特表 2024-530355 肥満症の処置に使用するための、ドミナントネガティブＡＭＰＫα１変異体を発現する小型細胞外小胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-08-16

(54)【発明の名称】肥満症の処置に使用するための、ドミナントネガティブＡＭＰＫα１変異体を発現する小型細胞外小胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240808BHJP

   A61K 38/45 20060101ALI20240808BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240808BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20240808BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240808BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240808BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240808BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240808BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20240808BHJP

   C12N 15/47 20060101ALN20240808BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240808BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALN20240808BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

A61K38/45

A61K9/127

A61K9/50

A61K47/46

A61K48/00

A61P3/04

A61P43/00 111

C12N15/54

C12N15/47

C12N15/62 Z

C12N5/0784

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024531566

(86)(22)【出願日】2022-07-29

(85)【翻訳文提出日】2024-04-05

(86)【国際出願番号】 EP2022071463

(87)【国際公開番号】W WO2023012076

(87)【国際公開日】2023-02-09

(31)【優先権主張番号】21382749.6

(32)【優先日】2021-08-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21382763.7

(32)【優先日】2021-08-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521125464

【氏名又は名称】ウニベルシダーデ デ サンティアゴ デ コンポステーラ

(71)【出願人】

【識別番号】506316557

【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック

(71)【出願人】

【識別番号】509000747

【氏名又は名称】アンスティトゥー ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ レシェルシュ メディカル（イエヌエスエエールエム）

(71)【出願人】

【識別番号】524050763

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ デアンジェ

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ミルバンク エドワード

(72)【発明者】

【氏名】ロペス ペレス ミゲル アントニオ

(72)【発明者】

【氏名】マルティネス マルティネス マリア デル カルメン

(72)【発明者】

【氏名】アンドリアンツィトハイナ ラマロソン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA27

4B065CA44

4C076AA19

4C076AA61

4C076AA65

4C076BB13

4C076CC21

4C076CC50

4C076EE57

4C076FF36

4C076FF65

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084DC25

4C084MA05

4C084MA24

4C084MA38

4C084MA66

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA701

4C084ZA702

4C084ZB212

4C084ZC191

4C084ZC192

4C084ZC331

4C084ZC332

4C084ZC351

4C084ZC352

(57)【要約】

本発明は、肥満症の処置を必要とする対象における肥満症の処置に使用するための小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団に関し、ｓＥＶは、作動可能に連結され、ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にある、Ｄ１６８ＡドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をそれらの外膜において一過性に発現するように操作されている。当該集団は、ｓＥＶが前全身的に投与された場合、視床下部腹内側核に位置するＳＦ１発現ニューロンにおいてそれらの効果を発揮することができるので、非常に安全かつ有効である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団であって、前記ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１からなることを特徴とし、
前記ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、作動可能に連結され、配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性を有するステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にあり、
前記ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をその外膜で発現するように操作されている、
小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団。

【請求項2】

前記ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータのアミノ酸配列が、配列番号３からなる、請求項１に記載の小型細胞外小胞の集団。

【請求項3】

リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した前記神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む前記融合タンパク質が、配列番号５、又は配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１又は２に記載の小型細胞外小胞の集団。

【請求項4】

肥満症の処置用又は予防用の、請求項１～３のいずれか一項に記載の小型細胞外小胞の集団。

【請求項5】

前記肥満症がレプチン受容体（ＬＥＰＲ）欠乏誘導性肥満症である、請求項４に記載の小型細胞外小胞の集団。

【請求項6】

請求項４又は５に記載の肥満症の前記処置のウォッシュアウト後のリバウンド効果の改善用又は減少用の、請求項１～３のいずれか一項に記載の小型細胞外小胞の集団。

【請求項7】

前記リバウンド効果の前記改善又は低減が、処置ウォッシュアウトの少なくとも５日後に測定される、請求項６に記載の小型細胞外小胞の集団。

【請求項8】

前記小型細胞外小胞の投与が全身性であり、好ましくは静脈内である、請求項４～７のいずれか一項に記載の小型細胞外小胞の集団。

【請求項9】

全身投与された場合に、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するＳＦ１発現ニューロンにおけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化レベルを、未処置ＳＦ１発現細胞におけるＡＭＰＫの活性化レベルと比較して有意に減少させることができるが、前記減少は、副腎、精巣、又は脳下垂体からなるリストから選択される他のＳＦ１発現組織では有意に減少しない、小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団であって、
前記小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団は、ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、前記ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１からなり、
前記ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、作動可能に連結され、配列番号３と少なくとも９８％の配列同一性を有するステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にあり、
前記ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をその外膜に発現するように操作され、
前記集団は、肥満症の処置を必要とする対象における全身投与経路を介した肥満症の処置用である、
小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団。

【請求項10】

前記ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータのアミノ酸配列が配列番号３からなる、請求項９に記載の集団。

【請求項11】

前記ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質のヌクレオチド配列が、配列番号２からなる、請求項９又は１０に記載の集団。

【請求項12】

リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した前記神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む前記融合タンパク質が、配列番号５、又は配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の集団。

【請求項13】

リバウンド効果の改善又は減少が、処置のウォッシュアウト後少なくとも５日で測定される、肥満症、好ましくは食餌誘発性及び／又は遺伝性肥満症の前記処置の前記ウォッシュアウト後の前記リバウンド効果の前記改善用又は減少用の、請求項９～１２のいずれか一項に記載の集団。

【請求項14】

前記処置が肥満症を回復又は改善することを含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載の集団。

【請求項15】

前記全身経路が血管内経路である、請求項９～１４のいずれか一項に記載の集団。

【請求項16】

前記小型細胞外小胞が、３０ｎｍ～１５０ｎｍのサイズ分布を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の集団、又は請求項９～１５のいずれか一項に記載の集団。

【請求項17】

前記小型細胞外小胞が、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９若しくはＣＤ８１、又はそれらの任意の組合せからなる群より選択される特異的マーカのうちの１つ以上を更に含む、請求項１６に記載の集団又は集団。

【請求項18】

前記小型細胞外小胞が、ＧＲＰ９４マーカを欠くことを特徴とする、請求項１６又は１７のいずれかに記載の集団。

【請求項19】

前記小型細胞外小胞が、成熟抗原提示細胞におけるＴ細胞活性化因子分子の発現と比較して、少なくとも１つの前記Ｔ細胞活性化因子分子の統計的に有意に低下した発現を有することを特徴とする未成熟抗原提示細胞から産生又は得られる、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の集団又は使用のための集団。

【請求項20】

前記抗原提示細胞が樹状細胞、好ましくはＪＡＷＳ ＩＩ細胞株であり、前記少なくとも１つのＴ細胞活性化因子分子が、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）、分化抗原群８０（ＣＤ８０）若しくは分化抗原群８６（ＣＤ８６）、又はそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上のＴ細胞活性化因子分子である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の集団。

【請求項21】

前記小型細胞外小胞がエキソソームである、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の集団。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナノ生物医学の分野に関する。特に、本発明は、肥満症の処置のための全身経路を介して投与される小型細胞外小胞の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

肥満症は、世界中で年間数千人の死亡を引き起こす。これは、癌、心血管疾患及び２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を含むこの状態に関連する多くの直接的及び間接的な併存症に起因するが、最も予防可能な流行である^１－６。肥満症の最も効果的な処置は肥満手術であり、これは体重を減少させるだけでなく、Ｔ２Ｄも改善する。しかし、肥満対象の大部分は肥満手術に適格ではない。更に、肥満手術の有害かつ危険な副作用を考慮して、革新的な抗肥満症薬を開発するための努力がますます増えている^{１、２、５}。しかし、いくつかの現在の薬理学的主導の戦略が体重の減少においていくらかの有益な結果を示すとしても、それらのほとんどは、主に特異性の欠如に起因する望ましくない副作用を示す。

【0003】

更に、現在の戦略のほとんどは、エネルギーバランスの食物摂取成分を目標とするように設計されているが、それらの多くはエネルギー消費（ＥＥ）をトリガーしない。実際、体重の調節は複雑であり、複数の生物機能に相互接続されているため、新しい分子標的の同定によって処置の特異性を高めることは重要であると思われる^{１、２、５}。ＡＭＰＫは、低エネルギーの条件で活性化され、逆調節応答を促進する細胞ゲージである^{３、７～１１}。最近の証拠は、視床下部におけるＡＭＰＫの調節がエネルギーバランスを調節する古典的機構であることを実証している。特に、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）におけるＡＭＰＫα１のホルモン的、薬理学的又は遺伝的阻害は、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）熱産生を刺激する交感神経系（ＳＮＳ）活性の増加をもたらし、ＥＥを上昇させ、その後、摂食非依存性体重減少をもたらす^{１２～１８}。細胞レベルでは、この作用はＶＭＨのステロイド産生因子１（ＳＦ１）ニューロンで起こり、ＡＭＰＫα１の特異的欠失は、マウスの食餌誘発性肥満症（ＤＩＯ）に対する耐性及び代謝改善を促進する^{１７、１８}。

【0004】

抗肥満症薬開発の有効性の鍵の１つは、その作用特異性である。これに関して、遺伝子治療の治療可能性は、（ｉ）全身注射後のそれらの急速な分解を誘導する、血液等の体液内でのその低い安定性、（ｉｉ）その限られた組織特異性作用のために制限される。非特異的送達後のこれらの望ましくない結果に対抗するために、過去数十年はナノ医薬戦略の拡大を通じていくらかの刺激的な突破口を提供している。アデノウイルス又は合成ナノ粒子送達戦略は、再生医療において、又はいくつかの病状に対して開発されている。しかし、炎症－望ましくない応答を誘発する反復注射を含むいくつかの問題は、それらの
を制限した。したがって、目的の組織を標的化し、治療遺伝子を特異的に送達することができるが、免疫応答を誘導することも他の生物学的プロセスに影響を及ぼすこともない、新しい生物由来のナノ小胞を開発することが望ましい。

【0005】

細胞外小胞（ＥＶ）は、本質的に全ての細胞型によって放出される天然に存在するナノからマイクロサイズの膜小胞の異種集団である。ＥＶは、標的細胞の再プログラミングを通して治療可能性を有し、細胞プロセス及び分泌物（細胞によって分泌される分子）の調節を可能にし、最終的には標的細胞の再プログラミング後の組織修復を促進することが示されている。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、肥満症の処置又は予防に使用するためのＡＭＰＫα１のドミナントネガティブアイソフォームをコードするプラスミドを送達するために全身投与される治療用ベクターとしての細胞外小胞の使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】ニューロン標的化樹状細胞由来ｓＥＶの生成及び特徴付けの図である。（ａ）Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の試料のナノ粒子追跡分析によって得られた曲線の例。グラフは、サイズ（ｎｍ）によるｓＥＶの濃度（粒子／ｍＬ）を表す。（ｂ）生成されたＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶの電子顕微鏡観察では、特定の丸い形状及び約７０ｎｍの小胞の平均サイズが示される。（ｃ）Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶ中のＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９及びＣＤ８１に対する抗体を使用するウェスタンブロッティング。（ｄ、ｅ）非ロードｓＥＶ（対照）、ｓｉＲＮＡ－Ｔｅｘａｓ ＲｅｄロードｓＥＶ（ｓＥＶ－ｓｉＲＮＡ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）又はＧＦＰプラスミドロードｓＥＶ（ｓＥＶ－ＧＦＰ）で２、６及び２４時間処置したＪＡＷＳ ＩＩ細胞の共焦点顕微鏡写真。（ｆ）ＤＩＤ標識天然（対照）又はＤＩＤ標識Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶ（Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ）の３０分、２、４及び６時間の静脈内注射後の生存マウスの代表的なＭＡＥＳＴＲＯ画像。（ｇ）ＤＩＤ標識天然（対照、ｎ＝３）又はＤＩＤ標識Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶ（Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ、ｎ＝４）による注射の６時間後の単離された器官（肺、脾臓、肝臓、心臓及び腎臓）におけるＤＩＤ蛍光のエクスビボ定量化。（ｈ）ＤＩＤ標識天然（対照；ｎ＝３マウス／群）及びＤＩＤ標識Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶ（Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ；ｎ＝４マウス／群）の注射６時間後に採取した、マウス脳、視床下部を区切る黒丸の代表的な画像。（ｉ）ＤＩＤ標識天然（対照、ｎ＝３マウス／群）及びＤＩＤ標識Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶ（ｎ＝４マウス／群）の注射の６時間後に採取したマウス脳のＤＩＤ蛍光のエクスビボ定量化。（ｊ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで２４時間処置したＧＴ１－７細胞の代表的なｐＡＣＣαウェスタンブロット画像（ｎ＝８試料／群）。β－アクチンをタンパク質ロードの対照として使用した。試料を同じゲルにロードしたが、並んでいなかった場合、黒い線を免疫ブロットに挿入した。（ｋ）対照（非ロード、ｎ＝８試料／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで２４時間処置したＧＴ１－７細胞におけるｐＡＣＣαの定量（ｎ＝８試料／群）。データを平均±ＳＥＭとして表した。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図2】ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの定位的ＶＭＨ注射のエネルギーバランスに対する効果の図である。（ａ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる定位的ＶＭＨ注射後のマウスのグラムで表される体重変化の図である。赤色矢印は注射の開始を示す（ｎ＝１８匹／群）。（ｂ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる定位的ＶＭＨ注射後のマウスのグラムで表される毎日の食物摂取量（ｎ＝１８動物／群）。（ｃ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる定位的ＶＭＨ注射の７２時間後にマウスから採取したＶＭＨの代表的なｐＡＣＣα及びＡＣＣαウェスタンブロット画像。β－アクチンをタンパク質ロードの対照として使用した。試料を同じゲルにロードしたが、並んでいなかった場合、黒い線を免疫ブロットに挿入した。（ｄ）ＶＭＨ、弓状核（ＡＲＣ）及び外側視床下部領域（ＬＨＡ）において対照の％で表されるｐＡＣＣα／ＡＣＣαの定量化（ｎ＝５～６マウス／群）。（ｅ、ｆ）対照（非ロード、ｎ＝１６動物／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる７２時間の定位的ＶＭＨ注射後のマウスの代表的なサーモグラフィ画像（ｅ）及びＢＡＴ肩甲骨間温度定量化（３日間の平均）（ｆ）（ｎ＝１７動物／群）。（ｇ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる定位的ＶＭＨ注射の７２時間後にマウスから採取したＢＡＴの代表的なＵＣＰ１ウェスタンブロット画像。α－チューブリンをタンパク質ロードの対照として使用した。試料を同じゲルにロードしたが、並んでいなかった場合、黒い線を免疫ブロットに挿入した。（ｈ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる定位的ＶＭＨ注射の７２時間後にマウスから採取したＢＡＴのＵＣＰ１タンパク質発現の定量化（ｎ＝５～７マウス／群）。データを平均±ＳＥＭとして表した。対照に対して＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図3】視床下部ＡＭＰＫ活性に対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置の効果の図である。（ａ）ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを静脈内注射したマウスにおける２４時間でのＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮプラスミドのインビボ発現。特異的ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ及びＨＰＲＴプライマーを使用した代表的なアガロースゲル電気泳動。＋対照はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮプラスミドである。（ｂ）対照（非ロード、ｎ＝６マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝６マウス／群）による静脈内注射の７２時間後のＶＭＨにおける代表的なｐＡＣＣα及びＡＣＣαウェスタンブロット画像及びｐＡＣＣαの定量化。β－アクチンをタンパク質ロードの対照として使用した。試料を同じゲルにロードしたが、並んでいなかった場合、黒い線を免疫ブロットに挿入した。（ｃ）ＶＭＨにおける対照の％で表されるｐＡＣＣα／ＡＣＣαの定量化。（ｄ）対照（非ロード、ｎ＝６マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝５マウス／群）での静脈内注射７２時間後のＶＭＨにおけるＡＭＰＫ活性の定量化。（ｅ、ｆ）対照（非ロード）ｓＥＶ又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる静脈内注射の２４時間後のＶＭＨにおけるＮｅｕｒｏｔｒａｃｅ５００／５２５（緑色）、ｐＡＣＣα（マゼンタ）陽性細胞及びマージされた反応性（ｅ）並びにｐＡＣＣα陽性細胞数の定量化（ｆ）（視野ごとの定量化；１０～１２視野、４マウス／群）を示す代表的な画像。スケールバーは２０μｍを表す。（ｇ、ｈ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｈ）による静脈内注射の２４時間後のＶＭＨにおけるＳＦ１細胞（視野ごとの定量化；２～３視野、４マウス／群）中のＤＡＰＩ（青色）、ＳＦ１（赤色）、ｐＡＣＣα（緑色）及びマージされた反応性（ｇ）並びにｐＡＣＣα蛍光（ｈ）の定量化を示す代表的な共焦点画像。矢印はｐＡＣＣ陽性ＳＦ１細胞を示す。スケールバーは２０μｍを表す。（ｉ、ｊ）１回の静脈内注射後のＶＭＨにおけるＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮプラスミド発現の時間経過。特異的ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ及びＨＰＲＴプライマーを使用した代表的なアガロースゲル電気泳動（ｉ）並びに異なる時点でのＶＭＨ（ｊ）におけるＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮプラスミド発現の定量（ｎ＝４～５マウス／群）。ＭＷＭ、分子量マーカ。データを平均±ＳＥＭとして表す。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図4】ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置のエネルギーバランスに対する効果の図である。（ａ、ｂ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを３日ごとに６日間静脈内注射した後のマウスのグラム（ａ）及びパーセンテージ（ｂ）で表される体重変化。赤色矢印は注射を示す（ｎ＝２４～２５マウス／群）。（ｃ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを３日ごとに６日間静脈内注射した後のマウスのグラムで表される食物摂取量。赤色矢印は注射を示す（ｎ＝２５マウス／群）。（ｄ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを３日間ごとに６日間、静脈内注射した後のマウスのグラムで表される毎日の食物摂取量（ｎ＝２５マウス／群）。（ｅ～ｇ）対照（非ロード、ｎ＝６マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝５匹マウス／群）を３日ごとに６日間、静脈内ＶＭＨ注射した後のマウスの明期及び暗期の間のエネルギー消費（ＥＥ、ｅ）、呼吸商（ＲＱ、ｆ）及び自発運動活性（ＬＡ、ｇ）。（ｈ）対照（非ロード、ｎ＝７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝８マウス／群）を３日ごとに６日間、静脈内ＶＭＨ注射した後のマウスの脂肪あり（ＡＴオン）及び脂肪なし（ＡＴオフ）、ＡＴ ｏｆｆによるＡＴ ｏｎを差し引いて得られた総ＡＴ、皮下ＡＴ（ｓｃＡＴ）及び内臓ＡＴ（ＶＡＴ）の画像上の脂肪組織（ＡＴ）を示す代表的なＮＭＲ画像。（ｉ～ｋ）グラムで表したＡＴ質量の定量；対照（非ロード、ｎ＝７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝８マウス／群）を３日ごとに６日間、静脈内ＶＭＨ注射した後のマウスの総ＡＴ質量（ｉ）、ｓｃＡＴ（ｊ）及びｖＡＴ（ｋ）。（ｌ、ｎ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの静脈内注射を２８日間３日ごと（ｎ＝１５マウス／群）、次いで１４日間のウォッシュアウト（ｎ＝８匹マウス／群）した後のマウスの体重（ｌ）及び体重変化（グラム（ｍ）及びパーセンテージ（２８－ｄ１日目）（ｎ）。赤色矢印は注射を示す。（ｏ、ｐ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの静脈内注射後のマウスの食物摂取量（ｏ）及び毎日の食物摂取量（ｐ）を３日ごとに２８日間、次いで１４日間のウォッシュアウト（ｎ＝１５マウス／群）。赤色矢印は注射を示す。（ｑ～ｓ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを３日ごとに６日間静脈内注射し、次いで２週間のウォッシュアウトを行い、３日ごとに再度６日間注射した後のマウスの全処置期間（ｑ）中及び各処置週間（ｒ）中のグラムで表される体重変化。同じプロトコルに従って、対照（非ロード、ｎ＝７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝７マウス／群）の静脈内注射後のマウスのグラム数で表した食物摂取量（ｓ）。赤色矢印は注射を示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図5】ＢＡＴ熱産生に対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置の効果の図である。（ａ～ｃ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを３日ごとに６日間尾静脈に注射したマウスの代表的なＢＡＴサーモグラフィ画像（ａ）、毎日のＢＡＴ温度（ｂ）（ｎ＝１０マウス／群）及び平均ＢＡＴ温度定量（ｃ）［ｎ＝６９～７０マウス／群；ボックスプロットは、中央値（中央線）、２５、７５パーセンタイル（ボックス）及び１０～９０パーセンタイル（ひげ；それぞれ最小値及び最大値）を示す］。赤色矢印は注射を示す。（ｄ、ｅ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを３日ごとに６日間尾静脈に注射したマウスのＢＡＴ温度（℃）（ｄ）及び食物摂取量（ｅ）とグラムで表される体重変化（ｎ＝６０個体／群）との相関分析。（ｆ～ｈ）対照（非ロード、ｎ＝８マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝８マウス／群）を３日ごとに６日間静脈内注射し、次いで２週間のウォッシュアウトを行い、３日ごとに再度６日間注射した後のマウスの４、１４及び２３日目の代表的なＢＡＴサーモグラフィ画像（ｆ）、毎日のＢＡＴ温度時間経過（ｇ）及び毎日のＢＡＴ温度ヒストグラム（ｈ）。（ｉ、ｊ）対照（非ロード、ｎ＝８マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝８マウス／群）を３日ごとに６日間、次いで２週間のウォッシュアウト後に、３日ごとに再度６日間静脈内注射した後のマウスの代表的な尾基部のサーモグラフィ画像（ｉ）及び平均尾基部の温度定量化（ｊ）。データを平均±ＳＥＭとして表した。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は、２つのスチューデントｔ検定によって評価した。但し、片側スチューデントｔ検定を使用したクロスオーバー実験（ｇ）の２日目及び２３日目のＢＡＴ温度を除く。

【図6】ＢＡＴ熱産生分子経路に対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置の効果の図である。（ａ、ｂ）対照（非ロード、ｎ＝８～１６マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝１０～１８マウス／群）を３日ごとに６日間静脈内注射した後のマウスのＢＡＴにおける、代表的なＵＣＰ１、ＵＣＰ３、ＰＧＣ１α及びＰＧＣ１βウェスタンブロット画像（ａ）及びそれらの発現の定量化（ｂ）。α－チューブリンをタンパク質ロードの対照として使用した。試料を同じゲルにロードしたが、並んでいなかった場合、黒い線を免疫ブロットに挿入した。（ｃ、ｄ）基底レベル及び対照（非ロード、ｎ＝５マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝５マウス／群）の注射後のＢＡＴを示す代表的な軸方向、矢状及び冠状ＰＥＴ－ＣＴスキャン画像（ｃ）及び標準化取込み値（ＳＵＶ）ＢＡＴ／肝臓の比（ｄ）。（ｅ、ｆ）対照（非ロード、ｎ＝７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの注射後（ｎ＝７マウス／群）のマウス由来のｓｃＷＡＴにおける、ＵＣＰ１染色領域の、ＵＣＰ１染色（ｅ）及び定量化（ｆ）を示す、抗ＵＣＰ１抗体による代表的なｓｃＷＡＴ免疫組織化学。スケールバーは１００μｍを表す。データを平均±ＳＥＭとして表す。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図7】ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置に対するアドレナリン遮断の効果。（ａ、ｂ）対照（非ロード；ｎ＝６マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶ（ｎ＝６マウス／群）を尾静脈に２４時間注射したＤＩＯマウスのスパイク／秒における代表的なＢＡＴ ＳＮＡトレース（ａ）及びその定量（ｂ）（総計、遠心性及び求心性信号）。（ｃ～ｆ）対照（非ロード；ｎ＝６マウス／群）、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ単独（ｎ＝６マウス／群）又は特異的β３－ＡＲアンタゴニスト、ＳＲ５９２３０Ａの存在下（ｎ＝６マウス／群）を注射したマウスの体重変化（グラム、ｃ）毎日の食物摂取量（グラム、ｄ）、代表的なＢＡＴサーモグラフィ画像（ｅ）及び平均ＢＡＴ温度定量（ｆ）。（ｇ、ｈ）対照（非ロード；ｎ＝６マウス／群）、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ単独又は特異的β３－ＡＲアンタゴニスト、ＳＲ５９２３０Ａ（ｎ＝６マウス／群）の存在下での静脈内注射後のマウスのＢＡＴにおける代表的なＵＣＰ１ウェスタンブロット画像（ｇ）及びその発現の定量化（ｈ）。α－チューブリンをタンパク質ロードの対照として使用した。試料を同じゲルにロードしたが、並んでいなかった場合、黒い線を免疫ブロットに挿入した。データを平均±ＳＥＭとして表した。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。＃Ｐ＜０．０５及び＃＃Ｐ＜０．０１ ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ対ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ＋ＳＲ５９２３０Ａ。統計的有意性は両側ＡＮＯＶＡによって評価した。

