(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-04
(54)【発明の名称】グルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート
(51)【国際特許分類】
C07K 14/605 20060101AFI20240927BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240927BHJP
A61K 38/26 20060101ALI20240927BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240927BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240927BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240927BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240927BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240927BHJP
【ＦＩ】
C07K14/605 ZNA
A61K47/64
A61K38/26
A61K45/00
A61P3/04
A61P3/10
A61P3/06
A61P1/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519111
(86)(22)【出願日】2022-09-28
(85)【翻訳文提出日】2024-05-22
(86)【国際出願番号】 EP2022076966
(87)【国際公開番号】W WO2023052415
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】21199346.4
(32)【優先日】2021-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522471836
【氏名又は名称】ケブンハウンス、ウニバーシテート
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＥＢＥＮＨＡＶＮＳ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】クリストファ、クレメンスン
(72)【発明者】
【氏名】アナス、ブーウ、クライン
(72)【発明者】
【氏名】ヨーナス、オズゴー、ピーダスン
(72)【発明者】
【氏名】坂本 啓
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB01
4C076CC21
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA17
4C084BA17
4C084BA19
4C084BA20
4C084BA44
4C084DB35
4C084MA52
4C084NA13
4C084ZA70
4C084ZA75
4C084ZC33
4C084ZC35
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA51
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA30
4H045EA20
4H045FA34
4H045FA50
4H045FA57
4H045GA25
(57)【要約】
本発明は、天然グルカゴンの少なくとも０．１％の活性をグルカゴン受容体において示すペプチドと、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化剤を含んでなるコンジュゲート分子であって、前記ペプチドは、前記ＡＭＰＫ活性化剤に直接またはリンカーを介して共有結合されているコンジュゲート分子、療法において使用するためのそのコンジュゲート分子、そのコンジュゲート分子を含んでなる医薬組成物、そのコンジュゲート分子を哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物の体重を減少させる方法、ならびにそのコンジュゲート分子を哺乳動物に経口投与することを含んでなる哺乳動物の体重を減少させる非治療的方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
天然グルカゴンの少なくとも０．１％の活性をグルカゴン受容体において示すペプチドと、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化剤を含んでなるコンジュゲート分子であって、前記ペプチドは、前記ＡＭＰＫ活性化剤に直接またはリンカーを介して共有結合されている、コンジュゲート分子。
【請求項2】
前記ペプチドがグルカゴンスーパーファミリーのものである、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項3】
前記ペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１または２に記載のコンジュゲート分子。
【請求項4】
前記ペプチドが、少なくとも１０個のアミノ酸で６０個以下のアミノ酸からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項5】
前記ＡＭＰＫ活性化剤が、前記ペプチドに切断可能な化学的リンカーを介して共有結合され、前記切断可能な化学的リンカーが、酸切断可能なリンカー、酵素切断可能なリンカー、ペプチド切断可能なリンカー、およびジスルフィド基を含んでなるリンカーから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項6】
前記化学的リンカーが式Ｒ１－Ｒ３－Ｓ－Ｓ－Ｒ４－Ｒ５－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ２を有し、式中、Ｒ１は前記ペプチドであり、Ｒ２は前記ＡＭＰＫ活性化剤であり、Ｒ３は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ３）２、ＣＨ２－ＣＨ２、またはＣＨ２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、Ｒ４は（ＣＨ２）ｎまたはＣ６Ｈ４であり、Ｒ５は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ３）２、ＣＨ－ＣＨ３、ＣＨ２－ＣＨ２、またはＣＨ２から選択され、ｎは、１、２、３または４である、請求項５に記載のコンジュゲート分子。
【請求項7】
前記ＡＭＰＫ活性化剤が、前記ペプチドに切断不可能なリンカーを介して共有結合され、塩基切断不可能なリンカーは、ポリエチレングリコールリンカー、炭素リンカー、ＳＭＣＣならびにマレイミド、エーテル、アミド、トリアゾール、ジスルフィド、およびチオエーテル共役の化学的性質を有するｍｃから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項8】
前記ＡＭＰＫ活性化剤が、５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミド１－β－Ｄ－リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）、（３Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（（６－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－７－クロロ－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－オール（ＭＫ－８７２２）、（３Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（（６－クロロ－５－（４－（１－（ヒドロキシメチル）シクロプロピル）フェニル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－オール（ＰＦ－７３９）、６－クロロ－５－［４－（１－ヒドロキシシクロブチル）フェニル］－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸（ＰＦ－０６４０９５７７）、塩酸１，１－ジメチルビグアニド（メトホルミン）、４－ヒドロキシ－３－（２’－ヒドロキシビフェニル－４－イル）－６－オキソ－６，７－ジヒドロチエノ［２，３－ｂ］ピリジン－５－カルボニトリル（Ａ－７６９６６２）、２－クロロ－５－［［５－［［５－（４，５－ジメチル－２－ニトロフェニル）－２－フラニル］メチレン］－４，５－ジヒドロ－４－オキソ－２－チアゾリル］アミノ］安息香酸（ＰＴ－１）、２－［［２－（２－ブロモ－４－メチルフェノキシ）エチル］チオ］－ピリミジン（ＺＬＮ０２４）、２－［［４－（ジエチルアミノ）－２－ヒドロキシフェニル］メチレン］ヒドラジド－４－ピリジンカルボン酸（ＲＳＶＡ－４０５）、およびそれらの類似体から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項9】
療法において使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項10】
肥満、２型糖尿病、高インスリン血症、インスリン抵抗性、耐糖能異常者、高コレステロール血症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および異脂肪血症の処置において使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子またはその薬学上許容可能な塩および薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項12】
哺乳動物の体重を減少させる方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１１に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、方法。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１１に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に経口投与することを含んでなる、体重を減少させるための哺乳動物の非治療的処置。
【請求項14】
哺乳動物が非病原性体格指数（ＢＭＩ）を有する、請求項１３に記載の体重を減少させるための哺乳動物の非治療的処置。
【請求項15】
請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子または請求項１１に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に経口投与することを含んでなる、血漿コレステロールを減少させるための哺乳動物の非治療的処置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、治療用コンジュゲートの分野に関し、より具体的には、グルカゴン受容体活性およびＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化剤を有するコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0002】
代謝障害とは、細胞レベルで食物をエネルギーに変換するプロセスである正常な代謝を乱す任意の疾患または障害である。代謝障害の発症は、例えば、遺伝的（先天的）な欠損、特定のホルモンもしくは酵素の欠損、または特定の食品の摂り過ぎなど、様々な欠損によって引き起こされ得る。代謝障害は、治療せずに放置すると、限定するものではないが、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの脂肪肝疾患、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、心臓病、異脂肪血症および肥満を含む、生命を脅かす疾患に進展する可能性がある。
【0003】
肥満は、豊かな社会においてヒトとイヌおよびネコなどの飼育動物に最も多く見られる栄養疾患であり、栄養欠乏症の数をはるかに上回っている。肥満外科手術の代替として、肥満処置用の減量薬を生成するための試みがなされてきた。これにより、腸内でリパーゼ阻害剤として作用することによって脂肪の吸収を防ぐことにより、または視床下部での選択的セロトニン受容体２Ｃ作動作用を介して食物摂取を阻害することにより作用する薬物がもたらされた。
【0004】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の第２段階であり、肝細胞への脂肪の蓄積に炎症が伴った場合に発症する。ＮＡＳＨを治療せずに放置すると、線維化、さらに肝硬変へと進行し、最終的には肝移植が必要となる。ＮＡＳＨは、例えば慢性的なカロリー過剰摂取および座りっぱなしの生活習慣に大きく影響され、アルコール乱用または薬の副作用による他の脂肪肝疾患とは異なる。現在までのところ、ＮＡＳＨに対してＦＤＡが承認した薬物療法はないため、依然として減量と生活習慣の改善が第一選択治療となっている。ＮＡＳＨに対する新しい治療法の必要性が高まる中、例えば、オベチコール酸、エラフィブラノールおよびアラムコールなど、いくつかのＮＡＳＨ薬が開発され試験されている。しかしながら、これらの薬剤は肝毒性およびＬＤＬコレステロールの上昇を含む副作用を伴うため、ＮＡＳＨ治療に適した薬剤の必要性が残されている。
【0005】
グルカゴンは、プログルカゴンペプチドの組織特異的な翻訳後プロセシングから誘導される２９アミノ酸のペプチドホルモンである。グルカゴンは主に膵臓のα細胞から分泌され、グルコース代謝、脂肪分解、ケトジェネシス、エネルギー消費、食欲および食物摂取における役割が証明されている。グルカゴンは、血糖作用とは独立に、循環中および肝臓中の脂質を低下させるなど、代謝性疾患に対して多くの利益をもたらす。代謝性疾患の治療にグルカゴンを使用することは、先行技術から知られている。ＵＳ ２０２０３５２９００ Ａ１には、インスリン抵抗性および肥満に関連する様々な疾患の治療における、グルカゴンを含むホルモンペプチドの使用が記載されている。ＵＳ ２００６０１４６７０ Ａ１には、糖尿病の治療上有効な管理を達成するためだけでなく、糖尿病患者の低血糖を予防するためのグルカゴンとインスリンの使用が記載されている。しかしながら、代謝性疾患の治療におけるグルカゴンの使用は、血糖値の上昇に対するグルカゴンの作用によって中止されている。
【0006】
ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）は、エネルギー恒常性の中枢的調節因子であり、代謝経路を調整し、従って、栄養供給とエネルギー需要のバランスをとる。ＡＭＰＫの活性化が代謝に好ましい生理学的結果をもたらすことから、ＡＭＰＫはメタボリックシンドロームおよび癌を含むヒト疾患を制御するための重要な治療標的であると考えられてきた。近年、いくつかの企業がＡＭＰＫ活性化剤の開発に関する医薬品化学キャンペーンを実施しており、そのためＡＭＰＫ活性化剤は先行技術から知られている。最近同定された間接的および直接的なＡＭＰＫ活性化剤のリストは、Steinberg et al. (Nat Rev Drug Dis 2019; 18(7): 527-55141)に示されている。Myers et al. (Science 2017; 357(6350): 507-511)は、インスリン非依存性のグルコース取り込みとグリコーゲン合成に有効で、その結果、血糖値が改善する、経口投与可能な、ＭＫ－８７２２としても知られるＡＭＰＫ活性化剤（３Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（（６－（［１、１’－ビフェニル］－４－イル）－７－クロロ－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－オールを記載している。しかしながら、この化合物の使用は、ＭＫ－８７２２によって引き起こされる心肥大の誘導によって中止されている。このように、ＡＭＰＫ活性化剤の臨床使用は、今日に至るまで、代謝経路に対する化合物の悪影響によって阻まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
よって、代謝性疾患の治療に適した、有効性が高く、安全性が高く（毒物学的影響が低い）、便利で安全な投与選択肢を提供する新規な治療法の必要性が高まっている。
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明の概要
従って、上記の観点から、本発明の目的は、必要とする対象において、肥満およびＮＡＳＨを含む代謝性疾患の処置に有用な効果的かつ安全な治療剤を提供することである。
従って、上記の観点から、本発明の目的は、必要とする対象において、肥満およびＮＡＳＨを含む代謝性疾患の処置に有用な効果的かつ安全な治療剤を提供することである。
【0009】
よって、本発明の第１の態様は、天然グルカゴンの少なくとも０．１％の活性をグルカゴン受容体において示すペプチドと、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化剤を含んでなるコンジュゲート分子に関し、前記ペプチドは、前記ＡＭＰＫ活性化剤に直接またはリンカーを介して共有結合されている。
【0010】
本発明者らは、意外にも、グルカゴン作動性およびＡＭＰＫ活性化を有するペプチドのコンジュゲーションは、肥満を効果的に逆転させ、肥満対象の血漿コレステロールおよび血糖値を低下させるための新規な薬物戦略となることを見出した。この戦略に基づくコンジュゲートは、図３に示すように、グルカゴンまたはＭＫ－８７２２単独と比較して、体重減少を引き起こすという点で優れている。さらに、本発明のコンジュゲートによって達成される体重の有意な減少は、図４および５に示すように、食物摂取量に依存しない。また、コンジュゲートは、図６～８に示すように、血糖値およびコレステロール値の低下にも有効である。本発明者らは、ＡＭＰＫのグルコース恒常性を改善する能力が、グルカゴンの糖尿病負債を取り消すのに有効であり、一方、グルカゴンが達成する特異的標的化は、心臓組織におけるＡＭＰＫの活性化を制限することを見出した。その結果、本発明のコンジュゲートは、特徴的な副作用を回避しながら、各成分から脂質代謝に対する有益な薬理学的効果を得る。特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、この効果は、ペプチドホルモンによって達成されると推測し、このペプチドホルモンは、脂肪分解刺激剤として、また、非特異的なＡＭＰＫ活性化剤を肝臓に部位選択的に送達することを可能にする標的化剤としての二機能的役割を果たす。また、別のグルカゴンペプチド変異体（配列番号３）および別のＡＭＰＫ活性化剤に基づくコンジュゲートは、臨床で知られている単一の標準的なＡＭＰＫ活性化剤と比較して、同等または向上したＡＭＰＫ活性を示すことが示されている（図２０および２１参照）。従って、これらの付加的コンジュゲートは、肥満を逆転させ、肥満対象の血漿コレステロールおよび血糖値を低下させるという点で好ましい結果を示すことが期待される。この仮説は、少なくとも、ＡＭＰＫ活性化剤ＭＫ－８７２２とコンジュゲートされた配列番号４～６のるコアゴニストおよびトリアゴニストが、忍容性試験後のマウスにおいて化合物に血糖値に対して改善効果を示すというさらなる知見によって支持される（図２１参照）。さらに、開発されたコンジュゲートは、ＡＭＰＫ活性化剤とグルカゴンアゴニストを組み合わせた二重の機能性を有し、肝脂肪酸酸化に関与する２つの異なる経路を標的とすることができる。
【0011】
