特表 2023-548149 生体分子プローブを使用した組織のマルチプレックス質量分析イメージングのための新規な光切断可能な質量タグ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-15

(54)【発明の名称】生体分子プローブを使用した組織のマルチプレックス質量分析イメージングのための新規な光切断可能な質量タグ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20231108BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20231108BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 Y

G01N27/62 V

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023526248

(86)(22)【出願日】2021-08-11

(85)【翻訳文提出日】2023-04-28

(86)【国際出願番号】 US2021045520

(87)【国際公開番号】W WO2022093357

(87)【国際公開日】2022-05-05

(31)【優先権主張番号】63/106,990

(32)【優先日】2020-10-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512087331

【氏名又は名称】アンバージェン， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リム， マール ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ヤグニック， ガーゲイ

(72)【発明者】

【氏名】ロスチャイルド， ケネス ジェイ．

【テーマコード（参考）】

2G041

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA04

2G041FA11

2G041FA12

2G041JA04

2G041JA06

2G041JA09

(57)【要約】

例えば研究用途及び病理学者による臨床用途（例えば、切除された腫瘍又は腫瘍生検のバイオマーカー分析）のための、組織又は細胞における生体分子（例えば、タンパク質及びｍｉＲＮＡ）の標的化検出及びマッピングのための免疫組織化学（ＩＮＣ）及びインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法であって、本方法は組織又は細胞内の生体分子を検出及びマッピングするためのモードとして質量分析イメージング（ＭＳＩ）を含む。本方法は抗体及び核酸などのプローブに結合され、マルチプレックス免疫組織化学及びインサイツハイブリダイゼーションを達成するために使用され、ＭＳＩを検出／読み出しの様式として用いる光切断可能な質量タグ試薬を利用する。本方法はマルチオミックＭＳＩ手順も包含し、光切断可能な質量タグプローブのＭＳＩは、生体試料（例えば、組織）由来の内因性生体分子の直接的非標識ＭＳＩなどのＭＳＩの他のモードと組み合わされる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単一スライド上の組織サンプル中の５つまたはそれを超える異なるタイプのバイオマーカーを同時検出するためのマルチプレックス方法であって、
ａ）単一スライド上に組織サンプルを提供することと、
ｂ）前記組織サンプルへの抗体の結合をもたらすために前記組織サンプルを５つまたはそれを超える異なる抗体と接触させることであって、前記抗体の各々が異なるバイオマーカーと反応性であり、前記抗体の各々が固有の質量タグにコンジュゲートされていることと、
ｃ）質量分析イメージングを使用して、前記質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む、方法。

【請求項2】

工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、前記組織サンプルに対して直接的質量分析イメージングを実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記５つまたはそれを超える抗体が混合物中にあり、工程ｂ）の前記組織サンプルを前記混合物と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記質量タグが非希土類金属質量タグである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記質量タグが複数のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記単一スライドにマウントする前に、前記組織サンプルを新鮮凍結し、薄片化した、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記スライドが金を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記スライドが金層を有するガラススライドである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記単一スライドにマウントする前に、前記組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記組織サンプルが、前記サンプルを抗体と接触させる前記工程の前に処理に供され、前記処理が脱パラフィンを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記脱パラフィンがキシレンを用いて行われる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記組織サンプルがさらに処理に供され、前記処理が再水和を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記再水和が一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて行われる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記組織サンプルがさらに処理に供され、前記処理が抗原賦活化を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記抗原賦活化が、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での加熱によって行われる、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記抗原賦活化がギ酸を使用して行われる、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

質量タグにコンジュゲートされた前記抗体が以下の一般構造を有し、Ｘがスペーサーである、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

工程ｃ）の前にマトリックス化合物が前記質量タグに付与される、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記マトリックス化合物が、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記マトリックス化合物が昇華によって付与される、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記組織サンプルが、前記サンプルをマトリックス化合物と接触させる工程の後に処理に供され、前記処理がマトリックス再結晶化を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記質量タグが光切断可能である、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

工程ｃ）の前に前記質量タグの少なくとも一部を光切断するように前記質量タグに光を照射することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記組織が腫瘍由来である、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記腫瘍が乳房腫瘍である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記５つまたはそれを超える抗体の少なくとも１つが、前記質量タグに加えて蛍光部分を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記異なる抗体の数が８つまたはそれを超える、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記異なる抗体のサブセットが、ｉ）エストロゲン受容体（ＥＲ）、ｉｉ）プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ｉｉｉ）ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）およびｉｖ）Ｋｉ６７と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記異なる抗体のサブセットが、Ｔ細胞バイオマーカーである、ｉ）ＣＤ３（Ｔ細胞）、ｉｉ）ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ｉｉｉ）ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）およびｉｖ）ＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞）と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記異なる抗体の１つがＢ細胞バイオマーカーＣＤ２０と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

前記異なる抗体の１つがマクロファージバイオマーカーＣＤ６８と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項32】

前記異なる抗体の１つが免疫チェックポイント分子と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項33】

前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照

【0002】

本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年１０月２９日に出願された「Ｎｏｖｅｌ Ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｍａｓｓ－Ｔａｇｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ」と題する米国仮出願第６３／１０６，９９０号に基づく優先権を主張する。

【0003】

連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載

【0004】

本発明は、国立癌研究所によって授与された助成金番号ＣＡ２３６０９７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0005】

発明の分野

【0006】

本発明の分野は、例えば研究用途および病理学者による臨床用途（例えば、切除された腫瘍または腫瘍生検のバイオマーカー分析）のための、組織または細胞における生体分子（例えば、タンパク質およびｍｉＲＮＡ）の標的化検出およびマッピングのための免疫組織化学（ＩＨＣ）およびインサイツ（in situ）ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に関する。特に、例えば、組織または細胞内の生体分子を検出およびマッピングするためのモードとしての質量分析イメージング（ＭＳＩ）の使用である。より具体的には、本発明の分野は、抗体および核酸などのプローブに結合され、マルチプレックス免疫組織化学およびインサイツハイブリダイゼーションを達成するために使用され、ＭＳＩを検出／読み出しの様式として用いる光切断可能な質量タグ試薬に関する。抗体および核酸以外のプローブタイプも本発明の分野に含まれ、炭水化物結合タンパク質（例えば、レクチン）、受容体およびリガンドが含まれるが、これらに限定されない。最後に、本発明の分野はまた、マルチオミックＭＳＩ手順も包含し、光切断可能な質量タグプローブのＭＳＩは、生体試料（例えば、組織）由来の内因性生体分子の直接的非標識ＭＳＩなどのＭＳＩの他のモードと組み合わされ、それによって当該生体分子は無傷であり得るか、または消化され得る（例えば、化学的に消化されるか、または酵素によって）。

【背景技術】

【0007】

発明の背景

【0008】

免疫組織化学（ＩＨＣ）およびインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、組織、細胞および細胞内レベルで生体分子の構造的構成を決定するために広く使用されている［ＫａｔｉｋｉｒｅｄｄｙおよびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７８４：１５５－６７、ＨｏｗａｔおよびＷａｒｆｏｒｄ（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０：１－２、Ｓｔａｃｋ，Ｗａｎｇら（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０：４６－５８］。例えば、ＩＨＣは、神経変性障害における細胞外アミロイド斑および細胞内タウベースの神経原線維変化を研究するための好ましい方法である［Ｄｅｎｇ、Ｂｉｇｉｏら（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７９３：２５９－７２、ＤｕｇｇｅｒおよびＤｉｃｋｓｏｎ（２０１７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ９］。腫瘍学では、ＩＨＣおよびＩＳＨを使用して、予後値である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の評価［Ｈａlｓｅ、Ｃｏｌｅｂａｔｃｈら（２０１８）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８：１１１５８］を含む、様々な癌の診断、サブタイプへの分類および最適な処置を決定することができる［Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｃｅｋａｎら（２０１３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３：２６９４－７０２、Ｚａｈａ（２０１４）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５：３８２－９２］。ＩＨＣおよびＩＳＨ分析は、一般に、例えば腫瘍の生検または外科的切除によって収集された組織サンプルに対して行われる。典型的には、組織サンプルを新鮮凍結（ＦＦ）またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）し、次いで薄片化（例えば、１０μｍ）し、ガラス顕微鏡スライドにマウントする。抗体または核酸プローブにコンジュゲートさせたフルオロフォアまたは発色剤は、顕微鏡法を用いて標的化生体分子（例えば、タンパク質抗原またはｍｉＲＮＡなどの遺伝物質）の空間分布を可視化する最も一般的な方法である［ＫａｔｉｋｉｒｅｄｄｙおよびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７８４：１５５－６７］。

【0009】

多くの場合、多数のバイオマーカーの局在化および潜在的な共局在を同時に決定することが重要である。これは、例えば、高度に不均一な組織における細胞調節および調節不全に関与する数百の可能なタンパク質および／またはｍｉＲＮＡの位置をマッピングするために重要である［Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｃｅｋａｎら（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２１１：１７１－８７；Ｂｌｏｍ、Ｐａａｖｏｌａｉｎｅｎら（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１５５８０］。しかしながら、蛍光顕微鏡法は、分子フルオロフォアが比較的広い励起バンドおよび発光バンドを示し、スペクトル重複をもたらすので、ほんの少数のバイオマーカーの同時検出に限定される［Ｓｔａｃｋ，Ｗａｎｇら（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０：４６－５８］。標準的な蛍光顕微鏡法のマルチプレックス化限界は一般に３～５であるが、ハイパースペクトル／マルチスペクトル法は８に制限される［Ｔｓｕｒｕｉ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（２０００）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４８：６５３－６２、Ｓｔａｃｋ，Ｗａｎｇら（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０：４６－５８、Ｐａｒｒａ，Ｕｒａｏｋａら（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１３３８０、Ｇｏｒｒｉｓ，Ｈａｌｉｌｏｖｉｃら（２０１８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：３４７－３５４］。さらに、これらのマルチプレックス方法は、反復染色とそれに続く光退色またはプローブ除去／変性などのサイクル戦略（例えば、パーキンエルマーのＯＰＡＬマルチスペクトルプラットフォーム）を必要とすることが多い［Ｗａｈｌｂｙ，Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎら（２００２）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ４７：３２－４１、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｂｏｎｎｅｋｏｈら（２００６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４：１２７０－８、Ｇｅｒｄｅｓ，Ｓｅｖｉｎｓｋｙら（２０１３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０：１１９８２－７；Ｂｌｏｍ、Ｐａａｖｏｌａｉｎｅｎら（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１５５８０］。そのような方法は複雑で面倒で不完全なサイクリングであり、結果を混乱させる可能性がある［Ｇｉｅｓｅｎ，Ｗａｎｇら（２０１４）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：４１７－２２、Ｂｌｏｍ，Ｐａａｖｏｌａｉｎｅｎら（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１５５８０］。

【0010】

対照的に、質量分析イメージング（ＭＳＩ）は、上述の光学的方法の制限なしに高レベルのマルチプレックス化を容易にする（典型的には１Ｄａ未満の質量分解能によってのみ制限される）。簡潔には（詳細については図１を参照されたい）、これらの方法は、質量分析計で組織検体を走査し、各「ピクセル」で完全な質量スペクトルを生成し、それによってスペクトル内の任意の所与の質量種の同時イメージングを可能にする［Ａｒｅｎｔｚ，Ｍｉｔｔａｌら（２０１７）Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３４：２７－６６］。Ｃａｐｒｉｏｌｉのグループは、最初にマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）に基づくこの技術を導入し［Ｃａｐｒｉｏｌｉ，Ｆａｒｍｅｒら（１９９７）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６９：４７５１－６０］、この技術はその後、複雑な組織におけるタンパク質、核酸、脂質、代謝産物を含む生体分子、さらには小さな薬物化合物の直接的非標識イメージングに広く採用されている［Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ，ＤｅＬａｎｅｙら（２０１８）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９０：２４０－２６５］。この技術はまた、ＥＳＬベースのＤＥＳＩ－ＭＳイメージングなどの他の質量分析（ＭＳ）手法にも拡張されている［Ｔａｋａｔｓ，Ｗｉｓｅｍａｎら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：４７１－３］。ＭＡＬＤＩおよびＤＥＳＩ ＭＳＩ手法は現在、光学的方法（例えば、より新しいＢｒｕｋｅｒ ｒａｐｉｆｌｅＸ ＭＡＬＤＩ－ＭＳ機器を用いた１０μｍのレーザー焦点）の空間分解能と一致していないが、透過幾何学（２μｍ）［Ｚａｖａｌｉｎ，Ｔｏｄｄら（２０１２）Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ４７：ｉ］またはレーザー集光対物レンズ（１．４μｍ）を備えた大気圧ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ［Ｋｏｍｐａｕｅｒ，Ｈｅｉｌｅｓら（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：９０－９６］などの革新的な設計を使用して、改善された分解能を得ることが可能である。

【0011】

しかしながら、タンパク質などの無傷の高分子のＭＳＩは、典型的には、不十分な質量分解能および低い感度のために不可能である［Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ，ＤｅＬａｎｅｙら（２０１８）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９０：２４０－２６５］。特定の生体分子の同定には、タンデムＭＳ／ＭＳフラグメンテーション、超高質量分解能機器および／またはボトムアッププロテオミクスアプローチ（例えば、組織のインサイツタンパク質分解）が必要である。この制限を克服するために、標識された抗体および核酸プローブを使用する従来のＩＨＣおよびＩＳＨと同様のマルチプレックスワークフローを可能にする、いくつかの標的化されたＭＳＩアプローチが導入されている。ＴＡＭＳＩＭ（標的化マルチプレックス質量分析イメージング）は、マトリックスなしのレーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）法であり、ＭＳＩの間に切断されイオン化される小さな有機光切断可能質量タグに結合体化された抗体を使用する［Ｔｈｉｅｒｙ，Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖら（２００７）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２１：８２３－９］。しかしながら、質量タグは容易に合成されず、３プレックスイメージングのみが示されている［Ｔｈｉｅｒｙ，Ａｎｓｅｌｍｉら（２００８）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８：３７２５－３４］。さらに、当業者は、質量分析計のレーザーエネルギーの吸収および分析物への移動を促進する過剰の外因的に添加されたマトリックス化合物との分析物共結晶化が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析と呼ばれる効率的な分析物の気化／イオン化および検出に必要であり［Ｙａｏ，Ｓｃｏｔｔら（１９９８）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ９：８０５－１３、Ｄｕｅｎａｓ、Ｃａｒｌｕｃｃｉら（２０１６）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２７：１５７５－８］、したがってＴＡＭＳＩＭ法は感度を欠くことを認識するであろう。

【0012】

対照的に、ペプチド質量タグは、標準的な固相合成を使用して容易に生成され、質量は、配列を変更することによって容易に調整され、ペプチドは、一般に高効率でイオン化される。Ｌｅｍａｉｒｅらは最初に、Ｔａｇ－Ｍａｓｓと呼ばれる組織の標的化イメージングのための光切断可能なペプチドベースのＭＳＩ法を導入した［Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｓｔａｕｂｅｒら（２００７）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ６：２０５７－６７］。しかしながら、プローブ（例えば、抗体）の質量タグ付けは、中間化学リンカーを含む複雑な多工程プロセスである。さらに、ペプチドに使用される光切断可能な核は、最適以下の感度を提供する。これらの欠点は、これまでのところＴａｇ－Ｍａｓｓの一般的な利用を制限しており、その結果、現在までに達成されているのは２プレックスＭＳＩのみである［Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｓｔａｕｂｅｒら（２００７）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ６：２０５７－６７、Ｆｒａｎｃｋ，Ａｒａｆａｈら（２００９）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８：２０２３－３３、Ｅｌ Ａｙｅｄ，Ｂｏｎｎｅｌら（２０１０）Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ １６：ＢＲ ２３３－４５］。

【0013】

イメージング質量分析は、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）と組み合わせた、希土類金属でタグ化された抗体を使用する［Ｇｉｅｓｅｎ，Ｗａｎｇら（２０１４）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：４１７－２２］。このアプローチは、少なくとも３２プレックスの組織染色でこれまでの最高のマルチプレックス化レベルを達成している。しかしながら、この方法は、特殊なＭＳ機器を必要とし、検出および分析のために分子を元素に還元（原子化）する破壊的アプローチであり、したがって、生体分子の非標的化直接的ＭＳＩ分析（本発明の実験例４のように質量タグ付きプローブを使用した標的化ＭＳＩと併せて）の実行に適合しない。ＩＣＰ－ＭＳの総説の例については、Ｗｉｌｓｃｈｅｆｓｋｉらを参照されたい［ＷｉｌｓｃｈｅｆｓｋｉおよびＢａｘｔｅｒ（２０１９）Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｒｅｖ ４０：１１５－１３３］。
イメージング質量サイトメトリーアプローチのさらなる欠点には、プローブ標識プロセスも非常に複雑であり、ポリマーに金属イオンを前負荷し、抗体を部分的に還元し、２つを一緒にカップリングし、ポリマーおよび抗体を複数回精製することを含むことが含まれる［Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、クイックレファレンス：「Ｍａｘｐａｒ Ｘ８ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ」、２０２０年９月アクセス、ｗｗｗ．ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ／ｂｉｎａｒｉｅｓ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｆｌｕｉｄｉｇｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｍａｘｐａｒ－ｘ８－ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｉａｂｅｌｉｎｇ－ｑｕｉｃｋ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ－ｆｌｄｍ－０００１５－ｒｅｖ０１／ｍａｘｐａｒ－ｘ８－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌａｂｅｌｉｎｇ－ｑｕｉｃｋ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ－ｆｌｄｍ－０００１５－ｒｅｖ０１／ｆｈｉｉｄｉｇｍ％３Ａｆｉｌｅ］。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】ＫａｔｉｋｉｒｅｄｄｙおよびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７８４：１５５－６７

【非特許文献2】ＨｏｗａｔおよびＷａｒｆｏｒｄ（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０：１－２

【非特許文献3】Ｓｔａｃｋ，Ｗａｎｇら（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０：４６－５８

【非特許文献4】Ｄｅｎｇ、Ｂｉｇｉｏら（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７９３：２５９－７２

【非特許文献5】ＤｕｇｇｅｒおよびＤｉｃｋｓｏｎ（２０１７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ９

【非特許文献6】Ｈａlｓｅ、Ｃｏｌｅｂａｔｃｈら（２０１８）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８：１１１５８

【非特許文献7】Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｃｅｋａｎら（２０１３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３：２６９４－７０２

【非特許文献8】Ｚａｈａ（２０１４）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５：３８２－９２

【非特許文献9】Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｃｅｋａｎら（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２１１：１７１－８７

【非特許文献10】Ｂｌｏｍ、Ｐａａｖｏｌａｉｎｅｎら（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１５５８０

【非特許文献11】Ｔｓｕｒｕｉ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（２０００）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４８：６５３－６２

【非特許文献12】Ｐａｒｒａ，Ｕｒａｏｋａら（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１３３８０

【非特許文献13】Ｇｏｒｒｉｓ，Ｈａｌｉｌｏｖｉｃら（２０１８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：３４７－３５４

【非特許文献14】Ｗａｈｌｂｙ，Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎら（２００２）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ４７：３２－４１

【非特許文献15】Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｂｏｎｎｅｋｏｈら（２００６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４：１２７０－８

【非特許文献16】Ｇｅｒｄｅｓ，Ｓｅｖｉｎｓｋｙら（２０１３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０：１１９８２－７

【非特許文献17】Ｇｉｅｓｅｎ，Ｗａｎｇら（２０１４）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：４１７－２２

【非特許文献18】Ａｒｅｎｔｚ，Ｍｉｔｔａｌら（２０１７）Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３４：２７－６６

【非特許文献19】Ｃａｐｒｉｏｌｉ，Ｆａｒｍｅｒら（１９９７）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６９：４７５１－６０

【非特許文献20】Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ，ＤｅＬａｎｅｙら（２０１８）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９０：２４０－２６５

【非特許文献21】Ｔａｋａｔｓ，Ｗｉｓｅｍａｎら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：４７１－３

【非特許文献22】Ｚａｖａｌｉｎ，Ｔｏｄｄら（２０１２）Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ４７：ｉ

【非特許文献23】Ｋｏｍｐａｕｅｒ，Ｈｅｉｌｅｓら（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：９０－９６

【非特許文献24】Ｔｈｉｅｒｙ，Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖら（２００７）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２１：８２３－９

【非特許文献25】Ｔｈｉｅｒｙ，Ａｎｓｅｌｍｉら（２００８）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８：３７２５－３４

【非特許文献26】Ｙａｏ，Ｓｃｏｔｔら（１９９８）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ９：８０５－１３

【非特許文献27】Ｄｕｅｎａｓ、Ｃａｒｌｕｃｃｉら（２０１６）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２７：１５７５－８

【非特許文献28】Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｓｔａｕｂｅｒら（２００７）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ６：２０５７－６７

【非特許文献29】Ｆｒａｎｃｋ，Ａｒａｆａｈら（２００９）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ８：２０２３－３３

【非特許文献30】Ｅｌ Ａｙｅｄ，Ｂｏｎｎｅｌら（２０１０）Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ １６：ＢＲ ２３３－４５

【非特許文献31】ＷｉｌｓｃｈｅｆｓｋｉおよびＢａｘｔｅｒ（２０１９）Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｒｅｖ ４０：１１５－１３３

【非特許文献32】Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、クイックレファレンス：「Ｍａｘｐａｒ Ｘ８ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ」、２０２０年９月アクセス、ｗｗｗ．ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ／ｂｉｎａｒｉｅｓ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｆｌｕｉｄｉｇｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｍａｘｐａｒ－ｘ８－ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｉａｂｅｌｉｎｇ－ｑｕｉｃｋ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ－ｆｌｄｍ－０００１５－ｒｅｖ０１／ｍａｘｐａｒ－ｘ８－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌａｂｅｌｉｎｇ－ｑｕｉｃｋ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ－ｆｌｄｍ－０００１５－ｒｅｖ０１／ｆｈｉｉｄｉｇｍ％３Ａｆｉｌｅ

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0015】

発明の概要

【0016】

本発明は、例えば研究用途および病理学者による臨床用途（例えば、切除された腫瘍または腫瘍生検のバイオマーカー分析）のための、組織または細胞における生体分子（例えば、タンパク質およびｍｉＲＮＡ）の標的化検出およびマッピングのための免疫組織化学（ＩＨＣ）およびインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に関する。特に、例えば、組織または細胞内の生体分子を検出およびマッピングするためのモードとしての質量分析イメージング（ＭＳＩ）の使用である。より具体的には、本発明の分野は、抗体および核酸などのプローブに結合され、マルチプレックス免疫組織化学およびインサイツハイブリダイゼーションを達成するために使用され、ＭＳＩを検出／読み出しの様式として用いる光切断可能な質量タグ試薬に関する。

【0017】

一実施形態では、本発明は、単一スライド上の組織サンプル中の５つまたはそれを超える異なるタイプのバイオマーカーを同時検出するためのマルチプレックス方法を提供し、当該方法は、ａ）単一スライド上に組織サンプルを提供することと、ｂ）組織サンプルへの抗体の結合をもたらすために当該組織サンプルを５つまたはそれを超える異なる抗体と接触させることであって、当該抗体の各々が異なるバイオマーカーと反応性であり、当該抗体の各々が固有の質量タグにコンジュゲートされていることと、ｃ）質量分析イメージングを使用して、当該質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む。一実施形態では、当該方法は、工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、当該組織サンプルに対して直接的質量分析イメージングを実施すること（すなわち、組織の画像化が単一の標本で達成される）をさらに含む。一実施形態では、当該５つまたはそれを超える抗体は混合物中にあり、工程ｂ）で当該組織サンプルを当該混合物と接触させる。一実施形態では、当該質量タグは非希土類金属質量タグである。一実施形態では、当該質量タグは複数のアミノ酸を含む。一実施形態では、当該単一スライドにマウントする前に、当該組織サンプルを新鮮凍結し、薄片化した。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、当該単一スライドにマウントする前に、当該組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した。一実施形態では、当該組織サンプルは、当該サンプルを抗体と接触させる工程の前に処理に供され、当該処理は脱パラフィンを含む。一実施形態では、当該脱パラフィンはキシレンを用いて行われる。一実施形態では、組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は再水和を含む。一実施形態では、当該再水和は一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて行われる。一実施形態では、組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は抗原賦活化を含む。一実施形態では、当該抗原賦活化は、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での加熱によって行われる。一実施形態では、当該抗原賦活化はギ酸を使用して行われる。一実施形態では、質量タグにコンジュゲートされた当該抗体は以下の一般構造：

【化1】

を有し、Ｘはスペーサーである。
一実施形態では、工程ｃ）の前にマトリックス化合物が当該質量タグに付与される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）からなる群から選択される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は昇華によって付与される。一実施形態では、組織サンプルは、サンプルをマトリックス化合物と接触させる工程の後に処理に供され、当該処理はマトリックス再結晶化を含む。一実施形態では、当該質量タグは光切断可能である。一実施形態では、本方法は、工程ｃ）の前に当該質量タグの少なくとも一部を光切断するように当該質量タグに光を照射することをさらに含む。一実施形態では、当該組織は腫瘍由来である。一実施形態では、当該腫瘍は乳房腫瘍（breast tumor）である。一実施形態では、当該５つまたはそれを超える抗体の少なくとも１つは、当該質量タグに加えて蛍光部分を含む。一実施形態では、当該異なる抗体の数は８つまたはそれを超える。一実施形態では、当該異なる抗体のサブセットは、ｉ）エストロゲン受容体（ＥＲ）、ｉｉ）プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ｉｉｉ）ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）およびｉｖ）Ｋｉ６７と反応する。一実施形態では、当該異なる抗体のサブセットは、Ｔ細胞バイオマーカーである、ｉ）ＣＤ３（Ｔ細胞）、ｉｉ）ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ｉｉｉ）ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）およびｉｖ）ＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞（ｅｅｌｌｓ））と反応する。一実施形態では、当該異なる抗体の１つはＢ細胞バイオマーカーＣＤ２０と反応する。一実施形態では、当該異なる抗体の１つはマクロファージバイオマーカーＣＤ６８と反応する。一実施形態では、当該異なる抗体の１つは免疫チェックポイント分子と反応する。一実施形態では、当該免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される。

【0018】

一実施形態では、本発明は、単一スライド上の組織サンプル中のヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）タンパク質とエストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質とを同時検出するためのマルチプレックス方法を提供し、当該方法は、ａ）単一スライド上に組織サンプルを提供することと、ｂ）組織サンプルをＨＥＲ２タンパク質特異的抗体と接触させることであって、当該抗体が第１の非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグが複数のアミノ酸を含むことと、ｃ）サンプルをＥＲ特異的抗体と接触させることであって、当該抗体が第２の非希土類金属質量にタグコンジュゲートされ、当該質量タグが第２の複数のアミノ酸を含み、当該第２の複数のアミノ酸が当該第１の複数のアミノ酸とは異なる質量を有することと、ｄ）質量分析イメージングを使用して、当該質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む。一実施形態では、工程ｂ）およびｃ）は同時に行われる。一実施形態では、工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、当該組織サンプルに対して直接的質量分析イメージングを実施することをさらに含む。一実施形態では、当該単一スライドにマウントする前に、当該組織サンプルを新鮮凍結し、薄片化した。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、当該単一スライドにマウントする前に、当該組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した。一実施形態では、当該組織サンプルは、当該サンプルを抗体と接触させる工程の前に処理に供され、当該処理は脱パラフィンを含む。一実施形態では、当該脱パラフィンはキシレンを用いて行われる。一実施形態では、組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は再水和を含む。一実施形態では、当該再水和は一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて行われる。一実施形態では、組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は抗原賦活化を含む。一実施形態では、当該抗原賦活化は、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での加熱によって行われる。一実施形態では、当該抗原賦活化はギ酸を使用して行われる。一実施形態では、質量タグにコンジュゲートされた当該抗体は以下の一般構造：

【化2】

を有し、Ｘはスペーサーである。
一実施形態では、工程ｄ）の前にマトリックス化合物が当該質量タグに付与される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）からなる群から選択される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は昇華によって付与される。一実施形態では、組織サンプルは、サンプルをマトリックス化合物と接触させる工程の後に処理に供され、当該処理はマトリックス再結晶化を含む。一実施形態では、当該質量タグは光切断可能である。一実施形態では、本方法は、工程ｄ）の前に当該質量タグの少なくとも一部を光切断するように当該質量タグに光を照射することをさらに含む。一実施形態では、当該組織は腫瘍由来である。一実施形態では、当該腫瘍は乳房腫瘍である。一実施形態では、工程ｄ）の前に、当該組織を追加の異なる抗体と接触させることをさらに含み、当該追加の異なる抗体の各々は、非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグは複数のアミノ酸を含む。一実施形態では、当該異なる抗体の数は８つまたはそれを超える。一実施形態では、当該異なる抗体の１つはプロゲステロン受容体（ＰＲ）と反応する。一実施形態では、当該異なる抗体のサブセットは、Ｔ細胞バイオマーカーである、ｉ）ＣＤ３（Ｔ細胞）、ｉｉ）ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ｉｉｉ）ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）およびｉｖ）ＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞）と反応する。一実施形態では、当該異なる抗体の１つはＢ細胞バイオマーカーＣＤ２０と反応する。一実施形態では、当該異なる抗体の１つはマクロファージバイオマーカーＣＤ６８と反応する。一実施形態では、当該異なる抗体の１つは免疫チェックポイント分子と反応する。一実施形態では、当該免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される。

【0019】

一実施形態では、本発明は、単一スライド上の腫瘍中の異なるタイプの腫瘍浸潤免疫細胞を同時検出するためのマルチプレックス方法を提供し、当該方法は、ａ）単一スライド上に腫瘍組織サンプルを提供することと、ｂ）組織サンプルへの抗体の結合をもたらすために当該組織サンプルを第１のタイプの腫瘍浸潤免疫細胞に特異的な第１の抗体と接触させることであって、当該抗体が第１の非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグが複数のアミノ酸を含むことと、ｃ）組織サンプルへの抗体の結合をもたらすために組織サンプルを第２のタイプの腫瘍浸潤免疫細胞に特異的な第２の抗体と接触させることであって、当該抗体が第２の非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグが複数のアミノ酸を含むことと、ｄ）質量分析イメージングを使用して、当該質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む。一実施形態では、工程ｂ）およびｃ）は同時に行われる。一実施形態では、工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、当該組織サンプルに対して直接的質量分析イメージングを実施することをさらに含む。一実施形態では、当該単一スライドにマウントする前に、当該組織サンプルを新鮮凍結し、薄片化した。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、当該単一スライドにマウントする前に、当該組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した。一実施形態では、当該組織サンプルは、当該サンプルを抗体と接触させる工程の前に処理に供され、当該処理は脱パラフィンを含む。一実施形態では、当該脱パラフィンはキシレンを用いて行われる。一実施形態では、組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は再水和を含む。一実施形態では、当該再水和は一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて行われる。一実施形態では、組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は抗原賦活化を含む。一実施形態では、当該抗原賦活化は、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での加熱によって行われる。一実施形態では、当該抗原賦活化はギ酸を使用して行われる。一実施形態では、質量タグにコンジュゲートされた当該抗体は以下の一般構造：

【化3】

を有し、Ｘはスペーサーである。
一実施形態では、工程ｄ）の前にマトリックス化合物が当該質量タグに付与される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）からなる群から選択される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は昇華によって付与される。一実施形態では、組織サンプルは、サンプルをマトリックス化合物と接触させる工程の後に処理に供され、当該処理はマトリックス再結晶化を含む。一実施形態では、当該質量タグは光切断可能である。一実施形態では、本方法は、工程ｄ）の前に当該質量タグの少なくとも一部を光切断するように当該質量タグに光を照射することをさらに含む。一実施形態では、当該腫瘍は肺腫瘍である。一実施形態では、当該腫瘍は乳房腫瘍である。一実施形態では、第１の抗体はＣＤ３に特異的であり、当該第２の抗体はＣＤ８に特異的である。一実施形態では、工程ｄ）の前に、当該組織を追加の異なる抗体と接触させることをさらに含み、当該追加の異なる抗体の各々は、非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグは複数のアミノ酸を含む。一実施形態では、当該追加の異なる抗体の１つはＣＤ４と反応する。一実施形態では、当該追加の異なる抗体の１つはマクロファージバイオマーカーＣＤ６８と反応する。一実施形態では、当該追加の異なる抗体の１つは免疫チェックポイント分子と反応する。一実施形態では、当該免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される。一実施形態では、本発明は、ｉ）光切断可能なリンカーを介した質量タグ、およびｉｉ）フルオロフォアにコンジュゲートした抗体を含む組成物を提供する。一実施形態では、当該抗体は、ｉ）エストロゲン受容体（ＥＲ）、ｉｉ）プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ｉｉｉ）ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、およびｉｖ）Ｋｉ６７からなる群から選択されるバイオマーカーと反応する。一実施形態では、当該抗体は、ｉ）ＣＤ３（Ｔ細胞）、ｉｉ）ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ｉｉｉ）ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）、およびｉｖ）ＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞）からなる群から選択されるＴ細胞バイオマーカーと反応する。一実施形態では、当該抗体は免疫チェックポイント分子と反応する。一実施形態では、当該免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される。

【0020】

一実施形態では、本発明は、単一スライド上の腫瘍組織上の免疫チェックポイント分子を検出するマルチプレックス方法を提供し、当該方法は、ａ）単一スライド上に腫瘍組織サンプルを提供することと、ｂ）当該組織サンプルを複数の異なる抗体を含む混合物と接触させることであって、各異なる抗体が異なる免疫チェックポイント分子と反応性であり、当該抗体の各々が非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグが複数のアミノ酸を含むことと、ｃ）質量分析イメージングを使用して、当該質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む。一実施形態では、当該複数の異なる抗体の１つは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７、およびＴＩＭ３からなる群から選択される免疫チェックポイント分子と反応する。一実施形態では、当該腫瘍組織は、ヒト患者からの生検を含む。一実施形態では、当該生検腫瘍組織はＰＤ－Ｌ１に対する抗体と反応する。一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的な免疫チェックポイント阻害剤で当該ヒト患者を処置することをさらに含む。一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的な当該チェックポイント阻害剤が、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブからなる群から選択される。

【0021】

一実施形態では、本発明は、組織サンプル中の３つまたはそれを超える（およびより好ましくは５つまたはそれを超える）異なるバイオマーカーを同時検出するためのマルチプレックス方法を提供し、当該方法は、ａ）組織サンプルを提供することと、ｂ）当該組織サンプルを３つまたはそれを超える（およびより好ましくは５つまたはそれを超える）異なるプローブと接触させて、プローブされた組織サンプルを作製することであって、当該プローブの各々が固有の質量タグにコンジュゲートされており、少なくとも３つまたはそれを超える（およびより好ましくは５つまたはそれを超える）当該プローブが当該組織サンプル中の異なるバイオマーカーにそれぞれ結合することと、ｃ）当該プローブされた組織サンプルの質量分析イメージング（例えば、組織イメージングは、単一の標本で達成される）を使用して、少なくとも３つまたはそれを超える（および好ましくは５つまたはそれを超える）当該結合したプローブから当該固有の質量タグまたはその断片を検出することであって、当該質量タグは分子イオンとして検出されることと、を含む。一実施形態では、当該組織サンプルは、薄い組織切片である。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルを凍結し、薄片化した。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルをホルマリン固定し、薄片化した。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルをスライドにマウントする。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、工程ｃ）の前に当該組織サンプルをスライドにマウントする。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、当該組織サンプルは腫瘍由来である。一実施形態では、当該腫瘍は乳房腫瘍である。一実施形態では、当該５つまたはそれを超えるプローブは混合物中にあり、工程ｂ）で当該組織サンプルを当該混合物と接触させて、当該プローブされた組織サンプルを作製する。一実施形態では、質量タグにコンジュゲートされた当該プローブは以下の一般構造：

【化4】

を有し、Ｘはスペーサーである。
一実施形態では、当該５つまたはそれを超えるプローブの少なくとも１つは、当該質量タグに加えて蛍光部分を含む。一実施形態では、当該プローブは、タンパク質および核酸からなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは抗体である。一実施形態では、当該抗体は、組換え抗体、ナノボディ、一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体、単一ドメイン抗体、およびＶＨＨ単一ドメイン抗体からなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、アフィボディ、受容体およびリガンドからなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、アプタマーである。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、ＲＮＡ標的に結合する。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ標的に結合する。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、ＤＮＡ標的に結合する。一実施形態では、当該質量タグは非希土類金属質量タグである。一実施形態では、当該質量タグは複数のアミノ酸を含む。一実施形態では、当該質量タグは光切断可能である。一実施形態では、本方法は、工程ｃ）の前に当該質量タグの少なくとも一部を光切断するように当該質量タグに光を照射することをさらに含む。一実施形態では、工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、当該組織サンプルに対して質量分析イメージングを実施することをさらに含む。一実施形態では、工程ｃ）の前にマトリックス化合物が当該プローブされた組織サンプルに付与される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）からなる群から選択される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は昇華によって付与される。一実施形態では、当該プローブされた組織サンプルは、当該プローブされた組織サンプルに当該マトリックス化合物を付与する工程の後に処理に供され、当該処理はマトリックス再結晶化を含む。一実施形態では、当該組織サンプルは、当該パラフィン包埋後および工程ｂ）の前に処理に供され、当該処理は脱パラフィンを含む。一実施形態では、当該脱パラフィンはキシレンを用いて行われる。一実施形態では、当該組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は再水和を含む。一実施形態では、当該再水和は一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて行われる。一実施形態では、当該組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は抗原賦活化を含む。一実施形態では、当該抗原賦活化は、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での加熱によって行われる。一実施形態では、当該抗原賦活化はギ酸を使用して行われる。一実施形態では、当該異なるプローブの数は１０またはそれを超える。一実施形態では、当該異なるプローブのサブセットは、ｉ）エストロゲン受容体（ＥＲ）、ｉｉ）プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ｉｉｉ）ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）およびｉｖ）Ｋｉ６７に結合することができる。一実施形態では、当該異なるプローブのサブセットは、Ｔ細胞バイオマーカーである、ｉ）ＣＤ３（Ｔ細胞）、ｉｉ）ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ｉｉｉ）ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）およびｉｖ）ＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞）に結合することができる。一実施形態では、当該異なるプローブの１つは、Ｂ細胞バイオマーカーＣＤ２０に結合することができる。一実施形態では、当該異なるプローブの１つは、マクロファージバイオマーカーＣＤ６８に結合することができる。一実施形態では、当該異なるプローブの１つは、免疫チェックポイント分子に結合することができる。一実施形態では、当該免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される。

【0022】

一実施形態では、本発明は、単一スライド上の組織サンプル中の異なるホルモン受容体を同時検出するためのマルチプレックス方法を提供し、当該方法は、ａ）単一スライド上にマウントした組織サンプルを提供することと、ｂ）当該組織サンプルを、第１のホルモン受容体に結合することができる第１のプローブと接触させることであって、当該プローブが第１の非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグが複数のアミノ酸を含むことと、ｃ）当該組織サンプルを、第２のホルモン受容体に結合することができる第２のプローブと接触させることであって、当該プローブが第２の非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグが第２の複数のアミノ酸を含み、当該第２のホルモン受容体が当該第１のホルモン受容体と異なり、当該第２の複数のアミノ酸が当該第１の複数のアミノ酸とは異なる質量を有し、工程ｂ）およびｃ）が一緒になって、プローブされた組織サンプルを作製することと、ｄ）質量分析イメージングを使用して、少なくとも１つの当該質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む。一実施形態では、当該組織サンプルは、薄い組織切片である。一実施形態では、当該スライドにマウントする前に当該組織サンプルを凍結し、薄片化した。一実施形態では、当該スライドにマウントする前に当該組織サンプルをホルマリン固定し、薄片化した。一実施形態では、当該スライドにマウントする前に当該組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、当該組織サンプルは腫瘍由来である。一実施形態では、当該腫瘍は乳房腫瘍である。一実施形態では、非希土類金属質量タグにコンジュゲートされた当該プローブは以下の一般構造：

