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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-08
(54)【発明の名称】ＨＧＨ融合タンパク質の高濃度投与剤形
(51)【国際特許分類】
A61K 38/27 20060101AFI20241031BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241031BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20241031BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20241031BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241031BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241031BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20241031BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20241031BHJP
【ＦＩ】
A61K38/27
A61K39/395 Y
A61K47/10
A61K47/26
A61K9/08
A61K47/18
A61K47/02
C07K19/00 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531548
(86)(22)【出願日】2022-10-19
(85)【翻訳文提出日】2024-07-12
(86)【国際出願番号】 KR2022095143
(87)【国際公開番号】W WO2023096475
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】10-2021-0165734
(32)【優先日】2021-11-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516351304
【氏名又は名称】ジェネクシン・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＸＩＮＥ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１７２ Ｍａｇｏｋｊｕｎｇａｎｇ－ｒｏ， Ｇａｎｇｓｅｏ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０７７８９ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ
(71)【出願人】
【識別番号】514081863
【氏名又は名称】ハンドク インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】パク， チャンウン
(72)【発明者】
【氏名】キム， キ－ヨン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC30
4C076DD08
4C076DD09
4C076DD23
4C076DD37Q
4C076DD46
4C076DD51
4C076EE23
4C076FF36
4C084AA02
4C084BA41
4C085AA21
4C085BB42
4C085DD59
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA31
4H045DA76
4H045EA20
(57)【要約】
本発明は、ポロクサマー１８８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）とポリソルベート８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）を含有するｈＧＨ融合タンパク質の高濃度投与剤形に関し、本発明によりポロクサマー１８８とポリソルベート８０を含有する場合、凝集反応が顕著に減少し、保管安定性が向上した高濃度のｈＧＨ融合タンパク質剤形を製造することができる。
【選択図】図８
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｈＧＨ（ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）融合タンパク質、ポロクサマー１８８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）およびポリソルベート８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）を含む、液状の薬学剤形。
【請求項2】
前記ｈＧＨ融合タンパク質は、ｈＧＨおよび免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項3】
前記ｈＧＨは、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載の剤形。
【請求項4】
前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載の剤形。
【請求項5】
前記ｈＧＨ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項6】
前記剤形は、３０ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ融合タンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項7】
前記剤形は、０．０１％～０．２％（ｗ／ｖ）ポロクサマー１８８を含むことを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項8】
前記剤形は、０．０１％～０．２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含むことを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項9】
前記剤形は、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）から成る群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項10】
前記剤形は、保存剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項11】
前記保存剤は、ｍ－クレゾール（ｍ－ｃｒｅｓｏｌ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）およびベンジルアルコール（ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）から成る群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載の剤形。
【請求項12】
前記保存剤は、１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬのフェノールであることを特徴とする請求項１１に記載の剤形。
【請求項13】
前記剤形は、１ｍＭ～２０ｍＭのヒスチジンを含むことを特徴とする請求項９に記載の剤形。
【請求項14】
前記剤形は、４０ｍＭ～７０ｍＭのアルギニンを含むことを特徴とする請求項９に記載の剤形。
【請求項15】
前記剤形は、４０ｍＭ～７０ｍＭのグルタミン酸を含むことを特徴とする請求項９に記載の剤形。
【請求項16】
前記剤形は、８０ｍＭ～１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むことを特徴とする請求項９に記載の剤形。
【請求項17】
前記剤形は、ｐＨ５．５～ｐＨ７．０であることを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項18】
前記剤形は、ｐＨ６．０～ｐＨ６．２であることを特徴とする請求項１７に記載の剤形。
【請求項19】
前記剤形は、冷蔵で６ヶ月保管時に１．５％未満の凝集体を形成することを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項20】
前記剤形は、皮下または筋肉投与用であることを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【請求項21】
前記剤形は、瓶（ｂｏｔｔｌｅ）、マイクロチューブ（ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ）、バッグ（ｂａｇ）、バイアル（ｖｉａｌ）、カートリッジ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）、注入器（ｉｎｊｅｃｔｏｒ）および注射器（ｓｙｒｉｎｇｅ）から成る群から選択された容器で保管されることを特徴とする請求項１に記載の剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｈＧＨ（ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）融合タンパク質の高濃度投与剤形に関し、より詳細には、ポロクサマー１８８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）とポリソルベート８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）を含有することによって、免疫グロブリンＦｃポリペプチド（以下、「ｈｙＦｃ」と混用して表示される）が融合しているｈＧＨの高濃度剤形においても凝集反応が顕著に減少したｈＧＨ融合タンパク質の高濃度投与剤形に関する。
