特表2023-548957新型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステム及びその適用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-21
(54)【発明の名称】新型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステム及びその適用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/90 20060101AFI20231114BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231114BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231114BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20231114BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20231114BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231114BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231114BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231114BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231114BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231114BHJP
【ＦＩ】
C12N15/90 Z
C12N15/63 Z ZNA
C12N5/10
A61K31/713
A61K35/12
A61K35/17
A61K48/00
A61K31/7088
A61P43/00 111
A61P37/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023546379
(86)(22)【出願日】2021-10-12
(85)【翻訳文提出日】2023-05-18
(86)【国際出願番号】 CN2021123191
(87)【国際公開番号】W WO2022078310
(87)【国際公開日】2022-04-21
(31)【優先権主張番号】202011085981.6
(32)【優先日】2020-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523136226
【氏名又は名称】上海君賽生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＵＮＣＥＬＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】金 華 君
(72)【発明者】
【氏名】許 馥 慧
(72)【発明者】
【氏名】黄 晨
(72)【発明者】
【氏名】馬 星 明
(72)【発明者】
【氏名】劉 天 怡
(72)【発明者】
【氏名】郭 曉 春
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA24
4B065CA46
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZC41
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZC41
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA12
4C087CA20
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZC41
(57)【要約】
本発明は、トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターというエレメントを含む核酸コンストラクトを提供する。本発明は、前記核酸コンストラクトを含む宿主細胞又は医薬組成物及びその適用をさらに提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列というエレメントを含むか又はこれらのエレメントからなる核酸コンストラクトであって、好ましくは、前記核酸コンストラクトは、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、ポリクローナル挿入部位と、エンハンサーと、５’ＵＴＲと、第２のｐｏｌｙＡ配列と、注目外来遺伝子とから選ばれる１種又は複数種のエレメントをさらに含み、
好ましくは、前記トランスポザーゼのコード配列、該トランスポザーゼの発現を制御する前記プロモーター、前記５’ＵＴＲ、前記第２のｐｏｌｙＡ配列のうちの何れか１種又は複数種が、前記トランスポゾン３’末端反復配列と前記トランスポゾン５’末端反復配列との間の領域外に位置する、核酸コンストラクト。
【請求項2】
トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、を含む請求項１に記載の核酸コンストラクトであって、好ましくは、前記核酸コンストラクトは、ポリクローナル挿入部位と、エンハンサーと、５’ＵＴＲと、第２のｐｏｌｙＡ配列と、注目外来遺伝子とから選ばれる１種又は複数種をさらに含む、核酸コンストラクト。
【請求項3】
請求項２に記載の核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、５’ＵＴＲと、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、５’ＵＴＲと、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含むか、又は、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含むか、又は、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
【請求項4】
請求項１～３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは、前記トランスポザーゼの発現カセットの方向と、外来遺伝子の発現カセットの方向が同じ又は反対であること、
前記トランスポザーゼの発現カセットの方向と、トランスポゾン３’末端反復配列とトランスポゾン５’末端反復配列との間の配列の方向が同じ又は反対であること、
前記トランスポゾン５’末端反復配列と前記トランスポゾン３’末端反復配列が位置を交換できること、
前記トランスポゾン３’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列であること、
前記トランスポゾン５’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列であること、
前記エンハンサーがＣＭＶエンハンサー配列、ＳＶ４０エンハンサー、ヒトεグロブリン５’ＨＳ２エンハンサー、ニワトリβグロブリン遺伝子５’ＨＳ４エンハンサーから選ばれること、
前記トランスポザーゼがＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼであること、
前記５’ＵＴＲがＣ３遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、ＨＰＸ遺伝子、ＦＧＡ遺伝子、ＡＧＸＴ遺伝子、ＡＳＬ遺伝子、ＡＰＯＡ２遺伝子、ＡＬＢ遺伝子の５’ＵＴＲから選ばれること、
前記プロモーターがＣＭＶプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ｍｉｎｉＳＶ４０プロモーター、ｍｉｎｉＴＫプロモーター、ＭＬＰプロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＵｂｉｑｕｉｔｉｎＢプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、ＰＧＫ－１プロモーター、β－ａｃｔｉｎプロモーター、ＴＫプロモーター、ＧＲＰ７８プロモーターから選ばれること、
前記トランスポザーゼのコード配列がシングルコピー又はマルチコピーの核局在シグナルのコード配列を含み、或いはそれと操作可能に連結される特徴から選ばれる１つ又は複数を有す、ことを特徴とする、核酸コンストラクト。
【請求項5】
請求項１～３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは、前記トランスポゾン３’末端反復配列のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されること、
前記トランスポゾン５’末端反復配列のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されること、
前記ポリクローナル挿入部位の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されること、
前記第１のｐｏｌｙＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６に示されること、
前記第２のｐｏｌｙＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６に示されること、
前記エンハンサー配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２６～２８の何れか１つに示されること、
前記インスレーター配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は１５に示されること、
前記ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、好ましくは、前記ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されること、
前記５’ＵＴＲ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１７～２４の何れか１つに示されること、
前記プロモーターの配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～４２の何れか１項に示されること、
前記核局在シグナルがｃ－ｍｙｃ核局在シグナルであり、好ましくは、前記核局在シグナルがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される配列を有する特徴から選ばれる１つ又は複数を有することを特徴とする、核酸コンストラクト。
【請求項6】
請求項１～３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又は１４に示される配列を含み、又は
前記核酸コンストラクトが組換えベクターであり、好ましくは、前記核酸コンストラクトが組換えクローニングベクター又は組換え発現ベクターであることを特徴とする、核酸コンストラクト。
【請求項7】
宿主細胞であって、（１）請求項１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクト、及び／又は
（２）請求項１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクトのトランスポゾン３’末端反復配列とトランスポゾン５’末端反復配列との間の配列、を含み、
好ましくは、前記宿主細胞が哺乳類動物細胞であり、
より好ましくは、前記宿主細胞がＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれる、宿主細胞。
【請求項8】
請求項１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクト又は請求項８に記載の宿主細胞と薬学的に許容される添加物とを含む、医薬組成物。
【請求項9】
請求項１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクト又は請求項７に記載の宿主細胞の、薬物、試薬又はツールの製造における適用、或いは薬物、試薬又はツールとしての適用であって、前記薬物、試薬又はツールが外来遺伝子の発現カセットを標的細胞のゲノムに統合するために利用され、或いは遺伝子治療、細胞治療、幹細胞誘導又は分化に利用され、好ましくは、前記標的細胞が哺乳類動物細胞であり、
より好ましくは、前記標的細胞が免疫細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれ、
さらに好ましくは、前記免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、樹状細胞（ＤＣ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞の何れか１種又は複数種から選ばれる、適用。
【請求項10】
外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する方法であって、外来遺伝子と任意のそのプロモーターを含む請求項１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクトを前記細胞に導入すること、及び任意のトランスポザーゼにより外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する条件で前記細胞をインキュベートすること、を含み、前記外来遺伝子と任意のそのプロモーターが前記核酸コンストラクトのポリクローナル挿入部位に位置し、好ましくは、前記トランスポザーゼがＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はトランスポゾンベクター分野に関し、具体的に新型ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステム及びその適用に関する。
【背景技術】
【0002】
外来遺伝子を標的細胞の中に導入し安定的に発現させて、遺伝子組換えによる標的細胞の改変を図ることは、免疫細胞治療を含む数多くの細胞治療技術を実現するための必須条件である。一過性発現と比較すれば、安定発現の外来遺伝子は標的細胞のゲノムに組み込まれ可能であるため、細胞の複数回継代又は培養条件の変化にも関わらず、長時間で安定的に発現することができる。よく使われる遺伝子組換えシステムは、ウィルスに基づくベクター、真核発現プラスミドベクター、トランスポゾンベクターを含む。非ウィルスベクターに基づく方法によるヒト初代Ｔ細胞の遺伝子改変や修飾が非常に困難であることは証明されている。そのため、世界におけるラボの大半は依然として、例えば、レンチウィルスベクターシステムなどのレトロウィルスベクターを含むウィルスベクターシステムにより、細胞の遺伝子修飾を行っている。ウィルスベクターシステムは幅広く利用されているが、複雑なウィルス製造工程、比較的に高いセキュリティリスク、高い製造コストなどの厳しい課題が存在している。
【0003】
近年、トランスポゾンベクターシステムは免疫細胞の修飾に利用されるようになり、さらに腫瘍の免疫治療に利用される。最初に哺乳類動物に利用されるトランスポゾンは魚類由来の「眠り姫」（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾンであるが、過剰な抑制効果や持つ断片がやや小さい（５ｋｂ程度）などの欠陥が存在するため、哺乳類動物細胞の遺伝子組換え操作における利用が厳しく制限されている。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンはチョウ目由来のトランスポゾンシステムであり、大きい断片を持つことが可能であるため、様々な真核宿主細胞と統合することができる。ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンシステムは、主に「カット－ペースト」（ｃｕｔ－ｐａｓｔｅ）の仕組みにより転移が発生するが、転移発生後に元の部位でフットプリント（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）が残らないため、改変後にゲノム研究、遺伝子治療、細胞治療、幹細胞誘導、誘導後分化などの分野に利用されるようになっている。
【0004】
ＷＯ２０１９０４６８１５Ａ１では、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼを含むベクターと５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含むヘルパーベクターとを備える、従来のＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに基づく二元システムが開示されている。該ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムを電気穿孔法と組合せることで、外来遺伝子をＴ細胞、ＮＫ細胞、ＨＳＰＣ細胞に導入することができる。しかしながら、二元システムは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼベクターとヘルパーベクターを細胞に同時にトランスフェクションしなければ、転移が発生せず、トランスフェクションに対する要求が高いため、実現が困難である。また、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムの仕組みであるＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼについて、「カット－ペースト」（ｃｕｔ－ｐａｓｔｅ）の仕組みにより転移断片をゲノムに挿入するプロセスが可逆であるため、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが発現し続ける限り、ゲノムに統合された転移断片が再びカットされて、ゲノムが不安定になり、実質的に転移効率が低下された。一般のＰｉｇｇｙＢａｃ二元トランスポゾンシステムのＴ細胞における転移効率は、通常、１０％程度に留まり、効率が低い。さらに、ＷＯ２０１９０４６８１５Ａ１では、プラスミドＤＮＡについて、Ｔ細胞に対する傷害性が大きく、そのＴ細胞に対する傷害性と電気穿孔に利用されるＤＮＡの量が関連することも記載されている。二元システムにより、電気穿孔に必要なプラスミドＤＮＡの使用量が増加され、細胞、特にＴ細胞に対する傷害性が大きくなり、プラスミドＤＮＡをトランスフェクションするＴ細胞の生存率が低下されたことは、疑いようがない。
【0005】
ＣＮ１０５１５４４７３Ｂでは、一元ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターであって、従来の二元ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムにおけるＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼベクターとヘルパーベクターとを１つのベクターに合併し、同じ発現ベクターにおいてＰｉｇｇｙＢａｃの発現カセットと外来遺伝子の発現カセットが同じ両方向ｐｏｌｙＡ配列を共用し、統合されたＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットにおけるｐｏｌｙＡがカットされて自己不活性化（ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）される仕組みを構築することで、構成性ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの持続的発現が効果的に低減され、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの転移効率が向上されると共に、二元システムを一元シングルベクターに簡略化することで、ＤＮＡの総量が大幅に削減され、外来ＤＮＡのＴ細胞に対する傷害性が低減された、ベクターが開示されている。しかしながら、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットと外来遺伝子の発現カセットが同じ両方向ｐｏｌｙＡ配列を共用することにより、両方向における相応な発現カセットの間に互いに影響が与えられると共に、特定種類の細胞において該一元トランスポゾンベクターにより仲介される統合効率の更なる向上が期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そのため、現在、外来遺伝子を高効率的に統合すると共に、統合機能を早急に止める高効率一元トランスポゾンシステムは未だにない。
【課題を解決するための手段】
【0007】
発明者は、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに基づく統合システムであって、宿主細胞内で高効率的に統合すると共に、高効率的且つ安定的に発現するように、外来遺伝子を仲介する統合システムを構築した。
【0008】
本発明の一態様は、トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列というエレメントを含むか、又はこれらのエレメントからなる核酸コンストラクトに関する。１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、ポリクローナル挿入部位と、エンハンサーと、５’ＵＴＲと、第２のｐｏｌｙＡ配列と、注目外来遺伝子とから選ばれる１種又は複数種のエレメントをさらに含む。
【0009】
本発明は、トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターというエレメントを含む核酸コンストラクトをさらに提供する。
【0010】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、ポリクローナル挿入部位と、エンハンサーと、５’ＵＴＲと、第２のｐｏｌｙＡ配列と、注目外来遺伝子とから選ばれる１種又は複数種のエレメントをさらに含む。
【0011】
１つ又は複数の実施形態において、前記トランスポザーゼのコード配列、該トランスポザーゼの発現を制御する前記プロモーター、前記５’ＵＴＲ、前記第２のｐｏｌｙＡ配列のうちの何れか１種又は複数種が、前記トランスポゾン３’末端反復配列と前記トランスポゾン５’末端反復配列との間の領域外に位置する。
【0012】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含む。
【0013】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含む。
【0014】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含む。
【0015】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含む。
【0016】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含む。
【0017】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、５’ＵＴＲと、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含む。
【0018】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含む。
【0019】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、５’ＵＴＲと、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含む。
【0020】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含む。
【0021】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含む。
【0022】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含む。