【図8】ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置の、熱的中性条件及びＵＣＰ１ノックアウトマウスにおけるエネルギーバランスに対する効果の図である。（ａ、ｂ）熱中性条件下（３０℃）に置かれた６日間３日ごとの、対照（非ロード、ｎ＝９マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝９マウス／群）の静脈内注射後のマウスのグラム（ａ）及びパーセンテージ（ｂ）で表される体重変化。（ｃ、ｄ）対照（非ロード、ｎ＝９マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝９マウス／群）を、熱的中性条件下に置かれた６日間３日ごとに静脈内注射した後のマウスの食物摂取量（ｃ）及び毎日の食物摂取量（ｄ）。（ｅ、ｆ）熱的中性条件下に置いた、対照（非ロード、ｎ＝９マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝９マウス／群）を３日ごとに６日間静脈内注射した後のマウスの代表的なＢＡＴサーモグラフィ画像（ｅ）及びＢＡＴ温度肩甲骨間温度定量化（ｆ）。（ｇ、ｈ）対照（非ロード、ｎ＝５マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ（ｎ＝７マウス／群）を３日ごとに６日間静脈内注射した後のマウスのＢＡＴにおける代表的なＵＣＰ１ウェスタンブロット画像（ｇ）及びＵＣＰ１発現の定量化（ｈ）。α－チューブリンをタンパク質ロードの対照として使用した。試料を同じゲルにロードしたが、並んでいなかった場合、黒い線を免疫ブロットに挿入した。（ｉ、ｊ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶでの単回静脈内注射後の野生型（ｕｃｐ１＋／＋、ｉ、ｎ＝７マウス／群）及びｕｃｐ１ヌルマウス（ｕｃｐ１－／－、ｊ、ｎ＝１０マウス／群）のグラムで表される体重変化。赤色矢印は注射を示す。（ｋ、ｌ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる単回静脈内注射後の野生型（ｋ、ｎ＝７マウス／群）マウス及びｕｃｐ１ヌルマウス（ｌ、ｎ＝１０マウス／群）の毎日の食物摂取。（ｍ～ｐ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる単回静脈内注射後の野生型（ｍ、ｎ、ｎ＝７マウス／群）及びｕｃｐ１ヌルマウス（ｏ、ｐ、ｎ＝１０マウス／群）の代表的なＢＡＴサーモグラフィ画像（ｍ、ｏ）及びＢＡＴ温度肩甲骨間温度定量化（ｎ、ｐ）。データを平均±ＳＥＭとして表す。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図9】ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードニューロン標的樹状細胞由来ｓＥＶの特徴付けの図である。（ａ）天然ｓＥＶ及びＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶにおいてＬａｍｐ２ｂに対する抗体を使用するウェスタンブロッティング。（ｂ）天然ｓＥＶ（ｎ＝４試料／群）及び天然対照％でのＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ（ｎ＝５試料／群）ｓＥＶのＬａｍｐ２ｂレベルの定量化。（ｃ）Ｊａｗｓ ＩＩ細胞（レーン１）、未改変の天然ｓＥＶ（レーン２）及びＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶ（レーン３）におけるＧＲＰ９４に対する抗体によるウェスタンブロッティング。（ｄ）ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮをコードするプラスミドの円形表示。（ｅ）天然（左パネル）及びＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶ（右パネル）の試料のナノ粒子追跡分析によって得られた曲線の例。グラフは、サイズ（ｎｍ）によるｓＥＶの濃度（粒子／ｍＬ）を表す。（ｆ）ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶの電子顕微鏡観察で、特異的な丸い形状及び約７０ｎｍの小胞の平均サイズを示す。（ｇ）ＡＭＰＫ及びＧＡＰＤＨの天然（レーン１）、Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ（レーン２）、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶ（レーン３）及び陰性対照Ｈ２Ｏ（レーン４）のアガロースゲル電気泳動。（ｈ）ＤＮＡｓｅ（レーン１）、ＤＮＡｓｅ＋ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ ０．２％（レーン２）及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００ ０．２％（レーン３）のＡＭＰＫ及びＧＡＰＤＨで処置したＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶのアガロースゲル電気泳動。（ｉ）天然（ｎ＝６試料／群）及びＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ（ｎ＝６試料／群）ｓＥＶで２４時間処置した初代星状細胞の対照％で発現されたｐＡＣＣα／ＡＣＣαの定量。（ｊ）天然（ｎ＝６）及びＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ（ｎ＝６）ｓＥＶで２４時間処置したＮｅｕｒｏ２Ａ細胞における対照の％で発現したｐＡＣＣα／ＡＣＣαの定量。データを平均±ＳＥＭとして表した。対照に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図10】視床下部核解剖の対照の図である。ＡＲＣ、ＶＭＨ及びＬＨＡ解剖におけるＰｏｍｃ、Ｓｆ１及びＨｃｒｔ／オレキシンｍＲＮＡレベルの定量［ｎ＝１９～２０マウス／群；ボックスプロットは、中央値（中央線）、２５、７５パーセンタイル（ボックス）及び１０～９０パーセンタイル（ひげ；それぞれ最小値及び最大値）を示す］。データを平均±ＳＥＭとして表した。Ｐｏｍｃ ＡＲＣ、Ｓｆ１ ＶＭＨ及びＨｃｒｔ ＬＨＡに対して＊＊＊Ｐ＜０．００１。統計的有意性は両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図11】視床下部ＡＭＰＫ活性に対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置の効果の図である。（ａ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶとの静脈内注射の２４時間後の脳切片におけるＧＦＡＰ（緑色）、ｐＡＣＣα（マゼンタ）及びマージされた反応性を示す代表的な共焦点画像。スケールバーは２０μｍを表す。（ｂ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶとの静脈内注射の２４時間後の脳切片におけるＩｂａ１（緑色）、ｐＡＣＣα（マゼンタ）及びマージされた反応性を示す代表的な共焦点画像。スケールバーは２０μｍを表す。（ｃ）ｐＡＣＣα及びＳＦ１二重免疫蛍光に対する陰性対照。ＳＦ１（赤色）の有無にかかわらずＤＡＰＩ（青色）、Ａｌｅｘａ５９４、ｐＡＣＣα（緑色）の有無にかかわらずＡｌｅｘａ４８８、及び脳切片におけるマージされた反応性を示す代表的な共焦点画像。スケールバーは２０μｍを表す。（ｄ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶでの静脈内注射２４時間後のＡＲＣ、ＤＭＨ及びＰＶＨ（視野ごとの定量化；４～１２視野）におけるｐＡＣＣα蛍光の定量。データを平均±ＳＥＭとして表した。統計的有意性は両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図12】中枢組織及び末梢組織に対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置の効果の図である。（ａ）対照（非ロード、ｎ＝６～７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝７マウス／群）ｓＥＶによる静脈内注射２８日後の皮質、視床及び小脳におけるｐＡＣＣα／ＡＣＣαレベルの定量化を、対照の％で表したもの。（ｂ）対照（非ロード、ｎ＝６～７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝７マウス／群）ｓＥＶによる静脈内注射２８日後の肝臓、副腎、精巣、ＢＡＴ、心臓及び骨格筋におけるｐＡＣＣα／ＡＣＣαレベルの定量化を、対照の％で表したもの。（ｃ）対照（非ロード、ｎ＝５試料／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝５試料／群）ｓＥＶとの２４時間のインキュベーション後の褐色脂肪細胞におけるｐＡＣＣα／ＡＣＣαレベルの定量化を、対照の％で表したもの。（ｄ）対照（非ロード、ｎ＝７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝７マウス／群）ｓＥＶによる静脈内注射２８日後のｎｇ／ｍｌで表される循環テストステロンレベルの定量化。（ｅ）対照（非ロード、ｎ＝７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝７マウス／群）ｓＥＶによる静脈内注射２８日後の精巣におけるステロイド産生酵素（ＳＴＡＲ、ｐ４５０ｓｃｃ及び１７β－ＨＳＤ３）のｍＲＮＡレベルの定量化を、対照の％で表したもの。（ｆ）対照（非ロード、ｎ＝７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝６マウス／群）ｓＥＶによる静脈内注射２８日後のｎｇ／ｍｌで表される循環ＣＯＲＴレベルの定量。（ｇ）対照（非ロード、ｎ＝５マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝６マウス／群）ｓＥＶによる静脈内注射２８日後の副腎におけるステロイド産生酵素（ＳＴＡＲ及びｐ４５０ｓｃｃ）のｍＲＮＡレベルの定量化を、対照の％で表したもの。（ｈ）対照（非ロード、ｎ＝６マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝６マウス／群）ｓＥＶによる静脈内注射２８日後のｎｇ／ｍｌで表される循環ＬＨレベルの定量。（ｉ）対照（非ロード、ｎ＝６マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝７マウス／群）ｓＥＶによる２８日間の静脈内注射後の下垂体におけるＬＨβサブユニットのｍＲＮＡレベルの定量化を、対照の％で表したもの。（ｊ）０日目の対照（非ロード、ｎ＝５～６マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ（ｎ＝４～５マウス／群）ｓＥＶの尾静脈への単回注射の１、２、３及び７日後のＢＡＴ ＵＣＰ１レベルの定量。値は対照の％で表す。データを平均±ＳＥＭとして表した。対照に対して＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図13】循環パラメータ及び血行動態パラメータに対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶによる全身処置の効果の図である。（ａ～ｉ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶでの２８日間の静脈内注射後の循環レプチン（ａ）、ＧＤＦ１５（ｂ）、ＩＬ－６（ｃ）、ＩＰ－１０（ｄ）、トリグリセリド（ｅ）、コレステロール（ｆ）、ＮＥＦＡ（ｇ）、ＡＳＴ（ｈ）及びＡＬＴ（ｉ）の定量。（ｎ＝５～１３マウス／群）。（ｊ－ｍ）対照（非ロード）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶでの静脈内注射２４時間後の心拍数（ｊ、ｎ＝６マウス／群）、収縮期動脈圧（ｋ、ｎ＝６マウス／群）、拡張期動脈圧（ｌ、ｎ＝６マウス／群）及び平均動脈圧（ｍ、ｎ＝６マウス／群）の定量化。データを平均±ＳＥＭとして表した。統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。

【図14】ＢＡＴ及び骨格筋熱産生マーカに対するＳＦ１－ＡＭＰＫα １－ＤＮ ｓＥＶによる全身処置の効果。（ａ）対照（非ロード、ｎ＝７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝７マウス／群）ｓＥＶによる静脈内注射２８日後のＢＡＴにおけるＵＣＰ１タンパク質レベルの定量化。（ｂ）対照（非ロード、ｎ＝６～７マウス／群）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝６～７マウス／群）ｓＥＶでの静脈内注射２８日後の骨格筋における熱産生マーカ（Ｕｃｐ３、Ｇｐｄ２、ＰＰａｒγ、Ｓｌｎ、Ｒｙｒ１、Ａｔｐ２ａ２）のｍＲＮＡレベルの定量化を、対照の％で表したもの。データを平均±ＳＥＭとして表した。対照に対して＊、＊＊Ｐ＜０．０５ 統計的有意性は、スチューデントｔ検定によって評価した。

【図15】ｄｂ／ｄｂマウスにおけるエネルギーバランスに対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置の効果の図である。対照（非ロード；ｎ＝８野生型マウス；ｎ＝８ｄｂ／ｄｂマウス）又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロード（ｎ＝７野生型；ｎ＝７ｄｂ／ｄｂマウス）ｓＥＶで静脈内処置した野生型マウス及びｄｂ／ｄｂマウスの、（Ａ～Ｂ）体重；（Ｃ～Ｄ）体重変化；（Ｅ～Ｈ）毎日及び累積食物摂取量；（Ｉ及びＫ）脂肪量及び（Ｊ及びＬ）血清トリグリセリドレベル。データをＭＥＡＮ±ＳＥＭとして表す。統計学的有意性は、混合効果分析（Ａ～Ｄ）又は両側スチューデントｔ検定（Ｅ～Ｌ）によって決定した。＊対照に対してＰ＜０．０５。

【図16】ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＢＡＴ熱産生及びＷＡＴ褐色化に対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置の効果の図である。対照又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを静脈内注射した野生型マウス及びｄｂ／ｄｂマウスの、（Ａ～Ｂ）代表的なｐＡＣＣα及びＡＣＣαウェスタンブロット画像並びにＶＭＨにおけるレベル（ｎ＝７マウス／群）；（Ｃ－Ｄ）代表的なＢＡＴサーモグラフィ画像及びＢＡＴ温度（１４日目；ｎ＝７～８マウス／群）；（Ｅ～Ｆ）代表的なＵＣＰ１ウェスタンブロット画像及びＢＡＴにおけるレベル（ｎ＝６マウス／群）；（Ｇ～Ｈ）代表的ＢＡＴ ＵＣＰ１染色及びレベル（ｎ＝７～８マウス／群）並びに（Ｉ～Ｊ）代表的ｓＷＡＴ ＵＣＰ１染色及びレベル（ｎ＝７～８マウス／群）。ウェスタンブロット分析（Ａ～Ｂ及びＥ～Ｆ）では、β－アクチン（ＶＭＨ中；図示せず）及びα－チューブリン（ＢＡＴ中）をタンパク質ロードの対照として使用した。試料を同じゲルにロードしたが、並んでいなかった場合、黒い線を免疫ブロットに挿入した。データをＭＥＡＮ±ＳＥＭとして表す。統計的有意性は、片側スチューデントｔ検定を使用したｄｂ／ｄｂマウスにおけるＢＡＴの温度（Ｄ）を除いて、両側スチューデントｔ検定によって決定した。対照に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。

【発明を実施するための形態】

【0008】

発明の詳細な説明
本発明は、ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団を提供し、ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１、３９又は４１からなり、当該ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、作動可能に連結され、配列番号３と少なくとも９８％、好ましくは１００％の配列同一性を有するステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にあり、ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をそれらの外膜で発現するように操作されている。

【0009】

好ましくは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む融合タンパク質は、配列番号５、又は配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0010】

好ましくは、ｓＥＶの集団は、食餌誘発性肥満症及び／又は遺伝性肥満症等の肥満症の処置又は予防に使用するためのものである。好ましくは、遺伝性肥満症はレプチン受容体（ＬＥＰＲ）欠乏誘導性肥満症である。

【0011】

好ましくは、ｓＥＶの集団は、肥満症の処置のウォッシュアウト後のリバウンド効果の改善又は減少に使用するためのものであり、好ましくは、リバウンド効果の当該改善又は減少は、処置のウォッシュアウトの少なくとも５日後に測定される。

【0012】

好ましくは、当該小型細胞外小胞の投与は、全身、好ましくは静脈内である。

【0013】

本発明は更に、全身投与された場合に、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するＳＦ１発現ニューロンにおけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化レベルを、未処置のＳＦ１発現細胞におけるＡＭＰＫ活性に対する効果の欠如と比較して有意に低下させることができる小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団を提供し、当該低下は、他のＳＦ１発現組織、例えば非ニューロン組織／器官において有意に低下せず、好ましくは副腎、精巣又は脳下垂体からなるリストから選択され、当該小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団は、ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１、３９又は４１からなり、当該ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、作動可能に連結され、配列番号３と少なくとも９８％、好ましくは１００％の配列同一性を有するステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にあり、ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をそれらの外膜に発現するように操作されており、当該集団は、肥満症の処置を必要とする対象において、好ましくは全身投与経路を介して、肥満症の処置に使用するためのものである。

【0014】

好ましくは、ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号２からなる。好ましくは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む融合タンパク質は、配列番号５、又は配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0015】

好ましくは、使用は、肥満症の処置のウォッシュアウト後のリバウンド効果の改善又は減少であり、リバウンド効果の当該改善又は減少は、処置のウォッシュアウトの少なくとも５日後に測定される。好ましくは、処置は、肥満症を回復又は改善することを含む。

【0016】

好ましくは、小型細胞外小胞は、３０～１５０ｎｍのサイズ分布を有する。好ましくは、ｓＥＶは、ＧＲＰ９４マーカを欠くことを特徴とする。好ましくは、ｓＥＶは、成熟抗原提示細胞におけるＴ細胞活性化因子分子の発現と比較して、少なくとも１つの当該Ｔ細胞活性化因子分子の統計的に有意な発現低下を有することを特徴とする未成熟抗原提示細胞から産生又は得られる。好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞、好ましくはＪＡＷＳＩＩ細胞株であり、少なくとも１つのＴ細胞活性化因子分子は、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）、分化抗原群８０（ＣＤ８０）若しくは分化抗原群８６（ＣＤ８６）、又はそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上のＴ細胞活性化因子分子である。

【0017】

好ましくは、ｓＥＶはエキソソームである。

【0018】

一般的な定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別のことを明らかに示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されるべきである。更に、別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の要素の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明に包含されることが意図される。

【0019】

所与の量又は含量に関して「約」という用語は、±１０パーセントの偏差を含むことを意味する。

【0020】

本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素間の連言用語「及び／又は」は、個々の選択肢と組み合わせた選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって結合される場合、第１の選択肢は、第２の要素を伴わない第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素なしの第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素を一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のいずれか１つは、その意味の範囲内にあり、したがって、本明細書で使用される「及び／又は」という用語の要件を満たすと理解される。２つ以上の選択肢の同時適用性も、その意味の範囲内に含まれ、したがって「及び／又は」という用語の要件を満たすと理解される。

【0021】

本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外しないことを意味すると理解される。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語で置き換えることができ、又は時には、本明細書で使用される場合、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語で置き換えることができる。前述の用語（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｈａｖｉｎｇ）のいずれも、本発明の態様又は実施形態の文脈において本明細書で使用される場合はいつでも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語で置き換えることができるが、あまり好ましくない。

【0022】

本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特許請求の範囲の要素で指定されていない要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を排除しない。

【0023】

本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」（ＥＶ）という用語は、生細胞から細胞外環境に放出された脂質二重層結合小胞を指す。これらの小胞は機能的核を欠き、複製することができない。従来、ＥＶは、それらの特徴及び生合成経路に関して２つの主要なサブタイプ：エクトソーム及び小型細胞外小胞（ｓＥＶ）に大別することができる。エクトソームは、１００ｎｍ～１０００ｎｍのサイズ分布を有し、細胞質膜出芽によって生成される。エキソソームが含まれるｓＥＶは、直径がより小さく（通常３０～１５０ｎｍ）、多胞体（ＭＶＢ）と原形質膜との融合によって放出される。ｓＥＶの成分は、それらの細胞起源及び潜在的な生物学的機能を示す。本発明との関連において、ｓＥＶ又はエキソソームは、以下に詳細に説明するように、抗原提示細胞において産生されることが好ましい。

【0024】

本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という語句は、本明細書に開示されるｓＥＶの集団の投与から利益を得るであろう対象、例えば哺乳動物対象、好ましくはヒトを含む。それを必要とする対象は、減量しようとしている人、又は減量を必要としている人であり得る。対象は、女性、好ましくはヒト女性であり得る。好ましくは、対象は男性、より好ましくはヒト男性である。より好ましくは、対象は肥満症であるか、又は肥満症の処置を必要としている。「個体」、「患者」又は「対象」という用語は、本出願では互換的に使用され、決して限定することを意味するものではない。「個体」、「患者」又は「対象」は、あらゆる年齢、性別及び身体的状態のものであり得る。

【0025】

「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）若しくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、又はそれらの任意のホスホエステル類似体、例えばホスホロチオエート及びチオエステルを、一本鎖形態又は二本鎖ヘリックスのいずれかで指す。

【0026】

本明細書で使用される場合、「遺伝子」又は「符号化配列」という用語は、遺伝子産物をコードするインビトロ又はインビボのポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの例では、遺伝子は、コード配列、すなわち遺伝子産物をコードする配列からなるか又は本質的になる。

【0027】

本明細書で使用される場合、「ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ」（ＡＭＰＫ）という用語は、細胞エネルギーの恒常性において役割を果たし、主に細胞エネルギーが低い場合にグルコース及び脂肪酸の取込み及び酸化を活性化する酵素を指す。これは高度に保存された真核生物タンパク質ファミリに属する。それは、酵母からヒトまで保存された機能性酵素を一緒に作る３つのタンパク質（サブユニット）からなる。これは、肝臓、脳、及び骨格筋を含む多くの組織で発現される。ＡＭＰ及びＡＤＰの結合に応答して、ＡＭＰＫ活性化の正味の効果は、肝臓脂肪酸酸化の刺激、ケトン生成、骨格筋脂肪酸酸化及びグルコース取込みの刺激、コレステロール合成、脂肪酸合成及びトリグリセリド合成の阻害、脂肪細胞脂質生成の阻害、並びに膵臓ベータ細胞によるインスリン分泌の調節である。ＡＭＰＫは、α、β及びγサブユニットによって形成されるヘテロ三量体タンパク質複合体である。本明細書で使用される場合、「ＡＭＰＫα」は、ＡＭＰＫタンパク質のサブユニットアルファ（α）を指す。その成分のアイソフォームの存在により、哺乳動物には１２種類のＡＭＰＫが存在し、そのそれぞれが異なる組織局在化及び異なる条件下での異なる機能を有し得る。α、β及びγサブユニットはまた、異なるアイソフォーム中に見出され得る：γサブユニットは、γ１、γ２又はγ３アイソフォームのいずれかとして存在し得、βサブユニットは、β１又はβ２アイソフォームのいずれかとして存在し得、αサブユニットは、α１又はα２アイソフォームのいずれかとして存在し得る。本明細書で使用される場合、「ＡＭＰＫα」は、ＡＭＰＫタンパク質のサブユニットαのアイソフォーム１を指す。本明細書で使用される場合、「ドミナントネガティブＡＭＰＫα１変異体タンパク質」（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）という用語は、少なくとも点変異Ｄ１６８Ａでのその活性部位の修飾によるＡＭＰＫα１、好ましくはラットＡＭＰＫα１タンパク質の不活性アイソフォームを指し、アミノ酸位置（１６８）は、野生型ラットＡＭＰＫａ１配列、好ましくは配列番号４０の野生型ラットＡＭＰＫａ１配列に関して発現される。本発明の文脈において、「ＡＭＰＫα１－ＤＮ」は、野生型ラットＡＭＰＫａ１配列、好ましくは配列番号４０の野生型ラットＡＭＰＫａ１配列に関して少なくとも点変異Ｄ１６８でその活性部位を修飾することによるＡＭＰＫα１、好ましくはラットＡＭＰＫα１タンパク質の不活性アイソフォームを指し、ＡＭＰＫα１－ＤＮタンパク質の配列は、ラットＡＭＰＫα１タンパク質の配列（実施例に示すように）、又はＡＭＰＫα１タンパク質のヒト相同、又はヒトにおける処置のためのヒト化若しくはコドン最適化ＡＭＰＫα１タンパク質等の、処置が適用される種に対応するラットＡＭＰＫα１タンパク質の相同配列であり得る。あるいは、ラットＡＭＰＫα１－ＤＮは、マウス（Ｓｅｏａｎｅ－Ｃｏｌｌａｚｏ ｅｔ ａｌ，２０１８，ＳＦ１－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡＭＰＫα１ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｉｅｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１８ Ｎｏｖ；６７（１１）：２２１３－２２２６を参照されたい）及びヒト細胞（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭＰ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０００）３４５，４３７－４４３）等の他の動物において有効であったことが示されているので、ＡＭＰＫα１タンパク質のラット配列を使用して、ヒト等の他の種を処置することができる。ＡＭＰＫヒト配列を使用する場合、配列は、他の点変異、例えばＴ１７２Ａ変異もまた又は代替で含み得る。