ペプチドには、アミノ末端およびカルボキシル末端がある。本発明の文脈において、アミノ末端およびカルボキシル末端は、それぞれＮ末端およびＣ末端、および対応する派生形と呼ばれることもある。
【0012】
ペプチドは、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸からなる場合もあれば、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸と、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ－アラニン（ｄＡｌａ）、およびＤ－グルタミンなどの遺伝子コードによってコードされない天然アミノ酸を含む場合もある。さらに、ペプチドは、Ｄ－アラニン、およびＤ－ロイシン、またはａ－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ｄ－セリン（ｄＳｅｒ）、Ｎ－メチル－セリンなどの合成アミノ酸を組み込んでいる場合もある。
【0013】
ペプチドはいずれの供給源からも得ることができ、または所望によりペプチドを生産することができる。例えば、ペプチドは組織から単離することができ、またはペプチドは、組換えによって生産し、もしくは当業者に周知の方法によって合成することができる。
【0014】
前記コンジュゲート分子は、ペプチドを含んでなり、前記ペプチド（遊離形態）は、天然グルカゴンの少なくとも０．１％の活性をグルカゴン受容体において示す。本発明の文脈において、グルカゴン受容体活性は、グルカゴン活性化とも呼ばれ、グルカゴン受容体（ＧＣＣＲ）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導を測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで測定することができる。このアッセイは、例えば、引用することにより本明細書の一部とされるFinan et al., Cell 167.3: 843-857 (2016)に記載されるように実施することができる。ある実施形態において、前記コンジュゲートのペプチドは、天然グルカゴンの少なくとも１％の活性、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または３０％の活性を示す。
【0015】
前記コンジュゲート分子のペプチドは、天然グルカゴンの少なくとも０．１％の活性をグルカゴン受容体において有する任意のペプチドであり得る。ある実施形態において、前記コンジュゲートのペプチドは、グルカゴンスーパーファミリーのものである。グルカゴンスーパーファミリーは、Ｎ末端領域およびＣ末端領域の構造が関連するペプチドのグループである（例えば、引用することにより本明細書の一部とされるSherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000)を参照）。このグループのメンバーには、限定されるものではないが、修飾グルカゴン（配列番号１）および非修飾グルカゴン（配列番号２）、および天然ペプチドに対して最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸修飾を有する類似体、誘導体またはコンジュゲートを含む、グルカゴン関連ペプチドが含まれる。また、配列番号３の修飾グルカゴン類似体も企図される。このようなペプチドは好ましくは、グルカゴン受容体スーパーファミリーの受容体、好ましくは、グルカゴン受容体と相互作用する能力を保持する。
【0016】
グルカゴン受容体スーパーファミリーの異なる受容体に結合する能力を示すアゴニストまたはトリアゴニスト活性を有するペプチドも企図される。一実施形態において、このようなコアゴニストまたはトリアゴニストは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）／グルカゴン受容体コアゴニスト（配列番号４）、消化管抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）／グルカゴン受容体コアゴニスト（配列番号５）およびＧＬＰ－１／ＧＩＰ／グルカゴン受容体トリアゴニスト（配列番号６）から選択することができる。
【0017】
ある実施形態において、前記コンジュゲートのペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。例えば、前記ペプチドは、配列番号１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約９７％超の同一性を有し得る。一実施形態では、前記ペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。そのようなペプチドは、グルカゴン受容体における天然グルカゴンと比較して、有意に高いグルカゴン活性をグルカゴン受容体において有し得る。従って、そのペプチドは、ＡＭＰＫ活性化剤にコンジュゲートされている場合、グルカゴン受容体の部位により高い速度で蓄積し、次に、ＡＭＰＫ活性化剤の有効性が高まる可能性がある。配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するコンジュゲートのペプチドの一例を図２２に示し、この図は配列番号１のグルカゴンペプチドとコアゴニストＧＬＰ－１／グルカゴン（配列番号４）およびトリアゴニストＧＬＰ－１／ＧＩＰ／グルカゴン（配列番号６）とのアミノ酸配列アラインメントを示している。図２２に示すように、配列番号１のグルカゴンとそれぞれ配列番号４および６のコアゴニストおよびトリアゴニストとのアミノ酸の違いは６個のアミノ酸であるので、それぞれ８０％および８５％の配列同一性となる。
【0018】
前記コンジュゲート分子のペプチドは、そのペプチドが（遊離形態で）天然グルカゴンの少なくとも０．１％の活性をグルカゴン受容体において示すのに十分な長さを有する。一般に、これは、少なくとも１０個のアミノ酸を含んでなるペプチドで観察できるが、そのペプチドが６０個を超えるアミノ酸を含んでなる場合、その活性が示されない場合がある。従って、ある実施形態において、前記ペプチドは、１０～６０個のアミノ酸の範囲、例えば、２０～５０個のアミノ酸の長さを有する。他のペプチドの配列と一定のパーセンテージで同一である本発明のアミノ酸配列は、当業者による配列の手動評価によるか、またはＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)などのアルゴリズムを使用したコンピューターによる自動配列比較および同定による、そのペプチドの推定上の識別を提供するのに十分なペプチドのアミノ酸配列、例えば、少なくとも１０個のアミノ酸を十分に含んでなるべきである（総説については、Altschul, et al., Meth Enzymol. 266: 460,1996；およびAltschul, et al., Nature Genet. 6: 119, 1994を参照）。
【0019】
本発明の文脈において、ペプチドは、置換、天然もしくは合成アミノ酸の挿入および／またはアミノ酸欠失を有することにより、％同一性が異なり得る。
【0020】
ある実施形態において、前記ペプチドは、アセチル化、脂肪酸コンジュゲーション、二酸コンジュゲーション、アルブミンコンジュゲーション、小分子アルブミンバインダー、および／またはＰＥＧコンジュゲーションによって修飾される。抗体などの担体タンパク質に連結することによって修飾されたペプチドも企図される。修飾は、好ましくは、配列番号１のペプチドのＣ末端領域内の（Ｎ末端から数えて）１６、１７、２０、２１、２４、および２９～４０番目に、またはＣ末端アミノ酸にある。配列番号１の２９～４０番にはグルカゴン受容体へのペプチドの結合に直接関与するアミノ酸はないことから、これらのアミノ酸は、グルカゴン受容体へのこのペプチドの結合に影響を及ぼすことなく交換および修飾可能である。コンジュゲーションは、ジスルフィド、マレイミド、α－ケトン、またはクリックケミストリーに基づくコンジュゲーションによるなど、任意の好適なリンカーによって行うことができる。当業者は、そのようなコンジュゲートを調製する方法を知っている。好ましくは、ＰＥＧ分子は１ｋＤａよりも大きく、脂肪酸および二酸は１２個を超える炭素原子を含み得る。修飾（ＰＥＧ／脂肪酸／二酸）とペプチドとの間にスペーサーを付加することが一般に好ましく、リンカーは、好ましくは、γ－Ｇｌｕリンカー、短いＰＥＧ鎖である。
【0021】
前記コンジュゲート分子は、ＡＭＰＫ活性化剤を含んでなる。任意のＡＭＰＫ活性化剤が、前記コンジュゲートとともに使用され得る。しかしながら、前記ＡＭＰＫ活性化剤は、小分子、例えば、最大９００ｋＤａであることが好ましい。例えば、一実施形態では、ＡＭＰＫ活性化剤は、５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミド１－β－Ｄ－リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）、（３Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（（６－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－７－クロロ－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－オール（ＭＫ－８７２２）、（３Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（（６－クロロ－５－（４－（１－（ヒドロキシメチル）シクロプロピル）フェニル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－オール（ＰＦ－７３９）、６－クロロ－５－［４－（１－ヒドロキシシクロブチル）フェニル］－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸（ＰＦ－０６４０９５７７）、塩酸１，１－ジメチルビグアニド（メトホルミン）、４－ヒドロキシ－３－（２’－ヒドロキシ－１，１’－ビフェニル－４－イル）－６－オキソ－６，７－ジヒドロチエノ［２，３－ｂ］ピリジン－５－カルボニトリル（Ａ－７６９６６２）、２－クロロ－５－［［５－［［５－（４，５－ジメチル－２－ニトロフェニル）－２－フラニル］メチレン］－４，５－ジヒドロ－４－オキソ－２－チアゾリル］アミノ］安息香酸（ＰＴ－１）、２－［［２－（２－ブロモ－４－メチルフェノキシ）エチル］チオ］－ピリミジン（ＺＬＮ０２４）、２－［［４－（ジエチルアミノ）－２－ヒドロキシフェニル］メチレン］ヒドラジド－４－ピリジンカルボン酸（ＲＳＶＡ－４０５）、およびそれらの類似体から選択される。ＭＫ－８７２２、ＰＦ－７３９およびＰＦ－０６４０９５７７がこのましい。別の実施形態では、ＡＭＰＫ活性化剤は、ＰＦ－０６４０９５７７の単純な類似体である。ＰＦ－０６４０９５７７のこのような単純な類似体の合成は、実施例３に示され、図１７のスキーム１に示される化合物１４ａ－１４ｅにより例示される。
【0022】
本発明のペプチドとＡＭＰＫ活性化剤は、共有結合される。本発明の文脈において、前記コンジュゲート分子は、ペプチド－薬物－コンジュゲート（ＰＤＣ）とも呼ばれる。前記ペプチドとＡＭＰＫ活性化剤は、直接結合され得る。例えば、ＡＭＰＫ活性化剤は、エーテル結合、エステル結合、カルバミン酸結合、炭酸結合、トリアゾール結合、マレイミド結合およびアミド結合を介して共有結合され得る。
【0023】
本発明の文脈において、直接共有結合しているとは、ペプチドがＡＭＰＫ活性化剤との共有結合を有すること、例えば、２つの分子の間に、リンカー基などの追加の化学基が存在しないことを意味する。
【0024】
一実施形態において、前記ＡＭＰＫ活性化剤は、前記ペプチドのＣ末端領域で共有結合している。本発明の文脈において、Ｃ末端領域は、Ｃ末端から数えてアミノ酸の最大５０％、例えば、Ｃ末端から数えてアミノ酸の最大４０％、３０％、２５％、２０％、または１０％であり得る。例えば、配列番号１のＣ末端領域は、アミノ酸１５～４０番、２６～４０番、または３０～４０番（Ｎ末端から数えた番号）であり得る。従って、ＡＭＰＫ活性化剤は、Ｃ末端から数えて１０個のアミノ酸のいずれか１つに、直接またはリンカーを介して結合され得る。それによって、ＡＭＰＫ活性化剤は、ペプチドのＮ末端において立体障害をほとんどまたは全く生じない。同じペプチド分子に２つ以上のＡＭＰＫ活性化剤が結合され得ることも企図される。
【0025】
前記ペプチドとＡＭＰＫ活性化剤は、リンカーを介しても結合され得る。いかなるリンカーも使用し得る。しかしながら、リンカーは最大３０個の原子の長さを有することが一般に好ましい。より長い鎖は、ペプチドがグルカゴン受容体と相互作用する場合、ＡＭＰＫ活性化剤がペプチドに対して立体障害が全くまたはほとんどないように、ＡＭＰＫ活性化剤をペプチドから遠ざけるという利点を有し得る（その逆もある）。ペプチドの立体障害がないかまたは低いと、グルカゴン受容体に対する親和性が高くなる。コンジュゲートのグルカゴン受容体に対する親和性が高くなるほど、グルカゴン受容体の部位での蓄積が多くなる可能性が高い。
【0026】
一実施形態では、ＡＭＰＫ活性化剤は、切断可能な化学的リンカーを介してペプチドに共有結合され、この切断可能な化学的リンカーは、酸切断可能なリンカー、酵素切断可能なリンカー、ペプチド切断可能なリンカー、およびジスルフィド基を含んでなるリンカーから選択される。このようなリンカーは、ペプチド－薬物コンジュゲートにおける使用に関して当技術分野で一般に周知である。このような切断可能なリンカーの例は、グルクロニド、β－ガラクトシド、ジスルフィド、ヒドラゾンを含んでなる化合物であり、かつ／またはこれらの化合物は、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ピロホスファターゼ、ホスファターゼ、アリールスルファターゼ、プロテアーゼ、またはエステラーゼによって切断可能である。リンカーは好ましくはＡＭＰＫ活性化剤をその遊離形態（すなわち、天然形態）で放出し、これは本明細書に開示されるジスルフィドリンカーなど、多くの異なるリンカー化学によって達成することができる。これらのリンカー化学およびさらなるリンカー化学は当業者に周知である。
【0027】
好ましい実施形態では、ＡＭＰＫ活性化剤は、ジスルフィド基を含んでなる化学的リンカーを介して前記ペプチドに共有結合される。ジスルフィド基は、化学的に還元されると、ペプチドからＡＭＰＫ活性化剤を放出させる。ジスルフィド基を含んでなる化学的リンカーは、ジスルフィドリンカーとしても知られ、体循環中、長期間にわたって、前記コンジュゲートのペプチドとＡＭＰＫ活性化剤がコンジュゲートしたままであることを保証する。ジスルフィドリンカーのジスルフィド基は細胞内環境などの還元環境で還元され、コンジュゲートのペプチド部分がコンジュゲートのＡＭＰＫ活性化剤部分から分離されるように、コンジュゲートが切断され得る。還元は、例えば、グルタチオンなどのチオール、または細胞内タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ酵素などのレダクターゼとのジスルフィド交換によるものであり得る。
【0028】
化学的リンカーは、一般式Ｒ’－Ｓ－Ｓ－Ｒ’’（式中、Ｒ’およびＲ’’基は互いに同一であっても異なっていてもよい）を有する当技術分野で公知の化学的リンカーから選択され得る。有利には、前記コンジュゲートは、グルカゴン受容体に対する前記ペプチドの親和性により、体内のグルカゴン受容体の部位におよび／またはその近くに蓄積し得、前記ＡＭＰＫ活性化剤は、グルカゴン受容体の部位におよび／またはその部位の近くに放出され得る。前記コンジュゲートのペプチド部分がない場合、前記ＡＭＰＫ活性化剤は、部位特異的ＡＭＰＫ活性化剤として好適な効果を有し得る。前記コンジュゲートは、グルカゴン受容体を有する細胞に直接隣接する細胞外環境で切断され得るか、または前記コンジュゲートは、グルカゴン受容体を有する細胞によって内在化され、細胞の還元環境で切断され得ることが本発明者らによって推測される。
【0029】
一実施形態において、前記コンジュゲート分子は化学的リンカーを介してコンジュゲートされ、その化学的リンカーは式Ｒ１－Ｒ３－Ｓ－Ｓ－Ｒ４－Ｒ５－Ｏ－ＣＯ－Ｒ２を有し、式中、Ｒ１は前記ペプチドであり、Ｒ２は前記ＡＭＰＫ活性化剤であり、Ｒ３は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ３）２、ＣＨ２－ＣＨ２、またはＣＨ２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、Ｒ４は（ＣＨ２）ｎまたはＣ６Ｈ４であり、Ｒ５は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ３）２、ＣＨ－ＣＨ３、ＣＨ２－ＣＨ２、またはＣＨ２から選択され、ｎは、１、２、または３である。化学的リンカーが還元されると、前記コンジュゲートの解放されたＡＭＰＫ活性化剤部分が分子内環化を受け、前記ＡＭＰＫ活性化剤が遊離形態で放出される。
【0030】
一実施形態において、前記化学的リンカーは式Ｒ１－Ｒ３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ２を有し、式中、Ｒ１は前記ペプチドであり、Ｒ２は前記ＡＭＰＫ活性化剤であり、Ｒ３は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ３）２、ＣＨ２－ＣＨ２、またはＣＨ２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、ｎは１、２、または３である。
【0031】
一実施形態において、前記化学的リンカーは式Ｒ１－Ｒ４－Ｒ３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ２を有し、式中、Ｒ１は前記ペプチドであり、Ｒ２は前記ＡＭＰＫ活性化剤であり、Ｒ３は、任意選択であり、存在する場合、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２－ＣＨ２、またはＣＨ２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、Ｒ４は、任意選択であり、存在する場合、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２－ＣＨ２、またはＣＨ２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、ｎは１、２、または３である。
【0032】
ある実施形態において、第２のラジカル結合は本発明のペプチドの主鎖に対するものである。
【0033】
別の実施形態において、第２のラジカル結合は本発明のペプチドの側鎖に対するものである。
【0034】
本発明の文脈において、Ｒ１が前記ペプチドの主鎖に結合している場合、Ｃ（ＣＨ３）２（Ｌ－ペニシラミン）は、Ｐｅｎと呼ばれることがあり、ＣＨ２－ＣＨ２（Ｌ－ホモシステイン）は、ｈＣｙｓと呼ばれることがあり、ＣＨ２（Ｌ－システイン）は、Ｃｙｓと呼ばれることがある。
【0035】
本明細書で使用する場合、第１のおよび第２のラジカル結合は、本明細書に開示される化学的リンカーにおける少なくとも２つの自由な結合の存在を述べるために使用される。
【0036】
別の実施形態では、ＡＭＰＫ活性化剤は、切断不可能なリンカーを介してペプチドに共有結合され、前記切断不可能なリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、炭素リンカー、ＳＭＣＣならびにマレイミド、エーテル、アミド、トリアゾール、ジスルフィド、およびチオエーテルの共役の化学的性質を有するｍｃから選択される。
【0037】