【0023】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含む。
【0024】
１つ又は複数の実施形態において、前記ポリクローナル挿入部位は、前記外来遺伝子のコード配列と任意の外来遺伝子の発現を制御するプロモーターを操作可能に挿入するために利用される。
【0025】
１つ又は複数の実施形態において、第１のｐｏｌｙＡ配列と第２のｐｏｌｙＡ配列のテーリングシグナル機能の方向が同じ又は反対である。
【0026】
１つ又は複数の実施形態において、前記トランスポザーゼの発現カセットの方向と、外来遺伝子の発現カセットの方向が同じ又は反対である。
【0027】
１つ又は複数の実施形態において、前記トランスポザーゼの発現カセットの方向と、トランスポゾン３’末端反復配列とトランスポゾン５’末端反復配列との間の配列の方向が同じ又は反対である。
【0028】
１つ又は複数の実施形態において、上記各エレメントはそれぞれ独立的にシングルコピー又はマルチコピーである。
【0029】
１つ又は複数の実施形態において、上記各エレメントは直接連結され、或いはリンカー又は酵素切断部位により連結される。
【0030】
本発明の何れか１項に係る核酸コンストラクトによれば、前記トランスポゾン５’末端反復配列と前記トランスポゾン３’末端反復配列が位置を交換できる。
【0031】
１つ又は複数の実施形態において、前記トランスポゾン３’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列である。好ましい実施形態において、前記トランスポゾン３’末端反復配列のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。
【0032】
１つ又は複数の実施形態において、前記ポリクローナル挿入部位の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
【0033】
１つ又は複数の実施形態において、前記第１のｐｏｌｙＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６に示される。
【0034】
１つ又は複数の実施形態において、前記第２のｐｏｌｙＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６に示される。
【0035】
１つ又は複数の実施形態において、エンハンサーがＣＭＶエンハンサー配列、ＳＶ４０エンハンサー、ヒトεグロブリン５’ＨＳ２エンハンサー、ニワトリβグロブリン遺伝子５’ＨＳ４エンハンサーから選ばれる。好ましくは、エンハンサー配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２６～２８の何れか１つに示される。
【0036】
１つ又は複数の実施形態において、転写終結機能を有するインスレーター配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は１５に示される。
【0037】
１つ又は複数の実施形態において、前記トランスポゾン５’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列である。好ましい実施形態において、前記トランスポゾン５’末端反復配列のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される。
【0038】
１つ又は複数の実施形態において、前記トランスポザーゼがＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである。１つ又は複数の実施形態において、前記ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、好ましくは、前記ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される。
【0039】
１つ又は複数の実施形態において、５’ＵＴＲ配列がＣ３遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、ＨＰＸ遺伝子、ＦＧＡ遺伝子、ＡＧＸＴ遺伝子、ＡＳＬ遺伝子、ＡＰＯＡ２遺伝子、ＡＬＢ遺伝子の５’ＵＴＲから選ばれる。好ましくは、５’ＵＴＲ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１７～２４の何れか１つに示される。
【0040】
１つ又は複数の実施形態において、前記プロモーターがＣＭＶプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ｍｉｎｉＳＶ４０プロモーター、ｍｉｎｉＴＫプロモーター、ＭＬＰプロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＵｂｉｑｕｉｔｉｎＢプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、ＰＧＫ－１プロモーター、β－ａｃｔｉｎプロモーター、ＴＫプロモーター、ＧＲＰ７８プロモーターから選ばれる。好ましくは、前記プロモーターがｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ｍｉｎｉＳＶ４０プロモーター、ｍｉｎｉＴＫプロモーター、ＭＬＰプロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＹＢ＿ＴＡＴＡから選ばれる。１つ又は複数の実施形態において、前記プロモーターの配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、３７～４２の何れか１つに示される。好ましくは、前記プロモーターはｍｉｎｉＣＭＶプロモーターであり、その配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される。
【0041】
１つ又は複数の実施形態において、前記トランスポザーゼのコード配列がシングルコピー又はマルチコピーの核局在シグナルのコード配列を含み、或いはそれと操作可能に連結される。１つ又は複数の実施形態において、核局在シグナルはｃ－ｍｙｃ核局在シグナルであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される配列を有することが好ましい。
【0042】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又は１４に示される配列を含む。
【0043】
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトが組換えベクターである。
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトが組換えクローニングベクター又は組換え発現ベクターである。
１つ又は複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトが組換えクローニングベクター又は組換え発現ベクターである。
【0044】
本発明は、（１）本明細書の何れか１つの実施形態に記載の核酸コンストラクト、及び／又は（２）本明細書の何れか１つの実施形態に記載の核酸コンストラクトのトランスポゾン３’末端反復配列とトランスポゾン５’末端反復配列との間の配列、を含む宿主細胞をさらに提供する。
【0045】
１つ又は複数の実施形態において、前記宿主細胞が哺乳類動物細胞である。
１つ又は複数の実施形態において、前記宿主細胞が免疫細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれる。
１つ又は複数の実施形態において、前記宿主細胞が免疫細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれる。
【0046】
１つ又は複数の実施形態において、前記免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、樹状細胞（ＤＣ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞の何れか１種又は複数種
から選ばれる。
から選ばれる。
【0047】
本発明は、本明細書の何れか１つの実施形態に係る核酸コンストラクト又は宿主細胞と薬学的に許容される添加物とを含む、医薬組成物をさらに提供する。
【0048】
本発明は、本明細書の何れか１つの実施形態に係る核酸コンストラクト又は宿主細胞の、薬物、試薬又はツールの製造における適用、或いは薬物、試薬又はツールとしての適用であって、前記薬物、試薬又はツールが外来遺伝子の発現カセットを標的細胞のゲノムに統合するために利用され、或いは遺伝子治療、細胞治療、幹細胞誘導又は分化に利用される、適用をさらに提供する。
【0049】
１つ又は複数の実施形態において、前記標的細胞が哺乳類動物細胞である。
１つ又は複数の実施形態において、前記標的細胞がＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれる。
１つ又は複数の実施形態において、前記標的細胞がＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれる。
【0050】
本発明は、外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する方法であって、外来遺伝子と任意のそのプロモーターを含む本明細書の何れか１つの実施形態に係る核酸コンストラクトを前記細胞に導入すること、及び任意のトランスポザーゼにより外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する条件で前記細胞をインキュベートすること、を含む方法をさらに提供する。
【0051】
１つ又は複数の実施形態において、前記トランスポザーゼがＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである。
【0052】
１つ又は複数の実施形態において、前記導入がウィルスにより仲介される変換、マイクロインジェクション、粒子衝突、遺伝子銃変換、電気穿孔などを含む。本発明の一実施態様において、前記導入が電気穿孔である。
【0053】
１つ又は複数の実施形態において、前記細胞は少なくとも３代インキュベートする。
本発明は、本明細書に係る方法で得られた、ゲノムに外来遺伝子又はその発現カセットが統合された細胞をさらに提供する。
本発明は、本明細書に係る方法で得られた、ゲノムに外来遺伝子又はその発現カセットが統合された細胞をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1A】本明細書に係る核酸コンストラクトの模式図である。
【図1B】本明細書に係る核酸コンストラクトの模式図である。
【図2】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞の蛍光写真である。
【図3】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー結果である。
【図4】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞の生細胞数である。
【図5】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞におけるＰＢトランスポザーゼの発現レベルである。
【図6】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＫ５６２細胞の蛍光写真である。
【図7】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＫ５６２細胞の生細胞数である。
【図8】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＫ５６２細胞のフローサイトメトリー結果である。
【図9】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＫ５６２細胞の蛍光陽性率である。
【図10】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦをそれぞれ電気穿孔した初代Ｔ細胞の蛍光写真である。
【図11】ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＴ細胞のフローサイトメトリー結果である。
【図12】ダブルプラスミドＰＢトランスポゾンシステムをＪｕｒｋａｔ細胞に電気穿孔した陽性率結果である。
【図13】ダブルプラスミドＰＢトランスポゾンシステムを初代Ｔ細胞に電気穿孔した陽性率結果である。
【図14】低減したプラスミド使用量でｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞の陽性率である。
【図15】細胞内ベクター残留コピー数の経時変化である。
【図16】ｐＫＢ２００３－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞の陽性率である。
【図17】ｐＫＢ２０５－ＥＧＦＰを電気穿孔した初代Ｔ細胞の陽性率である。
【図18】Ｋ５６２サンプル１におけるｐＫＢ２０ベクターにより仲介されるゲノム統合部位の模式図である。
【図19】Ｋ５６２サンプル２におけるｐＫＢ２０ベクターにより仲介されるゲノム統合部位の模式図である。
【図20】Ｊｕｒｋａｔサンプル１におけるｐＫＢ２０ベクターにより仲介されるゲノム統合部位の模式図である。
【図21】Ｊｕｒｋａｔサンプル２におけるｐＫＢ２０ベクターにより仲介されるゲノム統合部位の模式図である。
【図22】ｐＫＢ２０－ＨＥＲ２ＣＡＲを電気穿孔した初代Ｔ細胞の陽性率フローサイトメトリー結果である。
【図23】ＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞ＳＫＯＶ－３に対するインビトロＲＴＣＡ殺傷結果である。
【図24】ｐＫＢ２０－ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを電気穿孔した初代Ｔ細胞の陽性率フローサイトメトリー結果である。
【図25】ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔの標的細胞Ａ３７５に対するインビトロＲＴＣＡ殺傷結果である。
【図26】ｐＮＢ３２８－ＥＧＦＰを電気穿孔したＫ５６２細胞の陽性率フローサイトメトリー結果である。
【図27】ｐＮＢ３２８－ＥＧＦＰを電気穿孔した初代Ｔ細胞の陽性率フローサイトメトリー結果である。
【発明を実施するための形態】
【0055】
本発明の範囲において、本発明の上記各技術特徴と下記（例えば実施例）で具体的に記述した各技術特徴を互いに組合せることで、好ましい実施形態を構成することができると理解すべきである。
【0056】
文脈から別途で明確に説明しない限り、本明細書と付属される特許請求範囲で使用する単数形式「１つ」、「１種」、「前記」は複数の意味を含む。同様に、「１つ」（又は「１種」）、「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」という用語は本明細書で互いに交換して使用できる。「含む」という用語及びその変化形式は制限の意味がなく、これらの用語が本明細書と請求項に使用されている。そのため、用語「含む」、「包含」、「含有」は互いに交換して使用できる。
【0057】
核酸コンストラクトと細胞
「核酸コンストラクト」という用語は本明細書で一本鎖又は二本鎖核酸分子と定義され、好ましくは人工的な核酸分子である。任意に、前記核酸コンストラクトは操作可能に連結される１つ又は複数の調節配列をさらに含み、前記調節配列はその適合性条件でコード配列が適切な宿主細胞において発現するように調節できる。発現はタンパク質又はポリペプチドの生成に関わる任意の工程を含み、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、分泌を含むが、これらに限定されないと理解すべきである。本明細書に係るトランスポゾンシステムは一元核酸コンストラクトが好ましく、即ち、１つの核酸コンストラクトで高効率的な転移が実現できる。
「核酸コンストラクト」という用語は本明細書で一本鎖又は二本鎖核酸分子と定義され、好ましくは人工的な核酸分子である。任意に、前記核酸コンストラクトは操作可能に連結される１つ又は複数の調節配列をさらに含み、前記調節配列はその適合性条件でコード配列が適切な宿主細胞において発現するように調節できる。発現はタンパク質又はポリペプチドの生成に関わる任意の工程を含み、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、分泌を含むが、これらに限定されないと理解すべきである。本明細書に係るトランスポゾンシステムは一元核酸コンストラクトが好ましく、即ち、１つの核酸コンストラクトで高効率的な転移が実現できる。
【0058】
本発明において、特別な説明がない限り、トランスポザーゼの発現カセットの方向を逆方向とする。上記「下記エレメントをこの順で含む」における「この順」という方向及び／又は順番とは上流から下流までの順である。本発明において、特別な説明がない限り、上記「正方向」の方向に沿うこととは上流から下流までであり、上記「逆方向」の方向に沿うこととは下流から上流までである。
【0059】
本発明において、「発現カセット」という用語は１つの遺伝子を発現するために必要な完全なエレメントであり、プロモーター、遺伝子のコード配列、ＰｏｌｙＡテーリングシグナル配列を含む。
【0060】
「操作可能に挿入／連結」という用語は、本明細書で、調節配列がタンパク質又はポリペプチドの発現を調節するように、調節配列がＤＮＡ配列のコード配列に対する適切な部位に位置するという配座と定義される。本発明の核酸コンストラクトにおいて、ＤＮＡ組換え技術によりポリクローナル部位に１つ又は複数の相同又は相異の外来遺伝子及び任意の外来遺伝子の発現を制御するプロモーターが操作可能に挿入され、或いはそのポリクローナル部位が１つ又は複数の相同又は相異の外来遺伝子のコード配列及び任意の外来遺伝子の発現を制御するプロモーターに取り替えられる。前記「操作可能に連結」はＤＮＡ組換えの手段により実現でき、具体的に前記核酸コンストラクトが組換え核酸コンストラクトである。
【0061】
本明細書に係る「外来遺伝子」は任意由来の核酸分子であってもよく、宿主細胞のゲノムに転移してから発現し、又は機能を果たす。外来遺伝子の非限定的な例として、フルオレセインレポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）、ルシフェラーゼ遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなど）、天然機能タンパク質遺伝子、ＲＮＡｉ遺伝子、人工キメラ遺伝子（例えば、キメラ抗原受容体遺伝子、Ｆｃ融合タンパク質遺伝子、完全長抗体遺伝子）を含む。
【0062】
「コード配列」という用語は、本明細書で、核酸配列におけるそのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に決定する部分と定義される。コード配列の境界は通常、ｍＲＮＡ ５’末端のオープンリーディングフレーム上流と隣接するリボソーム結合部位（原核細胞の場合）及びｍＲＮＡ ３’末端のオープンリーディングフレーム下流と隣接する転写終結配列によって決定される。コード配列はＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸配列を含んでも良いが、これらに限定されない。
【0063】
本明細書で「調節配列」という用語は、本発明のペプチドの発現に必要又は有利な全ての成分を含むと定義される。各調節配列はタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然又は外来のものであってもよい。これらの調節配列は、リーダー配列、ｐｏｌｙＡ配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、転写ターミネーターを含むが、これらに限定されない。最低限でも、調節配列はプロモーター及び転写と翻訳の終結シグナルを含む。特定の制限部位を導入して調節配列とタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域を連結するために、リンカー付きの調節配列を提供してもよい。
【0064】
調節配列は、適切なプロモーター配列であってもよく、即ち、核酸配列を発現する宿主細胞に認識される核酸配列である。プロモーター配列は、タンパク質又はポリペプチドの発現を仲介する転写調節配列を含む。プロモーター配列は通常、タンパク質を発現しようとするコード配列と操作可能に連結する。プロモーターは、変異、トランケート、およびハイブリッドプロモーターを含む、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってもよく、宿主細胞と相同または異種である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。
【0065】
調節配列は、適切な転写終結配列であってもよく、即ち、宿主細胞に認識されて転写を終結する配列である。終結配列はタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に操作可能に連結される。選択される宿主細胞において機能を果たす任意のターミネーターが本発明に利用できる。
【0066】
調節配列は、適切なリーダー配列であってもよく、即ち、宿主細胞の翻訳にとって非常に重要なｍＲＮＡ非翻訳領域である。リーダー配列はポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に操作可能に連結される。選択される宿主細胞において機能を果たす任意のターミネーターが本発明に利用できる。
【0067】
調節配列はシグナルペプチドのコード領域であってもよく、該領域はタンパク質又はポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが細胞分泌経路に進入するように誘導する。核酸配列のコード領域の５’末端は、翻訳リーディングフレームが一致してポリペプチドを分泌するコード領域の断片と自然に連結するシグナルペプチドのコード領域、を天然に含んでも良い。或いは、コード領域の５’末端は、コード配列にとって外来のシグナルペプチドのコード領域を含んでも良い。コード配列が通常の状態においてシグナルペプチドのコード領域を含まない場合、外来のシグナルペプチドのコード領域を付加する必要がある。或いは、外来のシグナルペプチドのコード領域で天然のシグナルペプチドのコード領域を容易に取り替えて、ポリペプチドの分泌を促進してもよい。しかし、発現したポリペプチドが使用される宿主細胞の分泌経路に進入するように誘導できる任意のシグナルペプチドのコード領域は本発明に適用できる。
【0068】
本発明の核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターというエレメント、を含む。前記核酸コンストラクトは、ポリクローナル挿入部位と、エンハンサーと、５’ＵＴＲと、第２のｐｏｌｙＡ配列とから選ばれる１種又は複数種をさらに含む。特に好ましい一実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、５’ＵＴＲと、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、図１Ａに示される。特に好ましい別の実施形態において、前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、図１Ｂに示される。本明細書の核酸コンストラクトにおける各エレメントはそれぞれ独立的にシングルコピー又はマルチコピーである。
【0069】
本明細書において、トランスポゾン５’末端反復配列と前記トランスポゾン３’末端反復配列が位置を交換できる。好ましくは、前記トランスポゾン５’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列であり、前記トランスポゾン３’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列である。
【0070】
