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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-21
(54)【発明の名称】ＮＫ細胞の大量増殖培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20231114BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023551941
(86)(22)【出願日】2021-05-10
(85)【翻訳文提出日】2023-05-19
(86)【国際出願番号】 KR2021005785
(87)【国際公開番号】W WO2022102887
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】10-2020-0150118
(32)【優先日】2020-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523173210
【氏名又は名称】ハンビオ シーオー．，エルティーディー．
(71)【出願人】
【識別番号】522486634
【氏名又は名称】カン、ダ ウィット
【氏名又は名称原語表記】ＫＡＮＧ，Ｄａ Ｗｉｔｔ
【住所又は居所原語表記】＃１０１－９１０，２５，Ｉｒｗｏｎ－ｒｏ １４－ｇｉｌ，Ｇａｎｇｎａｍ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ ０６３５６，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000486
【氏名又は名称】弁理士法人とこしえ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カン ダウィット
(72)【発明者】
【氏名】カン ヒョンチョル
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BD39
4B065BD50
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、ＮＫ細胞の培養方法に関し、より詳細には、１）血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）の免疫細胞のペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を分離するステップと、２）前記ＰＢＭＣを抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされた培養器を用いてＲＰＭＩ培養培地において培養するステップと、３）前記ＰＢＭＣを継代培養するステップと、４）前記ＰＢＭＣにＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２＋ＩＬ－１５からなるサイトカイン群から選ばれたサイトカインを処理することにより、ＮＫ細胞を活性化させるステップと、を含むＮＫ細胞の培養方法に関する。本発明は、様々なサイトカインのうち、ＩＬ－２、ＩＬ－１５を用いてＮＫ細胞に処理したとき、効果的に細胞を活性化できる最適な組み合わせとしてのＩＬ－２＋ＩＬ－１５を処理したときにＮＫ細胞を大量で培養可能であり、これを用いる場合、がん細胞の細胞死滅または殺傷能が促されることができて、がんの予防または治療に効く免疫細胞治療剤として用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１）フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）と遠心分離を用いて、血液から免疫細胞を含有している末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）のペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を分離するステップと、２）前記分離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされた培養器を用いて、ＲＰＭＩ培養培地、血漿、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、抗ＣＤ５６、抗ＮＫｐ４６及び抗ＮＫｐ３０を含有している培地において培養するステップと、
３）前記培養された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＲＰＭＩ培地、アルブミン、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、抗ＣＤ５６、抗ＮＫｐ４６、抗ＮＫｐ３０において継代培養するステップと、
４）前記継代培養された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＲＰＭＩ及びアルブミン、抗ＮＫｐ３０、抗ＮＫｐ４６、抗ＣＤ５６抗体の添加を基本とした培地組成物に添加し、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２＋ＩＬ－１５からなるサイトカイン群から選ばれたサイトカインを処理することにより、ＮＫ細胞を活性化させるステップと、
を含む、ＮＫ細胞の培養方法。
【請求項2】
前記４）ステップのサイトカインとしては、ＩＬ－２＋ＩＬ－１５を処理することを特徴とする、請求項１に記載のＮＫ細胞の培養方法。
