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特表2025-503046Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）結合金クラスターＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４、その組成物及び利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-01-30
(54)【発明の名称】Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）結合金クラスターＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４、その組成物及び利用
(51)【国際特許分類】
A61K 33/242 20190101AFI20250123BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20250123BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20250123BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20250123BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20250123BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20250123BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20250123BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20250123BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20250123BHJP
【ＦＩ】
A61K33/242
A61P25/00
A61P25/28
A61P25/16
A61P27/06
A61P1/16
A61P3/10
A61K9/10
A61K47/69
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024543134
(86)(22)【出願日】2022-01-20
(85)【翻訳文提出日】2024-09-18
(86)【国際出願番号】 CN2022073051
(87)【国際公開番号】W WO2023137672
(87)【国際公開日】2023-07-27
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519000526
【氏名又は名称】深▲セン▼深見医薬科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＰＲＯＦＯＵＮＤ ＶＩＥＷ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３３１１， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ９Ａ，Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ＩＩ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｂａｙ Ｅｃｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐａｒｋ， Ｎｏ． ３６０９， Ｂａｉｓｈｉ Ｒｏａｄ， Ｈｉｇｈ－ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ， Ｙｕｅｈａｉ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｎａｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０００ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】110003845
【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲孫▼ 涛▲塁▼
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA16
4C076CC01
4C076CC10
4C076CC16
4C076CC21
4C076CC41
4C076DD51
4C076FF36
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA01
4C086HA28
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA21
4C086NA03
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA16
4C086ZA33
4C086ZA75
4C086ZC35
(57)【要約】
Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）結合金クラスターＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、又は緑内障の治療のためのその使用、及び多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、又は緑内障の治療用の医薬を製造するためのその使用。多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、又は緑内障を治療するための組成物及び方法。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）結合金クラスター分子であって、金コアと、
前記金コアに結合されたリガンドＬ－ＮＩＢＣと、
を含み、Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の式を有する、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子。
【請求項2】
被験体における疾患の治療用の医薬の製造に使用するための、請求項１に記載のＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４。
【請求項3】
前記疾患は、多発性硬化症である、請求項２に記載の使用。
【請求項4】
前記疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項２に記載の使用。
【請求項5】
前記疾患は、肝硬変である、請求項２に記載の使用。
【請求項6】
前記疾患は、糖尿病である、請求項２に記載の使用。
【請求項7】
前記疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）である、請求項２に記載の使用。
【請求項8】
前記疾患は、緑内障である、請求項２に記載の使用。
【請求項9】
請求項１に記載のＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を含む組成物であって、被験体における疾患を治療するために使用される、組成物。
【請求項10】
前記Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４が前記組成物中の金クラスター分子の混合物中の成分として使用される場合、前記Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４は、前記混合物中の少なくとも７％のクロマトグラフィー含有量を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記疾患は、多発性硬化症である、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項13】
前記疾患は、肝硬変である、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項14】
前記疾患は、糖尿病である、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項15】
前記疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）である、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項16】
前記疾患は、緑内障である、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項17】
被験体における疾患を治療する方法であって、前記被験体に組成物を投与することを含み、ここで、前記組成物は、請求項１に記載のＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を含む、方法。
【請求項18】
前記Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４が前記組成物中の金クラスター分子の混合物中の成分として使用される場合、前記Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４は、前記混合物中の少なくとも７％のクロマトグラフィー含有量を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記疾患は、多発性硬化症である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項20】
前記疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項21】
前記疾患は、肝硬変である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項22】
前記疾患は、糖尿病である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項23】
前記疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項24】
前記疾患は、緑内障である、請求項１７又は１８に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、金クラスター（ＡｕＣ）、特にＬ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を含む組成物、様々な疾患の治療用の薬剤を調製するための金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の使用、並びに金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４及び組成物を使用して様々な疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
金クラスター（ＡｕＣ）とは、リガンド結合金コアを含み、金コアの直径が３ｎｍ未満である物質の一種を指す。金クラスターはエネルギー準位の分裂により分子のような特性を示すため、金クラスター内の各金クラスター分子は分子式によって表すことができる。しかしながら、金クラスターでは、金クラスター分子の金原子の数は２から１０００にまで及ぶ場合があり、リガンドの数も１から１０００にまで及ぶ場合がある。状況を更に複雑にしているのは、金クラスターが同数の金原子を有するとしても、リガンドの種類及び調製条件によってリガンドの数が変動することである。したがって、同じリガンド結合金クラスター内に存在する可能性のある、特定の数の金原子と特定の数のリガンドとを有する金クラスター分子については不明なままである。
【発明の概要】
【0003】
本発明は、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４、被験体における疾患の治療に使用するためのＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を含む組成物、及びＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を用いて被験体における疾患を治療する方法を提供する。
【0004】
或る特定の実施の形態において、本発明は、Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）結合金クラスター分子であって、金コアと金コアに結合されたリガンドＬ－ＮＩＢＣとを含み、Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の式を有する、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子を提供する。
【0005】
或る特定の実施の形態において、本発明は、被験体における疾患の治療用の医薬の製造に使用するためのＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を提供する。或る特定の実施の形態において、疾患としては、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、及び緑内障が挙げられる。
【0006】
或る特定の実施の形態において、本発明は、被験体における疾患の治療用の組成物であって、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を含む、組成物を提供する。或る特定の実施の形態において、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４が組成物中の金クラスター分子の混合物中の成分として使用される場合、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４は、混合物中の少なくとも７％のクロマトグラフィー含有量を有する。或る特定の実施の形態において、疾患としては、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、及び緑内障が挙げられる。
【0007】
或る特定の実施の形態において、本発明は、被験体における疾患を治療する方法であって、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を含む組成物を被験体に投与することを含み、疾患が多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、２型糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、及び緑内障からなる群から選択される疾患である、方法を提供する。
【0008】
本発明の目的及び利点は、添付の図面と関連した本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【0009】
次に、本発明による好ましい実施形態を、図面を参照して説明する。図面において、同様の参照符号は同様の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び質量スペクトルを示す図である。図１ＡはＳ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）のＳＥＣを示し、図１ＢはＳ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）のＥＳＩ質量スペクトル（広範囲）を示し、図１Ｃ～図１Ｆは様々な質量電荷比（Ｍ／ｚ）を有する質量スペクトルピークを増幅した後に表示された質量スペクトル同位体ピークを示し、ここで、図１Ｃにおいて、ｚ＝－２、図１Ｄにおいて、ｚ＝－３、図１Ｅにおいて、ｚ＝－４、図１Ｆにおいて、ｚ＝－５である。
【図2】Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）の典型的なＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトルを示す図である。
【図3】Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）の赤外吸収スペクトル（上のスペクトル）及びリガンドＬ－ＮＩＢＣの赤外吸収スペクトル（下のスペクトル）を示す図である。
【図4】初期水溶液のｐＨ値の変化に伴う水相及び油相におけるＳ８薬物の分布の変化を示す図である。
【図5】ＥＡＥモデル薬物試験の行動臨床スコアを示す図である。
【図6-1】ＥＡＥマウスモデルにおけるＨＥ染色実験の結果を示す図である。図６Ａは、例示的な薬物投与群の組織学的スコアの統計結果であり、ここで、＃＃＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．００１）、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、図６Ｂ～図６Ｆは、ブランクコントロール群、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群のそれぞれの例示的な画像である。
【図7】ＥＡＥモデル薬物試験におけるＳ８薬物、Ｓ９薬物、及びＳ９＋Ｓ８薬物の行動臨床スコアを示す図である。
【図8-1】Ｓ１、Ｓ２、Ｓ８、及びＳ９の１８０日間連続の薬物投与が雄マウスのモリス水迷路試験におけるパフォーマンスに対して及ぼす効果を示す図である。図８Ａは位置ナビゲーション実験（positioning navigation experiment）の訓練中のプラットフォーム探索潜時を示し、図８Ｂはプラットフォーム横断回数を示し、図８Ｃは標的象限での水泳距離を示し、図８Ｄは標的象限での滞在時間を示し、ここで、＃：正常ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＃＃：正常ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）。
【図9】ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックＡＤモデルマウスの海馬内及び皮質内のＡβ１－４０プラークの形成に対する様々な金クラスター薬物の効果を示す図である。ここで、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＄：Ｓ９薬物投与群との比較（Ｐ＜０．０５）。
【図10-1】５ｘＦＡＤトランスジェニックマウスモデルにおける脳内Ａβプラーク形成に対する薬物の効果を示す図である。図１０Ａは大脳皮質内のＡβプラーク数を示し、図１０Ｂは海馬領域内のＡβプラーク数を示し、図１０Ｃはモデルコントロール群におけるマウスの大脳皮質内のＡβプラークの例示的な画像を示し、図１０ＤはＳ８薬物投与群におけるマウスの大脳皮質内のＡβプラークの例示的な画像を示し、図１０Ｅはモデルコントロール群におけるマウスの海馬内のＡβプラークの例示的な画像を示し、図１０ＦはＳ８薬物投与群におけるマウスの海馬内のＡβプラークの例示的な画像を示し、ここで、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＄：Ｓ９薬物投与群との比較（Ｐ＜０．０５）。
