特表 2025-503539 ＴｒｋＡ抗体とその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-04

(54)【発明の名称】ＴｒｋＡ抗体とその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20250128BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20250128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20250128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20250128BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20250128BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20250128BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K19/00

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61K39/395 D

A61K48/00

A61K35/12

A61P43/00 111

A61P29/00

A61P29/00 101

A61P19/02

A61P25/00

A61P21/00

C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024539492

(86)(22)【出願日】2022-12-27

(85)【翻訳文提出日】2024-06-27

(86)【国際出願番号】 CN2022142180

(87)【国際公開番号】W WO2023125477

(87)【国際公開日】2023-07-06

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/142017

(32)【優先日】2021-12-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524243941

【氏名又は名称】４ビー テクノロジーズ（スーヂョウ） リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】グァン シャオミン

(72)【発明者】

【氏名】リュイ チェン

(72)【発明者】

【氏名】ルゥ バイ

(72)【発明者】

【氏名】ルゥ ガン

(72)【発明者】

【氏名】ヂョウ ジュン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ドン

(72)【発明者】

【氏名】シエ ジエ

(72)【発明者】

【氏名】スー ジン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084MA17

4C084MA22

4C084MA23

4C084MA28

4C084MA31

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA08

4C084ZA20

4C084ZA21

4C084ZA94

4C084ZA96

4C084ZB11

4C084ZB15

4C084ZC02

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB31

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085BB44

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG08

4C085GG10

4C087AA01

4C087AA02

4C087MA17

4C087MA22

4C087MA23

4C087MA28

4C087MA31

4C087MA35

4C087MA37

4C087MA43

4C087MA52

4C087MA60

4C087MA63

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA08

4C087ZA20

4C087ZA21

4C087ZA94

4C087ZA96

4C087ZB11

4C087ZB15

4C087ZC02

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ＴｒｋＡ抗体、前記抗体を含む組成物、および疼痛などのＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害の予防および／または治療のために前記抗体を使用する方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体またはその抗原結合断片であって、ＴｒｋＡに特異的に結合し、以下からなる群より選択される１つ以上の特性：
１） ＯｃｔｅｔまたはＳＰＲで測定した場合、約５＊１０^－８Ｍ未満のＫ_ＤでＴｒｋＡに結合できること、
２） ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡの活性化を阻害する能力があること、
３） ＴｒｋＡとＮＧＦとの間の結合を実質的に阻害しないこと、
４） ＴｒｋＡへの結合においてＮＧＦと実質的に競合しないこと、および
５） ＮＧＦによる神経細胞の成長と生存への影響を実質的に損なうことなく、ＮＧＦを介した疼痛感作を選択的に緩和することができること、
を示す、
抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

ＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープを認識することができ、前記エピトープが配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７を含む、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

配列番号１１９のＱ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０および／またはＰ１８７に特異的に結合できる、
請求項１～２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体および多重特異性抗体からなる群より選択される、
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）_２断片、Ｆｖ断片、ＶＨＨおよびＳｃＦｖからなる群より選択される、
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

前記ＴｒｋＡがヒトＴｒｋＡである、
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

前記ＴｒｋＡへの結合に関して参照抗体と競合することができ、前記参照抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号９６～９８に記載されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号９３～９５に記載されるアミノ酸配列を含む、
請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１～３のうち少なくとも１つを含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１３２、１３４、１５、および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項9】

重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１～３のうち少なくとも１つを含み、前記重鎖可変領域が、配列番号１３１、１３３、１４および５１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項10】

軽鎖ＣＤＲ１を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号９６、１１７、９、および５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項11】

軽鎖ＣＤＲ１を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号９、２８、５０、５６、８０、および８８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項12】

軽鎖ＣＤＲ２を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号９７、１１８、および１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項13】

軽鎖ＣＤＲ２を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１１、３０、３９、５８、７７、８２、１０３、および１０８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項14】

軽鎖ＣＤＲ３を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号９８、１３、および４１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項15】

軽鎖ＣＤＲ３を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１３、３２、４１、および６０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項16】

軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１３２、１３４、１５、および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項17】

軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１５、１８、４４、５３、６１、７８、８５、９０、９１、１００、１０４、１０７、および１１３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項18】

軽鎖定常領域を含み、前記軽鎖定常領域が、ヒトＩｇκ定常領域またはヒトＩｇλ定常領域を含む、
請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項19】

重鎖ＣＤＲ１を含み、前記重鎖ＣＤＲ１が、配列番号９３、１１４（ＳＸ_１ＷＸ_２Ｑ、ここで、Ｘ_１はＨまたはＹであり、Ｘ_２はＩまたはＭである）、１、および４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項20】

重鎖ＣＤＲ１を含み、前記重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１、２０、４５、４７、６２、１０１、および１０９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項21】

重鎖ＣＤＲ２を含み、前記重鎖ＣＤＲ２が、配列番号９４、１１５、４、および４８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～２０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項22】

重鎖ＣＤＲ２を含み、前記重鎖ＣＤＲ２が、配列番号４、２３、４６、４８、６５、７３、７５、８７、１０２、および１１０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項23】

重鎖ＣＤＲ３を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号９５、１１６、７、および４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項24】

重鎖ＣＤＲ３を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号７、２６、３７、４９、６８、および１１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項25】

重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号１３１、１３３、１４、および５１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項26】

重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号１４、１６、４２、５１、７０、７４、７６、８４、８６、８９、９２、９９、１０５、１０６、および１１２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、
請求項１～２５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項27】

重鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ定常領域を含む、
請求項１～２６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項28】

１）配列番号９６、９７、および９８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号９３、９４、および９５にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
２）配列番号１１７、１１８、および４１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号１１４（ＳＸ_１ＷＸ_２Ｑ、ここでＸ_１はＨまたはＹであり、Ｘ_２はＩまたはＭである）、１１５、および１１６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
３）配列番号９、１１、および１３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号１、４、および７にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
４）配列番号２８、３０、および３２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号２０、２３、および２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
５）配列番号５６、５８、および６０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号６２、６５、および６８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
６）配列番号５６、５８、および６０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号２０、７３、および６８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
７）配列番号５６、５８、および６０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号２０、７５、および６８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
８）配列番号５６、７７、および６０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号６２、６５、および６８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
９）配列番号５６、７７、および６０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号２０、７３、および６８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
１０）配列番号５６、７７、および６０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号２０、７５、および６８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
１１）配列番号８０、８２、および３２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号６２、７９、および２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
１２）配列番号８８、３０、および３２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号２０、８７、および２６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
１３）配列番号２８、３９、および４１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号４５、４６、および３７にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
１４）配列番号８８、１０３、および４１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号１０１、１０２、および３７にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
１５）配列番号８８、１０３、および４１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号１０９、１１０、および１１１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
１６）配列番号８８、３９、および４１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号４５、４６、および３７にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
１７）配列番号３９、１０８および４１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号１０９、１１０および１１１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、または
１８）配列番号５０、３９、および４１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびに配列番号４７、４８、および４９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、
を含む、
請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項29】

１）配列番号１３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１３１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
２）配列番号１３４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１３３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
３）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
４）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
５）配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
６）配列番号９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
７）配列番号９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
８）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
９）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１０）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１１）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１２）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１３）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１４）配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１５）配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１６）配列番号１００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号９９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１７）配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１８）配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
１９）配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
２０）配列番号１１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または
２１）配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
を含む、
請求項１～２８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項30】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、融合タンパク質。

【請求項31】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項３０に記載の融合タンパク質を含む、タンパク質複合体。

【請求項32】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項３０に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。

【請求項33】

請求項３２に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。

【請求項34】

請求項３２に記載の単離された核酸分子または請求項３３に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項35】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項３０に記載の融合タンパク質、請求項３１に記載のタンパク質複合体、請求項３２に記載の単離された核酸分子、請求項３３に記載のベクター、および／または請求項３４に記載の細胞、ならびに任意に薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。

【請求項36】

前記薬学的に許容される賦形剤が緩衝剤を含む、請求項３５に記載の組成物。

【請求項37】

前記組成物のｐＨが約１～１３である、請求項３５～３６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項38】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項３０に記載の融合タンパク質、請求項３１に記載のタンパク質複合体、請求項３２に記載の単離された核酸分子、請求項３３に記載のベクター、請求項３４に記載の細胞、および／または請求項３５～３７のいずれか１項に記載の組成物の、ＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害を予防および／または治療するための医薬品の製造における、使用。

【請求項39】

前記疾患または障害が疼痛を含む、請求項３８に記載の使用。

【請求項40】

前記疼痛が慢性疼痛を含む、請求項３９に記載の使用。

【請求項41】

前記疾患または障害が、侵害受容性、炎症性、神経障害性、増殖性または混合性病因による慢性疼痛を含む、
請求項３８～４０のいずれか１項に記載の使用。

【請求項42】

前記疾患または障害が、筋骨格系または神経障害に起因する慢性疼痛を含む、
請求項３８～４１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項43】

前記疾患または障害が、術後疼痛、関節リウマチ疼痛、神経障害性疼痛および／または変形性関節症疼痛を含む、
請求項３８～４２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項44】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項３０に記載の融合タンパク質の発現を可能にする条件下で請求項３４に記載の細胞を培養することを含む、
請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項３０に記載の融合タンパク質を製造する方法。

