特表 2024-502036 操作されたＴ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-01-17

(54)【発明の名称】操作されたＴ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/23 20060101AFI20240110BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240110BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240110BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240110BHJP

【ＦＩ】

C12N15/23 ZNA

C12N15/11 Z

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N5/10

A61K35/17

A61P37/06

A61P37/02

A61P1/04

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P17/06

A61P25/00

A61P3/10

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023539978

(86)(22)【出願日】2021-12-29

(85)【翻訳文提出日】2023-08-15

(86)【国際出願番号】 US2021065524

(87)【国際公開番号】W WO2022147133

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】63/131,987

(32)【優先日】2020-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518196169

【氏名又は名称】インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100131990

【弁理士】

【氏名又は名称】大野 玲恵

(72)【発明者】

【氏名】ルドゥリエ，クリストファー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA68

4C087ZA89

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB09

4C087ZB15

4C087ZC35

(57)【要約】

本開示は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）、及び調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）の挿入を含むように操作されたＴ細胞、ならびにその組成物及び使用に関する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作されたＴ細胞であって、
ｉ）プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種核酸と、
ｉｉ）インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮＧ）をコードする内在性核酸配列の修飾であって、前記ＩＦＮＧの発現をノックダウンする、前記修飾と、
ｉｉｉ）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦＡ）をコードする内在性核酸配列の修飾であって、前記ＴＮＦＡの発現をノックダウンする、前記修飾とを含む、前記操作されたＴ細胞。

【請求項2】

前記調節性Ｔ細胞促進分子が、インターロイキン－１０（ＩＬ１０）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドラーゼ１（ＥＮＴＰＤ１）、５’－ヌクレオチダーゼエクト（ＮＴ５Ｅ）、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、インターロイキン－３５（ＩＬ３５）、ＧＡＲＰ、ＣＤ２７４分子（ＣＤ２７４）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）、ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー２（ＩＫＺＦ２）、家族性好酸球増加症（ＥＯＳ）、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１）、ならびにＢＴＢドメイン及びＣＮＣホモログ２（ＢＡＣＨ２）から選択される、請求項１に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項3】

前記調節性Ｔ細胞促進分子がＩＬ１０である、請求項１または２に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項4】

前記調節性Ｔ細胞促進分子がＣＴＬＡ４である、請求項１～２に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項5】

前記調節性Ｔ細胞促進分子が第１の調節性Ｔ細胞促進分子であり、プロモーター配列の制御下にある第２の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種核酸をさらに含む、請求項１～４のいずれかに記載の操作されたＴ細胞。

【請求項6】

前記第１及び前記第２の調節性Ｔ細胞促進分子がＩＬ１０及びＣＴＬＡ４である、請求項５に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項7】

インターロイキン１７Ａ（ＩＬ１７Ａ）、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン６（ＩＬ６）、パーフォリン１（ＰＲＦ１）、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）、またはグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）をコードする内在性核酸配列の修飾をさらに含み、前記修飾が、それぞれ前記ＩＬ１７Ａ、前記ＩＬ２、前記ＩＬ６、前記ＰＲＦ１、前記ＧＺＭＡ、または前記ＧＺＭＢの発現をノックダウンする、請求項１～６のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項8】

内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内在性核酸配列の修飾をさらに含み、前記修飾が前記内在性ＴＣＲの発現をノックダウンする、請求項１～７のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項9】

プロモーター配列の制御下にある標的化受容体のための異種コード配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項10】

前記標的化受容体が、粘膜血管アドレシン細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ１）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦＡ）、ＣＥＡ細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）、シトルリン化ビメンチン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）、プロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）、ＣＤ１９分子（ＣＤ１９）、ＣＤ２０分子（ＣＤ２０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ジペプチジルペプチダーゼ様６（ＤＰＰ６）、溶質輸送体ファミリー２メンバー２（ＳＣＬ２Ａ２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ２）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、及びＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）から選択されるリガンドに対し標的化される、請求項９に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項11】

前記標的化受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項９または１０に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項12】

前記標的化受容体をコードする前記異種核酸が、発現コンストラクトに組み込まれている、請求項９～１１のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項13】

標的化受容体をコードする前記異種核酸が、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする核酸を含まない発現コンストラクト内にある、請求項９～１２のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項14】

前記第１の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸が発現コンストラクトに組み込まれ、前記第２の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸が発現コンストラクトに組み込まれている、請求項５～１３のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項15】

前記第１の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸及び前記第２の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸が、別々の発現コンストラクトに組み込まれている、請求項５～１４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項16】

前記第１の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸及び前記第２の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸が、単一の発現コンストラクトに組み込まれている、請求項１３または１４に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項17】

前記発現コンストラクトが、標的化受容体をコードする核酸をさらに含む、請求項１２または１４～１６に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項18】

少なくとも１つの異種コード配列が、エピソーム発現コンストラクト内にある、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項19】

少なくとも１つの異種コード配列が、ゲノム内に挿入されている、請求項１～１７のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項20】

前記ゲノムへの前記挿入が非標的挿入である、請求項１９に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項21】

前記挿入が標的挿入である、請求項１９に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項22】

前記標的挿入が、ＴＣＲ遺伝子座位、ＴＮＦ遺伝子座位、ＩＦＮＧ遺伝子座位、ＩＬ１７Ａ遺伝子座位、ＩＬ６遺伝子座位、ＩＬ２遺伝子座位、アデノ随伴ウイルス統合部位１（ＡＡＶＳ１）座位から選択される部位内への挿入である、請求項２１に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項23】

前記ＴＣＲ遺伝子座位がＴ細胞受容体アルファコンスタント（ＴＲＡＣ）座位である、請求項２２に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項24】

遺伝子の発現をノックダウンする前記修飾が、挿入、欠失、または置換のうちの１つ以上を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項25】

請求項１～２４のいずれかに記載の操作されたＴ細胞を含む、細胞の集団。

【請求項26】

前記集団の細胞の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％が、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種核酸配列を含み、
前記集団の細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％が、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾を含み、
前記集団の細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％が、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項27】

挿入または修飾を含む細胞のパーセントが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によるリードのパーセントによって決定される、請求項２６に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項28】

前記調節性Ｔ細胞促進分子が、インターロイキン－１０（ＩＬ１０）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドラーゼ１（ＥＮＴＰＤ１）、５’－ヌクレオチダーゼエクト（ＮＴ５Ｅ）、インターロイキン－２２（ＩＬ２２）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）、ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー２（ＩＫＺＦ２）、家族性好酸球増加症（ＥＯＳ）、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１）、ならびにＢＴＢドメイン及びＣＮＣホモログ２（ＢＡＣＨ２）から選択される、請求項２６または２７に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項29】

前記調節性Ｔ細胞促進分子がＩＬ１０である、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項30】

前記調節性Ｔ細胞促進分子がＣＴＬＡ４である、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項31】

前記調節性Ｔ細胞促進分子が第１の調節性Ｔ細胞促進分子であり、プロモーター配列の制御下にある第２の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種核酸をさらに含む、請求項２６～３０のいずれかに記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項32】

前記第１及び前記第２の調節性Ｔ細胞促進分子がＩＬ１０及びＣＴＬＡ４である、請求項３１に記載の操作されたＴ細胞。

【請求項33】

インターロイキン１７Ａ（ＩＬ１７Ａ）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン２（ＩＬ２）、パーフォリン１（ＰＲＦ１）、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）、またはグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）をコードする少なくとも１つの内在性核酸配列の修飾をさらに含み、前記細胞の集団が、前記細胞の集団の少なくとも７０％、好ましくは前記細胞の集団の少なくとも８０％において、それぞれ前記ＩＬ１７Ａ、前記ＩＬ６、前記ＩＬ２、前記ＰＲＦ１、前記ＧＺＭＡ、または前記ＧＺＭＢの少なくとも１つの修飾を含み、前記修飾が、それぞれ前記ＩＬ１７Ａ、前記ＩＬ６、前記ＩＬ２、前記ＰＲＦ１、前記ＧＺＭＡ、または前記ＧＺＭＢの前記少なくとも１つの発現をノックダウンする、請求項２６～３２のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項34】

前記細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％がＴＣＲのノックダウンを含む、請求項２６～３３のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項35】

前記細胞の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％が標的化受容体の核酸コード配列の挿入を含む、請求項２６～３４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項36】

前記標的化受容体が、粘膜血管アドレシン細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ１）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦＡ）、ＣＥＡ細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）、シトルリン化ビメンチン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）、プロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）、ＣＤ１９分子（ＣＤ１９）、ＣＤ２０分子（ＣＤ２０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ジペプチジルペプチダーゼ様６（ＤＰＰ６）、溶質輸送体ファミリー２メンバー２（ＳＣＬ２Ａ２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ２）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、及びＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）から選択されるリガンドに特異的に結合する、請求項３５に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項37】

前記標的化受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項３５または３６に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項38】

前記標的受容体をコードする前記異種核酸が、発現コンストラクトに組み込まれている、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項39】

標的化受容体をコードする前記異種核酸が、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする核酸を含まない発現コンストラクト内にある、請求項３８に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項40】

第１の前記少なくとも１つの調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸が発現コンストラクトに組み込まれ、第２の前記少なくとも１つの調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸が発現コンストラクトに組み込まれている、請求項２６～３９のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項41】

前記第１の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸及び前記第２の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸が、別々の発現コンストラクトに組み込まれている、請求項４０に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項42】

前記第１の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸及び前記第２の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする前記異種核酸が、単一の発現コンストラクトに組み込まれている、請求項４０に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項43】

発現コンストラクトが、標的化受容体をコードする核酸をさらに含む、請求項３８または４０～４２に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項44】

少なくとも１つの異種コード配列が、エピソーム発現コンストラクト内にある、請求項２６～４３のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項45】

少なくとも１つの異種コード配列が、ゲノム内に挿入されている、請求項２６～４４のいずれか１項に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項46】

前記ゲノムへの前記挿入が非標的挿入である、請求項４５に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項47】

前記挿入が標的挿入である、請求項４５に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項48】

前記標的挿入が、ＴＣＲ遺伝子座位、ＴＮＦ遺伝子座位、ＩＬ２遺伝子座位、ＩＬ６遺伝子座位、ＩＬ１７Ａ遺伝子座位、ＩＦＮＧ遺伝子座位、アデノ随伴ウイルス統合部位１（ＡＡＶＳ１）座位から選択される部位内への挿入である、請求項４７に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項49】

前記ＴＣＲ遺伝子座位がＴ細胞受容体アルファコンスタント（ＴＲＡＣ）座位である、請求項４８に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項50】

遺伝子の発現をノックダウンする前記修飾が、挿入、欠失、または置換のうちの１つ以上を含む、請求項２６～４９に記載の操作されたＴ細胞の集団。

【請求項51】

請求項１～２４に記載の操作されたＴ細胞または請求項２５～５０に記載の操作されたＴ細胞の集団のいずれかを含む、医薬組成物。

【請求項52】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の細胞、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の細胞の集団、または請求項５１に記載の医薬組成物を、対象に投与する方法または使用。

【請求項53】

前記対象が免疫抑制を必要とする、請求項５２に記載の方法または使用。

【請求項54】

免疫障害の治療のための、請求項５２または５３に記載の方法または使用。

【請求項55】

自己免疫疾患の治療のための、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の方法または使用。

【請求項56】

前記自己免疫疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、及び１型糖尿病から選択される、請求項５５に記載の方法または使用。

【請求項57】

移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療のための、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の方法または使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、当該配列表の全体が参照により本明細書に援用される。当該ＡＳＣＩＩコピーは２０２１年１２月２８日に作成され、名称は１２７９３＿００３０－００３０４＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは１２０，０６１バイトである。

【0002】

関連出願
本出願は、２０２０年１２月３０日に出願された米国仮出願第６３／１３１，９８７号を参照により本明細書に援用するものであり、その内容全体が、参照により本明細書に明示的に援用される。

【背景技術】

【0003】

適応免疫は、それによって身体が外来性病原体を排除することができる防御機構である。Ｔ細胞は、この免疫応答を媒介可能な免疫細胞である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原を認識可能なＴ細胞の表面にあるタンパク質複合体である。Ｔ細胞の多様性は、ＴＣＲアルファ及びベータ座位の再編成に由来する。

【0004】

適応免疫の特徴の１つは、「自己」及び「非自己」の抗原を区別する能力である。自己免疫及び自己炎症性障害は、「自己」抗原に対する病的な免疫応答を特徴とする。いくつかのＴＣＲアルファ及びベータ座位の再編成は、自己反応性Ｔ細胞を生成する。Ｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｙｍｕｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０３（８）（２０１９）。多くの自己反応性Ｔ細胞は胸腺のクローン欠失によって排除されるが、他の細胞はクローン欠失を免れ、有害な免疫応答を誘発することがある。同上。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と呼ばれる特化型のＴ細胞は、「自己」寛容にとって重要である。同上。Ｔｒｅｇは、（例えば、移植片対宿主病における）過剰な免疫応答、自己免疫応答、及び望ましくない免疫応答を抑制することが可能である。同上。Ｔｒｅｇの調節不全（例えば、Ｔｒｅｇの数が十分でない場合、またはＴｒｅｇが適切に機能していない場合）は、自己免疫応答に寄与し得る。同上。

【0005】

自己免疫障害を治療するための現在の治療法は、適応免疫プロセスまたは免疫細胞の活性化の抑制を目的としている。これらの治療法は、有害な免疫応答（例えば、自己免疫応答）を抑制し得る一方で、有益な免疫応答も抑制することがある。Ｔｒｅｇ療法は、造血幹細胞移植後にドナー細胞が宿主組織への免疫攻撃を媒介する移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を含めて、種々の疾患における抗原特異的免疫応答を抑制するために使用されている。Ｐｉｅｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ２（２０）（２０１７）。しかし、「Ｔｒｅｇベース療法の臨床実施には、まだ大きな課題が存在する」。同上。したがって、免疫応答（複数可）（炎症及び自己免疫を含む）を抑制するための、有効なＴ細胞療法（Ｔｒｅｇ療法を含む）が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種核酸と、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮＧ）をコードする内在性核酸配列の修飾であって、ＩＦＮＧの発現をノックダウンする修飾と、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦＡ）をコードする内在性核酸配列の修飾であって、ＴＮＦＡの発現をノックダウンする修飾とを含むように操作された、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団、ならびにその組成物及び使用を、例えば、炎症及び自己免疫を含めた免疫応答（複数可）を抑制するために、提供する。いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子は、インターロイキン－１０（ＩＬ１０）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドラーゼ１（ＥＮＴＰＤ１）、５’－ヌクレオチダーゼエクト（ＮＴ５Ｅ）、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、インターロイキン－３５（ＩＬ３５）、ＧＡＲＰ、ＣＤ２７４分子（ＣＤ２７４）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）、ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー２（ＩＫＺＦ２）、家族性好酸球増加症（ＥＯＳ）、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１）、ならびにＢＴＢドメイン及びＣＮＣホモログ２（ＢＡＣＨ２）から選択される。

【0007】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、プロモーター配列の制御下にあるＩＬ１０をコードする異種核酸と、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾であって、ＩＦＮＧの発現をノックダウンする修飾と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾であって、ＴＮＦＡの発現をノックダウンする修飾とを含むように操作される。

【0008】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、プロモーター配列の制御下にあるＣＴＬＡ４をコードする異種核酸と、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾であって、ＩＦＮＧの発現をノックダウンする修飾と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾であって、ＴＮＦＡの発現をノックダウンする修飾とを含むように操作される。

【0009】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、各々プロモーター配列の制御下にあるＩＬ１０及びＣＴＬＡ４をコードする異種核酸配列と、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾であって、ＩＦＮＧの発現をノックダウンする修飾と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾であって、ＴＮＦＡの発現をノックダウンする修飾とを含むように操作される。

【0010】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ１７Ａ）、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン６（ＩＬ６）、パーフォリン１（ＰＲＦ１）、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）、またはグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）をコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）を含むようにさらに操作される。

【0011】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）を含むようにさらに操作される。

【0012】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、プロモーター配列の制御下にある標的化受容体のための異種コード配列を含むようにさらに操作される。いくつかの実施形態において、標的化受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。いくつかの実施形態において、標的化受容体は、粘膜血管アドレシン細胞接着分子１（ＭＡＤＣＡＭ１）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦＡ）、ＣＥＡ細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）、シトルリン化ビメンチン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）、プロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）、ＣＤ１９分子（ＣＤ１９）、ＣＤ２０分子（ＣＤ２０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ジペプチジルペプチダーゼ様６（ＤＰＰ６）、溶質輸送体ファミリー２メンバー２（ＳＣＬ２Ａ２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ２）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、及びＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）から選択されるリガンドに対し標的化される。

【0013】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団の少なくとも３０％、３５％、好ましくは少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列の挿入を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、ＩＦＮＧ配列における修飾（例えば、ノックダウン）を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、ＴＮＦＡ配列における修飾（例えば、ノックダウン）を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、ＴＣＲ配列における修飾（例えば、ノックダウン）を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列の挿入を含む。

【0014】

遺伝子の発現をノックダウンするための本明細書に記載の修飾は、挿入、欠失、または置換のうちの１つ以上を含むことができる。本明細書に記載の異種配列は、発現コンストラクト（複数可）に組み込むことができる。複数の異種配列は、１つの発現コンストラクトに組み込んでも、別々の発現コンストラクトに組み込んでもよい。本明細書に記載の異種配列は、エピソーム発現コンストラクト（複数可）に組み込むことができる。本明細書に記載の異種配列は、例えば、標的挿入または非標的挿入として、ゲノムに挿入することができる。いくつかの実施形態において、標的挿入は、ＴＣＲ遺伝子座位、ＴＮＦ遺伝子座位、ＩＦＮＧ遺伝子座位、ＩＬ１７Ａ遺伝子座位、ＩＬ６遺伝子座位、ＩＬ２遺伝子座位、アデノ随伴ウイルス統合部位１（ＡＡＶＳ１）座位から選択される部位内への挿入である。

【0015】

操作されたＴ細胞の医薬組成物及び使用も、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞及びその医薬組成物は、免疫抑制を必要とする対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞及びその医薬組成物は、免疫障害または自己免疫疾患、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療に有用であり得る。

【0016】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の配列（複数可）の挿入または配列（複数可）の修飾（例えば、ノックダウン）は、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）と組み合わせたガイドＲＮＡによって媒介することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の配列（複数可）の挿入または配列（複数可）のノックダウンは、別の好適な遺伝子編集システム（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム）によって媒介することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1A】非形質導入の、もしくは示されたコード配列の挿入で形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、またはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入Ｔ細胞または示された対照におけるＣＴＬＡ発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図1B】非形質導入の、もしくは示されたコード配列の挿入で形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、またはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入Ｔ細胞または示された対照におけるＩＬ１０発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図1C】非形質導入の、もしくは示されたコード配列の挿入で形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、またはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入されたＴ細胞または示された対照におけるＦｏｘｐ３発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図1D】非形質導入の、もしくは示されたコード配列の挿入で形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、またはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入Ｔ細胞または示された対照におけるＨｅｌｉｏｓ発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図1E】非形質導入の、もしくは示されたコード配列の挿入で形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、またはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入Ｔ細胞または示された対照におけるＥｏｓ発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図2】ＧｖＨＤのマウスモデルからの結果を示すグラフである。Ａは、示されたコード配列もしくは示された対照の挿入により形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ、ＰＢＭＣを注射した後、または細胞を注射しなかった場合（照射のみ）の生存日数を示す生存曲線である。Ｂは、示されているような形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞または対照を注射した後、屠殺時にマウスの脾臓から単離したヒトリンパ球の定量化を示すグラフである。

【図3A】示されたコード配列または示された対照の挿入で形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞または示された対照によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ６産生を示している。

【図3B】示されたコード配列または示された対照の挿入で形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞または示された対照によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＮＦ－アルファ産生を示している。

【図3C】示されたコード配列または示された対照の挿入で形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞または示された対照によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ１０産生を示している。

【図3D】示されたコード配列または示された対照の挿入で形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞または示された対照によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ１３産生を示している。

【図3E】示されたコード配列または示された対照の挿入で形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞または示された対照によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ２産生を示している。

【図3F】示されたコード配列または示された対照の挿入で形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞または示された対照によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ－ガンマ産生を示している。

【図4】ＣＴＶ標識Ｔ細胞及びＣＤ－３枯渇ＰＢＭＣを、示されたコード配列または示された対照の示された比率の挿入により形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞と混合した混合リンパ球反応アッセイにおいて、ＣＴＶ希釈により測定した、形質導入Ｔ細胞による細胞増殖のパーセント抑制を示すグラフである。

【図5A】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）で、またはＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの一方もしくは両方のノックアウト（ＫＯ）と組み合わせて形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入Ｔ細胞または示された対照におけるＣＴＬＡ４発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図5B】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）で、またはＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの一方もしくは両方のノックアウト（ＫＯ）と組み合わせて形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入Ｔ細胞または示された対照におけるＩＬ１０発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図5C】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）で、またはＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの一方もしくは両方のノックアウト（ＫＯ）と組み合わせて形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入Ｔ細胞または示された対照におけるＦＯＸＰ３発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図5D】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）で、またはＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの一方もしくは両方のノックアウト（ＫＯ）と組み合わせて形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入Ｔ細胞または示された対照におけるＨｅｌｉｏｓ発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図5E】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）で、またはＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの一方もしくは両方のノックアウト（ＫＯ）と組み合わせて形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇの蛍光染色の強度を示すフローサイトメトリーデータのヒストグラムである。形質導入Ｔ細胞または示された対照におけるＥｏｓ発現の蛍光強度のヒストグラムである。

【図6A】ＧｖＨＤのマウスモデルからの結果を示すグラフである。マウスにＰＢＭＣ、非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）による、またはＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの一方もしくは両方の編集（ＫＯ）と組み合わせて形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇを注射した後、あるいは細胞を注射しなかった（照射のみ）後の生存日数を示す生存曲線である。

【図6B】ＧｖＨＤのマウスモデルからの結果を示すグラフである。示されているような形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞または対照細胞を注射した後、屠殺時のマウスの脾臓から単離したヒトリンパ球の定量化を示すグラフである。

【図7A】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）またはＩＦＮＧもしくはＴＮＦＡの一方もしくは両方の編集（ＫＯ）と組み合わせて形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞または示された対照によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ６産生を示している。

【図7B】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）またはＩＦＮＧもしくはＴＮＦＡの一方もしくは両方の編集（ＫＯ）と組み合わせて形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ｎＴｒｅｇにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞または示された対照によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＮＦ－アルファ産生を示している。

【図7C】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）またはＩＦＮＧもしくはＴＮＦＡの一方もしくは両方の編集（ＫＯ）と組み合わせて形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ｎＴｒｅｇにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ１０産生を示す。

【図7D】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）またはＩＦＮＧもしくはＴＮＦＡの一方もしくは両方の編集（ＫＯ）と組み合わせて形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ｎＴｒｅｇにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ１３産生を示す。

【図7E】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）またはＩＦＮＧもしくはＴＮＦＡの一方もしくは両方の編集（ＫＯ）と組み合わせて形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ｎＴｒｅｇにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の形質導入Ｔ細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ２産生を示す。

【図7F】非形質導入の、あるいはＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列の挿入のみ（編集なし）またはＩＦＮＧもしくはＴＮＦＡの一方もしくは両方の編集（ＫＯ）と組み合わせて形質導入した刺激ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、あるいはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ｎＴｒｅｇにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインプロファイル解析の結果を示すグラフである。細胞刺激を行った際の操作された細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＦＮ－ガンマ産生を示す。