【0028】

本明細書で使用される場合、「核内受容体ステロイド産生因子－１（ＳＦ－１）」という用語は、腹内側核ニューロン集団の最終分化及び維持に不可欠な転写因子を指す。

【0029】

本明細書で使用される場合、「ＳＦ１発現細胞又は組織」という用語は、ＳＦ１転写因子を発現することができる細胞又は組織を指す。好ましくは、ＳＦ１発現細胞は、ＶＭＨ領域に位置するＳＦ１発現ニューロンである。

【0030】

視床下部は、とりわけエネルギー代謝の調節に関与する弓状核（ＡＲＣ）、腹内側核（ＶＭＨ）、室傍核（ＰＶＨ）、外側視床下部（ＬＨＡ）及び背内側核（ＤＭＨ）を含む解剖学的に異なる相互接続された視床下部核に組織化される。したがって、本明細書で使用される場合、「視床下部腹内側核」（ＶＭＨ）という用語は、視床下部領域を指す。ＶＭＨ領域は、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）熱産生を介して摂食行動及びエネルギー消費調節に関与することが知られている。ＶＭＨは、軸索投射を介して他の核に関連する。

【0031】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される希釈剤」とは、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を意味する。薬学的に有効な物質に対するそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。許容され得る担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、本発明の範囲を限定するものではないが、以下が含まれる：追加の緩衝剤；防腐剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ポリエステル等の生分解性ポリマー；ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、及びトレオニン等のアミノ酸；ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ｍｙｏ－イニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ｍｙｏ－イニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等の有機糖又は糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［α］－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質；並びにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー。

【0032】

タンパク質又はポリペプチド配列のアミノ酸残基の位置又は部位は、好ましくは、第１のアミノ酸残基から順に番号付けされ、第１のアミノ酸残基はその後、位置１に位置する。例えば、１３７アミノ酸のタンパク質は、１３７（最後のアミノ酸残基）まで１（第１のアミノ酸残基）の番号が付けられた残基を有する。好ましくは、第１の位置又は位置番号１は、窒素原子又は遊離アミノ基を有するポリペプチド鎖の５プライム（５’）末端に位置する第１のアミノ酸残基に対応する。したがって、番号付けは、好ましくは、タンパク質又はポリペプチドのＮ末端又は５’末端の第１のアミノ酸残基から始まり、タンパク質又はポリペプチドの３’末端又はＣ末端で終わる。好ましくは、アミノ酸残基の位置は、翻訳された成熟タンパク質のアミノ酸配列を使用して番号付けされる。

【0033】

２つ以上のヌクレオチド配列、ポリペプチド配列又はタンパク質配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性パーセント」という用語は、配列比較アルゴリズム、好ましくはＢＬＡＳＴアラインメントツールを使用して、又は代替的に目視検査によって測定して、比較し、第２の分子と最大に対応するように整列させた場合に、同じである（「同一である」）か、又は同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の指定されたパーセンテージを有する（「同一性パーセント」）２つ以上の配列又は部分配列を指す。「配列同一性」又は「同一性パーセント」は、核酸、ポリペプチド又はタンパク質中の同じ位置の同一のヌクレオチド又はアミノ酸の数を計算することによって決定することができる。同一性パーセントの計算は、２つ以上の配列間の最適なアラインメントの決定を含む。アラインメントは、限定されないが、核酸の非コード領域及びポリペプチド配列の切断又は伸長等、試験される配列のそれぞれにおける挿入及び欠失（すなわち、「ギャップ」）を考慮に入れることができる。Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）等のコンピュータプログラム及びアルゴリズムを使用して、同一性パーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴは、米国国立バイオテクノロジー情報センターによって提供される多くのリソースの１つである。遺伝暗号は縮重であり、２つ以上のコドンが所与のアミノ酸をコードすることができるので、核酸が同一のポリペプチドをコードする場合、核酸のコード領域は同一であると考えられる。したがって、同一性パーセントは、核酸によってコードされるポリペプチドに基づいて計算することもできる。同一性パーセントは、完全長コンセンサスゲノム配列に基づいて、又はゲノム配列の一部に基づいて、例えば、限定されないが、個々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に基づいて計算することができる。

【0034】

本明細書に記載のタンパク質又はポリペプチドに関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照配列（すなわち、それが由来するタンパク質又はポリペプチド）中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、ＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技能の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

【0035】

好ましくは、本明細書で使用される「同一性のパーセント」は、局所的なアラインメントの文脈で決定され、すなわち、２つの配列をそれらの全スパンにわたってアラインメントすることを目的とする全体的なアラインメントとは対照的に、核酸塩基配列間の局所的な類似性の領域のアラインメントに基づく。したがって、本発明の文脈において、同一性パーセントは、好ましくは局所アラインメント比較アルゴリズムのみに基づいて計算される。

【0036】

説明
この研究の目的は、ＳＦ１ニューロンにおける視床下部ＡＭＰＫの活性を特異的に低下させることによって、肥満症を処置又は予防するための新しい戦略を開発することである。この目的のために、本発明者らは、ドミナントネガティブＡＭＰＫα１変異体（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）をコードするプラスミドの担体として小型細胞外小胞（ｓＥＶ）を使用した。ｓＥＶは、多小胞体に由来し、標的細胞の表現型及び機能を改変することができるタンパク質、脂質、及び遺伝情報を含み、これにより、それらが生理学及び病態生理学において重要な役割を果たすことが可能になる。視床下部ＳＦ１発現ニューロンにおいてのみこのＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体の発現に特異性を付与するために、ＳＦ１プロモータを使用してその発現を駆動した。特に、任意の侵襲的な頭蓋手術／手順を回避するために、この研究の目的はまた、全身投与経路を使用して視床下部ＳＦ１ニューロン内のＡＭＰＫを特異的に標的とし、それらを潜在的な治療的使用のために手に入れやすくすることであった。

【0037】

したがって、本発明は、肥満症の処置又は予防に使用するために全身投与されるＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを提供する。未成熟樹状細胞を使用して大量のｓＥＶを生成した。産生されたｓＥＶに神経標的化能力を付与するために、未成熟樹状細胞を遺伝子改変して、（ｉ）ｓＥＶ膜で高発現するタンパク質であるリソソーム関連膜タンパク質２ｂ（Ｌａｍｐ２ｂ）から構成され、（ｉｉ）ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）への結合を介して血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を可能にする神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）由来の特定の糖タンパク質に融合した、融合タンパク質を一過性に発現させた。

【0038】

この戦略の有効性を試験するために、酵素ＡＭＰＫの主要標的である調節キナーゼであるアセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼα（ｐＡＣＣα）のリン酸化レベルを、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶで処置した肥満症マウスにおいて、中枢投与経路及び全身投与経路を介して測定した。結果は、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶが摂食非依存性体重減少を誘導することを実証した。視床下部抽出物中のＡＭＰＫ阻害の程度を制御するために使用されるｐＡＣＣαのレベルもまた、ＶＭＨ領域で特異的に低下したが、ＡＲＣ又はＬＨＡ領域では低下せず、これはＢＡＴ熱産生の増加に関連していた（図２）。全身投与すると、導入遺伝子はＶＭＨ試料でのみ検出されたが、ＳＦ１を発現する器官（すなわち、副腎、下垂体及び精巣）又はＳＦ１を発現しない器官（すなわち、ＢＡＴ、肝臓、骨格筋及び心臓）を含む他の評価器官のいずれにも検出されず（図３ａ）、この処置の効果が神経細胞、特に、ＶＭＨのＳＦ１発現ニューロンに限定されることを示し、この戦略が非常に特異的であることを実証している。更に、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶは、ＶＭＨにおけるＡＣＣαのリン酸化及びＡＭＰＫ活性のレベルの有意な減少を誘導した（図３）。

【0039】

更に、本発明者らは、肥満症マウスにおけるｓＥＶによる処置がリバウンド効果、すなわち対照マウスの体重に追いつくための体重減少の迅速な回復を有するかどうかを研究した。図４は、処置を中止した場合にｓＥＶの効果が持続したことを示す。ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで処置したマウスは、対照ｓＥＶで処置したマウスと比較した場合、注射を中止した（ウォッシュアウト）２週間後まで体重の回復を示さなかった。これは、体重減少が一過性ではなく、ウォッシュアウト期間が処置マウスにおけるリバウンド効果を暗示しないことを示す。

【0040】

まとめると、これらのデータは、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体ロードＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶが、体重減少を誘導するために特定のＳＦ１発現ニューロンにおけるＡＭＰＫ活性を特異的に下方制御又は阻害するのに適していることを支持し、したがって、ｓＥＶは、肥満症を処置又は予防するための潜在的な治療戦略を表す。

【0041】

第１の態様では、本発明は、肥満症の処置又は予防を必要とする対象における肥満症の処置又は予防に使用するための小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団の全身投与に関する。特に、第１の態様では、本発明は、肥満症の処置又は予防を必要とする対象における肥満症の処置又は予防に使用するためのｓＥＶの集団の全身投与に関し、ｓＥＶは、作動可能に連結され、ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にある、ＡＭＰＫタンパク質、好ましくはＡＭＰＫα、好ましくはＡＭＰＫα１、最も好ましくはＡＭＰＫα１－ＤＮ（ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１変異体）タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂ（Ｌａｍｐ２ｂ）に融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をそれらの外膜において好ましくは一過性に発現するように操作される。コード配列及び遺伝子発現制御配列又はプロモータは、コード配列の発現又は転写及び／又は翻訳を遺伝子発現制御配列の影響又は制御下に置くような方法で連結されている場合、作動可能に連結されていると言われる。例えば、ドミナントネガティブＡＭＰＫα１変異体タンパク質（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）は、ＡＭＰＫα１－ＤＮの発現レベルがＳＦ１プロモータによって調節されるように、ＳＦ１プロモータに作動可能に連結される。一実施形態では、肥満症は、食餌誘発性肥満症及び／又は遺伝性肥満症である。一実施形態では、肥満症は遺伝性肥満症、好ましくはレプチン受容体（ＬＥＰＲ）欠乏誘導性肥満症である。

【0042】

好ましくは、ｓＥＶの集団はエキソソームである。一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームの集団は実質的に純粋な集団である。好ましくは、ｓＥＶ又はエキソソームを単離する。本発明の文脈において、「単離」という用語は、ｓＥＶ若しくはエキソソーム又はその集団が、それらが産生された環境又は細胞培養物内にないことを示す。ｓＥＶ若しくはエキソソーム又はその集団は、周囲環境又は細胞培養から実質的に分離されている。いくつかの実施形態では、集団は実質的に純粋であるか、又はｓＥＶ若しくはエキソソームが豊富であり、ｓＥＶ若しくはエキソソームの少なくとも約５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は１００％を含む。一実施形態では、集団はｓＥＶ又はエキソソームにおいて純粋である。それらは、他の細胞と通信する手段として多くの細胞型によって放出され、したがって細胞内容物が集団から除去される可能性がある。細胞外小胞のカーゴには、それらが由来する細胞のタンパク質、脂質、核酸及び膜受容体が含まれる。単離されたという用語はまた、環境又は細胞培養物から、例えばそれらが由来する上清又はコンディショニング培地から除去されたｓＥＶ又はエキソソームの集団を包含する。

【0043】

一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームは球形又は円形である。更に、ｓＥＶ又はエキソソームは、２ｎｍを超えるサイズを有し得る。ｓＥＶ又はエキソソームは、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ又は１６０ｎｍを超えるサイズを有し得る。エキソソームは、実質的に１６０ｎｍ以上のサイズを有し得る。ｓＥＶ又はエキソソームは、３０ｎｍ～５０ｎｍ、３０ｎｍ～１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ～１５０ｎｍ又は３０ｎｍ～２００ｎｍ等の範囲のサイズ分布を有し得る。サイズ分布は、様々な手段によって決定され得る。原則として、サイズは、サイズ分画及び関連するサイズカットオフを有する膜を通した濾過によって決定され得る。次いで、ｓＥＶ又はエキソソームのサイズを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで成分タンパク質の分離を追跡することによって、又は生物学的アッセイによって決定することができる。サイズはまた、電子顕微鏡法又はナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって決定され得る。

【0044】

本明細書で提供されるｓＥＶ又はエキソソームの集団は、ＡＭＰＫタンパク質、好ましくはＡＭＰＫα、好ましくはＡＭＰＫα１、最も好ましくはＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質をコードする遺伝子を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むか又はそれをロードされ、当該遺伝子は、作動可能に連結され、ＳＦ１プロモータの制御下にある。好ましくは、集団のｓＥＶのそれぞれに、ＡＭＰＫタンパク質、好ましくはＡＭＰＫα、好ましくはＡＭＰＫα１、最も好ましくはＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質をコードする遺伝子を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドがロードされ、当該遺伝子は、作動可能に連結され、ＳＦ１プロモータの制御下にある。好ましくは、少なくとも１つのポリヌクレオチドはＤＮＡ、より好ましくはプラスミドである。したがって、ＳＦ－１の制御下でＡＭＰＫ－ＤＮをコードするプラスミド（ＳＦ１－ＡＭＰＫ－ＤＮプラスミド）を設計することにより、ＡＭＰＫ－ＤＮを、ＶＭＨに位置するＳＦ１発現ニューロンにおいてのみ発現させることが可能になる。ｓＥＶ又はエキソソームが標的細胞と融合されると、ＡＭＰＫタンパク質、好ましくはＡＭＰＫα、好ましくはＡＭＰＫα１、最も好ましくはＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、標的細胞、好ましくは視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するＳＦ１発現ニューロンである場合にのみ発現される。ｓＥＶに様々なカーゴをロードするために使用される技術には、ｓＥＶ及びリポソームを融合するための自由解凍サイクル、超音波処置、押出、サポニンによる透過化、及びエレクトロポレーションが含まれる。核酸をｓＥＶにロードするためのいくつかの市販のキットが利用可能であり、当業者はそれらに精通しているであろう。好ましくは、少なくとも１つのポリヌクレオチド、好ましくはプラスミドは、主にｓＥＶ又はエキソソームのコアに位置する。

【0045】

一実施形態では、ｓＥＶのポリヌクレオチドに含まれるＡＭＰＫタンパク質、好ましくはＡＭＰＫα、好ましくはＡＭＰＫα１、最も好ましくはＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、少なくとも変異又はアミノ酸置換Ｄ１６８Ａを含み、アミノ酸番号付けは、ラットのＡＭＰＫａ１タンパク質に関して、好ましくは配列番号４０の野生型ラットＡＭＰＫａ１配列に関して表される。一実施形態では、ＡＭＰＫ、ＡＭＰＫα、ＡＭＰＫα１、ＡＭＰＫα１－ＤＮタンパク質のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、げっ歯類、好ましくはマウスの配列である。別の実施形態では、ＡＭＰＫ、ＡＭＰＫα、ＡＭＰＫα１、ＡＭＰＫα１－ＤＮ配列のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、ヒトホモログ配列、又はマウス配列のヒト化若しくはヒトコドン最適化バージョンである。一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームに含まれる少なくとも１つのポリヌクレオチドによってコードされるＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、その全長にわたって配列番号１と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。一実施形態では、ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、配列番号２と、その全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。

【0046】

一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームに含まれる少なくとも１つのポリヌクレオチドにも含まれるステロイド産生因子１（ＳＦ１）ポリヌクレオチド配列は、その全長にわたって、配列番号３と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。

【0047】

一実施形態では、作動可能に連結され、ＳＦ１プロモータの制御下にある、ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、その全長にわたって配列番号４と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。

【0048】

本明細書で提供されるｓＥＶ又はエキソソームは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂ（Ｌａｍｐ２ｂ）に融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含むか又はそれからなる融合タンパク質を、好ましくは主にその外膜に、更に含むか又はそれにロードされ、当該融合タンパク質は、配列番号５と、その全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか又はそれから本質的になる。「融合タンパク質」とは、本明細書では、少なくとも２つのドメインによって形成されるタンパク質を指し、少なくとも２つのドメインは、それらが単一の単位として合成又は翻訳されるように次々に連結されており、したがって融合タンパク質の２つのドメインは、単一のポリペプチドの一部である。この特定の場合において、融合タンパク質を含むか又は融合タンパク質からなるドメインは、ＲＶＧペプチド及びＬａｍｐ２ｂタンパク質である。一実施形態では、融合タンパク質のドメインは、リンカーペプチドによって連結され得る。本明細書で使用される「リンカーペプチド」は、融合タンパク質のドメイン間に位置する短いペプチド配列である。リンカーペプチドは、融合タンパク質に含まれる２つのドメインに運動柔軟性を提供するように配置される。本発明に関連して、リンカーペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくは少なくとも２つの連続するアミノ酸残基、任意選択で３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又は２０個以上のアミノ酸残基を有する。リンカーペプチドは、可撓性リンカー、剛性リンカー、及びインビボ切断可能リンカーを含む。

【0049】

本明細書に記載のｓＥＶ又はエキソソームの集団は、少なくとも１つのＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ融合タンパク質を含むことを特徴とする。その目的のために、参考文献２８（本明細書の例を参照）に以前に記載されたように設計されたもの等のＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧプラスミドを、エキソソーム生成細胞、好ましくはエキソソーム生成未成熟樹状細胞にトランスフェクトして、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合された神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む融合タンパク質を一過性に発現させることができ、好ましくは、そのような融合タンパク質は、配列番号５と、その全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームは、それらを産生するために使用された細胞（以下、産生細胞と呼ばれる）に由来するマーカを更に含む。好ましくは、産生細胞は免疫細胞、より好ましくは抗原提示細胞、更により好ましくは樹状細胞である。好ましくは、産生細胞は哺乳動物細胞である。産生細胞は、初代細胞又は不死化細胞であり得る。一実施形態では、産生細胞は、免疫原性が低い細胞、好ましくは未成熟免疫細胞、好ましくは未成熟抗原提示細胞、最も好ましくは未成熟樹状細胞又は単球である。「未成熟」とは、本明細書では、活性化されていないか、生物学的に活性でないか、又は活性化マーカ若しくは分子を表面に提示しない細胞を指す。未成熟樹状細胞は、成熟樹状細胞とは異なる形態学的表現型を有する。未成熟樹状細胞は、丸い滑らかな表面を有するが、成熟樹状細胞等の成熟細胞は、複数の仮足を有する粗い表面を有する。未成熟樹状細胞は、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８０及びＣＤ８６等のＴ細胞活性化因子を欠く大量のエキソソームを産生する。したがって、一実施形態では、産生細胞、好ましくは未成熟樹状細胞は、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）、分化抗原群８０（ＣＤ８０）若しくは分化抗原群８６（ＣＤ８６）又はそれらの組合せ等の、活性化マーカ、好ましくはＴ細胞活性化因子マーカ又は分子を発現しない。一実施形態では、産生細胞は、未成熟不死化細胞、好ましくは未成熟不死化樹状細胞又は単球、最も好ましくはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＲＬ－１１９４；ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡに由来するＪＡＷＳ ＩＩ細胞株、又は当該ＪＡＷＳ ＩＩ細胞株に由来する細胞である。また、好ましくは、産生細胞は、好ましくはその外膜においてＲＶＧ－Ｌａｍｐ２ｂ融合タンパク質を発現する遺伝子改変細胞である。一実施形態では、産生細胞は、成熟抗原提示細胞における当該Ｔ細胞活性化因子分子の発現と比較して、少なくとも１つのＴ細胞活性化因子分子の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の統計学的に有意な発現低下を有することを特徴とする未成熟抗原提示細胞である。当該Ｔ細胞活性化因子分子の減少率は、当技術分野で公知の技術によって、例えばフローサイトメトリ又はＲＴ－ＰＣＲによって測定することができる。

【0050】

産生細胞を馴化培地中で増殖させ、ｓＥＶ又はエキソソームを産生し、当該培地に放出する。本発明の文脈において、「馴化培地」という用語は、細胞培養物の上清として理解される。ｓＥＶ又はエキソソームの集団は、細胞内多小胞体が産生細胞の原形質膜と融合すると細胞外培地に放出されるので、ｓＥＶ又はエキソソーム外膜は産生細胞の１つと同様である。したがって、一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームの集団は、細胞マーカ、好ましくは細胞未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）マーカについて陽性である。更に好ましくは、ｓＥＶ又はエキソソームの集団は、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９若しくはＣＤ８１、又はそれらの任意の組合せからなる群より選択される特異的エキソソームマーカの１つ以上を含む。別の実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームは、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６若しくはＧＲＰ９４マーカ、又はそれらの任意の組合せを欠くことを特徴とする。一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームは未成熟表現型を有するので、それらは免疫原性が低い。

【0051】

好ましい実施形態では、第１の態様又はその実施形態のいずれかによる集団は、肥満症の処置又は予防を必要とする対象における肥満症の処置又は予防に使用するための未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）由来ｓＥＶ又はエキソソームの実質的に純粋な集団を含み、ｉＤＣ由来ｓＥＶ又はエキソソーム、好ましくはｉＤＣ由来ｓＥＶ又はエキソソームのそれぞれは、作動可能に連結され、ＳＦ１プロモータの制御下にある、ＡＭＰＫタンパク質、好ましくはＡＭＰＫα、好ましくはＡＭＰＫα１、最も好ましくはＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、ｉＤＣ由来ｓＥＶ又はｉＤＣ由来エキソソームは、Ｌａｍｐ２ｂに融合したＲＶＧペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をその外膜に一過性に発現するように操作される。

【0052】

上記のように、結果は、本明細書に記載のｓＥＶ又はエキソソームの集団が、ＶＭＨに位置するＳＦ１発現ニューロンにおけるｐＡＣＣαのリン酸化レベル及び／又はＡＭＰＫの活性化レベルを減少又は低下させることができるという証拠を提供する。更に、本発明は、本明細書に開示される処置の顕著な特異性を示し、ｐＡＣＣαのリン酸化レベルを他の組織で評価した場合、ｐＡＣＣαレベルは、ＡＲＣ、ＤＭＨ及びＰＶＨ等の隣接視床下部核においても（図１１）、他の脳領域においても（皮質、視床、小脳、図１２Ａ）低下しないことが見出された。これは、これらの脳領域におけるＡＭＰＫの活性化レベルが処置によって改変されなかったことを示す。更に、脳外の他の組織における処置の影響を調査し、全身処置が精巣、副腎及び下垂体機能等の他の生物学的プロセスにどのように影響を及ぼし得るかを解明するために、対照及びＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで処置したマウスの精巣及び副腎におけるテストステロン及びコルチコステロン（ＣＯＲＴ）の循環レベル並びに重要なステロイド産生酵素のｍＲＮＡ発現を分析した。データは、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶでの処置がこれらのパラメータのいずれにおいても有意な変化を誘導しなかったことを示した（図１２ｄ及び図１２ｅ）。同様に、下垂体産生がＳＦ１によって調節されることが知られている黄体形成ホルモンの循環レベル（ＬＨ；図１２ｈ）又はＬＨβサブユニットのｍＲＮＡレベル（図１２ｉ）のいずれにも変化は見られなかった。全体として、これらの結果は、他の組織（下垂体、精巣及び副腎等のＳＦ１を発現するものを含む）におけるＡＭＰＫシグナル伝達の鈍化に対する潜在的な副作用がおそらく無視できることを示唆しており、当該組織におけるＡＭＰＫの活性化レベルが処置によって影響又は改変されなかったことを確認しており、処置が有効であるだけでなく、安全かつ非常に特異的であることを示している。したがって、本明細書で提供される処置の安全なプロファイル及び高い特異性は、肥満症の処置におけるその治療的使用を保証する。安全なプロファイル及び高い特異性は、以下の実施例に示すように、この種の投与が局所（脳）投与よりも侵襲性が低いため、本明細書に記載のｓＥＶの全身投与に関連するが、処置は非常に特異的であるため、ＡＭＰＫシグナル伝達の減少は標的組織（脳のＶＭＨ領域に位置するＳＦ１発現ニューロン）にのみ存在するため、標的外効果は見られない。

【0053】

これを考慮して、好ましい実施形態では、第１の態様又はその実施形態のいずれかによる肥満症の処置に使用するためのｓＥＶの集団は、全身投与された場合、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するＳＦ１発現ニューロンにおけるＡＭＰＫ、好ましくはＡＭＰＫａ１の活性化レベルを、未処置ＳＦ１発現細胞、好ましくは未処置ＳＦ１発現ニューロンにおけるＡＭＰＫ、好ましくはＡＭＰＫａ１の活性化レベルと比較して有意に減少させることができ、当該減少は、他のＳＦ１発現細胞及び／又は組織、好ましくは非神経組織／器官、より好ましくは副腎、精巣、又は脳下垂体からなるリストから選択されるものにおいて統計的に有意ではない。したがって、ＡＭＰＫ阻害の結果として、外因性ＡＭＰＫａ１－ＤＮアイソフォームはキナーゼ活性を欠き、したがってＡＭＰＫヘテロ三量体（α、β、γ；この場合、好ましくはα１）は適切に調節され得ず、下流の標的に対してそのリン酸化効果を発揮し得ない。「ＡＭＰＫ阻害」とは、本明細書ではＡＭＰＫ活性化レベルの減少と呼ばれる。