【図11-1】５ｘＦＡＤトランスジェニックＡＤモデルマウスの脳皮質内及び海馬領域内のＩｂａ１＋陽性細胞及びＧＦＡＰ＋細胞の数に対する薬物の効果を示す図である。図１１Ａは脳皮質内のＩｂａ１＋陽性細胞の数を示し、図１１Ｂは海馬内のＩｂａ１＋陽性細胞の数を示し、図１１Ｃは脳皮質内のＧＦＡＰ＋陽性細胞の数を示し、図１１Ｄは海馬内のＧＦＡＰ＋陽性細胞の数を示し、ここで、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＄：Ｓ９との比較（Ｐ＜０．０５）。
【図12-1】ＣＣｌ４でモデリングする肝硬変モデルマウスにおける血清指標に対する薬物の効果を示す図である。図１２ＡはＡＬＴの血清レベルを示し、図１２ＢはＡＳＴの血清レベルを示し、図１２ＣはＴＢＩＬの血清レベルを示し、図１２ＤはＭＡＯの血清レベルを示し、図１２ＥはＡＬＢの血清レベルを示し、ここで、＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＃＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＄：Ｓ９薬物投与群との比較（Ｐ＜０．０５）。
【図13-1】様々な薬物が投与されたＣＣｌ４でモデリングする肝硬変モデルマウスの肝臓組織の例示的なＨＥ染色画像及び病理学的スコアを示す図である。図１３Ａはブランクコントロール群を示し、図１３Ｂはモデルコントロール群を示し、図１３ＣはＳ１薬物投与群を示し、図１３ＤはＳ８薬物投与群を示し、図１３ＥはＳ９薬物投与群を示し、図１３Ｆは病理学的スコアを示し、ここで、＃＃＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．００１）、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＄：Ｓ９薬物投与群との比較（Ｐ＜０．０５）。
【図14】マウス糖尿病モデルにおける同時にモデリング及び薬物投与を行うプロトコルＩからの空腹時血糖値及び耐糖能レベルの結果を示す図である。図１４Ａは空腹時血糖値を示し、図１４Ｂは胃内ブドウ糖投与後の様々な時点での耐糖能レベルを示し、ここで、＃＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）。
【図15】モデリング後に薬物を様々な様式で投与するプロトコルＩＩからの空腹時血糖及び耐糖能の結果を示す図である。図１５Ａは急性薬物投与後の耐糖能の結果を示し、図１５Ｂは１ヶ月連続の薬物投与後の空腹時血糖の結果を示し、図１５Ｃは２ヶ月連続の薬物投与後の空腹時血糖の結果を示し、図１５Ｄは２ヶ月連続の薬物投与後の耐糖能の結果を示し、ここで、＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＃＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＄：Ｓ９薬物投与群との比較（Ｐ＜０．０５）。
【図16-1】同時にモデリング及び薬物投与を行うプロトコルＩからのインスリン免疫組織化学の結果を示す図である。図１６Ａはブランクコントロール群の例示的な画像を示し、図１６Ｂはモデルコントロール群の例示的な画像を示し、図１６ＣはＳ８薬物投与群の例示的な画像を示し、図１６Ｄは平均光学密度を示し、ここで、＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、図１６Ｅは、ブランクコントロール群のＨＥ染色の例示的な画像を示し、図１６Ｆは、モデルコントロール群のＨＥ染色の例示的な画像を示し、図１６Ｇは、Ｓ２薬物投与群のＨＥ染色の例示的な画像を示す。
【図17-1】ＭＰＴＰ損傷誘発ＰＤモデルマウスの行動に対する薬物の効果の結果を示す図である。図１７Ａは移動距離を示し、図１７Ｂは移動速度を示し、図１７Ｃは水泳距離を示し、図１７Ｄは水泳時間を示し、図１７Ｅは落下潜時を示し、図１７Ｆは落下率を示し、ここで、＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＃＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＃＃＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．００１）、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．００１）、＄：Ｓ９薬物投与群との比較（Ｐ＜０．０５）。
【図18】ＭＰＴＰ損傷誘発ＰＤモデルにおけるマウス脳内線条体内のＴＨ発現に対する薬物の効果のＷＢ試験結果を示す図である。ここで、＃＃：ブランクコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．００１）、＄：Ｓ９薬物投与群との比較（Ｐ＜０．０５）。
【図19-1】虚血再灌流動物モデルにおけるラットＥＲＧ ＤＡ３．０及びＤＡ１０．０に対する様々な薬物の効果を示す図である。図１９Ａはモデリング後の７日目（Ｄ８）でのモデルコントロール群におけるラットの左眼（正常な眼）（右パネル）及び右眼（モデリングする眼）（左パネル）での例示的なＥＲＧ（ＤＡ３．０）を示し、図１９Ｂ及び図１９Ｃはそれぞれ各群におけるラットの右眼での全視野ＥＲＧ ＤＡ３．０及びＤＡ１０．０のｂ波振幅の結果を示し、図１９Ｄは投与後の７日目（Ｄ８）でのＳ８薬物投与群におけるラットの左眼（正常な眼）（右パネル）及び右眼（モデリング及び薬物投与する眼）（左パネル）での例示的なＥＲＧ ＤＡ３．０を示し、ここで、＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０５）、＊＊：モデルコントロール群との比較（Ｐ＜０．０１）、＄：Ｓ９薬物投与群との比較。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、本発明の或る特定の実施形態の以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解され得る。
【0012】
本出願全体を通じて、出版物が参照される場合、本発明の属する技術水準をより完全に説明するのに、これらの出版物の開示内容は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【0013】
本明細書において使用される場合、「投与」とは、被験体への、経口（「ｐｏ」）投与、坐剤としての投与、局所接触、静脈内（「ｉｖ」）投与、腹腔内（「ｉｐ」）投与、筋肉内（「ｉｍ」）投与、病巣内投与、海馬内投与、脳室内投与、鼻内投与、若しくは皮下（「ｓｃ」）投与、又は徐放性デバイス、例えばミニ浸透圧ポンプ若しくは侵食性インプラントの埋め込みを意味する。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、経口、経鼻、膣内、直腸内、又は経皮）を含むあらゆる経路によって行われる。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、及び頭蓋内が挙げられる。その他の送達方式としては、限定されるものではないが、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチ等の使用が挙げられる。
【0014】
「全身投与」及び「全身投与される」という用語は、化合物又は組成物が循環系を介して薬学的作用の標的部位を含む体内の部位に送達されるように、化合物又は組成物を哺乳動物に投与する方法を指す。全身投与としては、限定されるものではないが、経口投与、鼻内投与、直腸内投与、及び非経口投与（すなわち、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮、及び皮下等の消化管を介する以外）が挙げられるが、但し、本明細書において使用される場合、全身投与には、髄腔内注射及び頭蓋内投与等の循環系を経由する以外の手段による脳領域への直接投与は含まれない。
【0015】
本明細書において使用される場合、「治療する」及び「治療」という用語は、その用語が適用される疾患若しくは病態、又はそのような疾患若しくは病態の１つ以上の症状のいずれかの発症を遅らせ、進行を遅滞若しくは退行させ、又は緩和若しくは予防することを指す。
【0016】
「患者」、「被験体」、又は「個体」という用語は、哺乳動物、例えばヒト、又は霊長類（例えば、マカク、パン・トログロダイト（pan troglodyte）、ポンゴ）、飼い慣らされた哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ）、農業哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ）、及び実験用哺乳動物若しくは齧歯類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット）を含む非ヒト哺乳動物を区別なく指す。
【0017】
本発明は、Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）結合金クラスター分子を提供する。Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子は、金コアと、金コアに結合されたリガンドＬ－ＮＩＢＣとを含む。Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子は、Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の式を有する。
【0018】
本発明は、被験体における疾患の治療に使用するためのＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を提供する。疾患としては、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、及び緑内障が挙げられる。
【0019】
本発明は、被験体における疾患の治療に使用するための組成物を提供する。疾患としては、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、及び緑内障が挙げられる。
【0020】
本発明は、組成物を被験体に投与することによる、被験体における疾患を治療する方法を提供する。疾患としては、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、及び緑内障が挙げられる。
【0021】
或る特定の実施形態において、組成物は、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を含む。
【0022】
或る特定の実施形態において、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４が組成物における金クラスター分子の混合物中の成分として使用される場合、混合物中のＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４は、少なくとも７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のクロマトグラフィー含有量を有する。
【0023】
或る特定の実施形態において、組成物は薬学的に許容可能な添加剤を更に含む。或る特定の実施形態において、添加剤はリン酸緩衝溶液又は生理学的食塩水である。
【0024】
本発明は、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、又は緑内障の治療用の薬剤を製造するための、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の使用を提供する。
【0025】
或る特定の実施形態において、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の投薬量は、少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ／日、０．００５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．５ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日、２ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、４ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、６ｍｇ／ｋｇ／日、７ｍｇ／ｋｇ／日、８ｍｇ／ｋｇ／日、９ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日、６０ｍｇ／ｋｇ／日、７０ｍｇ／ｋｇ／日、８０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日、３００ｍｇ／ｋｇ／日、４００ｍｇ／ｋｇ／日、５００ｍｇ／ｋｇ／日、６００ｍｇ／ｋｇ／日、７００ｍｇ／ｋｇ／日、８００ｍｇ／ｋｇ／日、９００ｍｇ／ｋｇ／日、又は１０００ｍｇ／ｋｇ／日である。各疾患について有効な投薬量を日常的な臨床試験によって突き止めることができる。
【0026】
以下の実施例は本発明の原理を説明することのみを目的として提供されており、これらは決して本発明の範囲を制限することを意図したものではない。
【0027】
実施形態
実施形態１．試料の調製
１．１．プロトコルＩ
氷浴及び撹拌の条件下で、塩化金酸の含有量が５ｇである２５００ｍｌの塩化金酸の無水メタノール溶液を反応器に加えた後、５００ｍｌの酢酸を加えた。十分に冷却した後、Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）の含有量が３６ｇである５００ｍｌのＬ－ＮＩＢＣのメタノール溶液を加えた。６０分間反応させた後、ＮａＢＨ４の含有量が４０ｇである１５００ｍｌのＮａＢＨ４のエタノール溶液を撹拌しながら加えた。このとき、溶液は素早く褐色がかった黒色に変わり、大量のガスが発生することとなる。３０分間反応させた後、５０００ｍｌのアセトンを加えて反応を止めたところ、生成物が沈殿した。遠心分離機で遠心分離した後、下方の沈殿物を採取し、上方の上清を捨てた。遠心分離により得られた沈殿物を５００ｍｌの超純水中に溶解し、室温２５℃及び中性条件下で７日間寝かせた。次いで、５００ダルトンの保持分子量を有する透析バッグを用いて超純水中で透析し、毎日水を交換した。７日後、透析バッグをほどき、バッグ内の溶液を収集した。収集した溶液を凍結乾燥して金クラスター粗生成物を得た。
実施形態１．試料の調製
１．１．プロトコルＩ
氷浴及び撹拌の条件下で、塩化金酸の含有量が５ｇである２５００ｍｌの塩化金酸の無水メタノール溶液を反応器に加えた後、５００ｍｌの酢酸を加えた。十分に冷却した後、Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）の含有量が３６ｇである５００ｍｌのＬ－ＮＩＢＣのメタノール溶液を加えた。６０分間反応させた後、ＮａＢＨ４の含有量が４０ｇである１５００ｍｌのＮａＢＨ４のエタノール溶液を撹拌しながら加えた。このとき、溶液は素早く褐色がかった黒色に変わり、大量のガスが発生することとなる。３０分間反応させた後、５０００ｍｌのアセトンを加えて反応を止めたところ、生成物が沈殿した。遠心分離機で遠心分離した後、下方の沈殿物を採取し、上方の上清を捨てた。遠心分離により得られた沈殿物を５００ｍｌの超純水中に溶解し、室温２５℃及び中性条件下で７日間寝かせた。次いで、５００ダルトンの保持分子量を有する透析バッグを用いて超純水中で透析し、毎日水を交換した。７日後、透析バッグをほどき、バッグ内の溶液を収集した。収集した溶液を凍結乾燥して金クラスター粗生成物を得た。
【0028】
金クラスター粗生成物は、様々な分子式を有する多くの金クラスター分子を含み得るが、金クラスター粗生成物中に実際にどのような金クラスター分子が含まれているかは全く分からない。金クラスター粗生成物中の特定の金クラスター分子の実際の含有量又はその治療効果に関しては知る方法がなく、これらの未知の要因が金クラスター粗生成物の創薬可能性及び新薬適用に大きな困難をもたらす。したがって、金クラスター粗生成物中に含まれる様々な成分を分離する必要がある。この目的のために、上記の金クラスター粗生成物を水中に溶解し、分取クロマトグラフィーによって分離し、異なる保持時間を有する画分を流出時間に応じて収集した。各画分をそれぞれ５００ダルトンの透析バッグを用いて透析し、凍結乾燥後に一連の金クラスター試料を得た。幾つかの試料を選択し、各試料中の主成分の分子式を超高分解能磁気共鳴質量分析法（Bruker Daltonics、Ｓｏｌａｒｉｘ ７．０Ｔ ＥＳＩ）と他の方法とを組み合わせることによって決定した。それらの分子式は以下の通りである：
試料１（Ｓ１）：主成分としてＡｕ２５（Ｌ－ＮＩＢＣ）１８、
試料２（Ｓ２）：主成分としてＡｕ４（Ｌ－ＮＩＢＣ）４、
試料３（Ｓ３）：主成分としてＡｕ７（Ｌ－ＮＩＢＣ）５、
試料４（Ｓ４）：主成分としてＡｕ１０（Ｌ－ＮＩＢＣ）６、
試料５（Ｓ５）：主成分としてＡｕ５（Ｌ－ＮＩＢＣ）５、
試料６（Ｓ６）：主成分としてＡｕ１１（Ｌ－ＮＩＢＣ）９、
試料７（Ｓ７）：主成分としてＡｕ１３（Ｌ－ＮＩＢＣ）９、
試料８（Ｓ８）：主成分としてＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４、
比較の便宜上、金クラスターの粗生成物を実験に含め、以下のように指定した：
試料９（Ｓ９）：金クラスター粗生成物の３つのバッチの混合物。
試料１（Ｓ１）：主成分としてＡｕ２５（Ｌ－ＮＩＢＣ）１８、
試料２（Ｓ２）：主成分としてＡｕ４（Ｌ－ＮＩＢＣ）４、
試料３（Ｓ３）：主成分としてＡｕ７（Ｌ－ＮＩＢＣ）５、
試料４（Ｓ４）：主成分としてＡｕ１０（Ｌ－ＮＩＢＣ）６、
試料５（Ｓ５）：主成分としてＡｕ５（Ｌ－ＮＩＢＣ）５、
試料６（Ｓ６）：主成分としてＡｕ１１（Ｌ－ＮＩＢＣ）９、
試料７（Ｓ７）：主成分としてＡｕ１３（Ｌ－ＮＩＢＣ）９、
試料８（Ｓ８）：主成分としてＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４、
比較の便宜上、金クラスターの粗生成物を実験に含め、以下のように指定した：
試料９（Ｓ９）：金クラスター粗生成物の３つのバッチの混合物。
【0029】
１．２．プロトコルＩＩ
氷浴及び撹拌の条件下で、塩化金酸の含有量が５グラムである１３００ｍｌの塩化金酸の無水メタノール溶液を反応器に加えた後、２００ｍｌの酢酸を加え、Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）の含有量が１２グラムである３００ｍｌのＬ－ＮＩＢＣのメタノール溶液を加え、１ｍｌの超純水を加え、撹拌しながら３０分間反応させた後、ＮａＢＨ４の含有量が１８グラムである５００ｍｌのＮａＢＨ４のメタノール溶液を加え、このとき、溶液は素早く褐色がかった黒色に変わり、大量のガスが発生することとなり、３０分間反応させた後、３０００ｍｌのアセトンを加えて反応を止めたところ、生成物が沈殿した。遠心分離機で遠心分離した後、下方の沈殿物を採取し、上方の上清を捨てた。遠心分離により得られた沈殿物を５００ｍｌの超純水中に溶解し、酸性条件下で２５℃にて７日間寝かせた。遠心分離後に沈殿物を捨てた。次いで、５００ダルトンの保持分子量を有する透析バッグを用いて弱酸性水中で上清を透析し、毎日水を交換した。７日後、透析バッグをほどき、バッグ内の溶液を収集した。収集した溶液を凍結乾燥して金クラスター粗生成物を得た。試料中の主成分の分画及び分子式の決定を上記１．１のプロトコルＩに記載されるように実施した。この結果により、Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４が検出されないことが明らかとなった。