【請求項3】
前記サイトカインは、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌとＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌを処理することを特徴とする、請求項２に記載のＮＫ細胞の培養方法。
【請求項4】
前記１）ステップの免疫細胞の分離に際して、免疫細胞のペレット（ｐｅｌｌｅｔ）にＲＢＣ（赤血球）分解用緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を処理することにより、赤血球を除去することを特徴とする、請求項１に記載のＮＫ細胞の培養方法。
【請求項5】
前記２）ステップの培養は、細胞数が３×１０７以下である場合に抗ＣＤ１６によりコーティングされたＴ２５フラスコにおいて、細胞数が３×１０７以上である場合に抗ＣＤ１６によりコーティングされたＴ７５フラスコにおいて、ＲＰＭＩ ８ｍｌ、血漿２ｍｌ、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌ、抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌを入れ、ＰＢＭＣペレットをＲＰＭＩ １０ｍｌに浮遊させてさらに入れた後、３７℃、５％ ＣＯ２培養器において３～４日間培養することを特徴とする、請求項１に記載のＮＫ細胞の培養方法。
【請求項6】
前記３）ステップの継代培養は、２）ステップの細胞培養懸濁液２０ｍｌ、ＲＰＭＩ ７２ｍｌ、アルブミン８ｍｌ、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌを入れ、３７℃、５％ ＣＯ２培養器において３～５日間１次継代培養を行い、１次継代培養懸濁液５０ｍｌ、ＲＰＭＩ １８０ｍｌ、アルブミン２０ｍｌ、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌを入れ、３７℃、５％ ＣＯ２培養器において５～７日間２次継代培養を行うことを特徴とする、請求項１に記載のＮＫ細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫療法に適用されるナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＮＫ細胞）の大量増殖培養方法に関し、より詳細には、ヒトの抹消血液に由来したリンパ球を培養して悪性腫瘍の治療効果が抜群であるＮＫ細胞を効率よく増幅及び活性化させるとともに、ＮＫ細胞が占める割合を著しく増加させることのできるＮＫ細胞の大量増殖培養方法に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫療法は、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＮＫ細胞）、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞などがんの治療に最も重要な免疫細胞を患者の血液から抽出した後、色々な種類の刺激剤を用いてがんに強く働く免疫細胞として育てた後、再び患者に注入する方法であって、患者自分の血液を使用するので、従来の化学療法などに比べて副作用も少なく、投与法もまた簡便であることから、最近、それに関する研究が盛んに行われている。
【0003】
免疫療法において活性化させる免疫細胞の中でも、特に、ＮＫ細胞は、リンパ球の一種である特徴的な形態である大顆粒状リンパ球（ＬＧＬ；Ｌａｒｇｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）であって、感染されたウィルス、腫瘍細胞を殺す能力が抜群であり、ほとんどの正常細胞は殺さないという特性を有しているが、その抗腫瘍作用は、壊死（ネクローシス）やプログラム細胞死（アポトーシス）、またはこれらの２種類の作用機序が同時に生じて行われる。ＮＫ細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、インターフェロン（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）などのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）に反応し、これにより、力価（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、分泌性（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ）、増殖性（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）の機能が上昇する。ＮＫ細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、ヒトにおいてＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＣＤ５６であり、ＣＤ１６とＣＤ５６は、細胞の表面にＴ細胞受容体複合体（ＴＲＣ：Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）がないため、ＮＫ細胞に対するマーカー（ｍａｒｋｅｒ）として活用される。
【0004】
このようなＮＫ細胞は、初期の生体防御機構と人体の腫瘍免疫において重要な役割を果たすことが知られている。