【0054】

一実施形態では、処置の特異性を示す他のＳＦ１発現細胞及び／又は組織の統計的に有意な減少の非存在は、女性における精巣の非存在の場合等、対象における当該ＳＦ１発現細胞及び／又は組織の非存在に起因し得る、並びに／あるいは当該細胞／組織の存在にもかかわらず、処置がそれらに影響を与えていないことに起因し得る。

【0055】

本明細書で提供される処置の安全性及び有効性を試験するために、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するＳＦ１発現ニューロンのＡＭＰＫの活性化レベルを直接測定することに加えて、当該活性化レベルの減少を示す他の代用マーカを更に使用できることに留意されたい。例えば、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼα（ｐＡＣＣα）のリン酸化レベルは、処置の有効性又は安全性の指標として使用することができる。したがって、一実施形態では、第１の態様又はその実施形態のいずれかによる全身経路を介した肥満症の処置に使用するためのｓＥＶの集団は、全身投与された場合、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するＳＦ１発現ニューロン中のｐＡＣＣαのリン酸化レベルを、未処置のＳＦ１発現細胞、好ましくはＳＦ１発現ニューロン中のｐＡＣＣαのリン酸化レベルと比較して有意に減少させることができ、当該減少は、他のＳＦ１発現細胞及び／又は組織、好ましくは副腎、精巣、又は脳下垂体からなるリストから選択される細胞及び／又は組織では統計的に有意ではない。

【0056】

「統計的に有意」又は「有意」とは、本明細書では、データの結果が偶然のみでは説明できないという分析者による判定と呼ばれる。統計的仮説検定は、当業者がこの決定を行う方法である。この試験はｐ値を提供し、これは、結果が真に偶然のみによるものであると仮定して、データの結果ほど極端な結果を観察する確率である。０．１以下（好ましくは０．０５、０．０１、０．００１以下）のｐ値は、本明細書では統計的に有意であると考えられる。例えば、ＶＭＨに位置するＤＦ発現ニューロンにおけるｐＡＣＣαレベル又はＡＭＰＫタンパク質の活性化レベルの減少は、ＶＭＨに位置する処置されたＳＦ１発現ニューロンを未処置のＳＦ１発現細胞又はニューロンと比較するために統計学的検定を実施した場合の統計学的に有意な低下又は減少であり、当該統計学的検定の結果として得られるｐ値は、０．１以下、好ましくは０．０５、０．０１、０．００１以下である。

【0057】

本明細書では、「減少」又は「増加」とは、参照細胞又は値又は参照組織と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のそれぞれ低下又は上昇を指す。好ましくは、増加は、参照細胞又は値又は参照組織に対して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０倍の増加である。「参照細胞又は組織」とは、本明細書では、本明細書に記載のエキソソームのｓＥＶで処置されていない細胞又は組織を指す。好ましくは、当該細胞又は組織は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、好ましくはニューロン、又は中枢神経系、好ましくはＶＭＨ領域からの細胞又は組織である。参照細胞はまた、任意のＳＦ１発現細胞、好ましくは視床下部、好ましくはＶＭＨ領域に位置するＳＦ１発現ニューロンであり得る。参照細胞はまた、単一の細胞、又は同じ対象若しくは対象の集団に由来する細胞の集団であり得る。参照細胞はまた、肥満症に罹患していない対象からの細胞、好ましくはＳＦ１発現細胞であり得る。「参照値」とは、本明細書では、パラメータ、例えば未処置細胞又は参照細胞におけるｐＡＣＣαのレベル又はＡＭＰＫタンパク質の活性レベルの平均的な既知の正確な測定値を指す。参照値は、より正確な測定機器からの反復測定の平均である。当業者は、当該参照値を得る方法を知っているであろう。

【0058】

好ましくは、ＳＦ１発現細胞は、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するニューロンである。リン酸化又は酵素活性のレベルは、「絶対的」定量又は「相対的」若しくは比較定量によって発現又は測定され得、それらは、適切な技術を使用して当業者によって計算することができる。ｐＡＣＣαのリン酸化レベルを測定するために使用される方法又は技術としては、限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリ、キナーゼ活性アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び抗体アレイ、質量分析（ＭＳ）が挙げられる。ＡＭＰＫタンパク質の活性レベルを測定するために使用される方法又は技術には、光学的、磁気共鳴及び核イメージング法（蛍光に基づく方法、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕザイモグラフィ、磁気共鳴に基づく方法）、質量分析に基づく方法、サンプリングに基づく方法（微小透析、電気浸透に基づく方法）、及び酵素活性測定法が含まれるが、これらに限定されない。

【0059】

上で説明したように、及び図４に示すように、本明細書に記載のｓＥＶで処置したマウスは、体重の著しい長期減少を示し、食物摂取量に変化はなかった。注目すべきことに、処置を中止した場合、ｓＥＶの効果は持続し、対照ｓＥＶで処置した対照マウスと比較した場合、処置を中止した後（ウォッシュアウト）、処置マウスは体重の取戻しを示さなかったことを表した。全体として、これらのデータは、ＲＶＧ－Ｌａｍｐ２ｂ融合タンパク質を含むＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの集団によって誘導される体重減少が一過性ではなく、処置ウォッシュアウトが、処置マウスを未処置マウスの体重に到達させるリバウンド効果をもたらさないことを示している。このデータは、本明細書に開示される処置が、処置のウォッシュアウト又は中止の間及び／又は後にリバウンド効果の改善又は減少を更に提供するという考えを支持する。「改善する」とは、本明細書では、患者の状態の改善、又は患者の状態に関連して耐えることが困難な状態を矯正する、又は少なくともより許容可能な状態にする努力をする活性を指す。特に、状態は、肥満症である。「リバウンド効果」とは、本明細書では、処置の効果（ｓＥＶ又はエキソソームの集団）が過ぎたとき、又は患者がもはやそれに応答していないときの産生陰性症状と呼ばれる。リバウンド効果の例のモードとして、Ｋａｗａｓｈｉｍａ（２０１９，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｈｙｓ．２０１９．０１４８３）による論文の図３を参照すると、高脂肪食の最初のサイクルの４０日間後に、処置マウスが対照マウスよりも有意に重かったことが観察される。したがって、「リバウンド効果」とは、本明細書では、基礎体重を処置なしの対象の体重と理解して、対象の基礎体重の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％又はそれを超える増加を意味する。

【0060】

好ましくは、リバウンド効果の減少又は改善は、処置ウォッシュアウト中又は処置ウォッシュアウト後の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９０日を超えて測定される。好ましくは、リバウンド効果の低下又は改善は、処置ウォッシュアウト中又は処置ウォッシュアウト後少なくとも５～１５、５～２０、５～３０、又は５～４０日の間に測定される。

【0061】

したがって、一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームの集団は、全身投与された場合、処置なし、処置のウォッシュアウト又は中止の間及び／又は後に、対象の基礎体重の少なくとも１５％～２０％の増加として好ましくは測定される、リバウンド効果を有意に減少又は改善することができる。一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームの集団は、全身投与された場合、肥満症又はその症状を有意に回復又は改善することができる。

【0062】

いくつかの実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームは、処置される対象の自己細胞から産生されるか、又は処置される対象から単離された細胞から得られた。他の実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームは、処置される対象に対する同種細胞から産生されるか、又は処置される対象以外のドナーから単離された細胞から得られた。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。特定の実施形態では、細胞は未成熟樹状細胞である。

【0063】

ｓＥＶの調製及び保存並びにそれらの組成
本明細書に記載の集団は、１つ以上の薬学的に許容される担体と共に、上で定義したｓＥＶ又はエキソソームの実質的に純粋な集団の有効量の水中油型エマルジョンを含む。「有効量」は、肥満症又は肥満症処置後のリバウンド効果を低減、改善、処置及び／又は予防するのに十分な量である。有効量は、処置される対象の年齢及び体重、疾患状態がどの程度進行しているか、患者の全般的な健康状態、症状の重症度、及びエマルジョンが単独で又は他の療法と組み合わせて投与されているかどうかを含むいくつかの要因に応じて変化するであろう。

【0064】

担体は、宿主に投与した場合に有害反応（例えば免疫応答）を誘発することなく生物学的に許容されるべきである。適切な薬学的に許容される担体は当技術分野で周知であり、医薬製剤の所望の形態及び投与様式によって異なる。例えば、それらは、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤等の希釈剤又は賦形剤を含み得る。典型的には、担体は、固体、液体若しくは気化性担体、又はそれらの組合せである。各担体は、製剤中の他の成分と適合性であり、対象に有害ではないという意味で「許容される」べきである。

【0065】

集団は、ｓＥＶ又はエキソソームを含有するエマルジョンを含む組成物の一部であり得る。そのようなエマルジョンは、水中油型エマルジョンを含み得る。エマルジョンは、当技術分野で公知の手段によって作製され得る。それらは、新たに調製されたｓＥＶ若しくはエキソソーム、又は凍結乾燥されたｓＥＶ若しくはエキソソーム、又は油中に保存されたｓＥＶ若しくはエキソソームから作製され得る。エマルジョンは、少なくとも２つの不混和性液体、例えば水及び油から構成される不均一系であり、そのうちの１つは、通常、機械的撹拌プロセスによって他の液相全体に微細な液滴として均一に分散される。組成物は、少なくとも１つの乳化剤を更に含んでもよい。乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）（「乳化剤（ｅｍｕｌｇｅｎｔ）」としても知られる）は、その動力学的安定性を増加させることによってエマルジョンを安定化する物質である。

【0066】

ｓＥＶ又はエキソソームは、油中の懸濁液又は分散液として好都合に貯蔵され得る。この目的のために、新たに調製したｓＥＶ又はエキソソーム又は凍結乾燥エキソソームを油に懸濁又は分散させることができる。油は、植物油等の任意の適切な油を含んでもよい。ｓＥＶ又はエキソソームは、例えばオリーブ油、パーム油、大豆油又はヤシ油中に懸濁又は分散され得る。ｓＥＶ又はエキソソームは、任意の適切な割合で油に懸濁又は分散され得る。

【0067】

油中のｓＥＶ又はエキソソームの懸濁液又は分散液は、使用前に、例えば室温で保存することができる。油中のｓＥＶ又はエキソソーム懸濁液又は分散液は、エキソソームが貯蔵期間に続いて又は貯蔵期間後にｓＥＶ又はエキソソームの少なくとも１つの生物学的活性を示すようなものであり得る。生物学的活性は、肥満症処置後の肥満症又はリバウンド効果を矯正する、低下させる、改善する、処置する、予防する等の治療活性を含み得る。生物学的活性は、ドミナントネガティブＡＭＰＫα１タンパク質（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）の存在に由来し得、これはＡＭＰＫ活性及びｐＡＣＣリン酸化を減少させる。生物学的活性は、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼα（ｐＡＣＣα）のリン酸化レベルの低下に由来し得る。ｓＥＶ又はエキソソームは、貯蔵に続いて又は貯蔵後に、上で定義した生物学的活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％を示し得る。

【0068】

一実施形態では、組成物は医薬組成物である。医薬組成物は、好ましくは、約３０～２００ｎｍ、好ましくは３０～１５０ｎｍのサイズを有するｓＥＶエキソソームの集団で濃縮される。ｓＥＶ又はエキソソーム量は、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）又はＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することによって、タンパク質量によって測定することができる。しかし、最適な用量は、既存の毒性及び有効性データを考慮して、投与経路、処置レジメン及び／又は投与スケジュールに従って選択される。好ましい実施形態では、組成物に含まれるｓＥＶ又はエキソソームの実質的に純粋な集団は、毒性作用の非存在下で重量減少又はＢＡＴ増加効果を提供することができる投与量である。

【0069】

更に、当該集団又は組成物又は医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化される。実施例に示されるように、また、上記で論じられるように、投与経路は、全身的又は局所的であり得る。局所投与経路には、脳室内投与又はより好ましくは、個別の視床下部核における特異的定位投与が含まれる。本明細書では、「全身投与経路」とは、組成物の循環系への直接的又は間接的な投与を指す。全身投与は、通常、局所投与よりも安全であるが、十分に許容されない可能性があり、又はオフターゲット効果を引き起こす可能性がある。しかし、本発明は、全身投与された場合の処置の安全性を示し、したがって、これは本明細書で提供される処置のための好ましい投与経路である。全身投与経路は、非経口経路、例えば血管内、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脳室内、硬膜外、又はその他、並びに経口、経鼻、眼、又は直腸を含む。好ましい全身投与経路は血管内であり、本明細書では血管内投与と理解され、典型的には静脈内又は動脈内投与を含む。

【0070】

本発明による集団又は組成物又は医薬組成物を製造する方法は当技術分野で公知であり、それらは場合により、実質的に純粋なｓＥＶ又はエキソソームの集団を特異的に濃縮する工程を含む。このために、一般に、磁性粒子、濾過、透析、超遠心分離、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び／又はクロマトグラフィを含む方法等の、精製及び／又は濃縮のための任意の適切な方法を使用することができる。

【0071】

上で説明したように、本発明の主な目的は、肥満症を処置又は予防するためのｓＥＶの安全で効果的な組織特異的集団を提供することである。本明細書で提供される使用は、短期又は３ヶ月を超える期間として定義される長期であり得る。本明細書で提供される肥満症を処置又は予防するための使用は、副作用及び／又は合併症、特にＳＦ１発現組織におけるＡＭＰＫタンパク質の活性の抑制に由来する副作用及び／又は合併症を最小限に抑える。更に、本明細書で提供される使用は、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、高血圧又は高コレステロール血症等の他の疾患又は肥満症関連疾患を同時に処置することができる。

【0072】

本発明の第２の態様は、第１の態様の下で定義されるｓＥＶの集団を指し、ｓＥＶは、作動可能に連結され、ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にある、ＡＭＰＫタンパク質、好ましくはＡＭＰＫα、好ましくはＡＭＰＫα１、最も好ましくはＡＭＰＫα１－ＤＮ（ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１変異体）タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂ（Ｌａｍｐ２ｂ）に融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をそれらの外膜において一過性に発現するように操作される。ｓＥＶは、本発明の第１の態様の下で上で特徴付けられているので、ｓＥＶに関連する全ての実施形態は、本明細書では第２の態様にも適用される。

【0073】

好ましくは、ｓＥＶの集団はエキソソーム、好ましくはエキソソームの純粋な集団である。一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームの集団は実質的に純粋な集団である。いくつかの実施形態では、集団は実質的に純粋であるか、又はｓＥＶ若しくはエキソソームが豊富であり、ｓＥＶ若しくはエキソソームの少なくとも約５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は１００％を含む。一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームは球形又は円形である。サイズに関する実施形態は、第１の態様の下で上で定義されており、本明細書に適用される。

【0074】

本明細書で提供されるｓＥＶ又はエキソソームの集団は、ＡＭＰＫタンパク質、好ましくはＡＭＰＫα、好ましくはＡＭＰＫα１、最も好ましくはＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質をコードする遺伝子を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むか又はそれをロードされ、当該遺伝子は、作動可能に連結され、ＳＦ１プロモータの制御下にある。好ましくは、集団のｓＥＶのそれぞれに、ＡＭＰＫタンパク質、好ましくはＡＭＰＫα、好ましくはＡＭＰＫα１、最も好ましくはＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質をコードする遺伝子を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドがロードされ、当該遺伝子は、作動可能に連結され、ＳＦ１プロモータの制御下にある。

【0075】

一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームに含まれる少なくとも１つのポリヌクレオチドによってコードされるＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、その全長にわたって、配列番号１、３９又は４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。

【0076】

一実施形態では、ｓＥＶ又はエキソソームに含まれる少なくとも１つのポリヌクレオチドによってコードされるＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、配列番号４０（野生型ラットＡＭＰＫα１配列）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．２％、９８．４％、９８．６％、９８．８％、９９％、９９．２％、９９．４％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、但し、アスパラギン酸に対応する配列番号４０の位置番号１６８のアミノ酸残基は、アスパラギン酸ではないアミノ酸残基によって置換されており、好ましくはアラニンによって置換される（変異Ｄ１６８Ａ）。

【0077】

本明細書及び全文書を通して、アミノ酸残基の位置は、好ましくは、タンパク質又はポリペプチドのＮ末端から順に又は連続して番号付けされることに留意されたい。アミノ酸番号付け、したがって本明細書で定義されるＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質をもたらすアミノ酸置換の数は、異なるＡＭＰＫα１タンパク質内で変化し得ることにも留意されたい。例えば、配列番号４０又は４１における置換Ｄ１６８Ａは、配列番号１における置換Ｄ１６９Ａ（Ｍｙｃ－Ｔａｇ及びＧ－リンカーを有するＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質アミノ酸配列）及び配列番号３９における置換Ｄ１５６Ａ（Ｍｙｃ－Ｔａｇ及びＧ－リンカーを有さないＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質アミノ酸配列）に等しい。したがって、当該アスパラギン酸がＡＭＰＫα１タンパク質の配列に配置される番号付けにかかわらず、異なるアミノ酸残基について変更された場合、本明細書で定義されるＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質に到達することができることが理解されるべきである。好ましくは、ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質を生成するためにＡＭＰＫα１の配列において変異させるアスパラギン酸は、保存配列「ＮＡＫＩＡＤＦＧＬＳ」のアスパラギン酸である。好ましくは、当該ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、細胞の内因性機能的対応物（ＡＭＰＫα１野生型）の活性を損なうか又は低下させることができ、処置細胞、好ましくはＶＭＨ領域におけるｐＡＣＣリン酸化レベルの低下をもたらすが、副腎、下垂体及び精巣等の他のＳＦ－１発現組織では低下させない。

【0078】

第１の態様で上に説明したように、本明細書で提供されるｓＥＶ又はエキソソームは、好ましくは主にそれらの外膜に、リソソーム関連膜タンパク質２ｂ（Ｌａｍｐ２ｂ）に融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含むか又はそれからなる融合タンパク質を更に含むか又はそれをロードされ、当該融合タンパク質は、その全長にわたって配列番号５と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。この場合、融合タンパク質を含むか又はそれからなるドメインは、ＲＶＧペプチド及びＬａｍｐ２ｂタンパク質である。一実施形態では、融合タンパク質のドメインは、リンカーペプチドによって連結され得る。

【0079】

一実施形態では、第２の態様又はその実施形態のいずれかによるｓＥＶの集団は、治療に使用するためのものである。一実施形態では、第２の態様によるｓＥＶの集団は、肥満症の処置又は予防を必要とする対象の肥満症の処置又は予防に使用するためのものであり、好ましくは、肥満症は、食餌誘発性及び／又は遺伝子誘発性肥満症、好ましくはレプチン受容体（ＬＥＰＲ）欠乏誘導性肥満症である。

【0080】

一実施形態では、第２の態様又はその実施形態のいずれかによるｓＥＶの集団は、肥満症の処置のウォッシュアウト中及び／又はウォッシュアウト後のリバウンド効果の改善又は減少に使用するためのものである。「改善する」及び「リバウンド効果」の説明及び実施形態は、第１の態様の下で上に含まれ、本明細書に適用される。

【0081】

一実施形態では、ｓＥＶの集団は、好ましくは全身投与された場合、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するＳＦ１発現ニューロン中のＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化レベルを、未処置ＳＦ１発現細胞中のＡＭＰＫの活性化レベルと比較して有意に減少させることができ、当該減少は、副腎、精巣、又は脳下垂体からなるリストから選択される他のＳＦ１発現組織では有意に減少せず、
当該ｓＥＶの集団は、ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１、３９又は４１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％又は１００％の配列同一性を有することを特徴とし、
当該ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、作動可能に連結され、ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にあり、好ましくは、当該ＳＦ１プロモータは、配列番号３と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をその外膜において一過性に発現するように操作され、
当該集団は、肥満症の処置又は予防において、好ましくは全身投与経路を介して、肥満症の処置又は予防を必要とする対象において使用するためのものである。

【0082】

一実施形態では、ｓＥＶの集団は、好ましくは全身投与された場合、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するＳＦ１発現ニューロン中のＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化レベルを、未処置ＳＦ１発現細胞中のＡＭＰＫの活性化レベルと比較して有意に減少させることができ、当該減少は、副腎、精巣、又は脳下垂体からなるリストから選択される他のＳＦ１発現組織では有意に減少せず、
当該ｓＥＶの集団は、ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４０（野生型ラットＡＭＰＫα１配列）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％又は１００％の配列同一性を有することを特徴とし、但し、配列番号４０の１６８番目のアミノ酸残基が、アスパラギン酸に対応し、アスパラギン酸ではないアミノ酸残基で置換され、好ましくはアラニンで置換されており（変異Ｄ１６８Ａ）、
当該ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質は、作動可能に連結され、ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にあり、好ましくは、当該ＳＦ１プロモータは、配列番号３と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、
ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をその外膜において一過性に発現するように操作され、
当該集団は、肥満症の処置又は予防において、好ましくは全身投与経路を介して、肥満症の処置又は予防を必要とする対象において使用するためのものである。

【0083】

配列表
配列番号１：ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質アミノ酸配列。
注：（下線：Ｍｙｃ－Ｔａｇ）
（灰色強調：Ｇ－リンカー）
（太字及び下線：変異Ｄ１６８→Ａ（変異のアミノ酸番号付け又は位置は、ラットＡＭＰＫα１タンパク質に関するもの、好ましくは配列番号４０のものである））

【0084】

配列番号２：ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１）変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
注：下線（Ｍｙｃ－タグ配列）

【0085】

配列番号３：ステロイド産生因子１（ＳＦ１）ポリヌクレオチド配列。

【0086】

配列番号４：作動可能に連結され、ＳＦ１プロモータの制御下にあるＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。

【0087】

配列番号５：融合タンパク質：リソソーム関連膜タンパク質２ｂ（Ｌａｍｐ２ｂ）に融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチド。
注：（下線なし：Ｌａｍｐ２ｂ配列）
（下線：ＲＶＧ配列）

【0088】

配列番号３８：リソソーム関連膜タンパク質２ｂ（Ｌａｍｐ２ｂ）に融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドからなる融合タンパク質のヌクレオチド配列。
注：（下線なし：Ｌａｍｐ２ｂ配列）
（下線：ＲＶＧ配列）