【背景技術】
【0002】
成長ホルモンは、１９１個のアミノ酸で構成されたポリペプチドであり、脳下垂体前葉から分泌されるホルモンである。成長ホルモン受容体と結合してＩＧＦ－１（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－１）を発現させることによって、細胞の成長および再生に関与する。成長ホルモンは、正常ヒトの身体では、脳下垂体で生産され、思春期まで生産量が増加し、年を取るにつれて次第に生産量が減少することが知られている。
【0003】
代表的な成長ホルモンの欠損症状には、成人成長ホルモン欠損症（ａｄｕｌｔ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ＡＧＨＤ）と小児成長ホルモン欠損症（ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ＰＧＨＤ）がある。成人成長ホルモン欠損症の場合、脳腫瘍、脳出血などの治療過程で放射線や手術によって患者の脳下垂体が損傷する場合または特発性で発生する。成長ホルモンの分泌が正しくできない場合、体重減少、骨の無機質密度減少、脂肪増加、ＨＤＬの減少、ＬＤＬの増加、筋肉強度減少などの症状が現れ、生活の質が低下する。成人成長ホルモン欠損症患者は、血清内ＩＧＦ－１の濃度が同じ年齢層の正常ヒトに比べて標準偏差スコア（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ，ＳＤＳ）が－２以下（≦－２ ＳＤＳ）または百分位２．５内（≦２．５ ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）に属する。血中成長ホルモンの反応値は、インスリン耐性検査（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ，ＩＴＴ）、アルギニン負荷（Ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ＋Ａｒｇｉｎｉｎｅ，ＧＨＲＨ＋ＡＲＧ）検査、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）検査、Ｌ－ＤＯＰＡ検査、クロニジン（Ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ）検査など刺激試験（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）を通じて測定することができる。成長ホルモンの最大数値（ｐｅａｋ ＧＨ）がボディマス指数（ＢＭＩ）２５ｋｇ／ｍ２未満の患者で１１．０μｇ／Ｌ以下、ボディマス指数２５～３０ｋｇ／ｍ２患者で８．０μｇ／Ｌ以下、またはボディマス指数３０ｋｇ／ｍ２超過の患者で４．０μｇ／Ｌ以下である場合、欠損症と判定する（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｐｒａｃｔ．２００９；１５（Ｓｕｐｐｌ ２））。小児成長ホルモン欠損症は、脳下垂体の損傷または発達障害がある場合に発生する。成長ホルモンの分泌障害があると、低身長症が現れるが、身長が同年齢の成長曲線で下位３％または１年５ｃｍ以下の成長を示し、低血糖、体力低下、うつ病および精神的未成熟などの症状が現れることもある。同じ年齢層で、身長が平均より３ＳＤ（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）以上低い場合、両親の身長の平均より１．５ＳＤ以上低い場合、平均身長より２ＳＤ以上低く、同年齢の成長に比べて１年以上１ＳＤ以上低い場合、２歳以上やＳＤ値が０．５以上低い場合、または低身長症状が現れなかったが、１年以上２ＳＤ未満であるか、２年以上１．５を維持する場合、小児成長ホルモン欠損症と判定することができる（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＧＨ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ａｎｄ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ：ｓｕｍｍａｒｙ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＧＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ．ＧＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２０００ Ｎｏｖ；８５（１１）：３９９０－３）。
【0004】
成長ホルモン欠損症は、主に成長ホルモンを用いた治療が行われるが、１９５０年代に初めて成長ホルモン治療が始まったとき、成長ホルモンは、ヒトの死体の脳下垂体から抽出し、１人のヒトから抽出された成長ホルモンの量が非常に少なかったため、供給が非常に制限的であり、高価であった。遺伝子組換え技術が発達するにつれて、大腸菌で合成した成長ホルモンが発売された（Ｓｏｍａｔｒｏｐｉｎ，１９８１，米国Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）。現在米国で市販される組換え成長ホルモン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）治療剤は、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）のジェノトロピン（Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ）、イーライリリー（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）のるヒューマトロープ（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ）、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のニュートロピン（Ｎｕｔｒｏｐｉｎ）、ノボノルディスク（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）のノルディトロピン（Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ）などがある。
【0005】
現在成長ホルモン製剤は、１日剤形として、特に、小児患者の場合、３～４年の長い治療期間の間毎日薬を注射しなければならない不便さがあり、注射による精神的ストレスが患者の生活の質を低下させることが知られている。また、患者が意図せずに注射を受けない問題が頻繁に発生し、治療効果を阻害する最も大きい要因となっている。また、治療年数が増加するほど投与不遵守回数が顕著に増加することが知られている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ，２００８ Ｍａｒ；１４（２）：１４３－５４）。約２／３程度の患者が不遵守により順応度が低くなり、実際にこれによって身長成長速度が減少することが知られている（ＰｌｏＳ ｏｎｅ，２０１１ Ｊａｎ；６（１）：ｅ１６２２３）。
【0006】
このような問題点に起因して、多様な技術を用いて持続型成長ホルモンを開発しようとする試みが着実に続いてきた。Ａｓｃｅｎｄｉｓ ｐｈａｒｍａ社は、Ｔｒａｎｓｃｏｎ ＰＥＧプラットフォームを用いて、ＯＰＫＯ／Ｐｆｉｚｅｒ社は、ｈＧＨにＣＴＰを融合して、そしてＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ社は、アルブミンを融合してｈＧＨの半減期を増加させ、このような技術は、成長ホルモン注射を毎日投与していた患者に週１回投与を可能にした。
【0007】
これと関連して、本出願人は、ｈＧＨにＩｇＤおよびＩｇＧ４を組み合わせたｈｙＦｃを融合して補体依存性および抗体依存性毒性が低く、ｈＧＨの持続性が向上したＧＸ－Ｈ９物質に対する特許を出願して登録を受けたことがある（米国登録特許第８，５２９，８９９号）。次に、ＧＸ－Ｈ９の週１回または２週１回投与が可能な用量用法の特許を出願した（米国公開特許第２０２１－０１７７９４５号および米国公開特許第２０１９－０２２４２８１号）。
【0008】
なお、ＧＸ－Ｈ９の臨床試験初期には、濃度を３０ｍｇ／ｍｌで剤形化して供給した。その後、ＧＸ－Ｈ９を２週１回投与する過程でＧＸ－Ｈ９投与量（ｖｏｌｕｍｅ）が増加し、これにより、高濃度剤形に対する必要性が台頭した。
【0009】