【化5】

を有し、Ｘはスペーサーである。
一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、当該非希土類金属質量タグに加えて蛍光部分を含む。一実施形態では、当該プローブは、タンパク質および核酸からなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは抗体である。一実施形態では、当該抗体は、組換え抗体、ナノボディ、一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体、単一ドメイン抗体、およびＶＨＨ単一ドメイン抗体からなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、アフィボディ、受容体およびリガンドからなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、アプタマーである。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、ＲＮＡ標的に結合することができる。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ標的に結合することができる。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、ＤＮＡ標的に結合することができる。一実施形態では、当該非希土類金属質量タグは、光切断可能である。一実施形態では、本方法は、工程ｄ）の前に当該非希土類金属質量タグの少なくとも一部を光切断するように当該非希土類金属質量タグに光を照射することをさらに含む。一実施形態では、工程ｂ）およびｃ）は同時に行われ、当該プローブされた組織サンプルを作製する。一実施形態では、工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、当該組織サンプルに対して質量分析イメージングを実施することをさらに含む。一実施形態では、工程ｄ）の前にマトリックス化合物が当該プローブされた組織サンプルに付与される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）からなる群から選択される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は昇華によって付与される。一実施形態では、当該プローブされた組織サンプルは、当該プローブされた組織サンプルに当該マトリックス化合物を付与する工程の後に処理に供され、当該処理はマトリックス再結晶化を含む。一実施形態では、当該組織サンプルは、当該パラフィン包埋後および工程ｂ）の前に処理に供され、当該処理は脱パラフィンを含む。一実施形態では、当該脱パラフィンはキシレンを用いて行われる。一実施形態では、組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は再水和を含む。一実施形態では、当該再水和は一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて行われる。一実施形態では、組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は抗原賦活化を含む。一実施形態では、当該抗原賦活化は、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での加熱によって行われる。一実施形態では、当該抗原賦活化はギ酸を使用して行われる。一実施形態では、当該第１のプローブはエストロゲン受容体（ＥＲ）に結合することができ、当該第２のプローブはプロゲステロン受容体（ＰＲ）に結合することができる。一実施形態では、工程ｄ）の前に、当該組織サンプルを追加の異なるプローブと接触させることをさらに含み、当該追加の異なるプローブの各々は、異なる非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグは複数のアミノ酸を含み、各質量タグの質量は異なる。一実施形態では、当該プローブの数は１０またはそれを超える。一実施形態では、当該追加の異なるプローブのサブセットは、ｉ）ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）およびｉｉ）Ｋｉ６７に結合することができる。一実施形態では、当該追加の異なるプローブのサブセットは、Ｔ細胞バイオマーカーである、ｉ）ＣＤ３（Ｔ細胞）、ｉｉ）ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ｉｉｉ）ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）およびｉｖ）ＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞）のに結合することができる。一実施形態では、当該追加の異なるプローブの１つは、Ｂ細胞バイオマーカーＣＤ２０に結合することができる。一実施形態では、当該追加の異なるプローブの１つは、マクロファージバイオマーカーＣＤ６８に結合することができる。一実施形態では、当該追加の異なるプローブの１つは、免疫チェックポイント分子に結合することができる。一実施形態では、当該免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される。

【0023】

一実施形態では、本発明は、単一スライド上の腫瘍組織中の異なるタイプの腫瘍浸潤免疫細胞を同時検出するためのマルチプレックス方法を提供し、当該方法は、ａ）単一スライド上にマウントした腫瘍組織サンプルを提供することと、ｂ）当該腫瘍組織サンプルを、第１の腫瘍浸潤免疫細胞型に結合することができる第１のプローブと接触させることであって、当該プローブが第１の非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグが複数のアミノ酸を含むことと、ｃ）当該腫瘍組織サンプルを、第２の腫瘍浸潤免疫細胞型に結合することができる第２のプローブと接触させることであって、当該プローブが第２の非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグが第２の複数のアミノ酸を含み、当該第２の腫瘍浸潤免疫細胞が当該第１の腫瘍浸潤免疫細胞とは異なる型であり、当該第２の複数のアミノ酸が当該第１の複数のアミノ酸とは異なる質量を有し、工程ｂ）およびｃ）が一緒になって、プローブされた腫瘍組織サンプルを作製することと、ｄ）質量分析イメージングを使用して、当該質量タグまたはその断片の少なくとも１つを分子イオンとして検出することと、を含む。一実施形態では、当該腫瘍組織サンプルは、薄い組織切片である。一実施形態では、当該スライドにマウントする前に当該腫瘍組織サンプルを凍結し、薄片化した。一実施形態では、当該スライドにマウントする前に当該腫瘍組織サンプルをホルマリン固定し、薄片化した。一実施形態では、当該スライドにマウントする前に当該腫瘍組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、当該腫瘍組織サンプルは乳房腫瘍由来である。一実施形態では、非希土類金属質量タグにコンジュゲートされた当該プローブは以下の一般構造：

【化6】

を有し、Ｘはスペーサーである。
一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、当該非希土類金属質量タグに加えて蛍光部分を含む。一実施形態では、当該プローブは、タンパク質および核酸からなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは抗体である。一実施形態では、当該抗体は、組換え抗体、ナノボディ、一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体、単一ドメイン抗体、およびＶＨＨ単一ドメイン抗体からなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、アフィボディ、受容体およびリガンドからなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、アプタマーである。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、ＲＮＡ標的に結合することができる。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ標的に結合することができる。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは、ＤＮＡ標的に結合することができる。一実施形態では、当該非希土類金属質量タグは、光切断可能である。一実施形態では、本方法は、工程ｄ）の前に当該非希土類金属質量タグの少なくとも一部を光切断するように当該非希土類金属質量タグに光を照射することをさらに含む。一実施形態では、工程ｂ）およびｃ）は同時に行われ、当該プローブされた腫瘍組織サンプルを作製する。一実施形態では、工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、当該腫瘍組織サンプルに対して質量分析イメージングを実施することをさらに含む。一実施形態では、工程ｄ）の前にマトリックス化合物が当該プローブされた腫瘍組織サンプルに付与される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）からなる群から選択される。一実施形態では、当該マトリックス化合物は昇華によって付与される。一実施形態では、当該プローブされた腫瘍組織サンプルは、当該プローブされた腫瘍組織サンプルに当該マトリックス化合物を付与する工程の後に処理に供され、当該処理はマトリックス再結晶化を含む。一実施形態では、当該腫瘍組織サンプルは、当該パラフィン包埋後および工程ｂ）の前に処理に供され、当該処理は脱パラフィンを含む。一実施形態では、当該脱パラフィンはキシレンを用いて行われる。一実施形態では、腫瘍組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は再水和を含む。一実施形態では、当該再水和は一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて行われる。一実施形態では、腫瘍組織サンプルはさらに処理に供され、当該処理は抗原賦活化を含む。一実施形態では、当該抗原賦活化は、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での加熱によって行われる。一実施形態では、当該抗原賦活化はギ酸を使用して行われる。一実施形態では、当該第１のプローブはＣＤ４に結合することができ、当該第２のプローブはＣＤ８に結合することができる。一実施形態では、工程ｄ）の前に、当該腫瘍組織サンプルを追加の異なるプローブと接触させることをさらに含み、当該追加の異なるプローブの各々は、異なる非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグは複数のアミノ酸を含み、各質量タグの質量は異なる。一実施形態では、当該プローブの数は１０またはそれを超える。一実施形態では、当該追加の異なるプローブの１つは、Ｔ細胞バイオマーカーＣＤ３に結合することができる。一実施形態では、当該追加の異なるプローブの１つは、マクロファージバイオマーカーＣＤ６８に結合することができる。一実施形態では、当該追加の異なるプローブの１つは、免疫チェックポイント分子に結合することができる。一実施形態では、当該免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される。

【0024】

一実施形態では、本発明は、ｉ）光切断可能なリンカーを介した質量タグ、およびｉｉ）フルオロフォアにコンジュゲートしたプローブを含む組成物を提供する。一実施形態では、当該プローブは、ｉ）エストロゲン受容体（ＥＲ）、ｉｉ）プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ｉｉｉ）ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、およびｉｖ）Ｋｉ６７からなる群から選択されるバイオマーカーに結合することができる。一実施形態では、当該プローブは、ｉ）ＣＤ３（Ｔ細胞）、ｉｉ）ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ｉｉｉ）ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）、およびｉｖ）ＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞）からなる群から選択されるＴ細胞バイオマーカーに結合することができる。一実施形態では、当該プローブは、免疫チェックポイント分子に結合することができる。一実施形態では、当該免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される。

【0025】

一実施形態では、本発明は、単一スライド上の腫瘍組織上の異なる免疫チェックポイント分子を検出するマルチプレックス方法を提供し、当該方法は、ａ）単一スライド上に腫瘍組織サンプルを提供することと、ｂ）当該腫瘍組織サンプルを複数の異なるプローブを含む混合物と接触させることであって、各異なるプローブが異なる免疫チェックポイント分子に結合することができ、当該プローブの各々が非希土類金属質量タグにコンジュゲートされ、当該質量タグが複数のアミノ酸を含むことと、ｃ）質量分析イメージングを使用して、当該質量タグまたはその断片の少なくとも１つを分子イオンとして検出することと、を含む。一実施形態では、当該複数の異なるプローブの１つは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７、およびＴＩＭ３からなる群から選択される免疫チェックポイント分子に結合することができる。一実施形態では、当該腫瘍組織サンプルは、ヒト患者からの生検を含む。一実施形態では、当該腫瘍組織生検は、ＰＤ－Ｌ１の質量タグ付きプローブに結合する。一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的な免疫チェックポイント阻害剤で当該ヒト患者を処置することをさらに含む。一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に特異的な当該チェックポイント阻害剤が、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｒｎａｂ）からなる群から選択される。一実施形態では、当該プローブの少なくとも１つは抗体である。一実施形態では、当該抗体は、組換え抗体、ナノボディ、一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体、単一ドメイン抗体、およびＶＨＨ単一ドメイン抗体からなる群から選択される。

【0026】

一実施形態では、本発明は、組織サンプル中の３つまたはそれを超える（およびより好ましくは５つまたはそれを超える）異なるタイプの炭水化物を同時検出するためのマルチプレックス方法を提供し、当該方法は、ａ）組織サンプルを提供することと、ｂ）組織サンプルへの炭水化物結合タンパク質の結合をもたらすために当該組織サンプルを３つまたはそれを超える（およびより好ましくは５つまたはそれを超える）異なる当該炭水化物結合タンパク質と接触させて、プローブされた組織サンプルを作製することであって、当該炭水化物結合タンパク質の各々が異なる炭水化物と反応性であり、当該炭水化物結合タンパク質の各々が固有の質量タグコンジュゲートされることと、ｃ）当該プローブされた組織サンプルの質量分析イメージングを使用して、当該質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む。一実施形態では、当該組織サンプルは、薄い組織切片である。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルを凍結し、薄片化した。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルをホルマリン固定し、薄片化した。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルをスライドにマウントする。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、工程ｃ）の前に当該組織サンプルをスライドにマウントする。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、当該組織サンプルは腫瘍由来である。一実施形態では、当該腫瘍は乳房腫瘍である。一実施形態では、質量タグにコンジュゲートされた当該炭水化物結合タンパク質は、以下の一般構造：

【化7】

を有し、Ｘはスペーサーであり、ＣＢＰは炭水化物結合タンパク質である。
一実施形態では、当該３つまたはそれを超える（およびより好ましくは５つまたはそれを超える）炭水化物結合タンパク質は混合物中にあり、工程ｂ）で当該組織サンプルを当該混合物と接触させて、当該プローブされた組織サンプルを作製する。一実施形態では、当該混合物は、１つまたはそれを超えるプローブをさらに含み、当該プローブの各々は、当該組織内の異なる標的と反応性であり、当該プローブの各々は、固有の質量タグにコンジュゲートされている。一実施形態では、当該５つまたはそれを超える炭水化物結合タンパク質の少なくとも１つは、当該質量タグに加えて蛍光部分を含む。一実施形態では、当該５つまたはそれを超える炭水化物結合タンパク質の少なくとも１つはレクチンである。一実施形態では、当該質量タグは非希土類金属質量タグである。一実施形態では、当該質量タグは複数のアミノ酸を含む。一実施形態では、当該質量タグは光切断可能である。一実施形態では、本方法は、工程ｃ）の前に当該質量タグの少なくとも一部を光切断するように当該質量タグに光を照射することをさらに含む。

【0027】

一実施形態では、本発明は、同じ組織サンプル中の異なる生体分子またはその断片を検出するためのマルチオミック方法であって、当該方法は、ａ）組織サンプルを提供することと、ｂ）当該組織サンプルの少なくとも一部に消化剤を適用することと、ｃ）当該組織サンプルに対して質量分析イメージングを実施することと、ｄ）当該組織サンプルへのプローブの結合をもたらすために当該組織サンプルを３つまたはそれを超える（およびより好ましくは５つまたはそれを超える）異なるプローブと接触させて、プローブされた組織サンプルを作製することであって、当該プローブの各々が当該組織サンプル内の異なる標的と反応性であり、当該プローブの各々が固有の質量タグにコンジュゲートされていることと、ｅ）当該プローブされた組織サンプルの質量分析イメージングを使用して、当該質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む。一実施形態では、当該消化剤は酵素である。一実施形態では、当該酵素は、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼおよびグリコシダーゼからなる群から選択される。一実施形態では、当該消化剤は化学物質である。一実施形態では、当該化学物質は、臭化シアン（ＣＮＢｒ）およびヒドロキシルアミンからなる群から選択される。一実施形態では、異なる消化剤の混合物は、工程ｂ）で代わりに適用される。一実施形態では、工程ｂ）およびｃ）は、代わりに、工程ｅ）の後にそれぞれ実行される。一実施形態では、当該組織サンプルは、当該消化剤を当該組織サンプルに付与する当該工程の前に、工程ｅ）の後に処理にさらに供され、当該処理は、当該結合したプローブを当該組織サンプルから分離することを含む。一実施形態では、当該結合したプローブの当該分離は、当該組織サンプルを変性処理に供することを含む。一実施形態では、当該変性処理は、カオトロピック剤、ｐＨ≦５の溶液、ｐＨ≧１０の溶液、還元剤、酸化剤、熱、有機溶媒、および界面活性剤からなる群から選択される。一実施形態では、当該組織サンプルは、薄い組織切片である。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルを凍結し、薄片化した。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルをホルマリン固定し、薄片化した。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した。一実施形態では、工程ｂ）の前に当該組織サンプルをスライドにマウントする。一実施形態では、当該スライドは金を含む。一実施形態では、当該スライドは金層を有するガラススライドである。一実施形態では、当該組織サンプルは腫瘍由来である。一実施形態では、当該腫瘍は乳房腫瘍である。一実施形態では、質量タグにコンジュゲートされた当該プローブは以下の一般構造：

【化8】

を有し、Ｘはスペーサーである。
一実施形態では、当該３つまたはそれを超える（およびより好ましくは５つまたはそれを超える）プローブは混合物中にあり、工程ｄ）で当該組織サンプルを当該混合物と接触させて、当該プローブされた組織サンプルを作製する。一実施形態では、当該５つまたはそれを超えるプローブの少なくとも１つは、当該質量タグに加えて蛍光部分を含む。一実施形態では、当該プローブは、タンパク質および核酸からなる群から選択される。一実施形態では、当該タンパク質プローブの少なくとも１つは、抗体、組換え抗体、アフィボディ、ナノボディ、一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ単一ドメイン抗体、受容体、リガンド、および炭水化物結合タンパク質からなる群から選択される。一実施形態では、当該核酸プローブの少なくとも１つは、アプタマーである。一実施形態では、当該核酸プローブの少なくとも１つは、ＲＮＡ標的に結合する。一実施形態では、当該核酸プローブの少なくとも１つは、ｍｉＲＮＡ標的に結合する。一実施形態では、当該核酸プローブの少なくとも１つは、ＤＮＡ標的に結合する。一実施形態では、当該質量タグは非希土類金属質量タグである。一実施形態では、当該質量タグは複数のアミノ酸を含む。一実施形態では、当該質量タグは光切断可能である。一実施形態では、本方法は、工程ｅ）の前に当該質量タグの少なくとも一部を光切断するように当該質量タグに光を照射することをさらに含む。

【0028】

一実施形態では、本発明は、以下の一般化学構造：

【化9】

を含む組成物を提供し、
式中、Ａは、少なくとも１つのアミンを含む第１のリンカーユニット（第１のスペーサーユニットとも呼ばれる）であり、Ｘは、当該アミンの窒素原子に共有結合した保護基であり、Ｂは、第２のリンカーユニット（第２のスペーサーユニットとも呼ばれる）である。一実施形態では、当該保護アミンは、Ｆｍｏｃ保護アミンである。一実施形態では、組成物は以下の化学構造：

【化10】

を有する。
一実施形態では、当該第１および／または第２のリンカー（あるいは第１および／または第２のスペーサーユニット）は、ポリエチレングリコールを含む。一実施形態では、当該第１および／または第２のリンカー（あるいは第１および／または第２のスペーサーユニット）は、２，２’－（エチレンジオキシ）－ビス－（エチルアミン）化学リンカーを含む。

【図面の簡単な説明】

【0029】

図面の簡単な説明

【0030】

特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの面を伴うこの特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて特許庁によって提供される。

【0031】

【図1】組織サンプル中の分析物のマルチプレックス直接的非標識マッピングのための質量分析イメージング（ＭＳＩ）のボトムアップ適用。［Ａｒｅｎｔｚ，Ｍｉｔｔａｌら（２０１７）Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３４：２７－６６］より適応。この既存のアプローチは、マルチプレックス化されているが本質的に標的化されておらず、それは、光切断可能な質量タグ付きプローブ（ＰＣ－ＭＴ－プローブ）などの標識プローブを使用せず、したがって、検出された分析物の複雑な同定方法を必要とし、場合によっては画像の空間分解能も低下させるためである（例えば、タンパク質の検出および同定にはインサイツ組織タンパク質分解が必要であるため）。

【0032】

【図2A】図２Ａ－２Ｃ。好ましい光切断可能な質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）および光切断可能な質量タグ付きプローブ（ＰＣ－ＭＴ－プローブ）の基本設計および使用。（図２Ａ）好ましいペプチドベースのＰＣ－ＭＴ。曲線はペプチドベースの質量ユニットであり、楕円形は光切断可能なリンカー（ＰＣ－リンカー）であり、「ＮＨＳ」はプローブ反応性部分であり、この例では第一級アミン反応性ＮＨＳエステル脱離基として示されている。ペプチドベースのＰＣ－ＭＴは、プローブ反応性部分が第一級アミン反応性である場合、ＰＣ－ＭＴの自己反応／重合を防ぐためにＮ末端がブロック／保護されている（例えば、アセチル化－図示せず）ことに留意されたい（そして、リシンアミノ酸上のｓ－アミンなどの内部第一級アミンは回避されるか、または保護／ブロックされる）。質量ユニットの質量コードは、異なるアミノ酸（または天然および非天然アミノ酸を含む、その同位体、類似体、誘導体もしくは修飾）を使用して達成される。質量分析イメージング（ＭＳＩ）の結果を従来の蛍光イメージングと直接比較することを可能にすることによって方法の開発を支援することができるフルオロフォア（「Ｆ」を有するスターバースト）がＰＣ－ＭＴに必要に応じて含まれることに留意されたい。（図２Ｂ）ＰＣ－ＭＴを、例えば抗体またはアミン修飾核酸などのプローブに結合させて、ＰＣ－ＭＴ－プローブを作製する。これは、典型的には、その後のＰＣ－ＭＴ－プローブの精製の有無にかかわらず、ＰＣ－ＭＴのプローブ反応性部分（例えば、この場合は失われるＮＨＳ－エステル脱離基）とプローブとの間の１工程化学反応で達成される。（図２Ｃ）次いで、ＰＣ－ＭＴプローブを使用して、従来の免疫組織化学（ＩＨＣ）またはインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に類似した手順で組織を「染色」し（すなわち、ＰＣ－ＭＴプローブは組織中の標的に結合している）、続いてＭＳＩを行う。質量レポーターを遊離させる光切断は、ＭＳＩの前の外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＵＶ処理によって達成することができ、または装置のレーザービームを使用してマトリックス支援レーザー脱離イオン化ＭＳＩ（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）と並行して達成することができる。いくつかの実施形態における質量レポーターは、結合した光切断ＰＣ－リンカーの部分を含むことができることに留意されたい。

【図2B】図２Ａ－２Ｃ。好ましい光切断可能な質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）および光切断可能な質量タグ付きプローブ（ＰＣ－ＭＴ－プローブ）の基本設計および使用。（図２Ａ）好ましいペプチドベースのＰＣ－ＭＴ。曲線はペプチドベースの質量ユニットであり、楕円形は光切断可能なリンカー（ＰＣ－リンカー）であり、「ＮＨＳ」はプローブ反応性部分であり、この例では第一級アミン反応性ＮＨＳエステル脱離基として示されている。ペプチドベースのＰＣ－ＭＴは、プローブ反応性部分が第一級アミン反応性である場合、ＰＣ－ＭＴの自己反応／重合を防ぐためにＮ末端がブロック／保護されている（例えば、アセチル化－図示せず）ことに留意されたい（そして、リシンアミノ酸上のｓ－アミンなどの内部第一級アミンは回避されるか、または保護／ブロックされる）。質量ユニットの質量コードは、異なるアミノ酸（または天然および非天然アミノ酸を含む、その同位体、類似体、誘導体もしくは修飾）を使用して達成される。質量分析イメージング（ＭＳＩ）の結果を従来の蛍光イメージングと直接比較することを可能にすることによって方法の開発を支援することができるフルオロフォア（「Ｆ」を有するスターバースト）がＰＣ－ＭＴに必要に応じて含まれることに留意されたい。（図２Ｂ）ＰＣ－ＭＴを、例えば抗体またはアミン修飾核酸などのプローブに結合させて、ＰＣ－ＭＴ－プローブを作製する。これは、典型的には、その後のＰＣ－ＭＴ－プローブの精製の有無にかかわらず、ＰＣ－ＭＴのプローブ反応性部分（例えば、この場合は失われるＮＨＳ－エステル脱離基）とプローブとの間の１工程化学反応で達成される。（図２Ｃ）次いで、ＰＣ－ＭＴプローブを使用して、従来の免疫組織化学（ＩＨＣ）またはインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に類似した手順で組織を「染色」し（すなわち、ＰＣ－ＭＴプローブは組織中の標的に結合している）、続いてＭＳＩを行う。質量レポーターを遊離させる光切断は、ＭＳＩの前の外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＵＶ処理によって達成することができ、または装置のレーザービームを使用してマトリックス支援レーザー脱離イオン化ＭＳＩ（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）と並行して達成することができる。いくつかの実施形態における質量レポーターは、結合した光切断ＰＣ－リンカーの部分を含むことができることに留意されたい。

【図2C】図２Ａ－２Ｃ。好ましい光切断可能な質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）および光切断可能な質量タグ付きプローブ（ＰＣ－ＭＴ－プローブ）の基本設計および使用。（図２Ａ）好ましいペプチドベースのＰＣ－ＭＴ。曲線はペプチドベースの質量ユニットであり、楕円形は光切断可能なリンカー（ＰＣ－リンカー）であり、「ＮＨＳ」はプローブ反応性部分であり、この例では第一級アミン反応性ＮＨＳエステル脱離基として示されている。ペプチドベースのＰＣ－ＭＴは、プローブ反応性部分が第一級アミン反応性である場合、ＰＣ－ＭＴの自己反応／重合を防ぐためにＮ末端がブロック／保護されている（例えば、アセチル化－図示せず）ことに留意されたい（そして、リシンアミノ酸上のｓ－アミンなどの内部第一級アミンは回避されるか、または保護／ブロックされる）。質量ユニットの質量コードは、異なるアミノ酸（または天然および非天然アミノ酸を含む、その同位体、類似体、誘導体もしくは修飾）を使用して達成される。質量分析イメージング（ＭＳＩ）の結果を従来の蛍光イメージングと直接比較することを可能にすることによって方法の開発を支援することができるフルオロフォア（「Ｆ」を有するスターバースト）がＰＣ－ＭＴに必要に応じて含まれることに留意されたい。（図２Ｂ）ＰＣ－ＭＴを、例えば抗体またはアミン修飾核酸などのプローブに結合させて、ＰＣ－ＭＴ－プローブを作製する。これは、典型的には、その後のＰＣ－ＭＴ－プローブの精製の有無にかかわらず、ＰＣ－ＭＴのプローブ反応性部分（例えば、この場合は失われるＮＨＳ－エステル脱離基）とプローブとの間の１工程化学反応で達成される。（図２Ｃ）次いで、ＰＣ－ＭＴプローブを使用して、従来の免疫組織化学（ＩＨＣ）またはインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に類似した手順で組織を「染色」し（すなわち、ＰＣ－ＭＴプローブは組織中の標的に結合している）、続いてＭＳＩを行う。質量レポーターを遊離させる光切断は、ＭＳＩの前の外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＵＶ処理によって達成することができ、または装置のレーザービームを使用してマトリックス支援レーザー脱離イオン化ＭＳＩ（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）と並行して達成することができる。いくつかの実施形態における質量レポーターは、結合した光切断ＰＣ－リンカーの部分を含むことができることに留意されたい。

【0033】

【図3】好ましい光切断可能なリンカー（ＰＣ－リンカー）、光切断可能な質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）および光切断可能な質量タグ付きプローブ（ＰＣ－ＭＴ－プローブ）の詳細な化学構造および使用。Ｆｍｏｃ－ＰＣ－リンカーは、従来のＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）中に、他のアミノ酸（または天然および非天然アミノ酸を含む、その同位体、類似体、誘導体もしくは修飾）と共にペプチドベースのＰＣ－ＭＴに組み込まれる（工程１）。Ｆｍｏｃ－ＰＣ－リンカーは、種々の化学組成物であり得る任意のリンカーユニットを含む。示されている例示的なＰＣ－ＭＴは、Ｎ末端を左に、Ｃ末端を右に向けている。「ＡＰＲＬＲＦＹＳＬ」は、質量ユニットのアミノ酸配列の一例である。ＰＣ－ＭＴは、例としてＰＣ－リンカー＋ＧＳＧＧＫアミノ酸配列の一部として示される任意のスペーサーユニットを含む。ＰＣ－ＭＴはまた、任意の質量ユニットリンカーを含む。スペーサーユニットおよび質量ユニットリンカーは、種々の化学組成物であり得る。ＰＣ－リンカーの光切断可能な核（ＰＣ－核）は、高速かつ効率的な１－（２－ニトロフェニル）エチルベースの部分である。プローブ反応性部分（例えば、ＮＨＳ－エステル脱離基として示される）は、例えば、示されるように含まれるリジンアミノ酸のｓ－アミン上で生成することができる（または例えば、Ｃ末端のカルボン酸基上で生成することができる－図示せず）。「Ａｃ」は、示されるＰＣ－ＭＴの自己反応／重合を防止するために使用されるａ－アミンのＮ末端アセチル化である。（工程２）ＰＣ－ＭＴを抗体（図示）またはアミン修飾核酸（図示せず）などのプローブと反応させてＰＣ－ＭＴ－プローブを形成する。図示の例では、ＰＣ－ＭＴのＮＨＳ－エステル脱離基（プローブ反応性部分）は、抗体上の第一級アミンと反応する（ＮＨＳ－エステルが失われ、アミド結合が形成される）。ＰＣ－ＭＴ－プローブのコア構造は、質量ユニットをプローブに連結するＰＣ－ＭＴの部分として定義される。これは、典型的には、すべてのＰＣ－ＭＴ種の共通構造に対応するすべてのＰＣ－ＭＴ－プローブ種の共通構造である。（工程３）最後に、ＰＣ－ＭＴ－プローブを組織中の標的に結合させ、続いて光切断（質量レポーターを遊離させるため）および質量分析イメージング（ＭＳＩ）を行う（ＭＳＩは示さず）。ＰＣ－リンカー（質量ユニットリンカー）の小さな残留部分は、この例では光切断された質量レポーターの一部として残り、この例では第一級アミン基を生成し、これはポジティブモードＭＳＩにおけるイオン化を支援し得ることに留意されたい。

【0034】

【図4】本発明の実施例ＰＣ－リンカーおよびＬｅｍａｉｒｅらの研究で使用されたＰＣ－リンカーの構造の比較。Ｌｅｍａｉｒｅらの研究については、［Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｓｔａｕｂｅｒら（２００７）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ６：２０５７－６７］および米国特許第８，２２１，９７２号を参照されたい。ＰＣ－リンカーは、例示的なペプチド配列に組み込まれているものとして示されている。

【0035】

【図5A】図５Ａ－５Ｂ。ＰＣ－ＭＴシグナル増幅の例示的な方法。（図５Ａ）例えばＮＨＳ－エステルベースのプローブ反応性部分を有する複数のＰＣ－ＭＴは、アミン末端金ナノ粒子（「ＮＰ」、図示）またはデンドリマー（図示せず）の表面にコンジュゲートさせることができる。次いで、デンドリマーまたはＮＰをプローブにコンジュゲートさせることができる（「抗体プローブ」が示されている）。（図５Ｂ）核酸プローブについては、好ましくは「標的結合」配列（すなわち、標的ハイブリダイゼーション配列）の一部ではない第一級アミン修飾核酸配列を使用して、各プローブ分子当たり多くのＰＣ－ＭＴの結合を促進することができる（例えば、ここでもプローブ反応性部分が第一級アミン反応性である場合）。

【図5B】図５Ａ－５Ｂ。ＰＣ－ＭＴシグナル増幅の例示的な方法。（図５Ａ）例えばＮＨＳ－エステルベースのプローブ反応性部分を有する複数のＰＣ－ＭＴは、アミン末端金ナノ粒子（「ＮＰ」、図示）またはデンドリマー（図示せず）の表面にコンジュゲートさせることができる。次いで、デンドリマーまたはＮＰをプローブにコンジュゲートさせることができる（「抗体プローブ」が示されている）。（図５Ｂ）核酸プローブについては、好ましくは「標的結合」配列（すなわち、標的ハイブリダイゼーション配列）の一部ではない第一級アミン修飾核酸配列を使用して、各プローブ分子当たり多くのＰＣ－ＭＴの結合を促進することができる（例えば、ここでもプローブ反応性部分が第一級アミン反応性である場合）。

【0036】

【図6】モデルシステムとしてビーズアレイを使用する１５プレックスＰＣ－ＭＴ－ＡｂベースのＭＳＩ。１５種類の異なるバージョンの抗ストレプトアビジンＰＣ－ＭＴ－Ａｂを、１５種類の新規アミン反応性ＮＨＳ活性化ＰＣ－ＭＴ試薬を用いた直接的１工程標識によって作製した。ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを別々に使用して、２０μｍポリマーストレプトアビジンビーズをプローブした。次いで、ビーズをプールし、顕微鏡スライドのフットプリントにアレイを形成するために使用し、次いで、これをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。挿入図は、ビーズアレイの代表的な領域の色分けされた１５プレックスＭＡＬＤＩ－ＭＳの「質量画像」である。色分けされオーバーレイされたスペクトルは、１５種類の異なるＰＣ－ＭＴ－Ａｂプローブされたビーズバージョンのそれぞれについての質量画像内の代表的な単一ビーズからのものである（黒色矢印は異なるＰＣ－ＭＴ質量レポーターピークを示す）。ペプチドＰＣ－ＭＴの１Ｄａ分離された天然同位体はＭＡＬＤＩ－ＭＳによって容易に分解されるが、コンパクトなＸ軸スケーリングのために提供されるスペクトルでは見えないことに留意されたい。

【0037】

【図7A】図７Ａ－７Ｅ。マウス脳ＦＦＰＥ組織切片に対するＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した５プレックスＭＩＨＣ。ＦＦＰＥ組織切片を５つの異なるタンパク質標的に対してＰＣ－ＭＴ－Ａｂで同時に染色し、次いでＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。ＭＳＩについては、マトリックス適用は昇華とそれに続く再結晶（ポジティブイオン反射モードでのＭＳＩ）によるものであった。標準的な免疫蛍光染色も、隣接する組織切片に対して行った。（図７Ａ）シナプシン（青色）、ＭＡＰ－２（オレンジ色）、ＮｅｕＮ（緑色）、ミエリン（赤色）およびＧｌｕｔ－１（シアン色）の色分けされた５プレックスオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの「質量画像」。異なる色は、モノアイソトピックＰＣ－ＭＴ質量レポーター質量スペクトルピークの異なるｍ／ｚ値に関係する。他の構造の中でも、海馬（^＊）および小脳（Ｉ）が観察される。（図７Ｂ）シナプシン（青色）、ＮｅｕＮ（緑色）およびミエリン（赤色）についての小脳のカラー化された免疫蛍光オーバーレイ。免疫蛍光を、隣接する組織切片およびオーバーレイされた画像に対して「シングルプレックス」モードで行った。（図７Ｃ）あまり顕著でないＧｌｕｔ－１バイオマーカーのスタンドアロンＭＡＬＤＩ－ＭＳ質量画像（サブ領域）が示されており（この場合はマゼンタ色）、これは主に脳の毛細血管（断面）を検出する。（図７Ｄ）Ｇｌｕｔ－１の対応する免疫蛍光（この場合は緑色）。（図７Ｅ）５プレックス質量画像（パネルａ内の色分けされた矢印で示されたピクセルから）から選択されたピクセルについて、色分けされたオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルが示されている。スペクトル中の黒色矢印は、ＰＣ－ＭＴ質量レポーターのｍ／ｚピークを示す。ペプチドＰＣ－ＭＴの１Ｄａ分離された天然同位体はＭＡＬＤＩ－ＭＳによって容易に分解されるが、コンパクトなＸ軸スケーリングのために提供されるスペクトルでは見えないことに留意されたい。

【図7B】図７Ａ－７Ｅ。マウス脳ＦＦＰＥ組織切片に対するＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した５プレックスＭＩＨＣ。ＦＦＰＥ組織切片を５つの異なるタンパク質標的に対してＰＣ－ＭＴ－Ａｂで同時に染色し、次いでＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。ＭＳＩについては、マトリックス適用は昇華とそれに続く再結晶（ポジティブイオン反射モードでのＭＳＩ）によるものであった。標準的な免疫蛍光染色も、隣接する組織切片に対して行った。（図７Ａ）シナプシン（青色）、ＭＡＰ－２（オレンジ色）、ＮｅｕＮ（緑色）、ミエリン（赤色）およびＧｌｕｔ－１（シアン色）の色分けされた５プレックスオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの「質量画像」。異なる色は、モノアイソトピックＰＣ－ＭＴ質量レポーター質量スペクトルピークの異なるｍ／ｚ値に関係する。他の構造の中でも、海馬（^＊）および小脳（Ｉ）が観察される。（図７Ｂ）シナプシン（青色）、ＮｅｕＮ（緑色）およびミエリン（赤色）についての小脳のカラー化された免疫蛍光オーバーレイ。免疫蛍光を、隣接する組織切片およびオーバーレイされた画像に対して「シングルプレックス」モードで行った。（図７Ｃ）あまり顕著でないＧｌｕｔ－１バイオマーカーのスタンドアロンＭＡＬＤＩ－ＭＳ質量画像（サブ領域）が示されており（この場合はマゼンタ色）、これは主に脳の毛細血管（断面）を検出する。（図７Ｄ）Ｇｌｕｔ－１の対応する免疫蛍光（この場合は緑色）。（図７Ｅ）５プレックス質量画像（パネルａ内の色分けされた矢印で示されたピクセルから）から選択されたピクセルについて、色分けされたオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルが示されている。スペクトル中の黒色矢印は、ＰＣ－ＭＴ質量レポーターのｍ／ｚピークを示す。ペプチドＰＣ－ＭＴの１Ｄａ分離された天然同位体はＭＡＬＤＩ－ＭＳによって容易に分解されるが、コンパクトなＸ軸スケーリングのために提供されるスペクトルでは見えないことに留意されたい。

【図7C】図７Ａ－７Ｅ。マウス脳ＦＦＰＥ組織切片に対するＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した５プレックスＭＩＨＣ。ＦＦＰＥ組織切片を５つの異なるタンパク質標的に対してＰＣ－ＭＴ－Ａｂで同時に染色し、次いでＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。ＭＳＩについては、マトリックス適用は昇華とそれに続く再結晶（ポジティブイオン反射モードでのＭＳＩ）によるものであった。標準的な免疫蛍光染色も、隣接する組織切片に対して行った。（図７Ａ）シナプシン（青色）、ＭＡＰ－２（オレンジ色）、ＮｅｕＮ（緑色）、ミエリン（赤色）およびＧｌｕｔ－１（シアン色）の色分けされた５プレックスオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの「質量画像」。異なる色は、モノアイソトピックＰＣ－ＭＴ質量レポーター質量スペクトルピークの異なるｍ／ｚ値に関係する。他の構造の中でも、海馬（^＊）および小脳（Ｉ）が観察される。（図７Ｂ）シナプシン（青色）、ＮｅｕＮ（緑色）およびミエリン（赤色）についての小脳のカラー化された免疫蛍光オーバーレイ。免疫蛍光を、隣接する組織切片およびオーバーレイされた画像に対して「シングルプレックス」モードで行った。（図７Ｃ）あまり顕著でないＧｌｕｔ－１バイオマーカーのスタンドアロンＭＡＬＤＩ－ＭＳ質量画像（サブ領域）が示されており（この場合はマゼンタ色）、これは主に脳の毛細血管（断面）を検出する。（図７Ｄ）Ｇｌｕｔ－１の対応する免疫蛍光（この場合は緑色）。（図７Ｅ）５プレックス質量画像（パネルａ内の色分けされた矢印で示されたピクセルから）から選択されたピクセルについて、色分けされたオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルが示されている。スペクトル中の黒色矢印は、ＰＣ－ＭＴ質量レポーターのｍ／ｚピークを示す。ペプチドＰＣ－ＭＴの１Ｄａ分離された天然同位体はＭＡＬＤＩ－ＭＳによって容易に分解されるが、コンパクトなＸ軸スケーリングのために提供されるスペクトルでは見えないことに留意されたい。

【図7D】図７Ａ－７Ｅ。マウス脳ＦＦＰＥ組織切片に対するＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した５プレックスＭＩＨＣ。ＦＦＰＥ組織切片を５つの異なるタンパク質標的に対してＰＣ－ＭＴ－Ａｂで同時に染色し、次いでＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。ＭＳＩについては、マトリックス適用は昇華とそれに続く再結晶（ポジティブイオン反射モードでのＭＳＩ）によるものであった。標準的な免疫蛍光染色も、隣接する組織切片に対して行った。（図７Ａ）シナプシン（青色）、ＭＡＰ－２（オレンジ色）、ＮｅｕＮ（緑色）、ミエリン（赤色）およびＧｌｕｔ－１（シアン色）の色分けされた５プレックスオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの「質量画像」。異なる色は、モノアイソトピックＰＣ－ＭＴ質量レポーター質量スペクトルピークの異なるｍ／ｚ値に関係する。他の構造の中でも、海馬（^＊）および小脳（Ｉ）が観察される。（図７Ｂ）シナプシン（青色）、ＮｅｕＮ（緑色）およびミエリン（赤色）についての小脳のカラー化された免疫蛍光オーバーレイ。免疫蛍光を、隣接する組織切片およびオーバーレイされた画像に対して「シングルプレックス」モードで行った。（図７Ｃ）あまり顕著でないＧｌｕｔ－１バイオマーカーのスタンドアロンＭＡＬＤＩ－ＭＳ質量画像（サブ領域）が示されており（この場合はマゼンタ色）、これは主に脳の毛細血管（断面）を検出する。（図７Ｄ）Ｇｌｕｔ－１の対応する免疫蛍光（この場合は緑色）。（図７Ｅ）５プレックス質量画像（パネルａ内の色分けされた矢印で示されたピクセルから）から選択されたピクセルについて、色分けされたオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルが示されている。スペクトル中の黒色矢印は、ＰＣ－ＭＴ質量レポーターのｍ／ｚピークを示す。ペプチドＰＣ－ＭＴの１Ｄａ分離された天然同位体はＭＡＬＤＩ－ＭＳによって容易に分解されるが、コンパクトなＸ軸スケーリングのために提供されるスペクトルでは見えないことに留意されたい。