【0089】

配列番号３９：ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体タンパク質アミノ酸配列（Ｍｙｃ－Ｔａｇペプチド及びＧ－リンカーなし）太字及び下線：変異Ｄ１６８－＞Ａ（変異のアミノ酸番号付け又は位置はラットＡＭＰＫα１タンパク質に関するもの、好ましくは配列番号４０のものである）
Met Glu Lys Gln Lys His Asp Gly Arg Val Lys Ile Gly His Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Gly Asp Thr Leu Gly Val Gly Thr Phe Gly Lys Val Lys Val Gly
20 25 30
Lys His Glu Leu Thr Gly His Lys Val Ala Val Lys Ile Leu Asn Arg
35 40 45
Gln Lys Ile Arg Ser Leu Asp Val Val Gly Lys Ile Arg Arg Glu Ile
50 55 60
Gln Asn Leu Lys Leu Phe Arg His Pro His Ile Ile Lys Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Val Ile Ser Thr Pro Ser Asp Ile Phe Met Val Met Glu Tyr Val Ser
85 90 95
Gly Gly Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Cys Lys Asn Gly Arg Leu Asp Glu
100 105 110
Lys Glu Ser Arg Arg Leu Phe Gln Gln Ile Leu Ser Gly Val Asp Tyr
115 120 125
Cys His Arg His Met Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val
130 135 140
Leu Leu Asp Ala His Met Asn Ala Lys Ile Ala Ala Phe Gly Leu Ser
145 150 155 160
Asn Met Met Ser Asp Gly Glu Phe Leu Arg Thr Ser Cys Gly Ser Pro
165 170 175
Asn Tyr Ala Ala Pro Glu Val Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Ala Gly Pro
180 185 190
Glu Val Asp Ile Trp Ser Ser Gly Val Ile Leu Tyr Ala Leu Leu Cys
195 200 205
Gly Thr Leu Pro Phe Asp Asp Asp His Val Pro Thr Leu Phe Lys Lys
210 215 220
Ile Cys Asp Gly Ile Phe Tyr Thr Pro Gln Tyr Leu Asn Pro Ser Val
225 230 235 240
Ile Ser Leu Leu Lys His Met Leu Gln Val Asp Pro Met Lys Arg Ala
245 250 255
Thr Ile Lys Asp Ile Arg Glu His Glu Trp Phe Lys Gln Asp Leu Pro
260 265 270
Lys Tyr Leu Phe Pro Glu Asp Pro Ser Tyr Ser Ser Thr Met Ile Asp
275 280 285
Asp Glu Ala Leu Lys Glu Val Cys Glu Lys Phe Glu Cys Ser Glu Glu
290 295 300
Glu Val Leu Ser Cys Leu Tyr Asn Arg Asn His Gln Asp Pro Leu Ala
305 310 315 320
Val Ala Tyr His Leu Ile Ile Asp Asn Arg Arg Ile Met Asn Glu Ala
325 330 335
Lys Asp Phe Tyr Leu Ala Thr Ser Pro Pro Asp Ser Phe Leu Asp Asp
340 345 350
His His Leu Thr Arg Pro His Pro Glu Arg Val Pro Phe Leu Val Ala
355 360 365
Glu Thr Pro Arg Ala Arg His Thr Leu Asp Glu Leu Asn Pro Gln Lys
370 375 380
Ser Lys His Gln Gly Val Arg Lys Ala Lys Trp His Leu Gly Ile Arg
385 390 395 400
Ser Gln Ser Arg Pro Asn Asp Ile Met Ala Glu Val Cys Arg Ala Ile
405 410 415
Lys Gln Leu Asp Tyr Glu Trp Lys Val Val Asn Pro Tyr Tyr Leu Arg
420 425 430
Val Arg Arg Lys Asn Pro Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Met Ser Leu
435 440 445
Gln Leu Tyr Gln Val Asp Ser Arg Thr Tyr Leu Leu Asp Phe Arg Ser
450 455 460
Ile Asp Asp Glu Ile Thr Glu Ala Lys Ser Gly Thr Ala Thr Pro Gln
465 470 475 480
Arg Ser Gly Ser Ile Ser Asn Tyr Arg Ser Cys Gln Arg Ser Asp Ser
485 490 495
Asp Ala Glu Ala Gln Gly Lys Pro Ser Glu Val Ser Leu Thr Ser Ser
500 505 510
Val Thr Ser Leu Asp Ser Ser Pro Val Asp Val Ala Pro Arg Pro Gly
515 520 525
Ser His Thr Ile Glu Phe Phe Glu Met Cys Ala Asn Leu Ile Lys Ile
530 535 540
Leu Ala Gln
545

【0090】

配列番号４０：野生型５’－ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ触媒サブユニットα－１［ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）］。ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６２０１５．２
Met Arg Arg Leu Ser Ser Trp Arg Lys Met Ala Thr Ala Glu Lys Gln
1 5 10 15
Lys His Asp Gly Arg Val Lys Ile Gly His Tyr Ile Leu Gly Asp Thr
20 25 30
Leu Gly Val Gly Thr Phe Gly Lys Val Lys Val Gly Lys His Glu Leu
35 40 45
Thr Gly His Lys Val Ala Val Lys Ile Leu Asn Arg Gln Lys Ile Arg
50 55 60
Ser Leu Asp Val Val Gly Lys Ile Arg Arg Glu Ile Gln Asn Leu Lys
65 70 75 80
Leu Phe Arg His Pro His Ile Ile Lys Leu Tyr Gln Val Ile Ser Thr
85 90 95
Pro Ser Asp Ile Phe Met Val Met Glu Tyr Val Ser Gly Gly Glu Leu
100 105 110
Phe Asp Tyr Ile Cys Lys Asn Gly Arg Leu Asp Glu Lys Glu Ser Arg
115 120 125
Arg Leu Phe Gln Gln Ile Leu Ser Gly Val Asp Tyr Cys His Arg His
130 135 140
Met Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val Leu Leu Asp Ala
145 150 155 160
His Met Asn Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Asn Met Met Ser
165 170 175
Asp Gly Glu Phe Leu Arg Thr Ser Cys Gly Ser Pro Asn Tyr Ala Ala
180 185 190
Pro Glu Val Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Ala Gly Pro Glu Val Asp Ile
195 200 205
Trp Ser Ser Gly Val Ile Leu Tyr Ala Leu Leu Cys Gly Thr Leu Pro
210 215 220
Phe Asp Asp Asp His Val Pro Thr Leu Phe Lys Lys Ile Cys Asp Gly
225 230 235 240
Ile Phe Tyr Thr Pro Gln Tyr Leu Asn Pro Ser Val Ile Ser Leu Leu
245 250 255
Lys His Met Leu Gln Val Asp Pro Met Lys Arg Ala Thr Ile Lys Asp
260 265 270
Ile Arg Glu His Glu Trp Phe Lys Gln Asp Leu Pro Lys Tyr Leu Phe
275 280 285
Pro Glu Asp Pro Ser Tyr Ser Ser Thr Met Ile Asp Asp Glu Ala Leu
290 295 300
Lys Glu Val Cys Glu Lys Phe Glu Cys Ser Glu Glu Glu Val Leu Ser
305 310 315 320
Cys Leu Tyr Asn Arg Asn His Gln Asp Pro Leu Ala Val Ala Tyr His
325 330 335
Leu Ile Ile Asp Asn Arg Arg Ile Met Asn Glu Ala Lys Asp Phe Tyr
340 345 350
Leu Ala Thr Ser Pro Pro Asp Ser Phe Leu Asp Asp His His Leu Thr
355 360 365
Arg Pro His Pro Glu Arg Val Pro Phe Leu Val Ala Glu Thr Pro Arg
370 375 380
Ala Arg His Thr Leu Asp Glu Leu Asn Pro Gln Lys Ser Lys His Gln
385 390 395 400
Gly Val Arg Lys Ala Lys Trp His Leu Gly Ile Arg Ser Gln Ser Arg
405 410 415
Pro Asn Asp Ile Met Ala Glu Val Cys Arg Ala Ile Lys Gln Leu Asp
420 425 430
Tyr Glu Trp Lys Val Val Asn Pro Tyr Tyr Leu Arg Val Arg Arg Lys
435 440 445
Asn Pro Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Met Ser Leu Gln Leu Tyr Gln
450 455 460
Val Asp Ser Arg Thr Tyr Leu Leu Asp Phe Arg Ser Ile Asp Asp Glu
465 470 475 480
Ile Thr Glu Ala Lys Ser Gly Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ser Gly Ser
485 490 495
Ile Ser Asn Tyr Arg Ser Cys Gln Arg Ser Asp Ser Asp Ala Glu Ala
500 505 510
Gln Gly Lys Pro Ser Glu Val Ser Leu Thr Ser Ser Val Thr Ser Leu
515 520 525
Asp Ser Ser Pro Val Asp Val Ala Pro Arg Pro Gly Ser His Thr Ile
530 535 540
Glu Phe Phe Glu Met Cys Ala Asn Leu Ile Lys Ile Leu Ala Gln
545 550 555

【0091】

配列番号４１：配列番号４０に関してＤ１６８Ａ変異を有する野生型５’－ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ触媒サブユニットα－１［ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）］。
Met Arg Arg Leu Ser Ser Trp Arg Lys Met Ala Thr Ala Glu Lys Gln
1 5 10 15
Lys His Asp Gly Arg Val Lys Ile Gly His Tyr Ile Leu Gly Asp Thr
20 25 30
Leu Gly Val Gly Thr Phe Gly Lys Val Lys Val Gly Lys His Glu Leu
35 40 45
Thr Gly His Lys Val Ala Val Lys Ile Leu Asn Arg Gln Lys Ile Arg
50 55 60
Ser Leu Asp Val Val Gly Lys Ile Arg Arg Glu Ile Gln Asn Leu Lys
65 70 75 80
Leu Phe Arg His Pro His Ile Ile Lys Leu Tyr Gln Val Ile Ser Thr
85 90 95
Pro Ser Asp Ile Phe Met Val Met Glu Tyr Val Ser Gly Gly Glu Leu
100 105 110
Phe Asp Tyr Ile Cys Lys Asn Gly Arg Leu Asp Glu Lys Glu Ser Arg
115 120 125
Arg Leu Phe Gln Gln Ile Leu Ser Gly Val Asp Tyr Cys His Arg His
130 135 140
Met Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val Leu Leu Asp Ala
145 150 155 160
His Met Asn Ala Lys Ile Ala Ala Phe Gly Leu Ser Asn Met Met Ser
165 170 175
Asp Gly Glu Phe Leu Arg Thr Ser Cys Gly Ser Pro Asn Tyr Ala Ala
180 185 190
Pro Glu Val Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Ala Gly Pro Glu Val Asp Ile
195 200 205
Trp Ser Ser Gly Val Ile Leu Tyr Ala Leu Leu Cys Gly Thr Leu Pro
210 215 220
Phe Asp Asp Asp His Val Pro Thr Leu Phe Lys Lys Ile Cys Asp Gly
225 230 235 240
Ile Phe Tyr Thr Pro Gln Tyr Leu Asn Pro Ser Val Ile Ser Leu Leu
245 250 255
Lys His Met Leu Gln Val Asp Pro Met Lys Arg Ala Thr Ile Lys Asp
260 265 270
Ile Arg Glu His Glu Trp Phe Lys Gln Asp Leu Pro Lys Tyr Leu Phe
275 280 285
Pro Glu Asp Pro Ser Tyr Ser Ser Thr Met Ile Asp Asp Glu Ala Leu
290 295 300
Lys Glu Val Cys Glu Lys Phe Glu Cys Ser Glu Glu Glu Val Leu Ser
305 310 315 320
Cys Leu Tyr Asn Arg Asn His Gln Asp Pro Leu Ala Val Ala Tyr His
325 330 335
Leu Ile Ile Asp Asn Arg Arg Ile Met Asn Glu Ala Lys Asp Phe Tyr
340 345 350
Leu Ala Thr Ser Pro Pro Asp Ser Phe Leu Asp Asp His His Leu Thr
355 360 365
Arg Pro His Pro Glu Arg Val Pro Phe Leu Val Ala Glu Thr Pro Arg
370 375 380
Ala Arg His Thr Leu Asp Glu Leu Asn Pro Gln Lys Ser Lys His Gln
385 390 395 400
Gly Val Arg Lys Ala Lys Trp His Leu Gly Ile Arg Ser Gln Ser Arg
405 410 415
Pro Asn Asp Ile Met Ala Glu Val Cys Arg Ala Ile Lys Gln Leu Asp
420 425 430
Tyr Glu Trp Lys Val Val Asn Pro Tyr Tyr Leu Arg Val Arg Arg Lys
435 440 445
Asn Pro Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Met Ser Leu Gln Leu Tyr Gln
450 455 460
Val Asp Ser Arg Thr Tyr Leu Leu Asp Phe Arg Ser Ile Asp Asp Glu
465 470 475 480
Ile Thr Glu Ala Lys Ser Gly Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ser Gly Ser
485 490 495
Ile Ser Asn Tyr Arg Ser Cys Gln Arg Ser Asp Ser Asp Ala Glu Ala
500 505 510
Gln Gly Lys Pro Ser Glu Val Ser Leu Thr Ser Ser Val Thr Ser Leu
515 520 525
Asp Ser Ser Pro Val Asp Val Ala Pro Arg Pro Gly Ser His Thr Ile
530 535 540
Glu Phe Phe Glu Met Cys Ala Asn Leu Ile Lys Ile Leu Ala Gln
545 550 555

【0092】

本発明はまた、以下の条項を含む。

【0093】

１．全身投与された場合、視床下部腹内側核（ＶＭＨ）に位置するＳＦ１発現ニューロンにおけるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化レベルを、未処置ＳＦ１発現細胞におけるＡＭＰＫの活性化レベルと比較して有意に減少させることができるが、当該減少は、副腎、精巣、又は脳下垂体からなるリストから選択される他のＳＦ１発現組織では有意に減少しない、小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団であって、
小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の当該集団が、作動可能に連結され、ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にある、ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１－ＤＮ）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とし、ｓＥＶは、リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質をそれらの外膜において一過性に発現するように操作され、
当該組成物は、肥満症の処置を必要とする対象における全身投与経路を介した肥満症の処置に使用するためのものである、
小型細胞外小胞（ｓＥＶ）の集団。

【0094】

２．処置が、処置のウォッシュアウト中及び／又はウォッシュアウト後にリバウンド効果の改善又は減少を更に提供する、条項１に記載の使用のための集団。

【0095】

３．少なくとも１つのポリヌクレオチドによってコードされるドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１）変異体タンパク質が、配列番号１と、その全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項１又は２のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0096】

４．ドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、配列番号２と、その全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、条項１～３のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0097】

５．ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータが、配列番号３と、その全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、条項１～４のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0098】

６．作動可能に連結され、ステロイド産生因子１（ＳＦ１）プロモータの制御下にあるドミナントネガティブＡＭＰ活性化プロテインキナーゼα１（ＡＭＰＫα１）変異体タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、配列番号４と、その全長にわたって１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、条項１～５のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0099】

７．リソソーム関連膜タンパク質２ｂに融合した神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）ペプチドを含む一過性発現融合タンパク質が、配列番号５と、その全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、条項１～６のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0100】

８．小型細胞外小胞が、３０～１５０ｎｍのサイズ分布を有する、条項１～７のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0101】

９．小型細胞外小胞が、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９若しくはＣＤ８１、又はそれらの任意の組合せからなる群より選択される１つ以上の特異的マーカを更に含む、条項１～８のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0102】

１０．小型細胞外小胞が、ＧＲＰ９４マーカを欠くことを特徴とする、条項１～９のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0103】

１１．小型細胞外小胞が、成熟抗原提示細胞におけるＴ細胞活性化因子分子の発現と比較して、少なくとも１つの当該Ｔ細胞活性化因子分子の発現が統計的に有意に低下していることを特徴とする未成熟抗原提示細胞から産生又は得られる、条項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0104】

１２．抗原提示細胞が樹状細胞、好ましくはＪＡＷＳ ＩＩ細胞株であり、少なくとも１つのＴ細胞活性化因子分子が、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）、分化抗原群８０（ＣＤ８０）若しくは分化抗原群８６（ＣＤ８６）、又はそれらの組合せからなる群より選択される１つ以上のＴ細胞活性化因子分子である、条項１～１１のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0105】

１３．小型細胞外小胞がエキソソームである、条項１～１２のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0106】

１４．全身経路が血管内経路である、条項１～１３のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【0107】

１５．処置が肥満症を回復又は改善することを含む、条項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための集団。

【実施例】

【0108】

実施例１
方法
細胞培養
ＪＡＷＳ ＩＩ樹状細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＲＬ－１１９４；ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＪＡＷＳ ＩＩ細胞を、リボヌクレオシド、デスオキシリボヌクレオシドを含有し、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、４ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及び５ｎｇ／ｍＬのマウスＧＭ－ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を補充したα最小必須培地（αＭＥＭ）（Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で構成される完全培養培地中、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内で増殖させた。マウス視床下部ＧＴ１－７細胞株（Ｅｄｕａｒｄｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｎｔｉａｇｏ ｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌａによって善意で提供される）を、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１ｍＭのＬ－グルタミンを含有し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からなる完全培地中、５％ＣＯ２の３７℃インキュベーター内で培養した。マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞株（研究室Ｍｉｃｒｏ ｅｔ Ｎａｎｏｍｅｄｅｃｉｎｅｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｎｅｌｌｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｎｇｅｒｓ，Ｆｒａｎｃｅによって善意で提供される）を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＦＢＳ、１０Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭからなる増殖培地中、３７℃及び５％ＣＯ２で増殖させた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス４９由来の不死化褐色脂肪細胞を、７０％～８０％のコンフルエンスに達するまで、１０％ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｎＭのＴ３及び２０ｎＭのインスリンを含有するＤＭＥＭ中の６ウェルプレートに２．５×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。次いで、５００ｎＭのデキサメタゾン、１μＭのロシグリタゾン、１２５μＭのインドメタシン、及び５００μＭの３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を４４時間添加した。次いで、細胞を、分化するまで（４～５日）、Ｔ３及びインスリンのみを含有する培地中で培養した。初代皮質星状細胞を３日齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの大脳皮質から得て、４日間～６日間にわたって培養で維持した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。

【0109】

動物
成体（８～１２週）の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２５ｇ；Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎａ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ；Ｓａｎｔｉａｇｏ ｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌａ，Ｓｐａｉｎ又はＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ）、ヌードマウス（ＮＲｊ：ＮＭＲＩ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ；Ｓａｉｎｔ Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ，Ｆｒａｎｃｅ）及びＣ５７ＢＬ／６ホモ接合型ＵＣＰ１ノックアウト（ＵＣＰ１－ＫＯ；ｕｃｐ１－／－）雄並びにそれらの対応する野生型同腹子５０（ＧＴＨ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｕｂｅｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙで飼育）を実験に使用した。実験は、動物実験に関する国際法に準拠して行われ、ＵＳＣ倫理委員会（プロジェクトＩＤ １５０１０／１４／００６）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（プロトコル８１０１５４９）によって承認された。動物を、制御された温度及び湿度条件下で、人工的な１２時間明期（８：００から２０：００）／１２時間暗期サイクルで飼育し、通常の固形飼料食又は６０％ＨＦＤ（Ｄ１２４９２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ；Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＵＳＡ）及び濾過した水道水を１０週間自由に摂取させた。全ての手順について、動物を個別にケージに入れ、ストレスのない条件下での取り扱い手順に順応させた。実験は、動物実験に関する国際法に準拠して行われ、ＵＳＣ倫理委員会によって承認された（１５０１２／２０２０／０１０）。

【0110】

プラスミド
Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧプラスミドを前述２８のように設計した。簡潔には、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を含むＬａｍｐ２ｂ配列（Ｓｅｏｗ Ｙｉｑｉ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄによって善意で提供される）をコードするプラスミドを、ｅＧＦＰコード配列を除去するように注意しながら、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１骨格にクローニングした。ＲＶＧプライマー（フォワード：５’－ＴＣＧ ＡＴＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＴＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＣＧＡ ＧＡＡ ＴＣＣ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＧＡＣ ＡＣＣ ＴＴＧ ＴＧＡ ＣＡＴ ＴＴＴ ＴＡＣ ＣＡＡ ＴＡＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＴＣ ＣＡＡ ＣＧＧ ＧＴ－３’；リバース：５’－ＣＣＧ ＧＡＣ ＣＣＧ ＴＴＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＣＴ ＣＴＧ ＣＴＡ ＴＴＧ ＧＴＡ ＡＡＡ ＡＴＧ ＴＣＡ ＣＡＡ ＧＧＴ ＧＴＣ ＣＣＴ ＧＧＴ ＣＴＣ ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＣＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＡＡ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＡ－３’）を、Ｌａｍｐ２ｂのＮ末端のＸｈｏＩとＢｓｐＥＩとの間に挿入した。ステロイド産生因子－１（ＳＦ１）プロモータの制御下にあるＡＭＰＫα１のドミナントネガティブ変異体（ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ）をコードするプラスミドを、Ｖｉｒａｑｕｅｓｔ（Ｎｏｒｔｈ Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＩＡ，ＵＳＡ）から購入した。

【0111】

小型細胞外小胞の生成及び単離
ＪＡＷＳ ＩＩ細胞を、トランスフェクションの前日に、完全培養培地（上記の組成を参照）中のＴ７５細胞培養フラスコ中に５×１０^６細胞の密度で播種した。トランスフェクション日に、ＭａｃｓＦｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）により、ＪＡＷＳ ＩＩ細胞にＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧプラスミドを一過性にトランスフェクトした。製造業者のプロトコルに示されているように、３５０μＬの無血清培地に希釈した２０μｇのＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧプラスミドを、３５０μＬの無血清培地に希釈した４０μＬのＭａｃｓＦｅｃｔｉｎに添加した。混合物を室温で２０分間インキュベートして、細胞に添加する前にトランスフェクション複合体の形成を可能にした。２４時間後、細胞培地をＦＢＳ－ｓＥＶ非含有培地（２００，０００ｇを２回の超遠心分離ＦＢＳで補充した完全αＭＥＭ）と交換した。４８時間後、細胞培地を回収し、３００ｇ及び２，０００ｇで１０分間２回遠心分離して、細胞及び細胞片をそれぞれ除去した。得られた上清を２０，０００ｇで３０分間遠心分離して、大きなＥＶを除外した。Ｏｐｔｉｍａ Ｍａｘ－ＸＰ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）中でＭＬＡ－５０ローターを使用して、４℃で２時間の２００，０００ｇ遠心分離工程によって、大きなＥＶ枯渇上清からｓＥＶペレットを更に単離した。ｓＥＶペレットを、同じ事前の超遠心プロセスを使用してＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁した。ｓＥＶ試料を使用するまで－８０℃に保った。

【0112】

電子顕微鏡法
ｓＥＶを、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の新たに調製した２．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩固定した。ｓＥＶを、前述の超遠心分離プロセスによりペレット化し、２．５％グルタルアルデヒド溶液に再懸濁した。ｓＥＶを銅グリッド上に堆積させ、リンタングステン酸でネガティブ染色し、ＪＥＭ１４００透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ；Ｐｅａｂｏｄｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）により２００ｋＶで観察した。

【0113】

ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）
５０μｇの精製された、（ｉ）天然の非修飾、（ｉｉ）Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧニューロン標的化又は（ｉｉｉ）Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを１ｍＬのＰＢＳで希釈し、製造業者の指示に従ってＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｏｒｓａｙ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して３７℃でサイズ分布を分析した。

【0114】

簡潔には、ＮＴＡは、目的の粒子の光散乱及びブラウン運動の両方の特性を適用して、液体懸濁液中のナノ粒子のサイズ分布を得る。６０秒のビデオを記録し、その後、ストークス－アインシュタイン方程式を使用してサイズ分布を決定するＮＴＡソフトウェアによって分析した。

【0115】

小型細胞外小胞ロード及び核酸含有量の評価
製造業者のプロトコルに従って、Ｅｘｏ－Ｆｅｃｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、精製ｓＥＶに核酸－ｓｉＲＮＡ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧＦＰプラスミド又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮのいずれか－をロードした。簡潔には、ｓＥＶ（５０～３００μｇ）を、１０μＬのＥｘｏ－Ｆｅｃｔ溶液、２０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ又は５μｇのプラスミド（ＧＦＰ又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ）及び７０μＬのＰＢＳと共に３７℃で１０分間インキュベートした。

【0116】

次いで、Ｅｘｏ－Ｑｕｉｃｋ溶液（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）３０μＬを添加した後、混合物を４℃で３０分間置いた。次いで、試料を１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離してｓＥＶをペレット化した後、その後の使用に応じて適切な体積のＰＢＳに再懸濁した。ｓＥＶを直接使用するか、又は更に使用するまで－８０℃で保存した。

【0117】

ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮプラスミドによるロードを評価するために、精製ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の非存在下又は存在下、３７℃で１０分間、ＲＤＤ緩衝液（製造業者の指示に従って）で希釈したＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処置するか、又は処置しなかった。ＤＮａｓｅ活性を不活性化するために、試料を７５℃で１０分間加熱した。次いで、非消化ｓＥＶ及びＤＮＡ消化ｓＥＶの両方を、ＡＭＰＫ又はＧＡＰＤＨ（対照として）プライマー（以下の配列）の存在下でエンドポイントＰＣＲに供した。

【0118】

次いで、ＰＣＲ反応の生成物を、０．００１％臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で泳動した。ゲルを、ＩＮＦＩＮＩＴＹ ＶＸ２ １１２０Ｍゲル文書化システム（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ；Ｃｏｌｌｅｇｉｅｎ Ｆｒａｎｃｅ）においてＵＶ光で可視化した。・ＡＭＰＫ：フォワード：５’－ＡＣＧ ＧＣＣ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＡＣ－３’；リバース：５’－ＴＣＧ ＴＧＣ ＴＴＧ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＣ－３’・ＧＡＰＤＨ：フォワード：５’－ＡＧＴ ＡＴＧ ＴＣＧ ＴＧＧ ＡＧＴ ＣＴＡ Ｃ－３’；リバース：５’－ＣＡＴ ＡＣＴ ＴＧＧ ＣＡＧ ＧＴＴ ＴＣＴ Ｃ－３’。

