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特表2024-505267Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-05
(54)【発明の名称】Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240129BHJP
C12P 1/04 20060101ALI20240129BHJP
C12P 13/22 20060101ALI20240129BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20240129BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240129BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240129BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P1/04 Z
C12P13/22 A
C12P13/08 A
C12N15/54
C12N15/55
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023546556
(86)(22)【出願日】2022-02-21
(85)【翻訳文提出日】2023-08-01
(86)【国際出願番号】 KR2022002505
(87)【国際公開番号】W WO2022191467
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】10-2021-0030087
(32)【優先日】2021-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514199250
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リ，ハン ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ビュン，ヒョ ジョン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ビョン ソ
(72)【発明者】
【氏名】キム，へ ジュ
(72)【発明者】
【氏名】ジュン，ムー ヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヒュン ジュン
(72)【発明者】
【氏名】パク，スル－ギ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE25
4B064AE34
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA24X
4B065AA24Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
本発明はＬ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物、これを用いてＬ－アミノ酸を生産する方法、Ｌ－アミノ酸生産への使用、及びＬ－アミノ酸生産用組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びフルクトキナーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）の活性が強化された、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項2】
前記グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載のＬ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項3】
前記フルクトキナーゼは、配列番号５のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載のＬ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項4】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リシン（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）またはＬ－トリプトファン（Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）である、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項5】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物または培地からＬ－アミノ酸を回収する段階を含む、Ｌ－アミノ酸の生産方法。
【請求項7】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リシンまたはＬ－トリプトファンである、請求項６に記載のＬ－アミノ酸の生産方法。
【請求項8】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項７に記載のＬ－アミノ酸の生産方法。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか一項に記載の微生物のＬ－アミノ酸生産への使用。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか一項に記載の微生物または前記微生物の培養物を含むＬ－アミノ酸生産用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物、これを用いてＬ－アミノ酸を生産する方法、Ｌ－アミノ酸生産への使用、及びＬ－アミノ酸生産用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－アミノ酸は、タンパク質の基本構成単位であり、薬品原料と食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられる。その中でも、Ｌ－リシンは、生体内で全く生合成されない必須アミノ酸であり、成長促進、カルシウム代謝、胃液分泌促進、病気に対する抵抗力の増加に必要であることが知られている。前記Ｌ－リシンは、飼料、医薬品、食品などに多様に用いられている。また、Ｌ－トリプトファンも必須アミノ酸の一つであり、飼料添加剤、輸液剤、薬品原料及び健康食品素材などとして用いられている。
【0003】
一方、コリネバクテリウム属菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特に、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は、Ｌ－アミノ酸及びその他有用物質の生産に多く用いられているグラム陽性の微生物である。前記アミノ酸の生産のために、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のための多様な研究が行われている。例えば、コリネバクテリウム属菌株においてアミノ酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させる、またはアミノ酸生合成に不要な遺伝子を除去するなどの目的物質特異的なアプローチが主に用いられている（韓国登録特許公報第１０－０９２４０６５号、第１０－１２０８４８０号）。また、このような方法以外に、アミノ酸生産に関与しない遺伝子を除去する方法、アミノ酸生産において具体的に機能が知られていない遺伝子を除去する方法も、活用されている。しかし、依然として効率的に高収率でＬ－アミノ酸を生産できる方法に関する研究の必要性が台頭している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】韓国登録特許公報第１０－０９２４０６５号
【特許文献2】韓国登録特許公報第１０－１２０８４８０号
【特許文献3】米国登録特許ＵＳ７６６２９４３ Ｂ２
【特許文献4】韓国登録特許第１０－０１５９８１２号
【特許文献5】韓国登録特許第１０－２０３５８４４号
【特許文献6】米国登録特許ＵＳ１０５８４３３８ Ｂ２
【特許文献7】米国登録特許ＵＳ８９３２８６１ Ｂ２
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０，５８７３（１９９３）
【非特許文献2】Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３，６３，１９９０
【非特許文献3】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
【非特許文献4】Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９
【非特許文献5】Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
【非特許文献6】Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６
【非特許文献7】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２
【非特許文献8】Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０
【非特許文献9】Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１
【非特許文献10】ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．６ ＮＯ．５，ＭＡＹ ２００９，ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
【非特許文献11】Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５
【非特許文献12】Ｋｊｅｌｄ Ｒａｕｎｋｊａｅｒ Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ａｔ ｅｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．、２００９ Ｆｅｂ １；１０２（２）：５８３－９７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明が解決しようとする課題は、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びフルクトキナーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）の活性が強化されたコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の一つの目的は、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びフルクトキナーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）の活性が強化された、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【0008】
