を満たす場合、その事象は、重篤である。「入院」が生じたか、または必要であるか疑義がある場合、ＡＥは、重篤であるとみなすべきである。
・永続的または重大な活動不能または無能力をもたらす。
－注記：「活動不能」という用語は、ヒトが日常の生活機能を遂行する能力が著しく損なわれていることを意味する。この定義は、単純な頭痛、悪心、嘔吐、下痢、インフルエンザなど比較的軽い医学的重要性の経験、および日常生活機能を妨げるまたは妨害する可能性はあるが実質的な混乱には至らない偶発的な外傷（足首の捻挫など）を含むと意図されない。
・先天異常または先天性欠損症である。
・重要な医療上の事象である。
－注記：直ちに生命を脅かすものではない、または死亡もしくは入院をもたらさないが、対象を危険にさらす可能性がある、または上の定義に列挙される他の転帰の１つを防ぐために医学的または外科的介入を必要とする可能性がある重要な医療事象などの、他の状況において報告が適切であるかを判断する際には、医学的または科学的判断が下されるべきである。これらもまた、重篤であると考えるべきである。このような事象の例は、浸潤性がんまたは悪性がん、入院とならないアレルギー性気管支けいれん、血液障害またはけいれんに対する救急室または自宅での集中治療、薬物依存症または薬物乱用の発症である。
－注記：用語「重篤」と「重症」は、同義ではない。用語「重症」は多くの場合、特定の事象（軽度、中等度、または重度の心筋梗塞など）の強度（重症度）を説明するために使用される；しかし、事象自体は、比較的深刻でない医学的重要性のものであり得る（重症の頭痛など）。これは、上記の対象／事象の転帰または行動基準に基づきかつ通常は、対象の生命または機能を脅かす事象に関連する、「重篤」と同じではない。重度のＡＥは、必ずしも重篤であるとみなされる必要はない。例えば、数時間持続する悪心は、重度の悪心とみなされ得るが、ＳＡＥではない。一方、軽度の活動不能のみ生じる脳卒中は、軽度とみなされ得るが、上記の基準に基づいてＳＡＥとして定義される。重篤度（重度ではなく）は、規制上の報告義務を定義するためのガイドとして機能する
・結果的に死に至る、
・生命を脅かす。
－注記：「重篤な」の定義における「生命を脅かす」という用語は、その事象の発生時に対象が死亡のリスクにさらされた、事象を指す。それは、それがより深刻であったなら、仮に死に至っていたかもしれないという仮定的な事象を指すものではない。
・入院または既存の入院の延長を必要とする、
－注記：一般に、入院は、対象が、医師の診察室または外来診療の場で適切でなかったであろう観察および／または治療のために、病院または救急病棟に拘留された（通常は少なくとも一晩の滞在を伴う）ことがあることを意味する。入院中に発生する合併症は、ＡＥである。合併症が入院を長引かせる場合、または任意の他の重篤な基準を満たす場合、その事象は、重篤である。「入院」が生じたか、または必要であるか疑義がある場合、ＡＥは、重篤であるとみなすべきである。
・永続的または重大な活動不能または無能力をもたらす。
－注記：「活動不能」という用語は、ヒトが日常の生活機能を遂行する能力が著しく損なわれていることを意味する。この定義は、単純な頭痛、悪心、嘔吐、下痢、インフルエンザなど比較的軽い医学的重要性の経験、および日常生活機能を妨げるまたは妨害する可能性はあるが実質的な混乱には至らない偶発的な外傷（足首の捻挫など）を含むと意図されない。
・先天異常または先天性欠損症である。
・重要な医療上の事象である。
－注記：直ちに生命を脅かすものではない、または死亡もしくは入院をもたらさないが、対象を危険にさらす可能性がある、または上の定義に列挙される他の転帰の１つを防ぐために医学的または外科的介入を必要とする可能性がある重要な医療事象などの、他の状況において報告が適切であるかを判断する際には、医学的または科学的判断が下されるべきである。これらもまた、重篤であると考えるべきである。このような事象の例は、浸潤性がんまたは悪性がん、入院とならないアレルギー性気管支けいれん、血液障害またはけいれんに対する救急室または自宅での集中治療、薬物依存症または薬物乱用の発症である。