これより、本発明者らは、ＧＸ－Ｈ９の配列分析を通じて構造的特徴を予測し、ｈＧＨが疎水性パッチ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐａｔｃｈ）を多く有していて、タンパク質自体が疎水性相互作用による凝集体を形成できるという点とＤＰ（Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ）容器内気体／オイル／固体表面などにタンパク質が吸着して一種のタンパク質フィルムを形成し、これらが脱離して作られたパッチが不溶性粒子で凝集体を形成できるという点に着目し、このような凝集体の形成を防止できる剤形を開発するために努力し、界面活性剤としてポリソルベート８０とポロクサマー１８８を共に添加した液状剤形において凝集体の形成が顕著に改善されることを確認することによって、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、ｈＧＨ融合タンパク質の高濃度剤形を製造するに際して、タンパク質凝集反応が顕著に減少して保管安定性が維持されるｈＧＨ－ｈｙＦｃ融合タンパク質の高濃度剤形を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
前記目的を達成するために、本発明は、ｈＧＨ（ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ）融合タンパク質、ポロクサマー１８８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）およびポリソルベート８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）を含む、液状の薬学剤形を提供する。
【0012】
本発明において、前記ｈＧＨ融合タンパク質は、ｈＧＨおよび免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含むことを特徴とする。
【0013】
本発明において、前記ｈＧＨは、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【0014】
本発明において、前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【0015】
本発明において、前記ｈＧＨ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【0016】
本発明において、前記剤形は、３０ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ融合タンパク質を含むことを特徴とする。
【0017】
本発明において、前記剤形は、０．０１％～０．２％（ｗ／ｖ）ポロクサマー１８８を含むことを特徴とする。
【0018】
本発明において、前記剤形は、０．０１％～０．２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含むことを特徴とする。
【0019】
本発明において、前記剤形は、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）から成る群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含むことを特徴とする。
【0020】
本発明において、前記剤形は、保存剤をさらに含むことを特徴とする。
【0021】
本発明において、前記保存剤は、ｍ－クレゾール（ｍ－ｃｒｅｓｏｌ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）およびベンジルアルコール（ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）から成る群から選択される１つ以上であることを特徴とする。
【0022】
本発明において、前記保存剤は、１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬのフェノールであることを特徴とする。
【0023】
本発明において、前記剤形は、１ｍＭ～２０ｍＭのヒスチジンを含むことを特徴とする。
【0024】
本発明において、前記剤形は、４０ｍＭ～７０ｍＭのアルギニンを含むことを特徴とする。
【0025】
本発明において、前記剤形は、４０ｍＭ～７０ｍＭのグルタミン酸を含むことを特徴とする。
【0026】
本発明において、前記剤形は、８０ｍＭ～１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むことを特徴とする。
【0027】
本発明において、前記剤形は、ｐＨ５．５～ｐＨ７．０であることを特徴とする。
【0028】
本発明において、前記剤形は、好ましくは、ｐＨ６．０～ｐＨ６．９、より好ましくは、ｐＨ６．０～６．２であることを特徴とする。
【0029】
本発明において、前記剤形は、冷蔵で６ヶ月間保管時に１．５％未満の凝集体を形成することを特徴とする。
【0030】
本発明において、前記剤形は、皮下または筋肉投与用であることを特徴とする。
【0031】
本発明において、前記剤形は、瓶（ｂｏｔｔｌｅ）、マイクロチューブ（ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ）、バッグ（ｂａｇ）、バイアル（ｖｉａｌ）、カートリッジ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）、注入器（ｉｎｊｅｃｔｏｒ）および注射器（ｓｙｒｉｎｇｅ）から成る群から選択された容器で保管されることを特徴とする。
【発明の効果】
【0032】
本発明によるポロクサマー１８８とポリソルベート８０を含有する場合、凝集反応が顕著に減少し、保管安定性が向上した高濃度のｈＧＨ融合タンパク質剤形を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【発明を実施するための最良の形態】
【0044】
他の式で定義されない限り、本明細書において使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書において使用された命名法は、当該技術分野においてよく知られており、通常使用されるものである。
【0045】
本発明では、ＧＸ－Ｈ９の高濃度剤形を製造するに際して、界面活性剤としてポリソルベート８０とポロクサマー１８８を共に含有する場合、凝集体の形成が顕著に減少することを確認した。
【0046】
したがって、本発明は、一観点においてｈＧＨ融合タンパク質、ポロクサマー１８８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）およびポリソルベート８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）を含む液状の薬学剤形に関する。
【0047】
本発明において、前記ｈＧＨ融合タンパク質は、ｈＧＨおよび免疫グロブリンＦｃポリペプチドを含むことを特徴とする。
【0048】
本発明において使用したｈＧＨ融合タンパク質「ＧＸ－Ｈ９」は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）にハイブリッドＦｃを融合させて製造したヒト成長ホルモン融合タンパク質であるｈＧＨ－ｈｙＦｃを指す。ｈＧＨ融合タンパク質であるＧＸ－Ｈ９は、米国特許第８，５２９，８９９号に開示された方法により製造することができる。
【0049】
本発明において、前記ｈＧＨは、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0050】
本発明において、前記免疫グロブリンＦｃポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0051】
本発明において、前記ｈＧＨ融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0052】
本発明において、前記剤形は、３０ｍｇ／ｍＬ～１５０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ融合タンパク質を含むことを特徴とし、好ましくは、６０ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬのＧＸ－Ｈ９を含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。前記剤形は、例えば、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１１０ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬ、１３０ｍｇ／ｍＬ、１４０ｍｇ／ｍＬまたは１５０ｍｇ／ｍＬのＧＸ－Ｈ９を含んでもよい。
【0053】
本発明において、前記剤形は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．２％（ｗ／ｖ）ポロクサマー１８８を含むことを特徴とし、好ましくは、０．０５％（ｗ／ｖ）～０．１５％（ｗ／ｖ）、または０．０８％（ｗ／ｖ）～０．１２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、０．１０％（ｗ／ｖ）のポロクサマー１８８を含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0054】