【図8】ＣＴＶ標識Ｔ細胞及びＣＤ－３枯渇ＰＢＭＣを、示されたコード配列または示された対照を示された比率で挿入することにより形質導入されたＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞と混合した混合リンパ球反応アッセイにおいて、ＣＴＶ希釈により測定された、操作されたＴ細胞による細胞増殖の抑制パーセントを示すグラフである。

【図9】ＧｖＨＤのマウスモデルからの結果を示すグラフである。Ａは、マウスに、ＰＢＭＣ、非形質導入の、あるいは示されているように、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡ両方の編集（ＫＯ）と組み合わせて、ＩＬ１０及びＣＴＬＡ４のコード配列（野生型（ｗｔ）または高親和性（ＨＡ））の挿入で形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｎＴｒｅｇを注射した後、あるいは細胞を注射しなかった（ビヒクル）後の生存日数を示す生存曲線である。Ｂは、示されているような形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞または対照細胞を注射した後、屠殺時にマウスの脾臓から単離したヒトリンパ球の定量化を示すグラフである。

【図10】混合リンパ球アッセイにおいてＣＴＶ希釈により測定された増殖抑制パーセントを示すグラフである。Ａは、炎症性プレコンディショニングのありまたはなしでの増殖の抑制を示している。Ｂは、さらに示されている炎症性サイトカインの存在下における、炎症性プレコンディショニングのありまたはなしでの増殖の抑制を示している。示されているそれぞれのｐ値は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

ここで、本発明のある特定の実施形態について詳細に説明する。その例は添付の図面に示す。本発明を示された実施形態と併せて説明するが、これらの実施形態が、本発明をこれらの実施形態に限定するように意図されていないことは理解されよう。そうではなく、本発明は、添付の実施形態によって定義されるような本発明内に含まれ得る全ての代替形態、変更形態、及び等価物を網羅するように意図されている。

【0019】

本明細書で使用される節の見出しは、編成上の目的にとどまるものであり、いかなる形でも所望の主題を限定するものと解釈すべきではない。参照により援用される任意の資料が、本明細書で定義される任意の用語または本明細書の任意の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先される。

【0020】

Ｉ．定義
本発明の教示を詳細に説明する前に、本開示が、特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、そのため変動し得ることを理解されたい。本明細書及び添付の実施形態で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容による別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「（１つの）結合体」に言及された場合は複数の結合体を含み、「（１つの）細胞」に言及された場合は複数の細胞または細胞集団を含む、などとなる。本明細書で使用する場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語及びその文法的変形は、非限定的であるように意図されており、リスト内の項目の列挙は、挙げられた項目に対し置き換えまたは追加され得る他の同様の項目を除外するものではない。

【0021】

数値範囲は、その範囲を画定する数字を含む。測定値及び測定可能値は、有効数字及び測定に伴う誤差を考慮した概算値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定的であるようには意図されていない。以上の全般的説明及び発明を実施するための形態は、いずれも例示的かつ説明的なものに過ぎず、本教示を制限するものではないことを理解されたい。

【0022】

本明細書内で特に注記しない限り、本明細書内で、様々な構成要素を「含む」と記載している実施形態は、記載された構成要素から「なる」または「本質的になる」ことも企図されており、本明細書内で様々な構成要素から「なる」と記載されている実施形態は、記載された構成要素を「含む」またはそれから「本質的になる」ことも企図されている。また、本明細書内で、様々な構成要素から「本質的になる」と記載している実施形態は、記載された構成要素から「なる」またはそれを「含む」ことも企図されている（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。

【0023】

「または」という用語は、文脈による別段の明確な指示がない限り、包括的な意味で、すなわち「及び／または」と同等の意味で使用される。

【0024】

「約」という用語は、一覧または範囲の前に使用される場合は、一覧の各メンバーまたは範囲の各端点を修飾する。「約」または「およそ」という用語は、当業者による判定で特定の値に対し許容される誤差を意味し、この誤差は、部分的には、値がどのように測定または決定されるかに依存する。「約」という用語は、本明細書では、当技術分野における典型的な許容差の範囲内を意味するように使用される。例えば、「約」は、平均値から約２標準偏差と理解することができる。ある特定の実施形態において、約は＋１０％を意味する。ある特定の実施形態において、約は＋５％を意味する。

【0025】

数または一連の数の前の「少なくとも」という用語は、文脈から明らかであるように、「少なくとも」という用語に隣接する数、及び論理的に含まれ得る全ての後続の数または整数を含むものと理解される。例えば、核酸分子内のヌクレオチドの数は整数でなければならない。例えば、「２０ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１７ヌクレオチド」とは、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドが示された特性を有することを意味する。少なくともが、一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、一連の数または範囲の数の各々を修飾することができると理解される。

【0026】

本明細書で使用する場合、「以下」または「未満」は、文脈から論理的な、当該表現及び論理的な低いゼロまでの値または整数に隣接する値と理解される。例えば、「２ヌクレオチド塩基対以下」の二重鎖領域は、２、１、または０ヌクレオチド塩基対を有する。「以下」または「未満」が一連の数または範囲の前に存在する場合、その一連の数または範囲の各々が修飾されるものと理解される。

【0027】

本明細書で使用する場合、範囲は、上限及び下限の両方を含む。

【0028】

本明細書で使用する場合、ある値の最大量が１００％（例えば、１００％阻害または１００％封入）によって表される場合、その値は検出方法によって限定されるものと理解される。例えば、１００％阻害は、アッセイの検出レベル未満のレベルに対する阻害と理解され、１００％封入は、封入を意図された物質が小胞外で検出することができないものと理解される。

【0029】

別段の記載がない限り、以下の用語及び表現は、本明細書で使用する場合、以下の意味を有することが意図されている。

【0030】

本明細書で使用する場合、「ノックダウン」とは、遺伝子編集により、例えば、細胞、細胞集団、組織、または器官において、特定の遺伝子産物（例えば、完全長または野生型のｍＲＮＡ、タンパク質、または両方）の発現を低下させることを指す。いくつかの実施形態において、遺伝子編集は、シークエンシング、例えば次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって評価することができる。発現は、例えば、遺伝子配列が修飾されていない好適な対照と比較して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはアッセイの検出レベル未満まで低下し得る。タンパク質のノックダウンは、目的とする組織、細胞集団、または液体からタンパク質の量を検出することによって測定することができる。ｍＲＮＡのノックダウンを測定する方法は知られており、目的とする組織または細胞集団から単離されたｍＲＮＡのシークエンシングが挙げられる。フローサイトメトリー解析は、タンパク質発現のノックダウンを測定するための既知の方法である。分泌タンパク質の場合、ノックダウンは、組織培養培地もしくは血液、またはこれらに由来する血清もしくは血漿などの液体中で評価することができる。いくつかの実施形態において、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物の発現のいくらかの損失、例えば、完全長タンパク質に転写または翻訳される完全長野生型ｍＲＮＡ量の低下、または細胞の集団によって発現するタンパク質量の低下を指すことがある。ｍＲＮＡの配列のどのような変化が野生型または完全長タンパク質の発現の低下をもたらすかについては、十分に理解されている。いくつかの実施形態において、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物（例えば、体液または組織培養培地中のＩＦＮＧまたはＴＮＦＡ遺伝子産物）の発現のいくらかの損失を指すことがある。内在性核酸配列（例えば、ＩＦＮＧまたはＴＮＦＡ）をコードする核酸配列の修飾は、ノックダウンをもたらし得る。

【0031】

本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」とは、Ｔ細胞内の受容体を指す。概して、ＴＣＲは、α鎖及びβ鎖の２つのＴＣＲポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体受容体分子である。α鎖及びβ鎖のＴＣＲポリペプチドは、抗原結合後、様々なＣＤ３分子と複合体化し、炎症及び自己免疫を含む免疫応答（複数可）を誘発し得る。本明細書で使用する場合、ＴＣＲのノックダウンとは、任意のＴＣＲ遺伝子の部分的または全体的なノックダウン（例えば、単独で、または他のＴＣＲ遺伝子（複数可）の部分的または全体的なノックダウンと組み合わせたＴＲＢＣ１遺伝子の一部の欠失）を指す。

【0032】

「ＴＲＡＣ」は、Ｔ細胞受容体α鎖を指すために使用される。ヒト野生型ＴＲＡＣ配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８７５５；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２７７７３４で入手可能である。Ｔ細胞受容体アルファコンスタント、ＴＣＲＡ、ＩＭＤ７、ＴＲＣＡ、及びＴＲＡは、ＴＲＡＣの遺伝子同義語である。

【0033】

「ＴＲＢＣ」は、Ｔ細胞受容体β鎖（例えば、ＴＲＢＣ１及びＴＲＢＣ２）を指す。「ＴＲＢＣ１」及び「ＴＲＢＣ２」とは、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２遺伝子の遺伝子産物であるＴ細胞受容体β鎖をコードする２つの相同遺伝子を指す。

【0034】

ヒト野生型ＴＲＢＣ１配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８６３９；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１１７５１で入手可能である。Ｔ細胞受容体ベータコンスタント、Ｖ＿セグメント翻訳産物、ＢＶ０５Ｓ１Ｊ２．２、ＴＣＲＢＣ１、及びＴＣＲＢは、ＴＲＢＣ１の遺伝子同義語である。

【0035】

ヒト野生型ＴＲＢＣ２配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８６３８；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１１７７２で入手可能である。Ｔ細胞受容体ベータコンスタント、Ｖ＿セグメント翻訳産物、及びＴＣＲＢＣ２は、ＴＲＢＣ２の遺伝子同義語である。

【0036】

本明細書で使用する場合、「免疫応答」とは、１つ以上の免疫システム反応（複数可）、例えば、刺激されていない対照免疫システムと比較しての、免疫システム細胞（例えば、限定されるものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、赤血球、樹状細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、または食細胞）の産生または活性の増加を指す。免疫システムが抗原、例えば、外来抗原または自己抗原（例えば、限定されるものではないが、病原体（微生物、ウイルス、プリオン、真菌など）、アレルゲン（ほこり、花粉、チリダニなど）、毒素（化学物質、薬物など）、または生理的変化（高コレステロール血症、肥満、臓器移植など））に曝露されると、免疫応答を引き起こし得る。また、免疫応答は、ＧｖＨＤにおいて、造血幹細胞移植後にドナー細胞が宿主組織の免疫攻撃を媒介する応答も含み得る。免疫応答は、炎症をもたらし得る。免疫応答は、抗原（例えば、外来または自己）を標的化、攻撃、除去、または中和し得る。免疫応答は、望ましい場合もそうでない場合もある。免疫応答は、急性の場合も慢性の場合もある。免疫応答は、免疫応答が開始された細胞、組織、または器官を損傷することがある。

【0037】

本明細書で使用する場合、「自己免疫応答」とは、自己抗原（例えば、対象自身の細胞、組織、または器官によってもたらされる自己抗原）に対する１つ以上の免疫システム反応（複数可）を指す。自己免疫応答の結果、好適な対照（例えば、健康な対照）と比較して、免疫システム細胞（例えば、限定されるものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、赤血球、樹状細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、または食細胞）の産生または活性が増加し得る。自己免疫応答は、炎症（例えば、炎症の持続）をもたらしたり、自己免疫疾患につながったりすることがある。自己免疫応答は、対象自身の細胞、組織、または器官によって産生される自己抗原を標的化、攻撃、除去、または中和することがあり、これが自己免疫疾患につながり得る。

【0038】

本明細書で使用する場合、「免疫応答（複数可）の抑制」とは、好適な対照（例えば、本明細書に記載の操作されたＴ細胞で処置されていない、または処置される前の対照）と比較して、１つ以上の免疫システム反応（複数可）（例えば、免疫システム細胞の産生または活性）のレベルを低下または阻害することを指す。免疫応答（複数可）を「抑制する」とは、好適な対照（例えば、本明細書に記載の操作されたＴ細胞で処置されていない、または処置される前の対照）と比較して、免疫システム細胞の産生または活性が低下することを指すことがある。免疫応答を「抑制する」ことは、免疫寛容を増加させることを指すことがある。例えば、免疫システム細胞の産生または活性は、細胞数（例えば、リンパ球数または脾臓細胞数）、細胞活性（例えば、Ｔ細胞アッセイ）、または遺伝子もしくはタンパク質発現（例えば、バイオマーカー発現）によって測定することができ、産生または活性は、好適な対照（例えば、本明細書に記載の操作されたＴ細胞で処置されていない、または処置される前の対照）と比較して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはアッセイの検出レベル未満に低下する。

【0039】

本明細書で使用する場合、「自己免疫疾患」または「自己免疫障害」とは、対象自身の抗原、細胞、組織、または器官に対する病的な免疫応答を特徴とする状態を指す。自己免疫疾患及び障害の例としては、限定されるものではないが、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、及び１型糖尿病が挙げられる。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、自己由来または同種異系で使用される。

【0040】

本明細書で使用する場合、「免疫障害」とは、対象における病的なまたは望ましくない免疫応答を特徴とする疾患または状態として理解される。ある特定の実施形態において、免疫障害は自己免疫疾患である。ある特定の実施形態において、免疫障害はＧｖＨＤである。ある特定の実施形態において、免疫障害を有する対象は、免疫応答の抑制を必要とする。ある特定の実施形態において、免疫障害を有する対象は、免疫寛容の増加を必要とする。

【0041】

「Ｔ細胞」とは、抗原に曝露された後の免疫応答で中心的な役割を果たす。Ｔ細胞は天然に存在することもあれば、例えば、Ｔ細胞が（例えば、幹細胞からの）操作により、または分化転換（例えば、体細胞の再プログラム）により形成される場合は、非天然であることもある。Ｔ細胞は、細胞表面にＴ細胞受容体が存在することにより、他のリンパ球と区別することができる。この定義に含まれるのは、従来的な適応性Ｔ細胞（ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、及び調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む）、ならびに自然様Ｔ細胞（ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、及びガンマデルタＴ細胞を含む）である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ３＋／ＣＤ４＋である。

【0042】

「調節性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」とは、過剰な免疫応答（複数可）（炎症及び自己免疫を含む）を抑制することにより、自己寛容において中心的な役割を果たす特化型Ｔ細胞を指す。Ｔｒｅｇは天然に存在することもあれば、例えば、Ｔｒｅｇが、操作により（例えば、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする少なくとも１つの配列（複数可）の挿入とにより）形成される場合は、非天然であることもある。天然に存在するＴｒｅｇ、または天然のＴｒｅｇ、またはｎＴｒｅｇとは、典型的には胸腺内で発生する特化型のＴ細胞であり、過剰な免疫応答（複数可）を抑制することにより、自己寛容を促進するように機能する。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、従来的なＴ細胞または従来的なＴ細胞の集団、例えば、ｎＴｒｅｇ細胞の存在が濃縮されていないＴ細胞の集団）は、ＴＮＦＡ及びＩＦＮＧをコードする内在性核配列を修飾、例えば、ＴＮＦＡ及びＩＦＮＧをコードする核酸配列をノックダウンし、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）を細胞に挿入することによって操作して、調節性Ｔ細胞の表現型特性及び抑制機能を示すことができ、これらは、形質導入Ｔ細胞または「操作された」Ｔ細胞と称され得る。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾と、異種の調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４）の挿入とを含む。内在性核酸配列の修飾（例えば、内在性遺伝子の発現をノックダウンする修飾）は、ゲノム配列内に１つ以上のインデル変異または置換変異を含む、またはそれからなることができる。

【0043】

本明細書で使用する場合、「調節性Ｔ細胞促進分子」とは、免疫抑制分子及びＴｒｅｇ転写因子を含む、従来的なＴ細胞から調節性Ｔ細胞への転換を促進する分子を指す。さらに、調節性Ｔ細胞促進分子は、従来的なＴ細胞に制御活性を付与する分子（Ｔｒｅｇ関連免疫抑制分子及び転写因子を含む）も指す。免疫抑制分子の例としては、限定されるものではないが、インターロイキン－１０（ＩＬ１０）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、形質転換成長因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドラーゼ１（ＥＮＴＰＤ１）、５’－ヌクレオチダーゼエクト（ＮＴ５Ｅ）、インターロイキン－２２（ＩＬ２２）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、インターロイキン－３５（ＩＬ３５）、ロイシンリッチリピート含有３２（ＧＡＲＰ）、ＣＤ２７４分子（ＣＤ２７４）、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）、ＩＫＡＲＯＳファミリージンクフィンガー２（ＩＫＺＦ２）、家族性好酸球増加症（ＥＯＳ）、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１）、ならびにＢＴＢドメイン及びＣＮＣホモログ２（ＢＡＣＨ２）が挙げられる。いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子は、特定の組合せ（例えば、ＩＬ１０及びＣＴＬＡ４、ＥＮＴＰＤ１及びＮＴ５Ｅ、ならびにＩＬ２２及びＡＲＥＧ）で使用することができる。詳細には、ＩＬ１０とＣＴＬＡ４との組合せが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、免疫抑制分子の発現は、ＦｏｘＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、Ｅｏｓ、ＩＲＦ４、Ｌｅｆ１、またはＢＡＣＨ２などの転写因子の発現によって促進することができる。

【0044】

いくつかの実施形態において、従来的なＴ細胞は、ゲノム内の配列を修飾、挿入、または欠失させるように操作することができ、「操作された」Ｔ細胞は、天然の調節性Ｔ細胞の１つ以上の表現型特性及び抑制機能を示す。例えば、「操作された」Ｔ細胞は、以下の実施例２及び３で提供されるような混合リンパ球反応アッセイで抑制活性を示し、または好ましくは、以下の実施例２及び３に提示されるマウスモデルで、好ましくは統計的に有意に、移植片対宿主病を抑制可能である（例えば、Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘ ｖｉｖｏ ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｒｄ－ｐａｒｔｙ ｈｕｍａｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｎｔｉ－ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｂｌｏｏｄ １２５（９）（２０１５）も参照）。いくつかの実施形態において、「操作された」Ｔ細胞は、調節性Ｔ細胞促進分子のコード配列の挿入、及び炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの両方）の発現の修飾（例えば、ノックダウン）により修飾された従来的なＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作のための開始Ｔ細胞集団は、天然Ｔｒｅｇの存在が濃縮されておらず、例えば、開始Ｔ細胞集団は２０％未満の天然Ｔｒｅｇを有する。

【0045】

本明細書で使用する場合、「炎症促進性」分子（例えば、サイトカイン）は、本明細書に記載の免疫応答を増加させ、例えば、実施例２及び３に提示される移植片対宿主病のマウスモデルでＴｒｅｇの有効性を用量応答的に低減する。炎症促進性分子の例としては、限定されるものではないが、ＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ６、ＩＬ２、
パーフォリン１（ＰＲＦ１）、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）が挙げられる。

【0046】

本明細書で使用する場合、「標的化受容体」とは、細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面に存在して、当該細胞が標的部位（例えば、生物内の特定の細胞または組織）に結合するのを可能にする受容体を指す。標的化受容体としては、限定されるものではないが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ならびにタンパク質の細胞外受容体部分の結合時にＴ細胞を活性化可能な内部シグナル伝達ドメイン内の少なくとも膜貫通ドメインを介し作用可能に結合した細胞表面分子の受容体、例えば、粘膜アドレシン細胞接着分子－１（ＭａｄＣＡＭ－１）、ＴＮＦＡ、ＣＥＡ細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）、シトルリン化ビメンチン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）、プロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）、ＣＤ１９分子（ＣＤ１９）、ＣＤ２０分子（ＣＤ２０）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）、溶質輸送体ファミリー２メンバー２（ＳＣＬ２Ａ２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ２）、デスモグレイン（ｄｅｍｏｇｌｅｉｎ）３（ＤＳＧ３）、及びＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）が挙げられる。

【0047】

本明細書で使用する場合、「キメラ抗原受容体」とは、細胞外抗原認識ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、ナノボディ）を指し、抗原が結合するとＴ細胞を活性化する細胞内シグナル伝達ドメインに作用可能に結合している。ＣＡＲは、４つの領域：抗原認識ドメイン、細胞外ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインから構成されている。このような受容体は、当技術分野で周知されている（例えば、ＷＯ２０２００９２０５７、ＷＯ２０１９１９１１１４、ＷＯ２０１９１４７８０５、ＷＯ２０１８２０８８３７を参照（これらの各内容の対応部分は、参照により本明細書に援用される））。また、アダプター分子を介して免疫細胞と標的細胞との結合を促進する逆ユニバーサルＣＡＲ（例えば、ＷＯ２０１９２３８７２２を参照（この内容は、全体として本明細書に援用される））も企図されている。ＣＡＲは、抗体が開発され得る任意の抗原に対し標的化することができ、典型的には、標的とされる細胞または組織の表面に表示される分子を対象とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を消化管に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲはＭＡｄＣＡＭ－１を標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を内皮細胞を含む組織に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲは、例えば、クローン病及び多発性硬化症などの障害における免疫応答を抑制するために、ＶＣＡＭ－１を標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を内皮細胞に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲは、例えば、クローン病などの障害における免疫応答を抑制するために、ＣＥＡＣＡＭ６を標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞をプレＢ細胞に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲは、例えば、多発性硬化症及び全身性エリテマトーデスなどの障害における免疫応答を抑制するために、ＣＤ１９を標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞をＢリンパ球に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲは、例えば、多発性硬化症及び全身性エリテマトーデスなどの障害における免疫応答を抑制するために、ＣＤ２０を標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を炎症組織に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲは、例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、またはクローン病などの障害における免疫応答を抑制するために、ＴＮＦＡを標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を炎症組織に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲは、例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、またはクローン病などの障害における免疫応答を抑制するために、ＴＧＦ－ｂ１を標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を神経組織に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲは、例えば、多発性硬化症などの障害における免疫応答を抑制するために、ＭＢＰ、ＭＯＧ、またはＰＬＰ１を標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を、成熟Ｂリンパ球を含む組織に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲは、例えば、全身性エリテマトーデスなどの障害における免疫応答を抑制するために、ＴＮＦＲＳＦ１７を標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を滑膜組織に対し標的化することが可能であり、例えば、ＣＡＲは、例えば、関節リウマチなどの障害における免疫応答を抑制するために、シトルリン化ビメンチンを標的化する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ジペプチジルペプチダーゼ様６（ＤＰＰ６）、溶質輸送体ファミリー２メンバー２（ＳＣＬ２Ａ２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ２）、デモグレイン３（ＤＳＧ３）、またはＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を標的化する。さらなるＣＡＲ標的（例えば、炎症性抗原）が当技術分野で知られている。例えば、ＷＯ２０２００９２０５７Ａ１を参照（この内容は、全体として本明細書に援用される）。

【0048】

本明細書で使用する場合、「治療」とは、対象における疾患または障害に対する治療薬の任意の投与または適用を指し、疾患の阻害、その発生の抑止、疾患の１つ以上の症状の軽減、疾患の治癒、疾患の１つ以上の症状の防止、または疾患の１つ以上の症状の再発の防止を含む。自己免疫または炎症性の応答または障害を治療することは、特定の障害に関連する炎症を緩和し、その結果、疾患に特有の症状を緩和することを含むことができる。本明細書に記載の操作されたＴ細胞による治療は、追加の治療剤、例えば抗炎症剤、免疫抑制剤、または自己免疫障害治療のための生物製剤（例えば、レミケード、ヒュミラ）の前、後、またはこれらと組み合わせて使用することができる。