【請求項45】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項３０に記載の融合タンパク質、請求項３１に記載のタンパク質複合体、請求項３２に記載の単離された核酸分子、請求項３３に記載のベクター、請求項３４に記載の細胞、および／または請求項３５～３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含み、疾患または障害が、ＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害である、
必要とする対象における疾患または障害を予防および／または治療する方法。

【請求項46】

前記疾患または障害が疼痛を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記疼痛が慢性疼痛を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記疾患または障害が、侵害受容性、炎症性、神経障害性、増殖性または混合性病因による慢性疼痛を含む、
請求項４５～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記疾患または障害が、筋骨格系または神経障害に起因する慢性疼痛を含む、
請求項４５～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記疾患または障害が、術後疼痛、関節リウマチ疼痛、神経障害性疼痛および／または変形性関節症疼痛を含む、
請求項４５～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

ＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害を予防および／または治療するための、請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項３０に記載の融合タンパク質、請求項３１に記載のタンパク質複合体、請求項３２に記載の単離された核酸分子、請求項３３に記載のベクター、請求項３４に記載の細胞、または請求項３５～３７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項52】

ＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープを使用することを含み、前記エピトープが、配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７を含む、ＴｒｋＡとＮＧＦとの結合を実質的に阻害しないＴｒｋＡ抗体をスクリーニングまたは取得する、方法。

【請求項53】

前記ＴｒｋＡ抗体が、以下からなる群より選択される１つ以上の特性：
１） ＯｃｔｅｔまたはＳＰＲで測定した場合、約５＊１０^－８Ｍ未満のＫ_ＤでＴｒｋＡに結合できること、
２） ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡの活性化を阻害する能力があること、
３） ＴｒｋＡとＮＧＦとの間の結合を実質的に阻害しないこと、
４） ＴｒｋＡへの結合においてＮＧＦと実質的に競合しないこと、および
５） ＮＧＦによる神経細胞の成長と生存への影響を実質的に損なうことなく、ＮＧＦを介した疼痛感作を選択的に緩和することができること、
を示す、
請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

インビトロ法またはイクスビボ法である、請求項５２～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記エピトープが、配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７を含む、ＴｒｋＡとＮＧＦとの結合を実質的に阻害しないＴｒｋＡ抗体を取得またはスクリーニングするための薬剤の製造における、ＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープの使用。

【請求項56】

前記ＴｒｋＡ抗体が、以下からなる群より選択される１つ以上の特性：
１） ＯｃｔｅｔまたはＳＰＲで測定した場合、約５＊１０^－８Ｍ未満のＫ_ＤでＴｒｋＡに結合できること、
２） ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡの活性化を阻害する能力があること、
３） ＴｒｋＡとＮＧＦとの間の結合を実質的に阻害しないこと、
４） ＴｒｋＡへの結合においてＮＧＦと実質的に競合しないこと、および
５） ＮＧＦによる神経細胞の成長と生存への影響を実質的に損なうことなく、ＮＧＦを介した疼痛感作を選択的に緩和することができること、
を示す、
請求項５５に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ＴｒｋＡ抗体とその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

ニューロトロフィンはペプチド成長因子のファミリーであり、前記ファミリーの最初のメンバーであるＮＧＦ（神経成長因子）と構造的に関連している。ニューロトロフィンは、末梢神経と中枢神経系の両方の神経分化と生存、およびシナプス伝達を調節する。さらに、ＮＧＦは免疫系細胞として、様々な非神経組織や細胞に作用する。

【0003】

ＮＧＦは、標的細胞に存在する２つの膜受容体、つまり低親和性のｐ７５受容体と、チロシンキナーゼ活性を持つ１４０ｋＤａの高親和性膜貫通糖タンパク質ＴｒｋＡ（トロポミオシン受容体キナーゼＡ）を介して作用する。ＴｒｋＡは、神経堤ニューロン、交感神経ニューロン、ならびに前脳基底部および線条体のコリン作動性ニューロンで発現しており、ＮＧＦ活性の重要なメディエーターとして機能する。ＴｒｋＡは、Ｂリンパ球を含む一部の非神経組織および細胞でも発現する。

【0004】

研究では、疼痛とＴｒｋＡシステムの間に直接的な関係があることが示され、関連のない４つのタイプ４疼痛慢性無感覚症例において、ＴｒｋＡ遺伝子の変異が存在し、その結果、機能的なＮＧＦ受容体が存在しないことが実証された。したがって、ＮＧＦ－ＴｒｋＡシステムは、疼痛に対する治療法、すなわち、ＴｒｋＡ有効拮抗薬を介して疼痛関連神経障害症候群に拮抗できる治療法を設計するための潜在的なターゲットを提供する。

【0005】

報告されている抗ＴｒｋＡ抗体は、ＮＧＦとＴｒｋＡの結合を阻害することが多く、望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。

【0006】

したがって、治療効果がありながら前記副作用を引き起こさないＴｒｋＡ拮抗薬の開発が強く求められている。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、ＴｒｋＡ抗体およびその使用を提供する。特に、本開示は、抗ＴｒｋＡ抗体、前記抗体を含む組成物、および侵害受容性、非侵害受容性、炎症性、外傷性、神経障害性、侵害形成性、または混合病因による慢性疼痛などの疼痛の治療に前記抗体を使用する方法を提供する。

【0008】

一態様では、本開示は、ＴｒｋＡに特異的に結合することができ、ＯｃｔｅｔまたはＳＰＲによって測定して約５＊１０^－８Ｍ未満のＫ_ＤでＴｒｋＡに結合することができること、ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡの活性化を阻害することができること、ＴｒｋＡとＮＧＦとの結合を実質的に遮断しないこと、ＴｒｋＡへの結合に関してＮＧＦと実質的に競合しないこと、およびＮＧＦを介した疼痛感作を軽減できることからなる群より選択される１つ以上の特性を示す、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特に、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、神経細胞の成長および生存に対するＮＧＦの効果を実質的に損なうことなく、ＮＧＦ媒介性疼痛感作を軽減することができ、すなわち、ＮＧＦ媒介性疼痛感作を選択的に軽減することができる。

【0009】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープを認識することができ、エピトープは、配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１９のＱ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０および／またはＰ１８７に特異的に結合することができる。

【0011】

いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および多重特異性抗体（二重特異性抗体、または三重特異性抗体など）からなる群より選択される。

【0012】

いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、ＶＨＨおよびＳｃＦｖからなる群より選択される。

【0013】

いくつかの実施形態では、ＴｒｋＡはヒトＴｒｋＡである。

【0014】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡへの結合に関して参照抗体と競合することができ、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号９６～９８に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号９３～９５に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１～３のうちの少なくとも１つを含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３２、１３４、１５、および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１～３のうちの少なくとも１つを含み、重鎖可変領域は、配列番号１３１、１３３、１４および５１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ１を含み、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号９６、１１７、９、および５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ１を含み、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号９、２８、５０、５６、８０、および８８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ２を含み、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号９７、１１８、および１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ２を含み、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１１、３０、３９、５８、７７、８２、１０３、および１０８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号９８、１３、および４１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１３、３２、４１、６０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号１３２、１３４、１５、および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１５、１８、４４、５３、６１、７８、８５、９０、９１、１００、１０４、１０７、および１１３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖定常領域を含み、軽鎖定常領域はヒトＩｇκ定常領域またはヒトＩｇλ定常領域を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ１を含み、重鎖ＣＤＲ１は配列番号９３、１１４（ＳＸ_１ＷＸ_２Ｑ、ここでＸ_１はＨまたはＹであり、Ｘ_２はＩまたはＭである）、１、および４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ１を含み、重鎖ＣＤＲ１は配列番号１、２０、４５、４７、６２、１０１、および１０９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ２を含み、重鎖ＣＤＲ２は配列番号９４、１１５、４、および４８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ２を含み、重鎖ＣＤＲ２は配列番号４、２３、４６、４８、６５、７３、７５、８７、１０２、および１１０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ３を含み、重鎖ＣＤＲ３は配列番号９５、１１６、７、および４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ３を含み、重鎖ＣＤＲ３は配列番号７、２６、３７、４９、６８、および１１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号１３１、１３３、１４、および５１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号１４、１６、４２、５１、７０、７４、７６、８４、８６、８９、９２、９９、１０５、１０６、および１１２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖定常領域を含み、重鎖定常領域はヒトＩｇＧ定常領域を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１）それぞれ配列番号９６、９７、および９８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号９３、９４、および９５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、２）それぞれ配列番号１１７、１１８、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号１１４（ＳＸ_１ＷＸ_２Ｑ、ここでＸ_１はＨまたはＹであり、Ｘ_２はＩまたはＭである）、１１５、および１１６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、３）それぞれ配列番号９、１１、および１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号１、４、および７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、４）それぞれ配列番号２８、３０、および３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号２０、２３、および２６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、５）それぞれ配列番号５６、５８、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号６２、６５、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、６）それぞれ配列番号５６、５８、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号２０、７３、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、７）それぞれ配列番号５６、５８、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号２０、７５、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、８）それぞれ配列番号５６、７７、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号６２、６５、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、９）それぞれ配列番号５６、７７、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号２０、７３、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１０）それぞれ配列番号５６、７７、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号２０、７５、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１１）それぞれ配列番号８０、８２、および３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号６２、７９、および２６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１２）それぞれ配列番号８８、３０、および３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号２０、８７、および２６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１３）それぞれ配列番号２８、３９、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号４５、４６、および３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１４）それぞれ配列番号８８、１０３、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号１０１、１０２、および３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１５）それぞれ配列番号８８、１０３、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号１０９、１１０、および１１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１６）それぞれ配列番号８８、３９、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号４５、４６、および３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１７）それぞれ配列番号３９、１０８、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号１０９、１１０、および１１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、または１８）それぞれ配列番号５０、３９、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号４７、４８、および４９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１）配列番号１３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１３１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、２）配列番号１３４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１３３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、３）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、４）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、５）配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、６）配列番号９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、７）配列番号９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、８）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、９）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１０）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１１）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１２）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１３）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１４）配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１５）配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１６）配列番号１００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号９９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１７）配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１８）配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１９）配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、２０）配列番号１１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または２１）配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、を含む。