本発明のもう一つの目的は、前記微生物を用いたＬ－アミノ酸の生産方法を提供することにある。
【0009】
本発明のもう一つの目的は、前記微生物のＬ－アミノ酸生産への使用を提供することにある。
【0010】
本発明のもう一つの目的は、前記微生物；及び／又は前記微生物の培養物を含むＬ－アミノ酸生産用組成物を提供することにある。
【発明の効果】
【0011】
本発明のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びフルクトキナーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）の活性が強化された、Ｌ－アミノ酸を生産する微生物はＬ－アミノ酸を高効率で生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【0012】
これを具体的に説明すれば、次の通りである。一方、本発明で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されることができる。すなわち、本発明で開示された多様な要素のすべての組合せが本発明の範囲に属する。また、下記の具体的な記述により本発明の範囲が制限されない。また、本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【0013】
本発明の一つの様態は、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びフルクトキナーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）の活性が強化された、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【0014】
本発明において用語、「Ｌ－アミノ酸」は、微生物が各種炭素源から代謝過程を経て生産され得るすべてのＬ－アミノ酸を含み、具体的には、Ｌ－リシン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－グリシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－メチオニンなどの非極性アミノ酸、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミンなどの極性アミノ酸、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸などの酸性アミノ酸であってもよい。より具体的には、本出願においてＬ－アミノ酸は、Ｌ－リシン（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）またはＬ－トリプトファン（Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）であってもよいが、これに制限されない。
【0015】
本発明の用語、「グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下、「Ｚｗｆ」）」とは、代謝経路であるペントースリン酸経路（ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ）に関与し、ブドウ糖６－リン酸を酸化させながらＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに還元させる役割をすることを意味する。
【0016】
本発明の目的上、前記タンパク質は「Ｇ６ＰＤ」、「Ｇ６ＰＤＨ」、「ブドウ糖－６－リン酸脱水素酵素」または「Ｚｗｆ」とも命名され得る。前記タンパク質をコードする遺伝子は、その例としてｚｗｆ遺伝子であってもよいが、これに制限されない。本発明において「ｚｗｆ遺伝子」は「グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子」と混用され得る。また、前記タンパク質は、一例としてコリネバクテリウム・グルタミカム由来のタンパク質と同一のタンパク質であってもよいが、Ｌ－アミノ酸の生産を増加させるものであれば、これに制限されない。
【0017】
前記Ｚｗｆは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を有したり、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１または配列番号３で記載されるアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。前記配列番号１または配列番号３の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋからその配列を確認することができる。
【0018】
前記Ｚｗｆは、配列番号２または配列番号４で記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。前記配列番号２または配列番号４の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋからその配列を確認することができる。
【0019】
具体的には、前記Ｚｗｆは、配列番号１、配列番号３及び／又は前記配列番号１、配列番号３と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列であってもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記Ｚｗｆに対応する機能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するＺｗｆも本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【0020】
本発明の用語、「フルクトキナーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ、以下、「ＣｓｃＫ」）」は、ＡＴＰの存在下でリン酸を転移し、Ｄ－フルクトース－６－リン酸とＡＤＰを生成する反応を触媒する酵素を意味する。
【0021】
本発明の目的上、前記タンパク質は「果糖リン酸化酵素」、「フルクトキナーゼ」または「ＣｓｃＫ」とも命名され得る。前記タンパク質をコードする遺伝子は、その例としてｃｓｃｋ遺伝子であってもよいが、これに制限されない。本出願において「ｃｓｃｋ遺伝子」とは「フルクトキナーゼをコードする遺伝子」と混用され得る。また、前記タンパク質は、一例としてエシェリキア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のタンパク質と同一のタンパク質であってもよいが、Ｌ－アミノ酸の生産を増加させるものであれば、これに制限されない。
【0022】
前記ＣｓｃＫは、配列番号５のアミノ酸配列を有するか、配列番号５のアミノ酸配列からなるか、または配列番号５で記載されるアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。前記配列番号５の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋからその配列を確認することができる。
【0023】
前記ＣｓｃＫは、配列番号６で記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。前記配列番号６の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋからその配列を確認することができる。
【0024】
具体的には、前記ＣｓｃＫは、配列番号５及び／又は前記配列番号５と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列であってもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記ＣｓｃＫに対応する機能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するＣｓｃＫも本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【0025】
本発明の用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）及び同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列に関連した程度を意味し、百分率で表示することができる。用語相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。
【0026】
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられる。実質的に、相同性を有するか（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）で一般に配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上でハイブリダイゼーションすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【0027】
前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に対する相同性または同一性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０，５８７３（１９９３）］、またはＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３，６３，１９９０）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。また、任意のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により配列を比較することにより確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は、当該技術範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）であってもよい。
【0028】
具体的には、前記「Ｌ－アミノ酸を生産する微生物」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含む。具体的には、外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因により特定の機序が弱化したり強化した微生物であり、目的とするＬ－アミノ酸生産のために遺伝的変異が起きたりＬ－アミノ酸生産活性を強化させた微生物であってもよい。本発明の目的上、前記Ｌ－アミノ酸を生産する微生物は、前記Ｚｗｆ及びＣｓｃｋタンパク質の発現または活性が強化され、目的とするＬ－アミノ酸生産能が増加したことを特徴とし、遺伝的に変形された微生物または組換え微生物であってもよいが、これに制限されない。
【0029】
