特表 2024-507846 核酸の送達のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-21

(54)【発明の名称】核酸の送達のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/88 20060101AFI20240214BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240214BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240214BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240214BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240214BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240214BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20240214BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240214BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240214BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240214BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240214BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20240214BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240214BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240214BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20240214BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240214BHJP

【ＦＩ】

C12N15/88 Z ZNA

A61K48/00

A61P43/00 105

A61P43/00 111

A61P1/16

A61P3/00

A61P7/04

A61K9/16

A61K47/22

A61K47/28

A61K47/24

A61K47/10

C12N15/52 Z

C12N15/12

C12N15/09 110

C12N15/63 Z

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023550218

(86)(22)【出願日】2022-02-23

(85)【翻訳文提出日】2023-10-10

(86)【国際出願番号】 US2022017570

(87)【国際公開番号】W WO2022182792

(87)【国際公開日】2022-09-01

(31)【優先権主張番号】63/152,517

(32)【優先日】2021-02-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/156,649

(32)【優先日】2021-03-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/164,174

(32)【優先日】2021-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/197,946

(32)【優先日】2021-06-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519331338

【氏名又は名称】ポセイダ セラピューティクス，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100225598

【弁理士】

【氏名又は名称】桐島 拓也

(72)【発明者】

【氏名】ジョシュア ライチャック

(72)【発明者】

【氏名】ショーン エセックス

(72)【発明者】

【氏名】マシュー ブッチャー

(72)【発明者】

【氏名】ピーター グリフィン

(72)【発明者】

【氏名】ブレア マディソン

(72)【発明者】

【氏名】レナタ マーティン

(72)【発明者】

【氏名】ネハ パラヤス

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ジェイ．ベネット

(72)【発明者】

【氏名】カーリド エー．ハッジ

(72)【発明者】

【氏名】オスカー アルバレス

(72)【発明者】

【氏名】ダン ジェイ．スミス

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076CC14

4C076CC16

4C076CC21

4C076CC26

4C076CC29

4C076DD60

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE23

4C084AA13

4C084MA41

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA751

4C084ZB211

4C084ZC191

4C084ZC211

(57)【要約】

本開示は、限定されるものではないが、肝細胞を含む、細胞の遺伝子改変のための組成物及び方法を提供する。組成物及び方法は、脂質ナノ粒子を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質、少なくとも１つの構造脂質、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組成物であって、
約５３モル％～約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３４モル％～約４１モル％のコレステロールと、
約４モル％～約１１モル％のＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、又はＤＯＰＥと、
約０．５モル％～約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７０：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、組成物。

【請求項2】

約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４０モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４０モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
前記少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、前記少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項15】

前記ＲＮＡ分子が、ｍＲＮＡ分子であり、好ましくは、前記ｍＲＮＡ分子が、５’－ＣＡＰを更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記少なくとも１つのＲＮＡ分子が、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードする核酸配列を含み、好ましくは、前記トランスポサーゼが、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ、ｐｉｇｇｙＢａｃ様（ＰＢＬ）トランスポサーゼ、Ｓｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼポリペプチド、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼ、Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼ、ヘリトロントランスポサーゼ、Ｔｏｌ２トランスポサーゼ、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼ、又は変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼである、請求項１～１３又は１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記ＤＮＡ分子が、環状ＤＮＡ分子、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡナノプラスミド、又は直鎖状ＤＮＡ分子であり、好ましくは、前記ＤＮＡ分子が、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子又はＤＮＡナノプラスミドである、請求項１４に記載の組成物。

【請求項18】

前記少なくとも１つのＤＮＡ分子が、少なくとも１つのトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、請求項１４又は１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

前記少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのトランスポゾンをコードする核酸配列を含み、前記トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項１４、１７及び１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記少なくとも１つの治療用タンパク質が、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）、第ＶＩＩＩ因子、又は第ＩＸ因子である、請求項１９又は２０に記載の組成物。

【請求項22】

少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの細胞に送達する方法であって、前記少なくとも１つの細胞を、先行請求項のいずれか一項に記載の少なくとも１つの組成物と接触させることを含む、方法。

【請求項23】

少なくとも１つの細胞を遺伝子改変する方法であって、前記少なくとも１つの細胞を、先行請求項のいずれか一項に記載の少なくとも１つの組成物と接触させることを含む、方法。

【請求項24】

前記少なくとも１つの細胞が、少なくとも１つの肝臓細胞であり、好ましくは、前記少なくとも１つの肝臓細胞が、肝細胞、肝星細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、又は肝類洞内皮細胞である、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

少なくとも１つの疾患又は障害を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療有効量の請求項１～２１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項26】

前記少なくとも１つの疾患又は障害が、肝臓疾患又は障害であり、好ましくは、前記肝臓疾患又は障害が、代謝性肝臓障害であり、好ましくは、前記代謝性肝臓障害が、
ｉ）尿素サイクル異常症、又は
ｉｉ）Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ欠損症（ＣＰＳＩ欠損症）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＳＤ）（シトルリン血症Ｉ）、シトリン欠損症（シトルリン血症ＩＩ）、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症（アルギニノコハク酸尿症）、アルギナーゼ欠損症（高アルギニン血症）、オルニチントランスロカーゼ欠損症（ＨＨＨ症候群）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症１型（ＰＦＩＣ１）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症１型（ＰＦＩＣ２）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症１型（ＰＦＩＣ３）、若しくはそれらの任意の組み合わせである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記少なくとも１つの疾患又は障害が、血友病疾患であり、好ましくは、前記血友病疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記少なくとも１つのＲＮＡ分子が、融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、前記融合タンパク質が、（ｉ）不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質又はその不活性化ヌクレアーゼドメイン、（ｉｉ）Ｃｌｏ０５１タンパク質又はそのヌクレアーゼドメインを含む、請求項１～１３、１５及び１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

前記組成物が、少なくとも１つのガイドＲＮＡ分子を更に含む、請求項２８に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年２月２３日出願の米国仮特許出願第６３／１５２，５１７号、２０２１年３月４日出願の米国仮特許出願第６３／１５６，６４９号、２０２１年３月２２日出願の米国仮特許出願第６３／１６４，１７４号、及び２０２１年６月７日出願の米国仮特許出願第６３／１９７，９４６号の優先権及び利益を主張する。上述の特許出願の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年２月２３日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、「ＰＯＴＨ－０６６＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」と名付けられ、サイズは約３２０，３３８バイトである。

【0003】

本開示は、概して、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含む新規の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、これらのＬＮＰを調製する方法、並びに遺伝子療法及び細胞ベースの療法用途のためのこれらのＬＮＰの使用に関する。

【背景技術】

【0004】

細胞に核酸を送達するための、並びにインビボ、エクスビボ、及びインビトロで細胞を遺伝子改変するための組成物及び方法について、当該技術分野では長年求められているが満たされていない必要性が存在する。ＡＡＶを含むウイルスベクターの使用など、広く受け入れられている遺伝子送達及び遺伝子改変技術は、患者に急性毒性及び有害な副作用を引き起こし得る。本開示は、インビボ、エクスビボ、及びインビトロで肝細胞を含む様々なタイプの細胞への核酸の送達のための改善された組成物、方法、及びキットを提供する。より具体的には、本開示は、改善された脂質ナノ粒子組成物及びそれを使用する方法を提供する。これらの脂質ナノ粒子組成物及び方法は、高効率かつ低毒性による肝臓細胞への特定のタイプの核酸（例えば、ＲＮＡ）の送達を可能にする。更に、本開示の脂質ナノ粒子組成物は、改善された保存安定性を呈し、これは、臨床及び商業の場で有利である。したがって、本開示の組成物及び方法は、遺伝子療法及び細胞ベースの治療薬の産生を含む、多様な分野に対する幅広い適用可能性を有する。

【発明の概要】

【0005】

いくつかの態様では、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含む新規の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が提供される。一態様では、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、Ｃｏａｔｓｏｍｅ ＳＳ－ＯＰである。

【0006】

一態様では、本開示の組成物と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤と、を含む、医薬組成物が提供される。

【0007】

一態様では、少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの細胞に送達する方法であって、少なくとも１つの細胞を本開示の少なくとも１つの組成物と接触させることを含む、方法が提供される。

【0008】

一態様では、少なくとも１つの細胞を遺伝子改変する方法であって、少なくとも１つの細胞を本開示の少なくとも１つの組成物と接触させることを含む、方法が提供される。

【0009】

一態様では、少なくとも１つの疾患又は障害を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本開示の少なくとも１つの組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。

【0010】

一態様では、少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの細胞に送達する方法であって、少なくとも１つの細胞を本開示の少なくとも１つの組成物と接触させることを含む、方法が提供される。

【0011】

一態様では、本開示の方法に従って改変された細胞が提供される。

【0012】

上記態様のいずれも、任意の他の態様と組み合わせられ得る。

【0013】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書では、単数形はまた、文脈が別途明確に示さない限り、複数形を含み、例として、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は単数形又は複数形であると理解され、「ｏｒ」という用語は、包括的であると理解される。一例として、「要素」は、１つ以上の要素を意味する。本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップのグループの包含を暗示するが、いかなる他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップのグループの排除を暗示するものではないと理解されるであろう。約は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解され得る。文脈上別段の明確性がない限り、本明細書に提供される全ての数値は、「約」という用語によって修飾される。

【0014】

本明細書に説明されるものと同様又は同等の方法及び材料が、本開示の実施又は試験に使用され得るが、適切な方法及び材料が以下に説明される。本明細書に述べられる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に引用される参考文献は、請求される発明の先行技術であるとは認められない。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先することになる。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本開示の他の特徴及び利点は、以下の「発明を実施するための形態」及び「特許請求の範囲」から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0015】

上記の及び更なる特徴は、添付図面と併せて考えるとき、以下の「発明を実施するための形態」からより明確に理解されるであろう。

【0016】

【図1】本開示のＬＮＰを投与された成体マウスにおけるヒトＦＶＩＩＩの発現を示す一連のグラフである。

【図2】本開示のＬＮＰを投与されたマウスにおけるヒトＦＩＸの発現を示す一連のグラフである。

【図3】０．１ｍｇ／ｍＬかつ４℃の温度における７日間のインキュベーションの過程にわたる、本開示の様々なＬＮＰ組成物の平均直径及び多分散度指数（ＰＤＩ）を示す一連のグラフである。

【図4】本開示のＬＮＰを投与されたマウスにおけるヒトＦＶＩＩＩの発現を示すグラフである。

【図5】本開示のＬＮＰを投与された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）の発現を示すグラフである。

【図6】本開示のＬＮＰを投与されたＮＨＰにおける肝臓酵素のレベルを示す一連のグラフである。

【図7】ヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子、及び本開示のＳＰＢ ＬＮＰと組み合わせてヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子を投与されたマウスの生存を示すグラフである。

【図8】本開示のＳＰＢ ＬＮＰと組み合わせてヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子を投与されたマウスにおける、組み込みウイルスコピー数（ＶＣＮ）及びｈＯＴＣ ｍＲＮＡレベルを示す一連のグラフである。

【図9】本開示のＳＰＢ ＬＮＰと組み合わせてヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子を投与されたマウスにおける、生存及びオロチン酸レベルを示す一連のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本開示は、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含む新規の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物、当該組成物を調製するための方法、及び当該組成物を使用する方法を提供する。非限定的な例では、本開示の組成物及び方法は、遺伝子療法の文脈において遺伝子送達に使用され得る。別の非限定的な例では、本開示の組成物及び方法は、細胞ベースの治療薬の文脈において使用され得る。別の非限定的な例では、本開示の組成物及び方法は、限定されるものではないが、分泌治療用タンパク質を含む治療用タンパク質の発現を誘起する核酸を送達するために広く使用され得る。非限定的な例では、本開示の組成物及び方法は、特定の肝臓障害の治療のために、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで、核酸を肝臓細胞に送達するために広く使用され得る。

【0018】

本開示の生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、生分解性であり、それによって、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質が分解され、動物において代謝されることを可能にする。理論に拘束されることを意図するものではないが、この生体還元性は、有利には、カチオン性脂質関連細胞傷害を低減する。

【0019】

本開示の組成物及び方法のいくつかの態様では、ＬＮＰ組成物で使用するための生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２であり得る。当業者によって理解されるように、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２は、以下の構造を有する。

【化1】

【0020】

当業者によって理解されるように、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２は、Ｃｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅ－Ｐ４Ｃ２、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅｎｙｌ－Ｐ４Ｃ２、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅ、及びｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈとも称され得る。したがって、式Ｉで表される化学構造を有する生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を指すために、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｃｏａｔｓｏｍｅ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅ－Ｐ４Ｃ２、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅｎｙｌ－Ｐ４Ｃ２、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅ、及びｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈが本明細書において互換的に使用される。

【0021】

理論に拘束されることを意図するものではないが、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２の３つの特定のセグメントは、その生分解を促進する。第一に、各ピペルジン環の三級アミンは、酸性ｐＨ反応性カチオン荷電単位である。エンドサイトーシス時、三級アミン部分は、酸性の細胞内エンドソーム区画に応答して正に荷電される。これらは、ここで、膜を相互作用させ、不安定化させることができ、これは、エンドソーム脱出につながる。サイトゾル中に入ると、ジスルフィド結合は、グルタチオンによる還元の影響を受け易く、２つの遊離スルフヒドリル基を生成する。結果として生じる高濃度の遊離チオールは、求核反応に更につながり、粒子は、チオエステル化を介して自己分解／崩壊し、サイトゾル中にペイロードを放出する。これは、反応物の粒子内濃縮によって加速されるＨｙＰＥＲ又は加水分解として定義され、一般的に、カチオン性脂質の潜在的毒性副作用を潜在的に排除する。

【0022】

本開示の組成物－脂質ナノ粒子
本開示は、少なくとも１つのカチオン性脂質と、少なくとも１つの核酸分子と、を含む、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの構造脂質を更に含み得る。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのリン脂質を更に含み得る。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を更に含み得る。

【0023】

したがって、本開示は、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物を提供し、少なくとも１つの脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つの構造脂質、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含む。

【0024】

生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質
いくつかの態様では、カチオン性脂質は、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質であり得る。したがって、本開示は、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物を提供し、少なくとも１つの脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。

【0025】

本明細書で使用される場合、「生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質」という用語は、その最も広い意味で、少なくとも１つの三級アミン、少なくとも１つのジスルフィド基、チオエステル化による切断に感受性である結合を含み、少なくとも２つの飽和又は不飽和炭化水素鎖を更に含む少なくとも１つの基を含む、カチオン性脂質を指すために使用される。例示的な生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質としては、限定されるものではないが、Ａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒ．Ｂｕｌｌ．４３：１６１７－１６２５に説明されるものが挙げられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0026】

いくつかの態様では、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、少なくとも２つの三級アミンを含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの三級アミンは、置換ピペリジニル基であり得る。いくつかの態様では、各三級アミンは、置換ピペリジニル基であり得る。いくつかの態様では、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、少なくとも１つのジスルフィド結合を含み得る。いくつかの態様では、ジスルフィド結合の硫黄原子は、アルキレン基を介してピペルジニル環の窒素に結合され、それによって、ジスルフィド結合に隣接する２つの三級アミン基を形成する。いくつかの態様では、アルキレン基のうちの少なくとも１つは、エチレン基である。いくつかの態様では、アルキレン基の各々は、エチレン基である。

【0027】

いくつかの態様では、チオエステル化による切断に感受性である結合を含む少なくとも１つの基は、フェニルエステル基であり得る。いくつかの態様では、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、少なくとも２つのフェニルエステル基を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも２つの飽和又は不飽和炭化水素鎖のうちの少なくとも１つは、不飽和炭化水素鎖である。いくつかの態様では、少なくとも２つの飽和又は不飽和炭化水素鎖の各々は、不飽和炭化水素鎖である。いくつかの態様では、不飽和炭化水素鎖は、オクタデセンであり得る。いくつかの態様では、オクタデセンは、（Ｚ）－オクタデック－９－エンであり得る。いくつかの態様では、（Ｚ）－オクタデック－９－エン基は、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質のフェニルエステル基に結合され得る。

【0028】

例示的な生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質及び本開示の方法に有用なそのような脂質を調製する方法は、ＷＯ／２０１６／１２１９４２として公開されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０５２６９０号、及びＷＯ／２０１９／１８８８６７として公開されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０１２３０２号に開示されているものを含み、それらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本開示は、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物を提供し、少なくとも１つの脂質ナノ粒子は、ＷＯ／２０１６／１２１９４２及びＷＯ／２０１９／１８８８６７に記載される生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質のうちのいずれか１つを含む。

【0029】

したがって、本開示は、少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物を提供し、少なくとも１つの脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つの構造脂質、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含む。

【0030】

いくつかの態様では、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、式Ｉで表される構造を有するｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２であり得る（Ａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒ．Ｂｕｌｌ．４３：１６１７－１６２５参照、その内容は参照によりその全体が組み込まれる）。

【0031】

本明細書に説明されるように、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含む本開示のＬＮＰ組成物は、有利には、非生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含むＬＮＰ組成物と比較して、動物において有意に低減された毒性を呈する。特に、本開示のＬＮＰ組成物の投与は、驚くべきことに、いかなる体重損失ももたらさない。実際に、本開示のＬＮＰ組成物は、非生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含むＬＮＰ組成物の致死量を超えるＬＮＰの量が投与されたときでも、ＬＮＰを投与された動物が実際に体重を増加させるほど、非毒性である。

【0032】

ＬＮＰ成分
いくつかの態様では、本開示のＬＮＰは、約２．５モル％、又は約５モル％、又は約７．５モル％、又は約１０モル％、又は約１２．５モル％、又は約１５モル％、又は約１７．５モル％、又は約２０モル％、又は約２２．５モル％、又は約２５モル％、又は約２７．５モル％、又は約３０モル％、又は約３２．５モル％、又は約３５モル％、又は約３７．５モル％、又は約４０モル％、又は約４２．５モル％、又は約４５モル％、又は約４７．５モル％、又は約５０モル％、又は約５２．５モル％、又は約５５モル％、又は約５７．５モル％、又は約６０モル％、又は約６２．５モル％、又は約６５モル％、又は約６７．５モル％、又は約７０モル％の少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含み得る。

【0033】

いくつかの態様では、本開示のＬＮＰは、少なくとも約２．５モル％、又は少なくとも約５モル％、又は少なくとも約７．５モル％、又は少なくとも約１０モル％、又は少なくとも約１２．５モル％、又は少なくとも約１５モル％、又は少なくとも約１７．５モル％、又は少なくとも約２０モル％、又は少なくとも約２２．５モル％、又は少なくとも約２５モル％、又は少なくとも約２７．５モル％、又は少なくとも約３０モル％、又は少なくとも約３２．５モル％、又は少なくとも約３５モル％、又は少なくとも約３７．５モル％、又は少なくとも約４０モル％、又は少なくとも約４２．５モル％、又は少なくとも約４５モル％、又は少なくとも約４７．５モル％、又は少なくとも約５０モル％、又は少なくとも約５２．５モル％、又は少なくとも約５５モル％、又は少なくとも約５７．５モル％、又は少なくとも約６０モル％、又は少なくとも約６２．５モル％、又は約６５モル％、又は少なくとも約６７．５モル％、又は少なくとも約７０モル％の少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含み得る。

【0034】

いくつかの態様では、本開示のＬＮＰは、約２．５モル％、又は約５モル％、又は約７．５モル％、又は約１０モル％、又は約１２．５モル％、又は約１５モル％、又は約１７．５モル％、又は約２０モル％、又は約２２．５モル％、又は約２５モル％、又は約２７．５モル％、又は約３０モル％、又は約３２．５モル％、又は約３５モル％、又は約３７．５モル％、又は約４０モル％、又は約４２．５モル％、又は約４５モル％、又は約４７．５モル％、又は約５０モル％、又は約５２．５モル％、又は約５５モル％、又は約５７．５モル％、又は約６０モル％、又は約６２．５モル％、又は約６５モル％、又は約６７．５モル％、又は約７０モル％の少なくとも１つの構造脂質を含み得る。

【0035】

いくつかの態様では、本開示のＬＮＰは、少なくとも約２．５モル％、又は少なくとも約５モル％、又は少なくとも約７．５モル％、又は少なくとも約１０モル％、又は少なくとも約１２．５モル％、又は少なくとも約１５モル％、又は少なくとも約１７．５モル％、又は少なくとも約２０モル％、又は少なくとも約２２．５モル％、又は少なくとも約２５モル％、又は少なくとも約２７．５モル％、又は少なくとも約３０モル％、又は少なくとも約３２．５モル％、又は少なくとも約３５モル％、又は少なくとも約３７．５モル％、又は少なくとも約４０モル％、又は少なくとも約４２．５モル％、又は少なくとも約４５モル％、又は少なくとも約４７．５モル％、又は少なくとも約５０モル％、又は少なくとも約５２．５モル％、又は少なくとも約５５モル％、又は少なくとも約５７．５モル％、又は少なくとも約６０モル％、又は少なくとも約６２．５モル％、又は約６５モル％、又は少なくとも約６７．５モル％、又は少なくとも約７０モル％の少なくとも１つの構造脂質を含み得る。

【0036】

いくつかの態様では、本開示のＬＮＰは、約２．５モル％、又は約５モル％、又は約７．５モル％、又は約１０モル％、又は約１２．５モル％、又は約１５モル％、又は約１７．５モル％、又は約２０モル％、又は約２２．５モル％、又は約２５モル％、又は約２７．５モル％、又は約３０モル％、又は約３２．５モル％、又は約３５モル％、又は約３７．５モル％、又は約４０モル％、又は約４２．５モル％、又は約４５モル％、又は約４７．５モル％、又は約５０モル％、又は約５２．５モル％、又は約５５モル％、又は約５７．５モル％、又は約６０モル％、又は約６２．５モル％、又は約６５モル％、又は約６７．５モル％、又は約７０モル％の少なくとも１つのリン脂質を含み得る。

【0037】

いくつかの態様では、本開示のＬＮＰは、少なくとも約２．５モル％、又は少なくとも約５モル％、又は少なくとも約７．５モル％、又は少なくとも約１０モル％、又は少なくとも約１２．５モル％、又は少なくとも約１５モル％、又は少なくとも約１７．５モル％、又は少なくとも約２０モル％、又は少なくとも約２２．５モル％、又は少なくとも約２５モル％、又は少なくとも約２７．５モル％、又は少なくとも約３０モル％、又は少なくとも約３２．５モル％、又は少なくとも約３５モル％、又は少なくとも約３７．５モル％、又は少なくとも約４０モル％、又は少なくとも約４２．５モル％、又は少なくとも約４５モル％、又は少なくとも約４７．５モル％、又は少なくとも約５０モル％、又は少なくとも約５２．５モル％、又は少なくとも約５５モル％、又は少なくとも約５７．５モル％、又は少なくとも約６０モル％、又は少なくとも約６２．５モル％、又は約６５モル％、又は少なくとも約６７．５モル％、又は少なくとも約７０モル％の少なくとも１つのリン脂質を含み得る。

【0038】

いくつかの態様では、本開示のＬＮＰは、約０．２５モル％、又は約０．５モル％、又は約０．７５モル％、又は約１．０モル％、又は約１．２５モル％、又は約１．５モル％、又は約１．７５モル％、又は約２．０モル％、又は少なくとも約若しくは約２．５モル％、又は約５モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。

【0039】

いくつかの態様では、本開示のＬＮＰは、少なくとも約０．２５モル％、又は少なくとも約０．５モル％、又は少なくとも約０．７５モル％、又は少なくとも約１．０モル％、又は少なくとも約１．２５モル％、又は少なくとも約１．５モル％、又は少なくとも約１．７５モル％、又は少なくとも約２．０モル％、又は少なくとも約若しくは少なくとも約２．５モル％、又は少なくとも約５モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。

【0040】

構造脂質
いくつかの態様では、構造脂質は、ステロイドであり得る。いくつかの態様では、構造脂質は、ステロールであり得る。いくつかの態様では、構造脂質は、コレステロールを含み得る。いくつかの態様では、構造脂質は、エルゴステロールを含み得る。いくつかの態様では、構造脂質は、フィトステロールであり得る。

【0041】

リン脂質
本明細書で使用される場合、「リン脂質」という用語は、リン酸及び２つの疎水性脂肪酸鎖を含む極性（親水性）頭部基を含む任意の両親媒性分子を指すように最も広い意味で使用される。

【0042】

本開示の脂質ナノ粒子のいくつかの態様では、リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含み得る。

【0043】

本開示の脂質ナノ粒子のいくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）を含み得る。

【0044】

本開示の脂質ナノ粒子のいくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）を含み得る。

【0045】

いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＤＰＣ（１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＥＰＡ－ＮＡ（１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩））、ＤＥＰＣ（１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＥＰＥ（１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＥＰＧ－ＮＡ（１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（ナトリウム塩））、ＤＬＯＰＣ（１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＬＰＡ－ＮＡ（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩））、ＤＬＰＣ（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＬＰＥ（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＬＰＧ－ＮＡ（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（ナトリウム塩））、ＤＬＰＧ－ＮＨ４（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（アンモニウム塩））、ＤＬＰＳ－ＮＡ（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩））、ＤＭＰＡ－ＮＡ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩））、ＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＧ－ＮＡ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（ナトリウム塩））、ＤＭＰＧ－ＮＨ４（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（アンモニウム塩））、ＤＭＰＧ－ＮＨ４／ＮＡ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（ナトリウム／アンモニウム塩））、ＤＭＰＳ－ＮＡ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩））、ＤＯＰＡ－ＮＡ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート（ナトリウム塩））、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ－ＮＡ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（ナトリウム塩））、ＤＯＰＳ－ＮＡ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩））、ＤＰＰＡ－ＮＡ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン酸（ナトリウム塩））、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＧ－ＮＡ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（ナトリウム塩））、ＤＰＰＧ－ＮＨ４（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（アンモニウム塩））、ＤＰＰＳ－ＮＡ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩））、ＤＳＰＡ－ＮＡ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン酸（ナトリウム塩））、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＧ－ＮＡ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（ナトリウム塩））、ＤＳＰＧ－ＮＨ４（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）（アンモニウム塩））、ＤＳＰＳ－ＮＡ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホセリン（ナトリウム塩））、ＥＰＣ（Ｅｇｇ－ＰＣ）、ＨＥＰＣ（水素添加Ｅｇｇ ＰＣ）、ＨＳＰＣ（水素添加Ｓｏｙ ＰＣ）、ＬＹＳＯＰＣ ＭＹＲＩＳＴＩＣ（１－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＬＹＳＯＰＣ ＰＡＬＭＩＴＩＣ（１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＬＹＳＯＰＣ ＳＴＥＡＲＩＣ（１－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ミルクスフィンゴミエリン（ＭＰＰＣ、１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＭＳＰＣ（１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＭＰＣ（１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＰＯＰＥ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＰＯＰＧ－ＮＡ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３［ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）］（ナトリウム塩））、ＰＳＰＣ（１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＳＭＰＣ（１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＳＯＰＣ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＳＰＰＣ（１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0046】

ＰＥＧ化脂質
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ化脂質」という用語は、改変（例えば）少なくとも１つのポリエチレングリコール分子（に共有結合）される任意の脂質を指すために使用される。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、以下、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と称される１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００を含み得る。

【0047】

核酸
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの核酸分子を含み得る。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、複数の核酸分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子、又は複数の核酸分子は、脂質ナノ粒子において製剤化され得る。

【0048】

いくつかの態様では、核酸分子は、合成核酸分子であり得る。いくつかの態様では、核酸分子は、非天然由来の核酸分子であり得る。いくつかの態様では、非天然由来の核酸分子は、少なくとも１つの非天然由来のヌクレオチドを含み得る。少なくとも１つの非天然由来のヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の非天然由来のヌクレオチドであり得る。いくつかの態様では、核酸分子は、改変核酸分子であり得る。いくつかの態様では、改変核酸分子は、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含み得る。少なくとも１つの改変ヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の改変核酸であり得る。

【0049】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、脂質及び核酸を、指定された比率（重量／重量）で含み得る。

【0050】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、脂質及び核酸を、約５：１～約１５：１、又は約１０：１～約２０：１、又は約１５：１～約２５：１、又は約２０：１～約３０：１、又は約２５：１～約３５：１、又は約３０：１～約４０：１、又は約３５：１～約４５：１、又は約４０：１～約５０：１、又は約４５：１～約５５：１、又は約５０：１～約６０：１、又は約５５：１～約６５：１、又は約６０：１～約７０：１、又は約６５：１～約７５：１、又は約７０：１～約８０：１、又は約７５：１～約８５：１、又は約８０：１～約９０：１、又は約８５：１～約９５：１、又は約９０：１～約１００：１、又は約９５：１～約１０５：１、又は約１００：１～約１１０：１、又は約１０５：１～約１１５：１、又は約１１０：１～約１２０：１、又は約１１５：１～約１２５：１、又は約１２０：１～約１３０：１、又は約１２５：１～約１３５：１、又は約１３０：１～約１４０：１、又は約１３５：１～約１４５：１、又は約１４０：１～約１５０：１の脂質：核酸重量／重量比率で含み得る。

