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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-18
(54)【発明の名称】フィトエン含有オレオレジン及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 8/31 20060101AFI20241010BHJP
A61K 36/062 20060101ALI20241010BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20241010BHJP
A61K 31/015 20060101ALI20241010BHJP
A61K 8/9728 20170101ALI20241010BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20241010BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241010BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20241010BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20241010BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20241010BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20241010BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20241010BHJP
A61Q 5/00 20060101ALI20241010BHJP
【ＦＩ】
A61K8/31
A61K36/062
A61P17/16
A61K31/015
A61K8/9728
A61K9/06
A61K9/08
A61K9/10
A61K9/20
A61K9/48
A61Q19/00
A61Q19/08
A61Q5/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024522633
(86)(22)【出願日】2022-10-16
(85)【翻訳文提出日】2024-06-11
(86)【国際出願番号】 IL2022051092
(87)【国際公開番号】W WO2023062640
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】63/256,588
(32)【優先日】2021-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507137232
【氏名又は名称】ライコード・リミテツド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】オフェル，タル
(72)【発明者】
【氏名】レビー－ニッセンバウム，エトガー
(72)【発明者】
【氏名】サポイニク，マーシャ
(72)【発明者】
【氏名】ブレイバーマン，オレグ
(72)【発明者】
【氏名】ボンダル，イリーナ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C083
4C087
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA06
4C076AA11
4C076AA16
4C076AA22
4C076AA24
4C076AA36
4C076AA49
4C076AA53
4C076AA56
4C076BB01
4C076BB31
4C076CC18
4C083AA031
4C083AA032
4C083AA122
4C083AC011
4C083AC012
4C083AC072
4C083AC172
4C083AC302
4C083AC442
4C083AD092
4C083AD132
4C083AD152
4C083AD412
4C083AD572
4C083CC04
4C083CC05
4C083DD08
4C083DD14
4C083DD15
4C083DD23
4C083DD27
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4C083EE21
4C083FF01
4C087BC05
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4C087CA36
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4C087MA16
4C087MA17
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4C087MA52
4C087MA63
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA89
4C206AA01
4C206AA02
4C206BA02
4C206MA01
4C206MA02
4C206MA04
4C206MA05
4C206MA72
4C206MA83
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZA89
(57)【要約】
本発明は、フィトエンを１０～４０％（ｗ／ｗ）の濃度で含む、ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）から得られる無溶媒非ＧＭＯオレオレジンを提供する。さらに、本発明は、前記オレオレジンを含有する組成物、並びに前記オレオレジンを含有する局所剤形及び経口剤形に関する。様々な皮膚状態の処置及び予防における、並びに皮膚の質を改善するための前記組成物及び剤形の使用も開示され、特許請求される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
フィトエンを１０～４０％（ｗ／ｗ）の濃度で含む、ブラケスレア・トリスポラから得られる、無溶媒非ＧＭＯオレオレジン。
【請求項2】
フィトエン濃度が２０～４０％（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載のオレオレジン。
【請求項3】
フィトエン濃度が２０～３０％（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載のオレオレジン。
【請求項4】
１つ以上のフィトステロールをさらに含む、請求項１に記載のオレオレジン。
【請求項5】
１つ以上のフィトステロールが、エルゴステロールを含む、請求項４に記載のオレオレジン。
【請求項6】
エルゴステロールの濃度が０．５～１％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項５に記載のオレオレジン。
【請求項7】
エルゴステロールの濃度が約０．６％（ｗ／ｗ）である、請求項６に記載のオレオレジン。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のオレオレジンと、シモンドシア・シネンシス（ホホバ）種子油と、を含む、組成物。
【請求項9】
フィトエンの濃度が０．０１％～１０％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
フィトエンの濃度が１～２％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
請求項８～１０のいずれか一項に記載の組成物と、１つ以上の製薬に許容される、栄養補助食品的に許容される、又は化粧料的に許容される賦形剤と、を含む、剤形。
【請求項12】
局所投与に適している、請求項１１に記載の剤形。
【請求項13】
クリーム、ローション、軟膏、ゲル、フォーム、膏薬、懸濁液、油又は溶液からなる群から選択される、請求項１２に記載の剤形。
【請求項14】
前記剤形におけるフィトエンの濃度が０．０１～０．５％（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１２に記載の剤形。
【請求項15】
経口投与に適している、請求項１１に記載の剤形。
【請求項16】
錠剤、カプレット、カプセル、シロップ、油、ソフトゲルカプセル、トローチ錠、チュアブル錠、懸濁液又は溶液からなる群から選択される、請求項１５に記載の剤形。
【請求項17】
大気汚染物質に曝露された対象の皮膚を保護する方法であって、フィトエンを含む組成物を、そのような保護を必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項18】