本明細書において、好ましくは、トランスポザーゼはＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼであり、そのコード配列がシングルコピー又はマルチコピーの核局在シグナルのコード配列を含み、或いはそれと操作可能に連結されることで、転移効率を向上させる。例示的なＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される。例示的な核局在シグナルのコード配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される。
【0071】
本発明の核酸コンストラクトは、トランスポザーゼと外来遺伝子に対して、ｐｏｌｙＡ配列を使用しても良い。この設計は、ある程度で核酸コンストラクトの全長を短縮させて、転移のためにより長い外来遺伝子を組込むことに繋がる。或いは、本発明の核酸コンストラクトは、トランスポザーゼと外来遺伝子に対して、別々のｐｏｌｙＡ配列を使用してもよく、両者のテーリングシグナル機能の方向が同じ又は反対であってもよい。この設計は、同じ両方向ｐｏｌｙＡ配列を共用することにより、両方向における相応な発現カセットの間に互いに影響が与えられること、を免れた。本明細書に係るｐｏｌｙＡ配列は両方向の転写終結機能を有してもよいが、有さなくても良い。好ましくは、ｐｏｌｙＡ配列は独立的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６から選ばれる。
【0072】
本発明の核酸コンストラクトは、トランスポザーゼと外来遺伝子に対して、転写終結のためにインスレーター配列を使用又はさらに使用しても良い。そのため、任意のｐｏｌｙＡ配列における任意の端末はインスレーター配列を含んでも良い。好ましくは、本発明のインスレーター配列がトランスポゾン５’末端反復配列とトランスポゾン３’末端反復配列との間にある。本明細書に係るインスレーター配列は転写終結機能を有し、該配列が本分野における既知の任意の転写終結機能を有する配列であってもよい。好ましくは、転写終結機能を有するインスレーター配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は１５に示される。
【0073】
そのため、トランスポザーゼはｐｏｌｙＡ配列、インスレーター配列、又はｐｏｌｙＡ配列及びインスレーター配列を使用して転写終結を実現してもよく、外来遺伝子はｐｏｌｙＡ配列、インスレーター配列、又はｐｏｌｙＡ配列及びインスレーター配列を使用して転写終結を実現しても良い。好ましくは、任意の前記インスレーター配列が前記トランスポゾン５’末端反復配列とトランスポゾン３’末端反復配列との間にある。
【0074】
本発明の核酸コンストラクトにおいて、適切なトランスポザーゼのプロモーター配列は、それと操作可能に連結されるトランスポザーゼの高レベル発現を駆動できるプロモーター配列であり、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウィルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウィルスプロモーター、ＥＢウィルス最初期プロモーター、ラウスサルコーマウィルスプロモーター、ヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されなく、例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、プロトヘムプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーターを含むが、これらに限らない。１つ又は複数の実施形態において、トランスポザーゼのプロモーターがＣＭＶプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ｍｉｎｉＳＶ４０プロモーター、ｍｉｎｉＴＫプロモーター、ＭＬＰプロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＵｂｉｑｕｉｔｉｎＢプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、ＰＧＫ－１プロモーター、β－ａｃｔｉｎプロモーター、ＴＫプロモーター、ＧＲＰ７８プロモーターから選ばれる。好ましくは、前記プロモーターがｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ｍｉｎｉＳＶ４０プロモーター、ｍｉｎｉＴＫプロモーター、ＭＬＰプロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーターから選ばれる。より好ましくは、前記プロモーターがｍｉｎｉＣＭＶプロモーターである。ｍｉｎｉＣＭＶがＣＭＶプロモーターよりかなり短いので、ベクターの長さがより短くなり、より大きい外来遺伝子の統合に繋がる。１つ又は複数の実施形態において、ｍｉｎｉＣＭＶとトランスポザーゼとの間に５’ＵＴＲ配列を付加して転写と翻訳を増強させる。５’ＵＴＲ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１７～２４の何れか１つに示される。
【0075】
本発明の核酸コンストラクトはエンハンサーを含んでもよく、該エンハンサーが本明細書に係る核酸コンストラクトにおけるエンハンサーを除く任意のエレメントの任意の末端にある。好ましくは、エンハンサーがトランスポゾン３’末端反復配列とトランスポゾン５’末端反復配列との間にある。より好ましくは、エンハンサーが第１のｐｏｌｙＡ配列の下流にある。エンハンサー配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２５～２８の何れか１つに示される。本明細書において、核酸コンストラクトは前記５’ＵＴＲ配列とエンハンサー配列を含まなくてもよく、又は両者の１つを含んでもよく、又は両者を含んでもよく、得られた核酸コンストラクトは外来遺伝子を細胞のゲノムに高効率的に統合できる。
【0076】
宿主細胞の成長状況に応じてポリペプチドの発現を調節できる調節配列を付加することも必要とされる。調節システムの例として、化学的又は物理的刺激物（調節化合物がある場合を含む）に対して反応でき、遺伝子の発現を開放又は閉鎖するシステムが挙げられる。調節配列のその他の例として、遺伝子を増幅させる調節配列が挙げられる。これらの例において、タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列と調節配列を操作可能に連結する。
【0077】
１つのｐｏｌｙＡシグナル配列を含む具体的な実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列（３’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と、ポリクローナル部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と、ｐｏｌｙＡシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６）と、任意のエンハンサーモチーフ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２５～２８の何れか１つ）と、インスレーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は１５）と、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列（５’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の逆向き相補配列と、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）の逆向き相補配列と、任意の５’ＵＴＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１７～２４の何れか１つ）の逆向き相補配列と、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の逆向き相補配列と、をこの順で含む。１つ又は複数の実施形態において、本発明の核酸コンストラクトはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列を有する。
【0078】
２つのｐｏｌｙＡシグナル配列を含む具体的な実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列（３’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と、ポリクローナル部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と、第１のｐｏｌｙＡシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６）と、任意のエンハンサーモチーフ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２５～２８の何れか１つ）と、インスレーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は１５）と、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列（５’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）と、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と、任意の５’ＵＴＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１７～２４の何れか１つ）と、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）と、第２のｐｏｌｙＡシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６）と、をこの順で含む。１つ又は複数の実施形態において、本発明の核酸コンストラクトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される配列を有する。
【0079】
特定の実施形態において、前記核酸コンストラクトは組換えベクターである。組換えベクターは組換えクローニングベクターであってもよく、組換え発現ベクターであってもよい。本発明の核酸コンストラクトの各エレメントは、例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウィルス、コスミドなどの様々なベクターに組込まれてもよい。通常、適切なベクターは、少なくとも１種の有機体において機能を果たす複製起点と、プロモーター配列と、便利な制限酵素部位と、１つ又は複数の選択可能な標識と、を含む。
【0080】
持ち込まれる遺伝子の発現を評価するために、細胞群から細胞を識別及び選択するように、細胞に組込まれるベクターは選択可能な標識遺伝子又はレポーター遺伝子の何れか１つ又は両者を含んでも良い。選択可能な標識は、単独のＤＮＡに持ち込まれると共に、コトランスフェクション工程に利用できる。選択可能な標識とレポーター遺伝子の両者の側鎖は、宿主細胞において発現できるように、適切な調節配列を有しても良い。有用で選択可能な標識はＦｌａｇ、ＨＡ又はＶ５を含む。レポーター遺伝子は、潜在的トランスフェクションの細胞の識別に利用されると共に、調節配列の機能性の評価に利用される。ＤＮＡが受容体細胞に組込まれた後、レポーター遺伝子の発現は適切な時間で測定する。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリフォスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含んでも良い。
【0081】
組換えクローニングベクターは、本発明の核酸コンストラクトの各エレメントと任意の外来遺伝子を含むコード配列を提供するために利用される。組換えクローニングベクターは、本発明の核酸コンストラクトの各エレメントとｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＭＤ１８－Ｔ、ｐＭＤ１９－Ｔ、ｐＧＭ－Ｔベクター、ｐＵＣ５７、ｐＭＡＸ又はｐＤＣ３１５シリーズベクターが組換えにより得られた組換えベクターであってもよい。
【0082】
組換え発現ベクターは、適切な宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの各エレメントにより外来遺伝子の発現カセットをゲノムに統合して発現するために利用される。当該ベクターは真核細胞の複製と統合に適する。代表的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節するために利用される転写と翻訳ターミネーター、開始配列とプロモーターを含む。組換え発現ベクターは、本発明の核酸コンストラクトの各エレメントとｐＣＤＮＡ３シリーズベクター、ｐＣＤＮＡ４シリーズベクター、ｐＣＤＮＡ５シリーズベクター、ｐＣＤＮＡ６シリーズベクター、ｐＲＬシリーズベクター、ｐＵＣ５７ベクター、ｐＭＡＸベクター又はｐＤＣ３１５シリーズベクターが組換えにより得られた組換えベクターである。
【0083】
組換えベクター（組換えクローニングベクター又は組換え発現ベクター）は組換えウィルスベクターであってもよく、組換えアデノウィルスベクター、組換えアデノ随伴ウィルスベクター、組換えレトロウィルスベクター、組換え単純ヘルペスウィルスベクター、又は組換えワクシニアウィルスベクターを含むが、これらに限定されない。ウィルスベクター技術は、本分野において周知であると共に、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びその他のウィルス学と分子生物学マニュアルに記載されている。
【0084】
本明細書に係る核酸コンストラクトは通常、ＰＣＲ増幅法により取得しても良い。具体的には、本明細書に開示されるヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列によりプライマーを設計すると共に、市販されるｃＤＮＡライブラリー又は当業者によく知られている通常の方法で製作されたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして増幅して関連配列を取得することができる。長い配列の場合、通常、ＰＣＲ増幅を２回又は複数回実施してから、それぞれ増幅された断片を正確な順番で繋げる必要がある。或いは、本明細書に係る核酸コンストラクトを直接的に合成しても良い。
【0085】
本発明は、本明細書の何れか１つの実施形態に係る核酸コンストラクトを含む宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、哺乳類動物細胞を含むほかに、例えば、大腸菌細胞などの、哺乳類動物細胞の生産プロセスで使用される様々な細胞も含み、本明細書に係る核酸コンストラクト又はベクターを提供するために利用される。特定の実施形態において、本明細書は、本明細書に係る核酸コンストラクト又はベクターを含む哺乳類動物細胞を提供し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、樹状細胞（ＤＣ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞を含むが、これらに限定されない。
【0086】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に係る核酸コンストラクト又は細胞と薬学的に許容される添加物を含む。本発明において、「薬学的に許容される添加物」は、本発明の核酸コンストラクト又は細胞を動物又は人間に取り込むために利用される、薬学的又は食品上許容されるベクター、溶剤、懸濁剤又は賦形剤である。本明細書において、薬学的に許容される添加物は採用される用量と濃度で前記組成物の受験者に対して無毒である。本分野における周知の治療において生物に送達するためによく利用される様々なタイプのベクター又は賦形剤を含んでも良い。例示的な添加物は液体又は固体であってもよく、ｐＨ調整剤、界面活性剤、炭水化物、アジュバント、酸化防止剤、キレート剤、イオン強度増強剤、防腐剤、キャリア、流動促進剤、甘味剤、染料／着色剤、着香剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶剤又は乳化剤を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、薬学的に許容される添加物は、１種又は複数種の非活性成分を含んでもよく、安定剤、防腐剤、添加剤、アジュバント、スプレー、圧縮空気又はその他の適切な気体、或いはその他の薬効化合物と併用する適切な非活性成分を含むが、これらに限定されない。具体的には、適切な添加物は本分野においてトランスポゾンシステム又はそれを含む細胞の投与によく利用される添加物であってもよい。添加物の例として、様々なラクトース、マンニトール、コーン油などの油類、ＰｉｇｇｙＢａｃＳ、塩水、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコール、ジメチルスルホキシドなどの緩衝剤、ジメチルアセトアミドなどのアミド、アルブミンなどのタンパク質、Ｔｗｅｅｎ８０などの洗剤、グルコースなどの単糖とオリゴ多糖、ラクトース、シクロデキストリン、でん粉を含む。
本発明の医薬組成物は、本明細書に係る核酸コンストラクト又は細胞と薬学的に許容される添加物を含む。本発明において、「薬学的に許容される添加物」は、本発明の核酸コンストラクト又は細胞を動物又は人間に取り込むために利用される、薬学的又は食品上許容されるベクター、溶剤、懸濁剤又は賦形剤である。本明細書において、薬学的に許容される添加物は採用される用量と濃度で前記組成物の受験者に対して無毒である。本分野における周知の治療において生物に送達するためによく利用される様々なタイプのベクター又は賦形剤を含んでも良い。例示的な添加物は液体又は固体であってもよく、ｐＨ調整剤、界面活性剤、炭水化物、アジュバント、酸化防止剤、キレート剤、イオン強度増強剤、防腐剤、キャリア、流動促進剤、甘味剤、染料／着色剤、着香剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶剤又は乳化剤を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、薬学的に許容される添加物は、１種又は複数種の非活性成分を含んでもよく、安定剤、防腐剤、添加剤、アジュバント、スプレー、圧縮空気又はその他の適切な気体、或いはその他の薬効化合物と併用する適切な非活性成分を含むが、これらに限定されない。具体的には、適切な添加物は本分野においてトランスポゾンシステム又はそれを含む細胞の投与によく利用される添加物であってもよい。添加物の例として、様々なラクトース、マンニトール、コーン油などの油類、ＰｉｇｇｙＢａｃＳ、塩水、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコール、ジメチルスルホキシドなどの緩衝剤、ジメチルアセトアミドなどのアミド、アルブミンなどのタンパク質、Ｔｗｅｅｎ８０などの洗剤、グルコースなどの単糖とオリゴ多糖、ラクトース、シクロデキストリン、でん粉を含む。
【0087】
その他の医薬組成物は当業者にとって明らかであり、持続的に又は制御的に放出される送達調製物に本明細書に係る核酸コンストラクト又は細胞が含まれる調製物を含む。幾つかのその他の持続的又は制御可能な送達方式を提供するための技術（例えば、リポソームベクター、生分解性微粒子又は多孔質ビーズ及びデポ注射）も当業者によく知られている。
【0088】
インビボで投与する医薬組成物は、通常、無菌製剤の形態で提供する。無菌ろ過膜によりろ過することで殺菌を実現する。組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥及び再構成の前に又はその後にこの方法により殺菌する。非経口投与に利用される組成物は凍結乾燥の形態又は溶液で保存できる。非経口組成物は、通常、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって穿通可能な栓を有する静脈内溶液バッグ、またはバイアルに入れられる。
【0089】
通常、組成物に本明細書に係る試薬が治療有効量で含まれる。治療有効量とは、被験者における疾患又は病状の治療、予防、軽減及び／又は緩和が実現できる用量である。これらの効果は相応な機能を有する外来遺伝子を挿入することで実現でき、前記相応な機能の外来遺伝子は、例えば、治療機能又は誘導機能などの具体的な適用に対応する機能を有する。患者の年齢、性別、罹患病状及びその重症度、患者のその他の体調などの要素によって治療有効量が決定される。治療有効量は、１回分用量として投与してもよく、或いは効果的な治療方案に応じて複数回分用量として投与してもよい。本明細書において、通常、被験者又は患者が哺乳動物であり、特に、ヒトである。例示的に、前記組成物は、本明細書に係る核酸コンストラクト又は細胞を、例えば０．００１～５０％、好ましくは０．０１～３０％、より好ましくは０．０５～１０％の重量比でを含む。
【0090】
本明細書に係る組成物は、前記外来遺伝子により実現される機能と類似又は相応な機能を有するその他の試薬と併用してもよい。例えば、前記外来遺伝子により治療される疾患又は病状を治療する試薬と併用する。当業者はその他の試薬の投与量を決定してもよい。
【0091】
本発明に係る医薬組成物の剤形は多様であり、活性成分が哺乳類動物生体に有効的に到達できる剤形であればよく、単位投与剤形に調整されてもよい。剤形は、例えば、ゲル剤、スプレー剤、錠剤、カプセル、粉末、粒子、シロップ、溶液、懸濁液、注射剤、散剤、丸薬、時限放出剤、輸液剤、懸濁剤などから選ばれても良い。当業者は本明細書に係る核酸コンストラクト又は細胞により予防及び治療される疾患の種類によって、容易に適用できる剤形を選択しても良い。容易に製造及び保存できる観点から、好ましい組成物は固体組成物であり、特に錠剤及び固体充填又は液体充填のカプセルである。本明細書に係る核酸コンストラクト又は細胞或いはその組成物は注射又は点滴注射に適する消毒器具に保存しても良い。本明細書に係る核酸コンストラクト又は細胞或いはその組成物は適切な容器に保存して、さらに試薬キット又は薬物ボックスに置いてもよい。
【0092】
方法と適用
本発明者は研究において、本明細書の核酸コンストラクトにより制御可能な方式で外来遺伝子のゲノム統合を高効率的に実現できること、を発現した。外来遺伝子をゲノムに統合した場合、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの転写発現を効果的に終結させることができると共に、外来遺伝子の発現カセットのインスレーター機能を果たし、統合された外来遺伝子の発現カセットの統合部位付近の遺伝子発現に対する影響を軽減することができる。そのため、本発明は、外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する方法であって、外来遺伝子と任意のそのプロモーターを含む本明細書の何れか１つの実施形態に係る核酸コンストラクトを前記細胞に導入すること、及び任意のＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼにより外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する条件で前記細胞をインキュベートすること、を含む方法に関わる。本発明は、上記方法で得られた、ゲノムに外来遺伝子又はその発現カセットが統合された細胞をさらに提供する。
本発明者は研究において、本明細書の核酸コンストラクトにより制御可能な方式で外来遺伝子のゲノム統合を高効率的に実現できること、を発現した。外来遺伝子をゲノムに統合した場合、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの転写発現を効果的に終結させることができると共に、外来遺伝子の発現カセットのインスレーター機能を果たし、統合された外来遺伝子の発現カセットの統合部位付近の遺伝子発現に対する影響を軽減することができる。そのため、本発明は、外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する方法であって、外来遺伝子と任意のそのプロモーターを含む本明細書の何れか１つの実施形態に係る核酸コンストラクトを前記細胞に導入すること、及び任意のＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼにより外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する条件で前記細胞をインキュベートすること、を含む方法に関わる。本発明は、上記方法で得られた、ゲノムに外来遺伝子又はその発現カセットが統合された細胞をさらに提供する。