【図7E】図７Ａ－７Ｅ。マウス脳ＦＦＰＥ組織切片に対するＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した５プレックスＭＩＨＣ。ＦＦＰＥ組織切片を５つの異なるタンパク質標的に対してＰＣ－ＭＴ－Ａｂで同時に染色し、次いでＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。ＭＳＩについては、マトリックス適用は昇華とそれに続く再結晶（ポジティブイオン反射モードでのＭＳＩ）によるものであった。標準的な免疫蛍光染色も、隣接する組織切片に対して行った。（図７Ａ）シナプシン（青色）、ＭＡＰ－２（オレンジ色）、ＮｅｕＮ（緑色）、ミエリン（赤色）およびＧｌｕｔ－１（シアン色）の色分けされた５プレックスオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの「質量画像」。異なる色は、モノアイソトピックＰＣ－ＭＴ質量レポーター質量スペクトルピークの異なるｍ／ｚ値に関係する。他の構造の中でも、海馬（^＊）および小脳（Ｉ）が観察される。（図７Ｂ）シナプシン（青色）、ＮｅｕＮ（緑色）およびミエリン（赤色）についての小脳のカラー化された免疫蛍光オーバーレイ。免疫蛍光を、隣接する組織切片およびオーバーレイされた画像に対して「シングルプレックス」モードで行った。（図７Ｃ）あまり顕著でないＧｌｕｔ－１バイオマーカーのスタンドアロンＭＡＬＤＩ－ＭＳ質量画像（サブ領域）が示されており（この場合はマゼンタ色）、これは主に脳の毛細血管（断面）を検出する。（図７Ｄ）Ｇｌｕｔ－１の対応する免疫蛍光（この場合は緑色）。（図７Ｅ）５プレックス質量画像（パネルａ内の色分けされた矢印で示されたピクセルから）から選択されたピクセルについて、色分けされたオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルが示されている。スペクトル中の黒色矢印は、ＰＣ－ＭＴ質量レポーターのｍ／ｚピークを示す。ペプチドＰＣ－ＭＴの１Ｄａ分離された天然同位体はＭＡＬＤＩ－ＭＳによって容易に分解されるが、コンパクトなＸ軸スケーリングのために提供されるスペクトルでは見えないことに留意されたい。

【0038】

【図8】オリゴヌクレオチドプローブに直接コンジュゲートされたＰＣ－ＭＴを使用したＭＩＳＨ。Ｕ６ ｓｎＲＮＡプローブ（陽性対照）および植物特異的ｍｉＲ－１５９プローブ（陰性対照）を使用して、マウス脳の矢状方向の組織切片に対するインサイツハイブリダイゼーションを行った。従来の「ＦＩＳＨ」を「ＭＩＳＨ」と比較するために、蛍光画像（赤色）ならびにモノアイソトピックＰＣ－ＭＴ質量レポーター質量スペクトルピーク（緑色）のｍ／ｚ値に対応する質量画像を示す。黄色矢印は、Ｕ６で検出された小脳および海馬の特徴を強調している。

【0039】

【図9A】図９Ａ－９Ｄ。同じ組織切片上の非標的化小分子ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩおよび標的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂベースの高分子ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ。（図９Ａ）未固定の新鮮凍結マウス脳の矢状方向の組織切片に対する直接的な非標的化ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを最初に行った。３つの周知の脂質種（スルファチド、ｍ／ｚ ８８８．７；ホスファチジルイノシトール、ｍ／ｚ ８８５．４；およびホスファチジルエタノールアミン、ｍ／ｚ ７９０．５）をカラー化されたＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像に示す（それぞれ赤色、緑色および青色）。（図９Ｂ～図９Ｃ）次いで、同じ組織切片を２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩのために処理した。そうするために、マトリックスを洗い流し、組織を固定し、ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した高分子抗原の標的化マルチプレックスＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行った。実証目的のために、１回目および２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩから選択された生体分子の画像をオーバーレイした。（図９Ｂ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からのスルファチド（赤色）に、第２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（マルチプレックスＭＩＨＣ）からのＮｅｕＮ（緑色）の画像をオーバーレイする。（図９Ｃ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からのスルファチド（赤色）に、第２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（マルチプレックスＭＩＨＣ）からのミエリン塩基性タンパク質（緑色）の画像をオーバーレイする。（図９Ｄ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からの例示的なオーバーレイスペクトルが示されており、図９Ａの画像と一致するように色分けされている（３つの脂質塊が示されている）。図９Ａの色分けされた矢印は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルが導出された領域を示す。

【図9B】図９Ａ－９Ｄ。同じ組織切片上の非標的化小分子ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩおよび標的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂベースの高分子ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ。（図９Ａ）未固定の新鮮凍結マウス脳の矢状方向の組織切片に対する直接的な非標的化ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを最初に行った。３つの周知の脂質種（スルファチド、ｍ／ｚ ８８８．７；ホスファチジルイノシトール、ｍ／ｚ ８８５．４；およびホスファチジルエタノールアミン、ｍ／ｚ ７９０．５）をカラー化されたＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像に示す（それぞれ赤色、緑色および青色）。（図９Ｂ～図９Ｃ）次いで、同じ組織切片を２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩのために処理した。そうするために、マトリックスを洗い流し、組織を固定し、ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した高分子抗原の標的化マルチプレックスＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行った。実証目的のために、１回目および２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩから選択された生体分子の画像をオーバーレイした。（図９Ｂ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からのスルファチド（赤色）に、第２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（マルチプレックスＭＩＨＣ）からのＮｅｕＮ（緑色）の画像をオーバーレイする。（図９Ｃ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からのスルファチド（赤色）に、第２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（マルチプレックスＭＩＨＣ）からのミエリン塩基性タンパク質（緑色）の画像をオーバーレイする。（図９Ｄ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からの例示的なオーバーレイスペクトルが示されており、図９Ａの画像と一致するように色分けされている（３つの脂質塊が示されている）。図９Ａの色分けされた矢印は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルが導出された領域を示す。

【図9C】図９Ａ－９Ｄ。同じ組織切片上の非標的化小分子ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩおよび標的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂベースの高分子ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ。（図９Ａ）未固定の新鮮凍結マウス脳の矢状方向の組織切片に対する直接的な非標的化ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを最初に行った。３つの周知の脂質種（スルファチド、ｍ／ｚ ８８８．７；ホスファチジルイノシトール、ｍ／ｚ ８８５．４；およびホスファチジルエタノールアミン、ｍ／ｚ ７９０．５）をカラー化されたＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像に示す（それぞれ赤色、緑色および青色）。（図９Ｂ～図９Ｃ）次いで、同じ組織切片を２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩのために処理した。そうするために、マトリックスを洗い流し、組織を固定し、ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した高分子抗原の標的化マルチプレックスＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行った。実証目的のために、１回目および２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩから選択された生体分子の画像をオーバーレイした。（図９Ｂ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からのスルファチド（赤色）に、第２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（マルチプレックスＭＩＨＣ）からのＮｅｕＮ（緑色）の画像をオーバーレイする。（図９Ｃ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からのスルファチド（赤色）に、第２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（マルチプレックスＭＩＨＣ）からのミエリン塩基性タンパク質（緑色）の画像をオーバーレイする。（図９Ｄ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からの例示的なオーバーレイスペクトルが示されており、図９Ａの画像と一致するように色分けされている（３つの脂質塊が示されている）。図９Ａの色分けされた矢印は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルが導出された領域を示す。

【図9D】図９Ａ－９Ｄ。同じ組織切片上の非標的化小分子ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩおよび標的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂベースの高分子ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ。（図９Ａ）未固定の新鮮凍結マウス脳の矢状方向の組織切片に対する直接的な非標的化ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを最初に行った。３つの周知の脂質種（スルファチド、ｍ／ｚ ８８８．７；ホスファチジルイノシトール、ｍ／ｚ ８８５．４；およびホスファチジルエタノールアミン、ｍ／ｚ ７９０．５）をカラー化されたＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像に示す（それぞれ赤色、緑色および青色）。（図９Ｂ～図９Ｃ）次いで、同じ組織切片を２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩのために処理した。そうするために、マトリックスを洗い流し、組織を固定し、ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した高分子抗原の標的化マルチプレックスＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行った。実証目的のために、１回目および２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩから選択された生体分子の画像をオーバーレイした。（図９Ｂ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からのスルファチド（赤色）に、第２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（マルチプレックスＭＩＨＣ）からのＮｅｕＮ（緑色）の画像をオーバーレイする。（図９Ｃ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からのスルファチド（赤色）に、第２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（マルチプレックスＭＩＨＣ）からのミエリン塩基性タンパク質（緑色）の画像をオーバーレイする。（図９Ｄ）１回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（直接的小分子検出）からの例示的なオーバーレイスペクトルが示されており、図９Ａの画像と一致するように色分けされている（３つの脂質塊が示されている）。図９Ａの色分けされた矢印は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルが導出された領域を示す。

【0040】

【図10A】図１０Ａ－１０Ｂ。ＰＣ－核への質量ユニット好ましい結合部位。（図１０Ａ）最終的にＰＣ－核のフェニル環への質量ユニットの結合の２つの構成が示されている（この場合には光切断後に示される－光切断前の構成１の例については図３の工程２を参照のこと）。この実施例では、光切断可能なペプチドを使用し、示されるように最終的に表面に結合した（最終的に組織の表面に結合したＰＣ－ＭＴプローブに類似）。好ましい構成１では、ＰＣ－核の光切断されたフェニル環（^＊で示される）は、質量分析（ＭＳ）によって測定される光切断された質量レポーターに結合したままではないが、構成２では結合している。（図１０Ｂ）２つの構成についての表面からの光切断後の質量レポーターの得られたオーバーレイ質量スペクトル。質量レポーターの予想されるモノアイソトピックピークを、両方の構成についてそれぞれのｍ／ｚ値で標識する。

【図10B】図１０Ａ－１０Ｂ。ＰＣ－核への質量ユニット好ましい結合部位。（図１０Ａ）最終的にＰＣ－核のフェニル環への質量ユニットの結合の２つの構成が示されている（この場合には光切断後に示される－光切断前の構成１の例については図３の工程２を参照のこと）。この実施例では、光切断可能なペプチドを使用し、示されるように最終的に表面に結合した（最終的に組織の表面に結合したＰＣ－ＭＴプローブに類似）。好ましい構成１では、ＰＣ－核の光切断されたフェニル環（^＊で示される）は、質量分析（ＭＳ）によって測定される光切断された質量レポーターに結合したままではないが、構成２では結合している。（図１０Ｂ）２つの構成についての表面からの光切断後の質量レポーターの得られたオーバーレイ質量スペクトル。質量レポーターの予想されるモノアイソトピックピークを、両方の構成についてそれぞれのｍ／ｚ値で標識する。

【0041】

【図11A】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11B】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11C】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11D】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11E】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11F】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11G】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11H】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11I】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11J】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11K】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【図11L】図１１Ａ－１１Ｌ。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。（図１１Ａ）ビーズアレイの例示的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像であり、ビーズは両方とも質量ユニット１からなるＰＣ－ＭＴ（赤色）およびＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）で二重標識されていた（しかし、質量レポーターは、ＰＣ－ＭＴのみが質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残すため、４３ｍ／ｚの差によって区別可能である）。（図１１Ｂ～図１１Ｉ）４つの異なるビーズ種を作製し、それぞれ同じ質量ユニット（表１の質量ユニット１～４）を有するＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。これらのビーズ種のそれぞれから４つの別個のビーズアレイを形成し（ビーズ種ごとに１つのビーズアレイ）、各ビーズアレイを光切断のために５分間、事前ＵＶ照射に供した。別の４つのビーズアレイを形成し、２５分間、事前ＵＶ照射に供した。次いで、合計８つの別個のビーズアレイをＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。代表的なスペクトルは、各々のビーズアレイのビーズから単一のピクセルで示されている（８つのスペクトルの各々は、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方からの質量レポーターに対応するピークを含む）。（図１１Ｊ）抗ミエリン抗体プローブを、両方とも質量ユニット１から構成されるＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌで二重標識した。プローブを使用してマウス脳組織切片を免疫染色し、続いてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。組織の色分けされた質量画像が示されている。ＰＣ－ＭＴは赤色、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶ条件を試験し、事前ＵＶをマトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析の前に実施した。０分の事前ＵＶの場合、光切断は、装置のレーザービームによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析中にのみ起こり得る。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１Ｋおよび図１１Ｌに示す。

【0042】

【図12】質量分析に基づく免疫組織化学のための蛍光ＰＣ－ＭＴ。「蛍光」パネルは、それぞれ蛍光抗ＮｅｕＮ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１、非蛍光抗ＮｅｕＮ ＰＣ－ＭＴ７および陰性対照蛍光抗Ｃａｓ９ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１でプローブした３つの矢状方向のマウス脳組織切片の蛍光画像（黄色）を示す。「ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ」パネルは、同じプローブされた組織切片のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像を示す（Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１からの質量レポーターについては赤色、ＰＣ－ＭＴ７からの質量レポーターについては緑色）。青色矢印は海馬を示し、白色矢印は小脳を示す。挿入スペクトルは、海馬内の代表的な単一ピクセルからのものであり、対応する質量レポーターピークは、検出された場合、黒色矢印で示される。

【0043】

【図13A】図１３Ａ－１３Ｅ。組換え抗体対従来の抗体。３７μｍストレプトアビジンＰＭＭＡビーズをＰＣ－ＭＴに直接コンジュゲートし（ビーズＩＤ－タグ）、次いでビオチン化プロテインＧを負荷し、引き続いて特異的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂに結合させた（各ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ種を特異的ビーズ種に別々に負荷した）。（図１３Ａ）ビーズプール１のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＭＢＰ１、抗ＭＢＰ１および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｂ）（図１３Ａ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ａ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｃ）ビーズプール２のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＮｅｕＮ７、抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｄ）（図１３Ｃ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ｃ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｅ）別個に、マウス脳の矢状方向の組織切片を抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＮｅｕＮ７で染色し、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。抗体由来のＰＣ－ＭＴ７は、画像中で緑色にカラー化されている。白色矢印は小脳を示し、青色矢印は海馬を示し、黄色矢印は斑点のある核染色パターンを示す。両方の画像の海馬の最も強いピクセルから選択された、提供されたスペクトルでは、赤色のトレースは「組換え」の組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示し、青色のトレースは「通常」非組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示す。

【図13B】図１３Ａ－１３Ｅ。組換え抗体対従来の抗体。３７μｍストレプトアビジンＰＭＭＡビーズをＰＣ－ＭＴに直接コンジュゲートし（ビーズＩＤ－タグ）、次いでビオチン化プロテインＧを負荷し、引き続いて特異的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂに結合させた（各ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ種を特異的ビーズ種に別々に負荷した）。（図１３Ａ）ビーズプール１のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＭＢＰ１、抗ＭＢＰ１および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｂ）（図１３Ａ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ａ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｃ）ビーズプール２のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＮｅｕＮ７、抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｄ）（図１３Ｃ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ｃ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｅ）別個に、マウス脳の矢状方向の組織切片を抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＮｅｕＮ７で染色し、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。抗体由来のＰＣ－ＭＴ７は、画像中で緑色にカラー化されている。白色矢印は小脳を示し、青色矢印は海馬を示し、黄色矢印は斑点のある核染色パターンを示す。両方の画像の海馬の最も強いピクセルから選択された、提供されたスペクトルでは、赤色のトレースは「組換え」の組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示し、青色のトレースは「通常」非組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示す。

【図13C】図１３Ａ－１３Ｅ。組換え抗体対従来の抗体。３７μｍストレプトアビジンＰＭＭＡビーズをＰＣ－ＭＴに直接コンジュゲートし（ビーズＩＤ－タグ）、次いでビオチン化プロテインＧを負荷し、引き続いて特異的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂに結合させた（各ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ種を特異的ビーズ種に別々に負荷した）。（図１３Ａ）ビーズプール１のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＭＢＰ１、抗ＭＢＰ１および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｂ）（図１３Ａ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ａ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｃ）ビーズプール２のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＮｅｕＮ７、抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｄ）（図１３Ｃ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ｃ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｅ）別個に、マウス脳の矢状方向の組織切片を抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＮｅｕＮ７で染色し、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。抗体由来のＰＣ－ＭＴ７は、画像中で緑色にカラー化されている。白色矢印は小脳を示し、青色矢印は海馬を示し、黄色矢印は斑点のある核染色パターンを示す。両方の画像の海馬の最も強いピクセルから選択された、提供されたスペクトルでは、赤色のトレースは「組換え」の組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示し、青色のトレースは「通常」非組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示す。

【図13D】図１３Ａ－１３Ｅ。組換え抗体対従来の抗体。３７μｍストレプトアビジンＰＭＭＡビーズをＰＣ－ＭＴに直接コンジュゲートし（ビーズＩＤ－タグ）、次いでビオチン化プロテインＧを負荷し、引き続いて特異的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂに結合させた（各ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ種を特異的ビーズ種に別々に負荷した）。（図１３Ａ）ビーズプール１のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＭＢＰ１、抗ＭＢＰ１および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｂ）（図１３Ａ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ａ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｃ）ビーズプール２のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＮｅｕＮ７、抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｄ）（図１３Ｃ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ｃ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｅ）別個に、マウス脳の矢状方向の組織切片を抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＮｅｕＮ７で染色し、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。抗体由来のＰＣ－ＭＴ７は、画像中で緑色にカラー化されている。白色矢印は小脳を示し、青色矢印は海馬を示し、黄色矢印は斑点のある核染色パターンを示す。両方の画像の海馬の最も強いピクセルから選択された、提供されたスペクトルでは、赤色のトレースは「組換え」の組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示し、青色のトレースは「通常」非組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示す。

【図13E】図１３Ａ－１３Ｅ。組換え抗体対従来の抗体。３７μｍストレプトアビジンＰＭＭＡビーズをＰＣ－ＭＴに直接コンジュゲートし（ビーズＩＤ－タグ）、次いでビオチン化プロテインＧを負荷し、引き続いて特異的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂに結合させた（各ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ種を特異的ビーズ種に別々に負荷した）。（図１３Ａ）ビーズプール１のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＭＢＰ１、抗ＭＢＰ１および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｂ）（図１３Ａ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ａ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｃ）ビーズプール２のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像。様々なＰＣ－ＭＴの質量スペクトルピーク強度は、画像の上に示されるようにカラー化される。ビーズＩＤ－タグ９、１０および１５を有するビーズに、それぞれ組換え抗ＮｅｕＮ７、抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＡＢ２（数字は、特定のＰＣ－ＭＴにおける表１からの質量ユニットを示すことに留意）を負荷した。（図１３Ｄ）（図１３Ｃ）において丸で囲んだ３つのビーズ内の３つの単一ピクセルから得た３つのオーバーレイスペクトル。スペクトルは、（図１３Ｃ）で観察されたビーズの色に従って色分けされている。（図１３Ｅ）別個に、マウス脳の矢状方向の組織切片を抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＮｅｕＮ７で染色し、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供した。抗体由来のＰＣ－ＭＴ７は、画像中で緑色にカラー化されている。白色矢印は小脳を示し、青色矢印は海馬を示し、黄色矢印は斑点のある核染色パターンを示す。両方の画像の海馬の最も強いピクセルから選択された、提供されたスペクトルでは、赤色のトレースは「組換え」の組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示し、青色のトレースは「通常」非組換え抗ＮｅｕＮ７抗体プローブからのＰＣ－ＭＴ７を示す。

【0044】

【図14A】図１４Ａ－１４Ｄ。ヒト扁桃ＦＦＰＥ組織切片中の１２個のバイオマーカーに対するマルチプレックス質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）。１２個の異なるバイオマーカーを使用したことを除いて、図７と同様にＭＩＨＣを実施した（各抗体のＰＣ－ＭＴ割り当てについては表１を参照）。さらに、汎サイトケラチン抗体（ＣＫ）をＰＣ－ＭＴおよびフルオロフォアの両方で標識した。（図１４Ａ）ＧｅｎｅＰｉｘ ４２００Ａ蛍光マイクロアレイスキャナを使用して５ミクロン解像度で撮影した扁桃組織切片全体のＣＫ免疫蛍光画像。（図１４Ｂ）ＣＫ抗体由来のＰＣ－ＭＴについてのモノアイソトピックｍ／ｚ値の強度マップを示す同じ組織切片のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（すべてのＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像が１０ミクロンの空間分解能である）。（図１４Ｃ）示差的構造パターンを示す、組織切片全体から選択されたバイオマーカーのマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ。色分けは、画像の下のキーに示されている。（図１４Ｄ）組織切片の代表的な小領域についてのグラデーションカラーとして示される１２個すべてのバイオマーカーの個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（標識によって示されるバイオマーカー同一性）。ＰＣ－ＭＴを有するアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＣＤ３と同じＰＣ－ＭＴ）で染色された隣接組織切片である「ブランク」も示されている。グラデーションカラースケールは下部に示されている。比較のために、すべてのバイオマーカーの表示スケールは、２５の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２．５の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ５０および５に設定されたＣＫ、ＣＤ２０およびＫｉ６７を除く。

【図14B】図１４Ａ－１４Ｄ。ヒト扁桃ＦＦＰＥ組織切片中の１２個のバイオマーカーに対するマルチプレックス質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）。１２個の異なるバイオマーカーを使用したことを除いて、図７と同様にＭＩＨＣを実施した（各抗体のＰＣ－ＭＴ割り当てについては表１を参照）。さらに、汎サイトケラチン抗体（ＣＫ）をＰＣ－ＭＴおよびフルオロフォアの両方で標識した。（図１４Ａ）ＧｅｎｅＰｉｘ ４２００Ａ蛍光マイクロアレイスキャナを使用して５ミクロン解像度で撮影した扁桃組織切片全体のＣＫ免疫蛍光画像。（図１４Ｂ）ＣＫ抗体由来のＰＣ－ＭＴについてのモノアイソトピックｍ／ｚ値の強度マップを示す同じ組織切片のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（すべてのＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像が１０ミクロンの空間分解能である）。（図１４Ｃ）示差的構造パターンを示す、組織切片全体から選択されたバイオマーカーのマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ。色分けは、画像の下のキーに示されている。（図１４Ｄ）組織切片の代表的な小領域についてのグラデーションカラーとして示される１２個すべてのバイオマーカーの個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（標識によって示されるバイオマーカー同一性）。ＰＣ－ＭＴを有するアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＣＤ３と同じＰＣ－ＭＴ）で染色された隣接組織切片である「ブランク」も示されている。グラデーションカラースケールは下部に示されている。比較のために、すべてのバイオマーカーの表示スケールは、２５の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２．５の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ５０および５に設定されたＣＫ、ＣＤ２０およびＫｉ６７を除く。

【図14C】図１４Ａ－１４Ｄ。ヒト扁桃ＦＦＰＥ組織切片中の１２個のバイオマーカーに対するマルチプレックス質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）。１２個の異なるバイオマーカーを使用したことを除いて、図７と同様にＭＩＨＣを実施した（各抗体のＰＣ－ＭＴ割り当てについては表１を参照）。さらに、汎サイトケラチン抗体（ＣＫ）をＰＣ－ＭＴおよびフルオロフォアの両方で標識した。（図１４Ａ）ＧｅｎｅＰｉｘ ４２００Ａ蛍光マイクロアレイスキャナを使用して５ミクロン解像度で撮影した扁桃組織切片全体のＣＫ免疫蛍光画像。（図１４Ｂ）ＣＫ抗体由来のＰＣ－ＭＴについてのモノアイソトピックｍ／ｚ値の強度マップを示す同じ組織切片のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（すべてのＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像が１０ミクロンの空間分解能である）。（図１４Ｃ）示差的構造パターンを示す、組織切片全体から選択されたバイオマーカーのマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ。色分けは、画像の下のキーに示されている。（図１４Ｄ）組織切片の代表的な小領域についてのグラデーションカラーとして示される１２個すべてのバイオマーカーの個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（標識によって示されるバイオマーカー同一性）。ＰＣ－ＭＴを有するアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＣＤ３と同じＰＣ－ＭＴ）で染色された隣接組織切片である「ブランク」も示されている。グラデーションカラースケールは下部に示されている。比較のために、すべてのバイオマーカーの表示スケールは、２５の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２．５の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ５０および５に設定されたＣＫ、ＣＤ２０およびＫｉ６７を除く。

【図14D】図１４Ａ－１４Ｄ。ヒト扁桃ＦＦＰＥ組織切片中の１２個のバイオマーカーに対するマルチプレックス質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）。１２個の異なるバイオマーカーを使用したことを除いて、図７と同様にＭＩＨＣを実施した（各抗体のＰＣ－ＭＴ割り当てについては表１を参照）。さらに、汎サイトケラチン抗体（ＣＫ）をＰＣ－ＭＴおよびフルオロフォアの両方で標識した。（図１４Ａ）ＧｅｎｅＰｉｘ ４２００Ａ蛍光マイクロアレイスキャナを使用して５ミクロン解像度で撮影した扁桃組織切片全体のＣＫ免疫蛍光画像。（図１４Ｂ）ＣＫ抗体由来のＰＣ－ＭＴについてのモノアイソトピックｍ／ｚ値の強度マップを示す同じ組織切片のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（すべてのＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像が１０ミクロンの空間分解能である）。（図１４Ｃ）示差的構造パターンを示す、組織切片全体から選択されたバイオマーカーのマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ。色分けは、画像の下のキーに示されている。（図１４Ｄ）組織切片の代表的な小領域についてのグラデーションカラーとして示される１２個すべてのバイオマーカーの個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（標識によって示されるバイオマーカー同一性）。ＰＣ－ＭＴを有するアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＣＤ３と同じＰＣ－ＭＴ）で染色された隣接組織切片である「ブランク」も示されている。グラデーションカラースケールは下部に示されている。比較のために、すべてのバイオマーカーの表示スケールは、２５の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２．５の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ５０および５に設定されたＣＫ、ＣＤ２０およびＫｉ６７を除く。

【0045】

【図15A】図１５Ａ－１５Ｄ。ヒト乳癌ＦＦＰＥ組織切片中の１２個のバイオマーカーに対するマルチプレックス質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）。ＭＩＨＣを図１４のように行った（各抗体についてのＰＣ－ＭＴ割り当てについては表１を参照）。（図１５Ａ）示差的構造パターンを示す選択された抗体由来のＰＣ－ＭＴについてのモノアイソトピックｍ／ｚ値の強度マップを示す乳癌組織切片のマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ（すべてのＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像は１０ミクロンの空間分解能である）。画像上のキーには色分けが示されている。生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告によるこの生体試料の臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌（乳管）、ｐＴｌｃｐＮ３ａｐＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＣ、７５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ－／ＥＲ－／ＨＥＲ２＋。（図１５Ｂ）組織切片全体についてのグラデーションカラーとして示される１２個すべてのバイオマーカーの個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（標識によって示されるバイオマーカー同一性）。ＰＣ－ＭＴを有するアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＣＤ３と同じＰＣ－ＭＴ）で染色された隣接組織切片である「ブランク」も示されている。グラデーションカラースケールも示されている。比較のために、すべてのバイオマーカーの表示スケールは、２０の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ５０および５に設定されたＣＫ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６８およびＫｉ６７を除く。（図１５Ｃ）同じ乳癌組織切片のマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ、この場合は簡単にするために、ＣＫ、ＨＥＲ２およびＥＲ（画像上の色分け）のみを示し、これら３つの重要なバイオマーカーの相対分布の視覚的識別を可能にする。（図１５Ｄ）異なる乳癌組織切片上の選択されたバイオマーカーのマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ（上部パネル、下画像の色分け）および個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（勾配スケール、底部パネル）。この場合、生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告によるこの生体試料の臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌、乳管、小葉、転移性、Ｔ２Ｎ２ａＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＡ、９５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ＋／ＥＲ＋／ＨＥＲ２－（すなわち、ＰＲ／ＥＲ／ＨＥＲ２プロファイルは、以前の組織の逆数である）。比較のために、グラデーションカラー画像の表示スケールは、２０の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ１００および１０に設定されたＣＫを除く。

【図15B】図１５Ａ－１５Ｄ。ヒト乳癌ＦＦＰＥ組織切片中の１２個のバイオマーカーに対するマルチプレックス質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）。ＭＩＨＣを図１４のように行った（各抗体についてのＰＣ－ＭＴ割り当てについては表１を参照）。（図１５Ａ）示差的構造パターンを示す選択された抗体由来のＰＣ－ＭＴについてのモノアイソトピックｍ／ｚ値の強度マップを示す乳癌組織切片のマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ（すべてのＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像は１０ミクロンの空間分解能である）。画像上のキーには色分けが示されている。生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告によるこの生体試料の臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌（乳管）、ｐＴｌｃｐＮ３ａｐＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＣ、７５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ－／ＥＲ－／ＨＥＲ２＋。（図１５Ｂ）組織切片全体についてのグラデーションカラーとして示される１２個すべてのバイオマーカーの個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（標識によって示されるバイオマーカー同一性）。ＰＣ－ＭＴを有するアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＣＤ３と同じＰＣ－ＭＴ）で染色された隣接組織切片である「ブランク」も示されている。グラデーションカラースケールも示されている。比較のために、すべてのバイオマーカーの表示スケールは、２０の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ５０および５に設定されたＣＫ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６８およびＫｉ６７を除く。（図１５Ｃ）同じ乳癌組織切片のマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ、この場合は簡単にするために、ＣＫ、ＨＥＲ２およびＥＲ（画像上の色分け）のみを示し、これら３つの重要なバイオマーカーの相対分布の視覚的識別を可能にする。（図１５Ｄ）異なる乳癌組織切片上の選択されたバイオマーカーのマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ（上部パネル、下画像の色分け）および個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（勾配スケール、底部パネル）。この場合、生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告によるこの生体試料の臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌、乳管、小葉、転移性、Ｔ２Ｎ２ａＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＡ、９５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ＋／ＥＲ＋／ＨＥＲ２－（すなわち、ＰＲ／ＥＲ／ＨＥＲ２プロファイルは、以前の組織の逆数である）。比較のために、グラデーションカラー画像の表示スケールは、２０の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ１００および１０に設定されたＣＫを除く。

【図15C】図１５Ａ－１５Ｄ。ヒト乳癌ＦＦＰＥ組織切片中の１２個のバイオマーカーに対するマルチプレックス質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）。ＭＩＨＣを図１４のように行った（各抗体についてのＰＣ－ＭＴ割り当てについては表１を参照）。（図１５Ａ）示差的構造パターンを示す選択された抗体由来のＰＣ－ＭＴについてのモノアイソトピックｍ／ｚ値の強度マップを示す乳癌組織切片のマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ（すべてのＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像は１０ミクロンの空間分解能である）。画像上のキーには色分けが示されている。生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告によるこの生体試料の臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌（乳管）、ｐＴｌｃｐＮ３ａｐＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＣ、７５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ－／ＥＲ－／ＨＥＲ２＋。（図１５Ｂ）組織切片全体についてのグラデーションカラーとして示される１２個すべてのバイオマーカーの個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（標識によって示されるバイオマーカー同一性）。ＰＣ－ＭＴを有するアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＣＤ３と同じＰＣ－ＭＴ）で染色された隣接組織切片である「ブランク」も示されている。グラデーションカラースケールも示されている。比較のために、すべてのバイオマーカーの表示スケールは、２０の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ５０および５に設定されたＣＫ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６８およびＫｉ６７を除く。（図１５Ｃ）同じ乳癌組織切片のマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ、この場合は簡単にするために、ＣＫ、ＨＥＲ２およびＥＲ（画像上の色分け）のみを示し、これら３つの重要なバイオマーカーの相対分布の視覚的識別を可能にする。（図１５Ｄ）異なる乳癌組織切片上の選択されたバイオマーカーのマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ（上部パネル、下画像の色分け）および個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（勾配スケール、底部パネル）。この場合、生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告によるこの生体試料の臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌、乳管、小葉、転移性、Ｔ２Ｎ２ａＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＡ、９５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ＋／ＥＲ＋／ＨＥＲ２－（すなわち、ＰＲ／ＥＲ／ＨＥＲ２プロファイルは、以前の組織の逆数である）。比較のために、グラデーションカラー画像の表示スケールは、２０の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ１００および１０に設定されたＣＫを除く。

【図15D】図１５Ａ－１５Ｄ。ヒト乳癌ＦＦＰＥ組織切片中の１２個のバイオマーカーに対するマルチプレックス質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）。ＭＩＨＣを図１４のように行った（各抗体についてのＰＣ－ＭＴ割り当てについては表１を参照）。（図１５Ａ）示差的構造パターンを示す選択された抗体由来のＰＣ－ＭＴについてのモノアイソトピックｍ／ｚ値の強度マップを示す乳癌組織切片のマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ（すべてのＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像は１０ミクロンの空間分解能である）。画像上のキーには色分けが示されている。生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告によるこの生体試料の臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌（乳管）、ｐＴｌｃｐＮ３ａｐＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＣ、７５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ－／ＥＲ－／ＨＥＲ２＋。（図１５Ｂ）組織切片全体についてのグラデーションカラーとして示される１２個すべてのバイオマーカーの個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（標識によって示されるバイオマーカー同一性）。ＰＣ－ＭＴを有するアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＣＤ３と同じＰＣ－ＭＴ）で染色された隣接組織切片である「ブランク」も示されている。グラデーションカラースケールも示されている。比較のために、すべてのバイオマーカーの表示スケールは、２０の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ５０および５に設定されたＣＫ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６８およびＫｉ６７を除く。（図１５Ｃ）同じ乳癌組織切片のマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ、この場合は簡単にするために、ＣＫ、ＨＥＲ２およびＥＲ（画像上の色分け）のみを示し、これら３つの重要なバイオマーカーの相対分布の視覚的識別を可能にする。（図１５Ｄ）異なる乳癌組織切片上の選択されたバイオマーカーのマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイ（上部パネル、下画像の色分け）および個々のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像（勾配スケール、底部パネル）。この場合、生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告によるこの生体試料の臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌、乳管、小葉、転移性、Ｔ２Ｎ２ａＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＡ、９５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ＋／ＥＲ＋／ＨＥＲ２－（すなわち、ＰＲ／ＥＲ／ＨＥＲ２プロファイルは、以前の組織の逆数である）。比較のために、グラデーションカラー画像の表示スケールは、２０の完全強度閾値（任意のピーク強度単位）および２の最小表示強度に設定されるが、例外的に強いシグナルを生成し、したがってそれぞれ１００および１０に設定されたＣＫを除く。

【0046】

【図16】本発明のプロトコル（ＭＩＨＣおよびＭＩＳＨ）の共通要素と、従来のＩＨＣ（例えば、［ＫａｔｉｋｉｒｅｄｄｙおよびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７８４：１５５－６７］）および従来のＩＳＨ（例えば、［Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｃｅｋａｎら（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２１１：１７１－８７］）、ならびに従来の直接的なＭＳＩ（例えば、［Ｃａｐｒｉｏｌｉ，Ｆａｒｍｅｒら（１９９７）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６９：４７５１－６０］）およびビーズアレイのＭＳＩ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５２３，６８０号）との比較。例えば、ＦＦまたはＦＦＰＥ組織が使用されるかどうか、それがＩＨＣ／ＭＩＨＣまたはＩＳＨ／ＭＩＳＨベースのプロトコルであるかどうか、および／または従来のＩＨＣまたはＩＳＨにどのようなタイプの光学的検出方法（例えば、直接標識された一次抗体または二次検出方法、および比色対蛍光読み出し）が使用されるかに応じて、多くのプロトコルのバリエーションが可能であり、したがって、図１６は、プロトコルの共通の必須要素のみを示すことに留意されたい。

【0047】

【図17】本発明の質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）手順を受けた酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）被覆ガラススライド上のマウス脳組織切片に対する損傷の例。上の２つの画像はＩＴＯ被覆ガラススライド上にあり、下の画像は金被覆ガラススライド上にある。組織切片の損失または損傷は可変であり得る。組織切片に対する損傷の主な部位は、黒色矢印で示されている。

【0048】

【図18】マトリックス再結晶ありおよびなしのＤＨＢマトリックス昇華を使用したマウス脳ＦＦＰＥ組織切片上の抗ＮｅｕＮ抗体検出についてのＭＩＨＣ結果の比較。

【0049】

【図19A】図１９Ａ－１９Ｃ。ＰＣ－ＭＴ標識レクチンプローブで染色した矢状方向のマウス脳ＦＦＰＥ組織切片のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ。（図１９Ａおよび図１９Ｂ）３つのレクチン、ＰＨＡ－Ｅ４（赤色）、ＰＮＡ（緑色）およびＷＧＡ（青色）に対応するＰＣ－ＭＴのカラー化された質量画像。（図１９Ｂ）（この場合はＷＧＡの）レクチン結合の特異性を示すための競合的阻害（ブロッキング）。ＰＣ－ＭＴレクチンプローブの混合物を、ＷＧＡに特異的に結合する可溶性糖Ｎ，Ｎ’，Ｎ”－トリアセチルキトトリオース（ＴＣＴ）とプレインキュベートした（可溶性糖は、組織染色／プロービング工程中に存在したままであった）。対照として、ＴＣＴブロッキングを省略した。（図１９Ｃ）パネルｂ内の各質量画像の全体からの全体平均スペクトルを取得した。３つのレクチンのモノアイソトピックＰＣ－ＭＴピークを標識する（ＷＧＡ、ＰＮＡおよびＰＨＡ－Ｅ４）。オレンジ色のトレースは、ＴＣＴブロッキングで処理された組織であり、紫色のトレースは、ＴＣＴブロッキングなしで処理された組織である。ＷＧＡ ＰＣ－ＭＴのピーク強度の７０％の低下がＴＣＴブロッキングで観察されるが、他の２つのレクチンは変化していない。

【図19B】図１９Ａ－１９Ｃ。ＰＣ－ＭＴ標識レクチンプローブで染色した矢状方向のマウス脳ＦＦＰＥ組織切片のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ。（図１９Ａおよび図１９Ｂ）３つのレクチン、ＰＨＡ－Ｅ４（赤色）、ＰＮＡ（緑色）およびＷＧＡ（青色）に対応するＰＣ－ＭＴのカラー化された質量画像。（図１９Ｂ）（この場合はＷＧＡの）レクチン結合の特異性を示すための競合的阻害（ブロッキング）。ＰＣ－ＭＴレクチンプローブの混合物を、ＷＧＡに特異的に結合する可溶性糖Ｎ，Ｎ’，Ｎ”－トリアセチルキトトリオース（ＴＣＴ）とプレインキュベートした（可溶性糖は、組織染色／プロービング工程中に存在したままであった）。対照として、ＴＣＴブロッキングを省略した。（図１９Ｃ）パネルｂ内の各質量画像の全体からの全体平均スペクトルを取得した。３つのレクチンのモノアイソトピックＰＣ－ＭＴピークを標識する（ＷＧＡ、ＰＮＡおよびＰＨＡ－Ｅ４）。オレンジ色のトレースは、ＴＣＴブロッキングで処理された組織であり、紫色のトレースは、ＴＣＴブロッキングなしで処理された組織である。ＷＧＡ ＰＣ－ＭＴのピーク強度の７０％の低下がＴＣＴブロッキングで観察されるが、他の２つのレクチンは変化していない。