氷浴及び撹拌の条件下で、塩化金酸の含有量が５グラムである１３００ｍｌの塩化金酸の無水メタノール溶液を反応器に加えた後、２００ｍｌの酢酸を加え、Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）の含有量が１２グラムである３００ｍｌのＬ－ＮＩＢＣのメタノール溶液を加え、１ｍｌの超純水を加え、撹拌しながら３０分間反応させた後、ＮａＢＨ４の含有量が１８グラムである５００ｍｌのＮａＢＨ４のメタノール溶液を加え、このとき、溶液は素早く褐色がかった黒色に変わり、大量のガスが発生することとなり、３０分間反応させた後、３０００ｍｌのアセトンを加えて反応を止めたところ、生成物が沈殿した。遠心分離機で遠心分離した後、下方の沈殿物を採取し、上方の上清を捨てた。遠心分離により得られた沈殿物を５００ｍｌの超純水中に溶解し、酸性条件下で２５℃にて７日間寝かせた。遠心分離後に沈殿物を捨てた。次いで、５００ダルトンの保持分子量を有する透析バッグを用いて弱酸性水中で上清を透析し、毎日水を交換した。７日後、透析バッグをほどき、バッグ内の溶液を収集した。収集した溶液を凍結乾燥して金クラスター粗生成物を得た。試料中の主成分の分画及び分子式の決定を上記１．１のプロトコルＩに記載されるように実施した。この結果により、Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４が検出されないことが明らかとなった。
【0030】
実施形態２．Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）の特性評価
分子式Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４は、超高分解能質量分析法によって与えられたＳ８の典型的な分子式である。Ｌ－ＮＩＢＣにはカルボキシル基が存在するため、異なる溶液又は溶媒中では、ｐＨ値の違い及び溶液又は溶媒中の金属カチオン又は他のカチオンの存在により、異なる数の水素イオンが対応する金属カチオン又は他のカチオンによって置き換えられる可能性がある。
分子式Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４は、超高分解能質量分析法によって与えられたＳ８の典型的な分子式である。Ｌ－ＮＩＢＣにはカルボキシル基が存在するため、異なる溶液又は溶媒中では、ｐＨ値の違い及び溶液又は溶媒中の金属カチオン又は他のカチオンの存在により、異なる数の水素イオンが対応する金属カチオン又は他のカチオンによって置き換えられる可能性がある。
【0031】
図１は、Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び質量スペクトルを示している。図１Ａに示されるように、Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）のＳＥＣスペクトルにより最大９９．５４％の純度が明らかとなる。図１Ｂは、Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）の大規模ＥＳＩ質量スペクトルを示し、スペクトルが非常にきれいであることを示していることから、これは不純物が殆どないことを示している。図１Ｃ～図１Ｆは、様々な質量電荷比（Ｍ／ｚ）を有するＳ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）の質量スペクトル同位体ピークを示している。
【0032】
【0033】
図３は、Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）の赤外吸収スペクトル（上のスペクトル）及びリガンドＬ－ＮＩＢＣの赤外吸収スペクトル（下のスペクトル）を示している。２５００ｃｍ－１付近に位置するリガンドＬ－ＮＩＢＣのチオール基（－ＳＨ）の吸収特性ピークはＳ８ではもはや見えないのに対し（ボックス内に示される）、他の官能基の特性吸収ピークは依然として存在していることが見て取れることから、これは、Ｓ８におけるリガンドＬ－ＮＩＢＣがチオール基を介して金原子に結合していることを示している。
【0034】
様々なｐＨ値を有する水溶液中のＳ８薬物の親水性特性／親油性特性を調べるのに、１０ｍｇのＳ８薬物を１０ｍｌの様々なｐＨ値を有する水溶液中に溶解し（超純水に５ＭのＨＣｌを加えてそのｐＨ値を１～７の範囲に調整し、特定のｐＨ値をｐＨメーターにより測定し、測定されたｐＨ値を初期水溶液のｐＨ値として定義する）、次いで、１０ｍｌのｎ－オクタノールをそれぞれ水溶液の上部に加え、水溶液及びｎ－オクタノールを振盪により完全に混合し、次いで、ｎ－オクタノール相及び水相が２層に分離するまで静置した。上方のｎ－オクタノール相及び下方の水相中の金の重量比濃度（ｐｐｍ）をグラファイト炉原子吸光光度計により測定し、脂質－水分配係数Ｐを式（１）：
ｌｏｇＰ＝ｌｏｇ（Ｃｏ／Ｃｗ）（１）
（式中、Ｃｏ及びＣｗはそれぞれ油相中及び水相中のＳ８薬物の濃度を表す）に従って計算した。
ｌｏｇＰ＝ｌｏｇ（Ｃｏ／Ｃｗ）（１）
（式中、Ｃｏ及びＣｗはそれぞれ油相中及び水相中のＳ８薬物の濃度を表す）に従って計算した。
【0035】
図４に示されるように、初期水溶液の高いｐＨ値（例えば、ｐＨ＞３．４）で、Ｓ８薬物は主に水相中に溶解するが、ｎ－オクタノール相中の含有量は非常に低く、その脂質－水分配係数は－２未満である（Ｐ＜０．０１）。しかしながら、初期水溶液がｐＨ３．４を下回ると、ｐＨ値の低下に伴って水相中の含有量は急速に減少するのに対し、ｎ－オクタノール相中の含有量は急激に増加する。初期水溶液のｐＨ値が３．０に減少すると、脂質－水分配係数は約１に達し（Ｐ＝９．７）、初期水溶液のｐＨ値が２．８であるとき、脂質－水分配係数は１．３１に達する（Ｐ＝２０．５）。Ｓ８薬物は、初期水溶液のｐＨ値の非常に狭い範囲内で親水性特性／親油性特性の大幅な逆転に至ったことが見て取れる（上記の点線の中央領域に示される通り）。これらの特性は従来の薬物とは大幅に異なっており、これは臨床応用に向けた薬物の製剤設計において大きな意義を有し得る。
【0036】
実施形態３．多発性硬化症の動物実験（実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデル）
３．１．ＥＡＥモデル実験
７週齢～９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウス。動物を規則に準拠して飼育及び維持した。
３．１．ＥＡＥモデル実験
７週齢～９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウス。動物を規則に準拠して飼育及び維持した。
【0037】
０日目に、マウスを体重別に無作為に群分けした後、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Hooke Laboratories）中の２００μｌのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドを右脇腹及び左脇腹に１部位当たり１００μｌずつ皮下注射した。百日咳毒素（ＰＴＸ）を、ＭＯＧ免疫化の０時間後及び４８時間後に腹腔内注射した。上記のＡｕＣ試料をそれぞれ表１に従って１日目から２８日目にかけて与えた。動物（ｎ＝１０）をＥＡＥの臨床徴候について毎日スコアリングした。
【0038】
ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ）は、組織及び細胞について最も一般的に使用される染色法の１つである。ヘマトキシリン染色溶液は核に対して高い親和性を有し、核を青く染め、エオシン染色溶液は細胞質に対して高い親和性を有し、細胞質をピンク色又は赤色に染める。各群から３匹のマウスを選び、組織を－８０℃の冷凍庫で凍結し、組織切片のために凍結組織を取り出し、凍結スライサー（ボックス温度、－２０℃）に入れて１５分間平衡させた。組織切片は１０μｍであった。
【0039】
ＨＥ染色は次の通りである。行動試験の後、マウスに麻酔をかけ、心臓に灌流し、次いでマウスの脳を摘出し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。勾配脱水後、凍結した冠状切片を接着用スライドで貼り付けた。脳スライスを貼り付けたスライドをオーブンに３７℃で１５分間入れ、スライドをヘマトキシリン染色溶液で８分間染色し、余分な染料を水道水で１０分間洗い流し、スライドを精製水で数秒間すすぎ、スライドを分化溶液（differentiation solution）で３０秒間分化し（任意）、水道水で１０分間すすぎ、次いで、スライドをエオシンで１分間染色し、水道水で１０分間、７０％のエタノールで１０秒間、８０％のエタノールで１０秒間、９０％のエタノールで１０秒間、１００％のエタノールで１０秒間、キシレンで５分間、新たなキシレンで５分間すすぎ、中性ガムシールで密封したところ、顕微鏡観察により核が青色であり、細胞質がピンク色であることが明らかとなった。
【0040】
【表1】
【0041】
【表2】
【0042】
３．２．結果及び分析
図５は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ８、及び金クラスター粗生成物Ｓ９によって表される薬物投与群におけるＥＡＥモデルマウスの行動臨床スコアの試験結果を示している。図５に示されるように、Ｓ１（Ａｕ２５（Ｌ－ＮＩＢＣ）１８）薬物及びＳ２（Ａｕ４（Ｌ－ＮＩＢＣ）４）薬物は、ＥＡＥモデルマウスの行動臨床スコアを有意に改善しなかった。しかしながら、Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）薬物群における全てのマウスは、最初の１３日間は正常マウスとほぼ同じであり、１４日目から行動臨床スコアの弱い増加を示し、実験期間全体において行動臨床スコアは１未満であった。モデル群のマウスと比較すると、大きな改善が見られた（９日目から、Ｐ＜０．００１）ことから、これは、Ｓ８薬物がＭＯＧ薬物によって引き起こされたマウスの行動障害の抑制に対して魅力的な効果を有したことを示している。Ｓ８薬物群と比較すると、Ｓ９（金クラスター粗生成物）薬物投与群だけが１９日目までモデルコントロール群に対して有意差を示し（Ｐ＜０．０５）、行動臨床スコアの最高点は２点を上回り、一方、フォローアップ投与においてスコアは急速に改善し、２２日目からは１点未満に減少したが、Ｓ９薬物の治癒効果はＳ８薬物の治癒効果よりも有意に低いことが依然として示された。他の５つの薬物（Ｓ３～Ｓ７）の試験結果はＳ１及びＳ２の結果と同様であり、明らかな薬力学的効果は見られなかったため、本明細書においてはこれらを詳細に説明しない。
図５は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ８、及び金クラスター粗生成物Ｓ９によって表される薬物投与群におけるＥＡＥモデルマウスの行動臨床スコアの試験結果を示している。図５に示されるように、Ｓ１（Ａｕ２５（Ｌ－ＮＩＢＣ）１８）薬物及びＳ２（Ａｕ４（Ｌ－ＮＩＢＣ）４）薬物は、ＥＡＥモデルマウスの行動臨床スコアを有意に改善しなかった。しかしながら、Ｓ８（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）薬物群における全てのマウスは、最初の１３日間は正常マウスとほぼ同じであり、１４日目から行動臨床スコアの弱い増加を示し、実験期間全体において行動臨床スコアは１未満であった。モデル群のマウスと比較すると、大きな改善が見られた（９日目から、Ｐ＜０．００１）ことから、これは、Ｓ８薬物がＭＯＧ薬物によって引き起こされたマウスの行動障害の抑制に対して魅力的な効果を有したことを示している。Ｓ８薬物群と比較すると、Ｓ９（金クラスター粗生成物）薬物投与群だけが１９日目までモデルコントロール群に対して有意差を示し（Ｐ＜０．０５）、行動臨床スコアの最高点は２点を上回り、一方、フォローアップ投与においてスコアは急速に改善し、２２日目からは１点未満に減少したが、Ｓ９薬物の治癒効果はＳ８薬物の治癒効果よりも有意に低いことが依然として示された。他の５つの薬物（Ｓ３～Ｓ７）の試験結果はＳ１及びＳ２の結果と同様であり、明らかな薬力学的効果は見られなかったため、本明細書においてはこれらを詳細に説明しない。
【0043】
図６－１および図６－２は、ＨＥ染色の試験結果を示している。ＥＡＥ動物モデルにおいて、多数の免疫細胞が骨髄に侵入することになる。免疫細胞の骨髄への侵入をＨＥ染色により確認することができる。図６Ａは、例示的な薬物投与群の組織学的スコアの統計結果を示している。図６Ａに示されるように、Ｓ８薬物はＥＡＥモデリングによって引き起こされる組織学的スコアの増加を有意に減らすことができ（Ｐ＜０．０１、＊＊）、また、Ｓ９（金クラスター粗生成物）薬物の投与もスコアを有意に減らすことができる（Ｐ＜０．０５、＊）が、Ｓ８薬物よりも有意に有効性が低く、Ｓ１及びＳ２は明らかな効果を有しない。薬物Ｓ３～薬物Ｓ７は薬物Ｓ１及び薬物Ｓ２と同様であり、明らかな効果がないため、本明細書においてはこれらを詳細に説明しない。図６Ｂ～図６Ｆは、それぞれブランクコントロール群、モデルコントロール群、Ｓ１投与群、Ｓ８投与群、及びＳ９投与群の例示的なＨＥ染色画像である。モデルコントロール群においては、ボックス内に示されるように、多数の免疫細胞が骨髄に侵入した（図６Ｃ）のに対し、ブランクコントロール群のマウスにおいては、このような現象は見られなかった（図６Ｂ）ことが見て取れる。図６Ｄは、Ｓ１薬物投与群の例示的なＨＥ染色画像であり、ボックス内に示されるように、モデルコントロール群マウスと同様に多数の免疫細胞の侵入を確認することができる。Ｓ８薬物投与（図６Ｅ）は、骨髄への免疫細胞の侵入を大幅に減少させることができ、免疫細胞の浸潤が殆ど見えないことから、これは効果が優れていることを示している。Ｓ９薬物投与群は特定の治療効果を有するが、骨髄中に或る程度の免疫細胞侵入を依然として確認することができた（図６Ｆ）。Ｓ１と同様に、Ｓ２～Ｓ７は免疫細胞の骨髄への侵入を有意に抑制しなかった。これらの結果は図５に示される行動結果と一致している。
【0044】
上記の結果により、Ｓ８薬物（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）がＥＡＥモデルマウスの脳内炎症及び行動臨床スコアを有意に改善することができ、この実験において他の薬物と比較して明らかな利点を有することが実証される。Ｓ８薬物の効果はＳ９（金クラスター粗生成物）薬物よりも優れている。したがって、Ｓ８薬物は多発性硬化症及びその他の免疫関連疾患において幅広い適用の見込みがある。
【0045】
金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４が独特な効力を示したため、Ｓ９試料（金クラスター粗生成物）中のＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の含有量を検出した。クロマトグラフィーの結果（検出波長２２０ｎｍ）によると、Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４クロマトグラフィーピークの純度は面積百分率法によって２．８％と計算された。研究により、金クラスター粗生成物中のＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４のクロマトグラフィー含有量は、調製方法、調製条件、及び調製バッチの影響により変動することが明らかになった。本研究のプロトコルＩの調製方法及び調製条件下では、Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４のクロマトグラフィー含有量は様々な調製バッチに応じて１％～４％の範囲内であった。
【0046】
Ｓ９薬物（金クラスター粗生成物）の効力がＳ８薬物の効力よりも有意に低いという事実は、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の含有量が試料の効力に影響を与える重要な要因の１つであることを示している。この点を更に調べるのに、Ｓ９薬物（金クラスター粗生成物）に様々な量のＳ８薬物を加えて、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４のクロマトグラフィー含有量が各Ｓ９＋Ｓ８薬物において異なるように一連のＳ９＋Ｓ８薬物を取得し、次いで、ＥＡＥモデルを用いて試験した。この結果により、Ｓ９＋Ｓ８薬物中の金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４のクロマトグラフィー含有量が７％に達するか又はそれを超えると、そのような薬物は大きな効力を示すことが明らかになったことから、これは、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の７％以上のクロマトグラフィー含有量を有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣ生成物はＭＳの治療に有効であることを示している。
【0047】
図７は、Ｓ８薬物、Ｓ９薬物、及びＳ９＋Ｓ２混合薬物のＥＡＥモデル薬物試験の行動臨床スコアを示しており、ここで、Ｓ９＋Ｓ２混合薬物中の金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４のクロマトグラフィー含有量は約２１％であった。金クラスター粗生成物Ｓ９に少量のＳ８を加えると、ＥＡＥモデルマウスに対する治療効果が有意に増加し、Ｓ８と殆ど変わらないことが見て取れる。
【0048】
実施形態４．アルツハイマー病（ＡＤ）動物モデル実験
４．１．ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックＡＤモデルマウスの実験
４．１．１．方法
雄Ｃ５７ＢＬ／６生殖系列ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックＡＤモデルマウスを、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群へと無作為に分けた。同時に、同齢群のＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを正常コントロール群として設けた。各群には１５匹のマウスが含まれていた。Ｓ１群、Ｓ２群、Ｓ３群、Ｓ４群、Ｓ５群、Ｓ６群、Ｓ７群、Ｓ８群、及びＳ９群に、対応する薬物の生理食塩水溶液を１日１回、マウス体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの用量及び１００μｌの注射容量で腹腔内注射した。モデルコントロール群及び正常コントロール群におけるマウスに、同容量の生理食塩水を腹腔内注射した。
４．１．ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックＡＤモデルマウスの実験
４．１．１．方法
雄Ｃ５７ＢＬ／６生殖系列ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックＡＤモデルマウスを、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群へと無作為に分けた。同時に、同齢群のＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを正常コントロール群として設けた。各群には１５匹のマウスが含まれていた。Ｓ１群、Ｓ２群、Ｓ３群、Ｓ４群、Ｓ５群、Ｓ６群、Ｓ７群、Ｓ８群、及びＳ９群に、対応する薬物の生理食塩水溶液を１日１回、マウス体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの用量及び１００μｌの注射容量で腹腔内注射した。モデルコントロール群及び正常コントロール群におけるマウスに、同容量の生理食塩水を腹腔内注射した。
【0049】