【0005】
すなわち、ＮＫ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）の発現に伴う免疫の獲得過程なしにも特定の自己細胞、同種細胞、さらには異種がん細胞もまた殺傷することができ、特に、クラス１ＭＨＣ（Ｃｌａｓｓ１ ＭＨＣ）を少なく発現させるか、あるいは、全く発現させない標的細胞をさらに上手く殺すこともできる。したがって、ＮＫ細胞は、ＭＨＣが発現しないほとんどのがん細胞を効果的に殺すことができ、その他にも、いくつかのウィルスに感染された細胞と腸チフス菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）などのような細菌を殺すことができる。
【0006】
このようなＮＫ細胞は、先天免疫（自然免疫、ｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ）を担う重要な細胞であって、Ｔ細胞とは異なり、肝（ｌｉｖｅｒ）、骨髄（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）において成熟される。特に、ウィルス（ｖｉｒｕｓ）に感染された細胞や腫瘍細胞（ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）など非正常細胞を自ら識別して死滅させる機能を有する。さる１０余年の間に患者の免疫システムを用いた腫瘍免疫治療が絶えず発展されてきており、これを用いた「細胞治療剤（ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）」もまた商業化されている。細胞治療剤は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）、もしくは異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）の細胞を体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において増殖させ、かつ選別する方法を用いて、細胞の生物学的特性を変化させる一連の行為を通じて治療、診断、予防の目的で使用する医薬品であると定義される（韓国の食品医薬安全庁告示第２００３－２６号第２条）。
【0007】
がんのような難治性疾患の治療のための細胞治療剤であって、免疫拒否反応を解消することができ、患者に合わせてカスタマイズされた細胞治療を提供することのできる、ＮＫ細胞を大量で増殖させる方法及び活性が強化されたＮＫ細胞を培養する方法が求められる。
【0008】
しかしながら、このように、がん細胞の殺傷に卓越した作用をするＮＫ細胞は、正常人の場合であっても、抹消血リンパ球の５～１５％のみを占めており、特に、がん患者の場合には、その割合が１％未満に低下するため、免疫療法を通じた別途の増幅過程なしには、がん細胞を効果的に攻撃するのに限界がある。
【0009】
ＮＫ細胞の分化と増殖、生存は、機能的な側面からみて、サイトカインに多大な影響を受け、従来の色々な研究によれば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８などのサイトカインが細胞の毒性及び活性化を増加させると言われている。現在、免疫細胞、特に、ＮＫ細胞を活性化させ、かつ増殖させるに当たって、ＩＬ－２などのサイトカインとＣＤ３などの抗体が用いられる。現行の技術は、免疫細胞の増殖において非常に重要な役割を果たすのがＣＤ３抗体であるが、問題は、この抗体を用いて免疫細胞を活性化させることが非常に煩雑であるということである。
【0010】
特に、最初からＣＤ３抗体の強い刺激が加えられると、未成熟前駆細胞はＴ細胞として成熟されることになるため、一般的に行われている現行の方法としては、最初にＣＤ３抗体を僅かに刺激する方法を用いるが、個人差など周辺環境の多くの要件に左右されて活性化済みの大量で増殖したＮＫ細胞を得る上で難点がある。
【0011】
したがって、現行の方法において、必ずフラスコにＣＤ３抗体を固定した後、一定の時間の間に反応させることを余儀なくされるという煩雑さを除去しながらも、ＮＫ細胞を安定的に増幅させて大量で増殖させることのできる新規な培養培地組成物及び培養方法に関する開発や取り組みへのニーズが取り上げられているのが現状である。
【0012】
このため、本発明者らは、サイトカインを用いたＮＫ細胞の大量増殖培養方法について悩んでいた中、ヒトの抹消血液に由来した免疫細胞であるリンパ球を分離、培養し、抗ＣＤ３抗体ではなく、抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされた培養器において様々なサイトカイン、特に、ＩＬ－２とＩＬ－１５を一緒に処理したとき、ＮＫ細胞が大量増殖し、かつ、活性化されるという知見を得ることにより、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明の目的は、サイトカインを用いたＮＫ細胞の大量増殖培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