本発明において、前記剤形は、０．０１％（ｗ／ｖ）～０．２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含むことを特徴とし、好ましくは、０．０５％（ｗ／ｖ）～０．１５％（ｗ／ｖ）、または０．０５％（ｗ／ｖ）～０．１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、０．０７％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0055】
本発明において、前記剤形は、前記剤形は、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）から成る群から選択される１つ以上の賦形剤をさらに含むことを特徴とする。
【0056】
本発明において、前記剤形は、保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）をさらに含むことを特徴とする。
【0057】
本発明において、前記保存剤は、ｍ－クレゾール（ｍ－ｃｒｅｓｏｌ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）およびベンジルアルコール（ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）から成る群から選択されたいずれか１つ以上であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0058】
本発明において、前記保存剤は、１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬのフェノールであることを特徴とし、好ましくは、１ｍｇ／ｍＬのフェノールであることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0059】
本発明において、前記剤形は、１ｍＭ～２０ｍＭのヒスチジンを含むことを特徴とし、好ましくは、５ｍＭ～１５ｍＭ、より好ましくは、１０ｍＭのヒスチジンを含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0060】
本発明において、前記剤形は、４０ｍＭ～７０ｍＭのアルギニンを含むことを特徴とし、好ましくは、５０ｍＭ～６０ｍＭ、より好ましくは、５５ｍＭのアルギニンを含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0061】
本発明において、前記剤形は、４０ｍＭ～７０ｍＭのグルタミン酸を含むことを特徴とし、好ましくは、５０ｍＭ～６０ｍＭ、より好ましくは、５５ｍＭのグルタミン酸を含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0062】
本発明において、前記剤形は、８０ｍＭ～１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むことを特徴とし、好ましくは、８５ｍＭ～９５ｍＭ、より好ましくは、９０ｍＭの塩化ナトリウムを含むことを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0063】
本発明において、前記剤形は、ｐＨ５．５～ｐＨ７．０であることを特徴とし、好ましくは、ｐＨ５．９～ｐＨ６．９、さらに好ましくは、ｐＨ６．０～ｐＨ６．５、より好ましくは、ｐＨ６．０～ｐＨ６．２、最も好ましくは、ｐＨ６．１であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0064】
本発明において、前記剤形は、冷蔵、例えば、２℃～８℃、好ましくは、４℃～６℃で約６ヶ月間保管時に、３．０％未満、好ましくは、２．０％未満、より好ましくは、１．５％未満、例えば０～１．５％の凝集体を形成することを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0065】
本発明において、前記剤形は、皮下または筋肉投与用であることを特徴とする。
【0066】
本発明において、前記剤形は、注射用剤形であることを特徴とする。
【0067】
本発明において、前記剤形は、瓶（ｂｏｔｔｌｅ）、マイクロチューブ（ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ）、バッグ（ｂａｇ）、バイアル（ｖｉａｌ）、カートリッジ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）、注入器（ｉｎｊｅｃｔｏｒ）および注射器（ｓｙｒｉｎｇｅ）から成る群から選択された容器で保管されることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0068】
例えば、剤形は、ガラスバイアル、ガラスカートリッジ、プラスチックカートリッジ、プレフィルド注射器（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）、ペン注入器（ｐｅｎ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）および自動注入器（ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ）から成る群から選択された容器で保管されることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【0069】
本発明による高濃度ＧＸ－Ｈ９薬学剤形は、成長ホルモンが欠損した成人または小児に投与することができる。本発明による高濃度ＧＸ－Ｈ９薬学剤形は、多様な方法で対象体に投与することができる。
【0070】
本発明において前記対象体は、哺乳動物であってもよいが、これに限定されず、好ましくは、前記対象体は、ヒトであってもよい。
【0071】
例えば、前記剤形は、非経口的に投与することができるが、その例は、皮下または筋肉内である。
【0072】
本発明において用語「薬学剤形」は、ＧＸ－Ｈ９の生物学的活性が効果的になる形態でＧＸ－Ｈ９を含有し、剤形が投与される被験者に毒性を示す成分が許容可能な用量以上で含有しない製剤を指す。
【0073】
「安定した」剤形は、保存、保管および流通時に、ＧＸ－Ｈ９の生理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を実質的に保有するものである。一様態において、剤形は、保存時に生理的および化学的安定性だけでなく、それの生物学的活性を実質的に保有する。保存期間は、剤形の意図的保管寿命に基づいて一般的に選択される。安定性は、選択された時間期間の間選択された温度で測定されることができる。例えば、一様態として液状剤形は、約２５℃で約２週間～４週間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間または少なくとも約１８ヶ月間安定している。さらに他の例として、液状剤形は、約５℃で約２～４週間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、少なくとも約３０ヶ月間または少なくとも約３６ヶ月間安定している。
【0074】
タンパク質安定性を測定するための分析技法は、非常に多様であり、先行文献［Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０（１９９３）］などを参考した。
【0075】
液状剤形の安定性は、ダイマー、マルチマーおよび／または凝集物形成の評価（例えば、サイズ排除超高性能液体クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＳＥ－ＵＰＬＣ）、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＳＥ－ＨＰＬＣ）、逆相超高性能液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＲＰ－ＵＰＬＣ）、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＲＰ－ＨＰＬＣ）などのような液体クロマトグラフィー）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ－ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）、分析用超遠心分離、光散乱（光子相関分光法、動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＤＬＳ）、静的光散乱、多角レーザー光散乱（ｍｕｌｔｉ－ａｎｇｌｅ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＭＡＬＬＳ）、フローイメージング顕微鏡、電子インピーダンス（コルター（ｃｏｕｌｔｅｒ））カウンター、光遮断または他の液体粒子計測システムを使用して、濁度測定によって、および／または視覚的検査によって）；陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＣＥＸ）、等電点電気泳動法（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ：ＩＥＦ）、例えば、毛細管法（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ｃＩＥＦ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を使用して電荷異質性を評価することによって；アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析；質量スペックペプチドマッビング（例えば、トリプシン／ＬＹＳ－Ｃ利用）分析；抗体の生物学的活性または抗原結合機能などの評価を含む、多様な異なる方法で定性的におよび／または定量的に評価することができる。