－注記：用語「重篤」と「重症」は、同義ではない。用語「重症」は多くの場合、特定の事象（軽度、中等度、または重度の心筋梗塞など）の強度（重症度）を説明するために使用される；しかし、事象自体は、比較的深刻でない医学的重要性のものであり得る（重症の頭痛など）。これは、上記の対象／事象の転帰または行動基準に基づきかつ通常は、対象の生命または機能を脅かす事象に関連する、「重篤」と同じではない。重度のＡＥは、必ずしも重篤であるとみなされる必要はない。例えば、数時間持続する悪心は、重度の悪心とみなされ得るが、ＳＡＥではない。一方、軽度の活動不能のみ生じる脳卒中は、軽度とみなされ得るが、上記の基準に基づいてＳＡＥとして定義される。重篤度（重度ではなく）は、規制上の報告義務を定義するためのガイドとして機能する
【0271】
試験中にいずれかの中止基準を満たした対象はいなかった。
【0272】
薬物動態評価
ＣＷＴ－００１の薬物動態を、ｍｉＲ２９ａの連続血漿濃度を測定することによって評価した。
ＣＷＴ－００１の薬物動態を、ｍｉＲ２９ａの連続血漿濃度を測定することによって評価した。
【0273】
ベースラインＰＫ血液サンプルを、投与前３０分以内に収集する。ｍｉＲ２９ａの血漿濃度を測定するための血液サンプルを、以下の表９に記載の時点で採取した。血漿濃度－時間データを、ノンコンパートメント法によって分析する。公称時間を、中間決定に使用したが、実際のサンプリング時間を、最終計算のために使用した。おおよそのサンプリング量を表８に示す。
【表13】
【0274】
追加のサンプルを、安全上の理由で必要ならば、採取した。最大で２つの追加の薬物動態サンプルを、薬物動態プロファイルを定義するために、必要に応じて採取してもよい。
【0275】
薬物動態学的血漿サンプルを収集し、ｍｉＲ２９ａを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒで開発された検証済み定量的リアルタイムＰＣＲ法を使用して定量した。
【表14】
【0276】
有効性評価－視覚的アナログスケール
対象は、治療後最初の１４日間、１日１回日誌で自分の疼痛を評価し、過去２４時間の疼痛をスコア付けした。１４日目以降、対象は、注射後９０日目まで毎週疼痛日誌をつけた。対象の疼痛評価は、質問「最近の２４時間の間の腱障害による最大の痛みを、横線上において縦線（｜）を用いて示してください」の後で「痛みなし」～「耐えられない程痛む」の範囲の１００ｍｍ視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）を使用して実施した。ＶＡＳは、値の連続にわたると考えられかつ直接容易に測定できない特性または姿勢の測定を試みる、検証済みの測定手段である。これはしばしば、様々な症状の強度または頻度を測定するために、疫学研究または臨床研究で使用される（参考文献１７）。
対象は、治療後最初の１４日間、１日１回日誌で自分の疼痛を評価し、過去２４時間の疼痛をスコア付けした。１４日目以降、対象は、注射後９０日目まで毎週疼痛日誌をつけた。対象の疼痛評価は、質問「最近の２４時間の間の腱障害による最大の痛みを、横線上において縦線（｜）を用いて示してください」の後で「痛みなし」～「耐えられない程痛む」の範囲の１００ｍｍ視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）を使用して実施した。ＶＡＳは、値の連続にわたると考えられかつ直接容易に測定できない特性または姿勢の測定を試みる、検証済みの測定手段である。これはしばしば、様々な症状の強度または頻度を測定するために、疫学研究または臨床研究で使用される（参考文献１７）。
【0277】
その結果を、図１７に示す。ＶＡＳスコアの低減は、２００μｇ（図１７Ａ）、５００μｇ（図１７Ｂ）、または１５００μｇ（図１７Ｃ）のＣＷＴ－００１投与を受けた対象、およびプラセボ生理食塩水注射を受けた対象のすべての群で観察された。これらのＶＡＳスコアの低減は概して、肘痛の治療におけるＶＡＳの最小臨床重要度差（ＭＣＩＤ）である－１１（参考文献１８）を上回った。任意の用量のＣＷＴ－００１を受けたすべての対象のＶＡＳスコアの平均変化を、決定し、プラセボと比較した（図１７Ｄ）。ＣＷＴ－００１による治療は、２８日目にプラセボで観察された変化を上回るＶＡＳスコアの変化をもたらした。観察されたＶＡＳスコアにおける平均変化は、９０日目でＣＷＴ－００１処置対象について－３３±７であり、これは３ＭＣＩＤの変化に相当する。
【0278】