【0051】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、脂質及び核酸を、約５：１、又は約１０：１、又は約１５：１、又は約２０：１、又は約２５：１、又は約３０：１、又は約３５：１、又は約４０：１、又は約４５：１、又は約５０：１、又は約５５：１、又は約６０：１、又は約６５：１、又は約７０：１、又は約７５：１、又は約８０：１、又は約８５：１、又は約９０：１、又は約９５：１、又は約１００：１、又は約１０５：１、又は約１１０：１、又は約１１５：１、又は約１２０：１、又は約１２５：１、又は約１３０：１、又は約１３５：１、又は約１４０：１、又は約１４５：１、又は約１５０：１、又は約２００：１の脂質：核酸重量／重量比率で含み得る。

【0052】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、脂質及び核酸を、約１０：１、又は約１７．５：１、又は約２５：１の脂質：核酸重量／重量比率で含み得る。

【0053】

いくつかの態様では、核酸分子は、ＲＮＡ分子であり得る。したがって、いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを含み得る。

【0054】

いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、任意の方法及び／又は当該技術分野で既知のキャッピング部分を使用してキャッピングされ得る。ｍＲＮＡ分子は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ部分でキャッピングされ得る。ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ部分はまた、本明細書では「Ｃａｐ０」とも称される。ｍＲＮＡ分子は、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）部分でキャッピングされ得る。ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）部分は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＡＧ）部分を含み得る。ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）部分は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）ＧＧ）部分を含み得る。ｍＲＮＡ分子は、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ（登録商標））部分でキャッピングされ得る。ＡＲＣＡ（登録商標）部分は、ｍ７（３’－Ｏ－メチル）Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ部分を含み得る。ｍＲＮＡ分子は、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）３’ＯＭｅ部分（ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）＋ＡＲＣＡ（登録商標））でキャッピングされ得る。

【0055】

いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、少なくとも１つの改変核酸を含み得る。

【0056】

改変核酸は、限定されるものではないが、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、Ｎ_１－メチルシュードウリジン（ｍｅ^１Ψ）、シュードウリジン（Ψ）、５－メチルシチジン（５－ＭｅＣ）を含み得る。

【0057】

いくつかの態様では、核酸分子は、ＤＮＡ分子であり得る。したがって、いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、ＤＮＡ分子は、限定されるものではないが、ＤＮＡプラスミドなどの環状ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ＤＮＡプラスミドを含み得る。いくつかの態様では、ＤＮＡ分子は、限定されるものではないが、直鎖状ＤＮＡプラスミドなどの直鎖状ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、ＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。

【0058】

ＤＮＡプラスミドは、少なくとも約０．２５ｋｂ、又は少なくとも約０．５ｋｂ、又は少なくとも約０．７５ｋｂ、又は少なくとも約１．０ｋｂ、又は少なくとも約１．２５ｋｂ、又は少なくとも約１．５ｋｂ、又は少なくとも約１．７５ｋｂ、又は少なくとも約２．０ｋｂ、又は少なくとも約２．２５ｋｂ、又は少なくとも約２．５ｋｂ、又は少なくとも約２．７５ｋｂ、又は少なくとも約３．０ｋｂ、又は少なくとも約３．２５ｋｂ、又は少なくとも約３．５ｋｂ、又は少なくとも約３．７５ｋｂ、又は少なくとも約４．０ｋｂ、又は少なくとも約４．２５ｋｂ、又は少なくとも約４．５ｋｂ、又は少なくとも約４．７５ｋｂ、又は少なくとも約５．０ｋｂ、又は少なくとも約５．２５ｋｂ、又は少なくとも約５．５ｋｂ、又は少なくとも約５．７５ｋｂ、又は少なくとも約６．０ｋｂ、又は少なくとも約６．２５ｋｂ、又は少なくとも約６．５ｋｂ、又は少なくとも約６．７５ｋｂ、又は少なくとも約７．０ｋｂ、又は少なくとも約７．２５ｋｂ、又は少なくとも約７．５ｋｂ、又は少なくとも約７．７５ｋｂ、又は少なくとも約８．０ｋｂ、又は少なくとも約８．２５ｋｂ、又は少なくとも約８．５ｋｂ、又は少なくとも約８．７５ｋｂ、又は少なくとも約９．０ｋｂ、又は少なくとも約９．２５ｋｂ、又は少なくとも約９．５ｋｂ、又は少なくとも約９．７５ｋｂ、又は少なくとも約１０．０ｋｂ、又は少なくとも約１０．２５ｋｂ、又は少なくとも約１０．５ｋｂ、又は少なくとも約１０．７５ｋｂ、又は少なくとも約１１．０ｋｂ、又は少なくとも約１１．２５ｋｂ、又は少なくとも約１１．５ｋｂ、又は少なくとも約１１．７５ｋｂ、又は少なくとも約１２ｋｂ、又は少なくとも約１２．２５ｋｂ、又は少なくとも約１２．５ｋｂ、又は少なくとも約１２．７５ｋｂ、又は少なくとも約１３．０ｋｂ、又は少なくとも約１３．２５ｋｂ、又は少なくとも約１３．５ｋｂ、又は少なくとも約１３．７５ｋｂ、又は少なくとも約１４．０ｋｂ、又は少なくとも約１４．２５ｋｂ、又は少なくとも約１４．５ｋｂ、又は少なくとも約１４．７５ｋｂ、又は少なくとも約１５．０ｋｂの長さであり得るものを含み得る。

【0059】

ＬＮＰ組成物
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質、及び少なくとも１つの構造脂質を含み得る。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２であり得る。

【0060】

いくつかの態様では、少なくとも１つの構造脂質は、２つの構造脂質の混合物であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質は、２つのＰＥＧ化脂質の混合物であり得る。

【0061】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質、少なくとも１つの構造脂質、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２であり得る。

【0062】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質、少なくとも１つの構造脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２であり得る。

【0063】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質、少なくとも１つの構造脂質、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２であり得る。

【0064】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質、少なくとも１つの構造脂質、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質は、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２であり得る。

【0065】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約２８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約６０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0066】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約２９．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0067】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約３２．９２モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．９２モル％のコレステロール、約３２．９２モル％のＤＯＰＥ、及び約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約５５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0068】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約１０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約２９．５モル％のコレステロール、約６０モル％のＤＯＰＥ、及び約０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0069】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約２８モル％～２９モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１．２５モル％～２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0070】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約２８モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0071】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約２８．７５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0072】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0073】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約２７．８４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約５６．２５モル％のコレステロール、約１３．４６モル％のＤＯＰＥ、及び約２．４５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約８８：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0074】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約２７．９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約５１．５１モル％のコレステロール、約１８．５９モル％のＤＯＰＥ、及び約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0075】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約２６．４モル％のコレステロール、約１１．６モル％のＤＯＰＥ、及び約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７０：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0076】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約３０．３７モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．２７モル％のコレステロール、約３０．３６モル％のＤＯＰＥ、及び約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0077】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％～５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％～４０モル％のコレステロール、約５モル％～１０モル％のＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、又はＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１～約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0078】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0079】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0080】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0081】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0082】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0083】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0084】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0085】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0086】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0087】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0088】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0089】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0090】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0091】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0092】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0093】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0094】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0095】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0096】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0097】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0098】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0099】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0100】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0101】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0102】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0103】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0104】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0105】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0106】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0107】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0108】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0109】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0110】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0111】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0112】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0113】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0114】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約４９モル％～６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２モル％～４４モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１．５モル％～３．０モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約４０：１～約１００：１（ｗ／ｗ）である。

【0115】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％～５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％～４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１～約１００：１（ｗ／ｗ）である。

【0116】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１～約１００：１（ｗ／ｗ）である。

【0117】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１～約１００：１（ｗ／ｗ）である。

【0118】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１～約１００：１（ｗ／ｗ）である。

【0119】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約４９．４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４４モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１．６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0120】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．８モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約２．２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0121】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３４モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約４０：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0122】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約４１．８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約５２．２モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0123】

いくつかの態様では、核酸分子は、ＤＮＡ分子である。したがって、本開示は、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子を提供し、これは、約２２．７１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約５５．２１モル％のコレステロール、約２０．８９モル％のＤＯＰＥ、及び約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る（ＷＯ／２０２０／１５４６４５参照）。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0124】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３８．６モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１．４モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る（ＷＯ／２０２０／１５４６４５参照）。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約２００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0125】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約３４．６９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３９．７４モル％のコレステロール、約２４．６９モル％のＤＯＰＥ、及び約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約５０：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0126】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約２０モル％のコレステロール、約２９．５モル％のＤＯＰＥ、及び約０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0127】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約２０モル％のコレステロール、約２８．７モル％のＤＯＰＥ、及び約１．３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約５０：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0128】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％～５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％～４０モル％のコレステロール、約５モル％～１０モル％のＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、又はＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１～約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0129】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0130】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0131】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0132】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0133】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0134】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0135】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0136】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0137】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0138】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0139】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0140】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0141】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0142】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0143】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0144】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0145】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0146】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0147】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0148】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0149】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0150】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0151】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0152】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＳＰＣ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0153】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0154】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0155】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0156】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0157】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0158】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0159】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0160】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0161】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0162】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0163】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0164】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を更に含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子であり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、共有結合で閉じた末端ＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0165】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約４８モル％～約６１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３１モル％～約５３モル％のコレステロール、約４モル％～約１１モル％のリン脂質、及び約０．５モル％～約３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約３０：１～約１１０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約４０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0166】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約４１．８モル％～約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．８モル％～約５２．２モル％のコレステロール、約５モル％～約１０モル％のリン脂質、及び約１モル％～約２．２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約３０：１～約１１０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約４０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0167】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のリン脂質、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約３０：１～約１１０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約４０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0168】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約４９．４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４４モル％のコレステロール、約５モル％のリン脂質、及び約１．６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約３０：１～約１１０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約４０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0169】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３２．８モル％のコレステロール、約５モル％のリン脂質、及び約２．２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約３０：１～約１１０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約４０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0170】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３４モル％のコレステロール、約５モル％のリン脂質、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約３０：１～約１１０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約４０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0171】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約４１．８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約５２．２モル％のコレステロール、約５モル％のリン脂質、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約３０：１～約１１０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約４０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0172】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のリン脂質、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約３０：１～約１１０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約４０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約６０：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0173】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５３モル％～約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３４モル％～約４１モル％のコレステロール、約４モル％～約１１モル％のリン脂質、及び約０．５モル％～約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７０：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0174】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％～約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％～約４０モル％のコレステロール、約５モル％～約１０モル％のリン脂質、及び約０．５モル％～約１．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７０：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0175】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のリン脂質、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７０：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0176】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３５モル％のコレステロール、約５モル％のリン脂質、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７０：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0177】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約４０モル％のコレステロール、約５モル％のリン脂質、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７０：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0178】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、約３７．５モル％のコレステロール、約５モル％のリン脂質、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ｍＲＮＡ分子は、５’－ＣＡＰを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ又はＤＮＡナノプラスミドであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。いくつかの態様では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの態様では、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約７０：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約７５：１（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、脂質と核酸との比率は、約１００：１（ｗ／ｗ）であり得る。

【0179】

本開示のいくつかの態様では、脂質ナノ粒子、又は複数の脂質ナノ粒子は、約２℃～約６℃、又は約４℃で、少なくとも約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、又は約１４日間安定であり得る。本開示のいくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、約４℃で少なくとも約７日間安定であり得る。

【0180】

本開示のいくつかの態様では、脂質ナノ粒子、又は複数の脂質ナノ粒子は、約２℃～約６℃、又は約４℃で、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、又は約１４日間安定であり得る。本開示のいくつかの態様では、脂質ナノ粒子、又は複数の脂質ナノ粒子は、約４℃で約７日間安定であり得る。

【0181】

いくつかの態様では、脂質ナノ粒子、又は複数の脂質ナノ粒子は、約０．５％以下、約１％以下、又は約５％以下、又は約１０％以下、又は約１５％以下、又は約２０％以下、又は約２５％以下の機会、又は約３０％以下、又は約３５％以下、又は約４０％以下、又は約４５％以下、又は約５０％以下の直径（単一の脂質ナノ粒子の場合）又は平均直径（複数の脂質ナノ粒子の場合）の変化がある場合、安定であると言うことができる。脂質ナノ粒子の直径又は複数のナノ粒子の平均直径は、当業者によって理解されるように、当該技術分野で既知の任意の標準的な方法を使用して決定され得る。

【0182】

いくつかの態様では、複数の脂質ナノ粒子は、約０．５％以下、約１％以下、又は約５％以下、又は約１０％以下、又は約１５％以下、又は約２０％以下、又は約２５％以下の機会、又は約３０％以下、又は約３５％以下、又は約４０％以下、又は約４５％以下、又は約５０％以下の多分散度指数（ＰＤＩ）又は複数の脂質ナノ粒子の変化がある場合、安定であると言うことができる。複数の脂質ナノ粒子のＰＤＩは、当業者によって理解されるように、当該技術分野で既知の任意の標準的な方法を使用して決定され得る。

【0183】

本開示のＣ１２－２００ＬＮＰ
本開示はまた、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つのリピドイド、少なくとも１つの構造脂質、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つのＰＥＧ化脂質、又はそれらの任意の組み合わせを含む、脂質ナノ粒子を提供する。

【0184】

リピドイドは、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）とも称される、Ｃ１２－２００であり得、以下、「Ｃ１２－２００」と称される（米国特許第８，４５０，２９８号、同第８，９６９，３５３号、同第９，５５６，１１０号、及び同第１０，１８９，８０２号を参照されたい。米国特許公開第２０１９－０１７７２８９号も参照されたい）。

【0185】

したがって、本開示の少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約２５モル％～約４５モル％のＣ１２－２００、約３２モル％～約５２モル％の少なくとも１つの構造脂質、約１０モル％～約３０モル％の少なくとも１つのリン脂質、及び約０．１モル％～約１３モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約３０モル％～約４０モル％のＣ１２－２００、約３７モル％～約４７モル％の少なくとも１つの構造脂質、約１５モル％～約２５モル％の少なくとも１つのリン脂質、及び約０．１モル％～約８モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約３２．５モル％～約３７．５モル％のＣ１２－２００、約３９．５モル％～約４４．５モル％の少なくとも１つの構造脂質、約１７．５モル％～約２２．５モル％の少なくとも１つのリン脂質、及び約０．５モル％～約５．５モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約３５モル％のＣ１２－２００、約４２モル％の少なくとも１つの構造脂質、約２０モル％の少なくとも１つのリン脂質、及び約３モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約３５モル％のＣ１２－２００、約４１．８４モル％の少なくとも１つの構造脂質、約２０モル％の少なくとも１つのリン脂質、及び約３．１６モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得る。いくつかの態様では、上記の脂質ナノ粒子は、脂質及び核酸を、約６０：１～約１００：１、又は約７０：１～約９０：１、又は約７５：１～約８５：１の脂質：核酸重量／重量比率で含み得る。いくつかの態様では、上記の脂質ナノ粒子は、脂質及び核酸を、約８０：１の脂質：核酸重量／重量比率で含み得る。リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。リン脂質は、ＤＰＳＣであり得る。リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。構造脂質は、コレステロールであり得る。ＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００であり得る。

【0186】

いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。いくつかの態様では、核酸分子は、ＤＮＡ分子（例えば、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子）である。したがって、本開示は、約３５モル％のＣ１２－２００、約４２モル％の少なくとも１つの構造脂質、約２０モル％の少なくとも１つのリン脂質、及び約３モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含む、脂質ナノ粒子を提供し、少なくとも１つの核酸が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。本開示はまた、約３５モル％のＣ１２－２００、約４１．８４モル％の少なくとも１つの構造脂質、約２０モル％の少なくとも１つのリン脂質、及び約３．１６モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含む、脂質ナノ粒子を提供し、少なくとも１つの核酸が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子である。いくつかの態様では、少なくとも１つのＤＮＡ分子は、ＤＮＡナノプラスミドである。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約３５モル％の少なくとも１つの滴定可能なカチオン性脂質、約４２モル％の少なくとも１つの構造脂質、約２０モル％の少なくとも１つのリン脂質、及び約３モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得、少なくとも１つの核酸が、ＤＮＡ分子（例えば、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子、ＤＮＡナノプラスミド）であり、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約８０：１（重量／重量）である。いくつかの態様では、少なくとも１つの核酸分子を含む脂質ナノ粒子は、約３５モル％の少なくとも１つの滴定可能なカチオン性脂質、約４１．８４モル％の少なくとも１つの構造脂質、約２０モル％の少なくとも１つのリン脂質、及び約３．１６モル％の少なくとも１つのＰＥＧ化脂質を含み得、少なくとも１つの核酸が、ＤＮＡ分子（例えば、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子、ＤＮＡナノプラスミド）であり、ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約８０：１（重量／重量）である。いくつかの態様では、上記の脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの肝臓細胞への少なくとも１つのＤＮＡ分子（例えば、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子、ＤＮＡナノプラスミド）の送達に使用され得る。リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。リン脂質は、ＤＰＳＣであり得る。リン脂質は、ＤＯＰＣであり得る。構造脂質は、コレステロールであり得る。ＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００であり得る。

【0187】

本開示の代替的なＬＮＰ実施形態
実施形態１．組成物であって、
約２３モル％～約３３モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５５モル％～約６５モル％のコレステロールと、
約５モル％～約１５モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約７モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２５．５モル％～約３０．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５７．５モル％～約６２．５モル％のコレステロールと、
約７．５モル％～約１２．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約４．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１の組成物。
実施形態３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２７モル％～約２９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５９モル％～約６１モル％のコレステロールと、
約９モル％～約１１モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％～約３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１又は実施形態２の組成物。
実施形態４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約６０モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１～３のいずれか１つの組成物。
実施形態５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約５：１～約１５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１～４のいずれか１つの組成物。
実施形態６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１～５のいずれか１つの組成物。
実施形態７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１～６のいずれか１つの組成物。
実施形態８．少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１～７のいずれか１つの組成物。
実施形態９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約６０モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１～８の組成物。
実施形態１０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約６０モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１～９のいずれか１つの組成物。
実施形態１１．組成物であって、
約５５モル％～約６５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２４．５モル％～約３４．５モル％のコレステロールと、
約５モル％～約１５モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約５．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態１２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５７．５モル％～約６２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２７モル％～約３２モル％のコレステロールと、
約７．５モル％～約１２．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１１の組成物。
実施形態１３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５９モル％～約６１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２８．５モル％～約３０．５モル％のコレステロールと、
約９モル％～約１１モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約１．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１１又は実施形態１２の組成物。
実施形態１４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２９．５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１１～１３のいずれか１つの組成物。
実施形態１５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１～１４のいずれか１つの組成物。
実施形態１６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１～１５のいずれか１つの組成物。
実施形態１７．少なくとも１つのナノ粒子が、
約６０モル％のＣｏａｔｓｏｍｅ ＳＳ－ＯＰと、
約２９．５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１～１６のいずれか１つの組成物。
実施形態１８．組成物であって、
約２７．９２モル％～約３７．９２モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２７．９２モル％～約３７．９２モル％のコレステロールと、
約２７．９２モル％～約３７．９２モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約６．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態１９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３０．４２モル％～約３５．４２モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３０．４２モル％～約３５．４２モル％のコレステロールと、
約３０．４２モル％～約３５．４２モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約３．７５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１８の組成物。
実施形態２０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３１．９２モル％～約３２．９２モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３１．９２モル％～約３２．９２モル％のコレステロールと、
約３１．９２モル％～約３２．９２モル％のＤＯＰＥと、
約０．２５モル％～約２．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１８又は実施形態１９の組成物。
実施形態２１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３２．９２モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３２．９２モル％のコレステロールと、
約３２．９２モル％のＤＯＰＥと、
約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１８～２０のいずれか１つの組成物。
実施形態２２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約５０：１～約６０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８～２１のいずれか１つの組成物。
実施形態２３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約５５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８～２２のいずれか１つの組成物。
実施形態２４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３２．９２モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３２．９２モル％のコレステロールと、
約３２．９２モル％のＤＯＰＥと、
約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約５５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８～２３のいずれか１つの組成物。
実施形態２５．組成物であって、
約５モル％～約１５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２４．５モル％～約３４．５モル％のコレステロールと、
約５５モル％～約６５モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約５．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態２６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約７．５モル％～約１２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２７モル％～約３２モル％のコレステロールと、
約５７．５モル％～約６２．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態２５の組成物。
実施形態２７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約９モル％～約１１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２８．５モル％～約３０．５モル％のコレステロールと、
約５９モル％～約６１モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約１．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態２５又は実施形態２６の組成物。
実施形態２８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約１０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２９．５モル％のコレステロールと、
約６０モル％のＤＯＰＥと、
約０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つの組成物。
実施形態２９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態２５～２８のいずれか１つの組成物。
実施形態３０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１である、実施形態２５～２９のいずれか１つの組成物。
実施形態３１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約１０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２９．５モル％のコレステロールと、
約６０モル％のＤＯＰＥと、
約０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態２５～３０のいずれか１つの組成物。
実施形態３２．組成物であって、
約５５モル％～約６５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２３モル％～約３３モル％のコレステロールと、
約５モル％～約１５モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約７モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態３３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５７．５モル％～約６２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２５．５モル％～約３０．５モル％のコレステロールと、
約７．５モル％～約１２．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約４．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態３２の組成物。
実施形態３４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５９モル％～約６１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２７モル％～約２９モル％のコレステロールと、
約９モル％～約１１モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％～約３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態３２又は実施形態３３の組成物。
実施形態３５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２８モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態３２～３４のいずれか１つの組成物。
実施形態３６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態３２～３５のいずれか１つの組成物。
実施形態３７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態３２～３６のいずれか１つの組成物。
実施形態３８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２８モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態３２～２７のいずれか１つの組成物。
実施形態３９．組成物であって、
約５５モル％～約６５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２３．７５モル％～約３３．７５モル％のコレステロールと、
約５モル％～約１５モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約６．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態４０．少なくとも１つのナノ粒子が、
約５７．５モル％～約６２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２６．２５モル％～約３１．２５モル％のコレステロールと、
約７．５モル％～約１２．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約３．７５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態３９の組成物。
実施形態４１．少なくとも１つのナノ粒子が、
約５９モル％～約６１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２７．７５モル％～約２９．７５モル％のコレステロールと、
約９モル％～約１１モル％のＤＯＰＥと、
約０．２５モル％～約２．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態３９又は実施形態４０の組成物。
実施形態４２．少なくとも１つのナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２８．７５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態３９～４１のいずれか１つの組成物。
実施形態４３．少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態３９～４２のいずれか１つの組成物。
実施形態４４．少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態３９～４３のいずれか１つの組成物。
実施形態４５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２８．７５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態３９～４４のいずれか１つの組成物。
実施形態４６．組成物であって、
約１７．７１モル％～約２７．７１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５０．２１モル％～約６０．２１モル％のコレステロールと、
約２３．８３モル％～約３３．８３モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約６．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態４７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２０．２１モル％～約２５．２１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５２．７１モル％～約５７．７１モル％のコレステロールと、
約２６．３３モル％～約３１．３３モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約３．７５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態４６の組成物。
実施形態４８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２１．７１モル％～約２３．７１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５４．２１モル％～約５６．２１モル％のコレステロールと、
約２７．８３モル％～約２９．８３モル％のＤＯＰＥと、
約０．２５モル％～約２．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態４６又は実施形態４７の組成物。
実施形態４９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２２．７１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５５．２１モル％のコレステロールと、
約２８．８３モル％のＤＯＰＥと、
約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態４６～４８のいずれか１つの組成物。
実施形態５０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態４６～４９のいずれか１つの組成物。
実施形態５１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態４６～５０のいずれか１つの組成物。
実施形態５２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２２．７１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５５．２１モル％のコレステロールと、
約２８．８３モル％のＤＯＰＥと、
約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態４６～５１のいずれか１つの組成物。
実施形態５３．組成物であって、
約４５モル％～約５５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３３．６モル％～約４３．６モル％のコレステロールと、
約５モル％～約１５モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約６．４モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態５４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４７．５モル％～約５２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３６．１モル％～約４１．１モル％のコレステロールと、
約７．５モル％～約１２．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約３．９モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態５３の組成物。
実施形態５５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４９モル％～約５１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．６モル％～約３９．６モル％のコレステロールと、
約９モル％～約１１モル％のＤＯＰＥと、
約０．４モル％～約２．４モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態５３又は実施形態５４の組成物。
実施形態５６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３８．６モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１．４モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態５３～５５のいずれか１つの組成物。
実施形態５７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１９５：１～約２０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態５３～５６のいずれか１つの組成物。
実施形態５８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約２００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態５３～５７のいずれか１つの組成物。
実施形態５９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３８．６モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１．４モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約２００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態５３～５８のいずれか１つの組成物。
実施形態６０．組成物であって、
約２９．６９モル％～約３９．６９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３４．７４モル％～約４４．７４モル％のコレステロールと、
約１９．６９モル％～約２９．６９モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約６．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態６１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３２．１９モル％～約３７．１９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．２４モル％～約４２．２４モル％のコレステロールと、
約２２．１９モル％～約２７．１９モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約３．７５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態６０の組成物。
実施形態６２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３３．６９モル％～約３５．６９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３８．７４モル％～約４０．７４モル％のコレステロールと、
約２３．６９モル％～約２５．６９モル％のＤＯＰＥと、
約０．２５モル％～約２．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態６０又は実施形態６１の組成物。
実施形態６３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３４．６９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３９．７４モル％のコレステロールと、
約２４．６９モル％のＤＯＰＥと、
約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態６０～６２のいずれか１つの組成物。
実施形態６４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約４５：１～約５５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態６０～６３のいずれか１つの組成物。
実施形態６５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約５０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態６０～６４のいずれか１つの組成物。
実施形態６６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３４．６９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３９．７４モル％のコレステロールと、
約２４．６９モル％のＤＯＰＥと、
約１．２５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約５０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態６０～６５のいずれか１つの組成物。
実施形態６７．組成物であって、
約４５モル％～約５５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約１５モル％～約２５モル％のコレステロールと、
約２４．５モル％～約３４．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約５．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態６８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４７．５モル％～約５２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約１７．５モル％～約２２．５モル％のコレステロールと、
約２７モル％～約３２モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態６７の組成物。
実施形態６９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４９モル％～約５１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約１９モル％～約２１モル％のコレステロールと、
約２８．５モル％～約３０．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．２５モル％～約１．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態６７又は実施形態６８の組成物。
実施形態７０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２０モル％のコレステロールと、
約２９．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態６７～６９のいずれか１つの組成物。
実施形態７１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態６７～７０のいずれか１つの組成物。
実施形態７２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態６７～７１のいずれか１つの組成物。
実施形態７３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２０モル％のコレステロールと、
約２９．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態６７～７１のいずれか１つの組成物。
実施形態７４．組成物であって、
約４９モル％～約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３０モル％～約４０モル％のコレステロールと、
約５モル％～約１５モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態７５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５１．５モル％～約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３２．５モル％～約３７．５モル％のコレステロールと、
約７．５モル％～約１２．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約３．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態７４の組成物。
実施形態７６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５３モル％～約５５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５９モル％～約６１モル％のコレステロールと、
約９モル％～約１１モル％のＤＯＰＥと、
約０．５モル％～約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態７４又は実施形態７５の組成物。
実施形態７７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態７４～７６のいずれか１つの組成物。
実施形態７８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態７４～７７のいずれか１つの組成物。
実施形態７９．少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態７４～７８のいずれか１つの組成物。
実施形態８０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態７４～７９のいずれか１つの組成物。
実施形態８１．組成物であって、
約２２．８４モル％～約３２．８４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５１．２５モル％～約６１．２５モル％のコレステロールと、
約８．４６モル％～約１８．４６モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約７．４５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態８２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２５．３４モル％～約３０．３４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５３．７５モル％～約５８．７５モル％のコレステロールと、
約１０．９６モル％～約１５．９６モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約４．９５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態８１の組成物。
実施形態８３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２６．８４モル％～約２８．８４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５５．２５モル％～約５７．２５モル％のコレステロールと、
約１２．４６モル％～約１３．４６モル％のＤＯＰＥと、
約１．４５モル％～約３．４５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態８１又は実施形態８２の組成物。
実施形態８４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２７．８４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５６．２５モル％のコレステロールと、
約１３．４６モル％のＤＯＰＥと、
約２．４５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態８１～８３のいずれか１つの組成物。
実施形態８５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約８３：１～約９３：１（ｗ／ｗ）である、実施形態８１～８４のいずれか１つの組成物。
実施形態８６．少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約８８：１（ｗ／ｗ）である、実施形態８１～８５のいずれか１つの組成物。
実施形態８７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２７．８４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５６．２５モル％のコレステロールと、
約１３．４６モル％のＤＯＰＥと、
約２．４５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約８８：１（ｗ／ｗ）である、実施形態８１～８６のいずれか１つの組成物。
実施形態８８．組成物であって、
約２２．９モル％～約３２．９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４６．５１モル％～約モル％のコレステロールと、
約１３．５９モル％～約２３．５９モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約７モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態８９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２５．４モル％～約３０．４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４９．０１モル％～約モル％のコレステロールと、
約１６．０９モル％～約２１．０９モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約４．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態８８の組成物。
実施形態９０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２６．９モル％～約２８．９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５０．５１モル％～約５２．５１モル％のコレステロールと、
約１７．５９モル％～約１９．５９モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％～約３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態８８又は実施形態８９の組成物。
実施形態９１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２７．９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５１．５１モル％のコレステロールと、
約１８．５９モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態８８～９０のいずれか１つの組成物。
実施形態９２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態８８～９１のいずれか１つの組成物。
実施形態９３．少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態８８～９２のいずれか１つの組成物。
実施形態９４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２７．９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５１．５１モル％のコレステロールと、
約１８．５９モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態８８～９３のいずれか１つの組成物。
実施形態９５．組成物であって、
約５５モル％～約６５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２１．４モル％～約３１．４モル％のコレステロールと、
約６．６モル％～約１６．６モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約７モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態９６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５７．５モル％～約６２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２３．９モル％～約２８．９モル％のコレステロールと、
約９．１モル％～約１４．１モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約４．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態９５の組成物。
実施形態９７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５９モル％～約６１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２５．４モル％～約２７．４モル％のコレステロールと、
約１０．６モル％～約１２．６モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％～約３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態９５又は実施形態９６の組成物。
実施形態９８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２６．４モル％のコレステロールと、
約１１．６モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態９５～９７のいずれか１つの組成物。
実施形態９９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約６５：１～約７５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態９５～９８のいずれか１つの組成物。
実施形態１００．少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態９５～９９のいずれか１つの組成物。
実施形態１０１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２６．４モル％のコレステロールと、
約１１．６モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態９５～１００のいずれか１つの組成物。
実施形態１０２．組成物であって、
約２５．３７モル％～約３５．３７モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３２．２７モル％～約４２．２７モル％のコレステロールと、
約２５．３６モル％～約３５．３６モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約７モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態１０３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２７．８７モル％～約３２．８７モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３４．７７モル％～約３９．７７モル％のコレステロールと、
約２７．８６モル％～約３２．８６モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約４．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１０２の組成物。
実施形態１０４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約２９．３７モル％～約３１．３７モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３６．２７モル％～約３８．２７モル％のコレステロールと、
約２９．３６モル％～約３１．３６モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％～約３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１０２又は実施形態１０３の組成物。
実施形態１０５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３０．３７モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．２７モル％のコレステロールと、
約３０．３６モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１０２～１０４のいずれか１つの組成物。
実施形態１０６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約９５：１～約１０５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１０２～１０５のいずれか１つの組成物。
実施形態１０７．少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１０２～１０６のいずれか１つの組成物。
実施形態１０８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３０．３７モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．２７モル％のコレステロールと、
約３０．３６モル％のＤＯＰＥと、
約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１０２～１０７のいずれか１つの組成物。
実施形態１０９．組成物であって、
約４５モル％～約５５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約１５モル％～約２５モル％のコレステロールと、
約２３．７モル％～約３３．７モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約６．３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、組成物。
実施形態１１０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４７．５モル％～約５２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約１７．５モル％～約２２．５モル％のコレステロールと、
約２６．２モル％～約３１．２モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約４モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１０９の組成物。
実施形態１１１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４９モル％～約５１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約１９モル％～約２１モル％のコレステロールと、
約２７．７モル％～約２９．７モル％のＤＯＰＥと、
約０．２５モル％～約２．３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１０９又は実施形態１１０の組成物。
実施形態１１２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２０モル％のコレステロールと、
約２８．７モル％のＤＯＰＥと、
約１．３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１０９～１１１のいずれか１つの組成物。
実施形態１１３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約４５：１～約５５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１０９～１１２のいずれか１つの組成物。
実施形態１１４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約５０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１０９～１１３のいずれか１つの組成物。
実施形態１１５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２０モル％のコレステロールと、
約２８．７モル％のＤＯＰＥと、
約１．３モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約５０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１０９～１１４のいずれか１つの組成物。
実施形態１１６．組成物であって、
約４９モル％～約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３０モル％～約４０モル％のコレステロールと、
約５モル％～約１５モル％のリン脂質と、
約０．０１モル％～約６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含む、組成物。
実施形態１１７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５１．５モル％～約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３２．５モル％～約３７．５モル％のコレステロールと、
約７．５モル％～約１２．５モル％のリン脂質と、
約０．１モル％～約３．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１１６の組成物。
実施形態１１８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５３モル％～約５５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３４モル％～約３６モル％のコレステロールと、
約９モル％～約１１モル％のリン脂質と、
約０．２５モル％～約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１１６又は実施形態１１７の組成物。