【0049】

「プロモーター」とは、調節領域が結合している遺伝子の発現を制御する調節領域を指す。

【0050】

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、骨格に沿って共に結合している窒素含有複素環の塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含む多量体化合物を指すために本明細書で使用され、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」としては、従来的なＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びこれらのアナログである重合体が挙げられる。核酸「骨格」は、糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ；ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはこれらの組合せのうちの１つ以上を含めた様々な結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換（例えば、２’メトキシ置換または２’ハロゲン化物置換）を伴った同様の化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、修飾ウリジン、例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、またはＮ１－メチルシュードウリジン、その他）；イノシン；プリンまたはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ^４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－またはアザ－プリン、デアザ－またはアザ－ピリミジン、５位または６位に置換基を伴うピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン））、２位、６位、または８位に置換基を伴うプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ^６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ^４－アルキル－ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号であり得る。全般的な解説についてはＴｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１^ｔｈ ｅｄ．，１９９２）を参照。核酸は、骨格が重合体の位置（複数可）に窒素含有塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含むことができる（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来的なＲＮＡまたはＤＮＡの糖、塩基、及び結合のみを含むこともあれば、従来的な構成要素及び置換の両方（例えば、２’メトキシ結合を有する従来的な塩基、または従来的な塩基及び１つ以上の塩基アナログの両方を含有する重合体）を含むこともある。核酸は「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含み、これは、ＲＮＡ模倣糖立体配座内にロックされた二環式フラノース単位とともに１つ以上のＬＮＡヌクレオチド単量体を含むアナログであり、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡの配列に対するハイブリダイゼーション親和性を強化する（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ＲＮＡ及びＤＮＡは異なる糖部分を有してもよく、ＲＮＡではウラシルまたはそのアナログの存在により、またＤＮＡではチミンまたはそのアナログの存在により区別することができる。

【0051】

「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、または単に「ガイド」は、本明細書では、ガイド配列を含むガイド、例えば、ｃｒＲＮＡ（別称ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）、またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡ（別称ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組合せのいずれかを指すために互換的に使用される。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合することも、例えば、２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）において会合することもできる。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は各々のタイプを指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列であっても、天然に存在する配列と比較して修飾またはバリエーションを有するｔｒＲＮＡ配列であってもよい。ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）は、本明細書に記載のような修飾ＲＮＡを含むことができる。

【0052】

本明細書で使用する場合、「ガイド配列」とは、標的配列に対し相補的であり、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、切断）のためにガイドＲＮＡを標的配列に誘導するよう機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。また「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」と称されることもある。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連するＣａｓ９ホモログ／オーソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。これより短い配列または長い配列（例えば、長さ１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド）も、ガイドとして使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ガイド配列は、標的に相補的な配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ガイド配列は、配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに対し約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列及び標的領域は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態において、ガイド配列及び標的領域は、少なくとも１つのミスマッチを含むことができる。例えば、ガイド配列及び標的配列は、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを含むことができ、このとき標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態において、ガイド配列及び標的領域は１～４つのミスマッチを含んでもよく、完全に相補的であってもよく、このときガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列及び標的領域は、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを含むことができ、このときガイド配列は２０ヌクレオチドを含む。

【0053】

ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の核酸基質が二重鎖核酸であることから、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖及びマイナス鎖の両方（すなわち、所与の配列及び配列の逆相補配列）を含む。よって、ガイド配列が「標的配列に対し相補的」であると述べられている場合、ガイド配列はガイドＲＮＡを標的配列の逆相補配列と結合させるよう誘導し得ることを理解されたい。したがって、いくつかの実施形態において、ガイド配列が標的配列の逆相補配列に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列中でＴがＵに置換されていることを除いて、標的配列（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）におけるある特定のヌクレオチドと同一である。

【0054】

本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡの結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはこのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、このときＤＮＡ結合活性は配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤という用語は、このようなポリペプチドをコードする核酸も含む。例示的なＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓクリーバーゼ／ニッカーゼを含む。例示的なＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、その不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）（例えば、これらの薬剤が、例えばＦｏｋＩクリーバーゼドメインとの融合を介し、ＤＮＡ切断を可能にするように修飾されている場合）を含むことができる。「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、本明細書で使用する場合、Ｃａｓクリーバーゼ及びＣａｓニッカーゼを包含する。Ｃａｓクリーバーゼ及びＣａｓニッカーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、Ｃａｓ１０、そのＣｓｍ１またはＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼを含む。本明細書で使用する場合、「クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ」とは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、クラス２ Ｃａｓクリーバーゼ／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）（これらはさらに、ＲＮＡ先導ＤＮＡクリーバーゼまたはニッカーゼ活性を有する）、及びクリーバーゼ／ニッカーゼ活性が不活性化されているクラス２ ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（例えば、これらの結合剤がＤＮＡ切断を可能にするように修飾されている場合、またはＣ→ＴデアミナーゼまたはＡ→Ｇデアミナーゼ活性を有する場合）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、デアミナーゼ領域及びＲＮＡ先導ＤＮＡニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）を含む。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）のタンパク質及びこれらの修飾物が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインも含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照により全体として援用される。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，１３（１１）７２２－３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照。本明細書で使用する場合、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）の送達は、ポリペプチドまたはｍＲＮＡの送達を含む。

【0055】

Ｃａｓ９分子の例示的なヌクレオチド及びポリペプチド配列を以下に示す。Ｃａｓ９ポリペプチド配列をコードする代替的なヌクレオチド配列（代替的な天然に存在するバリアントを含む）を特定するための方法は、当技術分野で知られている。また、本明細書で提供されるＣａｓ９核酸配列、アミノ酸配列、またはアミノ酸配列をコードする核酸配列のいずれかに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列も企図されている。
Ｃａｓ９の例示的なオープンリーディングフレーム
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Ｃａｓ９の例示的なアミノ酸配列
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Ｃａｓ９の例示的なオープンリーディングフレーム
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Ｈｉｂｉｔタグを有するＣａｓ９の例示的なオープンリーディングフレーム
ＡＵＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＵＡＣＵＣＣＡＵＣＧＧＣＣＵＧＧＡＣＡＵＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＵＣＣＧＵＧＧＧＣＵＧＧＧＣＣＧＵＧＡＵＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＵＡＣＡＡＧＧＵＧＣＣＣＵＣＣＡＡＧＡＡＧＵＵＣＡＡＧＧＵＧＣＵＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＣＧＧＣＡＣＵＣＣＡＵＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＵＧＡＵＣＧＧＣＧＣＣＣＵＧＣＵＧＵＵＣＧＡＣＵＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＵＧＡＡＧＣＧＧＡＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＵＡＣＡＣＣＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＵＣＵＧＣＵＡＣＣＵＧＣＡＧＧＡＧＡＵＣＵＵＣＵＣＣＡＡＣＧＡＧＡＵＧＧＣＣＡＡＧＧＵＧＧＡＣＧＡＣＵＣＣＵＵＣＵＵＣＣＡＣＣＧＧＣＵＧＧＡＧＧＡＧＵＣＣＵＵＣＣＵＧＧＵＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＣＣＡＵＣＵＵＣＧＧＣＡＡＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＧＡＧＧＵＧＧＣＣＵＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＧＵＡＣＣＣＣＡＣＣＡＵＣＵＡＣＣＡＣＣＵＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＵＧＧＵＧＧＡＣＵＣＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＣＵＧＣＧＧＣＵＧＡＵＣＵＡＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＧＣＣＣＡＣＡＵＧＡＵＣＡＡＧＵＵＣＣＧＧＧＧＣＣＡＣＵＵＣＣＵＧＡＵＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣＵＧＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＣＵＣＣＧＡＣＧＵＧＧＡＣＡＡＧＣＵＧＵＵＣＡＵＣＣＡＧＣＵＧＧＵＧＣＡＧＡＣＣＵＡＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧＵＵＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＵＣＡＡＣＧＣＣＵＣＣＧＧＣＧＵＧＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＵＣＣＵＧＵＣＣＧＣＣＣＧＧＣＵＧＵＣＣＡＡＧＵＣＣＣＧＧＣＧＧＣＵＧＧＡＧＡＡＣＣＵＧＡＵＣＧＣＣＣＡＧＣＵＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＣＵＧＵＵＣＧＧＣＡＡＣＣＵＧＡＵＣＧＣＣＣＵＧＵＣＣＣＵＧＧＧＣＣＵＧＡＣＣＣＣＣＡＡＣＵＵＣＡＡＧＵＣＣＡＡＣＵＵＣＧＡＣＣＵＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＣＣＡＡＧＣＵＧＣＡＧＣＵＧＵＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＵＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＵＧＧＡＣＡＡＣＣＵＧＣＵＧＧＣＣＣＡＧＡＵＣＧＧＣＧＡＣＣＡＧＵＡＣＧＣＣＧＡＣＣＵＧＵＵＣＣＵＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＣＵＧＵＣＣＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＵＣＣＧＡＣＡＵＣＣＵＧＣＧＧＧＵＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＣＵＧＵＣＣＧＣＣＵＣＣＡＵＧＡＵＣＡＡＧＣＧＧＵＡＣＧＡＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＵＧＡＣＣＣＵＧＣＵＧＡＡＧＧＣＣＣＵＧＧＵＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＵＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧＵＡＣＡＡＧＧＡＧＡＵＣＵＵＣＵＵＣＧＡＣＣＡＧＵＣＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＵＡＣＧＣＣＧＧＣＵＡＣＡＵＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＵＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＵＵＣＵＡＣＡＡＧＵＵＣＡＵＣＡＡＧＣＣＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＡＧＡＵＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＧＡＧＣＵＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＣＵＧＡＡＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＣＵＧＣＵＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＣＵＵＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＵＣＣＡＵＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＵＣＣＡＣＣＵＧＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＡＣＧＣＣＡＵＣＣＵＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＵＵＣＵＡＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＡＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＵＣＧＡＧＡＡＧＡＵＣＣＵＧＡＣＣＵＵＣＣＧＧＡＵＣＣＣＣＵＡＣＵＡＣＧＵＧＧＧＣＣＣＣＣＵＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＡＡＣＵＣＣＣＧＧＵＵＣＧＣＣＵＧＧＡＵＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＵＣＣＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＵＣＡＣＣＣＣＣＵＧＧＡＡＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＵＣＣＧＣＣＣＡＧＵＣＣＵＵＣＡＵＣＧＡＧＣＧＧＡＵＧＡＣＣＡＡＣＵＵＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＵＧＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＵＧＣＵＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＵＣＣＣＵＧＣＵＧＵＡＣＧＡＧＵＡＣＵＵＣＡＣＣＧＵＧＵＡＣＡＡＣＧＡＧＣＵＧＡＣＣＡＡＧＧＵＧＡＡＧＵＡＣＧＵＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＵＧＣＧＧＡＡＧＣＣＣＧＣＣＵＵＣＣＵＧＵＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＵＧＣＵＧＵＵＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＧＵＧＡＣＣＧＵＧＡＡＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＵＡＣＵＵＣＡＡＧＡＡＧＡＵＣＧＡＧＵＧＣＵＵＣＧＡＣＵＣＣＧＵＧＧＡＧＡＵＣＵＣＣＧＧＣＧＵＧＧＡＧＧＡＣＣＧＧＵＵＣＡＡＣＧＣＣＵＣＣＣＵＧＧＧＣＡＣＣＵＡＣＣＡＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＡＡＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＵＵＣＣＵＧＧＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＧＡＣＡＵＣＧＵＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＣＣＣＵＧＵＵＣＧＡＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＵＧＡＵＣＧＡＧＧＡＧＣＧＧＣＵＧＡＡＧＡＣＣＵＡＣＧＣＣＣＡＣＣＵＧＵＵＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＵＧＡＵＧＡＡＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＵＡＣＡＣＣＧＧＣＵＧＧＧＧＣＣＧＧＣＵＧＵＣＣＣＧＧＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＡＣＧＧＣＡＵＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＵＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＵＣＣＵＧＧＡＣＵＵＣＣＵＧＡＡＧＵＣＣＧＡＣＧＧＣＵＵＣＧＣＣＡＡＣＣＧＧＡＡＣＵＵＣＡＵＧＣＡＧＣＵＧＡＵＣＣＡＣＧＡＣＧＡＣＵＣＣＣＵＧＡＣＣＵＵＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＵＧＵＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＣＵＣＣＣＵＧＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＵＣＧＣＣＡＡＣＣＵＧＧＣＣＧＧＣＵＣＣＣＣＣＧＣＣＡＵＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＡＵＣＣＵＧＣＡＧＡＣＣＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＵＧＧＡＣＧＡＧＣＵＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＡＵＧＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＵＣＧＵＧＡＵＣＧＡＧＡＵＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＵＣＣＣＧＧＧＡＧＣＧＧＡＵＧＡＡＧＣＧＧＡＵＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＧＡＧＣＵＧＧＧＣＵＣＣＣＡＧＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＧＵＧＧＡＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＣＵＧＣＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＵＧＵＡＣＣＵＧＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＧＡＡＣＧＧＣＣＧＧＧＡＣＡＵＧＵＡＣＧＵＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＣＵＧＧＡＣＡＵＣＡＡＣＣＧＧＣＵＧＵＣＣＧＡＣＵＡＣＧＡＣＧＵＧＧＡＣＣＡＣＡＵＣＧＵＧＣＣＣＣＡＧＵＣＣＵＵＣＣＵＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＵＣＣＡＵＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＵＧＣＵＧＡＣＣＣＧＧＵＣＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＧＵＣＣＧＡＣＡＡＣＧＵＧＣＣＣＵＣＣＧＡＧＧＡＧＧＵＧＧＵＧＡＡＧＡＡＧＡＵＧＡＡＧＡＡＣＵＡＣＵＧＧＣＧＧＣＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＧＣＣＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＡＡＣＣＵＧＡＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣＵＧＵＣＣＧＡＧＣＵＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＵＵＣＡＵＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＵＧＧＵＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＣＡＧＡＵＣＡＣＣＡＡＧＣＡＣＧＵＧＧＣＣＣＡＧＡＵＣＣＵＧＧＡＣＵＣＣＣＧＧＡＵＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＵＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＡＵＣＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＣＣＡＡＧＣＵＧＧＵＧＵＣＣＧＡＣＵＵＣＣＧＧＡＡＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＵＵＣＵＡＣＡＡＧＧＵＧＣＧＧＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＡＣＵＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＵＡＣＣＵＧＡＡＣＧＣＣＧＵＧＧＵＧＧＧＣＡＣＣＧＣＣＣＵＧＡＵＣＡＡＧＡＡＧＵＡＣＣＣＣＡＡＧＣＵＧＧＡＧＵＣＣＧＡＧＵＵＣＧＵＧＵＡＣＧＧＣＧＡＣＵＡＣＡＡＧＧＵＧＵＡＣＧＡＣＧＵＧＣＧＧＡＡＧＡＵＧＡＵＣＧＣＣＡＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＵＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＵＡＣＵＵＣＵＵＣＵＡＣＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＵＧＡＡＣＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＣＣＧＡＧＡＵＣＡＣＣＣＵＧＧＣＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＵＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＣＣＣＵＧＡＵＣＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＵＣＧＵＧＵＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＵＵＣＧＣＣＡＣＣＧＵＧＣＧＧＡＡＧＧＵＧＣＵＧＵＣＣＡＵＧＣＣＣＣＡＧＧＵＧＡＡＣＡＵＣＧＵＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＧＡＧＧＵＧＣＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣＵＵＣＵＣＣＡＡＧＧＡＧＵＣＣＡＵＣＣＵＧＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＡＣＵＣＣＧＡＣＡＡＧＣＵＧＡＵＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＵＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＵＡＣＧＧＣＧＧＣＵＵＣＧＡＣＵＣＣＣＣＣＡＣＣＧＵＧＧＣＣＵＡＣＵＣＣＧＵＧＣＵＧＧＵＧＧＵＧＧＣＣＡＡＧＧＵＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＵＣＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＣＣＧＵＧＡＡＧＧＡＧＣＵＧＣＵＧＧＧＣＡＵＣＡＣＣＡＵＣＡＵＧＧＡＧＣＧＧＵＣＣＵＣＣＵＵＣＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＵＣＧＡＣＵＵＣＣＵＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＡＡＧＧＡＧＧＵＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＵＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＣＵＧＣＣＣＡＡＧＵＡＣＵＣＣＣＵＧＵＵＣＧＡＧＣＵＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＵＧＣＵＧＧＣＣＵＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＵＧＧＣＣＣＵＧＣＣＣＵＣＣＡＡＧＵＡＣＧＵＧＡＡＣＵＵＣＣＵＧＵＡＣＣＵＧＧＣＣＵＣＣＣＡＣＵＡＣＧＡＧＡＡＧＣＵＧＡＡＧＧＧＣＵＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＵＧＵＵＣＧＵＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＵＡＣＣＵＧＧＡＣＧＡＧＡＵＣＡＵＣＧＡＧＣＡＧＡＵＣＵＣＣＧＡＧＵＵＣＵＣＣＡＡＧＣＧＧＧＵＧＡＵＣＣＵＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＡＡＣＣＵＧＧＡＣＡＡＧＧＵＧＣＵＧＵＣＣＧＣＣＵＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＧＧＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＵＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＣＡＵＣＡＵＣＣＡＣＣＵＧＵＵＣＡＣＣＣＵＧＡＣＣＡＡＣＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＵＵＣＡＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＵＣＧＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＵＡＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＵＧＣＵＧＧＡＣＧＣＣＡＣＣＣＵＧＡＵＣＣＡＣＣＡＧＵＣＣＡＵＣＡＣＣＧＧＣＣＵＧＵＡＣＧＡＧＡＣＣＣＧＧＡＵＣＧＡＣＣＵＧＵＣＣＣＡＧＣＵＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＵＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＵＧＵＣＣＧＡＧＵＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＵＣＣＧＵＧＵＣＣＧＧＣＵＧＧＣＧＧＣＵＧＵＵＣＡＡＧＡＡＧＡＵＣＵＣＣＵＧＡ（配列番号１１７）
Ｈｉｂｉｔタグを有するＣａｓ９の例示的なアミノ酸配列
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤＧＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶＳＥＳＡＴＰＥＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ＊（配列番号１１８）

【0056】

本明細書で使用する場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」とは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリーバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）、Ｃａｓニッカーゼ、またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９））と一緒になったガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）を標的配列に先導し、ガイドＲＮＡは標的配列とハイブリダイズし、結合剤は標的配列に結合する。結合剤がクリーバーゼまたはニッカーゼである場合、結合は、二本鎖ＤＮＡ切断または一本鎖ＤＮＡ切断の後に行われ得る。

【0057】

本明細書で使用する場合、第１の配列の第２の配列へのアラインメントにより、全体で第２の配列の位置のＸ％以上が第１の配列にマッチすることが示される場合、第１の配列が第２の配列「に対し少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは配列ＡＡＧに対し、第２の配列における３つ全ての位置に対するマッチが存在することからアラインメントで１００％の同一性がもたらされると考えられるため、配列ＡＡＧＡは配列ＡＡＧに対し１００％の同一性を有する配列を含む。ＲＮＡとＤＮＡとの間の違い（概して、ウリジンからチミジンへの交換またはその逆）や、修飾ウリジンのようなヌクレオシドアナログの存在は、関連ヌクレオチド（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジン）が同じ相補物（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てに対するアデノシン；もう１つの例はシトシン及び５－メチルシトシンであり、これらは共に、相補物としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性に寄与しない。したがって、例えば、配列５’－ＡＸＧにおいて、Ｘが任意の修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンである場合、いずれも同じ配列（５’－ＣＡＵ）に対し完全に相補的であることから、ＡＵＧに対し１００％同一であるとみなされる。例示的なアラインメントアルゴリズムとして、スミス＝ウォーターマン及びニードルマン＝ウンシュアルゴリズムがあり、これらは当技術分野で周知されている。当業者は、与えられた対の配列をアラインメントするのにどのアルゴリズム及びパラメーター設定の選択が適切であるかを理解すると考えられ、概して同様の長さである、予測同一性がアミノ酸について＞５０％、またはヌクレオチドについて＞７５％の配列に関しては、ＥＢＩによりｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのｗｅｂサーバーにて提供されるニードルマン＝ウンシュアルゴリズムインターフェイスのデフォルト設定を用いたニードルマン＝ウンシュアルゴリズムが概して適切である。

【0058】

本明細書で使用する場合、第１の配列の塩基のＸ％が第２の配列と塩基対を形成する場合、第１の配列は第２の配列に「Ｘ％相補的」であるとみなされる。例えば、第１の配列５’ＡＡＧＡ３’は、第２の配列３’ＴＴＣＴ５’に１００％相補的であり、第２の配列は、第１の配列に１００％相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列５’ＡＡＧＡ３’は、第２の配列３’ＴＴＣＴＧＴＧＡ５’に１００％相補的であり、一方、第２の配列は、第１の配列に５０％相補的である。

【0059】

本明細書で使用する場合、「ｍＲＮＡ」は、完全にもしくは支配的にＲＮＡであるか、または修飾ＲＮＡであり、ポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として働き得る）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために、本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはそのアナログ（例えば、２’－メトキシリボース残基）を含めたリン酸－糖骨格を含むことができる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡリン酸－糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはこれらの組合せから本質的になる。

【0060】

本明細書で使用する場合、「インデル」とは、標的核酸内の２本鎖切断（ＤＳＢ）の部位で挿入または欠失される複数のヌクレオチドからなる挿入／欠失の変異を指す。

【0061】

本明細書で使用する場合、「標的配列」とは、ｇＲＮＡのガイド配列に対し相補性を有する標的遺伝子内の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用は、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤に標的配列内での結合、そして潜在的には（作用物質の活性に応じて）ニッキングまたは切断を行わせる。

【0062】

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」とは、野生型またはバリアントタンパク質（例えば、変異体、フラグメント、融合体、またはこれらの組合せ）を指す。バリアントポリペプチドは、野生型ポリペプチドの少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の機能的活性を有することができる。いくつかの実施形態において、バリアントは、野生型ポリペプチドの配列に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態において、バリアントポリペプチドは高活性バリアントであり得る。ある特定の場合において、バリアントは、野生型ポリペプチドの約８０％～約１２０％、約１４０％、約１６０％、約１８０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、またはそれ以上の機能的活性を有する。