上記の目的を達成するために、本発明は、１）フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）と遠心分離を用いて、血液から免疫細胞を含有している末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）のペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を分離するステップと、２）前記分離されたＰＢＭＣを、抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされた培養器を用いて、ＲＰＭＩ培養培地、血漿、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、抗ＣＤ５６、抗ＮＫｐ４６及び抗ＮＫｐ３０を含有している培地において培養するステップと、３）前記培養されたＰＢＭＣをＲＰＭＩ培地、アルブミン、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、抗ＣＤ５６、抗ＮＫｐ４６、抗ＮＫｐ３０において継代培養するステップと、４）前記継代培養されたＰＢＭＣをＲＰＭＩ及びアルブミン、抗ＮＫｐ３０、抗ＮＫｐ４６、抗ＣＤ５６抗体の添加を基本とした培地組成物に添加し、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２＋ＩＬ－１５からなるサイトカイン群から選ばれたサイトカインを処理することにより、ＮＫ細胞を活性化させるステップと、を含む、ＮＫ細胞の培養方法を提供する。
【0015】
以下、本発明について詳しく説明する。
【0016】
ＮＫ細胞は、リンパ球の一種である大顆粒状リンパ球（Ｌａｒｇｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ＬＧＬ）であって、感染されたウィルス及び腫瘍細胞を殺す能力が抜群であり、ほとんどの正常細胞は殺さないという特性を有する。したがって、ＮＫ細胞は、活性細胞毒性Ｔリンパ球が大量で生成される前に、ウィルス感染もしくは腫瘍形成の初期段階において重要な役割を果たす。例えば、ＮＫ細胞が標的細胞と接触する場合、いくつかの分子は、標的細胞の膜に穴を形成して細胞を溶解させ、他の分子は、標的細胞に入っていって核ＤＮＡの分節を増加させて、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）、細胞死滅（Ａｐｏｔｏｓｉｓ）またはプログラム細胞死（ＰＣＤ：Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ）を引き起こす。
【0017】
そのため、ＮＫ細胞は、特定のウィルスに感染された細胞とがん細胞を先刺激なしに溶解させることができる。ＴＣＲの発現を通じて抗原－特異的に認識する細胞毒性Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は、抗原－特異的収容体が欠如している。
【0018】
ＮＫ細胞は、正常細胞のＭＨＣ類型Ｉと結合するキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＩＲ）を発現させる。キラー細胞免疫グロブリン様受容体は、ＭＨＣ類型Ｉと結合すれば、特定の転写因子の抑制を誘導する細胞内信号が生成される。この結果、ＮＫ細胞の活性化、標的細胞の分解及び破壊が抑制される。ウィルス感染細胞またはがん細胞は、それらの表面にＭＨＣ類型Ｉ分子が大幅に減少されている。したがって、このような細胞がＮＫ細胞に出会うと、効果的にキラー細胞免疫グロブリン様受容体と結合することができないため、ＮＫ細胞－媒介の細胞の毒性に露出されて溶解される。
【0019】
前記ＮＫ細胞は、例えば、哺乳動物、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウスまたは兎などに由来したものであってもよい。前記ＮＫ細胞は、正常人またはがん患者から得たものであってもよい。前記ＮＫ細胞は、血液、抹消血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）から分離されたものであってもよい。血液を分離する方法、これからＰＢＭＣを分離する方法、これからＮＫ細胞を分離する方法は、公知の方法により行われるものであってもよい。
【0020】
本発明のＮＫ細胞の培養方法において、前記４）ステップのサイトカインとしては、ＩＬ－２＋ＩＬ－１５を処理することが好ましく、このとき、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌとＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌを処理することがさらに好ましい。
【0021】
また、本発明のＮＫ細胞の培養方法において、前記１）ステップの免疫細胞の分離に際して、免疫細胞のペレット（ｐｅｌｌｅｔ）にＲＢＣ（赤血球）分解用緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を処理することにより、赤血球を除去することが好ましく、前記２）ステップの培養は、細胞数が３×１０７以下である場合に抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたＴ２５フラスコにおいて、細胞数が３×１０７以上である場合に抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたＴ７５フラスコにおいて、ＲＰＭＩ ８ｍｌ、血漿２ｍｌ、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌ、抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌを入れ、ＰＢＭＣペレットをＲＰＭＩ １０ｍｌに浮遊させてさらに入れた後、３７℃、５％ ＣＯ２培養器において３～４日間培養することが好ましい。