【0188】

実施形態１１９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のリン脂質と、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１１６～１１８のいずれか１つの組成物。
実施形態１２０．組成物であって、
約５４モル％～約６４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３０モル％～約４０モル％のコレステロールと、
約０．１モル％～約１０モル％のリン脂質と、
約０．０１モル％～約６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含む、組成物。
実施形態１２１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５６．５モル％～約６１．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３２．５モル％～約３７．５モル％のコレステロールと、
約２．５モル％～約７．５モル％のリン脂質と、
約０．１モル％～約３．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１２０の組成物。
実施形態１２２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５８モル％～約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３４モル％～約３６モル％のコレステロールと、
約４モル％～約６モル％のリン脂質と、
約０．２５モル％～約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１２０又は実施形態１２１の組成物。
実施形態１２３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約５モル％のリン脂質と、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１２０～１２２のいずれか１つの組成物。
実施形態１２４．組成物であって、
約４９モル％～約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％～約４５モル％のコレステロールと、
約０．１モル％～約１０モル％のリン脂質と、
約０．０１モル％～約６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含む、組成物。
実施形態１２５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５１．５モル％～約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．５モル％～約４２．５モル％のコレステロールと、
約２．５モル％～約７．５モル％のリン脂質と、
約０．１モル％～約３．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１２４の組成物。
実施形態１２６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５３モル％～約５５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３９モル％～約４１モル％のコレステロールと、
約４モル％～約６モル％のリン脂質と、
約０．２５モル％～約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１２４又は実施形態１２５の組成物。
実施形態１２７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４０モル％のコレステロールと、
約５モル％のリン脂質と、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１２４～１２６のいずれか１つの組成物。
実施形態１２８．組成物であって、
約５１．５モル％～約６１．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３２．５モル％～約４２．５モル％のコレステロールと、
約０．１モル％～約１０モル％のリン脂質と、
約０．０１モル％～約６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含む、組成物。
実施形態１２９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％～約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％～約４０モル％のコレステロールと、
約２．５モル％～約７．５モル％のリン脂質と、
約０．１モル％～約３．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１２８の組成物。
実施形態１３０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５５．５モル％～約５７．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３６．５モル％～約３８．５モル％のコレステロールと、
約４モル％～約６モル％のリン脂質と、
約０．２５モル％～約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１２８又は実施形態１２９の組成物。
実施形態１３１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．５モル％のコレステロールと、
約５モル％のリン脂質と、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１２８～１３０のいずれか１つの組成物。
実施形態１３２．組成物であって、
約４４．４モル％～約５４．４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３９モル％～約４９モル％のコレステロールと、
約０．１モル％～約１０モル％のリン脂質と、
約０．０１モル％～約６．６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含む、組成物。
実施形態１３３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４６．９モル％～約５１．９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４１．５モル％～約４６．５モル％のコレステロールと、
約２．５モル％～約７．５モル％のリン脂質と、
約０．１モル％～約４．１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１３２の組成物。
実施形態１３４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４８．４モル％～約５０．４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４３モル％～約４５モル％のコレステロールと、
約４モル％～約６モル％のリン脂質と、
約０．６モル％～約２．６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１３２又は実施形態１３３の組成物。
実施形態１３５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４９．４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４４モル％のコレステロールと、
約５モル％のリン脂質と、
約１．６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１３２～１３４のいずれか１つの組成物。
実施形態１３６．組成物であって、
約５５モル％～約６５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２７．８モル％～約３７．８モル％のコレステロールと、
約０．１モル％～約１０モル％のリン脂質と、
約０．０１モル％～約７．２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含む、組成物。
実施形態１３７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５７．５モル％～約６２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３０．３モル％～約３５．３モル％のコレステロールと、
約２．５モル％～約７．５モル％のリン脂質と、
約０．１モル％～約４．７モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１３６の組成物。
実施形態１３８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５９モル％～約６１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３１．８モル％～約３３．８モル％のコレステロールと、
約４モル％～約６モル％のリン脂質と、
約１．２モル％～約２．２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１３６又は実施形態１３７の組成物。
実施形態１３９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３２．８モル％のコレステロールと、
約５モル％のリン脂質と、
約２．２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１３６～１３８のいずれか１つの組成物。
実施形態１４０．組成物であって、
約５５モル％～約６５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約２９モル％～約３９モル％のコレステロールと、
約０．１モル％～約１０モル％のリン脂質と、
約０．０１モル％～約６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含む、組成物。
実施形態１４１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５７．５モル％～約６２．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３１．５モル％～約３６．５モル％のコレステロールと、
約２．５モル％～約７．５モル％のリン脂質と、
約０．１モル％～約３．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１４０の組成物。
実施形態１４２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５９モル％～約６１モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３３モル％～約３５モル％のコレステロールと、
約４モル％～約６モル％のリン脂質と、
約０．２５モル％～約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１４０又は実施形態１４１の組成物。
実施形態１４３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３４モル％のコレステロールと、
約５モル％のリン脂質と、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１４０～１４２のいずれか１つの組成物。
実施形態１４４．組成物であって、
約３６．８モル％～約４６．８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４７．２モル％～約５７．２モル％のコレステロールと、
約０．１モル％～約１０モル％のリン脂質と、
約０．０１モル％～約６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含む、組成物。
実施形態１４５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３９．３モル％～約４４．３モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４９．７モル％～約５４．７モル％のコレステロールと、
約２．５モル％～約７．５モル％のリン脂質と、
約０．１モル％～約３．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１４４の組成物。
実施形態１４６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４０．８モル％～約４２．８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５１．２モル％～約５３．２モル％のコレステロールと、
約４モル％～約６モル％のリン脂質と、
約０．２５モル％～約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１４４又は実施形態１４５の組成物。
実施形態１４７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４１．８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５２．２モル％のコレステロールと、
約５モル％のリン脂質と、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１４４～１４６のいずれか１つの組成物。
実施形態１４８．少なくとも１つの核酸分子が、ＲＮＡ分子である、実施形態１１６～１４７のいずれか１つの組成物。
実施形態１４９．ＲＮＡ分子が、ｍＲＮＡ分子である、実施形態１４８の組成物。
実施形態１５０．ｍＲＮＡ分子が、５’－ＣＡＰを更に含む、実施形態１４９の組成物。
実施形態１５１．少なくとも１つの核酸分子が、ＤＮＡ分子である、実施形態１１６～１４７のいずれか１つの組成物。
実施形態１５２．ＤＮＡ分子が、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子である、実施形態１５１の組成物。
実施形態１５３．ＤＮＡ分子が、ＤＮＡナノプラスミドである、実施形態１５１の組成物。
実施形態１５４．リン脂質が、ＤＯＰＥである、実施形態１１６～１５３のいずれか１つの組成物。
実施形態１５５．リン脂質が、ＤＯＰＣである、実施形態１１６～１５３のいずれか１つの組成物。
実施形態１５６．リン脂質が、ＤＳＰＣである、実施形態１１６～１５３のいずれか１つの組成物。
実施形態１５７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約５５：１～約１１０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１６～１５６のいずれか１つの組成物。
実施形態１５８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約２０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１６～１５６のいずれか１つの組成物。
実施形態１５９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約４０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１６～１５６のいずれか１つの組成物。
実施形態１６０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約６０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１６～１５６のいずれか１つの組成物。
実施形態１６１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１６～１５６のいずれか１つの組成物。
実施形態１６２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約８０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１６～１５６のいずれか１つの組成物。
実施形態１６３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１１６～１５６のいずれか１つの組成物。
実施形態１６４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１６５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１６６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１６７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１６８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１６９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４０モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４０モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５６．５モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３７．５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５９モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＥと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約６０：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約６０：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１７９．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４９．４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約４４モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１．６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約６０：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１８０．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３２．８モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＳＰＣと、
約２．２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約６０：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１８１．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約６０モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３４モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＯＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約４０：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１８２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約４１．８モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約５２．２モル％のコレステロールと、
約５モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約６０：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１８３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２と、
約３５モル％のコレステロールと、
約１０モル％のＤＳＰＣと、
約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、少なくとも１つのナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約６０：１（ｗ／ｗ）である、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１８４．ｍＲＮＡが、５－メチルシチジン（５－ＭｅＣ）であるシチジン残基を含む、先行する実施形態のいずれか１つの組成物。
実施形態１８５．組成物であって、
約３０モル％～約４０モル％のＣ１２－２００と、
約３６．８４モル％～約４６．８４モル％のコレステロールと、
約１５モル％～約２５モル％のＤＯＰＥと、
約０．０１モル％～約８．１６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含み、
少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、少なくとも１つの核酸分子を含む、組成物。
実施形態１８６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３２．５モル％～約３７．５モル％のＣ１２－２００と、
約３９．３４モル％～約４４．３４モル％のコレステロールと、
約１７．５モル％～約２２．５モル％のＤＯＰＥと、
約０．１モル％～約５．６６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１８５の組成物。
実施形態１８７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３４モル％～約３６モル％のＣ１２－２００と、
約４０．８４モル％～約４２．８４モル％のコレステロールと、
約１９モル％～約２１モル％のＤＯＰＥと、
約２．１６モル％～約４．１６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１８５又は実施形態１８６の組成物。
実施形態１８８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子が、
約３５モル％のＣ１２－２００と、
約４１．８４モル％のコレステロールと、
約２０モル％のＤＯＰＥと、
約３．１６モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、を含む、実施形態１８５～１８７のいずれか１つの組成物。
実施形態１８９．少なくとも１つの核酸分子が、少なくとも１つのＤＮＡ分子である、実施形態１８５～１８８のいずれか１つの組成物。
実施形態１９０．ＤＮＡ分子が、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ ＤＮＡ分子である、実施形態１８９の組成物。
実施形態１９１．ＤＮＡ分子が、ＤＮＡナノプラスミドである、実施形態１９０の組成物。
実施形態１９２．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７０：１～約９０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８５～１９１のいずれか１つの組成物。
実施形態１９３．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約２０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８５～１９１のいずれか１つの組成物。
実施形態１９４．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約４０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８５～１９１のいずれか１つの組成物。
実施形態１９５．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約６０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８５～１９１のいずれか１つの組成物。
実施形態１９６．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約７５：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８５～１９１のいずれか１つの組成物。
実施形態１９７．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約８０：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８５～１９１のいずれか１つの組成物。
実施形態１９８．少なくとも１つの脂質ナノ粒子中の脂質と核酸との比率が、約１００：１（ｗ／ｗ）である、実施形態１８５～１９１のいずれか１つの組成物。

【0189】

本開示の医薬組成物
いくつかの態様では、本開示は、本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を提供する。

【0190】

いくつかの態様では、本開示は、本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本開示の少なくとも１つの第１のナノ粒子と、本開示の少なくとも１つの第２のナノ粒子とを含む医薬組成物を提供し、少なくとも１つの第１のナノ粒子が、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードする少なくとも１つの核酸分子を含み、少なくとも１つの第２のナノ粒子が、少なくとも１つのトランスポゾンをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む。

【0191】

いくつかの態様では、本開示は、本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子が接触している少なくとも１つの細胞を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子を使用して遺伝子改変されている少なくとも１つの細胞を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本開示の任意の方法を使用して遺伝子改変されている少なくとも１つの細胞を含む組成物を提供する。

【0192】

本開示の方法
本開示は、少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの細胞に送達する方法であって、少なくとも１つの細胞を本開示の少なくとも１つの組成物と接触させることを含む、方法を提供する。本開示は、少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの細胞に送達する方法であって、少なくとも１つの細胞を本開示の少なくとも１つのナノ粒子と接触させることを含む、方法を提供する。

【0193】

本開示の全ての方法、組成物、及びキットにおいて、少なくとも１つの細胞は、肝臓細胞であり得る。肝臓細胞は、限定されるものではないが、肝細胞、肝星細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、又は肝類洞内皮細胞を含み得る。

【0194】

本開示のいずれかの方法のうちのいくつかの態様では、細胞は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロであり得る。いくつかの態様では、本開示の方法のうちのいずれかは、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで適用され得る。

【0195】

本開示は、少なくとも１つの細胞を遺伝子改変する方法であって、少なくとも１つの細胞を本開示の少なくとも１つの組成物と接触させることを含む、方法を提供する。本開示は、少なくとも１つの細胞を遺伝子改変する方法であって、少なくとも１つの細胞を本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子と接触させることを含む、方法を提供する。

【0196】

いくつかの態様では、細胞を遺伝子改変することは、細胞が別途通常発現しない少なくとも１つのタンパク質を細胞が発現するように、又は細胞が少なくとも１つのタンパク質を別途通常発現するレベルよりも高いレベルで少なくとも１つの細胞が少なくとも１つのタンパク質を発現するように、又は細胞が別途通常発現するレベルよりも低いレベルで細胞が少なくとも１つのタンパク質を発現するように、少なくとも１つの外因性核酸を細胞に送達することを含み得る。いくつかの態様では、細胞を遺伝子改変することは、少なくとも１つの外因性核酸が少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込まれるように、少なくとも１つの外因性核酸を細胞に送達することを含み得る。

【0197】

いくつかの態様では、少なくとも１つの細胞を本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子と接触させることは、少なくとも１つの細胞を少なくとも１つの対照脂質ナノ粒子と接触させることによって誘起される外因性タンパク質の発現レベルと比較して、少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、少なくとも１５倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約２５倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約５０倍増加するレベルで少なくとも１つの外因性タンパク質を発現する少なくとも１つの細胞を結果的にもたらし得る。

【0198】

いくつかの態様では、本開示の方法は、複数の細胞を産生し得、複数の細胞のうちの少なくとも約１％、又は少なくとも約２％、又は少なくとも約３％、又は少なくとも約４％、又は少なくとも約５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％が、本開示のナノ粒子を介して複数の細胞に送達された少なくとも１つの核酸にコードされた少なくとも１つのタンパク質を発現する。

【0199】

いくつかの態様では、本開示の方法は、複数の細胞を産生し得、複数の細胞のうちの少なくとも約１％、又は少なくとも約２％、又は少なくとも約３％、又は少なくとも約４％、又は少なくとも約５％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％が、肝細胞、肝星細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、又は肝類洞内皮細胞である。

【0200】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子に製剤化された核酸分子は、少なくとも１つのゲノム編集組成物を含み得る。

【0201】

遺伝子編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする少なくとも１つの核酸配列と、ヌクレアーゼタンパク質又はそのヌクレアーゼドメインをコードする核酸配列と、を含む、少なくとも１つの核酸分子を含み得る。ヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸配列、又はそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0202】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子に製剤化されたゲノム編集組成物は、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含み得、融合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質又はそのヌクレアーゼドメインと、エンドヌクレアーゼタンパク質又はそのヌクレアーゼドメインと、を含む。

【0203】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子に製剤化されたゲノム編集組成物は、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含み得、融合タンパク質は、（ｉ）不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質又はその不活性化ヌクレアーゼドメイン、（ｉｉ）Ｃｌｏ０５１タンパク質又はそのヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの態様では、融合タンパク質は、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含み得る。いくつかの態様では、融合タンパク質は、少なくとも２つのＮＬＳを更に含み得る。いくつかの態様では、核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様では、核酸分子は、ＲＮＡを含み得る。例示的なｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（当該技術分野では「Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ」タンパク質と称される）、及び当該ｄＣａｓ９－Ｃｌｏ０５１融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、米国特許公開第２０２２／００４２０３８号に詳細に説明されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲを含む遺伝子編集組成物、及びこれらの組成物を遺伝子編集に使用する方法は、米国特許公開第２０１７／０１０７５４１号、同第２０１７／０１１４１４９号、同第２０１８／０１８７１８５号、及び米国特許第１０，４１５，０２４号に詳細に説明されており、それらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0204】

いくつかの態様では、Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲタンパク質は、配列番号３１に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0205】

いくつかの態様では、Ｃｌｏ０５１タンパク質又はヌクレアーゼドメインは、配列番号３２に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0206】

いくつかの態様では、不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質又はその不活性化ヌクレアーゼドメインは、配列番号３３に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0207】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子に製剤化されたゲノム編集組成物は、少なくとも１つのガイド分子を更に含み得る。いくつかの態様では、ガイド分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ分子）であり得る。

【0208】

したがって、本開示は、本明細書に説明される脂質ナノ粒子組成物のいずれかを提供し、脂質ナノ粒子が、少なくとも１つのゲノム編集組成物を含み、少なくとも１つのゲノム編集組成物が、ａ）融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子であって、融合タンパク質が、（ｉ）不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質又はその不活性化ヌクレアーゼドメイン、（ｉｉ）Ｃｌｏ０５１タンパク質又はそのヌクレアーゼドメインを含む、核酸分子と、ｂ）少なくとも１つのｇＲＮＡ分子と、を含む。いくつかの態様では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＮＬＳを更に含み得る。いくつかの態様では、少なくとも１つのゲノム編集組成物は、少なくとも２種のｇＲＮＡ分子を含み得る。

【0209】

本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む、少なくとも１つの治療有効量の本開示の少なくとも１つの組成物を対象に投与することを含む。

【0210】

本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、少なくとも１つの治療有効量の細胞を投与することを含み、細胞は、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む本開示の少なくとも１つのナノ粒子と接触している。本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、少なくとも１つの治療有効量の細胞を投与することを含み、細胞は、本開示の組成物及び／又は方法を使用して遺伝子改変されている。

【0211】

いくつかの態様では、少なくとも１つの疾患は、代謝性肝臓障害（ＭＬＤ）であり得る。ＭＬＤは、限定されるものではないが、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ欠損症（ＣＰＳＩ欠損症）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＳＤ）（シトルリン血症Ｉ）、シトリン欠損症（シトルリン血症ＩＩ）、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症（アルギニノコハク酸尿症）、アルギナーゼ欠損症（高アルギニン血症）、オルニチントランスロカーゼ欠損症（ＨＨＨ症候群）、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症１型（ＰＦＩＣ１）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症１型（ＰＦＩＣ２）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症１型（ＰＦＩＣ３）、若しくはそれらの任意の組み合わせである。

【0212】

いくつかの態様では、少なくとも１つの疾患は、血友病疾患であり得る。いくつかの態様では、血友病疾患は、血友病Ａである。いくつかの態様では、血友病疾患は、血友病Ｂである。いくつかの態様では、血友病疾患は、血友病Ｃである。

【0213】

いくつかの態様では、少なくとも１つの疾患は、増加したＬＤＬコレステロールによって特徴付けられる疾患及び／又は障害であり得る。したがって、本開示は、ＬＤＬコレステロールを減少させることを必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。

【0214】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子に製剤化された核酸分子は、少なくとも１つの導入遺伝子配列を含み得る。いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。

【0215】

いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、少なくとも１つのトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び少なくとも１つのプロトマー配列を含み得、少なくとも１つの治療用タンパク質は、少なくとも１つのプロモーター配列に作用可能に結合されている。いくつかの態様では、トランスポゾンは、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、第１のＩＴＲ及び少なくとも第２のＩＴＲを含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、少なくとも１つのインスレーター配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、第１のインスレーター配列及び少なくとも第２のインスレーター配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、少なくとも１つの５’ＵＴＲ配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、少なくとも１つの３’ＵＴＲ配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、第１の３’ＵＴＲ配列及び少なくとも第２の３’ＵＴＲ配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、少なくとも１つのポリＡ配列を含み得る。

【0216】

いくつかの態様では、トランスポゾンは、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列及び３’ＵＴＲ配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、５’から３’方向に、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列及び３’ＵＴＲ配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、続いて３’ＵＴＲ配列を含み得る。

【0217】

いくつかの態様では、トランスポゾンは、第１のＩＴＲ、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、３’ＵＴＲ配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、及び第２のＩＴＲを含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、５’から３’方向に、第１のＩＴＲ、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、３’ＵＴＲ配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、及び第２のＩＴＲを含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、第１のＩＴＲ、続いて第１のインスレーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、続いて３’ＵＴＲ配列、続いてポリＡ配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のＩＴＲを含み得る。

【0218】

上記のトランスポゾンのいくつかの態様では、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列は、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードする配列であり得、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードする配列は、配列番号２２の核酸配列を含み得る。

【0219】

上記のトランスポゾンのいくつかの態様では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２７の核酸配列を含み得る。

【0220】

したがって、非限定的な例では、トランスポゾンは、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列及び３’ＵＴＲ配列を含み得、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列は、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードする配列であり、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２７の核酸配列を含む。

【0221】

いくつかの態様では、トランスポゾンは、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、第１の３’ＵＴＲ配列、及び第２の３’ＵＴＲ配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、５’から３’の配列において、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、第１の３’ＵＴＲ配列、及び第２の３’ＵＴＲ配列を含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、続いて第１の３’ＵＴＲ配列、続いて第２の３’ＵＴＲ配列を含み得る。

【0222】

いくつかの態様では、トランスポゾンは、第１のＩＴＲ、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、第１の３’ＵＴＲ配列、第２の３’ＵＴＲ配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、及び第２のＩＴＲを含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、５’から３’方向に、第１のＩＴＲ、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、第１の３’ＵＴＲ配列、第２の３’ＵＴＲ配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、及び第２のＩＴＲを含み得る。いくつかの態様では、トランスポゾンは、第１のＩＴＲ、続いて第１のインスレーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、続いて第１の３’ＵＴＲ配列、続いて第２の３’ＵＴＲ配列、続いてポリＡ配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のＩＴＲを含み得る。

【0223】

上記のトランスポゾンのいくつかの態様では、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列は、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードする配列であり得、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードするｔａ配列は、配列番号２２の核酸配列を含み得る。

【0224】

上記のトランスポゾンのいくつかの態様では、第１の３’ＵＴＲ配列は、ＡＥＳ ３’ＵＴＲ配列であり得、ＡＥＳ ３’ＵＴＲ配列は、配列番号２５の核酸配列を含む。

【0225】

上記のトランスポゾンのいくつかの態様では、第２の３’ＵＴＲ配列は、ｍｔＲＮＲ１ ３’ＵＴＲ配列であり得、ｍｔＲＮＲ１ ３’ＵＴＲ配列は、配列番号２６の核酸配列を含む。

【0226】

したがって、非限定的な例では、トランスポゾンは、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列、第１の３’ＵＴＲ配列、及び第２の３’ＵＴＲ配列を含み得、治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの配列は、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードする配列であり、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、第１の３’ＵＴＲ配列は、配列番号２５の核酸配列を含み、第２の３’ＵＴＲ配列は、配列番号２６の核酸配列を含む。

【0227】

いくつかの態様では、トランスポゾンは、配列番号２８に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0228】

いくつかの態様では、トランスポゾンは、配列番号３４に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0229】

いくつかの態様では、トランスポゾンは、配列番号３５に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0230】

いくつかの態様では、治療用タンパク質は、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0231】

いくつかの態様では、治療用タンパク質は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0232】

いくつかの態様では、治療用タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＦＶＩＩＩポリペプチドは、Ｂドメインを欠くＦＶＩＩＩポリペプチド（以下、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドと称される）であり得る。当業者によって理解されるように、第ＶＩＩＩ－ＢＤＤ因子ポリペプチドは、インビトロ及びインビボで生物活性を保持する（Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，２００５，１１（２）：８４－９１参照）。