本発明の用語タンパク質の「活性強化」とは、タンパク質の活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記「内在的活性」とは、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する場合、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。これは「変形前活性」と混用され得る。タンパク質の活性が内在的活性に比べて「増加」するということは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定タンパク質の活性に比べて向上したことを意味する。
【0030】
前記「活性増加」は、外来のタンパク質を導入するか、内在的なタンパク質の活性強化を通じて達成することができるが、具体的には、内在的なタンパク質の活性強化を通じて達成することであってもよい。前記タンパク質の活性強化の有無は、当該タンパク質の活性程度、発現量または当該タンパク質から生産される産物の量の増加から確認することができる。
【0031】
前記活性強化は、当該分野によく知られた多様な方法の適用が可能であり、目的タンパク質の活性を変形前の微生物より強化させることができる限り、制限されない。具体的には、分子生物学の日常的方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであってもよいが、これに制限されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0032】
本発明において、前記活性強化の対象となるタンパク質、すなわち、目的タンパク質はＺｗｆ及びＣｓｃｋであってもよいが、これに制限されない。
【0033】
具体的には、本発明のタンパク質活性の強化は、
１）タンパク質をコードする遺伝子の細胞内コピー数の増加；
２）タンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節配列を活性が強力な配列で交換；
３）タンパク質をコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ
領域の塩基配列の変形；
４）タンパク質活性が強化されるようにアミノ酸配列を変形；
５）タンパク質活性が強化されるように前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、活性が強化されるように変形されたタンパク質をコードするように前記タンパク質をコードする遺伝子配列の変形）；
６）タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入；
７）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）タンパク質の三次構造を分析し、露出部位を選択して変形するか、化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組合せであってもよいが、これに制限されない。
１）タンパク質をコードする遺伝子の細胞内コピー数の増加；
２）タンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節配列を活性が強力な配列で交換；
３）タンパク質をコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ
領域の塩基配列の変形；
４）タンパク質活性が強化されるようにアミノ酸配列を変形；
５）タンパク質活性が強化されるように前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、活性が強化されるように変形されたタンパク質をコードするように前記タンパク質をコードする遺伝子配列の変形）；
６）タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入；
７）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）タンパク質の三次構造を分析し、露出部位を選択して変形するか、化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組合せであってもよいが、これに制限されない。
【0034】
具体的には、前記１）タンパク質をコードする遺伝子の細胞内コピー数の増加は、当業界に知られている任意の方法、例えば、当該タンパク質をコードする遺伝子が作動可能に連結された、宿主と関係がなく複製され、機能できるベクターを宿主細胞内に導入されることにより行われ得る。または前記遺伝子が作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記遺伝子を挿入させるベクターが宿主細胞内に導入されることにより実行されるが、これに制限されない。
【0035】
本発明において用語、「ベクター」は、適した宿主内で目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、目的タンパク質を発現させるのに適した調節配列に作動可能に連結された形態で含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記発現調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係がなく複製され、又は機能することができ、ゲノムそれ自体に統合することができる。
【0036】
本発明で用いられるベクターは、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを使用することができる。
【0037】
本発明において用語、「形質転換」とは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドが宿主細胞内で発現できさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置したり染色体外に位置したりに関係なく、これらすべてを含むことができる。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入する如何なる方法も含まれ、宿主細胞により当分野において公知となった通り、適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ4）の沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）の沈殿、微量注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【0038】
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列または発現調節領域と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知となった遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作することができるが、これに制限されない。
【0039】
前記２）タンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節配列を活性が強力な配列で交換する方法は、当業界に知られている任意の方法、例えば、前記発現調節配列の活性をより一層強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せで配列上の変異を誘導して行うか、より一層強い活性を有する核酸配列で交換することにより行われ得る。前記発現調節配列は、特に、これに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含むことができる。前記方法は、具体的には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターを連結させることであってもよいが、これに制限されない。
【0040】
公知となった強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国登録特許ＵＳ７６６２９４３ Ｂ２）、ｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター及びｒｍｆプロモーターが含まれ得るが、これに制限されず、内在的活性に比べて強力なプロモーターで置換するものはすべて含む。
【0041】
前記３）タンパク質をコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域の塩基配列変形は、当業界に知られている任意の方法、例えば、前記タンパク質の内在的開始コドンを前記内在的開始コドンに比べてタンパク質発現率がさらに高い他の開始コドンで置換するものであってもよいが、これに制限されない。
【0042】
前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、当業界に知られている任意の方法、例えば、前記ポリヌクレオチド配列の活性をより一層強化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組合せで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、より一層強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列で交換することにより行われ得る。前記交換は、具体的には、相同組換えにより前記遺伝子を染色体内に挿入することであってもよいが、これに制限されない。この時に用いられるベクターは、染色体挿入の有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含むことができる。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち、導入しようとする遺伝子挿入の有無を確認するためのものであり、薬品耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが用いられ、これに限定されるものではない。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞だけ生存する、または他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【0043】
前記６）タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチド、またはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して行われ得る。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限なく用いられる。また、導入された前記外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、そのコドンを最適化して宿主細胞内に導入することができる。前記導入は、公知となった形質転換方法を当業者が適切に選択して実行され、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現することによりタンパク質が生成され、その活性が増加することができる。
【0044】
前記７）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。
【0045】