マウスが３ヶ月齢になったとき、薬物投与を開始した。１８０日間連続の投与後、全ての動物の認知機能及び記憶機能をモリス水迷路試験によってアッセイした。
【0050】
位置ナビゲーション実験：モリス水迷路試験システムは、円形の水プールと自動ビデオ録画及び分析システムとからなっていた。水プールの上部にあるカメラはコンピューターに接続されていた。水迷路は、１２０ｃｍの直径及び６０ｃｍの高さを有する円形の水プールと９ｃｍの直径を有するプラットフォームとからなっていた。液面はプラットフォームよりも０．５ｃｍ高く、水温は２２±０．５℃であった。白色顔料を使用して水を乳白色に染めた。位置ナビゲーション実験を使用して水迷路におけるマウスの学習能力及び記憶能力を測定し、これを５日間続けた。水迷路は東、西、南、及び北の４方向にある４つの象限に分かれていた。プラットフォームを固定した象限に配置した。実験全体を通して、プラットフォームの位置を固定した。訓練中、マウスを、様々な象限における１／２ラジアンから外壁近くでプールの壁に頭を向けた状態で静かに水に入れた。マウスが隠れたプラットフォームに登るのにかかった時間を記録するか、又は記録時間が６０秒に達した時点で実験を止めた。マウスを、プラットフォームに登った後３０秒間プラットフォーム上に留まらせた。マウスが６０秒以内にプラットフォームを見つけることができなかった場合、実験者はマウスを誘導してプラットフォームに登らせ、３０秒間プラットフォーム上に留まらせる。マウスのプラットフォーム探索の逃避潜時をカメラ追跡システムによって記録した。実験後、全てのマウスを別の場所に移し、ドライヤーによって優しく乾かした。各マウスを、訓練セッションの合間に２０分の間隔を置いて５日間連続で１日４回訓練した。
【0051】
空間プローブ試験：５日目の訓練を終えた後、６日目にプラットフォームを取り外し、マウスをプラットフォームから最も遠い地点からプールの壁に向かって静かに水中に入れ、マウスの６０秒間の移動軌道をカメラにより記録し、マウスがプラットフォームを横切った回数、標的象限における滞在時間、及び標的象限における水泳距離をソフトウェアにより分析した。
【0052】
実験結果はｘ－±ＳＥＭにより表される。全てのデータをＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ ２１）により処理し、事後ダネット検定により分析した。Ｐ＜０．０５は、差が統計的に有意であることを示す。クラスカル・ウォリスＨ検定及びマン・ホイットニーＵ検定を使用して、正規分布に属しないデータの統計分析を行った。
【0053】
行動試験後、７％の抱水クロラールの腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけ、心臓灌流接続を確立し、生理食塩水を使用して７分間素早く流した後、組織を４％の抱水クロラールで７分間灌流させた。灌流後、脳組織を慎重に採集し、４％の灌流溶液中に入れ、後の使用に備えて室温で貯蔵した。免疫組織化学的方法を使用して、海馬内及び皮質内のＡβ１－４０の発現を検出した。灌流組織を脱水し、ヒアリン化し、ワックス処理して包埋し、パラフィンスライサーでスライスした。キシレン及び無水エタノールで段階的に脱ワックスする。マイクロ波による抗原修復後、切片を酸化水素とともにインキュベートし、切片を血清により３０分間ブロッキングした。一次抗体（マウス抗Ａβ１－４０、１：１００）を室温で加え、４℃で一晩（１５時間）インキュベートした。一次抗体を捨て、切片をＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体を加え、室温で３０分間インキュベートした。スライスをＰＢＳで洗浄した後、顕色剤ＤＡＢを加えて発色させ、スライスをハリスヘマトキシリンにより対比染色し、脱水して密封した。蛍光顕微鏡を使用して写真を撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用してスライスの定量分析を行った。
【0054】
４．１．２．結果
図８－１および図８－２は、１８０日間連続のＳ１、Ｓ２、Ｓ８、及びＳ９の薬物投与がモリス水迷路試験における雄マウスのパフォーマンスに対して及ぼす効果を示している。図８Ａに示されるように、位置ナビゲーション実験の訓練中、正常コントロール群（ブランク）と比較して、モデルコントロール群（モデル）マウスのプラットフォーム探索潜時は、訓練２日目から５日目まで正常マウスよりも有意に長かった（Ｐ＜０．０５、＃、Ｐ＜０．０１、＃＃）。モデルコントロール群と比較して、Ｓ１薬物投与群及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群のプラットフォーム探索潜時は明らかに減少し、４日目及び５日目に有意差を示した（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ８薬物投与により、モデリングしたマウスにおけるプラットフォーム探索潜時の更により有意な減少がもたらされ、モデルコントロール群と比較して、２日目から５日目まで有意差が認められた（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ９薬物投与群と比較して、Ｓ８薬物投与群のプラットフォーム探索潜時は３日目に有意に短かった（Ｐ＜０．０５、＄）。これら全ての結果により、Ｓ８薬物の効果がＳ１薬物及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物の効果よりも良好であることが実証された。Ｓ２薬物投与群ではプラットフォーム探索潜時の明らかな減少は示されなかった。
図８－１および図８－２は、１８０日間連続のＳ１、Ｓ２、Ｓ８、及びＳ９の薬物投与がモリス水迷路試験における雄マウスのパフォーマンスに対して及ぼす効果を示している。図８Ａに示されるように、位置ナビゲーション実験の訓練中、正常コントロール群（ブランク）と比較して、モデルコントロール群（モデル）マウスのプラットフォーム探索潜時は、訓練２日目から５日目まで正常マウスよりも有意に長かった（Ｐ＜０．０５、＃、Ｐ＜０．０１、＃＃）。モデルコントロール群と比較して、Ｓ１薬物投与群及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群のプラットフォーム探索潜時は明らかに減少し、４日目及び５日目に有意差を示した（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ８薬物投与により、モデリングしたマウスにおけるプラットフォーム探索潜時の更により有意な減少がもたらされ、モデルコントロール群と比較して、２日目から５日目まで有意差が認められた（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ９薬物投与群と比較して、Ｓ８薬物投与群のプラットフォーム探索潜時は３日目に有意に短かった（Ｐ＜０．０５、＄）。これら全ての結果により、Ｓ８薬物の効果がＳ１薬物及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物の効果よりも良好であることが実証された。Ｓ２薬物投与群ではプラットフォーム探索潜時の明らかな減少は示されなかった。
【0055】
図８Ｂ～図８Ｄに示されるように、空間プローブ試験の結果により、モデルコントロール群のマウスは、正常コントロール群のマウスと比較して、水泳距離（図８Ｃ）（Ｐ＜０．０１、＃＃）及び標的象限での滞在時間（図８Ｄ）（Ｐ＜０．０５、＃）の有意な減少を示し、より短いプラットフォーム横断時間を有意差なく示した（Ｐ＞０．０５）ことが明らかとなった。モデルコントロール群と比較して、Ｓ２薬物はマウスのプラットフォーム横断時間を増加させることができなかった（図８Ｂ）のに対し、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、及びＳ９薬物投与群におけるプラットフォーム横断時間は増加したが、いずれも有意差を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。標的象限の水泳距離及び標的象限の滞在時間（図８Ｃ及び図８Ｄ）については、Ｓ１薬物、Ｓ８薬物、及びＳ９薬物はこれら２つの値を有意に改善することができ（Ｐ＜０．０５、＊）、ここで、Ｓ８薬物投与群の増加幅はＳ１薬物投与群及びＳ９薬物投与群の増加幅よりも大きい。しかしながら、Ｓ２薬物はこれら２つの値を有意に増加させることはできなかった。
【0056】
これらのデータにより、Ｓ１薬物、Ｓ８薬物、及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物は全てＡＤモデルマウスの認知能力及び記憶能力を有意に改善し得るものの、Ｓ８薬物はＳ１薬物及びＳ９薬物よりも良好な治療効果を示したことが明らかとなる。Ｓ２薬物では明らかな効果は示されなかった。
【0057】
Ｓ３薬物～Ｓ７薬物を１８０日間連続で投与した結果はＳ２薬物の結果と同様である。モデルコントロール群と比較して、位置ナビゲーション実験の訓練中のプラットフォーム探索潜時、又はプラットフォーム横断時間、標的象限での水泳距離、及び空間プローブ試験における標的象限での滞在時間に明らかな増加は見られなかったことから、これは、Ｓ３薬物～Ｓ７薬物がＡＤモデルマウスの認知能力及び記憶能力の改善に対して明らかな効果を示さなかったことを示している。
【0058】
免疫組織化学検査の結果により、Ｓ８金クラスター分子（Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４）がＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックＡＤモデルマウスの脳内のＡβ１－４０線維性プラークの形成を有意に減少させ得ることが更に確認された。図９は、モデルコントロール群とＳ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、又はＳ９薬物投与群との間の海馬内及び皮質内の平均光学密度値の観点からのＡβ１－４０プラーク数の比較を示している。図９に示されるように、Ｓ８薬物は、海馬内及び皮質内のＡβ１－４０プラークの数を有意に減少させることができ、モデルコントロール群と比較して、その減少は有意である（Ｐ＜０．０１、＊＊）。金クラスター粗生成物Ｓ９も比較的良好な減少効果を示し、海馬内及び皮質内のＡβ１－４０プラークの数はモデルコントロール群の数よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５、＊）が、減少幅はＳ８薬物投与群よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５、＄）。Ｓ１薬物投与群はＳ９薬物投与群と同様に脳内のＡβ線維性プラークの数を減少させたが、減少幅はＳ８薬物投与群よりも有意に低かった。これらの結果により、Ｓ８薬物がＡＤ脳内線維性プラークの減少に対して優れた効果を有し、Ｓ１薬物及び金クラスター粗生成物Ｓ９よりも優れていることが実証された。しかしながら、Ｓ２薬物は治療効果を示さなかった。Ｓ３薬物～Ｓ７薬物はＳ２薬物と同様に治療効果を示さないため、本明細書においてはこれらを詳細に説明しない。
【0059】
４．２．五重トランスジェニック（five-transgenic）５ｘＦＡＤ ＡＤモデルマウスの実験
従来のマウスモデル（上述のＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックマウスモデル等）は、ＡＤの病因及び治療薬の初期の探索及び研究に役立つ。しかしながら、ＡＤの病原は複雑であるため、より徹底的な研究にはより適切な動物モデルが必要である。５ｘＦＡＤは比較的新しいＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックＡＤマウスモデルであり、これは５つの家族性遺伝子突然変異を有し、様々なＡＤ関連の神経障害及び記憶機能不全を伴う。ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックマウスモデル及びその他のＡＤ動物モデルと比較すると、神経病理学的病変の特性がより明白であるため、５ｘＦＡＤはますます広く認識されるようになった。
従来のマウスモデル（上述のＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックマウスモデル等）は、ＡＤの病因及び治療薬の初期の探索及び研究に役立つ。しかしながら、ＡＤの病原は複雑であるため、より徹底的な研究にはより適切な動物モデルが必要である。５ｘＦＡＤは比較的新しいＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックＡＤマウスモデルであり、これは５つの家族性遺伝子突然変異を有し、様々なＡＤ関連の神経障害及び記憶機能不全を伴う。ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックマウスモデル及びその他のＡＤ動物モデルと比較すると、神経病理学的病変の特性がより明白であるため、５ｘＦＡＤはますます広く認識されるようになった。
【0060】
４．２．１．方法
モデルマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６の背景を有する５ｘＦＡＤ雄マウスであった。実験用のマウスを、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群へと分けた。同時に、同齢群のＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを正常コントロール群として設けた。各群には１５匹のマウスが含まれていた。薬物投与群におけるマウスに、対応する薬物の生理食塩水溶液を、マウス体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの用量及び１００μｌの注射容量で１日１回腹腔内注射した。マウスが２ヶ月齢になったとき、薬物投与を開始した。モデルコントロール群及び正常コントロール群におけるマウスに、同容量の生理食塩水を薬物投与群の場合と同じスケジュールに従って腹腔内注射した。
モデルマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６の背景を有する５ｘＦＡＤ雄マウスであった。実験用のマウスを、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群へと分けた。同時に、同齢群のＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを正常コントロール群として設けた。各群には１５匹のマウスが含まれていた。薬物投与群におけるマウスに、対応する薬物の生理食塩水溶液を、マウス体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの用量及び１００μｌの注射容量で１日１回腹腔内注射した。マウスが２ヶ月齢になったとき、薬物投与を開始した。モデルコントロール群及び正常コントロール群におけるマウスに、同容量の生理食塩水を薬物投与群の場合と同じスケジュールに従って腹腔内注射した。
【0061】
３ヶ月連続の薬物投与後、全ての動物の認知機能及び記憶機能をモリス水迷路試験によってアッセイした。
【0062】
空間学習能力の試験
モリス水迷路システムは、マウス水泳用の水迷路と自動ビデオ録画及び分析システムとからなる。水迷路の上部にあるカメラはコンピューターに接続されていた。水迷路は、１１０ｃｍの直径及び６０ｃｍの高さを有する円形の水プールからなる。マウスの水泳訓練中は、水プール中の水を黒インクによって暗くし、水温を２２±０．５℃に保つ。水迷路は北、南、西、及び東の象限に分けられている。９ｃｍの直径を有するプラットフォームを固定した象限に配置する。プラットフォームは水面よりも０．５ｃｍ低い。
モリス水迷路システムは、マウス水泳用の水迷路と自動ビデオ録画及び分析システムとからなる。水迷路の上部にあるカメラはコンピューターに接続されていた。水迷路は、１１０ｃｍの直径及び６０ｃｍの高さを有する円形の水プールからなる。マウスの水泳訓練中は、水プール中の水を黒インクによって暗くし、水温を２２±０．５℃に保つ。水迷路は北、南、西、及び東の象限に分けられている。９ｃｍの直径を有するプラットフォームを固定した象限に配置する。プラットフォームは水面よりも０．５ｃｍ低い。
【0063】
マウスを訓練して、５日間にわたって水迷路内の隠れたプラットフォームについて学習させた。訓練中、マウスを様々な象限においてプールの壁に頭を向けた状態で静かに水に入れた。マウスが隠れたプラットフォームを見つけてそこに登るのにかかった時間を記録し、マウスをプラットフォームに登った後３０秒間プラットフォーム上に留まらせた。マウスが６０秒以内にプラットフォームを見つけることができなかった場合、訓練を止め、実験者はマウスを誘導してプラットフォームに登らせ、３０秒間プラットフォームに留まらせた。マウスのプラットフォーム探索潜時をカメラ追跡システムによって記録した。実験後、全てのマウスを別の場所に移し、ドライヤーによって優しく乾かした。各マウスを、訓練セッションの合間に２０分の間隔を置いて５日間連続で１日４回訓練した。
【0064】
空間記憶能力の試験（空間プローブ試験）
水泳訓練を５日後に完了した。６日目にプローブ試験を開始した。マウスをプラットフォームから最も遠い地点からプールの壁に向かって静かに水中に入れ、マウスの６０秒間の移動軌道をビデオカメラにより記録し、マウスがプラットフォームを横切った回数、標的象限における滞在時間、及び標的象限における水泳距離をソフトウェアにより分析した。
水泳訓練を５日後に完了した。６日目にプローブ試験を開始した。マウスをプラットフォームから最も遠い地点からプールの壁に向かって静かに水中に入れ、マウスの６０秒間の移動軌道をビデオカメラにより記録し、マウスがプラットフォームを横切った回数、標的象限における滞在時間、及び標的象限における水泳距離をソフトウェアにより分析した。
【0065】
実験結果はｘ－±ＳＥＭにより表される。全てのデータをＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ ２１）により処理し、事後ダネット検定により分析した。Ｐ＜０．０５は、差が統計的に有意であることを示す。クラスカル・ウォリスＨ検定及びマン・ホイットニーＵ検定を使用して、正規分布に属しないデータの統計分析を行った。
【0066】
行動試験後に病理学的分析を行った。マウスをＣＯ２により屠殺した後、心臓灌流接続を確立した。生理食塩水を使用して５分間～１０分間素早く流した後、組織を４％のＰＦＡ中で一晩固定した。翌日、組織を脱水し、ヒアリン化し、ワックス処理してパラフィン中に包埋し、パラフィン包埋ブロックを形成して、パラフィンスライサーを用いてスライスした。スライスした後、スライスをキシレン及び無水エタノールで段階的に脱ワックスする。次いで、免疫組織化学的方法によりアミロイドプラーク、アストロサイト、及びミクログリアを検出した。マイクロ波による抗原修復後、切片を酸化水素とともにインキュベートし、切片を血清により３０分間ブロッキングした。一次抗体（マウス抗Ａβ４２、１：１００）、ＧＦＡＰ、及びＩｂａ１を室温で加えた。一次抗体を捨て、切片をＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体を加え、室温で３０分間インキュベートした。スライスをＰＢＳで洗浄した後、顕色剤ＤＡＢを加えて発色させ、スライスをハリスヘマトキシリンにより対比染色し、脱水して密封した。蛍光顕微鏡を使用して写真を撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用してスライスの定量分析を行った。