【0233】

いくつかの態様では、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドは、配列番号２１に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの態様では、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２２又は３６に記載された配列のうちのいずれかに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0234】

いくつかの態様では、治療用タンパク質は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＦＩＸポリペプチドは、Ｒ３３８Ｌ変異を含み得る。当業者によって理解されるように、Ｒ３３８Ｌ変異は、Ｐａｄｕａ変異と称され得る（ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ ａｎｄ Ｃｈｕａｈ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８，Ｖｏｌ．２６，Ｉｓｓｕｅ １，Ｐ１４－１６参照、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0235】

本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）トランスポゾンを含む核酸分子を含む少なくとも１つの治療有効量の組成物であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物と、ｂ）少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む少なくとも１つの治療有効量の組成物と、を投与することを含む。

【0236】

上記の方法のいくつかの態様では、トランスポゾンを含む核酸分子を含む組成物は、本開示の少なくとも１つのＬＮＰを含む組成物であり得、ＬＮＰは、トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含み、トランスポゾンは、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含み、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＬＮＰと、ｂ）少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む少なくとも１つの治療有効量の組成物と、を投与することを含む。

【0237】

上記の方法のいくつかの態様では、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物は、本開示の少なくとも１つのＬＮＰを含む組成物であり得、ＬＮＰは、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含む。したがって、本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）トランスポゾンを含む核酸を含む、少なくとも１つの治療有効量の組成物であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物と、ｂ）本開示の少なくとも１つの治療有効量のＬＮＰであって、ＬＮＰが、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を含む、ＬＮＰと、を投与することを含む。

【0238】

追加的に、本開示はまた、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含み、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＬＮＰと、ｂ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含む、ＬＮＰと、を投与することを含む。

【0239】

上記の方法のいくつかの態様では、少なくとも１つのトランスポゾンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物は、トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクター粒子を含む組成物であり得、トランスポゾンは、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含む少なくとも１つの治療有効量のＡＡＶウイルスベクター粒子であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶウイルスベクター粒子と、ｂ）少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む少なくとも１つの治療有効量の組成物と、を投与することを含む。

【0240】

追加的に、本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含む、少なくとも１つの治療有効量のＡＡＶウイルスベクター粒子であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶウイルスベクター粒子と、ｂ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含む、ＬＮＰと、を投与することを含む。

【0241】

上記の方法のいくつかの態様では、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物は、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含むＡＡＶウイルスベクター粒子を含む組成物であり得る。したがって、本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）トランスポゾンを含む核酸を含む、少なくとも１つの治療有効量の組成物であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物と、ｂ）少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含む、少なくとも１つの治療有効量のＡＡＶウイルスベクター粒子と、を投与することを含む。

【0242】

追加的に、本開示は、対象において少なくとも１つの疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含み、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＬＮＰと、ｂ）少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含む、少なくとも１つの治療有効量のＡＡＶウイルスベクター粒子と、を投与することを含む。

【0243】

非限定的な例では、トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含むＡＡＶウイルスベクター粒子であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、治療用タンパク質が、ＯＴＣである、ＡＡＶウイルスベクター粒子は、配列番号１～６のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的にからなるか、又はそれからなり得る。

【0244】

非限定的な例では、トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含むＡＡＶウイルスベクター粒子であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、治療用タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子である、ＡＡＶウイルスベクター粒子は、配列番号８～１４のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的にからなるか、又はそれからなり得る。

【0245】

非限定的な例では、トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含むＡＡＶウイルスベクター粒子であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、治療用タンパク質が、第ＩＸ因子である、ＡＡＶウイルスベクター粒子は、配列番号１５～２０のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的にからなるか、又はそれからなり得る。

【0246】

非限定的な例では、トランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子を含むＡＡＶウイルスベクター粒子は、配列番号７に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的にからなるか、又はそれからなり得る。

【0247】

上記の方法のいくつかの態様では、トランスポゾンを含む核酸分子を含む組成物であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物と、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物と、が同時に投与され得る。いくつかの態様では、トランスポゾンを含む核酸分子を含む組成物であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物と、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物と、が順次投与され得る。いくつかの態様では、トランスポゾンを含む核酸分子を含む組成物であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物と、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物と、が時間的に近接して投与され得る。

【0248】

本明細書で使用される場合、「時間的に近接して」という用語は、１つの治療用組成物（例えば、トランスポゾンを含む組成物）の投与が、別の治療用組成物（例えば、トランスポサーゼを含む組成物）の投与の前又は後のある時間内に発生し、それにより、１つの治療剤の治療効果が、他の治療剤の治療効果と重複することを指す。いくつかの実施形態では、１つの治療剤の治療効果は、他の治療剤の治療効果と完全に重複している。いくつかの実施形態では、「時間的に近接して」とは、１つの治療剤の投与が、別の治療剤の投与の前又は後のある時間内に発生し、それにより、１つの治療剤と他の治療剤との間に相乗効果が存在することを意味する。「時間的に近接して」は、限定されるものではないが、治療剤が投与されることになる対象、疾患又は状態が治療又は改善される対象、治療結果が達成される対象の年齢、性別、体重、遺伝的背景、病状、病歴、及び治療歴、治療剤の用量、投与頻度、及び投与期間、治療剤の薬物動態及び薬力学、並びに治療剤が投与される経路を含む、様々な因子に従って変動し得る。いくつかの実施形態では、「時間的に近接して」とは、１５分以内、３０分以内、１時間以内、２時間以内、４時間以内、６時間以内、８時間以内、１２時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、又は８週間以内を意味する。いくつかの実施形態では、１つの治療剤の複数回投与は、別の治療剤の単回投与と時間的に近接して発生し得る。いくつかの実施形態では、時間的近接性は、治療サイクル中又は投与レジメン内で変化し得る。

【0249】

非限定的な例では、本開示は、対象において代謝性肝臓障害を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、トランスポゾンを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＬＮＰと、ｂ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、ＬＮＰと、を投与することを含む。いくつかの態様では、代謝性肝臓障害は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症であり得、少なくとも１つの治療用タンパク質は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドを含み得る。いくつかの態様では、代謝性肝臓障害は、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）であり得、少なくとも１つの治療用タンパク質は、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）ポリペプチドを含み得る。

【0250】

非限定的な例では、本開示は、対象において血友病疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、トランスポゾンを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＬＮＰと、ｂ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、ＬＮＰと、を投与することを含む。いくつかの態様では、血友病疾患は、血友病Ａであり得、少なくとも１つの治療用タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子を含み得る。いくつかの態様では、血友病疾患は、血友病Ｂであり得、少なくとも１つの治療用タンパク質は、第ＩＸ因子を含み得る。

【0251】

非限定的な例では、本開示は、対象において代謝性肝臓障害を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含む、少なくとも１つの治療有効量のＡＡＶウイルスベクター粒子であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶウイルスベクター粒子と、ｂ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、ＬＮＰと、を投与することを含む。いくつかの態様では、代謝性肝臓障害は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症であり得、少なくとも１つの治療用タンパク質は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドを含み得る。いくつかの態様では、代謝性肝臓障害は、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）であり得、少なくとも１つの治療用タンパク質は、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）ポリペプチドを含み得る。

【0252】

非限定的な例では、本開示は、対象において血友病疾患を治療する方法を提供し、方法は、対象に、ａ）トランスポゾンを含む少なくとも１つの核酸分子を含む、少なくとも１つの治療有効量のＡＡＶウイルスベクター粒子であって、トランスポゾンが、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶウイルスベクター粒子と、ｂ）少なくとも１つの治療有効量の本開示のＬＮＰであって、ＬＮＰが、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、ＬＮＰと、を投与することを含む。いくつかの態様では、血友病疾患は、血友病Ａであり得、少なくとも１つの治療用タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子を含み得る。いくつかの態様では、血友病疾患は、血友病Ｂであり得、少なくとも１つの治療用タンパク質は、第ＩＸ因子を含み得る。

【0253】

本開示は、増加したＬＤＬコレステロールによって特徴付けられる疾患及び／又は障害を治療する方法であって、ゲノム編集組成物を含む本開示の少なくとも１つのＬＮＰを対象に投与することを含み、ゲノム編集組成物が、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含み、融合タンパク質が、（ｉ）不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質又はその不活性化ヌクレアーゼドメイン、（ｉｉ）Ｃｌｏ０５１タンパク質又はそのヌクレアーゼドメインを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、融合タンパク質は、Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲタンパク質であり得る。いくつかの態様では、ゲノム編集組成物は、ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする少なくとも１種のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を更に含み得る。いくつかの態様では、ゲノム編集組成物は、ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を更に含み得る。ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２９、３０のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になり得る。

【0254】

本開示は、ＬＤＬコレステロールを減少させることを必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、方法は、ゲノム編集組成物を含む本開示の少なくとも１つのＬＮＰを対象に投与することを含み、ゲノム編集組成物が、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含み、融合タンパク質が、（ｉ）不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質又はその不活性化ヌクレアーゼドメイン、（ｉｉ）Ｃｌｏ０５１タンパク質又はそのヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの態様では、融合タンパク質は、Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲタンパク質であり得る。いくつかの態様では、ゲノム編集組成物は、ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする少なくとも１種のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子を更に含み得る。いくつかの態様では、ゲノム編集組成物は、ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を更に含み得る。ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２９、３０のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になり得る。

【0255】

本開示の治療方法のいくつかの態様では、対象への本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はナノ粒子の投与は、対象における少なくとも１つの器官及び／又は組織内の外因性タンパク質（例えば、治療用タンパク質、トランスポサーゼなど）の発現を結果的にもたらし得る。

【0256】

いくつかの態様では、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はナノ粒子の投与が、組織及び／又は器官内の細胞の少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも約２５％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約３５％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％における外因性タンパク質の発現を結果的にもたらす。

【0257】

いくつかの態様では、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はナノ粒子の投与が、組織及び／又は器官内の細胞の特定の部分集団の少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも約２５％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約３５％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％における外因性タンパク質の発現を結果的にもたらす。

【0258】

いくつかの態様では、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はナノ粒子の投与は、組織及び／又は器官内で、少なくとも約１日、又は少なくとも約２日、又は少なくとも約３日、又は少なくとも約４日、又は少なくとも約５日、又は少なくとも約６日、又は少なくとも約７日、又は少なくとも約８日、又は少なくとも約９日、又は少なくとも約１０日間、外因性タンパク質の発現を結果的にもたらす。

【0259】

いくつかの態様では、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はナノ粒子の投与は、組織及び／又は器官内の特定の部分集団で、少なくとも約１日、又は少なくとも約２日、又は少なくとも約３日、又は少なくとも約４日、又は少なくとも約５日、又は少なくとも約６日、又は少なくとも約７日、又は少なくとも約８日、又は少なくとも約９日、又は少なくとも約１０日間、外因性タンパク質の発現を結果的にもたらす。

【0260】

いくつかの態様では、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はナノ粒子の投与は、組織及び／又は器官内で、約１日間以下、又は約２日間以下、又は約３日間以下、又は約４日間以下、又は約５日間以下、又は約６日間以下、又は約７日間以下、又は約８日間以下、又は約９日間以下、又は約１０日間以下、外因性タンパク質の発現を結果的にもたらす。

【0261】

いくつかの態様では、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はナノ粒子の投与は、組織及び／又は器官内の特定の部分集団で、約１日間以下、又は約２日間以下、又は約３日間以下、又は約４日間以下、又は約５日間以下、又は約６日間以下、又は約７日間以下、又は約８日間以下、又は約９日間以下、又は約１０日間以下、外因性タンパク質の発現を結果的にもたらす。

【0262】

いくつかの態様では、本開示の組成物の投与時に外因性タンパク質を発現する細胞のパーセンテージは、対照ナノ粒子を含む組成物の投与時に外因性タンパク質を発現する細胞のパーセンテージと比較して、少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍、少なくとも１５倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約２５倍、又は少なくとも約３０倍、又は少なくとも約５０倍増加し得る。

【0263】

いくつかの態様では、組織及び／又は器官は、肝臓であり得る。いくつかの態様では、細胞の特定の部分集団は、限定されるものではないが、肝細胞、肝星細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、若しくは肝類洞内皮細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0264】

いくつかの態様では、本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子を含む組成物の投与は、少なくとも１つの対照脂質ナノ粒子を含む組成物の投与よりも低毒性である。

【0265】

いくつかの態様では、低下した毒性は、本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子の投与後の少なくとも１つの肝臓酵素のレベルの増加の減衰として顕在化し得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの肝臓酵素は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のうちの１つ以上であり得る。

【0266】

いくつかの態様では、低下した毒性は、本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子の投与後の少なくとも１つの炎症性サイトカインのレベルの増加の減衰として顕在化し得る。いくつかの態様では、少なくとも１つの炎症性サイトカインは、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ－Ｇ）、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－ａ）のうちの１つ以上であり得る。

【0267】

いくつかの態様では、低下した毒性は、本開示の少なくとも１つの脂質ナノ粒子の投与後の体重の減少の減衰として顕在化し得る。

【0268】

いくつかの態様では、対照脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質が生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質ではない点を除いて、他の点では同一である脂質ナノ粒子である。

【0269】

いくつかの態様では、対照脂質ナノ粒子は、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含まない脂質ナノ粒子である。

【0270】

いくつかの態様では、対照脂質ナノ粒子は、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２を含まない脂質ナノ粒子である。

【0271】

いくつかの態様では、対照脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質がｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２ではない点を除いて、他の点では同一である脂質ナノ粒子である。

【0272】

いくつかの態様では、対照脂質ナノ粒子は、より多い量の生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子である。

【0273】

いくつかの態様では、対照脂質ナノ粒子は、より少ない量の生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子である。

【0274】

いくつかの態様では、対照脂質ナノ粒子は、当該技術分野で既に開示されている脂質ナノ粒子組成物を含む。

【0275】

いくつかの態様では、対照脂質ナノ粒子は、本開示の脂質ナノ粒子と同じ用量で対象に投与される。

【0276】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子は、マイクロ流体混合プラットフォームを使用して生成され得る。いくつかの態様では、マイクロ流体混合プラットフォームは、非乱流マイクロ流体混合プラットフォームであり得る。

【0277】

いくつかの態様では、マイクロ流体混合プラットフォームは、マイクロ流体デバイスを使用して、ナノ粒子の脂質成分を含む混和性溶媒相と、脂質ナノ粒子カーゴ（例えば、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）を含む水相とを組み合わせることによって、本開示の脂質ナノ粒子を生成し得る。いくつかの態様では、混和性溶媒相及び水相は、２つの相の即時の混合を可能にしない層流条件下でマイクロ流体デバイス内で混合される。２つの相がマイクロ流体チャネルの層流下で移動すると、チャネルの顕微鏡的特徴が、制御された均質な混合を可能にして、本開示の脂質ナノ粒子を生成し得る。

【0278】

いくつかの態様では、マイクロ流体混合プラットフォームは、限定されるものではないが、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｓｐａｒｋ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｉｇｎｉｔｅ（商標）（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｂｌａｚｅ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）、又はＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）ＧＭＰ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を含み得る。

【0279】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子は、マイクロ流体混合プラットフォームを使用して生成され得、マイクロ流体混合プラットフォームは、少なくとも約２．５ｍｌ／分、又は少なくとも約５ｍｌ／分、又は少なくとも約７．５ｍｌ／分、又は少なくとも約１０ｍｌ／分、又は少なくとも約１２．５ｍｌ／分、又は少なくとも約１５ｍｌ／分、又は少なくとも約１７．５ｍｌ／分、又は少なくとも約２０ｍｌ／分、又は少なくとも約２２．５ｍｌ／分、又は少なくとも約２５ｍｌ／分、又は少なくとも約２７．５ｍｌ／分、又は少なくとも約３０ｍｌ／分の速度で混合する。

【0280】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子は、Ｔ－ミキサーを使用して生成され得、Ｔ－ミキサーは、少なくとも約２．５ｍｌ／分、又は少なくとも約５ｍｌ／分、又は少なくとも約７．５ｍｌ／分、又は少なくとも約１０ｍｌ／分、又は少なくとも約１２．５ｍｌ／分、又は少なくとも約１５ｍｌ／分、又は少なくとも約１７．５ｍｌ／分、又は少なくとも約２０ｍｌ／分、又は少なくとも約２２．５ｍｌ／分、又は少なくとも約２５ｍｌ／分、又は少なくとも約２７．５ｍｌ／分、又は少なくとも約３０ｍｌ／分の速度で混合する。

【0281】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子は、マイクロ流体混合プラットフォームを使用して生成され得、マイクロ流体混合プラットフォームは、約１０：１、又は約９：１、又は約８：１、又は約７：１、又は約６：１、又は約５：１、又は約４：１、又は約３：１、又は約２：１、又は約１：１、又は約１：２、又は約１：３、又は約１：４、又は約１：５、又は約１：６、又は約１：７、又は約１：８、又は約１：９、又は約１：１０、溶媒：水、ｖ：ｖの比率で混和性溶媒相と水相とを混合する。

【0282】

いくつかの態様では、本開示の脂質ナノ粒子は、Ｔ－ミキサーを使用して生成され得、Ｔ－ミキサーは、約１０：１、又は約９：１、又は約８：１、又は約７：１、又は約６：１、又は約５：１、又は約４：１、又は約３：１、又は約２：１、又は約１：１、又は約１：２、又は約１：３、又は約１：４、又は約１：５、又は約１：６、又は約１：７、又は約１：８、又は約１：９、又は約１：１０、溶媒：水、ｖ：ｖの比率で混和性溶媒相と水相とを混合する。

【0283】

ｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列
いくつかの態様では、核酸分子は、ｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列を含み得る。いくつかの態様では、核酸分子は、第１のｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列及び第２のｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列を含み得る。

【0284】

いくつかの態様では、ｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列は、当該技術分野で既知の任意のｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列を含み得る。

【0285】

本開示の方法のいくつかの態様では、第１のｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列及び／又は第２のｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列などのｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲ配列は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＩＴＲ、ＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンＩＴＲ、Ｔｏｌ２トランスポゾンＩＴＲ、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンＩＴＲ、又はそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなり得る。

【0286】

インスレーター配列
いくつかの態様では、インスレーター配列は、配列番号１４６、１４７に記載された配列のうちのいずれかに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0287】

プロモーター配列
いくつかの態様では、核酸分子は、プロモーター配列を含み得る。いくつかの態様では、プロモーター配列は、当該技術分野で既知の任意のプロモーター配列を含み得る。いくつかの態様では、プロモーター配列は、当該技術分野で既知の任意の肝臓特異的プロモーター配列を含み得る。

【0288】

いくつかの態様では、プロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含み得る。いくつかの態様では、プロモーター配列は、ＬＰ１プロモーターを含み得る。いくつかの態様では、プロモーター配列は、ｐｐ５２（ＬＳＰ１）ロングプロモーターの白血球特異的発現を含み得る。いくつかの態様では、プロモーター配列は、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターを含み得る。
いくつかの態様では、プロモーター配列は、ｗＴＢＧプロモーターを含み得る。いくつかの態様では、プロモーター配列は、肝コンビナトリアルバンドル（ＨＣＢ）プロモーターを含み得る。いくつかの態様では、プロモーター配列は、２ｘＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーターを含み得る。いくつかの態様では、プロモーター配列は、ｐｐ５２（ＬＳＰ１）プラスキメライントロンプロモーターの白血球特異的発現を含み得る。いくつかの態様では、プロモーター配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含み得る。

【0289】

導入遺伝子配列
いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＭＵＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４０～５１に記載された配列のうちのいずれかに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0290】

いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＭＵＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５６～５９に記載された配列のうちのいずれかに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0291】

いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、ｉＣＡＳ９ポリペプチドをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0292】

いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＦＶＩＩＩポリペプチドは、Ｂドメインを欠くＦＶＩＩＩポリペプチド（以下、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドと称される）であり得る。

【0293】

いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードする核酸配列を含み得、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドは、配列番号２１に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの態様では、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２２に記載された配列のうちのいずれかに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0294】

いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＦＩＸポリペプチドは、Ｒ３３８Ｌ変異を含み得る。当業者によって理解されるように、Ｒ３３８Ｌ変異は、Ｐａｄｕａ変異と称され得る。いくつかの態様では、ＦＩＸポリペプチドをコードする核酸配列は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は６５の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0295】

いくつかの態様では、導入遺伝子配列は、当該技術分野で既知の方法に従ってコドン最適化され得る。

【0296】

いくつかの態様では、少なくとも１つの導入遺伝子配列は、同じポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つのプロモーター配列に作用可能に結合され得る。

【0297】

治療用タンパク質
いくつかの態様では、治療用タンパク質は、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＭＵＴ１ポリペプチドは、配列番号５２～５５のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0298】

いくつかの態様では、治療用タンパク質は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＯＴＣポリペプチドは、配列番号６０～６３のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0299】

いくつかの態様では、治療用タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＦＶＩＩＩポリペプチドは、Ｂドメインを欠くＦＶＩＩＩポリペプチド（以下、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤポリペプチドと称される）であり得る。

【0300】

いくつかの態様では、治療用タンパク質は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。いくつかの態様では、ＦＩＸポリペプチドは、Ｒ３３８Ｌ変異を含み得る。当業者によって理解されるように、Ｒ３３８Ｌ変異は、Ｐａｄｕａ変異と称され得る。いくつかの態様では、ＦＩＸポリペプチドは、配列番号６４のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0301】

３’ＵＴＲ配列
いくつかの態様では、３’ＵＴＲ配列は、ＡＥＳ ３’ＵＴＲ配列であり得る。ＡＥＳ ３’ＵＴＲ配列は、配列番号２５に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0302】

いくつかの態様では、３’ＵＴＲ配列は、ｍｔＲＮＲ１ ３’ＵＴＲ配列であり得る。ｍｔＲＮＲ１ ３’ＵＴＲ配列は、配列番号２６に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0303】

いくつかの態様では、３’ＵＴＲ配列は、配列番号２７に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0304】

ポリＡ配列
いくつかの態様では、核酸分子は、ポリＡ配列を含み得る。いくつかの態様では、ポリＡ配列は、当該技術分野で既知の任意のポリＡ配列を含み得る。

【0305】

自己切断ペプチド配列
いくつかの態様では、核酸分子は、自己切断ペプチド配列を含み得る。いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、当該技術分野で既知の任意の自己切断ペプチド配列を含み得る。いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、当該技術分野で既知の２Ａ自己切断ペプチド配列を含み得る。自己切断ペプチドの非限定的な例としては、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、又はＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドが挙げられる。

【0306】

いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。

【0307】

いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。

【0308】

いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、Ｅ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。

【0309】

いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。

【0310】

いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、Ｆ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。

【0311】

いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。

【0312】

いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。

【0313】

いくつかの態様では、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み得る。

【0314】

転位システム
いくつかの態様では、核酸分子は、第１の核酸配列を含む、トランスポゾン又はナノトランスポゾンを含み得、第１の核酸配列が、（ａ）第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又は第１のＩＴＲをコードする配列、（ｂ）第２のＩＴＲ又は第２のＩＴＲをコードする配列、及び（ｃ）イントラＩＴＲ配列又はイントラＩＴＲをコードする配列を含み、イントラＩＴＲ配列は、トランスポゾン配列又はトランスポゾンをコードする配列を含む。

【0315】

いくつかの態様では、核酸分子は、第１の核酸配列であって、（ａ）第１の逆方向末端反復（ＩＴＲ）又は第１のＩＴＲをコードする配列、（ｂ）第２のＩＴＲ又は第２のＩＴＲをコードする配列、及び（ｃ）イントラＩＴＲ配列又はイントラＩＴＲをコードする配列を含み、イントラＩＴＲ配列が、トランスポゾン配列又はトランスポゾンをコードする配列を含む、第１の核酸配列と、インターＩＴＲ配列又はインターＩＴＲをコードする配列を含む第２の核酸配列であって、インターＩＴＲ配列の長さが、７００ヌクレオチド以下である、第２の核酸配列と、を含む、トランスポゾン又はナノトランスポゾンを含み得る。

【0316】

本開示のトランスポゾン又はナノトランスポゾンは、治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。トランスポゾン又はナノトランスポゾンは、２つのシス調節インスレーターエレメントに隣接した治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドＤＮＡトランスポゾンであり得る。トランスポゾン又はナノトランスポゾンは、トランスポサーゼをコードする配列を含むプラスミドを更に含み得る。トランスポサーゼをコードする配列は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であり得る。好ましくは、トランスポサーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。

【0317】

本開示のトランスポゾン又はナノトランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポゾンであり得る。いくつかの態様では、トランスポゾンがＰＢトランスポゾンであるとき、トランスポサーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼ、ｐｉｇｇｙＢａｃ様（ＰＢＬ）トランスポサーゼ、又はＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ若しくはｓＰＢ）トランスポサーゼである。好ましくは、ＳＰＢトランスポサーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。

【0318】

ＰＢトランスポゾン、並びにＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼの非限定的な例は、米国特許第６，２１８，１８２号、米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＰＣＴ公開第２０１０／０９９２９６号に詳細に説明されている。

【0319】

ＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼは、トランスポゾンの末端でトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、染色体部位内の配列５’－ＴＴＡＴ－３’（ＴＴＡＴ標的配列）で、又は染色体部位内の配列５’－ＴＴＡＡ－３’（ＴＴＡＡ標的配列）で、ＩＴＲ間に内容物を挿入する。ＰＢ又はＰＢＬトランスポゾンの標的配列は、５’－ＣＴＡＡ－３’、５’－ＴＴＡＧ－３’、５’－ＡＴＡＡ－３’、５’－ＴＣＡＡ－３’、５’ＡＧＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＧＡ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＡＣ－３’、５’－ＡＣＴＡ－３’、５’－ＡＧＧＧ－３’、５’－ＣＴＡＧ－３’、５’－ＴＧＡＡ－３’、５’－ＡＧＧＴ－３’、５’－ＡＴＣＡ－３’、５’－ＣＴＣＣ－３’、５’－ＴＡＡＡ－３’、５’－ＴＣＴＣ－３’、５’ＴＧＡＡ－３’、５’－ＡＡＡＴ－３’、５’－ＡＡＴＣ－３’、５’－ＡＣＡＡ－３’、５’－ＡＣＡＴ－３’、５’－ＡＣＴＣ－３’、５’－ＡＧＴＧ－３’、５’－ＡＴＡＧ－３’、５’－ＣＡＡＡ－３’、５’－ＣＡＣＡ－３’、５’－ＣＡＴＡ－３’、５’－ＣＣＡＧ－３’、５’－ＣＣＣＡ－３’、５’－ＣＧＴＡ－３’、５’－ＧＴＣＣ－３’、５’－ＴＡＡＧ－３’、５’－ＴＣＴＡ－３’、５’－ＴＧＡＧ－３’、５’－ＴＧＴＴ－３’、５’－ＴＴＣＡ－３’５’－ＴＴＣＴ－３’、及び５’－ＴＴＴＴ－３’を含むか、又はそれらからなり得る。ＰＢ又はＰＢＬトランスポゾンシステムは、ＩＴＲの間に含められ得る関心対象の遺伝子に対するペイロード限界がない。

【0320】

１つ以上のＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼの例示的なアミノ酸配列は、米国特許第６，２１８，１８５号、米国特許第６，９６２，８１０、及び米国特許第８，３９９，６４３号に開示されている。

【0321】

ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、３０位、１６５位、２８２位、又は５３８位の各々で２つ以上又は３つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり得る。トランスポサーゼは、アミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＳＰＢトランスポサーゼであり得、３０位のアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）に対するバリン（Ｖ）の置換であり得、１６５位のアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）に対するセリン（Ｓ）の置換であり得、２８２位のアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）に対するバリン（Ｖ）の置換であり得、５３８位のアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）に対するリジン（Ｋ）の置換であり得る。

【0322】

トランスポサーゼが３０位、１６５位、２８２位、及び／又は５３８位に上記の変異を含む特定の態様では、３位、４６位、８２位、１０３位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２５８位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８６位、５０３位、５５２位、５７０位、及び５９１位のうちの１つ以上にアミノ酸置換を更に含み得るＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼが、ＰＣＴ公開第２０１９／１７３６３６号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６により詳細に説明される。

【0323】

ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼは、ＰＣＴ公開第２０１９／１７３６３６号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６により詳細に説明されるように、昆虫、脊椎動物、甲殻類、又は尾索動物から単離又は誘導され得る。好ましい態様では、ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼは、昆虫Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ８７３７５）又はＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＤ１１１３５）から単離されるか、又は誘導される。