【0063】

本明細書で使用する場合、「異種遺伝子」とは、細胞内に外来源として導入された遺伝子（例えば、セーフハーバー座位などのゲノム座位（ＴＣＲ遺伝子座位を含む）に挿入された遺伝子）を指す。すなわち、導入された遺伝子は、その挿入部位に関して異種である。このような異種遺伝子から発現するポリペプチドは、「異種ポリペプチド」と称される。異種遺伝子は、天然に存在しても操作されていてもよく、野生型であってもバリアントであってもよい。異種遺伝子は、異種ポリペプチドをコードする配列以外のヌクレオチド配列（例えば、内部リボソーム進入部位）を含むことができる。異種遺伝子は、野生型またはバリアント（例えば、変異型）として、ゲノム内に天然に存在する遺伝子であってもよい。例えば、細胞は、（野生型またはバリアントとして）目的遺伝子を含むが、同じ遺伝子またはそのバリアントは、例えば、高度に発現する座位での発現のための外来源として導入することができる。また、異種遺伝子は、ゲノム内に天然に存在しない遺伝子、またはゲノム内に天然に存在しない異種ポリペプチドを発現する遺伝子であってもよい。「異種遺伝子」、「外来遺伝子」、及び「導入遺伝子」は、互換的に使用される。いくつかの実施形態において、異種遺伝子または導入遺伝子は、外来性核酸配列（例えば、レシピエント細胞にとって内因性のものでない核酸配列）を含む。いくつかの実施形態において、異種遺伝子または導入遺伝子は、外来性核酸配列（例えば、レシピエント細胞内に天然に存在しない核酸配列）を含む。例えば、異種遺伝子は、その挿入部位に関しても、そのレシピエント細胞に関しても異種性であり得る。

【0064】

「セーフハーバー」座位とは、細胞に顕著な悪影響を及ぼさずに遺伝子を挿入することができるゲノム内の座位である。本明細書で使用するためのヌクレアーゼ（複数可）により標的化されるセーフハーバー座位の非限定的な例としては、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１ Ｒ１２Ｃ）、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、ならびに本明細書に記載のノックダウンに標的化される任意の座位（例えば、ＴＮＦＡ、ＩＦＮＧ、ＩＬ１７Ａ、及びＩＬ６ゲノム座位）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ノックダウンに標的化される座位（単数または複数）（例えば、ＴＲＣ遺伝子、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子）への挿入は、同種異系細胞に有利である。他の好適なセーフハーバー座位は当技術分野で知られている。

【0065】

ＩＩ．組成物
Ａ．操作されたＴ細胞
本明細書では、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含むように操作されたＴ細胞及びＴ細胞の集団、ならびにその組成物及び使用が提供される。いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子は、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢ１、ＩＤＯ１、ＥＮＴＰＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＩＬ２２、ＡＲＥＧ、ＩＬ３５、ＧＡＲＰ、ＣＤ２７４、ＦＯＸＰ３、ＩＫＺＦ２、ＥＯＳ、ＩＲＦ４、ＬＥＦ１、及びＢＡＣＨ２から選択される。

【0066】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある２つ以上の調節性Ｔ細胞促進分子をそれぞれコードする異種配列の細胞内への挿入とを含むように操作される。例えば、操作されたＴ細胞は、第１のプロモーターの制御下にある第１の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする第１の異種配列と、第２プロモーターの制御下にある第２の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする第２の異種配列とを含む。第１のプロモーター及び第２のプロモーターは、同じプロモーターであっても異なるプロモーターであってもよい。

【0067】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーターの制御下にあるＩＬ１０をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含むように操作される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーターの制御下にあるＣＴＬＡ４をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含むように操作される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーターの制御下にあるＩＬ１０をコードする異種配列の細胞内への挿入と、プロモーターの制御下にあるＣＴＬＡ４をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含むように操作される。

【0068】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーターの制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含むように操作され、天然の調節性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）の少なくとも１つの抑制活性（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば、ＧｖＨＤの動物モデル）における免疫応答またはバイオマーカーの抑制）を示す。

【0069】

いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）は、発現コンストラクトに組み込まれる。いくつかの実施形態において、２つ以上の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列は、２つ以上の別々の発現コンストラクトに組み込むことができる。例えば、第１の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする第１の異種配列は、第１の発現コンストラクト内に提供され、第２の調節性Ｔ細胞促進分子をコードする第２の異種配列は、第２の別々の発現コンストラクト内に提供される。いくつかの実施形態において、発現コンストラクトはエピソーム発現コンストラクトである。いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）が、例えば、標的または非標的挿入として、ゲノムに挿入される。

【0070】

いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）は、ＴＣＲ遺伝子座位、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座位、ＴＮＦ遺伝子座位、ＩＦＮＧ遺伝子座位、ＩＬ１７Ａ遺伝子座位、ＩＬ６遺伝子座位、ＩＬ２遺伝子座位、またはアデノ随伴ウイルス統合部位１（ＡＡＶＳ１）座位から選択される部位に挿入することができる。

【0071】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞の集団は、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、遺伝子編集によるＴＮＦＡ配列の修飾（例えば、ノックダウン）を含み、細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、内在性ＴＮＦＡ配列の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦＡ（完全長野生型タンパク質またはｍＲＮＡ）の発現は、好適な対照（例えば、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによる定量でＴＮＦＡ遺伝子が修飾されていない対照）と比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはアッセイの検出限界未満まで低下する。（例えば、Ｔ細胞の集団における）ＴＮＦＡタンパク質及びｍＲＮＡの発現についてのアッセイは、当技術分野で知られており、本明細書で示している（実施例２及び３を参照）。ある特定の実施形態において、ＴＮＦＡのノックダウンは、実施例２及び３で示される方法によって２５００ｐｇ／ｍｌ以下のＴＮＦＡレベルをもたらす。

【0072】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞の集団は、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、遺伝子編集によるＩＦＮＧ配列の修飾（例えば、ノックダウン）を含み、細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、内在性ＩＦＮＧ配列の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、ＩＦＮＧ（完全長野生型タンパク質またはｍＲＮＡ）の発現は、好適な対照（例えば、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによる定量でＩＦＮＧ遺伝子が修飾されていない対照）と比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはアッセイの検出限界未満まで低下する。（例えば、Ｔ細胞の集団における）ＩＦＮＧタンパク質及びｍＲＮＡの発現についてのアッセイは、当技術分野で知られており、本明細書で示している（実施例２及び３を参照）。ある特定の実施形態において、ＩＦＮＧのノックダウンは、実施例２及び３で示される方法によって３００，０００ｐｇ／ｍｌ以下のＩＦＮＧレベルをもたらす。

【0073】

いくつかの実施形態において、遺伝子（例えば、ＴＮＦＡまたはＩＦＮＧ）の発現をノックダウンする修飾は、挿入、欠失、または置換のうちの１つ以上である。

【0074】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、例えば、遺伝子編集により、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）の挿入を含み、細胞の少なくとも３０％、３５％、好ましくは少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列の挿入を含む。いくつかの実施形態において、挿入された調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０）は、例えばＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによる定量で、例えば、調節性Ｔ細胞促進分子遺伝子が挿入されていない好適な対照と比較して、タンパク質またはｍＲＮＡの発現の統計的に有意な増加をもたらす。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、遺伝子編集によるＩＬ１０をコードする配列（複数可）の挿入を含み、細胞の少なくとも３０％、３５％、好ましくは少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、挿入またはＩＬ１０をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１０をコードする挿入配列（複数可）は、好適な対照と比較して、例えば、調節性Ｔ細胞促進分子において、タンパク質またはｍＲＮＡの発現の統計学的に有意な増加をもたらす。例えばＴ細胞の集団における、ＩＬ１０タンパク質及びｍＲＮＡの発現のアッセイは、本明細書に記載されており、また当技術分野で知られている（例えば、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー）。ある特定の実施形態において、ＩＬ１０のレベルは、実施例２及び３の方法による定量で、少なくとも３００ｐｇ／ｍｌである。

【0075】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、例えば、遺伝子編集により、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、ＣＴＬＡ４をコードする配列（複数可）の挿入を含み、細胞の少なくとも３０％、３５％、好ましくは少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、挿入またはＣＴＬＡ４をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ４をコードする挿入配列（複数可）は、好適な対照と比較して、例えば、調節性Ｔ細胞促進分子において、タンパク質またはｍＲＮＡの発現の統計学的に有意な増加をもたらす。例えばＴ細胞の集団における、ＣＴＬＡ４タンパク質及びｍＲＮＡの発現のアッセイは、本明細書に記載されており、また当技術分野で知られている（例えば、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー）。

【0076】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）、及び調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列の挿入を含むように操作されたＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団内のＴ細胞の少なくとも４０％、４５％、好ましくは少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（例えば、使用されるアッセイの検出限界内で）が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、異種の調節性Ｔ細胞促進分子を含むように操作される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団内のＴ細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、ＴＮＦＡをコードする配列（複数可）の修飾（例えば、ノックダウン）を含むように操作される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団内のＴ細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、ＩＦＮＧをコードする配列（複数可）の修飾（例えば、ノックダウン）を含むように操作される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団内のＴ細胞の少なくとも４０％、４５％、好ましくは少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列の挿入を含むように操作される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団内のＴ細胞の少なくとも３０％、３５％、好ましくは少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、ＩＬ１０をコードする配列（複数可）の挿入を含むように操作される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団内のＴ細胞の少なくとも３０％、３５％、好ましくは少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、ＣＴＬＡ４をコードする配列（複数可）の挿入を含むように操作される。

【0077】

いくつかの実施形態において、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の挿入とを含む、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ１７Ａ）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン２（ＩＬ２）、パーフォリン１（ＰＲＦ１）、グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）、またはグランザイムＢ（ＧＺＭＢ）をコードする内在性核酸配列の修飾であって、それぞれＩＬ１７Ａ、ＩＬ６、ＩＬ２、ＰＲＦ１、ＧＺＭＡ、またはＧＺＭＢの発現をノックダウンする、修飾をさらに含む。

【0078】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、遺伝子編集システムを用いて（例えば、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤を用いて）操作されている。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムを用いて操作される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓタイプＩＩ遺伝子編集システムを用いて（例えば、Ｃｐｆ１を用いて）操作される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムを用いて（例えば、ＳｐｙＣａｓ９を用いて）操作される。例示的なＣａｓ９配列が本明細書で提供される。

【0079】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡ遺伝子のノックダウンを提供するために、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡ遺伝子内の部位を特異的に標的化するガイドＲＮＡを用いて操作される。例示的な配列を表１及び表２に示す。また収載している各ガイド配列の標的のゲノム座標も示す。

【0080】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、本明細書で開示するガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いてノックダウンされたＩＦＮＧ遺伝子及びＴＮＦＡ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、（例えば、本明細書で開示するガイドＲＮＡを、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）とともに用いて）Ｔ細胞のＩＦＮＧ遺伝子及びＴＮＦＡ遺伝子内に切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック））を誘導することによって操作されるＴ細胞が開示される。当該方法は、例えば、免疫応答（複数可）（炎症や自己免疫を含む）を抑制するための細胞製品の製造で、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、ＩＦＮＧ遺伝子内の本明細書に記載の部位で、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）による標的特異的切断を媒介する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、ＴＮＦＡ遺伝子内の本明細書に記載の部位で、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）による標的特異的切断を媒介する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡが、前述の領域に結合する、または結合可能なガイド配列を含むことが理解されよう。

【0081】

表１に収載されたゲノム座標から選択されるゲノム座標に遺伝子修飾を含む操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団、例えば、ＩＦＮＧ内の任意の収載されたゲノム範囲内にインデルまたは置換変異を含む細胞が提供される。また、表２に収載されたゲノム座標から選択されるゲノム座標に遺伝子修飾を含む操作されたＴ細胞、例えば、ＴＮＦＡ内の任意の収載されたゲノム範囲内にインデルまたは置換変異を含む細胞も提供される。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、表１から選択されるゲノム座標領域内の修飾と、表２から選択されるゲノム座標領域の修飾とを含む。

【0082】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表１または表２の配列群から選択される配列に対し９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表１または表２の配列群から選択される配列に対し９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表１の配列群から選択される配列に対し９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列からなる群より選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを有するガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表１の配列群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドのガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表１の配列群から選択される配列に対し９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表１の配列群から選択される配列の１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表１の配列群から選択されるガイド配列を含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表２の配列群から選択される配列に対し９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列からなる群より選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを有するガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表２の配列群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドのガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表２の配列群から選択される配列に対し９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表２の配列群から選択される配列の１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、表２の配列群から選択されるガイド配列を含む。

【0085】

別段の記載がない限り、全体のゲノム座標は、ヒト参照ゲノムｈｇ３８に基づくものである。

【0086】

ある特定の実施形態において、ＩＦＮＧを標的化するガイド配列を含むガイドＲＮＡ及びＴＮＦＡを標的化するガイド配列を含むガイドＲＮＡが含まれる。

【表1-1】

【表1-2】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【0087】

ＴＮＦＡノックダウンのための非限定的な修飾ガイド配列を以下に示す（ｈｇ３８座標ｃｈｒ１２：６８１５８００１－６８１５８０２１）：
ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊ＧＡＧＣＡＵＣＣＡＡＡＡＧＡＧＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１１９）（配列中、ｍは、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチド／ヌクレオシド残基であり、＊は、残基間のホスホロチオエート結合を示し、大文字は残基を示し、好ましくはリボース糖を含む）

【0088】

ＩＦＮＧノックダウンのための非限定的な修飾ガイド配列を以下に示す（ｈｇ３８座標ｃｈｒ６：３１５７６８０５－３１５７６８２５）：
ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ＧＣＵＣＵＵＡＣＣＵＡＣＡＡＣＡＵＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１２０）

【0089】

例示的な修飾モックガイドを以下に示す（ｈｇ３８座標ｃｈｒ１：０－２０）：
ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＵ＊ＣＡＣＧＵＣＧＧＣＣＧＵＵＧＧＣＧＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１２１）

【0090】

いくつかの実施形態において、本明細書では、ガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いて、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム座位内に異種ＩＬ１０核酸を導入または挿入することによって操作されたＴ細胞、及び（例えば、操作されたＴ細胞を作製するための）異種ＩＬ１０核酸を含むコンストラクト（例えば、ドナーコンストラクトまたは鋳型）が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書では、例えば、ガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いて、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム座位内に異種ＩＬ１０を発現することによって操作されたＴ細胞、及び異種ＩＬ１０核酸を含むコンストラクト（例えば、ドナー）が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書では、例えば、ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）とともに用いて、ＩＬ１０遺伝子を挿入するために、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム内に切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック））を誘導することによって操作されるＴ細胞が開示される。また、当該方法によって作製された細胞及び細胞集団も提供される。

【0091】

いくつかの実施形態において、本明細書では、ガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いて、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム座位内に異種ＣＴＬＡ４核酸を導入または挿入することによって操作されたＴ細胞、及び（例えば、操作されたＴ細胞を作製するための）異種ＣＴＬＡ４核酸を含むコンストラクト（例えば、ドナーコンストラクトまたは鋳型）が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書では、例えば、ガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いて、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム座位内に異種ＣＴＬＡ４を発現することによって操作されたＴ細胞、及び異種ＣＴＬＡ４核酸を含むコンストラクト（例えば、ドナー）が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書では、例えば、ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）とともに用いて、ＣＴＬＡ４遺伝子を挿入するために、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム内に切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック））を誘導することによって操作されるＴ細胞が開示される。また、当該方法によって作製された細胞及び細胞集団も提供される。

【0092】

いくつかの実施形態において、本明細書では、ガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いて、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム座位内に異種ＣＴＬＡ４核酸及び異種ＩＬ１０核酸を導入または挿入することによって操作されたＴ細胞、ならびに（例えば、操作されたＴ細胞を作製するための）異種ＣＴＬＡ４核酸及び異種ＩＬ１０核酸を含む１つ以上のコンストラクト（例えば、ドナーコンストラクトまたは鋳型）が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書では、例えば、ガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いて、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム座位から異種ＣＴＬＡ４及び異種ＩＬ１０を発現することによって操作されたＴ細胞、ならびに異種ＣＴＬＡ４核酸及び異種ＩＬ１０核酸を含む１つ以上のコンストラクト（例えば、ドナーコンストラクトまたは鋳型）が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書では、例えば、ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）とともに用いて、ＣＴＬＡ４遺伝子及びＩＬ１０遺伝子を挿入するために、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム内に切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック））を誘導することによって操作されるＴ細胞が開示される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、２つ以上の調節性Ｔ細胞促進分子、例えばＩＬ１０及びＣＴＬＡ４をコードする配列（複数）を挿入するために、本明細書に記載の部位で、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えばＣａｓヌクレアーゼ）による標的特異的切断を媒介する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、前述の領域に結合する、または結合可能なガイド配列を含むことが理解されよう。また、当該方法によって作製された細胞及び細胞集団も提供される。

【0093】

調節性Ｔ細胞促進分子の例示的なヌクレオチド及びポリペプチド配列を以下に示す。ポリペプチド配列をコードする代替的なヌクレオチド配列（代替的な天然に存在するバリアント及び非ヒトホモログを含む）を特定するための方法は、当技術分野で知られている。例示的なＩＬ１０及びＣＴＬＡ４をコードする核酸配列を以下に示す。他の好適なＩＬ１０及びＣＴＬＡ４配列も当技術分野で知られている。例えば、Ｇｏｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＩＬ－１０ ｖａｒｉａｎｔｓ ｅｌｉｃｉｔ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏ－ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｏｗ ｌｉｇａｎｄ ｄｏｓｅｓ，ＢｉｏＲｘｉｖ（２０２０）及びＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ＣＴＬＡ４－Ｉｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）を参照（これらの内容及び配列は、参照により本明細書に援用される）。代替的なＩＬ１０及びＣＴＬＡ４配列を特定するための方法も当技術分野で知られている。例えば、上記を参照。本明細書に記載の任意の核酸配列、アミノ酸配列、またはアミノ酸配列をコードする核酸配列のいずれかに対し、例えば変異または切断により、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列も企図されている。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される任意のアミノ酸配列をコードする核酸配列も提供される。

【0094】

非限定的で例示的なＩＬ１０をコードする核酸配列を示す。
野生型ＩＬ１０：
ＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＡＡＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＴＧＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＣＴＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣ（配列番号１２２）
高親和性ＩＬ１０（Ｎ３６Ｉ、Ｎ１１０Ｉ、Ｋ１１７Ｎ、Ｆ１２９Ｌ）：
ＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＡＡＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧａｔｃＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＴＧＴＣＡＴＣＧＡｃｔｃＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＣＴＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣ（配列番号１２３）

【0095】

非限定的で例示的なＩＬ１０のアミノ酸配列を示す。
野生型ＩＬ１０：
ＭＨＳＳＡＬＬＣＣＬＶＬＬＴＧＶＲＡＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号１２４）
高親和性ＩＬ１０（Ｎ３６Ｉ、Ｎ１１０Ｉ、Ｋ１１７Ｎ、Ｆ１２９Ｌ）：
ＭＨＳＳＡＬＬＣＣＬＶＬＬＴＧＶＲＡＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＩＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＩＳＬＧＥＮＬＮＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＬＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号１２５）

【0096】

非限定的で例示的なＣＴＬＡ４をコードする核酸配列を示す。
野生型ＣＴＬＡ４：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＴＣＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＣＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＣＴＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＡＣＴＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＧＧＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＧＴＡＣＴＴＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＡＡＣ（配列番号１２６）
高親和性ＣＴＬＡ４（ベラタセプト；結合ドメイン：Ａ２９Ｙ、Ｌ１０４Ｅ）：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＴＣＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＣＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＣＴＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＴＡＴＧＡＧＧＧＧＡＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＡＣＴＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＧＧＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＧＴＡＣＴＴＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＡＡＣ（配列番号１２７）
高親和性ＣＴＬＡ４（結合ドメイン：Ａ２９Ｈ）：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＴＣＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＣＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＴＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＣＴＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＡＣＴＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＧＧＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＧＴＡＣＴＴＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＡＡＣ（配列番号１２８）
高親和性ＣＴＬＡ４（結合ドメイン：Ｋ２８Ｈ、Ａ２９Ｈ）：
ＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＴＣＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＣＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＣＴＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＡＣＴＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＧＧＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＧＴＡＣＴＴＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＡＡＣ（配列番号１２９）

【0097】

非限定的で例示的なＣＴＬＡ４のアミノ酸配列を示す。
野生型ＣＴＬＡ４：
ＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＬＮＬＡＴＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＬＬＦＩＰＶＦＣＫＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ（配列番号１３０）
高親和性ＣＴＬＡ４（ベラタセプト；結合ドメイン：Ａ２９Ｙ、Ｌ１０４Ｅ）：
ＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＬＮＬＡＴＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＬＬＦＩＰＶＦＣＫＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＹＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＥＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ（配列番号１３１）
高親和性ＣＴＬＡ４（結合ドメイン：Ａ２９Ｈ）：
ＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＬＮＬＡＴＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＬＬＦＩＰＶＦＣＫＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＨＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ（配列番号１３２）
高親和性ＣＴＬＡ４（結合ドメイン：Ｋ２８Ｈ、Ａ２９Ｈ）：
ＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＬＮＬＡＴＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＬＬＦＩＰＶＦＣＫＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＨＨＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ（配列番号１３３）

【0098】

いくつかの実施形態において、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、天然に存在する調節性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）の少なくとも１つの抑制活性（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば、ＧｖＨＤの動物モデル）における免疫応答（複数可）またはバイオマーカーの抑制）を示す。いくつかの実施形態において、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、ｎＴｒｅｇと比較して改善された抑制活性（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば、ＧｖＨＤの動物モデル）における免疫応答またはバイオマーカーの抑制の増加）を示す。例えば、ＧｖＨＤのマウスモデルにおいて、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与したマウスは、対照（例えば、ＰＢＭＣを投与したマウス）と比較して改善された生存率を示す。

【0099】

Ｂ．標的化受容体
いくつかの実施形態において、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞は、標的化受容体をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入をさらに含む。標的化受容体をコードする配列（複数可）は、プロモーター配列（例えば内在性プロモーターまたは異種プロモーター）の制御下にある。

【0100】

いくつかの実施形態において、標的化受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または細胞外受容体部分の結合時にＴ細胞を活性化可能な、内部シグナル伝達ドメイン内で少なくとも膜貫通ドメインを介し作用可能に結合した細胞表面分子の受容体である。いくつかの実施形態において、標的化受容体は、細胞が、標的部位（例えば、生物内の特定の細胞または組織）に結合するのを可能にする、細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面に存在する受容体であり得る。標的化受容体は抗原受容体である必要はなく、例えば、標的化受容体は、インテグリンを標的化可能なＲＧＤペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、標的化受容体は、ＭＡｄＣＡＭ－１、ＴＮＦＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＶＣＡＭ－１、シトルリン化ビメンチン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＯＧ（ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）、プロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）、ＣＤ１９分子（ＣＤ１９）、ＣＤ２０分子（ＣＤ２０）、ＴＮＦＲＳＦ１７、ジペプチジルペプチダーゼ様６（ＤＰＰ６）、溶質輸送体ファミリー２メンバー２（ＳＣＬ２Ａ２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ２）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、及びＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）からなる群より選択される分子を標的化する。

【0101】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢ１、ＩＤＯ１、ＥＮＴＰＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＩＬ２２、ＡＲＥＧ、ＩＬ３５、ＧＡＲＰ、ＣＤ２７４、ＦＯＸＰ３、ＩＫＺＦ２、ＥＯＳ、ＩＲＦ４、ＬＥＦ１、及びＢＡＣＨ２から選択される調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）の挿入と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ（例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１を標的化するＣＡＲ））をコードする配列（複数可）の挿入とを含む。

【0102】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＩＬ１０をコードする配列（複数可）の挿入と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ（例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１を標的化するＣＡＲ））をコードする配列（複数可）の挿入とを含む。