【0093】
核酸コンストラクトを細胞に組込む方法は本分野において既知である。ベクターは、本分野における任意の方法で、例えば、哺乳類動物、細菌、酵母又は昆虫細胞などの宿主細胞に容易に組込むことができる。例えば、ベクターは物理、化学又は生物学の手段で宿主細胞に導入することができる。例示的な物理又は化学の方法は、リン酸カルシウム沈殿、脂質媒介性トランスフェクション法、マイクロインジェクション、粒子衝突、微注射、遺伝子銃変換、電気穿孔、コロイド分散システム、大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、脂質に基づくシステム（オイルインウォーター乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを含む）を含む。核酸コンストラクトを宿主細胞に組込む生物学方法は、ウィルスにより仲介される変換を含み、特にレトロウィルスベクターである。その他のウィルスベクターは、レンチウィルス、ポックスウィルス、単純ヘルペスウィルスＩ、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルスなどに由来しても良い。本分野においてよく知られている技術により選択される核酸配列をベクターに挿入すると共に、レトロウィルス粒子にパッケージングしてもよい。該組換えウィルスはその後、単離されて、インビボ又はインビトロの対象細胞に伝達される。ウィルスのパッケージングに利用される試薬は本分野において周知されており、例えば、ｐＲｓｖ－ＲＥＶ、ｐＭＤｌｇ－ｐＲＲＥ、ｐＭＤ２Ｇ、目的干渉プラスミドなどを含む、通常のレンチウィルスベクターシステムである。
【0094】
本発明は、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の核酸コンストラクト又は宿主細胞の、薬物、試薬又はツールの製造における適用、或いは薬物、試薬又はツールとしての適用であって、前記薬物、試薬又はツールが外来遺伝子の発現カセットを標的細胞のゲノムに統合するために利用され、或いは遺伝子治療、細胞治療、幹細胞誘導又は分化に利用される、適用をさらに提供する。１つ又は複数の実施形態において、前記標的細胞は哺乳類動物細胞であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、樹状細胞（ＤＣ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞を含むが、これらに限定されない。
【0095】
＜具体的な実施形態＞
＜実施形態１＞
トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列というエレメントを含むか、又はこれらのエレメントからなる核酸コンストラクトであって、
好ましくは、前記核酸コンストラクトは、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、ポリクローナル挿入部位と、エンハンサーと、５’ＵＴＲと、第２のｐｏｌｙＡ配列と、注目外来遺伝子とから選ばれる１種又は複数種をさらに含み、
好ましくは、前記トランスポザーゼのコード配列、該トランスポザーゼの発現を制御する前記プロモーター、前記５’ＵＴＲ、前記第２のｐｏｌｙＡ配列のうちの何れか１種又は複数種が、前記トランスポゾン３’末端反復配列と前記トランスポゾン５’末端反復配列との間の領域外に位置する、核酸コンストラクト。
＜実施形態１＞
トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列というエレメントを含むか、又はこれらのエレメントからなる核酸コンストラクトであって、
好ましくは、前記核酸コンストラクトは、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、ポリクローナル挿入部位と、エンハンサーと、５’ＵＴＲと、第２のｐｏｌｙＡ配列と、注目外来遺伝子とから選ばれる１種又は複数種をさらに含み、
好ましくは、前記トランスポザーゼのコード配列、該トランスポザーゼの発現を制御する前記プロモーター、前記５’ＵＴＲ、前記第２のｐｏｌｙＡ配列のうちの何れか１種又は複数種が、前記トランスポゾン３’末端反復配列と前記トランスポゾン５’末端反復配列との間の領域外に位置する、核酸コンストラクト。
【0096】
＜実施形態２＞
トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターというエレメントを含む実施形態１に記載の核酸コンストラクトであって、
好ましくは、前記核酸コンストラクトは、ポリクローナル挿入部位と、エンハンサーと、５’ＵＴＲと、第２のｐｏｌｙＡ配列と、注目外来遺伝子とから選ばれる１種又は複数種をさらに含む、核酸コンストラクト。
トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターというエレメントを含む実施形態１に記載の核酸コンストラクトであって、
好ましくは、前記核酸コンストラクトは、ポリクローナル挿入部位と、エンハンサーと、５’ＵＴＲと、第２のｐｏｌｙＡ配列と、注目外来遺伝子とから選ばれる１種又は複数種をさらに含む、核酸コンストラクト。
【0097】
＜実施形態３＞
実施形態２に記載の核酸コンストラクトであって、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、５’ＵＴＲと、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、５’ＵＴＲと、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含むか、又は、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含むか、又は、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
実施形態２に記載の核酸コンストラクトであって、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、５’ＵＴＲと、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼのコード配列と、５’ＵＴＲと、該トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含むか、又は、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含み、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、エンハンサーと、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含むか、又は、
前記核酸コンストラクトは、トランスポゾン３’末端反復配列と、エンハンサーと、転写終結機能を有するインスレーター配列と、ポリクローナル挿入部位と、第１のｐｏｌｙＡ配列と、トランスポゾン５’末端反復配列と、トランスポザーゼの発現を制御するプロモーターと、５’ＵＴＲと、トランスポザーゼのコード配列と、第２のｐｏｌｙＡ配列と、をこの順で含むことを特徴とする、核酸コンストラクト。
【0098】
＜実施形態４＞
実施形態１～３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは、
前記トランスポザーゼの発現カセットの方向と、外来遺伝子の発現カセットの方向が同じ又は反対であること、
前記トランスポザーゼの発現カセットの方向と、トランスポゾン３’末端反復配列とトランスポゾン５’末端反復配列との間の配列の方向が同じ又は反対であること、
前記トランスポゾン５’末端反復配列と前記トランスポゾン３’末端反復配列が位置を交換できること、
前記トランスポゾン３’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列であること、
前記トランスポゾン５’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列であること、
前記エンハンサーがＣＭＶエンハンサー配列、ＳＶ４０エンハンサー、ヒトεグロブリン５’ＨＳ２エンハンサー、ニワトリβグロブリン遺伝子５’ＨＳ４エンハンサーから選ばれること、
前記トランスポザーゼがＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼであること、
前記５’ＵＴＲがＣ３遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、ＨＰＸ遺伝子、ＦＧＡ遺伝子、ＡＧＸＴ遺伝子、ＡＳＬ遺伝子、ＡＰＯＡ２遺伝子、ＡＬＢ遺伝子の５’ＵＴＲから選ばれること、
前記プロモーターがＣＭＶプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ｍｉｎｉＳＶ４０プロモーター、ｍｉｎｉＴＫプロモーター、ＭＬＰプロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＵｂｉｑｕｉｔｉｎＢプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、ＰＧＫ－１プロモーター、β－ａｃｔｉｎプロモーター、ＴＫプロモーター、ＧＲＰ７８プロモーターから選ばれること、
前記トランスポザーゼのコード配列がシングルコピー又はマルチコピーの核局在シグナルのコード配列を含み、或いはそれと操作可能に連結されるという特徴から選ばれる１つ又は複数を有することを特徴とする、核酸コンストラクト。
実施形態１～３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは、
前記トランスポザーゼの発現カセットの方向と、外来遺伝子の発現カセットの方向が同じ又は反対であること、
前記トランスポザーゼの発現カセットの方向と、トランスポゾン３’末端反復配列とトランスポゾン５’末端反復配列との間の配列の方向が同じ又は反対であること、
前記トランスポゾン５’末端反復配列と前記トランスポゾン３’末端反復配列が位置を交換できること、
前記トランスポゾン３’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列であること、
前記トランスポゾン５’末端反復配列がＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列であること、
前記エンハンサーがＣＭＶエンハンサー配列、ＳＶ４０エンハンサー、ヒトεグロブリン５’ＨＳ２エンハンサー、ニワトリβグロブリン遺伝子５’ＨＳ４エンハンサーから選ばれること、
前記トランスポザーゼがＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼであること、
前記５’ＵＴＲがＣ３遺伝子、ＯＲＭ１遺伝子、ＨＰＸ遺伝子、ＦＧＡ遺伝子、ＡＧＸＴ遺伝子、ＡＳＬ遺伝子、ＡＰＯＡ２遺伝子、ＡＬＢ遺伝子の５’ＵＴＲから選ばれること、
前記プロモーターがＣＭＶプロモーター、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ５３プロモーター、ｍｉｎｉＳＶ４０プロモーター、ｍｉｎｉＴＫプロモーター、ＭＬＰプロモーター、ｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター、ＹＢ＿ＴＡＴＡプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＵｂｉｑｕｉｔｉｎＢプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、ＰＧＫ－１プロモーター、β－ａｃｔｉｎプロモーター、ＴＫプロモーター、ＧＲＰ７８プロモーターから選ばれること、
前記トランスポザーゼのコード配列がシングルコピー又はマルチコピーの核局在シグナルのコード配列を含み、或いはそれと操作可能に連結されるという特徴から選ばれる１つ又は複数を有することを特徴とする、核酸コンストラクト。
【0099】
＜実施形態５＞
実施形態１～３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは、
前記トランスポゾン３’末端反復配列のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されること、
前記トランスポゾン５’末端反復配列のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されること、
前記ポリクローナル挿入部位の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されること、
前記第１のｐｏｌｙＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６に示されること、
前記第２のｐｏｌｙＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６に示されること、
前記エンハンサー配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２６～２８の何れか１つに示されること、
前記インスレーター配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は１５に示されること、
前記ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、好ましくは、前記ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されること、
前記５’ＵＴＲ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１７～２４の何れか１つに示されること、
前記プロモーターの配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～４２の何れか１項に示されること、
前記核局在シグナルがｃ－ｍｙｃ核局在シグナルであり、好ましくは、前記核局在シグナルがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される配列を有するという特徴から選ばれる１つ又は複数を有することを特徴とする、核酸コンストラクト。
実施形態１～３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトであって、前記核酸コンストラクトは、
前記トランスポゾン３’末端反復配列のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されること、
前記トランスポゾン５’末端反復配列のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されること、
前記ポリクローナル挿入部位の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されること、
前記第１のｐｏｌｙＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６に示されること、
前記第２のｐｏｌｙＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３又は１６に示されること、
前記エンハンサー配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２６～２８の何れか１つに示されること、
前記インスレーター配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は１５に示されること、
前記ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、好ましくは、前記ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されること、
前記５’ＵＴＲ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１７～２４の何れか１つに示されること、
前記プロモーターの配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～４２の何れか１項に示されること、
前記核局在シグナルがｃ－ｍｙｃ核局在シグナルであり、好ましくは、前記核局在シグナルがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される配列を有するという特徴から選ばれる１つ又は複数を有することを特徴とする、核酸コンストラクト。
【0100】
＜実施形態６＞
実施形態１～３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトであって、
前記核酸コンストラクトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又は１４に示される配列を含み、又は
前記核酸コンストラクトが組換えベクターであり、好ましくは、前記核酸コンストラクトが組換えクローニングベクター又は組換え発現ベクターであることを特徴とする、核酸コンストラクト。
実施形態１～３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトであって、
前記核酸コンストラクトがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又は１４に示される配列を含み、又は
前記核酸コンストラクトが組換えベクターであり、好ましくは、前記核酸コンストラクトが組換えクローニングベクター又は組換え発現ベクターであることを特徴とする、核酸コンストラクト。
【0101】
＜実施形態７＞
宿主細胞であって、
（１）実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクト、及び／又は
（２）実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクトのトランスポゾン３’末端反復配列とトランスポゾン５’末端反復配列との間の配列、を含み、
好ましくは、前記宿主細胞が哺乳類動物細胞であり、
より好ましくは、前記宿主細胞がＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれる、宿主細胞。
宿主細胞であって、
（１）実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクト、及び／又は
（２）実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクトのトランスポゾン３’末端反復配列とトランスポゾン５’末端反復配列との間の配列、を含み、
好ましくは、前記宿主細胞が哺乳類動物細胞であり、
より好ましくは、前記宿主細胞がＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれる、宿主細胞。
【0102】
＜実施形態８＞
実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクト又は実施形態８に記載の宿主細胞と薬学的に許容される添加物とを含む、医薬組成物。
実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクト又は実施形態８に記載の宿主細胞と薬学的に許容される添加物とを含む、医薬組成物。
【0103】
＜実施形態９＞
実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクト又は実施形態７に記載の宿主細胞の、薬物、試薬又はツールの製造における適用、或いは薬物、試薬又はツールとしての適用であって、前記薬物、試薬又はツールが外来遺伝子の発現カセットを標的細胞のゲノムに統合するために利用され、或いは遺伝子治療、細胞治療、幹細胞誘導又は分化に利用され、
好ましくは、前記標的細胞が哺乳類動物細胞であり、
より好ましくは、前記標的細胞が免疫細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれ、
さらに好ましくは、前記免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、樹状細胞（ＤＣ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞の何れか１種又は複数種から選ばれる、適用。
実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクト又は実施形態７に記載の宿主細胞の、薬物、試薬又はツールの製造における適用、或いは薬物、試薬又はツールとしての適用であって、前記薬物、試薬又はツールが外来遺伝子の発現カセットを標的細胞のゲノムに統合するために利用され、或いは遺伝子治療、細胞治療、幹細胞誘導又は分化に利用され、
好ましくは、前記標的細胞が哺乳類動物細胞であり、
より好ましくは、前記標的細胞が免疫細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、胚性幹細胞、腫瘍細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞から選ばれ、
さらに好ましくは、前記免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、樹状細胞（ＤＣ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞の何れか１種又は複数種から選ばれる、適用。
【0104】
＜実施形態１０＞
外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する方法であって、外来遺伝子と任意のそのプロモーターを含む実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクトを前記細胞に導入すること、及び任意のトランスポザーゼにより外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する条件で前記細胞をインキュベートすること、を含み、前記外来遺伝子と任意のそのプロモーターが前記核酸コンストラクトのポリクローナル挿入部位にあり、
好ましくは、前記トランスポザーゼがＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである、方法。
外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する方法であって、外来遺伝子と任意のそのプロモーターを含む実施形態１～６の何れか１項に記載の核酸コンストラクトを前記細胞に導入すること、及び任意のトランスポザーゼにより外来遺伝子又はその発現カセットを細胞のゲノムに統合する条件で前記細胞をインキュベートすること、を含み、前記外来遺伝子と任意のそのプロモーターが前記核酸コンストラクトのポリクローナル挿入部位にあり、
好ましくは、前記トランスポザーゼがＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼである、方法。
【0105】
本発明の優位性：
１）本発明のトランスポゾンベクターシステムは、ＰｉｇｇｙＢａｃの発現及びそれにより仲介される外来遺伝子の統合を多段階で調節する多段階調節エレメントを有する。本明細書で使用される、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現を駆動するプロモーターは、発現強度を低減させると共に、ＤＮＡ長さを短縮させた。さらに、エンハンサーエレメントを組込み、完全なプラスミドの状態で、トランスポザーゼの発現を瞬時に増強させて、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのカットと統合機能を果たした。外来遺伝子の発現カセットが完全なプラスミドからカットされて、エンハンサーのプロモーターに対する増強効果が失われ、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの高効率的な開放又は閉鎖が実現されることで、トランスポザーゼレベルの短時間発現がピークに達してから低下し、外来遺伝子の統合を仲介すると共に、細胞傷害性が大幅に低減された。