本発明は、化学的リンカーを介して付加されたペプチドとＡＭＰＫ活性化剤を含んでなるコンジュゲート分子のライブラリーの設計および合成を容易にする。図１は、そのようなコンジュゲート分子の設計方法を示している。図１に示されるように、コンジュゲートは、ＡＭＰＫ活性化剤（図１のＭＫ－８７２２）をペプチドに化学的に結合させることによって調製し得る。当業者は、膨大な数の異なる化学的リンカーを本明細書に開示される方法によっても、文献で報告されている他の方法によっても調製し得、これらの化学的リンカーを使用して、本明細書に開示される方法に従って、また公知技術の他の場所で報告されているように、ペプチドおよびＡＭＰＫ活性化剤を付加し得ることを理解するであろう。
【0038】
本発明者らは、意外にも、本発明のペプチドが減量薬および標的薬として二機能の役割を果たし得、そうでない場合、肝臓への、ＡＭＰＫ活性化剤などの非特異的な小分子の部位選択的送達を可能にすることを見出した。本発明のペプチドのターゲティング特性は、ＡＭＰＫ活性化剤の、例えば、内分泌の膵臓などの他の部位への送達も容易にし得ることが理解される。
【0039】
本明細書に開示されるコンジュゲート分子は、選択性を提供し、また標的の領域における薬物作用を強める。このコンジュゲート分子によって可能になるこのターゲティングは、治療指数の改善、すなわち、最小有効濃度の低下を可能にする。さらに、カップリングにより、グルカゴン受容体を標的とする医薬の有効性に別の代謝薬物作用を追加することが可能である。
【0040】
本発明者らは、本発明のコンジュゲートの食欲、減量に対する驚くべき相乗効果を実証しており、これは、ペプチドまたは薬物単独の投与で得られる効果と比較して有意に大きい（図３参照）。興味深いことに、食物摂取量から、体重減少は食欲抑制とは無関係であることが示され、その効果は純粋にエネルギー消費量の増加によるものであることが示唆された（図４および５参照）。
【0041】
本発明者らは、本発明のコンジュゲートの血糖値および血漿コレステロールの低下に対する驚くべき相乗効果をさらに実証しており、これは、ペプチドまたは薬物単独の投与で得られる効果と比較して有意に大きい（図６～８参照）。本発明のコンジュゲートの驚くべき相乗作用はさらに、配列番号３のグルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート（その合成は実施例３に開示）のＡＭＰＫを示す図２０に示される知見および化合物忍容性試験後のマウスの血糖値に対する種々のコアゴニストおよびトリアゴニストペプチド（配列番号４～６）／ＭＫ８７２２コンジュゲートの効果を示す図２１に示される知見によって裏付けられる。
【0042】
本発明のある実施形態において、前記コンジュゲート分子は、療法において使用するためのものである。
【0043】
ある実施形態において、本発明のコンジュゲート分子は、肥満、２型糖尿病、高インスリン血症、インスリン抵抗性、耐糖能異常者、高コレステロール血症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および異脂肪血症の処置において使用するためのものである。
【0044】
本発明の別の態様は、本発明によるコンジュゲート分子、および薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物に関する。前記コンジュゲート分子の任意の実施形態は、前記医薬組成物において使用し得る。
【0045】
本発明は、本発明によるコンジュゲート分子の、医薬組成物の製造における使用に関する。特に、医薬組成物は、肥満、２型糖尿病、高インスリン血症、インスリン抵抗性、耐糖能異常者、高コレステロール血症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および異脂肪血症の処置において使用するためのものである。前記コンジュゲート分子のいずれの実施形態も、医薬組成物の製造に使用可能である。
【0046】
本発明において開示されるデータは、マウスの研究で得られたものであるが、エネルギー代謝を支配する主要なホルモン経路は、マウスとヒトの間で、同等の受容体発現プロファイルを示す点で類似しているため、結論はヒトにも同様に関連する。
【0047】
本発明のコンジュゲートは、医薬組成物の形態で投与し得る。従って、本発明は、本発明のコンジュゲートまたはその薬学上許容可能な塩、および薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物をさらに提供する。医薬処方物は、従来の技術によって調製し得る。簡潔には、薬学上許容可能な担体は、固体または液体のいずれかであり得る。固形調製物には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒が含まれる。固体担体は、希釈剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、湿潤剤、錠剤崩壊剤または封入材料としても機能し得る１以上の賦形剤であり得る。
【0048】
医薬処方物に含まれるコンジュゲートは、滅菌固体の無菌分離によって、または好適なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水での使用前の構成のために、溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態であり得る。
【0049】
一実施形態において、前記医薬組成物は、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与にまたは経口投与に適している。従って、本発明の組成物は、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量輸液での単回投与形態でまたは複数回投与用容器で提供し得、場合により、保存剤が添加される。これらの組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり得る。
【0050】
本開示に従って、グルカゴン活性を有するペプチドの体重減少効果が単一の様式でＡＭＰＫ活性化剤と組み合わされる医薬組成物が提供される。グルカゴン活性を有するペプチドを介した肝臓への能動的送達は、例えば、ＡＭＰＫの活性化により引き起こされる心肥大などの望ましくない有害を回避する。ＡＭＰＫ活性化剤のプラスの代謝効果には、グルコースの取り込み、脂肪酸酸化、ミトコンドリア生合成およびインスリン感受性の改善が含まれ得、これは、ヒトまたは哺乳動物における肥満および肥満関連代謝障害の軽減に有益であり得る。
【0051】
従って、本発明のペプチドとＡＭＰＫ活性化剤との組合せの治療的有用性は、肥満およびその関連代謝障害の処置のための新しいアプローチを提供する。
【0052】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物の体重を減少させる方法であって、本発明のコンジュゲート分子または本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、方法に関する。
【0053】
前記コンジュゲート分子または前記医薬組成物は、皮下、経口、筋肉内、腹腔内、または静脈内に投与し得る。
【0054】
前記コンジュゲート分子、従って、前記医薬組成物も、体重減少に効果的である。そのため、前記コンジュゲート分子および前記医薬組成物は、肥満の処置において任意のレベルで使用し得る。肥満は、体格指数（ＢＭＩ）として表すことができ、これは、体重を身長の２乗で割ったものとして定義され、例えば、ｋｇ／ｍ２の単位で表される。理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、病原性肥満と非病原性肥満との間の限界値を規定するためにＢＭＩを使用することができると考えている。例えば、本発明の文脈において、ＢＭＩ ３０ｋｇ／ｍ２が、病原性肥満と非病原性肥満との間の限界値と解釈される場合がある。しかしながら、他のＢＭＩ値もまた、病原性肥満と非病原性肥満との間の限界値を規定すると考えることができる。従って、例えば、ＢＭＩ値 ２４ｋｇ／ｍ２、２５ｋｇ／ｍ２、２６ｋｇ／ｍ２、２７ｋｇ／ｍ２、２８ｋｇ／ｍ２、２９ｋｇ／ｍ２、３０ｋｇ／ｍ２、３１ｋｇ／ｍ２、３２ｋｇ／ｍ２、３３ｋｇ／ｍ２、３４ｋｇ／ｍ２、および３５ｋｇ／ｍ２は、病原性肥満と非病原性肥満との間の限界値を規定すると考えられる。
【0055】
さらなる態様において、本発明は、体重を減少させるための哺乳動物の非治療的処置であって、本発明によるコンジュゲート分子を前記哺乳動物に経口投与することを含んでなる処置に関する。例えば、哺乳動物は、非病原性ＢＭＩを有し得る。具体的には、この方法は、非病原性肥満を規定する限界値を下回るＢＭＩを有する対象に前記コンジュゲート分子を経口投与することを含んでなり得る。
【0056】
上記において、本発明は、主にいくつかの実施形態を参照して説明してきた。しかしながら、当業者には容易に理解されるように、上に開示したもの以外の実施形態も本発明の範囲内で等しく可能である。
【0057】
以下、非限定的な実施例により、本発明の他の態様および有利な特徴を詳細に説明する。
【0058】
一般に、本明細書で使用される総ての用語は、当技術分野での通常の意味に従って解釈されるべきであり、明示的に定義されるかまたは特に断りのない限り、本発明の総ての態様および実施形態に適用可能である。「１つの(a/an)／その(the)［コンジュゲート、分子、リンカー、ペプチドなど］」への総ての言及は、明示的に特に断りのない限り、前記コンジュゲート、薬剤、分子、リンカー、ペプチドなどの少なくとも１つの実例を指すものとしてオープンに解釈されるべきである。
【0059】
本発明の文脈において、用語グルカゴンとは、グルカゴンスーパーファミリーのペプチドである。本発明のペプチドはまた、体重減少ホルモンペプチドであり、本発明のコンジュゲート分子の肝臓への能動的送達因子として機能すると考えられ得る。
【0060】
本発明の文脈において、用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された１０～６０個のアミノ酸のストレッチから構成される化合物を意味する。
【0061】
用語「類似体」とは、グルカゴンペプチドおよびＡＭＰＫ活性化剤に関して本明細書で使用する場合、類似のまたは同等の生物学的特性および効果を有するペプチドまたは化合物または薬物を意味する。
【0062】
ペプチドまたはアミノ酸に関して本明細書で使用される用語「誘導体」とは、化学的に修飾されたペプチドまたはアミノ酸を意味し、少なくとも１つの置換基は非修飾のペプチドまたはアミノ酸またはその類似体に存在しないもの、すなわち、共有結合により修飾されているペプチドまたはアミノ酸を意味する。典型的な修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステルなどである。
【0063】
本発明の文脈において、用語「パーセンテージ同一性」または「％同一性」とは、特に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、比較した２つのペプチド間で同一のアミノ酸の割合％を意味する。
【0064】
用語「ＡＭＰＫ活性化剤」は、本明細書で使用する場合、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化剤またはアゴニストまたは刺激剤である化合物を意味する。ＡＭＰＫ活性化剤の例としては、限定されるものではないが、５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミド１－β－Ｄ－リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）、（３Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（（６－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－７－クロロ－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－オール（ＭＫ－８７２２）、（３Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（（６－クロロ－５－（４－（１－（ヒドロキシメチル）シクロプロピル）フェニル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－オール（ＰＦ－７３９）、６－クロロ－５－［４－（１－ヒドロキシシクロブチル）フェニル］－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸（ＰＦ－０６４０９５７７）、塩酸１，１－ジメチルビグアニド（メトホルミン）、４－ヒドロキシ－３－（２’－ヒドロキシビフェニル－４－イル）－６－オキソ－６，７－ジヒドロチエノ［２，３－ｂ］ピリジン－５－カルボニトリル（Ａ－７６９６６２）、２－クロロ－５－［［５－［［５－（４，５－ジメチル－２－ニトロフェニル）－２－フラニル］メチレン］－４，５－ジヒドロ－４－オキソ－２－チアゾリル］アミノ］安息香酸（ＰＴ－１）、２－［［２－（２－ブロモ－４－メチルフェノキシ）エチル］チオ］－ピリミジン（ＺＬＮ０２４）、２－［［４－（ジエチルアミノ）－２－ヒドロキシフェニル］メチレン］ヒドラジド－４－ピリジンカルボン酸（ＲＳＶＡ－４０５）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0065】
本発明の上記ならびに追加の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して、本発明の実施形態の以下の例示的かつ非限定的な詳細な説明によってよりよく理解される。
【発明を実施するための形態】
【0066】
詳細な説明
図１は、化学的リンカー１０４を介して配列番号１のペプチド１０３のＣ末端システイン１０２に化学的に付加されたＭＫ－８７２２ １０１からなる、化学的リンカー１０４がジスルフィド基１０５を含んでなる、ペプチドとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート１００の一例を示す。Ｃ末端システイン１０２の側鎖１０６は、場合により、側鎖１０６の長さｎが１または２個の炭素原子であるように、誘導体化されてもよい。側鎖１０６のｈＣｙｓ４０と呼ばれる修飾は、ｎ＝２個の炭素原子の長さを有し、Ｒ＝水素である。側鎖１０６のｈＣｙｓ４０と呼ばれる修飾は、ｎ＝１個の炭素原子の長さを有し、Ｒ＝メチルである。通常のシステインはＣｙｓ４０と呼ばれる。
図１は、化学的リンカー１０４を介して配列番号１のペプチド１０３のＣ末端システイン１０２に化学的に付加されたＭＫ－８７２２ １０１からなる、化学的リンカー１０４がジスルフィド基１０５を含んでなる、ペプチドとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート１００の一例を示す。Ｃ末端システイン１０２の側鎖１０６は、場合により、側鎖１０６の長さｎが１または２個の炭素原子であるように、誘導体化されてもよい。側鎖１０６のｈＣｙｓ４０と呼ばれる修飾は、ｎ＝２個の炭素原子の長さを有し、Ｒ＝水素である。側鎖１０６のｈＣｙｓ４０と呼ばれる修飾は、ｎ＝１個の炭素原子の長さを有し、Ｒ＝メチルである。通常のシステインはＣｙｓ４０と呼ばれる。
【0067】
図２は、図１のコンジュゲート１００からＭＫ－８７２２が放出される機構を示す。ジスルフィド基１０５を含んでなる化学的リンカー１０４は、自壊性であり、細胞内環境などの還元環境（示していない）で還元されてチオール基を生成し、コンジュゲート１００のＭＫ－８７２２部分１０１からこのコンジュゲートのペプチド部分１０３を分離し得る。この分子のＭＫ－８７２２部分１０１において、解放された求核性チオール１０９が自発的分子内環化を受けて、ＭＫ－８７２２を天然の非修飾ＭＫ－８７２２薬物（ＭＫ－８７２２の遊離形態）として放出する。
【0068】
図３～１４は、実施例２に開示されているｉｎ ｖｉｖｏマウス試験の結果を示す。
【0069】
図３は、７日間処置した食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスの体重パーセンテージ（ＢＷ％）で測定した図１および２に示されるリンカーを介して化学的に付着された配列番号１のペプチドとＭＫ－８７２２のコンジュゲート（グルカゴン－Ｐｅｎ４０／ＭＫ－８７２２）（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）および等モル用量の配列番号１のペプチド（グルカゴンＰｅｎ４０）またはＭＫ－８７２２の減量効果を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、Ｎは各群８である。グルカゴンＰｅｎ４０またはＭＫ－８７２２のいずれかの単剤療法で処置したマウスは、約４％ ＢＷ％減というわずかな体重減少しか示さなかった。ＢＷ％の最も著しい減少は、グルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２で処置したＤＩＯマウスで見られ、このコンジュゲートは７日の処置の後に約１０％ ＢＷ％の減少を示した。さらに、曲線の傾きに基づけば、処置を延長すれば、グルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２でさらなる体重減少が予想されると思われる。
【0070】
図４は、７日間処置したＤＩＯマウスの１日当たりの食物摂取（グラム／日）に対するグルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のグルカゴンＰｅｎ４０もしくはＭＫ－８７２２の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。７日の処置の間、グルカゴンＰｅｎ４０、ＭＫ－８７２２またはグルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２で処置したマウスは、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）のマウスと同等の１日当たりの食物摂取を示した。試験の終了時に、グルカゴンＰｅｎ４０で処置したマウスは、対照群（ビヒクル）に比べて食物摂取に若干の低下を示した。
【0071】
図５は、６日間処置したＤＩＯマウスの累積食物摂取（累積ＦＩ、グラム／日）に対するグルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２および等モル用量のグルカゴンＰｅｎ４０またはＭＫ－８７２２の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。処置経過にわたって、グルカゴンＰｅｎ４０、ＭＫ－８７２２またはグルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２で処置したマウスは、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）のマウスと同等の累積食物摂取を示した。
【0072】
図６および７は、処置経過の７日目における化合物忍容性試験（ＣＴＴ）（図６）または腹腔内糖負荷試験（ｉｐＧＴＴ）（図７）のいずれかを受けたＤＩＯマウスの血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対するグルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２および等モル用量のグルカゴンＰｅｎ４０またはＭＫ－８７２２の効果を、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）と比較して示す。血糖値は、４０時間（ＣＴＴ、図６）および２時間（ＩｐＧＴＴ、図７）にわたって測定した。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝５～６である。一般に、グルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ８７２は、血糖値に対照群に比べて有意に低い初期増加を示した（ストレス負荷直後、＞１時間）。