ＵＶ放射線に曝露された対象の皮膚を保護する方法であって、フィトエンを含む組成物を、そのような保護を必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項19】
皮膚の質の１つ以上の態様を改善する方法であって、フィトエンを含む組成物を、そのような保護を必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項20】
皮膚の質の１つ以上の態様の改善が、皮膚の色調の均一化及び平均化、しわの減少、弾力性の向上、自然な皮膚バリア機能の保護、並びに皮膚の外観の改善からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
フィトエンを含む組成物が、請求項６～８のいずれか一項に記載の組成物である、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
フィトエンを含む組成物が、局所適用によって対象に投与される、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
組成物が、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の局所剤形として製剤される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
フィトエンを含む組成物が対象に経口投与される、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
組成物が、請求項１５又は１６に記載の経口剤形として製剤される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
フィトエンを２０～３０％（ｗ／ｗ）の濃度で含む、ブラケスレア・トリスポラから得られる無溶媒非ＧＭＯオレオレジンであって、ａ）カビ種ブラケスレア・トリスポラのｐｈｙｔ １＋／ｐｈｙｔ １－株を培養するステップと；
ｂ）前記培養ブラケスレア・トリスポラからバイオマスを得るステップと；
ｃ）３００～４５０バールの間の操作圧力及び約５０℃～６５℃の操作温度で実施される超臨界二酸化炭素流体抽出に前記バイオマスを供し、これにより２０～３０％（ｗ／ｗ）の濃度のフィトエンと、エルゴステロールと、を含むオレオレジンを得るステップと；
を含む方法によって得られる、無溶媒非ＧＭＯオレオレジン。
【請求項27】
エルゴステロールの濃度が約０．６％（ｗ／ｗ）である、請求項２６に従って得られるオレオレジン。
【請求項28】
請求項１に記載のオレオレジンと、１つ以上の製薬的に許容される、栄養補助食品的に許容される、又は化粧料的に許容される賦形剤と、を含む、剤形。
【請求項29】
経口投与に適している、請求項２８に記載の剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高濃度のフィトエンを含むオレオレジン、及び前記フィトエンをホホバ油と一緒に含む組成物に関する。本発明はまた、空気汚染又はＵＶ放射線への曝露によって引き起こされる皮膚病変の予防及び管理における前記フィトエン含有組成物の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
フィトエンは、果実の多くの異なる種に見られる、主として無色のカロテノイドである。他の生物活性カロテノイドの生合成における重要な中間体として作用するだけでなく、フィトエン自体は、抗炎症活性、抗酸化活性、及びＵＶ吸収活性を含むいくつかの生物学的特性を有する。これらの特性は、色の欠如と相まって、様々な皮膚状態の処置又は予防に使用するための、フィトエンを含む局所調製物及び化粧料調製物の開発につながった。皮膚の色を明るくする、又は美白するために使用され得るそのような調製物の一例は、ＵＳ８，３９８，９５８に記載されている。
【0003】
フィトエンは、様々な果実種（例えば、トマト）、藻類（例えば、ドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種）及びカビを含むいくつかの異なる供給源から得ることができ、その最も注目すべきものはブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）である。
【0004】
ブラケスレア・トリスポラ（Ｂ．ｔｒｉｓｐｏｒａ）は熱帯植物の病原体であるが、動物及びヒトには無害である。この種は、リコペン、β－カロテン、フィトエン及びフィトフルエンなどの重要なカロテノイドを産生することが見出されているので、カロテノイド合成経路を研究するために広く使用されている。さらに、株選択及び増殖条件によって、ウクライナ特許ＵＡ８５４８９に記載されているように、ブラケスレア・トリスポラから多量のフィトエンを産生することが可能であることが分かった。さらに、ＵＡ８６５５６は、ＵＡ８５４８９に記載の株のインキュベーション後にフィトエン含有バイオマスを得る方法を開示している。
【0005】
近年、疾患を引き起こす際の浮遊汚染の役割がますます懸念されている。心臓及び呼吸器の健康に対する大気汚染物質の影響は長い間知られているが、皮膚がしばしばこのような汚染物質によって標的化され、悪影響を受けることが明らかになってきている。したがって、浮遊汚染の増加と、ヒトにおけるざ瘡、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹及び他の皮膚状態の新たな症例の数との間の明確な相関関係が見出された。さらに、浮遊汚染はまた、加速された又は早期の皮膚老化の増悪因子であると考えられる。最後に、空気汚染を様々な皮膚がんの発生率及び／又は重症度に結び付ける知識体系が増大している。
【0006】
浮遊汚染は多くの異なる供給源に由来し得るが、自動車の排気に含有される汚染物質は、そのような汚染への世界人口の非常に大きな割合の日常的な曝露を考慮すると、特に重要である。特に懸念されるのは、ディーゼルエンジンによって排出される排気に含有される汚染物質である。
【0007】
ディーゼル排気は非常に多数の化合物を含有し、その多くは重大な健康リスクに関連している。気相に溶解された化合物によって引き起こされる悪影響に加えて、ディーゼル排気はまた、かなりの濃度のディーゼル排気微粒子（ｄｉｅｓｅｌ ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｍａｔｔｅｒ）（ＤＰＭ）を含む。様々な異なるサイズ範囲で存在するこれらの粒子は、肺がん及び他の重篤な肺疾患に関して特に懸念される。しかしながら、最近の研究はまた、皮膚細胞のＤＰＭへの曝露と、様々な皮膚状態（上記のものなど）との間の直接的な関連を示している。さらに、皮膚細胞に対する浮遊粒子状物質（ＤＰＭを含む）の影響を説明するいくつかの研究が発表されている。そのような一例は、Ｒｙｕ ｅｔ ａｌ．［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５１：１０８；２０１９］による研究であり、その中で著者らは、浮遊粒子状物質への曝露によって引き起こされるケラチノサイト老化の根底にある生化学的変化を記載している。他の研究では、培養細胞をＤＰＭに曝露した場合の、ＩＬ－８を含むサイトカイン及びインターロイキンのレベルの増加も記載されている。したがって、例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）［Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ １１９（３）：３３２－３３６］は、上皮細胞がＤＰＭに曝露された場合に見られるＩＬ－８分泌の増加の根底にある生化学的経路を記載している。
【0008】
大気汚染物質、特にディーゼル排気中に見られる汚染物質への曝露によって引き起こされる、又はそれに関連する皮膚状態、並びに日光曝露に関連する皮膚状態を予防、緩和又は処置するために使用され得る安全な天然由来組成物が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】米国特許第８，３９８，９５８号明細書
【特許文献2】ウクライナ国特許第８５４８９号明細書
【特許文献3】ウクライナ国特許第８６５５６号明細書
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｒｙｕ ｅｔ ａｌ．［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５１：１０８；２０１９］