１）本発明のトランスポゾンベクターシステムは、ＰｉｇｇｙＢａｃの発現及びそれにより仲介される外来遺伝子の統合を多段階で調節する多段階調節エレメントを有する。本明細書で使用される、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現を駆動するプロモーターは、発現強度を低減させると共に、ＤＮＡ長さを短縮させた。さらに、エンハンサーエレメントを組込み、完全なプラスミドの状態で、トランスポザーゼの発現を瞬時に増強させて、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのカットと統合機能を果たした。外来遺伝子の発現カセットが完全なプラスミドからカットされて、エンハンサーのプロモーターに対する増強効果が失われ、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの高効率的な開放又は閉鎖が実現されることで、トランスポザーゼレベルの短時間発現がピークに達してから低下し、外来遺伝子の統合を仲介すると共に、細胞傷害性が大幅に低減された。
【0106】
２）プロモーター下流に５’ＵＴＲ配列が付加され、エンハンサーエレメントとの組合せでトランスポザーゼの発現強度が瞬時に向上されることにより、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現強度が十分高くなり、全体の統合効率が向上された。下記の実施例に示される通り、本発明のトランスポゾンベクターシステムの統合効率が顕著的に向上された。
【0107】
３）ＰｉｇｇｙＢａｃの発現カセットは転写終結効果を有するインスレーター配列を採用することで、外来遺伝子の統合発生前に転写を効果的に終結させて、トランスポザーゼ遺伝子を発現させた。外来遺伝子をゲノムに統合した場合、転写終結効果を有するインスレーター配列の欠失によって、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの転写発現が効果的に終結された。さらに、転写終結効果を有するインスレーター配列と外来遺伝子の発現カセットをゲノムに統合した場合、インスレーターは外来遺伝子の発現によるゲノムにおける隣接領域への影響を遮断して、統合された外来遺伝子の発現カセットによる統合部位付近の遺伝子発現への影響が低減された。
【0108】
４）本発明のトランスポゾンベクターシステムのゲノムにおける挿入部位が少なく、遺伝子内の挿入部位が少ないため、ゲノムの安定性に対する影響が小さい。
【0109】
５）ｍＲＮＡレベルが遺伝子発現プロフィルに対する影響は小さい。
次に、実施例を参照しながら本発明に係る実施形態について詳しく記述した。当業者は、下記の実施例が本発明の説明に利用されるものであり、本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。実施例に具体的な技術又は条件を明記していない場合、本分野の文献に記載される技術又は条件（例えば、Ｊｏｓｅｐｈ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、黄培堂ら訳、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、科学出版社を参照）或いは製品取扱説明書に従う。メーカを明記していない試薬又は計器は、いずれも市販で得られる通常製品である。下記実施例に使用される細胞系はいずれもＡＴＣＣより購入したものである。
次に、実施例を参照しながら本発明に係る実施形態について詳しく記述した。当業者は、下記の実施例が本発明の説明に利用されるものであり、本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。実施例に具体的な技術又は条件を明記していない場合、本分野の文献に記載される技術又は条件（例えば、Ｊｏｓｅｐｈ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、黄培堂ら訳、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、科学出版社を参照）或いは製品取扱説明書に従う。メーカを明記していない試薬又は計器は、いずれも市販で得られる通常製品である。下記実施例に使用される細胞系はいずれもＡＴＣＣより購入したものである。
【実施例】
【0110】
＜実施例１＞ベクターの構築
ｐＫＢ２０：ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列（３’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ポリクローナル部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、エンハンサーモチーフ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、転写終結機能を有するインスレーター配列（Ｃ２転写アレスト部位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列（５’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の逆向き相補配列、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）の逆向き相補配列、５’ＵＴＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の逆向き相補配列、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の逆向き相補配列をこの順で長い配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）となるように繋げ、上海捷瑞生物科技有限公司に合成を依頼し、その両端にＡｇｅＩとＡｓｃＩ酵素切断部位をそれぞれ付加し、ｐＵＣ５７（上海捷瑞生物より購入）に組込んで、ｐＫＢ２０と名付ける。プラスミド模式図は図１Ａに示される。
ｐＫＢ２０：ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列（３’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ポリクローナル部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、エンハンサーモチーフ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、転写終結機能を有するインスレーター配列（Ｃ２転写アレスト部位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列（５’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の逆向き相補配列、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）の逆向き相補配列、５’ＵＴＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の逆向き相補配列、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の逆向き相補配列をこの順で長い配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）となるように繋げ、上海捷瑞生物科技有限公司に合成を依頼し、その両端にＡｇｅＩとＡｓｃＩ酵素切断部位をそれぞれ付加し、ｐＵＣ５７（上海捷瑞生物より購入）に組込んで、ｐＫＢ２０と名付ける。プラスミド模式図は図１Ａに示される。
【0111】
ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０のポリクローナル部位のＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位との間にＮＦＡＴモチーフ付きのＥＦ１Ａプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を挿入し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位との間にＥＧＦＰコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を挿入して、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰと名付ける。ＮＦＡＴモチーフ付きのＥＦ１Ａプロモーター配列とＥＧＦＰコード配列は上海杰瑞生物科技有限公司に合成を依頼する。
【0112】
ｐＫＢ２０５：ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン３’末端反復配列（３’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ポリクローナル部位ＭＣＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、エンハンサーモチーフ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、転写終結機能を有するインスレーター配列（Ｃ２転写アレスト部位、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン５’末端反復配列（５’ＩＴＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ｍｉｎｉＣＭＶプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、５’ＵＴＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）をこの順で長い配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）となるように繋げ、上海捷瑞生物科技有限公司に合成を依頼し、その両端にＡｇｅＩとＡｓｃＩ酵素切断部位をそれぞれ付加し、ｐＵＣ５７（上海捷瑞生物より購入）に組込んで、ｐＫＢ２０５と名付ける。プラスミド模式図は図１Ｂに示される。
【0113】
ｐＫＢ２０５－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０５のポリクローナル部位のＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位との間にＮＦＡＴモチーフ付きのＥＦ１Ａプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を挿入し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位との間にＥＧＦＰコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を挿入して、ｐＫＢ２０５－ＥＧＦＰと名付ける。ＮＦＡＴモチーフ付きのＥＦ１Ａプロモーター配列とＥＧＦＰコード配列は上海杰瑞生物科技有限公司に合成を依頼する。
【0114】
同じ方法で下記プラスミドをそれぞれ取得する。
ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ配列からエンハンサーモチーフ配列を削除して取得する。
ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ配列からエンハンサーモチーフ配列を削除して取得する。
【0115】
ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ配列から５’ＵＴＲ配列を削除して取得する。
【0116】
ｐＫＢ２００３－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ配列からエンハンサーモチーフ配列と５’ＵＴＲ配列を削除して取得する。
【0117】
ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ配列からｍｉｎｉＣＭＶプロモーター配列、５’ＵＴＲ配列、核局在シグナルを含むＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列を削除して取得する。
【0118】
ｐＫ２０１－ＰＢ：ｐＫＢ２０配列から５’ＵＴＲ、５’ＩＴＲ、エンハンサーモチーフ、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡシグナル配列、ポリクローナル部位、３’ＩＴＲを削除し、ｍｉｎｉＣＭＶ、核局在シグナルを含むＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼのコード配列、転写終結機能を有するインスレーター配列だけを残して取得する。
【0119】
ｐＫＢ２０Ｉ１－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおける転写終結機能を有するインスレーター配列をヒトα２ ｇｌｏｂｉｎ遺伝子の転写アレスト部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）に取り替えて取得する。
【0120】
ｐＫＢ２０Ａ１－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるｂＧＨ ｐｏｌｙＡをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に取り替えて取得する。
【0121】
ｐＫＢ２０Ａ２－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるｂＧＨ ｐｏｌｙＡをＳＶ４０ ｐｏｌｙＡシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）に取り替えて取得する。
【0122】
ｐＫＢ２０Ｕ１－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおける５’ＵＴＲ配列をＣ３遺伝子の５’ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）に取り替えて取得する。
【0123】
ｐＫＢ２０Ｕ２－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおける５’ＵＴＲ配列をＯＲＭ１遺伝子の５’ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）に取り替えて取得する。
【0124】
ｐＫＢ２０Ｕ３－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおける５’ＵＴＲ配列をＨＰＸ遺伝子の５’ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）に取り替えて取得する。
【0125】
ｐＫＢ２０Ｕ４－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおける５’ＵＴＲ配列をＦＧＡ遺伝子の５’ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）に取り替えて取得する。
【0126】
ｐＫＢ２０Ｕ５－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおける５’ＵＴＲ配列をＡＧＸＴ遺伝子の５’ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）に取り替えて取得する。
【0127】
ｐＫＢ２０Ｕ６－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおける５’ＵＴＲ配列をＡＳＬ遺伝子の５’ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）に取り替えて取得する。
【0128】
ｐＫＢ２０Ｕ７－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおける５’ＵＴＲ配列をＡＰＯＡ２遺伝子の５’ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）に取り替えて取得する。
【0129】
ｐＫＢ２０Ｕ８－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおける５’ＵＴＲ配列をＡＬＢ遺伝子の５’ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）に取り替えて取得する。
【0130】
ｐＫＢ２０Ｅ１－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるエンハンサーモチーフ配列をＣＭＶエンハンサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）に取り替えて取得する。
【0131】
ｐＫＢ２０Ｅ２－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるエンハンサーモチーフ配列をＳＶ４０エンハンサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）に取り替えて取得する。
【0132】
ｐＫＢ２０Ｅ３－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるエンハンサーモチーフ配列をヒトε－ｇｌｏｂｉｎ ５’ＨＳ２エンハンサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）に取り替えて取得する。
【0133】
ｐＫＢ２０Ｅ４－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるエンハンサーモチーフ配列をニワトリβ－ｇｌｏｂｉｎ遺伝子５’ＨＳ４エンハンサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）に取り替えて取得する。
【0134】
ｐＫＢ２０Ｐ１－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるｍｉｎｉＣＭＶ配列をＣＭＶ５３プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）に取り替えて取得する。
【0135】
ｐＫＢ２０Ｐ２－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるｍｉｎｉＣＭＶ配列をｍｉｎｉＳＶ４０プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）に取り替えて取得する。
【0136】
ｐＫＢ２０Ｐ３－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるｍｉｎｉＣＭＶ配列をｍｉｎｉＴＫプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）に取り替えて取得する。
【0137】
ｐＫＢ２０Ｐ４－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるｍｉｎｉＣＭＶ配列をＭＬＰプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）に取り替えて取得する。
【0138】
ｐＫＢ２０Ｐ５－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるｍｉｎｉＣＭＶ配列をｐＪＢ４２ＣＡＴ５プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）に取り替えて取得する。
【0139】
ｐＫＢ２０Ｐ６－ＥＧＦＰ：ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰにおけるｍｉｎｉＣＭＶ配列をＹＢ＿ＴＡＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）に取り替えて取得する。
【0140】
＜実施例２＞ＥＧＦＰ発現カセットを含むｐＫＢベクターのＪｕｒｋａｔ細胞における統合
急激に成長する少ない継代数のＪｕｒｋａｔ細胞を５×１０６個用意し、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ質量５μｇで細胞核にトランスフェクションして（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で継代培養した。電気穿孔後の７日目、１０日目、１４日目で蛍光顕微鏡により写真を撮って観察した。電気穿孔後の７日目、１０日目、１４日目（３回継代後）でフローサイトメータによりＥＧＦＰ陽性細胞の比率変化を検出し、プラスミドをトランスフェクションしていないＪｕｒｋａｔ細胞をフローサイトメトリーの対照とした。電気穿孔の全プロセスで蛍光顕微鏡により細胞蛍光強度を観察した。電気穿孔後の５日目、７日目、１０日目、１４日目で生細胞をそれぞれ計数し、ｐＫＢベクターの電気穿孔によるＪｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響を観察した。
急激に成長する少ない継代数のＪｕｒｋａｔ細胞を５×１０６個用意し、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ質量５μｇで細胞核にトランスフェクションして（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で継代培養した。電気穿孔後の７日目、１０日目、１４日目で蛍光顕微鏡により写真を撮って観察した。電気穿孔後の７日目、１０日目、１４日目（３回継代後）でフローサイトメータによりＥＧＦＰ陽性細胞の比率変化を検出し、プラスミドをトランスフェクションしていないＪｕｒｋａｔ細胞をフローサイトメトリーの対照とした。電気穿孔の全プロセスで蛍光顕微鏡により細胞蛍光強度を観察した。電気穿孔後の５日目、７日目、１０日目、１４日目で生細胞をそれぞれ計数し、ｐＫＢベクターの電気穿孔によるＪｕｒｋａｔ細胞の増殖への影響を観察した。
【0141】
１：１０の比率で希釈させて継代し、統合していないプラスミドは細胞の分裂に伴って素早く消えた。３代（約１３日）後、緑色蛍光陽性の細胞は、緑色蛍光の発現カセットが安定的に統合されたと考えられる。フローサイトメトリーにより緑色蛍光陽性細胞の比率を検出することで、統合の効率が決定される。
【0142】
結果は図２～４に示される。図２は電気穿孔後１０日目まで、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞に高い蛍光輝度の細胞が大量に見えていることを示している。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットが欠失したｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞は、蛍光が殆ど見えない。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットを付帯するベクターはＪｕｒｋａｔ細胞においてＥＧＦＰをゲノムに統合したことを示している。一方、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットを含まないベクターは外来遺伝子ＥＧＦＰを効果的に仲介して統合することができない。
【0143】
図３は電気穿孔後７日目のｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー結果を示す。結果によれば、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞は７日目と１０日目に陽性細胞比率が６７％以上であり、細胞を３代培養した後の１４日目に陽性率が６５％の高レベルを維持している。ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰとｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞の陽性率は７日目に４８％程度であり、３代培養した後の１４日目にそれぞれ２７％と２６％を上回った。