【0324】

過活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、それが誘導される天然由来のバリアントよりも活性が高いトランスポサーゼである。好ましい態様では、過活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ又はＸｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから単離されるか、又は誘導される。過活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼの例は、米国特許第６，２１８，１８５号、米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。過活性アミノ酸置換のリストは、米国特許第１０，０４１，０７７号に開示されている。

【0325】

いくつかの態様では、ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、組み込み欠損である。組み込み欠損ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、その対応するトランスポゾンを切除し得るが、対応する野生型トランスポサーゼよりも低い頻度で切除されたトランスポゾンを組み込み得るトランスポサーゼである。組み込み欠損ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼの例は、米国特許第６，２１８，１８５号、米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。組み込み欠損アミノ酸置換のリストは、米国特許第１０，０４１，０７７号に開示されている。

【0326】

いくつかの態様では、ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、核局在化シグナルに融合される。核局在化シグナルに融合されるＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼの例は、米国特許第６，２１８，１８５号、米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。

【0327】

いくつかの態様では、ｓＰＢタンパク質は、配列番号３７～３９のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はそれらの間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり得る。

【0328】

本開示のトランスポゾン又はナノトランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンであり得る。いくつかの態様では、トランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンであるとき、トランスポサーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼ（例えば、米国特許第９，２２８，１８０号に開示されている）又は過活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼである。

【0329】

本開示のトランスポゾン又はナノトランスポゾンは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンであり得る。例示的なＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンは、Ｈｅｌｉｂａｔ１を含む。いくつかの態様では、トランスポゾンがＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンであるとき、トランスポサーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポサーゼである（例えば、ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されているように）。

【0330】

本開示のトランスポゾン又はナノトランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポゾンであり得る。いくつかの態様では、トランスポゾンがＴｏｌ２トランスポゾンであるとき、トランスポサーゼは、Ｔｏｌ２トランスポサーゼである（例えば、ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されているように）。

【0331】

本開示のトランスポゾン又はナノトランスポゾンは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンであり得る。いくつかの態様では、トランスポゾンがＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンであるとき、トランスポサーゼは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼ又は過活性ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼである（例えば、ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されているように）。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼは、天然由来のアミノ酸配列又は非天然由来のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなり得る。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドは、天然由来の核酸配列又は非天然由来の核酸配列を含むか、又はそれからなり得る。

【0332】

いくつかの態様では、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼは、ＰＣＴ公開第２０１９／１７３６３６号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６により詳細に説明されるように、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポサーゼと比較したとき、１つ以上の配列変動を含む。

【0333】

本明細書に開示される細胞送達組成物（例えば、トランスポゾン）は、治療用タンパク質又は治療剤をコードする核酸分子を含み得る。治療用タンパク質の例は、ＰＣＴ公開第２０１９／１７３６３６号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されたものを含む。

【0334】

本開示の細胞及び改変細胞
本開示の細胞及び改変細胞は、哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、細胞及び改変細胞は、ヒト細胞である。一態様では、本開示のＬＮＰ組成物を使用した改変のために標的化された細胞は、肝細胞、肝星細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、又は肝類洞内皮細胞である。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、トランスポサーゼをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ分子を含み、改変細胞は、インビボで生成される。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、トランスポゾンをコードする少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、改変細胞は、インビボで生成される。一実施形態では、トランスポゾンは、肝臓特異的プロモーターに作用可能に結合された治療用遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0335】

本開示の細胞及び改変細胞は、体細胞であり得る。本開示の細胞及び改変細胞は、分化細胞であり得る。本開示の細胞及び改変細胞は、自己細胞又は同種細胞であり得る。同種細胞は、対象への投与後の生着に対する有害反応を防止するように操作される。同種細胞は、任意のタイプの細胞であり得る。同種細胞は、幹細胞であってもよく、又は幹細胞から誘導されてもよい。同種細胞は、分化した体細胞であり得る。

【0336】

製剤、用量、及び投与モード
本開示は、本明細書に説明される組成物の投与のための製剤、用量、及び方法を提供する。

【0337】

開示される組成物及び医薬組成物は、限定されるものではないが、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどの、任意の好適な補助剤のうちの少なくとも１つを更に含み得る。薬学的に許容される補助剤が好ましい。そのような滅菌溶液の非限定的な例及び調製方法は、当該技術分野で周知であるが、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）１９９０、及び“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ（Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．）１９９８に限定される。当該技術分野で周知であるか、又は本明細書に説明される、組成物の投与モード、溶解性、及び／又は安定性に好適である薬学的に許容される担体が、通例的に選択され得る。

【0338】

例えば、本開示の開示されたＬＮＰ組成物は、希釈剤を更に含み得る。いくつかの組成物では、希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であり得る。いくつかの組成物では、希釈剤は、酢酸ナトリウムであり得る。

【0339】

使用に好適な医薬賦形剤及び添加剤の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖、ジ－、トリ－、テトラ－、及びオリゴ糖を含む糖類、アルディトール、アルドニン酸、エステル化糖類などの誘導体化糖類、及び多糖又は糖ポリマー）が挙げられ、これらは、単独又は１～９９．９９重量％又は体積％の組み合わせを含む、単一又は組み合わせで存在し得る。タンパク質賦形剤の非限定的な例としては、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどの血清アルブミンが挙げられる。緩衝能でも機能し得る代表的なアミノ酸／タンパク質成分としては、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパラギンなどが挙げられる。１つの好ましいアミノ酸は、グリシンである。

【0340】

組成物はまた、緩衝剤又はｐＨ調整剤を含み得、典型的には、緩衝剤は、有機酸又は塩基から調製された塩である。代表的な緩衝剤としては、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩などの有機酸塩、トリス、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸緩衝剤が挙げられる。好ましい緩衝剤は、クエン酸塩などの有機酸塩である。

【0341】

多くの公知及び開発済みのモードは、治療有効量の本明細書に開示される組成物又は医薬組成物を投与するために使用され得る。投与モードの非限定的な例としては、ボーラス投与、口腔、注入、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、細胞内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝臓内、病変内、筋肉内、心筋内、鼻腔内、眼内、骨内、骨膜内、骨盤内、心包内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、腫瘍内、静脈内、膀胱内、経口、非経口、直腸内、舌下、皮下、経皮、又は膣内手段が挙げられる。

【0342】

本開示の組成物は、非経口（皮下、筋肉内、若しくは静脈内）、若しくは特に液体溶液若しくは懸濁液の形態の任意の他の投与のための使用のために、限定されるものではないが、クリーム及び座薬などの特に半固体形態における膣内若しくは直腸投与で使用するために、限定されるものではないが、錠剤若しくはカプセルの形態における口腔若しくは舌下投与のために、又は限定されるものではないが、粉末、点鼻薬、若しくはエアロゾル、若しくは特定の薬剤などの鼻腔内、又は限定されるものではないが、皮膚構造を改変するか、若しくは経皮パッチ中の薬物濃度を増加させるためにジメチルスルホキシドなどの化学増強剤を用いる、ゲル、軟膏、ローション、懸濁液、若しくはパッチ送達システムなどの経皮的に（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ“Ｄｒｕｇ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ；”Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．５９－９０（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９４）、又はエレクトロポレーションなどの一時的輸送経路を作成する電場の適用、イオントフォレシスなどの皮膚を通した荷電薬物の移動性を増加させるために、又はソノフォレシスなどの超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号）のために調製され得る（上記の刊行物及び特許は参照により本明細書に完全に組み込まれる）。

【0343】

非経口投与について、本明細書に開示される任意の組成物は、薬学的に許容される非経口ビヒクルと関連する、又は別個に提供される、溶液、懸濁液、エマルジョン、粒子、粉末、又は凍結乾燥粉末として製剤化され得る。非経口投与のための製剤は、一般的な賦形剤として、滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含有し得る。注射用の水性又は油性の懸濁液は、既知の方法に従って、適切な乳化剤又は加湿剤及び懸濁剤を使用して調製され得る。注射のための薬剤は、水溶液、滅菌注射可能な溶液、又は溶媒中の懸濁液などの非毒性、非経口投与可能な希釈剤であり得る。使用可能なビヒクル又は溶媒として、水、リンゲル溶液、等張性生理食塩水などが許容され、通常の溶媒又は懸濁溶媒として、滅菌不揮発性オイルが使用され得る。これらの目的のために、天然又は合成又は半合成脂肪酸又は脂肪酸、天然又は合成又は半合成のモノグリセリド又はジグリセリド又はトリグリセリドを含む、任意の種類の不揮発性オイル及び脂肪酸が使用され得る。親投与は、当該技術分野で既知であり、限定されるものではないが、米国特許第５，８５１，１９８号に説明される従来の注射手段、ガス加圧無針注射デバイス、及び米国特許第５，８３９，４４６号に説明されるレーザー穿孔デバイスを含む。

【0344】

経肺投与について、好ましくは、本明細書に説明される組成物又は医薬組成物は、肺又は洞の気道の下部に到達するために有効な粒子サイズで送達される。組成物又は医薬組成物は、吸入による治療剤の投与のために当該技術分野で既知の様々な吸入又は鼻腔デバイスのいずれかによって送達され得る。患者の洞腔又は肺胞にエアロゾル化製剤を堆積させることができるこれらのデバイスとしては、定量噴霧式吸入器、噴霧器（例えば、ジェット噴霧器、超音波噴霧器）、乾燥粉末発生器、噴霧器などが挙げられる。全てのそのようなデバイスは、エアロゾルにおける本明細書に説明される組成物又は医薬組成物の分注のための投与に好適な製剤を使用し得る。そのようなエアロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）又は固体粒子のいずれかからなり得る。追加的に、本明細書に説明される組成物又は医薬組成物を含むスプレーが、少なくとも１つのタンパク質足場の懸濁液又は溶液を、圧力下でノズルに強制的に通すことによって生成され得る。定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）では、本明細書に説明される推進剤、組成物、又は医薬組成物、並びに任意の賦形剤又は他の添加剤は、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスタ内に含有される。定量弁の作動は、混合物をエアロゾルとして放出する。肺投与、製剤、及び関連デバイスのより詳細な説明は、ＰＣＴ公開第２０１９／０４９８１６号に開示されている。

【0345】

粘膜表面を通した吸収について、組成物は、複数のサブミクロン粒子を含むエマルジョン、粘性高分子、生理活性ペプチド、及び水性連続相を含み、これは、エマルジョン粒子の粘膜接着を達成することによって、粘膜表面を通した吸収を促進する（米国特許第５，５１４，６７０号）。本開示のエマルジョンの適用に好適な粘液表面は、角膜、結膜、口腔、舌下、鼻腔、膣、肺、胃、腸、及び直腸の投与経路を含み得る。膣又は直腸投与のための製剤、例えば、座薬は、賦形剤として、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、ココアバターなどを含有し得る。鼻腔内投与のための製剤は、固体であってもよく、賦形剤、例えば、ラクトースとして含有されてもよく、又は鼻腔滴の水性若しくは油性溶液であってもよい。口腔投与について、賦形剤としては、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、プレゲリン化デンプンなどが挙げられる（米国特許第５，８４９，６９５号）。粘膜投与及び製剤のより詳細な説明が、ＰＣＴ公開第２０１９／０４９８１６号に開示されている。

【0346】

経皮投与について、本明細書に開示される組成物又は医薬組成物は、リポソーム又はポリマーナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、又は小球体（別途記載されない限り、まとめてマイクロ粒子と称される）などの、送達デバイスに封入される。ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びその共重合体などのポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、並びにポリホスファゼンなどの合成ポリマーと、コラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン、及び他のタンパク質、アルギン酸塩及び他の多糖類などの天然ポリマーと、それらの組み合わせと、から作製された微粒子を含む、いくつかの好適なデバイスが既知である（米国特許第５，８１４，５９９号）。経皮投与、製剤、及び好適なデバイスのより詳細な説明は、ＰＣＴ公開第２０１９／０４９８１６号に開示されている。

【0347】

開示された化合物を、長期間、例えば、単回投与から１週間～１年間にわたって対象に送達することが望ましい場合がある。様々な徐放剤形、デポ剤形、又はインプラント剤形が利用され得る。

【0348】

好適な用量は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（２０００）、ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．（２０００）、Ｎｕｒｓｉｎｇ ２００１ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ，２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ Ｃｏｒｐ．，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ，Ｐａ．，２００１、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｇｕｉｄｅ ２００１，ｅｄ．，Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓｔａｎｇ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ－Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ，Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ，Ｎ．Ｊを参照されたい。好ましい用量は、任意選択的に、約０．１～９９及び／若しくは１００～５００ｍｇ／ｋｇ／投与、又はその任意の範囲、値、若しくは画分を含み得るか、あるいは単回若しくは複数回投与当たり約０．１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、又はその任意の範囲、値、若しくは画分の血清濃度を達成するためのものであり得る。本明細書に開示される組成物又は医薬組成物の好ましい用量範囲は、対象の体重において約１ｍｇ／ｋｇ、最大約３、約６、又は約１２ｍｇ／ｋｇである。

【0349】

あるいは、投与される用量は、特定の薬剤の薬力学的特徴、並びにその投与モード及び投与経路、レシピエントの年齢、健康、及び体重、症状の性質及び程度、併用療法の種類、治療頻度、並びに望ましい効果などの既知の因子に応じて変化し得る。

【0350】

非限定的な例として、ヒト又は動物の治療は、１～４０日目のうちの少なくとも１日、又は代替的に若しくは追加的に、１～５２週目のうちの少なくとも１週、又は代替的に若しくは追加的に、１～２０年のうちの少なくとも１年、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、本明細書に開示される組成物又は医薬組成物の１回又は定期的な用量として、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、又は１日当たりの任意の範囲、値、若しくは画分として提供され得る。

【0351】

本明細書に開示されるように、組成物を必要とする対象に投与される組成物が改変細胞である態様では、細胞は、約１×１０^３～１×１０^１５個の細胞、１×１０^３～１×１０^１５個の細胞、約１×１０^４～１×１０^１２個の細胞、約１×１０^５～１×１０^１０個の細胞、約１×１０^６～１×１０^９個の細胞、約１×１０^６～１×１０^８個の細胞、約１×１０^６～１×１０^７個の細胞、又は約１×１０^６～２５×１０^６個の細胞を投与され得る。一態様では、細胞は、約５×１０^６～２５×１０^６個を投与される。

【0352】

本開示の組成物及び医薬組成物の投与の薬学的に許容される賦形剤、製剤、用量、及び方法のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開第２０１９／０４９８１号に開示されている。

【0353】

本開示は、開示される組成物及び医薬組成物を使用して、例えば、組成物又は医薬組成物の治療有効量を細胞、組織、器官、動物、又は対象に投与又は接触させて、当該技術分野で既知のように、又は本明細書に説明されるように、細胞、組織、器官、動物、又は対象における疾患又は障害の治療のための開示される組成物又は医薬組成物の使用を提供する。一態様では、対象は、哺乳動物である。好ましくは、対象は、ヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0354】

本開示の任意の使用又は方法は、有効量の本明細書に開示される任意の組成物又は医薬組成物を、そのような改変、治療、又は療法を必要とする細胞、組織、器官、動物、又は対象に投与することを含み得る。そのような方法は、そのような疾患又は障害を治療するための併用投与又は併用療法を任意選択的に更に含み、本明細書に開示される任意の組成物又は医薬組成物の投与は、少なくとも１つの化学療法剤（例えば、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品）の前、それと同時、及び／又はその後に投与することを更に含む。

【0355】

いくつかの態様では、対象は、投与後に移植片対宿主（ＧｖＨ）及び／又は宿主対移植片（ＨｖＧ）を発現しない。一態様では、投与は、全身的である。全身投与は、当該技術分野で既知の、及び本明細書で詳細に説明される任意の手段であり得る。好ましくは、全身投与は、静脈内注射又は静脈内注入によるものである。一態様では、投与は、局所的である。局所投与は、当該技術分野で既知の、及び本明細書で詳細に説明される任意の手段であり得る。好ましくは、局所投与は、腫瘍内注射若しくは注入、脊髄内注射若しくは注入、脳室内注射若しくは注入、眼内注射若しくは注入、又は骨内注射若しくは注入による。

【0356】

いくつかの態様では、治療有効用量は、単回用量である。いくつかの態様では、単回用量は、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、又は同時に製造される間の任意の数の用量のうちの１つである。組成物が自己細胞又は同種細胞であるいくつかの態様では、用量は、細胞が疾患又は障害を治療するのに十分な時間にわたって生着及び／又は持続するのに十分な量である。

【0357】

本明細書に説明される治療の方法のいくつかの態様では、治療は、修正又は終了され得る。具体的には、治療に使用される組成物が誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む態様では、アポトーシスは、細胞を誘導剤と接触させることによって細胞内に選択的に誘導され得る。治療は、例えば、回復の徴候、若しくは疾患の重症度／進行の減少の徴候、疾患寛解／障害の徴候、及び／又は有害事象の発生に応答して、修正又は終了され得る。いくつかの態様では、方法は、細胞療法の修正を阻害するために誘導剤の阻害剤を投与するステップを含み、それによって、細胞療法の機能及び／又は有効性を回復させる（例えば、疾患再発若しくは重症度の増加の徴候又は症状、及び／又は有害事象が解決されたとき）。

【0358】

核酸分子
治療用タンパク質をコードする本開示の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、若しくは任意の他の形態などのＲＮＡの形態、又は限定されるものではないが、クローニングによって得られるか、若しくは合成的に生成されたｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖若しくは一本鎖、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１つの鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよく、又はアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。

【0359】

本開示の単離された核酸分子は、１つ以上のイントロン、例えば、限定されるものではないが、治療用タンパク質の少なくとも１つの特定の酵素活性部分を任意選択的に含む、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子と、治療用タンパク質のためのコード配列を含む核酸分子、並びに上記に説明されたものとは実質的に異なるが、遺伝子コードの縮重に起因して、本明細書に説明されるように、及び／又は当該技術分野で既知であるように、治療用タンパク質を依然としてコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、を含み得る。当然ながら、遺伝子コードは、当該技術分野で周知である。したがって、本開示の特定のタンパク質足場をコードするそのような縮重核酸バリアントを生成することは、当業者にとって通例であろう。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照すると、そのような核酸バリアントが本開示に含まれる。

【0360】

本明細書で示されるように、治療用タンパク質をコードする核酸分子を含む本開示の核酸分子は、限定されるものではないが、それ自体によって治療用タンパク質の酵素活性断片のアミノ酸配列をコードするもの、治療用タンパク質全体又はその一部分のコード配列、転写において、スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含むｍＲＮＡ処理の役割を果たす（例えば、リボソーム結合及びｍＲＮＡの安定性）、転写された非翻訳配列などの、非コード５’及び３’配列を含むが限定されるものではない、追加の非コード配列と一緒に、少なくとも１つのイントロンなどの、上述の追加のコード配列を有するか、又は有していない、少なくとも１つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列などの治療用タンパク質に対するコード配列、追加の機能を提供するものなどの、追加のアミノ酸に対してコードする追加のコード配列を含み得る。したがって、治療用タンパク質をコードする配列は、融合治療用タンパク質の精製を容易にするペプチドをコードする配列などの、マーカー配列に融合され得る。

【0361】

核酸の構築
本開示の単離された核酸は、当該技術分野で周知の、（ａ）組換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、及び／又は（ｄ）それらの組み合わせを使用して作製され得る。

【0362】

核酸は、本開示のポリヌクレオチドに加えて配列を簡便に含み得る。例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位が核酸に挿入されて、ポリヌクレオチドの単離を支援し得る。また、本開示の翻訳されたポリヌクレオチドの単離を支援するために、翻訳可能な配列が挿入され得る。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するための簡便な手段を提供する。本開示の核酸は、コード配列を除いて、任意選択的に、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプター、又はリンカーである。

【0363】

追加の配列が、そのようなクローニング及び／又は発現配列に追加されて、クローニング及び／又は発現におけるそれらの機能を最適化して、ポリヌクレオチドの単離を支援するか、又は細胞内へのポリヌクレオチドの導入を改善し得る。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当該技術分野で周知である。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。

【0364】

核酸を構築するための組換え方法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせなどの本開示の単離された核酸組成物は、当業者に既知の任意の数のクローニング方法論を使用して、生物学的起源から得られ得る。いくつかの態様では、厳格な条件下で、本開示のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列を識別するために使用される。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーの構築は、当業者に周知である。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。

【0365】

核酸スクリーニング及び単離方法
ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーは、本開示のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用してスクリーニングされ得る。プローブは、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリダイズして、同一又は異なる生物において相同遺伝子を単離するために使用され得る。当業者であれば、ハイブリダイゼーションの様々な程度の厳密性がアッセイに採用され得、ハイブリダイゼーション又は洗浄培地のいずれかが厳密であり得ることを理解するであろう。ハイブリダイゼーションの条件がより厳密になると、二本鎖形成が起こるためのプローブと標的との間の相補性がより高度でなければならない。厳密性の程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドなどの部分的に変性する溶媒の存在のうちの１つ以上によって制御され得る。例えば、ハイブリダイゼーションの厳密性は、例えば、０％～５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作を通して、反応物溶液の極性を変化させることによって簡便に変化する。検出可能な結合に必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション培地及び／又は洗浄培地の厳密性に応じて変化することになる。相補性の程度は、１００％、又は７０～１００％、又はその任意の範囲若しくは値であることが最適となる。しかしながら、プローブ及びプライマーのわずかな配列変化は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄培地の厳密性を低減することによって補償され得ることが理解されるべきである。

【0366】

ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅の方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づいて、過度の実験なしで、本開示に従って使用され得る。

【0367】

ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の公知の方法としては、限定されるものではないが、以下が含まれる。限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセス（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、Ｔａｂｏｒらの米国特許第４，７９５，６９９号及び同第４，９２１，７９４号、Ｉｎｎｉｓの同第５，１４２，０３３号、Ｗｉｌｓｏｎらの同第５，１２２，４６４号、Ｉｎｎｉｓの同第５，０９１，３１０号、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎらの同第５，０６６，５８４号、Ｇｅｌｆａｎｄらの同第４，８８９，８１８号、Ｓｉｌｖｅｒらの同第４，９９４，３７０号、Ｂｉｓｗａｓの同第４，７６６，０６７号、Ｒｉｎｇｏｌｄの同第４，６５６，１３４号）、並びに二本鎖ＤＮＡ合成の鋳型として標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介性増幅（商品名ＮＡＳＢＡのＭａｌｅｋらの米国特許第５，１３０，２３８号）が挙げられ、これらの内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。）

【0368】

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから直接、本開示のポリヌクレオチド及び関連遺伝子の配列を増幅するために使用され得る。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングし、試料中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するための、核酸シーケンシングのための、又は他の目的のためのプローブとして使用するために核酸を作製するためにも有用であり得る。インビトロ増幅方法を通して当業者を導くのに十分な技術の例は、上記のＢｅｒｇｅｒ、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、及び上記のＡｕｓｕｂｅｌ、並びにＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）、及びＩｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に見出される。ゲノムＰＣＲ増幅のための市販のキットは、当該技術分野で既知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ－ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照されたい。加えて、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が、ロングＰＣＲ生成物の収率を改善するために使用され得る。

【0369】

核酸を構築するための合成方法
本開示の単離された核酸はまた、既知の方法による直接的な化学合成によって調製され得る（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい）。化学合成は、一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、これは、相補配列とのハイブリダイゼーション、又は鋳型として一本鎖を使用したＤＮＡポリメラーゼとの重合によって二本鎖ＤＮＡに変換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成が、約１００塩基以上の配列に限定され得るが、より長い配列が、より短い配列のライゲーションによって得られ得ることを認識するであろう。

【0370】

組換え発現カセット
本開示は、本開示の核酸を含む組換え発現カセットを更に提供する。本開示の核酸配列、例えば、ｃＤＮＡ又は本開示のタンパク質足場をコードするゲノム配列は、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入され得る組換え発現カセットを構築するために使用され得る。組換え型発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞中のポリヌクレオチドの転写を方向付ける転写開始制御配列に作用可能に結合された本開示のポリヌクレオチドを含むことになる。異種及び非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方が、本開示の核酸の発現を方向付けるために用いられ得る。

【0371】

いくつかの態様では、プロモーター、エンハンサー、又は他の要素として機能する単離された核酸は、本開示のポリヌクレオチドの発現を上方又は下方に制御するために、本開示のポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置（上流、下流、又はイントロン）に導入され得る。例えば、内因性プロモーターは、変異、欠失、及び／又は置換によって、インビボ又はインビトロで修飾され得る。

【0372】

発現ベクター及び宿主細胞
本開示はまた、本開示の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び組換え技術による少なくとも１つの治療用タンパク質の産生に関するものであり、当該技術分野で周知である。例えば、各々が参照により完全に本明細書に組み込まれる、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．、上記のＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．を参照されたい。

【0373】

ポリヌクレオチドは、任意選択的に、宿主における増殖のための選択可能なマーカーを含有するベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物、又は荷電脂質との複合体に導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ、次いで、宿主細胞に形質導入され得る。

【0374】

ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに作用可能に結合されるべきである。発現構築物は、転写開始、終了のための部位、及び転写された領域内の翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含有することになる。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、開始における翻訳開始と、翻訳されるｍＲＮＡの末端に適切に位置付けられた終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）と、を含むことになり、哺乳動物又は真核細胞の発現にはＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。

【0375】

発現ベクターは、好ましくは、任意選択的に、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことになる。そのようなマーカーは、例えば、限定されるものではないが、アンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ｎｅｏ遺伝子）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードし、メトトレキサートに対する耐性を付与する）、ミコフェノール酸、又はグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号、同第５，７７０，３５９号、同第５，８２７，７３９号）、ブラストシジン（ｂｓｄ遺伝子）、真核細胞培養並びにアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢに対する耐性遺伝子、又はＥ．ｃｏｌｉ及び他の細菌又は原核生物中で培養するためのテトラサイクリン耐性遺伝子（上記の特許は参照により完全に本明細書に組み込まれる）を含む。上記の宿主細胞に対する適切な培養培地及び条件は、当該技術分野で既知である。好適なベクターは、当業者に容易に明らかとなるであろう。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、又は他の既知の方法によって行われ得る。そのような方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、チャプター１～４及び１６～１８、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、チャプター１、９、１３、１５、１６などの、当該技術分野で説明される。

【0376】

発現ベクターは、好ましくは、任意選択的に、本開示の組成物及び方法によって改変された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な細胞表面マーカーを含むことになる。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、細胞又は細胞の部分集団を別の細胞の定義済み部分集団から区別する、表面タンパク質、糖タンパク質、又はタンパク質群を含む。好ましくは、選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物又は方法によって改変された細胞を、本開示の組成物又は方法によって改変されていない細胞から区別する。そのような細胞表面マーカーは、例えば、限定されるものではないが、ＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、又はそれらの任意の組み合わせの短縮化又は全長形態などの「分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ又はｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」タンパク質（多くの場合、「ＣＤ」と略される）を含む。細胞表面マーカーは、自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８（Ｐｈｉｌｉｐ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ａｕｇ ２１；１２４（８）：１２７７－８７）を更に含む。

【0377】

発現ベクターは、好ましくは、任意選択的に、本開示の組成物及び方法によって改変された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な薬物耐性マーカーを含むことになる。本開示の選択可能な薬物耐性マーカーは、野生型若しくは変異型Ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0378】

本開示の少なくとも１つのタンパク質足場は、融合タンパク質などの改変形態で発現され得、分泌シグナルのみならず、追加の異種官能領域も含み得る。例えば、追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、タンパク質足場のＮ末端に追加されて、精製中、又はその後の取り扱い及び保管中の宿主細胞における安定性及び持続性を改善し得る。また、ペプチド部分が本開示のタンパク質足場に追加されて、精製を容易にし得る。そのような領域は、タンパク質足場又はその少なくとも１つの断片の最終調製前に除去され得る。そのような方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、チャプター１７．２９～１７．４２及び１８．１～１８．７４、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、チャプター１６、１７及び１８などの、多くの標準的な研究室マニュアルに説明されている。

【0379】

当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸分子の発現に利用可能な多数の発現系に精通している。あるいは、本開示の核酸は、本開示のタンパク質足場をコードする内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞中でオンにすることによって（操作によって）宿主細胞中で発現され得る。そのような方法は、例えば、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、及び同第５，７３３，７６１号に説明されるように当該技術分野で周知であり、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

【0380】

タンパク質足場、その特定の部分又はバリアントの生成に有用な細胞培養物の例示は、当該技術分野で既知の細菌、酵母、及び哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、多くの場合、細胞の単層の形態であるが、哺乳動物細胞懸濁液又はバイオリアクターも使用され得る。無傷のグリコシル化タンパク質を発現することができるいくつかの好適な宿主細胞株が、当該技術分野で開発されており、ＣＯＳ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ－７（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）及びＢＳＣ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などを含み、これらは、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である。好ましい宿主細胞は、骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞を含む。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ－１５８０）及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ－１８５１）である。好ましい態様では、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞である。