【0119】

小型細胞外小胞の標識及び生体内分布分析
ｓＥＶを、製造業者のプロトコルに従ってＤＩＤ溶液（励起最大：６４４ｎｍ；発光最大：６６５ｎｍ）（Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＤ Ｃｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）で染色した。簡潔には、ｓＥＶを、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬのＶｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｉＤ Ｃｅｌｌと共に室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で２００，０００ｇ超遠心工程で２回２時間洗浄した。得られたＤＩＤ標識ｓＥＶをＰＢＳ中で回収し、直接使用した。

【0120】

１００μｇのＤＩＤ標識天然又はＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶをヌードマウスに静脈内注射した。ＤＩＤ標識ｓＥＶ生体内分布の分析には、マルチスペクトルイメージングシステムＭＡＥＳＴＲＯ Ｉｎ－Ｖｉｖｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した。ＤＩＤ標識ｓＥＶ生体内分布を、イソフルランで鎮静させたマウスで異なる時間（３０分、２、４及び６時間）に分析した。動物の屠殺後、単離された器官（肝臓、脾臓、肺、心臓、脳及び骨格筋）のそれぞれの蛍光も分析した。ＭＡＥＳＴＲＯ Ｉｎ－Ｖｉｖｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によりデータを分析した。

【0121】

ｓＥＶによるインビトロ処置
ｓＥＶによる処置の２４時間前に、（ｉ）ＪＡＷＳ ＩＩ細胞を、３００μＬの完全増殖培地を含むμ－Ｓｌｉｄｅ ８Ｗｅｌｌ（Ｉｂｉｄｉ；Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に２×１０^４細胞の密度で播種し、（ｉｉ）ＧＴ１－７及び（ｉｉｉ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、１ｍＬの完全増殖培地中に２×１０^５細胞の密度で６ウェルプレートに播種し、（ｉｖ）初代皮質星状細胞を、１ｍＬの完全増殖培地中に５×１０^５細胞の密度で播種した。処置の当日に、ＪＡＷＳ ＩＩ細胞を、固定前に非ロードｓＥＶ、ｓｉＲＮＡ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ又はＧＦＰロードｓＥＶ（全ての条件で１μｇ）とインキュベートし、それぞれの蛍光－ｓｉＲＮＡ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（励起最大：５９６ｎｍ及び発光最大：６１５ｎｍ）及びＧＦＰ（励起最大：４８８ｎｍ及び発光最大：５０９ｎｍ）－を共焦点顕微鏡法（ＣＬＭＳ７００、Ｚｅｉｓｓ，ＺＥＮ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって異なる時間（２、６及び２４時間）に評価した。他方では、ＧＴ１－７、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、褐色脂肪細胞及び初代皮質星状細胞を１０μｇ／ｍＬのＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで２４時間処置した後、収集し、後の分析のためにタンパク質を抽出した。

【0122】

ｓＥＶによる定位処置
ＤＩＯマウスをケタミン－キシラジン麻酔（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）下で定位フレーム（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に置いた。

【0123】

以下の定位座標を使用して、３２ゲージ針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ；Ｒｅｎｏ，ＮＶ，ＵＳＡ）を使用してＶＭＨを両側に標的化した；^{１７、１８}に示すように、ブレグマの後方１．７ｍｍ、正中線の外側±０．５ｍｍ及び深さ５．５ｍｍ。２μｇの対照又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを、１００ｎＬ分^－１の速度で１０分間送達した（各注射部位で０．５μＬ）。体重、食物摂取量及びＢＡＴ温度（下記参照）の毎日の測定を行った。３日目に、動物を屠殺し、更なる分析のために器官を収集した（以下を参照）。

【0124】

ｓＥＶによる全身処置
１００μｇのＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ非ロード又はロードｓＥＶ（Ｂｒａｄｆｏｒｄによって測定された総ｓＥＶタンパク質含有量を考慮することによる間接定量化）を、実験に応じて対応する時間、マウスの尾静脈にそれぞれ３日間注射した。時間経過実験のために（時間経過のＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮプラスミドインビボ発現及びＵＣＰ１ ＢＡＴ発現の両方）、マウスに１回注射し、対応する時点（２４時間、４８時間、７２時間及び１週間）で屠殺した。体重、食物摂取量及びＢＡＴ温度（下記参照）の毎日の測定を行った。異なる実験手順の最後に動物を屠殺し、更なる分析のために器官を収集した（以下を参照）。各実験には１群当たり６～１５匹の動物を使用し、これを２～６回繰り返した。β３－ＡＲ特異的アンタゴニストＳＲ５９２３０Ａ（［３－（２エチルフェノキシ）－１－［（１，Ｓ）－１，２，３，４－テトラヒドロナフト－１－イルアミノ］－２Ｓ－２－プロパノール－オキサレート］（ＤＭＳＯに溶解した３ｍｇ／Ｋｇ／日；Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）１２、１３、１５～１８、４４を、初回静脈内注射の３日前から開始して、８：００及び２０：００のサイクル開始時に１日２回皮下投与した。熱的中性実験のために、マウスを熱的中性条件（３０℃）で収容した。マウスを、前述のように６日間の実験手順及び毎日の測定の前に温度変動（４日間毎日２℃上昇）に適応させた。

【0125】

温度測定
ＢＡＴを取り巻く皮膚温度及び尾基部の温度を赤外線カメラ（Ｂ３３５：Ｃｏｍｐａｃｔ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ－Ｔｈｅｒｍａｌ－Ｉｍａｇｉｎｇ－Ｃａｍｅｒａ；ＦＬＩＲ；Ｗｅｓｔ Ｍａｌｌｉｎｇ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）で記録し、１２、１３、１５～１８、４４に示すように、特定のソフトウェアパッケージ（ＦＬＩＲ－Ｔｏｏｌｓ－Ｓｏｆｔｗａｒｅ；ＦＬＩＲ；Ｗｅｓｔ Ｍａｌｌｉｎｇ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）で分析した。全ての場合において、選択した領域の平均温度を選択した。その領域のサイズ及びランドマークは、全てのマウスについて同様であった。放射率（ε）は０．９５に設定した。結果分析の一貫性を得るために、ＢＡＴ及び尾部温度記録を、全ての実験手順の間、常に同じ時間に毎日実施した。結果は、時間依存性効果を強調するための経時変化として、又は実験を通して行われた異なる毎日の測定の平均として提示される。

【0126】

間接熱量測定
動物を、本発明者らの以前の報告^{１３、１５～１８、４４、５１}のように、熱量測定システム（ＬａｂＭａｓｔｅｒ；ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＥＥ、酸素消費量（ＶＯ２）、呼吸商（ＲＱ）及び自発運動活性（ＬＡ）について分析した。

【0127】

核磁気共鳴
全ての研究は、４４０ｍＴ／ｍの勾配を有する９．４Ｔ水平ボア磁石（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。身体組成には、直角位相体積コイル（直径７ｃｍ）を使用した。ＮＭＲ手順は、セボフルラン麻酔（７０％ＮＯ２及び３０％Ｏ２のガス混合物中で６％誘導及び３．５％維持）下で行った。ＭＲＩ試験中、画像取得中の自発運動を最小限に抑えるために、歯棒、耳棒及び接着テープを使用して各動物をプレキシグラスホルダーに固定した。身体組成研究のために、反復時間／エコー時間（ＲＴ／ＥＴ）＝１３００／３．５ｍｓ、平均数（ＮＡ）＝２、１ｍｍの３０個の冠状スライス、視野（ＦＯＶ）＝６０×８０ｍｍ、及びマトリクスサイズ＝２５６×３５０（０．２３４×０．２２９ｍｍ／ピクセルの平面解像度）を有する高速低角度ショット（ＦＬＡＳＨ）シーケンスを、脂肪抑制オプションの有無にかかわらず取得して、「脂肪抑制」及び「脂肪」画像セットの両方を生成した。

【0128】

総取得時間は３１分であった。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｗ．Ｒａｓｂａｎｄ，ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用してＭＲ後処理を実行した。半自動画像処理を使用して、脂肪抑制オプションありとなしの同一登録画像セットを比較する脂肪マスク（総計（総ＡＴ）、皮下脂肪組織（ｓｃＡＴ）及び内臓脂肪組織（ｖＡＴ）の体積）を作成した。脂肪組織（０．９ｇ／ｍＬ）及び他の組織（１．０４ｇ／ｍＬ）の標準密度を使用して、ＭＲＩ体積を重量に変換した^{５２－５４}。

【0129】

ポジトロン放出断層撮影－コンピュータ断層撮影
全身マイクロＰＥＴ／ＣＴ（陽電子放射断層撮影－コンピュータ断層撮影）画像を、Ａｌｂｉｒａ ＰＥＴ／ＣＴ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ；Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ，ＣＴ，ＵＳ）により取得した。マウスは、（７．４±１．８５）ＭＢｑの２^－１８Ｆ－フルオロ－２－デオキシ－２－グルコース（^１８Ｆ－ＦＤＧ）の注射を尾静脈に受けた。^１８Ｆ－ＦＤＧ注射の４５±１０分後に取得を行った。Ｂｒｕｋｅｒ Ａｌｂｉｒａ Ｓｕｉｔｅソフトウェアバージョン５．０を使用して画像を生成した。褐色脂肪及び肝臓領域を、ＡＭＩＤＥソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ａｍｉｄｅ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）に実装された画像ツールを使用して、半径６ｍｍの目的の３次元球状体積を生成することによって描写した。したがって、平均標準化取込み値（ＳＵＶ）を計算した^{１７、１８}。

【0130】

交感神経活動（ＳＮＡ）記録
ＳＮＡの多線維記録は、以前に記載されたように^{１２、１５、１７、１８、５５}、神経サブサービングＢＡＴから得た。各マウスをケタミン（９１ｍｇ／ｋｇ体重）及びキシラジン（９．１ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内投与で麻酔し、マウスがＯ２富化室内空気を自発的に呼吸するための妨げられない気道を提供するためにＰＥ－５０による挿管を行った。次に、持続麻酔剤α－クロラロース（初期用量：１２ｍｇ／ｋｇ、次いで持続用量６ｍｇ／ｋｇ／時間）の注入のために、マイクロレナタンチュービング（ＭＲＥ－４０、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を右頸静脈に挿入した。動脈圧及び心拍数の連続測定のために、別のＭＲＥ－４０カテーテルを左頸動脈に挿入した。直腸プローブを使用して深部体温をモニターし、３７．５℃で継続的に維持した。次いで、各マウスに、肩甲下ＢＡＴに役立つ神経からの直接多線維ＳＮＡを装備した。双極白金－イリジウム電極（３６ゲージ、Ａ－Ｍシステム；Ｓｅｑｕｉｍ，ＷＡ，ＵＳＡ）を神経下に懸垂し、シリコーンゲル（Ｋｗｉｋ－Ｓｉｌ，ＷＰＩ；Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ，ＵＳＡ）で固定した。電極を高インピーダンスプローブ（ＨＩＰ－５１１，Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｗｅｓｔ Ｗａｒｗｉｃｋ，ＲＩ，ＵＳＡ）に取り付け、神経信号を１０５倍に増幅し、Ｇｒａｓｓ Ｐ５ ＡＣ前置増幅器により１００Ｈｚ及び１，０００Ｈｚカットオフでフィルタリングした。増幅及びフィルタリングされた神経信号をスピーカシステム及びオシロスコープ（モデル５４５０１Ａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ－Ｐａｃｋａｒｄ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）にルーティングして、定量化の目的でＢＡＴ交感神経記録の音声及び視覚品質を監視した。増幅され、フィルタリングされた神経信号はまた、バックグラウンドノイズ閾値を超える１秒当たりのスパイク数を分析するためにカーソルを利用するソフトウェア（ＭａｃＬａｂ Ｃｈａｒｔ Ｐｒｏ，ｖｅｒｓｉｏｎ７．０；Ｔａｋｏｍａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を含むＭａｃＬａｂアナログ－デジタル変換器（モデル８Ｓ、ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ ＣＯ，ＵＳＡ）及びリセット電圧積分器（モデルＢ６００Ｃ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ，ＩＡ，ＵＳＡ）にも向けられた。

【0131】

安定した等温（３７．５℃）条件下及び麻酔下で、ベースラインＢＡＴ ＳＮＡを３０分間にわたって記録した。次いで、神経を遠位に切断して、更に１５分間遠心性ＳＮＡを記録した。次に、記録部位の近位の神経を切断した後に残っている活動を記録することによって、バックグラウンドノイズを測定し、これを差し引いて実際のＳＮＡを測定した。求心性神経活動は、総神経活動から遠心性を差し引くことによって決定した。神経記録中、心拍数と共に収縮期、拡張期、及び平均動脈圧を全ての動物で測定した。

【0132】

試料処理
マウスを脱臼及び断頭によって殺傷した。各動物から、ＶＭＨ、皮質、視床及び小脳並びに末梢組織をウェスタンブロッティング及びリアルタイムＲＴ－ＰＣＲのために回収し、直ちに氷上でホモジナイズしてＲＮＡ及びタンパク質レベルを保存した。これらの試料及び血清を、更なる処理まで－８０℃で保存した。ＶＭＨの解剖は、以前に記載されたように^{１２、１３、１５～１８、４４}、顕微鏡下でマイクロパンチ手順によって行った。

【0133】

血液生化学
ＬＨ血清レベルを、１５、５６の他の箇所に詳細に記載されているように、Ｄｒ．ＡＦ Ｐａｒｌｏｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）によって供給される二重抗体法及びラジオイムノアッセイキットを使用して二連で測定した。血清テストステロンレベル及びＣＯＲＴレベルを、ＲＩＡキット（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ；Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。レプチン循環レベルを、マウスＥＬＩＳＡキット（＃ＥＺＭＬ－８２Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。コレステロール（＃１００１０９３，Ｓｐｉｎｒｅａｃｔ；Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）、トリグリセリド（＃１００１３１４，Ｓｐｉｎｒｅａｃｔ；Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ：２７０－７７０００及びＮＥＦＡ－ＨＲ Ｒ２セット：４３６－９１９９５ ＷＡＫＯ；Ｎｅｕｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）循環レベル並びにＡＳＴ（＃４１２７２、ＡＳＴ）及びＡＬＴ（＃４１２８２、ＡＬＴ）活性（Ｓｐｉｎｒｅａｃｔ；Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ分光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）における分光光度法によって測定した。ＧＤＦ１５血清レベルを、マウスＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．，Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ）を使用して測定した。

【0134】

血清サイトカイン（ＩＬ－６及びＩＰ－１０）を、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘキット（Ｍｅｒｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を製造者の説明書に従って用いて測定した。

【0135】

ＲＴ－ＰＣＲ分析
精巣及び副腎分析のために、以下の特異的プライマーを使用して、以前に記載された５７、５８のようにリアルタイムＰＣＲ（ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ（商標）ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を行った：・ＳＴＡＲ：フォワード：５’－ＡＧＴ ＴＣＧ ＡＣＧ ＴＣＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＣＴ－３’；リバース：５’－ＴＡＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＣＴＴ ＣＧＴ ＣＣＣ ＣＧ－３’；・Ｐ４５０ｓｃｃ：フォワード：５’－ＧＡＴ ＴＧＣ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＧＡ ＧＡＴ ＧＡ－３’；リバース：５’－ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＧＧ－３’；・１７β－ＨＳＤ３：フォワード：５’－ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＣＴ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＡＧ ＡＧ－３’；リバース：５’－ＧＧＣ ＣＴＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＣＴ ＣＣ－３’；・ＬＨ β：フォワード：５’－ＧＡＧ ＴＴＣ ＴＧＣ ＣＣＡ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＴ－３’；リバース：５’－ＡＧＧ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＴＡＴ ＧＧＧ ＧＴＣ Ｔ－３’・Ｓ１１：フォワード：５’－ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＡＣ ＧＧＡ ＧＣＧ ＴＧＣ ＴＴＡ Ｃ－３’；
リバース：５’－ＴＧＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＧＴＣ ＡＣ－３’。

【0136】

骨格筋熱産生マーカのＲＮＡレベルについては、以下の特異的プライマー及びプローブを使用してリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を行った：・Ａｔｐ２ａ２：フォワード：５’－ＴＣＣ ＧＣＴ ＡＣＣ ＴＣＡ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＣ－３’；リバース：５’－ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＧＧ ＡＧＧ ＡＴＴ ＧＡＡ ＣＣ－３’；・Ｇｄｐ２：フォワード：５’－ＧＡＡ ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＧＧ Ｔ－３’；リバース：５’－ＧＧＡ ＴＧＴ ＣＡＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＧＴＧ ＴＧＴ－３’；・Ｐｐａｒγ：フォワード：５’－ＴＣＧ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＡＣ ＴＧＣ ＣＴＡ ＴＧ－３’；リバース：５’－ＧＡＧ ＡＧＧ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＴＴ－３’；・Ｒｙｒ１：フォワード：５’－ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＧＧ ＡＣＧ ＧＡＴ ＧＡＴ－３’；リバース：５’－ＣＡＣ ＣＧＧ ＣＣＴ ＣＣＡ ＣＡＧ ＴＡＴ ＴＧ－３’；・Ｓｌｎ：フォワード：５’－ＧＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＣＣ ＴＴＧ Ｇ－３’；リバース：５’－ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＧＧ ＧＧＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＡＧ－３’；・Ｕｃｐ３：フォワード：５’－ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＡＴＣ Ａ－３’；リバース：５’－ＧＣＧ ＴＴＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＣＧＧ ＧＴＣ ＴＴＴ Ａ－３’。

【0137】

インビボでのＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ発現の分析のために、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で対応する時間に屠殺し、次いで、供給業者のプロトコルに従ってＭ－ＭＬＶ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡに逆転写したマウス由来の組織から全ＲＮＡを単離した。

【0138】

対応するｃＤＮＡを、１０μＭの各プライマーを含有するＰＣＲ反応における鋳型として使用した（以下の配列を参照のこと）。ＰＣＲサイクル条件を以下のように設計した：９５℃で３分間の初期変性工程、続いて９５℃で３０秒間の４０サイクルの変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で４５秒間の伸長。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析した。次のプライマーを使用した：・ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ：フォワード：５’－ＡＡＡ ＣＡＣ ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＴＡ ＣＧＧ ＡＡ－３’；リバース：５’－ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＣ ＴＡＧ ＡＴＴ ＡＣ－３’ ・ＨＰＲＴ：フォワード：５’－ＧＧＴ ＴＡＡ ＧＣＡ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＡ－３’；リバース：５’－ＴＣＣ ＡＡＣ ＡＣＴ ＴＣＧ ＡＧＡ ＧＧＴ ＣＣ－３’。

【0139】

ＡＭＰＫ活性アッセイ
ＡＭＰＫ活性を、ＣｙｃＬｅｘ ＡＭＰＫキナーゼアッセイ（ＣＹ－１１８２；ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳ）を製造者の推奨及び他のもの５９、６０によって示されたものに従って測定した。簡潔には、５μｇのＶＭＨタンパク質を含有する１０ｕｌの溶解緩衝液を９０μＬのキナーゼアッセイ緩衝液に添加した。各試料を二連で分析し、Ｕ２ＯＳ ＷＴ又はＡＭＰＫ ＫＯ細胞抽出物を対照として使用した。吸光度をＭｕｌｔｉＳｋａｎ Ｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で４５０／５５０ｎｍで測定した。

【0140】

免疫組織化学
脳を４℃で４％ＰＦＡ中で一晩後固定し、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．２）中３０％スクロースを含有する溶液中で平衡化し、クライオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ，Ｌｅｉｃａ；Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で３０μｍ冠状切片に切片化した。視床下部内側基底部の内側部分に沿った脳切片を選択した。脳切片を最初にＴＢＳで洗浄し、ＳＵＭＩ溶液（ＴＢＳ中０．２５％のブタゼラチン及び０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ｐＨ７．２）でブロックし、ＳＵＭＩ溶液に溶解した以下の一次抗体と４℃で一晩インキュベートした：ウサギ抗ｐＡＣＣα－Ｓｅｒ７９（ＰＡ５－１７７２５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ヤギ抗ＧＦＡＰ（ＳＡＢ２５００４６２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及びヤギ抗Ｉｂａ１（ａｂ１０７５１９，Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。脳切片をＴＢＳで洗浄し、ＳＵＭＩに希釈したそれぞれの二次抗体：ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ６４７（Ａ２１２０６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びロバ抗ヤギＡｌｅｘａ４８８（Ａ２１２０６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）と室温で２時間インキュベートした。切片をＴＢＳで洗浄し、ＴＢＳに溶解したＤＡＰＩ（Ｄ３５７１，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び／又はＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ（商標）５００／５２５（Ｎ２１４８０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）とインキュベートした。グリセロールに浸漬した２０倍対物レンズ及びｚ方向に３μｍの工程サイズを有する共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８ Ｌｅｉｃａ；Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ｚスタックとして画像を取得した。ＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩを使用して、取得した画像を処理した。定量化は、優勢なニューロンプロファイリングを示したｐＡＣＣα－Ｓｅｒ７９染色（ＰＡ５－１７７２５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した細胞体の可視化に基づいて行った。ＶＭＨ内のニューロンにおけるｐＡＣＣα－Ｓｅｒ７９の存在及び非存在を、Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｅ５００／５２５（Ｎ２１４８０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）との共染色を使用することによって評価した。ｐＡＣＣα－Ｓｅｒ７９の区別される細胞染色は、定量化の一部として破棄されなかった。

【0141】

二重ＳＦ１及びｐＡＣＣα－Ｓｅｒ７９免疫蛍光染色
マウスを深く麻酔し、０．９％生理食塩水、続いて４％ＰＦＡを経心臓的に灌流した。脳を取り出し、４℃で４％ＰＦＡ中で一晩後固定し、氷冷０．１ＭのＰＢＳで洗浄して過剰の固定溶液を除去し、続いて４℃で一晩、０．１ＭのＰＢＳ中の３０％スクロース（ｐＨ７．４）に移した後、－８０℃で凍結した。クライオスタットにより厚さ２０μｍの切片を得た。ＶＭＨを中心とする切片を選択し（ブレグマから－１．３４ｍｍ～－１．９４ｍｍ）、ＳＦ１ニューロン及びｐＡＣＣα－Ｓｅｒ７９の二重免疫蛍光染色のために処理した。

【0142】

簡単に説明すると、脳切片を０．１ＭのＰＢＳで５分間３回洗浄した後、ブロッキング溶液（０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有する０．１ＭのＰＢＳ中の５％正常ロバ血清）と室温で２時間インキュベートした。次に、切片を０．１ＭのＰＢＳで５分間２回洗浄し、次いで、第１の一次抗体（ＳＦ１、０．１ＭのＰＢＳで希釈した１：２００；ａｂ６５８１５、Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）と４℃で一晩インキュベートした。０．１ＭのＰＢＳで５分間の３回の洗浄後、切片を、０．１ＭのＰＢＳ中のロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４（１：１０００；Ａ２１２０７、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に室温で２時間インキュベートした。

【0143】

２つの一次抗体を同じ種（すなわち、ウサギ）から得たので、両方の抗ウサギ一次抗体間の交差反応性を回避するために、脳切片をＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂ断片ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：４０；１１１－００７－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）と共に室温で４時間インキュベートして、第１の一次抗体上の残りの開いた結合部位を飽和させた。Ｆａｂ断片抗体の飽和濃度を決定するために、本発明者らは、滴定曲線を実施してＦａｂ断片抗体の最適濃度を決定した。広範に洗浄した後、切片を第２の一次抗体（ｐＡＣＣα－Ｓｅｒ７９、０．１ＭのＰＢＳで１：１００希釈；ＰＡ５－１７７２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片を０．１ＭのＰＢＳで５分間３回洗浄した後、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ４８８（１：１０００；７１１－５４５－５１２、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とＲＴで２時間インキュベートした。

【0144】

３回の０．１ＭのＰＢＳ洗浄からなる最終工程の後、切片を、ＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ ＵＫ）を使用してマウントし、イメージングまで４℃の暗所で保存した。