【0144】
図４は、ＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含むプラスミドｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞が、ＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含まないｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞と比較すれば、電気穿孔後５、７、１０、１４日目の生細胞数について明らかな差異がないことを示す。ＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含むものの導入がＪｕｒｋａｔ細胞の増殖に対して影響を与えないことを示している。
【0145】
上記の結果によれば、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰはＪｕｒｋａｔ細胞に電気穿孔した後に非常に高い統合率と外来遺伝子陽性発現率を有し、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰとｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰはＪｕｒｋａｔ細胞に電気穿孔した後に比較的に高い統合率と外来遺伝子陽性発現率を有するが、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔した後のレベルより低い。また、ｐＫＢシリーズベクターの統合は細胞の増殖に対して殆ど影響を与えない。
【0146】
＜実施例３＞ｐＫＢベクターをＪｕｒｋａｔ細胞に電気穿孔した後のＰＢトランスポザーゼ発現の時間曲線
急激に成長する少ない継代数のＪｕｒｋａｔ細胞を５×１０６個取り、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ質量５μｇで細胞核にトランスフェクションして（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。電気穿孔後６、１２、２４、４８、９６時間及び１５日間に細胞を収集してＲＮＡを抽出し、β－ａｃｔｉｎを内部リファレンスとしてＲＴ－ＰＣＲによりＰＢトランスポザーゼの発現レベルを定量で検出し、結果は図５に示される。
急激に成長する少ない継代数のＪｕｒｋａｔ細胞を５×１０６個取り、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ質量５μｇで細胞核にトランスフェクションして（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。電気穿孔後６、１２、２４、４８、９６時間及び１５日間に細胞を収集してＲＮＡを抽出し、β－ａｃｔｉｎを内部リファレンスとしてＲＴ－ＰＣＲによりＰＢトランスポザーゼの発現レベルを定量で検出し、結果は図５に示される。
【0147】
図５は、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞におけるＰＢトランスポザーゼの発現レベルがいずれも６ｈにピークに達した後、明らかに低下し始めたことを示している。ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞はｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞より、６ｈピーク時のＰＢトランスポザーゼの発現レベルが明らかに高い。そのうち、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞は２４ｈ時点にＰＢトランスポザーゼの発現レベルが急激に低下した。全ての細胞は９６時間にＰＢトランスポザーゼの発現レベルが低く低下し、１５日目に検出できなくなった。
【0148】
＜実施例４＞ＥＧＦＰ発現カセットを含むｐＫＢベクターのＫ５６２細胞における統合
急激に成長する少ない継代数のＫ５６２細胞を５×１０６個用意し、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ質量５μｇで細胞核にトランスフェクションして（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で継代培養した。電気穿孔後の１日目、７日目、１０日目で蛍光顕微鏡により写真を撮って観察した。電気穿孔後の１０日目、１４日目（３回継代後）でフローサイトメータによりＥＧＦＰ陽性細胞の比率変化を検出し、プラスミドをトランスフェクションしていないＫ５６２細胞をフローサイトメトリーの対照とした。電気穿孔の全プロセスで蛍光顕微鏡により細胞蛍光強度を観察した。電気穿孔後の５日目、７日目、１０日目、１４日目で生細胞をそれぞれ計数し、ｐＫＢベクターの電気穿孔によるＫ５６２細胞の増殖への影響を観察した。
急激に成長する少ない継代数のＫ５６２細胞を５×１０６個用意し、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ質量５μｇで細胞核にトランスフェクションして（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で継代培養した。電気穿孔後の１日目、７日目、１０日目で蛍光顕微鏡により写真を撮って観察した。電気穿孔後の１０日目、１４日目（３回継代後）でフローサイトメータによりＥＧＦＰ陽性細胞の比率変化を検出し、プラスミドをトランスフェクションしていないＫ５６２細胞をフローサイトメトリーの対照とした。電気穿孔の全プロセスで蛍光顕微鏡により細胞蛍光強度を観察した。電気穿孔後の５日目、７日目、１０日目、１４日目で生細胞をそれぞれ計数し、ｐＫＢベクターの電気穿孔によるＫ５６２細胞の増殖への影響を観察した。
【0149】
１：１０の比率で希釈させて継代し、統合していないプラスミドは細胞の分裂に伴って素早く消えた。３代（約１３日）後、緑色蛍光陽性の細胞は、緑色蛍光の発現カセットが安定的に統合されたと考えられる。フローサイトメトリーにより緑色蛍光陽性細胞の比率を検出することで、統合の効率が決定される。
【0150】
結果は図６～９に示される。図６は電気穿孔後１０日目まで、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔したＫ５６２細胞に高い蛍光輝度の細胞が大量に見えていることを示している。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットが欠失したｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したＫ５６２細胞は、高い蛍光輝度の細胞が殆ど見えない。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットを付帯するベクターはＫ５６２細胞においてＥＧＦＰをゲノムに統合したことを示している。一方、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットを含まないベクターは外来遺伝子ＥＧＦＰを効果的に仲介して統合することができない。
【0151】
図７は、ＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含むプラスミドｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞が、ＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含まないｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞と比較すれば、電気穿孔後５、７、１０、１４日目の生細胞数について明らかな差異がないことを示す。ＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含むものの導入がＫ５６２細胞の増殖に対して影響を与えないことを示している。
【0152】
図８は電気穿孔後１０日目、１４日目のｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔した細胞のフローサイトメトリー結果を示す。結果によれば、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞は１０日目の細胞蛍光陽性率がそれぞれ７５％と７３％上回り、電気穿孔後１４日目（３代以上培養）の蛍光陽性率が７０％以上を維持しており、非常に高い統合効率を示している。ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞は電気穿孔後１０日目の蛍光陽性率が７０％弱であり、さらに電気穿孔後１４日目（３代以上培養）の蛍光陽性率も７０％弱のレベルを維持している。
【0153】
図９は、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰベクターを電気穿孔したＫ５６２細胞は電気穿孔後の１０～１４日目に蛍光陽性率が変化小さく、７０％以上であり、７５％弱であり、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰベクターを電気穿孔したＫ５６２細胞は電気穿孔後の１０～１４日目に蛍光陽性率があまり低下しておらず、７０％よりやや低いことを示している。
【0154】
上記の結果によれば、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをＫ５６２細胞に電気穿孔した後、非常に高い統合率と外来遺伝子の陽性発現率を有することを示してる。
【0155】
＜実施例５＞ＥＧＦＰ発現カセットを含むｐＫＢベクターの初代Ｔ細胞における統合
単離されたばかりの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を１組あたり５×１０６個で４組用意し、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－２ｂエレクトロポレーターにより、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ質量５μｇで細胞核に電気穿孔してから（装置取扱説明書を参照）、細胞をＡＩＭ－Ｖ培地に入れて３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。６時間後に３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体と３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（ＮＯｖｏｐｒｏｔｅｉｎより購入）を含む６ウェルプレートに移動して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で希釈させて継代した。電気穿孔後の１、７、１０日目にｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞をそれぞれ蛍光顕微鏡により観察して、写真を撮り、電気穿孔後７、１０、１４日目にｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞をフローサイトメトリーにより検出し、結果は図１０及び１１に示される。
単離されたばかりの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を１組あたり５×１０６個で４組用意し、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－２ｂエレクトロポレーターにより、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ質量５μｇで細胞核に電気穿孔してから（装置取扱説明書を参照）、細胞をＡＩＭ－Ｖ培地に入れて３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。６時間後に３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体と３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（ＮＯｖｏｐｒｏｔｅｉｎより購入）を含む６ウェルプレートに移動して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で希釈させて継代した。電気穿孔後の１、７、１０日目にｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰ、ｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞をそれぞれ蛍光顕微鏡により観察して、写真を撮り、電気穿孔後７、１０、１４日目にｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔した細胞をフローサイトメトリーにより検出し、結果は図１０及び１１に示される。
【0156】
図１０は電気穿孔後１０日目まで、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔したＴ細胞に高い蛍光輝度の細胞が大量に見えていることを示している。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットが欠失したｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したＴ細胞は、高い蛍光輝度の細胞が殆ど見えない。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットを付帯するベクターはＴ細胞においてＥＧＦＰをゲノムに統合したことを示している。一方、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの発現カセットを含まないベクターは外来遺伝子ＥＧＦＰを効果的に仲介して統合することができない。
【0157】
図１１は電気穿孔後７～１４日目のｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔したＴ細胞のフローサイトメトリー結果を示す。結果によれば、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したＴ細胞は、７日目の細胞陽性率が７４％弱に達し、電気穿孔後１４日目（３代培養）に７２％弱を維持している。ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを電気穿孔したＴ細胞は、電気穿孔後７日目の陽性率が７０％弱に達し、電気穿孔後１４日目（３代培養）の陽性率が６６％と６２％以上をそれぞれ維持している。
【0158】
上記の結果によれば、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０２－ＥＧＦＰを初代Ｔ細胞に電気穿孔した後、非常に高い統合率と外来遺伝子の陽性発現率を有することを示している。
【0159】
＜実施例６＞ダブルプラスミドＰＢトランスポゾンシステムをＪｕｒｋａｔ細胞に電気穿孔した統合効率の検出
急激に成長する少ない継代数のＪｕｒｋａｔ細胞を１×１０７個用意し、それぞれＡ組とＢ組とし、細胞が１組あたりで５×１０６個とする。４μｇのｐＫ２０１－ＰＢ＋３μｇのｐＫＣ２０－ＥＧＦＰの混合液と３μｇのｐＫ２０１－ＰＢ＋４μｇのｐＫＣ２０－ＥＧＦＰの混合液をそれぞれ用意し、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、Ａ組とＢ組細胞の細胞核にそれぞれ電気穿孔して（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で継代培養した。電気穿孔後の７日目、１０日目、１４日目で蛍光顕微鏡により写真を撮って観察した。電気穿孔後７日目、１０日目、１４日目（３代培養後）でフローサイトメータによりＥＧＦＰ陽性細胞の比率変化を検出し、プラスミドをトランスフェクションしていないＪｕｒｋａｔ細胞をフローサイトメトリーの対照とした。
急激に成長する少ない継代数のＪｕｒｋａｔ細胞を１×１０７個用意し、それぞれＡ組とＢ組とし、細胞が１組あたりで５×１０６個とする。４μｇのｐＫ２０１－ＰＢ＋３μｇのｐＫＣ２０－ＥＧＦＰの混合液と３μｇのｐＫ２０１－ＰＢ＋４μｇのｐＫＣ２０－ＥＧＦＰの混合液をそれぞれ用意し、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、Ａ組とＢ組細胞の細胞核にそれぞれ電気穿孔して（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で継代培養した。電気穿孔後の７日目、１０日目、１４日目で蛍光顕微鏡により写真を撮って観察した。電気穿孔後７日目、１０日目、１４日目（３代培養後）でフローサイトメータによりＥＧＦＰ陽性細胞の比率変化を検出し、プラスミドをトランスフェクションしていないＪｕｒｋａｔ細胞をフローサイトメトリーの対照とした。
【0160】
結果は図１２に示される。結果によれば、４μｇのｐＫ２０１－ＰＢ＋３μｇのｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞は、電気穿孔後７日目に細胞陽性率が４３％を上回り、電気穿孔後１４日目（３代培養後）に細胞陽性率が１３．３１％に低下した。同様に、３μｇのｐＫ２０１－ＰＢ＋４μｇのｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞は、電気穿孔後７日目に細胞陽性率が５２％を上回り、電気穿孔後１４日目（３代培養後）に細胞陽性率が１０．５７％に低下した。
【0161】
上記の結果によれば、ＰＢトランスポザーゼと外来遺伝子をそれぞれ発現したダブルベクタートランスポゾンシステムはＪｕｒｋａｔ細胞における統合効率が前述したシングルベクターｐＫＢシステムの統合効率より遥かに低い。
【0162】
＜実施例７＞ダブルプラスミドＰＢトランスポゾンシステムを初代Ｔ細胞に電気穿孔した統合効率の検出
単離されたばかりの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を５×１０６個用意し、４μｇのｐＫ２０１－ＰＢ＋３μｇのｐＫＣ２０－ＥＧＦＰの混合液を用意し、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－２ｂエレクトロポレーターにより、細胞核に電気穿孔してから（装置取扱説明書を参照）、細胞をＡＩＭ－Ｖ培地に入れて３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。６時間後に３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体と３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（ＮＯｖｏｐｒｏｔｅｉｎより購入）を含む６ウェルプレートに移動して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で希釈させて継代した。電気穿孔後の７日目と１４日目にフローサイトメトリーにより細胞を検出した。
単離されたばかりの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を５×１０６個用意し、４μｇのｐＫ２０１－ＰＢ＋３μｇのｐＫＣ２０－ＥＧＦＰの混合液を用意し、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－２ｂエレクトロポレーターにより、細胞核に電気穿孔してから（装置取扱説明書を参照）、細胞をＡＩＭ－Ｖ培地に入れて３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。６時間後に３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体と３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（ＮＯｖｏｐｒｏｔｅｉｎより購入）を含む６ウェルプレートに移動して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で希釈させて継代した。電気穿孔後の７日目と１４日目にフローサイトメトリーにより細胞を検出した。
【0163】
結果は図１３に示される。結果によれば、４μｇのｐＫ２０１－ＰＢ＋３μｇのｐＫＣ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔した初代細胞は、電気穿孔後７日目に細胞陽性率が１６．２０％であり、電気穿孔後１４日目（３代培養後）に細胞陽性率が１５．３４％に低下した。
【0164】
上記の結果によれば、ＰＢトランスポザーゼと外来遺伝子をそれぞれ発現したダブルベクタートランスポゾンシステムは初代Ｔ細胞における統合効率が前述したシングルベクターｐＫＢシステムの統合効率より明らかに低い。
【0165】
＜実施例８＞プラスミド使用量が低減したｐＫＢベクターをＪｕｒｋａｔ細胞に電気穿孔した統合効率の検出
急激に成長する少ない継代数のＪｕｒｋａｔ細胞を５×１０６個用意し、３μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドを用意し、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、細胞核に電気穿孔し（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で継代培養した。電気穿孔後７日目、１０日目、１４日目（３代培養後）にフローサイトメータによりＥＧＦＰ陽性細胞の比率変化を検出し、プラスミドをトランスフェクションしていないＪｕｒｋａｔ細胞をフローサイトメトリーの対照とした。
急激に成長する少ない継代数のＪｕｒｋａｔ細胞を５×１０６個用意し、３μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドを用意し、Ｌｏｎｚａ２ｂ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置により、細胞核に電気穿孔し（装置取扱説明書を参照）、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞が一杯になるまで成長した後、１：１０の比率で継代培養した。電気穿孔後７日目、１０日目、１４日目（３代培養後）にフローサイトメータによりＥＧＦＰ陽性細胞の比率変化を検出し、プラスミドをトランスフェクションしていないＪｕｒｋａｔ細胞をフローサイトメトリーの対照とした。
【0166】
結果は図１４に示される。結果によれば、３μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞は電気穿孔後７日目に細胞陽性率が６６％を上回り、電気穿孔後１４日目（３代培養後）に細胞陽性率が６３％弱を維持しており、実施例２における６μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドをＪｕｒｋａｔ細胞に電気穿孔した場合の１４日目の細胞陽性率に近い。
【0167】
上記の結果によれば、実施例２を基に、電気穿孔に利用されるｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミド使用量を半減した後、ｐＫＢベクターシステムの細胞における統合効率が殆ど変化しないため、本発明のｐＫＢベクターシステムは、ＤＮＡ量を減少した場合に同じ統合効率が実現でき、電気穿孔のＤＮＡ使用量を減少して、さらにＤＮＡによるＴ細胞への傷害性の低減及び電気穿孔後の細胞における残留プラスミドＤＮＡの低減に繋がる。
【0168】
＜実施例９＞細胞内ｐＫＢベクターの残留プラスミドのコピー数の検出