前記８）タンパク質の三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を公知のタンパク質の配列情報が保存されたデータベースと比較することにより配列の類似性程度により鋳型タンパク質候補を決定し、これに基づいて構造を確認し、変形するか、化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾するものであってもよい。
【0046】
このようなタンパク質の活性強化は、対応するタンパク質の活性または濃度が野生型や変形前の微生物菌株で発現したタンパク質の活性または濃度を基準として増加するか、当該タンパク質から生産される産物の量を増加するものであってもよいが、これに制限されるものではない。本発明において用語「変形前の菌株」または「変形前の微生物」は、微生物に自然的に発生しうる突然変異を含む菌株を除くものではなく、天然型菌株自体であるか、人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する前の菌株を意味する。本発明において、前記形質変化はＰｈｅＡの活性強化であってもよい。前記「変形前の菌株」または「変形前の微生物」は「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」、「非変形微生物」または「基準微生物」と混用され得る。
【0047】
本発明において、前記基準微生物は、Ｌ－アミノ酸を生産する微生物であれば、特に制限されず、野生型に比べてＬ－アミノ酸生産能が強化された変異菌株も制限なく含まれる。その例として、Ｌ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（韓国登録特許第１０－０１５９８１２号）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（韓国登録特許第１０－０９２４０６５号）、ＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０）菌株またはＬ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ（韓国登録特許第１０－２０３５８４４号）菌株の生合成経路を強化するために前記菌株に一つ以上の遺伝的変形が追加された菌株が含まれてもよいが、これに制限されない。
【0048】
本発明の目的上、前記Ｌ－アミノ酸を生産する微生物は、前述した方法でＺｗｆ及びＣｓｃｋ活性が強化され、Ｌ－アミノ酸を生産できる微生物であれば、いずれも可能である。本出願において前記「Ｌ－アミノ酸を生産する微生物」は「Ｌ－アミノ酸生産微生物」、「Ｌ－アミノ酸生産能を有する微生物」と混用され得、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよいが、これに制限されない。
【0049】
本出願において「コリネバクテリウム属微生物」は、すべてのコリネバクテリウム属微生物を含むことができる。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよく、さらに具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよい。
【0050】
一方、コリネバクテリウム属微生物がＬ－アミノ酸を生産できることはすでに知られていたが、その生産能が顕著に低く、生産の機序に作用する遺伝子や機序の原理の全部は明らかになっていない状態である。したがって、本発明の「Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物」は、天然の野生型微生物自体、Ｌ－アミノ酸生産の機序に関連した遺伝子の活性を強化させ、不活性させ、又は向上したＬ－アミノ酸生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物、または外部遺伝子の活性を導入または強化させ、向上したＬ－アミノ酸生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。
【0051】
本発明は、他の一つの様態として、本発明による前記微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物または培地からＬ－アミノ酸を回収する段階を含む、Ｌ－アミノ酸生産方法を提供する。
【0052】
本発明による前記微生物は、先に説明した通りである。
【0053】
本発明の方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養は、当業界に知られている任意の培養条件及び培養方法が用いられる。
【0054】
本発明において用語「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本発明においてＬ－アミノ酸を生産する微生物を用いてＬ－アミノ酸を培養する方法は、当業界に広く知られている方法を利用して行うことができる。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｏｒ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）で連続式で培養することができるが、これに制限されるものではない。培養に用いられる培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリウム菌株に対する培養培地は公知となっている（例えば、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）。
【0055】
培地中で用いられる炭素源としては、ブドウ糖、サッカロース、乳糖、果糖、マルトース、デンプン、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これら物質は、個別にまたは混合物として用いられ、これに限定されるものではない。
【0056】
用いられる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別的に、または混合物として使用することができ、これに限定されるものではない。
【0057】
前記培地に含まれるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウムを含有する塩が含まれ得る。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができる。最後に、前記物質に加えてアミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられる。また、培養培地に適切な前駆体が用いられる。前記の原料は、培養過程で培養物に適切な方式により回分式でまたは連続式で添加されてもよいが、これに制限されない。
【0058】
前記微生物の培養中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で用いて培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体（例、空気）を注入することができる。培養水の温度は、普通２０℃～４５℃、具体的には２５℃～４０℃であってもよい。培養時間は、目的とするＬ－アミノ酸の生成量が得られるまで継続できるが、具体的には、１０～１６０時間であってもよい。しかし、これら例示に制限されるものではない。
【0059】
本発明は、本発明の方法で前記培養する段階以前、培地を準備する段階をさらに含んでもよいが、これに制限されない。
【0060】
培養物からのＬ－アミノ酸の分離は、当業界に知られている常法により分離することができる。このような分離方法には、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が用いられる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄液を、イオン交換クロマトグラフィーを通じて分離することができるが、これに限定されるものではない。
【0061】
また、前記回収段階は、精製工程を含むことができ、当該分野に公知となった適切な方法を利用して行われてもよい。
【0062】
本発明は、他の一つの様態として、本発明による前記微生物のＬ－アミノ酸生産への使用を提供する。
【0063】
本発明による前記微生物及びＬ－アミノ酸は、先に説明した通りである。
【0064】
本発明は、他の一つの様態として、本発明による前記微生物；及び／又は前記微生物の培養物を含むＬ－アミノ酸生産用組成物を提供する。
【0065】
本発明による前記微生物及びＬ－アミノ酸は、先に説明した通りである。
【実施例】
【0066】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【0067】
実施例１．強化ベクターの作製
実施例１－１．コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２由来のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）が強化されたベクターの作製
前記遺伝子の強化は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）にそれぞれＳＰＬ１３プロモーター（米国登録特許ＵＳ１０５８４３３８ Ｂ２）とコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＣＪ７プロモーター（米国登録特許ＵＳ７６６２９４３ Ｂ２）で連結されたｚｗｆを入れて効果を確認した。
実施例１－１．コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２由来のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）が強化されたベクターの作製
前記遺伝子の強化は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）にそれぞれＳＰＬ１３プロモーター（米国登録特許ＵＳ１０５８４３３８ Ｂ２）とコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＣＪ７プロモーター（米国登録特許ＵＳ７６６２９４３ Ｂ２）で連結されたｚｗｆを入れて効果を確認した。
【0068】
ｚｗｆは、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡをそれぞれ鋳型とし、ＮＣＢＩ塩基配列（ＮＣ＿００３４５０．３）情報に基づいて配列番号９、１０（表１）と配列番号１３、１４（表２）のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作し、表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行ってベクターを製作するためのｚｗｆ遺伝子断片を取得した。
【0069】
【表1】
【0070】
【表2】
【0071】
【表3】
【0072】
【表4】
【0073】