【0037】

別の態様では、本開示は、本開示の抗体または抗原結合断片を含む融合タンパク質を提供する。

【0038】

別の態様では、本開示は、本開示の抗体または抗原結合断片、または本開示の融合タンパク質を含むタンパク質複合体を提供する。

【0039】

別の態様では、本開示は、本開示の抗体または抗原結合断片、または本開示の融合タンパク質をコードする１つまたは複数の単離された核酸分子を提供する。

【0040】

別の態様では、本開示は、本開示の１つまたは複数の単離された核酸分子を含む１つまたは複数のベクターを提供する。

【0041】

別の態様では、本開示は、本開示の単離された核酸分子またはベクターを含む細胞を提供する。

【0042】

別の態様では、本開示は、本開示の抗体または抗原結合断片、融合タンパク質、タンパク質複合体、単離された核酸分子、ベクター、および／または細胞、および任意に薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。

【0043】

いくつかの実施形態では、組成物中の薬学的に許容される賦形剤は緩衝剤を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは約１～１３である。

【0045】

別の態様では、本発明は、ＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害を予防および／または治療するための医薬品の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質、タンパク質複合体、単離された核酸分子、ベクター、細胞、および／または組成物の使用を提供する。

【0046】

いくつかの実施形態では、疾患または障害は疼痛を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、疼痛は慢性疼痛を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、侵害受容性、炎症性、神経障害性、増殖性、または混合性病因による慢性疼痛を含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、筋骨格系または神経障害に起因する慢性疼痛を含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、疾患または障害は、術後疼痛、関節リウマチ疼痛、神経障害性疼痛、および／または変形性関節症疼痛を含む。

【0051】

別の態様では、本開示は、サンプル中のＴｒｋＡの存在および／または量を決定するための薬剤の製造における抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質、またはタンパク質複合体の使用を提供する。

【0052】

別の態様では、本開示は、本開示の抗体またはその抗原結合断片、または融合タンパク質を産生する方法を提供し、前記方法は、本開示の細胞を、抗体またはその抗原結合断片、または融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養することを含む。

【0053】

別の態様では、本開示は、対象に、本開示の抗体または抗原結合断片、融合タンパク質、タンパク質複合体、単離された核酸分子、ベクター、細胞、および／または組成物の有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または障害を予防および／または治療する方法を提供し、ここで、疾患または障害は、ＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害である。

【0054】

この方法のいくつかの実施形態では、疾患または障害は疼痛を含む。

【0055】

この方法のいくつかの実施形態では、疼痛は慢性疼痛を含む。

【0056】

この方法のいくつかの実施形態では、疾患または障害は、侵害受容性、炎症性、神経障害性、増殖性、または混合性病因による慢性疼痛を含む。

【0057】

この方法のいくつかの実施形態では、疾患または障害は、筋骨格系または神経障害に起因する慢性疼痛を含む。

【0058】

この方法のいくつかの実施形態では、疾患または障害には、術後疼痛、関節リウマチ疼痛、神経障害性疼痛、および／または変形性関節症疼痛を含む。

【0059】

別の態様では、本開示は、サンプル中のＴｒｋＡの存在および／または量を決定する方法を提供し、前記方法は、ａ）サンプルを本開示の抗体または抗原結合断片、融合タンパク質、またはタンパク質複合体と接触させること、およびｂ）サンプルに結合した抗体または抗原結合断片、融合タンパク質、またはタンパク質複合体の存在および／または量を決定することを含む。

【0060】

別の態様では、本開示は、ａ）疾患または障害を予防および／または治療するため、および／またはｂ）サンプル中のＴｒｋＡの存在および／または量を決定するための、本開示の抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質、タンパク質複合体、単離された核酸分子、ベクター、細胞、または組成物を提供し、ここで、疾患または障害は、ＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害である。

【0061】

別の態様では、本開示は、配列番号１１９のアミノ酸残基：Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７を含むＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープを使用することを含む、ＴｒｋＡとＮＧＦとの結合を実質的に阻害しないＴｒｋＡ抗体をスクリーニングまたは取得する方法を提供する。

【0062】

この方法のいくつかの実施形態では、ＴｒｋＡ抗体は、以下からなる群より選択される１つ以上の特性を示す：ＯｃｔｅｔまたはＳＰＲで測定して約５＊１０^－８Ｍ未満のＫＤでＴｒｋＡに結合できること、ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡの活性化を阻害できること、ＴｒｋＡへの結合に関してＮＧＦと実質的に競合しないこと、ＮＧＦを介した疼痛感作などの疼痛感作を軽減できること（例えば、神経細胞の成長および生存に対するＮＧＦの効果を実質的に損なうことなく、ＮＧＦを介した疼痛感作を選択的に軽減できること）。

【0063】

いくつかの実施形態では、前記方法は、インビトロまたはエクスビボの方法である。

【0064】

別の態様では、本開示は、ＴｒｋＡとＮＧＦとの結合を実質的に阻害しないＴｒｋＡ抗体を取得またはスクリーニングするための薬剤の製造におけるＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープの使用を提供し、ここで、エピトープは、配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７を含む。

【0065】

使用のいくつかの実施形態では、ＴｒｋＡ抗体は、以下からなる群より選択される１つ以上の特性を示す：ＯｃｔｅｔまたはＳＰＲで測定して約５＊１０^－８Ｍ未満のＫＤでＴｒｋＡに結合できること、ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡの活性化を阻害できること、ＴｒｋＡ への結合に関してＮＧＦと実質的に競合しないこと、ＮＧＦを介した疼痛感作などの疼痛感作を軽減できること（例えば、神経細胞の成長および生存に対するＮＧＦの効果を実質的に損なうことなく、ＮＧＦを介した疼痛感作を選択的に軽減できること）。

【0066】

本開示の追加の態様および利点は、本開示の例示的実施形態のみが図示および説明される以下の詳細の説明から、当業者には速やかに明らかとなろう。理解されるように、本開示は他の、および異なる実施形態をとることが可能であり、その詳細のいくつかは、全て、本開示を逸脱することなく、様々な明らかな観点から変更を行うことができる。したがって、図面および説明は、本質的に実例とみなされるべきであり、限定としてみなされるべきではない。

【0067】

参照による援用
本明細書にて言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の出版物、特許、または特許出願が参照により援用されることを明確にかつ個別に指示したかのごとく、参考として同程度に本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0068】

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に記載する。本発明の原理が用いられる、例示的実施形態を説明する以下の詳細の説明、ならびに、添付図面（本明細書では「図」とも言う）を参照することで、本開示の特徴および利点がより良く理解される。

【図1】本開示の例示的な抗体のＥＬＩＳＡ結合分析の結果を示す。

【図2】本開示の例示的な抗体のＦＡＣＳ結合分析の結果を示す。

【図3A-3B】本開示の例示的な抗体のＮＦＡＴ機能解析の結果を示す。

【図4A-4B】本開示の例示的な抗体の結合特性および機能特性を示す。

【図5A-5B】本開示の例示的な抗体の結合特性および機能特性を示す。

【図6】ＴｒｋＡ（ＥＣＤ）および本開示の例示的な抗体のエピトープ分析を示す。

【図7A-7D】ＴｒｋＡ抗体競合アッセイのセンサーグラムを示す。

【図8A-8C】本発明の抗体がＴｒｋＡとＮＧＦとの結合を阻害しないことを示す。

【図9】本開示の例示的な抗体のＮＦＡＴ機能解析の結果を示す。

【図10】ＤＲＧ播種後７２時間後の明視野写真を示す。

【図11】ＤＲＧ播種後７２時間後の明視野軸索長統計を示す。

【図12】ＮＧＦ誘発性過敏症モデルの足底内注射のスキームを示す。

【図13A-13B】本開示の例示的な抗体を用いたＮＧＦ誘発性の機械的感受性および熱感受性の薬理学的評価を示す。

【図14】ホルマリン誘発性の疼痛試験の概略図を示す。

【図15A-15B】はホルマリン誘発性の疼痛試験における本発明の例示的な抗体の抗侵害受容作用を示す。

【図16】ＭＩＡ注射および機械的過敏性試験によって誘発される変形性関節症（ＯＡ）の疼痛の概略を示す。

【図17A-17G】本開示の例示的な抗体がＭＩＡ注射によって誘発されるＯＡ疼痛に及ぼす効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0069】

本発明の様々な実施形態が本明細書で図示および説明されるものの、当業者には、このような実施形態は、単に例示として示されるものであることが明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には、様々な変更、変化、および置換が生じ得る。本明細書に記載する本発明の実施形態に、様々な代替物を用いることができることが理解されなければならない。