整形外科におけるランダム化比較試験（ＲＣＴ）は、プラセボ／対照群として生理食塩水（ＮＳ）注射の使用を評価し、この物質の非生理学的効果を予期する。しかし、本分野における現在の最良のエビデンスによって示唆されるとおり（参考文献１８、１９、２０、２１）、ＮＳが本分野において適切なプラセボとして作用し得るかについて疑問が生じる。例えば、変形性関節症に罹患している患者の膝関節中への生理食塩水の関節内注射に関する最近の試験（参考文献２２）は、疼痛緩和および浸透圧関連変化などの、生理食塩水の見事で可能性のある有益な効果を示唆した。分子的および生理学的観点から、ＴＮＦ－ａおよびＩＬ－１ｂによる誘導後の炎症誘発性サイトカイン（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ－１、ＩＰ－１０、Ｇ－ＣＳＦ）の減少における高張食塩水投与の寄与、ならびにナトリウムイオンおよび浸透圧がどのように変形性関節症の病理に寄与し得るかはしたがって、それが強力な抗炎症メディエーターであることを示唆している。生理食塩水の腱内注射が対照として使用される腱障害の臨床試験では、ＶＡＳスコアにおける７０％低減のプラセボ効果が知られている（参考文献１８）。
【0279】
特に外側上顆炎試験におけるプラセボとしてのＮＳの最近の系統的な再調査（参考文献２３）は、調査した１件を除くすべてのＲＣＴにおいて、生理食塩水と非生理食塩水（多血小板血漿（ＰＲＰ）、自家調整血漿（ＡＣＰ）、コルチコステロイドおよびボツリヌス毒素）注射の間で患者報告アウトカム尺度（Ｐａｔｉｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔｅｄ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｍｅａｓｕｒｅｓ、ＰＲＯＭＳ）に統計的有意差がないことを見出し、ＮＳは、試験される注射療法と同様の治療効果を発揮する。この研究に基づき、ＮＳ注射の原理、生理学的特性、効果、および根底にあるメカニズムを解明するための確実なエビデンスがないため、擬似シリンジ／ニードルなどの代替制御方法を、より良い試験対照アームとして実施し得ることが本分野で提唱された（Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；参照文献に記載のものなど）。
【0280】
腱障害試験におけるプラセボとしての腱内生理食塩水注射の使用に関連する既知の問題を考慮して、任意の用量のＣＷＴ－００１を投与されたすべての対象についてのＶＡＳスコアにおける平均変化率を、別の試験において外側上顆炎に対する代替治療を受けた対象についてのＶＡＳスコアにおける平均変化率とさらに比較した（図１７Ｅ；参考文献２５）。本試験は、コルチコステロイド、多血小板血漿（ＰＲＰ）、およびキシロカインはすべて、外側上顆炎の治療において安全かつ有効であることを見出した。本試験におけるＣＷＴ－００１による治療で観察されたＶＡＳにおける変化率は、すべての時点において既知の治療のそれぞれで観察されたＶＡＳにおける変化率を上回った。
【0281】
有効性評価－ＡＳＥＳ－Ｅスコア
ＡＳＥＳスコアは、肩および肘の機能の評価のために、Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｈｏｕｌｄｅｒ ａｎｄ Ｅｌｂｏｗ Ｓｕｒｇｅｏｎｓによって開発された（参考文献２６）。ＡＳＥＳ－Ｅスコアは、自己管理され、症状および機能の領域で１７の質問を有する。疼痛の重症度を、０（まったく痛みがない）～１０（あり得る限りのひどい痛み）の範囲の１０ｃｍ視覚的アナログスケールでグレード分けした。想起期間は、対象がこの時点でどのように感じているかを指す。この検証済みツールを、それが対象の報告したアウトカムと肘の可動範囲および強度の変化に関する医師の評価を組み合わせるので、選択した（参考文献２７）。
ＡＳＥＳスコアは、肩および肘の機能の評価のために、Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｈｏｕｌｄｅｒ ａｎｄ Ｅｌｂｏｗ Ｓｕｒｇｅｏｎｓによって開発された（参考文献２６）。ＡＳＥＳ－Ｅスコアは、自己管理され、症状および機能の領域で１７の質問を有する。疼痛の重症度を、０（まったく痛みがない）～１０（あり得る限りのひどい痛み）の範囲の１０ｃｍ視覚的アナログスケールでグレード分けした。想起期間は、対象がこの時点でどのように感じているかを指す。この検証済みツールを、それが対象の報告したアウトカムと肘の可動範囲および強度の変化に関する医師の評価を組み合わせるので、選択した（参考文献２７）。