【0022】
また、本発明のＮＫ細胞の培養方法において、前記３）ステップの継代培養は、２）ステップの細胞培養懸濁液２０ｍｌ、ＲＰＭＩ ７２ｍｌ、アルブミン８ｍｌ、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌを入れ、３７℃、５％ ＣＯ２培養器において３～５日間１次継代培養を行い、１次継代培養懸濁液５０ｍｌ、ＲＰＭＩ １８０ｍｌ、アルブミン２０ｍｌ、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌを入れ、３７℃、５％ ＣＯ２培養器において５～７日間２次継代培養を行うことが好ましい。
【発明の効果】
【0023】
以上述べたように、本発明は、様々なサイトカインのうち、ＩＬ－２、ＩＬ－１５を用いてＮＫ細胞に処理したとき、効果的に細胞を活性化できる最適な組み合わせとしてのＩＬ－２＋ＩＬ－１５を処理したときに、ＮＫ細胞を大量培養することが可能であり、特に、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌとＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌを処理したときに最も効果的である。これを用いる場合、がん細胞の細胞死滅または殺傷能が促されることができて、がんの予防または治療に効く免疫細胞治療剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】実施例１に従い分離された免疫細胞ＰＢＭＣの３種類の試料別のＣＤ３、ＣＤ５６抗体に応じた分布度（ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞の分布）に沿ったフローサイトメトリーの結果を示すものである。図１のグラフのＸ軸は、ＣＤ３（Ｔリンパ球標識子）を標識するものであり、Ｙ軸は、ＣＤ５６（ＮＫリンパ球標識子）を標識するものである。
【図2】ＮＫ細胞へのＩＬ－２及びＩＬ－１５サイトカインの処理濃度に応じたＩＦＮ－γの分泌量を測定したグラフである。
【図4】条件別の抗体及びＩＬ－２及びＩＬ－１５サイトカイン処理に伴う免疫細胞分布を測定したグラフである。
【図5】条件別の抗体及びＩＬ－２及びＩＬ－１５サイトカイン処理に伴う免疫細胞の総細胞数と細胞の生存率を示すグラフである。
【図6】設定された条件でＮＫ細胞を１４日間培養した後に測定した細胞数を示すグラフである。
【図7】設定された条件でのＮＫ細胞の大量培養の組成に応じた蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）解析試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより詳しく説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例により何ら制限されないということは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【0026】
＜実施例１＞血液からの免疫細胞の分離
【0027】
血液から免疫細胞を分離するために、まず、フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）（ＧＥヘルスケア社製）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＷＥＬＧＥＮＥ社製）、ろ過チューブ（ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅ）（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）（２本）、５０ｍｌチューブ（ＶＷＲ社製）（４本）、ＥＤＴＡチューブ（ＢＤバイオサイエンス社製）、血球計算器（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＭＡＲＩＥＮＦＥＬＤ（マリエンフェルド）社製）を準備した。
【0028】
滅菌されたエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）チューブに採取された５０～１００ｍｌの血液を製造室に運び、前記血液を５０ｍｌチューブに分けて入れた。ろ過チューブ２本にフィコール（ｆｉｃｏｌｌ）１５ｍｌずつを入れ、２０００ｒｐｍにて１分間遠心分離して準備された前記フィコールが含有されているろ過チューブに前記血液を分けて入れた。これを２５００ｒｐｍにて２５分間遠心分離した。ここで、末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）層のみを分離して新たな５０ｍｌチューブに集め、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて体積を５０ｍｌに合わせた後、２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。もし、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）にＲＢＣ（赤血球）が多い場合、ＲＢＣ分解用緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いた。
【0029】