【非特許文献2】Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）［Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ １１９（３）：３３２－３３６］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明の一態様では、本発明者らは、以前に得られた濃度よりもはるかに高い（例えば、２０～３０倍高い）濃度でフィトエンを含む、カビ種ブラケスレア・トリスポラから得られた無溶媒非ＧＭＯオレオレジンを製造することが可能であることを発見した。さらに、予想外にも、前記組成物が得られるバイオマスと比較した場合、本開示のオレオレジンにおいてフィトステロールであるエルゴステロールの選択的濃縮があることが見出された。このフィトエン濃縮オレオレジンは、特定の実施形態では、本明細書中下記でより詳細に開示及び記載される組成物及び剤形の調製のための出発材料として使用される。
【0012】
さらなる態様では、本発明者らは、フィトエンと組み合わせてシモンドシア・シネンシス（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（ホホバ）種子油を含む組成物が、大気汚染物質（ディーゼル排気微粒子（ＤＰＭ）など）及びＵＶ放射線によって引き起こされる損傷から皮膚を保護する際の使用、並びに皮膚の質の維持及び改善のために特に有利であることを見出した。
【0013】
したがって、本発明は、主に、フィトエンを１０～４０％（ｗ／ｗ）の濃度で含む、ブラケスレア・トリスポラから得られる無溶媒非ＧＭＯオレオレジンに関する。
【課題を解決するための手段】
【0014】
好ましい一実施形態では、オレオレジン中のフィトエンの濃度は、２０～４０％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【0015】
別の好ましい実施形態では、オレオレジン中のフィトエンの濃度は、２０～３０％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【0016】
多くの場合、上記で開示されたオレオレジンは、１つ以上のフィトステロールを含むと思われる。オレオレジン中に存在する主要なフィトステロールの１つはエルゴステロールであり、これは一般に約０．５～１％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度で存在する。好ましい一実施形態では、エルゴステロール濃度は約０．６％（ｗ／ｗ）である。
【0017】
「約」という用語は、記載された値から最大＋／－０．５％異なる濃度が記載された濃度値又は範囲によって定義された範囲内に含まれることを示すために、本開示全体を通して（濃度パーセンテージ値に関して）使用されることに留意されたい。
【0018】
別の態様では、本発明は、フィトエンを２０～３０％（ｗ／ｗ）の濃度で含む、ブラケスレア・トリスポラから得られる無溶媒非ＧＭＯオレオレジンであって、
ａ）カビ種ブラケスレア・トリスポラ（を培養するステップと；
ｂ）前記培養ブラケスレア・トリスポラからバイオマスを得るステップと；
ｃ）３００～４５０バールの間の操作圧力及び約５０℃～６５℃の操作温度で実施される超臨界二酸化炭素流体抽出に前記バイオマスを供し、それによりフィトエン含有オレオレジンを得るステップと、
を含む方法によって得られる、又は得ることができる、無溶媒非ＧＭＯオレオレジンに関する。
ａ）カビ種ブラケスレア・トリスポラ（を培養するステップと；
ｂ）前記培養ブラケスレア・トリスポラからバイオマスを得るステップと；
ｃ）３００～４５０バールの間の操作圧力及び約５０℃～６５℃の操作温度で実施される超臨界二酸化炭素流体抽出に前記バイオマスを供し、それによりフィトエン含有オレオレジンを得るステップと、
を含む方法によって得られる、又は得ることができる、無溶媒非ＧＭＯオレオレジンに関する。
【0019】
好ましくは、上に開示された方法の工程（ａ）で培養されるブラケスレア・トリスポラカビは、ｐｈｙｔ １＋／ｐｈｙｔ １－株である。
【0020】
一般に、この方法によって得られるオレオレジンは、２０～３０％（ｗ／ｗ）の濃度のフィトエン及び１つ以上のフィトステロールを含む。大部分の実施形態において、１つ以上のフィトステロールは、エルゴステロールを主成分として含む。オレオレジン中のエルゴステロールの濃度は、概して０．５～１％（ｗ／ｗ）の範囲である。好ましい一実施形態では、オレオレジン中のエルゴステロール濃度は約０．６％（ｗ／ｗ）である。
【0021】
さらなる態様では、本発明は、本明細書中上記で開示されるようなフィトエン含有オレオレジンと共に、シモンドシア・シネンシス（ホホバ）から得られた種子油を含む組成物に関する。好ましい一実施形態では、前記組成物中のフィトエンの濃度は、０．０１～１０％（ｗ／ｗ）の範囲である。特に好ましい実施形態では、フィトエン濃度は１～２％（ｗ／ｗ）の範囲、より好ましくは１～１．５％（ｗ／ｗ）の範囲である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物中のフィトエンの濃度は、約１％（ｗ／ｗ）である。
【0022】
なおさらなる態様では、本発明は、上記で開示されたフィトエン含有組成物と共に、１つ以上の製薬的に許容される、栄養補助食品的に許容される、又は化粧料的に許容される賦形剤を含む剤形に関する。
【0023】
別の態様では、本発明は、上記で開示されたフィトエン含有オレオレジンと共に、１つ以上の製薬的に許容される、栄養補助食品的に許容される、又は化粧料的に許容される賦形剤を含む剤形に関する。
【0024】
前記剤形（経口剤形及び局所剤形の両方）に関するさらなる詳細を本明細書中下記に提供する。
【0025】
本発明はまた、皮膚の質を改善若しくは維持する方法及び／又は皮膚形態の環境損傷（例えば、大気汚染物質又はＵＶ放射線に起因するもの）を保護する方法も包含し、前記方法は、それを必要とする対象への上記に開示された組成物又は剤形の投与を含む。好ましい一実施形態では、対象はヒト対象である。これらの方法に関するさらなる詳細を本明細書中下記に提供する。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
本明細書中上記で説明したように、一態様では、本発明は、フィトエンを１０～４０％（ｗ／ｗ）の濃度で含む、カビ種ブラケスレア・トリスポラから得られる無溶媒非ＧＭＯオレオレジンに関する。いくつかの好ましい実施形態では、オレオレジンのフィトエン濃度は、２０～３０％（ｗ／ｗ）の範囲である。好ましい一実施形態では、オレオレジン中のフィトエン濃度は約２０％（ｗ／ｗ）である。
【0028】
「オレオレジン」という用語は、一般に、精油及び／又は脂肪油並びに他の、主に疎水性の化合物を含む半固体（又は粘性液体）抽出物を指すと理解されることに留意されたい。歴史的に、そのようなオレオレジンは、専ら生体物質（例えば、植物材料又は微生物の発酵後に得られるバイオマス）の溶媒抽出及びその後の前記溶媒の除去によって得られてきた。しかしながら、完全に無溶媒組成物に関する本発明の文脈において、オレオレジンは、超臨界流体抽出、好ましくは超臨界二酸化炭素抽出によって得られる。さらに、本明細書中上記のように、オレオレジンは「非ＧＭＯ」オレオレジンであり、すなわち遺伝子改変生物から得られたものではない。
【0029】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、オレオレジンは、追加の生物学的に活性な化合物、特にフィトステロールをさらに含む。場合によっては、オレオレジンの主要なフィトステロール成分はエルゴステロールである。
【0030】
本明細書中上記で説明したように、フィトエンに富むバイオマスは、ＵＡ８５４８９及びＵＡ８６５５６の教示に従ってブラケスレア・トリスポラ株から得られる。この方法は、図１に提供されるフローチャートに要約されている。
【0031】
次いで、バイオマス（通常、５～７％（ｗ／ｗ）のフィトエン及び約４０％～５０％の油を含有する）を、３００～４５０バールの間の操作圧力で実施される超臨界二酸化炭素流体抽出に供する。抽出は、約５０℃～６５℃の温度で実施された。この抽出の後、概して２０～３０％（ｗ／ｗ）の濃度のフィトエン及び約０．６％（ｗ／ｗ）の濃度のフィトステロールの混合物（その中でエルゴステロールが主成分である）を含有する（本明細書中上記のような）オレオレジンを得た。この方法の概要を図２に表すフロー図に示す。
【0032】
本明細書中上記のように、本発明はまた、フィトエン及びフィトステロールを含む組成物を提供する。好ましい一実施形態では、前記組成物は、１％（ｗ／ｗ）のフィトエン及び０．０２％（ｗ／ｗ）のフィトステロールを含む。別の好ましい実施形態では、前記組成物は、０．１％（ｗ／ｗ）のフィトエン及び０．００２％のフィトステロールを含む。
【0033】
上に開示された方法の一実施形態では、投与された組成物中に存在するフィトエンは、１５－シス－フィトエンを含む。いくつかの実施形態では、前記組成物中のフィトエンの５０％（ｗ／ｗ）超が、１５－シス－フィトエンである。他の実施形態では、フィトエンの９０％（ｗ／ｗ）超が、１５－シス－フィトエンである。
【0034】