【0282】
有効性評価－迅速な上肢障害（ＤＡＳＨ）（ｑｕｉｃｋ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｍ，ｓｈｏｕｌｄ，ａｎｄ ｈａｎｄ）スコア
Ｑｕｉｃｋ ＤＡＳＨは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ ＳｕｒｇｅｏｎｓがＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｗｏｒｋ ＆Ｈｅａｌｔｈ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）と共に開発した対象報告アウトカムツールであるＤＡＳＨの短縮された形態である。Ｑｕｉｃｋ ＤＡＳＨインデックスは、自己管理され、１１項目を使用して、上肢の筋骨格系障害のいずれかまたは複数を有する対象における身体機能および症状を測定する。この検証済みの結果尺度（参照文献２１）は、ＣＷＴ－００１注射後の対象の機能における変化の中心的な情報を提供する。
Ｑｕｉｃｋ ＤＡＳＨは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ ＳｕｒｇｅｏｎｓがＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｗｏｒｋ ＆Ｈｅａｌｔｈ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）と共に開発した対象報告アウトカムツールであるＤＡＳＨの短縮された形態である。Ｑｕｉｃｋ ＤＡＳＨインデックスは、自己管理され、１１項目を使用して、上肢の筋骨格系障害のいずれかまたは複数を有する対象における身体機能および症状を測定する。この検証済みの結果尺度（参照文献２１）は、ＣＷＴ－００１注射後の対象の機能における変化の中心的な情報を提供する。
【0283】
ＱｕｉｃｋＤＡＳＨの各項目は、５つの応答の選択肢を有する：１＝困難なし；２＝やや困難；３＝中程度困難；４＝かなり困難；５＝できない。
【0284】
結果を図１８に示す。ＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコアにおける低下は、ＣＷＴ－００１の２００μｇ（図１８Ａ）、５００μｇ（図１８Ｂ）、または１５００μｇ（図１８Ｃ）用量を受けた対象において観察された。９０日時点で、ＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコアにおける低下は、各投与量コホートについて、プラセボ生理食塩水注射を受けた対象よりもＣＷＴ－００１を受けた対象について大きかった。任意の用量のＣＷＴ－００１を受けたすべての対象についてＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコアの平均変化を、決定し、プラセボと比較した（図１８Ｄ）。ＣＷＴ－００１による治療は、すべての時点においてプラセボで観察された変化を上回った、ＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコアの変化をもたらした。任意の用量のＣＷＴ－００１を受けた対象のＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコアの平均変化もまた、上肢筋骨格系障害患者におけるＤＡＳＨの確立されたＭＣＩＤである－２０ポイント（参考文献２８）を上回った。ＣＷＴ－００１用量を受けた対象の投与前スコアと比較した９０日目のＱｕｉｃｋＤＡＳＨスコアの平均の改善は、－５３±５ポイントであった。
【0285】
有効性評価－ｐａｔｉｅｎｔ ｒａｔｅｄ ｔｅｎｎｉｓ ｅｌｂｏｗ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＰＲＴＥＥ）