【0073】
図８は、７日間処置したＤＩＯマウスの血漿コレステロール値（ｍｇ／ｄＬ）に対するグルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２および等モル用量のグルカゴンＰｅｎ４０またはＭＫ－８７２２の効果を、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）と比較して示す。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝５～６である。グルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２で処置したマウスに関して、血漿コレステロール値の有意な低下が見られた。さらに、コンジュゲートで処置したマウスは、ビヒクルに比べてはるかに低い血漿コレステロール値（１００ｍｇ／ｄＬ対２００ｍｇ／ｄＬ）を示しただけでなく、このコンジュゲートは、単剤療法として投与されたＭＫ－８７２２およびグルカゴンＰｅｎ４０よりも明らかに優れていた。
【0074】
図９は、７日間処置した食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスの体重パーセンテージ（ＢＷ％）で測定した、図１および２に示されるリンカーを介して化学的に付着された配列番号１のペプチドとＡＩＣＡＲのコンジュゲート（グルカゴン－Ｐｅｎ４０／ＡＩＣＡＲ）（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）および等モル用量の配列番号１のペプチド（グルカゴンＰｅｎ４０）またはＡＩＣＡＲの減量効果を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。グルカゴンＰｅｎ４０もしくはＡＩＣＡＲのいずれかの単剤療法またはコンジュゲートとしてのグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲで処置したマウスは、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）に比べて、体重に約４％ＢＷ％減というわずかな減少を示したに過ぎなかった。ＢＷ％における最高の減少は、グルカゴンＰｅｎ４０単独またはコンジュゲートとしてのグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲのいずれかで処置したＤＩＯマウスに見られ、両方とも７日の処置の後に約５％ＢＷ％の減少を示した。
【0075】
図１０は、７日間処置したＤＩＯマウスの１日当たりの食物摂取（グラム／日）に対するグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲ（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）または等モル用量のグルカゴンＰｅｎ４０またはＡＩＣＡＲの効果を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。７日の処置の間、グルカゴンＰｅｎ４０、ＡＩＣＡＲまたはグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲで処置したマウスは、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）のマウスと同等の１日当たりの食物摂取を示した。試験の終了時に、グルカゴンＰｅｎ４０またはグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲで処置したマウスは、食物摂取に対照群（ビヒクル）およびＡＩＣＡＲに比べてわずかな減少を示した。曲線の傾きに基づけば、処置を延長すれば、グルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲまたはグルカゴンＰｅｎ４０で食物摂取にマイナスの傾向が予想されると思われる。
【0076】
図１１は、６日間処置したＤＩＯマウスの累積食物摂取（累積ＦＩ、フラム／日）に対するグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲおよび等モル用量のグルカゴンＰｅｎ４０またはＡＩＣＡＲの効果を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。処置の経過にわたって、グルカゴンＰｅｎ４０、ＡＩＣＡＲまたはグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲで処置したマウスは、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）のマウスと同等の累積食物摂取を示した。
【0077】
図１２および１３は、処置経過の７日目における、ＣＴＴ（図１２）またはｉｐＧＴＴ（図１３）のいずれかを受けたＤＩＯマウスの血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）に対するグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲおよび等モル用量のグルカゴンＰｅｎ４０またはＡＩＣＡＲの効果を、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）と比較して示す。血糖値は４０時間（ＣＴＴ、図１２）および２時間（ＩｐＧＴＴ、図１３）にわたって測定した。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝５～６である。両ストレス試験において、グルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲは、血糖値に対照群に比べて有意に低い初期増加を示した（ストレス負荷直後、＞１時間）。
【0078】
図１４は、７日間処置したＤＩＯマウスの血漿コレステロール値（ｍｇ／ｄＬ）に対するグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲおよび等モル用量のグルカゴンＰｅｎ４０またはＡＩＣＡＲの効果を、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）と比較して示す。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝５～６である。血漿コレステロール値における最高の減少は、グルカゴンＰｅｎ４０またはグルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲで処置したマウスで見られた。ＡＩＣＡＲ単独で処置したマウスは、対照群と同等の血漿コレステロール値を示し、血漿コレステロールに対するＡＩＣＡＲの効果は限定的なものであると結論づけられた。
【0079】
図２０は、合成された、ＡＭＰＫ活性化剤化合物と配列番号３のグルカゴンペプチドのコンジュゲート化合物２２ａ～２２ｄおよび２３ａ～２３ｅ（実施例３）のＡＭＰＫ活性アッセイ（実施例４）の結果を示す。結果は、合成されたコンジュゲート化合物２２ａ～２２ｄおよび２３ａ～２３ｅは、対照化合物ＰＦ－０６４０９５７７（ＰＦ）およびＭＫ－８７２２（Ｇｌｉｘｘ ｌａｂ；ＧＬＸＣ－１１４４５）に比べて同等または改善されたＡＭＰＫ活性を呈することを示す。
【0080】
図２１は、急性化合物忍容性試験を受けたＤＩＯマウスの血糖値（ｍＭ）に対するコアゴニストおよびトリアゴニストペプチド（配列番号４～６）とＭＫ８７２２の種々のコンジュゲートの効果を、対照群（ビヒクル、すなわち、生理食塩水）と比較して示す。血糖値は、皮下注射の２４時間後に測定した。データは、平均±ＳＥＭとして表し、各群Ｎ＝８である。一般に、３種類のコンジュゲートグルカゴン／ＧＬＰ－１／ＭＫ８７２２、グルカゴン／ＧＩＰ／ＭＫ８７２２およびグルカゴン／ＧＬＰ－１／ＧＩＰ／ＭＫ８７２２（図２１では「トリアゴニスト」と表示）は、ビヒクルまたはコアゴニストおよびトリアゴニストペプチド単独で処置した群に比べて有意に低い血糖値を示す。
【0081】
図２２は、薬物コンジュゲートに使用した配列番号４～６のコアゴニストおよびトリアゴニストペプチドと配列番号１のグルカゴンペプチドのアミノ酸配列アラインメントを示し、Ｘ１は、Ｄ－アラニン、Ｄ－セリン、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチル－セリン、グリジンまたはバリンであり、Ｘ２は、システイン（ｈＣｙｓ４０／Ｃｙｓ４０）またはＬ－ペニシラミン（Ｐｅｎ４０）である。
【0082】
結論
示されたデータは、グルカゴン類似体とＡＭＰＫ活性化剤の化学的コンジュゲーションが、肥満、糖尿病およびＮＡＳＨを含む代謝障害を効果的に逆転させるための新規な医療戦略となることを実証している。この戦略に基づくコンジュゲートは、グルカゴン対照と比較して、体重およびコレステロールレベルの低下において優れており、ＡＭＰＫ活性化剤の中枢的作用に悪影響を及ぼすという欠点はない。
示されたデータは、グルカゴン類似体とＡＭＰＫ活性化剤の化学的コンジュゲーションが、肥満、糖尿病およびＮＡＳＨを含む代謝障害を効果的に逆転させるための新規な医療戦略となることを実証している。この戦略に基づくコンジュゲートは、グルカゴン対照と比較して、体重およびコレステロールレベルの低下において優れており、ＡＭＰＫ活性化剤の中枢的作用に悪影響を及ぼすという欠点はない。
【実施例】
【0083】
実施例１：ペプチドおよびペプチド－ＡＭＰＫ活性化剤コンジュゲートの調製
材料：総ての溶媒および試薬は、商業的供給源から購入し、さらに精製することなく使用した。ペプチドの伸長には、Ｈ－Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂を使用した。特に明記しない限り、Ｆｍｏｃ保護（９－フルオレニルメチルカルバメート）アミノ酸は、Ｉｒｉｓ－ＢｉｏｔｅｃｈまたはＧｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、Ｈ－Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂、３５～１００メッシュ；ローディング０．４０～０．６０ｍｍｏｌ／ｇはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。市販のＮα－Ｆｍｏｃアミノ酸ビルディングブロックは、次の側鎖保護類似体として購入した：Ａｒｇ、Ｐｍｃ；Ａｓｐ、ＯｔＢｕ；Ｃｙｓ、Ｔｒｔ；Ｇｌｎ、Ｔｒｔ；Ｈｉｓ、Ｔｒｔ；Ｌｙｓ、Ｔｒｔ；Ｓｅｒ、ｔＢｕ；およびＴｒｐ、Ｂｏｃ（Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８－ペンタメチルコマン－６－スルホニル、ＯｔＢｕ＝ｔｅｒｔ－ブチルエステル、Ｔｒｔ＝トリチル、Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、およびｔＢｕ＝ｔｅｒｔ－ブチルエーテル）。
材料：総ての溶媒および試薬は、商業的供給源から購入し、さらに精製することなく使用した。ペプチドの伸長には、Ｈ－Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂を使用した。特に明記しない限り、Ｆｍｏｃ保護（９－フルオレニルメチルカルバメート）アミノ酸は、Ｉｒｉｓ－ＢｉｏｔｅｃｈまたはＧｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、Ｈ－Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）樹脂、３５～１００メッシュ；ローディング０．４０～０．６０ｍｍｏｌ／ｇはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。市販のＮα－Ｆｍｏｃアミノ酸ビルディングブロックは、次の側鎖保護類似体として購入した：Ａｒｇ、Ｐｍｃ；Ａｓｐ、ＯｔＢｕ；Ｃｙｓ、Ｔｒｔ；Ｇｌｎ、Ｔｒｔ；Ｈｉｓ、Ｔｒｔ；Ｌｙｓ、Ｔｒｔ；Ｓｅｒ、ｔＢｕ；およびＴｒｐ、Ｂｏｃ（Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８－ペンタメチルコマン－６－スルホニル、ＯｔＢｕ＝ｔｅｒｔ－ブチルエステル、Ｔｒｔ＝トリチル、Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、およびｔＢｕ＝ｔｅｒｔ－ブチルエーテル）。
【0084】
総てのペプチドおよびペプチドとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲートを、Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＸＢＤ－Ｃ１８、４．６×５０ｍｍ）使用のＡｇｉｌｅｎｔ ６４１０ トリプル四重極マスフィルターと連動した分析用逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＰＬＣ）（Ｗａｔｅｒｓ）およびエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ－ＬＣＭＳ）により特性評価した。ＥＳＩ－ＬＣＭＳは、Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（Ａ：９５：５：０．１、Ｂ：５：９５：０．１）で構成される二成分バッファー系を用いた、０．７５ｍＬ／分の流量での溶出であった。純度は、Ｃ１８カラム（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）を備えたＲＰ－ＵＰＬＣによって決定し、Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（Ａ：９５：５：０．１、Ｂ：５：９５：０．１）で構成される二成分バッファー系を用いて、０．４５ｍＬ／分の流量で溶出した。
【0085】
Ｆｍｏｃ保護スキームの自動ペプチド合成プロトコール：ペプチドは、１０ｍＬガラス容器を備えたＰｒｅｌｕｄｅ Ｘ、誘導加熱使用によるペプチド合成装置（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、トゥーソン、ＡＺ、ＵＳＡ）を使用して、Ｃ末端がアミド化された誘導体として調製した。総ての試薬は、ＤＭＦ中のストック溶液として新たに調製した：Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（０．２Ｍ）、ＨＣＴＵ（０．５Ｍ）、ＤＩＰＥＡ（１．０Ｍ）およびピペリジン（２０％ｖ／ｖ）。ペプチドの伸長は、次のプロトコールを使用した連続合成操作によって達成した：脱保護（２×２分、室温、３００ｒｐｍでの振盪）およびカップリング（２×５分、７５℃、３００ｒｐｍでの振盪、ＡｒｇおよびＨｉｓの場合、２×５分、５０℃、３００ｒｐｍでの振盪）。ペプチドは、樹脂と比較して５倍過剰でＡＡ／ＨＣＴＵ／ＤＩＰＥＡ（比 １：１．２５：２．５）からなるダブルおよびトリプルカップリングを使用して調製した。
【0086】
精製：粗ペプチドまたはペプチドとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲートを、精製前にＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳまたはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で分析した。精製は、逆相Ｃ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ、３００ ＳＢ－Ｃ１８、２１．２×２５０ｍｍ）を備えた、Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（Ａ：９５：５：０．１；Ｂ：５：９５：０．１）の二成分バッファー系を使用して線形勾配（流量２０ｍＬ／分）で溶出する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ）で実行した。画分を０．３分間隔で収集し、ＥＳＩ－ＬＣＭＳによる特性評価を行った。純度は、ＲＰ－ＵＰＬＣによって２１４ｎｍで決定し、純度＞９５％の画分をプールし、凍結乾燥した。最終凍結乾燥生成物をさらなる実験に使用した。
【0087】
ペプチドとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲートのアセンブリーのためのコンジュゲーションプロトコール：純粋ペプチドおよび純粋チオピリジル活性化ＡＭＰＫ活性化剤コンジュゲートを二成分溶媒系（Ａ：Ｈ２Ｏ中、ＤＭＦ；６Ｍグアニジン、１．５Ｍイミダゾール、ｐＨ＝８）に溶解し（比 ７：１）、少なくとも２時間撹拌した。粗反応混合物を分析用ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳによって監視した。完了したら、反応混合物をバッファーＡおよびバッファーＢで希釈し、線形勾配で溶出するＲＰ－ＨＰＬＣを使用して直接精製した。
【0088】
脱塩：総てのペプチドを生物学的実験の前に脱塩した。脱塩は、ペプチドまたはペプチドとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲートを０．０１Ｍ希ＨＣｌ水溶液に連続的に再溶解し、続いて、凍結乾燥することによって行い、３回繰り返した。ペプチドまたはコンジュゲートの純度は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に使用するまで、ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳによって監視した。
【0089】
２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エタン－１－アミン塩酸塩。磁気撹拌バーを備えた乾燥シュランク丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、２’－アルドリチオール（５．００ｇ、２２．７０ｍｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、続いて、塩酸システアミン（８５９．５ｍｇ、７．５７ｍｍｏｌ、１．０当量）を滴下した。反応物を室温で２時間撹拌した後、真空濃縮した。黄色の粗油をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ １７：３）によって精製するか、またはＭｅＯＨに再溶解し、冷エーテルで沈殿させて、２－（ピリジン－２－イルスルファンイル）エタン－１－アミン塩酸塩を白色結晶として得た（１．３９ｇ、＞９５％）。Ｒｆ＝０．２２；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ７Ｈ１０Ｎ２Ｓ２［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝１８７．０、測定値１８７．２； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.51 (dt, J = 4.9, 1.4 Hz, 1H), 8.23 (s, 3H), 7.84 (td, J = 7.7, 1.9 Hz, 1H), 7.78 - 7.72 (m, 1H), 7.30 (ddd, J = 7.4, 4.8, 1.1 Hz, 1H), 3.14 - 3.06 (m, 4H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 158.05, 149.83, 137.91, 121.64, 120.08, 37.67, 34.79.