【図19C】図１９Ａ－１９Ｃ。ＰＣ－ＭＴ標識レクチンプローブで染色した矢状方向のマウス脳ＦＦＰＥ組織切片のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ。（図１９Ａおよび図１９Ｂ）３つのレクチン、ＰＨＡ－Ｅ４（赤色）、ＰＮＡ（緑色）およびＷＧＡ（青色）に対応するＰＣ－ＭＴのカラー化された質量画像。（図１９Ｂ）（この場合はＷＧＡの）レクチン結合の特異性を示すための競合的阻害（ブロッキング）。ＰＣ－ＭＴレクチンプローブの混合物を、ＷＧＡに特異的に結合する可溶性糖Ｎ，Ｎ’，Ｎ”－トリアセチルキトトリオース（ＴＣＴ）とプレインキュベートした（可溶性糖は、組織染色／プロービング工程中に存在したままであった）。対照として、ＴＣＴブロッキングを省略した。（図１９Ｃ）パネルｂ内の各質量画像の全体からの全体平均スペクトルを取得した。３つのレクチンのモノアイソトピックＰＣ－ＭＴピークを標識する（ＷＧＡ、ＰＮＡおよびＰＨＡ－Ｅ４）。オレンジ色のトレースは、ＴＣＴブロッキングで処理された組織であり、紫色のトレースは、ＴＣＴブロッキングなしで処理された組織である。ＷＧＡ ＰＣ－ＭＴのピーク強度の７０％の低下がＴＣＴブロッキングで観察されるが、他の２つのレクチンは変化していない。

【0050】

【図20A】図２０Ａ－２０Ｃ。直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに続く同じ組織切片に対するＭＩＨＣ。ＦＦの矢状方向のマウス脳組織切片を使用した。直接検出された脂質および様々な抗体に由来するＰＣ－ＭＴの質量画像を示す。（図２０Ａ）ＭＳＩ－１。内因性脂質の最初の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（例示的な脂質が表示されている画像のキーを参照）。（図２０Ｂ）ＭＳＩ－２。選択された抗体ＰＣ－ＭＴを示す後続のＭＩＨＣ（抗体ＰＣ－ＭＴが表示されている画像のキーを参照）。（図２０Ｃ）合成。ＭＳＩ－１およびＭＳＩ－２から選択された分析物の画像の合成（分析物の画像のキーを参照）。脂質スルファチド（ＳＴ）とミエリンとの予想される共局在であるが、ＳＴとＮｅｕＮとの間ではないことは、実施例４で説明される。

【図20B】図２０Ａ－２０Ｃ。直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに続く同じ組織切片に対するＭＩＨＣ。ＦＦの矢状方向のマウス脳組織切片を使用した。直接検出された脂質および様々な抗体に由来するＰＣ－ＭＴの質量画像を示す。（図２０Ａ）ＭＳＩ－１。内因性脂質の最初の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（例示的な脂質が表示されている画像のキーを参照）。（図２０Ｂ）ＭＳＩ－２。選択された抗体ＰＣ－ＭＴを示す後続のＭＩＨＣ（抗体ＰＣ－ＭＴが表示されている画像のキーを参照）。（図２０Ｃ）合成。ＭＳＩ－１およびＭＳＩ－２から選択された分析物の画像の合成（分析物の画像のキーを参照）。脂質スルファチド（ＳＴ）とミエリンとの予想される共局在であるが、ＳＴとＮｅｕＮとの間ではないことは、実施例４で説明される。

【図20C】図２０Ａ－２０Ｃ。直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに続く同じ組織切片に対するＭＩＨＣ。ＦＦの矢状方向のマウス脳組織切片を使用した。直接検出された脂質および様々な抗体に由来するＰＣ－ＭＴの質量画像を示す。（図２０Ａ）ＭＳＩ－１。内因性脂質の最初の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（例示的な脂質が表示されている画像のキーを参照）。（図２０Ｂ）ＭＳＩ－２。選択された抗体ＰＣ－ＭＴを示す後続のＭＩＨＣ（抗体ＰＣ－ＭＴが表示されている画像のキーを参照）。（図２０Ｃ）合成。ＭＳＩ－１およびＭＳＩ－２から選択された分析物の画像の合成（分析物の画像のキーを参照）。脂質スルファチド（ＳＴ）とミエリンとの予想される共局在であるが、ＳＴとＮｅｕＮとの間ではないことは、実施例４で説明される。

【0051】

【図21A】図２１Ａ－２１Ｂ。非イメージング質量分析用途におけるＰＣ－ＭＴプローブ。ＰＣ－ＭＴ－ＡｂをプロテインＧアガロースビーズに結合させ、ビーズを洗浄し、ビーズに結合したＰＣ－ＭＴ－ＡｂからＰＣ－ＭＴを光放出させ、非イメージング標準ＭＡＬＤＩ－ＭＳ（図２１Ａ）によって分析した上清を、プロテインＧビーズに添加された６つの異なる濃度のＰＣ－ＭＴ－Ａｂに対応する６つのサンプルからのＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルの積層３Ｄ投影（ビーズに添加されたＰＣ－ＭＴ－Ａｂの濃度範囲を黒色矢印で示す）。対照ペプチドは、データ正規化の目的のために固定濃度でサンプルに含めた。（図２１Ｂ）光放出されたＰＣ－ＭＴと対照ペプチドモノアイソトピックピーク強度の比を取り、プロテインＧビーズに添加したＰＣ－ＭＴ－Ａｂ濃度の関数としてプロットした。

【図21B】図２１Ａ－２１Ｂ。非イメージング質量分析用途におけるＰＣ－ＭＴプローブ。ＰＣ－ＭＴ－ＡｂをプロテインＧアガロースビーズに結合させ、ビーズを洗浄し、ビーズに結合したＰＣ－ＭＴ－ＡｂからＰＣ－ＭＴを光放出させ、非イメージング標準ＭＡＬＤＩ－ＭＳ（図２１Ａ）によって分析した上清を、プロテインＧビーズに添加された６つの異なる濃度のＰＣ－ＭＴ－Ａｂに対応する６つのサンプルからのＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルの積層３Ｄ投影（ビーズに添加されたＰＣ－ＭＴ－Ａｂの濃度範囲を黒色矢印で示す）。対照ペプチドは、データ正規化の目的のために固定濃度でサンプルに含めた。（図２１Ｂ）光放出されたＰＣ－ＭＴと対照ペプチドモノアイソトピックピーク強度の比を取り、プロテインＧビーズに添加したＰＣ－ＭＴ－Ａｂ濃度の関数としてプロットした。

【0052】

【図22】図２２は、未消化組織と消化組織での作業の並行を示す例示的な概略図を示す。ＦＦＰＥ＝ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）。

【発明を実施するための形態】

【0053】

表１。ＰＣ－ＭＴの質量ユニット配列および質量レポーターの質量（例示的なＰＣ－ＭＴ構造については図３を参照）。

【0054】

表１．１。アミノ酸同位体。

【0055】

発明の説明

【0056】

本発明は、例えば研究用途および病理学者による臨床用途（例えば、切除された腫瘍または腫瘍生検のバイオマーカー分析）のための、組織または細胞における生体分子（例えば、タンパク質およびｍｉＲＮＡ）の標的化検出およびマッピングのための免疫組織化学（ＩＨＣ）およびインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に関する。特に、例えば、組織または細胞内の生体分子を検出およびマッピングするためのモードとしての質量分析イメージング（ＭＳＩ）の使用である。より具体的には、本発明の分野は、抗体および核酸などのプローブに結合され、マルチプレックス免疫組織化学およびインサイツハイブリダイゼーションを達成するために使用され、ＭＳＩを検出／読み出しの様式として用いる光切断可能な質量タグ試薬に関する。

【0057】

蛍光ＩＨＣなどの現在の組織イメージング方法は、複雑な生体系およびヒト疾患を解明するために必要なマルチプレックス性および／またはマルチオミックのレベルを欠いている。質量分析イメージング（ＭＳＩ）は、一般に、小分子およびペプチドの非標的化分析に限定され、タンパク質などの特定のインタクト分子、グリカンなどの翻訳後修飾、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸を標的とする能力を欠く。本発明者らは、組織中の標的化高分子の高度にマルチプレックス化されたＭＳＩのための抗体、レクチンおよび核酸を含むプローブの容易な標識のために新規な光切断可能なペプチド質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）を利用する方法を開発した。非標的化ＭＳＩと組み合わせると、単一の検体で高度なマルチプレックス性とマルチオミック組織イメージングの両方が達成される。複合マルチモーダル蛍光およびＭＳ ＩＨＣイメージングはまた、二重標識抗体プローブを使用することによって単一組織検体上で達成される。必要とされているのは、これらの前述の制限を克服する新規な光切断可能な質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ手順である。

【0058】

ここで、本発明者らは、これらの前述の制限を克服する新規な光切断可能な質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ手順を報告する。ＰＣ－ＭＴは、質量ユニットと、固相合成によってペプチドに組み込まれた高効率光切断可能リンカー（ＰＣ－リンカー）と、スペーサーと、Ｃ末端付近のＮＨＳ－エステルプローブ反応性部分とを含む修飾ポリペプチドである。ＰＣ－ＭＴ抗体プローブを１工程反応で作製する。新規ＰＣ－リンカーに使用される高速かつ効率的な光核［Ｏｌｅｊｎｉｋ，Ｓｏｎａｒら（１９９５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）９２：７５９０－７５９４］は、実際には堅牢な感度を提供し、ここに示されるように、マウス脳（実験例２）、ヒト扁桃および乳癌（実験例９）を含む様々な組織における広範囲のバイオマーカーの高プレックスＭＳＩを可能にする。さらに、ＰＣ－ＭＴとフルオロフォアの両方を組み合わせた新規二重標識抗体は、ＭＳＩと従来の免疫蛍光との直接相関を可能にした（実験例９）。最後に、このアプローチの汎用性は、同じ組織切片に対して、標準的なＩＨＣでは不可能な（脂質の）非標識非標的化小分子ＭＳＩと、高分子バイオマーカーのマルチプレックスＰＣ－ＭＴに基づく標的化ＭＳＩとの両方を実行する能力によって示される（実験例４）。

【0059】

本発明は、抗体および核酸などのプローブを使用して、組織および細胞などの生物学的検体中の標的化生体分子の高度にマルチプレックス化されたＭＳＩを可能にするために、以前の標的化質量分析イメージング（ＭＳＩ）方法の前述の制限を克服する新規な光切断可能リンカー（ＰＣ－リンカー）、光切断可能質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）および光切断可能質量タグ付きプローブ（ＰＣ－ＭＴ－プローブ）の組成物ならびに製造方法および使用を伴う。

【0060】

ペプチドベースのＰＣ－ＭＴならびに得られたＰＣ－ＭＴ－プローブの基本設計およびそれらの使用を図２に示す。

【0061】

図２ａに示すように、ペプチドベースのＰＣ－ＭＴは、ｉ）例えばアミン反応性ＮＨＳエステル脱離基（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル）が示されている、プローブ反応性部分、ｉｉ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）中にペプチド鎖に導入される内部ＰＣ－リンカー（図２ａの楕円）、ｉｉｉ）ＳＰＰＳ化学を使用して組み込むことができるアミノ酸もしくは同位体またはその類似体／誘導体を含む選択的に検出可能な質量ユニット（図２ａの曲線）、およびｉｖ）任意のフルオロフォア（図２ａにおいて「Ｆ」を有するスターバースト）を含む。

【0062】

ＰＣ－ＭＴのプローブ反応性部分とプローブとの化学反応によって、ＰＣ－ＭＴをプローブに共有結合させて、ＰＣ－ＭＴ－プローブを作製する（図２ｂ）。プローブは、例えば、抗体などのタンパク質またはアミン修飾オリゴヌクレオチドもしくはアプタマーなどの核酸であり得る。

【0063】

細胞／組織をＰＣ－ＭＴ－プローブで「染色」し（すなわち、ＰＣ－ＭＴプローブは、細胞／組織中のそれらの標的に結合している）、光切断すると、ＭＳＩによる検出のために質量レポーター領域が遊離する（光放出される）（図２ｃ、質量レポーターは、質量ユニットを含み、いくつかの実施形態では、光切断されたＰＣ－リンカーの一部も含むことに留意されたい）。光切断は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームおよび／または任意の光、例えば２００ｎｍ～４００ｎｍの範囲の波長を有するＵＶまたは近ＵＶ光によって達成され得ることに留意されたい。

【0064】

ＰＣ－ＭＴ、得られたＰＣ－ＭＴ－プローブおよびそれらの使用における改善は、以下のｉ）光切断可能ビオチン（ＰＣ－ビオチン）および光切断可能ホスホラミダイト（ＰＣ－ホスホラミダイト）などの他の化合物に組み込まれた場合、様々な他の用途で以前に実証された高速かつ効率的な光切断可能核（ＰＣ核、図３の工程１参照）［Ｏｌｅｊｎｉｋ，Ｓｏｎａｒら（１９９５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）９２：７５９０－７５９４、Ｏｌｅｊｎｉｋ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３６１－３６６、Ｏｌｅｊｎｉｋ，Ｋｒｚｙｍａｎｃｋａ－Ｏｌｅｊｎｉｋら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６：３５７２－６、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｐａｔｋａｎｉｏｗｓｋａら（２００２）Ｃｅｌｌ １１０：５６３－７４、Ｐａｎｄｏｒｉ，Ｈｏｂｓｏｎら（２００２）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ９：５６７－７３、Ｍｉｔｒａ，Ｓｈｅｎｄｕｒｅら（２００３）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，３２０：５５～６５、ＬｉｍおよびＲｏｔｈｓｃｈｉｌｄ（２００８）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３８３：１０３－１１５、Ｌｉｍ，Ｌｉｕら（２０１４）Ｒａｐｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＲＣＭ ２８：４９－６２、Ｚｈｏｕ，Ｌｉｕら（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２６１２５］［参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６４３，７２２号、同第５，９８６，０７６号、同第６，２１８，５３０号、同第８，９０６，７００号、および同第１０，０６０，９１２号も参照されたい］、ｉｉ）当該ＰＣ－核を含み、標準的なＦｍｏｃベースのＳＰＰＳ化学を使用してペプチド鎖に組み込むことができる新規Ｆｍｏｃ保護光切断可能リンカー（Ｆｍｏｃ－ＰＣ－リンカー、図３参照）（図３参照）ｉｉｉ）ＰＣ－ＭＴのプローブ反応性部分を使用した容易な１工程プローブ標識化（例えば、ＮＨＳ－エステルプローブ反応性部分、図３の工程１－２参照）、ｉｖ）ＭＳＩに加えて従来の蛍光イメージングを可能にすることによって方法の開発を支援するためのＰＣ－ＭＴ上の組み込まれた任意の蛍光標識（図２ａ参照）、ｖ）非標的化非標識小分子ＭＳＩを実行し、同じ組織切片上の高分子のＰＣ－ＭＴベースの標的化ＭＳＩをマルチプレックス化する能力（実験例４参照）に要約される。

【0065】

本発明は、組織のみに限定されるものではない。例えば、消化した組織を使用することができる。さらに、本発明に記載の組成物および方法は、表面上で増殖または堆積した細胞、または表面上で増殖または堆積したバイオフィルムに適用することができる。例えば、臨床微生物学における微生物の迅速な同定のためのＭＳＩの使用が急速に成長している［（２０１９）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０：４０２９、ＯｖｉａｎｏおよびＢｏｕ（２０１９）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ３２］。細菌細胞を基材上で増殖させるかまたは堆積させ、次いでＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行う。さらなる例では、癌生検に由来し、表面に堆積した細胞を、本発明に記載の組成物および方法を使用して分析することができる。追加の例は、複雑な不均一パターンを形成するように表面上で増殖した単一種または複数種の両方の細菌である。追加の例は、バイオフィルムのＭＡＬＤＩ－ＭＳＩである。噴霧器を使用して寒天上で増殖させたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのバイオフィルムにこの方法を適用して、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに適合する２，５－ジヒドロキシベンゾイン酸溶液などの特定のマトリックス化合物を堆積させることにおいて、最近の進歩がなされている［Ｌｉ，Ｃｏｍｉら（２０１６）Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ５１：１０３０－１０３５］。本方法は、表面に堆積した複雑な多細胞全生物にも適用することができる。例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、軟らかい土壌環境に生息する、長さ約１ｍｍの自由生活の透明な線虫である。ＭＳＩはＣ．ｅｌｅｇａｎｓに以前に適用されており、本発明に記載の組成物および方法を適用することの実現可能性を実証している［Ｍｅｎｇｅｒ，Ｃｌｅｎｄｉｎｅｎら（２０１５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ ３：１３０－１３７］。本発明に記載される組成物および方法はまた、有機および非有機ナノ構造の両方を含む表面上で増殖または堆積される細胞内または分子集合体に適用することができる。単一細胞および細胞内構造のＭＳＩプロファイリングの例は、Ｌａｎｎｉらによる最近の総説［Ｌａｎｎｉ，Ｒｕｂａｋｈｉｎら（２０１２）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７５：５０３６－５０５１］に記載されている。近年、本発明に記載される組成物および方法と適合する透過モード幾何学［Ｎｉｅｈａｕｓ，Ｓｏｌｔｗｉｓｃｈら（２０１９）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：９２５－９３１］などの特殊な技術を使用することによって、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを用いて細胞内分解能が得られている。

【0066】

別の実施形態では、ＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴプローブは、マイクロアレイおよびビーズアレイにおけるコード化および／または検出のために使用されてもよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５２３，６８０号、同第９，５１３，２８５号、および同第１０，０６０，９１２号）。

【0067】

発明の詳細な説明

【0068】

光切断可能な質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）

【0069】

好ましいＦｍｏｃ保護された光切断可能なリンカー（Ｆｍｏｃ－ＰＣ－リンカー）の化学構造は図３に示されており、ＰＣ－ＭＴの合成における重要な構成要素である。化合物は、間にＦｍｏｃ保護第一級アミン末端、遊離カルボキシル末端および１－（２－ニトロフェニル）エチルベースの光切断可能な核（ＰＣ－核）を最小限に含む。必要に応じて、Ｆｍｏｃ－ＰＣ－リンカーはまた、１－（２－ニトロフェニル）エチルベースの光切断可能な核をｆｍｏｃ保護された第一級アミンおよびカルボキシル部分に連結する、図３に示されるリンカーユニットを含む。全体として、Ｆｍｏｃ－ＰＣ－リンカーの最小構成により、ＰＣ－リンカーのペプチドへの組み込みが可能になり、光切断可能な質量タグ（ＰＣ－ＭＴ）が作製される（図３の工程１）。ＰＣ－リンカーは、標準的なＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、現在は化学ペプチド合成の好ましいモード［Ｂｅｈｒｅｎｄｔ，Ｗｈｉｔｅら（２０１６）Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ ２２：４－２７］を使用して、アミノ酸と同じ様式で組み込まれる。しかしながら、Ｂｏｃ保護基および関連するペプチド合成化学などの他の保護基および他のペプチド合成方法が可能であることを理解されたい［ＳｔａｗｉｋｏｗｓｋｉおよびＦｉｅｌｄｓ（２０１２）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ Ｃｈａｐｔｅｒ １８：Ｕｎｉｔ １８ １］。

【0070】

図３に示すように、得られたＰＣ－ＭＴは、以下の特徴から構成されるが、これらに限定されない。

【0071】

ｉ）１－（２－ニトロフェニル）エチルベースのＰＣ－核が図３の工程１に開示されている。光切断部位は、図３の工程１の黒色矢印および図３の工程３に示す光切断反応で示される。本発明のＰＣ－リンカーに使用されるこのＰＣ－核は、高速かつ効率的な光切断を提供し、ＰＣ－核のニトロフェニル環上に追加のメトキシ部分を含有するＬｅｍａｉｒｅらの前述の研究で使用されたＰＣ－リンカーと比較して、質量分析において優れた感度を提供することが本明細書（実験例６）に示されていることに留意されたい（ＰＣ－リンカー構造の比較については図４を参照）。Ｌｅｍａｉｒｅらの以前の研究については、［Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｓｔａｕｂｅｒら（２００７）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ６：２０５７－６７］および米国特許第８，２２１，９７２号を参照されたい。

【0072】

ｉｉ）第一級アミン反応性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ－エステル）脱離基などのプローブ反応性部分。例えば、ＮＨＳ－エステルは、変換［Ｍｏｒｐｕｒｇｏ，Ｂａｙｅｒら（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３８：１７～２８］のための例えばＮ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）またはＤＳＳ（スべリン酸ジスクシンイミジル）を使用して、リジン（Ｋ）側鎖のｓ－アミン上に作製することができる（図３の工程１、ＮＨＳ－エステルを参照）。プローブ反応性部分はまた、例えば、ペプチドベースのＰＣ－ＭＴのＣ末端のカルボン酸官能基の化学変換／修飾によって作製されてもよい（図３には示されていない）。プローブ反応性部分は、抗体または核酸などの標的化プローブへのＰＣ－ＭＴの容易な結合を可能にする。例えば、アミン反応性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（スルホ－ＮＨＳ）エステル、スクシンイミジルエステル（ＳＥ）、スルホ－スクシンイミジルエステル（ＳＳＥ）、アルデヒドまたはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、スルフヒドリル反応性マレイミドまたはヨードアセトアミドまたはポリ反応性エポキシ部分を含むがこれらに限定されない様々なプローブ反応性部分を使用できることを理解されたい。銅を含むまたは銅を含まないクリックケミストリーで使用されるようなアジドおよびアルキンも可能である［ＭｃＫａｙおよびＦｉｎｎ（２０１４）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２１：１０７５－１０１］。

【0073】

ｉｉｉ）例えば、図３の工程１におけるＰＣ－リンカー＋ＧＳＧＧＫアミノ酸配列の一部として示される、ＰＣ－核酸をプローブ反応性部分に連結する任意のスペーサーユニット。プローブ反応性部分は、スペーサーユニットなしで同じ位置で１－（２－ニトロフェニル）エチルベースのＰＣ－核に結合することができるので、このスペーサーユニットは必要ではないことが理解されるべきである。このスペーサーユニットは、親水性／水溶性を促進するための様々な化学構造、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーであり得ることも理解されるべきである。

【0074】

ｉｖ）一例として図３にＡＰＲＬＲＦＹＳＬアミノ酸（ペプチド）配列として示されている、選択的に検出可能な質量ユニット。使用される任意のアミノ酸は、例えば、天然および非天然アミノ酸、ならびに修飾アミノ酸、同位体アミノ酸、アミノ酸類似体／誘導体およびそれらの任意の組み合わせであり得ることが理解されるべきである。ペプチドベースの質量ユニットは、合成の容易さ、質量分析における堅牢な性能、およびタンデムＭＳベースの断片化分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ）の確立された方法を使用した質量分析同定におけるさらなる特異性を得る能力のために好ましい具体例であるが、選択的に検出可能な質量ユニットはペプチドである必要はなく、例えば、質量分析によって検出され得る任意の化学的実体であってもよい。ポリマー質量ユニットは、一般的な合成の容易さ、および単純にモノマーサブユニットの数およびタイプを変更することによって質量を容易に調節する能力のために好ましい。ペプチドは、（例えば、核酸に加えて）バイオポリマーの形態であると考えられるが、ペプチド以外のポリマー、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳによって容易に合成および検出されるポリエチレングリコールを使用してもよい［Ｅｎｊａｌｂａｌ，Ｒｉｂｉｅｒｅら（２００５）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １６：６７０－８］。

【0075】

ｖ）ＰＣ－核を質量ユニットに連結する、図３の工程１に示す任意の質量ユニットリンカー。質量ユニットは、質量ユニットリンカーなしで同じ位置で１－（２－ニトロフェニル）エチルベースのＰＣ－核に結合することができるので、この質量ユニットリンカーは必要ではないことを理解されたい。この質量ユニットリンカーは、親水性／水溶性を促進するための様々な化学構造、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーであり得ることも理解されるべきである。

【0076】

ｖｉ）ＰＣ－ＭＴの自己反応または重合を回避するために、プローブ反応性部分が第一級アミン反応性である場合、ペプチドベースのＰＣ－ＭＴのＮ末端のａ－アミン上にブロッキング基、例えばアセチル化（図３の「Ａｃ」）を使用してもよい。遊離第一級アミン（例えば、ｓ－アミンを有するリジン）を有する内部アミノ酸は、これらの場合に回避されてもよく、またはブロック／保護されてもよい。プローブ反応性部分がスルフヒドリルなどの異なる官能基と反応する場合、ペプチド上に存在する任意のそのような官能基（例えば、システインから）も、ＰＣ－ＭＴの自己反応または重合を防ぐためにブロック／保護されてもよい。

【0077】

ｖｉｉ）フルオロフォアまたは他の検出可能な標識（例えば、発色団またはビオチンなどの親和性リガンド）は、選択的に検出可能な質量ユニット（図３に示されていないフルオロフォア、一実施形態については図２ａを参照）に加えて、ＰＣ－ＭＴに必要に応じて含まれている。これは、例えば、同じ細胞／組織サンプルに対するＭＳＩに加えて従来の蛍光イメージングを可能にすることによって、方法の開発を支援することができる。フルオロフォアは、様々な市販のアミン反応性色素（例えば、Ｃｙ５－ＮＨＳまたはＳｕｌｆｏ－Ｃｙ５－ＮＨＳ）を使用して、例えば、含まれるリジンの８－アミン上のＰＣ－ＭＴに結合され得る。この結合は、ＳＰＰＳ中またはＳＰＰＳ後に達成され得る。フルオロフォアの結合は、他の化学物質、例えば、クリックケミストリーでも可能である［ＭｃＫａｙおよびＦｉｎｎ（２０１４）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２１：１０７５－１０１］。好ましい実施形態では、フルオロフォアはスペーサーユニットに結合している。他の実施形態では、フルオロフォアは、質量ユニットまたは質量ユニットリンカーに結合していてもよい。しかしながら、フルオロフォアは、プローブ反応性部分とプローブとの反応、光切断反応または質量ユニットのＭＳＩ検出を妨害せず、かつプローブ標識のために選択された溶媒環境におけるＰＣ－ＭＴ標識試薬の溶解性を損なわない限り、ＰＣ－ＭＴ構造の任意の部分に結合していてもよい。このアプローチは、質量レポーターおよびフルオロフォアが同じＰＣ－ＭＴ標識試薬の一部であり、それによって、例えば（質量分析手段に加えて）蛍光手段によるＰＣ－ＭＴプローブ標識の成功の評価を可能にするという利点を有する。あるいは、蛍光標識（または発色団などの他の検出可能な標識またはビオチンなどの親和性リガンド）を欠くＰＣ－ＭＴをプローブに結合させてもよく、さらに、蛍光標識（または発色団などの他の検出可能な標識またはビオチンなどの親和性リガンド）を、ＰＣ－ＭＴとは異なる部位で同じプローブに結合させてもよい。これは、例えば、ＮＨＳ－エステルプローブ反応性部分を有するＰＣ－ＭＴおよび前述のＮＨＳ活性化フルオロフォアの両方でプローブ（例えば、抗体）を標識することによって容易に達成することができる。ＰＣ－ＭＴおよびフルオロフォアによるプローブの標識は、同時にまたは順番に（ＰＣ－ＭＴの後に最初にフルオロフォアが続くか、またはフルオロフォアの後にＰＣ－ＭＴが続くかのいずれか）行うことができる。プローブ標識に第一級アミン反応性ＮＨＳ基を使用するこの実施形態では、例えば、抗体プローブ中に多数の第一級アミンが存在するので、ＰＣ－ＭＴおよびフルオロフォアの両方による標識が容易に可能である。全体として、このアプローチは、典型的には水性条件下で行われるプローブ標識中のＰＣ－ＭＴ標識反応またはＰＣ－ＭＴ溶解度に対するフルオロフォアの有害な影響を回避することができるので、蛍光ＰＣ－ＭＴを超える利点を有してもよく、質量分析による読み出しにおけるフルオロフォアの有害な影響（例えば、フルオロフォアが質量レポーターに結合している場合、潜在的に低いイオン化効率など）も回避することができる。さらに、この代替アプローチにより、蛍光およびＰＣ－ＭＴ標識比を独立して調整することが可能になる。

【0078】

最後に、図３に示される任意の化学的リンカー、すなわちリンカーユニット、質量ユニットリンカーおよびスペーサーユニットは、本発明の範囲を限定することを意味しないことが理解されるべきである。これらは、ＰＣ－核と、例えばプローブ反応性部分および質量ユニットなどの重要な部分との間の架橋として働く。これらの化学的リンカーは、様々な化学組成のものであってもよい。例えば、化学的リンカーは、単に炭化水素鎖であってもよく、あるいは、例えば、水性環境でのより良好な溶解性のために、２，２’－（エチレンジオキシ）－ビス－（エチルアミン）化学的リンカーを使用してもよい［Ｐａｎｄｏｒｉ，Ｈｏｂｓｏｎら（２００２）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ９：５６７－７３］。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は別の例であり、当業者であれば、比較的安定で水溶性で生体適合性である優れた化学リンカーとして認識する。

【0079】

ＰＣ－ＭＴ－プローブ

【0080】

図３の工程２に示すように、ＰＣ－ＭＴをプローブ反応性部分を介してプローブに結合させる。示される例では、ＰＣ－ＭＴのＮＨＳ－エステル脱離基は、抗体上の第一級アミンとの反応後に失われ、ＰＣ－ＭＴと抗体との間にアミド結合を形成する。抗体が示されているが、プローブは、例えば抗体、組換え抗体、アフィボディ、ナノボディ、一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ単一ドメインＶＨＨ抗体）、受容体、炭水化物結合タンパク質（例えば、レクチン［ＴｓａｎｅｖａおよびＶａｎ Ｄａｍｍｅ（２０２０）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ ３７：５３３－５５１］）もしくはリガンド、またはそれらの断片を含むがこれらに限定されないタンパク質などの任意の種類のものであってもよい。プローブはまた、例えばオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブまたはＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーにおけるような、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはロック核酸（ＬＮＡ）などの核酸［Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｓｉｎｇｈら（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｄｙｎ １７：１７５－９１］であってもよい。プローブはまた、例えば、脂質、炭水化物、ステロイドまたは薬物などの他の有機分子または生体分子であってもよい。ＰＣ－ＭＴによるプローブの標識は、ランダムな部位（例えば、プローブ反応性部分としてＮＨＳ－エステルを含むＰＣ－ＭＴで生じる可能性があるように、タンパク質の任意の第一級アミン部位で非特異的に）であってもよく、または標識は部位特異的（例えば、いくつかの抗体の重鎖上の特定の部位に存在する炭水化物領域）であってもよい。場合によっては、第一級アミン修飾核酸プローブ（例えば、プローブ反応性部分がＮＨＳ－エステルである場合）などの修飾プローブを使用してＰＣ－ＭＴ標識を容易にすることが必要な場合がある。

【0081】

プローブは、組織、すなわちプローブが結合する部分（分子構造）を有する様々な標的を有し得る。以下の例は、プローブ標的のタイプを限定することを意図するものではなく、異なるプローブは、異なる生体分子またはバイオマーカー（例えば、異なるタンパク質）を標的とし得るか、または同じ生体分子またはバイオマーカー（例えば、同じタンパク質内の異なる結合部位）内の異なる結合部位を標的とし得る。プローブ標的としては、タンパク質、タンパク質の翻訳後修飾、糖タンパク質、核酸、脂質およびその誘導体、薬物、代謝産物、炭水化物、グリカン、プロテオグリカン、ガングリオシドならびに有機化合物を含む生体分子またはその複合体もしくは部分が挙げられるが、これらに限定されない。

【0082】

ＰＣ－ＭＴ－プローブにおいて、コア構造は、質量ユニットをプローブに連結する構造として定義される（例えば、図３の工程２の「コア構造」を参照）。コア構造は、限定されるものではないが、ＰＣ－核、任意のスペーサーユニット、および任意の質量ユニットリンカーから構成され、典型的には、すべてのＰＣ－ＭＴ－プローブ種において共通の構造である。好ましい実施形態では、コア構造は非中立構造（例えば、イオン性基、例えばスルホネート、ホスフェート、アミンまたはカルボン酸を含有する）である。これにより、ＰＣ－ＭＴ標識試薬の水溶性が向上するため、典型的には水性環境下で行われるプローブ標識反応が向上する。これはまた、ＰＣ－ＭＴ－プローブの水溶性を改善することができる。一実施形態では、スルホン化フルオロフォアがコア構造（例えば、実験例７で使用されるようなＳｕｌｆｏ－Ｃｙ５）上に含まれる。フルオロフォアは典型的には多環式化合物であり、そのようなスルホネート部分なしでは水溶性ではないので、フルオロフォアのスルホン化バージョンが使用される。別の実施形態では、ＰＣ－ＭＴ標識試薬および／またはＰＣ－ＭＴ－プローブの水溶性を改善するために、ＰＣ－ＭＴのスペーサーユニットのアミノ酸部分にアスパラギン酸および／またはグルタミン酸が含まれる。

【0083】

好ましい実施形態では、複数のＰＣ－ＭＴ分子を各プローブ分子に結合させて、質量分析工程における感度の向上を促進する。担体をプローブに添加して、ＰＣ－ＭＴ標識の数をさらに増加させ、それによってさらなるシグナル増幅を促進することができ、一実施形態では、ポリアミン修飾デンドリマーまたはナノ粒子（ＮＰ）をＰＣ－ＭＴで標識し、次いでプローブ（例えば、抗体）に結合させて、ＰＣ－ＭＴ標識の数を増加させる（図５ａ）。金ＮＰは、１３ｎｍもの小ささであり、例えば標的生体分子の免疫標識のために電子顕微鏡で日常的に使用されている［Ａｃｋｅｒｓｏｎ，Ｐｏｗｅｌｌら（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４８１：１９５－２３０］ので、特に魅力的である。一例では、ポリアミン末端金ＮＰまたは分岐デンドリマーは市販されており（例えば、ＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈおよびＮａｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、ＰＣ－ＭＴに（アミン反応性ＮＨＳ－エステルプローブ反応性部分を介して）コンジュゲートさせることができる。利用可能なＮＨＳ活性化試薬（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製［マサチューセッツ州ウォルサム］のＮＨＳ－ＤＩＢＯ－アルキン）を使用して、ポリアミンデンドリマーまたはＮＰにアルキン基を導入することもできる。同様に、抗体またはアミン修飾核酸プローブは、市販のＮＨＳ活性化試薬（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製［マサチューセッツ州ウォルサム］のＮＨＳ－ＰＥＧ４－アジド）も使用してアジド基で修飾することができる。最後に、十分に確立された、高度に選択的で、穏やかで、生物直交性のクリックケミストリー［Ｋｏｌｂ，Ｆｉｎｎら（２００１）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４０：２００４－２０２１］を使用して、ＰＣ－ＭＴ／アルキン修飾デンドリマーまたはＮＰをアジド修飾プローブ（アジドおよびアルキンは、複雑な混合物であっても、生理学的水性条件下で自発的かつ選択的に共有結合を形成すし、場合によっては、使用されるアルキンのタイプに応じて、銅触媒が必要である）と連結することができる。

【0084】

別の実施形態では、複数の第一級アミン修飾を核酸プローブに導入して、ＰＣ－ＭＴ標識部位の数を増加させる。いくつかの場合、核酸プローブの標的結合（ハイブリダイゼーション）配列の一部ではない核酸「尾部」を使用することが望ましい場合があり、これらの「尾部」は、多数のＰＣ－ＭＴ標識部位を提供するために複数のアミン修飾を有する（図５ｂ）。この構成により、核酸プローブの標的結合領域に対するＰＣ－ＭＴからの潜在的な干渉が低減される。アミン修飾は、例えば修飾ヌクレオチドを使用して核酸プローブに導入することができる。例えば、５’－ジメトキシトリチル－５－［Ｎ－（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）－３－アクリルイミド］－ウリジン、アミノ修飾剤Ｃ６－Ｕホスホラミダイトとして一般的に知られており、ホスホラミダイトベースの化学的ＤＮＡ合成中に導入される２’－Ｏ－トリイソプロピルシリルオキシメチル－３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト。修飾ヌクレオチドはまた、例えば、一般にアミノアリル－ｄＵＴＰと呼ばれる５－［３－アミノアリル］－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸を使用して核酸プローブに酵素的に（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって）導入することができる。ＰＣ－ＭＴ標識の部位として使用するためのアミン以外の修飾も同様に核酸プローブに導入することができる。

【0085】

好ましい実施形態では、ＰＣ－ＭＴは、ＰＣ－ＭＴとプローブとの間の１工程化学反応（例えば、プローブ反応性部分としてＮＨＳ－エステルを含むＰＣ－ＭＴを、抗体またはアミン修飾核酸などのプローブと混合することによって）でプローブに結合される。本発明におけるＰＣ－ＭＴによるプローブの標識化は、Ｌｅｍａｉｒｅらの以前の研究［Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｓｔａｕｂｅｒら（２００７）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ６：２０５７－６７］［米国特許第８，２２１，９７２号も参照］における複雑な多工程プロセスとは重要なことに異なっており、ここで、プローブ（例えば、抗体）は、最初に、ＭＢＳのＮＨＳ－エステル部分との反応によって光切断可能でないヘテロ二官能性架橋剤ＭＢＳ（３－マレイミドベンゾイック酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）にコンジュゲートされなければならず、次いで、抗体は、脱塩カラムクロマトグラフィーによって精製され（未反応のＭＢＳリンカーを除去するため）、結合したＭＢＳリンカーによって抗体上に生成されたスルフヒドリル反応性マレイミド部分は、その後、内部光切断可能な部位およびシステインアミノ酸を含有するペプチドと反応する（それによって、光切断可能なペプチド上のシステインは、抗体結合ＭＢＳリンカー上のマレイミドとの反応するための遊離スルフヒドリル部分を提供する）。同様に、前述のイメージング質量サイトメトリーアプローチ［Ｇｉｅｓｅｎ，Ｗａｎｇら（２０１４）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：４１７－２２］もまた、高度に複雑な多工程プローブ（すなわち、抗体）標識手順を使用し、これは、ポリマーに金属イオンを予め負荷し、抗体を部分的に還元し、２つを一緒にカップリングし、ポリマーおよび抗体を複数回精製することを含む［Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、クイックリファレンス：「Ｍａｘｐａｒ Ｘ８ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ」、２０２０年９月アクセス、ｗｗｗ．ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ／ｂｉｎａｒｉｅｓ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｆｌｕｉｄｉｇｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｍａｘｐａｒ－ｘ８－ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｉａｂｅｌｉｎｇ－ｑｕｉｃｋ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ－ｆｌｄｍ－０００１５－ｒｅｖ０１／ｍａｘｐａｒ－ｘ８－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌａｂｅｌｉｎｇ－ｑｕｉｃｋ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ－ｆｌ ｄｍ－０００１５－ｒｅｖ０１／ｆｌｕｉｄｉｇｍ％３Ａｆｉｌｅ］。

【0086】

本発明の一実施形態では、簡単にするために（未反応ＰＣ－ＭＴを除去しないように）ＰＣ－ＭＴ標識反応後のプローブのさらなる精製を回避することができる可能性があり、他の実施形態では、例えば、サイズ排除（ゲル濾過）クロマトグラフィーまたは限外濾過（例えば、適切な分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５遠心フィルターユニットを使用して、標識プローブを保持すること）による未反応ＰＣ－ＭＴの除去が、下流バイオマーカー検出のバックグラウンドを回避するために望ましい場合がある。