【0381】

これらの細胞に対する発現ベクターは、限定されるものではないが、複製の起源、プロモーター（例えば、後期又は初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号、同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒトプロモーター、エンハンサー、及び／又はリボソーム結合部位、ＲＮＡスライス部位、ポリアデニル化部位などの処理情報部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ ＡｇポリＡ付加部位）、並びに転写終了配列などの発現制御配列のうちの１つ以上を含み得る。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌら、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。本開示の核酸又はタンパク質の生成に有用な他の細胞は、既知である、及び／あるいは、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）又は他の既知の若しくは商業的供給源から入手可能である。

【0382】

真核宿主細胞が用いられるとき、ポリアデニル化又は転写終了配列が、典型的には、ベクターに組み込まれる。終了配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含まれ得る。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３－７８１（１９８３））。追加的に、当該技術分野で既知のように、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列がベクターに組み込まれ得る。

【0383】

アミノ酸コード
本開示のタンパク質足場を構成するアミノ酸は、多くの場合、省略される。アミノ酸指定は、当該技術分野で良く理解されているように、その単一文字コード、その３文字コード、名称、又は３つのヌクレオチドコドンによってアミノ酸を指定することによって示され得る（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照されたい）。本開示の治療用タンパク質は、本明細書に指定されるように、自然発生的又は突然変異及び／又はヒトの操作からの１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を含み得る。機能に必須である本開示の治療用タンパク質中のアミノ酸は、部位特異的変異導入又はアラニンスキャニング変異導入などの、当該技術分野で既知の方法によって識別され得る（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、チャプター８、１５、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子中の全ての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異型分子が、限定されるものではないが、少なくとも１つの中和活性などの生物活性について試験される。治療用タンパク質の活性を維持するのに重要である部位は、結晶化、核磁気共鳴、又は光親和性標識などの構造解析によっても識別され得る（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９－９０４（１９９２）及びｄｅ Ｖｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６－３１２（１９９２））。

【0384】

当業者であれば理解するであろうように、本開示は、本開示の少なくとも１つの生物活性治療用タンパク質を含む。生物活性治療用タンパク質は、天然（非合成）、内因性、又は関連及び既知のタンパク質足場の特異的活性の少なくとも２０％、３０％、又は４０％、及び、好ましくは、少なくとも５０％、６０％、又は７０％、及び、最も好ましくは、少なくとも８０％、９０％、又は９５％～９９％以上の特異的活性を有する。酵素活性及び基質特異性の測定をアッセイ及び定量化する方法は、当業者に周知である。

【0385】

別の態様では、本開示は、本明細書に説明される治療用タンパク質及び断片に関し、これらは、有機部分の共有結合によって改変される。そのような改変は、改善された薬物動態特性（例えば、インビボの血清半減期の増加）を有するタンパク質足場断片を生成し得る。有機部分は、直鎖状又は分岐状の親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。特定の態様では、親水性ポリマー基は、約８００～約１２０，０００ダルトンの分子量を有し得、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、又はポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸又は脂肪酸エステル基は、約８～約４０個の炭素原子を含み得る。

【0386】

本開示の改変された治療用タンパク質及び断片は、抗体に直接的又は間接的に共有結合される１つ以上の有機部分を含み得る。本開示のタンパク質足場又は断片に結合される各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、モノ－カルボン酸及びジ－カルボン酸を包含する。本明細書で使用される用語である「親水性ポリマー基」は、オクタン中よりも水中でより可溶性である有機ポリマーを指す。例えば、ポリリシンは、オクタン中よりも水中でより可溶性である。したがって、ポリリシンの共有結合によって改変される治療用タンパク質は、本開示によって包含される。本開示の治療用タンパク質を改変するのに好適な親水性ポリマーは、直鎖状又は分岐状であり、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ－ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖類など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカン酸化物（例えば、ポリエチレン酸化物、ポリプロピレン酸化物など）、及びポリビニルピロリドンを含み得る。好ましくは、本開示の治療用タンパク質を改変する親水性ポリマーは、別個の分子実体として約８００～約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、添え字がダルトン単位のポリマーの平均分子量であるＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００が使用され得る。親水性ポリマー基は、１つ～約６つのアルキル基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基で置換され得る。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換される親水性ポリマーは、好適な方法によって調製され得る。例えば、アミン基を含むポリマーは、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボキシレートに結合され得、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボキシレート（例えば、Ｎ，Ｎ－カルボニルジイミダゾールで活性化される）は、ポリマー上のヒドロキシル基に結合され得る。

【0387】

本開示の治療用タンパク質を改変するのに好適な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和であってもよく、又は１つ以上の不飽和単位を含有してもよい。本開示のタンパク質足場を改変するのに好適である脂肪酸としては、例えば、ｎ－ドデカノエート（Ｃ１２、ラウレート）、ｎ－テトラデカノエート（Ｃ１４、ミリスチン酸）、ｎ－オクタデカノエート（Ｃ１８、ステアリン酸塩）、ｎ－エイコサノエート（Ｃ２０、アラチデート）、ｎ－ドコサノエート（Ｃ２２、ベヘネート）、ｎ－トリアコンタン酸（Ｃ３０）、ｎ－テトラコンタン酸（Ｃ４０）、シス－Δ９－オクタデカノエート（Ｃ１８、オレイン酸塩）、全てシス－Δ５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸（Ｃ２０、アラキドン酸）、オクタン二ケイ酸、テトラデカン二ケイ酸、オクタデカン二酸、ドコサネディオン酸、などが挙げられる。好適な脂肪酸エステルは、直鎖状又は分岐状の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルを含む。下側アルキル基は、炭素原子を１個～約１２個、好ましくは、１個～約６個含み得る。

【0388】

改変された治療用タンパク質及び断片は、例えば、１つ以上の改変剤との反応などの、好適な方法を使用して調製され得る。本明細書で使用される用語としての「改変剤」は、活性化基を含む好適な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を指す。「活性化基」は、適切な条件下で、第２の化学基と反応し、それによって、改変剤と第２の化学基との間に共有結合を形成することができる化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基は、トシレート、メシル酸塩、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などの求電子基を含む。チオールと反応し得る活性化基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５－チオール－２－ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ－チオール）などが挙げられる。アルデヒド官能基は、アミン又はヒドラジド含有分子に結合され得、アジド基は、三価リン基と反応して、ホスホラミデート又はホスホルイミド結合を形成し得る。活性化基を分子に導入するための好適な方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）参照）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接結合され得るか、又はリンカー部分、例えば、二価Ｃ１－Ｃ１２基を介して結合され得、１つ以上の炭素原子は、酸素、窒素、又は硫黄などのヘテロ原子によって置換され得る。好適なリンカー部分は、例えば、テトラエチレングリコール、－（ＣＨ２）３－、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、及び－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ－ＮＨ－を含む。リンカー部分を含む改変剤は、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で、モノ－Ｂｏｃ－アルキルジアミン（例えば、モノ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、モノ－Ｂｏｃ－ジアミノヘキサン）を脂肪酸と反応させて、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間にアミド結合を形成することによって、生成され得る。Ｂｏｃ保護基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による処理によって生成物から除去されて、説明されるように、別のカルボキシレートに結合され得る一級アミンを曝露するか、又は無水マレイン酸と反応させ、得られた生成物を環化して、脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成し得る。（例えば、教示全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｈｏｍｐｓｏｎらのＷＯ９２／１６２２１を参照されたい。）

【0389】

本開示の改変された治療用タンパク質は、タンパク質足場又は断片を改変剤と反応させることによって生成され得る。例えば、有機部分は、アミン反応性改変剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを用いることによって、非部位特異的様式でタンパク質足場に結合され得る。本開示のタンパク質足場の特定の部位に結合される有機部分を含む改変された治療用タンパク質及び断片は、逆タンパク質分解などの好適な方法（Ｆｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３：１４７－１５３（１９９２）、Ｗｅｒｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：４１１－４１７（１９９４）、Ｋｕｍａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３－２２４１（１９９７）、Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９－６８（１９９６）、Ｃａｐｅｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６－４６３（１９９７））、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９６）に説明される方法を使用して調製され得る。

【0390】

定義
本開示全体を通して使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、複数のそのような方法を含み、「用量」への言及は、当業者に既知の１つ以上の用量及び均等物への言及を含む。

【0391】

「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、例えば、測定システムの限界に部分的に依存することになる。例えば、「約」は、１つ以上の標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、最大２０％、又は最大１０％、又は最大５％、又は最大１％の所定の値の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、１桁以内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは、２倍以内の値を意味し得る。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に説明されている場合、別段の記載がない限り、その特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語が想定されるべきである。

【0392】

本明細書に開示される化合物は、特定の構成なし（例えば、特定の立体化学なし）で提示され得ることが理解されるであろう。そのような提示は、化合物の全ての利用可能な異性体、互変異性体、位置異性体、及び立体異性体を包含することを意図している。いくつかの実施形態では、特定の構成なしの本明細書の化合物の提示は、化合物の利用可能な異性体、互変異性体、位置異性体、及び立体異性体の各々、又はそれらの任意の混合物を指すことを意図している。

【0393】

本明細書に説明される化合物は、適用可能な場合、化合物自体、並びにそれらの塩、及びそれらの溶媒和化合物を含むことが理解されるべきである。例えば、塩は、アニオンと、本明細書に開示される置換化合物上の正電荷基（例えば、アミノ）との間に形成され得る。好適なアニオンとしては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルタミン酸塩、グルクロン酸塩、グルタル酸、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、サリチル酸塩、乳酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、及び酢酸塩（例えば、トリフルオロ酢酸塩）が挙げられる。

【0394】

本開示は、単離又は実質的に精製されたポリヌクレオチド又はタンパク質組成物を提供する。「単離された」又は「精製された」ポリヌクレオチド若しくはタンパク質、又はその生物活性部分は、その天然由来環境中に見出されるポリヌクレオチド若しくはタンパク質に通常伴うか、又はそれと相互作用する成分を実質的に又は本質的に含まない。したがって、単離又は精製されたポリヌクレオチド又はタンパク質は、組換え技術によって作製されたときに他の細胞材料又は培養培地を実質的に含まないか、又は化学的に合成されたときに化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。最適には、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが誘導される生物のゲノムＤＮＡにおいて、ポリヌクレオチドに天然に隣接する配列（すなわち、ポリヌクレオチドの５’及び３’末端に位置する配列）（最適なタンパク質コード配列）を含まない。例えば、様々な態様では、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが誘導される細胞のゲノムＤＮＡにおいて、ポリヌクレオチドに天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量による）未満の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。本開示のタンパク質又はその生物活性部分が組換え的に生成されるとき、最適な培養培地は、約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量による）未満の化学前駆体又は非関心対象のタンパク質化学物質を表す。

【0395】

本開示は、これらのＤＮＡ配列によってコードされる本開示のＤＮＡ配列及びタンパク質の断片及びバリアントを提供する。本開示全体を通して使用される場合、「断片」という用語は、ＤＮＡ配列の一部分、又はアミノ酸配列の一部分、したがって、それによってコードされるタンパク質を指す。コード配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然タンパク質の生物活性を保持するタンパク質断片、したがって、本明細書に説明される標的ＤＮＡ配列へのＤＮＡ認識又は結合活性をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であるＤＮＡ配列の断片は、概して、生物活性を保持するか、又はプロモーター活性を保持しないタンパク質をコードしない。したがって、ＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、及び本開示の全長ポリヌクレオチドまでの範囲であり得る。

【0396】

本開示の核酸又はタンパク質は、標的ベクター中の単量体単位及び／又は反復単位をプリアセンブルし、その後、最終目的ベクターにアセンブルされ得ることを含む、モジュール式アプローチによって構築され得る。本開示のポリペプチドは、本開示の反復単量体を含み得、標的ベクター中の反復単位をプリアセンブルし、その後、最終目的ベクターにアセンブルされ得ることによる、モジュール式アプローチによって構築され得る。本開示は、本方法によって生成されるポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュール式アプローチを生成したポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物体及び細胞を提供する。

【0397】

「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合性相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。

【0398】

「含む」という用語は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味することを意図している。組成物及び方法を定義するために使用されるとき、「から本質的になる」は、意図される目的のために使用されるとき、組み合わせにとって任意の本質的に重要要素の他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、微量汚染物質又は不活性担体を排除しない。「からなる」とは、他の成分の微量要素及び実質的な方法ステップ以上のものを排除することを意味する。これらの転換語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲内である。

【0399】

「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、空間構造内に、エピトープに固有である３つのアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも４、５、６、又は７個のそのようなアミノ酸からなり、より一般的には、少なくとも８、９、又は１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間構造を決定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴を含む。

【0400】

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0401】

「遺伝子発現」は、遺伝子生成物への遺伝子内に含まれる情報の変換を意味する。遺伝子生成物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡ、若しくは任意の他のタイプのＲＮＡ）、又はｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質の直接転写生成物であり得る。遺伝子生成物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって改変されるＲＮＡ、並びに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、及びグリコシル化によって改変されるタンパク質も含む。

【0402】

遺伝子発現の「調節」又は「制御」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節は、限定されるものではないが、遺伝子活性化及び遺伝子抑制を含み得る。

【0403】

「作用可能に結合された」という用語又はその等価物（例えば、作用可能に結合された）は、２つ以上の分子が相互作用して、一方又は両方の分子又はその組み合わせに起因する機能に影響を及ぼすことができるように、互いに対して位置付けられることを意味する。

【0404】

非共有結合成分、並びに非共有結合成分を作製及び使用する方法が開示される。様々な成分は、本明細書に説明されるように、様々な異なる形態をとり得る。例えば、非共有結合（すなわち、作用可能に結合された）タンパク質は、当該技術分野における１つ以上の問題を回避する一時的な相互作用を可能にするために使用され得る。タンパク質などの非共有結合成分が会合及び解離する能力は、そのような会合が所望の活性に必要とされる状況下のみで、又は主にそのような状況下で機能的会合を可能にする。結合は、所望の効果を可能にするのに十分な持続時間のものであり得る。

【0405】

生物のゲノム中の特定の遺伝子座にタンパク質を誘導する方法が開示されている。方法は、ＤＮＡ局在化成分を提供し、エフェクター分子を提供するステップを含み得、ＤＮＡ局在化成分及びエフェクター分子は、非共有結合を介して作用可能に結合することができる。

【0406】

「ｓｃＦｖ」という用語は、単鎖可変断片を指す。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドと接続された免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーペプチドは、約５～４０アミノ酸、又は約１０～３０アミノ酸、又は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、若しくは４０アミノ酸長であり得る。一本鎖可変断片は、完全な抗体分子に見出される定常Ｆｃ領域、したがって、抗体を精製するために使用される共通結合部位（例えば、プロテインＧ）を欠く。用語は、細胞内抗体であるｓｃＦｖ、細胞の細胞質内で安定であり、細胞内タンパク質に結合し得る抗体を更に含む。

【0407】

「単一ドメイン抗体」という用語は、特定の抗原に選択的に結合することができる単一単量体可変抗体ドメインを有する抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体は、概して、重鎖抗体の、又は一般的なＩｇＧの１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む約１１０アミノ酸長のペプチド鎖であり、これは、概して、抗体全体と抗原に対する同様の親和性を有するが、洗剤及び高濃度の尿素に対してより耐熱性及び安定である。例は、ラクダ科動物抗体又は魚類抗体に由来するものである。あるいは、単一ドメイン抗体は、４つの鎖を有する共通のマウス又はヒトＩｇＧから作製され得る。

【0408】

本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」及び「特異的結合」という用語は、異なる抗原の均質な混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する抗体、抗体断片、又はナノボディの能力を指す。いくつかの態様では、特異的結合相互作用は、試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを区別することになる。いくつかの態様では、約１０倍～１００倍以上（例えば、約１０００倍又は１０，０００倍超）。「特異性」は、ナノボディなどの、イムノグロブリン又はイムノグロブリン断片が、異なる抗原標的に対して１つの抗原標的に優先的に結合する能力を指し、必ずしも高い親和性を意味するものではない。

【0409】

「標的部位」又は「標的配列」は、結合に十分な条件が存在する場合、結合分子が結合することになる核酸の一部分を画定する核酸配列である。

【0410】

「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を画定する。したがって、核酸はまた、図示された一本鎖の相補鎖を包含し得る。本開示の核酸はまた、同じ構造を保持するか、又は同じタンパク質をコードする、実質的に同一の核酸及びその相補体を包含する。

【0411】

本開示のプローブは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得る一本鎖核酸を含み得る。したがって、本開示の核酸は、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを指し得る。

【0412】

本開示の核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよい。本開示の核酸は、分子の大部分が一本鎖であるときでも、二本鎖配列を含有し得る。本開示の核酸は、分子の大部分が二本鎖であるときでも、一本鎖配列を含有し得る。本開示の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそのハイブリッドを含み得る。本開示の核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組み合わせを含有し得る。本開示の核酸は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。本開示の核酸は、非天然アミノ酸改変を含むように合成され得る。本開示の核酸は、化学合成方法又は組換え方法によって得られ得る。

【0413】

本開示の核酸、その配列全体、又はその一部分のいずれかは、非天然由来であってもよい。本開示の核酸は、天然由来ではない１つ以上の変異、置換、欠失、又は挿入を含有し得、核酸配列全体を非天然由来にする。本開示の核酸は、１つ以上の重複、逆方向、又は反復配列を含有し得、結果として生じる配列は、天然由来ではなく、核酸配列全体を非天然由来にする。本開示の核酸は、天然由来ではない改変、人工、又は合成ヌクレオチドを含有し得、核酸配列全体を非天然由来にする。

【0414】

遺伝子コードにおける冗長性を考慮すると、複数のヌクレオチド配列は、任意の特定のタンパク質をコードし得る。全てのそのようなヌクレオチド配列が本明細書で企図されている。

【0415】

本開示全体を通して使用される場合、「作用可能に結合された」という用語は、それが空間的に接続されるプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に位置付けられ得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが誘導される遺伝子内のプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。プロモーターと遺伝子との間の距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。

【0416】

本開示全体を通して使用される場合、「プロモーター」という用語は、細胞内の核酸の発現を付与、活性化、又は増強することができる合成又は天然由来分子を指す。プロモーターは、発現を更に増強する、並びに／又はその空間的発現及び／若しくは時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的転写制御配列を含み得る。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対程度に位置し得る、遠位エンハンサー又はリプレッサー要素を含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源から誘導され得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、若しくは器官に関して、又は発現が起こる発生段階に関して、又は生理学的ストレス、病原体、金属イオン、若しくは誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的又は差次的に遺伝子成分の発現を制御し得る。プロモーターの代表例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、又はＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

【0417】

本開示全体を通して使用される場合、「実質的に相補的」という用語は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸の領域にわたって第２の配列の相補体に対し、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である第１の配列を指すか、又は２つの配列が、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。

【0418】

本開示全体を通して使用される場合、「実質的に同一」という用語は、第１及び第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であること、又は核酸に関して、第１の配列が、第２の配列の相補体に対して実質的に相補的である場合を指す。

【0419】

本開示全体を通して使用される場合、核酸を説明するために使用されるとき、「バリアント」の用語は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部分若しくは断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列若しくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）参照される核酸若しくはその相補体と実質的に同一である核酸、又は（ｉｖ）参照される核酸、その相補体、若しくはそれと実質的に同一な配列に、厳密な条件下でハイブリダイズする核酸を指す。

【0420】

本開示全体を通して使用される場合、「ベクター」という用語は、複製の起源を含有する核酸配列を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、又は酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。ベクターは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はＤＮＡ及びＲＮＡ配列の両方を有するアミノ酸の組み合わせを含み得る。

【0421】

本開示全体を通して使用される場合、ペプチド又はポリペプチドを説明するために使用されるとき、「バリアント」という用語は、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持するペプチド又はポリペプチドを指す。バリアントはまた、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。

【0422】

アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を同様の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸で置換することは、典型的には、軽微な変化を伴うものとして当該技術分野で認識される。これらの軽微な変化は、部分的には、当該技術分野で理解されるように、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することによって識別され得る。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性及び電荷の考慮に基づく。同様のハイドロパシー指数のアミノ酸が置換され、タンパク質機能を依然として保持し得る。一態様では、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持するタンパク質を結果的にもたらす置換を明らかにするために使用され得る。ペプチドの文脈でアミノ酸の親水性を考慮すると、そのペプチドの最大の局所平均親水性の計算を可能にし、これは、抗原性及び免疫原性と良好に相関することが報告された有用な尺度である。参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号。

【0423】

同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドを結果的にもたらし得る。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて実施され得る。アミノ酸の疎水性指数及び親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一貫して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び他の特性によって明らかにされるように、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存すると理解される。

【0424】

本明細書で使用される場合、以下の表Ａ、Ｂ、又はＣに記載されるように、「保存的」アミノ酸置換が定義され得る。いくつかの態様では、そのような融合ポリペプチドをコードする融合ポリペプチド及び／又は核酸は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変によって導入された保存的置換を含む。アミノ酸は、物理的特性並びに二次及び三次タンパク質構造への寄与に従って分類され得る。保存的置換は、同様の特性を有する別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置換である。例示的な保存的置換が表１に記載される。

【表1】

【0425】

あるいは、保存的アミノ酸は、表２に記載されるように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９７５），ｐｐ．７１－７７）に説明されるようにグループ化され得る。

【表2】

【0426】

あるいは、例示的な保存的置換が表３に記載される。

【表3】

【0427】

本開示のポリペプチドは、アミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、若しくは置換、又はそれらの任意の組み合わせ、並びにアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換以外の改変を有するポリペプチドを含むことが意図されることが理解されるべきである。本開示のポリペプチド又は核酸は、１つ以上の保存的置換を含有し得る。

【0428】

本開示全体を通して使用される場合、上述のアミノ酸置換のうちの「１つ超」という用語は、列挙されたアミノ酸置換のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上を指す。「１つ超」という用語は、列挙されたアミノ酸置換のうちの２、３、４、又は５個を指してもよい。

【0429】

本開示のポリペプチド及びタンパク質、その配列全体、又はその一部分のいずれかは、非天然由来であってもよい。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、天然由来ではない１つ以上の変異、置換、欠失、又は挿入を含有し得、アミノ酸配列全体を非天然由来にする。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、１つ以上の重複、逆方向、又は反復配列を含有し得、結果として生じる配列は、天然由来ではなく、アミノ酸配列全体を非天然由来にする。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、天然由来ではない改変、人工、又は合成アミノ酸を含有し得、アミノ酸配列全体を非天然由来にする。

【0430】

本開示全体を通して使用される場合、「配列同一性」は、デフォルトパラメータ（Ｔａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１９９９，１７４，２４７－２５０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ｆｔｐサイトから取得され得る、２つの配列をブラストするためのスタンドアロン実行可能なＢＬＡＳＴエンジンプログラム（ｂｌ２ｓｅｑ）を使用することによって決定され得る。２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈で使用されるとき、「同一」又は「同一性」という用語は、配列の各々の指定された領域にわたって同じである指定された残基のパーセンテージを指す。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、指定された領域にわたって２つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が発生する位置の数を決定して、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を指定された領域内の位置の総数で除算し、結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。２つの配列の長さが異なる場合、又は整列が１つ以上の互い違いの端を生成し、指定された比較領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが分子には含まれない。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は、同等であるとみなされ得る。同一性は、手動で、又はＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータシーケンスアルゴリズムを使用することによって、実施され得る。

【0431】

本開示全体を通して使用される場合、「内因性」という用語は、それが導入される標的遺伝子又は宿主細胞と天然に関連付けられた核酸又はタンパク質配列を指す。

【0432】

本開示全体を通して使用される場合、「外因性」という用語は、標的遺伝子又は導入される宿主細胞と天然に関連付けられていない核酸又はタンパク質配列を指し、天然由来の核酸、例えば、ＤＮＡ配列、又は非天然由来のゲノム位置に位置する天然由来の核酸配列の非天然由来の複数のコピーを含む。

【0433】

本開示は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入する方法を提供する。「導入」によって、構築物が宿主細胞の内部へのアクセスを得るような様式で、ポリヌクレオチド構築物を細胞に提示することが意図される。本開示の方法は、ポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入するための特定の方法に依存せず、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部へのアクセスを得ることのみに依存する。細菌、植物、真菌、及び動物にポリヌクレオチド構築物を導入するための方法は、限定されるものではないが、安定的形質転換方法、一過性形質転換方法、及びウイルス媒介方法を含み、当該技術分野で既知である。

【0434】

実施例１－ＬＮＰ組成物のためのｍＲＮＡの調製
ＤＮＡプラスミドｐＲＴ－ＨＡ－ＳＰＢ－ＣＣ－ＡＧは、アミノ酸９８～１０６に対応する５’－ヘマグルチニンタグを含むＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ（「ＨＡ－ＳＰＢ」）をコードする。このプラスミドを、５’－ＣＡＰを更に含むＨＡ－ＳＰＢをコードするｍＲＮＡを生成するためのインビトロ転写反応の鋳型として使用した。

【0435】

簡潔に述べると、約１０ｕｇのスーパーコイル化ｐＲＴ－ＨＡ－ＳＰＢ－ＣＣ－ＡＧを、１Ｘ ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ、２００単位の制限酵素ＳｐｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ３１３３ｌ）を含む１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に１００μｌの総体積で追加した。プラスミドＤＮＡを、３７℃で一晩インキュベートすることによって直鎖状にして、完全な消化を確保した。

【0436】

直鎖状プラスミドを、製造業者の説明書に従ってＤＮＡ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）を使用して精製し、精製ＤＮＡを４０μｌのヌクレアーゼ遊離水中で溶出した。溶出液のＤＮＡ濃度を、製造業者の説明書に従って、ＮａｎｏＤｒｏｐマイクロボリューム分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して決定した。

【0437】

精製プラスミドを、製造業者の説明書に従って、インビトロ転写ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＡＭ１３４４）を使用してｍＲＮＡを生成するためのＤＮＡ鋳型として使用した。簡潔に述べると、ヌクレオチドＧＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、及び５ＭｅＣ（５－メチルシチジン－５’－トリリン酸）（ＴｒｉＬｉｎｋ ＃Ｎ＝１０１４）及びＣｌｅａｎＣａｐ試薬ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、Ｔｒｉｌｉｎｋ ＃Ｎ－７１１３）の１００ｍＭストックを調製した。ＡＴＰ、ＵＴＰ、及び５ＭｅＣの各々１５μｌ、並びにＧＴＰ及びＣｌｅａｎＣａｐ試薬ＡＧの各々１２ｕＬを１００μｌの総体積に追加した。

【0438】

約１．６７μｇの直鎖状ｐＲＴ－ＨＡ－ＳＰＢ－ＣＣ－ＡＧ ＤＮＡ、２０μｌの１０Ｘ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、及び２０μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼミックスを、１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管（２００μｌの最終容量）に追加し、管を３７℃で３時間インキュベートした。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の１０μｌアリコートを追加し、管を更に３７℃で１５分間インキュベートして、ＤＮＡ鋳型を分解した。

【0439】

ポリ（Ａ）テールを、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＡＭ１３４４）に供給される試薬及び手順を使用して、５’－ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）－ＨＡ－ＳＰＢ ｍＲＮＡの３’末端に追加した。

【0440】

５’－ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）－ＨＡ－ＳＰＢ－ポリ（Ａ）－５ＭｅＣ ｍＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７５１４４）を使用して精製した。簡潔に述べると、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴの３．５ｍｌの溶液を、３５μｌの２－メルカプトエタノールを使用して新たに調製し、２．５ｍｌの１００％エタノールと組み合わせ、最終ｍＲＮＡ生成物を、３００μｌのヌクレアーゼ遊離水を使用してカラムから溶出した。このプロセスからの平均ｍＲＮＡ収率は、約６００～８００μｇである。

【0441】

実施例２－ｍＲＮＡを含む本開示のＬＮＰの調製及びインビボスクリーニング
Ａ．調製
以下は、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質及びｍＲＮＡを含む複数の多成分ＬＮＰ組成物を製剤化するための例示的な方法を提供する非限定的な例である。

【0442】

ＬＮＰを製剤化するために、様々なパーセンテージの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、リン脂質ＤＯＰＥ、構造脂質コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡ）を組み合わせて、ＬＮＰ組成物を調製した。

【0443】

個別の２５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を、２００プルーフＨＰＬＣグレードのエタノール中で脂質を可溶化することによって調製し、ストック溶液を製剤化されるまで－８０℃で保存した。製剤化時に、脂質ストック溶液を室温に平衡化することを一時的に可能にし、次いで、５０～５５℃の温度範囲で維持されたホットプレート上に配置した。次いで、高温脂質ストック溶液を組み合わせて、所望の最終モルパーセンテージを得た。ＬＮＰ組成物の部分集団が表４ａ及び４ｂに示される。