【0090】
５－アミノ－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－カルボキサミド。磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させたシュランク丸底フラスコ中、乾燥アセトン（３６０ｍＬ）中、Ａｉｃａｒ（５．５０ｇ、２１．３ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌懸濁液に、過塩素酸（７０％、２．３８ｍＬ、２７．６９ｍｍｏｌ、１．３当量）を加えた。３時間室温で撹拌した後、０℃で水酸化アンモニウム（４．０４ｍＬ、２９．８３ｍｍｏｌ、１．４当量）を滴下することで反応を急冷した。得られた固体を濾過し、乾燥させ、５－アミノ－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソｌ－４－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－カルボキサミドを白色結晶として得た（４．２６ｇ、６７％）。純度＞９５％（ＨＰＬＣ、２０分で０－５０Ｂ）、Ｒｔ＝１６．６０分； ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１２Ｈ１９Ｎ４Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝２９９．１、測定値２９９．４；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.37 (s, 1H), 6.74 (d, J = 50.9 Hz, 2H), 5.93 (s, 2H), 5.75 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.27 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 5.08 (dd, J = 6.3, 3.7 Hz, 1H), 4.87 (dd, J = 6.4, 2.9 Hz, 1H), 4.10 (q, J = 3.7 Hz, 1H), 3.52 (tq, J = 11.7, 6.1, 4.7 Hz, 2H), 3.31 (s, 1H), 1.53 (s, 3H), 1.32 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 166.60, 142.75, 128.16, 113.38, 112.82, 88.58, 84.97, 82.31, 80.53, 61.00, 26.96, 25.20.
【0091】
（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（５－アミノ－４－カルバモイル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソｌ－４－イル）メチル （２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カルバメート。磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させたシュランク丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、５－アミノ－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソｌ－４－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－カルボキサミド（６００．０ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、続いて、Ｎ，Ｎ－カルボニルジイミダゾール（３９１．０ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ、１．２当量）および乾燥ピリジン（４８８μＬ、６．０３ｍｍｏｌ、３．０当量）を加えた。反応をＵＰＬＣ－ＭＳによって継続的に監視した。活性化カルバメートに完全に変換した際に、２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エタン－１－アミン塩酸塩（４６８．４ｍｇ、３．０２ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、反応物を油浴で４５℃に加熱し、２２時間撹拌した。化合物２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エタン－１－アミン塩酸塩は反応が進むにつれ可溶化した。完了したところで（ＵＰＬＣ－ＭＳより監視）、反応物を、ＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍＬ）が入った分液漏斗に移し、水（３×５０ｍｌ）およびブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空濃縮した。粗油を、勾配（ＣＨ２Ｃｌ２→ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ １９：１→ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９：１）を用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製することにより精製し、（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（５－アミノ－４－カルバモイル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル （２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カルバメートを白色結晶固体として得た（９１６ｍｇ、８９％）；純度＞９５％（ＨＰＬＣ、２０分で０－５０Ｂ）、Ｒｔ＝１６．６０分； ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２０Ｈ２７Ｎ６Ｏ６Ｓ２［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝５１１．１、測定値５１１．２；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.51 - 8.28 (m, 1H), 7.86 - 7.73 (m, 2H), 7.51 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.24 (ddd, J = 7.3, 4.8, 1.2 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 31.7 Hz, 2H), 5.90 (s, 2H), 5.78 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 5.17 (dd, J = 6.3, 3.5 Hz, 1H), 4.84 (dd, J = 6.3, 3.0 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 4.4 Hz, 1H), 4.11 - 3.97 (m, 2H), 3.28 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.52 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 1.53 (s, 3H), 1.32 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 166.42, 159.01, 155.61, 149.58, 142.90, 137.79, 127.51, 121.19, 119.29, 113.72, 112.47, 87.60, 82.49, 82.27, 80.52, 63.70, 37.53, 26.87, 25.19.
【0092】
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－４－カルバモイル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メチル （２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カルバメート。スクリューキャップ付きの１０ｍＬバイアル中、（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（５－アミノ－４－カルバモイル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－２，２－ジメチル－テトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カルバメート（８０．０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、１．０当量）をＭｅＣＮと１．０Ｍ ＨＣｌ水溶液の１：３混合物に溶解し、３時間振盪機に置おいた（Ｕｎｔｉｌ ＨＰＬＣおよびＵＰＬＣ－ＭＳが完全な変換を示すまで）。次に、反応混合物を凍結乾燥させて（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（５－アミノ－４－カルバモイル－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラ－ヒドロフラン－２－イル）メチル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カルバメートを二塩酸塩として得た（８４ｍｇ＞９５％）。純度＞９５％（ＨＰＬＣ、２０分で０－５０Ｂ）、Ｒｔ＝１１．６２分；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１７Ｈ２３Ｎ６Ｏ６Ｓ２［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝４７１．１、測定値４７１．４；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (s, 1H), 8.46 (dd, J = 5.0, 1.8 Hz, 1H), 7.85 (td, J = 7.8, 1.9 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.60 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.26 (ddd, J = 7.5, 4.8, 1.1 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.37 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.19 (m, 2H), 4.03 (m, 1H), 3.29 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 2.92 (m, 2H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 162.32, 161.07, 158.92, 155.79, 149.35, 142.90, 138.13, 127.63, 121.31, 119.51, 103.12, 88.46, 83.31, 73.73, 69.93, 63.80, 37.58.
【0093】
（３Ｓ，３ａＳ，６Ｓ，６ａＳ）－６－（（５－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－６－クロロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－イル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カルバメート。火炎乾燥させた丸底フラスコ中、アルゴン雰囲気下で、ＭＫ－８７２２（１２ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｎ，Ｎ－カルボニルジイミダゾール（５．２ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、１．２当量）および乾燥ピリジン（６．５μＬ、０．０８ｍｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、周囲温度で一晩、振盪機（５００ｒｐｍ）に置いた。活性化カルバメートの形成をＵＰＬＣ－ＭＳによって確認した；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２８Ｈ２４ＣｌＮ５Ｏ５［Ｍ＋２Ｈ］２＋についてのｍ／ｚ計算値＝２７２、６ 測定値２７２．４。ＵＰＬＣ－ＭＳによって監視して完全に変換時されたところで、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中、２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エタン－１－アミン塩酸塩（７．４８ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ、１．５当量）にシリンジを介して加え、温度を５０℃に上げ、一晩置いた。反応混合物をＨ２Ｏ：ＭｅＣＮ（１：１）で希釈し、分取ＨＰＬＣ（２０ｍＬ／分で０から１００％Ｂへの勾配で溶出）によって精製し、続いて、凍結乾させて、（３Ｓ，３ａＳ，６Ｓ，６ａＳ）－６－（（５－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－６－クロロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－イル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カルバメートを白色固体として得た（１１．６ｍｇ、６６％）；純度＞９５％（ＨＰＬＣ）、ＲＴ＝１６．７７分；ＵＰＬＣ－ＭＳ；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３２Ｈ３０ＣｌＮ５Ｏ５Ｓ２［Ｍ＋２Ｈ］２＋についてのｍ／ｚ計算値＝３３１、６ 測定値３３１．５；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.49 - 8.43 (m, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.83 (td, J = 7.7, 1.9 Hz, 1H), 7.81 - 7.72 (m, 7H), 7.59 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.43 - 7.37 (m, 1H), 7.32 - 7.21 (m, 1H), 5.48 (q, J = 5.9 Hz, 1H), 4.94 (td, J = 6.9, 5.4 Hz, 1H), 4.87 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.65 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 9.5, 6.1 Hz, 1H), 3.93 (ddd, J = 16.9, 9.2, 6.3 Hz, 2H), 3.68 (dd, J = 8.8, 7.3 Hz, 1H), 3.35 - 3.22 (m, 2H), 2.92 (t, J = 6.8 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 160.21, 159.06, 155.38, 149.57, 146.90, 139.69, 139.63, 137.88, 137.85, 130.09, 129.01, 127.65, 126.70, 126.09, 121.79, 121.22, 119.31, 116.22, 114.30, 80.44, 80.07, 78.61, 73.33, 70.12, 69.79, 37.59.
【0094】
グルカゴンＰｅｎ４０／ＡＩＣＡＲ（ペニシラミン結合）の調製： グルカゴンペプチド誘導体を、上記に開示したＦｍｏｃプロトコールを用いて合成し、化学的リンカー誘導体化ＡＩＣＡＲ類似体とコンジュゲートした。化学的リンカー誘導体化ＡＩＣＡＲの化学合成は、図１５に開示する合成経路によって行った。
【0095】
グルカゴンＰｅｎ４０／ＭＫ－８７２２：このコンジュゲートは、上記に開示するコンジュゲーションプロトコールを用い、図１６に示す化学反応によって調製し、化学反応は、６Ｍグアニジン、１．５Ｍイミダゾールバッファー中、室温で２時間行った。ＲＰ－ＵＰＬＣおよびＥＳＩ－ＬＣＭＳ分析により純度は＞９５％と判定された。
【0096】
実施例２：食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ薬理学研究
Ｃ５７ＢＬ６Ｊ雄マウス（以下、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスと呼ぶ）は、高脂肪食（脂肪からのエネルギー５８％）で飼育し、各研究について、研究開始前に平均体重は４５グラムを超えていた。マウスは個別収容するかまたは二重収容した。マウスは、２１～２３℃で１２時間の明暗サイクルで飼育した。化合物を１日１回（午後２時～午後５時）皮下投与し、食物摂取（ＦＩ）および体重（ＢＷ）を対応する時間に測定した。体組成については、研究前（研究開始の１～３日前）および研究の最終日に、ＭＲＩスキャナー（ＥｃｈｏＭＲＩ）を使用して脂肪および除脂肪量の測定を行った。ビヒクル（生理食塩水）を注射したマウス群を対照群とした。
Ｃ５７ＢＬ６Ｊ雄マウス（以下、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスと呼ぶ）は、高脂肪食（脂肪からのエネルギー５８％）で飼育し、各研究について、研究開始前に平均体重は４５グラムを超えていた。マウスは個別収容するかまたは二重収容した。マウスは、２１～２３℃で１２時間の明暗サイクルで飼育した。化合物を１日１回（午後２時～午後５時）皮下投与し、食物摂取（ＦＩ）および体重（ＢＷ）を対応する時間に測定した。体組成については、研究前（研究開始の１～３日前）および研究の最終日に、ＭＲＩスキャナー（ＥｃｈｏＭＲＩ）を使用して脂肪および除脂肪量の測定を行った。ビヒクル（生理食塩水）を注射したマウス群を対照群とした。
【0097】
実施例３：修飾グルカゴン（配列番号３）とＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲートの調製
４’－（５－シアノ－４－ヒドロキシ－６－オキソ－６，７－ジヒドロチエノ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル）－［１，１’－ビフェニル］－２－イル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カルバメート（４０２）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、Ａ－７６９６６２（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１．０当量）および乾燥Ｅｔ３Ｎ（１１６μＬ、０．８３ｍｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解した。反応混合物を氷水浴中で０℃に冷却した後、クロロギ酸ニトロフェニル（６２ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応物をＵＰＬＣ－ＭＳによってモニタリングした。完了したところで、１３７（５７ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え、反応物を５０℃に加熱し、一晩撹拌放置した。反応混合物をＨ２Ｏ：ＭｅＣＮ（１：１）で希釈し、分取ＨＰＬＣ（２０ｍＬ／分で０－１００％Ｂの勾配で溶出）によって精製し、続いて、凍結乾燥させて４０２を白色固体として得た（７８ｍｇ、４９％）；ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２８Ｈ２１Ｎ４Ｏ４Ｓ３［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝５７３．１、測定値５７３．１；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.57 (s, 1H), 8.49 - 8.42 (m, 1H), 7.95 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.77 (td, J = 7.7, 1.9 Hz, 1H), 7.76 - 7.70 (m, 1H), 7.52 - 7.45 (m, 2H), 7.48 - 7.40 (m, 2H), 7.43 - 7.35 (m, 2H), 7.34 (td, J = 7.5, 1.3 Hz, 1H), 7.26 - 7.21 (m, 1H), 7.19 (dd, J = 8.0, 1.3 Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 3.30 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 2.84 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 162.47, 159.49, 155.03, 150.06, 148.39, 138.22, 137.32, 136.67, 135.54, 134.44, 130.86, 129.82, 128.96, 128.22, 126.34, 124.18, 121.66, 119.73, 116.35, 40.41, 37.89.
４’－（５－シアノ－４－ヒドロキシ－６－オキソ－６，７－ジヒドロチエノ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル）－［１，１’－ビフェニル］－２－イル（２－（ピリジン－２－イルジスルファンイル）エチル）カルバメート（４０２）
【化1】
【0098】
カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２－ヒドロキシエチル）（２）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中、２－エタノールアミン（１．９８ｍＬ、３２．７４ｍｍｏｌ、１．０当量）および乾燥Ｅｔ３Ｎ（６．７０ｍＬ、４９．１１ｍｍｏｌ、１．５当量）の撹拌溶液に、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（７．８６ｇ、３６．０１ｍｍｏｌ、１．１０当量）を加え、一晩置いた。反応混合物を真空濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に再溶解し、有機層を０．５Ｎ ＨＣｌ水溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、２を無色の油として得た（５．２１ｇ、＞９５％）。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 5.06 (s, 1H), 3.66 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.25 (q, J = 5.4 Hz, 2H), 1.42 (s, 9H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 156.94, 79.72, 62.54, 46.15, 28.49.