ＳＰＬ１３プロモーターとコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＣＪ７プロモーターを得るために、配列番号７と８（表１）、配列番号１１と１２（表２）のプライマーを用いてＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行った（表４）。増幅されたＳＰＬ１３、ＣＪ７プロモーター部位とｚｗｆ遺伝子断片及びＳｃａＩ制限酵素で切断されたベクターｐＤＺＴｎ（米国登録特許ＵＳ８９３２８６１ Ｂ２）をギブスン・アセンブリー（ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．６ ＮＯ．５，ＭＡＹ ２００９，ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）方法を利用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が抱合されたＬＢ固体培地に塗抹した。目的とした遺伝子とｐＤＺＴｎが連結されたベクターで形質転換されたコロニーを選別するために、配列番号４７と４８（表３）プライマーでＰＣＲを行った。選別されたコロニーから通常知られているプラスミド抽出法を利用してプラスミドを取得し、前記プラスミドをｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）と命名した。
【0074】
実施例１－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）が強化されたベクターの作製
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｚｗｆ強化効果の確認は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡをそれぞれ鋳型とし、米国国立衛生研究所ジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９遺伝子及び周辺塩基配列に対する情報を基に配列番号１７、１８（表５）と配列番号２１、２２（表６）のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作し、表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）してベクターを製作するためのｚｗｆ遺伝子断片を取得した。
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｚｗｆ強化効果の確認は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡをそれぞれ鋳型とし、米国国立衛生研究所ジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９遺伝子及び周辺塩基配列に対する情報を基に配列番号１７、１８（表５）と配列番号２１、２２（表６）のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作し、表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）してベクターを製作するためのｚｗｆ遺伝子断片を取得した。
【0075】
【表5】
【0076】
【表6】
【0077】
ＳＰＬ１３プロモーターとコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＣＪ７プロモーターを得るために、配列番号１５と１６（表５）、配列番号１９と２０（表６）プライマーを用いて表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行った。
【0078】
増幅されたＳＰＬ１３、ＣＪ７プロモーター部位とｚｗｆ遺伝子断片及びＳｃａＩ制限酵素で切断されたベクターｐＤＺＴｎ（米国登録特許ＵＳ８９３２８６１ Ｂ２）をギブスン・アセンブリー（ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．６ ＮＯ．５，ＭＡＹ ２００９，ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）方法を利用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が抱合されたＬＢ固体培地に塗抹した。目的とした遺伝子とｐＤＺＴｎが連結されたベクターで形質転換されたコロニーを選別するために、配列番号４７と４８（表３）プライマーでＰＣＲを行った。選別されたコロニーから通常知られているプラスミド抽出法を利用してプラスミドを取得し、このプラスミドをｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）と命名した。
【0079】
実施例１－３．エシェリキア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来フルクトキナーゼ遺伝子（ｃｓｃＫ）が強化されたベクターの作製
エシェリキア由来のフルクトキナーゼ遺伝子の塩基配列は、すでに明らかになっており、公開されている。ＮＣＢＩのエシェリキア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ（ＣＰ００２９６７）からｃｓｃＫ遺伝子情報を確保し、これに基づいて配列番号２５と２６（表７）、配列番号２９と３０（表８）のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作し、表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行ってベクターを製作するためのｃｓｃＫ遺伝子断片を取得した。
エシェリキア由来のフルクトキナーゼ遺伝子の塩基配列は、すでに明らかになっており、公開されている。ＮＣＢＩのエシェリキア・コリ（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｗ（ＣＰ００２９６７）からｃｓｃＫ遺伝子情報を確保し、これに基づいて配列番号２５と２６（表７）、配列番号２９と３０（表８）のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作し、表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行ってベクターを製作するためのｃｓｃＫ遺伝子断片を取得した。
【0080】
ＳＰＬ１３プロモーターとＣＪ７プロモーターを得るために、配列番号２３と２４（表７）、配列番号２７と２８（表８）プライマーを用いて表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行った。
【0081】
増幅されたＳＰＬ１３、ＣＪ７プロモーター部位とｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）遺伝子断片及びＳｃａＩ制限酵素で切断されたベクターｐＤＺＴｎ（米国登録特許ＵＳ８９３２８６１ Ｂ２）をギブスン・アセンブリー（ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．６ ＮＯ．５，ＭＡＹ ２００９，ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）方法を利用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が抱合されたＬＢ固体培地に塗抹した。目的とした遺伝子とｐＤＺＴｎが連結されたベクターで形質転換されたコロニーを選別するために、配列番号４７と４８（表３）プライマーでＰＣＲを行った。選別されたコロニーから通常知られているプラスミド抽出法を利用してプラスミドを取得し、前記プラスミドをｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
【0082】
【表7】
【0083】
【表8】
【0084】
実施例１－４．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来ｚｗｆとエシェリキア・コリ由来ｃｓｃＫが強化されたベクターの作製
実施例１－１と実施例１－３の個別遺伝子強化の効果を確認し、両遺伝子の同時強化効果を確認するためにベクターを作製した。
実施例１－１と実施例１－３の個別遺伝子強化の効果を確認し、両遺伝子の同時強化効果を確認するためにベクターを作製した。
【0085】
実施例１－１のｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）と実施例１－３のｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）をそれぞれ鋳型とし、配列番号３１、３２と配列番号３３、３４（表９）のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作し、表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行ってＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）とＰｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）を得た。増幅されたＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）とＰｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）遺伝子断片及びＳｃａＩ制限酵素で切断されたベクターｐＤＺＴｎ（米国登録特許ＵＳ８９３２８６１ Ｂ２）をギブスン・アセンブリー（ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．６ ＮＯ．５，ＭＡＹ ２００９，ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）方法を利用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が抱合されたＬＢ固体培地に塗抹した。目的とした遺伝子とｐＤＺＴｎが連結されたベクターで形質転換されたコロニーを選別するために、配列番号４７と４８（表３）プライマーでＰＣＲを行った。選別されたコロニーから通常知られているプラスミド抽出法を利用してプラスミドを取得し、前記プラスミドをｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
【0086】
前記方法と同様に、実施例１－１のｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）と実施例１－３のｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）をそれぞれ鋳型とし、配列番号３５、３６（表１０）と配列番号３７、３８（表１０）のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作し、表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行ってＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）とＰｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）を得た。増幅されたＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）とＰｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）遺伝子断片及びＳｃａＩ制限酵素で切断されたベクターｐＤＺＴｎ（米国登録特許ＵＳ８９３２８６１ Ｂ２）をギブスン・アセンブリー（ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．６ ＮＯ．５，ＭＡＹ ２００９，ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）方法を利用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が抱合されたＬＢ固体培地に塗抹した。目的とした遺伝子とｐＤＺＴｎが連結されたベクターで形質転換されたコロニーを選別するために、配列番号４７と４８（表３）プライマーでＰＣＲを行った。選別されたコロニーから通常知られているプラスミド抽出法を利用してプラスミドを取得し、前記プラスミドをｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