実施例２及び４の方法でＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２に５μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔して、電気穿孔後１０、１４、２０日目に細胞をそれぞれ収穫した。装置取扱説明書を参照しながら、実施例８の方法でＪｕｒｋａｔ細胞に３μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔して、電気穿孔後１０、１２、１４日目に細胞をそれぞれ収穫した。実施例５の方法で新鮮なＰＢＭＣに５μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔して、電気穿孔後の１０、１２、１４日目に細胞をそれぞれ収穫した。全ての操作は３回繰り返した。ＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含む上記収穫された全ての細胞について、異なる時点における残留プラスミド量をＴａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ法で検出した。
実施例２及び４の方法でＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２に５μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰをそれぞれ電気穿孔して、電気穿孔後１０、１４、２０日目に細胞をそれぞれ収穫した。装置取扱説明書を参照しながら、実施例８の方法でＪｕｒｋａｔ細胞に３μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔して、電気穿孔後１０、１２、１４日目に細胞をそれぞれ収穫した。実施例５の方法で新鮮なＰＢＭＣに５μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔して、電気穿孔後の１０、１２、１４日目に細胞をそれぞれ収穫した。全ての操作は３回繰り返した。ＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含む上記収穫された全ての細胞について、異なる時点における残留プラスミド量をＴａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ法で検出した。
【0169】
１）ＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含むｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドを標準品とし、内部リファレンス遺伝子Ａｃｔｉｎを含むプラスミドを内部リファレンス標準品とし、１０倍勾配で希釈された標準品をそれぞれ製造した。
【0170】
２）ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔した指定日数の細胞の総ＤＮＡを抽出して、ＰＢトランスポザーゼ遺伝子とＡｃｔｉｎ遺伝子を検出するためのサンプルとした。
【0171】
３）ＰＣＲ反応系を配置して、対象サンプルに対してＰＢトランスポザーゼ遺伝子と内部リファレンスＡｃｔｉｎ遺伝子をそれぞれ増幅させた。ＰＢ遺伝子の勾配希釈標準品とＡｃｔｉｎ遺伝子の勾配希釈標準品を増幅させて、ＰＢ遺伝子とＡｃｔｉｎ遺伝子の標準曲線をそれぞれ作成した。ＰＢ遺伝子とＡｃｔｉｎ遺伝子を増幅させるプライマー、プローブ配列、反応系はそれぞれ下記に示される。
【0172】
ＰＢ遺伝子増幅：
ＰＢ－Ｆ：５’ｇｇａｃｇａｇａｔｃｔａｃｇｃｃｔｔｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
ＰＢ－Ｒ：５’ｃｔｃａｔｃａｃｇｃｔｃａｃｇｔａｃａｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
ＰＢ－プローブ：５’ｔｇｃｇｃａｃｇｇｃｇｇｔｃａｔｃａｃｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
Ａｃｔｉｎ遺伝子増幅：
Ａｃｔｉｎ－Ｆ：５’ｇｇｇａｃｃｔｇａｃｔｇａｃｔａｃｃｔｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
Ａｃｔｉｎ－Ｒ：５’ａａｔｇｔｃａｃｇｃａｃｇａｔｔｔｃｃｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）
Ａｃｔｉｎ－プローブ：５’ｃａｃｃｇａｇｃｇｃｇｇｃｔａｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）
ＰＢ－Ｆ：５’ｇｇａｃｇａｇａｔｃｔａｃｇｃｃｔｔｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
ＰＢ－Ｒ：５’ｃｔｃａｔｃａｃｇｃｔｃａｃｇｔａｃａｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
ＰＢ－プローブ：５’ｔｇｃｇｃａｃｇｇｃｇｇｔｃａｔｃａｃｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
Ａｃｔｉｎ遺伝子増幅：
Ａｃｔｉｎ－Ｆ：５’ｇｇｇａｃｃｔｇａｃｔｇａｃｔａｃｃｔｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
Ａｃｔｉｎ－Ｒ：５’ａａｔｇｔｃａｃｇｃａｃｇａｔｔｔｃｃｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）
Ａｃｔｉｎ－プローブ：５’ｃａｃｃｇａｇｃｇｃｇｇｃｔａｃａｇｃｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）
【0173】
【表1】
【0174】
４）リアルタイム蛍光定量ＰＣＲで対象サンプルと標準品に対して増幅反応を行い、反応系が表１に示されており、反応プロセスが（１）５０℃、２ｍｉｎ；（２）９５℃、１０ｍｉｎ；（３）９５℃、１５ｓ、６０℃、１ｍｉｎであり、計４０サイクル繰り返した。標準曲線を作成して、標準曲線によりプラスミド残留量を算出した。コピー数の計算式はＰＢコピー数／Ａｃｔｉｎコピー数×２である。
【0175】
結果は図１５に示される。電気穿孔のプラスミド使用量が５μｇである通常使用量の場合、細胞内の残留プラスミドのコピー数が時間の経過と共に急激に低下している。細胞を電気穿孔後１４日目（３代後）まで培養した場合、Ｊｕｒｋａｔ細胞１個あたりの残留プラスミドコピー数が１０より小さく、Ｋ５６２細胞１個当たりと初代Ｔ細胞１個当たりの残留プラスミドコピー数が５より小さい。電気穿孔後２０日目まで培養した場合、Ｊｕｒｋａｔ細胞１個あたりとＫ５６２細胞１個あたりの残留プラスミドコピー数が１より小さい。電気穿孔プラスミド使用量を３μｇに減少した場合、電気穿孔後Ｊｕｒｋａｔ細胞内の残留プラスミドの含有量は、５μｇのプラスミドを電気穿孔した場合と比較すれば、さらに明らかに低下し、１０日目に細胞１個あたりのプラスミドコピー数が１０より小さく、１４日目にコピー数が１より小さい。
【0176】
上記の結果によれば、本発明のベクターはそのゲノム統合機能を十分に果たすと共に、宿主細胞における残留レベルが非常に低い。また、実施例８の結果を参照した結果、本発明のｐＫＢシリーズベクターは電気穿孔後の高い統合効率を保証する前提で、プラスミドＤＮＡの使用量を減少して、電気穿孔後のプラスミドＤＮＡの細胞内における残留をさらに減少した。
【0177】
＜実施例１０＞ｐＫＢ２００３－ＥＧＦＰベクターを電気穿孔した後の細胞における統合
上記実施例２及び４に記載される方法で、ｐＫＢ２００３－ＥＧＦＰプラスミドをＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞にそれぞれ電気穿孔して、電気穿孔後の７、１０、１４日目にフローサイトメトリーにより細胞陽性率を検出した。結果は図１６に示される。ｐＫＢ２００３－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞は７日目と１０日目に陽性細胞比率がそれぞれ４９％と４８％以上に達し、細胞を３代培養した後の１４日目に陽性率が４８％弱の高レベルを維持している。ｐＫＢ２００３－ＥＧＦＰを電気穿孔したＫ５６２細胞は７日目と１０日目に陽性細胞比率が７０％弱に達し、細胞を３代培養した後の１４日目に陽性率が６６％を上回る高レベルを維持している。
上記実施例２及び４に記載される方法で、ｐＫＢ２００３－ＥＧＦＰプラスミドをＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞にそれぞれ電気穿孔して、電気穿孔後の７、１０、１４日目にフローサイトメトリーにより細胞陽性率を検出した。結果は図１６に示される。ｐＫＢ２００３－ＥＧＦＰを電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞は７日目と１０日目に陽性細胞比率がそれぞれ４９％と４８％以上に達し、細胞を３代培養した後の１４日目に陽性率が４８％弱の高レベルを維持している。ｐＫＢ２００３－ＥＧＦＰを電気穿孔したＫ５６２細胞は７日目と１０日目に陽性細胞比率が７０％弱に達し、細胞を３代培養した後の１４日目に陽性率が６６％を上回る高レベルを維持している。
【0178】
上記の結果によれば、ｐＫＢ２００３ベクターは、細胞において高効率的に統合すると共に、外来遺伝子を発現することができる。
【0179】
＜実施例１１＞調節エレメント配列により取り替えられたｐＫＢシリーズベクターを電気穿孔した後の細胞における統合
実施例２、実施例４、実施例５に記載される方法で電気穿孔しているプラスミドの使用量をそれぞれ３μｇに低下させ、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、健康なヒト血液に由来するＰＢＭＣにｐＫＢ２０Ｉ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ａ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ａ２－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ２－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ３－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ４－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ５－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ６－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ７－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ８－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｅ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｅ２－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｅ３－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｅ４－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ２－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ３－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ４－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ５－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ６－ＥＧＦＰプラスミドをそれぞれ電気穿孔して、電気穿孔後１４日目にフローサイトメトリーにより細胞陽性率を検出し、結果は表２に示される。
実施例２、実施例４、実施例５に記載される方法で電気穿孔しているプラスミドの使用量をそれぞれ３μｇに低下させ、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、健康なヒト血液に由来するＰＢＭＣにｐＫＢ２０Ｉ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ａ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ａ２－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ２－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ３－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ４－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ５－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ６－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ７－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｕ８－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｅ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｅ２－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｅ３－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｅ４－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ１－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ２－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ３－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ４－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ５－ＥＧＦＰ、ｐＫＢ２０Ｐ６－ＥＧＦＰプラスミドをそれぞれ電気穿孔して、電気穿孔後１４日目にフローサイトメトリーにより細胞陽性率を検出し、結果は表２に示される。
【0180】
【表2】
【0181】
表２の結果によれば、上記調節エレメント配列により取り替えられたｐＫＢシリーズプラスミドベクターは、異なる細胞のゲノムに高効率的に統合することができ、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰの上記各細胞における統合率と同じレベルである。
【0182】
＜実施例１２＞ｐＫＢ２０５－ＥＧＦＰベクターを初代Ｔ細胞に電気穿孔した後の統合効率の検出
実施例５に記載される方法で電気穿孔しているプラスミドの使用量を３μｇに低下させ、健康なヒト血液に由来するＰＢＭＣにｐＫＢ２０５－ＥＧＦＰを電気穿孔して、電気穿孔後７日目と１４日目にフローサイトメトリーにより細胞陽性率を検出した。
実施例５に記載される方法で電気穿孔しているプラスミドの使用量を３μｇに低下させ、健康なヒト血液に由来するＰＢＭＣにｐＫＢ２０５－ＥＧＦＰを電気穿孔して、電気穿孔後７日目と１４日目にフローサイトメトリーにより細胞陽性率を検出した。
【0183】
結果は図１７に示される。ｐＫＢ２０５－ＥＧＦＰを電気穿孔したＴ細胞は、７日目の細胞陽性率が４２％を上回り、電気穿孔後の１４日目（３代培養）に３６％以上を維持している。上記によれば、ｐＫＢ２０５－ＥＧＦＰベクターを初代Ｔ細胞に電気穿孔した後、比較的に高い統合率と外来遺伝子の陽性発現率を有することを示している。
【0184】
＜実施例１３＞ｐＫＢベクターのＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞における統合部位の分析
Ｊｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞をそれぞれ２組用意し、実施例２及び４に記載される方法で２種の細胞にｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドをそれぞれ電気穿孔し、電気穿孔後に１４日培養し、細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出して、晶能生物技術（上海）有限公司に全ゲノムシークエンシングを依頼し、ＥＧＦＰのゲノムにおける挿入部位の分布状況を分析した。結果は図１８～２１と表３に示される。図１８、１９、２０、２１は、Ｋ５６２サンプル１、Ｋ５６２サンプル２、Ｊｕｒｋａｔサンプル１、Ｊｕｒｋａｔサンプル２のそれぞれにおけるｐＫＢ２０ベクターにより仲介されるゲノム統合部位の模式図である。
Ｊｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞をそれぞれ２組用意し、実施例２及び４に記載される方法で２種の細胞にｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドをそれぞれ電気穿孔し、電気穿孔後に１４日培養し、細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出して、晶能生物技術（上海）有限公司に全ゲノムシークエンシングを依頼し、ＥＧＦＰのゲノムにおける挿入部位の分布状況を分析した。結果は図１８～２１と表３に示される。図１８、１９、２０、２１は、Ｋ５６２サンプル１、Ｋ５６２サンプル２、Ｊｕｒｋａｔサンプル１、Ｊｕｒｋａｔサンプル２のそれぞれにおけるｐＫＢ２０ベクターにより仲介されるゲノム統合部位の模式図である。
【0185】
【表3】
【0186】
図１８～２１と表３の結果によれば、本発明のｐＫＢ２０ベクターにより仲介される外来遺伝子の細胞のゲノムへの統合は、主に遺伝子間領域とイントロン領域に発生し、エキソン領域と遺伝子発現の調節に関する領域（例えば３’ＵＴＲ）に統合部位が少ない。これにより、ｐＫＢ２０ベクターにより仲介される外来遺伝子の細胞のゲノムにおける統合は細胞自身の遺伝子発現への影響が非常に小さい。
【0187】
＜実施例１４＞ｐＫＢベクターのＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞における統合のｍＲＮＡ発現プロフィルの分析
上記実施例２及び４に記載される方法でＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞にｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドをそれぞれ電気穿孔し、プラスミド使用量が４μｇである。電気穿孔後１４日目に細胞を収穫して、ｍＲＮＡシークエンシングと発現プロフィル分析を実施すると共に、プラスミドを電気穿孔していないＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞のｍＲＮＡ発現プロフィルと比較した。Ｋ５６２とＪｕｒｋａｔはそれぞれサンプルを２組提供して分析した。
上記実施例２及び４に記載される方法でＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞にｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドをそれぞれ電気穿孔し、プラスミド使用量が４μｇである。電気穿孔後１４日目に細胞を収穫して、ｍＲＮＡシークエンシングと発現プロフィル分析を実施すると共に、プラスミドを電気穿孔していないＪｕｒｋａｔ細胞とＫ５６２細胞のｍＲＮＡ発現プロフィルと比較した。Ｋ５６２とＪｕｒｋａｔはそれぞれサンプルを２組提供して分析した。
【0188】
シークエンシングと分析の結果によれば、それぞれのプラスミドを電気穿孔していない対照細胞と比較すれば、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気穿孔したｐＫＢ２０統合部位の隣接遺伝子のｍＲＮＡ発現変化が小さく、関連遺伝子の差次的発現状況は表４～７に示される。これにより、本発明のｐＫＢベクターのゲノムにおける統合は細胞のゲノムの安定性と遺伝子発現プロフィルへの影響が比較的に小さい。
【0189】
【表4】
【0190】
【表5】
【0191】
【表6】
【0192】
【表7】
【0193】
＜実施例１５＞ｐＫＢ２０－ＨＥＲ２ＣＡＲベクター及びＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造
ｐＫＢ２０のポリクローナル部位のＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位との間にＮＦＡＴモチーフを付帯するＥＦ１Ａプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を挿入し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位との間にＨＥＲ２ＣＡＲのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）を挿入し、ｐＫＢ２０－ＨＥＲ２ＣＡＲと名付ける。ＮＦＡＴモチーフを付帯するＥＦ１Ａプロモーター配列とＨＥＲ２ＣＡＲのコード配列は上海杰瑞生物科技有限公司に合成を依頼する。
ｐＫＢ２０のポリクローナル部位のＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位との間にＮＦＡＴモチーフを付帯するＥＦ１Ａプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を挿入し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位との間にＨＥＲ２ＣＡＲのコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）を挿入し、ｐＫＢ２０－ＨＥＲ２ＣＡＲと名付ける。ＮＦＡＴモチーフを付帯するＥＦ１Ａプロモーター配列とＨＥＲ２ＣＡＲのコード配列は上海杰瑞生物科技有限公司に合成を依頼する。
【0194】
下記工程で末梢血から単離されたＰＢＭＣにｐＫＢ２０－ＨＥＲ２ＣＡＲベクターを電気穿孔し、ＨＥＲ２をターゲティングするＣＡＲ－Ｔ細胞を製造した。使用されるＰＢＭＣはＡｌｌＣｅｌｌｓ社より購入し、健康な成人の末梢血に由来する。
【0195】
１）懸濁細胞を５０ｍｌ遠心分離チューブに収集して、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離する。
【0196】
２）上澄みを捨て、生理食塩水を入れて再懸濁させ、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離し、生理食塩水を捨てる。この工程を繰り返して細胞を計数する。
【0197】
３）１．５ｍｌ遠心分離チューブを２つ取り、それぞれ５×１０６個細胞を入れて、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離する。
【0198】
４）上澄みを捨て、電気穿孔試薬キット（Ｌｏｎｚａ社より購入）を取り、１８μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎＩ試薬と８２μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ試薬を入れ、第１チューブに５μｇのｐＫＢ２０ブランクプラスミドを入れて対照とし、第２チューブに５μｇのｐＫＢ２０－ＨＥＲ２ＣＡＲプラスミドを入れる。
【0199】
５）遠心分離チューブにプラスミドが混合された細胞懸濁液を電気穿孔カップに移動し、エレクトロポレーターに入れ、プログラムＴ０２０を選択して、エレクトロポレーションを行う。
【0200】