【0070】

本明細書において使用される「抗体」という用語は、一般に、抗原を特異的に認識または結合することができる免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を指す。抗体は軽鎖（Ｌ）と重鎖（Ｈ）を含んでもよい。抗体の軽鎖はκ軽鎖とλ軽鎖に分類できる。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、そして抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプなど）、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）を含んでもよい。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含んでもよい。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）を含んでもよい。軽鎖定常領域は、ＣＬドメインを含んでもよい。ＶＨ領域とＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる変動性の高い領域にさらに分割することもできる。各ＶＨおよびＶＬは、Ｎ末端からＣ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。各重鎖／軽鎖ペアの可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ抗体結合部位を形成する。アミノ酸の領域またはドメインへの分布は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学的関心のあるタンパク質のＫａｂａｔ配列）（アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ、（１９８７年および１９９１年））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８～８８３の定義に従う。「抗体」という用語は、抗体の産生方法によって制限されるものではない。例えば、組み換え抗体、モノクローナル抗体、その他の形態の抗体が含まれる。場合によっては、本開示の抗体は単離された抗体である。

【0071】

本明細書で使用される「抗原結合断片」という用語は、一般に、抗体が結合する同じ抗原（例えば、ＴｒｋＡ）に結合する能力を保持し、および／または抗原特異的結合に関して完全な抗体と競合する、全長抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗原結合断片は、組み換えＤＮＡ技術によって、または正常な抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生できる。場合によっては、抗原結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、ＶＨＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（例：ＳｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、およびポリペプチドに特定の抗原結合能力を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。

【0072】

本明細書で使用される用語「ＴｒｋＡ」は、一般に、高親和性神経成長因子受容体、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体１型、ＴＲＫ１変換チロシンキナーゼタンパク質、トロポミオシン関連キナーゼＡ、チロシンキナーゼ受容体、チロシンキナーゼ受容体Ａ、Ｔｒｋ－Ａ、ｇｐ１４０ｔｒｋ、ｐ１４０－ＴｒｋＡ、ＭＴＣ、またはＴＲＫを指す。ＴｒｋＡは、交感神経ニューロンと神経ニューロンの増殖、分化、生存の調節を通じて、中枢神経系と末梢神経系の発達と成熟に関与する受容体チロシンキナーゼである。ＴｒｋＡは、その主要なリガンドであるＮＧＦに対する高親和性受容体であり、ＮＴＦ３／ニューロトロフィン－３に結合して活性化される可能性もある。本明細書で使用されるＴｒｋＡには、ヒトＴｒｋＡの機能的断片、変異体、アイソフォーム、およびホモログ種が含まれる可能性がある。したがって、本開示の抗体は、場合によっては、ヒト以外の種のＴｒｋＡと交差反応する可能性がある。特定の実施形態では、抗体は、１つ以上のヒトＴｒｋＡタンパク質に対して完全に特異的であり、種または他のタイプの非ヒト交差反応性を示さない可能性がある。既知の４つのヒトＴｒｋＡアイソフォームの完全なアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４６２９（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ＴＵ、（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（核酸研究））４０（Ｄ１）：Ｄ７１－Ｄ５）で見出される。４つのアイソフォームは選択的スプライシングによって生成される。アイソフォームＴｒｋＡ－Ｉはほとんどの非神経組織に存在し（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４６２９－２）、アイソフォームＴｒｋＡ－ＩＩは主に神経細胞に発現する（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４６２９－１）、アイソフォームＴｒｋＡ－ＩＩＩは多能性神経幹および神経堤前駆細胞に特異的に発現する（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４６２９－４）。残基１～７１がアイソフォームＴｒｋＡ－ＩＩと異なり、残基３９３～３９８が欠落している４番目のアイソフォームは、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４６２９－３）として知られている。ＴｒｋＡ－ＩＩアイソフォームは、ＴｒｋＡの主要な既知のアイソフォームである。アイソフォームＴｒｋＡ－ＩはＮＴＦ３ニューロトロフィンに対する応答性が強化されているが、アイソフォームＴｒｋＡ－ＩＩＩは恒常的に活性であり、ＮＧＦに結合しない。

【0073】

本明細書で使用される「ＴｒｋＡの生物学的活性」または「ＴｒｋＡの生物学的活性」という用語は、一般に、ＮＧＦまたは他のニューロトロフィンに結合する能力、ＮＧＦ誘導シグナル伝達経路を活性化する能力、細胞の分化、増殖、生存、成長、移動、および細胞生理学におけるその他の変化を促進する能力（末梢ニューロンおよび中枢ニューロンを含むニューロンの場合）ニューロンの形態、シナプス形成、シナプス機能、神経伝達物質および／または神経ペプチドの放出および損傷後の再生の変化を含む）、および骨転移に関連する疼痛および癌性疼痛を媒介する能力のうちの１つ以上を指す。

【0074】

本明細書で使用される用語「ＴｒｋＡ／ＮＧＦシグナル伝達経路」は、一般的に、神経成長因子（ＮＧＦ）およびチロシンキナーゼＡ（ＴｒｋＡ）に関連するシグナル伝達経路を指す。ＮＧＦペプチドは、ＴｒｋＡリン酸化、ＳｈｃＣ／ＰＩ３ＫおよびＰｌｃ－γ／ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化を介してＮＧＦ経路に関与し、ＡＫＴ依存性の生存とＣＲＥＢ駆動型ニューロン活動を促進する可能性がある。ＴｒｋＡ／ＮＧＦシグナル伝達経路は、交感神経および感覚ニューロンの生存と神経支配を促進する可能性があり、例えば、神経細胞の生存と発達に関与するＮＧＦ誘導性遺伝子発現の活性化のために、軸索末端から細胞体へのＮＧＦ／ＴｒｋＡ含有エンドソームのエンドサイトーシスと逆行性輸送に関連している可能性がある。

【0075】

本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、一般的に、ある物質が別の物質に特異的に結合し、他の物質にランダムに結合しない能力を指す。例えば、あるタンパク質は、その特定の構造により、別のタンパク質に特異的に結合することがある。結合特異性は、例えば、交差競合アッセイまたは当技術分野で知られている他の結合アッセイによって測定することができる。

【0076】

本明細書で使用される「Ｋ_Ｄ」という用語は、一般的に解離定数を指す。解離定数は、複合体がその構成分子に分解する場合のように、より大きな物体がより小さな成分に可逆的に分離（解離）する傾向を測定する特定の種類の平衡定数である。解離定数は結合定数の逆数である。抗体（Ａｂ）が抗原（Ａｇ）に結合する特定のケースでは、通常、親和定数という用語は結合定数を指す。

【0077】

本明細書で使用される「Ｋｏｎ」という用語は、一般に、結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）が抗原に結合して結合複合体（例えば、抗体／抗原複合体）を形成するためのオン速度定数を指す。「Ｋｏｎ」という用語は、本明細書では互換的に使用される「会合速度定数」または「ｋａ」も意味する。この値は、結合タンパク質とその標的抗原との結合速度、または結合タンパク質（抗体など）と対応する抗原との複合体形成速度を示す。

【0078】

本明細書で使用される「ＩＣ_５０」という用語は、一般に、生物学的機能の阻害における化合物の有効性の尺度である半数阻害濃度（ＩＣ_５０）、例えば、ＴｒｋＡ抗体がＮＧＦ誘導性ＴｒｋＡ活性化を阻害する能力を指す。

【0079】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、一般的に、全て固有の親細胞のクローンである同一の免疫細胞によって生成される抗体を指す。モノクローナル抗体は、同じエピトープ（抗体によって認識される抗原の部分）に結合するという点で、一価の親和性を持つことができる。場合によっては、モノクローナル抗体は二重特異性や三重特異性など、多重特異性を持つこともある。それは、生化学、分子生物学、医学において重要なツールとなっている。最近、ファージディスプレイ、単一Ｂ細胞培養、様々なＢ細胞集団からの単一細胞増幅、単一形質細胞検査技術など、いくつかのモノクローナル抗体技術が開発された。

【0080】

本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、一般的に、軽鎖および重鎖の可変（Ｖ）領域がマウス由来であり、定常（Ｃ）領域がヒト由来である抗体を指す。一般に、キメラ抗体は元のマウスモノクローナル抗体の特異性と親和性を保持するが、ＨＡＭＡ応答は大幅に低下する可能性がある。

【0081】

本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、一般的に、タンパク質配列が改変され、ヒトで自然に生成される抗体変異体との類似性を高めた非ヒト種由来の抗体を指す。ヒト化抗体のアミノ酸配列は、抗体が標的抗原に結合する能力を担う相補性決定領域（ＣＤＲ）セグメントの一部が非ヒト由来であるにもかかわらず、ヒト変異体のアミノ酸配列と本質的に同一である可能性がある。

【0082】

本明細書では、「完全ヒト抗体」および「ヒト抗体」という用語は互換的に使用され、一般的に、ヒト可変領域、最も好ましくはヒト定常領域を含む抗体を指す。特定の実施形態では、これらの用語は、ヒト由来の可変領域および定常領域を含む抗体を指す。「完全ヒト抗体」という用語には、Ｋａｂａｔらによって説明されているように、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に対応する可変領域と定常領域を持つ抗体が含まれる。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、アメリカ合衆国保健福祉省、ＮＩＨ出版物番号９１－３２４２を参照）。