以前はＰａｔｉｅｎｔ－ Ｒａｔｅｄ Ｆｏｒｅａｒｍ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅと呼ばれていたＰＲＴＥＥは、テニス肘を有するヒトにおいて知覚された疼痛および活動不能を測定するための１５項目の自己報告質問票である。これは、３つの下位スケール：疼痛、通常の活動、および特定の活動、を有する。疼痛サブスケールは、様々な活動中の疼痛強度に関する５つの項目を有する。特定の活動のサブスケールは、コーヒーカップを持ち上げるのような、特定の活動を実施する際に経験される困難を反映する６つの項目を有する。「通常の活動」サブスケールにおける４つの項目は、仕事中およびレクリエーション中に行われるものを含む、通常の日常の役割を行う際に経験される困難を把握する。ＰＲＴＥＥは、疾患固有の自己報告尺度の優れた例である。これは、一般的な関節固有または領域固有の測定値よりもテニス肘に固有の疼痛および機能の側面を把握するのに非常に役立つ。この検証済みの結果尺度（参照文献２７）は、ＣＷＴ－００１注射後の対象の機能における変化の中心的な情報を提供する。
以前はＰａｔｉｅｎｔ－ Ｒａｔｅｄ Ｆｏｒｅａｒｍ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅと呼ばれていたＰＲＴＥＥは、テニス肘を有するヒトにおいて知覚された疼痛および活動不能を測定するための１５項目の自己報告質問票である。これは、３つの下位スケール：疼痛、通常の活動、および特定の活動、を有する。疼痛サブスケールは、様々な活動中の疼痛強度に関する５つの項目を有する。特定の活動のサブスケールは、コーヒーカップを持ち上げるのような、特定の活動を実施する際に経験される困難を反映する６つの項目を有する。「通常の活動」サブスケールにおける４つの項目は、仕事中およびレクリエーション中に行われるものを含む、通常の日常の役割を行う際に経験される困難を把握する。ＰＲＴＥＥは、疾患固有の自己報告尺度の優れた例である。これは、一般的な関節固有または領域固有の測定値よりもテニス肘に固有の疼痛および機能の側面を把握するのに非常に役立つ。この検証済みの結果尺度（参照文献２７）は、ＣＷＴ－００１注射後の対象の機能における変化の中心的な情報を提供する。
【0286】
結果を図１９に示す。ＰＲＴＥＥスコアにおける低下は、ＣＷＴ－００１の２００μｇ（図１９Ａ）、５００μｇ（図１９Ｂ）、または１５００μｇ（図１９Ｃ）用量を受けた対象において観察された。ＣＷＴ－００１の２００μｇ用量を投与された対象について観察されたＰＲＴＥＥスコアにおける低下は、すべての時点において、プラセボを投与された対象についてのＰＲＴＥＥスコアにおける低下を上回った。
【0287】
ＣＷＴ－００１の任意の用量を受けたすべての対象についてＰＲＴＥＥスコアにおける平均変化を、決定し、プラセボと比較した（図１９Ｄ）。９０日目でのＰＲＴＥＥスコアの平均改善は、ＣＷＴ－００１のいずれかの用量を受けた対象についてのベースライン投与前スコアの７１±６％であった。これは、ＰＲＴＥＥについて「はるかによい」または「完全に回復した」と定義される臨床的意義のＭＣＩＤを上回り、それは、ベースラインスコアの３７％の改善である（参考文献２９）。
【0288】
有効性評価－超音波評価
肘のレベルでの外側腱複合体は、それが皮下組織および筋膜の直下に位置しているため、超音波検査に容易にアクセス可能である。通常、複合体は、対応するアタッチメント間で整列される高エコーの線形構造として可視化される。肘外側腱障害の特徴的な超音波所見は、腱内の局所的な低エコー領域を含み、これは正常な内部コラーゲン線維アライメントパターンの喪失に関連している。重要なことに、試験は、超音波検査の特徴が疾患の過程と一致することを示し、かつ治療的処置後のＶＡＳスコアおよびＤＡＳＨスコアを使用して症状の改善を有する解決法を示す（参考文献３０）。前臨床モデルに基づき、超音波評価を、注射後２８日目および９０日目に実施した。重要なことに、これは、治療後に正常な腱構造に戻す、ＣＷＴ－００１の作用（コラーゲン構造の改善）のメカニズムに関するデータを与え、これは、対象の回復および治療の耐久性にとって有益である。