遠心分離後に前記上澄み液を除去した後、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ： Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培養培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標））１０ｍｌにてペレットを解離させた後、懸濁液を適量採取して細胞数の計数に用い、残りは、ＲＰＭＩ培養培地にて体積を５０ｍｌに合わせた後、２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。
【0030】
このとき、ＲＢＣ分解用緩衝液の使用は、次の通りである。
【0031】
１×１０８～２×１０８の細胞当たりにＲＢＣ分解用緩衝液１ｍｌを入れた。１分間タッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）した。ここにＲＰＭＩ培養培地１５～２０ｍｌを入れた後、１５００ｒｐｍ（２５０～５００×Ｇ）にて７分間遠心分離した。もし、ＲＢＣの除去がさらに必要である場合、上記の過程を２～３回繰り返し行った。
【0032】
＜実施例２＞試料抹消血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）免疫細胞の分布
【0033】
前記実施例１に記載されたように、抹消血液４０～６０ｃｃをフィコールが入れられているろ過チューブ２本に分けて分注した後、２５００ｒｐｍにて２５分間遠心分離した。層分離された抹消血液から抹消血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）層のみを分離して新たな５０ｍｌチューブに集め、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄した後、上澄み液を捨て、得られた細胞に蛍光物質を含む抗体（ＣＤ５６－ＰＥ、ＣＤ３－ＢＶ４２１）を反応させた後、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて解析した。抗体に応じた免疫細胞の分布結果を下記の表１と図１に示す。
【0034】
【表1】
【0035】
上記の表１と図１に記載されたように、全体的に血液から分離された抹消血単核球（ＰＢＭＣ）免疫細胞は、ＮＫ細胞５～６％、ＮＫＴ細胞２～７％、Ｔ細胞６０～８０％の分布を示しているということを確認することができた。
【0036】
＜実施例３＞ＩＬ－２及びＩＬ－１５サイトカインの濃度の設定のためのＮＫ活性度の測定試験（ＩＦＮ－γの測定）
【0037】
予備実験にてＩＬ－２及びＩＬ－１５サイトカインの効果と濃度を設定するために、前記実施例１による抹消血液から得られた単核球に、抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたフラスコにＲＰＭＩ １８ｍｌ、血漿２ｍｌ、抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌを入れた培地において、ＩＬ－２及びＩＬ－１５サイトカインのそれぞれの濃度を処理して７日間培養した後、細胞をすべて回収した。収集された細胞を２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して上澄み液１ｍｌを新たなチューブに移し替えた後、細胞の活性度を測定した。細胞の活性度の測定は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＦＮ－γの分泌量にて確認することにより行った。
【0038】
ＮＫ細胞にＩＬ－２及びＩＬ－１５の処理濃度に応じたＩＦＮ－γの分泌量を図２に、前記図２によるＩＬ－２及びＩＬ－１５の最適な濃度を設定し、前記設定した濃度を処理した後のＩＦＮ－γの分泌量に応じた活性度を図３に記載した。
【0039】
具体的に、図２から明らかなように、ＩＬ－２の場合には、濃度を５、１０、１５、２０、４０（ｎｇ／ｍｌ）にして処理したとき、次第にＩＦＮ－γの分泌量が増えていて、２０ｎｇ／ｍｌにおいて最高の濃度を示し、４０ｎｇ／ｍｌにおいてはそれ以上増加しなかった。一方、ＩＬ－１５の場合には、１０、３０、５０、１００（ｎｇ／ｍｌ）の濃度を比較したとき、ＩＦＮ－γの分泌量は、５０ｎｇ／ｍｌにおいて最高の濃度を示し、１００ｎｇ／ｍｌにおいてそれ以上増加しなかった。２種類の実験の結果、ＩＬ－２は２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５は５０ｎｇ／ｍｌにおいて細胞の活性度が最も効果的になる濃度であるということを確認した。
【0040】
図３から、ＩＬ－２及びＩＬ－１５をそれぞれ処理した細胞のＩＦＮ－γの分泌量よりも、ＩＬ－２＋ＩＬ－１５を一緒に処理して培養された細胞のＩＦＮ－γの分泌量の方が確然として増えて細胞の活性度が増加したことを確認した。
【0041】
＜実施例４＞ＩＬ－２及びＩＬ－１５処理による免疫細胞の分布及び細胞の生存率、並びに細胞数の測定
【0042】