【0067】
４．２．２．結果
行動研究の結果により、訓練の２日目から５日目までは、モデルコントロール群のマウスのプラットフォーム探索潜時は、正常コントロール群のマウスのプラットフォーム探索潜時よりも有意に長いことが明らかとなった。モデルコントロール群と比較して、Ｓ８薬物投与群のマウスのプラットフォーム探索潜時は有意に減少し、３日目からはモデルコントロール群と比較して有意差が見られた。Ｓ１薬物投与群及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群では、モデルコントロール群と比較してプラットフォーム探索潜時の減少が示されたが、統計的に有意性ではなかった。Ｓ２薬物投与群～Ｓ７薬物投与群においては明らかな減少は観察されなかった。
行動研究の結果により、訓練の２日目から５日目までは、モデルコントロール群のマウスのプラットフォーム探索潜時は、正常コントロール群のマウスのプラットフォーム探索潜時よりも有意に長いことが明らかとなった。モデルコントロール群と比較して、Ｓ８薬物投与群のマウスのプラットフォーム探索潜時は有意に減少し、３日目からはモデルコントロール群と比較して有意差が見られた。Ｓ１薬物投与群及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群では、モデルコントロール群と比較してプラットフォーム探索潜時の減少が示されたが、統計的に有意性ではなかった。Ｓ２薬物投与群～Ｓ７薬物投与群においては明らかな減少は観察されなかった。
【0068】
空間プローブ試験でも同様の結果が得られた。Ｓ８薬物は、プラットフォーム横断時間、標的象限における水泳距離、及び標的象限における滞在時間を有意に改善することができた。Ｓ１薬物投与群及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群では若干の減少が示されたが、統計的に有意ではなかった。Ｓ２薬物投与群～Ｓ７薬物投与群では効果は示されなかった。
【0069】
図１０－１および図１０－２は、モデルコントロール群及び薬物投与群におけるマウスの脳内皮質内及び海馬内の線維性プラークのＡβ４２免疫化学染色結果を示している。図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、及び図１０Ｅに示されるように、モデルコントロール群のマウスにおいては５ヶ月齢で上記の領域に多数のＡβプラークが現れた。モデルコントロール群と比較して、Ｓ９薬物投与群マウスの脳内皮質内及び海馬内のＡβプラークの数は或る程度まで減少したが、有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。しかしながら、Ｓ８薬物は脳内皮質内及び海馬内のＡβプラークの数を半分以上減少させた（Ｐ＜０．０１）ことから、これは、Ｓ８薬物が優れた治療効果を有し、その効果が金クラスター粗生成物Ｓ９の効果よりもはるかに良好であることを示している。また、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群とＳ８薬物投与群との間にも有意差が見られる（Ｐ＜０．０５、＄）ことから、効果の違いが更に実証される。図１０Ｄ及び図１０Ｆはそれぞれ皮質及び海馬の免疫組織化学染色の例示的な画像を示している。Ｓ１薬物はＳ９薬物と同様の効果を示し、モデルコントロール群と比較して或る程度の減少が見られたが、有意差はなかった。Ｓ２薬物投与群はモデルコントロール群と比較して減少を示さなかったことから、これは効果がないことを示している。Ｓ３薬物投与群～Ｓ７薬物投与群はＳ２薬物投与群と同様に明らかな効果を有しなかった。
【0070】
脳内炎症はＡＤの病原に関するもう一つの重要な仮説である。ミクログリア及びアストロサイトは神経炎症を引き起こす主な細胞である。Ｉｂａ１及びＧＦＡＰはそれぞれミクログリア及びアストロサイトについてのマーカーである。これらのタンパク質の発現の増加は、ミクログリア及びアストロサイトの数の増加並びに細胞の活性化を示している。多くの研究により、ＡＤマウスの脳内のＩｂａ１及びＧＦＡの発現が大幅に増加していることが明らかにされている。これらの細胞の活性化により、インターロイキン（ＩＬ－１β、ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及び活性酸素種等のサイトカインの大量の産生がもたらされ、神経機能不全及び死が引き起こされる可能性がある。したがって、Ｉｂａ１陽性（Ｉｂａ１＋）細胞及びＧＦＡＰ陽性（ＧＦＡＰ＋）細胞の数に対する薬物の効果を評価することで、脳内炎症関連プロセスに対する薬物の効果を示すことができる。
【0071】
図１１－１および図１１－２は、５ｘＦＡＤトランスジェニックＡＤモデルマウスの脳内皮質内及び海馬領域内のＩｂａ１＋陽性細胞及びＧＦＡＰ＋細胞の数に対する薬物の効果を示している。図１１Ａ及び図１１Ｂは、それぞれモデルコントロール群及び各薬物投与群におけるマウスの皮質内及び海馬内のＩｂａ１＋細胞の免疫組織化学染色の試験結果を示している。図１１Ｃ及び図１１Ｄは、対応するＧＦＡＰ＋細胞の免疫組織化学染色の試験結果である。Ｓ１薬物は脳内皮質内及び海馬内のＩｂａ１＋細胞及びＧＦＡＰ＋細胞の数に対して有意な効果を有しなかったことが見て取られることから、これは、Ｓ１薬物が脳の炎症に対して有意な抑制効果を有しないことを示している。Ｓ２～Ｓ７にはＳ１と同様に明らかな抑制効果はない。金クラスター粗生成物Ｓ９は、脳内皮質内及び海馬領域内のＩｂａ１＋陽性細胞及びＧＦＡＰ＋細胞の数を減少させたが、モデルコントロール群と比較して有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。しかしながら、Ｓ８薬物は脳の炎症に対して有意な抑制効果を示した。図１１Ａに示されるように、モデルコントロール群と比較して、Ｓ８薬物投与により皮質内のＩｂａ１＋細胞の数が約４０％減少し、有意差を示している（Ｐ＜０．０１、＊＊）。図１１Ｂに示されるように、モデルコントロール群と比較して、Ｓ８薬物投与により海馬内のＩｂａ１＋細胞の数が有意に２７％減少した（Ｐ＜０．０５、＊）。図１１Ｃ及び図１１Ｄに示されるように、モデルコントロール群と比較して、皮質内及び海馬内のＧＦＡＰ＋細胞の数はそれぞれ２４％（Ｐ＜０．０５、＊）及び１５％（Ｐ＜０．０５、＊）有意に減少した。これらの結果により、Ｓ８薬物がＡＤ関連脳内炎症に対して優れた抑制効果を有することが明らかとなる。
【0072】
上記の結果により、Ｓ８薬物が五重トランスジェニック５ｘＦＡＤモデルマウス試験において優れた治療効果を示し、少なくとも認知行動及び記憶行動の改善、タンパク質線維化及び脳内炎症の抑制という３つの側面からＡＤの治療に肯定的な役割を果たし得ることが明らかとなる。ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックマウスモデルの試験結果と合わせると、Ｓ１薬物は特定の治療効果を有し、全体的な効果の観点からＳ９薬物がＳ１薬物より優れているが、Ｓ８薬物とは比較にならないことが見て取れる。Ｓ２薬物～Ｓ７薬物は明らかな治療効果を示すことができなかった。
【0073】
以上の結果により、同じリガンドを含む様々な金クラスター分子の分子構造が、アルツハイマー病の予防及び治療における金クラスター分子の適用効果に対して大きな影響を与えることが明らかとなる。Ｌ－ＮＩＢＣを含む様々な金クラスター分子に関して、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４（Ｓ８薬物）が、他の７つの金クラスター分子及び金クラスター粗生成物Ｓ９に比べて極めて大きな利点を有し、アルツハイマー病の予防用及び治療用の薬物の開発により適している。
【0074】
更なる研究により、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物にＳ８薬物を加えて混合薬物を得たところ、混合薬物中の金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の含有量が７％に達すると、混合薬物の治療効果が有意に増加したことが明らかとなる。
【0075】
実施形態５．肝硬変マウスモデル実験
５．１．方法
マウス肝硬変モデルのモデリング
６週齢～８週齢及び１６ｇ～２０ｇの体重のＳＰＦ雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを、それらの体重に基づいて、１１個の群（ｎ＝１０）、すなわち、ブランクコントロール群、モデル群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群へと無作為に分けた。ブランクコントロール群を除き、他の群におけるマウスの肝硬変モデルを四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘発処理法によって作製した。モデリングプロトコルは次の通りであった：（１）各マウスに、１０％のＣＣｌ４（オリーブオイルで希釈）を体重１ｇ当たり７μｌで週２回、合計８週間にわたって腹腔内注射し、ブランクコントロール群のマウスに、同量のオリーブオイル溶媒を腹腔内注射した。（２）６週目からは毎週２匹のマウスを選び、最後の注射から４８時間後に殺処分した。肝臓の外観を観察した。外観が肝硬変の特性と一致したら（８週目）、肝臓組織をホルマリンで固定した。ＨＥ染色及びマッソン染色を使用して、肝硬変のモデルを評価した。
５．１．方法
マウス肝硬変モデルのモデリング
６週齢～８週齢及び１６ｇ～２０ｇの体重のＳＰＦ雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを、それらの体重に基づいて、１１個の群（ｎ＝１０）、すなわち、ブランクコントロール群、モデル群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群へと無作為に分けた。ブランクコントロール群を除き、他の群におけるマウスの肝硬変モデルを四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘発処理法によって作製した。モデリングプロトコルは次の通りであった：（１）各マウスに、１０％のＣＣｌ４（オリーブオイルで希釈）を体重１ｇ当たり７μｌで週２回、合計８週間にわたって腹腔内注射し、ブランクコントロール群のマウスに、同量のオリーブオイル溶媒を腹腔内注射した。（２）６週目からは毎週２匹のマウスを選び、最後の注射から４８時間後に殺処分した。肝臓の外観を観察した。外観が肝硬変の特性と一致したら（８週目）、肝臓組織をホルマリンで固定した。ＨＥ染色及びマッソン染色を使用して、肝硬変のモデルを評価した。
【0076】
薬物投与
モデリングが成功したら、Ｓ１薬物投与群～Ｓ９薬物投与群のマウスに、それぞれ対応する薬物を腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇで与え、ブランクコントロール群及びモデル群のマウスに生理学的食塩水を１０ｍｌ／ｋｇで腹腔内投与した。投与を１日１回、２０日間連続で行った。
モデリングが成功したら、Ｓ１薬物投与群～Ｓ９薬物投与群のマウスに、それぞれ対応する薬物を腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇで与え、ブランクコントロール群及びモデル群のマウスに生理学的食塩水を１０ｍｌ／ｋｇで腹腔内投与した。投与を１日１回、２０日間連続で行った。
【0077】
生化学的アッセイ
薬物投与が完了したら、マウスの眼窩から血液を採集し、血清を取得して、Zhongsheng Beikongのキット及び生化学分析装置（Siemens）を使用して、アルブミン（アルブミン、ＡＬＢ）、総ビリルビン（ＴＢｉｌ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）の生化学的試験を行った。検出方法をキットの使用説明書に厳密に従って実施した。
薬物投与が完了したら、マウスの眼窩から血液を採集し、血清を取得して、Zhongsheng Beikongのキット及び生化学分析装置（Siemens）を使用して、アルブミン（アルブミン、ＡＬＢ）、総ビリルビン（ＴＢｉｌ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）の生化学的試験を行った。検出方法をキットの使用説明書に厳密に従って実施した。
【0078】
病理学的検査
ＨＥ染色
安楽死後、マウスの肝臓組織試料を４％のパラホルムアルデヒド固定液で４８時間以上固定した。固定後、肝臓試料をアルコール勾配により脱水し、キシレン及びエタノールで処理した。次いで、肝臓組織をワックス中に浸して包埋した。包埋材料をトリミングし、取り付け、修復した後、肝臓組織をパラフィンミクロトームでスライスし、スライスは４μｍの厚さを有していた。ＨＥ染色の主なプロセスは次の通りである。６５℃のオーブン内でベーキングした後、スライスをキシレンで処理し、勾配エタノールで脱水した。スライスをヘマトキシリン、青色増強溶液、及び０．５％のエオシンで順次染色した後、勾配エタノール及びキシレンで処理し、中性ガムで密封した。肝臓組織の線維化を顕微鏡で観察した。
ＨＥ染色
安楽死後、マウスの肝臓組織試料を４％のパラホルムアルデヒド固定液で４８時間以上固定した。固定後、肝臓試料をアルコール勾配により脱水し、キシレン及びエタノールで処理した。次いで、肝臓組織をワックス中に浸して包埋した。包埋材料をトリミングし、取り付け、修復した後、肝臓組織をパラフィンミクロトームでスライスし、スライスは４μｍの厚さを有していた。ＨＥ染色の主なプロセスは次の通りである。６５℃のオーブン内でベーキングした後、スライスをキシレンで処理し、勾配エタノールで脱水した。スライスをヘマトキシリン、青色増強溶液、及び０．５％のエオシンで順次染色した後、勾配エタノール及びキシレンで処理し、中性ガムで密封した。肝臓組織の線維化を顕微鏡で観察した。
【0079】
マッソン染色
ベーキング後、マウスの肝臓組織スライスを脱ワックスし、脱水した。クロム処理後、核をルゴーのヘマトキシリン染色溶液で染色した。水で洗浄した後、スライスをマッソンのポンソーレッド酸性フクシンで染色し、スライスを２％の氷酢酸水溶液中に浸し、１％のリンモリブデン酸溶液で分化させた。アニリンブルー溶液又はライトグリーン溶液で直接染色した後、スライスを０．２％の氷酢酸水溶液中にしばらく浸し、次いで９５％のアルコール、無水アルコール、及びキシレンで透明化し、次いで中性ガムで密封した。肝臓組織を顕微鏡で観察した。
ベーキング後、マウスの肝臓組織スライスを脱ワックスし、脱水した。クロム処理後、核をルゴーのヘマトキシリン染色溶液で染色した。水で洗浄した後、スライスをマッソンのポンソーレッド酸性フクシンで染色し、スライスを２％の氷酢酸水溶液中に浸し、１％のリンモリブデン酸溶液で分化させた。アニリンブルー溶液又はライトグリーン溶液で直接染色した後、スライスを０．２％の氷酢酸水溶液中にしばらく浸し、次いで９５％のアルコール、無水アルコール、及びキシレンで透明化し、次いで中性ガムで密封した。肝臓組織を顕微鏡で観察した。
【0080】
５．２．結果
モデル群におけるマウスの肝臓は、増殖する線維性隔壁によって様々なサイズの円形又は楕円形の塊に分割された。図１２－１～図１２－３に示されるように、血清ＡＬＴ指標、血清ＴＢｉｌ指標、血清ＡＳＴ指標、及び血清ＭＡＯ指標はブランクコントロール群の指標と比較して有意に増加し（Ｐ＜０．０１、＃＃）、血清ＡＬＢはブランクコントロール群と比較して有意に減少した（Ｐ＜０．０５、＃）ことから、これは、この実験モデリングが成功したことを示している。
モデル群におけるマウスの肝臓は、増殖する線維性隔壁によって様々なサイズの円形又は楕円形の塊に分割された。図１２－１～図１２－３に示されるように、血清ＡＬＴ指標、血清ＴＢｉｌ指標、血清ＡＳＴ指標、及び血清ＭＡＯ指標はブランクコントロール群の指標と比較して有意に増加し（Ｐ＜０．０１、＃＃）、血清ＡＬＢはブランクコントロール群と比較して有意に減少した（Ｐ＜０．０５、＃）ことから、これは、この実験モデリングが成功したことを示している。
【0081】
図１２－１～図１２－３は、肝硬変モデルマウスにおけるＡＬＴ（図１２Ａ）、ＡＳＴ（図１２Ｂ）、ＴＢｉｌ（図１２Ｃ）、ＭＡＯ（図１２Ｄ）、及びＡＬＢ（図１２Ｅ）の血清レベルに対する薬物の効果を示している。この結果により、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物がモデリングしたマウスにおけるＡＬＴ、ＡＳＴ、及びＴＢｉｌの血清レベルを有意に改善することができ（Ｐ＜０．０５、＊）、かつＳ８薬物がモデリングしたマウスの血清における５つの指標全てを有意に改善することができること（Ｐ＜０．０５、＊、Ｐ＜０．０１、＊＊）が明らかとなる。金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群と比較して、Ｓ８薬物投与群は５つの指標全てのレベルのより大幅な改善を示し、ＡＬＴ、ＡＳＴ、及びＴＢＩＬのレベルに有意差が見られた（Ｐ＜０．０５、＄）ことから、これは、肝硬変モデルマウスにおける血清指標の改善に対するＳ８薬物の効果が金クラスター粗生成物Ｓ９薬物の効果よりも有意に良好であることを示している。Ｓ１薬物はＳ９薬物と同様の効果を有し、改善効果を有したが、改善の幅はＳ８薬物よりもはるかに低い。Ｓ２薬物はモデルマウスの血液における５つの指標の明らかな改善を示さなかった。Ｓ３薬物～Ｓ７薬物はＳ２薬物と同様に明らかな改善効果を有しないため、本明細書においてはこれらを詳細に説明しない。上記の結果により、Ｓ８薬物は他の薬物と比較して肝硬変に対して優れた治療効果を有することが明らかとなった。
【0082】
図１３－１および図１３－２はマッソン染色実験の結果を示している。図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、及び図１３Ｅはそれぞれ、ブランクコントロール群、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群の例示的な画像を示している。図１３Ａに示されるように、ブランクコントロール群のマウスからの正常な肝臓組織は、明確な構造、インタクトな肝小葉、中心静脈を中心とした放射状の配置を有する整然と並んだ肝細胞索、正常な肝細胞核、及び集水領域（catchment area）における少量のみの線維組織を有していた。図１３Ｂに示されるように、モデルコントロール群の肝臓組織において、肝細胞は病的であり、風船のような構造が現れ、肝小葉がほぼ消失し、偽小葉が豊富に形成され、肝臓組織内に多数の増殖したプロトフィブリルが存在し、円形又は楕円形の線維性隔壁を形成していた。
【0083】
図１３Ｄに示されるように、モデルコントロール群と比較して、Ｓ２薬物投与群マウスの肝臓組織は、肝臓障害からの極めて顕著な回復を示し、明確な構造、インタクトな肝小葉、整然と並んだ肝細胞索を示し、観察可能な線維増殖及び偽小葉を示さず、正常な肝臓組織との明らかな違いを示さなかったことから、これは極めて顕著な薬力学を示している。
【0084】
図１３Ｅに示されるように、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群も比較的顕著な効果を示したが、ブランクコントロール群と比較して、或る特定の量の線維増殖及び偽小葉構造が存在する。上記の血清指標の結果と合わせると、Ｓ８薬物の総合的な治療効果はＳ９薬物の治療効果よりも明らかに良好であることが明らかとなる。図１３Ｃに示されるように、Ｓ１薬物はＳ９薬物と同様であり、Ｓ１薬物は或る特定の治療効果を有したものの、Ｓ８薬物より依然として劣っている。Ｓ２薬物～Ｓ７薬物は治療効果を示すことができなかった。ここで、肝細胞は病的であり、肝小葉がほぼ消失し、偽小葉が豊富に形成され、肝臓組織内に多数の増殖したプロトフィブリルが存在し、円形又は楕円形の線維性隔壁を形成していた。モデルコントロール群と比較して有意差は見られない。