【0145】

油浸６３倍対物レンズを備えた共焦点Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ－５－Ｘ顕微鏡を使用し、３倍のズームを使用して画像を取得した。ＶＭＨ切片の全ての写真（群当たりｎ＝４匹の動物）について同様のイメージング条件を確実にするために、正確に同じ顕微鏡設定（レーザー出力及びゲイン）を使用して全ての写真を撮影した。画像を、最大強度投影が行われ、輝度及びコントラストが等しく調整されたＦｉｊｉ（ＮＩＨ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）にインポートした。定量化のために、切片当たりの各ＳＦ１陽性ニューロンを手動で選択し、ｐＡＣＣシグナルの強度を分析し、対照に対するパーセンテージとして表す。更に、他の視床下部核（ＡＲＣ、ＤＭＨ及びＰＶＨ）におけるｐＡＣＣレベルをｓＥＶ注射の陰性対照として定量した。

【0146】

ウェスタンブロッティング
それらの特徴付けのために、１０μｇのｓＥＶをＰＡＧＥで分離した。移動後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、以下の抗体とインキュベートした：Ａｌｉｘ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ９（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１及びＧＲＰ９４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）。ＪＡＷＳのトランスフェクション効率の評価すること

【0147】

Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ及びｓＥＶ、精製ｓＥＶの膜へのその移行を有するＩＩ細胞（天然又はＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ修飾）を、上記と同じウェスタンブロッティングプロトコルに従ってＬａｍｐ２ｂ（Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で免疫ブロットした。

【0148】

以前に示したように^{１２、１３、１５～１８、４４}、解剖したＶＭＨ又は末梢組織をホモジナイズし、以下の組成の緩衝液で溶解した：５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、ＥＧＴＡ １ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ｖｏｌ／ｖｏｌ、０．１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．２７Ｍのスクロース及びプロテアーゼ阻害剤カクテル。以前記載されたように^{１２、１３、１５～１８、４４}、タンパク質溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に電気泳動転写し、以下の抗体でプローブした：ｐＡＣＣα－Ｓｅｒ７９、ＡＣＣα（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵＣＰ１、ＵＣＰ３、Ｌａｍｐ２ｂ（Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ＰＧＣ１α、ＰＧＣ１β、ＧＲＰ９４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）、β－アクチン、α－チューブリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及びＧＡＰＤＨ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）。

【0149】

次いで、各膜を対応する二次抗体：抗マウス又は抗ウサギ（ＤＡＫＯ；Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共にインキュベートした。値を、α－チューブリン（ＢＡＴ、骨格筋及び心臓について）又はβ－アクチン（分析した組織の残りについて）のタンパク質レベルに関連して表した。ｓＥＶに関しては、ポンソーＳによって測定されたタンパク質の総含有量に関して値を表した。ＩｍａｇｅＪ－１．３３ソフトウェア（ＮＩＨ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、オートラジオグラフィックフィルムをスキャンし、デンシトメトリによってバンドシグナルを定量した。全てのタンパク質の代表的な画像を、ロード対照の場合、上で説明したように、各タンパク質はそれ自体の内部対照（β－アクチン又はα－チューブリン）によって補正されたが、代表的なゲルが表示される。ゲルの画像を示す全ての図において、各写真の全てのバンドは常に同じゲルに由来するが、それらは明確にするためにスプライスされていてもよく、縦線でマークされている。

【0150】

統計分析
データを平均±ＳＥＭとして表し、データが相対化される場合、それらは適切な対照の割合として与えられる。統計的有意性は、事後ボンフェローニ検定に従う両側（少なくとも片側が指定される）スチューデントｔ検定（２つの群を比較した場合）又は両側ＡＮＯＶＡ（２つを超える群を比較した場合）によって決定した。連続変数間の関係を単純相関（ピアソンの検定）によって分析した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。

【0151】

データの可用性
この研究の所見を支持するデータは、妥当な要求に応じて対応する著者から入手可能である。

【0152】

結果
ニューロン標的化樹状細胞由来ｓＥＶの作製及び特性評価
任意の送達有機系に必要とされるように、免疫学的に不活性な小胞は、宿主免疫反応を制限するように設計されなければならなかった^{２７、２８}。未成熟樹状細胞を使用して、主要組織適合遺伝子複合体ＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）並びに表面抗原分類８０及び８６（ＣＤ８０及びＣＤ８６）等のＴ細胞活性化因子の低発現を有する大量のｓＥＶを生成した２７、２８。産生されたｓＥＶに神経標的化能力を付与するために、未成熟樹状細胞を遺伝子改変して、以前に報告されたように２８、（ｉ）ｓＥＶ膜で高発現するタンパク質であるリソソーム関連膜タンパク質２ｂ（Ｌａｍｐ２ｂ）から構成され２９、（ｉｉ）ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）への結合を介して血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を可能にする、神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）に由来する特定の糖タンパク質に融合された３０、融合タンパク質を一過性に発現させた。Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧプラスミドによるトランスフェクションの３日後、ｓＥＶを単離し、精製し、分析した。ニューロン標的化Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶは、天然のものと比較してより高いレベルのＬａｍｐ２ｂの発現を示し（図９ａ～図９ｂ）、ｓＥＶ膜でのＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧの良好な統合を示唆した。興味深いことに、この戦略を使用すると、ＲＶＧはそれらの物理的特性に影響を及ぼすことなくｓＥＶの外膜に局在化することが実証された^２８。文献と一致して、Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶは、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ、カメラレベル９、シャッタ：６０７、及びゲイン：１５、図１ａ）によって決定されるように、３０～１５０ｎｍのサイズ分布を有していた。これらの結果は、電子顕微鏡分析によって確認された（図１ｂ）。２つの異なる方法（ＮＴＡ及び電子顕微鏡法）によって得られたｓＥＶのサイズはわずかに異なる。このサイズ差は、電子顕微鏡検査のためにｓＥＶを染色する手順がそれらの脱水を誘発し、それらのサイズを低下させるという事実によって説明される^３１。ｓＥＶは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９及びＣＤ８１等の特異的マーカを発現し（図１ｃ）、ＥＶ純度を評価するために一般的に使用されるマーカであるＧＲＰ９４を欠いていた（図９ｃ）。

【0153】

ｓＥＶが核酸を効率的に送達する能力を、蛍光核酸プローブ、テキサスレッドで標識されたｓｉＲＮＡ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドを使用してインビトロで評価した。ｓＥＶに核酸を外因的にロードしたら、それらを未成熟樹状細胞と共に２、６又は２４時間インキュベートし、共焦点顕微鏡を使用してそれぞれの細胞蛍光を分析した。ｓｉＲＮＡ－Ｔｅｘａｓ ＲｅｄロードｓＥＶは、対照条件と比較して２時間後に未成熟樹状細胞の赤色蛍光を誘導した（非ロードｓＥＶ、図１ｄ）。同様に、ＧＦＰプラスミドロードｓＥＶは、対照条件と比較して６時間後及び２４時間後に未成熟樹状標的細胞の緑色蛍光を誘導した（図１ｅ）。

【0154】

次に、静脈内注射後にＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶがＢＢＢを通過する能力を評価した。ｓＥＶを近赤外色素ＤＩＤで標識し、これは脂質構造に組み込まれると蛍光を発する。ＤＩＤの非特異的な残留蛍光を回避するために、標識ｓＥＶを注射前に２回洗浄した。続いて、ＤＩＤ標識天然（対照）及びＤＩＤ標識Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶをヌードマウスの尾静脈に注射した。麻酔をかけた生存マウスを、インビボ蛍光イメージングシステムＭＡＥＳＴＲＯを使用して３０分、２、４及び６時間でＤＩＤ－蛍光スペクトル（励起最大：６４４ｎｍ；発光最大：６６５ｎｍ）を使用してイメージングした。蛍光ホールマウスイメージング（図１ｆ）からの分解能のレベルでは、ＤＩＤ－蛍光シグナルがどの組織から発生したかを正確に決定することができなかった。したがって、動物を６時間で屠殺し、異なる器官を回収し、蛍光をエクスビボで分析した。興味深いことに、ｓＥＶの２つの集団、天然（対照）及びＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧは、大部分が肺、脾臓及び肝臓に分布しており、対照のものと比較してＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ集団に対する肺標的化がより低い（図１ｇ）。

【0155】

この分布プロファイルは、これらの器官が高度に血管化されており、解毒プロセスに関与しているため、一貫している。興味深いことに、Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶは、天然のｓＥＶ対照状態と比較して、心臓（図１ｇ）及び脳（図１ｈ～図１ｉ）等のｎＡＣｈＲ発現組織における有意に増加した局在化を示した。

【0156】

全蛍光に対する脳による取込みのパーセンテージは２．３±０．３％であり、蛍光を組織重量で補正すると、取込みのパーセンテージは５．３±０．７％蛍光／ｍｇに上昇した。更に、脳内のＤＩＤ特異的蛍光は、Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ標的化戦略（対照：１００±５．０１；Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ：１２９±０．６５；Ｐ＜０．０１；図１ｈ－ｉ）を使用して有意に増加し、中枢神経系（ＣＮＳ）２８へのｓＥＶの標的化を増加させるためのその適合性を確認した。

【0157】

ｓＥＶが脳に到達できることを実証したら、次の工程は、排他的ＶＭＨ、特にＣＮＳにおいてこの因子を発現するユニーク細胞集団であるＳＦ１細胞への送達の特異性を制限することであった３２、３３。

【0158】

このために、ＳＦ１プロモータ（ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ）の制御下で発現されるＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体をコードするプラスミドを設計した（図９ｄ）。精製ニューロン標的化Ｌａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶに、続いてＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮをロードした。興味深いことに、ロードは、カメラレベル９（シャッタ：６０７、ゲイン：１５）及び電子顕微鏡法（図１ａ及び図９ｅ～図９ｆ）でＮＴＡによって測定されるように、形態学的特性もｓＥＶのサイズも変更しなかった。更に、封入されたＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮプラスミドの量を、ｓＥＶの溶解の有無にかかわらず、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ ０．２％（図９ｇ～図９ｈ）によりアッセイしたところ、ｓＥＶコアの膜及び内部にＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮプラスミドが存在することが示された。

【0159】

次いで、本発明者らは、視床下部細胞株ＧＴ１－７における、ＡＭＰＫの主要な下流標的であるアセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼα（ｐＡＣＣα）のリン酸化レベルをアッセイすることによってこの戦略の有効性を評価し、これは、ＳＦ１^３４を内因的に発現し、多数のニューロン特性を有し^３５、予備的ＡＭＰＫニューロン研究の優れたモデルとなっている^{３６、３７}。データは、ＧＴ１－７細胞をＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶと２４時間インキュベートした場合、非ロード対照ｓＥＶと比較して、ＡＣＣαのリン酸化レベルが有意に減少したことを示した（図１ｊ～図１ｋ）。注目すべきことに、ＳＦ１を発現しない他のＣＮＳ由来細胞（例えば、初代星状細胞及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞）をＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶとインキュベーションした場合、ｐＡＣＣレベルにおける変化が何ら見出されなかった（図９ｉ～図９ｊ）。まとめると、これらのデータは、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体をロードした生成されたＬａｍｐ２ｂ－ＲＶＧ ｓＥＶが、（ｉ）サイズ及び形態が均一であり、（ｉｉ）核酸を送達することができ、（ｉｉｉ）静脈内注射後に脳を標的化し、（ｉｖ）特異的にインビトロでＳＦ１プロモータの制御下でＡＭＰＫα１活性を調節することを示す。

【0160】

ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる中枢処置は、肥満症マウスにおいて摂食独立体重減少を誘導した
最初に、本発明者らは、６０％高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられた食餌誘発性肥満症（ＤＩＯ）マウスのＶＭＨにおけるＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの定位的中枢送達の有効性を評価した。結果は、この核内に投与した場合、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶが３日間摂食非依存性体重減少を誘導することを実証した（図２ａ～図２ｂ）。次に、本発明者らは、以前に示されたように^{１５～１７}、顕微解剖された視床下部抽出物中のｐＡＣＣα（ＡＭＰＫ活性の代用マーカ）のレベルをアッセイした。マイクロパンチの特異性を、それぞれＳｆ１（ＶＭＨの特異的マーカ）、プロオピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ；視床下部弓状核の特異的マーカ、ＡＲＣ）及びヒポクレチン／オレキシン（Ｈｃｒｔ；視床下部外側領域の特異的マーカ、ＬＨＡ）のｍＲＮＡレベルを測定することによって検証した（図１０）。本発明者らのデータは、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶが、ＶＭＨではＡＣＣαのリン酸化レベルの有意な減少を誘導したが、ＡＲＣ又はＬＨＡでは誘導しなかったことを示した（図２ｃ～図２ｄ）。これは、肩甲骨間領域の温度上昇及びＢＡＴ脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）タンパク質レベルの上昇によって示されるように、ＢＡＴ熱産生の増加に関連していた（図２ｅ～図２ｈ）。全体として、これらのデータは、ＡＭＰＫα１－ＤＮアイソフォームによるウイルス遺伝子媒介処置の効果、並びにＳＦ１ ＡＭＰＫヌルマウスの表現型を再現する^{１２～１８}。

【0161】

ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置は視床下部ニューロンＡＭＰＫ活性を調節する
次に、本発明者らは、ＤＩＯマウスの視床下部におけるＡＭＰＫ活性の調節におけるＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの全身投与の能力を調べることを目的とした。最初に、本発明者らは、ロードｓＥＶの静脈内注射の２４時間後に、いくつかの組織におけるＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ導入遺伝子の発現をアッセイすることによって、本発明者らの処置の効率を評価した。導入遺伝子はＶＭＨ試料でのみ検出されたが、ＳＦ１を発現する器官（すなわち、副腎、下垂体及び精巣）又はＳＦ１を発現しない器官（すなわち、ＢＡＴ、肝臓、骨格筋、及び心臓）を含む他の評価器官のいずれにも検出されなかった（図３ａ）。全体として、このデータは、ＡＭＰＫα１－ＤＮ導入遺伝子の発現が、ＶＭＨのＳＦ１発現ニューロン（ＳＦ１駆動発現を考慮）を含むニューロン細胞（所与のＲＶＧ依存性向性^{２８、３０}）に限定されることを示し、本発明者らの戦略が特異的であることを実証した。これらの結果を確認するために、静脈内注射後のいくつかの組織におけるＡＣＣαのリン酸化レベルをアッセイした。ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶは、ＶＭＨにおけるＡＣＣαのリン酸化レベル及びＡＭＰＫ活性の有意な低下を誘導した（図３ｂ～図３ｄ）。これに関連して、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶ処置マウスは、ｐＡＣＣα及びＮｅｕｒｏｔｒａｃｅの共局在化によって実証されるように、対照と比較してＶＭＨ内のｐＡＣＣα Ｓｅｒ７９陽性ニューロンの数の有意な減少を示した（図３ｅ～図３ｆ）。本発明者らはまた、非神経細胞におけるｐＡＣＣαの存在を、ＶＭＨにおけるグリア線維酸性タンパク質（星状細胞マーカであるＧＦＡＰ）及びイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１、ミクログリアマーカ）の共染色によって評価した。しかし、本発明者らの分析では、ＧＦＡＰ又はＩｂａ１発現細胞とのｐＡＣＣα共局在化は検出されなかった（図１１ａ～図１１ｂ）。本発明者らの処置の特異性におけるより多くの洞察を得るために、本発明者らは、二重免疫蛍光アッセイによってＶＭＨのＳＦ１ニューロンにおけるｐＡＣＣα－Ｓｅｒ７９のレベルを分析した。本発明者らのデータは、ｐＡＣＣ免疫反応性が、陰性対照と比較した場合、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶで処置したマウスのＳＦ１ニューロンで有意に減少したことを示し（図３ｇ～図３ｈ）、この技術の特異性を実証した（図１１ｃ）。

【0162】

注目すべきことに、ｐＡＣＣαレベルは、ＡＲＣ、背内側（ＤＭＨ）及び室傍（ＰＶＨ）等の隣接視床下部核では減少しなかった（図１１ｄ）。

【0163】

全体として、この証拠は、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ導入遺伝子の発現がＶＭＨ内のＳＦ１ニューロンで起こるが、他の視床下部細胞集団では起こらないことを実証している。

【0164】

ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる本発明者らの処置の特異性を更に確認するために、ＣＮＳ及び末梢組織の他の部分におけるｐＡＣＣレベルを調べた。試験した任意の他の脳領域（例えば、皮質、視床及び小脳；図１２ａ）又は肝臓、副腎、精巣、ＢＡＴ、心臓及び骨格筋等の末梢組織（図１２ｂ）におけるＡＣＣαのリン酸化レベルに変化は見られなかった。ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶは、初代褐色脂肪細胞においてｐＡＣＣαレベルの変化を誘導しなかった（図１２ｃ）。これらのデータはまた、他の組織（精巣及び副腎等のＳＦ１を発現するものを含む）におけるＡＭＰＫシグナル伝達の鈍化に対する潜在的な副作用がおそらく無視できることを示唆している。しかし、ＳＦ１細胞が少ない（例えば、精巣ライディッヒ細胞に限定される）末梢組織における総タンパク質抽出物に依存するアッセイの使用は^{３２、３３}、信頼性があるとは考えられないかもしれない。この制限を克服し、精巣及び副腎機能に対する処置の可能性のある影響を更に評価するために、対照及びＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで処置したマウスの精巣及び副腎におけるテストステロン及びコルチコステロン（ＣＯＲＴ）の循環レベル並びに重要なステロイド産生酵素のｍＲＮＡ発現を分析した。データは、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶでの処置が、テストステロン循環レベル（図１２ｄ）、又はステロイド産生性急性調節タンパク質（ＳＴＡＲ）、コレステロール側鎖切断酵素（Ｐ４５０ｓｓｃ）及び１７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ３型（１７β－ＨＳＤ３）等の精巣ステロイド産生に関与するいくつかの酵素のｍＲＮＡレベルのいずれにおいても有意な変化を誘導しなかったことを示した（図１２ｅ）。一方、副腎機能は、循環ＣＯＲＴの変化（図１２ｆ）又はＰ４５０ｓｓｃ若しくはＳＴＡＲのｍＲＮＡ副腎レベルの変化（図１２ｇ）が検出されなかったので、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶでの処置によって影響されなかった。同様に、下垂体産生がＳＦ１によって調節されることが知られている黄体形成ホルモンの循環レベル（ＬＨ；図１２ｈ）又はＬＨβサブユニットのｍＲＮＡレベル（図１２ｉ）のいずれにも変化は見られなかった^３８。

【0165】

ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置は、肥満症マウスにおいて摂食非依存性体重減少を誘導した
ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの体重調節における効率を評価するために、ＤＩＯマウスを使用した。特に、ＣＮＳへの直接投与を含むいかなる手順／手術も回避するために、マウスの尾静脈に全身注射した。

【0166】

最初に、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ導入遺伝子が、ロードｓＥＶによる末梢処置後にＶＭＨ ＳＦ１ニューロンにおいてどのくらい長く発現されたかを評価した。本発明者らのデータは、ＡＭＰＫα１－ＤＮ導入遺伝子が２４時間ＶＭＨで検出され得ることを示した（図３ｉ～図３ｊ）。しかし、中枢投与のみを含む実験（図２ｈ）を維持すると、ＢＡＴ ＵＣＰ１発現の増加は、静脈内注射後４８ｈまで検出することができる（図１２ｊ）。これらの理由から、本発明者らは、６日間にわたって３日ごとに１回の注射に基づく戦略を選択した。本発明者らは、６日間の処置（０日目及び３日目の注射）後に、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの静脈内注射が、対照ｓＥＶと比較した場合、有意かつ顕著な摂食非依存性体重減少をＤＩＯマウスにおいて誘導し（図４ａ～図４ｄ）、同時にＥＥの増加を伴うことを見出した（図４ｅ）。しかし、呼吸商（ＲＱ）及び自発運動活性（ＬＡ）は修正されなかった（図４ｆ～図４ｇ）。注目すべきことに、ｓＥＶ誘発性体重減少は、核磁気共鳴分析によって実証されるように、脂肪過多の減少と関連していた（図４ｈ～図４ｋ）。

【0167】

次に、本発明者らは、ＤＩＯマウスにおけるｓＥＶ処置の長期効果（４週間、３日ごとの投与）を調査した。結果は、通常は体重を増加させた対照ｓＥＶで処置したマウスと比較した場合、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ注射ＤＩＯマウスは、食物摂取量に変化はなく（図４ｏ～図４ｐ）、体重の著しい長期減少を示した（図４ｌ～図４ｎ）。注目すべきことに、処置を中止した場合、ｓＥＶの効果は持続した。実際、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで処置したＤＩＯマウスは、対照ｓＥＶで処置したマウスと比較した場合、注射を中止した（ウォッシュアウト）２週間後まで体重の回復を示さなかった（図４ｌ～図４ｍ）。全体として、これらのデータは、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによって誘導される体重減少が一過性ではなく、ウォッシュアウト期間が対照群の体重に追いつくのに十分なリバウンド効果を暗示しないことを示している。ｓＥＶの重量減少作用は、循環レプチンレベルを減少させる傾向と関連していたが（図１３ａ）、成長／分化因子１５の変化は観察されなかった（ＧＤＦ１５；図１３ｂ）。

【0168】

循環炎症マーカの評価は、インターロイキン－６（ＩＬ－６）レベル（図１３ｃ）及びインターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ－１０）レベル（図１３ｄ）の変化を示さず、ｓＥＶ投与が全身性炎症反応を誘導しなかったことを示唆した。循環代謝パラメータに対するＳＦ１ロードｓＥＶの効果も評価した。本発明者らのデータは、ロードｓＥＶ処置群において有意に減少した非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）循環レベルを示し、これはＢＡＴ熱産生の増加と適合し（以下を参照）、総トリグリセリド又はコレステロールに変化はなかった（図１３ｅ～図１３ｇ）。最後に、本発明者らの処置の起こり得る有害作用を評価するために、本発明者らは、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）に対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの影響を分析したが、それらのいずれも変化しなかったので（図１３ｈ～図１３ｉ）、ｓＥＶの肝臓影響を除外した。重要な心血管パラメータ、すなわち心拍数（図１３ｊ）又は動脈圧（収縮期、拡張期及び平均；図１３ｋ～図１３ｍ）のいずれにも変化は見られなかった。むしろ、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶで処置したマウスでは血圧が低くなる傾向があり（これは有意ではなかったが）、この処置によって誘発された体重減少と一致していた。これらのデータは、全身投与した場合のＡＭＰＫ－ｓＥＶの心血管副作用の欠如を示している。

【0169】

最後に、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ処置の時間依存性効果についてより多くの洞察を得るために、本発明者らはクロスオーバー研究を行った。この新しい実験設定では、インターカレートした非処置期間を有する２サイクルプロトコルに従って動物を尾静脈に注射した。したがって、最初の注射の機能的効果がもはや観察されなくなると、新しい注射を行って新しい処置の効力を評価した。データは、両方の注入サイクルが予想される摂食非依存性体重減少を誘導したことを示した（図４ｑ～図４ｓ）。

【0170】

ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置は、肥満症マウスにおいてＢＡＴ熱産生を増加させた
次に、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで処置したＤＩＯマウスで観察された摂食非依存性体重減少がＢＡＴ熱産生の上昇に関連し得るかどうかを調べた。これは、これらの視床下部細胞におけるＡＭＰＫα１の遺伝的阻害又は除去が褐色脂肪活性を促進することを以前の証拠が示しているという事実によって１２～１８、２３、及び本発明者らの定位実験（図２ｅ～図２ｈ）及び時間応答実験（図１２ｊ）のデータによって正当化された。ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで処置したマウスは、注射後１日目からより高いＢＡＴ温度を示し、これは処置全体にわたって持続した（図５ａ～図５ｃ）。

【0171】

提示された証拠は、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる末梢処置が、摂食に関連する体重減少ではなく、ＢＡＴ熱産生を誘発することを示唆した。したがって、ＢＡＴ機能の調節を含む機構的実験を行う前に、本発明者らは、これらの変数間の可能な相関に対処することを目的とした。本発明者らのデータは、体重変化とＢＡＴ温度との間の非常に有意な負の相関を明らかにした（Ｐ＜０．０００１）：ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを投与したマウスは、最も体重が減少し、ＢＡＴ温度がより高かったマウスである（図５ｄ）。特に、食物摂取は両群で同様であり、関連性は見られなかった（図５ｅ）。全体として、この証拠は、ＢＡＴ機能の増加がＥＥの増加をもたらし、このｓＥＶ戦略の体重減少効果を説明したことを示唆した。視床下部ＡＭＰＫを標的とするこれらのｓＥＶの熱産生効果に対する更なる洞察を得るために、本発明者らはクロスオーバー実験でＢＡＴ温度を分析した（図４ｑ～図４ｓ）。特に、処置を中止した場合、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ誘発ＢＡＴ温度は対照／基礎値に戻り（図５ｆ～図５ｈ）、観察された効果が時間及び処置依存的であったことを示した。