【化2】
【0099】
２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エチル ４－メチルベンゼンスルホネート（３）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、２（５．２８ｇ、３２．７４ｍｍｏｌ、１．０当量）および乾燥Ｅｔ３Ｎを無水ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、塩化ｐ－トルエンスルホニル（９．３６ｇ、４９．１２ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、一晩置いた。反応物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）が入った分液漏斗に移し、合わせた有機層をＨ２Ｏ（３×５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空濃縮した。コンビフラッシュ（勾配０－５０で４５分溶出）によって精製し、３を褐色油として得た（８．９８ｇ、８７％）。Ｒｆ＝０．６１（１：１、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン）；1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 7.90 - 7.69 (m, 2H), 7.40 - 7.33 (m, 2H), 4.85 (s, 1H), 4.06 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.37 (q, J = 5.5 Hz, 2H), 2.44 (s, 3H), 1.40 (s, 9H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 155.73, 145.14, 132.83, 130.08, 128.05, 79.89, 69.57, 39.88, 28.40, 21.75.
【化3】
【0100】
（２－（４－ブロモフェノキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（４）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、３（２．５ｇ、１３．９２ｍｍｏｌ、１．０当量）、４－ブロモフェノール（２．６５ｇ、１５．３１ｍｍｏｌ、１．１当量）および炉で乾燥させたＫ２ＣＯ３（５．７６ｇ、４１．２ｍｍｏｌ、３．０当量）を６０℃で一晩、乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）に懸濁した。次に、この反応混合物に水を加え、水層をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で濾過し、真空濃縮して、４（４．０９ｇ、９３％）を得た；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ９Ｈ１０ＢｒＮＯ２［Ｍ＋Ｈ－ｔＢｕ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝２６０．０、測定値２６０．１；1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 7.62 - 7.28 (m, 2H), 6.90 - 6.63 (m, 2H), 4.98 (s, 1H), 3.97 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.51 (dt, J = 5.5 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 157.82, 155.98, 132.44, 116.38, 116.38, 113.34, 79.73, 67.54, 40.16, 28.51.
【化4】
【0101】
（２－（４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェノキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（５）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、４（２．０４ｇ、６．５ｍｍｏｌ、１．０当量）、ビス（ピナコラト）二ホウ素（３．３０ｇ、１３．０２ｍｍｏｌ、２．０当量）、ＡｃＯＫ（３．４４ｇ、３５ｍｍｏｌ、５．４当量）、およびＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２・ＣＨ２Ｃｌ２（５０８ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、０．１当量）を乾燥脱気したＤＭＳＯ（３０ｍＬ）と混合し、反応混合物を手早く脱気した後、１３時間８０℃に加熱した。反応混合物をセライト（登録商標）パッドで濾過し、濾液を水（１００ｍＬ）が入った分液漏斗に移し、水層をＥｔＯＡｃ（３×７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏ（３×１００ｍＬ）およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。黒い粗油を、勾配（ヘプタン：ＥｔＯＡｃ、２０：１から５：１へ）で溶出させるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、５を無色の油として得た（１．７３ｇ、７３％）。ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１５Ｈ２３ＢＮＯ５［Ｍ＋Ｈ－ｔＢｕ］＋についてのｍ／ｚ計算値３０８．２、測定値３０８．３；1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.93 - 7.34 (m, 2H), 6.93 - 6.67 (m, 2H), 4.04 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.53 (q, J = 5.2 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.32 (s, 12H)
【化5】
【0102】
１－（５－ブロモ－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）－２，２，２－トリフルオロエタン－１－オン（７）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、５－ブロモ－６－クロロ－１Ｈ－インドール（２．２２ｇ、９．５４ｍｍｏｌ、１．０当量）を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、氷浴中で０℃に冷却した。この撹拌溶液にトリフルオロ酢酸無水物（５．３ｍＬ、３８．２ｍｍｏｌ、４．０当量）を滴下した。反応を撹拌放置した後、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液で急冷すると沈殿を生じた。沈殿を濾過し、回収し、７を得た（定量的）。ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１０Ｈ５ＢｒＣｌＦ３ＮＯ［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝３２７．９、測定値３２８．０；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.33 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 8.27 (dp, J = 3.9, 2.0 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.70 (d, J = 1.8 Hz, 1H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 171.26 (q, CO-CF3), 147.33, 145.16, 129.68, 125.47, 118.14 (q, CO-CF3), 117.85, 115.23, 114.20, 108.97.
【化6】
【0103】
５－ブロモ－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－酸（８）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた丸底フラスコ中、７（３．１１ｇ、９．５４ｍｍｏｌ、１．０当量）を３．０Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５０ｍＬ）に懸濁し、１６時間還流した。反応混合物を室温まで放冷した後、５．０Ｎ ＨＣｌ水溶液を用いてｐＨ１～２に酸性化し、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、中間体カルボン酸８を褐色固体として得た（定量的）。ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１０Ｈ４ＢｒＣｌＮＯ２［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝２７３．９、測定値２７３．９。
【化7】
【0104】
５－ブロモ－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸メチル（９）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、粗８（２．３４ｇ、７．７１ｍｍｏｌ、１．０当量）を乾燥ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解し、発煙硫酸（１．０ｍＬ）を滴下した後、１２時間加熱還流した。反応混合物を真空濃縮し、メチルエステル９を赤みがかった固体として得た（１．９０ｇ、８６％）。ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１０Ｈ６ＢｒＣｌＮＯ２［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝２８７．９、測定値２８８．０; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.18 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 3.82 (s, 3H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 164.59, 136.31, 135.24, 126.96, 126.48, 125.00, 114.51, 114.37, 106.51, 51.45.
【化8】
【0105】
５－（４－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）フェニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸メチル（１０）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、９（１ｇ、３．４７ｍｍｏｌ、１．０当量）および５（１．２２ｇ、３．４７ｍｍｏｌ、１．０当量）をトルエン（６６ｍＬ）に溶解した。Ｋ２ＣＯ３（３．０２ｇ、２１．８５ｍｍｏｌ、７．０当量）をＨ２Ｏ（３３ｍＬ）に溶解し、この溶液を反応混合物に加え、続いて、反応混合物にＮ２を１０分間バブリングすることによって脱気した。Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２
＊ＣＨ２Ｃｌ２（２４７ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、０．１当量）を加え、反応物を３時間還流した。反応混合物を真空濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）再溶解させ、セライト（登録商標）パッドで濾過した。コンビフラッシュ（勾配０－５０で５０分溶出）によって精製し、１０を褐色固体として得た（１．３３ｇ、９３％）。Ｒｆ＝０．６１（１：１、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン）；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１８Ｈ１８ＣｌＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ－Ｂｏｃ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝３４５．１、測定値３４５．４；1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 9.00 - 8.91 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.43 - 7.37 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.7, 2H), 5.06 (s, 1H), 4.08 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.57 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 165.38, 157.98, 135.75, 134.60, 133.32, 132.18, 131.31, 128.31, 127.94, 124.94, 123.77, 114.89, 113.97, 112.55, 109.15, 77.37, 77.16, 76.95, 67.33, 51.46, 51.34, 28.56, 25.01, 24.74.
【化9】
【0106】
５－（４－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）フェニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸（１１）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた丸底フラスコ中、１０（６８５ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（１２ｍＬ、１：１：１）からなる溶媒系に溶解し、ＮａＯＨ（１８５ｍｇ、４．６２ｍｍｏｌ、３．０当量）を加え、一晩還流した。次に、反応物を真空濃縮し、続いて、ｐＨ＝３～４に酸性化した。水層をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。コンビフラッシュ（ヘプタン中５０－１００％ＥｔＯＡｃの勾配で溶出）によって精製し、１１を褐色がかった固体として得た（５９７ｍｇ、９０％）。Ｒｆ＝０．４３（ＥｔＯＡｃ）；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２２Ｈ２２ＣｌＮ２Ｏ５［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝４２９．１、測定値４２９．３；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 11.91 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.34 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.01 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.33 (t, 6,1 2H), 1.40 (s, 9H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 165.55, 157.63, 155.68, 135.89, 133.75, 132.78, 132.44, 130.74, 125.79, 125.24, 122.68, 114.01, 112.83, 107.56, 77.76, 73.49, 66.41, 28.22.
【化10】
【0107】
５－（４－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）フェニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸アリル（１２）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、１１（５００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮａＨＣＯ３（１５７ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ、１．６当量）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に懸濁し、続いて、臭化アリル（１５１μＬ、１．７４ｍｍｏｌ、１．５当量）を、シリンジを介して加えた。反応混合物を５０℃に加熱し、１２時間撹拌した。反応物をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で急冷し、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）が入った分液漏斗に移した。有機層をＨ２Ｏ（５×３０ｍＬ）およびブライン（２×３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、１２を褐色固体として得た（５４３ｍｇ、＞９５％）。ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２５Ｈ２６ＣｌＮ２Ｏ５［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝４６９．２、測定値４６９．４；1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 8.95 - 8.92 (m, 1H), 8.13 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 2H), 6.98 - 6.93 (m, 2H), 6.04 (ddt, J = 17.3, 10.9, 5.6 Hz, 1H), 5.39 (dq, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H), 5.26 (dq, J = 10.5, 1.4 Hz, 1H), 5.05 (s, 1H), 4.82 (tt, J = 6.8, 1.5 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.57 (q, J = 5.2 Hz, 2H), 1.47 (s, 9H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 164.50, 157.97, 156.12, 135.75, 134.64, 133.30, 132.89, 132.24, 131.31, 128.33, 125.06, 123.80, 118.02, 113.97, 112.57, 109.07, 79.73, 77.37, 77.16, 76.95, 67.34, 64.77, 40.35, 28.57.
【化11】
【0108】
５－（４－（２－アミノエトキシ）フェニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸アリル（１３）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた丸底フラスコ中、１２（５００ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ、１．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に溶解し、氷水浴を用いて０℃に冷却し、続いて、ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）中、５０％ＴＦＡを滴下した。反応物を室温で２時間撹拌した後、真空濃縮した。この油を複数回エーテルと共蒸発させ、１３を褐色固体として得た（３８５ｍｇ、＞９５％）。ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２０Ｈ２０ＣｌＮ２Ｏ３［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝３７１．１、測定値３７１．４; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.13 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 8.03 (s, 3H), 7.95 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.46 - 7.32 (m, 2H), 7.20 - 7.01 (m, 2H), 6.03 (ddt, J = 17.2, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.38 (dq, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.23 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.27 (h, J = 4.7 Hz, 2H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 162.28, 157.10, 135.96, 133.27, 133.00, 132.98, 130.83, 126.05, 124.91, 122.43, 117.28, 114.23, 113.10, 106.33, 64.42, 63.64, 38.43.
【化12】
【0109】
４－（（２－（４－（３－（（アリルオキシ）カルボニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－５－イル）フェノキシ）エチル）アミノ）－４－オキソブタン酸（１４ａ）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌を備えた、火炎乾燥させたフラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、１３（７５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）および乾燥Ｅｔ３Ｎ（８３μＬ、０．６０ｍｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解した後、塩化メチルスクシニル（７５μＬ、０．４ｍｍｏｌ、２．０当量）を、シリンジを介して加えた。反応物を２時間撹拌した後、蒸発乾固した（二重アシル化中間体の形成）。粗反応混合物をＴＨＦとＨ２Ｏの混合物（１：１、４ｍＬ）に再溶解し、ＮａＯＨ（３０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ、３．５当量）を加え、４時間撹拌放置した。反応混合物を真空濃縮し、シリカに吸収させ、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ＋１％ＡｃＯＨ）によって精製し、１４ａを白色固体として得た（４３ｍｇ、４５％）。Ｒｆ＝０．１１（ＥｔＯＡｃ＋１％ＡｃＯＨ）；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２４Ｈ２２ＣｌＮ２Ｏ６［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝４６９．９、測定値４６９．４；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.15 (q, J = 5.6, 4.7 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.36 - 7.33 (m, 2H), 7.07 - 7.00 (m, 2H), 6.03 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.38 (dq, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.45 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.44 (dd, J = 7.3, 6.1 Hz, 2H), 2.36 (t, J = 6.7 Hz, 2H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 173.84, 171.34, 163.58, 157.67, 135.90, 134.19, 133.27, 133.13, 132.39, 130.74, 126.11, 124.87, 122.45, 117.31, 114.07, 113.05, 106.37, 66.38, 63.66, 38.30, 29.93, 29.13.
【化13】
【0110】
６－（（２－（４－（３－（（アリルオキシ）カルボニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－５－イル）フェノキシ）エチル）アミノ）－６－オキソヘキサン酸（１４ｂ）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌を備えた、火炎乾燥させたフラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、１３（７５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）および乾燥Ｅｔ３Ｎ（８３μＬ、０．６０ｍｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解した後、塩化メチルアジポイル（６７μＬ、０．４ｍｍｏｌ、２．０当量）を、シリンジを介して加えた。反応物を２時間撹拌した後、蒸発乾固した（二重アシル化生成物の形成）。粗反応混合物をＴＨＦとＨ２Ｏの混合物（１：１、４ｍＬ）に再溶解し、ＮａＯＨ（３０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ、３．５当量）を加え、４時間撹拌放置した。反応混合物を真空濃縮し、シリカに吸収させ、フラッシュクロマトグラフィー（３９：１ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＋１％ＡｃＯＨ）によって精製し、１４ｂを白色固体として得た（４０．３ｍｇ、４０％）。Ｒｆ＝０．２３（３９：１ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＋１％ＡｃＯＨ）；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２６Ｈ２６ＣｌＮ２Ｏ６［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝３９８．０、測定値３９７．４；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.08 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 11.98 (s, 1H), 8.19 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 8.07 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.37 - 7.32 (m, 2H), 7.05 - 7.00 (m, 2H), 6.03 (ddt, J = 17.2, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.38 (dq, J = 17.3, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.45 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.11 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.56 - 1.43 (m, 4H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 174.35, 172.25, 163.58, 157.67, 135.89, 134.19, 133.27, 133.13, 132.37, 130.73, 126.10, 124.86, 122.44, 117.31, 114.06, 113.04, 106.37, 66.36, 63.65, 38.18, 34.96, 33.40, 24.76, 24.12.