【0076】
本発明において、前記薬学剤形は、等張性剤形であってもよく、「等張性」剤形は、実質的にヒトの血液と同じ浸透圧を有する。等張性剤形は、一般的に約２５０～３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有するものである。等張性は、例えば、水蒸気圧または氷冷型浸透圧計を使用して測定することができる。
【0077】
本発明において、「緩衝剤」は、それの酸－塩基コンジュゲート成分の作用によってｐＨの変化に抵抗する緩衝剤を指す。一部の実施形態において、本発明の緩衝剤は、約５．０～約７．５、約５．８～約７．０、約６．０～約６．５または約６．０～約６．３のｐＨに剤形のｐＨを調節する。一様態において、単独でまたは組み合わせでｐＨを制御する緩衝剤の例は、アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）、スクシネート（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、グルコネート（ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、シトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）、ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、マリエート（ｍａｌｅａｔｅ）、カコジレート（ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ）、２－［Ｎ－モルホリノ］エタンスルホン酸（２－［Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＥＳ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（ビス－トリス）（ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ［Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ］ｍｅｔｈａｎｅ（ｂｉｓ－ｔｒｉｓ））、Ｎ－［２－アセトアミド］－２－イミノ２酢酸（Ｎ－［２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ］－２－ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＡＤＡ）、グリシルグリシン（ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）または他の有機酸緩衝剤を含んでもよい。
【0078】
なお、本発明において緩衝剤は、生物学的緩衝剤、すなわち、生物学的システムまたはそのコンテキストで使用される従来技術から知られている緩衝剤を使用することができるが、例えば、本発明において使用される緩衝液は、無機塩および有機塩を含有する混合緩衝液であってもよい。
【0079】
また、本発明において使用することができる好ましい混合緩衝液は、生物学的緩衝液であり、アミノ酸を含むものであってもよい。本発明において使用することができる好ましいアミノ酸は、ヒスチジン、アルギニンおよびグルタミン酸から成る群から選択される１つ以上であってもよく、ヒスチジン、アルギニンおよびグルタミン酸を全部含むことが好ましい。
【0080】
本発明において、「界面活性剤」は、液体の表面張力を低減する作用剤を指す。一様態において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であってもよい。好ましい様態として、本発明は、界面活性剤としてポリソルベート８０とポロクサマー１８８を両方とも含んでもよいが、これに限定されるものではない。本発明においてさらに含まれてもよい界面活性剤の例は、ポリソルベート（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、例えば、ポリソルベート２０）；トリトン（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標））（ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、非イオン性洗浄剤、ミシガン州ミドルランド所在のダウケミカルカンパニーのユニオンカーバイド（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ）の子会社）；ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ：ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ソジウムオクチルグルコシド；ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－またはステアリル－スルホベタイン；ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－またはステアリル－サルコシン、；リノレイル－、ミリスチル－またはセチル－ベタイン；ラウロアミドプロピル－、コカミドプロピル－、リノレアミドプロピル－、ミリストアミドプロピル－、パルミドプロピル－、またはイソステアルアミドプロピル－ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリリストアミドプロピル－、パルミドプロピル－、またはイソステアルアミドプロピル－ジメチルアミン；ソジウムメチルココイル、またはジソジウムメチルオレイル－タウレート；ソルビタンモノパルミテート；およびＭＯＮＡＱＵＡＴシリーズ（ニュージャージー州パターソン所在のモナインダストリズインコポレイティドゥ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．））；ポリエチルグリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレングリコールの共重合体（例えば、プルロニックス（登録商標）／ポロクサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）／Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、ＰＦ６８など）；から成る群から選択されるものを含む。
【0081】
本発明による剤形は、一実施様態において、滅菌され、保存剤を含まない。他の実施様態において、本発明による剤形は、任意の保存剤を含んでもよいし、前記保存剤は、パラベン無含有保存剤であってもよい。パラベンは、一連のパラヒドロキシベンゾアートまたはパラヒドロキシ安息香酸のエステルであり、これは、サイトカイン放出および刺激を引き起こし、様々な類型のがんと関係していることが知られている。パラベンの例は、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ヘプチルパラベン、イソブチルパラベン、イソプロピルパラベン、ベンジルパラベン、およびこれらのナトリウム塩を含む。
【0082】
例示的なパラベン無含有保存剤は、メチルフェノール（クレゾール）、例えば、３－メチルフェノール（メタ－クレゾールまたはｍ－クレゾール）、フェノール、フェネチルアルコール、カプリリルグリコール、フェノキシエタノール、ソルベート、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、安息香酸ナトリウム、安息香酸、アセマンナン、オレウロペイン、カルバクロール、クランベリー抽出物、グルコノラクトン、緑茶抽出物、ヘリアンサス・アナス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）種子オイル、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）発酵物、ウスネアバルバタ（Ｕｓｎｅａ ｂａｒｂａｔａ）抽出物、ポリアミノプロピルビグアニド、ポリグリセリル－３パルミテート、ポリグリセリル－６カプリレート、ザクロ抽出物、アメリカヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）葉抽出物、レスベラトロール、ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）葉抽出物、ベンジルアルコール、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【0083】
本発明による剤形は、抗酸化剤をさらに含んでもよい。「抗酸化剤」は、他の分子の酸化を抑制する作用剤を指し、本発明において抗酸化剤の例は、シトレート、リポ酸、尿酸、グルタチオン、トコフェロール、カロテン、リコペン、システイン、ホスホネート化合物、例えば、エチドロン酸、デスペロキサミンおよびマレートを含む。
【0084】