【0085】
図１３Ｆは、Ｓ１薬物、Ｓ２薬物、Ｓ８薬物、及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物が肝硬変の組織病理学的スコアに対して及ぼす効果の結果を示している。モデルコントロール群の組織病理学的スコアは０．５から３．３５±０．４２に増加し、ブランクコントロール群と比較して極めて有意な差を示すことが見て取れる（Ｐ＜０．００１、＃＃＃）。Ｓ８薬物投与群のスコアはモデルコントロール群と比較して１．３３±０．２５に有意に減少した（Ｐ＜０．０１、＊＊）。金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群はモデルコントロール群と比較して有意な減少を示したが（Ｐ＜０．０５、＊）、減少幅はＳ８薬物投与群よりも４９％低く、これらの間には有意差が見られる（Ｐ＜０．０５、＄）。これらの結果により、Ｓ８薬物が肝硬変により引き起こされる肝臓障害に対して優れた保護効果を有し、治療効果が金クラスター粗生成物Ｓ９薬物よりも有意に良好であることが実証された。Ｓ１薬物はＳ９薬物と同様に治療効果を有するが、Ｓ８薬物ほどではない。Ｓ２薬物は明らかな効果を示さなかった。Ｓ３薬物投与群～Ｓ７薬物投与群の結果はＳ２薬物投与群の結果と同様であり、明らかな効力を有しなかったため、本明細書においてはこれらを詳細に説明しない。ＨＥ染色の結果はマッソン染色の結果と一致しており、本明細書においては詳細に説明しない。
【0086】
上記の結果から、病理学的試験結果が生化学試験結果と一致していることが見て取られ、これにより総合的に、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４（Ｓ８薬物）は肝硬変に対して有意な治療効果を有し、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物及び他の金クラスター薬物の治療効果よりも有意に良好であることが明らかとなる。金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４（Ｓ８薬物）は、肝硬変の治療（予防及び治癒）用の薬物の開発により適している。
【0087】
更なる研究により、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物にＳ８薬物を加えて混合薬物を得たところ、混合薬物中のＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の含有量が７％に達すると、混合薬物の治療効果が有意に増加したことが明らかとなる。
【0088】
実施形態６．糖尿病動物モデル実験
６．１．方法
６．１．１．糖尿病モデリング、薬物投与、及び血糖試験
本実験は、モデリング中に薬物投与を行うプロトコルと、モデリングが成功に終わった後に薬物投与を行うプロトコルの２つのプロトコルを採用した。これらのプロトコルはそれぞれ以下の通りであった：
６．１．方法
６．１．１．糖尿病モデリング、薬物投与、及び血糖試験
本実験は、モデリング中に薬物投与を行うプロトコルと、モデリングが成功に終わった後に薬物投与を行うプロトコルの２つのプロトコルを採用した。これらのプロトコルはそれぞれ以下の通りであった：
【0089】
プロトコルＩ．同時のモデリング及び薬物投与
ＳＰＦグレードのＣ５７ＢＬ／６雄マウスを、空腹時血糖値に応じて、ブランクコントロール群、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群へと無作為に分けた（１群当たりｎ＝１２）。高脂肪食及び少ない用量のストレプトゾトシンを与えることによって糖尿病のマウスモデルを樹立し、モデリング初日に薬物投与を開始した。最初に、各群におけるマウスに実験室標準の維持飼料を１週間与え、１週間後、ブランクコントロール群を除く他の群に高脂肪食を３週間与えた。３週間後、モデルコントロール群及びＳ１薬物投与群～Ｓ９薬物投与群におけるマウスにストレプトゾトシン（１００ｍｇ／ｋｇ）を５日間連続で腹腔内注射したところ、膵臓に更なる損傷がもたらされ、２型糖尿病のモデルが得られた。ブランクコントロール群にコントロールと同じ量の生理食塩水を注射した。維持飼料を与えた初日から、Ｓ１薬物投与群～Ｓ９薬物投与群に体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの用量で１日１回腹腔内投与し、ブランクコントロール群及びモデルコントロール群に同量の生理食塩水を腹腔内注射した。この投与方法を実験終了まで３５日間継続した。モデリング及び薬物投与試験の後、全てのマウスを５時間絶食させて起点の血糖（空腹時血糖）を検出し、次いで、ブドウ糖（体重１ｇ当たり１．５ｍｇ）を胃内投与した後、血糖値をそれぞれ０．５時間、１時間、１．５時間、及び２時間の時点で検出した。
ＳＰＦグレードのＣ５７ＢＬ／６雄マウスを、空腹時血糖値に応じて、ブランクコントロール群、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群へと無作為に分けた（１群当たりｎ＝１２）。高脂肪食及び少ない用量のストレプトゾトシンを与えることによって糖尿病のマウスモデルを樹立し、モデリング初日に薬物投与を開始した。最初に、各群におけるマウスに実験室標準の維持飼料を１週間与え、１週間後、ブランクコントロール群を除く他の群に高脂肪食を３週間与えた。３週間後、モデルコントロール群及びＳ１薬物投与群～Ｓ９薬物投与群におけるマウスにストレプトゾトシン（１００ｍｇ／ｋｇ）を５日間連続で腹腔内注射したところ、膵臓に更なる損傷がもたらされ、２型糖尿病のモデルが得られた。ブランクコントロール群にコントロールと同じ量の生理食塩水を注射した。維持飼料を与えた初日から、Ｓ１薬物投与群～Ｓ９薬物投与群に体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの用量で１日１回腹腔内投与し、ブランクコントロール群及びモデルコントロール群に同量の生理食塩水を腹腔内注射した。この投与方法を実験終了まで３５日間継続した。モデリング及び薬物投与試験の後、全てのマウスを５時間絶食させて起点の血糖（空腹時血糖）を検出し、次いで、ブドウ糖（体重１ｇ当たり１．５ｍｇ）を胃内投与した後、血糖値をそれぞれ０．５時間、１時間、１．５時間、及び２時間の時点で検出した。
【0090】
プロトコルＩＩ．モデリング成功後の薬物投与
高脂肪食によって誘発された糖尿病マウスモデルを使用して、血糖値の低下に対する薬物の効果を研究した。ＳＰＦグレードのＢ６マウスを、ブランクコントロール群（通常給餌）、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群へと無作為に分けた。モデルコントロール群及び９つの薬物投与群に２ヶ月齢の時点で高脂肪食を与えた。ブランクコントロール群におけるマウスに標準的な実験用飼料を与えた。給餌を３ヶ月間行った。５ヶ月齢の時点で、マウスの血糖を測定して、高脂肪食を与えられたマウスが血糖の上昇及び糖代謝障害を有するかどうかを判定することで、モデリングの成功を確認した。２種類の薬物投与があった。一方は急性投与であり、９つの薬物投与群におけるマウスに１回腹腔内注射（５ｍｇ／ｋｇ）し、３０分後に対応する空腹時血糖及び耐糖能を測定した。もう一方は長期投与であり、９つの薬物投与群におけるマウスに２ヶ月間腹腔内注射（５ｍｇ／ｋｇ／日）した。ブランクコントロール群及びモデルコントロール群に同量の生理食塩水を腹腔内注射した。薬物投与の１ヶ月後又は２ヶ月後に、全てのマウスを一晩中１６時間絶食させて空腹時血糖を検出し、次いで、ブドウ糖（体重１ｇ当たり１．５ｍｇ）を胃内投与した後、血糖値をそれぞれ１５分、３０分、４５分、６０分、及び１２０分の時点で検出した。
高脂肪食によって誘発された糖尿病マウスモデルを使用して、血糖値の低下に対する薬物の効果を研究した。ＳＰＦグレードのＢ６マウスを、ブランクコントロール群（通常給餌）、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群へと無作為に分けた。モデルコントロール群及び９つの薬物投与群に２ヶ月齢の時点で高脂肪食を与えた。ブランクコントロール群におけるマウスに標準的な実験用飼料を与えた。給餌を３ヶ月間行った。５ヶ月齢の時点で、マウスの血糖を測定して、高脂肪食を与えられたマウスが血糖の上昇及び糖代謝障害を有するかどうかを判定することで、モデリングの成功を確認した。２種類の薬物投与があった。一方は急性投与であり、９つの薬物投与群におけるマウスに１回腹腔内注射（５ｍｇ／ｋｇ）し、３０分後に対応する空腹時血糖及び耐糖能を測定した。もう一方は長期投与であり、９つの薬物投与群におけるマウスに２ヶ月間腹腔内注射（５ｍｇ／ｋｇ／日）した。ブランクコントロール群及びモデルコントロール群に同量の生理食塩水を腹腔内注射した。薬物投与の１ヶ月後又は２ヶ月後に、全てのマウスを一晩中１６時間絶食させて空腹時血糖を検出し、次いで、ブドウ糖（体重１ｇ当たり１．５ｍｇ）を胃内投与した後、血糖値をそれぞれ１５分、３０分、４５分、６０分、及び１２０分の時点で検出した。
【0091】
６．１．２．ＨＥ染色
上記試験の完了後、各群における動物を安楽死させ、動物の膵臓を速やかに採集し、４％のパラホルムアルデヒド中で固定した後、固定された動物の膵臓組織を包埋ボックスに入れ、流水で３０分間洗浄して固定溶液を除去した。組織をアルコール勾配（５０％、７０％、８０％、９５％、無水エタノール）により脱水し、環境的透明剤（environmental transparent agent）で処理した。透明組織を純粋なパラフィン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）中に毎回１時間ずつ順次浸して、組織を包埋し、残りの透明剤を完全に除去した。包埋した膵臓組織をパラフィンスライサーで連続的に３μｍの切片にスライスし、スライスを後の使用に備えて６０℃で１時間ベーキングした。スライスをキシレン中に１５分間入れて脱ワックスし、これを３回繰り返した後、スライスを勾配エタノール（１００％、８５％、及び７５％）中にそれぞれ５分間浸し、流した水道水で５分間すすいでスライスを脱ワックスする。スライスをヘマトキシリン染料溶液中で５分間染色した後、余分な染料溶液を水道水で洗い流し、０．７％の塩酸エタノールを使用して１０秒間色を分離し、スライスを核及び核クロマチンが透き通るまで水道水で洗浄した。スライスを７０％及び９０％のエタノールで１０分間脱水し、０．５％のエオシン溶液で５分間染色し、余分な染料を水道水で洗い流した。染色したスライスを７０％、８０％、９０％、及び１００％のエタノールで１０秒間脱水し、透明剤でヒアリン化し、換気した場所で乾燥させた。適量の中性ガムを垂らした後、スライスをカバーガラスで密封した。病理切片を光学顕微鏡により観察し、写真を撮影した。
上記試験の完了後、各群における動物を安楽死させ、動物の膵臓を速やかに採集し、４％のパラホルムアルデヒド中で固定した後、固定された動物の膵臓組織を包埋ボックスに入れ、流水で３０分間洗浄して固定溶液を除去した。組織をアルコール勾配（５０％、７０％、８０％、９５％、無水エタノール）により脱水し、環境的透明剤（environmental transparent agent）で処理した。透明組織を純粋なパラフィン（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）中に毎回１時間ずつ順次浸して、組織を包埋し、残りの透明剤を完全に除去した。包埋した膵臓組織をパラフィンスライサーで連続的に３μｍの切片にスライスし、スライスを後の使用に備えて６０℃で１時間ベーキングした。スライスをキシレン中に１５分間入れて脱ワックスし、これを３回繰り返した後、スライスを勾配エタノール（１００％、８５％、及び７５％）中にそれぞれ５分間浸し、流した水道水で５分間すすいでスライスを脱ワックスする。スライスをヘマトキシリン染料溶液中で５分間染色した後、余分な染料溶液を水道水で洗い流し、０．７％の塩酸エタノールを使用して１０秒間色を分離し、スライスを核及び核クロマチンが透き通るまで水道水で洗浄した。スライスを７０％及び９０％のエタノールで１０分間脱水し、０．５％のエオシン溶液で５分間染色し、余分な染料を水道水で洗い流した。染色したスライスを７０％、８０％、９０％、及び１００％のエタノールで１０秒間脱水し、透明剤でヒアリン化し、換気した場所で乾燥させた。適量の中性ガムを垂らした後、スライスをカバーガラスで密封した。病理切片を光学顕微鏡により観察し、写真を撮影した。
【0092】
６．１．３．インスリン免疫組織化学
プロトコルＩの試験が完了した後、３μｍの膵臓スライスを順次取得した。３μｍの膵臓スライスを脱ワックスした後、これらを室温で３％Ｈ２Ｏ２の脱イオン水とともに５分間～１０分間インキュベートして内因性過酸化物をブロックし、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で５分間３回洗浄した。スライスを抗原修復溶液中に入れ、マイクロ波オーブンにおいて抗原を修復した。自然冷却後、スライスをＰＢＳで５分間３回洗浄した。５％のＢＳＡブロッキング溶液を滴加し、スライスを３７℃で３０分間インキュベートした。ブロッキング溶液を捨て、インスリン免疫組織化学一次抗体インキュベーション溶液（抗体比：１：２００）を加え、３７℃で１時間～２時間インキュベートし、ＰＢＳで５分間３回すすいで余分な一次抗体を除去した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体インキュベーション溶液を滴加し、スライスを３７℃で３０分間インキュベートした。スライスをＰＢＳで５分間３回洗浄した。スライスをＤＡＢで着色し、顕微鏡下で観察して発色時間を制御し、水道水で洗浄して染色を終わらせた。核をヘマトキシリンで対比染色し、水道水ですすぎ、様々な濃度のアルコール（７５％、８５％、及び１００％）で勾配脱水し、透明剤及び中性ガム密封を施した。膵臓組織を顕微鏡により観察し、インスリンの発現を免疫組織化学により検出し、写真撮影した。各スライスから、膵島を含む３つの視野（４００倍）を無作為に選択した。各視野の平均光学密度を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓバージョン６．０ソフトウェアを使用することによって定量的に測定し、スライスの平均光学密度として平均値を取った。
プロトコルＩの試験が完了した後、３μｍの膵臓スライスを順次取得した。３μｍの膵臓スライスを脱ワックスした後、これらを室温で３％Ｈ２Ｏ２の脱イオン水とともに５分間～１０分間インキュベートして内因性過酸化物をブロックし、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で５分間３回洗浄した。スライスを抗原修復溶液中に入れ、マイクロ波オーブンにおいて抗原を修復した。自然冷却後、スライスをＰＢＳで５分間３回洗浄した。５％のＢＳＡブロッキング溶液を滴加し、スライスを３７℃で３０分間インキュベートした。ブロッキング溶液を捨て、インスリン免疫組織化学一次抗体インキュベーション溶液（抗体比：１：２００）を加え、３７℃で１時間～２時間インキュベートし、ＰＢＳで５分間３回すすいで余分な一次抗体を除去した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体インキュベーション溶液を滴加し、スライスを３７℃で３０分間インキュベートした。スライスをＰＢＳで５分間３回洗浄した。スライスをＤＡＢで着色し、顕微鏡下で観察して発色時間を制御し、水道水で洗浄して染色を終わらせた。核をヘマトキシリンで対比染色し、水道水ですすぎ、様々な濃度のアルコール（７５％、８５％、及び１００％）で勾配脱水し、透明剤及び中性ガム密封を施した。膵臓組織を顕微鏡により観察し、インスリンの発現を免疫組織化学により検出し、写真撮影した。各スライスから、膵島を含む３つの視野（４００倍）を無作為に選択した。各視野の平均光学密度を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓバージョン６．０ソフトウェアを使用することによって定量的に測定し、スライスの平均光学密度として平均値を取った。
【0093】
６．２．結果
図１４Ａは、同時にモデリング及び薬物投与を行うプロトコルＩからの空腹時血糖値の試験結果を示している。図１４Ａに示されるように、モデルコントロール群の空腹時血糖は２０．３±４．１ｍＭであり、これはブランクコントロール群における正常マウスの空腹時血糖（１１．５±２．１ｍＭ、Ｐ＜０．０１、＃＃）よりも有意に高かった。Ｓ８薬物投与群の空腹時血糖は１３．１±２．３ｍＭであり、これはモデルコントロール群の空腹時血糖よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ９薬物投与群の空腹時血糖は１５．１±２．９ｍＭに低下し、これはモデルコントロール群の空腹時血糖と有意差がある（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ１薬物投与群の空腹時血糖は１６．７±１．７ｍＭに低下し、これはモデルコントロール群の空腹時血糖と有意差はない（Ｐ＞０．０５）。Ｓ２投与群～Ｓ７投与群はモデルコントロール群と同レベルであり、明らかな効果を有しなかった。
図１４Ａは、同時にモデリング及び薬物投与を行うプロトコルＩからの空腹時血糖値の試験結果を示している。図１４Ａに示されるように、モデルコントロール群の空腹時血糖は２０．３±４．１ｍＭであり、これはブランクコントロール群における正常マウスの空腹時血糖（１１．５±２．１ｍＭ、Ｐ＜０．０１、＃＃）よりも有意に高かった。Ｓ８薬物投与群の空腹時血糖は１３．１±２．３ｍＭであり、これはモデルコントロール群の空腹時血糖よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ９薬物投与群の空腹時血糖は１５．１±２．９ｍＭに低下し、これはモデルコントロール群の空腹時血糖と有意差がある（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ１薬物投与群の空腹時血糖は１６．７±１．７ｍＭに低下し、これはモデルコントロール群の空腹時血糖と有意差はない（Ｐ＞０．０５）。Ｓ２投与群～Ｓ７投与群はモデルコントロール群と同レベルであり、明らかな効果を有しなかった。
【0094】
図１４Ｂは、同時にモデリング及び薬物投与を行うプロトコルＩからの耐糖能レベルの試験結果を示しており、ここで、０時間は、図１４Ａにおける空腹時血糖に対応する。モデルコントロール群における各時点での血糖値は、ブランクコントロール群における血糖値よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１、＃＃）ことから、これはモデリングが成功したことを示している。Ｓ１薬物投与群における空腹時血糖値及びブドウ糖を与えた後の様々な時点での血糖値はモデルコントロール群における値よりも低く、ここで、空腹時血糖（０時間）、０．５時間、及び２時間のデータ（Ｐ＜０．０５、＊）は有意差があることから、これはＳ１薬物が或る特定の低血糖効果を有することを示している。Ｓ９薬物投与群はＳ１薬物投与群と同様であるが、空腹時血糖（０時間）、０．５時間、１．５時間、及び２時間のデータはモデルコントロール群のデータと比較して有意差がある（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ８薬物投与群の０時間、０．５時間、１時間、１．５時間、及び２時間の時点での血糖値はモデルコントロール群の血糖値よりも有意に低く（０時間、Ｐ＜０．０５、＊、残りの時点、Ｐ＜０．０１、＊＊）、血糖の減少幅はＳ１薬物及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物よりもはるかに大きかった（０．５時間～２．０時間の血糖の結果においては、血糖低下の減少幅はほぼ２倍超であった）。Ｓ２薬物の投与では、全ての時点で血糖は有意に低下しなかった。Ｓ３薬物～Ｓ７薬物の結果はＳ２薬物の結果と同様であり、明らかな効果は見られなかったため、本明細書においてはこれらを詳細に説明しない。