上記のように、本発明は、上記で開示されたフィトエン含有組成物と共に、１つ以上の製薬的に許容される、栄養補助食品的に許容される、又は化粧料的に許容される賦形剤を含む剤形をその範囲内に含む。前記剤形は、本明細書中下記でより詳細に記載されるように、局所投与又は経口投与のいずれかのために製剤され得る。
【0035】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示され、記載されるフィトエン含有オレオレジンと共に、１つ以上の製薬的に許容される、栄養補助食品的に許容される、又は化粧料的に許容される賦形剤を含む剤形を提供する。そのような剤形は、局所投与に適しているように調製され得る。しかしながら、好ましい一実施形態では、このタイプの剤形は経口投与に適している。
【0036】
好ましい一実施形態では、剤形は局所投与（すなわち、対象の皮膚又は粘膜への適用のために）に適している。例えば、前記組成物は、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、フォーム、膏薬、懸濁液、油又は溶液として製剤され得る。代替的又は追加的に、組成物は、皮膚若しくは粘膜表面上に配置される、又は皮膚若しくは粘膜表面上に接着されるのに適したパッド又は他の送達装置に吸着されてもよい。
【0037】
いくつかの実施形態では、局所剤形は、水中油型又は油中水型エマルジョンなどのエマルジョンとして製剤され得る。他の場合には、疎水性フィトエンを、植物油（例えば、オリーブ油、ヒマワリ油、トマト油、ホホバ油など）、流動パラフィン又は他の従来の親油性希釈剤（例えば、スクアレン）などの天然起源の生体適合性希釈剤で希釈してもよい。
【0038】
いくつかの好ましい実施形態では、局所剤形中のフィトエンの濃度は、０．０１～０．５％（ｗ／ｗ）の範囲である。いくつかの好ましい実施形態では、フィトエン濃度は０．１％である。他の好ましい実施形態では、フィトエン濃度は０．０２％（ｗ／ｗ）である。
【0039】
別の実施形態では、本発明の剤形は、本明細書中上記で開示されるように、経口投与に適した剤形である。好ましくは、そのような経口剤形は、錠剤、カプレット、カプセル、トローチ錠、チュアブル錠、懸濁液、シロップ、油又は溶液からなる群から選択される。
【0040】
いくつかの実施形態では、経口組成物は、ソフトゲルカプセルの形態である。いくつかの実施形態では、経口組成物は、飲料、ショット、グミ又は粉末の形態である。いくつかの実施形態では、経口組成物は、チョコレート、アイスクリームなどの食料品中に混合又は同化される。
【0041】
このような単位剤形は、組成物の安全かつ有効な量を含む。経口投与のための単位剤形の調製物に適した製薬的に許容される担体は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、錠剤は、典型的には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、ラクトース及びセルロースなどの不活性希釈剤；デンプン、ゼラチン及びスクロースなどの結合剤（ｈｉｎｄｅｒｓ）；デンプン、アルギン酸及びクロスカルメロースなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及びタルクなどの滑沢剤として従来の製薬的に適合性のアジュバントを含む。一実施形態では、二酸化ケイ素などの流動促進剤を使用して、粉末混合物の流動特性を改善することができる。一実施形態では、ＦＤ＆Ｃ染料などの着色剤を外観のために添加することができる。甘味料及び香味剤、例えばアスパルテーム、サッカリン、メントール、ペパーミント及びフルーツフレーバーは、チュアブル錠のための有用なアジュバントである。カプセルは、典型的には、１つ以上の固体希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、担体成分の選択は、味、コスト及び保存安定性などの二次的な考慮事項に依存し、これらは本発明の目的にとって重要ではなく、当業者によって容易に行うことができる。
【0042】
一実施形態では、経口剤形は、所定の放出プロファイルを含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、持続放出性の錠剤、カプセル、トローチ錠又はチュアブル錠を含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、遅延放出性の錠剤、カプセル、トローチ錠又はチュアブル錠を含む。一実施形態では、本発明の経口剤形は、即時放出性の錠剤、カプセル、トローチ錠又はチュアブル錠を含む。一実施形態では、経口剤形は、当業者に公知の医薬活性成分の所望の放出プロファイルに従って製剤される。
【0043】
上記のように、本発明の組成物中に存在するフィトエン及び他の任意選択の活性成分に加えて、本明細書で提供される剤形は、概して、１つ以上の賦形剤をさらに含む。これらには、例えば、増粘剤、湿潤剤、安定剤、着色剤、希釈剤、増量剤、制御放出ポリマーなどが含まれ得る。
【0044】
本発明の組成物を製剤するために使用され得る様々な剤形タイプは、この分野の当業者に周知であり、さらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ，ＵＳＡ，２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００６）などの標準的な参考文献において入手可能である。
【0045】
本明細書中上記で説明したように、本発明はまた、皮膚の質を改善若しくは維持する方法及び／又は皮膚形態を環境損傷（例えば、大気汚染物質又はＵＶ放射線に起因するもの）から保護する方法も包含し、前記方法は、それを必要とする対象への上記に開示された組成物又は剤形の投与を含む。
【0046】
したがって、一実施形態では、本発明は、大気汚染物質に曝露された対象の皮膚を保護する方法であって、フィトエンを含む組成物を、そのような保護を必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。典型的には、この実施形態では、本発明の組成物又は前記組成物を含有する剤形は、予防措置として、又はディーゼル排気微粒子（ＤＰＭ）若しくは他の浮遊汚染物への曝露によって引き起こされる既存の病変を緩和若しくは処置するために、対象の皮膚に局所投与され得る。組成物は、例えば、対象がそのような汚染物質が存在する環境で時間を費やしていることを知っている場合、新たな汚染物質関連皮膚病変の発生を防ぐために短期間（例えば、数日間又は数週間）投与することができる。あるいは、組成物は、より長期間（例えば、数週間～数ヶ月）投与することができる。組成物がクリーム、ゲル、軟膏又は他の比較的粘性のある剤形として製剤される場合、少量（例えば、約０．５～約１０ｃｍのクリーム）が対象の皮膚表面の標的部位に擦り込まれる。そのような処置の頻度は、製剤中のフィトエン及び／又は他の活性成分の正確な濃度、対象の年齢、及び／又は前記製剤を投与する理由（例えば、新しい病変の予防、早期皮膚老化の予防、又は既存の病変の処置のために）に応じて、１週間に１回～１日に３回以上であり得る。
【0047】
この方法の他の実施形態では、本方法の組成物は、それを必要とする対象に経口投与することができる。
【0048】
「大気汚染物質に曝露された対象の皮膚を保護する」という語句は、対象の皮膚の疾患、障害及び早期老化の予防、緩和又は処置の１つ以上を指すと理解されるべきであることに留意されたい。これらの疾患及び障害は、大気汚染物質によって引き起こされる又は悪化する任意の皮膚状態であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、前記疾患及び障害は、ざ瘡、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、皮膚がん及び早期皮膚老化からなる群から選択される。
【0049】
本発明はまた、大気汚染物質への曝露によって引き起こされる又はそれに関連する皮膚状態を予防、緩和又は処置する方法であって、本発明の組成物又は剤形をヒト（又は非ヒト哺乳動物）対象に投与することを含む、方法に関する。
【0050】
一実施形態では、上述の皮膚状態は、サイトカインＩＬ－１α、ＩＬ－８及び／又はＩＬ－６によって少なくとも部分的に媒介される炎症状態である。
【0051】
上記で開示された２つの方法の文脈で使用される「大気汚染物質」という用語は、屋内又は屋外いずれかの空気中に存在し得るすべてのタイプの有害な化合物、物質及び薬剤を含むと理解されるべきである。前記有害な化合物、物質及び薬剤は、空気中に分散若しくは溶解されていることもあり、又は液滴、エアロゾルとして若しくは固体粒子状物質として存在していることもある。後者の場合、粒子状物質は、その表面に吸着された追加の液体又は気体成分を有し得る。
【0052】