本発明において使用されるＧＸ－Ｈ９は、実質的に純粋であってもよく（すなわち、汚染タンパク質などがない）、実質的に同種であってもよい。「実質的に純粋な」ＧＸ－Ｈ９は、薬学剤形内タンパク質の全重量を基準として少なくとも約９０重量％、選択的に、少なくとも約９５重量％または９７重量％で含まれることを意味する。
【0085】
ＧＸ－Ｈ９は、「実質的に同種の」ＧＸ－Ｈ９を含んでもよいし、前記「実質的に同種の」ＧＸ－Ｈ９は、本発明において使用されるＧＸ－Ｈ９と均等活性を有する変異を有することを意味する。前記の実質的に同種は、一様態としてＧＸ－Ｈ９アミノ酸配列と実質的に同じことを意味し、実質的に同じ配列は、本発明のＧＸ－Ｈ９アミノ酸配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインし、当業界において通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小９０％の相同性、最も好ましくは、最小９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。
【実施例】
【0086】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明だろう。
実施例１．ｈＧＨ－ｈｙＦｃの高濃度剤形１２週安定性の評価
１－１．予備実験結果の要約
実施例１．ｈＧＨ－ｈｙＦｃの高濃度剤形１２週安定性の評価
１－１．予備実験結果の要約
【0087】
ｈＧＨ－ｈｙＦｃ（以下、「ＧＸ－Ｈ９」と混用して表示される）の高用量剤形に対する予備実験では、ｐＨ６．０～６．５の範囲にわたって温度ストレスに対する凝集抵抗性が他のｐＨ範囲に比べてさらに大きく現れた。また、リン酸塩緩衝製剤に比べてヒスチジン緩衝製剤を使用する場合、さらに高いレベルの安定性を確認することができた。なお、凍結／解凍、撹拌条件でポロクサマー１８８およびポリソルベート８０を使用する場合、高い安定性を得ることができた。
【0088】
全般的に、ＳＥ－ＨＰＬＣ結果は、ｐＨ６．１でさらに高い安定性を示すのに対し、ＲＰ－ＵＰＬＣ結果は、塩化ナトリウムを含有するｐＨ６．５剤形においてさらに高い安定性を示すことが確認された（データ不図示）。
１－２．実験設計
１－２．実験設計
【0089】
以下では、リン酸塩緩衝液ｐＨ６．９剤形をさらに含み、合計５個の互いに異なる剤形に対して温度（－７０℃、２～８℃、２５℃、４５℃）ストレス、凍結／解凍ストレス、軽い振とうストレスによる安定性を評価した。表１は、ＧＸ－Ｈ９および賦形剤の濃度および種類の剤形条件を示す。
【表1】
【0090】
ＧＸ－Ｈ９を含む溶液を表１で言及された剤形条件（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８を除外）のそれぞれのバッファーで限外ろ過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ＵＦ）／透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ＤＦ）を実施した。ｐＨと伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を測定し、バッファーが十分に平衡が到達したことを確認した後、所望の濃度まで濃縮した後、ポロクサマー１８８を添加して目標濃度に合わせた。
【0091】
無菌条件でそれぞれの剤形で作成したＧＸ－Ｈ９試料を０．２μｍポリビニリデンジフロライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＰＶＤＦ）メンブレンを通じてろ過した後、事前に滅菌された脱パイロジェンホウケイ酸バイアル（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ ｖｉａｌｓ）に分配し、栓を閉じた後、アルミニウムシールでクリンピング（ｃｒｉｍｐｉｎｇ）した。その後、各バイアルを安定性試験のためのストレス条件に置いて、所望の時点にサンプルを抽出して、安定性評価を行った（表２）。サンプルの分取量は、適切な分析のために必要に応じて希釈して使用し、残りのサンプルは、バックアップテストのために－７０℃で維持された。表２は、ストレス条件および分析項目の実験条件を示す。
【表2】
【0092】
１－３．濃度（Ａ２８０）、濁度（Ａ３３０）、外観およびｐＨ変化
【0093】
ストレス条件で各剤形の濃度、濁度、目視による外観およびｐＨ変化を確認した。
【0094】
サンプルの濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ＝１．０４ＡＵの吸光係数を使用して２８０ｎｍで吸光度測定によって決定された。確認された最終タンパク質濃度は、散乱に対して修正された（（Ａ２８０－Ａ３３０）／ε２８０＝修正されたタンパク質濃度）。
【0095】
多様なストレス条件後、サンプルのタンパク質濃度、濁度、外観およびｐＨを確認した結果は、表３と表４に示された通りである。多様なストレス条件によるタンパク質濃度、濁度およびｐＨと関連して明確な差異が観察されなかった。多様なストレス条件下ですべての剤形では、目に見える微粒子が観察されなかった。５Ｘ凍結／解凍または２～８℃で３日間振とうストレスを行った結果、いかなる剤形でも識別可能な分析的変化が確認されなかった。
【0096】
表３は、温度ストレス後、濃度、濁度、外観およびｐＨ変化を示す。
【表3】
【0097】
＊Ｃ＝Ｃｌｅａｒ；Ｔ＝Ｔｕｒｂｉｄ；Ｏ＝Ｏｐａｌｅｓｃｅｎｔ（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ）；ＬＹ＝Ｌｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ；ＮＣ＝Ｎｏ Ｃｏｌｏｒ；ＮＰ＝Ｎｏ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ
【0098】
表４は、凍結／解凍および振とうストレス後、濃度、濁度、外観およびｐＨ変化を示す。
【表4】
【0099】
＊Ｃ＝Ｃｌｅａｒ；Ｔ＝Ｔｕｒｂｉｄ；Ｏ＝Ｏｐａｌｅｓｃｅｎｔ（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ）；ＬＹ＝Ｌｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ；ＮＣ＝Ｎｏ Ｃｏｌｏｒ；ＮＰ＝Ｎｏ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ
【0100】
ＧＸ－Ｈ９の目標濃度は、すべてのテスト剤形で達成され、これは、準備後、多くの剤形に対して＜１％の散乱レベルを示した。ストレス反応後、サンプルのタンパク質濃度、濁度、外観およびｐＨを確認した結果、すべてのテスト剤形において多様なストレス条件によるタンパク質濃度、濁度およびｐＨと関連して明確な差異が観察されなかった。
１－４．ＳＥ－ＵＰＬＣ
１－４．ＳＥ－ＵＰＬＣ
【0101】
ＳＥ－ＵＰＬＣ（ゲルろ過クロマトグラフィーともいう）は、サイズによってタンパク質の分子形態を分離する。この方法では、高分子種（例えば、凝集体、ＩｇＧ二量体およびオリゴマー）が所望の（単量体）ＩｇＧ種より先にプレピークで溶離される。低分子種（例えば、分解産物および断片）は、その後、ポストピークで溶離される。
【0102】
ＳＥ－ＵＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ ＳＥＣ、２００Ａ（４．６ｘ３００ｍｍ、１．７μｍ）および１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭアルギニン－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、移動相を使用して行われた。
【0103】
表５は、温度ストレスによるＳＥ－ＵＰＬＣ結果を示す。
【表5】
【0104】
表６は、凍結／解凍および振とうストレスによるＳＥ－ＵＰＬＣ結果を示す。
【表6】
【0105】
－７０℃、２～８℃、２５℃および４５℃で１２週間保管したサンプルのＳＥ－ＵＰＬＣ結果、表５および表６に示されたように、高分子種（ＨＭＷ）および低分子種（ＬＭＷ）が両方とも増加した。安定性終末点の比較結果、さらに高いｐＨに比べてｐＨ６．１でＧＸ－Ｈ９安定性がさらに高く現れた。なお、同じｐＨ６．１剤形のうち１００ｍｇ／ｍＬ剤形が１５０ｍｇ／ｍＬより安定していた。凍結／解凍および２～８℃振とうストレスに露出したとき、すべてのテスト剤形の間に識別可能な傾向が観察されなかったが、その理由は、結果データがｔ＝０結果および検定変動性内で類似していたためである（表５および表６）。
１－５．ＲＰ－ＵＰＬＣ
１－５．ＲＰ－ＵＰＬＣ
【0106】
ＲＰ－ＵＰＬＣは、疎水性の差異によって分子を分離する。分離は、固定相の固定された疎水性リガンドに対する移動相の溶質結合によって変わる。溶出は、一般的に分子疎水性が増加する順に有機溶媒を用いた移動相の疎水性変化で行われる。溶媒勾配分離は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ３００ Ｃ４カラム（２．１ｘ１５０ｍｍ）とともに２２０ｎｍでモニタリングするＵＶ検出器（Ａ２２０）および統合ソフトウェア（Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ７．２）が装着された超高性能液体クロマトグラフィーシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ）を使用して行われた。