【0083】

本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」という用語は、一般的に、免疫グロブリン分子の一部（抗原結合断片など）を指す。Ｆａｂ断片は、１つの軽鎖と、単一の抗原結合部位を持つ重鎖の一部で構成される場合がある。Ｆａｂ断片は、免疫グロブリン分子のパパイン消化によって得られる場合がある。例えば、Ｆａｂ断片は、重鎖と軽鎖のそれぞれに１つの定常ドメインと１つの可変ドメインで構成される場合がある。可変ドメインには、免疫グロブリン分子のアミノ末端に、相補性決定領域のセットを含むパラトープ（抗原結合部位）が含まれる場合がある。パパイン酵素は、免疫グロブリン分子を２つのＦａｂ断片と１つのＦｃ断片に切断するために使用される場合がある。ペプシン酵素はヒンジ領域の下で切断し、Ｆ（ａｂ’）_２断片とｐＦｃ’断片が形成される。二価のＦ（ａｂ）_２またはＦ（ａｂ’）_２断片には、ジスルフィド結合によって連結された２つの抗原結合領域がある。Ｆ（ａｂ）_２またはＦ（ａｂ’）_２断片を還元すると、他の分子への結合に有用な遊離スルフィドリル基を持つ２つの一価ＦａｂまたはＦａｂ’断片が生成される。

【0084】

本明細書で使用される「Ｆｖ断片」という用語は、一般に、ＩｇＧおよびＩｇＭクラスの抗体の酵素切断から生成される最小の断片を指す。Ｆｖ断片には、ＶＨ領域とＶＬ領域からなる抗原結合部位があるが、ＣＨ１領域とＣＬ領域はない。ＶＨ鎖とＶＬ鎖は、非共有結合的な相互作用によってＦｖ断片内で一緒に保持される場合がある。

【0085】

本明細書で使用される「ＳｃＦｖ」という用語は、一般に単鎖抗体断片を指す。ＳｃＦｖは、抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域が直接またはペプチドリンカーを介して結合された組み換え単鎖ポリペプチド分子である。単鎖抗体（ＳｃＦｖ）には一般的に、抗体のＦｃ前記領域の一部は含まれないが、必要に応じて、既知のＳｃＦｖ分子に前記領域を追加する方法が知られている。Ｈｅｌｆｒｉｃｈら ｅｔ ａｌ．、Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ＳｃＦｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３７：１３１～１４５（２０００）およびｄｅ Ｈａａｒｄらｅｔ ａｌ．、Ｃｒｅａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙを参照。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３１：５～３１（１９９８）。

【0086】

本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、一般的に、異種ポリペプチド（すなわち、異なる起源、配列または構造のポリペプチド）のアミノ酸配列に直接または間接的に（例えば、リンカーを介して）融合されたポリペプチドのアミノ酸配列を含む、または代替的にそれからなるポリペプチドを指す。

【0087】

本明細書で使用される「タンパク質複合体」という用語は、一般的に、細胞毒性剤、例えば化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、またはその断片）、標識（例えば、蛍光標識）および／または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）などの１つ以上の追加部分に結合したタンパク質（例えば、抗体またはその機能的断片）を含む複合体を指す。

【0088】

多数のＣＤＲ定義が使用されており、本明細書に含まれている。Ｋａｂａｔの定義は配列の変異性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．、同上）。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造ループの位置に基づいている（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ Ｊ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７）ＡｂＭ定義は、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている（Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：９２６８～９２７２、Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：１２１～１５３、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＪＴ ｅｔ ａｌ．、（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ１：１２６～１３６、Ｒｅｅｓ ＡＲ ｅｔ ａｌ．、（１９９６）Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１４１～１７２）。接触定義は最近導入された（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５）、この論文は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋで入手可能な複合体構造の分析に基づいて作成されている。ＩＭＧＴ（登録商標）、国際免疫遺伝子情報システム（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によるＣＤＲの定義は、全ての種の全ての免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体Ｖ領域に対するＩＭＧＴ番号に基づいている（ＩＭＧＴ（登録商標）、国際免疫遺伝子情報システム（登録商標）、Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ ｅｔ ａｌ．、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（１）：２０９－１２、Ｒｕｉｚ Ｍ ｅｔ ａｌ．、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１）：２１９－２１、Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１）：２０７－９、Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１）：３０７－１０、Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：１８５－２０３、Ｋａａｓ Ｑ ｅｔ ａｌ．、（２００７）Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、６（４）：２５３－６４）。

【0089】

本明細書で使用される「単離された核酸分子」という用語は、一般的に、天然環境から単離された、または人工的に合成された、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。

【0090】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、一般的に、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入して発現させることができる核酸媒体を指す。ベクターに運ばれる遺伝物質要素は、ベクターで宿主細胞を形質転換、形質導入、またはトランスフェクトすることによって宿主細胞内で発現することができる。ベクターには、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素、レポーター遺伝子など、発現を制御する様々な要素が含まれる場合がある。さらに、ベクターには複製起点も含まれる場合がある。ベクターには、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質シェルなど、細胞への侵入を助ける成分が含まれている可能性もあるが、これらの物質だけが含まれるわけではない。

【0091】

本明細書で使用される「細胞」という用語は、一般的に、本発明のベクターを運ぶために使用され得る、または本発明の抗体、抗原結合断片を発現または生成するために使用され得る細胞を指す。本開示の細胞は宿主細胞であってもよい。

【0092】

本明細書では、「疾患」と「障害」という用語は互換的に使用され、一般的に身体の正常な機能を損なうあらゆる状態を指す。病気は多くの場合、特定の症状や兆候を伴う医学的状態として解釈される。それは、病原体などの外的要因、または免疫不全などの免疫系の内部機能不全、あるいはアレルギーや自己免疫などの過敏症によって引き起こされることがある。

【0093】

本明細書で使用される「対象」という用語には、あらゆるヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語には、霊長類、ヒツジイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳類および非哺乳類など、全ての脊椎動物が含まれる。例えば、対象はヒトである可能性がある。

【0094】

本明細書で使用される「有効量」という用語は、一般的に、レシピエントに有益な効果を与えるのに十分な濃度を提供するのに十分な投与量を指す。特定の対象に対する特定の治療有効投与量レベルは、治療対象となる疾患または障害、疾患または障害の重症度、特定の成分の活性、投与経路、クリアランス速度、治療期間、対象の年齢、体重、性別、食事、および全般的な健康状態、およびその他の関連要因を含む様々な要因によって異なる。

【0095】

本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、一般的に、薬学的投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、等張剤、吸収遅延剤などを指す。

【0096】

本明細書で使用される「約」という用語は、通常、当該技術分野における通常の技術に基づいて合理的に推測される所定の値に対する近似値を指し、かかる所定の値に対する実験および／または測定条件による同等値および近似値も含まれる。例えば、用語によって変更される値より１０％以内の上または下の値を参照する場合がある。

【0097】

本明細書で使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、一般的に、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する高分子、すなわち、自然に発生する非組み換え細胞によって生成されるタンパク質、または遺伝子操作された細胞または組み換え細胞によって生成され、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つ以上のアミノ酸の欠失、追加、および／または置換を有する分子を含むタンパク質を指す。この用語には、１つ以上のアミノ酸が対応する天然アミノ酸およびポリマーの化学的類似体であるアミノ酸ポリマーも含まれる。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、具体的には、抗原結合タンパク質の１つ以上のアミノ酸の欠失、追加、および／または置換を有するＴｒｋＡ抗原結合タンパク質、抗体、または配列を包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、全長天然タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドを指す。このような断片には、天然のタンパク質と比較して、修飾アミノ酸も含まれる可能性がある。特定の実施形態では、断片は約５～５００個のアミノ酸の長さである。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０個のアミノ酸の長さになる。有用なポリペプチド断片には、結合ドメインを含む抗体の免疫学的に機能的な断片が含まれる。ＴｒｋＡ結合抗体の場合、有用な断片には、ＣＤＲ領域、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部、または２つのＣＤＲを含むその可変領域のみなどが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【0098】

本明細書で使用される「分離したタンパク質」（分離した抗体など）という用語は、一般的に、対象タンパク質が（１）通常一緒に存在する他のタンパク質の少なくとも一部を含まない、（２）同じ供給源、例えば同じ種からの他のタンパク質が本質的に含まない、（３）異なる種の細胞によって発現される、（４）自然界で関連するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）自然界で関連しないポリペプチドと機能的に関連している（共有結合または非共有結合による相互作用によって）、または（６）自然界に存在しないことを指す。通常、「単離されたタンパク質」は、与えられたサンプルの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせは、このような分離したタンパク質をコードできる。好ましくは、単離されたタンパク質には、その治療、診断、予防、研究、またはその他の用途を妨げるような、自然環境中に見られるタンパク質またはポリペプチドまたはその他の汚染物質が実質的に含まれていない。

【0099】

ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質または抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基が挿入、削除および／または置換されたアミノ酸配列を含む。変異体には融合タンパク質が含まれる。

【0100】

本明細書で使用される「同一性」という用語は、一般的に、配列を整列させて比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」とは、比較される分子内のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基の割合を意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算では、アライメントのギャップ（存在する場合）は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されることが望ましい。アラインメントされた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用できる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、編）、１９８８、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）、１９９３、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）、１９９４、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．著、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、１９９１、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ，、１９８８、ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３、に記載されている方法を含む。