６）試薬キットのマイクロピペットで電気穿孔された細胞懸濁液を、ＡＩＭ－Ｖ培養液を入れた１２ウェルプレート（２％ＦＢＳを含むＡＩＭ－Ｖ培養液）に移動し、均一に混合して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。さらに、５μｇ／ｍＬのＨＥＲ２細胞外領域抗原（
【0201】
【表8】
【0202】
１０００４－Ｈ０８Ｈ）と５μｇ／ｍＬのＣＤ２８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４－０２８１－８２）を含む混合液で６ウェルプレートの２つのウエルをコーティングし、各ウェルに１ｍＬずつ入れ、６ウェルプレートを３７℃でインキュベートする。
【0203】
７）６時間後、電気穿孔されて３７℃で、５％ＣＯ２インキュベータで培養した細胞を、ＨＥＲ２細胞外領域抗原とＣＤ２８抗体でコーティングした６ウェルプレートに移動して、３ｍｌとなるように最終濃度１００ＩＵ／ｍＬＩＬ－２の追加培養液を入れ、４～５日培養した後、Ｔ細胞の成長状況を観察する。活性化した細胞を、２％ＦＢＳを含むＡＩＭ－Ｖ培養液に移動し、必要量となるように引き続き培養して、ＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞を獲得する。ｐＫＢ２０ブランクに移動した細胞は対照とするＭｏｃｋ－Ｔ細胞である。
【0204】
＜実施例１６＞ＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現陽性細胞の検出
１）実施例１５で製造されたＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞を１×１０６個収集して、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。
１）実施例１５で製造されたＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞を１×１０６個収集して、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。
【0205】
２）上澄みを捨て、生理食塩水をそれぞれ入れ、細胞を再懸濁させて、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。
【0206】
３）上澄みを捨て、１００μＬ生理食塩水をそれぞれ入れ、細胞を再懸濁させ、各チューブに１μＬのビオチン標識を実施したＨＥＲ２抗原（
【0207】
【表9】
【0208】
より購入、製品番号：ＨＥＲ－ＨＭ４０２）をそれぞれ入れて、４℃で３０分間インキュベートする。
【0209】
４）適量の生理食塩水をそれぞれ入れ、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、２回洗浄して、上澄みを捨てる。
【0210】
５）１００μＬ生理食塩水をそれぞれ入れ、細胞を再懸濁させ、１μＬのＰＥ標識を実施したストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒより購入、製品番号：Ｓ２０９８２）を入れ、均一に混合して、４℃で３０ｍｉｎインキュベートする。
【0211】
６）適量の生理食塩水をそれぞれ入れ、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、２回洗浄して、上澄みを捨てる。
【0212】
７）４００μＬ生理食塩水で再懸濁させて、フローサイトメータにより検出する。
結果は図２２に示される。ＰＥ陽性を示した細胞が９３．４１％に達したため、ｐＫＢ２０－ＨＥＲ２ＣＡＲプラスミドをＰＢＭＣに電気穿孔することで製造されたＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞に、ＣＡＲ発現陽性の細胞の比率が９０％以上である。
結果は図２２に示される。ＰＥ陽性を示した細胞が９３．４１％に達したため、ｐＫＢ２０－ＨＥＲ２ＣＡＲプラスミドをＰＢＭＣに電気穿孔することで製造されたＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞に、ＣＡＲ発現陽性の細胞の比率が９０％以上である。
【0213】
＜実施例１７＞ＨＥＲ２－ＣＡＲ－Ｔの細胞殺傷機能テスト
ＡＣＥＡ社のリアルタイム非標識細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）で実施例１５により取得したＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出した。具体的な工程は下記の通りである。
ＡＣＥＡ社のリアルタイム非標識細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）で実施例１５により取得したＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出した。具体的な工程は下記の通りである。
【0214】
（１）ゼロ設定：各ウェルに５０μＬのＤＭＥＭ培養液を入れ、装置に入れ、工程１を選択して、ゼロ設定する。
【0215】
（２）標的細胞プレーティング：ヒト卵巣がん細胞ＳＫＯＶ－３（ＡＴＣＣより購入、ＨＥＲ２発現陽性）を、１ウェルあたり１０４個細胞／５０μＬで検出電極を含むプレートにプレーティングし、細胞が安定的になるまで数分間静置してから、装置に入れ、工程２を開始して、細胞を培養する。
【0216】
（３）エフェクター細胞の添加：標的細胞を１８ｈ培養した後、対照細胞Ｍｏｃｋ－Ｔとエフェクター細胞ＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔを１ウエルあたり５０μＬでそれぞれ添加する。ＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔは、１：１、２：１、４：１といった３つのＥＴ比をそれぞれ設定し、Ｍｏｃｋ－Ｔは４：１のＥＴ比を設定する。ＥＴ比の設定は生細胞の総数で算出する。共培養を開始し、６０ｈ超えた後、細胞の増殖曲線を観察する。
【0217】
結果は図２３に示される。対照Ｍｏｃｋ－Ｔ細胞組の殺傷曲線とＳＫＯＶ－３腫瘍細胞曲線は傾向が似ているため、Ｍｏｃｋ－Ｔ細胞のＳＫＯＶ－３細胞に対する殺傷効果が小さい。ＨＥＲ２ＣＡＲ－Ｔは１：１、２：１、４：１といった３つのＥＴ比でＳＫＯＶ－３細胞に対する殺傷効果が明らかであり、さらに殺傷効果がＥＴ比の向上に伴って明らかに向上する。
【0218】
＜実施例１８＞ｐＫＢ２０－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲベクター及びＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞の製造
ｐＫＢ２０－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲベクターの構築：
コードを合成してＮＹ－ＥＳＯ－１抗原ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（ＨＬＡ－＊０２：０１）のＴＣＲのα鎖とβ鎖の遺伝子ＤＮＡ配列を認識し、両者はＰ２Ａペプチド断片をコードするＤＮＡ配列により連結し、連結された配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示される。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４の３’末端に、Ｐ２Ａペプチド断片をコードするＤＮＡによりＥＧＦＰをコードするＤＮＡ配列を連結して、ＥＧＦＰリーディングフレームを共有連結するＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ遺伝子を取得し、得られた配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される。ｐＫＢ２０のポリクローナル部位のＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位との間にＮＦＡＴモチーフを付帯するＥＦ１Ａプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を挿入し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位との間にＥＧＦＰリーディングフレームを共有連結するＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ遺伝子のコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）を挿入し、ｐＫＢ２０－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲと名付ける。ＮＦＡＴモチーフを付帯するＥＦ１Ａプロモーター配列とＥＧＦＰリーディングフレームを共有連結するＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ遺伝子のコード配列は上海杰瑞生物科技有限公司に合成を依頼する。
ｐＫＢ２０－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲベクターの構築：
コードを合成してＮＹ－ＥＳＯ－１抗原ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（ＨＬＡ－＊０２：０１）のＴＣＲのα鎖とβ鎖の遺伝子ＤＮＡ配列を認識し、両者はＰ２Ａペプチド断片をコードするＤＮＡ配列により連結し、連結された配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示される。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４の３’末端に、Ｐ２Ａペプチド断片をコードするＤＮＡによりＥＧＦＰをコードするＤＮＡ配列を連結して、ＥＧＦＰリーディングフレームを共有連結するＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ遺伝子を取得し、得られた配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される。ｐＫＢ２０のポリクローナル部位のＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位との間にＮＦＡＴモチーフを付帯するＥＦ１Ａプロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を挿入し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位との間にＥＧＦＰリーディングフレームを共有連結するＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ遺伝子のコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）を挿入し、ｐＫＢ２０－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲと名付ける。ＮＦＡＴモチーフを付帯するＥＦ１Ａプロモーター配列とＥＧＦＰリーディングフレームを共有連結するＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ遺伝子のコード配列は上海杰瑞生物科技有限公司に合成を依頼する。
【0219】
ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞の製造：
５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４－００３７－８２）と５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４－０２８１－８２）を含むコーティング液により６ウェルプレートを室温で２～４時間コーティングし、コーティング液を吸い取ってから、生理食塩水でウェルプレートを１～３回洗浄し、２％ＦＢＳを含むＡＩＭ－Ｖ培地を入れて使用に備える。ヒト末梢血ＰＢＭＣ（ＨＬＡ－＊０２：０１、ＡＬＬＣＥＬＬＳより購入）を３７℃水浴で蘇生させ、ＰＢＭＣを２～４ｈ接着培養した。そのうち、接着していない懸濁細胞はナイーブＴ細胞である。懸濁細胞を１５ｍｌ遠心分離チューブに収集して、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨て、生理食塩水を入れて、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離し、生理食塩水を捨て、この工程を繰り返す。さらに、洗浄されたナイーブＴ細胞を、用意された培地を入れた抗体コーティングウェルに移動し、３７℃、５％ＣＯ２で３～４日培養してから、その後の実験に利用される。
５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４－００３７－８２）と５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４－０２８１－８２）を含むコーティング液により６ウェルプレートを室温で２～４時間コーティングし、コーティング液を吸い取ってから、生理食塩水でウェルプレートを１～３回洗浄し、２％ＦＢＳを含むＡＩＭ－Ｖ培地を入れて使用に備える。ヒト末梢血ＰＢＭＣ（ＨＬＡ－＊０２：０１、ＡＬＬＣＥＬＬＳより購入）を３７℃水浴で蘇生させ、ＰＢＭＣを２～４ｈ接着培養した。そのうち、接着していない懸濁細胞はナイーブＴ細胞である。懸濁細胞を１５ｍｌ遠心分離チューブに収集して、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨て、生理食塩水を入れて、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離し、生理食塩水を捨て、この工程を繰り返す。さらに、洗浄されたナイーブＴ細胞を、用意された培地を入れた抗体コーティングウェルに移動し、３７℃、５％ＣＯ２で３～４日培養してから、その後の実験に利用される。
【0220】
ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔを発現する細胞を電気穿孔して製造する。工程は下記の通りである。
【0221】
１）ＡＩＭ－Ｖ培地を１ウェルあたり２ｍＬで１２ウェルプレートの２ウェルに事前に入れてから、インキュベータに入れて、３７℃、５％ＣＯ２で１時間予熱する。
【0222】
２）下記表８の１ウェルあたり単回使用量の電気穿孔液の配合比で２ウェル調製する。
【0223】
【表10】
【0224】
３）得られた活性化Ｔ細胞を取り、２つのＥＰチューブに入れ、各ＥＰチューブに細胞をそれぞれ５×１０６個入れて、１２００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨ててから、５００μＬ生理食塩水で細胞を再懸濁させ、遠心分離工程を繰り返し、細胞を洗浄して沈殿させた。
【0225】
４）２）で調製された２ウェルの電気穿孔液系にプラスミドｐＫＢ２０－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲとｐＫＢ２０－ＥＧＦＰベクターをそれぞれ４μｇずつ入れた後、室温で３０ｍｉｎ以内静置した。
【0226】
５）４）で調製された、プラスミドを含む電気穿孔液で再懸濁させた２チューブの活性化Ｔ細胞から、細胞再懸濁液を１チューブあたり１００μＬでゆっくりと吸い取り、ＬＯＮＺＡ １００μＬ電気穿孔カップに移動し、電気穿孔カップをＬＯＮＺＡ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標） ２ｂ電気穿孔槽に入れて、電気穿孔プログラムを立ち上げた。電気穿孔プログラムはＴ－０２０を選択する。
【0227】
６）電気穿孔を完了してから、電気穿孔カップをゆっくりと取り出し、細胞懸濁液を吸い取り、ＥＰチューブに移動した。予熱されたＡＩＭ－Ｖ培地を１チューブあたり２００μＬ入れてから、１）における１２ウェルプレートの予熱されたＡＩＭ－Ｖ培地を含むウェルに移動し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。１ｈ培養してから、最終濃度が５μＭとなるように化合物Ｇ１５０（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓより購入）を入れた。その後、１３日間培養し続け、その間に細胞増殖状況に応じて継代し、１３日間後、各電気穿孔サンプルの細胞数と細胞生存率について検出し、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞とＭｏｃｋ－Ｔ細胞をそれぞれ製造した。
【0228】
＜実施例１９＞ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現陽性細胞の検出
１）実施例１８で製造されたＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞を１×１０６個収集して、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。
１）実施例１８で製造されたＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞を１×１０６個収集して、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。
【0229】
２）上澄みを捨て、生理食塩水をそれぞれ入れ、細胞を再懸濁させて、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。
【0230】
３）フローサイトメータにより検出する。
結果は図２４に示される。ＥＧＦＰ発現陽性の細胞比率が３７．５７％である。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲのα鎖とβ鎖の遺伝子ＤＮＡ配列及びＥＧＦＰのコードＤＮＡ配列の三者の間はＰ２Ａペプチド断片のコード配列により連結され、ＥＧＦＰ発現陽性の細胞はＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ遺伝子の発現を間接的に反映できる。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現陽性の細胞比率が３７％程度であると推測する。
結果は図２４に示される。ＥＧＦＰ発現陽性の細胞比率が３７．５７％である。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲのα鎖とβ鎖の遺伝子ＤＮＡ配列及びＥＧＦＰのコードＤＮＡ配列の三者の間はＰ２Ａペプチド断片のコード配列により連結され、ＥＧＦＰ発現陽性の細胞はＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ遺伝子の発現を間接的に反映できる。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現陽性の細胞比率が３７％程度であると推測する。
【0231】
＜実施例２０＞ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔの細胞殺傷機能テスト
ＡＣＥＡ社のリアルタイム非標識細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）で実施例１８により取得したＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出した。具体的な工程は下記の通りである。
ＡＣＥＡ社のリアルタイム非標識細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）で実施例１８により取得したＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出した。具体的な工程は下記の通りである。
【0232】
（１）ゼロ設定：各ウエルに５０μＬのＤＭＥＭ培養液を入れ、装置に入れ、工程１を選択して、ゼロ設定する。
【0233】
（２）標的細胞プレーティング：ヒト悪性黒色腫細胞系Ａ３７５（ＡＴＣＣより購入、ＮＹ－ＥＳＯ－１発現陽性）を、１ウェルあたり１０４個細胞／５０μＬで検出電極を含むプレートにプレーティングし、細胞が安定的になるまで数分間静置してから、装置に入れ、工程２を開始して、細胞を培養する。
【0234】
（３）エフェクター細胞の添加：標的細胞を１８ｈ培養した後、細胞指数を観察した。細胞指数が１である場合、対照細胞Ｍｏｃｋ－Ｔとエフェクター細胞ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔを１ウェルあたり５０μＬでそれぞれ添加する。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔは、０．２５：１、０．５：１といった２つのＥＴ比を設定し、Ｍｏｃｋ－Ｔは０．５：１のＥＴ比を設定する。ＥＴ比の設定はＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現陽性の細胞数で算出する。工程３共培養を開始し、７０ｈ超えた後、細胞の増殖曲線を観察する。
【0235】
結果は図２５に示される。対照Ｍｏｃｋ－Ｔ細胞組の殺傷曲線とＡ３７５腫瘍細胞曲線はほぼ重なるため、Ｍｏｃｋ－Ｔ細胞のＡ３７５細胞に対する殺傷効果が殆どない。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－Ｔは０．２５：１と０．５：１の２つのＥＴ比でＡ３７５細胞に対する殺傷効果が明らかであり、さらに殺傷効果がＥＴ比の向上に伴って明らかに向上する。
【0236】
＜比較例１＞ＥＧＦＰ発現カセットを含むｐＮＢベクターのＫ５６２細胞における統合
中国特許ＣＮ１０５１５４４７３Ｂ明細書第１５ページの実施例１と明細書第１６ページの実施例２に記載される方法で、ｐＮＢベクターとｐＮＢ３２８－ＥＧＦＰをそれぞれ構築した。本願の実施例４に記載される方法で、ｐＮＢ３２８－ＥＧＦＰを使用して電気穿孔法によりＥＧＦＰを安定的に統合発現するＫ５６２を製造し、電気穿孔後１４日目（３代培養）にフローサイトメトリーによりＥＧＦＰ発現陽性の細胞を検出した。
中国特許ＣＮ１０５１５４４７３Ｂ明細書第１５ページの実施例１と明細書第１６ページの実施例２に記載される方法で、ｐＮＢベクターとｐＮＢ３２８－ＥＧＦＰをそれぞれ構築した。本願の実施例４に記載される方法で、ｐＮＢ３２８－ＥＧＦＰを使用して電気穿孔法によりＥＧＦＰを安定的に統合発現するＫ５６２を製造し、電気穿孔後１４日目（３代培養）にフローサイトメトリーによりＥＧＦＰ発現陽性の細胞を検出した。
【0237】
結果は図２６に示される。電気穿孔後１４日目にＥＧＦＰ発現陽性のＫ５６２細胞比率が４５．５４％である。
【0238】
＜比較例２＞ＥＧＦＰ発現カセットを含むｐＮＢベクターの初代Ｔ細胞における統合
本願の実施例５に記載される方法で、ｐＮＢ３２８－ＥＧＦＰを使用して電気穿孔法によりＥＧＦＰを安定的に統合発現する初代Ｔ細胞を製造し、電気穿孔後１４日目（細胞を３代培養）にフローサイトメトリーによりＥＧＦＰ発現陽性の細胞を検出した。電気穿孔に利用されるＰＢＭＣと実施例５に利用されるＰＢＭＣは同じロットのＰＢＭＣである。電気穿孔後１４日目（３代培養）にフローサイトメトリーによりＥＧＦＰ発現陽性の細胞を検出した。
本願の実施例５に記載される方法で、ｐＮＢ３２８－ＥＧＦＰを使用して電気穿孔法によりＥＧＦＰを安定的に統合発現する初代Ｔ細胞を製造し、電気穿孔後１４日目（細胞を３代培養）にフローサイトメトリーによりＥＧＦＰ発現陽性の細胞を検出した。電気穿孔に利用されるＰＢＭＣと実施例５に利用されるＰＢＭＣは同じロットのＰＢＭＣである。電気穿孔後１４日目（３代培養）にフローサイトメトリーによりＥＧＦＰ発現陽性の細胞を検出した。
【0239】
結果は図２７に示される。電気穿孔後１４日目にＥＧＦＰ発現陽性のＴ細胞比率が３４．６０％である。
【0240】
本発明の具体的な実施形態について詳しく記述したにも関わらず、当業者は、開示された全ての教示に基づき、その詳細内容について様々な修正と置換を実施してもよく、これらの変更が本発明の保護範囲にあると理解すべきである。本発明の全範囲は、添付される請求項及びその任意の同等物より提示された。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】