【0107】
表７は、温度ストレスによるＲＰ－ＵＰＬＣ結果を示す。
【表7】
【0108】
表８は、凍結／解凍および振とうストレスによるＲＰ－ＵＰＬＣ結果を示す。
【表8】
【0109】
－７０℃、２～８℃、２５℃で１２週間または４５℃で３週間保管したサンプルのＲＰ－ＵＰＬＣ結果、アルギニンおよびグルタミン酸を含有するｐＨ６．１剤形が他の高いｐＨ剤形と比較してさらに優れた安定性を示した。凍結／解凍および２～８℃振とうストレスに露出したとき、すべてのテスト剤形の間に識別可能な傾向が観察されなかったが、その理由は、結果データがｔ＝０結果および検定変動性内で類似していたためである（表７および表８）。
実施例２．ポリソルベート８０の有無によるｈＧＨ－ｈｙＦｃ剤形安定性の評価
実施例２．ポリソルベート８０の有無によるｈＧＨ－ｈｙＦｃ剤形安定性の評価
【0110】
実施例１を通じて最も優れた剤形に選ばれた１０ｍＭのヒスチジン、０．１％（ｗ／ｖ）ポロクサマー１８８、５５ｍＭのアルギニン、５５ｍＭのグルタミン酸、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．１条件でも不溶性異物の生成と微細粒子の増加傾向を示し、ＧＸ－Ｈ９のｈＧＨが疎水性パッチ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐａｔｃｈ）を多く有していて、タンパク質自体が疎水性相互作用による凝集体を形成できるという点とＤＰ容器内気体／オイル／固体表面などにタンパク質が吸着して一種のタンパク質フィルムを形成し、これらが脱離されて作成されたパッチが不溶性粒子で凝集体を形成できるという点に着目し、このような凝集体の形成を防止できる剤形を開発するために、界面活性剤としてポロクサマー１８８だけでなく、ポリソルベート８０と共に添加した液状剤形において凝集体の形成が顕著に改善されることを確認しようとした。
【0111】
ポロクサマー１８８のみを使用する場合に比べて、ポロクサマー１８８とポリソルベート８０を共に使用する場合、不溶性異物および微細粒子の生成をさらによく阻害する結果に基づいて、６０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ－ｈｙＦｃを含む剤形組成物４種においてポロクサマー１８８の濃度を０．１０％（ｗ／ｖ）に固定し、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を添加して、合計８種の剤形に対して外観、微細粒子分析、ＳＥ－ＵＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析を進めた。
２－１．外観分析（不溶性異物の目視検査）
２－１．外観分析（不溶性異物の目視検査）
【0112】
ｈＧＨ－ｈｙＦｃ原液（Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ＤＳ）を用いて多様な剤形組成物を調製し、バイオセーフティキャビネットで０．２２μｍのＰＥＳフィルターでフィルタリングした後、外部由来ダストなどが含まれないようにガラスバイアルに約０．８ｍＬずつ分注した。冷蔵（５℃）および常温（２５℃）で保管中のサンプル容器を取り出して、約３０分間常温化させた後、異物検査台で容器の外部をアルコールなどで表面をきれいに洗浄した後、容器に入っているそのまま目視で直接観察して、６ヶ月間不溶性異物の有無を確認した。
【0113】
その結果、図１に示されたように、冷蔵（５℃）保管時に、ポリソルベート８０が含まれた条件では、６ヶ月間不溶性異物が生成されなかったが、ポリソルベート８０が含まれていない条件では、冷蔵６ヶ月間１０個のうち相当数のサンプルで不溶性異物の生成が確認された。なお、常温（２５℃）保管時、ポリソルベート８０が含まれた条件では、これを含まない条件に比べて概して不溶性異物の生成が阻害されることが示された。特に、候補群（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）＃１および 候補群（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）＃４は、３ヶ月間不溶性異物が生成されなかった。しかしながら、ポリソルベート８０が含まれていない剤形条件では、常温で保管６ヶ月にすべてのバイアルにおいて不溶性異物の生成が確認された。
２－２．微細粒子（Ｓｕｂ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）分析
２－２．微細粒子（Ｓｕｂ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）分析
【0114】
各条件別のサンプルをガラスバイアルに１ｍＬずつ取って準備し、外部会社に依頼して（ＫＢＩＯ、剤形テクニカルサポートチーム）Ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ Ｉｍａｇｉｎｇ装備（ＭＦＩ ５２００，Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ）とＭＦＩ Ｖｉｅｗ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＭＶＳＳ）Ｖｅｒｓｉｏｎ ２－Ｒ４．１．０．４０．４８１６、ＭＦＩ Ｖｉｅｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ（ＭＶＡＳ）Ｖｅｒｓｉｏｎ １．４．０を用いて微細粒子分析を進めた。
【0115】
その結果、図２に示されたように、冷蔵（５℃）保管６ヶ月でポリソルベート８０を含む 候補群（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）＃１、＃２、＃４および＃６が微細粒子の生成をよく阻害することが観察された。微細粒子の生成と関連して、冷蔵および常温の両方でポリソルベート８０を共に含まない剤形では、顕著に高い微細粒子が生成されることが分かった。
２－３．ＳＥ－ＵＰＬＣ分析
２－３．ＳＥ－ＵＰＬＣ分析
【0116】
ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ２００（４．６＊３００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、１８６００５２２６）カラムを使用して１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、移動相溶液を０．２５ｍＬ／ｍｉｎの速度で流し、各条件別のサンプルを１０μｇ注入して、吸光度２８０ｎｍでＧＸ－Ｈ９タンパク質のピークを確認した。
【0117】
その結果、図３のように、冷蔵（５℃）保管および常温（２５℃）保管６ヶ月で 候補群（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）＃２、＃３および＃５の純度は優れていることが確認された。特に、ポリソルベート８０を含む剤形では、 候補群（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）＃２の純度が最も優れていた。ポリソルベート８０を含まない剤形である 候補群（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）＃３、＃５の場合、 候補群（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）＃２と比較して冷蔵保管６ヶ月での純度は類似していたが、常温保管６ヶ月では、純度が相対的に低いことが確認された。
２－４．ＲＰ－ＨＰＬＣ
２－４．ＲＰ－ＨＰＬＣ
【0118】
Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ Ｃ４ ３００Å ５μｍ（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ、８０２０５）カラムを使用して０．０５％ Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ）ｉｎ Ｗａｔｅｒ（ＭＰＡ）、０．０５％ Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ）ｉｎ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（ＭＰＢ）移動相溶液を０．５ｍＬ／ｍｉｎの速度で表９の勾配条件で流し、２０μｇの試料を注入して、吸光度２２０ｎｍでＧＸ－Ｈ９タンパク質のピークを確認した。
【表9】
【0119】
その結果、図４のように、冷蔵（５℃）保管６ヶ月では、すべての剤形間純度が類似していたが、常温（２５℃）保管６ヶ月では、候補群（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）＃４が相対的に最も優れた純度を示した。
実施例３．ポリソルベート８０の含有量によるｈＧＨ－ｈｙＦｃ剤形安定性の評価
実施例３．ポリソルベート８０の含有量によるｈＧＨ－ｈｙＦｃ剤形安定性の評価
【0120】