【0101】

同一性パーセントを計算する場合、比較される配列は通常、配列間の一致が最大になるように整列される。同一性パーセントを決定するために使用できるコンピュータプログラムの一例として、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含むＧＣＧプログラムパッケージがある。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、配列同一性のパーセントを決定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを整列させるために使用される。配列は、それぞれのアミノ酸またはヌクレオチドが最適に一致するように整列される（アルゴリズムによって決定される「一致する範囲」）。ギャップ開始ペナルティ（平均対角線の３倍として計算される。ここで、「平均対角線」は、使用されている比較マトリックスの対角線の平均である。「対角線」は、特定の比較マトリックスによって各完全なアミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数値である）とギャップ拡張ペナルティ（通常はギャップ開始ペナルティの１／１０倍）に加えて、ＰＡＭ ２５０やＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスがアルゴリズムと組み合わせて使用される。特定の実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９７８、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ５：３４５～３５２を参照、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５～１０９１９（ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックス用）も、このアルゴリズムで使用される。

【0102】

保存的アミノ酸置換には、通常、生物系での合成ではなく、化学ペプチド合成によって組み込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基が含まれる場合がある。これらには、ペプチド模倣体や、アミノ酸部分の他の逆または反転した形態が含まれる。

【0103】

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインを含む２つの重鎖断片で構成される。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合とＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用によって結合されている。

【0104】

「多重特異性抗原結合タンパク質」または「多重特異性抗体」とは、複数の抗原またはエピトープを標的とするタンパク質である。

【0105】

「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二重機能性」の抗原結合タンパク質または抗体は、それぞれ２つの異なる抗原結合部位を持つハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。二重特異性抗原結合タンパク質および抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合やＦａｂ’断片の結合など、様々な方法によって生成できる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉよびＬａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５～３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７～１５５３を参照。二重特異性抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は、同じまたは異なるタンパク質ターゲット上に存在する２つの異なるエピトープに結合する。

【0106】

抗原結合タンパク質は、解離定数（Ｋａ）が１０^－７Ｍ未満の場合に、標的抗原に「特異的に結合する」と言われる。抗原結合タンパク質は、Ｋ_Ｄが５×１０^－８Ｍ未満の場合に「高親和性」で抗原に特異的に結合し、Ｋ_Ｄが１×１０^－８Ｍ未満の場合に「非常に高親和性」で抗原に特異的に結合する。

【0107】

抗原結合タンパク質は、ある標的への結合が他の標的への結合よりも強固である場合に「選択的」である。

【0108】

「抗原結合領域」または「抗原結合断片」とは、特定の抗原（例えば、パラトープ）に特異的に結合するタンパク質またはタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質に抗原に対する特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質の部分は、「抗原結合領域」と呼ばれる。抗原結合領域には通常、１つ以上の「相補結合領域」（「ＣＤＲ」）が含まれる。「ＣＤＲ」は、抗原結合の特異性と親和性に寄与するアミノ酸配列である。

【0109】

特に明記しない限り、「抗体」という用語には、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、それらの誘導体、変異体、断片、および突然変異タンパク質が含まれ、それらの例は以下に記載される。さらに、明示的に除外されない限り、抗体には、それぞれモノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣体」と呼ばれることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある）、およびそれらの断片が含まれる。いくつかの実施形態では、前記用語にはペプチボディも含まれる。

【0110】

特定の実施形態では、抗体の重鎖は抗体の軽鎖が存在しない状態で抗原に結合する。特定の実施形態では、抗体の軽鎖は抗体の重鎖が存在しない状態で抗原に結合する。特定の実施形態では、抗体結合領域は抗体軽鎖が存在しない状態で抗原に結合する。特定の実施形態では、抗体結合領域は抗体重鎖が存在しない状態で抗原に結合する。特定の実施形態では、個々の可変領域は他の可変領域が存在しない状態で抗原に特異的に結合する。

【0111】

特定の実施形態では、抗体の構造を解明し、および／または抗体－リガンド複合体の構造を解明することによって、ＣＤＲの明確な描写および抗体の結合部位を構成する残基の同定が達成される。特定の実施形態では、これは、Ｘ線結晶構造解析など、当業者に知られている様々な技術のいずれかによって達成できる。特定の実施形態では、ＣＤＲ領域を識別または近似するために、様々な分析方法が採用される。このような方法の例には、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、接触定義などがあるが、これらに限定されない。

【0112】

「競合」という用語は、同じエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質（抗原結合タンパク質または抗体など）の文脈で使用される場合、試験される抗原結合タンパク質（抗体またはその免疫学的に機能する断片など）が、参照抗原結合タンパク質（リガンドまたは参照抗体など）と共通抗原（ＴｒｋＡまたはその断片、例えばそのＥＣＤなど）との特異的結合を防止または阻害（例えば、低減）するアッセイによって決定される抗原結合タンパク質間の競合を意味する。ある抗原結合タンパク質が他の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを決定するために、多数のタイプの競合結合アッセイを使用することができる。例えば、固相直接または間接放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合測定法（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２～２５３を参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４～３６１９）固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバープレスを参照）、１－１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ、１９８８、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７～１５を参照）、固相直接ビオチン－アビジン ＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６～５５２を参照）、および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ、１９９０、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７～８２）を参照）。通常、このようなアッセイでは、固体表面に結合した精製抗原、またはこれらのいずれか、標識されていない試験抗原結合タンパク質、および標識された参照抗原結合タンパク質を含む細胞を使用する。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合したラベルの量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定された抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）には、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質、および立体障害が発生するほど参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープに十分近い隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質が含まれる。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、共通抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合が少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、または７５％以上阻害される（例：減少する）。場合によっては、結合は少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、または９７％以上阻害される。

【0113】

本明細書で使用される「抗原」という用語は、一般的に、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的機能断片を含む）などの選択的結合剤によって結合することができる分子または分子の一部を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、その抗原に結合できる抗体を生成するために動物内で使用することができる。抗原は、抗体などの異なる抗原結合タンパク質と相互作用できる１つ以上のエピトープを持つことができる。

【0114】

「エピトープ」という用語には、抗体やＴ細胞受容体などの抗原結合タンパク質に結合できるあらゆる決定因子が含まれる。エピトープとは、その抗原を標的とする抗原結合タンパク質が結合する抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗原結合タンパク質と直接接触する特定のアミノ酸が含まれる。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、場合によっては核酸などの他の種類の分子上に存在することもある。エピトープ決定因子には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、スルホニル基などの化学的に活性な分子の表面グループが含まれ、特定の三次元構造特性や特定の電荷特性を持つ場合がある。一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質や高分子の複雑な混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。

【0115】

本明細書において、「実質的に」または「実質的な」とは、一般的に、大きなまたは非常な程度（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％以上の程度）を意味する。

【0116】

本明細書において、「薬剤」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作られた抽出物を指すために使用される。

【0117】

「治療する」および「治療」という用語には、治療的処置、予防的処置、および対象者が障害またはその他の危険因子を発症するリスクを軽減する応用が含まれる。治療は、疾患の完全な治癒を必要とせず、症状または根本的な危険因子を軽減する実施形態を包含する。

【0118】

「防止する」という用語は、事象の可能性を１００％排除することを要求するものではない。むしろ、化合物または方法の存在下では事象の発生の可能性が減少したことを示す。

【0119】

組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例：エレクトロポレーション、リポフェクション）には標準的な技術を使用できる。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様に従って、または当該技術分野で一般的に行われている方法、あるいは本明細書に記載されている方法に従って実行することができる。前述の技術および手順は、一般的に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、また本明細書全体にわたって引用および説明されている様々な一般的な参考文献およびより具体的な参考文献に記載されているように実行することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照。これは、いかなる目的においても参照により本明細書に組み込まれる。特定の定義が提供されていない限り、本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、医薬化学および製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方、投与、および患者の治療に使用できる。

【0120】

抗体またはその抗原結合断片
一態様では、本開示は、ＴｒｋＡに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0121】

抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡに特異的に結合することができ、トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）、トロポミオシン受容体キナーゼＣ（ＴｒｋＣ）、またはｐ７５受容体には実質的に結合しない。

【0122】

抗体またはその抗原結合断片は、ＯｃｔｅｔまたはＳＰＲで測定した場合、約５．０×１０^－８Ｍ未満のＫ_ＤでＴｒｋＡに結合することができる。例えば、Ｋ_Ｄが約４．５×１０^－８Ｍ未満、約４×１０^－８Ｍ未満、約３．５×１０^－８Ｍ未満、約３×１０^－８Ｍ未満、約２．８×１０^－８Ｍ未満、約２．７×１０^－８Ｍ未満、約２．５×１０^－８Ｍ未満、約２×１０^－８Ｍ未満、約１．５×１０^－８Ｍ未満、約１×１０^－８Ｍ未満、約８×１０^－９Ｍ未満、約５×１０^－９Ｍ未満、約５×１０^－９Ｍ未満、約４．５×１０^－９Ｍ未満、約４×１０^－９Ｍ未満、約３．５×１０^－９Ｍ未満、約３×１０^－９Ｍ未満、約２．５×１０^－９Ｍ未満、約２×１０^－９Ｍ未満、約１．５×１０^－９Ｍ未満、約１×１０^－９Ｍ未満、約１×１０^－１０Ｍ未満、約１×１０^－１１Ｍ未満、または約１×１０^－１２Ｍ未満、あるいはさらに小さいＫ_Ｄ値である。