【0087】
【表9】
【0088】
【表10】
【0089】
実施例１－５．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来ｚｗｆとエシェリキア・コリ由来ｃｓｃＫが強化されたベクターの作製
実施例１－２と実施例１－３の個別遺伝子強化効果を確認し、両遺伝子の同時強化効果を確認するためにベクターを作製した。
実施例１－２と実施例１－３の個別遺伝子強化効果を確認し、両遺伝子の同時強化効果を確認するためにベクターを作製した。
【0090】
実施例１－２のｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）と実施例１－３のｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）をそれぞれ鋳型とし、配列番号３９，１０と配列番号４１，４２（表１１）のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作し、表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行ってＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）とＰｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）を得た。増幅されたＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）とＰｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）遺伝子断片及びＳｃａＩ制限酵素で切断されたベクターｐＤＺＴｎ（米国登録特許ＵＳ８９３２８６１ Ｂ２）をギブスン・アセンブリー（ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．６ ＮＯ．５，ＭＡＹ ２００９，ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）方法を利用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が抱合されたＬＢ固体培地に塗抹した。目的とした遺伝子とｐＤＺＴｎが連結されたベクターで形質転換されたコロニーを選別するために、配列番号４９と５０（表３）プライマーでＰＣＲを行った。選別されたコロニーから通常知られているプラスミド抽出法を利用してプラスミドを取得し、前記プラスミドをｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
【0091】
前記方法と同様に、実施例１－２のｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）と実施例１－３のｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）をそれぞれ鋳型とし、配列番号４３、４４と配列番号４５、４６（表１２）のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作して表４の条件でＰＣＲ（ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を行ってＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）とＰｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）を得た。増幅されたＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）とＰｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）遺伝子断片及びＳｃａＩ制限酵素で切断されたベクターｐＤＺＴｎ（米国登録特許ＵＳ８９３２８６１ Ｂ２）をギブスン・アセンブリー（ＤＧ Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．６ ＮＯ．５，ＭＡＹ ２００９，ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）方法を利用して連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が抱合されたＬＢ固体培地に塗抹した。目的とした遺伝子とｐＤＺＴｎが連結されたベクターで形質転換されたコロニーを選別するために、配列番号４７と４８（表３）プライマーでＰＣＲを行った。選別されたコロニーから通常知られているプラスミド抽出法を利用してプラスミドを取得し、このプラスミドをｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
【0092】
【表11】
【0093】
【表12】
【0094】
実施例２．強化菌株の作製
実施例２－１．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のｚｗｆが強化されたリシン生産菌株の作製
実施例１－１で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）ベクターをそれぞれ利用してＬ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（韓国登録特許第１０－０１５９８１２号）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（韓国登録特許第１０－０９２４０６５号）、ＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）とＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）と命名した。
実施例２－１．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のｚｗｆが強化されたリシン生産菌株の作製
実施例１－１で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）ベクターをそれぞれ利用してＬ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（韓国登録特許第１０－０１５９８１２号）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（韓国登録特許第１０－０９２４０６５号）、ＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）とＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）と命名した。
【0095】
実施例２－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｚｗｆが強化されたトリプトファン生産菌株の作製
実施例１－２で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）ベクターをそれぞれ利用してＬ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ（韓国登録特許第１０－２０３５８４４号）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）とＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）、ＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）と命名した。
実施例１－２で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）ベクターをそれぞれ利用してＬ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ（韓国登録特許第１０－２０３５８４４号）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）とＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）、ＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）と命名した。
【0096】
実施例２－３．エシェリキア・コリ由来ｃｓｃＫが強化されたリシン、トリプトファン生産菌株の作製
実施例１－３で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）ベクターをそれぞれ利用してＬ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（韓国登録特許第１０－０１５９８１２号）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（韓国登録特許第１０－０９２４０６５号）、ＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０）菌株とＬ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ（韓国登録特許第１０－２０３５８４４号）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）とＰｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得したリシン生産菌株はコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名し、トリプトファン生産菌株はＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