実施例２を総合して最も適合した剤形と判断される 候補群（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）＃２においてポリソルベート８０の濃度を異ならせてｈＧＨ－ｈｙＦｃの剤形安定性（外観分析、微細粒子分析、ＳＥ－ＵＰＬＣ分析、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析）を実施例２と同じ実験方法で進めた。
【0121】
その結果、外観分析では、常温（２５℃）で３ヶ月以上保管するために０．０７％（ｗ／ｖ）以上のポリソルベート８０をさらに含有する剤形が適していることを確認することができた（図５）。また、微細粒子分析では、ポリソルベート８０の濃度０．０３～０．１５％（ｗ／ｖ）の範囲で概して類似した微細粒子が確認された（図６）。ＳＥ－ＵＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ結果では、冷蔵（５℃）保管時にポリソルベート８０の濃度による有意差がなく、ＳＥ－ＵＰＬＣ結果で常温保管時にポリソルベート８０の濃度が０．１０％（ｗ／ｖ）以上のとき、純度が減少し、ＲＰ－ＨＰＬＣ結果では、常温保管時にポリソルベート８０の濃度による純度差が大きくなかった（図７）。
実施例４．高用量ｈＧＨ－ｈｙＦｃ剤形安定性の評価
実施例４．高用量ｈＧＨ－ｈｙＦｃ剤形安定性の評価
【0122】
前記実施例を総合して、（ｉ）ポリソルベート８０を０．０７％（ｗ／ｖ）に固定し、ｈＧＨ－ｈｙＦｃをそれぞれ６０、８０、１００、１２０ｍｇ／ｍｌ処理してガラスカートリッジに保管する場合、（ｉｉ）ｈＧＨ－ｈｙＦｃを１２０ｍｇ／ｍｌに固定し、ポリソルベート８０をそれぞれ０．０３、０．０５、０．０７、０．１０、０．１５％（ｗ／ｖ）処理してガラスカートリッジに保管する場合、（ｉｉｉ）ｈＧＨ－ｈｙＦｃを６０ｍｇ／ｍｌおよびポリソルベート８０の０．０７％（ｗ／ｖ）に固定し、それぞれｍ－クレゾール、フェノールまたはベンジルアルコールの保存剤を処理してガラスバイアルに保管する場合に対して、冷蔵（５℃）および常温（２５℃）保管による外観分析を通じて不溶性異物が観察されるかを確認し、純度変化を確認して、剤形安定性を評価しようとした。
４－１．外観分析（不溶性異物の目視検査）
４－１．外観分析（不溶性異物の目視検査）
【0123】
ｈＧＨ－ｈｙＦｃ原液（ＤＳ）を用いて多様な剤形組成物を調製し、バイオセーフティキャビネットで０．２２μｍのＰＥＳフィルターでフィルタリング後、外部由来ダストなどが含まれないようにガラスバイアルに約１．０ｍＬずつ分注した。冷蔵（５℃）および常温（２５℃）で保管中のサンプル容器を取り出して約３０分間常温化させた後、異物検査対で容器の外部をアルコールなどで表面をきれいに洗浄した後、容器に入っているそのまま目視で直接観察して、６ヶ月間不溶性異物の有無を確認した。
【0124】
その結果、（ｉ）ポリソルベート８０の０．０７％（ｗ／ｖ）に固定し、ｈＧＨ－ｈｙＦｃを６０～１００ｍｇ／ｍｌ処理してガラスカートリッジに保管する場合、冷蔵および常温６ヶ月間不溶性異物が生成されないことが確認され、（ｉｉ）ｈＧＨ－ｈｙＦｃを１２０ｍｇ／ｍｌに固定し、ポリソルベート８０をそれぞれ０．０５～０．１５％（ｗ／ｖ）処理してガラスカートリッジに保管する場合、冷蔵および常温６ヶ月間不溶性異物が生成されないことが確認され、（ｉｉｉ）ｈＧＨ－ｈｙＦｃを６０ｍｇ／ｍｌおよびポリソルベート８０を０．０７％（ｗ／ｖ）に固定し、１ｍｇ／ｍＬフェノールを保存剤で処理してガラスバイアルに保管する場合、冷蔵および常温６ヶ月間不溶性異物が生成されないことが確認された（図８）。
４－２．ＳＥ－ＵＰＬＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣ分析
４－２．ＳＥ－ＵＰＬＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣ分析
【0125】
各条件によるサンプルをガラスカートリッジまたはガラスバイアルから取って、移動相バッファーおよび剤形バッファーを用いて２ｍｇ／ｍＬで希釈した後、０．２２μｍセルロースアセテート遠心分離用チューブフィルターでろ過後、ＬＣバイアルに入れてＳＥ－ＵＰＬＣまたはＲＰ－ＨＰＬＣ分析を行った。
【0126】
ＳＥ－ＵＰＬＣは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ２００（４．６＊３００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、１８６００５２２６）カラムを使用して１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２００ｍＭのアルギニン－ＨＣｌ、移動相溶液を０．２５ｍＬ／ｍｉｎの速度で流し、１０μｇ注入して、吸光度２８０ｎｍでＧＸ－Ｈ９タンパク質のピークを確認した。
【0127】
ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ Ｃ４ ３００Å ５μｍ（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ、８０２０５）カラムを使用して０．０５％ Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ）ｉｎ Ｗａｔｅｒ（ＭＰＡ）、０．０５％ Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＴＦＡ）ｉｎ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（ＭＰＢ）移動相溶液を０．５ｍＬ／ｍｉｎの速度で表９の勾配条件で流し、２０μｇの試料を注入して、吸光度２２０ｎｍでＧＸ－Ｈ９タンパク質のピークを確認した。
【0128】
その結果、（ｉ）ポリソルベート８０の０．０７％（ｗ／ｖ）に固定し、ｈＧＨ－ｈｙＦｃを６０－１２０ｍｇ／ｍｌ処理してガラスカートリッジに保管する場合、ＳＥ－ＵＰＬＣで冷蔵（５℃）保管時にｈＧＨ－ｈｙＦｃ用量６０ｍｇ／ｍＬと１２０ｍｇ／ｍＬ間の純度差０．５％と僅かであるが、常温（２５℃）保管時には、ｈＧＨ－ｈｙＦｃ用量６０ｍｇ／ｍＬと１２０ｍｇ／ｍＬ間の純度差が３．６％と確認された。なお、常温保管時にｈＧＨ－ｈｙＦｃ用量６０ｍｇ／ｍＬと１２０ｍｇ／ｍＬ間のＲＰ－ＨＰＬＣによる純度差が０．８％と僅かであった（図９ａ）。
【0129】
（ｉｉ）ｈＧＨ－ｈｙＦｃを１２０ｍｇ／ｍｌに固定し、ポリソルベート８０をそれぞれ０．０３～０．１５％（ｗ／ｖ）処理してガラスカートリッジに保管する場合には、冷蔵保管時にポリソルベート８０の濃度０．０３％（ｗ／ｖ）と０．１５％（ｗ／ｖ）間の純度差がなく、常温保管時にポリソルベート８０の濃度０．０３％（ｗ／ｖ）と０．１５％（ｗ／ｖ）間の差も僅かであった（図９ｂ）。
【0130】
（ｉｉｉ）ｈＧＨ－ｈｙＦｃを６０ｍｇ／ｍｌおよびポリソルベート８０の０．０７％（ｗ／ｖ）に固定し、それぞれｍ－クレゾール、フェノールまたはベンジルアルコールの保存剤を処理してガラスバイアルに保管する場合においては、ＳＥ－ＵＰＬＣ結果、１ｍｇ／ｍｌフェノールを含有する条件で純度が最も少なく減少し、ＲＰ－ＨＰＬＣ結果では、すべての保存剤において純度に有意差がなかった（図９ｃ）。
【0131】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は、ただ好ましい実施様態であり、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明白だろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
[配列目録プレテキスト]
1. GX-H9 (hGH-hyFc5)
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Arg
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
Ser Leu Gly Lys
2. hGH (GenBank: AAA98618.1) (シグナル配列除外)
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
3. hyFc5
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His
Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
Leu Ser Leu Gly Lys
[配列目録プレテキスト]
1. GX-H9 (hGH-hyFc5)
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Arg
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
Ser Leu Gly Lys
2. hGH (GenBank: AAA98618.1) (シグナル配列除外)
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
3. hyFc5
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His
Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
Leu Ser Leu Gly Lys
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【配列表】
【国際調査報告】