【0123】

抗体、またはその抗原結合断片は、ＯｃｔｅｔまたはＳＰＲによって測定されるように、約１．５×１０^５（１／Ｍｓ）を超えるＫ_ｏｎでＴｒｋＡに結合し得、例えば、約２×１０^５（１／Ｍｓ）を超える、約３×１０^５（１／Ｍｓ）を超える、約４×１０^５（１／Ｍｓ）を超える、約５×１０^５（１／Ｍｓ）を超える、約６×１０^５（１／Ｍｓ）を超える、約７×１０^５（１／Ｍｓ）を超える、約８×１０^５（１／Ｍｓ）を超える、約９×１０^５（１／Ｍｓ）を超える、約１×１０^６（１／Ｍｓ）を超える、またはそれ以上のＫ_ｏｎでＴｒｋＡに結合し得る。

【0124】

抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡ／ＮＧＦシグナル伝達経路を阻害することができる。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡの活性化を阻害することができる。

【0125】

抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡとＮＧＦとの間の結合を実質的に阻害しない可能性がある。

【0126】

抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡへの結合に関してＮＧＦと実質的に競合しない可能性がある。

【0127】

抗体またはその抗原結合断片は、ＮＧＦを介した疼痛シグナル伝達を遮断することができる。

【0128】

抗体またはその抗原結合断片は、ＮＧＦを介した機械的感受性および／または熱感受性を軽減することができる。

【0129】

抗体またはその抗原結合断片は、ホルマリン試験において抗侵害受容作用を誘発することができる。

【0130】

この抗体またはその抗原結合断片は、ＭＩＡ注射によって誘発される変形性関節症の疼痛における機械的過敏症を改善することができる。

【0131】

抗体またはその抗原結合断片は、神経細胞の成長および生存に対するＮＧＦの効果を実質的に損なうことなく、ＮＧＦを介した疼痛感作を選択的に緩和することができる可能性がある。

【0132】

ＴｒｋＡは、高親和性神経成長因子受容体、神経栄養性チロシンキナーゼ受容体タイプ１、またはＴＲＫ１変換チロシンキナーゼタンパク質としても知られ、ヒトではＮＴＲＫ１遺伝子によってコード化されるタンパク質である。例示的なヒトＴｒｋＡアミノ酸配列は、配列番号１１９に示されるとおりである。本明細書に記載のとおり、ＴｒｋＡタンパク質には、全長ＴｒｋＡタンパク質の断片、例えばその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）も含まれる場合がある。例示的なヒトＴｒｋＡ ＥＣＤアミノ酸配列は、配列番号１２０に示されるとおりである。

【0133】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５または６個のＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）ポリペプチド構造と、（ｂ）ポリペプチド構造に挿入および／または結合された１つ以上のＣＤＲとを含む。ポリペプチド構造は様々な形態をとることができる。例えば、それは、天然に存在する抗体、またはその断片もしくは変異体のフレームワークであるか、またはそれを含むことができ、あるいは、完全に合成されたものであってもよい。

【0134】

特定の実施形態では、抗体のポリペプチド構造、またはその抗原結合断片は、抗体であるか、または抗体に由来し、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある）、およびそれぞれの一部または断片を含むが、これらに限定されない。場合によっては、抗体またはその抗原結合断片は、抗体の免疫学的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、またはＳｃＦｖ）である。

【0135】

抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖定常領域を含み得る。軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域またはヒトＩｇλ定常領域を含み得る。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域はヒトＩｇκ定常領域を含み得る。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、配列番号１２１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0136】

抗体またはその抗原結合断片は、重鎖定常領域を含み得る。重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ定常領域（ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４定常領域など）を含み得る。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４定常領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号１２２に記載のアミノ酸配列を含む。

【0137】

免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般的に同じ全体構造を示し、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、より一般的には「相補性決定領域」またはＣＤＲと呼ばれる３つの超可変領域が結合した構成になっている。前述の各重鎖／軽鎖ペアの２つの鎖のＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、標的タンパク質（例：ＴｒｋＡ）上の特定のエピトープと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、自然に発生する軽鎖および重鎖可変領域はどちらも、通常、これらの要素の次の順序に従う：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。これらの各ドメイン内の位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための番号付けシステムが考案されている。この番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７および１９９１、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ、１９８７、Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８～８８３、で定義されている。

【0138】

本明細書では、様々な重鎖および軽鎖可変領域が提供される。いくつかの実施形態では、これらの可変領域のそれぞれを重鎖定常領域および軽鎖定常領域に結合して、それぞれ完全な抗体重鎖および軽鎖を形成することができる。さらに、このように生成された重鎖配列と軽鎖配列のそれぞれを組み合わせて、完全な抗体構造を形成することができる。

【0139】

抗体の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域のいくつかの具体的な例が提供され、それらの対応するアミノ酸配列が以下の表１にまとめられている。

【0140】

【表1】

表１に列挙された例示的な可変重鎖のそれぞれは、表１に列挙された例示的な可変軽鎖のいずれかと組み合わせて抗体を形成することができる。表１は、本明細書に開示される抗体のいくつかに見られる例示的な軽鎖および重鎖のペアを示している。場合によっては、抗体には、表１に記載されているもののうち少なくとも１つの可変重鎖と１つの可変軽鎖が含まれる。他の例では、抗体には２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖が含まれる。一例として、抗体またはその抗原結合断片には、重鎖および軽鎖、２つの重鎖、または２つの軽鎖が含まれ得る。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙された配列の少なくとも１つからの１、２、および／または３個の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲを含む（および／またはそれらからなる）。いくつかの実施形態では、６つのＣＤＲ全て（軽鎖のＣＤＲ１～３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）および重鎖のＣＤＲ１～３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３））が、抗体またはその抗原結合断片の一部である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片に１、２、３、４、５個、またはそれ以上のＣＤＲが含まれる。いくつかの実施形態では、表１の配列中のＣＤＲのうちの１つの重鎖ＣＤＲと１つの軽鎖ＣＤＲが抗体またはその抗原結合断片に含まれる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片に追加のセクションも含まれる。任意の軽鎖可変配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む）は、以下の配列番号１３２、１３４、１５、および５３から選択できる。任意の重鎖可変配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む）は、以下の配列番号１３１、１３３、１４、および５１から選択できる。

【0141】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙された配列の少なくとも１つからのＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ３を含む（および／またはそれらからなる）。

【0142】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙された配列の少なくとも１つからのＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ３を含む（および／またはそれらからなる）。

【0143】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙された配列（例えば、配列番号９１および８６）の少なくとも１つからのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ３を含む（および／またはそれらからなる）。

【0144】

表１に示される抗体のＣＤＲの例（Ｋａｂａｔ法に従って決定）を以下の表２に示す。

【0145】

【表2】

本開示で提供される例示的な抗体のいくつかは、互いの代替物または変異体であると考えられる。例えば、ｍｕＰＨＤ４８、ＰＨＤ４８－０１、ＰＨＤ４８、ＰＨＤ４８－０８、ＰＨＤ２２、ＰＨＤ２４、ＰＨＤ２５、ＰＨＤ２６、ＰＨＤ２８、ＰＨＤ２９、およびＰＨＤ３０は、互いの変異体または代替物として考えられる。別の例として、ｍｕＰＨＤ４９、ＰＨＤ４９－０１、ＰＨＤ４９－０５、ＰＨＤ４９、ＰＨＤ４９－１１、およびＰＨＤ４９－２１は、互いの変異体または代替物として考えられる。

【0146】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表１に記載される抗体の１つによって認識されるエピトープに結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡの特定の立体構造状態に結合して、ＴｒｋＡへのＮＧＦの結合を遮断せずに、ＴｒｋＡの活性化（例えば、ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡの活性化）を阻害することができる。

【0147】

本明細書に記載のとおり、ＴｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体および／またはその一部を含むことができる。このような戦略の重要な実用化は、マウスの体液性免疫システムの「ヒト化」である。特定の実施形態では、ヒト化抗体はヒトにおいて実質的に非免疫原性である。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化抗体が由来する別の種からの抗体と実質的に同じ標的に対する親和性を有する。

【0148】

特定の実施形態では、抗原結合ドメインの本来の親和性を低下させることなく、その免疫原性を低下させることなく改変することができる抗体可変ドメインのアミノ酸が特定される。

【0149】

特定の実施形態では、当該技術分野で既知の方法による抗体の改変は、典型的には、標的に対する結合親和性の向上、および／または受容体における抗体の免疫原性の低下を達成するように設計される。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、抗体の同族抗原に対する親和性を高めるために、グリコシル化部位を除去するように改変される。例えば、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．、ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、３０：１３６１～１３６７（１９９３）を参照。特定の実施形態では、「再形成」、「ハイパーキメラ化」または「ベニアリング／再表面化」などの技術を使用して、ヒト化抗体が生成される。例えば、Ｖａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ、Ａｓｔｈｍａ、＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５（１９９８）、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．９：８９５～９０４（１９９６）、および米国特許第６，０７２，０３５号を参照。特定の実施形態では、このような技術は、典型的には、外来残基の数を減らすことによって抗体の免疫原性を低下させるが、抗体の繰り返し投与後の抗イディオタイプおよび抗アロタイプ応答を防ぐことはできない。