【0103】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＣＴＬＡ４をコードする配列（複数可）の挿入と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ（例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１を標的化するＣＡＲ））をコードする配列（複数可）の挿入とを含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＩＬ１０をコードする配列（複数可）の挿入と、ＣＴＬＡ４をコードする配列（複数可）の挿入と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ（例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１を標的化するＣＡＲ））をコードする配列（複数可）の挿入とを含む。

【0105】

いくつかの実施形態において、標的化受容体をコードする配列（複数可）は、発現コンストラクトに組み込まれる。いくつかの実施形態において、標的化受容体をコードする配列（複数可）を含む発現コンストラクトは、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）をさらに含み、例えば、標的化受容体をコードする配列（複数可）及び調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）は、同じ発現コンストラクトに組み込まれる。いくつかの実施形態において、標的化受容体をコードする配列（複数可）を含む発現コンストラクトは、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）をさらに含まず、例えば、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）は、別々の発現コンストラクトに組み込まれる。いくつかの実施形態において、標的化受容体をコードする配列を含む発現コンストラクトはエピソーム発現コンストラクトである。いくつかの実施形態において、標的化受容体をコードする配列（複数可）が、例えば、標的または非標的挿入として、ゲノムに挿入される。

【0106】

いくつかの実施形態において、標的化受容体をコードする配列（複数可）は、ＴＣＲ遺伝子座位、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座位、ＴＮＦ遺伝子座位、ＩＦＮＧ遺伝子座位、ＩＬ１７Ａ遺伝子座位、ＩＬ６遺伝子座位、ＩＬ２遺伝子座位、またはアデノ随伴ウイルス統合部位１（ＡＡＶＳ１）座位から選択される部位に挿入することができる。

【0107】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、遺伝子編集による標的化受容体をコードする配列（複数可）の挿入を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列の挿入と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列（複数可）の挿入とを含むように操作されているＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団内のＴ細胞の少なくとも４０％、４５％、好ましくは少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、標的化受容体をコードする配列（複数可）の挿入を含むように操作される。Ｔ細胞集団は、当分野で知られている選択方法を用いて、標的受容体を有する細胞集団について濃縮することできるものと理解される。

【0108】

いくつかの実施形態において、本明細書では、ガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いて、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム座位内に標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）核酸を導入または挿入することによって操作されたＴ細胞、及び（例えば、操作されたＴ細胞を作製するための）標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）核酸を含むコンストラクト（例えば、ドナーコンストラクトまたは鋳型）が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書では、例えば、ガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いて、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム座位内に標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現することによって操作されたＴ細胞、及び標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）を含むコンストラクト（例えば、ドナー）が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書では、例えば、ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）とともに用いて、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）を挿入するために、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のゲノム内に切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック））を誘導することによって操作されるＴ細胞が開示される。また、当該方法によって作製された細胞及び細胞集団も提供される。

【0109】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）を含む操作されたＴ細胞に、例えば、特定の細胞、組織、または器官に対する標的特異性を付与可能である。

【0110】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を胃腸系に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、またはクローン病などの障害における免疫応答を抑制するために、ＭＡｄＣＡＭ－１を標的化するＣＡＲである。

【0111】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を炎症組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、またはクローン病などの障害における免疫応答を抑制するために、ＴＮＦＡを標的化するＣＡＲである。

【0112】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を内皮細胞に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、クローン病などの障害における免疫応答（複数可）（炎症を含む）を抑制するために、ＣＥＡＣＡＭ６を標的化するＣＡＲである。

【0113】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を内皮細胞を含む組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、クローン病及び多発性硬化症などの障害における免疫応答を抑制するために、ＶＣＡＭ－１を標的化するＣＡＲである。

【0114】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、操作されたＴ細胞を滑膜組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、関節リウマチなどの障害における免疫応答を抑制するために、シトルリン化ビメンチンを標的化するＣＡＲである。

【0115】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を神経組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、多発性硬化症などの障害における免疫応答を抑制するために、ＭＢＰ、ＭＯＧ、またはＰＬＰ１を標的化するＣＡＲである。

【0116】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞をＢ細胞に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、多発性硬化症及び全身性エリテマトーデスなどの障害における免疫応答を抑制するために、ＣＤ１９を標的化するＣＡＲである。

【0117】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞をＢ細胞に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、多発性硬化症及び全身性エリテマトーデスなどの障害における免疫応答を抑制するために、ＣＤ２０を標的化するＣＡＲである。

【0118】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を、成熟Ｂリンパ球を含む組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、全身性エリテマトーデスなどの障害における免疫応答を抑制するために、ＴＮＦＲＳＦ１７を標的化するＣＡＲである。

【0119】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、ＳＣＬ２Ａ２を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、ＤＰＰ６を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、ＧＡＤ２を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、ＤＳＧ３を標的化する。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を標的化する。

【0120】

さらなるＣＡＲ標的（例えば、炎症性抗原）が当技術分野で知られている。例えば、ＷＯ２０２００９２０５７Ａ１を参照（この内容は、全体として本明細書に援用される）。いくつかの実施形態において、挿入は、操作されたＴ細胞、操作されたＴ細胞の集団、組織、目的とする体液、または操作されたＴ細胞を含む組織培養培地中のタンパク質またはｍＲＮＡの量を検出することによって評価することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子編集による挿入は、シークエンシング、例えば次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって評価することができる。標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）のタンパク質及びｍＲＮＡ発現のアッセイは、本明細書に記載されており、当技術分野で知られている。

【0121】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、異種の標的受容体を含まない。

【0122】

Ｃ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態において、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、ＴＣＲ遺伝子配列（複数可）をコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）をさらに含む。

【0123】

いくつかの実施形態において、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入と、標的化受容体をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、ＴＣＲ遺伝子配列（複数可）をコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）をさらに含む。

【0124】

概して、ＴＣＲは、α及びβの２つのＴＣＲポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体受容体分子である。ノックダウンのために標的化する好適なα及びβゲノム配列または座位は当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα鎖遺伝子配列（例えば、ＴＲＡＣ）の修飾（例えば、ノックダウン）を含む。例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２８７５５；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２７７７３４（Ｔ細胞受容体アルファコンスタント）、ＵＳ２０１８／０３６２９７５、及びＷＯ２０２００８１６１３を参照。

【0125】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢ１、ＩＤＯ１、ＥＮＴＰＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＩＬ２２、ＡＲＥＧ、ＩＬ３５、ＧＡＲＰ、ＣＤ２７４、ＦＯＸＰ３、ＩＫＺＦ２、ＥＯＳ、ＩＲＦ４、ＬＥＦ１、及びＢＡＣＨ２から選択される調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）の挿入と、ＴＣＲ遺伝子配列（複数可）をコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）とを含む。

【0126】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４をコードする配列（複数可）の挿入と、ＴＣＲ遺伝子配列（複数可）をコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）とを含む。

【0127】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）の挿入と、内在性ＴＣＲ遺伝子配列（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子配列）の修飾（例えば、ノックダウン）とを含む。

【0128】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、

【0129】

以下から選択される、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）：
ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢ１、ＩＤＯ１、ＥＮＴＰＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＩＬ２２、ＡＲＥＧ、ＩＬ３５、ＧＡＲＰ、ＣＤ２７４、ＦＯＸＰ３、ＩＫＺＦ２、ＥＯＳ、ＩＲＦ４、ＬＥＦ１、及びＢＡＣＨ２、の挿入と、内在性ＴＣＲ遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子配列）の修飾（例えば、ノックダウン）とを含む。

【0130】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４をコードする配列（複数可）の挿入と、ＴＣＲ遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子配列）の修飾（例えば、ノックダウン）とを含む。

【0131】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）の挿入と、内在性ＴＣＲ遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子配列）の修飾（例えば、ノックダウン）とを含む。

【0132】

任意のこれらの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、本明細書に記載の標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１を標的化するＣＡＲ）をコードする配列（複数可）の挿入をさらに含むことができる。

【0133】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、遺伝子編集によるＴＲＣ遺伝子配列の修飾（例えば、ノックダウン）を含み、細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、内在性ＴＲＣ遺伝子配列の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、ＴＲＣは、好適な対照（例えば、ＴＲＣ遺伝子が修飾されていない対照）と比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはアッセイの検出限界未満まで低下する。ＴＲＣタンパク質及びｍＲＮＡ発現のアッセイは当技術分野で知られている。

【0134】

いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団は、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、遺伝子編集による標的化受容体をコードする配列（複数可）の挿入を含む。

【0135】

いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列の挿入と、少なくとも１つのＴＣＲ遺伝子配列の修飾（例えば、ノックダウン）とを含むように操作されているＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団内のＴ細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、少なくとも１つのＴＣＲ遺伝子配列の修飾（例えば、ノックダウン）を含むように操作される。

【0136】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲ遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子）内の部位を特異的に標的化するガイドＲＮＡが、ＴＣＲ遺伝子の修飾（例えば、ノックダウン）を提供するために使用される。

【0137】

いくつかの実施形態において、ＴＣＲ遺伝子は、ガイドＲＮＡをＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とともに用いて、Ｔ細胞内で修飾（例えば、ノックダウン）される。いくつかの実施形態において、本明細書では、例えば、ガイドＲＮＡを、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）とともに用いて、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子内に切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック））を誘導することによって操作されるＴ細胞が開示される。当該方法は、例えば、免疫応答を抑制するための細胞製品の製造で、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。

【0138】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＴＣＲ遺伝子内の本明細書に記載の部位で、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）による標的特異的切断を媒介する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡが、前述の領域に結合する、または結合可能なガイド配列を含むことが理解されよう。

【0139】

Ｄ．ガイドＲＮＡ
本明細書の任意の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含むことができる。本明細書に記載の各組成物及び方法実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）上で会合しても、別々のＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）上にあってもよい。ｓｇＲＮＡの文脈において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介し、共有結合することができる。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではないヌクレオチド間の１つ以上の結合を含む。

【0140】

本明細書に記載の組成物、使用、及び方法実施形態の各々において、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ分子を「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として含むことができる。ｄｇＲＮＡは、例えば本明細書で示されているガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１及び第２のＲＮＡ分子は、共有結合していない場合があるが、ｃｒＲＮＡの一部とｔｒＲＮＡの一部との間の塩基対合を介してＲＮＡ二重鎖を形成することができる。

【0141】

本明細書に記載の組成物、使用、及び方法実施形態の各々において、ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子を「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」として含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡと共有結合している本明細書で示されているガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（またはその一部）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、本明細書で示されているガイド配列の１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合している。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部とｔｒＲＮＡの一部との間の塩基対合を介してステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して共有結合している。

【0142】

いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するｔｒＲＮＡ配列の全てまたは一部を含むことができる。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、切断または修飾野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに依存する。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、または１００個を超えるヌクレオチドを含む、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、ある特定の二次構造、例えば、１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造などの二次構造を含むことができる。

【0143】

いくつかの実施形態において、標的配列または領域は、ガイドＲＮＡのガイド配列に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡのガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、標的配列及びｇＲＮＡのガイド配列は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態において、ｇＲＮＡの標的配列及びガイド配列は、１つのミスマッチを含むことができる。例えば、標的配列及びｇＲＮＡのガイド配列は、１、２、３、４、または５個のミスマッチを含むことができ、ガイド配列の全長は約２０または２０である。いくつかの実施形態において、標的配列及びｇＲＮＡのガイド配列は、ガイド配列が約２０または２０ヌクレオチドである場合、１～４ミスマッチを含むことができる。

【0144】

本明細書の任意の実施形態において、本明細書のガイド配列の各々は、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチド、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列（５’→３’方向）：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１３４）をさらに含むことができる。ｓｇＲＮＡの場合、上記のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチド、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１３５）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１３６）をさらに含むことができる。

【0145】

任意の実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、プロトスペーサー（ｐｒｏｐｏｓｐａｃｅｒ）隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流の領域に結合する。当業者には理解されるであろうように、ＰＡＭ配列は、標的配列を含む鎖とは反対側の鎖に生じ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって異なる。すなわち、ＰＡＭ配列は、標的鎖（ガイドＲＮＡが結合する標的配列を含む鎖）の相補鎖上にある。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは、ＮＧＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＮＮＧ（Ａ／Ｃ）ＴＴ、及びＮＮＮＮＲＹＡＣからなる群より選択される。

【0146】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるガイドＲＮＡ配列は、ＰＡＭ配列に隣接する配列に相補的である。

【0147】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ配列は、ヒト参照ゲノムｈｇ３８の座標に従って本明細書の表から選択されるゲノム領域内の配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ配列は、本明細書の表から選択されるゲノム領域内からの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続ヌクレオチドを含む配列に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ配列は、本明細書の表から選択されるゲノム領域にまたがる５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続ヌクレオチドを含む配列に相補的な配列を含む。

【0148】

本明細書で開示するガイドＲＮＡは、二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす標的特異的切断を媒介する。本明細書で開示するガイドＲＮＡは、一本鎖切断（ＳＳＢまたはニック）をもたらす標的特異的切断を媒介する。

【0149】

Ｅ．化学修飾ｇＲＮＡ
本明細書の任意の実施形態において、ｇＲＮＡは化学修飾することができる。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、カノニカルなＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、またはそれに加えて使用される１つ以上の非天然または天然に存在する構成要素または構成の存在を説明するために、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、ノンカノニカルなヌクレオシドまたはヌクレオチドで合成され、ここでは「修飾」と呼ばれる。修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における非結合リン酸酸素の一方もしくは両方、または結合リン酸酸素の一方もしくは両方の改変（例えば、置換）（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの、リボース糖の構成要素の改変（例えば、置換）（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）「脱ホスホ」リンカーによるリン酸部分のホールセール置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）天然に存在する核酸塩基の修飾または置換（ノンカノニカルな核酸塩基を含む）（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボース－リン酸骨格の置換または修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分、キャップ、もしくはリンカーの結合体化（このような３’または５’キャップ修飾は、糖または骨格修飾を含み得る）、及び（ｖｉｉ）糖の修飾または置換（例示的な糖修飾）、のうちの１つ以上を含むことができる。

【0150】

上に挙げたような化学修飾を組み合わせて、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の修飾を有し得るヌクレオシド及びヌクレオチド（総称して「残基」）を含む修飾ｇＲＮＡを得ることができる。例えば、修飾残基は、修飾糖及び修飾核酸塩基を有することができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡのあらゆる塩基が修飾され、例えば、全ての塩基がホスホロチオエート基などの修飾リン酸基を有する。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基で置換されている。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端またはその近傍に少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端またはその近傍に少なくとも１つの修飾残基を含む。ある特定のｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端及び３’末端に、またはその付近に少なくとも１つの修飾残基を含む。

【0151】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、ＷＯ２０１８／１０７０２８（この内容は、参照により関連部分が本明細書に援用される）に開示されている修飾パターンのうちの１つを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、ＵＳ２０１７０１１４３３４（参照により本明細書に援用される）に開示されている構造／修飾パターンのうちの１つを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するガイドＲＮＡは、ＷＯ２０１７／１３６７９４、ＷＯ２０１７００４２７９、ＵＳ２０１８１８７１８６、ＵＳ２０１９０４８３３８（参照により本明細書に援用される）に開示されている構造／修飾パターンのうちの１つを含む。

【0152】

Ｆ．ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡ
いくつかの実施形態において、細胞または方法は、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼ）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。Ｃａｓ９ ＯＲＦは、本明細書で提供され、当技術分野で知られている。一例として、Ｃａｓ９ ＯＲＦは、コード配列が１つ以上のアミノ酸に対する１つ以上の代替コドンを含むように、コドン最適化することができる。本明細書で使用する場合、「代替コドン」とは、所与のアミノ酸に対するコドン使用のバリエーションを指し、所与の発現システムにとって好ましいまたは最適化されたコドン（コドン最適化）である場合もそうでない場合もある。好ましいコドン使用、または所与の発現システムで十分に許容されるコドンは、当技術分野で知られている。ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１６／１０６１２１、及びＷＯ２０１９／０６７９１０のＣａｓ９コード配列、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びＣａｓ９タンパク質配列が、参照により本明細書に援用される。詳細には、ＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０４４９］の表のＯＲＦ及びＣａｓ９アミノ酸配列、ならびにＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０２１４］～［０２３４］のＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＯＲＦが、参照により本明細書に援用される。

【0153】

いくつかの実施形態において、修飾ＯＲＦは、少なくとも１つ、複数、または全てのウリジン位置に修飾ウリジンを含むことができる。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、５位で、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、１位で、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで修飾されたシュードウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはこれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンはシュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンはＮ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンとＮ１－メチル－シュードウリジンとの組合せである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンと５－メトキシウリジンとの組合せである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジンと５－メトキシウリジンとの組合せである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンとＮ１－メチル－シュードウリジンとの組合せである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、シュードウリジンと５－ヨードウリジンとの組合せである。いくつかの実施形態において、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンと５－メトキシウリジンとの組合せである。

【0154】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示するｍＲＮＡは５’キャップ（例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２）を含む。５’キャップは概して、７－メチルグアニンリボヌクレオチド（これはさらに修飾されてもよく、例えば、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に結合した７－メチルグアニン３’－メトキシ－５’－トリホスフェートを含むキャップアナログである）であり、５’－三リン酸を介し、ｍＲＮＡの５’→３’鎖の最初のヌクレオチド（すなわち、第１のキャップ近位ヌクレオチド）の５’位に結合している。Ｃａｐ０において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースは、いずれも２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１において、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ２’－メトキシ及び２’－ヒドロキシルを含む。例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｎ－７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｎ－７１３３）を参照。Ｃａｐ２において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースは、いずれも２’－メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（３３）：１２０２５－３０；Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照。

【0155】

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化（ポリＡ）テールをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアデニン（配列番号１４７）、任意選択で最大３００個のアデニン（配列番号１４８）を含む。いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む（配列番号１４９）。

【0156】

Ｇ．操作のためのＴ細胞
本明細書で提供される操作された細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が濃縮された細胞集団から調製される。このような細胞は、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを含む様々な供給元から市販されている新鮮なｌｅｕｋｏｐａｋ試料から容易に得ることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、市販のキットを用いて通例の方法で、例えば、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを用いたネガティブセレクションにより、単離することができる。ただし、他の供給源からのＣＤ４＋Ｔ細胞の調製方法も当技術分野で知られている。例えば、多能性細胞、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ、例えば、骨髄もしくは臍帯血から単離されたもの）、造血前駆細胞（例えば、リンパ球様前駆細胞）、または間葉幹細胞（ＭＳＣ）を使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を得ることができる。多能性細胞は複数の細胞型に発達可能であるが、分化の幅は万能性細胞よりも限定的である。多能性細胞は、確立された細胞株に由来することもあれば、ヒトの骨髄または臍帯から単離されることもある。例えば、ＨＳＣは、Ｇ－ＣＳＦ誘導性動員、プレリキサホル誘導性動員、またはこれらの組合せに従って、患者または健康ドナーから単離することができる。血液または骨髄からＨＳＣを分離するためには、血液または骨髄中の細胞を、不要な細胞に結合する抗体（例えば、ＣＤ４及びＣＤ８（Ｔ細胞）、ＣＤ４５（Ｂ細胞）、ＧＲ－Ｉ（顆粒球）、及びＩａｄ（分化抗原提示細胞）に対する抗体）によってふるい分けることができる（例えば、Ｉｎａｂａ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１６９３－１７０２を参照）。ＣＤ４＋Ｔ細胞への分化を促進する方法は、当技術分野で知られている。

【0157】

ＩＩＩ．送達の方法
本明細書で開示するガイドＲＮＡ、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）、及び核酸配列は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４）をコードする配列（複数可）の挿入とを含み、任意選択で、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列（複数可）の挿入をさらに含み、任意選択で、ＴＣＲ配列（複数可）の修飾（例えば、ノックダウン）をさらに含む、細胞または細胞の集団に、当技術分野で利用可能な様々な既知の好適な方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで送達することができる。ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤、及び核酸コンストラクトは、必要に応じて、同じまたは異なる送達方法を用いて、個別にまたは任意の組合せで一緒に送達することができる。

【0158】

従来的なウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子送達方法を使用して、細胞（例えば、哺乳類細胞）及び標的組織内にガイドＲＮＡならびにＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤及びドナーコンストラクトを導入することができる。本明細書でさらに提供されるように、非ウイルスベクター送達システム核酸、例えば、非ウイルスベクター、プラスミドベクター、及び例えば裸の核酸、ならびに送達ビヒクル（例えば、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、またはポロキサマー）と複合体化した核酸。ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含む。

【0159】

核酸の非ウイルス性送達のための方法及び組成物としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ＬＮＰ、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸の核酸（例えば、裸のＤＮＡ／ＲＮＡ）、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤強化取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を用いたソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。

【0160】

ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤、及びドナーコンストラクトを単独でまたは組み合わせて含む様々な送達システム（例えば、ベクター、リポソーム、ＬＮＰ）も、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞または細胞培養物に投与することができる。投与は、分子と、血液、体液、または細胞との最終的な接触を導入するために通常使用される任意の経路（限定されるものではないが、注射、点滴、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む）によって行われる。このような核酸を投与する好適な方法が利用可能であり、当業者に周知されている。

【0161】

ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で開示する任意の組成物、例えば、（例えば、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡを修飾（例えば、ノックダウン）するために）本明細書に記載のガイド配列のいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡ、または調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０）、もしくは標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）をコードする配列（複数可）を含むドナーコンストラクト、をコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードする配列も含む。ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の組成物のいずれか１つ以上、または任意の組合せでコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、例えば、プロモーター、エンハンサー、及び調節配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のガイド配列のいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを含むベクターは、本明細書で開示するように、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）も含む。

【0162】

ある特定の実施形態において、本開示は、調節性Ｔ細胞促進分子及び標的化受容体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを提供する。このようなベクターは、調節性Ｔ細胞促進分子のコード配列も含む細胞に対し、受容体の存在に基づく細胞の選択を可能にする。細胞表面分子の存在に基づくポジティブ及びネガティブセレクションは、当技術分野で知られている。

【0163】

いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つのコピーを含む。他の実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡの複数のコピーを含む。複数のガイドＲＮＡを用いた実施形態において、これらのガイドＲＮＡは、異なる標的配列を標的化するように同一ではないこともあれば、同じ標的配列を標的化する点で同一であることもある。ベクターが複数のガイドＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、各ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ先導ＤＮＡヌクレアーゼを有する複合体（例えば、Ｃａｓ ＲＮＰ複合体）内で、他の異なる特性（例えば、活性または安定性）を有し得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写制御配列または翻訳制御配列（例えば、プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ）に作用可能に結合することができる。１つの実施形態において、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター（例えば、ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ３）またはｔＲＮＡキメラであり得る。Ｍｅｆｆｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１５ ２１：１６８３－９；Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ ３５：２６２０－２６２８を参照。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）により認識され得る。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに対し作用可能に結合していてもよい。他の実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＨ１プロモーターに対し作用可能に結合していてもよい。複数のガイドＲＮＡを用いた実施形態において、発現の駆動に使用されるプロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドと、ガイドＲＮＡのｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドとを、同じベクター上で提供することができる。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドとｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドとを、同じプロモーターによって駆動することができる。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを単一の転写物に転写することができる。例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡを形成するために単一の転写物から処理することができる。代替的に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に転写することができる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、同じベクター上の対応するプロモーターによって駆動することができる。また他の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、異なるベクターによってコードすることができる。