肘のレベルでの外側腱複合体は、それが皮下組織および筋膜の直下に位置しているため、超音波検査に容易にアクセス可能である。通常、複合体は、対応するアタッチメント間で整列される高エコーの線形構造として可視化される。肘外側腱障害の特徴的な超音波所見は、腱内の局所的な低エコー領域を含み、これは正常な内部コラーゲン線維アライメントパターンの喪失に関連している。重要なことに、試験は、超音波検査の特徴が疾患の過程と一致することを示し、かつ治療的処置後のＶＡＳスコアおよびＤＡＳＨスコアを使用して症状の改善を有する解決法を示す（参考文献３０）。前臨床モデルに基づき、超音波評価を、注射後２８日目および９０日目に実施した。重要なことに、これは、治療後に正常な腱構造に戻す、ＣＷＴ－００１の作用（コラーゲン構造の改善）のメカニズムに関するデータを与え、これは、対象の回復および治療の耐久性にとって有益である。
【0289】
超音波組織特性評価（ＵＴＣ；ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ）と呼ばれる画像診断モダリティを、腱の構造を可視化するため、および腱基質の完全性を定量化するために使用できる（参考文献３１）。二次元超音波およびカラードップラーとは異なり、ＵＴＣは、腱の完全性に関連する４つの異なるエコータイプへとグレースケールの腱基質の変化を客観的に定量化する。タイプＩ（緑）およびタイプＩＩ（青）は、組織化された基質を表す；タイプＩＩＩ（赤）およびタイプＩＶ（黒）は、組織化されていない基質を表す（図２０Ａ）。従来の超音波と比較した、このツールの利点は、それが腱の三次元超音波画像を取得し、標準化パラメーター（トランスデューサの傾斜角、深さ、およびゲイン設定）を使用することである。両側スキャン（肘の両側）を、ＵＴＣスキャンの実施経験を有する１名の検査者により実施した。画像を、腱の長軸に沿って５ｃｍの距離を自動的に移動し０．２ｍｍ間隔で定期的な画像を記録する追跡デバイス（ＵＴＣ Ｔｒａｃｋｅｒ，ＵＴＣ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓｔｅｉｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に配置した７～１０ＭＨｚの線形超音波トランスデューサ（ＳｍａｒｔＰｒｏｂｅ １２Ｌ５－Ｖ，Ｔｅｒａｓｏｎ ２０００＋；Ｔｅｒａｔｅｃｈ；Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて取得した。トランスデューサの傾斜、角度、ゲイン、焦点、および深度を、追跡デバイスによって標準化する。矢状面、冠状面、および横断面からの画像を編集して、腱の三次元ビューを作成した。超音波組織特性評価を、治療前（４週間以内）と、２８日目および９０日目に行った。
【0290】
肘外側の代表的な超音波画像を、注射前（図２０Ｂ）、２８日目（図２０Ｃ）および９０日目（図２０Ｄ）にプラセボを投与された対象、ならびに注射前（図２０Ｅ）、２０日目（図２０Ｆ）、および９０日目（図２０Ｇ）に２００μｇのＣＷＴ－００１を投与された対象について提供する。
【0291】
ＵＴＣタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの腱組織のパーセンテージ（率）、および修復腱（ＵＴＣタイプＩおよびＩＩ）対変性腱（ＵＴＣタイプＩＩＩおよびＩＶ）の合計パーセンテージ（率）を、対象について定量化した。各投与量コホートについて、修復腱組織、特に無傷のＵＴＣタイプＩの腱のパーセンテージは、ＣＷＴ－００１を投与された対象では０日目～２８日目、９０日目に増加し、ＣＷＴ－００１を投与された対象では、プラセボを投与された対象よりもはるかに高かった。試験期間中およびプラセボ群と比較して、変性腱、特に最も重度に損傷したＵＴＣタイプＩＶの腱において対応する減少があった（２００μｇＣＷＴ－００１については図２０Ｈ、Ｉ、μｇＣＷＴ－００１については図２０Ｊ、Ｋ、および１５００μｇＣＷＴ－００１については図２０Ｌ、Ｍを参照）。
【0292】
ＣＷＴ－００１の任意の用量を受けたすべての対象の修復腱の平均パーセンテージは、０日目から２８日目（Ｐ＜０．０５）および９０日目（Ｐ＜０．０１）で有意に増加し、プラセボを投与された対象では、有意な変化は観察されなかった。ＣＷＴ－００１を投与された対象はまた、２８日目（Ｐ＜０．０５）および９０日目（Ｐ＜０．０１）の時点で、プラセボを投与された対象よりも修復腱の有意に高いレベルを有し、２８日目（Ｐ＜０．０５）および９０日目（Ｐ＜０．０１）で変性腱の有意に低いレベルを有した。
【0293】