【0087】

ＰＣ－ＭＴプローブおよび質量分析イメージング（ＭＳＩ）により組織を処理する

【0088】

プロセスの最後の工程は、細胞または組織を処理（「染色」）するためのＰＣ－ＭＴ－プローブの利用（すなわち、ＰＣ－ＭＴプローブは、細胞／組織中の標的に結合している）、続いて光切断された質量レポーターを画像化するためのＭＳＩの利用である（図２ｃおよび図３の工程３を参照）。本発明において質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）および質量分析に基づくインサイツハイブリダイゼーション（ＭＩＳＨ）と称される２つの例示的な実施形態は、抗体および核酸プローブがそれぞれ使用される場合、従来の免疫組織化学（ＩＨＣ）およびインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に類似する。本質的に、ＭＩＨＣおよびＭＩＳＨは、フルオロフォアまたは発色剤で標識されたプローブの代わりにＰＣ－ＭＴ標識プローブを使用する点、および光学イメージング（例えば、顕微鏡検査）の代わりにＭＳＩを使用する点で異なる。実験例において後に詳細に例示されるＭＩＨＣおよびＭＩＳＨプロセスは、典型的には、以下の段落に記載される基本的な工程（標準的なＩＨＣおよびＩＳＨの場合のように、当業者によって認識されるように、多くのプロトコルの変形が可能である）を含む。本発明のプロトコル（ＭＩＨＣおよびＭＩＳＨ）の本質的な共通要素と、従来のＩＨＣ（例えば、［ＫａｔｉｋｉｒｅｄｄｙおよびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７８４：１５５－６７］）および従来のＩＳＨ（例えば、［Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｃｅｋａｎら（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２１１：１７１－８７］）、ならびに従来の直接的なＭＳＩ（例えば、［Ｃａｐｒｉｏｌｉ，Ｆａｒｍｅｒら（１９９７）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６９：４７５１－６０］）およびビーズアレイのＭＳＩ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，５２３，６８０号）との比較については、図１６も参照されたい。例えば、ＦＦまたはＦＦＰＥ組織が使用されるかどうか、それがＩＨＣ／ＭＩＨＣまたはＩＳＨ／ＭＩＳＨベースのプロトコルであるかどうか、および／または従来のＩＨＣまたはＩＳＨにどのようなタイプの光学的検出方法（例えば、直接標識された一次抗体または二次検出方法、および比色対蛍光読み出し）が使用されるかに応じて、多くのプロトコルのバリエーションが可能であり、したがって、図１６は、プロトコルの共通の必須要素のみを示すことに留意されたい。
ＭＩＨＣの基本的な工程は、ｉ）薄いＦＦＰＥまたは新鮮凍結組織切片（例えば、ＦＦＰＥまたは新鮮凍結組織ブロックからミクロトームまたはクライオスタットにより厚さ５～１０μｍ）を導電性スライド（例えば、金属被覆ガラススライド）にマウントすること、なお、導電性表面としての酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）で被覆されたガラススライドは、ＭＳＩでほぼ普遍的に使用されているが（例えば、［Ｙａｌｃｉｎおよびｄｅ ｌａ ｍｏｎｔｅ（２０１５）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ６３：７６２－７１、Ａｎｇｅｌ，Ｂａｌｄｗｉｎら（２０１７）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｔｅｏｍ １８６５：９２７－９３５］を参照）、本発明では、以下に記載されるＭＩＨＣおよびＭＩＳＨの広範な処理工程を考慮すると、金で被覆されたガラススライドは、ＭＳＩに必要な導電性表面（例えば、ウィスコンシン州マディソンのＰｌａｔｙｐｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ製の１０ｎｍの金層および２ｎｍのチタン接着下層、またはカナダオンタリオ州のＳｕｂｓｔｒａｔａ Ｔｈｉｎ Ｆｉｌｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ａｎｇｓｔｒｏｍ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．製の５０ｎｍの金層および５ｎｍのクロム接着下層を有するガラススライド）を依然として提供しながら、処理中にスライドから組織が浮き上がることおよび／または組織の損傷を回避するのに有益であることが見出され、組織をマウントした後、ｉｉ）ＦＦＰＥの場合は脱パラフィン（例えば、キシレンを用いて）すること、ｉｉｉ）典型的には一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて再水和（脱パラフィンが行われた場合）すること、ｉｖ）新鮮凍結組織の場合、ホルマリンまたはパラホルムアルデヒド中で固定すること、ｖ）抗原賦活化し、ホルマリン／パラホルムアルデヒド固定の有害作用の一部を逆転させること（例えば、ｐＨ６のクエン酸緩衝液中での加熱、またはギ酸の使用）、ｖｉ）ブロッキング緩衝液（典型的には、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０などの非イオン性界面活性剤ならびにウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］および動物血清などのタンパク質遮断薬を含む生理食塩水緩衝液）で処理し、バックグラウンドを減少させること、ｖｉｉ）マルチプレックス化のために異なるＰＣ－ＭＴ抗体（ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ）の混合物で同時に染色すること（典型的にはブロッキング緩衝液で希釈）、ｖｉｉｉ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０などの非イオン性界面活性剤を含む生理食塩水緩衝液中で洗浄して、あらゆる未結合ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを除去し、続いて重炭酸アンモニウムなどの揮発性水性緩衝液中で洗浄して、質量分析のいくつかの形態を妨害し得る不揮発性塩を除去すること、およびｉｘ）ＭＳＩの前に組織スライドを乾燥させることである。免疫組織化学的スタイルの質量分析イメージング（ＭＳＩ）プロトコル（図１６のフローチャート）を用いると、金スライド（例えば、金層を有するスライド）にマウントした組織がより良好な結果を有することが発見された。より具体的には、金スライドにマウントすることは、必要なスライド処理工程（ＭＳＩ用の導電性スライド）中の組織損傷または損失を回避するのに役立った。組織ＭＳＩにおける金スライドの以前の使用は、本発明のすべての処理工程を欠いており（図１６のフローチャートを参照）、したがって組織の損失／損傷に問題がない直接的なＭＳＩ用であった。本発明は、組織接着を改善するために金スライドを使用する（より一般的には、ＩＴＯ導電性スライドが直接的なＭＳＩに使用されるが、本発明者らのプロトコルでは不十分な結果を示し、実施例１０を参照されたい）。組織の損傷および損失は、スライドの液相処理工程のいずれにおいても起こり得る。

【0089】

ＭＩＳＨの工程は、ｉ）組織をマウントすること、ｉｉ）脱パラフィンすること、ｉｉｉ）再水和すること、およびｉｖ）ホルマリン／パラホルムアルデヒド固定を、ＭＩＨＣについて記載されるように行うこと、これは典型的には、ｖ）プロテイナーゼＫによる部分タンパク質消化が続き、ｖｉ）ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）により核酸を固定すること、ｖｉｉ）組織をアセチル化し、遊離アミンをキャッピングし、バックグラウンド（プローブの非特異的結合によって引き起こされる）を減少させること、ｖｉｉｉ）典型的には少なくとも無関係の核酸（例えば、酵母ｔＲＮＡおよび／またはサケ精子ＤＮＡ）を含有するブロッキング緩衝液を用いて処理し、バックグラウンドを減少させること、ｉｘ）マルチプレックス化のために異なるＰＣ－ＭＴ核酸（ＰＣ－ＭＴ－ＮＡ）の混合物と同時に染色（ハイブリダイゼーション）すること（典型的にはブロッキング緩衝液または同様のもので希釈される）、ｘ）生理食塩水緩衝液中で洗浄して、あらゆる未結合ＰＣ－ＭＴ－ＮＡを除去し、続いて重炭酸アンモニウムなどの揮発性水性緩衝液中で洗浄して、質量分析のいくつかの形態を妨害し得る不揮発性塩を除去すること、およびｘｉ）ＭＳＩの前に組織スライドを乾燥させることである。

【0090】

しかしながら、先に論じられたように、本発明のプローブは、抗体（ＭＩＨＣに使用される）および核酸（ＭＩＳＨに使用される）に限定される必要はなく、例えば、レクチン、受容体またはリガンドであってもよい。したがって、本発明は、ＭＩＨＣおよびＭＩＳＨ方法論に限定されず、組織が、例えばＰＣ－ＭＴがコンジュゲートしたレクチン、受容体もしくはリガンド、または任意のプローブタイプもしくはそれらの組み合わせで処理（「染色」）される他の実施形態も含まれる。

【0091】

質量分析イメージング（ＭＳＩ）（ならびにＭＩＨＣおよびＭＩＳＨを含む実施形態）。上に概説した手順に従って、ＭＳＩが実行され、一実施形態ではＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを使用する。

【0092】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの場合、マトリックス化合物は、典型的には薄く均一な層で組織に適用される。マトリックス化合物の例としては、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、１，５－ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）または３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）が挙げられる。好ましい実施形態では、マトリックス昇華とそれに続く再結晶［Ｈａｎｋｉｎ，Ｂａｒｋｌｅｙら（２００７）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １８：１６４６－５２、Ｄｕｅｎａｓ，Ｃａｒｌｕｃｃｉら（２０１６）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２７：１５７５－８］を使用して、優れた空間分解能（すなわち、マトリックス適用中の分析物の非局在化を制限する昇華によって提供される）および高感度（すなわち、質量レポーターがマトリックスと十分に共結晶化することを可能にするが、十分な分析物の非局在化を伴わない再結晶化によって提供される）の両方を達成する。市販の噴霧器（例えば、ＨＴＸ ＴＭ噴霧器、ノースカロライナ州チャペルヒルのＨＴＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）を使用するなどして、マトリックス適用の他の方法を使用してもよい。

【0093】

ＭＳＩ工程には、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩだけでなく、様々な質量分析技術および機器を使用することができる。他のＭＳＩ法としては、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＤＥＳＩ－ＭＳＩ）［Ｔａｋａｔｓ，Ｗｉｓｅｍａｎら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：４７１－３］、レーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＬＡＥＳＩ－ＭＳＩ）［Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｗｉｌｓｃｈｕｔら（２０１８）Ｐｌａｎｔａ ２４８：１５１５－１５２３］、および大気圧（ＡＰ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析イメージング（ＡＰ－ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）［Ｋｏｍｐａｕｅｒ，Ｈｅｉｌｅｓら（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：９０－９６］が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＤＥＳＩ－ＭＳＩは、代謝産物および脂質などの小分子に元々最も適していたが、それ以来、タンパク質／ペプチド検出にも適合されている［Ｔａｋａｔｓ，Ｗｉｓｅｍａｎら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：４７１－３、Ｔａｋａｔｓ，Ｗｉｓｅｍａｎら（２００８）ＣＳＨ Ｐｒｏｔｏｃ ２００８：ｐｄｂ ｐｒｏｔ４９９４、Ｈｓｕ，Ｃｈｏｕら（２０１５）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８７：１１１７１－５、Ｔｏｗｅｒｓ，Ｋａｒａｎｃｓｉら（２０１８）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２９：２４５６－２４６６、ＨａｌｅおよびＣｏｏｐｅｒ（２０２１）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９３：４６１９－４６２７］。その基本的な形態では、ＤＥＳＩ－ＭＳＩは、エレクトロスプレーされ帯電した溶媒液滴を表面（例えば、組織）に向けて、表面から分析物を抽出（脱離）およびイオン化し、次いでこれを質量分析計の質量分析計の入口（例えば、トランスファーキャピラリー）に取り込むことによって機能する［Ｔａｋａｔｓ，Ｗｉｓｅｍａｎら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：４７１－３］。しかしながら、脱離事象およびイオン化事象の分離を可能にするナノＤＥＳＩ－ＭＳＩなどのＤＥＳＩ－ＭＳＩの変形も存在する［Ｒｏａｃｈ，Ｌａｓｋｉｎら（２０１０）Ａｎａｌｙｓｔ １３５：２２３３－６］。ＤＥＳＩ－ＭＳＩは、真空下ではなく周囲条件下で容易に行うことができ、したがって必要なサンプル調製は最小限であり、自動化に適している。さらに、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）ベースの方法として、ＤＥＳＩ－ＭＳＩはＭＡＬＤＩ－ＭＳＩのようにマトリックス適用を必要としない。ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩマトリックス適用は、再現性の問題につながる可能性がある追加の困難で面倒な工程であるだけでなく、分析物の非局在化のリスクもある。

【0094】

ＭＳＩ技術および機器のタイプにかかわらず、ＰＣ－ＭＴは光切断され、ＭＳＩ分析のためにＰＣ－ＭＴ－プローブから質量レポーターを遊離させる（図２ｃおよび図３の工程３を参照）。図３の工程３に例示されるように、質量レポーターは、質量ユニット、場合によっては光切断されたＰＣ－リンカーの一部から構成されることに留意されたい（図３に示されていない他の場合では、質量レポーターは、光切断されたＰＣ－リンカーの一部を含まなくてもよく、したがって、質量レポーターおよび質量ユニットは等価である）。ＰＣ－ＭＴは、入射ＵＶのマトリックス吸収を回避するために、ＭＳＩの前に、好ましくはＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの場合にはマトリックス適用の前にもＵＶ処理によって予備光切断され得る。光切断はまた、好ましくは、拡散による光切断された質量レポーターの非局在化を防止するために、乾燥スライド上で行われる。予備光切断は、例えば、モデルＸＸ－１５自己フィルタリング３６５ｎｍピークランプ（カリフォルニア州アップランドのＵＶＰ／Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＵＳ ＬＬＣ）を使用することによって達成することができるが、他の多くの光源も可能である。好ましい実施形態では、予備光切断は、比較的低い強度のＵＶ光（例えば、３～１０ｍＷ／ｃｍ^２）を用いて短時間（例えば、５分）で達成される。あるいは、ＰＣ－ＭＴは、機器のレーザービームによって（またはＬＡＥＳＩ－ＭＳＩなどの任意の他のレーザーベース質量分析計のレーザービームによって）ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析とインラインで光切断されてもよい。ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの場合、質量レポーターはマトリックス適用前に光切断されないので、この代替アプローチはＭＳＩの空間分解能を改善すると予想することができる（マトリックス適用は、そうでなければ予備光切断された質量レポーターの拡散を引き起こす可能性がある）。しかしながら、本明細書における結果は、インライン光切断のこのアプローチが、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの場合には不十分な感度を提供することを示している（実験例６）。マトリックス適用前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ前の予備光切断の優位性は、以下の、ｉ）予備光切断は、マトリックス化合物の遮光効果を回避し（実際には、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの間に衝突するＵＶレーザー光を吸収し、質量レポーターが分析のために気化およびイオン化されるように熱に変換することはマトリックスの機能である）、ｉｉ）予備光切断された質量レポーターを有することは、遊離された質量レポーターがその後に適用されるマトリックスと共結晶化することを可能にし（当業者は、マトリックスとの分析物の共結晶化がＭＡＬＤＩ－ＭＳにおける分析物の効率的な脱着／イオン化のために重要であることを認識するであろう）、逆に、機器のレーザービームによるＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析とインラインの光切断は、マトリックス適用／結晶化後に必然的に起こり、マトリックスおよび質量レポーターの効率的な共結晶化を可能にしない可能性が高い（マトリックス適用／結晶化の時点で、質量レポーターは依然としてプローブに付着しており、プローブは依然として組織に付着している可能性があるからである）ことにより説明され得る。しかしながら、他のレーザーベースのＭＳＩ方法および機器、例えばマトリックス化合物を必要としないものは、レーザー波長が光切断波長と十分に一致すると仮定して、効率的なインライン光切断および十分な感度を提供することが期待され得る。

【0095】

好ましいＰＣ－リンカー（図３）では、光切断は、質量レポーターに結合したＰＣ－リンカーの小さな残留部分を残し、それにより、光切断時に質量レポーター上に遊離第一級アミンを生成し（図３の工程３参照）、これは、ポジティブモードＭＡＬＤＩ－ＭＳＩにおける質量レポーターイオン化を補助し得るので、この設計は感度を増加させ得ることに留意されたい。

【0096】

また、図３は、光切断部位（稲妻で示される光切断部位について図３の工程３を参照）を介してＰＣ－核のフェニル環に（光切断前に）連結されたＰＣ－ＭＴの質量レポーター、および光切断部位とは異なる位置でＰＣ－核のフェニル環に最終的に連結されたプローブを示すことにも留意されたい。重要なことに、ＰＣ－リンカーの光切断された１－（２－ニトロフェニル）－エチル部分は、図３の工程３に示されるように光切断時に質量レポーターに結合したままではない（代わりにプローブに結合したままである）ので、これは本発明の好ましい実施形態である。逆に、Ｏｌｅｊｎｉｋら［Ｏｌｅｊｎｉｋ，Ｌｕｄｅｍａｎｎら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：４６２６－３１］およびＬｅｖｙおよびＣａｐｒｉｏｌｉ（米国特許第７，５６９，３９２号）によって教示されているように、この向きを完全に逆転させることが可能である。しかしながら、この構成では、ＰＣ－リンカーの光切断された１－（２－ニトロフェニル）－エチル部分は質量レポーターに結合したままであり（図３には示されていない）、その結果、光切断された１－（２－ニトロフェニル）－エチル部分の様々な副反応副生成物に結合した質量レポーターに関連する複数のピークを含む非常に複雑な質量スペクトルが観察される（実験例５参照）。これはＭＳＩの感度を低下させ（多数の質量スペクトルピーク、すなわち当該副生成物の中の単一の質量レポーターに対するシグナルを分割することによって）、異なる質量レポーターの識別を混乱させる（例えば、ピークオーバーラップによって）。

【0097】

なお、フルオロフォアがＰＣ－ＭＴ上で必要に応じて使用される場合、質量レポーター領域上に配置されないことが好ましい。これにより、質量レポーターの質量分析検出に対するフルオロフォアからの潜在的な干渉が回避される（例えば、フルオロフォアは、光切断光によって構造的に変化し、それによって分析を混乱させる可能性がある）。しかしながら、場合によっては、蛍光によってＰＣ－ＭＴの光切断効率を定量するなどのために、フルオロフォアを質量レポーター上に配置することが有用であり得る。

【0098】

最後に、全体として、先の段落で論じたように、本発明は、プローブのタイプおよびＭＳＩに使用される質量分析のタイプに限定されない。したがって、より一般的には、本発明のＰＣ－ＭＴ－プローブベースのＭＳＩ技術は、ＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩと呼ばれる（そのうちの前述の質量分析ベースの免疫組織化学［ＭＩＨＣ］および質量分析ベースのインサイツハイブリダイゼーション［ＭＩＳＨ］の方法は、いくつかの多くの可能な方法論的サブタイプである）。

【0099】

ＰＣ－ＭＴ－プローブを使用したマルチオミック組織イメージング

【0100】

本発明の重要な利点は、組織検体のマルチオミックイメージングを実行する能力であり、「オミックス」は、細胞分子の大きなファミリーのいくつかの特徴の測定であり、そのような分子には、遺伝子（ゲノミクス）、タンパク質（プロテオミクス）、低分子代謝産物（メタボロミクス）、グリカン（グリコミクス）またはＲＮＡ（トランスクリプトミクス）が含まれるが、これらに限定されない［（２０１２）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｏｍｉｃｓ：Ｌｅｓｓｏｎｓ Ｌｅａｒｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐａｔｈ Ｆｏｒｗａｒｄ］。組織イメージングの場合、この測定された「特徴」は、例えば、これらの細胞分子の空間マッピング、形態学的分析、および共局在分析であってもよく、定量化（例えば、バイオマーカーレベルを定量すること、またはバイオマーカー陽性細胞の数をスコア化すること）も含み得る。したがって、マルチオミックスは、異なるオミック群（例えば、プロテオミクスおよびグリコミクスの組み合わせ）の測定および分析を組み合わせたものである。組織イメージングの文脈における本発明では、マルチオミクスは、例えば、ａ）異なるＰＣ－ＭＴ－プローブタイプまたはクラス（例えば、抗体およびレクチン）および／またはｂ）異なるＭＳＩ「モード」（例えば、内因性組織生体分子の非標的化直接的なＭＳＩならびに特異的ＰＣ－ＭＴ－プローブによって標的化される生体分子のＭＳＩ）を使用することによって達成することができる。好ましい実施形態では、異なるオミック測定が同じ組織切片に対して行われる。しかしながら、これらの測定は、同じ組織検体／ブロックからスライスした別々の、好ましくは連続した／隣接した組織切片に対して行うことも可能である。さらに、異なるオミック測定は、組織切片／標本に対して同時に（例えば、抗体およびレクチンなどの異なるＰＣ－ＭＴ－プローブクラスの混合物で組織を処理することによって、）または連続して（１つのオミック測定とそれに続く別のオミック測定）実施することができる。例えば、蛍光イメージングでは、これは、レクチンおよび抗体を使用した様々な方法論的並べ替えによって行われている［Ｚｕｐａｎｃｉｃ，Ｋｒｅｆｔら（２０２０）Ｅｕｒ Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ６４］。異なるオミック測定が組織検体に対して順番に実行される場合、本発明は、これらの測定が実行される順序に限定されるようには意図されておらず、これは、多くの並べ替えが、以下の段落で明らかになるような有用な結果をもたらし得るからである。

【0101】

最後に、組織の同時処理のために、レクチンプローブなどの糖質結合プローブを抗体プローブと組み合わせる場合、レクチンプローブと抗体プローブとの交差反応が組織イメージング結果を混乱させる可能性がある（例えば、組織の真の内因性バイオマーカーパターンを表さないアーチファクトを生成する）ことを避けるために、グリコシル化を欠く抗体プローブを使用することが重要であり得ることに留意すべきである。これは、例えば、グリコシル化Ｆｃドメインを欠く抗体、例えば限定されないが、Ｆａｂフラグメント抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント抗体、ナノボディ、シングレカインフラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体およびＶＨＨ単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科の単一ドメインＶＨＨ抗体）を使用して行うことができる。抗体グリコシル化が欠如している限り、Ｆｃドメインを含有する全抗体プローブは、限定されないが、組換え抗体（例えば、原核生物発現系において産生される場合）または化学的もしくは酵素的に脱グリコシル化された抗体（例えば、酵素ＰＮＧａｓｅ Ｆの使用）の使用を含めて、レクチンなどの炭水化物結合プローブと依然として同時に使用することができる。より広義には、異なるプローブクラスが同時組織処理のために組み合わされる場合、組織イメージングにおけるアーチファクトを回避するためにプローブの相互反応を回避するための措置を講じることが重要である。

【0102】

本発明におけるマルチオミクスは、分子分析に「ソフト」イオン化を用いるＭＳＩ法の使用によって促進されるが、これは、これらの方法が一般に分子断片化を引き起こさないか、または限定的に引き起こし、より具体的には検出のために分子を原子化しないからである（例えば、インタクトなペプチドまたはポリマーベースの質量タグ、ならびに脂質、薬物、または代謝産物などの組織中のインタクトな内因性生体分子の検出を可能にする）。ソフトイオン化法には、レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、ケイ素脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、高速原子／イオン衝撃（ＦＡＢ）、ならびにＤＥＳＩおよびＬＡＥＳＩなどの前述のＥＳＩの派生を含むエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）［Ｓｉｕｚｄａｋ（２００４）ＪＡＬＡ ９：５０－６３］が含まれるが、これらに限定されない。前述のリストは、本発明を特定のタイプの「ソフト」イオン化質量分析に限定することを意図していない。本発明の目的のために、「ソフト」イオン化に基づく方法は、分子イオン、すなわち、化学結合によって一緒に保持された２個またはそれを超える原子からなる帯電した分子をイオン化して検出する方法として定義される。

【0103】

二重連続ＭＳＩ：単純なマルチオミックの実施形態では、最初に内因性の小さな生体分子（例えば、メタボロミクス）の非標識直接的ＭＳＩを行い、続いてＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩを使用して、好ましくは同じ組織切片で標的化生体分子（例えば、プロテオミクスなどのタンパク質標的）のＭＳＩを行うことが有用である。標的化ＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩは、例えば、それ自体が十分にイオン化されない、十分に検出されない、ソフトイオン化であっても望ましくない様式で断片化する可能性がある、および／または質量分析計で十分に分解されない高分子標的など、直接的なＭＳＩに一般にアクセスできない生体分子を検出するために必要である。少なくともいくつかの既知のバイオマーカーを標的化することが望ましいかまたは必要である場合、マルチオミックワークフローにＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩを含めることも重要である。全体として、マルチオミック組織イメージングのこの実施形態は、例えば、薬物化合物（直接的非標識ＭＳＩによる小分子検出）および薬物標的（薬物標的は典型的にはタンパク質であるので、ＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩによる高分子検出）を共局在化するために重要であり得る。好ましい実施形態では、非標識直接的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩが最初に行われ、新鮮凍結（ＦＦ）組織切片を使用し、これにより、組織はまだ組織固定を受けていない（ホルマリン固定パラフィン包埋［ＦＦＰＥ］の使用は可能であるが、内因性分子の直接的非標識ＭＳＩにとってより理想的である［Ｗｉｓｚｔｏｒｓｋｉ，Ｆｒａｎｃｋら（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６５６：３０３－２２］）。好ましい実施形態では、次いで、組織切片を洗浄し、以前に行われていない場合は固定し、次いで、同じ組織切片に対して、別のサイクルのＭＳＩを含むＭＩＨＣおよび／またはＭＩＳＨなどのＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩ法を用いる。

【0104】

いくつかの実施形態では、最初に組織切片に対して非標識直接的ＭＳＩが行われ、例えば小さな生体分子を直接検出し、続いて同じ組織切片に対して標的化ＭＩＨＣおよび／またはＭＩＳＨを実施して高分子標的および／または核酸標的を検出することが有用である。これは、例えば、薬物化合物（直接的非標識ＭＳＩによる小分子検出）および薬物標的（標的化されたＰＣＭＴ－プローブベースのＭＳＩによる高分子検出）を共局在化するために重要であり得る。好ましい実施形態では、非標識直接的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩが最初に行われ、新鮮凍結組織切片を使用し、これにより、組織はまだ組織固定を受けていない（ＦＦＰＥは可能であるが、内因性分子の直接的非標識ＭＳＩにとってより理想的である［Ｗｉｓｚｔｏｒｓｋｉ，Ｆｒａｎｃｋら（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６５６：３０３－２２］）。好ましい実施形態では、次いで、残存するマトリックス化合物を除去するために組織切片を洗浄し（例えば有機溶媒中で）、次いで、ＭＩＨＣおよび／またはＭＩＳＨ、続いて、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの別のサイクルを上記のように同じ組織切片に対して行う。より詳細については、実験例４を参照されたい。

【0105】

本発明は、分子分析のために「ソフト」イオン化を用いる質量分析法の使用によって促進されるが、これは、これらの方法が一般に分子断片化を引き起こさないか、または限定的に引き起こし、より具体的には検出のために分子を原子化しないからである（例えば、ペプチドまたはポリマーベースの質量タグならびに組織内の内因性生体分子の検出を可能にする）ことに留意されたい。そのような方法には、レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、ケイ素脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、高速原子／イオン衝撃（ＦＡＢ）、およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析［Ｓｉｕｚｄａｋ（２００４）ＪＡＬＡ ９：５０－６３］が含まれるが、これらに限定されない。前述のリストは、本発明を特定のタイプの「ソフト」イオン化質量分析に限定することを意図していない。本発明の目的のために、「ソフト」イオン化に基づく方法は、分子イオン、すなわち、化学結合によって一緒に保持された２個またはそれを超える原子からなる帯電した分子を検出することができる方法として定義される。

【0106】

別の好ましいマルチオミックの実施形態では、標的ＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩ法は、非標的化「ボトムアップ」オミクス法と組み合わされる。

【0107】

ボトムアップオミクスは、生体分子が最初に質量分析によりアクセスしやすいより小さな断片に分解（消化）されるという事実を指す。続いて、生体分子全体の同一性および構造を質量分析から推定することができる。他のボトムアップシナリオでは、様々な質量種のフィンガープリント（高精度で測定される）のみが、例えば疾患状態または病期と相関し得るので、生体分子の同一性を知る必要はない。ボトムアップ組織ＭＳＩの文脈では、組織は、質量分析によりアクセスしやすい生体分子断片を遊離させるために消化剤で処理される。例えば、図２２を参照されたい。典型的には、消化剤は、分析物の非局在化を伴わない消化、いわゆるインサイツ消化を促進するために、薄膜中の組織に噴霧される。しかしながら、十分な消化と最小限の非局在化との間のバランスを達成することは困難であり、おそらく完全なバランスは存在しない。これらの消化剤は、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）、プロテアーゼ（例えば、キモトリプシン、トリプシン、ＬｙｓＣまたはＡｓｐＮ）、キナーゼ（例えば、ＰＫＣ）、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、またはグリコシダーゼ（例えば、ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ［ＰＮＧａｓｅ Ｆ］）などの酵素であってもよく、または臭化シアン（ＣＮＢｒ）もしくはヒドロキシルアミンなどの化学薬剤であってもよい［Ｇｕｎｄｒｙ，Ｗｈｉｔｅら（２００９）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １０：Ｕｎｉｔ １０ ２５、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｗｉｔｈｅｒら（２０１７）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ １６：４１７７－４１８４］。インサイツ組織消化とそれに続くＭＳＩは以前に報告されている。例えば、Ｄｒａｋｅら［Ｄｒａｋｅ，Ｐｏｗｅｒｓら（２０１８）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ９４：ｅ６８］は、グリコシダーゼＰＮＧａｓｅ ＦをＦＦおよびＦＦＰＥ組織に噴霧して、組織中のタンパク質からＮ結合グリカンを酵素的に切断し、続いて遊離グリカンのＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行った。消化剤としてプロテアーゼを使用するこの場合の他の例としては、特定のタンパク質タイプまたはトリプシンを消化して一般的なタンパク質消化を達成するためのコラゲナーゼの使用が挙げられる［Ａｎｇｅｌ，Ｓｃｈｗａｍｂｏｒｎら（２０１９）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎ Ａｐｐｌ １３：ｅ １７００１５２、Ｌａｚｏｖａ，Ｓｍｏｏｔら（２０２０）Ｊ Ｃｕｔａｎ Ｐａｔｈｏｌ ４７：２２６－２４０］。

【0108】

マルチオミック組織イメージングアプローチのためにボトムアップＭＳＩがＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩと組み合わされる場合、本発明は特定の操作順序に限定されることを意図しない。例えば、ＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩは、ボトムアップＭＳＩの前または後に実行されてもよい（両方の選択肢は２回のＭＳＩを必要とする）。逆に、組織をＰＣ－ＭＴ－プローブで染色し、次いで、インサイツ消化を実施し、続いてＭＳＩを１回だけ行うことができる。ＰＣ－ＭＴ－ＭＳＩが最初に実行される場合、プローブが後続のボトムアップＭＳＩと干渉する可能性がある場合、ＰＣ－ＭＴ－プローブを後で除去することが望ましい場合がある。そうするために、まず変性処理によってプローブを組織から分離し、次いでプローブを洗い流すことができる。そのような変性処理には、カオトロピック剤、ｐＨ≦５の溶液、ｐＨ≧１０の溶液、還元剤、酸化剤、熱、有機溶媒、および／または界面活性剤（例えば、ＳＤＳなどのイオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００などの非イオン性界面活性剤、またはＣＨＡＰＳなどの双性イオン性界面活性剤）が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、図２２を参照されたい。

【0109】

上記は広範囲のマルチオミック方法論的並べ替えを包含するが、インサイツプロテアーゼまたはグリコシダーゼ消化を使用する２つの具体例が実験例１５に提供されていることに留意されたい。

【0110】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0111】

網掛けされた（太字の）行は、可変ＭＡＬＤＩ－ＭＳイオン化効率を最小にするために使用される質量ユニット１または質量ユニット１の変形である。括弧内の文字は、表１．１に示す安定同位体アミノ酸を表す。

【0112】

^＊質量ユニットはａ－アミン上でＮ末端アセチル化されており、質量レポーター質量は、このアセチル化＋質量ユニットおよび光切断されたＰＣ－リンカーの小部分を含む（図３の工程３参照）。

【0113】

【表1.1】

【0114】

実験

【0115】

実験例の材料。

【0116】

水（ＬＣＭＳグレード）およびキシレン（半導体グレード）は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（ペンシルバニア州ピッツバーグ）から入手した。メタノール（ＬＣＭＳグレード）は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（ペンシルベニア州ラドナーのＡｖａｎｔｏｒ）から入手した。エタノール（分子生物学用生体試薬）、アセトン（ＨＰＬＣグレード）、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（無水、≧９９．８％）、１，５－ジアミノナフタレン（ＤＡＮ、９７％）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ、９８．０％）、イソプロピルアルコール（分子生物学用生体試薬）、塩化ナトリウム（ＢｉｏＸｔｒａ、≧９９．５％）、重炭酸ナトリウム（９９．７％～１００．３％、試験された分子生物学）、重炭酸アンモニウム（ＢｉｏＵｌｔｒａ、≧９９．５％）、ウシ血清アルブミン（熱ショック画分、プロテアーゼフリー、脂肪酸フリー、本質的にグロブリンフリー、ｐＨ７、≧９８％）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＢｉｏＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ、ｐＨ７．４、Ｐ５３６８）、グリシン（分子生物学用ウルトラ、≧９９％、Ｆｌｕｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ）、パラホルムアルデヒド（粉末、９５％）、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０、１０×、Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ）、５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（５－ＥＴＴ、９５％）、１－メチルイミダゾール（ＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ、９９％）、ホルムアミド（分子生物学用バイオ試薬、≧９９．５％）、パン酵母からのＲＮＡ、ｔＲＮＡ、デンハルト溶液（５０×５ｍＬ）、Ａｔｔｏ－６４７Ｎ－ＮＨＳエステルおよびオクチルＢ－Ｄ－グルコピラノシド（ＯＢＧ）（５０％［ｗ／ｖ］ストック溶液）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手し、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０ ＮＨＳエステル、抗ストレプトアビジン抗体クローンＳ３Ｅ１１、ヒドロキシルアミン、２０ｋＤａ膜を有するＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）０．１ｍＬ ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅｓおよびビオチン化プロテインＧは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州ウォルサム）から入手した。ＣＨＡＰＳ（粉末、≧９８％、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｓａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ ＳｏｌｕｔｉｏｎおよびＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｃｕｒｅ－Ｓｅａｌ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒｓ（１ウェル、２２ｍｍ×５３ｍｍ×０．６ｍｍ深さ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニューハンプシャー州ハンプトン）から入手した。トリスＨＣｌおよびトリス塩基（分子生物学グレード）、５Ｎ塩化ナトリウム（分子生物学グレード）、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８、分子生物学グレード）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（分子生物学グレード）、ＳＳＣ緩衝液２０×（分子生物学グレード）およびヌクレアーゼフリー水はＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から入手した。抗原賦活化Ｒｅａｇｅｎｔ－Ｂａｓｉｃ（ＣＴＳ０１３）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。金被覆顕微鏡スライド（Ａｕ－５００Ａ）は、Ａｎｇｓｔｒｏｍ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．（カナダオンタリオ州キッチナー）から入手した。マウスＣ５７脳の矢状方向のＦＦＰＥ切片（５μｍ厚）およびマウスＣ５７脳の矢状方向の新鮮凍結（ＦＦ）切片（２％ｗ／ｖのＣＭＣに埋め込まれ、１０ｐｍ厚）を、Ｚｙａｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。ＦＦＰＥヒト扁桃組織ブロックは、ａｍｓｂｉｏ ＬＬＣ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手し、ＦＦＰＥヒト乳癌組織ブロックは、ＯｒｉＧｅｎｅ（メリーランド州ロックビル）から入手した。ＦＦＰＥ組織ブロックを、薄切片化（厚さ５μｍ）およびスライド上にマウントするためにＺｙａｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）に送った。マウス脳切片のマルチプレックスイメージングのための抗体を以下のように様々な供給業者から入手し、抗ミエリン塩基性タンパク質抗体（ＭＡＢ４２２８２）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｅ（ミネソタ州ミネアポリス）から、抗ＮｅｕＮ抗体（ＭＡＢ３７７）および抗シナプシン２抗体（ＭＡＢＮ１５７３）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（マサチューセッツ州バーリントン）から、抗ＧＬＵＴ１抗体（ＰＡ１４６１５２）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニューハンプシャー州ハンプトン）から入手し、抗ＭＡＰ２抗体（ａｂ１１２６８）、組換え抗ＮｅｕＮ抗体（ａｂ２０９８９８）および組換え抗Ｃａｓ９（ａｂ２１８６５４、ＢＳＡおよびアジドフリー）、組換え抗汎サイトケラチン抗体［Ｃ－１１］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２６４４８５）、組換え抗ＣＤ３レプシロン抗体［ＣＡＬ５７］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２５１６０７）、組換え抗ＣＤ４抗体［ＥＰＲ６８５５］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ１８１７２４）、組換え抗ＣＤ８アルファ抗体［ＣＡＬ６６］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２５１５９６）、組換え抗ＣＤ２０抗体［ＥＰ４５９Ｙ］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２１４２８２）、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体［ＵＣＨ－Ｌ１］（ａｂ２３）、組換え抗エストロゲン受容体アルファ抗体［ＳＰ１］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ１８７２６０）、組換え抗プロゲステロン受容体抗体［ＹＲ８５］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２０６９２６）、組換え抗ＥｒｂＢ２抗体［ＣＡＬ２７］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２５１６０２）、組換え抗ヒストンＨ２Ａ．Ｘ抗体［ＥＰＲ２２８２０－２３］－ＣｈＩＰグレード－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２５６５４４）、組換え抗ＣＤ６８抗体［ＥＰＲ２０５４５］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２２７４５８）、ならびに組換え抗Ｋｉ６７抗体［ＥＰＲ３６１０］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２０９８９７）は、Ａｂｅａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手した。マウスＩｇＧ全分子（０１５－０００－００３）、正常マウス血清（０１５－２２２－００１）、ウサギＩｇＧ全分子（０１１－０００－００３）および正常ウサギ血清（０１１－０００－００１）は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ペンシルバニア州ウエストグローブ）から入手した。特定のビーズアレイ実験のために、組換え抗βアミロイド１－４２抗体（ａｂ２２４２７５）および組換え抗ミエリン塩基性タンパク質抗体（ａｂ２３０３７８）は、ＢＳＡおよびアジドフリーであり、Ａｂｅａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手した。Ｕ６－アミンカスタムＬＮＡオリゴヌクレオチド（３３９４０６ ＹＣ００１９１７０４）、センスｍｉＲ－１５９－アミンカスタムＬＮＡオリゴヌクレオチド（３３９４０６ ＹＣ００１９１７０５）およびＦＦＰＥ用のｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ ＩＳＨ緩衝液セットは、Ｑｉａｇｅｎ（メリーランド州ジャーマンタウン）から入手した。ストレプトアビジンで被覆された２０μｍおよび３７μｍのＰＭＭＡビーズ（ミクロスフェア）は、Ｐｏｌｙ Ａｎ ＧｍｂＨ（ドイツ、ベルリン）から入手した。０．５ｍＬ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ０．４５μｍフィルターデバイスはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（マサチューセッツ州バーリントン）から入手した。ＮＡＰ－５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラムおよびＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ－２５カラムはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ペンシルバニア州ピッツバーグ）から入手し、以下、４－［４－［１－（９－Ｆｍｏｃ－アミノ）エチル］－２－メトキシ－５－ニトロフェノキシ］ブタン酸と呼ばれる４－［４－［１－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）エチル］－２－メトキシ－５－ニトロフェノキシ］ブタン酸は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（テキサス州ダラス）から入手した。ＦｌｅｘＷｅｌｌ（商標）１６チャンバ自己接着性ガスケット（２０４９１６）は、Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ（オレゴン州ベンド）から入手した。