【化14】
【0111】
８－（（２－（４－（３－（（アリルオキシ）カルボニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－５－イル）フェノキシ）エチル）アミノ）－８－オキソオクタン酸（１４ｃ）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌を備えた、火炎乾燥させたフラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、１３（７５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）および乾燥Ｅｔ３Ｎ（８３μＬ、０．６０ｍｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解した後、オクタン酸塩化メチル（１２１μＬ、０．４ｍｍｏｌ、２．０当量）を、シリンジを介して加えた。反応物を２時間撹拌した後、蒸発乾固した（二重アシル化中間体の形成）。粗反応混合物をＴＨＦとＨ２Ｏの混合物（１：１、４ｍＬ）に再溶解し、ＮａＯＨ（３０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ、３．５当量）を加え、４時間撹拌放置した。反応混合物を真空濃縮し、シリカに吸収させ、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ＋１％ＡｃＯＨ）によって精製し、１４ｃを白色固体として得た（４３ｍｇ、４５％）。Ｒｆ＝０．３１（ＥｔＯＡｃ＋１％ＡｃＯＨ）；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２８Ｈ３０ＣｌＮ２Ｏ６［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝５２５．２、測定値５２５．５；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.49 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.14 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.52 - 7.25 (m, 2H), 7.25 - 6.94 (m, 2H), 6.02 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.37 (dq, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.75 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.03 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.43 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 2.08 (dt, J = 17.5, 7.4 Hz, 4H), 1.53 - 1.39 (m, 2H), 1.24 (m, 4H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 175.64, 172.52, 163.61, 157.66, 135.98, 134.10, 133.28, 133.05, 132.39, 130.74, 125.98, 124.86, 122.39, 117.28, 114.04, 113.15, 106.22, 66.32, 63.62, 38.14, 35.27, 28.60, 28.49, 25.19, 25.11.
【化15】
【0112】
６－クロロ－５－（４－（２－（１０－メトキシ－１０－オキソデカンアミド）エトキシ）フェニル）－１－（１０－メトキシ－１０－オキソデカノイル）－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸アリル（１４ｄ’）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、１３（７５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＨＢＴＵ（１１８ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、１．５当量）、セバシン酸モノメチル（７０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に懸濁し、続いて、乾燥Ｅｔ３Ｎ（８３μＬ、０．６ｍｍｏｌ、３．０当量）を加えた。反応物を４時間撹拌放置した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）が入った分液漏斗に移した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３×５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。粗残渣をシリカ上で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（１：１ ＥｔＯＡｃ：ヘプタン＋１％ＡｃＯＨ）によって精製し、１４ｄ’－二重アシル化中間体を白色固体として得た（９０ｍｇ、５４％）。Ｒｆ＝０．１５（１：１ ＥｔＯＡｃ：ヘプタン＋１％ＡｃＯＨ）；1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 8.64 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.43 - 7.39 (m, 2H), 7.02 - 6.77 (m, 2H), 6.10 - 5.98 (m, 1H), 5.96 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 5.41 (dq, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.30 (dq, J = 10.4, 1.3 Hz, 1H), 4.85 (dt, J = 5.8, 1.4 Hz, 2H), 4.11 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.71 (q, J = 5.3 Hz, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.65 (s, 3H), 2.97 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.30 (dt, J = 17.0, 7.5 Hz, 4H), 2.22 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.86 (p, J = 7.4 Hz, 2H), 1.62 (dq, J = 20.4, 7.2 Hz, 4H), 1.52 - 1.43 (m, 2H), 1.42 - 1.25 (m, 16H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 174.44, 174.40, 171.58, 163.43, 158.12, 137.16, 135.38, 132.82, 132.29, 131.43, 131.22, 131.00, 126.32, 123.57, 118.83, 117.90, 114.07, 113.59, 67.05, 65.48, 51.61, 51.58, 39.13, 36.85, 35.70, 34.22, 34.20, 29.32, 29.27, 29.24, 29.19, 29.13, 25.79, 25.03, 24.47.
【化16】
【0113】
１０－（（２－（４－（３－（（アリルオキシ）カルボニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－５－イル）フェノキシ）エチル）アミノ）－１０－オキソデカン酸（１４ｄ）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、丸底フラスコ中、１４ｄ’（９０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＨＦとＨ２Ｏからなる溶媒系（６ｍＬ、１：１）に溶解し、続いて、ＮａＯＨ（１７．６ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、３．５当量）を加えた。反応物を６時間撹拌放置した後、真空濃縮した。粗残渣をシリカ上で蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ＋１％ＡｃＯＨ）によって精製し、１４ｄを白色固体として得た（３６ｍｇ、５２％）。Ｒｆ＝０．１９（ＥｔＯＡｃ＋１％ＡｃＯＨ）；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３０Ｈ３４ＣｌＮ２Ｏ６［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝５５３．２、測定値５５３．５；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.04 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.34 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.04 - 6.96 (m, 2H), 6.03 (ddt, J = 17.3, 10.5, 5.3 Hz, 1H), 5.38 (dq, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H), 5.23 (dq, J = 10.5, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.44 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.16 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.09 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.52 - 1.40 (m, 4H), 1.23 (m, 8H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 174.50, 172.47, 163.57, 157.70, 135.90, 134.19, 133.27, 133.12, 132.36, 130.73, 126.09, 124.86, 122.44, 117.29, 114.04, 113.05, 106.36, 66.37, 63.65, 38.19, 35.28, 33.75, 28.64, 28.62, 28.58, 28.53, 25.22, 24.50.
【化17】
【0114】
２０－（（２－（４－（３－（（アリルオキシ）カルボニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－５－イル）フェノキシ）エチル）アミノ）－２０－オキソイコサン酸（１４ｅ）（図１７、スキーム１）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、１３（７５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）、オクタデカン二酸モノ－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（１２１ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＨＢＴＵ（１１５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した後、乾燥Ｅｔ３Ｎ（８３μＬ、０．６０ｍｍｏｌ、３．０当量）を加えた。反応物を２時間撹拌放置した後、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）で希釈し、有機層をＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。粗中間体をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に再溶解し、氷水浴を用いて０℃に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２中５０％ＴＦＡ（４ｍＬ）で処理した。反応物を室温に温め、２時間撹拌放置した後、真空濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：１ ＥｔＯＡｃ：ヘプタン＋１％ＡｃＯＨ）によって精製し、１４ｅを白色固体として得た（４４．５ｍｇ、３２％）。Ｒｆ＝０．２８（１：１ ＥｔＯＡｃ：ヘプタン＋１％ＡｃＯＨ）；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３８Ｈ５１ＣｌＮ２Ｏ５［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝６６７．３、測定値６６７．１；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.07 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 11.97 - 11.90 (m, 1H), 8.19 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 8.04 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.37 - 7.31 (m, 2H), 7.06 - 6.99 (m, 2H), 6.09 - 5.97 (m, 1H), 5.38 (dq, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H), 5.23 (dddq, J = 10.4, 5.9, 4.4, 1.5 Hz, 1H), 4.76 (dt, J = 5.3, 1.6 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.44 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 2.16 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 2.09 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.54 - 1.41 (m, 6H), 1.30 - 1.15 (m, 26H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 174.45, 172.48, 163.56, 157.72, 135.89, 133.26, 130.71, 126.08, 124.88, 122.46, 117.27, 114.02, 113.03, 106.38, 66.40, 63.64, 48.62, 38.20, 35.29, 33.64, 29.02, 29.00, 28.96, 28.94, 28.87, 28.79, 28.70, 28.57, 28.52, 25.25, 24.46.
【化18】
【0115】
Ｎ，Ｎ－ジメチルピリジン－４－アミニウム ５－ブロモ－１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボキシレート（１５）（図１８、スキーム２）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２保護下で、７（３．７１ｇ、１６．０５ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．９８ｇ、８．０３ｍｍｏｌ、０．５ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に懸濁した後、二炭酸ｔｅｒｔブチル（３．８５ｇ、１７．６７ｍｍｏｌ、１．１当量）を一度に加え、得られた混合物を６時間撹拌した。反応物を水で急冷し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏ（３×１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。粗固体をＥｔＯＡｃから再結晶化し、１５をＤＭＡＰ塩として得た（２．５１ｇ、６４％）。ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１４Ｈ１２ＢｒＣｌＮＯ４［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝３７４．０、測定値３７４．２；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.39 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.17 - 8.12 (m, 2H), 8.12 (s, 1H), 6.69 - 6.64 (m, 2H), 2.99 (s, 6H), 1.64 (s, 9H); 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 164.67, 154.56, 147.95, 147.08, 134.34, 132.49, 128.96, 128.19, 125.67, 116.27, 116.24, 113.40, 106.70, 85.79, 27.44.
【化19】
【0116】
１－（ｔｅｒｔ－ブチル） ３－（４－メトキシベンジル） ５－ブロモ－６－クロロ－１Ｈ－インドール－１，３－ジカルボキシレート（１６）（図１８、スキーム２）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、１５（２．５０ｇ、５．０４ｍｍｏｌ、１．０当量）、塩化ｐ－メトキシベンジル（１．０３ｍＬ、７．５６ｍｍｏｌ、１．５当量）および無水Ｋ２ＣＯ３（１．３９ｇ、１０．０８ｍｍｏｌ、２．０当量）を乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）に懸濁した。反応物を５０℃に加熱し、３時間撹拌した。次に、反応物をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）が入った分離器に移した。有機層をＨ２Ｏ（５×１００ｍＬ）およびブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。コンビフラッシュ（ヘプタン中１０％ＥｔＯＡｃで４５分溶出）によって精製し、１６を白色固体として得た（２．４９ｇ、＞９５％）。Ｒｆ＝０．３５； ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２２Ｈ２０ＢｒＣｌＮＯ５［Ｍ－Ｈ］－についてのｍ／ｚ計算値＝４９４．０、測定値４９４．２；1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 8.42 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 2H), 6.96 - 6.86 (m, 2H), 5.33 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 1.67 (s, 9H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 163.49, 159.92, 148.46, 134.92, 133.26, 131.24, 130.41, 130.37, 129.56, 128.18, 127.62, 126.29, 118.13, 117.05, 114.21, 113.95, 111.62, 86.25, 66.38, 55.47, 28.18.
【化20】
【0117】
４－（４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）フェノキシ）ブタン酸メチル（１８）（図１８、スキーム２）
磁気撹拌バーを備えた、火炎乾燥させた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、４－ブロモブタン酸メチル（１．８ｍＬ、１３．６３ｍｍｏｌ、１．２当量）、４－ヒドロキシフェニルボロン酸ピナコールエステル（２．５０ｇ、１１．３６ｍｍｏｌ、１．０当量）および炉で乾燥させたＫ２ＣＯ３（５．６５ｇ、４０．８９ｍｍｏｌ、３．０当量）を乾燥ＤＭＦ（４０ｍＬ）に５０℃で一晩懸濁した。次に、反応混合物に水を加え、水層をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏ（３×１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。コンビフラッシュ（ヘプタン中２０％ＥｔＯＡｃの勾配で５０分溶出）によって精製し、１８を透明な油として得た（３．２１ｇ、８８％）。Ｒｆ＝０．２１（１：４、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン）；1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 7.88 - 7.55 (m, 2H), 6.99 - 6.73 (m, 2H), 4.03 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.68 (s, 3H), 2.53 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.14 - 2.08 (m, 2H), 1.33 (s, 12H); 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 173.77, 161.54, 136.66, 113.97, 83.69, 66.61, 51.77, 30.67, 25.00, 24.74.
【化21】
【0118】
１－（ｔｅｒｔ－ブチル） ３－（４－メトキシベンジル） ６－クロロ－５－（４－（４－メトキシ－４－オキソブトキシ）フェニル）－１Ｈ－インドール－１，３－ジカルボキシレート（１９）（図１８、スキーム２）
磁気撹拌バーを備えた丸底フラスコ中、Ｎ２雰囲気下で、１６（８０４ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）および１８（５００ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）をトルエン（３０ｍＬ）に溶解した。Ｋ２ＣＯ３（１．５１ｇ、１０．９３ｍｍｏｌ、７．０当量）をＨ２Ｏ（１５ｍＬ）に溶解し、この溶液を反応混合物に加え、続いて、反応混合物にＮ２を１０分間バブリングすることによって脱気した。Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２
＊ＣＨ２Ｃｌ２（１２８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、０．１当量）を加え、反応物を３時間還流した。反応混合物を真空濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に再溶解し、セライト（登録商標）パッドで濾過した。濾液をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）が入った分液漏斗に移した。合わせた有機層をＨ２Ｏ（３×１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。コンビフラッシュ（ヘプタン中２０％ＥｔＯＡｃの勾配で５０分溶出）によって精製し、１９を白色固体として得た（９０７ｍｇ、＞９５％）。Ｒｆ＝０．２１（１：４、ＥｔＯＡｃ：ヘプタン）；ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３３Ｈ３６ＣｌＮＯ８［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ＝６０８．２、測定値６０７．６；1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.30 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.45 - 7.33 (m, 4H), 6.98 - 6.92 (m, 2H), 6.90 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.31 (s, 2H), 4.07 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 2.57 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.22 - 2.10 (m, 2H), 1.69 (s, 9H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.83, 163.84, 159.82, 158.42, 148.77, 136.51, 134.90, 132.82, 132.39, 131.12, 130.26, 128.38, 126.67, 123.89, 116.54, 114.15, 114.05, 112.37, 85.84, 66.85, 66.17, 55.45, 51.80, 30.75, 28.22, 24.85.
【化22】
【0119】
４－（４－（１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－６－クロロ－３－（（（４－メトキシベンジル）オキシ）カルボニル）－１Ｈ－インドール－５－イル）フェノキシ）ブタン酸（２０）（図１８、スキーム２）
磁気撹拌バーを備えた丸底フラスコ中、メチルエステル１９（３００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ、１．０当量）をＨ２Ｏ：ＴＨＦ（１：１）混合物に溶解し、ＮａＯＨ（２２ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え、６時間撹拌した。ＵＰＬＣ－ＭＳによって監視して完了したところで、反応物を真空濃縮し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に再溶解し、０．０５Ｎ ＨＣｌ水溶液（１×２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中５０％ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃへの勾配で溶出）により精製し、２０を白色固体として得た（１３９ｍｇ、４７％）。ＵＰＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３２Ｈ３３ＣｌＮＯ８［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｚ計算値＝５９４．２、測定値５９３．６；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.16 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.44 - 7.39 (m, 2H), 7.38 - 7.32 (m, 2H), 7.05 - 7.00 (m, 2H), 6.97 - 6.91 (m, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.05 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.74 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 2.42 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.99 (h, J = 6.9, 6.5 Hz, 2H), 1.65 (s, 9H); 13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 174.07, 162.72, 159.21, 158.08, 147.97, 135.65, 134.14, 132.95, 131.12, 130.62, 130.02, 128.73, 127.98, 126.12, 123.13, 115.91, 114.13, 113.89, 111.14, 86.06, 66.65, 65.61, 55.09, 30.13, 27.45, 24.25.