したがって、ＵＴＣデータは、ＣＷＴ－００１の単回の２００μｇ、５００μｇ、または１５００μｇ用量による治療後に、外側上顆炎を有するヒト対象の腱構造における定量可能な改善を示す。
【0294】
実施例８－デュピュイトラン病（図１５および図１６）
健康な筋膜組織およびデュピュイトラン筋膜組織中のｍｉＲ２９ａの発現のｑＰＣＲ分析を、実施した（健康な群では、４つのサンプル、デュピュイトラン群では、３つのサンプル）。結果は、ｍｉＲ２９ａのレベルが、手根管開放手術を受けた健康な対照と比較して、デュピュイトラン組織からのサンプルにおいて有意に減少されたことを示した（図１５）。これらの実験は、デュピュイトラン病で観察される線維性成長がｍｉＲ２９ａの発現の減少と関連していることを示した。この観察は、ｍｉＲ－２９補充療法が、デュピュイトラン病で見られるコラーゲンの過剰産生を予防または減少し得ることを示した。
健康な筋膜組織およびデュピュイトラン筋膜組織中のｍｉＲ２９ａの発現のｑＰＣＲ分析を、実施した（健康な群では、４つのサンプル、デュピュイトラン群では、３つのサンプル）。結果は、ｍｉＲ２９ａのレベルが、手根管開放手術を受けた健康な対照と比較して、デュピュイトラン組織からのサンプルにおいて有意に減少されたことを示した（図１５）。これらの実験は、デュピュイトラン病で観察される線維性成長がｍｉＲ２９ａの発現の減少と関連していることを示した。この観察は、ｍｉＲ－２９補充療法が、デュピュイトラン病で見られるコラーゲンの過剰産生を予防または減少し得ることを示した。
【0295】
ｍｉＲ－２９補充療法がデュピュイトラン病の治療において有用であり得るかをさらに調べるために、培養デュピュイトラン線維芽細胞を、５μＭのｍｉＲ－２９ａ模倣体、ｍｉＲ－２９ｂ模倣体、ｍｉＲ－２９ｃ模倣体、ＣＷＴ－００１、ｍｉＲ－２９ａ ａｎｔａｇｏｍｉｒ、またはスクランブルｍｉＲ－２９ａ対照により処置した。処置後のコラーゲン１およびコラーゲン３の発現レベルを、ｑＰＣＲによって分析した。
【0296】
結果は、コラーゲン１（図１６Ａ）およびコラーゲン３（図１６Ｂ）の両方の発現が、スクランブルｍｉＲ－２９対照による処置に対して、ｍｉＲ－２９ａ模倣体、ｍｉＲ－２９ｂ模倣体、ｍｉＲ－２９ｃ模倣体またはＣＷＴ－００１による処置後に、有意に減少されたことを示した。これらのデータは、ＣＷＴ－００１などのｍｉＲ－２９模倣化合物による治療が、デュピュイトラン病の治療に有効であり得ることを示している。
【0297】
実施例９－ペイロニー病
ＣＷＴ－００１を、陰茎の白膜中への単回の病変内（陰茎内）注射としてペイロニー病を有する対象に投与する。対象は、３０°以下の陰茎の曲率および／または２ｃｍ未満の範囲で触知可能なプラークを有する、初期段階（急性または活動期）のペイロニー病（Ｋｅｌａｍｉ分類に基づく、参考文献３２）の男性である。対象を、注射後１年間追跡調査する。有効性評価は、陰茎の曲率、陰茎二重ドップラー超音波検査、疼痛ＶＡＳ、ＩＥＦＦ質問票、およびＰＤＱ質問票を含む。
ＣＷＴ－００１を、陰茎の白膜中への単回の病変内（陰茎内）注射としてペイロニー病を有する対象に投与する。対象は、３０°以下の陰茎の曲率および／または２ｃｍ未満の範囲で触知可能なプラークを有する、初期段階（急性または活動期）のペイロニー病（Ｋｅｌａｍｉ分類に基づく、参考文献３２）の男性である。対象を、注射後１年間追跡調査する。有効性評価は、陰茎の曲率、陰茎二重ドップラー超音波検査、疼痛ＶＡＳ、ＩＥＦＦ質問票、およびＰＤＱ質問票を含む。
【0298】
本発明は、例としてのみ説明されており、本発明の範囲および趣旨内に留めて、変更を加え得ることが理解されるであろう。
【0299】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3-A】
【図3-B】
【図3-C】
【図3-D】
【図3-E】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18-1】
【図18-2】
【図19-1】
【図19-2】
【図20-1】
【図20-2】
【図20-3】
【図20-4】
【図20-5】
【図20-6】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-03
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】