【0117】

実施例１。モデルシステムとしてビーズアレイを使用する１５プレックスＰＣ－ＭＴ－ＡｂベースのＭＳＩ。

【0118】

ＰＣ－ＭＴ。

【0119】

ペプチドベースのＰＣ－ＭＴは、標準的なＦｍｏｃアミノ酸固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して生成した［Ｂｅｈｒｅｎｄｔ，Ｗｈｉｔｅら（２０１６）Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ ２２：４－２７］。Ｆｍｏｃ保護された光切断可能なアミノ酸リンカー（図３のＦｍｏｃ－ＰＣ－リンカーを参照）を、他のアミノ酸と同じ様式でペプチド鎖に導入し、標準的な手順を使用してペプチドのＮ末端ａ－アミンを無水酢酸でアセチル化した。ＮＨＳ－エステルプローブ反応性部分は、スペーサーユニットに含まれるリジン（Ｋ）のｓ－アミン上に作成された。（図３の工程１、ＮＨＳ－エステルを参照）リジン（Ｋ）のｓ－アミンのＮＨＳ－エステルへの変換は、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）を用いて達成した。ＤＳＳまたはＤＳＣ（ジスクシンイミジルカーボネート）などの二官能性スクシンイミジルエステルの使用は、第一級アミンのＮＨＳエステルへの変換について以前に報告されている［Ｍｏｒｐｕｒｇｏ，Ｂａｙｅｒら（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３８：１７－２８］。合成後、Ｏｎｙｘ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｃ１８カラムおよびアセトニトリル溶媒系中、Ｈ_２Ｏ中０．０５％ＴＦＡ／アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡを使用して、ＰＣ－ＭＴをＨＰＬＣ精製した。例示的なＰＣ－ＭＴの化学構造が図３に示されている。１５個の異なるＰＣ－ＭＴが作製され、質量ユニットのアミノ酸配列が図３に示されたものとのみ異なる。１５個の異なる質量ユニット配列を表１（ＩＤ１、２～３および５～１６）ならびに質量レポーターのモノアイソトピック質量に列挙し、これは図３（工程プ３）に示すように、Ｎ末端アセチル化、ペプチド質量ユニットおよび光切断されたＰＣ－リンカーの小部分を含む。

【0120】

場合によっては、追加のリジンをＰＣ－ＭＴのスペーサーユニットに含め、市販のアミン反応性試薬（例えば、メリーランド州ハントバレーのＬｕｍｉｐｒｏｂｅ製のＳｕｌｆｏ－Ｃｙ５－ＮＨＳ）を使用してフルオロフォアで修飾した。この場合、スペーサーユニットのアミノ酸配列は、非蛍光ＰＣ－ＭＴのＧＳＧＧ［Ｋ－ＮＨＳ］ではなく、ＧＳ［Ｋ－Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ５］ＧＧ［Ｋ－ＮＨＳ］であった。

【0121】

ＰＣ－ＭＴ抗体（ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ）の調製

【0122】

１００ｐＬの抗体溶液（ＰＢＳ中１μｇ／μＬ）に１／９容量のＩＭ重炭酸ナトリウムを補充し、続いて、抗体に対して１０倍モル過剰になるように無水ＤＭＦ中の１ｍＭストックから十分なＰＣ－ＭＴを添加した。光から保護し、穏やかに混合しながら反応を１時間行った。次いで、１／９体積のＩＭグリシンによって反応をクエンチし、続いて光から保護して１５分間混合した。最後に、１／１９９体積の１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ担体ストック水溶液を添加し、最終的に０．０５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）とした。未反応ＰＣ－ＭＴを除去するために、得られたＰＣ－ＭＴ抗体（ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ）を、予備平衡化緩衝液としてＴＢＳ（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して製造者の指示に従ってＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ－２５カラムで処理した。得られたＰＣ－ＭＴ－Ａｂにさらに１／９体積の１０×ＴＢＳを添加した。場合によっては、ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを、２０ｋＤａ膜を有するＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）０．１ｍＬ ＭＩＮＩ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅｓを使用してＴＢＳに対して広範囲に透析することによって精製した。

【0123】

ビーズ－アレイ

【0124】

ストレプトアビジンで被覆された２０ミクロンのＰＭＭＡビーズは、特に明記しない限り、０．５ｍＬ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ０．４５μｍフィルターデバイス中で処理した（洗浄は、フィルターデバイス中でビーズ懸濁液の３秒間のボルテックス混合によって行い、溶液からビーズを分離するための濾過は、標準的な微量遠心機で１５，０００ｒｐｍで５秒間行った）。各ＰＣ－ＭＴ－Ａｂバージョンについて、特に明記しない限り、１０，０００個のビーズを使用し、別々に処理した。最初に４００μＬのビーズブロック緩衝液（ＴＢＳ－Ｔ中１％ＢＳＡ［ｗ／ｖ］、ＴＢＳ－Ｔは、０．０５％［ｖ／ｖ］のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０が補充されたＴＢＳであることに留意されたい）で４回、ビーズを洗浄した。次いで、ビーズを１５種類の異なるバージョンの抗ストレプトアビジンＰＣ－ＭＴ－Ａｂで別々にプローブし、各ＰＣ－ＭＴ－Ａｂバージョンは異なるＰＣ－ＭＴ種（すなわち、異なる質量ユニット－ＩＤ１、２～３および５～１６を有する質量ユニットについては表１を参照）を保有していた。ＰＣ－ＭＴ－Ａｂをビーズブロック緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、穏やかに混合しながら１００μＬを使用して１時間プロービングを行った。次いで、４００μＬのＴＢＳ－Ｔで４回、ビーズを洗浄した後、１５種類の異なるビーズバージョンをすべてプールした。次いで、４００μＬの質量分析グレードの水（ＭＳ－Ｗａｔｅｒ）でさらに４回、プールしたビーズを洗浄した。標準的な顕微鏡スライドのフットプリントを有する酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）被覆マイクロウェル基材上のビーズアレイ形成を、以前に報告されたように行った［Ｌｉｍ，Ｌｉｕら（２０１４）Ｒａｐｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＲＣＭ ２８：４９－６２、Ｚｈｏｕ，Ｌｉｕら（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２６１２５］。

【0125】

光切断

【0126】

基材を最終的に真空乾燥チャンバ内で４５分間乾燥させ、モデルＸＸ－１５ランプ（カリフォルニア州アップランドのＵＶＰ／Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＵＳ ＬＬＣ）を使用して、５ｃｍの距離で３６５ｎｍの光で約３ｍＷ／ｃｍ^２照明した。あるいは、基材を、ＬＥＤ Ｃｕｂｅ １００ ＩＣ（マサチューセッツ州マルボロのＨｏｎｌｅ ＵＶ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して３６５ｎｍの光で約３０ｍＷ／ｃｍ^２照明した。特に明記しない限り、５分間の光処理を使用した。

【0127】

マトリックス適用

【0128】

次に、ＤＨＢまたはＤＡＮマトリックスを昇華によって乾燥した基材に適用し、続いて公開された報告に従って再結晶した［Ｈａｎｋｉｎ，Ｂａｒｋｌｅｙら（２００７）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １８：１６４６－５２、Ｄｕｅｎａｓ，Ｃａｒｌｕｃｃｉら（２０１６）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２７：１５７５－８］。

【0129】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳイメージング（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）

【0130】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳイメージング（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）は、以下のパラメータである、リフレクタモード、それぞれ１０μｍまたは２０μｍの連続ラスタ走査を伴うレーザースポットサイズ１０μｍまたは２０μｍ、３００～５００レーザーショット／ピクセル、および場合によっては総イオンカウント（ＴＩＣ）に正規化を使用してｒａｐｉｆｌｅＸ ＭＡＬＤＬＴＯＦ－ＭＳ装置（マサチューセッツ州ビレリカのＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）で達成された。画像およびスペクトル分析は、ｆｌｅｘｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（マサチューセッツ州ビレリカのＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して行った。

【0131】

結果

【0132】

図６の結果（挿入画像）は、ビーズアレイのＭＡＬＤＩ－ＭＳ「質量画像」を示す。挿入画像における異なる色は、特定のＰＣ－ＭＴ質量レポーター（ＩＤ１、２～３および５～１６を有する質量レポーターの予想質量については表１を参照）についてのモノアイソトピック質量スペクトルピークの異なるｍ／ｚ値に対応する。アレイ中の別個の２０μｍビーズに結合したＰＣ－ＭＴ－Ａｂプローブに由来する１５種類の異なる質量分解能の質量レポーター種が観察される。アレイ内の代表的な単一ビーズからの色分けされたオーバーレイＭＡＬＤＩ－ＭＳＩスペクトル（図６、黒色矢印）は、ビーズ間の「クロストーク」を示さない。

【0133】

実施例２。マウス脳の矢状方向のＦＦＰＥ組織切片に対するＰＣ－ＭＴ－Ａｂを使用した５プレックスＭＩＨＣ。

【0134】

ＰＣ－ＭＴ－Ａｂによる免疫染色

【0135】

ＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ａｂを実施例１のように調製し、ＭＩＨＣにおいて以下のように使用し、脱パラフィンおよび水和のために、ＦＦＰＥ組織切片を以下のように（各処理工程を別々の染色ジャーで）処理した。キシレンで各５分間を３回、キシレン：エタノール（１：１）で３分間を１回、次いで、１００％エタノールで各２分間を２回、９５％エタノールで各３分間を２回、７０％エタノールで３分間を１回、５０％エタノールで３分間を１回、およびＴＢＳで１０分間を１回、水和させる。

【0136】

抗原賦活化は、２００ｍＬの１×クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０、材料を参照）中、ビーカー中で９５℃の水浴中で１時間予熱し、同じビーカー中で室温で３０分間冷却して達成した。次いで、スライドを染色ジャー内で５０ｍＬの組織ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ－Ｔ中２％［ｖ／ｖ］正常血清［ウサギおよびマウス］および５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ＴＢＳ－Ｔは０．０５％［ｖ／ｖ］のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０が補充されたＴＢＳであることに留意されたい）で１時間ブロッキングした。ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ染色のために、スライドを、組織ブロッキング緩衝液で希釈した２．５μｇ／ｍＬの各抗体を含有する２００ｐＬ／切片の溶液で４℃で一晩処理した（インキュベーションは、光から保護され、加湿チャンバ内で蒸発を回避し、各組織切片を疎水性バリアペンで囲んで流体を保持して行った）。

【0137】

次に、スライドを以下のようにそれぞれＴＢＳで５分間を３回洗浄した後、それぞれ５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで２分間を３回洗浄した（すべての溶液はＬＣＭＳグレードの水中にあり、すべての洗浄は過剰の溶液を使用して行い、スライドをペトリ皿に水平に置き、穏やかに振盪したことに留意）。

【0138】

最後に、実施例１と同様に、光切断、マトリックス適用およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行った。

【0139】

場合によっては、ＰＣ－ＭＴ－Ａｂによる染色の代わりに免疫蛍光法を行ったことに留意されたい。これらの場合、ＰＣ－ＭＴで標識された抗体の代わりに、１５倍モル過剰のＤｙＬｉｇｈｔ ６５０ ＮＨＳエステル試薬（ＤＭＦ中５ｍＭストックから添加）で標識された抗体を使用した（そうでなければ、実施例１においてＰＣ－ＭＴ－Ａｂについて先に記載された同じ標識手順を使用した）。さらに、光切断、マトリックス適用およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは行わず、代わりに、乾燥スライドのイメージングをＧｅｎｅＰｉｘ ４２００Ａ蛍光スキャナー（カリフォルニア州サンノゼのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で５μｍの解像度で行った。他のすべての手順は、この実施例においてＭＩＨＣについて記載されたものと同じであった。

【0140】

結果

【0141】

５プレックスＭＩＨＣを、マウス脳のＦＦＰＥ矢状方向切片に対して行った。この目的のために、異なるＰＣ－ＭＴを１工程で抗体に直接コンジュゲートした。５つの抗体は、ミエリン塩基性タンパク質（周知の軸索鞘マーカー、例えば［ｖａｎ Ｔｉｌｂｏｒｇ，ｖａｎ Ｋａｍｍｅｎら（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１６４９２］）、ＮｅｕＮ（ニューロン核マーカー、例えば［Ｇｕｓｅｌ’ｎｉｋｏｖａおよびＫｏｒｚｈｅｖｓｋｉｙ（２０１５）Ａｃｔａ Ｎａｔｕｒａｅ ７：４２－７］）、シナプシン（シナプスタンパク質、例えば［Ｍａｓｏｎ（１９８６）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９：１３１９－３３］）、Ｇｌｕｔ－１（脳組織の毛細血管に豊富［Ｔａｎｇ，Ｇａｏら（２０１７）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８：１４１５２］）およびＭＡＰ－２（神経組織に存在する微小管関連タンパク質、例えば［Ｗｉｃｈｅ，Ｂｒｉｏｎｅｓら（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ ２：１９１５－２０］）を標的とした。ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは、１０μｍの空間分解能で社内のＢｒｕｋｅｒ ｒａｐｉｆｌｅＸ ＭＳＩ機器で達成された。図７ａは、全脳切片の５色ＭＡＬＤＩ－ＭＳ「質量画像」を示す。異なる色は、特定のＰＣ－ＭＴのモノアイソトピック質量スペクトルピークの異なるｍ／ｚ値に対応する。ミエリン（赤色）、ＮｅｕＮ（緑色）およびシナプシン（青色）が最も優勢であり、最も明確な構造パターンを生じる。例えば、ＮｅｕＮは、海馬の明確な「旋回」パターン（^＊で示される）を生成する。さらに、ミエリン、ＮｅｕＮおよびシナプシンは、小脳の３つの異なる層（Ｉで示される）を強調している。合成カラー画像に隠されたあまり明確でないバイオマーカーは、単色画像として最もよく見ることができる。例えば、図７ｃは、Ｇｌｕｔ－１バイオマーカーの単色スタンドアロンＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像を示す（主に脳の毛細血管の断面を示す）。ＭＡＰ－２は、脳切片のかなり均一な染色をもたらす（スタンドアロン画像として示されていない）。さらに、同じＰＣ－ＭＴを有する種一致非免疫アイソタイプコントロール免疫グロブリンは、ＭＡＬＤＩ－ＭＳシグナルを示さない（図示せず）。ＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像の選択されたピクセル（これらのピクセルは図７ａにおいて矢印で示されている）について、色分けされたオーバーレイ質量スペクトルが示されている（図７ｅ）。最後に、ＭＩＨＣの結果は、従来の免疫蛍光と明らかに一致する。例えば、フルオロフォアのみで直接標識されたミエリン、ＮｅｕＮおよびシナプシン抗体を使用すると、小脳（図７ｂ）においてＭＩＨＣと同じパターンが生成される。Ｇｌｕｔ－１のＭＡＬＤＩ－ＭＳパターンもまた、免疫蛍光によって一致する（図７ｄ）。

【0142】

実施例３。ＦＦＰＥ組織切片に対するＰＣ－ＭＴ－ＮＡ ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いたＭＩＳＨ

【0143】

ＰＣ－ＭＴ核酸（ＰＣ－ＭＴ－ＮＡ）の調製

【0144】

アミン修飾ロック核酸（ＬＮＡ）プローブ（材料を参照）を以下のようにＰＣ－ＭＴで標識した。１００μＬのＬＮＡプローブ溶液（２００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２００ｍＭ重炭酸ナトリウム中１０μＭ）に、ＬＮＡプローブに対して２００倍モル過剰になるように、無水ＤＭＦ中の１０ｍＭストックから十分なＰＣ－ＭＴを添加した（１０ｍＭストック２μＬを３０分ごとに添加して合計５回添加した）。光から保護し、穏やかに混合しながら反応を合計２．５時間行った。未反応ＰＣ－ＭＴを除去するために、得られたＰＣ－ＭＴ－ＮＡを、予備平衡化緩衝液としてＴＥ－１５０ｍＭ ＮａＣｌ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して、製造者の指示に従ってＮＡＰ－５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラムで処理した。

【0145】

ＰＣ－ＭＴ－ＮＡによるインサイツハイブリダイゼーション

【0146】

脱パラフィンおよび水和のために、ＦＦＰＥ組織切片を実施例２と同様に処理した。以下の手順をＲｅｎｗｉｃｋら［Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｃｅｋａｎら（２０１３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３：２６９４－７０２］から適合させた。プロテイナーゼＫ消化、ＥＤＣ固定およびアセチル化によるインサイツハイブリダイゼーションのために組織切片を調製した。プロテイナーゼＫ消化のために、ＦＦＰＥ用のｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ ＩＳＨ緩衝液セット（材料を参照）からの１．５μＬのプロテイナーゼＫストック溶液をプロテイナーゼＫ緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＣｌ）で２．０ｍＬに希釈し、３００μＬを各組織切片と共に３７℃で１０分間インキュベートした。プロテイナーゼＫ消化後、組織切片をそれぞれＰＢＳ中の０．２％（ｗ／ｖ）グリシンで１０分間を２回洗浄した。ＥＤＣ固定のために、組織切片を０．１Ｍ １－メチルイミダゾール溶液中でそれぞれ２回、３分間前処理し、次いで２００μＬのＥＤＣ固定溶液で１時間処理した（１．０ｍＬの０．１Ｍ ５－ＥＴＴおよび０．１Ｍ １－メチルイミダゾールを１０ｍｇのＥＤＣ ＨＣｌバイアルに添加することによって新たに調製し、１０Ｍ ＮａＯＨでｐＨを８．０に調整する）。ＥＤＣ固定後、組織切片をＰＢＳ中０．２％（ｗ／ｖ）グリシンで１０分間洗浄した。アセチル化のために、１４９μＬのトリエタノールアミン、２μＬのＨＣｌ（３７％）および５μＬの無水酢酸を８４６μＬのヌクレアーゼフリー水に添加することによってアセチル化溶液を新たに調製し、２００μＬを各組織切片と１０分間インキュベートした。アセチル化後、組織切片を過剰のＰＢＳ中で３分間洗浄した。次に、切片を、加湿チャンバ中、２５℃で１時間、５０％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１×デンハルト溶液、２５０μｇ／ｍＬパン酵母ｔＲＮＡ、５００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、５ｍＭ ＣＨＡＰＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０で構成される１５０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液中で予備ハイブリダイゼーションした。予備ハイブリダイゼーション後、自己接着性ハイブリダイゼーションチャンバをスライド上に置いた（２２ｍｍ×５３ｍｍ×０．６ｍｍ／チャンバ）。ハイブリダイゼーションのために、ＰＣ－ＭＴ Ｕ６および１５９ ＬＮＡプローブをハイブリダイゼーション緩衝液中で２００ｎＭに希釈し、組織切片を加湿チャンバ（光から保護）中５５℃で一晩インキュベートした。次いで、組織切片を５×ＳＳＣ緩衝液中で５分間を１回、それぞれ１×ＳＳＣ緩衝液中で５分間を２回および０．２×ＳＳＣ緩衝液中で５分間を１回、５５℃で洗浄し、０．２×ＳＳＣ緩衝液中で５分間を１回、室温で洗浄した。

【0147】

次に、スライドを以下のようにそれぞれＴＢＳで５分間を３回洗浄した後、それぞれ５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで２分間を３回洗浄した（すべての溶液はＬＣＭＳグレードの水中にあり、すべての洗浄は過剰の溶液を使用して行い、スライドをペトリ皿に水平に置き、穏やかに振盪したことに留意）。

【0148】

最後に、実施例１と同様に、光切断、マトリックス適用およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行った。

【0149】

場合によっては、ＰＣ－ＭＴ－ＮＡによる染色の代わりにＦＩＳＨを行ったことに留意されたい。これらの場合、ＰＣ－ＭＴで標識された核酸の代わりに、Ａｔｔｏ－６４７Ｎ－ＮＨＳエステル試薬で標識された核酸を使用した（そうでなければ、ＰＣ－ＭＴ－ＮＡについて本実施例で前述したのと同じ標識手順を使用した）。さらに、光切断、マトリックス適用およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは行わず、代わりに、乾燥スライドのイメージングをＧｅｎｅＰｉｘ ４２００Ａ蛍光スキャナー（カリフォルニア州サンノゼのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で５μｍの解像度で行った。他のすべての手順は、この実施例においてＭＩＳＨについて記載されたものと同じであった。

【0150】

結果

【0151】

ＭＩＳＨを実証するために、アミン反応性ＮＨＳ活性化ＰＣ－ＭＴ標識試薬を５’アミン末端ＬＮＡハイブリダイゼーションプローブに直接コンジュゲートした（ＬＮＡ＝より良好な親和性のためのロック核酸［ＶｅｓｔｅｒおよびＷｅｎｇｅｌ（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１３２３３－４１、Ｓｅｍｐｅｒｅ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：１１６１２－２０、ＲｏｂｅｒｔｓｏｎおよびＴｈａｃｈ（２００９）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３９０：１０９－１４、Ｎｉｅｌｓｅｎ（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ８２２：６７－８４、Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｃｅｋａｎら（２０１３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３：２６９４－７０２、Ｋａｓａｉ，Ｋａｋｉｈａｒａら（２０１６）Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ９：１２６、Ｌｅｉ，ｖａｎ Ｍｉｌら（２０１８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｒｅｐ（Ａｍｓｔ）１８：ｅ００２５５］）。次いで、プローブを使用してマウス脳の矢状方向の組織切片を染色し、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行った。プローブは、ｍｉＲＮＡ ＦＩＳＨにおいて陽性対照として一般的に使用されるｓｎＲＮＡであるＵ６、および陰性対照植物特異的配列であるｍｉＲ－１５９であった［Ｌｅｉ，ｖａｎ Ｍｉｌら（２０１８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｒｅｐ（Ａｍｓｔ）１８：ｅ００２５５］。図８の結果は、Ｕ６プローブを用いたＭＩＳＨが、従来のＦＩＳＨ法と同様の組織染色パターンを生成する一方で、陰性対照ｍｉＲ－１５９プローブは、感知できるほどの染色パターンを生成しないことを示している。

【0152】

実施例４。マルチオミックＭＳＩ：同じＦＦ組織切片上の脂質の非標的化非標識ＭＳＩおよび標的化ＭＩＨＣ

【0153】

ＦＦ組織切片上の非標的化非標識直接的ＭＳＩ

【0154】

未処理の新鮮凍結（ＦＦ）組織切片を最初に、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩによって非標的化様式で直接分析した（組織切片を解凍し、実施例２［この場合はＤＡＮマトリックス］のようにマトリックス適用のみを行った後）。

【0155】

同じＦＦ組織切片上のＭＩＨＣ

【0156】

次に、ＦＦ組織切片では脱パラフィン処理は必要ではなかったが、次のようにしてパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定を行った（各処理工程は別々の染色ジャーで）。冷アセトンで３分間、予備洗浄を２回行い（溶媒固定を提供しながら、以前のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩから残りのマトリックス化合物を除去するのに役立つことに留意）、１０分間風乾し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１％ＰＦＡを使用して１０分間固定し（この溶液は、１．０ｇのＰＦＡを、１．０ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨを含む６０ｍＬのＰＢＳに約６０℃の加熱ブロックで絶えず撹拌しながら溶解し、続いて１Ｍ ＨＣｌ［約１ｍＬ］でｐＨを７．４に調整し、ＰＢＳで最終容量を１００ｍＬに調整することによって新たに調製したことに留意）、ＰＢＳで１０分間、１回洗浄する。ＰＣ－ＭＴ－ＡｂベースのＭＩＨＣの残りの工程は、抗原賦活化工程から最後まで実施例２と同様に行った。

【0157】

結果

【0158】

同じ組織切片上で非標的化非標識小分子およびＰＣ－ＭＴ－Ａｂ標的化巨大分子の両方を検出できることは非常に有利であろう。例えば、これにより、小分子薬物とその受容体などの薬物標的、ならびに薬物に対する細胞応答に関与する関連生体分子の共局在が可能になる。この能力の基本的な実現可能性を実証するために、本発明者らはまず、新鮮凍結マウス脳の矢状方向の組織切片に対して直接的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析を行った（組織固定または事前洗浄なしで小分子検出を容易にするために、ＦＦＰＥの代わりに新鮮凍結が最適である）。ＤＡＮマトリックスを有する負イオンモードＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを使用した。次に、組織を冷アセトンで洗浄／固定してＭＡＬＤＩ－ＭＳマトリックス化合物を除去し、次いでパラホルムアルデヒドでさらに固定した。次いで、２回のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（いわゆる二重ＭＳＩ）を構成するＭＩＨＣを実施した。１回目の直接的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの結果を図９ａに示し、画像は、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ［Ｓｍｉｔｈ，ＯＭａｉｌｌｅら（２００５）Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ ２７：７４７－５１］のＭＥＴＬＩＮデータベースから同定された３つの周知の脂質のｍ／ｚ値について色分けされており、マウス脳組織切片からの脂質の以前のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析と一致している［Ｗａｎｇ，Ｗａｎｇら（２０１８）Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ １０００：１５５－１６２］（スルファチド［Ｎ２４：１］、赤色、実測値ｍ／ｚ８８８．７；ホスファチジルエタノールアミン［４０：６］、青色、実測値ｍ／ｚ７９０．５；およびホスファチジルイノシトール［３８：４］、緑色、実測値ｍ／ｚ８８５．４）。これらの３つの脂質は、脳の異なる構造において明らかに濃縮されており、特に、スルファチド（赤色）は、他の２つの脂質とは異なるパターンを示す。しかしながら、真核細胞膜の主要な構造脂質の２つとして予想されるように、ホスファチジルエタノールアミン（青色）およびホスファチジルイノシトール（緑色）の有意な共局在も存在する［ｖａｎＭｅｅｒ，Ｖｏｅｌｋｅｒら（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：１１２－２４］（共局在した青色および緑色は、図９ａではシアン色として現れる）。実証目的のために、図９ｂおよび図９ｃは、１回目の直接的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩで検出されたスルファチド脂質と、２回目のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩでＭＩＨＣによって検出された選択された高分子バイオマーカーの２色オーバーレイを示す。図９ｂは、ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを用いて実施例２で先に実証されたように検出された、ニューロン核バイオマーカーＮｅｕＮ（緑色）がオーバーレイされたスルファチド（赤色）を示す。これらの２つの生体分子は一般に共局在しない。逆に、図９ｃは、マルチプレックスＭＩＨＣ分析においてＰＣ－ＭＴ－Ａｂを用いて再び検出された、ミエリン塩基性タンパク質（緑色）がオーバーレイされた同じ脂質スルファチド（赤色）を示す。この場合、スルファチドとミエリンの強い共局在が存在する（緑色と赤色の共局在から生じる黄色によって証明される）。スルファチドおよびミエリンの共局在は、スルファチドが主にニューロン軸索のミエリン鞘（シュワン細胞／乏突起膠細胞）に見られることを示す以前の文献と一致する［Ｅｃｋｈａｒｄｔ（２００８）Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ３７：９３－１０３、Ｈｉｒａｈａｒａ，Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら（２０１７）Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ １４０：４３５－４５０］。逆に、ここで観察されたように、スルファチドはニューロン核バイオマーカーＮｅｕＮと共局在するとは予想されないであろう（実施例２で先に示したように、ミエリンおよびＮｅｕＮも一般に共局在しないことに留意されたい）。最後に、１回目の直接的ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩからの例示的なスペクトルを図９ｄに示す。これらのスペクトルは、マウスの脳の延髄／神経層で観察される３つの異なる色の「層」から選択された選択画像ピクセルからのものである（これらの層については、図９ａの色付き矢印を参照されたい）。将来、ＭＳ／ＭＳまたはより高分解能のＦＴＩＣＲ質量分析計を利用することにより、より正確な小分子同定が提供される。

【0159】

実施例５。ＰＣ－核への質量ユニット好ましい結合部位。

【0160】

本発明では、質量ユニットのＰＣ－核（ＰＣ－核については図３を参照）のフェニル環への好ましい結合様式は、最終的に光切断部位を介する（図１０ａの構成１を参照、図３も参照）。この構成では、ＰＣ－核の光切断されたフェニル環は、質量分析（ＭＳ）によって検出される光切断された質量レポーターに結合したままではない。代わりに、Ｏｌｅｊｎｉｋら［Ｏｌｅｊｎｉｋ，Ｌｕｄｅｍａｎｎら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：４６２６－３１］ならびにＬｅｖｙおよびＣａｐｒｉｏｌｉ（米国特許第７，５６９，３９２号）によって教示されるように、光切断部位以外の部位を介して最終的に質量ユニットをＰＣ－核のフェニル環に結合させることが可能であるが、これは、ＰＣ－核の光切断されたフェニル環が、ＭＳによって検出された光切断された質量レポーターに結合したままであるため、好ましくない（図１０ａ、構成２参照）。

【0161】

好ましい構成１の利点を実証するために、同じ質量ユニットのペプチド配列を有する光切断可能なペプチドを、図１０ａに示される２つの構成に従って表面に結合させた。（光切断可能なペプチドの構造および配列についても図１０ａを参照）。次いで、質量レポーターを表面から光切断し、質量分析によって測定した。好ましい構成１は、質量レポーターの予想質量（図１０ｂの薄い灰色のトレース、１，１９４．７ｍ／ｚ、構成１）でのクリーンなモノアイソトピックピーク、および１ｍ／ｚだけ離れた質量レポーターの天然同位体に対応する付随するピーククラスタのみ（Ｘ軸スケーリングのために図１０ｂには存在するが認識できない）を提供する。構成２では、光切断された質量レポーターは、予想されるモノアイソトピック質量レポーターピーク（図１０ｂの黒色トレース、１，３９９．９ｍ／ｚ、構成２）を提供するが、質量レポーターに結合したままであるＰＣ－核の光切断されたフェニル環の副反応副生成物に起因すると思われる非常に複雑な質量スペクトルも生成する（図１０ｂ「構成２におけるＰＣ－核の副産物」参照）。これらの副生成物は、部分的には、関与する酸素ラジカル化学に起因する酸素付加物および損失を含み得る。最終的に、これは（質量レポーターシグナルを多数の質量スペクトルピークに分割することによって）感度を低下させ、マルチプレックス分析において（ピーク重複により）質量レポーター同定を混乱させる。

【0162】

実施例６。異なるＰＣリンカーの比較および予備光切断対ＭＡＬＤＩ－ＭＳレーザービームを用いたインライン光切断の比較。

【0163】

ＰＣ－ＭＴ

【0164】

実施例１と同様にして、図３に示す構成を有するＰＣ－ＭＴを作製した（表１に列挙された質量ユニット１および２～４からなる、この実施例における４つのＰＣ－ＭＴ）。

【0165】

さらに、いわゆるＰＣ－ＭＴｓ－Ｌを、図３に示されるＰＣ－リンカーの代わりにＬｅｍａｉｒｅらのＰＣ－リンカー［Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｓｔａｕｂｅｒら（２００７）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ６：２０５７－６７］［米国特許第８，２２１，９７２号］を使用することによってのみ異なる、同じ様式で製造した。これを達成するために、４－［４－［１－（９－Ｆｍｏｃ－アミノ）エチル］－２－メトキシ－５－ニトロフェノキシ］ブタン酸（材料を参照）を使用して、ペプチド合成中にＰＣ－リンカーをＰＣ－ＭＴｓ－Ｌに導入した（プレーンのペプチドに組み込まれたこのＰＣ－リンカーについては図４「ＬｅｍａｉｒｅのＰＣ－リンカー」を参照－図４では、プレーンのペプチドがＰＣ－リンカー自体を示すように示されているが、プレーンのペプチドはＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴｓ－Ｌの他の特徴を欠いていることに留意されたい）。重要なことに、ＰＣ－ＭＴｓ－ＬのＰＣ－リンカーは、Ｌｅｍａｉｒｅらによって使用されたものであったが、図３に示すＰＣ－ＭＴ特徴と同じＰＣ－ＭＴｓ－Ｌの他の特徴は、Ｌｅｍａｉｒｅらによって教示されていない。これらの特徴（図３）には、プローブ反応性部分（この場合はＮＨＳ－エステル）、ペプチドベースのＰＣ－ＭＴのＮ末端ブロッキング（この場合はＮ末端アセチル化）、質量ユニット（表１）およびスペーサーユニットのペプチド配列、ならびに光切断部位を介したＰＣ－核のフェニル環への質量ユニットの特異的結合が含まれるが、これらに限定されない。

【0166】

ビーズ－アレイ

【0167】

ＰＣ－ＭＴ－ＬをＰＣ－ＭＴと共に等モル濃度で使用して、ストレプトアビジンで被覆された３７ミクロンのＰＭＭＡビーズを同時に二重標識した。これを達成するために、４つの別々の反応において、同じ質量ユニットからなるＰＣ－ＭＴ－ＬおよびＰＣ－ＭＴでそれぞれ同時に二重標識することによって４つのビーズ種を作製した。これは、ＰＣ－ＭＴが光切断された質量レポーターに結合したＰＣ－リンカーの小さな残存部分を残し（図３の工程３参照）、一方、ＰＣ－ＭＴ－Ｌはそうではないために可能である（したがって、たとえ各ビーズ種の質量ユニットが同じであっても、光切断された質量レポーターの質量は、質量分析計において区別可能である）。

【0168】

ビーズの質量タグ標識を以下のように行った。ストレプトアビジンで被覆された３７ミクロンのＰＭＭＡビーズは、特に明記しない限り、０．５ｍＬ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ０．４５μｍフィルターデバイス中で処理した（洗浄は、フィルターデバイス中でビーズ懸濁液の３秒間のボルテックス混合によって行い、溶液からビーズを分離するための濾過は、標準的な微量遠心機で１５，０００ｒｐｍで５秒間行った）。４つのビーズ種（特に断らない限り別々に処理）のそれぞれについて、１００，０００個のビーズを使用した。４００μＬのコンジュゲーション緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌを含む２００ｍＭ重炭酸ナトリウム）で４回、ビーズを洗浄した。次いで、各ビーズペレットを１００μＬのコンジュゲーション緩衝液に再懸濁した後、ＰＣ－ＭＴ－ＬおよびＰＣ－ＭＴのそれぞれを５００μＭ含有する２ｐＬ（ＤＭＦ中）を添加した。反応物を３０分間混合し、次いでビーズを４００ｐＬのグリシン－ヒドロキシルアミンクエンチ（１０倍濃縮ＴＢＳ中１Ｍグリシンおよび１００ｍＭヒドロキシルアミン、新たに調製）でそれぞれ１５分間を３回洗浄した。次いで、ビーズをそれぞれ４００μＬのＯＢＧ生理食塩水（２５ｍＭ重炭酸アンモニウム、０．０５％（ｗ／ｖ）オクチル－Ｂ－Ｄ－グルコピラノシドおよび５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１５分間を４回洗浄し、同じ緩衝液中２５０ビーズ／ｐＬに再懸濁した。

【0169】

最後に、ビーズアレイを以下のように形成した。４００ｐＬの質量分析グレードの精製水で４回、ビーズを洗浄し、質量分析グレードの精製水で再懸濁した（２０，０００ビーズ／１００ｐＬ）。次いで、金で被覆された顕微鏡スライド（材料を参照）に取り付けられたＦｌｅｘＷｅｌｌ（商標）１６チャンバ自己接着性ガスケット（材料を参照）を使用して、ビーズを化学煙霧フード内で４００ビーズ／ｍｍ^２の密度で一晩乾燥させた。乾燥後、スライドを過剰な質量分析グレードの精製水を含むトレイで穏やかに洗浄し（ビーズはスライドに付着したままである）、次いでスライドを真空乾燥チャンバ内で４５分間再び乾燥させた。

【0170】

ビーズアレイの光切断、マトリックス適用およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ

【0171】

実施例１と同様に実施した（上記のように直接質量タグ付けされたビーズは、実施例１で行われたようにＰＣ－ＭＴ－Ａｂでプローブされなかったことに留意されたい）。場合によっては、ＵＶ照射を２５分に増加させた。

【0172】

Ｃ－ＭＴ－Ａｂ

【0173】

表１に記載の質量ユニット１からなる等モル濃度のＰＣ－ＭＴ－ＬおよびＰＣ－ＭＴで抗ミエリン抗体を同時に二重標識したこと以外は実施例１と同様にして調製した（すなわち、ＰＣ－ＭＴ－ＬおよびＰＣ－ＭＴ標識試薬の両方を等モル濃度［それぞれＤＭＦ中１ｍＭ］で予備混合し、次いで混合物を二重標識のための同じ抗体に添加した［標識のための抗体と比較してそれぞれ１０倍モル過剰］）。

【0174】

ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ、光切断、マトリックス適用およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩによる組織免疫染色

【0175】

実施例２と同様に実施した。場合によっては、ＵＶ照射を２５分に増加させた。他の場合では、ＵＶ照射は行わず、機器のレーザービームを使用して、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ中にインライン光切断のみを可能にした。

【0176】

結果

【0177】

最初に、ビーズアレイを使用して、表１に列挙した質量ユニット１および２～４について、ＰＣ－ＭＴをＰＣ－ＭＴ－Ｌと比較した。図１１ａは、１，２０６．７ｍ／ｚ（質量ユニット１を有するＰＣ－ＭＴ）および１，１６３．７ｍ／ｚ（質量ユニット１を有するＰＣ－ＭＴ－Ｌ）における質量レポーターの質量スペクトルピーク強度のピクセルマップを表す、質量ユニット１についてのビーズアレイの例示的な質量画像を示す。画像において、ＰＣ－ＭＴは赤色に色分けされ、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは緑色に色分けされている。ピークが同様の強度である場合、２色オーバーレイは黄色を生成すると予想されるが、ＰＣ－ＭＴははるかに強いシグナルを生成するので、ビーズは赤橙色に見える。アレイ内のビーズからの単一ピクセルからの代表的な質量スペクトルを、５分および２５分の事前ＵＶ照射（すなわち、マトリックス適用前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ前のＵＶ光切断）での４つすべての質量ユニットについて図１１ｂ～図１１ｉに示す。４つのビーズ種のそれぞれが二重標識されているので、各スペクトルは、所与の質量ユニットについてＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌの両方のピークを含むことに留意されたい（ＰＣ－ＭＴは、ＰＣ－ＭＴ－Ｌからの等価な質量ユニットと比較して＋４３のｍ／ｚを生じるが、これは、ＰＣ－ＭＴは質量レポーターに結合した光切断されたＰＣ－リンカーのわずかな残存部分を残すが、ＰＣ－ＭＴ－Ｌは残さないためである）。次いで、質量スペクトルピーク強度のＰＣ－ＭＴ対ＰＣ－ＭＴ－Ｌ比を、各質量ユニットおよび各事前ＵＶ時点について計算し、各並べ替えについて５ピクセル（５スペクトル）から平均した。これらの比は、それぞれ質量ユニット１および２～４について、５分間の事前ＵＶで５：１、８：１、１０：１および６：１であり、したがってＰＣ－ＭＴはＰＣ－ＭＴ－Ｌと比較して５～１０倍高いシグナルを示した。相対的なＰＣ－ＭＴ－Ｌシグナルは、２５分間のＵＶで穏やかに改善し、２：１、３：１、７：１および５：１の比をもたらしたが、改善は事前ＵＶ時間の増加（事前ＵＶ時間の５倍の増加）とは決して比例せず、ＰＣ－ＭＴは常にＰＣ－ＭＴ－Ｌよりも優れたままであったので、リターンは減少した。

【0178】

第２に、ＭＩＨＣ（質量分析ベースの免疫組織化学）を使用して、ミエリンに対する二重標識抗体プローブを使用してマウス脳組織切片を染色するために、質量ユニット１のＰＣ－ＭＴおよびＰＣ－ＭＴ－Ｌを比較した。この場合、組織の５分間および２５分間の事前ＵＶ処理（マトリックス適用の直前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの前）に加えて、０分間の事前ＵＶも試験し、この場合、光切断は、機器のレーザービームを使用したＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析と一致しているにすぎない。ビーズアレイと同様に、組織のミエリンイメージングのための２色質量画像が図１１ｊに示されており、ここでも、ＰＣ－ＭＴ（赤色）はＰＣ－ＭＴ－Ｌ（緑色）よりもはるかに高いシグナルを提供し、それによって画像において優勢である。代表的なピクセルからのスペクトルを図１１ｋおよび図１１ｌに示し、この結果を確認する。この場合、ピーク強度のＰＣ－ＭＴ対ＰＣ－ＭＴ－Ｌ比は、５分間および２５分間の事前ＵＶでいずれも６：１であった。最後に、０分間の事前ＵＶは、検出可能なＰＣ－ＭＴまたはＰＣ－ＭＴ－Ｌシグナルを実質的に示さない（図１１ｊ参照）。事前ＵＶの効果を定量化するために、各組織切片について、対象の領域全体（図１１ｊの点線の輪郭を参照）の各々から平均スペクトルを生成した。これらの平均スペクトルから、ＰＣ－ＭＴのモノアイソトピックピーク強度は、０分間、５分間および２５分間の事前ＵＶでそれぞれ２．５、１５．８および２３．３であった。重要なことに、これは、装置のレーザービームを使用するＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析にと一致した光切断（０分間の事前ＵＶ）が、光切断のための事前ＵＶ処理よりもはるかに感度が低い（この例では約６～９倍）ことを実証している。