【0164】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列を含む同じベクター上に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの発現、及びＣａｓタンパク質などのＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の発現は、自らの対応するプロモーターによって駆動することができる。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの発現は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の発現を駆動するプロモーターと同じプロモーターによって駆動することができる。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質転写物などのＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、単一の転写物内に含まれ得る。例えば、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質転写物などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の非翻訳領域（ＵＴＲ）内に存在し得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、転写物の５’ＵＴＲ内にあり得る。他の実施形態において、ガイドＲＮＡは、転写物の３’ＵＴＲ内にあり得る。いくつかの実施形態において、転写物の細胞内半減期は、ガイドＲＮＡを転写物の３’ＵＴＲ内に収容して３’ＵＴＲの長さを短くすることにより、低減することができる。追加の実施形態において、ガイドＲＮＡは、転写物のイントロン内にあり得る。いくつかの実施形態において、好適なスプライス部位を、内部にガイドＲＮＡが位置するイントロンに付加して、ガイドＲＮＡが転写物から適切にスプライシングされるようにすることができる。いくつかの実施形態において、同じベクター由来のＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）及びガイドＲＮＡの一時的に極めて近接した発現は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ複合体のより効率的な形成を促進することができる。

【0165】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡまたはＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列は、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４）または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）をコードする配列を含むコンストラクトを含む同じベクター上に位置することができる。いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４）、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）をコードする配列を含むコンストラクト及びガイドＲＮＡ（またはＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤）が同じベクター上で近接することで、ガイドＲＮＡ／ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤によって作出される挿入部位へのコンストラクトの挿入をより効率的に促進することができる。

【0166】

ある特定の実施形態において、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターは、ベクター内またはゲノム挿入部位のいずれかに存在する単一のプロモーター下で発現するための複数のオープンリーディングフレームを含むことができる。このような実施形態において、自己切断ペプチドのためのコード配列がオープンリーディングフレーム間に含まれることがある。自己切断ペプチドは、例えば、２Ａペプチド、例えば、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、またはＴ２Ａペプチドであり得る。

【0167】

いくつかの実施形態において、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）であり得る）をコードするｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）であり得る）をコードするｍＲＮＡとを含む。１つの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）である。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであってもよい）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのリピート配列の全てまたは一部に隣接するガイド配列を含む、またはそれからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含む、またはそれからなる核酸は、天然にはｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡとともに見出されない核酸を含む、またはそれからなるベクター配列をさらに含むことができる。

【0168】

いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、１つのベクター内で連続していない核酸によってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、連続した核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一の核酸の対向鎖によってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一の核酸の同じ鎖によってコードされる。

【0169】

いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書で開示するように、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０）または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１）をコードする配列を含むドナーコンストラクトを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するドナーコンストラクトに加えて、ベクターは、本明細書に記載のガイドＲＮＡをコードする核酸、またはＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）をコードする核酸をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードする核酸は、本明細書で開示するドナーコンストラクトを含むベクターとは別のベクター上に各々または両方が存在する。任意の実施形態において、ベクターは、本明細書に記載のように、限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、調節配列を含む他の配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ドナーコンストラクトの調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０）、または標的化受容体（例えばＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１）の発現を駆動しない。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡ先導ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であり得る）をコードするｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡ先導ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であり得る）をコードするｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）である。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであってもよい）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのリピート配列の全てまたは一部に隣接するガイド配列を含む、またはそれからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含む、またはそれからなる核酸は、天然にはｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡとともに見出されない核酸を含む、またはそれからなるベクター配列をさらに含むことができる。

【0170】

いくつかの実施形態において、ベクターは環状であり得る。他の実施形態において、ベクターは線状であり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、脂質ナノ粒子、リポソーム、非脂質ナノ粒子、またはウイルスカプシドの中に封入することができる。ベクターの非限定的な例示としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、及び発現ベクターが挙げられる。

【0171】

いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、その野生型対応物から遺伝子修飾することができる。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを促進するための、またはベクターの１つ以上の特性を変化させるような１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含むことができる。このような特性としては、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組込み、複製、転写、及び翻訳を挙げることができる。いくつかの実施形態において、ウイルスが大きなサイズの外来配列をパッケージングできるように、ウイルスゲノムの一部を欠失させることができる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、強化された形質導入効率を有することができる。いくつかの実施形態において、宿主内でウイルスにより誘発される免疫応答を低減することができる。いくつかの実施形態において、ウイルスの配列をゲノムに組み込むのを促進するウイルス遺伝子（例えば、インテグラーゼ）を、ウイルスが非組込み型になるように変異させることができる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは複製欠損型であり得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ベクター上でのコード配列の発現を推進するための外来の転写制御配列または翻訳制御配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、ウイルスはヘルパー依存的であり得る。例えば、ウイルスは、ベクターをウイルス粒子に増幅及びパッケージングするのに要するウイルス構成要素（例えば、ウイルスタンパク質）を供給するための１つ以上のヘルパーウイルスを必要とする場合がある。このような場合、１つ以上のヘルパー構成要素（ウイルス構成要素をコードする１つ以上のベクターを含む）を、本明細書に記載のベクターシステムとともに細胞または細胞の集団に導入することができる。他の実施形態において、ウイルスはヘルパーフリーであり得る。例えば、ウイルスは、ヘルパーウイルスなしでベクターの増幅及びパッケージングが可能な場合がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターシステムは、ウイルスの増幅及びパッケージングに要するウイルス構成要素もコードすることができる。

【0172】

ウイルスベクターの非限定的な例示としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルパー依存的アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）ベクター、バクテリオファージＴ４、バキュロウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターであり得る。他の実施形態において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり得る。

【0173】

いくつかの実施形態において、「ＡＡＶ」とは、全ての血清型、亜型、及び天然に存在するＡＡＶならびに組換えＡＡＶを指す。「ＡＡＶ」は、ウイルス自身またはその派生物を指すために使用され得る。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びこれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびにネイティブな末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列が、当技術分野で知られている。このような配列は、文献及びＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースで見出すことができる。本明細書で使用する場合、「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ由来でない異種配列（すなわち、ＡＡＶとは異種の核酸配列）を含むＡＡＶベクターを指し、典型的には、目的とする異種ポリペプチドをコードする配列を含む。コンストラクトは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びこれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶカプシド配列を含むことができる。概して、異種核酸配列（導入遺伝子）は、少なくとも１つ、概して２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補性（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。

【0174】

いくつかの実施形態において、レンチウイルスは組込み型であり得る。いくつかの実施形態において、レンチウイルスは非組込み型であり得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態において、アデノウイルスは、パッケージング能力を増大させるために５’及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及びパッケージングシグナル（「Ｉ」）を除いた全てのウイルスコード領域がウイルスから欠失している、高クローニング能力または「ガットレス」アデノウイルスであり得る。また他の実施形態において、ウイルスベクターはＨＳＶ－１ベクターであり得る。いくつかの実施形態において、ＨＳＶ－１ベースベクターはヘルパー依存的であり、他の実施形態において、当該ベクターはヘルパー非依存的である。例えば、パッケージング配列のみを保持するアンプリコンベクターは、パッケージングのための構造的構成要素を有するヘルパーウイルスを要するが、必須でないウイルス機能を除去する３０ｋｂ欠失ＨＳＶ－１ベクターは、ヘルパーウイルスを要しない。追加の実施形態において、ウイルスベクターはバクテリオファージＴ４であり得る。いくつかの実施形態において、バクテリオファージＴ４は、当該ウイルスの頭部を空にした場合、任意の線状または環状のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をパッケージングすることができると考えられる。さらなる実施形態において、ウイルスベクターはバキュロウイルスベクターであり得る。またさらなる実施形態において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり得る。比較的小さいクローニング能力を有するＡＡＶまたは他のベクターを使用する実施形態において、本明細書で開示されているようなベクターシステムの全ての構成要素を送達するには、２つ以上のベクターの使用が必要となり得る。例えば、あるＡＡＶベクターがＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）のようなＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードする配列を含み、一方第２のＡＡＶベクターが１つ以上のガイド配列を含むことがある。

【0175】

いくつかの実施形態において、ベクターは、細胞内での１つ以上のヌクレアーゼ構成要素の発現を駆動することが可能であり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、細胞内に組み込まれたときに１つ以上のコード配列の発現を駆動するプロモーターを含まない（例えば、本明細書で例示されるように、細胞の特定のゲノム座位に挿入されたときに、細胞の内在性プロモーターを使用する）。異なるタイプの細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）内での発現を駆動するのに適したプロモーターが、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、プロモーターは野生型であり得る。他の実施形態において、プロモーターは、より効率的または効果的な発現のために修飾することができる。また他の実施形態において、プロモーターは、切断されてなおその機能を保持することができる。例えば、プロモーターは、ベクターをウイルスに適切にパッケージングするのに適した正常なサイズまたは低減したサイズを有することができる。

【0176】

いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載のＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）のようなＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、ベクターによりコードされたヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、ベクターシステムは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーを含むことができる。他の実施形態において、ベクターシステムは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の２つ以上のコピーを含むことができる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写制御配列または翻訳制御配列に対し作用可能に結合していてもよい。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターに対し作用可能に結合していてもよい。

【0177】

いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載のような調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４）、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）をコードする配列を含むコンストラクトのいずれか１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４）、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）の配列は、少なくとも１つの転写制御配列または翻訳制御配列に作用可能に結合することができる。いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４）、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）の配列は、少なくとも１つのプロモーターに作用可能に結合することができる。いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４）、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）の配列は、異種遺伝子の発現を駆動するプロモーターに結合していない。

【0178】

いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的、誘導的、または組織特異的であり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターであり得る。構成的プロモーターの非限定的な例示としては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、これらの機能的フラグメント、または前述のいずれかの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、プロモーターはＣＭＶプロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは切断されたＣＭＶプロモーターであり得る。他の実施形態において、プロモーターはＥＦ１ａプロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは誘導的プロモーターであり得る。誘導的プロモーターの非限定的な例示としては、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールにより誘導可能なプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、誘導的プロモーターは、基底の（誘導されていない）発現レベルが低いプロモーター、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であり得る。

【0179】

いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、Ｔ細胞内の発現に特異的なプロモーターであり得る。

【0180】

いくつかの実施形態において、組成物はベクターシステムを含む。いくつかの実施形態において、ベクターシステムは１つの単一ベクターを含むことができる。他の実施形態において、ベクターシステムは２つのベクターを含むことができる。追加の実施形態において、ベクターシステムは３つのベクターを含むことができる。多重化のために異なるガイドＲＮＡが使用される場合、またはガイドＲＮＡの複数のコピーが使用される場合、ベクターシステムは４つ以上のベクターを含むことができる。

【0181】

いくつかの実施形態において、ベクターシステムは、標的細胞に送達された後のみに発現を開始するための誘導的プロモーターを含むことができる。誘導的プロモーターの非限定的な例示としては、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールにより誘導可能なプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、誘導的プロモーターは、基底の（誘導されていない）発現レベルが低いプロモーター、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であり得る。

【0182】

追加の実施形態において、ベクターシステムは組織特異的プロモーターを含むことができる。

【0183】

非限定的な例示的ウイルスベクター配列を以下に示す。
ＣＴＬＡ４レンチウイルス挿入物（ヌクレオチド配列）
ＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＴＣＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＣＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＧＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＧＴＣＡＣＴＧＴＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＧＣＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＡＣＴＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＧＧＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＧＴＡＣＴＴＴＡＴＴＣＣＴＡＴＡＡＡＣＴＧＡ（配列番号１３７）
ＣＴＬＡ４レンチウイルス挿入物（アミノ酸配列）
ＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＬＮＬＡＴＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＬＬＦＩＰＶＦＣＫＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ＊（配列番号１３０）
ＩＬ１０レンチウイルス挿入物（ヌクレオチド配列）
ＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＡＡＣＡＴＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＡＡＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＡＣＧＧＣＧＣＴＧＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＣＴＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡＴＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＧＡＡＡＣＴＧＡ（配列番号１３８）
ＩＬ１０レンチウイルス挿入物（アミノ酸配列）
ＭＨＳＳＡＬＬＣＣＬＶＬＬＴＧＶＲＡＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ＊（配列番号１２４）
ＦＯＸＰ３レンチウイルス挿入物（ヌクレオチド配列）
ＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＣＧＧＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＧＡＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＴＴＣＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＡＡＧＴＧＧＣＣＣＧＧＡＴＧＴＧＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＣＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＧＴＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＣＣＴＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＧＣＴＣＡＴＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＴＣＡＡＴＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＴＣＡＣＡＣＧＣＡＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡＴＡＡ（配列番号１３９）
ＦＯＸＰ３レンチウイルス挿入物（アミノ酸配列）
ＭＰＮＰＲＰＧＫＰＳＡＰＳＬＡＬＧＰＳＰＧＡＳＰＳＷＲＡＡＰＫＡＳＤＬＬＧＡＲＧＰＧＧＴＦＱＧＲＤＬＲＧＧＡＨＡＳＳＳＳＬＮＰＭＰＰＳＱＬＱＬＰＴＬＰＬＶＭＶＡＰＳＧＡＲＬＧＰＬＰＨＬＱＡＬＬＱＤＲＰＨＦＭＨＱＬＳＴＶＤＡＨＡＲＴＰＶＬＱＶＨＰＬＥＳＰＡＭＩＳＬＴＰＰＴＴＡＴＧＶＦＳＬＫＡＲＰＧＬＰＰＧＩＮＶＡＳＬＥＷＶＳＲＥＰＡＬＬＣＴＦＰＮＰＳＡＰＲＫＤＳＴＬＳＡＶＰＱＳＳＹＰＬＬＡＮＧＶＣＫＷＰＧＣＥＫＶＦＥＥＰＥＤＦＬＫＨＣＱＡＤＨＬＬＤＥＫＧＲＡＱＣＬＬＱＲＥＭＶＱＳＬＥＱＱＬＶＬＥＫＥＫＬＳＡＭＱＡＨＬＡＧＫＭＡＬＴＫＡＳＳＶＡＳＳＤＫＧＳＣＣＩＶＡＡＧＳＱＧＰＶＶＰＡＷＳＧＰＲＥＡＰＤＳＬＦＡＶＲＲＨＬＷＧＳＨＧＮＳＴＦＰＥＦＬＨＮＭＤＹＦＫＦＨＮＭＲＰＰＦＴＹＡＴＬＩＲＷＡＩＬＥＡＰＥＫＱＲＴＬＮＥＩＹＨＷＦＴＲＭＦＡＦＦＲＮＨＰＡＴＷＫＮＡＩＲＨＮＬＳＬＨＫＣＦＶＲＶＥＳＥＫＧＡＶＷＴＶＤＥＬＥＦＲＫＫＲＳＱＲＰＳＲＣＳＮＰＴＰＧＰ＊＊（配列番号１４０）
空のレンチベクター
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【0184】

ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合性ＤＮＡ結合剤、または調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４）、もしくは標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列を含むドナーコンストラクトを含むベクターは、個別にまたは任意の組合せで、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞によって送達することができる。また、ベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって送達することもできる。１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合性ＤＮＡ結合剤（例えば、ｍＲＮＡ）、または異種タンパク質をコードする配列を含むドナーコンストラクトは、個別にまたは任意の組合せで、ＬＮＰ、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞によって送達することができる。１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合性ＤＮＡ結合剤（例えば、ｍＲＮＡ）、または異種タンパク質をコードする配列を含むドナーコンストラクトは、個別にまたは任意の組合せで、ＬＮＰによって送達することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡ及びＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、ｍＲＮＡ）が、ＬＮＰによって送達される。ドナーコンストラクトは、ウイルスベクターによって送達することができる。

【0185】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチド及びタンパク質カーゴを送達するための周知された手段であり、本明細書で開示するガイドＲＮＡ、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤、またはドナーコンストラクトのいずれかの送達に使用することができる。

【0186】

本明細書で使用する場合、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）とは、分子間力によって互いに物理的に会合した複数の（すなわち、２つ以上の）脂質分子を含む粒子を指す。ＬＮＰは、例えば、ミクロスフェア（単層及び多重層小胞、例えば、「リポソーム」：いくつかの実施形態において、実質的に球状であり、より特定の実施形態において、水性コアを含むことができる（例えば、ＲＮＡ分子の実質的な部分を含む）層状相脂質二重層を含む）、エマルション中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相であり得る（例えば、ＷＯ２０１７１７３０５４を参照（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される））。対象にヌクレオチドを送達可能であることが当業者に知られている、任意のＬＮＰを利用することができる。

【0187】

いくつかの実施形態において、本明細書では、任意の本明細書に記載のガイドＲＮＡまたは本明細書で開示するドナーコンストラクトを、単独でまたは組み合わせて、細胞もしくは細胞集団または対象に送達する方法であって、構成要素のいずれか１つ以上がＬＮＰと会合している、方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする配列）をさらに含む。

【0188】

いくつかの実施形態において、本明細書では、任意の本明細書に記載のガイドＲＮＡまたは本明細書で開示するドナーコンストラクトを、単独でまたは組み合わせて、ＬＮＰとともに含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする配列）をさらに含む。

【0189】

いくつかの実施形態において、ＬＮＰはカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（別名３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）または別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、ＷＯ２０１９／０６７９９２、ＷＯ２０１７／１７３０５４、ＷＯ２０１５／０９５３４０、及びＷＯ２０１４／１３６０８６の脂質、ならびにそこに示されている参考文献を参照。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約４．５、５．０、５．５、６．０、または６．５のカチオン性脂質アミン：ＲＮＡリン酸のモル比（Ｎ：Ｐ）を含む。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ脂質の文脈におけるカチオン性及びイオン化可能という用語は互換的であり、例えば、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じてカチオン性である。

【0190】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示するコンストラクトに関連するＬＮＰは、免疫応答を抑制するための細胞ベース医薬の調製に使用される。細胞ベース治療薬の調製のための方法及び細胞ベース治療薬に使用するための試薬は、当技術分野で知られている。

【0191】

いくつかの実施形態において、任意の本明細書に記載のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤、または本明細書で開示するドナーコンストラクトは、単独でまたは組み合わせて、裸かまたはベクターの一部かにかかわらず、脂質ナノ粒子内で製剤化されるか、または脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、ＷＯ２０１９／０６７９９２またはＷＯ２０１７／１７３０５４を参照（これらの内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。

【0192】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ構成要素及び脂質構成要素を含むＬＮＰ組成物が包含され、ここで脂質構成要素は、アミン脂質（例えば、生分解性でイオン化可能な脂質）を含む。いくつかの場合において、脂質構成要素は、生分解性でイオン化可能な脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含む。ある特定の実施形態において、脂質核酸集合体は、イオン化可能な脂質Ａ（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（別名３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート））、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含むものであった。ある特定の実施形態において、当該構成要素は、それぞれ５０：３８：９：３のモル比で存在する。脂質核酸集合体は、脂質アミン：ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比を約６で、ｇＲＮＡ：ｍＲＮＡの重量比を２：１、１：１、または１：２で製剤化することができる。

【0193】

ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸）、及び調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０）、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列を含むドナーコンストラクトを、同じまたは異なるシステムを用いて送達することができることは明らかであろう。例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓヌクレアーゼ、及びコンストラクトは、同じベクター（例えば、ＡＡＶ）によって運搬することができる。代替的に、Ｃａｓヌクレアーゼ（タンパク質もしくはｍＲＮＡとして）またはｇＲＮＡは、プラスミドまたはＬＮＰによって運搬することができ、一方ドナーコンストラクトは、ＡＡＶなどのベクターによって運搬することができる。

【0194】

異なる送達システムは、同時に送達することも、任意の順で送達することもできる。いくつかの実施形態において、ドナーコンストラクト、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼは、例えば、１つのベクター、２つのベクター、個々のベクター、１つのＬＮＰ、２つのＬＮＰ、個々のＬＮＰ、またはこれらの組合せで、同時に送達することができる。いくつかの実施形態において、ドナーコンストラクトは、ガイドＲＮＡまたはＣａｓヌクレアーゼを送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、またはそれ以上）前に、ベクターとして、またはＬＮＰと会合して、単独でもしくは一緒に、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）として、送達することができる。さらなる例として、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、ベクターとして、またはＬＮＰと会合して、単独でもしくは一緒に、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）として、コンストラクトを送達する前（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上の日）に送達することができる。

【0195】

ＩＶ．Ｔ細胞を操作する方法
本開示は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含むように、Ｔ細胞を操作する方法を提供する。本開示は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にあるＩＬ１０をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含むように、Ｔ細胞を操作する方法を提供する。本開示は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にあるＣＴＬＡ４をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含むように、Ｔ細胞を操作する方法を提供する。本開示は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、各々プロモーター配列の制御下にあるＩＬ１０及びＣＴＬＡ４をコードする異種配列の細胞内への挿入とを含むようにＴ細胞を操作する方法を提供する。

【0196】

いくつかの実施形態において、当該方法は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４）をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含み、ＴＣＲ配列（複数可）の修飾（例えば、ノックダウン）をさらに含むように、Ｔ細胞を操作することを含む。

【0197】

いくつかの実施形態において、当該方法は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４）をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含み、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入をさらに含むように、Ｔ細胞を操作することを含む。

【0198】

いくつかの実施形態において、当該方法は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４）をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入と、ＴＣＲ配列（複数可）の修飾（例えば、ノックダウン）と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含むように、Ｔ細胞を操作することを含む。

【0199】

いくつかの実施形態において、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入、ＴＣＲ遺伝子の任意選択のノックダウン、及び標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）の細胞内への任意の挿入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び本明細書で開示するガイドＲＮＡを用いて操作される。

【0200】

これらの実施形態において、挿入される調節性Ｔ細胞促進分子は、ドナーコンストラクトを介して提供することができる。ドナーコンストラクトを介して提供される調節性Ｔ細胞促進分子は、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、ＴＧＦＢ１、ＩＤＯ１、ＥＮＴＰＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＩＬ２２、ＡＲＥＧ、ＩＬ３５、ＧＡＲＰ、ＣＤ２７４、ＦＯＸＰ３、ＩＫＺＦ２、ＥＯＳ、ＩＲＦ４、ＬＥＦ１、及びＢＡＣＨ２、ならびにＴＣＲ遺伝子配列（複数可）の修飾（例えば、ノックダウン）から選択することができる。

【0201】

これらの実施形態において、挿入される標的化受容体は、ドナーコンストラクトを介して提供することができる。いくつかの実施形態において、標的化受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または細胞外受容体部分の結合時にＴ細胞を活性化可能な、内部シグナル伝達ドメイン内で少なくとも膜貫通ドメインを介し作用可能に結合した細胞表面分子の受容体であり得る。いくつかの実施形態において、標的化受容体は、細胞が、標的部位（例えば、生物内の特定の細胞または組織）に結合するのを可能にする、細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面に存在する受容体であり得る。これらの実施形態において、標的化受容体は、ＭＡｄＣＡＭ－１を標的化可能なＣＡＲである。

【0202】

挿入及び修飾（例えば、ノックダウン）を含むようにＴ細胞を操作するための好適な遺伝子編集システムは、本明細書で開示され、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムは、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムを含む。概して、遺伝子編集システムは、標的ＤＮＡ配列内で二重鎖切断（ＤＳＢ）またはニック（例えば、一本鎖切断、またはＳＳＢ）を誘導するために、操作された切断システムの使用を伴う。切断またはニッキングは、特異的ヌクレアーゼ（例えば、操作されたＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ）の使用により、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを操作されたガイドＲＮＡとともに使用して、標的ＤＮＡ配列の特異的切断もしくはニッキング（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）を先導することにより、生じ得る。さらに、アルゴノートシステムに基づいた標的ヌクレアーゼが開発されており（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られているＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のもの；Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照）、これは、ゲノム編集及び遺伝子治療で使用される可能性も有し得る。