実施例１－３で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）ベクターをそれぞれ利用してＬ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（韓国登録特許第１０－０１５９８１２号）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（韓国登録特許第１０－０９２４０６５号）、ＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０）菌株とＬ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ（韓国登録特許第１０－２０３５８４４号）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）とＰｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得したリシン生産菌株はコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名し、トリプトファン生産菌株はＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
【0097】
実施例２－４．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のｚｗｆとエシェリキア・コリ由来ｃｓｃＫが強化されたリシン生産菌株の作製
実施例１－４で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）ベクターをそれぞれ利用してＬ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（韓国登録特許第１０－０１５９８１２号）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（韓国登録特許第１０－０９２４０６５号）、ＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）とＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿ Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿ Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
実施例１－４で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）ベクターをそれぞれ利用してＬ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（韓国登録特許第１０－０１５９８１２号）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（韓国登録特許第１０－０９２４０６５号）、ＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１３：Ｒ４０）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）とＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿ Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿ Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＣＪ３Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
【0098】
実施例２－５．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｚｗｆとエシェリキア・コリ由来ｃｓｃＫが強化されたトリプトファン生産菌株の作製
実施例１－５で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）ベクターをそれぞれ利用してＬ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ菌株（韓国登録特許第１０－２０３５８４４号）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）とＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得したトリプトファン生産菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
実施例１－５で作製されたｐＤＺＴｎ－Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ｐＤＺＴｎ－Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）ベクターをそれぞれ利用してＬ－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ菌株（韓国登録特許第１０－２０３５８４４号）菌株を電気穿孔法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９９） ５２：５４１－５４５）で形質転換した後、２次交差過程を経てトランスポゾン遺伝子の間にＰｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）とＰｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）がそれぞれ挿入された菌株を取得した。当該遺伝子が挿入された位置を含む隣接部位を増幅できる配列番号４７と配列番号４８のプライマー（表３）を利用してＰＣＲ及び塩基配列分析を行い、当該遺伝的操作を確認した。このように収得したトリプトファン生産菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）、ＫＣＣＭ１２２１８Ｐ＿Ｐｃｊ７－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）＿Ｐｓｐｌ１３－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）と命名した。
【0099】
実施例３．Ｚｗｆ、ｃｓｃＫ強化菌株のＬ－リシンまたはＬ－トリプトファン生産能の比較
実施例３－１．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来ｚｗｆ、エシェリキア・コリ由来ｃｓｃＫ強化菌株のＬ－リシン生産能の比較
実施例２－４で製作されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＣＪ３Ｐ基盤ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）同時強化菌株と実施例２－１で製作されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＣＪ３Ｐ基盤ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）強化菌株、実施例２－３で製作されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＣＪ３Ｐ基盤ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）強化菌株をそれぞれ以下のような方法で培養し、菌体量、糖消耗能、リシン生産能を比較した。
実施例３－１．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来ｚｗｆ、エシェリキア・コリ由来ｃｓｃＫ強化菌株のＬ－リシン生産能の比較
実施例２－４で製作されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＣＪ３Ｐ基盤ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）同時強化菌株と実施例２－１で製作されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＣＪ３Ｐ基盤ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）強化菌株、実施例２－３で製作されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＣＪ３Ｐ基盤ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）強化菌株をそれぞれ以下のような方法で培養し、菌体量、糖消耗能、リシン生産能を比較した。
【0100】
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３７℃で４２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後ＨＰＬＣによりＬ－リシンの生産量を測定した。前記実験は３回繰り返され、培養結果（平均値）は表１３、１４，１５に示した。
【0101】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ビオチン０．１ｍｇ、チアミンＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２２ｍｇ、ニコチンアミド２ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ビオチン０．１ｍｇ、チアミンＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２２ｍｇ、ニコチンアミド２ｇ（蒸溜水１リットルを基準）
【0102】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
原糖４５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １５ｇ、大豆タンパク質１０ｇ、糖蜜１０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．６ｇ、ビオチン０．９ｍｇ、チアミン塩酸塩４．５ｍｇ、パントテン酸カルシウム４．５ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ９ｍｇ、ＦｅＳＯ4 ９ｍｇ、ＺｎＳＯ4 ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ4 ０．４５ｍｇ、ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸溜水１リットルを基準）。
原糖４５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １５ｇ、大豆タンパク質１０ｇ、糖蜜１０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．６ｇ、ビオチン０．９ｍｇ、チアミン塩酸塩４．５ｍｇ、パントテン酸カルシウム４．５ｍｇ、ニコチンアミド３０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ９ｍｇ、ＦｅＳＯ4 ９ｍｇ、ＺｎＳＯ4 ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ4 ０．４５ｍｇ、ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸溜水１リットルを基準）。
【0103】