【0179】

実施例７。質量分析に基づく免疫組織化学のための蛍光ＰＣ－ＭＴ。

【0180】

質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）

【0181】

以下の、組換え抗ＮｅｕＮ抗体（材料を参照）を、図３のように構成された（表１の質量ユニット１を有する）が、スペーサーユニットに付加されたリジンアミノ酸のｓ－アミンに結合したＳｕｌｆｏ－Ｃｙ５蛍光標識をさらに含むＰＣ－ＭＴにコンジュゲートしたしたことを除いて、実施例２と同様にマウス脳の矢状方向の組織切片に対するＭＩＨＣを実施した。したがって、Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１と呼ばれる質量ユニット１を有するこの蛍光ＰＣ－ＭＴの完全な配列は、以下の通りであった（Ｎ末端からＣ末端）。Ａｃｅｔｙｌ－ＡＰＲＬＲＦＹＳＬ－［ＰＣ－Ｌｉｎｋｅｒ］－ＧＳ［Ｋ－Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ５］ＧＧ－［Ｋ－ＮＨＳ］－ＣＯＯＨ。抗ＮｅｕＮ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１と呼ばれる得られた抗体プローブをＭＩＨＣに使用した。

【0182】

陰性対照として、組換え抗Ｃａｓ９抗体（材料を参照）をＦｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１にもコンジュゲートした（Ｃａｓ９は哺乳動物に存在しない細菌特異的タンパク質であることに留意されたい）。抗Ｃａｓ９ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１と呼ばれる得られた抗体プローブをＭＩＨＣに使用した。

【0183】

最後に、陽性対照として、組換え抗ＮｅｕＮ抗体を、ＰＣ－ＭＴ７と呼ばれる、表１の質量ユニット７を除いて、図３のように構成された非蛍光ＰＣ－ＭＴにのみ結合させた。抗ＮｅｕＮ ＰＣ－ＭＴ７と呼ばれる得られた抗体プローブをＭＩＨＣに使用した。

【0184】

Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１はフルオロフォアを含むので、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに加えて、（金で被覆されたスライド上の）同じ組織の蛍光イメージングを行うことができた（光切断のための事前ＵＶ処理の直前、マトリックス適用前およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ分析前に行われた蛍光イメージング）。実施例２と同様に蛍光イメージングを行った。

【0185】

結果

【0186】

マウス脳組織の蛍光画像を図１２に黄色で示す（「蛍光」参照）。組織を抗ＮｅｕＮ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１でプローブすると、強い特異的な蛍光シグナルが観察される。比較すると、陰性対照抗Ｃａｓ９ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１でプローブした組織は、弱いバックグラウンドのみを示す（Ｃａｓ９は哺乳動物に存在しない細菌タンパク質である）。非蛍光抗ＮｅｕＮ ＰＣ－ＭＴ７でプローブした組織は、組織の自己蛍光に対応する非常に弱いバックグラウンド蛍光しか示さない。

【0187】

マウス脳組織のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像を、図１２において赤色（Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１からの質量レポーター）および緑色（ＰＣ－ＭＴ７からの質量レポーター）として表示する（「ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ」参照）。抗ＮｅｕＮ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１でプローブした組織は、弱いバックグラウンドしかもたらさない陰性対照抗Ｃａｓ９ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１でプローブした組織と比較して、強く特異的なＭＡＬＤＩ－ＭＳＩシグナルを示す（図１２の「ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ」パネルの赤色を参照）。

【0188】

抗ＮｅｕＮ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１の「染色」パターンは、図１２の蛍光およびＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像において類似している。具体的には、実施例２と同様に、抗ＮｅｕＮは、海馬（図１２の青色矢印）および小脳（図１２の白色矢印）などの異なる特徴を検出する。しかしながら、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩでは、非蛍光抗ＮｅｕＮ ＰＣ－ＭＴ７プローブは、抗ＮｅｕＮ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１プローブよりも明確なパターン（図１２の「ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ」パネルの緑色）を生成する。海馬（図１２の青色矢印）内の代表的な単一ピクセルからのＦｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１およびＰＣ－ＭＴ７の質量レポーターピーク（スペクトルの黒色矢印）を示す図１２の挿入図のスペクトルに基づいて、抗ＮｅｕＮ ＰＣ－ＭＴ７プローブの優位性は、より高いピーク強度（スペクトルの同じｙ軸スケーリング）に起因するようには見えない。優れた結果は、抗ＮｅｕＮ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１プローブと比較して、抗ＮｅｕＮ ＰＣ－ＭＴ７プローブの非特異的結合が少ない（したがって、拡散バックグラウンドが少ない）ことによって説明され得る。これは、非特異的結合を低減するために異なるフルオロフォアを使用することによって解決され得る。さらに、にスペーサーユニットの長さを長くして、フルオロフォアがプローブ反応性部分（この実施例ではＰＣ－ＭＴ上のＮＨＳ－エステル）からより離れるようにすると、プローブ標識効率を改善することができる。

【0189】

最後に、陰性対照抗Ｃａｓ９ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１プローブについて示されるスペクトルは、識別可能な質量レポーターピークを示さないことに留意されたい。

【0190】

実施例８。組換え抗体対従来の抗体。

【0191】

ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ

【0192】

以下のＰＣ－ＭＴ－Ａｂを実施例１のように調製した（抗体は特に明記しない限り非組換えである－抗体の材料を参照）（以下の数字は、特定のＰＣ－ＭＴで使用される表１の質量ユニットを示すことに留意されたい）。組換え抗アミロイドβ（組換え抗ＡＢ２と呼ばれる）、組換え抗ミエリン塩基性タンパク質（組換え抗ＭＢＰ１と呼ばれる）、抗ミエリン塩基性タンパク質（抗ＭＢＰ１と呼ばれる）、組換え抗ＮｅｕＮ（組換え抗ＮｅｕＮ７と呼ばれる）、および抗ＮｅｕＮ（抗ＮｅｕＮ７と呼ばれる）。

【0193】

ビーズ－アレイ

【0194】

以下を除いて実施例６と同様に実施した。ストレプトアビジンで被覆された３７μｍのＰＭＭＡビーズをＰＣ－ＭＴへのコンジュゲーションに使用した（これらのＰＣ－ＭＴはビーズＩＤ－タグと呼ばれる）。次いで、ビーズを使用して、以下のように前述のＰＣ－ＭＴ－Ａｂを捕捉した。ビーズを実施例６のようにフィルターデバイスで処理した。特に明記しない限り、各ＰＣ－ＭＴビーズ種を別々に処理した。ビーズを４００μＬのＯＢＧ生理食塩水で４回洗浄した（製剤については実施例６を参照）。ＯＢＧ生理食塩水中１００μｇ／ｍＬビオチン化プロテインＧ ２００μＬを各ビーズペレットに添加し、３０分間混合した。ビーズを４００μＬのＯＢＧ生理食塩水で８回洗浄した。ＯＢＧ生理食塩水中１μｇ／ｍＬ ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ溶液２００μＬをビーズペレットに添加し、３０分間混合した。ビーズを４００μＬＯＢＧ生理食塩水で２回および４００μＬのＯＢＧ緩衝液（ＯＢＧ生理食塩水と同じであるがＮａＣｌを含まない）で２回洗浄した。この段階で、異なるビーズ種をプールした。次に、実施例６と同様に、ビーズアレイ形成、光切断、マトリックス適用、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行った。

【0195】

上記の手順の結果として、２つのビーズプールを作成し、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩによってビーズアレイで別々に分析した。プール中の各ビーズ種は、固有の直接結合したビーズＩＤ－タグならびに結合したＰＣ－ＭＴ－Ａｂを有する。以下のすべての数字は、特定のＰＣ－ＭＴで使用される表１に列挙された質量ユニットを指す。

【0196】

ビーズプール１：

【0197】

ビーズＩＤ－タグ９／組換え抗ＭＢＰ１

【0198】

ビーズＩＤ－タグ１０／抗ＭＢＰ１

【0199】

ビーズＩＤ－タグ１５／組換え抗ＡＢ２

【0200】

ビーズプール２：

【0201】

ビーズＩＤ－タグ９／組換え抗ＮｅｕＮ７

【0202】

ビーズＩＤ－タグ１０／抗ＮｅｕＮ７

【0203】

ビーズＩＤ－タグ１５／組換え抗ＡＢ２

【0204】

質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）

【0205】

マウス脳の矢状方向の組織切片に対するＭＩＨＣを、以下の前述のＰＣ－ＭＴ－Ａｂ：組換え抗ＮｅｕＮ７および抗ＮｅｕＮ７を使用して実施例２と同様に行った。

【0206】

結果

【0207】

図１３ａは、ビーズプール１のビーズアレイのＭＡＬＤＩ－ＭＳ質量画像を示す。ビーズは、それぞれ組換え抗ＭＢＰ１、抗ＭＢＰ１および組換え抗ＡＢ２が負荷されたビーズに対応するビーズＩＤ－タグ９、１０および１５の質量スペクトルピーク強度について、青色、緑色および黄色として画像内で色分けされる。ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ由来のＰＣ－ＭＴはすべて赤色に色分けされている。したがって、青色のビーズビーズＩＤ－タグ９と結合された赤色の組換え抗ＭＢＰ１との共局在（オーバーレイ）は、質量画像においてピンク色として現れる。逆に、緑色のビーズＩＤ－タグ１０が検出されている間、対応する赤色の抗ＭＢＰ１についてのシグナルはほとんどまたは全く観察されず、したがって、これらのビーズは主に緑色として現れる。最後に、黄色のビーズＩＤ－タグ１５と結合した赤色の組換え抗ＡＢ２との共局在（オーバーレイ）は、質量画像においてオレンジ色として現れる。結論として、両方の組換え抗体は、それらのそれぞれのビーズ上で強いＰＣ－ＭＴ－Ａｂシグナル（ピンクおよびオレンジ色のビーズとして観察される）を示すが、非組換え抗ミエリン塩基性タンパク質ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ（抗ＭＢＰ１）はほとんど検出されない。これは、図１３ｂに示すオーバーレイスペクトルによって確認される。３つのスペクトルは、図１３ａに丸で囲んだ３つのビーズの中心から選択された３つの単一ピクセルに対応し、図１３ａで観察されたビーズの色に応じて色分けされている。図１３ｂにおけるピンク色のトレースは、ビーズＩＤ－タグ９および結合した組換え抗ＭＢＰ１について対応する抗体ＰＣ－ＭＴ１についての強いピークを示す。逆に、図１３ｂにおける緑色のトレースは、ビーズＩＤ－タグ１０については強いピークを示すが、結合した抗ＭＢＰ１について対応する抗体ＰＣ－ＭＴ１については弱いピーク（黒色矢印）のみを示す。組換え抗ＭＢＰ１の抗体ＰＣ－ＭＴ１ピークは、（非組換え）抗ＭＢＰ１の１０倍強いことに留意されたい。最後に、図１３ｂにおけるオレンジ色のトレースは、ビーズＩＤ－タグ１５および結合した組換え抗ＡＢ２について対応する抗体ＰＣ－ＭＴ２についての強いピークを示す。

【0208】

ビーズプール２も同様の結果を示す。図１３ｃは、ビーズプール２のビーズアレイのＭＡＬＤＩ－ＭＳ質量画像を示す。ビーズは、それぞれ組換え抗ＮｅｕＮ７、抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＡＢ２が負荷されたビーズに対応するビーズＩＤ－タグ９、１０および１５の質量スペクトルピーク強度について、青色、緑色および黄色として画像内で色分けされる。ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ由来のＰＣ－ＭＴはすべて赤色に色分けされている。したがって、青色のビーズビーズＩＤ－タグ９と結合された赤色の組換え抗ＮｅｕＮ７との共局在（オーバーレイ）は、質量画像においてピンク色として現れる。逆に、緑色のビーズＩＤ－タグ１０が検出されている間、対応する赤色の抗ＮｅｕＮ７についてのシグナルはほとんどまたは全く観察されず、したがって、これらのビーズは主に緑色として現れる。最後に、黄色のビーズＩＤ－タグ１５と結合した赤色の組換え抗ＡＢ２との共局在（オーバーレイ）は、質量画像においてオレンジ色として現れる。結論として、両方の組換え抗体は、それらのそれぞれのビーズ上で強いＰＣ－ＭＴ－Ａｂシグナル（ピンクおよびオレンジ色のビーズとして観察される）を示すが、非組換え抗ＮｅｕＮ７ ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ（抗ＮｅｕＮ７）はほとんど検出されない。これは、図１３ｄに示すオーバーレイスペクトルによって確認される。３つのスペクトルは、図１３ｃに丸で囲んだ３つのビーズの中心から選択された３つの単一ピクセルに対応し、図１３ｃで観察されたビーズの色に応じて色分けされている。図１３ｄにおけるピンク色のトレースは、ビーズＩＤ－タグ９および結合した組換え抗ＮｅｕＮ７について対応する抗体ＰＣ－ＭＴ７についての強いピークを示す。逆に、図１３ｄにおける緑色のトレースは、ビーズＩＤ－タグ１０については強いピークを示すが、結合した抗ＮｅｕＮ７について対応する抗体ＰＣ－ＭＴ７については非常に弱いピーク（黒色矢印）のみを示す。組換え抗ＮｅｕＮ７の抗体ＰＣ－ＭＴ７ピークは、（非組換え）抗ＮｅｕＮ７の６０倍強いことに留意されたい。最後に、図１３ｄにおけるオレンジ色のトレースは、ビーズＩＤ－タグ１５および結合した組換え抗ＡＢ２について対応する抗体ＰＣ－ＭＴ２についての強いピークを示す。

【0209】

ビーズアレイにおける組換えＰＣ－ＭＴ－Ａｂの優れた性能は、マウス脳の矢状方向の組織切片に対する質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）において再現される。図１３ｅは、抗ＮｅｕＮ７および組換え抗ＮｅｕＮ７で染色した組織のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ質量画像を示す。ＮｅｕＮ免疫染色は、実施例２で観察されたのと同様に、このバイオマーカーの典型的なパターンを示す。注目すべきことに、海馬（青色矢印）および小脳（白色矢印）は強く染色され、核染色に特徴的な斑点模様（ＮｅｕＮはニューロン核バイオマーカーである）が観察される（黄色矢印）。しかしながら、組換えの組換え抗ＮｅｕＮ７は、図１３ｅの質量画像から明らかなように、非組換えの抗ＮｅｕＮ７よりも実質的に高い感度を示す。これは、図１３ｅに示すスペクトルによって確認される。各画像の海馬内の最も強いピクセルからスペクトルを取得すると、「組換え」抗体からのピーク（赤色のトレース）は、「通常の」非組換え抗体からのピーク（青色のトレース）よりも約７倍強い。

【0210】

全体として、組換え抗体の優れた性能は、混入タンパク質、アジドおよびアミン含有緩衝液を含まない、これらの抗体の一般的により高い純度に由来し、ＰＣ－ＭＴ標識効率を高めると考えられる。

【0211】

実施例９。ＦＦＰＥ扁桃および乳癌組織に対する１２プレックスＭＩＨＣの実証

【0212】

方法

【0213】

以下を除いて実施例２と同様に実施した。ＦＦＰＥヒト扁桃および乳癌組織を使用した。抗原賦活化工程を以下のように行った。基本的な抗原賦活化は、６０ｍＬの１×抗原賦活化Ｒｅａｇｅｎｔ－Ｂａｓｉｃ（材料を参照）中で９５℃で３０分間行い、続いて同じＣｏｐｌｉｎ染色ジャー中で室温で３０分間冷却することにより達成した。さらに、この場合、１２種類の異なるＰＣ－ＭＴ抗体を使用し（ＰＣ－ＭＴ抗体の割り当てについては表１を参照のこと）、組織プローブには０．５μｇ／ｍＬの抗体を使用した。最後に、ＰＣ－ＭＴおよび蛍光の両方による汎サイトケラチン抗体（ＣＫ）の二重標識のために、ＰＣ－ＭＴ標識試薬を添加し、１時間反応させた後、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０ ＮＨＳエステル試薬を添加し（ＤＭＦ中の５ｍＭストックから１５倍モル過剰量を添加し）、さらに１時間反応させた後、実施例１に詳述した残りの抗体標識手順を進めたことを除いて、実施例１と同様にＰＣ－ＭＴ抗体標識を行った。

【0214】

結果

【0215】

本発明者らは、乳癌腫瘍微小環境を評価するのに適した１２プレックスのバイオマーカーパネル、具体的には、乳癌関連バイオマーカー［Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｈａｙｍｏｎｄら（２０１８）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １５：１３１－１５２］エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）およびＫｉ６７（増殖バイオマーカー）；Ｔ細胞サブセットバイオマーカーＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）およびＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞）、Ｂ細胞バイオマーカーＣＤ２０およびＣＤ６８、マクロファージおよび他の単核食細胞のバイオマーカーを含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および他の免疫関連細胞のバイオマーカー［Ｂｌｏｍ，Ｐａａｖｏｌａｉｎｅｎら（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１５５８０、Ｃｈｉｓｔｉａｋｏｖ，Ｋｉｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈら（２０１７）Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ９７：４－１３、Ｈａｉｓｅ，Ｃｏｌｅｂａｔｃｈら（２０１８）Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８：１１１５８、ＰｏｈおよびＥｒｎｓｔ（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ８：４９］；最後に、一般的な上皮細胞バイオマーカーとしての汎サイトケラチン（ＣＫ）抗体［Ｋａｒａｎｔｚａ（２０１１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３０：１２７－３８］および核バイオマーカーとしてのヒストンＨ２Ａ．Ｘ抗体［Ｒｏｇａｋｏｕ，Ｐｉｌｃｈら（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：５８５８－６８］を構築した。重要なことに、これらの研究の目的は、特定の細胞または癌タイプの検出のための所与のバイオマーカーを検証することでも、特定の疾患状態の同定におけるバイオマーカーの有効性を決定することでもなかったことを明確にすべきである。目的は、本明細書に提示された新しいＭＩＨＣ法の機能性および有用性を実証することであった。

【0216】

各抗体を固有のＰＣ－ＭＴで直接標識した（各抗体および質量レポーター質量のＰＣ－ＭＴ割り当てについては表１を参照）。特に、異なるＰＣ－ＭＴアミノ酸配列で生じるであろう可変ＭＡＬＤＩ－ＭＳイオン化効率からのバイアスを排除するために、８つのＰＣ－ＭＴは、質量ユニット１（すべての質量ユニットについて表１を参照）または様々な安定同位体（質量ユニットＩｓｏ－１．１～Ｉｓｏ－１．５、Ｉｓｏ－１．７およびＩｓｏ－１．８）からなる同じ配列のいずれかから構成され、残りの４つのＰＣ－ＭＴも質量ユニット１のコア配列から構成されていたが、末端に１～３個のグリシンおよび／またはセリンアミノ酸が伸長しており（質量ユニット１．２から１．５）、これはＭＡＬＤＩ－ＭＳイオン化効率を有意に変化させるとは予想されない。

【0217】

さらに、ＭＩＨＣ手順を強化するために、ＣＫ抗体をＰＣ－ＭＴおよびフルオロフォアで二重標識した。従来の免疫蛍光と、同じ組織切片上のＰＣ－ＭＴベースのＭＳＩとを組み合わせる能力は、免疫蛍光マルチプレックス化が５プレックス未満に制限された場合でも、極めて有用であろう。第１に、そのような組み合わせは、方法の開発および抗体プローブ検証に役立つであろう。さらに、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの空間分解能は光学イメージングの空間分解能とまだ一致していないので、高マルチプレックス化ＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像内の観察された構造のデコンボリューションを支援するために、高解像度非マルチプレックス位置合わせ蛍光画像さえも使用することができる。これは、隣接組織を染色することによって（１つは蛍光用、もう１つはＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ用）、または同じ組織切片に対する連続的な手順によって達成することができるが、両方の方法は、多くの追加工程を導入し、またＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像および蛍光画像の位置合わせを不正確にする可能性がある変数を導入するため、面倒である。この制限を克服するために、本発明者らは、最初にＰＣ－ＭＴ、２番目に蛍光試薬を用いてＣＫ抗体を２つの異なるアミン反応性ＮＨＳエステル活性化試薬で順次標識した。ＰＣ－ＭＴ標識試薬をモル基準で抗体に対して１０倍過剰で使用し、蛍光試薬を１５倍過剰で使用した（抗体は、ＮＨＳ－エステル活性化試薬による標識のために８０個までの利用可能なリジンアミノ酸を含有することに留意されたい［Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｗｒａｓｉｄｌｏら（１９８８）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ７：４５３－６］）。パネルの一部としてこの二重標識抗体を使用して、組織切片をマルチプレックス抗体混合物で１回染色し、続いて蛍光イメージング、ＰＣ－ＭＴ光切断、ＭＡＬＤＩ－ＭＳマトリックス適用およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを同じ組織切片で行う。

【0218】

最初に、本発明者らはヒト扁桃組織を使用して、１２プレックスパネルの抗体の大部分を検証した。扁桃は、Ｂ細胞［Ｋａｌｉｎａ，Ｆｉｓｅｒら（２０１９）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：２４３４］およびＴ細胞［Ｓａｄａ－Ｏｖａｌｌｅ，Ｔａｌａｙｅｒｏら（２０１２）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８：２００－６、Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ｍａｒｋｗａｒｔら（２０１７）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２：ｅ０１８３２１４］を含む免疫細胞ＣＤマーカー［Ｋａｐ，ｖａｎ Ｍｅｕｒｓら（２００９）Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ５７：１１５９－６７、Ｋａｌｉｎａ，Ｆｉｓｅｒら（２０１９）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：２４３４］の陽性対照として頻繁に使用されており、Ｋｉ６７が強陽性であることも知られている［Ｈｓｕ，Ｙａｎｇら（２０１３）Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ６３：８１０－６］。図１４ａは、組織切片全体のＣＫ免疫蛍光画像（ＧｅｎｅＰｉｘ ４２００Ａマイクロアレイスキャナを用いた５μｍ画像解像度）を示す。ＣＫ抗体は、予想通り、扁桃腺を覆い、その多くの陥入および陰窩を裏打ちする扁平上皮層を選択的に染色する。図１４ｂは、同一のパターンを生成する、同じ組織切片上のＣＫ ＰＣ－ＭＴの対応するＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像を示す（ＣａｐｒｉｏｌｉおよびＳｐｅｎｇｌｅｒグループは、約１～２μｍの分解能を達成することができる技術を開発しているが、この研究に使用されるＢｒｕｋｅｒ ｒａｐｉｆｌｅＸ機器の限界である１０μｍの分解能がここで使用される［Ｚａｖａｌｉｎ，Ｔｏｄｄら（２０１２）Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ４７：ｉ、Ｋｏｍｐａｕｅｒ，Ｈｅｉｌｅｓら（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：９０－９６］）。

【0219】

図１４ｃは、選択されたバイオマーカーからのＰＣ－ＭＴに対応するマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像を示す（人間の目が多数のオーバーレイされた色を区別することは現実的ではないため、ここでは一例として示差的パターンを生成する選択されたバイオマーカーを示し、代わりに、１２個すべてのバイオマーカーについて別々に図１４ｄを参照）。注目すべきことに、リンパ濾胞内の胚中心（例えば、白色矢印）は、Ｋｉ６７（増殖マーカー、図１４ｃの青色）およびＣＤ２０（Ｂ細胞マーカー、図１４ｃのシアン色、胚中心におけるこのバイオマーカーのより良好な視覚化については、図１４ｄのＣＤ２０も参照）に対して強く陽性である。胚中心が増殖性Ｂ細胞を含有することが知られている部位であるため、これは予想されることである［ＭａｃＬｅｎｎａｎ（１９９４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：１１７－３９］。胚中心の強いＫｉ６７染色もまた、標準的なＨ４Ｃを使用して以前に報告された結果と一致する［Ｈｓｕ，Ｙａｎｇら（２０１３）Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ６３：８１０－６］。対照的に、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３およびＣＤ４５ＲＯ、図１４ｃにおいてそれぞれ赤色および橙色）は、やはり以前の報告と一致して、濾胞外領域において優勢である［Ｎａｖｅ，Ｇｅｂｅｒｔら（２００１）Ａｎａｔ Ｅｍｂｒｙｏｌ（Ｂｅｒｌ）２０４：３６７－７３、Ｓａｄａ－Ｏｖａｌｌｅ，Ｔａｌａｙｅｒｏら（２０１２）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８：２００－６］。興味深いことに、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は組織中に広く分布していなかったが、扁桃陰窩内の別個の領域、上皮周囲および上皮内領域に高濃度で見出された（図１４ｃの緑色）。扁桃陰窩は、微生物および病原体を保有または捕捉することが知られているので、これはもっともなことである［Ｊｅｎｓｅｎ，Ｆａｇｏ－Ｏｌｓｅｎら（２０１３）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ５６４１８、Ｒｉｅｔｈ，Ｇｉｌｌら（２０１８）ＪＡＭＡ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ １４４：２３１－２３７］。図１４ｄは、グラデーションカラースケールを使用して、組織切片の代表的な小領域上の１２個すべての抗体を別々に示す。「ブランク」は、別個であるが隣接する組織切片を染色するために使用されたＰＣ－ＭＴ標識アイソタイプ対照ＩｇＧ（ＣＤ３抗体と同じＰＣ－ＭＴ）に対応し、検出可能なシグナルを提供しない。逆に、すべてのＣＤ抗体は様々な程度で陽性であり、予想通りＣＫ、Ｋｉ６７およびヒストン抗体も同様であり、多くは異なるパターンを示す。ＨＥＲ２およびＰＲは陰性である。ＥＲはわずかに陽性を示すが、これは、標準的なＩＨＣを使用した以前の報告では予想外ではなく［Ｓｈｉｒａｓａｋｉ，Ｗａｔａｎａｂｅら（２００３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ １２５７：１１５－１１８］、ＥＲは評価した扁桃組織の４つすべてで検出されたが、ＰＲは見られなかった（図１４に示されている扁桃腺が女性起源のものであったことも注目に値する）。

【0220】

次に、本発明者らは、有用性を実証し、扁桃組織で一般に陰性であったＰＲ、ＥＲおよびＨＥＲ２抗体をさらに検証するために、乳癌ＦＦＰＥ組織切片に１２プレックス抗体パネルを適用した（上で論じたような明るいＥＲ染色を除く）。図１５ａ～図５ｃに示す組織について、生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告による臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌（乳管）、ｐＴｌｃｐＮ３ａｐＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＣ、７５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ－／ＺＥＲ－／ＨＥＲ２＋。図１５ａは、差次的パターンを表示する選択されたバイオマーカーのマルチカラーＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像オーバーレイを再び示す。腫瘍は、ＣＫ（赤色、上皮マーカー）およびＨＥＲ２（薄緑色）の両方について陽性に染色される領域によって同定され、２つの色の共局在はしばしば黄橙色に見える。ＣＤ２０Ｂ細胞の別個のパッチ（濃い緑色）が腫瘍外領域および腫瘍周囲領域において観察される。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（シアン色）は、この場合も扁桃と同様に組織全体に広く分布していないが、明るい染色が、腫瘍内に浸潤したものを含めて、別個の領域において認められる（例えば、シアン色矢印）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の有病率および腫瘍へのそれらの浸潤は、乳癌のいくつかの形態の陽性予後指標として報告されている［Ｖｉｈｅｒｖｕｏｒｉ，Ａｕｔｅｒｅら（２０１９）Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １４５：３１０５－３１１４、Ｇａｏ，Ｗａｎｇら（２０２０）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０：１７９、ＪｉｎおよびＨｕ（２０２０）Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１２］。また、腫瘍外および腫瘍周囲領域に非常に豊富なＣＤ６８染色（紫色）が存在し、マクロファージ（および他の単核食細胞）を示している［Ｃｈｉｓｔｉａｋｏｖ，Ｋｉｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈら（２０１７）Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ９７：４－１３］。豊富なＣＤ６８染色は、マクロファージがしばしば腫瘍塊の最大５０％を構成し得るという報告と一致している［ＰｏｈおよびＥｒｎｓｔ（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ８：４９］。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の存在は、様々な固形腫瘍の陽性または陰性の予後を示すことができるが、通常、免疫抑制ならびに血管新生および炎症の促進などの腫瘍促進活性のために陰性である（Ｐｏｈら［ＰｏｈおよびＥｒｎｓｔ（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ８：４９］およびＧｏｓｗａｍｉら［Ｇｏｓｗａｍｉ，Ｇｈｏｓｈら（２０１７）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１６：１－１０］に概説されている）。

【0221】

図１５ｂは、やはり、１２個すべての抗体のＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像を別々に示しており、同様にまた、（この場合、隣接する乳癌組織切片に対して）先に記載されたように行われた「ブランク」を示している。ＨＥＲ２は先に述べたように陽性であるが、ＰＲは陰性であり、両方とも生体試料の病理報告と一致する。しかしながら、ＥＲは陽性染色を示し、これは腫瘍外領域にあるが、腫瘍自体はＥＲ＋ではなく、この場合も病理報告と一致する。これを説明するために、簡単にするためには、図１５ｃは、原色で示される３つのバイオマーカー（ＣＫ、ＨＥＲ２、およびＥＲ）のみのマルチカラーオーバーレイを示す。腫瘍は、共局在化したＣＫ（この場合は青色に着色）およびＨＥＲ２（緑色）染色によって示されるが、ＥＲ染色（赤色）は、ほぼ排他的に組織切片の腫瘍外領域に限定される。

【0222】

最後に、ＰＲ、ＥＲおよびＨＥＲ２抗体をさらに検証するために、第２の乳癌組織検体を分析した。この場合、生体試料のベンダー（ＯｒｉＧｅｎｅ）によって提供された病理報告による臨床的注釈は以下の通りであった：乳房の腺癌、乳管、小葉、転移性、Ｔ２Ｎ２ａＭＸのＴＮＭ病期分類、最小病期分類ＩＩＩＡ、９５％腫瘍、および従来のＩＨＣによるＰＲ＋／ＥＲ＋／ＨＥＲ２－（すなわち、ＰＲ／ＥＲ／ＨＥＲ２プロファイルは、以前の組織の逆数である）。図１５ｄの上部パネルのＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像は、この場合のＰＲ、ＥＲおよびＣＫの単純な視覚化のために原色を使用した３色画像オーバーレイを再び示している。ＰＲ（緑色）およびＥＲ（赤色）は両方とも強く陽性であり、ＣＫ上皮バイオマーカー（青色）との共局在は、多くの領域で白色を生じる（３色すべてが同様の強度である場合に生じる）。図１５ｄ（下のパネル）はまた、ＣＫ、ＰＲ、ＥＲおよびＨＥＲ２を別々に示し、ここでもそれぞれがグラデーションカラーであり、病理報告と完全に一致するＰＲ＋／ＥＲ＋／ＨＥＲ２－を示す。

【0223】

実施例１０。質量分析イメージングにおける改善された組織接着性のための金被覆顕微鏡スライド

【0224】

背景

【0225】

導電性スライドは、ほとんどの形態のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを含むほとんどの形態のＭＳＩに必要とされる。インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）被覆ガラススライドが一般的に使用され、金被覆スライドも導電特性のために使用され、場合によっては、例えば金は化学修飾に適している［Ｃｈａｕｒａｎｄ，Ｃｏｒｎｅｔｔら（２０１１）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０：Ｏ１１０ ００４２５９、ＹａｎｇおよびＣａｐｒｉｏｌｉ（２０１４）Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ４９：４１７－２２］。しかし、これらは直接的なＭＳＩ用途に使用され、それによって組織がマウントされ、場合によってはマトリックス化合物が適用され（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ用）、ＭＳＩが実行される。したがって、スライドの液相処理はほとんどまたは全くない。対照的に、本発明の方法（質量分析に基づく免疫組織化学および質量分析に基づくインサイツハイブリダイゼーション、ＭＩＨＣおよびＭＩＳＨ）は、従来のＩＨＣまたはＩＳＨに類似しているが、蛍光発生プローブまたは発色プローブの代わりにＰＣ－ＭＴプローブを用い、光学顕微鏡法の代わりにＭＳＩ（および関連する手順）を用いる（ＩＨＣ／ＩＳＨ、直接的なＭＳＩおよびＭＩＨＣ／ＭＩＳＨプロトコルの比較については図１６を参照）。したがって、ＭＩＨＣおよびＭＩＳＨは、スライドが（ＩＨＣおよびＩＳＨとは異なり）導電性であること、および直接的ＭＳＩに必要とされるよりも強い組織接着を提供することの両方を必要とする。本発明者らは、これが金表面で最もよく達成されることを見出し、本発明者らの知る限りでは、金表面は、ＰＣ－ＭＴプローブおよびＭＳＩを使用するＩＨＣスタイルおよびＩＳＨスタイルの手順での使用について以前に報告されていない。

【0226】

方法

【0227】

組織を異なる導電性被覆を有するガラススライド（標準的な顕微鏡スライド寸法）にマウントしたことを除いて、実施例２と同様に実施した。これらは以下の酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）スライド（マサチューセッツ州ビレリカのＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）、公開されているプロトコルに従ってシラン化試薬として（３－アミノプロピル）トリエトキシシランを使用してシラン化されたＩＴＯスライド［Ｑｉｎ，Ｈｏｕら（２００７）Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ Ｂ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ６０：２４３－９］、製造業者の指示に従ってポリ－Ｌ－リジン溶液で被覆されたＩＴＯスライド（０．０１％、滅菌濾過、分子生物学用バイオ試薬、細胞培養に好適、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、製造業者の指示に従ってクロムアルミニウム接着剤で被覆されたＩＴＯスライド（カリフォルニア州ローディのＡｍｅｒｉｃａｎ ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、製造業者の指示に従ってＢＩＯＢＯＮＤ組織切片接着剤で被覆されたＩＴＯスライド（カリフォルニア州レディングのＴｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）、市販の銀被覆スライド（ウィスコンシン州マディソンのＰｌａｔｙｐｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ）および２種類の金被覆スライド（ウィスコンシン州マディソンのＰｌａｔｙｐｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣからの１０ｎｍの金層および２ｎｍのチタン接着下層、またはカナダオンタリオ州のＳｕｂｓｔｒａｔａ Ｔｈｉｎ Ｆｉｌｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ａｎｇｓｔｒｏｍ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．からの５０ｎｍの金層および５ｎｍのクロム接着下層を有するガラススライド）の通りであった。組織の損傷または喪失を、抗原賦活化工程の最後まで視覚的に評価した。

【0228】

結果

【0229】

組織損傷がほとんどまたは全く観察されなかった両方のタイプの金被覆スライドを除いて、重度の組織損傷または組織損失がすべての場合に様々な程度で観察された。損傷は、液相処理工程のいずれかで起こり得るが、熱媒介抗原賦活化工程で起こるかまたは開始する可能性がより高かった。図１７は、処理後のＩＴＯスライド上の損傷マウス脳組織切片の可視光画像、ならびに金スライド上の無傷の組織切片の一例を示す図である。

【0230】

実施例１１。質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）におけるマトリックス昇華およびその後のマトリックス再結晶化の要件

【0231】

背景

【0232】

当業者は、質量分析計のレーザーエネルギーの吸収および分析物への移動を容易にするため、過剰の外因的に添加されたマトリックス化合物との分析物の共結晶化が、ほとんどの形態のレーザーベース質量分析（ＭＡＬＤＩ質量分析）における効率的な分析物の気化／イオン化および検出に一般に必要であることを認識するであろう［Ｙａｏ，Ｓｃｏｔｔら（１９９８）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ９：８０５－１３、Ｄｕｅｎａｓ，Ｃａｒｌｕｃｃｉら（２０１６）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２７：１５７５－８］。これは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）と呼ばれる。ＴＡＭＳＩＭ［Ｔｈｉｅｒｙ，Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖら（２００７）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２１：８２３－９］およびＤＩＯＳ［Ｔｒａｕｇｅｒ，Ｇｏら（２００４）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７６：４４８４－９］などのマトリックスなしのＬＤＩ方法が存在するが、それらの使用は一般に特定の用途（例えば、ＤＩＯＳを用いた薬物検出であるが、レーザーに基づかない方法がこのために一般的に好ましい）に限定される。さらに、これらのマトリックスなしの方法は感度を欠く。ＭＡＬＤＩ質量分析イメージング（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）におけるマトリックス適用の多くの方法が存在し、いくつかの例としてエアブラシ、自動市販噴霧器および昇華が挙げられる［Ｇｅｍｐｅｒｌｉｎｅ，Ｒａｗｓｏｎら（２０１４）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８６：１００３０－５］。目的は、分析物の拡散／非局在化を最小限に抑えながら感度を最大化することである。本発明は、マトリックス適用のいずれか１つの方法、またはマトリックスの必要性を全く制限することを意図していないが、好ましい実施形態は、マトリックス昇華とそれに続く再結晶を使用する［Ｈａｎｋｉｎ，Ｂａｒｋｌｅｙら（２００７）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １８：１６４６－５２、Ｄｕｅｎａｓ，Ｃａｒｌｕｃｃｉら（２０１６）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２７：１５７５－８］。これにより、優れた空間分解能（すなわち、液相の欠如に起因してマトリックス適用中の分析物の非局在化を制限する昇華によって提供される）と高感度（すなわち、分析物［ＰＣ－ＭＴの質量レポーター］がマトリックスと十分に共結晶化することを可能にするが、有意な分析物の非局在化を伴わない蒸気ベースの再結晶によって提供される）の両方が得られる。

【0233】

方法

【0234】

ＰＣ－ＭＴ抗ＮｅｕＮ抗体のみ（プロービング濃度１μｇ／ｍＬ）を用いた以外は実施例２と同様に行い、再結晶の有無を比較した。

【0235】

結果

【0236】

マウス脳組織切片に対するＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを使用したＰＣ－ＭＴ標識抗ＮｅｕＮ抗体によるＭＩＨＣを、再結晶ありおよびなしのマトリックス（ＤＨＢ）昇華を使用して図１８に示す（カラー化ＭＡＬＤＩ－ＭＳ画像を示す）（方法については実施例１～２を参照）。図１８は、再結晶を適用した場合のマウス脳組織切片（実施例２参照）において強いシグナルおよび典型的な抗ＮｅｕＮパターンが観察されることを示す。再結晶なしでは、シグナルは画像内で視覚的に検出されない。昇華後のマトリックス再結晶化の効果を定量化するために、各組織切片について、対象の領域全体（図１８の点線の輪郭を参照）の各々から平均スペクトルを生成した。これらの平均スペクトルから、ＰＣ－ＭＴのモノアイソトピックピーク強度は、再結晶ありおよび再結晶なしでそれぞれ５５．４および２．５であった。重要なことに、これは、ＭＩＨＣのＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ工程のために、昇華後のマトリックス再結晶化が堅牢なＰＣ－ＭＴシグナルに必要であることを実証している。