【表4】

【表5】

【0444】

ＬＮＰに組み込まれる５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－ｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１ｍｇ／ｍｌの溶液を、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に追加して、ストック溶液を形成し、氷上で保存した。脂質相を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）機器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用してマイクロ流体チップ内の水性ｍＲＮＡ相と混合して、カプセル化されたｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を形成した。ｍＲＮＡカプセル化のためのナノアセンブリプロセスパラメータが表５に示される。

【表6】

【0445】

次いで、結果的に得られたｍＲＮＡ ＬＮＰ組成物を、８～１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＲｅｐｌｉｇｅｎ Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析デバイス（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ，ＣＡ，ＵＳＡ）に移し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対する透析（透析液：透析緩衝液体積が少なくとも１：２００ｖ／ｖ）によって、ｐＨ７．４、４℃で一晩（又は代替的に室温で少なくとも４時間）処理して、２５％エタノールを除去し、完全な緩衝液交換を達成する。いくつかの実験では、ＬＮＰをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－４遠心フィルターユニットで更に濃縮し、ＭＷＣＯ－３０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を超遠心機内で約４１００×ｇで回転させた。次いで、ｍＲＮＡ ＬＮＰを、更に使用するまで４℃で保存した。

【0446】

ＬＮＰの平均粒子サイズ直径は、約７０ｎｍであった。

【0447】

Ｂ．インビボスクリーニング
メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝２／群）に、表４に示されるＬＮＰ組成物を用いて製剤化された０．５ｍｇ／ｋｇの５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－ｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を静脈内投与した。マウスの一群を、陰性対照としてビヒクル（ＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で処置した。

【0448】

処置及び対照マウスにおけるルシフェラーゼ発現の場所及び程度を、製造業者の説明書に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａインビボ撮像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、麻酔をかけたマウスの生物発光撮像（ＢＬＩ）によって４時間で決定した。簡潔に述べると、マウスを、酸素中のイソフルランを使用して麻酔し、仰臥位で加熱されたステージ上に配置した。次いで、マウスにＤ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ＃１２２７９９）ＩＰを投与し、ＢＬＩを実施した。結果が表６に示される。

【表7】

【0449】

表６に示されるように、ＬＮＰ組成物３、９、１１、１３、２４、２８、及び２９は、インビボで、主に肝臓の細胞にｍＲＮＡを送達することができ、その後にコードされたタンパク質の発現を行うことができた。更に、ＬＮＰ組成物３、９、１１、１３、２４、２８、及び２９の投与は、ＬＮＰ組成物０の投与と比較して、大幅に改善した肝臓ルシフェラーゼシグナルを結果的にもたらした。ＬＮＰ組成物０は、当該技術分野で使用されるＬＮＰ組成物と最も類似したＬＮＰ組成物である（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０２０）Ｖｏｌ：３０，３４を参照されたい）。したがって、本開示のＬＮＰ組成物は、当該技術分野で使用される標準的なＬＮＰ組成物と比較して、優れた遺伝子送達活性を呈する。

【0450】

加えて、表４ａのＬＮＰ組成物で処置されたマウスの体重を、静脈内投与前及び投与後２４時間で評価し、ベースライン及び処置後の体重を比較した。表７の各ＬＮＰ組成物で処置されたマウスの各群に対する平均体重変化率が表７に示される。

【表8】

【0451】

表７に示されるように、本開示のＬＮＰ組成物は、元の体重を保持するか、又はわずかに体重増加さえする、ほとんどの処置マウスで忍容性良好であった。

【0452】

実施例３－肝臓へのｍＲＮＡのインビボＬＮＰ－送達
Ａ．肝臓細胞へのｓＰＢ ｍＲＮＡの送達
以下は、本開示の組成物が、インビボで肝細胞を含む肝臓細胞にｍＲＮＡを送達するために使用され得ることを実証する非限定的な実施例である。

【0453】

この実施例では、ＨＡタグ付きＳＰＢタンパク質をコードする配列を含む５ＭｅＣ－ｍＲＮＡ分子を、約２８モル％のＣｏａｔｓｏｍｅ ＳＳ－ＯＰ、約６０モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む、本開示の脂質ナノ粒子中にカプセル化した。ナノ粒子中の脂質と核酸との比率は、約１００：１（重量／重量）であり、総脂質は１０ｍＭであった。ｍＲＮＡ分子を、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）を使用して更にキャッピングした。陰性染色対照として、非ＨＡタグ付きｓＰＢタンパク質をコードする配列を含むｍＲＮＡを使用した。

【0454】

ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を、メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウスに投与した。ナノ粒子を、１ｍｇ／ｋｇの量で単回用量として静脈内投与した。マウスは、処置後４時間で人道的に安楽死させ、マウスの肝臓を処理し、例えば、血液を、約１０ｍＬのＨＢＳＳ＋２．５ｍＭ ＥＤＴＡを門脈を通してフラッシングすることによって肝臓から除去し、ＨＡタグ並びにＥＬＩＳＡ及びＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔの免疫染色を使用して分析した。

【0455】

ＨＡ染色を、処置されたマウスの肝臓全体にわたって肝細胞で観察し、１匹のマウス由来の全肝臓細胞の約６２％、及び別のマウス由来の全肝臓細胞の６６％が、ｓＰＢ発現に対して試験陽性であった。更に、ｓＰＢのインビボ発現を、主肝葉、内側並びに左及び右外側葉の各々を均一なスループットで検出した。したがって、本開示のナノ粒子組成物は、インビボで肝臓全体にわたって肝細胞にｍＲＮＡを効果的に送達し、その後、送達されたｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される。

【0456】

Ｂ．肝臓細胞へのｍＲＮＡの用量依存性ＬＮＰ送達及び忍容性
以下は、本開示の脂質ナノ粒子組成物が、インビボで肝臓細胞にｍＲＮＡを送達するために、及び良好な忍容性を有する広範な用量範囲にわたるコードされたタンパク質の発現のために使用され得ることを実証する非限定的な実施例である。

【0457】

メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝３／群）に、実施例１に従って調製されたＬＮＰ組成物中に製剤化されたＨＡタグ付きｓＰＢタンパク質をコードする配列を含む、０．５、１．０、２．０、又は３．０ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ分子を静脈内投与した。マウスの一群を、陰性対照として未処置のままにした。

【0458】

処置後４時間でマウスの一群を殺傷し、マウスの肝臓を、ＨＡタグ並びにＥＬＩＳＡ及びＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔの免疫染色を使用して分析した。結果が表８に示される。

【表9】

【0459】

表８に示されるように、０．５～３ｍｇ／ｋｇのＨＡタグ付きｓＰＢ ｍＲＮＡの単回投与で処置されたマウスに対して、線形用量応答が観察された。

【0460】

別の実験では、ＨＡタグ付きｓＰＢタンパク質発現の持続時間を経時的に測定した。メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝３／群）に、実施例２に従って調製されたＬＮＰ組成物９中に製剤化されたＨＡタグ付きｓＰＢタンパク質をコードする配列を含む、０．５、１．０、又は３．０ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ分子を静脈内投与した。マウスの一群を、陰性対照として未処置のままにした。

【0461】

各濃度のマウスの一群を４時間で殺傷し、各濃度のマウスの一群を２４時間で殺傷し、各濃度のマウスの一群を処置の７日後に殺傷し、マウスの肝臓を、ＨＡタグ及びＥＬＩＳＡに対する免疫染色を使用して分析した。結果が表９に示される。

【表10】

【0462】

表９に示されるように、ＨＡタグ付きｓＰＢタンパク質の発現は、試験された各濃度で経時的に減少し、ｓＰＢ発現は、７日目までにほぼベースラインレベルまで低下した。

【0463】

加えて、血清中に存在する３つの肝臓酵素のレベルを、潜在的な肝毒性の尺度として、試験された濃度の各々について、ＬＮＰ投与後２４時間及び７日目に評価した。簡潔に述べると、血液を２４時間及び７日目に採血し、各試料を２０分間凝固させ、１３Ｋｒｐｍで３分間遠心分離して、望ましくない細胞及び破片を除去することを可能にした。試料を、輸送のために濡れた氷上に配置し、分析されるまで－８０℃で保存した。酵素レベルを、標準化されたアッセイ（Ｉｄｅｘｘ）を使用して決定した。

【0464】

２４時間及び７日目の肝臓酵素アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のレベルが、それぞれ、表１０ａ～ｃに示される。

【表11】

【表12】

【表13】

【0465】

表１０ａ～ｃに示されるように、本開示のＬＮＰ組成物のインビボ投与は、２４時間で血清中のＡＳＴ及びＡＬＴレベルの用量依存的な非常にわずかな増加（＜２×）を結果的にもたらしたが、７日目までに全ての３つの酵素レベルがベースラインまで回復し、肝臓酵素上昇の程度が低かったことを実証する。

【0466】

血清肝臓酵素に加えて、血清中に存在する３つの炎症性サイトカインのレベルを、試験された濃度の各々について、ＬＮＰ投与の４時間後に評価した。簡潔に述べると、血清試料を肝臓酵素分析について説明されるように調製し、各サイトカインの血清濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット）を使用して決定した。４時間における炎症性サイトカインインターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ－Ｇ）、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－ａ）のレベルが、それぞれ、表１１ａ～ｃに示される。

【表14】

【表15】

【表16】

【0467】

表１１ａ～ｃに示されるように、本開示のＬＮＰ組成物のインビボ投与は、応答の程度が他の非生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質に照らして控えめであったが、血清炎症性サイトカインの用量依存性の増加を結果的にもたらした。

【0468】

更に別の実験では、実施例２からのＬＮＰ組成物９を、非生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質Ｃ１２－２００を含むＬＮＰ粒子と比較した。メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝３／群）に、ＬＮＰ組成物中に製剤化されたＨＡタグ付きｓＰＢタンパク質をコードする配列を含む、０．５、１．０、又は３．０ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ分子を静脈内投与した。マウスの一群を、陰性対照として未処置のままにした。ＳＢ陽性肝細胞、ＡＬＴ肝臓酵素測定値、及びＩＬ－６サイトカイン放出測定値のパーセンテージを、各群について処置された動物間で比較し、１ｍｇ／ｋｇ用量（Ｃ１２－２００ ＬＮＰ組成物に対するＭＴＤ用量）における各々の値が表１２に報告される。

【表17】

【0469】

表１２に示されるように、ＬＮＰ組成物９は、肝細胞にＳＢ ｍＲＮＡを送達する際に同様の有効性を呈したが、同時に、Ｃ１２－２００ ＬＮＰと比較して、低減したＩＬ－６サイトカイン放出及び低減したＡＬＴ肝臓酵素によって示されるようにＣ１２－２００ ＬＮＰ組成物と比較して、有意に低減した毒性プロファイルを呈する。

【0470】

Ｃ．本開示のＬＮＰ組成物は、インビボで肝臓に高い特異性を有するＲＮＡを送達する。

【0471】

第３の実験では、メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウスの一群（ｎ＝３／群）に、実施例１に従って調製されたナノ粒子組成物中に製剤化された１ｍｇ／ｋｇのＨＡタグ付きｓＰＢ ｍＲＮＡを静脈内投与し、第２の群を対照として未処置のままにした。投与後４時間後、各群からのマウスを人道的に安楽死させ、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の４つの組織タイプを収集した。

【0472】

収集した組織を処理し、例えば、門脈を通して約１０ｍＬのＨＢＳＳ＋２．５ｍＭ ＥＤＴＡをフラッシングすることによって血液を肝臓から除去した。タンパク質抽出緩衝液を、プロテアーゼ阻害剤（ＨＡＬＴ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃７８４３９）を１：５０（ｖ：ｖ）の比率でＴ－ＰＥＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃７８５１０）に追加することによって調製した。タンパク質抽出緩衝液を、室温で最大１時間保存した。組織試料を、ＲＮＡｓｅ－ｆｒｅｅ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ａｍ１２４２５）中の１ｇの組織当たり９ｍＬの比率でタンパク質抽出緩衝液に追加した。１つのタングステンカーバイドビーズ（３ｍｍ、Ｑｉａｇｅｎ＃６９９９７）を溶液に追加し、管を組織ディスラプター（Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ ＩＩ）中の予め冷却されたアダプターブロック内に配置した。試料を、２５Ｈｚで５分間振盪することによって溶解した。試料を、４℃、１４．８ｋで１０分間、遠心分離することによって澄ませた。上清を収集し、ペレットを廃棄した。

【0473】

総タンパク質を、市販のキット（ＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ ＃ ２３２２５）を使用してＢＣＡアッセイによって測定した。澄ませた肝臓溶解物を、２００×で希釈し、３７℃で３０分間インキュベートし、５６２ｎｍで吸光度を読み取った。結果が表１３に示される。

【表18】

【0474】

表１３に示されるように、ＨＡタグ付きｓＰＢ発現は、処置された動物の肝臓においてほぼ排他的に検出され、脾臓における最小限の発現を有するが、肺又は腎臓における検出可能な発現はなく、これは、肝臓にインビボでｍＲＮＡを優先的に送達する本開示のＬＮＰ組成物の能力、及び肝臓肝細胞におけるコードされたポリペプチドのその後の発現を実証する。

【0475】

実施例３に提示された結果は、本開示のＬＮＰ組成物が、ｍＲＮＡをインビボで肝臓に効果的に送達することができ、次いで、肝臓の細胞内で発現され、タンパク質発現が、広範囲にわたって投与された用量によって制御され得ることを実証する。更に、本開示のＬＮＰ組成物は、忍容性良好であり、低レベルの毒性を呈する。

【0476】

実施例４－ＤＮＡを含む本開示のＬＮＰ組成物の調製
以下は、ＤＮＡナノプラスミド（環状ＤＮＡ）が本開示のＬＮＰ組成物に組み込まれ得ることを実証する非限定的な実施例である。

【0477】

本開示のＬＮＰ組成物は、ＤＮＡ、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンをコードするナノプラスミドを含み、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、ＣＭＶプロモーター（本明細書では、ｐＢ－ｎａｎｏｆｌｕｃ２と称される）の制御下におけるルシフェラーゼ、並びにＣｏａｔｓｏｍｅ ＳＳ－ＯＰ、リン脂質ＤＯＰＥ、構造脂質コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）を、表１４の以下のパーセンテージで含んだ。

【表19】

【0478】

成体ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、表１４に列挙されたＬＮＰ組成物Ｄ１～Ｄ５の各々の１．０ｍｇ／ｋｇの総ＤＮＡ（ｎ＝４）を投与した。処置及び対照マウスにおけるルシフェラーゼ発現の場所及び程度を、製造業者の説明書に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａインビボ撮像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、麻酔をかけたマウスの生物発光撮像（ＢＬＩ）によって４時間で決定した。簡潔に述べると、マウスを、酸素中のイソフルランを使用して麻酔し、仰臥位で加熱されたステージ上に配置した。次いで、マウスにＤ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ＃１２２７９９）ＩＰを投与し、ＢＬＩを実施した。結果が表１５に示される。

【表20】

【0479】

表１５に示されるように、ＬＮＰ組成物の全てが、肝臓細胞にＤＮＡを送達し、肝臓細胞においてコードされた導入遺伝子を発現することができた。

【0480】

実施例５－血友病の治療のための本開示のＬＮＰ
以下は、本開示の組成物及び方法が、血友病の治療、より具体的には、血友病Ａの治療に使用され得ることを実証する非限定的な実施例である。

【0481】

成体マウス
メス、成体（８～９週間）、野生型ＢＡＬＢ／ｃに、まず、実験の０日目に０．５ｍｇ／ｋｇのＦＶＩＩＩトランスポゾンＬＮＰを投与し、次いで、７日目に３．０ｍｇ／ｋｇのＨＡ－ＳＰＢ ＬＮＰを投与した。０日目及び７日目の両方の総注射量は、マウス当たり２００μＬであった。投与時に、マウスを拘束し、２９ゲージのインスリンシリンジを使用して尾静脈を通して静脈内に注射した。

【0482】

ＦＶＩＩＩトランスポゾンＬＮＰは、トランスポゾンを含むナノプラスミドＤＮＡを含むＣ１２－２００含有ＬＮＰであり、トランスポゾンが、第１のｐｉｇｇｙＢａｃ逆方向末端反復（ＩＴＲ）、続いて、第１のインスレーター配列、続いて、Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ＴＴＲ）エンハンス／プロモーター及びマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列、続いて、Ｂドメインを欠くヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（以下、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤと称される）をコードするコドン最適化核酸配列、続いて、ＳＶ４０ポリＡ配列、続いて、第２のインスレーター配列、続いて、第２のｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲを含んだ。トランスポゾンの配列は、配列番号３５に記載される。ＦＶＩＩＩトランスポゾンＬＮＰは、０．３５：０．２：０．４１８４：０．０３１６のモル比でＣ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み、８０：１（ｗ／ｗ）の脂質：ＤＮＡ比率を有した。

【0483】

ＨＡ－ＳＰＢ ＬＮＰは、活性ＳＰＢをコードするｍＲＮＡを含む本開示のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２含有ＬＮＰであった。ｍＲＮＡ中の全てのシチジン残基は、５－メチルシチジン（５－ＭｅＣ）であった。ＨＡ－ＳＰＢ ＬＮＰは、２８：１０：６０：２のモル比でｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み、１００：１（ｗ／ｗ）の脂質：ＲＮＡ比率を有した。

【0484】

最初の０日目の注射後、６日目及び１３日目に、後眼窩静脈叢からの採血によって血漿を収集した。簡潔に述べると、プレーンな未被覆のパスツールピペットを使用して、後球静脈洞を破壊し、全血を収集し、３．２％の緩衝クエン酸ナトリウムと体積で９：１の比率で混合した。この混合物を、２２℃で１５分間、１５，０００ｇで遠心分離し、血漿上清を収集し、－８０℃で保存した。試料中のヒトＦＶＩＩＩタンパク質レベルを、製造業者の説明書に従って、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（商標）、Ｉｎｃ．ＶｉｓｕＬｉｚｅ（商標）Ｆａｃｔｏｒ ＦＶＩＩＩ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔを使用して分析した。

【0485】

この分析の結果が図１に示される。図１は、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質レベルが、試料において、６日目のＨＡ－ＳＰＢ ＬＮＰの投与後の１３日目に、正常なヒトＦＶＩＩＩの１～５％に相当するレベルで観察されたことを示す。

【0486】

本実施例に提示される結果は、本開示のＬＮＰが、成体マウスであっても、インビボで高レベルのＦＶＩＩＩ発現を駆動するために使用され得ることを実証し、それによって、本開示の組成物及び方法が、血友病Ａを治療するために使用され得ることを実証する。

【0487】

実施例６－血友病の治療のための本開示のＬＮＰ
以下は、本開示の組成物及び方法が、血友病の治療、より具体的には、血友病Ｂの治療に使用され得ることを実証する非限定的な実施例である。

【0488】

幼若マウス
３週齢の幼若Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、未処置のままであったか、又は以下の２つの処置のうちの１つを投与された。
処置＃１：第ＩＸ因子トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子
処置＃２：ＳＰＢ ＬＮＰとの組み合わせにおける第ＩＸ因子トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子

【0489】

第ＩＸ因子トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含むＡＡＶウイルスベクター粒子であり、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、Ｒ３３８Ｌ変異を有するヒト第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする核酸を含んだ。

【0490】

ＳＰＢ ＬＮＰは、活性ＳＰＢをコードするｍＲＮＡを含む本開示のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２含有ＬＮＰであった。ＳＰＢ ＬＮＰは、２８：１０：６０：２のモル比でｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み、１００：１（ｗ／ｗ）の脂質：ＲＮＡ比率を有した。

【0491】

処置の投与後３週間で、マウスの血漿中のヒト第ＩＸ因子ポリペプチドの量を決定するためにＥＬＩＳＡ実験を実施した。これらのＥＬＩＳＡ実験の結果が図２に示される。図２は、ヒト第ＩＸ因子タンパク質レベルが、試料において、本開示のＬＮＰを含む処置＃２の投与後に、正常なヒト第ＩＸ因子の約４０～８５％に相当するレベルで観察されたことを示す。

【0492】

本実施例に提示される結果は、本開示のＬＮＰが、インビボで高レベルの第ＩＸ因子発現を駆動するために使用され得ることを実証し、それによって、本開示の組成物及び方法が、血友病Ｂを治療するために使用され得ることを実証する。より具体的には、本開示のＬＮＰは、健常な個人で観察される第ＩＸ因子レベルの範囲内である、インビボの第ＩＸ因子発現のレベルを駆動するために使用され得る。

【0493】

実施例７－ｍＲＮＡを含む本開示のＬＮＰの調製、インビボスクリーニング、及び安定性試験
Ａ．調製
以下は、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質及びｍＲＮＡを含む複数の多成分ＬＮＰ組成物を製剤化するための例示的な方法を提供する非限定的な実施例である。

【0494】

ＬＮＰを製剤化するために、様々なパーセンテージの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、リン脂質ＤＯＰＥ、構造脂質コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡ）を組み合わせて、ＬＮＰ組成物を調製した。

【0495】

個別の２５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を、２００プルーフＨＰＬＣグレードのエタノール中で脂質を可溶化することによって調製し、ストック溶液を製剤化されるまで－８０℃で保存した。製剤化時に、脂質ストック溶液を室温に平衡化することを一時的に可能にし、次いで、５０～５５℃の温度範囲で維持されたホットプレート上に配置した。次いで、高温脂質ストック溶液を組み合わせて、所望の最終モルパーセンテージを得た。ＬＮＰ組成物の部分集団が表１６に示される。

【表21】

【0496】

ＬＮＰに組み込まれる５ｍｅＣ ５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－ＳＰＢ－ＨＡ ｍＲＮＡ（特定の実施例１のように調製された）の１ｍｇ／ｍｌの溶液を、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）又はマレイン酸塩（ｐＨ５．０）に追加して、ストック溶液を形成し、氷上で保存した。ｍＲＮＡは、ＨＡタグ付きＳＢＰポリペプチドをコードする核酸配列を含んだ。脂質相を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）機器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用してマイクロ流体チップ内の水性ｍＲＮＡ相と混合して、カプセル化されたｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を形成した。ＬＮＰ組成物の各々に対するｍＲＮＡカプセル化のための、使用される緩衝液、緩衝液濃度、及び流量を含む、ナノアセンブリプロセスパラメータが表１７に示される。

【表22】

【0497】

次いで、結果的に得られたｍＲＮＡ ＬＮＰ組成物を、８～１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＲｅｐｌｉｇｅｎ Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析デバイス（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ，ＣＡ，ＵＳＡ）に移し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対する透析（透析液：透析緩衝液体積が少なくとも１：２００ｖ／ｖ）によって、ｐＨ７．４又は６．５、４℃で一晩（又は代替的に室温で少なくとも４時間）処理して、２５％エタノールを除去し、完全な緩衝液交換を達成する。いくつかの実験では、ＬＮＰをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－４遠心フィルターユニットで更に濃縮し、ＭＷＣＯ－１００ｋＤａ又は５０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を超遠心機内で約４０００×ｇで回転させた。次いで、ｍＲＮＡ ＬＮＰを、更に使用するまで４℃で保存した。

【0498】

Ｂ．インビボスクリーニング
メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝２／群）に、１．０ｍｇ／ｋｇの表１６に示されるＨＡ－ＳＢＰ ｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を静脈内投与した。マウスの一群を、陰性対照としてビヒクル（ＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で処置した。

【0499】

マウスを投与後４時間で安楽死させ、その肝臓を収集した。ＨＡ－ＳＢＰの発現をＥＬＩＳＡによって評価した。この分析の結果が表１８に示される。

【表23】

【0500】

表１８に示されるように、ＬＮＰ ＩＤ ２．６、ＬＮＰ ＩＤ ２．１０、ＬＮＰ ＩＤ ２．１１、ＬＮＰ ２．１４、及びＬＮＰ ２．１６は、インビボで、特に肝臓の細胞にｍＲＮＡを送達することができ、その後にコードされたタンパク質の発現があった。

【0501】

Ｃ．安定性試験
ＬＮＰ組成物の保存安定性を評価するために、ＬＮＰ ＩＤ ２．６、ＬＮＰ ＩＤ ２．１０、ＬＮＰ ＩＤ ２．１１、ＬＮＰ ２．１４、及びＬＮＰ ２．１６のアリコートを、各々、４℃で０．１ｍｇ／ｍＬで７日間保存した。ＬＮＰ組成物の各々の平均直径及び多分散度指数（ＰＤＩ）を、７日間のインキュベーションの開始時（０日目）、及びインキュベーションの１日目、４日目、及び７日目に分析した。この分析の結果が図３に示される。図３に示されるように、ＬＮＰ ＩＤ ２．６、ＬＮＰ ＩＤ ２．１０、ＬＮＰ ＩＤ ２．１１、ＬＮＰ ２．１４、及びＬＮＰ ２．１６の各々のサイズ及びＰＤＩは、７日間のインキュベーションの過程にわたって安定しており、これは、これらの組成物が、臨床的及び商業的設定において有利である、増強された保存安定性を示すことを示している。

【0502】

まとめると、本実施例に説明された結果は、本開示のＬＮＰ組成物が、肝臓細胞を含む細胞にインビボでｍＲＮＡを効果的に送達し得、これらの組成物が、長期間にわたって標準保存温度で安定していることを実証する。

【0503】

実施例８－ｍＲＮＡを含む本開示のＬＮＰの調製及びインビボスクリーニング
Ａ．調製
以下は、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質及びｍＲＮＡを含む複数の多成分ＬＮＰ組成物を製剤化するための例示的な方法を提供する非限定的な実施例である。

【0504】

ＬＮＰを製剤化するために、様々なパーセンテージの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、リン脂質（ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、又はＤＯＰＣ）、構造脂質コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡ）を組み合わせて、ＬＮＰ組成物を調製した。

【0505】

個別の２５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を、２００プルーフＨＰＬＣグレードのエタノール中で脂質を可溶化することによって調製し、ストック溶液を製剤化されるまで－８０℃で保存した。製剤化時に、脂質ストック溶液を室温に平衡化することを一時的に可能にし、次いで、５０～５５℃の温度範囲で維持されたホットプレート上に配置した。次いで、高温脂質ストック溶液を組み合わせて、所望の最終モルパーセンテージを得た。ＬＮＰ組成物の部分集団が表１９に示される。

【表24】

【0506】

ＬＮＰに組み込まれる５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－ｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１ｍｇ／ｍｌの溶液を、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に追加して、ストック溶液を形成し、氷上で保存した。脂質相を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）機器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用してマイクロ流体チップ内の水性ｍＲＮＡ相と混合して、カプセル化されたｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を形成した。ｍＲＮＡカプセル化のためのナノアセンブリプロセスパラメータが表２０に示される。

【表25】

【0507】

次いで、結果的に得られたｍＲＮＡ ＬＮＰ組成物を、８～１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＲｅｐｌｉｇｅｎ Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析デバイス（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ，ＣＡ，ＵＳＡ）に移し、２５ｍＭ酢酸ナトリウムに対する透析（透析液：透析緩衝液体積が少なくとも１：２００ｖ／ｖ）によって、ｐＨ５．５、４℃で一晩（又は代替的に室温で少なくとも４時間）処理して、２５％エタノールを除去し、完全な緩衝液交換を達成する。いくつかの実験では、ＬＮＰをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－４遠心フィルターユニットで更に濃縮し、ＭＷＣＯ－３０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を超遠心機内で約４１００×ｇで回転させた。スクロースを、５％（ｗ／ｖ）の最終濃度までｍＲＮＡ ＬＮＰに追加し、次いで、更なる使用まで４℃で保存又は－８０℃で凍結した。

【0508】

ＬＮＰの平均粒子サイズ直径は、約８４～１２１ｎｍの範囲であった。

【0509】

Ｂ．インビボスクリーニング
メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝２／群）に、表１９に示されるＬＮＰ組成物を用いて製剤化された０．５ｍｇ／ｋｇの５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－ｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、静脈内投与した。マウスの一群を、陰性対照としてビヒクル（ＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で処置した。

【0510】

処置及び対照マウスにおけるルシフェラーゼ発現の場所及び程度を、製造業者の説明書に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａインビボ撮像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、麻酔をかけたマウスの生物発光撮像（ＢＬＩ）によって４時間で決定した。簡潔に述べると、マウスを、酸素中のイソフルランを使用して麻酔し、仰臥位で加熱されたステージ上に配置した。次いで、マウスにＤ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ＃１２２７９９）ＩＰを投与し、ＢＬＩを実施した。結果が表２１に示される。