【0203】

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作することができる制限酵素である。これは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合させることによって作製される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、所望のＤＮＡ配列に結合し、特定の位置でＤＮＡ切断を促進するように操作することができる（例えば、Ｂｏｃｈ，ＴＡＬＥｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１３５－１３６（２０１１）を参照）。制限酵素は、遺伝子編集に使用するために、あるいは操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集として知られる技法であるｉｎ ｓｉｔｕでのゲノム編集のために、細胞に導入することができる。このような方法及びそこで使用するための組成物は、当技術分野で知られている。例えば、ＷＯ２０１９１４７８０５、ＷＯ２０１４０４０３７０、ＷＯ２０１８０７３３９３を参照（これらの内容は、全体として本明細書に援用される）。

【0204】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと融合させることによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的化するように操作して、複雑なゲノム内のユニークな配列を標的化するジンクフィンガーヌクレアーゼを有効にすることができる。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの非特異的切断ドメインは、典型的にはＺＦＮ内の切断ドメインとして使用される。切断は、内在性ＤＮＡ修復装置によって修復され、これによりＺＦＮは高等生物のゲノムを正確に改変することが可能になる。このような方法及びそこで使用するための組成物は、当技術分野で知られている。例えば、ＷＯ２０１１０９１３２４を参照（この内容は、全体として本明細書に援用される）。

【0205】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ分子が標的ｍＲＮＡ分子を中和することにより、遺伝子発現または翻訳を阻害する生物学的プロセスである。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉の中心的存在である。ＲＮＡは遺伝子の直接的産物であり、これらの低分子ＲＮＡ（典型的には、各鎖は１９～２３ヌクレオチド長であり、１９～２１ヌクレオチドの二重鎖を形成する）は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング（ＲＩＳＣ）複合体にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を分解するように指示して、転写後遺伝子サイレンシングを介し翻訳を妨げることにより、その活性を低下させることができる。ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、二重鎖領域を形成する鎖がヘアピン構造を有する単一ＲＮＡ鎖であるｓｉＲＮＡであり、しばしば発現ベクターからの転写によって生成される。ＲＮＡｉは、ダイサー基質分子と称される長いＲＮＡ二重鎖構造によっても達成することができ、この構造は、ＲＩＳＣに装填される前に酵素ダイサーによって切断され、標的ｍＲＮＡの切断を促進する。このような使用方法及び組成物は、当技術分野で知られている。本明細書で提供される組成物及び方法においては、ＲＮＡ干渉を促進するためのＲＮＡ分子が、耐久性のために発現ベクターとして提供されることが好ましい。例えば、ＷＯ２０１８２０８８３７を参照（この内容は、全体として本明細書に援用される）。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、発現ベクターとともに使用される。

【0206】

本開示が、本明細書で開示するガイドＲＮＡのありまたはなしで実施される挿入方法（例えば、ＺＦＮシステムを使用して標的ＤＮＡ配列に切断を引き起こし、コンストラクトの挿入部位を作出する）を企図していることが理解されよう。本明細書で開示するガイドＲＮＡを使用する方法において、当該方法は、ＴＮＦＡ、ＩＦＮＧ、またはＴＣＲをコードする核酸配列を修飾（例えば、ノックダウン）するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を含む。また、本開示が、ＴＮＦＡ、ＩＦＮＧ、またはＴＣＲを修飾（例えば、ノックダウン）する方法を企図しており、これが、本明細書で開示するガイドＲＮＡなしで実施することができる（例えば、ＺＦＮシステムを使用して標的ＤＮＡ配列に切断を引き起こし、コンストラクトの挿入部位を作出する）ことも理解されよう。

【0207】

いくつかの実施形態において、挿入のための配列（例えば、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４をコードする配列）を含むドナーコンストラクトは、修飾（例えば、ノックダウン）に対し標的化される配列、例えばＴＣＲ遺伝子のゲノム座位に挿入される。

【0208】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、ガイドＲＮＡ及びＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤）を使用して、ゲノム内の所望の座位に挿入部位を作出することができ、その部位に、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４をコードする配列を含むドナーコンストラクト、または標的化受容体（例えば、本明細書で開示するＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）を挿入して、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、またはＣＡＲ（例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）を発現することができる。標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）、ＩＬ１０、またはＣＴＬＡ４は、本明細書に記載のように、その挿入部位または座位、例えばＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）が通常発現しないセーフハーバー座位またはＴＣＲ座位に関して異種であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のガイドＲＮＡを、本方法に従ってＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）とともに使用して挿入部位を作出し、その部位に、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４をコードする配列を含むドナーコンストラクト、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）を挿入して、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、またはＣＡＲ（例えばＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）を発現させることができる。ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）を特定のゲノム座位に挿入するためのガイドＲＮＡが、本明細書で例示及び記載されている。

【0209】

いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｇＲＮＡ（例えば、ノックダウンのためにＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、またはＴＣＲを標的化するｇＲＮＡ）、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）、ドナーコンストラクトを用いた形質導入（例えば、ウイルスまたは非ウイルス送達を使用）によって操作される。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、１）炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＦＮＧまたはＴＮＦＡ）をコードする核酸配列を標的化するｇＲＮＡ、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）で形質導入され、また２）調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４）をコードする核酸配列（複数可）と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）とを含むドナーコンストラクトで形質導入される。ある特定の実施形態において、操作された細胞は、標的化受容体の発現のために選択される。

【0210】

いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｇＲＮＡ（例えば、ノックダウンのためにＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、またはＴＣＲを標的化するｇＲＮＡ）、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）、及びドナーコンストラクトを用いた形質導入によって操作される。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、１）調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４）をコードする核酸配列（複数可）と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）とを含むドナーコンストラクトで形質導入され、２）炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＦＮＧまたはＴＮＦＡ）をコードする核酸配列を標的化するｇＲＮＡ、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）で形質導入される。ある特定の実施形態において、操作された細胞は、標的化受容体の発現のために選択される。

【0211】

いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｇＲＮＡ（例えば、ノックダウンのためにＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、またはＴＣＲを標的化するｇＲＮＡ）、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）、ドナーコンストラクトを用いた形質導入によって操作される。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、１）調節性Ｔ細胞促進分子（例えば、ＩＬ１０またはＣＴＬＡ４）をコードする核酸配列（複数可）と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ、例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）とを含むドナーコンストラクトで形質導入され、２）炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＦＮＧまたはＴＮＦＡ）をコードする核酸配列を標的化するｇＲＮＡ、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）で形質導入される。

【0212】

本明細書に記載のように、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列と、ガイドＲＮＡ（例えば、ノックダウンのためにＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、またはＴＣＲを標的化するｇＲＮＡ）と、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とを含むドナーコンストラクトは、当技術分野で知られている任意の好適な送達システム及び方法を用いて送達することができる。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列を含むドナーコンストラクトを送達する前に、ＬＮＰと会合し、細胞または細胞の集団に送達される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、または標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列を含むドナーコンストラクトを送達した後に、ＬＮＰと会合し、細胞または細胞の集団に送達される。

【0213】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡ、ドナーコンストラクト、及びＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の天然に存在するＴ細胞への投与は、天然に存在するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）を、調節性Ｔ細胞の特性（例えば、免疫応答抑制特性）を示す細胞に変換することが可能である。

【0214】

ＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、もしくはＴＣＲ遺伝子発現を修飾（例えば、ノックダウン）するための、またはＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、もしくは標的化受容体（例えばＣＡＲ、例えばＭＡｄＣＡＭ－１ ＣＡＲ）をコードする配列を挿入するためのｇＲＮＡ、ドナーコンストラクト、及びＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、従来的なＴ細胞または従来的なＴ細胞の集団に導入して、本明細書に記載の操作されたＴ細胞またはＴ細胞の集団を生成することができる。

【0215】

様々なＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９）を使用する方法も当技術分野で周知されている。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用が例示されているが、当該システムに対する好適な変形形態も使用できることが理解されよう。文脈によっては、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）として、例えば、上記で提供されたＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとして、またはタンパク質として提供され得ることが理解されよう。いくつかの実施形態において、当該方法は、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤を既に含むまたは発現する細胞で実施することができる。

【0216】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）は、クリーバーゼ活性を有し、これは二重鎖エンドヌクレアーゼ活性と称されることもある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）は、ニッカーゼ活性を有し、これは一本鎖エンドヌクレアーゼ活性と称されることもある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はＣａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのもの（例えば、次の段落の一覧を参照）、ならびにこれらのバリアントまたは変異体（例えば、操作された、非天然存在、天然存在、または他のバリアント）バージョンが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８ Ａ１；ＵＳ２０１６／０３１２１９９ Ａ１を参照。

【0217】

Ｃａｓヌクレアーゼが由来し得る種の非限定的な例示としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。

【0218】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。ある特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。

【0219】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤と一緒になったｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質と一緒になったｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰと呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＲＮＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型構成要素を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９と一緒になったｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰと呼ばれる。

【0220】

野生型Ｃａｓ９は、ＲｕｖＣ及びＨＮＨという２つのヌクレアーゼドメインを有する。ＲｕｖＣドメインは非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインはＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、複数のＲｕｖＣドメインまたは複数のＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９である。組成物、使用、及び方法の実施形態の各々において、Ｃａｓは、標的ＤＮＡにおける二重鎖切断を誘導する。

【0221】

いくつかの実施形態において、１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の一部で置き換えられているキメラＣａｓヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のような異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは修飾ヌクレアーゼであり得る。

【0222】

他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来であってもよい。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼはＲＮＡ切断活性を有し得る。

【0223】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、１本のＤＮＡ鎖を切断して、「ニック」としても知られる一本鎖切断をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はＣａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼとは、ｄｓＤＮＡ内でニックを作成する酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断し、他方の鎖を切断しない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓニッカーゼは、エンドヌクレアーゼ活性部位が、例えば、触媒ドメインにおける１つ以上の改変（例えば、点変異）によって不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上述のＣａｓヌクレアーゼ）のバージョンである。例えば、Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメインの改変の議論については、米国特許第８，８８９，３５６号を参照。いくつかの実施形態において、Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）は、不活性化ＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインを有する。

【0224】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、１つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含むように修飾されている。例えば、薬剤タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つが変異し、または完全もしくは部分的に欠失して、その核酸切断活性を低減するように修飾することができる。いくつかの実施形態において、活性が低減したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態において、不活性のＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態において、活性が低減したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態において、不活性のＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。

【0225】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸が、ヌクレアーゼ活性を低減または改変するために置換される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含むことができる。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内の例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含むことができる。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内の例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ （２０１５）を参照。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａが挙げられる（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ））に基づく）。

【0226】

いくつかの実施形態において、ニッカーゼは、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖にそれぞれ相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態において、ガイドＲＮＡは、ニッカーゼを標的配列に誘導し、標的配列の対向鎖上にニックを生成すること（すなわち、二重ニッキング）によってＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態において、ニッカーゼは、標的ＤＮＡ内で二重ニックを生成するために、ＤＮＡの対向鎖を標的化する２つの別々のガイドＲＮＡと一緒に使用される。いくつかの実施形態において、ニッカーゼは、標的ＤＮＡ内でダブルニックを生成するために、極めて近接するように選択された２つの別々のガイドＲＮＡと一緒に使用される。

【0227】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、１つ以上の異種の機能的ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、またはそれを含む）。

【0228】

いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の細胞核内への輸送を促進することができる。例えば、異種の機能的ドメインは核局在化シグナル（ＮＬＳ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は１～１０個のＮＬＳ（複数可）と融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は１～５個のＮＬＳ（複数可）と融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、１つのＮＬＳと融合することができる。１つのＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤配列のＮ末端またはＣ末端で結合することができる。また、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の配列内に挿入することもできる。他の実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、複数のＮＬＳと融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、２、３、４、または５個のＮＬＳと融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、２つのＮＬＳと融合することができる。ある特定の状況において、２つのＮＬＳは同じ（例えば、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ）ことも異なることもある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端で結合している２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列と融合している。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、一方がＮ末端で結合し、他方がＣ末端で結合している２つのＮＬＳと融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、３つのＮＬＳと融合することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳと融合しないことがある。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１４３）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号１４４）などの単分割（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）配列であり得る。いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１４５）などの二分割（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）配列であり得る。特定の実施形態において、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１４３）ＮＬＳが、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤のＣ末端で結合することができる。１つ以上のリンカーが、任意選択で融合部位に含まれる。

【0229】

Ｖ．治療方法
本開示は、対象における免疫応答を抑制するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。本開示は、対象における免疫応答を抑制するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にあるＩＬ１０をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。本開示は、対象における免疫応答を抑制するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にあるＣＴＬＡ４をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。本開示は、対象における免疫応答を抑制するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＩＬ１０及びＣＴＬＡ４をコードする異種配列の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。

【0230】

本開示は、対象における自己免疫障害を治療するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。本開示は、対象における自己免疫障害を治療するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にあるＩＬ１０をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。本開示は、対象における自己免疫障害を治療するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にあるＣＴＬＡ４をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。本開示は、対象における自己免疫障害を治療するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、各々プロモーター配列の制御下にあるＩＬ１０及びＣＴＬＡ４をコードする異種配列の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。

【0231】

本開示は、対象におけるＧｖＨＤを治療するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にある調節性Ｔ細胞促進分子をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。本開示は、対象におけるＧｖＨＤを治療するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にあるＩＬ１０をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。本開示は、対象におけるＧｖＨＤを治療するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、プロモーター配列の制御下にあるＣＴＬＡ４をコードする異種配列（複数可）の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む、方法を提供する。本開示は、対象におけるＧｖＨＤを治療するための方法であって、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、各々プロモーター配列の制御下にあるＩＬ１０及びＣＴＬＡ４をコードする異種配列の細胞内への挿入とを含む、操作されたＴ細胞に投与することを含む、方法を提供する。

【0232】

いくつかの実施形態において、当該方法は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）の挿入とを含み、ＴＣＲ配列（複数可）の修飾（例えば、ノックダウン）をさらに含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む。

【0233】

いくつかの実施形態において、当該方法は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）の挿入とを含み、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列（複数可）の挿入をさらに含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む。

【0234】

いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を胃腸系に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、またはクローン病などの障害における免疫応答（炎症を含む）を抑制するために、ＭＡｄＣＡＭ－１を標的化するＣＡＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を内皮細胞を含む組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、クローン病及び多発性硬化症などの障害における免疫応答（炎症を含む）を抑制するために、ＶＣＡＭ－１を標的化するＣＡＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を内皮細胞に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、クローン病などの障害における免疫応答を抑制するために、ＣＥＡＣＡＭ６を標的化するＣＡＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞をＢ細胞に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、多発性硬化症及び全身性エリテマトーデスなどの障害における免疫応答を抑制するために、ＣＤ１９を標的化するＣＡＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞をＢ細胞に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、多発性硬化症及び全身性エリテマトーデスなどの障害における免疫応答を抑制するために、ＣＤ２０を標的化するＣＡＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を炎症組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、またはクローン病などの障害における免疫応答を抑制するために、ＴＮＦＡを標的化するＣＡＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を神経組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、多発性硬化症などの障害における免疫応答を抑制するために、ＭＢＰ、ＭＯＧ、またはＰＬＰを標的化するＣＡＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を、成熟Ｂリンパ球を含む組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、全身性エリテマトーデスなどの障害における免疫応答を抑制するために、ＴＮＦＲＳＦ１７を標的化するＣＡＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、操作されたＴ細胞を滑膜組織に対し標的化することが可能であり、例えば、標的化受容体は、例えば、関節リウマチなどの障害における免疫応答を抑制するために、シトルリン化ビメンチンを標的化するＣＡＲである。

【0235】

いくつかの実施形態において、標的化受容体は、ＤＰＰ６、ＳＣＬ２Ａ２、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ２）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、及びＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａ（ＨＬＡ－Ａ＊０２）を標的化するＣＡＲである。

【0236】

いくつかの実施形態において、当該方法は、ＩＦＮＧをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、ＴＮＦＡをコードする内在性核酸配列の修飾（例えば、ノックダウン）と、調節性Ｔ細胞促進分子をコードする配列（複数可）の挿入と、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）をコードする配列（複数可）の挿入とを含み、ＴＣＲ配列（複数可）の修飾（例えば、ノックダウン）をさらに含む、操作されたＴ細胞を投与することを含む。

【0237】

いくつかの実施形態において、挿入される配列（複数可）は、修飾（例えば、ノックダウン）される配列（複数可）に挿入される。例えば、ＣＡＲ配列は、ＴＮＦＡゲノム配列に挿入され、それによってＴＮＦＡ配列が修飾（例えば、ノックダウン）される。

【0238】

いくつかの実施形態において、方法は、上記のように操作されているＴ細胞を含むＴ細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の集団内のＴ細胞の少なくとも４０％、４５％、好ましくは少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、例えば、シークエンシング（例えば、ＮＧＳ）による評価で、操作される。

【0239】

いくつかの実施形態において、自己免疫障害は、潰瘍性大腸炎、クローン病、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）から選択される。いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞は、自己由来または同種異系で使用される。

【0240】

いくつかの実施形態において、上記の操作されたＴ細胞を用いた治療の有効性は、移植片対宿主病の動物モデル（例えば、マウスモデル）において、操作されたＴ細胞の投与後に、動物の体重または生存率を測定することによって評価することができる（動物は体重のかなりの部分、例えば開始体重の２０％が減少した後に屠殺される）。いくつかの実施形態において、有効な治療は、好適な対照（例えば、ＰＢＭＣで処置した動物）と比較して、統計的に有意な生存率の増加をもたらす。

【実施例】

【0241】

以下の実施例は、ある特定の開示実施形態を例示するために提供されるものであり、いかなる形でも本開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

【0242】

実施例１．一般的な方法
１．１．脂質ナノ粒子の調製
概して、脂質構成要素を様々なモル比で１００％エタノールに溶解した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を２５ｍＭのクエン酸バッファー、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に溶解して、その結果ＲＮＡカーゴの濃度をおよそ０．４５ｍｇ／ｍＬとした。

【0243】

別段の指定がない限り、脂質核酸集合体は、イオン化可能な脂質Ａ（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（別名３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート））、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧをそれぞれ５０：３８．５：１０：１．５のモル比で含むものであった。脂質核酸集合体は、別段の指定がない限り、脂質アミン：ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比を約６で、ｇＲＮＡ：ｍＲＮＡの重量比を１：１で製剤化した。

【0244】

ＬＮＰは、エタノール中の脂質と２体積のＲＮＡ溶液及び１体積の水との衝突ジェット混合を利用するクロスフロー技法を用いて調製した。エタノール中の脂質を、ミキシングクロスを通じて２体積のＲＮＡ溶液と混合した。第４の水流を、インラインティーを通じてクロスのアウトレット流と混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照）。ＬＮＰを室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（およそ１：１ ｖ／ｖ）。フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）上でのタンジェンシャルフロー濾過を用いてＬＮＰを濃縮し、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）にバッファー交換した。代替的に、１００ｋＤａのＡｍｉｃｏｎスピンフィルターを用いてＬＮＰを任意選択で濃縮し、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いてＴＳＳにバッファー交換した。次に、０．２μＭの滅菌フィルターを用いて得られた混合物を濾過した。最終的なＬＮＰを、さらに使用するまで４℃または－８０℃で保存した。

【0245】

１．２．ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含むキャッピング及びポリアデニル化されたｍＲＮＡを、線状化プラスミドＤＮＡ鋳型及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成した。Ｔ７プロモーター、転写のための配列、及びポリアデニル化領域を含むプラスミドＤＮＡを、以下の条件：２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、及び１×反応バッファーを用いて、ＸｂａＩとともに３７℃にて２時間インキュベートすることにより線状化した。ＸｂａＩは、反応物を６５℃で２０分間加熱することにより不活性化した。線状化プラスミドを酵素及びバッファー塩から精製した。修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応を、以下の条件：５０ｎｇ／μＬの線状化プラスミド；各２～５ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルシュード－ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；１０～２５ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）；１Ｕ／μＬのマウスＲＮアーゼ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；ならびに１×反応バッファーにおいて、３７℃で１．５～４時間インキュベートすることにより実施した。ＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えて最終濃度０．０１Ｕ／μＬとし、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を取り出した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）をメーカーのプロトコルに従って用いて、ｍＲＮＡを精製した。代替的に、ｍＲＮＡを沈殿プロトコルにより精製し、場合によってはその後にＨＰＬＣベースの精製を行った。簡潔に説明すると、ＤＮアーゼ消化後、ＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を用いてｍＲＮＡを精製する。ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡについては、ＬｉＣｌ沈殿及び再構成の後、ｍＲＮＡをＲＰ－ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２１ ｅ１４２を参照）。プール用に選択した画分を合わせ、上記のように酢酸ナトリウム／エタノール沈殿により脱塩した。さらに代替的な方法では、ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿方法で精製し、続いてタンジェンシャルフロー濾過によりさらに精製した。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍにおける光吸収を測定することにより定量し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動により解析した。

【0246】

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、本明細書に記載の核酸配列に従ってオープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡから生成した。以下のｍＲＮＡ核酸配列については、ＴがＵに置き換えられるべきであることが理解される（上述のようにＮ１－メチル擬ウリジンであった）。実施例に使用するメッセンジャーＲＮＡは、５’キャップ及び３’ポリＡテールを含み、例えば最大１００ｎｔである（配列番号１４６）。

【0247】

１．３．次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット編集効率の解析
ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）をメーカーのプロトコルに従って用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。

【0248】

ゲノム内の標的位置における編集効率を定量的に決定するため、ディープシークエンシングを利用して、遺伝子編集により導入された挿入及び欠失の存在を特定した。目的の遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ）内の標的部位に基づいてＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム区域を増幅した。プライマー配列設計は、この分野で標準的であるように行った。

【0249】

製造業者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施して、シークエンシングに化学作用を加えた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置上でアンプリコンをシークエンシングした。品質スコアが低いリードを除去した後、リードをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対しアラインメントした。リードを含む結果ファイルを参照ゲノムにマッピングし（ＢＡＭファイル）、目的の標的領域と重なるリードを選択し、野生型のリード数に対しインデルを含むリード数を計算した。編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「編集パーセント」または「インデルパーセント」）は、インデルを伴う配列リードの総数を配列リードの総数（野生型を含む）で割ったものとして定義される。

【0250】

実施例２．Ｔｒｅｇ関連因子を過剰発現するＴ細胞の抑制能力
Ｔｒｅｇ関連転写因子Ｆｏｘｐ３、Ｆｏｘｐ３及びＩＬ１０、ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、ならびにＩＬ１０及びＣＴＬＡ４を過剰発現するようにＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に形質導入し、その炎症性免疫応答を抑制する能力についてアッセイした。

【0251】

２．１ Ｔ細胞の調製
ヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、新鮮なｌｅｕｋｏｐａｋ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドナー番号ＲＧ１９５３）から内部調製した。内部調製のため、ヒトＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９６－５３３）をメーカーのプロトコルに従って用いたネガティブセレクションにより、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。単離したＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、さらに使用するまでＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｄｉａ（カタログ番号０７９３０）で凍結した。活性化の当日、３７℃の水浴を用いて凍結ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を解凍した。解凍したＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１×１０^６細胞／ｍＬの密度で、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ３１６０５－０１）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３５０５０－０６１）、５０μＭの２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、３１３５０－０１０）、１×非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号２５－０２５０－ＣＩ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号２５－０００－ＣＩ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５６３０－０８０）、１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５１４０－１２２）及び添加サイトカイン、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８０３６．１）、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン７（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８０５３．１）、ならびに５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトインターロイキン１５（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８０３１．１）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号１０－０４０－ＣＶ）から構成された合計５ｍｌのＴ細胞ＲＰＭＩ培地にプレーティングした。細胞を、２５ｕＬ／ｍＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０９９０）を加えることにより活性化し、レンチウイルス形質導入の前に３７℃で４８時間培養した。