【0095】
図１５は、モデリング後に薬物を様々な様式で投与するプロトコルＩＩからの空腹時血糖及び耐糖能の結果を示している。図１５Ａは、急性薬物投与後の耐糖能の結果を示しており（比較の便宜上、Ｓ２、Ｓ８、及びＳ９のデータのみを示している）、ここで、０分は、空腹時血糖に相当する。図１５Ａに示されるように、モデルコントロール群における空腹時血糖及び他の時点での血糖のデータはどちらも、ブランクコントロール群におけるデータよりも有意に高い（Ｐ＜０．０５、＃）ことから、これはモデリングの成功を示している。その中でも、モデルコントロール群の０時間空腹時血糖は１０．８±２．３ｍＭであったのに対し、ブランクコントロール群の０時間空腹時血糖は６．７±１．１ｍＭであった。各薬物投与群における急性薬物投与のため、それらの空腹時血糖はモデルコントロール群の空腹時血糖と有意差がなかった。金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群では、ブドウ糖を与えた後の各時点での血糖値はモデルコントロール群における血糖値よりも低く、１５分の時点での結果は有意差があった（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ１薬物投与群はＳ９薬物投与群と同様であったため、本明細書においてはこれを詳細に説明しない。Ｓ８薬物では、モデルコントロール群に対する各時点での血糖の減少幅はＳ９薬物投与群の減少幅よりも大きく（減少幅は１５分～６０分の時点で３９％～２．２倍高かった）、１５分、３０分、４５分、及び６０分の時点でモデルコントロール群と比較して有意差が見られた（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ２薬物投与群は、全ての時点でモデルコントロール群と同じレベルを示した。Ｓ３薬物投与群～Ｓ７薬物投与群はＳ２薬物投与群と同様であり、各時点でモデルコントロール群と同じレベルであった。
【0096】
図１５Ｂ及び図１５Ｃは、それぞれ１ヶ月間連続又は２ヶ月間連続の薬物投与後のプロトコルＩＩからの空腹時血糖の結果である（比較の便宜上、Ｓ２、Ｓ８、及びＳ９のデータのみを示す）。モデルコントロール群の空腹時血糖はそれぞれ１２．２±０．７ｍＭ及び１０．４±０．６ｍＭであり、これらは、ブランクコントロール群のデータ（５．８±０．５ｍＭ及び５．５±０．３ｍＭ）と比較して有意に増加した（Ｐ＜０．０１、＃＃）。Ｓ９薬物投与群の値は減少したが、モデルコントロール群と比較して有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。Ｓ８薬物投与群の減少幅はより大きく、値はそれぞれ９．８±０．３ｍＭ及び８．３±０．４ｍＭに有意に減少し（減少幅はそれぞれＳ９薬物より３５％及び３．２倍高い）、これはモデルコントロール群と比較して有意であった（Ｐ＜０．０５、＊）。Ｓ２薬物投与群はモデルコントロール群のレベルと同じレベルであり、明らかな減少は見られなかった。Ｓ３薬物～Ｓ７薬物はＳ１薬物と同様であり、大きな減少は見られなかったため、本明細書においてはこれらを詳細に説明しない。
【0097】
図１５Ｄは、Ｓ８薬物の２ヶ月連続の薬物投与後の耐糖能の結果を示している。図１５Ｄに示されるように、０分、１５分、３０分、６０分、及び１２０分の時点でのＳ８薬物投与群の血糖値はモデルコントロール群の血糖値よりも有意に低く（Ｐ＜０．０５、＊）、これによりＳ８薬物の優れた低血糖効果が検証された。
【0098】
上記の結果により、Ｓ８薬物が優れた低血糖効果を示し、その効果がＳ１薬物及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物よりも有意に良好であることが相互に裏付けられ、総合的に示される。Ｓ２薬物～Ｓ７薬物は明らかな低血糖効果を有しなかった。
【0099】
図１６－１および図１６－２は、同時にモデリング及び薬物投与を行うプロトコルＩからのＨＥ染色及びインスリン免疫組織化学の結果を示している。図１６Ａ、図１６Ｂ、及び図１６Ｃは、それぞれブランクコントロール群、モデルコントロール群、及びＳ８薬物投与群の例示的な免疫組織化学画像である。免疫組織化学の結果により、各群におけるマウスでは黄色乃至褐色のインスリン陽性信号が見られることが示された（備考：灰色の画像では褐色がより暗く、灰色の画像では黄色がより明るかった）。主な発現位置は膵島細胞であった。ブランクコントロール群におけるインスリン染色は強い褐色の陽性信号を示し（図１６Ａにおいて点線で囲まれた領域によって示されるように、この色は灰色の画像においては非常に暗かった）、モデルコントロール群におけるインスリン染色信号は大幅に弱まり、色は大幅により明るく、まばらな薄褐色乃至黄色となり（図１６Ｂにおいて点線で囲まれた領域によって示されるように、この色は灰色の図においてはより明るかった）、一方、Ｓ８薬物投与群におけるマウスはブランクコントロール群における正常マウスと同様であり、強い褐色の陽性信号を示した（図１６Ｃにおいて点線で囲まれた領域によって示されるように、この色は灰色の図においては非常に暗かった）。図１６Ｄは、ブランクコントロール群、モデルコントロール群、及び様々な薬物投与群の平均光学密度値の統計結果を示している。図１６Ｄに示されるように、モデルコントロール群におけるインスリンの発現はブランクコントロール群における発現よりも有意に低く（Ｐ＜０．０５、＃）、Ｓ１薬物投与群及びＳ９薬物投与群におけるインスリンの発現はモデルコントロール群における発現よりも高かった（Ｓ９薬物投与群においてより顕著）が、その差は有意ではなかった（Ｐ＞０．０５）ことから、これは、Ｓ１及びＳ９が膵島に対して何らかの保護効果を有することを示している。モデルコントロール群と比較して、Ｓ８薬物投与群は有意に高いインスリン発現を示した（Ｐ＜０．０５、＊）ことから、これは、Ｓ８薬物が膵島の障害からの保護又は膵島障害の修復に対して非常に良好な効果を有することを示している。Ｓ２薬物投与群はインスリン発現がモデルコントロール群と同じレベルであったことから、これは、Ｓ２薬物が膵島を保護又は修復する機能を有しなかったことを示している。Ｓ３薬物～Ｓ７薬物はＳ２薬物と同様であったため、本明細書においてはこれらを詳細に説明しない。プロトコルＩＩにおけるモデリング後の薬物投与の試験結果はここでの結果と同様であった。Ｓ８薬物はまた膵島の損傷からの保護又は膵島損傷の修復に対して有意な効果を示した（モデルコントロール群と比較して、Ｐ＜０．０１）。Ｓ９はまたモデルコントロール群の効果と有意差のある或る特定の効果を有するが（Ｐ＜０．０５）、Ｓ９はＳ８薬物よりもはるかに有効性が低い。
【0100】
一方、ＨＥ染色の結果により、ブランクコントロール群（図１６Ｅ）と比較して、モデルコントロール群（図１６Ｆ）の膵臓が、主に膵島の数の減少、膵島容積の激しい減少、膵島細胞の数の大幅な減少、及び軽度乃至中等度の膵島炎症として現れる明らかな組織学的変化を示したことが明らかとなる。Ｓ８薬物投与群（図１６Ｇ）において、モデルコントロール群と比較して膵島の組織構造が大幅に改善され、ブランクコントロール群と比較して、膵島における異常な変化も炎症細胞浸潤も見られなかったことから、これはまた、膵島に対するＳ８薬物の優れた保護効果を示している。Ｓ９薬物投与群の膵島組織構造もモデルコントロール群と比較して大幅に改善されたが、その効果はＳ８薬物投与群の効果よりははるかに明らかではなく、より具体的には、膵島容積が或る程度まで減少し、膵島細胞の数も減少し、膵島において少量の炎症細胞浸潤も現れた。Ｓ１薬物はＳ９薬物よりも有効性が低いが、モデルコントロール群と比べて比較的良好な効果を示す。Ｓ２薬物投与群はモデルコントロール群と同じレベルであったことから、これは、Ｓ２薬物が膵島を保護又は修復する機能を有しなかったことを示している。薬物Ｓ３～薬物Ｓ７は薬物Ｓ２と同様であり、明らかな効力を示さないため、本明細書において詳細な説明を示さない。
【0101】
これらの結果により、Ｓ８薬物は血糖指標を有意に改善することができるだけでなく、膵島を障害から保護し、又は膵島の障害を修復することができ、その効果は金クラスター粗生成物Ｓ９薬物及び他の薬物の効果よりもはるかに良好であることが明らかとなる。
【0102】
上記の結果により、同じリガンドを含む様々な金クラスター分子の分子構造が、２型糖尿病の予防及び治療に対して大きな影響を与えることが明らかとなる。リガンドＬ－ＮＩＢＣを含む様々な金クラスター分子に関して、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４（Ｓ８薬物）は２型糖尿病の予防及び治療に対して優れた効果を示し、金クラスター粗生成物及び他の７つの金クラスター分子よりも２型糖尿病の予防及び治療において非常に大幅な利点を有する。
【0103】
一方、膵島損傷はＩ型糖尿病の典型的な特性の１つである。膵島保護及び膵島修復におけるＳ８薬物の優れた役割はＩ型糖尿病の予防及び治療において大きな利点及び幅広い適用の見込みがある。
【0104】
更なる研究により、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物にＳ８薬物を加えて混合薬物を得たところ、混合薬物中のＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の含有量が７％に達すると、混合薬物の治療効果が有意に増加したことが明らかとなる。
【0105】
実施形態７．パーキンソン病（ＰＤ）動物モデル実験
７．１．方法
ＭＰＴＰ（１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン）損傷モデルは、ＰＤ研究において広く使用されている動物モデルである。この研究ではこの動物モデルを使用した。実験動物はＳＰＦ雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスであった。マウスを、各群に１２匹のマウスが含まれるブランクコントロール群、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群へと無作為に分けた。モデルコントロール群のマウスに、ＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を７日間腹腔内注射してＭＰＴＰ誘発ＰＤマウスモデルを樹立し、ブランクコントロール群に同量の生理食塩水を腹腔内注射した。各薬物投与群に、最初にＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を腹腔内注射した後、０．５時間後に、対応する薬物（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を１日１回、７日間連続で腹腔内注射した。
７．１．方法
ＭＰＴＰ（１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン）損傷モデルは、ＰＤ研究において広く使用されている動物モデルである。この研究ではこの動物モデルを使用した。実験動物はＳＰＦ雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスであった。マウスを、各群に１２匹のマウスが含まれるブランクコントロール群、モデルコントロール群、Ｓ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群へと無作為に分けた。モデルコントロール群のマウスに、ＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を７日間腹腔内注射してＭＰＴＰ誘発ＰＤマウスモデルを樹立し、ブランクコントロール群に同量の生理食塩水を腹腔内注射した。各薬物投与群に、最初にＭＰＴＰ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を腹腔内注射した後、０．５時間後に、対応する薬物（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を１日１回、７日間連続で腹腔内注射した。
【0106】
モデル動物の行動に対する薬物の効果をオープンフィールド、ロータロッド試験、及び水泳試験によって分析した。具体的な方法は以下の通りである：
【0107】
オープンフィールド：実験のために、動物を給餌ケージから自発活動検出器に移す。動物を新しい環境に５分間順応させた後、５分以内にそれらの自発的な活動及び変化の記録を始め、次いで、５分以内の動物の移動距離及び移動速度によってそれらの活動能力の強さを測定する。
【0108】
ロータロッド試験：動物は回転するロッドの上でバランスを保って連続的に移動する必要がある。これは動作協調性を見るのに広く使用されている実験である。実験のために、動物を回転するロッドの上に置いて滑らないようにする。ローラーの直径は６ｃｍであり、回転速度は２０ｒｐｍ／分であった。５回の順応後、動物を毎回１５分間試験し、３連続の回について平均値を取る。動物が滑り落ちると、それに応じて下部の感知プラットフォームが停止し、回転するロッドからの落下の潜時が記録される。各試験において、ロッドから落ちる潜時及びロッドから落ちる動物の数を記録する。
【0109】
水泳試験：試験対象のマウスを６０ｃｍの水深及び２２℃の水温を有するモリス水槽に入れる。１０分間以内での動物の水泳距離及び水泳時間を記録して、それらの活動能力の強さを測定する。
【0110】
行動試験後、脳内線条体内のタンパク質をウエスタンブロット（ＷＢ）により検出した。脳の必要な部分を氷から取り出し、ＲＩＰＡ溶解バッファーで溶解した。均質物を４℃、１２０００ｇで３０分間遠心分離し、タンパク質を抽出し、試料を調製した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動を５５Ｖ～６０Ｖで４．５時間実施し、タンパク質を半乾式法により６０ｍＡにて約１．５時間かけてメンブレンに転写した。メンブレンを室温で５％の脱脂粉乳により１時間ブロッキングし、ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をＴＢＳＴで希釈したもの（希釈比１：３００）を加え、４℃で一晩インキュベートした。抗体を回収し、メンブレンをＴＢＳＴにより１回当たり１０分で３回洗浄した。ＩＲＤｙｅ Ｒ ６８０ＲＤヤギ抗ウサギをＴＢＳＴで希釈したもの（希釈比１：３０００）を加え、ＴＢＳＴにより１回当たり１０分で３回洗浄した。タンパク質信号を２色赤外線レーザーイメージングシステムによってスキャンした。
【0111】
全てのデータをＰｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアにより処理し、データはｔ検定又は一元配置ＡＮＯＶＡを使用してｘ－±ＳＤで表され、Ｐ＜０．０５は、差が統計的に有意であることを示す。
【0112】
【0113】
モデルコントロール群におけるマウスは、ＭＰＴＰ投与から３分後～５分後に振戦、運動の低下、背中を丸めた姿勢、後肢の開き、不安定な歩行、立てた尻尾、及び逆立った毛を示し、１匹又は２匹のマウスは癲癇発作を示した。上記の症状は３０分後～６０分後に徐々に軽減し、基本的に２４時間後には正常に戻った。しかしながら、投与回数が増えるにつれて急性反応は減少したが、２４時間後には運動の低下、歩行の不安定性、及び鈍い応答がますます顕著になった。
【0114】
図１７Ａ及び図１７Ｂに示されるように、ＭＰＴＰを７日間連続で注射した後、ブランクコントロール群と比較して、モデルコントロール群におけるマウスの自発運動距離は約３２％減少し（Ｐ＜０．０１、＃＃）、移動速度は約２９％減少した（Ｐ＜０．０１、＃＃）ことから、これは運動遅延の症状を示している。Ｓ８薬物投与群の自発運動距離及び移動速度はモデルコントロール群の自発運動距離及び移動速度よりも有意に高く（Ｐ＜０．０１、＊＊）、ブランクコントロール群のレベルまでほぼ回復した。Ｓ９薬物投与群の自発運動距離及び移動速度もモデルコントロール群の自発運動距離及び移動速度より有意に高かった（Ｐ＜０．０５、＊）が、増加幅はＳ８薬物投与群よりも有意に小さかった（Ｓ８薬物投与群の自発運動距離及び移動速度の増加幅はＳ９薬物投与群の増加幅よりもそれぞれ５１％及び１３９％高かった、Ｐ＜０．０５）。Ｓ１薬物投与群はＳ９薬物投与群と同様であり、モデルコントロール群の増加幅と比較して有意な増加を示した（Ｐ＜０．０５）が、増加幅はＳ８薬物投与群よりも有意に小さかった。Ｓ２薬物投与群～Ｓ７薬物投与群はモデルコントロール群と比較して自発運動距離及び移動速度の点で有意差を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。
【0115】
マウスの水泳能力試験において、水泳時間が長く、水泳距離が長いほど、四肢の運動協調性はより良好である。図１７Ｃ及び図１７Ｄに示されるように、ブランクコントロール群と比較して、モデルコントロール群におけるマウスの１０分間の水泳距離は約２７％減少し、水泳時間は約１８％減少した（Ｐ＜０．０１、＃＃）。モデルコントロール群と比較して、Ｓ８薬物投与群の水泳距離及び水泳時間は有意に増加し（Ｐ＜０．０１、＊＊）、ここで、水泳距離は３３％増加し、水泳時間は２１％増加した。モデルコントロール群と比較して、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物投与群の水泳距離及び水泳時間も有意に増加した（それぞれ２１％及び１１％増加）が、増加幅はＳ８薬物投与群よりも有意に小さかった（Ｓ９薬物投与群とＳ８薬物投与群との比較、Ｐ＜０．０５、＄）。Ｓ１薬物投与群はＳ９薬物投与群と同様であり、またモデルコントロール群と比較して有意な増加を示したが、増加幅はＳ８薬物投与群よりも有意に小さかった。残りのＳ２薬物～Ｓ７薬物の値はモデルコントロール群の値と同様であり、モデルコントロール群とは有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）。
【0116】
図１７Ｅ及び図１７Ｆに示されるように、ロータロッド行動試験において、ブランクコントロール群におけるマウスは１３．１±２．１分の落下潜時及び３１±１．６％の落下率を示した。モデルコントロール群におけるマウスの落下潜時は５．６±１．８分に有意に減少し、落下率は７８．１±５．０％に有意に増加したことから、これは、ＭＰＴＰモデリングにより運動協調能力が低下し、掴みが不安定になり、落下しやすくなることを示している。モデルコントロール群と比較して、Ｓ８薬物投与群の落下潜時は有意に増加し（Ｐ＜０．０１、＊＊）、落下率は極めて有意に減少した（Ｐ＜０．０００１、＊＊＊）。これらの結果により、Ｓ８がＭＰＴＰ誘発性運動協調機能障害を見事に改善する機能を有することが実証された。金クラスター粗生成物Ｓ９投与群では、落下潜時は延長し（Ｐ＜０．０５、＊）、落下率も有意に減少した（Ｐ＜０．０１、＊＊）が、増加幅及び減少幅はＳ８薬物投与群よりも小さかった（Ｓ８とＳ９とを比較すると、落下率に有意差がある、Ｐ＜０．０５、＄）。Ｓ１薬物投与群はＳ９薬物投与群と同様であり、またモデルコントロール群と比較して落下潜時及び落下率の有意な改善も示した（Ｐ＜０．０５、＊）が、改善の幅もＳ８薬物投与群より明らかに小さかった。その他の薬物投与群はそれらの落下潜時及び落下率においてモデルコントロール群と同等又は同様のレベルであり、有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５）ことから、これは有意な効力が見られないことを示している。