【表26】

【0511】

表２１に示されるように、ＬＮＰ組成物３．１～３．１０は、インビボで、主に肝臓の細胞にｍＲＮＡを送達することができ、その後にコードされたタンパク質の発現を行うことができる。

【0512】

実施例９－ｍＲＮＡを含む本開示のＬＮＰの調製及びインビボスクリーニング
Ａ．調製
以下は、生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質及びｍＲＮＡを含む複数の多成分ＬＮＰ組成物を製剤化するための例示的な方法を提供する非限定的な実施例である。

【0513】

ＬＮＰを製剤化するために、様々なパーセンテージの生体還元性のイオン化可能なカチオン性脂質ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、リン脂質（ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、又はＤＯＰＣ）、構造脂質コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡ）を組み合わせて、ＬＮＰ組成物を調製した。

【0514】

個別の２５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を、２００プルーフＨＰＬＣグレードのエタノール中で脂質を可溶化することによって調製し、ストック溶液を製剤化されるまで－８０℃で保存した。製剤化時に、脂質ストック溶液を室温に平衡化することを一時的に可能にし、次いで、５０～５５℃の温度範囲で維持されたホットプレート上に配置した。次いで、高温脂質ストック溶液を組み合わせて、所望の最終モルパーセンテージを得た。ＬＮＰ組成物の部分集団が表２２に示される。

【表27】

【0515】

ＬＮＰに組み込まれる５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－ｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１ｍｇ／ｍｌの溶液を、１５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に追加して、ストック溶液を形成し、氷上で保存した。脂質相を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）機器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用してマイクロ流体チップ内の水性ｍＲＮＡ相と混合して、カプセル化されたｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を形成した。ｍＲＮＡカプセル化のためのナノアセンブリプロセスパラメータが表２３に示される。

【表28】

【0516】

次いで、結果的に得られたｍＲＮＡ ＬＮＰ組成物を、８～１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＲｅｐｌｉｇｅｎ Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析デバイス（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ，ＣＡ，ＵＳＡ）に移し、２５ｍＭ酢酸ナトリウムに対する透析（透析液：透析緩衝液体積が少なくとも１：２００ｖ／ｖ）によって、ｐＨ５．５、４℃で一晩（又は代替的に室温で少なくとも４時間）処理して、２５％エタノールを除去し、完全な緩衝液交換を達成する。いくつかの実験では、ＬＮＰをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－４遠心フィルターユニットで更に濃縮し、ＭＷＣＯ－３０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を超遠心機内で約４１００×ｇで回転させた。スクロースを、５％（ｗ／ｖ）の最終濃度までｍＲＮＡ ＬＮＰに追加し、次いで、更なる使用まで４℃で保存又は－８０℃で凍結した。

【0517】

ＬＮＰの平均粒子サイズ直径は、約８０～１０３ｎｍの範囲であった。

【0518】

Ｂ．インビボスクリーニング
メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝２／群）に、表２２に示されるＬＮＰ組成物の部分集団を用いて製剤化された０．５ｍｇ／ｋｇの５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－ｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を静脈内投与した。マウスの一群を、陰性対照としてビヒクル（ＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で処置した。

【0519】

別の実験では、メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝３、４／群）に、表２２に示されるＬＮＰ組成物の部分集団を用いて製剤化された１ｍｇ／ｋｇの５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－ｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を静脈内投与した。マウスの一群を、陰性対照としてビヒクル（ＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で処置した。

【0520】

処置及び対照マウスにおけるルシフェラーゼ発現の場所及び程度を、製造業者の説明書に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａインビボ撮像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、麻酔をかけたマウスの生物発光撮像（ＢＬＩ）によって４時間で決定した。簡潔に述べると、マウスを、酸素中のイソフルランを使用して麻酔し、仰臥位で加熱されたステージ上に配置した。次いで、マウスにＤ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ＃１２２７９９）ＩＰを投与し、ＢＬＩを実施した。０．５ｍｇ／ｋｇの用量実験の結果は表２４に示され、１ｍｇ／ｋｇの用量実験は表２５に示される。

【表29】

【表30】

【0521】

表２４及び２５に示されるように、本開示のＬＮＰ組成物は、インビボで、主に肝臓の細胞にｍＲＮＡを送達し、その後、コードされたタンパク質を発現することができる。

【0522】

加えて、表２２のＬＮＰ組成物の部分集団で処置されたマウスの体重を、静脈内投与前及び投与後２４時間で評価し、ベースライン及び処置後の体重を比較した。表２２の各ＬＮＰ組成物で処置されたマウスの各群に対する平均体重変化率が表２６に示される。

【表31】

【0523】

表２６に示されるように、本開示のＬＮＰ組成物は、元の体重を保持するか、又はわずかに体重増加さえする、ほとんどの処置マウスで忍容性良好であった。

【0524】

実施例１０－本開示のＬＮＰ組成物は、免疫応答及び毒性を低減する
Ａ．本開示のＬＮＰに対する免疫応答
以下は、本開示の特定のＬＮＰ組成物のインビトロ投与が、ヒト血清中のＣ３ａの血清レベルによって測定される補体活性化の低下を結果的にもたらしたことを実証する非限定的な実施例である。

【0525】

ＬＮＰ組成物を、表２７に示される、以下のモルパーセンテージで、実施例８に説明されるように調製した。ＬＮＰ組成物は、ＨＡタグ付きＳＰＢをコードする配列を含むＲＮＡ分子をカプセル化した。

【表32】

【0526】

正常なヒト血清（ＮＨＳ）を３７℃で解凍し、１００μＬを１．５ｍＬの遠心分離管に等分した。次いで、ＮＨＳを、０．１ｍｇ／ｍＬの１６μＬのＬＮＰ組成物で処理し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応混合物を１：５０００で希釈し、Ｃ３ａ ＥＬＩＳＡキット（Ｑｕｉｄｅｌ）を使用して分析した。

【0527】

本開示のＬＮＰ組成物で処理された試料中のＣ３ａのレベルは、ベンチマークホスホエタノールアミン（ＰＥ）ベースのリン脂質を含むＬＮＰ組成物で処理された試料中のＣ３ａのレベルと比較され、値が表２８に報告される。

【表33】

【0528】

表２８に示されるように、本開示のＬＮＰ組成物５．２及び５．３は、低減したＣ３ａ血清レベルによって示されるように、ベンチマークＬＮＰ組成物と比較して、免疫応答プロファイルの有意な低減を呈した。

【0529】

Ｂ．毒性プロファイル
別の評価では、血清中に存在する４つの肝臓酵素のレベルを、潜在的な肝毒性の尺度として、ＬＮＰ投与後４時間及び２４時間で評価した。ＬＮＰ組成物を、表２９に示される、以下のモルパーセンテージで、実施例９に説明されるように調製した。実施例９に説明されるように、ＬＮＰ組成物は、５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－ｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をカプセル化した。

【表34】

【0530】

簡潔に述べると、血液を４時間及び２４時間に採血し、各試料を２０分間凝固させ、１３Ｋｒｐｍで３分間遠心分離して、望ましくない細胞及び破片を除去することを可能にした。試料を、輸送のために濡れた氷上に配置し、分析されるまで－８０℃で保存した。酵素レベルを、標準化されたアッセイ（ＩＤＥＸＸ）を使用して決定した。

【0531】

２４時間の肝臓酵素アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、及びクレアチンキナーゼ（ＣＫ）のレベルが、それぞれ、表３０ａ～ｄに示される。本開示のＬＮＰ組成物で処理された試料中の各肝臓酵素のレベルは、ベンチマークホスホエタノールアミン（ＰＥ）ベースのリン脂質を含むＬＮＰ組成物で処理された試料中の各肝臓酵素のレベルと比較され、値が表３０ａ～ｄに報告される。

【表35】

【表36】

【表37】

【表38】

【0532】

表３０ａ～ｄに示されるように、本開示のＬＮＰ組成物は、低減した血清肝臓酵素レベルによって示されるように、ベンチマークＬＮＰ組成物と比較して、毒性プロファイルの有意な低減を呈した。

【0533】

実施例１１－肝臓へのＤＮＡのインビボＬＮＰ－送達
以下は、本開示のＬＮＰ組成物が、インビボで肝臓細胞にＤＮＡを送達するために、及びコードされたタンパク質の発現のために使用され得ることを実証する非限定的な実施例である。

【0534】

ホタルルシフェラーゼ（以下、「Ｆｌｕｃ」、ＴｒｉＬｉｎｋ）をコードするＤＮＡを含む本開示のＬＮＰ組成物を、表３１に提示されるモルパーセンテージで、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、リン脂質ＤＯＰＣ、構造脂質コレステロール（Ｃｈｏｌ）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）を組み合わせることによって、実施例９に説明されるように調製した。

【表39】

【0535】

成体ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、表３１に列挙されたＬＮＰ組成物の０．５ｍｇ／ｋｇの総ＤＮＡ（ｎ＝４）を投与した。処置及び対照マウスにおけるルシフェラーゼ発現の場所及び程度を、製造業者の説明書に従って、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａインビボ撮像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、麻酔をかけたマウスの生物発光撮像（ＢＬＩ）によって４時間で決定した。簡潔に述べると、マウスを、酸素中のイソフルランを使用して麻酔し、仰臥位で加熱されたステージ上に配置した。次いで、マウスにＤ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ＃１２２７９９）ＩＰを投与し、ＢＬＩを実施した。結果が表３２に示される。

【表40】

【0536】

表３２に示されるように、本開示のＬＮＰ組成物が、肝臓細胞にＤＮＡを送達し、肝臓細胞においてコードされた導入遺伝子を発現することができた。

【0537】

実施例１２－血友病の治療のための本開示のＬＮＰ
以下は、本開示の組成物及び方法が、血友病の治療、より具体的には、血友病Ａの治療に使用され得ることを実証する非限定的な実施例である。

【0538】

新生仔の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５、６）に０．２５ｍｇ／ｋｇのＦＶＩＩＩトランスポゾンＬＮＰを、１）機能的ＳＰＢをカプセル化している１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ（「機能的ＳＰＢ」）、又は２）触媒的に欠損したＳＰＢをカプセル化している０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ（「欠損ＳＰＢ」）のいずれかと同時送達で投与した。

【0539】

ＦＶＩＩＩトランスポゾンＬＮＰは、トランスポゾンを含むナノプラスミドＤＮＡを含む本開示のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２含有ＬＮＰであり、トランスポゾンが、第１のｐｉｇｇｙＢａｃ逆方向末端反復（右ＩＴＲ）、続いて、第１のインスレーター配列、続いて、ＳＥＲＰＩＮＡ１エンハンサーの３つのタンデムコピー、続いて、Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ＴＴＲ）エンハンス／プロモーター及びマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列、続いて、改変ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードするコドン最適化核酸配列、続いて、ＡＥＳ非翻訳領域（ＵＴＲ）、続いて、ｍＴＲＮＲ１ ＵＴＲ、続いて、ＳＶ４０後期ポリアデニル化及び切断シグナル配列、続いて、第２のインスレーター配列、続いて、第２のｐｉｇｇｙＢａｃ逆方向末端反復（左ＩＴＲ）を含んだ。トランスポゾンの配列は、配列番号３４に記載される。ＦＶＩＩＩトランスポゾンＬＮＰは、５４：１０：３５：１のモル比でｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み、１００：１（ｗ／ｗ）の脂質：ＤＮＡ比率を有した。

【0540】

機能的ＳＰＢ ＬＮＰは、活性ＳＰＢをコードするｍＲＮＡと、５４：１０：３５：１のモル比でｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と、１００：１（ｗ／ｗ）の脂質：ＲＮＡ比率を含む、本開示のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２含有ＬＮＰであった。欠損ＳＰＢ ＬＮＰは、触媒的に欠損したＳＰＢをコードするｍＲＮＡ、並びに３３．５：３２：３３．５：１のモル比でＣ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む、本開示のＣ１２－２００含有ＬＮＰであった。機能的ＳＰＢ又は欠損ＳＰＢのいずれかをコードするｍＲＮＡ中の全てのシチジン残基は、５－メチルシチジン（５－ＭｅＣ）であった。

【0541】

ＬＮＰの投与前に、麻酔を誘起するために、新生仔を短時間（約３分）氷上に配置した。同時送達投与について、ＤＮＡ－ＬＮＰ及びｍＲＮＡ－ＬＮＰの両方を管内で一緒に混合し、３０μＬを単一の２９ゲージインスリンシリンジに引き込み、顔面静脈を通して静脈内（ＩＶ）を介して送達した。新生仔を、その母親と戻す前に、３７℃の加熱パッドで正常な体温に戻した。処置後の２、４、６、及び８週目に、処置されたマウスから血漿を収集した。血漿収集について、処置されたマウスをイソフルランを用いて麻酔下に置き、約１５０μＬの全血を後眼窩に収集し、全血を１０％の体積の３．２％クエン酸ナトリウムと混合し、１５，０００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離し、血漿上清を採取した。ｈＦＶＩＩＩ抗原レベルを、Ｖｉｓｕａｌｉｚｅ（商標）Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（商標）Ｉｎｃ．）を使用して測定した。

【0542】

この分析の結果が図４に示される。図４は、ＳＰＢ ＬＮＰの投与後８週までに、上記の治療ヒトＦＶＩＩＩタンパク質レベルが試料で観察されたことを示す。

【0543】

本実施例に提示される結果は、本開示のＬＮＰが、インビボで高レベルのＦＶＩＩＩ発現を駆動するために使用され得ることを実証し、それによって、本開示の組成物及び方法が、血友病Ａを治療するために使用され得ることを実証する。

【0544】

実施例１３－本開示のＬＮＰ組成物は、インビボで肝臓に高い特異性を有するＲＮＡを送達する
この実験は、一対のｇＲＮＡによってｐｓｋ９遺伝子に標的化され、結果として、その後のｐｓｋ９遺伝子のインビボ遺伝子編集をもたらす、Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ ｍＲＮＡを肝臓に送達する本開示のＬＮＰ組成物の能力を示す。Ｐｃｓｋ９タンパク質は、肝細胞によって分泌され、ＬＤＬ受容体に結合し、その内部移行及びリソソーム分解を誘起し、結果として、ＬＤＬコレステロールの増加した循環レベルをもたらす。

【0545】

この実験では、メスの成体ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝２／群）の各群を、５’－ＣｌｅａｎＣａｐ－５ＭｅＣ－Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ（配列番号３１）をコードするｍＲＮＡ、及びマウスｐｃｓｋ９遺伝子の第１のエクソンに標的化された一対のｇＲＮＡ（配列番号２９、３０）を静脈内に同時投与した。ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ分子を、５４：１０：３５：１のモル比（表３３～３６のＬＮＰ組成物６．１、６．２、６．３、６．４、及び６．５と称される）で、ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む、本開示のＬＮＰ組成物内で製剤化した。ｍＲＮＡ中の全てのシチジン残基は、５－メチルシチジン（５－ＭｅＣ）であった。

【0546】

表３３に示される総ＲＮＡ用量を含む本開示のＬＮＰ組成物を、各群からマウスに投与した。マウスの一群に、Ｃａｓ－ＣＬＯＶＥＲ ｍＲＮＡ及び一対のｐｃｓｋ９ ｇＲＮＡの用量を投与し、両方、ベンチマークＣ１２－２００ ＬＮＰ組成物中に共カプセル化した。マウスの一群を、陰性対照としてビヒクル（ＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で処置した。

【表41】

【0547】

投与後７日後、ＤＮＡを、各群におけるマウスから、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の４つの組織タイプから単離した。簡潔に述べると、組織を安楽死後に切除し、液体窒素中で急速凍結し、溶解緩衝液（２００ｕＬの溶解緩衝液＋１０ｕＬのプロテイナーゼＫ中の１５ｍｇの組織）と混合し、Ｔｒｉｐｌｅ－Ｐｕｒｅジルコニウムビーズ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）で粉砕した。次いで、均質化された組織を、５６Ｃで３０分間インキュベートし、製造業者の説明書に従って、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＭｏｎａｒｃｈ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用してカラム精製した。最終的なＤＮＡ溶出を、５０ｕＬの溶出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．５）中で行った。ＤＮＡ試料の濃度及び純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して２６０及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって評価した。また、ＬＤＬ－Ｃ定量化のために血液試料を採取した。簡潔に述べると、２ｍｌのシリンジ及び２５Ｇ針を使用して心臓穿刺を介して安楽死させた後、５００ｕＬの血液を収集し、微量遠心分離管に移し、室温で１時間インキュベートし、１５００ｇで１５分間遠心分離して、血清から細胞画分を分離した。血清画分（２００ｕＬ）を新しい管に移し、更なる分析まで－８０Ｃで保存した。

【0548】

加えて、表３３のＬＮＰ組成物で処置されたマウスの体重を、投与後７日間評価し、ベースライン及び処置後の体重を比較した。表３３の各ＬＮＰ組成物で処置されたマウスの各群に対する処置後７日後の平均体重変化率が表３４に示される。

【表42】

【0549】

表３４に示されるように、本開示のＬＮＰ組成物は、元の体重を保持するか、又はわずかに体重増加さえする、ほとんどの処置マウスで忍容性良好であった。

【0550】

マウスに送達されたＣａｓ－ＣＬＯＶＥＲ ｍＲＮＡによる遺伝子編集を、次世代シーケンス（ＮＧＳ）によって測定した。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡ試料を、まず、Ｐｃｓｋ９エクソン１に隣接し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ部分アダプターを含有するプライマーで増幅した。結果的に得られたアンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５及びＰ７配列、並びに固有のインデックス配列（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有するプライマーを用いて、第２のＰＣＲ反応を受けた。最終アンプリコンを等モル濃度でプールし、Ｍｉｓｅｑ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ ｖ２ ３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に装填し、Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑの標準Ｉｌｌｕｍｉｎａ手順に従ってＭｉｓｅｑベンチトップシーケンサーで実行した。次いで、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２を使用してシーケンシングデータを分析して、各試料における挿入／欠失（インデル）の頻度を決定した。ＮＧＳの結果は、ｐｃｓｋ９遺伝子に見出されるインデルパーセンテージとして表３５に提供される。

【表43】

【0551】

表３５に示されるように、本開示のＬＮＰ組成物は、ｐｃｓｋ９遺伝子のその後の遺伝子編集によって示されるように、肝臓にＣａｓ－ＣＬＯＶＥＲ ｍＲＮＡを正常に送達し、１．５ｍｇ／ｋｇ以上の総ＲＮＡ用量に対して、ベンチマークＣ１２－２００組成物以上に良好なインデル率を伴った。

【0552】

マウスにおけるｐｃｓｋ９タンパク質の血清レベルもまた、投与の７日後に測定され、結果が表３６に示される。簡潔に述べると、マウスＰｃｓｋ９ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、製造業者の説明書に従って各血清試料中のＰｃｓｋ９を決定した。全ての血清試料を３回アッセイし、結果をＰＢＳ処置マウスのＰｃｓｋ９レベルと比較して、Ｐｃｓｋ９レベルのパーセンテージ低減として表した。

【表44】

【0553】

まとめると、表３５及び３６の結果は、本開示のＬＮＰ組成物によって送達されるＣａｓ－ＣＬＯＶＥＲ ｍＲＮＡが、インビボで肝臓のｐｃｓｋ９遺伝子を編集するのに効果的であることを示す。ベンチマークと比較して高いインデル％率、及びベースラインと比較して低いｐｃｓｋ９タンパク質発現レベルによって示されるように、遺伝子編集有効性は、２ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡで最大である。

【0554】

実施例１４－本開示のＬＮＰは、ｍＲＮＡを非ヒト霊長類に送達する
以下は、本開示の組成物が、インビボでｍＲＮＡを非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に送達するために使用され得、送達されたｍＲＮＡがＮＨＰで忍容性良好であったことを実証する非限定的な実施例である。

【0555】

第１の研究では、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードする配列を含むｍＲＮＡ分子を、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２ ＳＳ－ＯＰ、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む、本開示の脂質ナノ粒子中にカプセル化した（図５ではＰｏｓｅｉｄａ ｍＲＮＡ ＬＮＰと称される）。

【0556】

ｈＥＰＯ ｍＲＮＡをカプセル化した本開示のＬＮＰを２匹のサルに投与し、ベンチマーク脂質ナノ粒子組成物ＭＣ３を１匹のサルに投与した。サルに、１日目に０．２５ｍｇ／ｋｇの用量、及び２１日目に０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、漸増用量のＬＮＰを投与した。採血を、０時間、１時間、４時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び１６８時間において、各注入後１週間にわたって行った。全ての採血を絶食下で行い、収集された量は各々２ｍＬであった。

【0557】

１日目の投与（０．２５ｍｇ／ｋｇ用量）後の採血試料中のヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）のレベルを、標準化されたアッセイを使用して決定した。簡潔に述べると、全血を標準化された方法で血清に処理した。ｈＥＰＯを、ＮＨＰに最適化されたＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて血清中で検出した。図５は、本開示のＬＮＰで処理されたサルからの試料のｈＥＰＯレベルが、注入後の１６８時間にわたってベンチマーク組成物で処理されたサルからの試料のｈＥＰＯレベルよりも高かったことを示す。本開示のＬＮＰの投与後のピークＥＰＯレベルには、図５に示されるように、注入後約１２時間で到達し、また、図５に示されるように、ピークＥＰＯレベルは、１６８時間の経過にわたってベンチマークＬＮＰの投与後のピークｈＥＰＯレベルの３倍程度高かった。

【0558】

この研究の結果は、血清中で測定されたｈＥＰＯの増加したレベルによって実証されるように、ｍＲＮＡがインビボでＮＨＰに送達されたことを示す。

【0559】

別の研究では、２つの肝臓酵素のレベルが、潜在的な肝毒性の尺度として、本開示のＬＮＰで処置されたラット及びＮＨＰの血清中で測定された。この研究の実験では、ＨＡタグ付きＳＰＢをコードする配列を含む５ＭｅＣ－ｍＲＮＡ分子を、約５４モル％のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２ ＳＳ－ＯＰ、約３５モル％のコレステロール、約１０モル％のＤＯＰＥ、及び約１モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む、本開示の脂質ナノ粒子中にカプセル化した。

【0560】

第１の実験では、成体ラットの血清中に存在する肝臓酵素アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルを、０、０．２５、０．５及び１ｍｇ／ｋｇの濃度で本開示のＬＮＰの投与の４時間後、２４時間後、及び７日後に評価した。ラット（ｎ＝３）に尾静脈を介して本開示のＬＮＰ又はビヒクル（ＰＢＳ）を静脈内に注入し、４時間後、２４時間後、及び７日後に採血した。

【0561】

別個の実験では、メスのカニクイザルの血清中に存在するＡＳＴ及びＡＬＴのレベルを、０、０．１、及び０．２５ｍｇ／ｋｇの濃度で本開示のＬＮＰの投与の０時間後、２４時間後、及び７日後に評価した。サル（ｎ＝２、３）に本開示のＬＮＰ又はビヒクル（ＰＢＳ）を注入し、０時間後、２４時間後、及び７日後に採血した。

【0562】

血清試料を採取した後、各試料を２０分間凝固させ、１３Ｋｒｐｍで３分間遠心分離して、望ましくない細胞及び破片を除去することを可能にした。試料を、輸送のために濡れた氷上に配置し、分析されるまで－８０℃で保存した。酵素レベルを、標準化されたアッセイを使用して決定した。

【0563】

この研究の２つの異なる実験からの試験対象における７日後のＡＳＴ及びＡＬＴのレベルが、図６に示される。図６に示されるように、本開示のＬＮＰ組成物のインビボ投与は、ラット及びＮＨＰの両方で、７日後の血清中のＡＳＴ及びＡＬＴレベルの有意な増加を結果的にもたらさなかった。

【0564】

実施例１５－オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療のための本開示のＬＮＰ
以下は、本開示の組成物及び方法が、ＯＴＣ欠損症の治療に使用され得ることを実証する非限定的な実施例である。

【0565】

１日齢のＢ６ＥｉＣ３ＳｎオスＯＴＣＤ新生仔（ｎ＝４～９）に、以下の処置を施した。
処置＃１：ヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子
処置＃２：ＳＰＢ ＬＮＰとの組み合わせにおけるヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子

【0566】

ヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）トランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含むＡＡＶウイルスベクター粒子であり、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、ヒトＯＴＣポリペプチドをコードする核酸を含んだ。

【0567】

ＳＰＢ ＬＮＰは、活性ＳＰＢをコードするｍＲＮＡを含む本開示のｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２含有ＬＮＰであった。ＳＰＢ ＬＮＰは、５４：１０：３５：１のモル比でｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含み、１００：１（ｗ／ｗ）の脂質：ＲＮＡ比率を有した。

【0568】

内因性マウスＯＴＣを標的とするｓｈＲＮＡをコードする配列を含む別個のＡＡＶ８ウイルスベクター粒子を利用して、残留内因性マウスＯＴＣを除去することによってＯＴＣＤモデルにおいて重篤な疾患を誘起し、このモデルでは、ヒトＯＴＣ導入遺伝子を用いた遺伝子療法のみが、重度のＯＴＣＤを救済することができた。

【0569】

両方の処置について、マウスにｈＯＴＣトランスポゾンＡＡＶウイルスベクターの用量を増加させて投与し、処置＃２群のマウスにも０．５ｍｇ／ｋｇのＳＰＢ ＬＮＰを投与した。図７は、重度のＯＴＣ疾患誘起時に全用量範囲にわたって重度のＯＴＣＤ罹患率を結果的にもたらしたＡＡＶ単独の処置と比較して、処置の投与の４７日後、ＡＡＶの低用量範囲内の処置＃２群でＯＴＣ欠損マウスの１００％の生存が観察されたことを示す。

【0570】

更に、処置＃２群のマウスの肝臓における組み込みウイルスコピー数（ＶＣＮ）及びｈＯＴＣ ｍＲＮＡのレベルを、それぞれ、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）及びリアルタイムｑＰＣＲによって測定した。簡潔に述べると、ＤＮＡ Ｒａｐｉｄｌｙｓｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して、粉末化された肝臓組織からＤＮＡを単離し、ベクターコピーを、エピソーマルベクターコピーと組み込みベクターコピーとを区別するために、ｈＯＴＣ導入遺伝子の３’ＵＴＲ及びｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＴＲの外部のＡＡＶ骨格を標的とする別個のプライマーを利用して、ＱＸ２００ Ａｕｔｏ ＤＧ液滴デジタルＰＣＲシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて分析した。ＨＭＢＳ（ヒドロキシメチルビランシンターゼ）遺伝子に対するプライマーを、マウス細胞数を正規化するために利用した。ｍＲＮＡ定量化のために、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、粉末化された肝臓組織からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡへの変換後（ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡキット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、遺伝子発現を、ｈＯＴＣ及びｍＡｃｔｂ（ベータアクチン）を標的とする特定のプライマーセットを使用して、リアルタイム定量的ｑＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６）によって分析した。図８は、組み込みＶＣＮ及びｈＯＴＣ ｍＲＮＡレベルの両方のＡＡＶ用量依存性の増加を示し、本開示のＳＰＢ ＬＮＰと組み合わせたｈＯＴＣトランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子の投与が、機能的ＯＴＣ遺伝子を肝臓内に正常に組み込んだことを実証する。

【0571】

別の研究では、ＯＴＣＤで増加するバイオマーカーであるオロチン酸のレベルが、処置されたマウスの尿で測定された。簡潔に述べると、１日齢のＢ６ＥｉＣ３Ｓｎオス新生仔（２１日齢の遺伝子型確認のみ）（最低用量群はｎ＝３、残りの群は６～８）に、２Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ用量のｈＯＴＣトランスポゾンＡＡＶウイルスベクター粒子を、ＳＰＢ ＬＮＰの増加する用量と組み合わせて投与した。オロチン酸レベルを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって測定した。簡潔に述べると、希釈尿試料を逆相ＵＰＬＣカラム、続いて、陰イオン化モードのＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏを用いたＭＳ／ＭＳ検出で分析した。親水性相互作用ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて尿中のクレアチニンレベルを測定することによって結果を正規化し、陽イオン化モードでデータを収集した。図９は、処置の投与の４７日後、マウスの１００％の生存が、重度のＯＴＣ疾患誘起時のオロチン酸の用量依存性の減少とともに、ＳＰＢ ＬＮＰの全用量範囲にわたって観察されたことを示す。

【0572】

本実施例に提示される結果は、本開示のＬＮＰが、インビボで高レベルのヒトＯＴＣポリペプチド発現を駆動するために使用され得ることを実証し、それによって、本開示の組成物及び方法が、ＯＴＣＤを治療するために使用され得ることを実証する。更に、本開示のＬＮＰは、ＯＴＣ遺伝子を肝臓に正常に組み込み、オロチン酸によって測定される際に、疾患表現型を決定するために使用され得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】