本発明の一実施形態では、上記で開示される方法は、特に、自動車、特にディーゼルエンジンによって動力供給されるような車両の排気中に放出される大気汚染物質に関する。一実施形態では、上記で開示される方法は、特にディーゼル排気中に存在する粒子状物質（すなわち、ＤＰＭ）に関する。本開示の方法のさらに他の実施形態では、大気汚染物質は、他の形態の輸送（例えば、航空機及びディーゼル列車エンジン）又は産業プラント及び工場から放出される。
【0053】
任意の適切なフィトエン含有組成物を使用して本発明の上記開示の方法を実施してもよいが、好ましい一実施形態では、前記組成物は、天然起源の無溶媒非ＧＭＯフィトエンを含む。
【0054】
別の実施形態では、本発明は、ＵＶ放射線に曝露された対象の皮膚を保護する方法であって、フィトエンを含む組成物を、そのような保護を必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。「ＵＶ放射線」という用語は、すべての周波数のＵＶ放射線、特にＵＶＡ及びＵＶＢ範囲の放射線など、ヒト対象の皮膚が曝露される太陽光に存在する放射線を指す。
【0055】
なおさらなる実施形態では、本発明は、皮膚の質の１つ以上の態様を改善する方法であって、フィトエンを含む組成物を、そのような保護を必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。皮膚の質の多くの異なる態様が、この方法によって改善され得る。しかしながら、好ましい一実施形態では、皮膚の質の前記態様は、皮膚の色調の均一化（ｅｖｅｎｉｎｇ）及び平均化、しわの減少、弾力性の向上、自然な皮膚バリア機能の保護、及び皮膚の外観の改善からなる群から選択される。
【0056】
別の態様において、本発明は、医薬品として使用するための、本明細書中上記で開示される組成物を提供する。好ましい一実施形態では、前記医薬品は、大気汚染物質に曝露された対象の皮膚を保護するのに使用するためのものである。別の実施形態では、前記医薬品は、ＵＶ放射線に曝露された対象の皮膚を保護するのに使用するためのものである。なおさらなる実施形態では、前記医薬品は、皮膚の質の１つ以上の態様を改善するのに使用するためのものであって、前記改善は、好ましくは、皮膚の色調の均一化及び平均化、しわの減少、弾力性の向上、自然な皮膚バリア機能の保護、及び皮膚の外観の改善からなる群から選択される。
【0057】
上記に開示される方法及び使用のいくつかの好ましい実施形態では、フィトエンを含む組成物は、本明細書中上記で定義され、本明細書中下記で特許請求される組成物である。これらの方法及び使用のいくつかの実施形態では、フィトエンを含む組成物は、対象の皮膚及び／又は粘膜への局所適用によって投与される。他の実施形態では、フィトエンを含む組成物は、経口経路によって対象に投与され、好ましくは経口剤形として、例えば本明細書中上記で定義された経口剤形の１つとして製剤される。
【0058】
本明細書中上記で開示されるように、上記で開示される方法において使用される組成物は、カビ種、ブラケスレア・トリスポラから得られるフィトエンを含む。特に好ましい一実施形態では、前記ブラケスレア・トリスポラは、ｐｈｙｔ １＋／ｐｈｙｔ １－株、例えば、ＵＡ８５４８９に開示されている株であり、寄託番号Ｆ－１０００５３でウクライナのＮＡＳである微生物学及びウイルス学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）（ＤＫ Ｚａｂｏｌｏｔｎｙにちなんで命名）の寄託機関に寄託されている。
【0059】
好ましくは、上記で開示される方法で使用される組成物に含有されるフィトエンは、ＵＡ８６５５６の教示に従って製造されたバイオマスから得られる。この方法のさらなる詳細を本明細書中下記に提供する。ＵＡ８５４８９及びＵＡ８６５５６の両方の教示は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【0060】
好ましい一実施形態では、上記に開示された方法で投与される組成物は、フィトエンを０．０１％（ｗ／ｗ）～１０％（ｗ／ｗ）の濃度で含む。より好ましい一実施形態では、組成物中のフィトエンの濃度は、０．１～２．５％（ｗ／ｗ）の範囲である。さらに好ましい一実施形態では、組成物中のフィトエン濃度は約０．１％（ｗ／ｗ）である。なおさらに好ましい実施形態では、フィトエン濃度は約１％（ｗ／ｗ）である。
【0061】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、投与される組成物は、１つ以上のフィトステロールをさらに含む。一実施形態では、前記１つ以上のフィトステロールはエルゴステロールを含む。
【0062】
本発明はさらに、医薬品又は化粧料又は栄養補助食品の製造における、本明細書で定義される非ＧＭＯ無溶媒フィトエン含有組成物の使用を包含する。
【0063】
一実施形態では、本発明は、大気汚染物質に曝露された対象の皮膚を保護するための医薬品又は化粧料又は栄養補助食品の製造における、本明細書で定義される非ＧＭＯ無溶媒フィトエン含有組成物の使用に関する。
【0064】
別の実施形態では、本発明は、大気汚染物質葉の曝露によって引き起こされる、又はそれ関連する皮膚の状態を予防する、緩和する又は処置するための、医薬品又は化粧料又は栄養補助食品の製造における、本明細書で定義される非ＧＭＯ無溶媒フィトエン含有組成物の使用に関する。
【0065】
一実施形態では、本発明は、ＵＶ放射線に曝露された対象の皮膚を保護するための医薬品又は化粧料又は栄養補助食品の製造における、本明細書で定義される非ＧＭＯ無溶媒フィトエン含有組成物の使用に関する。
【0066】
一実施形態では、本発明は、皮膚の質の１つ以上の態様を改善するための医薬品又は化粧料又は栄養補助食品の製造における、本明細書で定義される非ＧＭＯ無溶媒フィトエン含有組成物の使用に関する。好ましい一実施形態では、前記改善は、皮膚の色調の均一化及び平均化、しわの減少、弾力性の向上、自然な皮膚バリア機能の保護、及び皮膚の外観の改善からなる群から選択される。
【0067】
上記で開示された方法に関連して説明された様々な技術的特徴のすべては、本明細書に開示された異なる使用態様に等しく適用される。
【実施例】
【0068】
ここで、本特許請求される発明の様々な特徴を、以下の非限定的な実施例に例示する。
［実施例１］
本発明の組成物による、培養細胞におけるＤＰＭ誘導性ＩＬ－８産生の阻害
序論：
この研究の目的は、フィトエンが、培養ケラチノサイトにおける炎症促進性サイトカインＩｌ－８の産生のＤＰＭ誘導性増加を阻害できるかどうかを調べることであった。このインビトロシステムは、大気汚染物質への曝露後に皮膚病変を発症し、皮膚老化を加速する、対象において観察される皮膚細胞における炎症反応のモデルとして機能する。
［実施例１］
本発明の組成物による、培養細胞におけるＤＰＭ誘導性ＩＬ－８産生の阻害
序論：
この研究の目的は、フィトエンが、培養ケラチノサイトにおける炎症促進性サイトカインＩｌ－８の産生のＤＰＭ誘導性増加を阻害できるかどうかを調べることであった。このインビトロシステムは、大気汚染物質への曝露後に皮膚病変を発症し、皮膚老化を加速する、対象において観察される皮膚細胞における炎症反応のモデルとして機能する。
【0069】
方法：
ＨａＣａＴ株の自然形質転換された成体ヒトケラチノサイトを増殖させ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン及び１０％ ＦＢＳを補充した濾過ＤＭＥＭ中で維持した。細胞のアリコート（約２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度）を、１７０μｌ／ウェルの前述の培地を含有する９６ウェルプレートに播種した。各播種ウェルは約４２，５００個の細胞を含有していた。次いで、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２において２４時間インキュベートした。この後、培地を吸引し、最終フィトエン濃度５６ｐｐｍを含有する本発明の１％（ｗ／ｗ）フィトエン含有組成物の希釈物（「試験」）、又は以下の３つの対照と交換した：
－ビヒクル対照（「対照」、図３）
－ＤＰＭ刺激対照（「ＤＰＭ」）
－陽性対照：デキサメタゾン（「ＤＥＸ」）
ＨａＣａＴ株の自然形質転換された成体ヒトケラチノサイトを増殖させ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン及び１０％ ＦＢＳを補充した濾過ＤＭＥＭ中で維持した。細胞のアリコート（約２．５×１０５細胞／ｍｌの濃度）を、１７０μｌ／ウェルの前述の培地を含有する９６ウェルプレートに播種した。各播種ウェルは約４２，５００個の細胞を含有していた。次いで、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２において２４時間インキュベートした。この後、培地を吸引し、最終フィトエン濃度５６ｐｐｍを含有する本発明の１％（ｗ／ｗ）フィトエン含有組成物の希釈物（「試験」）、又は以下の３つの対照と交換した：
－ビヒクル対照（「対照」、図３）
－ＤＰＭ刺激対照（「ＤＰＭ」）