前記作製されたｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）単独強化または同時強化リシン生産菌株は、下記表１３に示した通り親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて収率１．２～２．６％向上効果を確認した。コリネバクテリウムからリシン１ｍｏｌ生産のためには、ＮＡＤＰＨ ４ｍｏｌが必要であるため、リシン生産菌株においてＮＡＤＰＨ供給能の増加は、すぐに収率増加と密接な関連性を有する（Ｋｊｅｌｄ Ｒａｕｎｋｊａｅｒ Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ａｔ ｅｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．、２００９ Ｆｅｂ １；１０２（２）：５８３－９７．）。本発明においては、ＫＣＣＭ１０１６Ｐ菌株にｚｗｆ遺伝子を単独強化してＮＡＤＰＨ供給能を向上させ、これにより生産量０．９ｇ／Ｌの向上効果を確認した。さらに、コリネバクテリウムの原糖利用時に発生する細胞内部果糖をすぐに利用することができるようにｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）遺伝子を導入し、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて１５．２％増加した２．１／Ｌ向上効果を確認した。最終的に、ｃｓｃＫとｚｗｆを同時強化することによりｚｗｆ遺伝子を通じた還元力供給能が最大化してリシン収率向上効果が単独強化比で大きく増加することをＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）菌株評価により確認した。
【0104】
前記遺伝子の強化効果は、表１４と１５のように他のリシン生産菌株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＣＪ３Ｐでも同様な効果を示した。いずれもｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）単独強化菌株より同時強化をした時、それぞれ親株比で２２．１％、２７．１％増加した生産量１．９ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ向上した結果を示した。
【0105】
【表13】
【0106】
【表14】
【0107】
【表15】
【0108】
実施例３－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｚｗｆとエシェリキア・コリ由来ｃｓｃＫ強化菌株のＬ－トリプトファン生産能の比較
実施例２－５で作製されたＫＣＣＭ１２２１８Ｐ基盤ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）、ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）同時強化菌株と実施例２－２で作製されたＫＣＣＭ１２２１８Ｐ基盤ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）強化菌株、実施例２－３で作製されたＫＣＣＭ１２２１８Ｐ基盤ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）強化菌株をそれぞれ以下のような方法で培養し、菌体量、糖消耗能、トリプトファン生産能を比較した。
実施例２－５で作製されたＫＣＣＭ１２２１８Ｐ基盤ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）、ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）同時強化菌株と実施例２－２で作製されたＫＣＣＭ１２２１８Ｐ基盤ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）強化菌株、実施例２－３で作製されたＫＣＣＭ１２２１８Ｐ基盤ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）強化菌株をそれぞれ以下のような方法で培養し、菌体量、糖消耗能、トリプトファン生産能を比較した。
【0109】
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して３７℃で４２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後、ＨＰＬＣによりＬ－トリプトファンの生産量を測定した。前記実験は３回繰り返され、培養結果（平均値）は表１６に示した。
【0110】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットルを基準）
原糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸溜水１リットルを基準）
【0111】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
原糖３０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １５ｇ、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ １．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン９００μｇ、チアミン塩酸塩４５００μｇ、パントテン酸カルシウム４５００μｇ、ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸溜水１リットルを基準）。
原糖３０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １５ｇ、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ １．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、酵母抽出物５ｇ、ビオチン９００μｇ、チアミン塩酸塩４５００μｇ、パントテン酸カルシウム４５００μｇ、ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸溜水１リットルを基準）。
【0112】
前記作製されたｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）、ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）遺伝子が単独強化されたトリプトファン生産菌株は、下記表１６に示した通り親株であるＫＣＣＭ１２２１８Ｐと比較してトリプトファンの収率が０．５８～１．６７％向上した。特に、ｃｓｃＫ遺伝子の発現強化がｚｗｆ遺伝子の強化よりトリプトファン収率向上に、より大きな影響を与え、これは、細胞内部で原糖が分解されて生成された果糖の一部分が細胞の外部に排出されず、フルクトース－６－リン酸塩に転換されて解糖過程に流入し、このような現象により排出された果糖が流入して用いられるＰＥＰ ｐｏｏｌを消耗することなくトリプトファン前駆体として用いたことと判断される。また、ｚｗｆ遺伝子の発現によるトリプトファン収率の強化は、トリプトファンの前駆体として用いられるＰＲＰＰ及びＥ４Ｐの細胞内濃度を向上させたことと判断される。前記両遺伝子ｚｗｆ及びｃｓｃＫが同時強化された菌株では、トリプトファン収率向上因子が統合されて親株であるＫＣＣＭ１２２１８Ｐと比較してトリプトファンの生産量が３４％～４５％向上し、前記両遺伝子が単独で強化された時と比較し、非常に向上したトリプトファン収率を確認した。
【0113】
【表16】
【0114】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-09-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0103】
前記製作されたｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）、ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）単独強化または同時強化リシン生産菌株は、下記表１３に示した通り親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて収率４．３～１５．２％向上効果を確認した。コリネバクテリウムからリシン１ｍｏｌ生産のためには、ＮＡＤＰＨ ４ｍｏｌが必要であるため、リシン生産菌株においてＮＡＤＰＨ供給能の増加は、すぐに収率増加と密接な関連性を有する（Ｋｊｅｌｄ Ｒａｕｎｋｊａｅｒ Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ａｔ ｅｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．、２００９ Ｆｅｂ １；１０２（２）：５８３－９７．）。本出願においては、ＫＣＣＭ１０１６Ｐ菌株にｚｗｆ遺伝子を単独強化してＮＡＤＰＨ供給能を向上させ、これにより生産量０．９ｇ／Ｌの向上効果を確認した。さらに、コリネバクテリウムの原糖利用時に発生する細胞内部果糖をすぐに利用することができるようにｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）遺伝子を導入し、親株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べて１５．２％増加した２．１／Ｌ向上効果を確認した。最終的に、ｃｓｃＫとｚｗｆを同時強化することによりｚｗｆ遺伝子を通じた還元力供給能が最大化してリシン収率向上効果が単独強化比で大きく増加することをＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Ｐｓｐｌ１３－ｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３０３２）＿Ｐｃｊ７－ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）菌株評価により確認した。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0112】
前記製作されたｚｗｆ（Ｃ．ｇｌ１３８６９）、ｃｓｃＫ（Ｅ．ｃｏ）遺伝子が単独強化されたトリプトファン生産菌株は、下記表１６に示した通り親株であるＫＣＣＭ１２２１８Ｐと比較してトリプトファンの収率が７．９～２３．３％向上した。特に、ｃｓｃＫ遺伝子の発現強化がｚｗｆ遺伝子の強化よりトリプトファン収率向上に、より大きな影響を与え、これは、細胞内部で原糖が分解されて生成された果糖の一部分が細胞の外部に排出されず、フルクトース－６－リン酸塩に転換されて解糖過程に流入し、このような現象により排出された果糖が流入して用いられるＰＥＰ ｐｏｏｌを消耗することなくトリプトファン前駆体として用いたことと判断される。また、ｚｗｆ遺伝子の発現によるトリプトファン収率の強化は、トリプトファンの前駆体として用いられるＰＲＰＰ及びＥ４Ｐの細胞内濃度を向上させたことと判断される。前記両遺伝子ｚｗｆ及びｃｓｃＫが同時強化された菌株では、トリプトファン収率向上因子が統合されて親株であるＫＣＣＭ１２２１８Ｐと比較してトリプトファンの生産量が３４％～４５％向上し、前記両遺伝子が単独で強化された時と比較し、非常に向上したトリプトファン収率を確認した。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】