【化23】
【0120】
グルカゴン類似体；Ｃ末端リジンホモログ（２１）（図１９、スキーム３および４）
樹脂結合ペプチド（配列番号３）を、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。Ｃ末端リジンはＭｔｔ保護基で導入し、継続合成のために直交脱保護を可能にした。ペプチドの一部は切断カクテルＡを用いて切断し、アッセイで対照として使用される。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０～６０％Ｂ）で精製し、凍結乾燥後にグルカゴン類似体２１を白色粉末として得た（１６．６ｍｇ、５．３％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ１９３Ｈ２８８Ｎ５６Ｏ６１Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１１０１．１；測定値１１０１．２。
【化24】
【0121】
修飾グルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート；ＰＥＧ－リンカー：１単位（２２ａ）（図１９、スキーム３）
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。Ｆｍｏｃ－アミノ－ＥＧ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを、マニュアルＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせ、続いて、マニュアルＦｍｏｃ脱保護の標準的な手順を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。最後に、ＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて２０をダブルカップリングした。このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて切断した。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２２を白色粉末として得た（５．１ｍｇ、３．４％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１７Ｈ３１５ＣｌＮ５８Ｏ６７Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２１８．８；測定値１２１８．８。
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。Ｆｍｏｃ－アミノ－ＥＧ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを、マニュアルＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせ、続いて、マニュアルＦｍｏｃ脱保護の標準的な手順を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。最後に、ＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて２０をダブルカップリングした。このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて切断した。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２２を白色粉末として得た（５．１ｍｇ、３．４％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１７Ｈ３１５ＣｌＮ５８Ｏ６７Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２１８．８；測定値１２１８．８。
【0122】
修飾グルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート。ＰＥＧ－リンカー：２単位（２２ｂ）（図１９、スキーム３）
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。Ｆｍｏｃ－アミノ－ＰＥＧ２－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを、マニュアルＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせ、続いて、マニュアルＦｍｏｃ脱保護の標準的な手順を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。最後に、ＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて２０をダブルカップリングした。このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて切断した。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２２を白色粉末として得た（６．９ｍｇ、４．３％）。分析的ＨＰＬＣ純度：９８％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１９Ｈ３１９ＣｌＮ５８Ｏ６８Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２２９．６；測定値１２２９．７。
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。Ｆｍｏｃ－アミノ－ＰＥＧ２－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを、マニュアルＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせ、続いて、マニュアルＦｍｏｃ脱保護の標準的な手順を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。最後に、ＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて２０をダブルカップリングした。このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて切断した。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２２を白色粉末として得た（６．９ｍｇ、４．３％）。分析的ＨＰＬＣ純度：９８％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１９Ｈ３１９ＣｌＮ５８Ｏ６８Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２２９．６；測定値１２２９．７。
【0123】
修飾グルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート。ＰＥＧ－リンカー：３単位（２２ｃ）（図１９、スキーム３）
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。Ｆｍｏｃ－アミノ－ＰＥＧ３－ＣＨ２ＣＯＯＨを、マニュアルＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせ、続いて、マニュアルＦｍｏｃ脱保護の標準的な手順を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。最後に、ＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて２０をダブルカップリングした。このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて切断した。こ分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２２を白色粉末として得た（１．８ｍｇ、１．５％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２２０Ｈ３２０ＣｌＮ５８Ｏ６９Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２３７．１；測定値１２３７．２。
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。Ｆｍｏｃ－アミノ－ＰＥＧ３－ＣＨ２ＣＯＯＨを、マニュアルＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせ、続いて、マニュアルＦｍｏｃ脱保護の標準的な手順を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。最後に、ＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて２０をダブルカップリングした。このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて切断した。こ分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２２を白色粉末として得た（１．８ｍｇ、１．５％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２２０Ｈ３２０ＣｌＮ５８Ｏ６９Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２３７．１；測定値１２３７．２。
【0124】
修飾グルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート。ＰＥＧ－リンカー：４単位（２２ｄ）（図１９、スキーム３）
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ４－ＣＨ２ＣＯＯＨを、マニュアルＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせ、続いて、マニュアルＦｍｏｃ脱保護の標準的な手順を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。最後に、ＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて２０をダブルカップリングした。このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて切断した。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２２を白色粉末として得た（３．７ｍｇ、２．６％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２２２Ｈ３２５ＣｌＮ５８Ｏ７０Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２４８．１；測定値１２４８．２。
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。Ｆｍｏｃ－ＰＥＧ４－ＣＨ２ＣＯＯＨを、マニュアルＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせ、続いて、マニュアルＦｍｏｃ脱保護の標準的な手順を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。最後に、ＨＢＴＵカップリングの一般的な手順を用いて２０をダブルカップリングした。このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて切断した。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２２を白色粉末として得た（３．７ｍｇ、２．６％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２２２Ｈ３２５ＣｌＮ５８Ｏ７０Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２４８．１；測定値１２４８．２。
【0125】
修飾グルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート。Ｃ４リンカー（２３ａ）（図１９、スキーム４）
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ａを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ａを白色粉末として得た（９．１ｍｇ、６．９％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１４Ｈ３０９ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２０４．２；測定値１２０２．０。
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ａを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ａを白色粉末として得た（９．１ｍｇ、６．９％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１４Ｈ３０９ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２０４．２；測定値１２０２．０。
【0126】
修飾グルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート。Ｃ６リンカー（２３ｂ）（図１９、スキーム４）
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ｂを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ｂを白色粉末として得た（２．３ｍｇ、３．１％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１６Ｈ３１３ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２１１．３；測定値１２１１．３。
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ｂを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ｂを白色粉末として得た（２．３ｍｇ、３．１％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１６Ｈ３１３ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２１１．３；測定値１２１１．３。
【0127】
修飾グルカゴンおよびＡＭＰＫ活性化剤コンジュゲート。Ｃ８リンカー（２３ｃ）（図１９、スキーム４）
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ｃを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ｃを白色粉末として得た（４．７ｍｇ、３．０％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１８Ｈ３１３ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２１８．３；測定値１２１８．６。
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ｃを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ｃを白色粉末として得た（４．７ｍｇ、３．０％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２１８Ｈ３１３ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２１８．３；測定値１２１８．６。
【0128】
修飾グルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート。Ｃ１０リンカー（２３ｄ）（図１９、スキーム４）
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ｄを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ｄを白色粉末として得た（４．６ｍｇ、４．０％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２２０Ｈ３２１ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２２５．３；測定値１２２５．４。
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ｄを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ｄを白色粉末として得た（４．６ｍｇ、４．０％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２２０Ｈ３２１ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２２５．３；測定値１２２５．４。
【0129】
修飾グルカゴンとＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲート。Ｃ１８リンカー（２３ｅ）（図１９、スキーム４）
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ｅを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ｅを白色粉末として得た（５．５ｍｇ、３．７％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２２８Ｈ３３７ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２５３．１；測定値１２５３．５。
樹脂結合ペプチド２１（配列番号３）を、４０番のリジンについてはＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）－ＯＨを、また１番のヒスチジンについてはＢｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを使用したこと以外は、自動ペプチド合成の一般的な手順に従って、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋａｍｉｄｅ樹脂（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．０５ｍｍｏｌスケールで合成した。カップリング反応は、アスタリスクで指定したようにダブルカップリングおよびトリプルカップリングとして行った。樹脂上Ｍｍｔ脱保護は、Ｍｍｔ脱保護の一般的な手順を用いて達成した。化合物１４ｅを、ＰｙＢＯＰカップリングの一般的な手順を用いて遊離アミンにカップリングさせた。アリルエステルを、アリル脱保護の一般的な手順を用いて脱保護し、このコンジュゲートを、切断カクテルＡを用いて樹脂コンジュゲートから遊離させた。分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０分で１０－６０％Ｂ）によって精製し、凍結乾燥後にアシル化ＧＬＰ－１ホモログ２３ｅを白色粉末として得た（５．５ｍｇ、３．７％）。分析的ＨＰＬＣ純度：＞９５％（λ＝２１４ｎｍ）。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２２８Ｈ３３７ＣｌＮ５８Ｏ６６Ｓ４＋についての［Ｍ＋４Ｈ］４＋計算値１２５３．１；測定値１２５３．５。
【0130】
実施例４：ＡＭＰＫ活性アッセイにおける修飾グルカゴン（配列番号３）とＡＭＰＫ活性化剤のコンジュゲートの試験
ＡＭＰＫ活性は、１μＭ ＭＫ－８７２２（陽性対照）、１μＭ ＰＦ－０６４０９５７７（陽性対照）、またはＰＦ－０６４０９５７７－グルカゴンコンジュゲート（０～１０００ｎＭ）の存在下、アッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴ）、２００μＭ合成ペプチド基質（ＡＭＡＲＡ）、および１００μＭ［γ－３２Ｐ］－ＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する３５μｌ反応液に添加した５０ｎｇの組換えヘテロ三量体ＡＭＰＫ ａ１ｂ１ｙ１（Ｓｉｇｎａｌｃｈｅｍ Ｐ４７－１１０ＧＨ）を使用することによって評価した。反応は３０℃で行い、３０分後に３５μｌをＰ８１ホスホセルロースペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ）にスポットすることによって終了させた。各サンプルの放射能は、チェレンコフカウンティングによって測定した。
ＡＭＰＫ活性は、１μＭ ＭＫ－８７２２（陽性対照）、１μＭ ＰＦ－０６４０９５７７（陽性対照）、またはＰＦ－０６４０９５７７－グルカゴンコンジュゲート（０～１０００ｎＭ）の存在下、アッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴ）、２００μＭ合成ペプチド基質（ＡＭＡＲＡ）、および１００μＭ［γ－３２Ｐ］－ＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する３５μｌ反応液に添加した５０ｎｇの組換えヘテロ三量体ＡＭＰＫ ａ１ｂ１ｙ１（Ｓｉｇｎａｌｃｈｅｍ Ｐ４７－１１０ＧＨ）を使用することによって評価した。反応は３０℃で行い、３０分後に３５μｌをＰ８１ホスホセルロースペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ）にスポットすることによって終了させた。各サンプルの放射能は、チェレンコフカウンティングによって測定した。
【0131】
実施例５：糖耐性および化合物忍容性試験
糖耐性：マウスを5時間絶食させた後、等張食塩水に溶解した１．７５ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内注射により投与した。注射から０、１５、３０、６０、９０、１２０分後に携帯型グルコメーター（Ｃｏｎｔｏｕｒ ＸＴ、Ｂａｙｅｒ）を用いて尾部の血糖値を測定した。
糖耐性：マウスを5時間絶食させた後、等張食塩水に溶解した１．７５ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内注射により投与した。注射から０、１５、３０、６０、９０、１２０分後に携帯型グルコメーター（Ｃｏｎｔｏｕｒ ＸＴ、Ｂａｙｅｒ）を用いて尾部の血糖値を測定した。
【0132】
化合物忍容性：化合物忍容性は、特に指定がない限り、実験化合物を皮下注射した後、注射から０、１、２、４および２４時間後に携帯型グルコメーター（（Ｃｏｎｔｏｕｒ ＸＴ、Ｂａｙｅｒ）を用いて尾部の血糖値を測定することにより評価した。須２１では、２４時間後にコアゴニストおよびトリアゴニスト化合物の血糖値を測定した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
天然グルカゴンの少なくとも０．１％の活性をグルカゴン受容体において示すペプチドと、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）活性化剤を含んでなるコンジュゲート分子であって、前記ペプチドは、前記ＡＭＰＫ活性化剤に直接またはリンカーを介して共有結合されている、コンジュゲート分子。
【請求項2】
前記ペプチドがグルカゴンスーパーファミリーのものである、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項3】
前記ペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項4】
前記ペプチドが、少なくとも１０個のアミノ酸で６０個以下のアミノ酸からなる、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項5】
前記ＡＭＰＫ活性化剤が、前記ペプチドに切断可能な化学的リンカーを介して共有結合され、前記切断可能な化学的リンカーが、酸切断可能なリンカー、酵素切断可能なリンカー、ペプチド切断可能なリンカー、およびジスルフィド基を含んでなるリンカーから選択される、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項6】
前記化学的リンカーが式Ｒ１－Ｒ３－Ｓ－Ｓ－Ｒ４－Ｒ５－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ２を有し、式中、Ｒ１は前記ペプチドであり、Ｒ２は前記ＡＭＰＫ活性化剤であり、Ｒ３は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ３）２、ＣＨ２－ＣＨ２、またはＣＨ２から選択され、前記ペプチドの側鎖にまたは前記ペプチドの主鎖の炭素原子に結合し、Ｒ４は（ＣＨ２）ｎまたはＣ６Ｈ４であり、Ｒ５は、任意選択であり、存在する場合、Ｃ（ＣＨ３）２、ＣＨ－ＣＨ３、ＣＨ２－ＣＨ２、またはＣＨ２から選択され、ｎは、１、２、３または４である、請求項５に記載のコンジュゲート分子。
【請求項7】
前記ＡＭＰＫ活性化剤が、前記ペプチドに切断不可能なリンカーを介して共有結合され、塩基切断不可能なリンカーは、ポリエチレングリコールリンカー、炭素リンカー、ＳＭＣＣならびにマレイミド、エーテル、アミド、トリアゾール、ジスルフィド、およびチオエーテル共役の化学的性質を有するｍｃから選択される、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項8】
前記ＡＭＰＫ活性化剤が、５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミド１－β－Ｄ－リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）、（３Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（（６－（［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－７－クロロ－３Ｈ－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－オール（ＭＫ－８７２２）、（３Ｒ，３ａＲ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（（６－クロロ－５－（４－（１－（ヒドロキシメチル）シクロプロピル）フェニル）－１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２－イル）オキシ）ヘキサヒドロフロ［３，２－ｂ］フラン－３－オール（ＰＦ－７３９）、６－クロロ－５－［４－（１－ヒドロキシシクロブチル）フェニル］－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸（ＰＦ－０６４０９５７７）、塩酸１，１－ジメチルビグアニド（メトホルミン）、４－ヒドロキシ－３－（２’－ヒドロキシビフェニル－４－イル）－６－オキソ－６，７－ジヒドロチエノ［２，３－ｂ］ピリジン－５－カルボニトリル（Ａ－７６９６６２）、２－クロロ－５－［［５－［［５－（４，５－ジメチル－２－ニトロフェニル）－２－フラニル］メチレン］－４，５－ジヒドロ－４－オキソ－２－チアゾリル］アミノ］安息香酸（ＰＴ－１）、２－［［２－（２－ブロモ－４－メチルフェノキシ）エチル］チオ］－ピリミジン（ＺＬＮ０２４）、２－［［４－（ジエチルアミノ）－２－ヒドロキシフェニル］メチレン］ヒドラジド－４－ピリジンカルボン酸（ＲＳＶＡ－４０５）、およびそれらの類似体から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項9】
療法において使用するための、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項10】
肥満、２型糖尿病、高インスリン血症、インスリン抵抗性、耐糖能異常者、高コレステロール血症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および異脂肪血症の処置において使用するための、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項11】
請求項１に記載のコンジュゲート分子またはその薬学上許容可能な塩および薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項12】
哺乳動物の体重を減少させる方法であって、請求項１に記載のコンジュゲート分子または請求項１１に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、方法。
【請求項13】
請求項１に記載のコンジュゲート分子または請求項１１に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に経口投与することを含んでなる、体重を減少させるための哺乳動物の非治療的処置。
【請求項14】
哺乳動物が非病原性体格指数（ＢＭＩ）を有する、請求項１３に記載の体重を減少させるための哺乳動物の非治療的処置。
【請求項15】
請求項１に記載のコンジュゲート分子または請求項１１に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に経口投与することを含んでなる、血漿コレステロールを減少させるための哺乳動物の非治療的処置。
【国際調査報告】