ＮＫ細胞の大量培養をするための予備実験にて、抗体及びＩＬ－２及びＩＬ－１５のそれぞれの条件でＮＫ細胞の割合及び細胞の生存率または細胞数の効果を得るために、前記実施例１による抹消血液から得られた単核球に、抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたフラスコにＲＰＭＩ １８ｍｌ、血漿２ｍｌを入れた状態で、それぞれの条件を処理して７日間培養した後、細胞をすべて回収してＮＫ細胞の表面抗原を分析した。抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたフラスコにＲＰＭＩ １８ｍｌ、血漿２ｍｌを基本として入れた状態で、抗体（抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ）のみを添加した群、抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたフラスコにＲＰＭＩ １８ｍｌ、血漿２ｍｌを基本として入れた状態で、ＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）サイトカインのみを添加した群、抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたフラスコにＲＰＭＩ １８ｍｌ、血漿２ｍｌを基本として入れた状態で、抗体（抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）のみを添加した群、抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたフラスコにＲＰＭＩ １８ｍｌ、血漿２ｍｌを基本として入れた状態で、抗体（抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）のみを添加した群、抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたフラスコにＲＰＭＩ １８ｍｌ、血漿２ｍｌを基本として入れた状態で、抗体（抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した群に分けてそれぞれ処理して７日間培養し、２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、得られた細胞に蛍光物質を含む抗体（ＣＤ５６－ＰＥ、ＣＤ３－ＢＶ４２１）を反応させた後、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて解析した。細胞数の測定は、遠心分離して得られた細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浮遊させた後、１０μｌを取ってトリパンブルー１０μｌと混ぜた後、血球計算器（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて行った。抗体に応じた免疫細胞の分布結果を下記の表２と図４に示し、総細胞数と細胞の生存率は図５に記載した。
【0043】
【表2】
【0044】
上記の表２と図４に記載されたように、抗体のみを処理した試料よりも、ＩＬ－２＋ＩＬ－１５サイトカインを処理した混合物の方においてＮＫ細胞の割合がさらに増加したものの、抗体＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５を組み合わせた混合物を処理したとき、ＮＫ及びＮＫＴ細胞を増加させる上で有効であるということを確認した。なお、図５でのように、抗体＋ＩＬ－２＋ＩＬ－１５の混合物が他の比較群よりも２～４倍ほど高い増殖効果を示しており、生存率もまた高く保持されるということを確認した。
【0045】
＜実施例５＞設定された濃度でのＮＫ免疫細胞の大量培養方法
【0046】
＜５－１＞抗ＣＤ１６コーティング
【0047】
Ｔ７５フラスコにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌと抗ＣＤ１６ ５ｎｇ／ｍｌを混合し、常温で６時間放置した後、冷蔵において一晩中（２４時間）保管することにより、抗ＣＤ１６をコーティングした。前記コーティングされたフラスコは、一週間以内に使用しなければならず、使用する前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて一回洗浄した後に使用した。コーティングされているため、底面が乾かないようにしなければならず、フラスコの底面に直接的にピペッティングしないように注意を払った。
【0048】
＜５－２＞免疫細胞の培養
【0049】
まず、前記実施例５－１において準備した、抗ＣＤ１６によりコーティングされたＴ７５フラスコの他に、ＲＰＭＩ培地、血漿、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、抗ＣＤ５６、抗ＮＫｐ４６、抗ＮＫｐ３０を準備した。
【0050】
細胞懸濁液の細胞数が３×１０７以下である場合に抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたＴ２５フラスコにおいて、３×１０７以上である場合には抗ＣＤ１６抗体によりコーティングされたＴ７５フラスコにおいて細胞を培養した。具体的に、コーティングされたＴ７５フラスコにＲＰＭＩ ８ｍｌ、血漿２ｍｌ、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌ、抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌを入れ、実施例１の方法と同様にして得られた細胞を、上澄み液を除去し、ＲＰＭＩ １０ｍｌにてピペッティングした後、前記フラスコに入れた。３７℃、５％ ＣＯ２培養器において細胞の状態に合うように３～４日間培養した。
【0051】
＜５－３＞継代培養
【0052】