【0252】

２．２ Ｔ細胞形質導入及び細胞選別
ＩＬ１０、ＣＴＬＡ４、及びＦＯＸ３Ｐを過剰発現させるため、活性化ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、レンチウイルスコンストラクトを用いて個別にまたは一緒に形質導入した。活性化から４８時間後、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を採取し、洗浄し、１×１０^６細胞／１００ｕＬの密度でＴ細胞ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。１００ｕＬの濃縮したウイルス上清をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に加え、１０００×ｇで６０分間、３７℃で遠心処理した。形質導入後、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を細胞／ウイルス上清混合液に再懸濁し、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１７を追加した２０ｍＬのＴ細胞ＲＰＭＩ培地を含む６ウェルＧ－ｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ；カタログ番号８０２４０Ｍ）の単一ウェルに移した。形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を４～６日間培養し、ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別して、目的とする標的を発現する細胞を単離した。選別後、２．１で言及した構成要素を含み、さらに５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ７、及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１７を追加した２０ｍＬのＴ細胞ＲＰＭＩ培地が入った６ウェルＧｒｅｘプレートで、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を２５日目まで培養した。

【0253】

天然の調節性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）を、当技術分野で知られている方法を用いて調製した。簡潔に説明すると、自己由来ＰＢＭＣを解凍し、ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９６－５３３）をメーカーの指示に従って用いて処理し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離して処理した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を１×１０^７細胞／ｍＬでＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＢＶ４２１抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、ＡＰＣ抗ＣＤ２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６１０）、及びＰＥ－Ｃｙ７抗ＣＤ１２７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５１３２０）を用いて、４℃で３０分間染色した。ＣＤ４＋ＣＤ１２７－集団から上位３～５％の高発現ＣＤ２５＋細胞をＦＡＣＳにより選別し、５０％ウシ胎児血清を含むＴ細胞ＲＰＭＩ培地培養物に入れた。実施例２．１に記載の構成要素を補充した２０ｍＬのＴ細胞ＲＰＭＩ培地に、さらに５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８０３６．１）、１００ｎＭのラパマイシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号５５３２１１）、及び２５μｌ／ｍＬの抗ＣＤ３／２８／２ Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ Ｔ細胞アクチベーター（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０９９０）を追加した６ウェルＧｒｅｘで、選別したＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ｎＴｒｅｇをプレーティングした。ＩＬ－２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８０３６．１）及びラパマイシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号５５３２１１）を１日おきに７日間加え、その時点で５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８０３６．１）のみを１日おきに加えた。１２日目に、ｎＴｒｅｇを採取し、洗浄し、Ａ．１で言及した構成要素、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８０３６．１）を追加したＴ細胞ＲＰＭＩ培地が入った６ウェルＧｒｅｘプレートで、注射当日までプレーティングした。

【0254】

２．３ 標的発現の検証
フローサイトメトリーによって標的発現を検証した。ＦｏｘＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－５５２３－００）をメーカーの指示に従って用いて、５０万個の形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を透過処理した。透過処理後、形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、（１）ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ ５．５抗ＦｏｘＰ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６１４９３）、ｅＦｌｕｏｒ６６０抗Ｅｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号５０－５７５８－８０）、Ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ抗Ｈｅｌｉｏｓ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１３７２２０）、または（２）ＢＶ４２１抗ＩＬ－１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号５０１４２２）及びＡＰＣ抗ＣＴＬＡ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６９６１２）のいずれかからなる抗体パネルとともにインキュベートした。染色した形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣｙｔｏｆｌｅｘ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを用いて解析した。形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗体パネルにおいて標的を定量化する前に、サイズ、形状に基づいてゲーティングした。標的の過剰発現は、形質導入対照との対比で特徴付けた。所与の標的に対する所望の発現レベルは、ｎＴｒｅｇと同等またはそれ以上とした（表４及び図１Ａ～Ｅ）。ｎＴｒｅｇ試料は、高レベルのＦｏｘｐ３、Ｈｅｌｉｏｓ、及びＥｏｓを発現しており、これは非常に純粋で抑制的な表現型と相関している。

【表3】

【0255】

２．４ ＧｖＨＤモデルにおける免疫抑制のｉｎ ｖｉｖｏ評価
移植片対宿主病マウスモデルを用いて、選別した形質転換ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抑制機能を評価した。

【0256】

選別したｉｎ ｖｉｖｏ注射用のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を採取し、ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９０－１０１）をメーカーの指示に従って用いて処理した。自己由来ＰＢＭＣを、上記の実施例に記載のように解凍した。ＰＢＭＣを各アッセイ集団に１：１の比で加え、細胞をＰＢＳに再懸濁して６×１０^６／１５０μＬとした。ＰＢＭＣのみの群を３×１０^６／１５０μＬで再懸濁した。

【0257】

雌ＮＯＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ；Ｔａｃｏｎｉｃ、カタログ番号ＮＯＧ－Ｆ）を、注射の１日前にＸ線（ＲＳ－２０００ ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ；Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて致死以下の照射（２００ラド）を行うことにより、細胞移植のコンディショニングを行った。照射したＮＯＧマウスのコホートに、１５０μＬの各試験細胞集団を静脈注射した。５匹の照射マウスには注射せず、照射のみ対照として使用した。体重を毎日モニターした。体重が２０％減少したマウスを屠殺し、脾臓の細胞組成を評価した。各試験群におけるマウスの生存率を理解するため、生存期間をプロットした。表５及び図２Ａに示されているように、ＩＬ－１０及びＣＴＬＡ４の両方を形質導入したＴ細胞のみが、ｎＴｒｅｇと同様のレベルまで生存期間が延長した。

【表4】

【0258】

ヒト白血球の生着を確認するため、脾臓の組成を評価した。安楽死時に、各動物の脾臓を収集してＰＢＳ含有ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃ ｔｕｂｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９６－３３４）に入れた。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９５－９３７、ｐｒｏｇｒａｍ ｍＳｐｌｅｅｎ０１＿０１）を用いて脾臓を分離した。細胞懸濁液を７０ミクロンのセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号０８－７７１－２）で濾過し、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞をカウントした。およそ１００万個の生存可能な脾臓細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、抗ヒトＣＤ３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３１０）またはＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３２７）））、ＢＶ６５０抗ヒトＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２２３８）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、カタログ番号５６１８６４）、ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ ７５０抗ヒトＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５６０）、及びＢＶ４２１抗マウスＴｅｒ１１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１１６２３４）からなる抗体のパネルで、４℃で３０分間染色した。脾臓細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを用いて解析した。ＣＤ４ Ｔ細胞をＴｅｒ１１９－ＣＤ４５＋ＣＤ１９－ＣＤ３＋ＣＤ４＋と定義した。ＣＤ８ Ｔ細胞をＴｅｒ１１９－ＣＤ４５＋ＣＤ１９－ＣＤ３＋ＣＤ４－と定義した。Ｂ細胞をＴｅｒ１１９－ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋ＣＤ３－と定義した。個々の集団の細胞数を定量するために、回収した脾臓細胞の総数に対する各集団のパーセンテージを適用した。ＩＬ１０及びＣＴＬＡ４の両方を過剰発現するようにレンチウイルスベクターを形質導入したＴ細胞、ならびにｎＴｒｅｇで処置したマウスは、無処置のＰＢＭＣマウスよりもＢ細胞のパーセンテージ及び数が少なかった。データを表６及び図２Ｂに示す。

【表5】

【0259】

２．５ 形質導入導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイル解析
選別した形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激して、サイトカインプロファイルを評価した。選別した形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｕ底培養プレート内の２５ｕＬ／ｍＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０９９０）を伴うまたは伴わない合計２００μＬのＴ細胞ＲＰＭＩ培地中に１×１０＾５個のＴ細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃で４８時間培養した。４８時間の培養後、培養プレートを遠心分離し、上清を収集し、凍結保存して、その後ｃｕｓｔｏｍ Ｕ－ＰＬＥＸ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号Ｋ１５０６７Ｌ－２）をメーカーの指示に従って用いて、サイトカイン定量化を行った。具体的には、Ｕ－ＰＬＥＸ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｋｉｔを使用して、以下のヒトサイトカイン：ＩＦＮＧ、ＴＮＦＡ、ＩＬ６、ＩＬ２、ＩＬ１３、及びＩＬ１０を定量化した。Ｍｅｓｏ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ１２０ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いてＵ－ＰＬＥＸ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒプレートを読み取り、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ４．０ソフトウェアパッケージ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によりデータを解析した。結果を表７及び図３Ａ～３Ｆに示す。ＩＬ１０をコードする配列を持つレンチウイルス発現ベクターで形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ刺激により大量のＩＬ１０を分泌した。ＩＬ１０の過剰発現により、ＩＬ６、ＩＦＮＧ、及びＴＮＦＡの分泌も増加した。これに対し、ＦｏｘＰ３をコードする配列を有するレンチウイルス発現ベクターで形質導入したＴ細胞は、全ての定量化されたサイトカインの発現の低減を示した。また天然Ｔｒｅｇも、定量化されたサイトカインの分泌の低減（高度に純粋で抑制的なｎＴｒｅｇに特徴的である）を示した。

【表6】

【0260】

２．６ 抑制機能の混合リンパ球反応アッセイ
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用して、選別した形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の抑制機能をアッセイした。ＭＬＲは、Ｔ細胞が他のドナーの同種異系白血球を異物と認識することによって引き起こされる炎症反応である。Ｔｒｅｇは、この炎症反応を抑制することができる。そのため、ＭＬＲは、操作されたＴｒｅｇを含むＴｒｅｇの抑制能力を評価するための標準的なアッセイである。Ｔｒｅｇが抑制的であれば、応答する炎症性Ｔ細胞による炎症性サイトカインの増殖及び産生は少なくなる。

【0261】

Ｔ細胞ＲＰＭＩ培地を用いた９６ウェルＵ底プレートで、ＭＬＲを行った。非形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ３４５５７）によりメーカーの指示に従って標識し、応答細胞として使用した。Ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９０－１０１）をメーカーの指示に従って用いて、形質導入Ｔ細胞に使用したものとは別の同種異系ドナーからのＣＤ３枯渇ＰＢＭＣを処理した。ウェル当たり５０，０００個のＣＴＶ標識Ｔ細胞と、５０，０００個のＣＤ３欠失ＰＢＭＣと、およそ５０，０００個（１：１）、１６，６６６個（４：１）、５，５５５個（１６：１）、１，８５１個（６４：１）、または６１７個（２５６：１）の選別された形質導入ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とを合わせることにより、培養物を調製した。３７℃で５日間培養した後、培養プレートを遠心分離し、サイトカイン定量化用に培養上清を採取した。細胞ペレットをＡＰＣ／Ｆｉｒｅ ７５０抗ＣＤ４を含むＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４℃で３０分間静置した。続いて細胞を洗浄し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを用いて解析した。細胞を最初にポジティブＣＤ４発現によりゲーティングし、次にＣＴＶ発現によりゲーティングし、最後に非希釈ＣＴＶ集団でゲーティングした。以下の式を用いてＣＴＶ希釈の抑制を計算した。

【数1】

【0262】

式中、ｙ＝ＣＴＶ標識集団全体の平均蛍光強度／ＣＴＶ標識集団の非希釈部分の平均蛍光強度である。データを表８及び図４に示す。

【表7】

【0263】

実施例３．操作されたＴ細胞の抑制能力
ＩＬ－１０及びＣＴＬＡ－４の過剰発現を促進するようにレンチウイルスベクターで形質導入したＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの産生の増加を示したことから、これらの細胞を、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡをコードする遺伝子を破壊するようにさらに操作した。これらの細胞の抑制能力をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで評価した。

【0264】

３．１ Ｔ細胞操作
ヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をｌｅｕｋｏｐａｋから単離し、活性化し、実施例２．２に記載のようにＩＬ１０及びＣＴＬＡ４の過剰発現を促進するようにレンチウイルスコンストラクトで形質導入した。形質導入から１日後、Ｃａｓ９を用いて形質導入した細胞を操作して、ＴＮＦＡ及びＩＦＮＧ遺伝子を破壊した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと、ＩＦＮＧ（Ｇ０１９７５３；ＩＦＮＧガイド配列ＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＣＡＡＡＡＧＡＧＵＧ（配列番号１４））またはＴＮＦＡ（Ｇ０１９７５７；ＴＮＦＡガイド配列ＡＧＡＧＣＵＣＵＵＡＣＣＵＡＣＡＡＣＡＵ（配列番号５８））を標的化するｓｇＲＮＡとを含むＬＮＰを、実施例１に記載のように製剤化した。
Ｇ０１９７５３：
ｍＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊ＧＡＧＣＡＵＣＣＡＡＡＡＧＡＧＵＧＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ （配列番号１１９）
Ｇ０１９７５７：
ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ＧＣＵＣＵＵＡＣＣＵＡＣＡＡＣＡＵＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１２０）

【0265】

各ＬＮＰ調製物を、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ３７０５００１）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１Ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ番号１００－５１２）、２００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン７、及び５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－１５を含み、１０ｕｇ／ｍｌの組換えヒトＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３５０－０２）を加えたＯｐＴｍｉｚｅｒ基本培地中で、３７℃で１５分間インキュベートした。活性化から４８時間後、形質導入Ｔ細胞を洗浄し、２００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン７、及び５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン－１５を、２．５％のヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、カタログ番号１００－５１２）とともに含むＯｐＴｍｉｚｅｒ基本培地に懸濁した。プレインキュベートしたＬＮＰ混合物を各１５ｍＬチューブに加えて、５ｕｇ／ｍｌの最終濃度の全ＲＮＡを得た。ダブルノックアウト群では、最終濃度を１０ｕｇ／ｍｌの全ＲＮＡとした。ＡｐｏＥ３を追加した培地をビヒクル対照として使用した。２４時間後、Ｔ細胞を収集し、洗浄し、実施例２に記載のようにサイトカインを含むＴ細胞ＲＰＭＩ培地中で培養して、注射当日（活性化から１５日後）まで増やした。

【0266】

３．２ 操作されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるタンパク質発現のフローサイトメトリー解析
標的発現を、実施例２のようにフローサイトメトリーによって検証した。データを表９及び図５Ａ～５Ｅに示す。

【表8】

【0267】

３．３ ＧｖＨＤモデルにおける炎症応答のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ＩＬ１０及びＣＴＬＡ４を単独で（モックＫＯ）、またはＩＦＮＧ、ＴＮＦＡの発現をノックダウンする編集、もしくはＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの二重ノックダウンと組み合わせて過剰発現する、操作されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抑制機能を、実施例２のように移植片対宿主病マウスモデルを用いて評価した。生存データを表１０及び図６Ａに示す。実施例２のように、ヒト白血球の生着を脾臓の組成によって評価した。データを表１１及び図６Ｂに示す。

【表9】

【表10】

【0268】

３．４ ＣＤ３＋ＣＤ４＋操作された細胞のサイトカインプロファイル
選別した形質転換ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激して、実施例２のように三重反復でサイトカインプロファイルを評価した。結果を表１２及び図７Ａ～７Ｆに示す。

【表11】

【0269】

３．５ 抑制機能の混合リンパ球反応アッセイ
混合リンパ球反応を使用して、表１３に記載のＣＴＶ標識Ｔ細胞：操作されたＴ細胞の比を用いて、実施例２のように形質導入細胞の抑制機能をアッセイした。データを表１３及び図８に示す。

【表12】

【0270】

実施例４．ＧｖＨＤモデルにおける炎症応答のｉｎ ｖｉｖｏ評価
野生型または高親和性バージョンのＩＬ１０及びＣＴＬＡ４を過剰発現し、ＩＦＮＧ、ＴＮＦＡの発現をノックダウンするように編集した操作されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏの抑制機能を、５×１０＾６個のＰＢＭＣ及びＴｒｅｇを注射した以外は実施例２と同じように、移植片対宿主病マウスモデルを用いて評価した。生存データを表１４及び図９Ａに示す。実施例２のように、ヒト白血球の生着を脾臓の組成により評価した。データを表１５及び図９Ｂに示す。

【表13】

【表14】

【0271】

実施例５．炎症性サイトカインに曝露した後の操作されたＴ細胞の抑制能力
炎症環境におけるＴｒｅｇ抑制表現型の安定性は、Ｔｒｅｇ療法にとって重要な検討事項である。そのため、我々は、ｓＴｒｅｇを炎症性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及びＩＬ－１βに曝露し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでその抑制機能を評価した。

【0272】

５．１ Ｔ細胞操作
ヒトＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をｌｅｕｋｏｐａｋから単離し、活性化し、実施例２．２に記載のようにＩＬ１０及びＣＴＬＡ４の過剰発現を促進するようにレンチウイルスコンストラクトで形質導入した。形質導入から１日後、実施例３．１に記載のように、ｇＲＮＡ Ｇ０１９７５４（ＩＮＦＧ）及びＧ０１９７６０（ＴＮＦＡ）を用いて、ＴＮＦＡ及びＩＦＮＧ遺伝子を破壊するようにＣａｓ９を用いて形質導入細胞を操作した。

【0273】

選別した操作されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の一部を、炎症性サイトカインの混合物（各１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；１３０－０９４－０１４）、ＩＬ－１β（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；１３０－０９３－８９８）、及びＩＬ－６（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；１３０－０９５－３６５））の存在下で培養した。ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６を２日毎に８日間補充し、その時点でＭＬＲ抑制アッセイを用いてその機能を評価した。

【0274】

実施例２のように、標的発現をフローサイトメトリーにより検証した。データを表１６に示す。

【表15】

実施例２のように、選別した形質導入されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を三重反復で刺激して、サイトカインプロファイルを評価した。データを表１７及び１８に示す。

【表16】

【表17】

【0275】

５．２ 抑制機能の混合リンパ球反応アッセイ
実施例２と同じように、混合リンパ球反応を使用して、ＣＴＶ標識Ｔ細胞と操作されたＴ細胞との比を１：１にし、形質導入細胞の抑制機能を、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６の各１００ｎｇ／ｍＬ添加のありまたはなしでアッセイした。データを表１９及び表２０、ならびに図１０Ａ～Ｂに示す。

【表18】

【表19】

【0276】

実施例６．炎症性腸疾患モデルにおける操作されたＴ細胞の抑制能力
Ｔｒｅｇは、前臨床モデルにおいて大腸炎の誘導を抑制することが知られている。さらに、ＩＬ－１０の変異はヒトにおける大腸炎発症のリスク因子として知られている。重要なことには、炎症性の結腸は、リンパ球の接着分子であるＭＡｄＣＡＭ－１を高レベルで発現することが知られている。ＩＬ１０及びＣＴＬＡ４を過剰発現し、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡをコードする遺伝子を破壊するように編集され、さらに抗ＭＡｄＣＡＭ ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のヒト化マウスモデル（例えば、Ｇｏｔｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｗ－Ｄｏｓｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ Ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ａ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１９；８（２）：１９３－１９５を参照）、またはＩＢＤのＣＤ４５ＲＢ^ｈｉ移行モデル（例えば、Ａｓｓｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈａｔ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｅｘｐｔ Ｍｅｄ．１９０（７）：９９５－１００３を参照）における治療に使用されている。

【0277】

簡潔に説明すると、０日目にＮＯＧマウスに２０×１０^６個のＰＢＭＣを注射し、５０％エタノール水溶液（Ｘ ｗ／ｖ）に懸濁した５０μＬの２，４－ジニトロベンゼンスルホン酸（ＤＮＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号５５６９７１）を含む浣腸を投与することにより、ヒト化マウスＩＢＤモデルを誘導する。操作されたＴ細胞を予防設定で評価するには、本明細書で提供される２０×１０＾６個の操作されたＴ細胞を、０日目に同じドナーからのＰＢＭＣとともに同時移植する。ヒト化モデルの治療設定では、ＰＢＭＣをＤＮＢＳ浣腸の当日に注射し、ＰＢＭＣと同じドナーからの２０×１０＾６個の操作されたＴ細胞を、その後の様々な日に移植する。体重が２０％低減した後、または少なくとも２０％の体重減少がない場合は所定の時期に、マウスを安楽死させ、結腸を収集する。既知の方法を用いて、マウスの大腸炎の程度を解析する。例えば、大腸炎の程度は、結腸の全長及び結腸長：体重の比によって決定される。結腸をホルマリン中で固定し、組織学的に結腸上皮の肥厚を解析する。ＣＴＬＡ４及びＩＬ１０の挿入と、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの両方のノックアウトとの組合せを伴う、操作されたＴ細胞を用いたマウスの予防的及び治療的処置は、上皮の肥厚を有意に低減する。いくつかの実施形態において、予防的治療及び治療的治療は、ＣＴＬＡ４の挿入と、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの両方のノックアウトとを伴う、操作されたＴ細胞を投与することを含み、上皮の肥厚を有意に低減する。いくつかの実施形態において、予防的及び治療的治療は、ＩＬ１０の挿入と、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの両方のノックアウトとを有する操作されたＴ細胞を投与することを含み、上皮の肥厚を有意に低減する。

【0278】

ＩＢＤのＴヘルパー細胞１型媒介／ＣＤ４５ＲＢ^ｈｉ移植モデルは、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ；ＢＡＬＢ）から免疫不全ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ；ＣＢ１７ＳＣ）にＣＤ４５ＲＢ^ｈｉ ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を移植することによって誘導される。大腸炎は、Ｔｈ１応答の発現に起因する。これは、分極したＴｈ１細胞が腸病変に存在するためである。相反するＣＤ４５ＲＢ^低ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット及び通常の病的なＣＤ４５ＲＢ^高細胞の同時移植は、大腸炎の発生を予防する。これは、正常なマウスからのＣＤ４５ＲＢ^低ＣＤ４＋サブセットが、腸における炎症応答を制御可能な調節性Ｔ細胞の集団を含むことを示している（Ｐｏｗｒｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅ ｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔ ｆｒｏｍ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ．Ｂ－１７ ｓｃｉｄ ｍｉｃｅ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１４６１－１４７１）。既知の方法を用いて細胞集団を単離し、腹腔内注射用に調製する。操作されたＴｒｅｇ及びｎＴｒｅｇを、上記の実施例２のように調製する。体重が２０％低減した後、または少なくとも２０％の体重減少がない場合は所定の時期にマウスを安楽死させ、その結腸を収集する。ＩＢＤのヒト化マウスモデルで提供されているような既知の方法を用いて、マウスの大腸炎の程度を解析する。ＣＴＬＡ４及びＩＬ１０の挿入と、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの両方のノックアウトとの組合せを伴う、操作されたＴ細胞を用いたマウスの処置は、上皮の肥厚を５０％超有意に低減する。いくつかの実施形態において、予防的及び治療的治療は、ＣＴＬＡ４の挿入と、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの両方のノックアウトを伴う、操作されたＴ細胞を投与することを含み、上皮の肥厚を５０％超有意に低減する。いくつかの実施形態において、予防的及び治療的治療は、ＩＬ１０の挿入と、ＩＦＮＧ及びＴＮＦＡの両方のノックアウトを伴う、操作されたＴ細胞を投与することを含み、上皮の肥厚を５０％超有意に低減する。また、治療は、体重減少も低減し、生存率を拡大する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】