【0237】

実施例１２。抗癌免疫チェックポイント阻害剤薬物に関連するバイオマーカーのマルチプレックスイメージングのための質量分析に基づく免疫組織化学（ＭＩＨＣ）

【0238】

背景

【0239】

免疫チェックポイント経路の正常な生物学的機能は、例えばＴ細胞応答の抑制による末梢免疫寛容の維持である。この証拠では、免疫チェックポイント経路の重要なタンパク質（ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１）が欠損したマウスは、自己免疫型障害を発症する［ＨａａｎｅｎおよびＲｏｂｅｒｔ（２０１５）Ｐｒｏｇ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓ ４２：５５－６６］。現在、Ｔ細胞の活性化が、活性化されたＴ細胞上のＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイントの発現を誘導し、それが次に、負のフィードバックの形態としてＴ細胞シグナル伝達および活性化を抑制することがよく知られている［ＳｈａｒｍａおよびＡｌｉｓｏｎ（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８：５６－６１、Ｄａｒｖｉｎ，Ｔｏｏｒら（２０１８）Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ５０：１－１１、Ｗｅｉ，Ｄｕｆｆｙら（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ８：１０６９－１０８６］。しかしながら、この免疫抑制はまた、有益な抗腫瘍免疫応答をブロックすることができ、場合によっては、腫瘍自体が免疫チェックポイントをその利点まで乗っ取ることができる。例えば、腫瘍細胞は、活性化Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合して抗腫瘍免疫応答を抑制するＰＤ－Ｌ１リガンドを発現することができる［ＳｈａｒｍａおよびＡｌｉｓｏｎ（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８：５６－６１、Ｄａｒｖｉｎ，Ｔｏｏｒら（２０１８）Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ５０：１－１１、Ｗｅｉ，Ｄｕｆｆｙら（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ８：１０６９－１０８６］。現在、いくつかの抗体治療薬、例えば、ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－Ｌ１／２とのその相互作用を防止し、それによって免疫抑制を防止するペムブロリズマブ（ニュージャージー州ケニルワース、ＭｅｒｃｋのＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）として販売）が存在する（同様に、例えばＰＤ－Ｌ１に対する治療用抗体もこの相互作用をブロックする）［Ｋｗｏｋ，Ｙａｕら（２０１６）Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １２：２７７７－２７８９、Ｗｅｉ，Ｄｕｆｆｙら（２０１８）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ８：１０６９－１０８６］。現在ＦＤＡが承認している免疫チェックポイント阻害剤薬物としては、ＣＴＬＡ－４に特異的なイピリムマブ、ＰＤ－１に特異的なニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびセミプリマブ、ならびにＰＤ－Ｌ１に特異的な、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブが挙げられる［Ｖａｄｄｅｐａｌｌｙ，Ｋｈａｒｅｌら（２０２０）Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１２］。これらの薬物は、画期的な地位を獲得し［Ｄａｒｖｉｎ，Ｔｏｏｒら（２０１８）Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ５０：１－１１］、様々な癌に対して有効であるが［ＳｈａｒｍａおよびＡｌｉｓｏｎ（２０１５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８：５６－６１、Ｇｏｒｒｉｓ，Ｈａｌｉｌｏｖｉｃら（２０１８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：３４７－３５４］、持続的応答は患者の２０～４０％においてのみ達成される［Ｇｏｒｒｉｓ，Ｈａｌｉｌｏｖｉｃら（２０１８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：３４７－３５４］。したがって、どの患者が応答するか、および利用可能な治療の範囲のどれに応答するかを理解し、予測することに問題が残る。したがって、腫瘍自体および腫瘍微小環境内の浸潤免疫細胞の両方において、様々な既知の免疫チェックポイントおよび関連分子の発現を理解することが重要である［Ｇｏｒｒｉｓ，Ｈａｌｉｌｏｖｉｃら（２０１８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：３４７－３５４］。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７、およびＴＩＭ３を含む多数の既知の免疫チェックポイント分子を考慮すると、本発明のＭＩＨＣ技術などによる高マルチプレックス化ＩＨＣのための方法は、重要な臨床ツールとなる。

【0240】

方法

【0241】

乳癌バイオマーカーおよび浸潤免疫細胞のバイオマーカーについて実施例９に詳述されている１２プレックス抗体パネルをさらに拡大して、免疫チェックポイントおよびチェックポイント阻害剤薬物に関連する以下のバイオマーカーＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＴＩＭ３に対するＰＣ－ＭＴ抗体を含めることを除いて、実施例２および９と同様にＭＩＨＣを実施する。パネル中の他の抗体と重複しないように、これらの新規抗体を、実施例１、２および９からの方法を使用して、合計２０プレックス抗体パネルについて、質量ユニット７～１４を含有するＰＣ－ＭＴ（表１参照）で標識する。

【0242】

ＰＣ－ＭＴ標識用の抗体は、ＡＢＣＡＭ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から市販されており、以下の組換え抗ＰＤｌ抗体［ＣＡＬ２０］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２５１６１３）、組換え抗ＰＤ－Ｌ１抗体［７３－１０］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２２６７６６）、組換え抗ＰＤ－Ｌ２抗体［ＥＰＲ１１６３（２）］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２１５２５４）、組換え抗ＣＴＬＡ４抗体［ＣＡＬ４９］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２５１５９９）、ヒトＯＸ４０抗体ペア－ＢＳＡおよびアジドフリー（ＴＮＦＲＳＦ４）（ａｂ２４４０７６）（両方の抗体を試験し、最良を選択する）、組換え抗ＣＤ２７抗体［ＥＰＲ８５６９］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２５６５８３）、組換え抗ＣＤ２８抗体［ＥＰＲ２２０７６］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２４３５５７）、組換え抗ＴＩＭ３抗体［ＥＰＲ２２２４１］－ＢＳＡおよびアジドフリー（ａｂ２４２０８０）の通りである。

【0243】

上述の２０プレックス抗体パネル全体を使用することを除いて、実施例９に記載されているように、例としてＦＦＰＥ乳癌組織に対してＭＩＨＣを実施する。しかしながら、本発明は、ＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）またはＦＦ（新鮮凍結）として調製された組織を含むがこれらに限定されない任意の腫瘍タイプに適用可能である。

【0244】

結果

【0245】

このアプローチは、癌バイオマーカー、浸潤免疫細胞のバイオマーカーおよび免疫チェックポイントのバイオマーカーの同時マルチプレックスイメージング（実施例９に類似するが、上述の追加されたバイオマーカーを有する）を可能にして、癌の診断、予後、および免疫チェックポイント阻害剤などの治療の誘導に関する重要な情報を病理学者に提供することが予想される。

【0246】

実施例１３。グリカンの標的化マルチプレックス質量分析イメージングのためのＰＣ－ＭＴレクチン。

【0247】

背景

【0248】

この実施例は、組織ＭＳＩのためのＰＣ－ＭＴ標識レクチンプローブの使用を記載する。レクチンは、通常は植物に由来する炭水化物結合タンパク質の一種である（前述）。ＰＣ－ＭＴ標識レクチンプローブは、組織中のＮ－およびＯ－グリカンのＭＳＩに使用することができるが、Ｏ－グリカンには特に重要であり、それによって、Ｎ－グリカンとは異なり、インサイツ組織消化とそれに続く直接的非標識ＭＳＩに適したグリコシダーゼは存在しない。むしろ、Ｏ－グリカンは、コアＧａｌ－β（１→３）－ＧａｌＮＡｃ炭水化物のみが残るまで連続的に化学的に分解されなければならず、その時点でＯ－グリコシダーゼがコア除去のために使用され得るが、これらの手順は、インサイツ消化および組織の直接的非標識ＭＳＩに適していない［Ｐｏｉｒｏｕｘ，Ｂａｒｒｅら（２０１７）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １８、ＷｉｌｋｉｎｓｏｎおよびＳａｉｄｏｖａ（２０２０）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ １９：３８９０－３９０５］。ＰＣ－ＭＴ標識レクチンプローブはこの問題を回避し、したがって組織中のＮ－グリカンおよびＯ－グリカンの両方の標的化高マルチプレックス化ＭＳＩを促進する。重要なことに、レクチンは、Ｎ－グリカンおよびＯ－グリカンに結合するために存在する［ＴｓａｎｅｖａおよびＶａｎ Ｄａｍｍｅ（２０２０）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ ３７：５３３－５５１］だけでなく、例えば、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）凝集素レクチン（ＰＮＡ）は、Ｏ－グリカンのＧａｌ－β（１→３）－ＧａｌＮＡｃコアに対して選択的であり［ＣｈａｃｋｏおよびＡｐｐｕｋｕｔｔａｎ（２００１）Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ ２８：３６５－７１、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｄａｒｖｉｌｌら（２０１５）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ：６１１－６２５］、Ｏ－グリカンをＮ－グリカンと区別するために使用することができる。Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌａ由来のジャカリンレクチンおよびＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓレクチンもＯ－グリカンＴ／Ｔｎ抗原に特異的である［Ｐｏｉｒｏｕｘ，Ｂａｒｒｅら（２０１７）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １８］。Ｏ－グリカンは、Ｏ－グリカンの変化が癌に繰り返し関連しているので、特に重要である［ＣｈａｃｋｏおよびＡｐｐｕｋｕｔｔａｎ（２００１）Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ ２８：３６５－７１、Ｐｏｉｒｏｕｘ，Ｂａｒｒｅら（２０１７）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １８］。発明の詳細な説明で論じたように、レクチンおよび抗体などの様々なタイプのプローブを組み合わせてもよく、すべての種類のＰＣ－ＭＴプローブを他の「オミック」ＭＳＩアプローチ（例えば、直接的非標識メタボロミクスＭＳＩ）と組み合わせてもよいことに留意されたい。

【0249】

方法

【0250】

レクチンを実施例１の抗体と同様にＰＣ－ＭＴで標識し、以下の変更を加えた。プローブに対して１０倍モル比のＰＣ－ＭＴ標識試薬を維持し、したがって、レクチンは抗体とは分子量が異なるため、ＰＣ－ＭＴ標識試薬の量を適宜調整した。ＰＤ ＳｐｉｎＴｒａｐ Ｇ－２５ Ｃｏｌｕｍｎを使用する代わりに、この場合の未反応ＰＣ－ＭＴ標識試薬の除去は、Ｕｌｔｒａｃｅｌ再生セルロース膜からなるＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）を製造者の指示に従って使用して、４５０μＬのＴＢＳで６サイクル洗浄することによって達成された。フィルターユニットの公称分子量限界（ＮＭＷＬ）は、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ製）およびｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ 凝集素（ＰＨＡ－Ｅ４、ａｍｓｂｉｏ製）レクチンについては１０ｋＤａであり、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ製）およびｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ凝集素（ＤＢＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ製）レクチンについては５０ｋＤａであった。各レクチンを以下の、ＷＧＡ、ＰＮＡ、ＰＨＡ－Ｅ４、およびＤＢＡレクチンについて、それぞれＰＣ－ＭＴ質量ユニットＩＤ１、Ｉｓｏ－１．２、Ｉｓｏ－１．３、および１．２（詳細については表１を参照）のように固有のＰＣ－ＭＴで標識した。

【0251】

その後のマウス脳の矢状方向のＦＦＰＥ切片の組織処理は、この場合には必要でなかったので、抗原賦活化工程を省略したことを除いて、実施例２と同様に行った。したがって、行われた処理工程は、脱パラフィン、水和、ブロッキング、プロービング／染色（この場合、ＰＣ－ＭＴレクチンを用いる）、洗浄、乾燥、光切断、ＤＨＢマトリックス昇華／再結晶およびＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ（免疫蛍光は行わなかった）であった。例えば、ＰＣ－ＭＴレクチンプローブをＰＣ－ＭＴ抗体プローブと組み合わせる場合には、抗原賦活化を依然として使用することができることに留意されたい。組織切片のマルチプレックスプローブ／染色のために、４つすべての前述のＰＣ－ＭＴ標識レクチンを一緒に混合し、濃度は１～２０μｇ／ｍＬの範囲であった。場合によっては、ＰＣ－ＭＴレクチンプローブ／染色混合物に、可溶性糖Ｎ，Ｎ’，Ｎ”－トリアセチルキトトリオース（ＴＣＴ、ＷＧＡレクチンに結合する）を１ｍＭ濃度で補充し、組織プローブ／染色の前に３０分間プレインキュベートした（可溶性糖は組織プローブ／染色中に存在したままであった）。これは、競合的阻害によるＰＣ－ＭＴレクチン（ＷＧＡ）染色の特異性を確認するためであった。

【0252】

結果

【0253】

図１９ａは、３つのレクチン、ＰＨＡ－Ｅ４、ＰＮＡおよびＷＧＡに対応するＰＣ－ＭＴレポーターのモノアイソトピック質量スペクトルピークのカラー化質量画像である。結果は、マウス脳組織切片を蛍光標識レクチンで染色したＫｉｔａｄａらによる以前の文献報告と一致する［Ｋｉｔａｄａ，Ｋｕｒｏｄａら（２０１１）Ａｎａｔ Ｒｅｃ（Ｈｏｂｏｋｅｎ）２９４：３０５－２１］。注目すべきことに、Ｋｉｔａｄａらにおいて、ＰＣ－ＭＴレクチンおよびＭＳＩを用いてここで観察されたように、ＰＨＡ－Ｅ４レクチン染色は、いくらかのＷＧＡ染色と共に脈絡叢で優勢であった（脈絡叢を図１９ａに示し、図１９ｂも参照）。一方、Ｋｉｔａｄａらにおいて、ＰＮＡレクチンは、脳の白質、すなわち有髄軸索を優先的に染色した。したがって、ここでのＰＣ－ＭＴ ＰＮＡレクチン染色（図１９ａの緑色）は、予想されるように、以前に観察されたＰＣ－ＭＴミエリン抗体染色と一致する（以前のＰＣ－ＭＴミエリン抗体染色については、実施例２、図７ａ、赤色を参照）。

【0254】

最後に、組織へのＰＣ－ＭＴレクチン結合の特異性を実証するために、ＰＣ－ＭＴレクチンプローブ／染色混合物を１ｍＭの可溶性糖Ｎ，Ｎ’，Ｎ”－トリアセチルキトトリオース（ＴＣＴ）とプレインキュベートし、この糖は、ＷＧＡ結合の競合的阻害（ブロッキング）のための組織プローブ／染色工程中に存在したままであった（ＴＣＴはＷＧＡに特異的に結合するため［Ｄａｍｍ，Ｍｉｋｋａｔら（２００４）Ｐａｎｃｒｅａｓ ２８：３１－７］）。図１９ｂのＰＣ－ＭＴ質量画像で観察されるように、ＴＣＴブロッキングを使用しなかった場合、優勢なＷＧＡ染色が観察された（図１９ｂの青色）。ＴＣＴブロッキングを使用した場合、ＷＧＡ染色は選択的に阻害されたが、他のレクチン、ＰＨＡ－Ｅ４（赤色）およびＰＮＡ（緑色）による染色は依然として観察された。この結果を定量化するために、ＴＣＴブロッキングの有無にかかわらず、各組織切片の全体からの全体平均スペクトルを得た（図１９ｃ）。ＴＣＴブロッキングを使用した場合（オレンジ色のトレース）、ＷＧＡ ＰＣ－ＭＴシグナル強度は、ＴＣＴブロッキングなし（紫色のトレース）と比較して７０％低下したが、他の２つのレクチン、ＰＮＡおよびＰＨＡ－Ｅ４のピーク強度は、ＴＣＴブロッキングの有無で実質的に同一であり、それにより特異性が実証された。

【0255】

実施例１４。改善されたマルチオミックＭＳＩ：同じＦＦ組織切片上の脂質の非標的化非標識ＭＳＩおよび標的化ＭＩＨＣ

【0256】

方法

【0257】

この実施例は、マウス脳の矢状方向のＦＦ組織切片を使用して、ＰＣ－ＭＴ標識抗体（ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ）を用いたその後のＭＩＨＣ工程の前に、（この場合は内因性脂質の）最初の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの後の、より良好な組織固定および未固定の小さな内因性有機化合物のより良好な除去のためのいくつかの増強を除いて、実施例４と同じように実施した。したがって、内因性脂質の最初の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの後、組織切片に対して以下を実施した（各処理工程を別々の染色ジャーで）。－８０℃のアセトンで３分間、予備洗浄を２回行い（溶媒固定を提供しながら、以前のＭＡＬＤＩ－ＭＳＩから残りのマトリックス化合物を除去するのに役立つことに留意）、１０分間真空し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１％ＰＦＡを使用して３０分間固定し（この溶液は、１．０ｇのＰＦＡを、１．０ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨを含む６０ｍＬのＰＢＳに約６０℃の加熱ブロックで絶えず撹拌しながら溶解し、続いて１Ｍ ＨＣｌ［約１ｍＬ］でｐＨを７．４に調整し、ＰＢＳで最終容量を１００ｍＬに調整することによって新たに調製したことに留意）、ＰＢＳで１０分間、１回洗浄し、それぞれ室温のアセトンで３分間、２回洗浄し、さらなる固定のためにカルノワ溶液６：３：１ ＥｔＯＨ／クロロホルム／酢酸）で３分間、１回洗浄し、未固定の内因性有機化合物をさらに除去する。その後のＰＣ－ＭＴ－ＡｂベースのＭＩＨＣの残りの工程は、抗原賦活化工程から最後まで実施例２と同様に行った。

【0258】

結果

【0259】

質量画像を図２０に示す。図２０ａは、内因性脂質の最初の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩであり（例示的な脂質が表示されている図２０ａを参照）、図２０ｂは、その後のＭＩＨＣであり、選択された抗体ＰＣ－ＭＴ（抗体ＰＣ－ＭＴが表示されている図２０ｂを参照）を示し、図２０ｃは、最初の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩおよびその後のＭＩＨＣ（図２０ｃを参照）からの選択された分析物間の画像合成である。脂質スルファチド（ＳＴ）とミエリンとの予想される共局在であるが、ＳＴとＮｅｕＮとの間ではないことは、実施例４で説明される。

【0260】

実施例１５。マルチオミック組織イメージング：ボトムアッププロテオームＭＳＩと組み合わされたＭＩＨＣ。

【0261】

「ＰＣ－ＭＴ－プローブを使用したマルチオミック組織イメージング」という見出しのセクションの下の発明の詳細な説明には、ＰＣ－ＭＴプローブ技術を組み込んだマルチオミックイメージングアプローチの広範囲の順列が記載されている。以下の実施例は、そのようなアプローチのいくつかの順列を示すが、本発明の範囲を限定することを意図しない。

【0262】

方法

【0263】

乳癌ＦＦＰＥ組織切片を実施例９と同様に使用する。

【0264】

一実施形態では、グリコシダーゼＰＮＧａｓｅ Ｆを用いたインサイツ組織グリカン消化、続いて遊離グリカンの直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを、Ｄｒａｋｅら［Ｄｒａｋｅ，Ｐｏｗｅｒｓら（２０１８）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ９４：ｅ６８］に従って行う。次に、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの後、ＭＡＬＤＩ－ＭＳマトリックスをそれぞれ室温のアセトン（染色瓶中）で３分間、２回洗浄することによって除去し、次いで組織を真空下で１０分間完全に乾燥させる。次に、実施例９と同様に１２プレックスＭＩＨＣを実施して、乳癌ならびに腫瘍浸潤リンパ球／免疫細胞の高分子タンパク質バイオマーカーを検出する（ただし、実施例９の脱パラフィン工程は、Ｄｒａｋｅらの工程に従って既に行われているため、省略される）。

【0265】

別の実施形態では、（標的化）ＭＩＨＣを最初に実施し、続いて組織切片のインサイツプロテアーゼ消化を実施し、（内因性組織タンパク質由来の）遊離したタンパク質分解断片の直接的非標的化非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを実施する。例えば、図２２を参照されたい。この場合、最後の工程としてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを含む実施例９のようにＭＩＨＣが再び実行される。次いで、ＭＡＬＤＩ－ＭＳマトリックスをそれぞれ室温のアセトン（染色瓶中）で３分間、２回洗浄することによって除去し、次いで組織を真空下で１０分間完全に乾燥させる。その後のインサイツロテアーゼ（トリプシン）消化および遊離タンパク質分解断片の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは、脱パラフィン工程および抗原賦活化工程がＭＩＨＣプロセスごとに既に行われているので省略されることを除いて、Ｌａｚｏｖａら［Ｌａｚｏｖａ，Ｓｍｏｏｔら（２０２０）Ｊ Ｃｕｔａｎ Ｐａｔｈｏｌ ４７：２２６－２４０］に従って行われる。最後に、別の実施形態では、（内因性組織タンパク質由来のタンパク質分解断片のみが検出されるように）その後の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩのためのインサイツタンパク質分解消化の前に、最初のＭＩＨＣプロセスから抗体（およびタンパク質性ブロッキング剤）を除去することが望ましい場合がある。この場合、ＭＩＨＣプロセスの最後の工程からのＭＡＬＤＩ－ＭＳマトリックスは、再度、それぞれ室温のアセトンで３分間、２回洗浄することによって除去される（ジャーを染色する際のすべての工程）が、しかしながら、次いで、組織は、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４中の１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ界面活性剤の溶液において６５℃で５分間の変性処理に供される。この変性処理は、抗体プローブ（およびタンパク質性ブロッキング剤）を組織から分離するのに役立つ。これに続いて、プレーンな５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で３分間ずつ２回洗浄し、次いで、室温のアセトンで３分間ずつ２回洗浄する（これは、組織からのＳＤＳ界面活性剤の完全な除去をさらに助ける）。次いで、組織を真空下で１０分間完全に乾燥させる。その後のインサイツロテアーゼ（トリプシン）消化およびタンパク質分解断片の直接的非標識ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは、再度、Ｌａｚｏｖａら［Ｌａｚｏｖａ，Ｓｍｏｏｔら（２０２０）Ｊ Ｃｕｔａｎ Ｐａｔｈｏｌ ４７：２２６－２４０］に従って行われる（しかし、再度、Ｌａｚｏｖａらの脱パラフィン工程および抗原賦活化工程は、ＭＩＨＣプロセスごとに既に行われているので省略される）。

【0266】

結果

【0267】

ＭＩＨＣの結果をボトムアップＭＳＩアプローチと組み合わせることにより、いずれかのアプローチ単独と比較して、組織からのはるかに大きな空間情報コンテンツが得られる。これは、例えば、Ｌａｚｏｖａらの機械学習統計的アプローチによって決定されるような、より良好なバイオマーカー「シグネチャ」をもたらすと予想され、例えば、腫瘍組織上の癌において、診断、ステージ分類、予後判定、サブタイプ決め、および患者の予後改善のための最適な処置経路の予測に使用することができる。

【0268】

実施例１６。非イメージング質量分析用途におけるＰＣ－ＭＴプローブ。

【0269】

背景

【0270】

ＰＣ－ＭＴ－プローブはまた、質量分析イメージング用途に限定されず、非イメージング質量分析（ＭＳ）用途と併せて使用することができる。例えば、一群のＰＣ－ＭＴ－プローブは、不均一なサンプルの成分の存在を同定するために、組織または組織の切除された部分、腫瘍、腫瘍に由来する（または任意の組織に由来する）細胞、液体生検、細胞培養物、血液および他の体液、細菌細胞および培養感染病原体を含むがこれらに限定されない不均一な生物学的サンプルに付与することができる。例えば、生物学的サンプル中に存在する病原体は、病原体または複数の病原体に特徴的な抗原を標的とする１またはそれを超えるＰＣ－ＭＴ抗体（ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ）プローブを使用して同定することができる。読み出しは、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ）の前に液体クロマトグラフィーの有無にかかわらず、ＭＡＬＤＩ－ＭＳまたはＥＳＩ－ＭＳを含むがこれらに限定されない非イメージング質量分析法を使用した光切断（光放出）ＰＣ－ＭＴの検出によるものであり、これは、質量分析の前に分析物をさらに精製（例えば、脱塩）する必要がある場合があるとして当業者によって認識される。一実施形態では、ＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックを引き起こす原因となるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの特定の変異体に特異的な抗原／エピトープを、スパイクタンパク質抗原および／またはそのエピトープなどのこれらの抗原／エピトープを標的とするＰＣ－ＭＴ－Ａｂプローブを使用して同定することができる。第２の実施形態では、腫瘍生検に存在する腫瘍浸潤リンパ球上に存在する特異的抗原／エピトープを、特異的ＰＣ－ＭＴ－Ａｂプローブで標的化し、非イメージング質量分析を使用して検出して、腫瘍内の様々な免疫細胞型の存在を決定することができ、これは例えば、予後および治療上有用な情報を提供することができる。この非イメージングアプローチのために空間情報が失われるが、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーを含む免疫診断の当業者には、生物学的サンプルへの抗体（または他のプローブタイプ）の特定の組み合わせの正の結合を使用して、感染性疾患の場合に細菌細胞またはウイルスなどのサンプルの特定の成分の存在を同定することができることが周知である。サンプル中の特定のバイオマーカーの存在を検出するこの標的化アプローチは、サンプルの成分（例えば、生物学的混合物の成分）を同定するために、小分子、脂質、代謝産物およびタンパク質の特定の組み合わせの非標的化検出などの他の質量分析方法と組み合わせることができる。以下に示す実験例では、表面へのＰＣ－ＭＴ－プローブ（ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ）の結合、続いて、ＰＣ－ＭＴの光放出および光放出されたＰＣ－ＭＴの非イメージング質量分析が実証される。この場合、ＰＣ－ＭＴ－Ａｂが結合した表面はビーズであったが、最終的には、任意の種類のＰＣ－ＭＴ－プローブを上記に例示したような任意のサンプルに結合させることができる。

【0271】

方法

【0272】

ＰＣ－ＭＴ（表１の質量ユニットＩｓｏ－１．１）およびＰＣ－ＭＴ－Ａｂを実施例１と同様に調製した。なお、この場合、モデルＰＣ－ＭＴ－Ａｂとして、精製ウサギＩｇＧを用いた（「実験例の材料」のセクション参照）。

【0273】

得られたＰＣ－ＭＴ－ＡｂをプロテインＧアガロースビーズ（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合させ、次いでビーズを洗浄して未結合ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを除去し、次いでビーズ結合したＰＣ－ＭＴ－ＡｂからＰＣ－ＭＴを光放出させ、上清中に存在する光放出されたＰＣ－ＭＴに対して非イメージングＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析を行った。完全な手順は以下の通りであった。特に明記しない限り、プロテインＧアガロースビーズを０．５ｍＬ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ０．４５μｍフィルターデバイス（「実験例の材料」セクションを参照）中で処理した（洗浄は、洗浄溶液中でビーズを短時間ボルテックス混合し、続いて標準的な微量遠心機で１５，０００ｒｐｍで短時間回転させ、次いで、洗浄されたビーズがフィルターデバイスの上部チャンバ内に保持されている間、濾液をフィルターデバイスの底部チャンバで廃棄することによって行ったことに留意されたい）。１μＬのビーズペレット体積を各サンプルに使用した（各サンプルは別々のフィルターデバイスで並行して処理された）。各サンプルのビーズを最初に４００μＬのＯＢＧ－生理食塩水で４回、簡単に予備洗浄した（製剤については実施例６を参照）。次いで、洗浄した各ビーズペレットを１００μＬのＰＣ－ＭＴ－Ａｂ溶液に再懸濁した（ＯＢＧ－生理食塩水でＰＣ－ＭＴ－Ａｂ濃度０．６２５、１．２５、２．５、５、７．５および１０μｇ／ｍＬで調製）。ビーズを３０分間穏やかに混合して（光から保護して）、ビーズ上のプロテインＧにＰＴ－ＭＴ－Ａｂを結合させた。次いで、ビーズを４００μＬのＯＢＧ－生理食塩水で４回、簡単に洗浄し、続いて４００μＬの質量分析グレードの水（ｗａｓｔｅｒ）（ＭＳ－水）で４回、簡単に洗浄して、未結合ＰＣ－ＭＴ－Ａｂを除去した。

【0274】

次いでビーズを再懸濁し、１００μＬのＭＳ－水中の透明な薄壁ポリプロピレンＰＣＲ型微小遠心管に移した。次いで、ビーズを標準的な微小遠心機で１５，０００ｒｐｍで短時間スピンダウンした後、約８０μＬの上清を廃棄し、約２０μＬのＭＳ－水をチューブおよびビーズペレットに残した。ビーズを短時間の混合によってチューブに再懸濁し、２５％出力（３６０ｎｍで３０ｍＷ／ｃｍ^２）でＨｏｎｌｅ ＬＥＤ Ｃｕｂｅ １００ＩＣ（マサチューセッツ州マルボロのＨｏｎｌｅ ＵＶ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してチューブの側壁を通して５分間ＵＶ光に曝露した（チューブをその側面に配置した）。ビーズをチューブに入れたまま、次に２０μＬの以下の溶液を各サンプルに添加した。１０ｍｇ／ｍＬのアルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、８０％のアセトニトリル、０．２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および２５フェムトモル／μＬの配列ＡＰＲＬＲＦＹＳＬを有する未修飾対照ペプチド（ニュージャージー州ピスカタウェイのＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙによってカスタム合成）。次いで、ビーズを１５分間混合して、光放出されたＰＣ－ＭＴの完全抽出を可能にした。ビーズを標準的な微小遠心機で１５，０００ｒｐｍで短時間スピンダウンし、次いで、２μＬの各サンプル上清（ビーズを含まない）を、ｒａｐｉｆｌｅＸ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ装置（マサチューセッツ州ビレリカのＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）での標準的な非イメージングＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析のために標準的スチールＭＡＬＤＩ－ＭＳ標的上にスポットした。

【0275】

結果

【0276】

図２１ａは、プロテインＧビーズに添加された６つの異なる濃度のＰＣ－ＭＴ－Ａｂに対応する６つのサンプルからの光放出されたＰＣ－ＭＴの非イメージングＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析からのスペクトルを示す。光放出されたＰＣ－ＭＴ（レポーター）および対照ペプチドモノアイソトピックピークは、予想通り、それぞれｍ／ｚ１，２１０．６および１，１２２．６で観察される。結果を定量化するために、対照ペプチド（固定濃度であった）に対する光放出されたＰＣ－ＭＴのモノアイソトピックピーク強度の比を計算し、図２１ｂにグラフ化した。ＰＣ－ＭＴ－Ａｂ濃度の関数としての線形応答が観察される（Ｒ^２＝０．９７７９）。

【0277】

上記の明細書で言及されたすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を実施するための記載された態様の様々な修正は、当業者およびそれに関連する分野で明らかであり、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図11I】

【図11J】

【図11K】

【図11L】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【手続補正書】

【提出日】2023-05-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単一スライド上の組織サンプル中の複数の異なるタイプのバイオマーカーを同時検出するためのマルチプレックス方法であって、
ａ）単一スライド上に組織サンプルを提供することと、
ｂ）前記組織サンプルへの抗体の結合をもたらすために前記組織サンプルを複数の異なる抗体と接触させることであって、前記抗体の各々が異なるバイオマーカーと反応性であり、前記抗体の各々が光切断可能な固有の質量タグにコンジュゲートされていることと、
ｃ）工程ｄ）の前に前記質量タグの少なくとも一部を光切断するように前記光切断可能な質量タグに光を照射することと、
ｄ）質量分析イメージングを使用して、前記質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む、方法。

【請求項2】

工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、前記組織サンプルに対して直接的質量分析イメージングを実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記複数の異なる抗体が混合物中にあり、工程ｂ）の前記組織サンプルを前記混合物と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記質量タグが非希土類金属質量タグである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記質量タグが複数のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記単一スライドにマウントする前に、前記組織サンプルを新鮮凍結し、薄片化した、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記スライドが金を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記スライドが金層を有するガラススライドである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記単一スライドにマウントする前に、前記組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記組織サンプルが、前記サンプルを抗体と接触させる前記工程の前に処理に供され、前記処理が脱パラフィンを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記脱パラフィンがキシレンを用いて行われる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記組織サンプルがさらに処理に供され、前記処理が再水和を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記再水和が一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて行われる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記組織サンプルがさらに処理に供され、前記処理が抗原賦活化を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記抗原賦活化が、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での加熱によって行われる、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記抗原賦活化がギ酸を使用して行われる、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

光切断可能な質量タグにコンジュゲートされている前記抗体が以下の一般構造：

【化11】

を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

工程ｄ）の前にマトリックス化合物が前記質量タグに付与される、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記マトリックス化合物が、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記マトリックス化合物が昇華によって付与される、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記組織サンプルが、前記サンプルをマトリックス化合物と接触させる工程の後に処理に供され、前記処理がマトリックス再結晶化を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記抗体にコンジュゲートされている光切断可能な質量タグが、質量ユニットにコンジュゲートされているコア構造を含み、前記抗体が、以下の一般構造：
質量ユニット－コア構造－抗体
を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記コア構造は、構造：

【化12】

を有する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記組織が腫瘍由来である、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記腫瘍が乳房腫瘍である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記複数の異なる抗体の少なくとも１つが、前記質量タグに加えて蛍光部分を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記異なる抗体の数が８つまたはそれを超える、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記異なる抗体のサブセットが、ｉ）エストロゲン受容体（ＥＲ）、ｉｉ）プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ｉｉｉ）ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）およびｉｖ）Ｋｉ６７と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記異なる抗体のサブセットが、Ｔ細胞バイオマーカーである、ｉ）ＣＤ３（Ｔ細胞）、ｉｉ）ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ｉｉｉ）ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）およびｉｖ）ＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞）と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記異なる抗体の１つがＢ細胞バイオマーカーＣＤ２０と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

前記異なる抗体の１つがマクロファージバイオマーカーＣＤ６８と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項32】

前記複数の異なる抗体の１つが免疫チェックポイント分子と反応する、請求項２７に記載の方法。

【請求項33】

前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２７７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0277】

上記の明細書で言及されたすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を実施するための記載された態様の様々な修正は、当業者およびそれに関連する分野で明らかであり、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
単一スライド上の組織サンプル中の５つまたはそれを超える異なるタイプのバイオマーカーを同時検出するためのマルチプレックス方法であって、
ａ）単一スライド上に組織サンプルを提供することと、
ｂ）前記組織サンプルへの抗体の結合をもたらすために前記組織サンプルを５つまたはそれを超える異なる抗体と接触させることであって、前記抗体の各々が異なるバイオマーカーと反応性であり、前記抗体の各々が固有の質量タグにコンジュゲートされていることと、
ｃ）質量分析イメージングを使用して、前記質量タグまたはその断片を分子イオンとして検出することと、を含む、方法。
（項目２）
工程ａ）の後であるが工程ｂ）の前に、前記組織サンプルに対して直接的質量分析イメージングを実施することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記５つまたはそれを超える抗体が混合物中にあり、工程ｂ）の前記組織サンプルを前記混合物と接触させる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記質量タグが非希土類金属質量タグである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記質量タグが複数のアミノ酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記単一スライドにマウントする前に、前記組織サンプルを新鮮凍結し、薄片化した、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記スライドが金を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記スライドが金層を有するガラススライドである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記単一スライドにマウントする前に、前記組織サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、薄片化した、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記組織サンプルが、前記サンプルを抗体と接触させる前記工程の前に処理に供され、前記処理が脱パラフィンを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記脱パラフィンがキシレンを用いて行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記組織サンプルがさらに処理に供され、前記処理が再水和を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記再水和が一連のエタノール／水混合物および水性生理食塩水緩衝液を用いて行われる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記組織サンプルがさらに処理に供され、前記処理が抗原賦活化を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記抗原賦活化が、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中での加熱によって行われる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記抗原賦活化がギ酸を使用して行われる、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
質量タグにコンジュゲートされている前記抗体が以下の一般構造を有し、Ｘがスペーサーである、項目１に記載の方法。
（項目１８）
工程ｃ）の前にマトリックス化合物が前記質量タグに付与される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記マトリックス化合物が、アルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）および３，５－ジメトキシ－４－ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記マトリックス化合物が昇華によって付与される、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記組織サンプルが、前記サンプルをマトリックス化合物と接触させる工程の後に処理に供され、前記処理がマトリックス再結晶化を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記質量タグが光切断可能である、項目１に記載の方法。
（項目２３）
工程ｃ）の前に前記質量タグの少なくとも一部を光切断するように前記質量タグに光を照射することをさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記組織が腫瘍由来である、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記腫瘍が乳房腫瘍である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記５つまたはそれを超える抗体の少なくとも１つが、前記質量タグに加えて蛍光部分を含む、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記異なる抗体の数が８つまたはそれを超える、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記異なる抗体のサブセットが、ｉ）エストロゲン受容体（ＥＲ）、ｉｉ）プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ｉｉｉ）ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）およびｉｖ）Ｋｉ６７と反応する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記異なる抗体のサブセットが、Ｔ細胞バイオマーカーである、ｉ）ＣＤ３（Ｔ細胞）、ｉｉ）ＣＤ４（Ｔヘルパー）、ｉｉｉ）ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）およびｉｖ）ＣＤ４５ＲＯ（メモリーＴ細胞）と反応する、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記異なる抗体の１つがＢ細胞バイオマーカーＣＤ２０と反応する、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記異なる抗体の１つがマクロファージバイオマーカーＣＤ６８と反応する、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
前記異なる抗体の１つが免疫チェックポイント分子と反応する、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＣＤ２７およびＴＩＭ３からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。

【手続補正書】

【提出日】2023-10-20

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0110】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0120】

場合によっては、追加のリジンをＰＣ－ＭＴのスペーサーユニットに含め、市販のアミン反応性試薬（例えば、メリーランド州ハントバレーのＬｕｍｉｐｒｏｂｅ製のＳｕｌｆｏ－Ｃｙ５－ＮＨＳ）を使用してフルオロフォアで修飾した。この場合、スペーサーユニットのアミノ酸配列は、非蛍光ＰＣ－ＭＴのＧＳＧＧ［Ｋ－ＮＨＳ］（配列番号３１）ではなく、ＧＳ［Ｋ－Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ５］ＧＧ［Ｋ－ＮＨＳ］（配列番号３０）であった。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0181】

以下の、組換え抗ＮｅｕＮ抗体（材料を参照）を、図３のように構成された（表１の質量ユニット１を有する）が、スペーサーユニットに付加されたリジンアミノ酸のｓ－アミンに結合したＳｕｌｆｏ－Ｃｙ５蛍光標識をさらに含むＰＣ－ＭＴにコンジュゲートしたしたことを除いて、実施例２と同様にマウス脳の矢状方向の組織切片に対するＭＩＨＣを実施した。したがって、Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１と呼ばれる質量ユニット１を有するこの蛍光ＰＣ－ＭＴの完全な配列は、以下の通りであった（Ｎ末端からＣ末端）。Ａｃｅｔｙｌ－ＡＰＲＬＲＦＹＳＬ－［ＰＣ－Ｌｉｎｋｅｒ］－ＧＳ［Ｋ－Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ５］ＧＧ－［Ｋ－ＮＨＳ］－ＣＯＯＨ（配列番号３２）。抗ＮｅｕＮ Ｆｌｕｏｒ－ＰＣ－ＭＴ１と呼ばれる得られた抗体プローブをＭＩＨＣに使用した。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２７４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0274】

次いでビーズを再懸濁し、１００μＬのＭＳ－水中の透明な薄壁ポリプロピレンＰＣＲ型微小遠心管に移した。次いで、ビーズを標準的な微小遠心機で１５，０００ｒｐｍで短時間スピンダウンした後、約８０μＬの上清を廃棄し、約２０μＬのＭＳ－水をチューブおよびビーズペレットに残した。ビーズを短時間の混合によってチューブに再懸濁し、２５％出力（３６０ｎｍで３０ｍＷ／ｃｍ^２）でＨｏｎｌｅ ＬＥＤ Ｃｕｂｅ １００ＩＣ（マサチューセッツ州マルボロのＨｏｎｌｅ ＵＶ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してチューブの側壁を通して５分間ＵＶ光に曝露した（チューブをその側面に配置した）。ビーズをチューブに入れたまま、次に２０μＬの以下の溶液を各サンプルに添加した。１０ｍｇ／ｍＬのアルファ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、８０％のアセトニトリル、０．２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および２５フェムトモル／μＬの配列ＡＰＲＬＲＦＹＳＬ（配列番号３３）を有する未修飾対照ペプチド（ニュージャージー州ピスカタウェイのＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙによってカスタム合成）。次いで、ビーズを１５分間混合して、光放出されたＰＣ－ＭＴの完全抽出を可能にした。ビーズを標準的な微小遠心機で１５，０００ｒｐｍで短時間スピンダウンし、次いで、２μＬの各サンプル上清（ビーズを含まない）を、ｒａｐｉｆｌｅＸ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ装置（マサチューセッツ州ビレリカのＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）での標準的な非イメージングＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析のために標準的スチールＭＡＬＤＩ－ＭＳ標的上にスポットした。

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2023548149000001.app

【国際調査報告】