継代培養のために、Ｔ１７５またはＴ２２５フラスコ、ＲＰＭＩ培地、アルブミン、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、抗ＣＤ５６、抗ＮＫｐ４６、抗ＮＫｐ３０を準備した。
【0053】
＜５－３－１＞１次継代培養（Ｔ７５フラスコからＴ１７５フラスコへの植え継ぎ（継代培養））
【0054】
前記実施例５－２のＴ７５フラスコにおいて培養された免疫細胞をＴ１７５フラスコにおいて継代培養した。具体的に、Ｔ７５フラスコをスクレーパー（ｓｃｒａｐｅｒ）にて掻いて底面に付いている細胞を剥がし、ピペッティングして固まった細胞を解離させた。このようにして準備した細胞懸濁液２０ｍｌを、新たなＴ１７５フラスコに入れ、ＲＰＭＩ ７２ｍｌ、アルブミン８ｍｌ、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌを入れ、培養培地と混ぜた後、３７℃、５％ ＣＯ２培養器において細胞の状態に合うように３～５日間培養した。
【0055】
＜５－３－２＞２次継代培養（Ｔ１７５フラスコからＴ２２５フラスコ２個への植え継ぎ（継代培養））
【0056】
Ｔ１７５フラスコからＴ２２５フラスコ２個への植え継ぎ（継代培養）を行った。具体的に、Ｔ１７５フラスコをスクレーパーにて掻いて底面に付いている細胞を剥がし、ピペッティングして固まった細胞を解離させた。このようにして準備した細胞懸濁液１００ｍｌをそれぞれ５０ｍｌずつ、新たなＴ２２５フラスコ２個に入れ、それぞれＲＰＭＩ １８０ｍｌ、アルブミン２０ｍｌ、ＩＬ－２ ２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ ５０ｎｇ／ｍｌを入れ、前記培養培地と混ぜた後、３７℃、５％ ＣＯ２培養器において細胞の状態に合うように５～７日間培養した。このとき、細胞の状態に合うように培地を追加してＴ２２５フラスコ１個当たりに最終的に４００ｍｌを超えないように注意を払った。
【0057】
＜実施例６＞設定された濃度でＮＫ細胞を１４日間培養した後の細胞数の測定試験
【0058】
大量増殖のために設定された組成が、１４日間の培養にも拘わらず、ＮＫ細胞の大量増殖及び分布の増加が可能であるか否かを調べてみた。具体的に、実施例１の方法により分離されたリンパ球細胞５×１０７ ｃｅｌｌをそれぞれ試料の培養培地に添加し、設定された組成であるＲＰＭＩ＋アルブミン＋抗体（抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）をさらに処理して１４日間培養した。また、対照群としては、ＲＰＭＩ＋アルブミン＋ＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）サイトカインのみを処理した群、ＲＰＭＩ＋アルブミン＋抗体（抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ）のみを添加した群に分けた。なお、細胞数に応じて継代培養して培養培地を添加して１４日間培養した。細胞数の測定のために日付け毎に培養した細胞を回収した後、浮遊させた細胞から１０μｌを取ってトリパンブルー１０μｌと混ぜた後、血球計算器にて測定した。その結果を図６に記載した。図６に記載されたように、造成された培養培地において１４日間培養したときに、２×１０９ ｃｅｌｌ以上の細胞増殖結果を示した。
【0059】
＜実施例７＞設定された濃度でのＮＫ細胞の大量培養の組成に応じたＦＡＣＳ解析試験
【0060】
前記実施例５－３－２に従い培養されたリンパ球免疫細胞分布（蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ））実験は、ＲＰＭＩ＋アルブミン＋抗体（抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）を処理して１４日間培養し、対照群として行った実験は、ＲＰＭＩ＋アルブミン＋ＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）サイトカインのみを処理した群、ＲＰＭＩ＋アルブミン＋抗体（抗ＣＤ５６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ４６ ５ｎｇ／ｍｌ、抗ＮＫｐ３０ ５ｎｇ／ｍｌ）のみを処理した群をそれぞれ細胞数に応じて継代培養により１４日間培養して比較した。２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、得られた細胞に蛍光物質を含む抗体（ＣＤ５６－ＰＥ、ＣＤ３－ＢＶ４２１）を反応させた後、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて分析した。その結果を下記の表３及び図７に記載した。
【0061】
【表3】
【0062】
上記の表３及び図７に記載されたように、大量増殖のために設定された組成が、１４日間の大量培養後にもＮＫ及びＮＫＴ細胞が８５％、Ｔ細胞が８．５％という組成となって、ＮＫ細胞の割合が他の対照群に比べて確然として増えるという結果を確認することができた。
【0063】
以上、本発明について、好適な実施形態を挙げて詳しく説明したが、本発明は、上記の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の技術思想の範囲内において当分野において通常の知識を有する者により色々な変形が可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】