【0172】

更に、本発明者らは、げっ歯類における周知の熱調節機構である尾基部温度に対するそれらの影響を調べた^３９。ロードされたｓＥＶは、尾基部温度のわずかであるが有意ではない上昇を誘導し（図５ｉ～図５ｊ）、尾部による熱放散の傾向を示した。

【0173】

ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置はＢＡＴ熱産生プログラム及びグルコース取込みを誘導した
ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ処置ＤＩＯマウスのＢＡＴは、重要な熱産生性マーカ、例えば、ＵＣＰ１、脱共役タンパク質３（ＵＣＰ３）並びにペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ共活性化因子１α及びβ（ＰＧＣ１α及びＰＧＣ１β）のタンパク質レベルの増加を示した（６日間の図６ａ～図６ｂ及び２８日間の図１４ａ）。これらのデータと一致して、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの注射は、肝臓（対照組織として使用）と比較した場合、より高いＢＡＴ １８Ｆ－ＦＤＧ取込みを誘導し（図６ｃ～図６ｄ）、より高いＢＡＴ活性化を示した。興味深いことに、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの注射はまた、わずかに増加したＵＣＰ１染色によって示唆されるように、皮下白色脂肪組織（ｓｃＷＡＴ）の褐色化を増加させる有意でない傾向に関連していた（図６ｅ～図６ｆ）。

【0174】

全体として、この証拠は、視床下部ＳＦ１ニューロンを標的とするＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの全身投与がＢＡＴ活性の変化を誘導することを示している。注目すべきことに、この作用は、以下の２つの主な理由のために、褐色脂肪細胞（ＳＦ１が発現されていない場合）に対するｓＥＶの非特異的作用に関連しない可能性が高い：（ｉ）ＢＡＴ ＡＭＰＫα１の阻害はこの組織の活性化ではなく機能障害を引き起こすことが最近報告されており４０、（ｉｉ）重要なことに、インビボでのｓＥＶ処置後（図１２ｂ）又はインビトロでｓＥＶを初代ＢＡＴ脂肪細胞に与えた場合（図１２ｃ）のいずれにおいても、交絡する非特異的作用の存在を除いて、ＡＭＰＫシグナル伝達の変化はＢＡＴにおいて見られなかった。更に、骨格筋熱産生プログラムに変化は見られず（図１４ｂ）、ｓＥＶの全身投与時に観察されるＥＥの増加が筋熱産生ではなくＢＡＴによって促進されることを示している。

【0175】

ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ誘導ＢＡＴによる全身処置は、ＳＮＳの活性化による熱産生及び体重減少を誘導した
ＢＡＴ熱産生は、主に、β３アドレナリン受容体（β３－ＡＲ）を介してＳＮＳによって制御される４１～４３。したがって、本発明者らは、ＶＭＨ－ＳＦ１ニューロンにおけるＡＭＰＫα１を標的とするｓＥＶの全身注射後のＢＡＴの調節がＳＮＳによって媒介されるかどうかを調べた。ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶは、マイクロニューログラフィによって直接記録された総ＢＡＴ交感神経トラフィックを増加させた（図７ａ～図７ｂ）。記録部位の遠位のＢＡＴ神経の横断は、遠心性交感神経活動の測定を可能にした。ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶで処置したマウスは、対照と比較して有意に上昇した遠心性ＢＡＴ交感神経活性（ＳＮＡ）を示した。しかし、計算された求心性ＢＡＴ神経活動は２つの群の間で異ならなかった。これらのデータは、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶが、求心性交感神経流出ではなく遠心性を刺激したことを実証しており、これは処置の中枢媒介効果と一致している。ＳＮＡデータと一致して、特定のβ３－ＡＲアンタゴニスト、ＳＲ５９２３０Ａの皮下投与によるβ３－ＡＲの薬理学的阻害^{１２、１３、１５～１８、４４}は、摂食を妨げることなく、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの末梢静脈内注射によって誘起される体重の減少を防止した（図７ｃ～図７ｄ）。

【0176】

β３－ＡＲ遮断後の増加した体重と一致して、ＳＲ５９２３０Ａによる処置は、ＢＡＴ温度（図７ｅ～図７ｆ）及びＵＣＰ１タンパク質レベル（図７ｇ～図７ｈ）の増加を無効にした。注目すべきことに、単独で投与した場合、ＳＲ５９２３０Ａは、分析したパラメータのいずれにおいても変化を促進しなかった（対照＋ビヒクルｖｓ対照＋ＳＲ５９２３０Ａ：（ｉ）体重：－１．２７±０．０９ｖｓ－１．３０±０．４２、有意性なし；（ｉｉ）食物摂取量：２．４９±０．０７ｖｓ２．５８±０．１７、有意性なし；（ｉｉｉ）ＢＡＴ温度：３６．８±０．１８ｖｓ３６．７±０．０７、有意性なし；（ｉｖ）ＵＣＰ１ ＢＡＴ：１００±８．２ｖｓ８４．１±８．３、有意性なし）。全体として、この証拠は、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの全身注射が、摂食とは無関係に、ＶＭＨのＳＦ１ニューロンに作用する体重減少を促進し、β３－ＡＲ活性化を介してＳＮＳによるＢＡＴ熱産生の増加をもたらすことを示している。特に、示されるように、重要な心血管パラメータに変化が見られなかったという事実（図１３ｊ～図１３ｍ）は、ｓＥＶによって及ぼされる交感神経刺激がＢＡＴに特異的であることを示唆した。

【0177】

ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置は、熱的中性条件におけるＢＡＴ熱産生及び体重減少を誘導した
本発明者らは、非熱的中性環境（マウスを収容する場合２２～２３℃）では、ＢＡＴの基礎活性化がｓＥＶの効果をマスクし得るため^{４１、４５}、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶの効果が周囲温度に依存するかどうかを調べることを目的とした。しかし、データは、熱的中性条件（３０℃）に収容されたＤＩＯマウスにおけるＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶでの処置が、摂食とは無関係に（図８ｃ～図８ｄ）、顕著な体重減少を誘発し（図８ａ～図８ｂ）、ＢＡＴ熱産生の増加（図８ｅ～図８ｆ）及びＢＡＴ ＵＣＰ１タンパク質含有量の増加（図８ｇ～図８ｈ）に関連することを示した。全体として、この証拠は、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶが、ＢＡＴ熱産生を標的とすることによってエネルギーバランス及び体重を調節することを実証している。

【0178】

ＵＣＰ１は、全身ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによって誘起される熱産生効果及び体重減少効果に不可欠である
最後に、本発明者らは、ＢＡＴ熱産生及び体重に対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶの効果が、ＵＣＰ１発現に依存するかどうかを調べた。ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶは、野生型マウスにおいて摂食非依存性であるが熱産生依存性の体重減少を誘導したが（図８ｉ、図８ｋ、図８ｍ及び図８ｎ）、この効果は、ｕｃｐ１ヌルマウスでは全く存在しなかった（図８ｊ、図８ｌ、図８ｏ、及び図８ｐ）。全体として、これらのデータは、ＵＣＰ１が熱産生及びエネルギーバランスに対するＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶの中心的な効果を媒介するのに不可欠な役割を果たすことを実証し、同時に筋肉等の他の末梢組織からの寄与が無視できることを確認する。

【0179】

考察
現在の肥満症のパンデミックを阻止するための戦略の開発は、主に、（ｉ）体重を調節する恒常性機構の固有の冗長性、（ｉｉ）逆調節応答の結果としての恒常性摂動に対する回復力（すなわち、摂食の減少はＥＥの減少をもたらす）、（ｉｉｉ）これまで利用可能であったほとんどの薬物の限定された特異性、及び（ｉｖ）有害な副作用に起因して妨げられてきた^１～５。したがって、より正確な標的化、したがってより高い特異性を可能にする新しい遺伝的戦略／資源を生成することは興味深いであろう。

【0180】

それらの組成のために、ｓＥＶは、薬物のシャトルとして使用することができ、したがって、分子を特定の細胞に向けて運ぶために使用することができ^{１９～２２}、したがって、予後、バイオマーカ及び革新的な治療のために利用される^{１９～２２、２４～２６}。実際、生体適合性及び低い免疫原性等のそれらの特性は、それらをＣＮＳに到達するのに理想的にする^{２７、２８}。エネルギーバランスを調節する中心的な機構を標的とするために、ＢＢＢの交差は、目的の薬剤を送達する際の主要な課題である。この制限を回避するために、Ｌａｍｐ２ｂに融合したＲＶＧペプチドをその表面に発現する操作されたｓＥＶが開発され、特異的なニューロン標的化を可能にしたが^２８、任意の所与の脳領域の１つのニューロン集団に特異的ではない。本発明者らは、肥満症主導の状況において、目的のＤＮＡプラスミドのカーゴとしてｓＥＶを使用するこのアプローチを利用した。したがって、この研究では、本発明者らは、エネルギーバランスを調節する中枢経路及び正準経路、すなわち視床下部ＡＭＰＫ^{３、８、１１}、特にＶＭＨのＳＦ１ニューロンを標的とする送達ツールとしてｓＥＶを開発した。

【0181】

特に、ＡＭＰＫ作用は高い解剖学的及びアイソフォーム依存的特異性を示し、食欲不振は、視床下部弓状核（ＡＲＣ）のアグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ）ニューロンにおけるＡＭＰＫα２アイソフォームの選択的消失によって誘発されるが^４６、ＶＭＨのＳＦ１ニューロンにおけるＡＭＰＫα１活性の阻害は、ＳＮＳ駆動ＢＡＴ熱産生を刺激することによってエネルギー消費を増加させる^{１７、１８}。注目すべきことに、ＳＦ１ニューロンにおけるＡＭＰＫα１の選択的消失を有するマウスはＤＩＯ１８に対して耐性であり、このことは、視床下部集団においてこのアイソフォームを標的化することが肥満症に対する興味深い標的であり得ることを示唆している。しかし、この戦略の実施は、ＡＭＰＫの末梢阻害に関連する任意の副作用が反対の効果、インスリン抵抗性の悪化及び糖尿病を有するので、高レベルの視床下部特異性を必要とし^{３、４７、４８}、したがって、処置の特異性及び安全性の重要性を高めた。したがって、本発明者らは、ＳＦ１プロモータの制御下でＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体をコードするプラスミドを外因的にロードしたｓＥＶを開発した。特に、任意の中枢／脳操作を回避し、潜在的な治療的使用に許容され得る状態にするために、これらのｓＥＶを尾静脈に末梢投与した。注目すべきことに、データは、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶが、（ｕｃｐ１ヌルマウスにおける効果の欠如によって実証されるように）ＳＮＳ媒介性ＵＣＰ１依存性ＢＡＴ熱産生の増加に起因して、顕著な摂食非依存性体重減少効果を促進し、全身性炎症応答又は肝臓及び心血管の副作用のいずれにも関連しないことを示した。注目すべきことに、この作用がＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶ注射マウスにおける食欲代償性変化の非存在下で起こるという事実は、本発明者らの長期及びクロスオーバー処置によっても実証されるように、典型的には食事療法介入を特徴付ける望ましくないリバウンド効果を排除するので、並進的関連性を有する^５。

【0182】

注目すべきことに、本発明者らの共局在解析によって実証されたように、末梢組織に到達したにもかかわらず、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶは、ＶＭＨ、特にＳＦ１ニューロンにおけるＡＭＰＫシグナル伝達のみを調節した。これは、（ｉ）ニューロン２８に対するＲＶＧ媒介指向性及び（ｉｉ）ＡＭＰＫα１－ＤＮ導入遺伝子のＳＦ１駆動発現に起因する。注目すべきことに、（ｉ）他の視床下部隣接核、（ｉｉ）精巣、副腎及び下垂体等の末梢ＳＦ１発現組織、並びに（ｉｉｉ）肝臓、ＢＡＴ、心臓及び骨格筋等の末梢非発現ＳＦ１組織では、ＡＭＰＫ活性の検出可能な変化は見られなかった。全体として、これらのデータは、本発明者らが開発したＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶによる全身処置が、ＶＭＨのＳＦ１ニューロンにおけるＡＭＰＫα１機能を特異的に阻害することによって体重減少を誘導することができたことを示している。これは、視床下部ネットワークが、肥満症及び他の神経障害のための新しい治療可能性を開く末梢性に運ばれる薬剤によって選択的に標的化され得ることを実証する。この考えを強化するために、本発明者らのデータはまた、全身投与した場合、ＡＭＰＫ－ｓＥＶの肝臓及び心血管の副作用がないことを示した。これは、視床下部ＡＭＰＫの標的化が、エネルギーバランス及び代謝を調節する末梢機構に作用する処置に関連する二次的効果のいくつかを迂回し得ることを示している^５。

【0183】

肥満症に対する成功した処置法の開発のための戦略は、脳を標的とする固有の複雑さを考慮して、主に末梢アプローチに集中してきた。しかし、エネルギー恒常性を制御する視床下部機構に関する知識の増加により、別個の領域における神経回路の特異的調節が、薬物開発のための新規でより効果的な標的を提供し得ることが明らかになった。興味深いことに、肥満症の新しい処置法（レプチン、グレリン、グルカゴン様ペプチド－１アゴニスト、グルカゴン等）の開発の基礎となったエネルギーバランスにおける重要なプレイヤーの多くは^１～６、視床下部ＡＭＰＫを介して作用する可能性が高い^３。

【0184】

しかし、ＣＮＳにおける特定のニューロンを標的とすることは、困難な作業であると考えられた。ここで、本発明者らは、肥満症の処置、炎症反応の制限、及び高度に選択的な細胞作用の増強におけるより伝統的な送達システムの代替としての天然バイオキャリアとして使用されるｓＥＶの能力、すなわちＶＭＨのＳＦ１ニューロンにおけるＡＭＰＫα１についての証拠を提供する。したがって、遺伝学的ツールを有するｓＥＶは、肥満症及び関連する併存症並びにおそらく他の神経疾患の処置のための新しい戦略の合理的な設計において新しい方法を開く。

【0185】

実施例２
遺伝性肥満症は２つのカテゴリーに分類される：メンデル型に遺伝する単遺伝子性肥満症は、典型的にはまれであり、早期発症及び重度であり、それぞれが小さな効果を有する数百の多型の結果である多遺伝子性肥満症である。単遺伝性肥満症の場合、治療選択肢は少ない。例えば、突然変異がリガンド、例えばホルモンの欠如を伴う場合（低ホルモン症候群をもたらす）、１つの可能性は補充療法であり得る。その戦略は、要因に応じて異なる程度の効率を与えている。しかし、変異がレプチン受容体（ＬＥＰＲ）又はメラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）等の受容体上で起こる場合、治療選択肢はより限定され、肥満手術でさえ失敗する可能性がある。

【0186】

視床下部ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は、全身レベルでのエネルギーバランス及び代謝の標準的な調節因子である。ＡＭＰＫは、レプチンの食欲不振作用及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の熱産生作用の両方の重要な下流因子である。本発明者らは、ＢＡＴ熱産生活性を調節する重要な集団である視床下部腹内側核（ＶＭＨ）のステロイド産生因子１（ＳＦ１）ニューロンにおいて視床下部ＡＭＰＫα１（ドミナントネガティブ変異体ＡＭＰＫα１－ＤＮの使用）を特異的に阻害するために、ＤＮＡ配列のカーゴとして小型細胞外小胞（エキソソーム）を使用した。注目すべきことに、食餌誘発性肥満症（ＤＩＯ）マウスをＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶで全身（尾静脈内）処置した場合、これらのマウスは、交感神経活性化及びＢＡＴにおける脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）依存性熱産生の増加に関連する顕著な摂食非依存性体重減少を示した。重要なことに、代謝、内分泌又は心血管の炎症反応又は他の有害作用は発生しなかった。

【0187】

この研究の目的は、ｄｂ／ｄｂマウスにおいてＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮを有するｓＥＶを使用して、ｉ）本発明者らの戦略が遺伝的形態の肥満症の処置に有効であるかどうか、及びｉｉ）ＢＡＴ熱産生を調節する中心機構を標的とすることが、ＬＥＰＲ欠損症の処置のための新しい治療選択肢を提供し得るかどうかに対処することであった。

【0188】

１．材料及び方法
１．１．動物
雄ヌルＬＥＰＲ（ｄｂ／ｄｂ）及び野生型（ＷＴ）同腹仔マウス（Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊ；８週齢；Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ）を実験に使用した。それらは、水及び標準的な実験室用食事（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－Ａｎｉｍａｌ－Ｆｏｏｄ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）への自由なアクセスを許された。７～８マウス／群を使用した。実験は、動物実験に関する国際法に準拠して行われ、ＵＳＣ倫理委員会（１５０１２／２０２０／０１０）によって承認された。

【0189】

１．２ ｓＥＶの生成、検証、及び処置
ｓＥＶへのニューロン標的化能力を付与し、宿主免疫反応を制限するために、本発明者らは、前の実施例に示すように、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）への結合を介して血液脳関門（ＢＢＢ）横断を可能にする、神経栄養性狂犬病ウイルス（ＲＶＧ）に由来する特定の糖タンパク質に融合したリソソーム関連膜タンパク質２ｂ（ｓＥＶ膜で高発現されるタンパク質であるＬａｍｐ２ｂ）の融合タンパク質を発現するように遺伝子改変された未成熟樹状細胞を使用した。以前に実証されたように｛Ｍｉｌｂａｎｋ、２０２１＃５６４９４｝、電子顕微鏡法、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）膜タンパク質マーカを使用して示されるように、ｓＥＶを深く特徴付けた。ｓＥＶに、ＳＦ１プロモータ（ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ）の制御下で発現されるＡＭＰＫα１－ＤＮ変異体をコードするプラスミドをロードして、それらの作用をＶＭＨ中のＳＦ１細胞に限定した。示されるように、１００μｇの非ロードｓＥＶ又はＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮロードｓＥＶを、３日ごとに２週間マウスの尾静脈に注射した｛Ｍｉｌｂａｎｋ、２０２１＃５６４９４｝。体重及び食物摂取量を毎日測定した。

【0190】

１．３．動物の測定
ＢＡＴ温度（Ｂ３３５：Ｃｏｍｐａｃｔ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ－Ｔｈｅｒｍａｌ－Ｉｍａｇｉｎｇ－Ｃａｍｅｒａ；ＦＬＩＲ）及び核磁気共鳴（ＮＲＭ；Ｗｈｏｌｅ Ｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ；ＥｃｈｏＭＲＩ）を上記のように行った。

【0191】

１．４分析方法
血清トリグリセリドレベル、ＶＭＨアセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ｐＡＣＣα／ＡＣＣα）及びＢＡＴ ＵＣＰ１ウェスタンブロッティング、並びにＢＡＴ及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）ＵＣＰ１免疫染色を、同じキット（Ｓｐｉｎｒｅａｃｔ）、抗体［（ｐＡＣＣα－Ｓｅｒ^７９及びＡＣＣα（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ＵＣＰ１（Ａｂｃａｍ）；β－アクチン、α－チューブリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び上記の試薬を使用して記載されるように行った。ウェスタンブロット画像では、全ての試料を同じゲルにロードしたが、試料を並べてロードしなかった場合は黒い線を挿入した。

【0192】

１．５統計分析
データをＭＥＡＮ±ＳＥＭとして表す。統計学的有意性は、混合効果分析（時間経過処置について）又は対応のないスチューデントｔ検定によって決定し、Ｐ＜０．０５は有意であった。

【0193】

２．結果
２．１．全身ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶはｄｂ／ｄｂマウスにおいて体重減少を誘導する
ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶの静脈内注射は、野生型（図１５Ａ、図１５Ｃ、図１５Ｅ及び図１５Ｆ）及びｄｂ／ｄｂマウス（図１５Ｂ、図１５Ｄ、図１５Ｇ及び図１５Ｈ）において有意な摂食非依存性体重減少を促進し、ｄｂ／ｄｂマウスにおける脂肪過多の減少（図１５Ｉ及び図１５Ｋ）及び血清トリグリセリドレベルの減少（図１５Ｊ及び図１５Ｌ）に関連した。

【0194】

２．２．全身ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶは熱産生及び褐色化を増加させた
ＶＭＨのＳＦ１ニューロンにおけるＡＭＰＫα１の阻害は、ＢＡＴ上の交感神経緊張を増加させる古典的な機構であり、熱産生、エネルギー消費の増加及び体重減少をもたらす。本発明者らのデータは、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶの静脈内注射が両方のマウスモデルのＶＭＨにおいてｐＡＣＣαレベルを減少させることを示し（図１６Ａ及び図１６Ｂ）、この視床下部核におけるＡＭＰＫ活性の阻害における本発明者らの処置の有効性を実証した。

【0195】

次に、本発明者らは、熱産生機構に対するｓＥＶ媒介処置の効果を評価した。本発明者らの結果は、野生型マウスとＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶで静脈内処置したｄｂ／ｄｂマウスの両方が、増大したＵＣＰ１タンパク質レベル（図１６Ｅ～図１６Ｆ）及び免疫反応性（図１６Ｇ～図１６Ｈ）のために、増大したＢＡＴ温度を示したことを表した（図１６Ｃ～図１６Ｄ）。最後に、本発明者らの結果は、ｄｂ／ｄｂマウス（野生型ではない）が皮下ＷＡＴ（ｓＷＡＴ）においてより高いＵＣＰ１免疫反応性を示し、褐色化を示すことも実証した（図１６Ｉ～図１６Ｊ）。全体として、この証拠は、ＬＥＰＲ欠損マウス（及びその野生型）におけるＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶ誘発性体重減少がＢＡＴ熱産生の増加及びＷＡＴ褐色化に関連することを実証した。

【0196】

３．結論
遺伝的形態の肥満症に対する現在の処置の多くは、置換療法に機構的に基づいている。そのようなアプローチは、重要な受容体へのリガンド結合の欠如を代替するアゴニストの使用に基づく。肥満症誘発性ＬＥＰＲ欠損症に対する新しい戦略の探索は、依然として満たされていない臨床的必要性である。これらの患者の多くは、新しいＭＣ４Ｒアゴニストで処置しても所望の治療応答を達成することができなかった。

【0197】

視床下部ＡＭＰＫは下流ＬＥＰＲに作用して、摂食とＢＡＴ熱産生の両方を調節する。更に、本発明者らは、ｓＥＶベースの戦略によるＡＭＰＫα１のセントラルターゲティングが、ＢＡＴ熱産生を特異的に調節することによって、前臨床モデルにおけるＤＩＯに対する適切なアプローチであることを示した。

【0198】

これを念頭に置いて、本発明者らは、ＬＥＰＲ欠損による完全なレプチン抵抗性のモデルであるｄｂ／ｄｂマウスにおけるＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶの有効性を評価した。本発明者らの結果は、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶの静脈内注射がＶＭＨのＡＭＰＫ活性を阻害し、野生型マウス及びｄｂ／ｄｂマウスのＢＡＴ熱産生及び体重減少をもたらし、ＷＡＴ褐色化も増加したことを実証した。注目すべきことに、ＳＦ１－ＡＭＰＫα１－ＤＮ ｓＥＶ誘発性体重減少は完全に摂食非依存性であり、このことは、本発明者らのアプローチと、食欲を標的とする他の戦略（例えば、セトメラノチド、又は更には恒常性及び／又は快楽の食物摂取を調節する他の視床下部細胞集団におけるＡＭＰＫに対するｓＥＶ）との組合せが、より有意な重量喪失を達成することを可能にし得ることを示唆している。これにより、エネルギーバランス方程式の両辺を標的とすることによって、ＬＥＰＲ欠損、ひいては任意のレプチン耐性状態に対するより一体的な処置が可能になる。

【0199】

したがって、本発明者らのデータは、褐色脂肪熱産生及びＷＡＴ褐色化を刺激することによって、視床下部ＡＭＰＫのｓＥＶ媒介標的化がこの形態の遺伝性肥満症に対する適切なアプローチであり得ることを初めて明らかにした。

【0200】

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【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【配列表】

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【国際調査報告】