【0117】
ウエスタンブロット（ＷＢ）を使用して、脳内線条体におけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）タンパク質の発現を更に検出した。ＴＨはドーパミン（ＤＡ）生合成経路の主要な酵素である。ＴＨイムノブロット法は組織内のＴＨの発現レベルを示すことができるため、ＤＡニューロンの変化が明らかとなる。図１８はＷＢ試験の結果を示している。図１８に示されるように、ＭＰＴＰ処理により、モデルコントロール群におけるＴＨ発現レベルはブランクコントロール群におけるＴＨ発現レベルの４７．５±３．７％まで減少した。金クラスター粗生成物Ｓ９の処理により、モデリングしたマウスにおけるＴＨ発現レベルはブランクコントロール群におけるＴＨ発現レベルの７１．１±２．３％まで回復し、モデルコントロール群と比較して有意差が示された（Ｐ＜０．０１、＊＊）ことから、これは、金クラスター粗生成物Ｓ９がＤＡニューロンの特定の損失に対して比較的良好な保護効果を有することを示している。Ｓ８薬物の処理により、モデリングしたマウスにおけるＴＨ発現レベルはブランクコントロール群におけるＴＨ発現レベルの９１．８±３．３％まで回復し、モデルコントロール群と比較して極めて有意な差を示し（Ｐ＜０．００１、＊＊＊）、また、Ｓ９薬物投与群と比較しても有意な差を示した（Ｐ＜０．０５、＄）ことから、これは、Ｓ８薬物がＤＡニューロンの特定の損失に対して優れた保護効果を有し、その保護効果が金クラスター粗生成物Ｓ９よりも優れていることを裏付けている。Ｓ１薬物の処理によっても、モデリングしたマウスにおけるＴＨ発現レベルは６０．７±４．２％まで回復した（Ｐ＜０．０５、＊）が、回復幅はＳ９投与群よりも明らかに小さく、Ｓ８薬物投与群よりも更に小さい。Ｓ２薬物投与群～Ｓ７薬物投与群におけるＴＨ発現量はモデルコントロール群の発現量と同じレベルであったことから、これは、Ｓ２薬物～Ｓ７薬物が有意な神経保護効果を有しないことを示している。
【0118】
上記の結果は、同じリガンドを含む様々な金クラスター分子の分子構造がそれらのＰＤの予防及び治療に対して大きな影響を与えることを示している。リガンドＬ－ＮＩＢＣを含む様々な金クラスター分子に関して、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４（Ｓ８薬物）がＡＤ治療に対して優れた治療効果を示した。金クラスター分子Ａｕ２５（Ｌ－ＮＩＢＣ）１８（Ｓ１薬物）及び金クラスター粗生成物Ｓ９薬物も明らかな治療効果を有するが、行動試験又はＴＨ ＷＢのいずれかからの効果は金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４（Ｓ８薬物）よりも小さい。他の６つの金クラスター分子は明らかな治療効果を有しなかった。これは、他の７つの金クラスター分子及び金クラスター粗生成物Ｓ９と比較して、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４がＰＤの予防及び治療において非常に大きな利点を有し、ＰＤの予防用及び治療用の薬物の製造により適していることを示している。
【0119】
更なる研究により、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物にＳ８薬物を加えて混合薬物を得たところ、混合薬物中のＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の含有量が７％に達すると、混合薬物の治療効果が有意に増加したことが明らかとなる。
【0120】
実施形態８．虚血再灌流緑内障動物モデル
８．１．方法
１００匹の雄ＳＤラットを、モデリング前のＥＲＧのｂ波振幅に応じて１０個の群に無作為に分けた。右眼に眼虚血再灌流モデリングを行い、左眼にはモデリング処置を行わず（ブランクコントロールとして）、モデリング当日（１日目、Ｄ１として数える）から投与を開始した。モデルコントロール群に処置を行わなかったことを除き、残りは全て薬物投与群であり、これには、片方の眼当たり１ｍｇの用量で点眼によって１日３回、２１日間連続で投与したＳ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群が含まれる。Ｄ１の薬物投与時間をモデリングの約３時間前、２時間前、及び１時間前に設け、Ｄ１を除く残りの投与日の薬物投与間隔は３時間であった。試験中、動物には全身臨床観察及び局所眼観察を毎日行い、それらの体重を週１回測定した。薬物投与前並びに最初の薬物投与後の７日目（Ｄ８）、１４日目（Ｄ１５）、及び２１日目（Ｄ２２）に、動物を全視野網膜電図（ＥＲＧ）及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって検査した。
８．１．方法
１００匹の雄ＳＤラットを、モデリング前のＥＲＧのｂ波振幅に応じて１０個の群に無作為に分けた。右眼に眼虚血再灌流モデリングを行い、左眼にはモデリング処置を行わず（ブランクコントロールとして）、モデリング当日（１日目、Ｄ１として数える）から投与を開始した。モデルコントロール群に処置を行わなかったことを除き、残りは全て薬物投与群であり、これには、片方の眼当たり１ｍｇの用量で点眼によって１日３回、２１日間連続で投与したＳ１薬物投与群、Ｓ２薬物投与群、Ｓ３薬物投与群、Ｓ４薬物投与群、Ｓ５薬物投与群、Ｓ６薬物投与群、Ｓ７薬物投与群、Ｓ８薬物投与群、及びＳ９薬物投与群が含まれる。Ｄ１の薬物投与時間をモデリングの約３時間前、２時間前、及び１時間前に設け、Ｄ１を除く残りの投与日の薬物投与間隔は３時間であった。試験中、動物には全身臨床観察及び局所眼観察を毎日行い、それらの体重を週１回測定した。薬物投与前並びに最初の薬物投与後の７日目（Ｄ８）、１４日目（Ｄ１５）、及び２１日目（Ｄ２２）に、動物を全視野網膜電図（ＥＲＧ）及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって検査した。
【0121】
最後の検査の後、全ての動物を安楽死させて肉眼解剖学的観察を行い、両眼の眼球を採集し、デビッドソン溶液中に固定して、サンプリング、パラフィン包埋、切片化、及びＨＥ染色を含む日常的な組織学的処理を行った。周囲の結合組織を除去した後、視神経を予冷したＰＦＡ固定溶液中に素早く入れ、素早く修復し、脱水し、樹脂で包埋し、超薄切片を得て、トルイジンブルー染色を行った。眼球及び視神経の様々な部分の構造を光学顕微鏡下で視神経軸索の形態、網膜の各層の厚さ、及び細胞の形態学的変化に着目して観察した。切片は病理学者により光学顕微鏡用いて検査及び評価された。病変を、標準用語を使用して診断し、等級分けした。顕微鏡検査の結果をそれぞれ軽微（１点）、軽度（２点）、中等度（３点）、及び重度（４点）の４つの等級分け方法により等級分けし、スコアリングして、群間の比較を容易にした。
【0122】
データの統計分析：データを統計ソフトウェアＳＰＳＳ ２２．０によって処理した。最初に、ルビーン検定を使用してデータの均一性を検定した。データが均一であった場合（Ｐ＞０．０５）、一元配置ＡＮＯＶＡを実施し、ルビーン検定分析によりデータが非正規分布であることが示される場合（Ｐ≦０．０５）、クラスカル・ウォリスノンパラメトリック検定を実施するものとする。クラスカル・ウォリスノンパラメトリック検定の結果が有意（Ｐ≦０．０５）である場合、マン・ホイットニーＵ検定を更に使用してペアワイズ比較を行う。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると見なした。
【0123】
８．２．結果
網膜電図（ＥＲＧ）は、虚血再灌流緑内障動物の視神経機能障害を評価するのに一般的な方法である。光刺激下で網膜視覚細胞によって生成される一群の複雑な電位変化を電極によって導き出し、適切な拡大装置（magnifying device）によって記録することができ、これが網膜視神経機能の変化を直接反映するＥＲＧ図である。
網膜電図（ＥＲＧ）は、虚血再灌流緑内障動物の視神経機能障害を評価するのに一般的な方法である。光刺激下で網膜視覚細胞によって生成される一群の複雑な電位変化を電極によって導き出し、適切な拡大装置（magnifying device）によって記録することができ、これが網膜視神経機能の変化を直接反映するＥＲＧ図である。
【0124】
図１９Ａは、モデリング後の７日目（Ｄ８）のモデルコントロール群におけるラットの左眼（正常眼）（右パネル）及び右眼（モデリングする眼）（左パネル）での例示的なＥＲＧ（ＤＡ３．０）を示している。図１９Ａに示されるように、左眼と右眼との間のａ波の振幅には有意差は見られないが、ｂ波には有意な変化が見られる。ブランクコントロールとして、正常な左眼のｂ波は正常な振幅で明瞭に見えたが、モデリングする右眼のｂ波の振幅は有意に減少し、波形は不明瞭になった。右眼及び左眼におけるＤＡ１０．０のｂ波振幅はＤＡ３．０の振幅と同様であり、また有意に変化した。上記の結果により、モデリングする眼の視神経機能が重度に低下し、モデリングが成功したことが明らかとなった。
【0125】
図１９Ｂ及び図１９Ｃは、それぞれ各群におけるラットの右眼での全視野ＥＲＧ ＤＡ３．０及びＤＡ１０．０のｂ波振幅の結果を示している。モデリング中及び薬物投与前に、各群におけるラット間に右眼でのｂ波の振幅に有意差は見られなかった。同時期でのモデルコントロール群と比較すると、Ｓ８薬物投与群におけるラットの右眼でのＤＡ３．０のｂ波振幅（図１９Ｂ）は、Ｄ８、Ｄ１５、及びＤ２２でのモデルコントロール群における振幅よりも有意に高く（Ｄ８：Ｐ＜０．０１、＊＊、Ｄ１５：Ｐ＜０．０５、＊、Ｄ２２：Ｐ＜０．０５、＊）、ＤＡ１０．０のｂ波振幅（図１９Ｃ）もモデルコントロール群の振幅よりも有意に高かった（全日、Ｐ＜０．０５、＊）。
【0126】
図１９Ｄは、投与後の７日目（Ｄ８）のＳ８薬物投与群におけるラットの左眼（正常眼）（右パネル）及び右眼（モデリング及び薬物投与する眼）（左パネル）での例示的なＥＲＧ ＤＡ３．０を示している。Ｓ８薬物投与後に、右眼のＥＲＧ波形は明瞭かつ正常であり、右眼と左眼との間でｂ波の形状及び振幅に有意差が見られないことが見て取れる。右眼及び左眼でのＥＲＧ ＤＡ１０．０のｂ波振幅はＤＡ３．０のｂ波振幅と同様であり、左眼と右眼との間に有意差は見られないため、本明細書においてはこれを詳細に説明しない。これらの結果により、Ｓ８薬物が虚血再灌流によって誘発される緑内障ラットモデルにおける視神経機能の障害を有意に改善し得ることが明らかとなる。
【0127】
Ｓ９薬物投与群におけるラットの右眼でのｂ波ＤＡ３．０の振幅もモデルコントロール群におけるラットの右眼での振幅より高く、Ｄ１５及びＤ２２で有意差を示した（Ｐ＜０．０５、＊）が、増加幅はＳ８薬物投与群におけるラットの右眼よりも明らかに低かった（Ｄ８で有意差が見られる、Ｐ＜０．０５、＄）。Ｓ９薬物投与群におけるラットの右眼でのｂ波ＤＡ１０．０の振幅もモデルコントロール群におけるラットの右眼での振幅よりも高く、Ｄ８で有意差が示された（Ｐ＜０．０５、＊）。これらの結果により、金クラスター粗生成物Ｓ９が虚血再灌流によって誘発された緑内障ラットモデルにおける視神経機能の障害を改善する効果を有するが、改善の効果はＳ８薬物よりも明らかに低いことが明らかとなった。
【0128】
Ｓ１薬物投与群におけるラットの右眼でのｂ波ＤＡ３．０の振幅はＤ８でモデルコントロール群におけるラットの右眼での振幅よりも有意に高く（Ｐ＜０．０５、＊）、Ｄ１５及びＤ２２では或る程度までの増加が見られたが、有意差はなかった。Ｓ１薬物投与群におけるラットの右眼でのｂ波ＤＡ１０．０の振幅はモデルコントロール群におけるラットの右眼での振幅よりも有意に高かった。これらの結果により、Ｓ１薬物が虚血再灌流によって誘発された緑内障ラットモデルにおける視神経機能の障害を改善する効果を有するが、改善の効果はＳ８薬物よりも明らかに低いことが明らかとなる。
【0129】
Ｓ２薬物～Ｓ７薬物は治療効果を一切示さなかった。
【0130】
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を更に使用して、ラット網膜の厚さ変化を調べた。これらの結果により、モデルコントロール群における視神経乳頭から７５０μｍ又は１５００μｍの右眼の網膜の厚さは日数が増えるにつれて徐々に減少傾向を示すことが明らかとなった。例えば、視神経乳頭から１５００μｍでは、モデリング前と比較してモデリング後の２１日目（Ｄ２２）に網膜の厚さが約１１％減少し、その差は有意であった（Ｐ＜０．０１）。モデリング及び薬物投与の後、Ｓ８薬物投与群におけるラットの右眼の厚さは対応する日にモデルコントロール群におけるラットの右眼の厚さよりも有意に厚く、その差は１４日目（Ｄ１５）（Ｐ＜０．０５）及び２１日目（Ｄ２２）（Ｐ＜０．０１）に有意であった。この結果はまたＳ８薬物がラットの網膜に対して及ぼす保護効果を示している。
【0131】
図２０は、虚血再灌流モデリング及び薬物投与によって誘発された眼底の病理学的変化をトルイジンブルーによる超薄切片の染色により示している。図２０Ａは病理学的スコアの結果を示し、図２０Ｂ、図２０Ｃ、及び図２０Ｄはそれぞれブランクコントロールとしての左眼、モデルコントロール群における右眼、及びＳ８薬物投与群における右眼の例示的な画像を示している。病理学的検査により、ブランクコントロールとしての左眼の視神経構造は明瞭であり、髄鞘は様々なサイズの絞輪（rings）を有し、明らかな異常は見られなかった（図２０Ｂ）。モデルコントロール群の右眼においては、モデリング後に重度の視神経構造障害及びミエリン喪失が観察された（図２０Ｃ）。モデルコントロール群の右眼と比較して、Ｓ９投与薬物群におけるラットの右眼はより良好な改善効果を示したが、視神経構造は或る程度病的であり、髄鞘の喪失は明らかであり、病理学的スコアはモデルコントロール群の右眼のスコアよりも有意に低かった（図２０Ａ）（Ｐ＜０．０５、＊）。モデルコントロール群の右眼と比較して、Ｓ２薬物投与群の右眼は極めて明らかな改善を示し、視神経構造は正常な左眼と同様に明瞭であり、少量の僅かな脱髄しか観察されず（図２０Ｄ）、病理学的スコアはモデルコントロール群の右眼のスコアよりも有意に低かった（図２０Ａ）（Ｐ＜０．００１、＊＊＊）。Ｓ９薬物投与群におけるラットの右眼と比較して、Ｓ８薬物投与群におけるラットの右眼の病理学的スコアは有意により低い（Ｐ＜０．０５、＄）ことから、これは、Ｓ８薬物の治療効果が金クラスター粗生成物Ｓ９薬物の治療効果よりもはるかに良好であることを示している。Ｓ１薬物はＳ９薬物と同様に或る特定の改善効果も示したが、Ｓ８薬物の効果よりも有意に低かったため、本明細書においてはこれを詳細に説明しない。Ｓ２薬物～Ｓ７薬物は明らかな効果を示さなかった。
【0132】
以上の結果により、同じリガンドを含む様々な金クラスター分子の分子構造が視神経保護におけるそれらの効果並びに緑内障の予防及び治療に対して大きな影響を与えることが明らかとなる。Ｌ－ＮＩＢＣを含む様々な金クラスター分子に関して、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４（Ｓ８薬物）が極めて優れた治療効果を有し、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物及び金クラスター分子Ａｕ２５（Ｌ－ＮＩＢＣ）１８（Ｓ１薬物）も明らかな治療効果を有するが、その治療効果は金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４よりもはるかに低い。他の６つの金クラスター分子は明らかな治療効果を有しない。上記の結果から、金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４は緑内障の予防及び治癒において極めて大きな利点を有することが見て取れる。
【0133】
更なる研究により、金クラスター粗生成物Ｓ９薬物にＳ８薬物を加えて混合薬物を得たところ、混合薬物中のＡｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の含有量が７％に達すると、混合薬物の治療効果が有意に増加したことが明らかとなる。
【0134】
本発明は特定の実施形態を参照して説明されているが、実施形態は例示的なものであり、本発明の範囲は限定されないことが理解されるであろう。本発明の代替的な実施形態は、本発明が属する技術分野における当業者には明らかとなるであろう。このような代替的な実施形態は、本発明の範囲内に含まれるものと見なされる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定され、上述の説明によって裏付けられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌ－Ｎ－イソブチリルシステイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）結合金クラスター分子であって、金コアと、
前記金コアに結合されたリガンドＬ－ＮＩＢＣと、
を含み、
Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４の式を有する、Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子。
【請求項2】
被験体における疾患の予防及び／又は治療における請求項１に記載のＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４
の使用。
【請求項3】
前記疾患は、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、又は緑内障である、請求項２に記載の使用。
【請求項4】
請求項１に記載のＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を含む組成物であって、被験体における疾患を治療するために使用される、組成物。
【請求項5】
前記Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４が前記組成物中の金クラスター分子の混合物中の成分として使用される場合、前記Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４は、前記混合物中の少なくとも７％のクロマトグラフィー含有量を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記疾患は、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、又は緑内障である、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項7】
被験体における疾患の予防及び／又は治療における請求項４又は５に記載の組成物の使用であって、前記被験体に前記組成物を投与することを含み、
ここで、前記組成物は、請求項１に記載のＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４を含む、使用。
【請求項8】
前記Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４が前記組成物中の金クラスター分子の混合物中の成分として使用される場合、前記Ｌ－ＮＩＢＣ結合金クラスター分子Ａｕ１８（Ｌ－ＮＩＢＣ）１４は、前記混合物中の少なくとも７％のクロマトグラフィー含有量を有する、請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記疾患は、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、肝硬変、糖尿病、パーキンソン病（ＰＤ）、又は緑内障である、請求項７又は８に記載の使用。【国際調査報告】