－陽性対照：デキサメタゾン（「ＤＥＸ」）
【0070】
ＤＰＭ、ＤＥＸ及び試験溶液を調製するためのビヒクルは、１００μｇ／ｍｌのディーゼル排気微粒子（ＤＰＭ）を含有するＰＢＳであった。すべての試験品目及び対照を３連でプレーティングした。
【0071】
次いで、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２においてさらに２４時間インキュベートした。このインキュベーション期間の終わりに、培地を吸引し、２５０×ｇで５分間遠心分離して粒子状物質を除去した。次いで、ＩＬ－８分析を行うことができるまで、透明な上清を－７０Ｃで凍結した。
【0072】
定量的ＩＬ－８分析を、市販のＥＬＩＳＡキット（ヒトＩＬ－８用ＥＬＩＳＡ Ｍａｘ Ｄｅｌｕｘｅセット、Ｅｎｃｏから供給、カタログ番号Ｂ２８７５４９）を使用して行った。
【0073】
結果：
この研究の結果を図３に示すが、これは、ＤＰＭ単独での処置が、ビヒクルのみの対照（陰性対照）と比較して、ＩＬ－８産生のおよそ２倍の増加を引き起こすことを示している。デキサメタゾン陽性対照は、非刺激細胞の基礎レベルのＩＬ－８産生に有意な変化を引き起こさない。しかしながら、本発明の組成物（「試験」）は、ＤＰＭのみの群と比較した場合、ＤＰＭ刺激ＩＬ－８産生の顕著かつ統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）阻害を引き起こしたことが分かる。
この研究の結果を図３に示すが、これは、ＤＰＭ単独での処置が、ビヒクルのみの対照（陰性対照）と比較して、ＩＬ－８産生のおよそ２倍の増加を引き起こすことを示している。デキサメタゾン陽性対照は、非刺激細胞の基礎レベルのＩＬ－８産生に有意な変化を引き起こさない。しかしながら、本発明の組成物（「試験」）は、ＤＰＭのみの群と比較した場合、ＤＰＭ刺激ＩＬ－８産生の顕著かつ統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）阻害を引き起こしたことが分かる。
【0074】
培養ヒトケラチノサイトモデルを使用して得られたこれらの結果は、フィトエンが、ＤＰＭなどの大気汚染物質に曝露された皮膚細胞における炎症反応の少なくとも一部を低減できることを示している。
【0075】
［実施例２］
本発明の組成物による、培養細胞におけるＤＰＭ誘導性活性酸素種（ＲＯＳ）産生の阻害
序論：
化石燃料の燃焼からの浮遊粒子成分（ＤＰＭなど）は、気道炎症及び喘息と強く相関する活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を介して酸化ストレスを誘発する可能性がある。ＲＯＳ実体は、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２ ・－）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）及び一重項酸素（１Ｏ２）を含むフリーラジカル及び非フリーラジカル酸素中間体（過酸化物）の両方を含む。この研究では、培養ケラチノサイトのＤＰＭへの曝露に応答したＮＯＳの産生に対する本発明の組成物の効果を調べた。
本発明の組成物による、培養細胞におけるＤＰＭ誘導性活性酸素種（ＲＯＳ）産生の阻害
序論：
化石燃料の燃焼からの浮遊粒子成分（ＤＰＭなど）は、気道炎症及び喘息と強く相関する活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を介して酸化ストレスを誘発する可能性がある。ＲＯＳ実体は、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２ ・－）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）及び一重項酸素（１Ｏ２）を含むフリーラジカル及び非フリーラジカル酸素中間体（過酸化物）の両方を含む。この研究では、培養ケラチノサイトのＤＰＭへの曝露に応答したＮＯＳの産生に対する本発明の組成物の効果を調べた。
【0076】
方法：
ＨａＣａＴ株の自然形質転換された成体ヒトケラチノサイトを、上記の実施例１に記載されるように、増殖させ、維持し、プレーティングし、対照物質及び試験物質に曝露した。この試験で使用した対照物質は以下の通りであった：
－ビヒクル対照（「対照」、図４）
－ＤＰＭ
－Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ；陽性対照）
ＨａＣａＴ株の自然形質転換された成体ヒトケラチノサイトを、上記の実施例１に記載されるように、増殖させ、維持し、プレーティングし、対照物質及び試験物質に曝露した。この試験で使用した対照物質は以下の通りであった：
－ビヒクル対照（「対照」、図４）
－ＤＰＭ
－Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ；陽性対照）
【0077】
使用した試験物質は、本発明の組成物の希釈物（すなわち、非ＧＭＯ、無溶媒フィトエン及びホホバ油を含有する）であり、５６ｐｐｍの最終フィトエン濃度が得られた。
【0078】
処理細胞上清及び対照細胞上清のＲＯＳ含有量の定量分析を、ヒドロキシル、ペルオキシル及び他の細胞内活性酸素種ＲＯＳ活性を測定する蛍光発生色素（ＤＣＦＤＡ）を使用する市販のキットを使用して行った。
【0079】
結果：
図４から、ＤＰＭ処理はＲＯＳレベルを非刺激対照の約４０倍に上昇させたが、本発明の組成物（「試験」）はＲＯＳ濃度のこの増加を非常に有意な程度まで阻害し、ＮＡＣ陽性対照よりもわずかに有効性が低かったことが分かる。
図４から、ＤＰＭ処理はＲＯＳレベルを非刺激対照の約４０倍に上昇させたが、本発明の組成物（「試験」）はＲＯＳ濃度のこの増加を非常に有意な程度まで阻害し、ＮＡＣ陽性対照よりもわずかに有効性が低かったことが分かる。
【0080】
［実施例３］
本発明の組成物による、培養細胞におけるＵＶＢ誘導性ＩＬ－８産生の阻害
序論：
この研究では、ＵＶＢ曝露培養ケラチノサイトにおけるＩＬ－８の産生に対する本発明の組成物の効果を調べた。
本発明の組成物による、培養細胞におけるＵＶＢ誘導性ＩＬ－８産生の阻害
序論：
この研究では、ＵＶＢ曝露培養ケラチノサイトにおけるＩＬ－８の産生に対する本発明の組成物の効果を調べた。
【0081】
方法：
ＨａＣａＴ株の自然形質転換された成体ヒトケラチノサイトを、上記の実施例１に記載されるように、増殖させ、維持し、プレーティングし、対照物質及び試験物質で処理した。培養細胞に炎症反応を生じさせるために、培養細胞にＵＶＢランプを用いて照射した。この試験で使用した対照物質は以下の通りであった：
－ビヒクル対照（「対照」、図５）
－ＵＶＢ曝露のみ（「未処理」）
－４－アミノ安息香酸（「ＰＡＢＡ」；陽性対照）
ＨａＣａＴ株の自然形質転換された成体ヒトケラチノサイトを、上記の実施例１に記載されるように、増殖させ、維持し、プレーティングし、対照物質及び試験物質で処理した。培養細胞に炎症反応を生じさせるために、培養細胞にＵＶＢランプを用いて照射した。この試験で使用した対照物質は以下の通りであった：
－ビヒクル対照（「対照」、図５）
－ＵＶＢ曝露のみ（「未処理」）
－４－アミノ安息香酸（「ＰＡＢＡ」；陽性対照）
【0082】
使用した試験物質は、本発明の組成物の希釈物（すなわち、非ＧＭＯ、無溶媒フィトエン及びホホバ油を含有する）であり、５６ｐｐｍの最終フィトエン濃度が得られた。
【0083】
培養細胞上清のＩＬ－８濃度を、上記の実施例１に記載したように測定した。
【0084】
結果：
図５から、ＵＶＢ曝露は、ビヒクル対照と比較して、ＩＬ－８産生の大幅な増加を引き起こしたことが分かると思われる。本発明の試験組成物は、このＵＶＢ刺激ＩＬ－８産生の有意な減少を、陽性対照（市販の日焼け止め成分ＰＡＢＡ）によって引き起こされる阻害よりも大きい程度に引き起こしたことにさらに留意されたい。
図５から、ＵＶＢ曝露は、ビヒクル対照と比較して、ＩＬ－８産生の大幅な増加を引き起こしたことが分かると思われる。本発明の試験組成物は、このＵＶＢ刺激ＩＬ－８産生の有意な減少を、陽性対照（市販の日焼け止め成分ＰＡＢＡ）によって引き起こされる阻害よりも大きい程度に引き起こしたことにさらに留意されたい。
【0085】
［実施例４］
３Ｄ再構築皮膚モデルにおけるＤＰＭ誘導性炎症反応の阻害
序論：
実施例１（本明細書中上記）で示されるインビトロ結果をさらに調べるために、再構築されたヒト表皮（ＲＨＥ）モデルを試験プラットフォームとして使用した。「ＥｐｉＤｅｒｍ」の商品名で市販されている、本明細書中下記で本実施例に記載の実験で使用される再構築皮膚は、細胞培養インサート上で培養された正常なヒト由来表皮ケラチノサイトからなる高度に分化した３Ｄ組織モデルである。これらのインサートは、気液界面での再構築組織の培養を可能にし、それによって皮膚上の局所投与剤の評価を容易に可能にする。
３Ｄ再構築皮膚モデルにおけるＤＰＭ誘導性炎症反応の阻害
序論：
実施例１（本明細書中上記）で示されるインビトロ結果をさらに調べるために、再構築されたヒト表皮（ＲＨＥ）モデルを試験プラットフォームとして使用した。「ＥｐｉＤｅｒｍ」の商品名で市販されている、本明細書中下記で本実施例に記載の実験で使用される再構築皮膚は、細胞培養インサート上で培養された正常なヒト由来表皮ケラチノサイトからなる高度に分化した３Ｄ組織モデルである。これらのインサートは、気液界面での再構築組織の培養を可能にし、それによって皮膚上の局所投与剤の評価を容易に可能にする。
【0086】
方法：
ＥｐｉＤｅｒｍ再構築皮膚システムは、供給元ＭａｔＴｅｋ（カタログ番号ＥＰＩ－２００）から入手し、組織は製造業者の指示書に従って取り扱った。簡潔には、送達の際に、組織をその寒天培地から取り出し、洗浄し、次いで、５％ ＣＯ２環境において３７Ｃで一晩放置して回収した。
ＥｐｉＤｅｒｍ再構築皮膚システムは、供給元ＭａｔＴｅｋ（カタログ番号ＥＰＩ－２００）から入手し、組織は製造業者の指示書に従って取り扱った。簡潔には、送達の際に、組織をその寒天培地から取り出し、洗浄し、次いで、５％ ＣＯ２環境において３７Ｃで一晩放置して回収した。
【0087】
次いで、ホホバワックスに０．１、１及び２．５％の濃度で３０μｌの最終体積に希釈されたフィトエンオレオレジンの存在下又は非存在下で、組織を局所適用ＤＰＭ（ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌ、１０μｌ／試料）で処理した。以下の対照群も設定した：ナイーブ組織（未処理対照）、ビヒクル（ホホバワックス）、ＤＰＭ刺激組織及びＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ；陽性対照）。試験物質及び対照の添加後、再構築皮膚培養物を５％ ＣＯ２環境において３７Ｃでさらに４８時間インキュベートした。
【0088】
処理期間の終わりに、粒子状物質を除去するために、組織対照インプラントから培地を回収し、２５０×ｇで５分間遠心分離した。次いで、透明な上清を－７０Ｃで凍結した後、サイトカイン分析を行った。
【0089】
融解培地中のＩＬ－１α及びＩＬ－６レベルを、市販のＥＬＩＳＡキット（ＥＬＩＳＡ Ｍａｘ Ｄｅｌｕｘｅ ＳｅｔヒトＩＬ－１α カタログ番号Ｂ２６５４２４；ＥＬＩＳＡ Ｍａｘ Ｄｅｌｕｘｅ ＳｅｔヒトＩＬ－６ カタログ番号Ｂ２８５２５５８；両方ともＥｎｃｏから供給される）を製造者の指示書に従って使用して決定した。
【0090】
結果：
この研究の結果を図６及び７に示す。図６に示す棒グラフは、ＥｐｉＤｅｒｍ人工皮膚モデルにおいて、フィトエン含有オレオレジンの希釈物の全部ではないが一部が皮膚細胞によるＩＬ－１α産生の減少を引き起こしたことを示す。この試験物質の１％濃度は、抗炎症陽性対照（Ｎ－アセチルシステイン；ＮＡＣ）によって引き起こされる減少と定量的に同程度のＩＬ－１α産生の減少を引き起こしたことに留意すべきである。さらに、試験物質のこの濃度によって引き起こされるＩＬ－１αレベルの低下は、ＤＰＭのみの試料及びビヒクルのみの試料の両方と比較した場合、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
この研究の結果を図６及び７に示す。図６に示す棒グラフは、ＥｐｉＤｅｒｍ人工皮膚モデルにおいて、フィトエン含有オレオレジンの希釈物の全部ではないが一部が皮膚細胞によるＩＬ－１α産生の減少を引き起こしたことを示す。この試験物質の１％濃度は、抗炎症陽性対照（Ｎ－アセチルシステイン；ＮＡＣ）によって引き起こされる減少と定量的に同程度のＩＬ－１α産生の減少を引き起こしたことに留意すべきである。さらに、試験物質のこの濃度によって引き起こされるＩＬ－１αレベルの低下は、ＤＰＭのみの試料及びビヒクルのみの試料の両方と比較した場合、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【0091】
図７にＩＬ－６産生の結果を示す。このグラフから、試験したすべての濃度のフィトエン含有オレオレジン希釈物が、ＤＰＭのみのサンプルと比較した場合、ＩＬ－６産生の有意な減少（ｐ＜０．０５）を引き起こしたことが分かる。
【0092】
これらのデータは、インビボ皮膚モデルのＤＰＭへの曝露が炎症性メディエーターの産生の増加を引き起こすこと、及び本発明のフィトエン含有組成物による処理が炎症反応のこの態様を阻害できることを実証している。したがって、これらの結果は、本発明の組成物が、環境汚染物質及び刺激物、例えばＤＰＭへの皮膚の曝露に起因する皮膚損傷の予防、緩和又は処置において価値があり得ることを強く示唆している。
【0093】
［実施例５］
皮膚の質の様々な態様に対する本発明の組成物の効果の臨床試験
序論：
以下の皮膚の質の特徴を、本出願の組成物による局所治療の前後に健常ボランティアの群で試験した：
－皮膚の色調
－皮膚の発赤
－皮膚のハリ
－皮膚弾力性
－皮膚の滑らかさ
－しわの状態
－皮膚バリア機能
－鎮静効果
皮膚の質の様々な態様に対する本発明の組成物の効果の臨床試験
序論：
以下の皮膚の質の特徴を、本出願の組成物による局所治療の前後に健常ボランティアの群で試験した：
－皮膚の色調
－皮膚の発赤
－皮膚のハリ
－皮膚弾力性
－皮膚の滑らかさ
－しわの状態
－皮膚バリア機能
－鎮静効果
【0094】
方法及び結果：
３３人の女性ボランティア（平均年齢５０歳）の群をこの研究のためにランダムに選択した。ボランティアの顔の皮膚を、本発明の組成物（ホホバ油中に１．５％（ｗ／ｗ）のフィトエンを含有する）の１日２回の適用で最大２８日間処置した。
３３人の女性ボランティア（平均年齢５０歳）の群をこの研究のためにランダムに選択した。ボランティアの顔の皮膚を、本発明の組成物（ホホバ油中に１．５％（ｗ／ｗ）のフィトエンを含有する）の１日２回の適用で最大２８日間処置した。
【0095】
皮膚の色調を、Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ（Ｒ）ＭＸ １８装置（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙより供給）を使用して評価し、被験体のメラニンレベルを評価した。図８に示された結果から分かるように、本発明の組成物を１４日間適用するとメラニン指数が平均６％低下したが、２８日間の処置では平均１０％低下し、この処置の結果として皮膚の明るさが有意に増加したことを示している。
【0096】
皮膚の発赤を、Ｍｅｘａｍｅｔｅｒ（Ｒ）ＭＸ １８装置を使用して評価した。図９は、処置前の初期測定値と比較した場合の、処置後の１４日及び２８日の両方の時点での紅斑の有意な減少を示す。
【0097】
皮膚のハリ及び皮膚の弾力性を、吸引ベースの装置、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ（Ｒ）ＭＰＡ ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙにより販売）を使用して評価した。図１０は、１４日及び２８日の両方の時点での皮膚のハリの増加（すなわち、皮膚変形能の深さの減少）を示す。同様に、図１１に示すように、これらの２つの時点で皮膚弾力性の有意な増加が見られた。
【0098】
皮膚の滑らかさを、Ｐｒｉｍｏｓ ３Ｄ Ｌｉｔｅシステム（Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡにより販売）を使用して評価した。図１２に示すように、滑らかさの有意な増加が、１４日及び２８日の両方の時点で見られた。
【0099】
しわ解析を、Ｐｒｉｍｏｓ ３Ｄ Ｌｉｔｅシステムを用いて行った。図１３は、測定された様々なパラメータ（すなわち、しわの長さ、深さ、数、体積及び面積）のすべてが２８日間の処置後に改善したが、しわの数に関して最も有意な変化（２０％の減少）が見られたことを示す。
【0100】
皮膚バリア機能 皮膚水和を皮膚バリア機能の尺度として使用し、Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ（Ｒ）ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ（ＴＥＷＬ）装置を使用して評価した。図１４に示すように、本発明の組成物で処理すると、１４日及び２８日の両方で水分喪失が顕著に減少した。
【0101】
皮膚の鎮静 刺激を受けた皮膚を鎮静させる本発明の組成物の能力を、１０％乳酸溶液を皮膚表面に適用した後の被験体により作成されたスコアを使用して評価した。図１５に見られるように、本発明の組成物で１４日間処理すると、刺激が２０％超減少した。この皮膚鎮静効果は、２８日間の処置後にさらに顕著であり、報告された刺激性は４５％低下した。
【0102】
［実施例６］
本発明の組成物を含むフェイスクリーム製剤
本発明の組成物を含むフェイスクリーム製剤
【0103】
【表1】
【0104】
本明細書中上記のように調製され、図１に要約される本発明のフィトエン含有オレオレジンを、上記の表に要約される成分から調製されるフェイスクリーム製剤と混合する。製剤の最終フィトエン濃度は０．１％（ｗ／ｗ）である。
【0105】
［実施例７］
本発明の組成物を含むヘアクリーム製剤
本発明の組成物を含むヘアクリーム製剤
【0106】
【表2】
【0107】
本明細書中上記のように調製され、図１に要約される本発明のフィトエン含有オレオレジンを、上記の表に要約される成分から調製されるヘアクリーム製剤と混合する。製剤の最終フィトエン濃度は０．１％（ｗ／ｗ）である。
【0108】
［実施例８］
本発明のフィトエン組成物を含有する経口投与ソフトゲルカプセル
フィトエンオレオレジンソフトゲルカプセルは、当業者に公知の標準的な手順に従って調製される。各カプセルは、前記カプセル中のフィトエンの最終濃度が０．０１～１０％（ｗ／ｗ）の範囲内になるように、本発明に従って調製されたオレオレジンを含有する。
本発明のフィトエン組成物を含有する経口投与ソフトゲルカプセル
フィトエンオレオレジンソフトゲルカプセルは、当業者に公知の標準的な手順に従って調製される。各カプセルは、前記カプセル中のフィトエンの最終濃度が０．０１～１０％（ｗ／ｗ）の範囲内になるように、本発明に従って調製されたオレオレジンを含有する。
【0109】
［実施例９］
ＵＶ誘導性光酸化損傷からの健康な皮膚の保護におけるフィトエンオレオレジン組成物の効果
方法
二重盲検、プラセボ対照並行群臨床バイオ研究。フィトエンに富む食品及び抗酸化サプリメントの摂取が制限される５週間の導入期間の後、被験体を、１２週間毎日、製剤１のソフトゲルカプセル又はプラセボとして同一に見えるソフトゲルカプセルを受けるようにランダム化する。
ＵＶ誘導性光酸化損傷からの健康な皮膚の保護におけるフィトエンオレオレジン組成物の効果
方法
二重盲検、プラセボ対照並行群臨床バイオ研究。フィトエンに富む食品及び抗酸化サプリメントの摂取が制限される５週間の導入期間の後、被験体を、１２週間毎日、製剤１のソフトゲルカプセル又はプラセボとして同一に見えるソフトゲルカプセルを受けるようにランダム化する。
【0110】
被験体数（計画及び分析）
試験を完了させ、分析するための６０名の被験体。
試験を完了させ、分析するための６０名の被験体。
【0111】
診断及び主要組み入れ基準
Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ皮膚Ｉ型～ＩＶ型、ＢＭＩ≦３０ｋｇ／ｍ２及び健康な食習慣を有する、２０歳～６５歳の健康な男女。
Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ皮膚Ｉ型～ＩＶ型、ＢＭＩ≦３０ｋｇ／ｍ２及び健康な食習慣を有する、２０歳～６５歳の健康な男女。
【0112】
試験生成物、用量及び投与様式
１つの（上記の実施例８に記載の）ソフトゲルカプセルを毎日経口投与した。
１つの（上記の実施例８に記載の）ソフトゲルカプセルを毎日経口投与した。
【0113】
参照療法、用量及び投与様式
プラセボを毎日経口投与した。
プラセボを毎日経口投与した。
【0114】
処置期間
１２週間。
１２週間。
【0115】
比色法（Ｃｈｒｏｍｏｍｅｔｒｙ）によって測定された紅斑に対する保護
比色法は、比色計を用いて皮膚の色を測定する方法である。皮膚の色は、Ｌ＊ａ＊ｂ＊スケールを使用して測定され、Ｌ＊はグレースケール上の色の輝度を反映し、ａ＊は赤色と緑色との対比を反映し、ｂ＊は青色と黄色との対比を反映する。
比色法は、比色計を用いて皮膚の色を測定する方法である。皮膚の色は、Ｌ＊ａ＊ｂ＊スケールを使用して測定され、Ｌ＊はグレースケール上の色の輝度を反映し、ａ＊は赤色と緑色との対比を反映し、ｂ＊は青色と黄色との対比を反映する。
【0116】
被験体は、ＵＶ照射誘導性紅斑からの保護について試験される。各被験体の皮膚の領域にＵＶ照射し、照射の２４時間後に紅斑の発生を測定する。
【0117】
この分析のために、Δａ＊を、供給前のＵＶ照射後２４時間での紅斑発生レベルと供給後のＵＶ照射後２４時間での紅斑発生レベルとの間の差異として定義した。製剤１群とプラセボ群との間で紅斑形成の統計学的に有意な変化が予想される。
【0118】
サイトカインレベル
平均ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αレベルをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって評価する。臨床試験に参加している被験体を、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αのレベルについてアッセイする。試料は、ランダム化前のＵＶＢ照射後及び製剤１又はプラセボによる１２週間の処置後に行われたＵＶＢ照射後に得る。
平均ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αレベルをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって評価する。臨床試験に参加している被験体を、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αのレベルについてアッセイする。試料は、ランダム化前のＵＶＢ照射後及び製剤１又はプラセボによる１２週間の処置後に行われたＵＶＢ照射後に得る。
【0119】
予想される結果：皮膚生検からのサイトカインｍＲＮＡの分析は、処置群間で統計学的に有意に異なる。
【0120】
［実施例１０］
本発明の組成物は、刺激された好中球からの分解酵素の分泌を減少させる
コラーゲンに損傷を引き起こす可能性がある酵素の放出に対する本発明の組成物の効果を研究するために、本発明者らはまず、活性化好中球からのそのような酵素の放出の動態を決定する。好中球は、ＵＶへの曝露中に皮膚細胞から放出されて活性化される１００ ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦα又は１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ８によって活性化される。さらに、比較のために、好中球を５×１０７ｆＭＬＰで活性化する。
本発明の組成物は、刺激された好中球からの分解酵素の分泌を減少させる
コラーゲンに損傷を引き起こす可能性がある酵素の放出に対する本発明の組成物の効果を研究するために、本発明者らはまず、活性化好中球からのそのような酵素の放出の動態を決定する。好中球は、ＵＶへの曝露中に皮膚細胞から放出されて活性化される１００ ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦα又は１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ８によって活性化される。さらに、比較のために、好中球を５×１０７ｆＭＬＰで活性化する。
【0121】
ＭＭＰ－９又はＭＰＯの放出に対する本発明のフィトエン含有組成物の効果を研究するために、好中球は、ＴＮＦα又はＩＬ８によって４時間、ｆＭＬＰによって３０分間活性化されるべきである。組成物を、活性化前に好中球に３７℃で１０分間添加する。刺激された好中球からのサイトカインの放出の阻害が測定され、用量依存的阻害が予想される
【0122】
［実施例１１］
本発明のフィトエン含有組成物は、線維芽細胞－好中球共培養物におけるコラーゲン喪失を減少させる
活性化好中球によって誘導されるコラーゲン－３の損傷に対する本発明の組成物の効果を研究するために、本発明者らは、培養線維芽細胞及び好中球の最適条件を使用する。１×１０５個の線維芽細胞を２４時間プレーティングして、コンフルエントな培養物を得る。細胞生存率を各処理において測定する。
本発明のフィトエン含有組成物は、線維芽細胞－好中球共培養物におけるコラーゲン喪失を減少させる
活性化好中球によって誘導されるコラーゲン－３の損傷に対する本発明の組成物の効果を研究するために、本発明者らは、培養線維芽細胞及び好中球の最適条件を使用する。１×１０５個の線維芽細胞を２４時間プレーティングして、コンフルエントな培養物を得る。細胞生存率を各処理において測定する。
【0123】
好中球を本発明の組成物と共に３７℃で１０分間インキュベートした後、培養物に２４時間添加する。培養物中のコラーゲン－３レベルの定量は、デンシトメトリーによって決定されるべきである。
【0124】
共培養物中の本発明の組成物の存在は、分泌されたプロ－コラーゲン－３の用量依存的増加を有することが予想される。
【0125】
ＮＨＤＦ細胞を５０ｍＭ Ｈ２Ｏ２で処理すると、コラーゲンｌａｌの分泌が約１０倍減少する。本発明の組成物は、コラーゲン分泌の減少を完全に無効にすることが予想され、このことは、インビボでの皮膚コラーゲンレベルの増加及び皮膚老化の減少における組成物の役割を示唆している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】