【0150】

場合によっては、抗体をヒト化すると抗原結合能力が失われる。特定の実施形態では、ヒト化抗体は「復帰変異」される。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ドナー抗体に見られるアミノ酸残基の１つ以上を含むように変異される。例えばＳａｌｄａｎｈａ ｅｔ ａｌ．、ＭｏＩ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６：７０９－１９（１９９９）を参照。

【0151】

特定の実施形態では、ＴｒｋＡに対する抗体の軽鎖および重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、同じ種または別の種のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することができる。特定の実施形態では、ＴｒｋＡに対する抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲをコンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを作成するために、特定の実施形態では、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列からのＦＲが整列され、コンセンサスアミノ酸配列が識別される。特定の実施形態では、ＴｒｋＡ重鎖または軽鎖に対する抗体のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖のＦＲに置き換えられる。特定の実施形態では、ＴｒｋＡに対する抗体の重鎖および軽鎖のＦＲ内の希少アミノ酸は置換されず、残りのＦＲアミノ酸は置換される。希少アミノ酸とは、ＦＲに通常存在しない位置にある特定のアミノ酸である。特定の実施形態では、ＴｒｋＡに対する抗体からの移植された可変領域は、ＴｒｋＡに対する抗体の定常領域とは異なる定常領域とともに使用することができる。特定の実施形態では、移植された可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲ移植については、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第６，０５４，２９７号、第５，６９３，７６２号、第５，８５９，２０５号、第５，６９３，７６１号、第５，５６５，３３２号、第５，５８５，０８９号、および第５，５３０，１０１号、ならびにＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２～５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３～３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４～１５３６（１９８８）、Ｗｉｎｔｅｒ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．、４３０：９２～９４（１９９８）に記載されており、これらは、いかなる目的であっても参照により本明細書に組み込まれる。

【0152】

本明細書に記載のように、ＴｒｋＡに結合する抗体またはその抗原結合断片は、ヒト（すなわち、完全ヒト）抗体および／またはその一部を含み得る。特定の実施形態では、重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、およびそれらを含むアミノ酸配列、特に可変領域に対応する配列が提供される。特定の実施形態では、相補性決定領域（ＣＤＲ）、具体的にはＣＤＲ１からＣＤＲ３までに対応する配列が提供される。特定の実施形態によれば、免疫グロブリン分子を発現するハイブリドーマ細胞株が提供される。特定の実施形態によれば、このようなモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株が提供される。特定の実施形態では、ハイブリドーマ細胞株は、表１に記載の細胞株、例えばｍｕＰＨＤ３１、ｍｕＰＨＤ４８、ｍｕＰＨＤ４９および／またはｍｕＰＨＤ５０のうちの少なくとも１つから選択される。特定の実施形態では、ヒトＴｒｋＡに対する精製されたヒトモノクローナル抗体が提供される。

【0153】

マウス抗体の産生が欠損したマウス系統を、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片で操作すれば、マウスはマウス抗体がなくてもヒト抗体を産生するだろうと予想できる。大きなヒトＩｇ断片は、大きな可変遺伝子の多様性と、抗体の産生および発現の適切な調節を維持することができる。マウスの抗体の多様化と選択の仕組みと、ヒトタンパク質に対する免疫学的寛容性の欠如を利用することで、これらのマウス系統で再現されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む任意の対象抗原に対する高親和性の完全ヒト抗体を生み出すことができる。ハイブリドーマ技術を使用することで、望ましい特異性を持つ抗原特異的ヒトＭＡｂｓを生成し、選択することができる。特定の例示的な方法は、ＷＯ ９８／２４８９３、米国特許第５，５４５，８０７号、ＥＰ ５４６０７３、およびＥＰ ５４６０７３に記載されている。

【0154】

特定の実施形態では、ヒト可変領域とともに、ヒト以外の種からの定常領域を使用することができる。

【0155】

メガベースサイズのヒト遺伝子座を酵母人工染色体（ＹＡＣ）にクローン化して再構築し、それをマウスの生殖細胞系列に導入する能力は、非常に大きな遺伝子座や大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的構成要素を解明するとともに、ヒト疾患の有用なモデルを生成するためのアプローチを提供する。さらに、マウス遺伝子座をヒトの遺伝子座と置換するこのような技術を利用することで、発達中のヒト遺伝子産物の発現と調節、他のシステムとのコミュニケーション、および疾患の誘発と進行への関与についての洞察が得られる可能性がある。

【0156】

ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変領域および／または定常領域を持つ抗体に関連する問題の一部を回避する。このようなマウスまたはラット由来のタンパク質が存在すると、抗体が急速に消失したり、患者による抗体に対する免疫反応が発生したりする可能性がある。マウスまたはラット由来の抗体の利用を避けるために、機能的なヒト抗体遺伝子座をげっ歯類、他の哺乳動物または動物に導入し、げっ歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生するようにすることで、完全ヒト抗体を生成することができる。

【0157】

ヒト化抗体とは、当初はヒト以外の抗体アミノ酸配列を含んでいたものの、これらの非ヒト抗体アミノ酸配列の少なくとも一部がヒト抗体配列に置き換えられた抗体である。これは、抗体がヒトが持つ遺伝子によってコード化される（またはコード化される可能性がある）ヒト抗体とは対照的である。

【0158】

提供される他の抗体は、表１に示される可変重鎖および可変軽鎖の組み合わせまたはサブ部分によって形成された、上記に列挙された抗体またはその抗原結合断片の変異体であり、それぞれが表１の配列のアミノ酸配列（配列全体または配列のサブ部分、例えば１つ以上のＣＤＲ）に対して少なくとも５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、９５％～９７％、９７％～９９％、または９９％以上の同一性を有する可変軽鎖および／または可変重鎖を含む。いくつかの例では、このような抗体には少なくとも１つの重鎖と１つの軽鎖が含まれるが、他の例では、変異体には２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖（またはそのサブ部分）が含まれる。いくつかの実施形態では、結合に影響を与える変異と結合に影響を与えないと思われる変異を観察することによって、変更できる抗体のセクションを識別するために、配列比較を使用することができる。例えば、類似の配列を比較することで、変更可能なセクション（特定のアミノ酸など）を特定し、抗体またはその抗原結合断片の機能性を維持（または向上）しながら変更する方法を特定できる。いくつかの実施形態では、抗体の変異体には、上記のように、選択肢間のコンセンサスグループおよび配列が含まれる。表２に示されるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法（配列の変動性に基づく、例えばＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版）ＮＩＨ出版物番号９１－３２４２、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）を参照）に基づいて定義されている。。

【0159】

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３１、１３３、１４および５１の配列のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３１、１３３、１４および５１の配列のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３１、１３３、１４および５１の配列のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３１、１３３、１４および５１の配列のうち少なくとも１つの配列中のＣＤＲからの１つ以上のＣＤＲと少なくとも９０％、９０～９５％、および／または９５～９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ（それぞれ上記配列と少なくとも９０％、９０～９５％、および／または９５～９９％同一である）が存在する。

【0161】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３１、１３３、１４および５１の配列のうち少なくとも１つの配列中のＦＲからの１つ以上のＦＲと少なくとも９０％、９０～９５％、および／または９５～９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、または４つのＦＲ（それぞれ上記配列と少なくとも９０％、９０～９５％、および／または９５～９９％同一である）が存在する。

【0162】

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３２、１３４、１５、および５３の配列のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３２、１３４、１５、および５３の配列のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、その抗原結合断片は、配列番号１３２、１３４、１５、および５３の配列のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。

【0163】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３２、１３４、１５、および５３の配列のうち少なくとも１つの配列中のＣＤＲからの１つ以上のＣＤＲと少なくとも９０％、９０～９５％、および／または９５～９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ（それぞれ上記配列と少なくとも９０％、９０～９５％、および／または９５～９９％同一である）が存在する。

【0164】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１３２、１３４、１５、および５３の配列のうち少なくとも１つの配列中のＦＲからの１つ以上のＦＲと少なくとも９０％、９０～９５％、および／または９５～９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、または４つのＦＲ（それぞれ上記配列と少なくとも９０％、９０～９５％、および／または９５～９９％同一である）が存在する。

【0165】

本開示に鑑みて、熟練した技術者は、周知の技術を使用して、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片の適切な変異体を決定することができるであろう。特定の実施形態では、当業者は、活性に対して重要ではないと考えられる領域を標的とすることにより、活性を損なうことなく変更できる分子の適切な領域を特定することができる。特定の実施形態では、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を識別することができる。特定の実施形態では、生物学的活性または構造に対して重要となり得る領域であっても、生物学的活性を破壊したりポリペプチド構造に悪影響を与えたりすることなく、保存的アミノ酸置換を施すことができる。

【0166】

さらに、当業者は、活性または構造に対して重要な類似のポリペプチド内の残基を特定する構造機能研究を検討することができる。このような比較を考慮すると、類似のタンパク質の活性や構造に重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質内のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測される重要なアミノ酸残基に対して化学的に類似したアミノ酸置換を選択することができる。

【0167】

当業者は、類似の抗体におけるその構造に関連して三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報を考慮すると、当業者は抗体の三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基の配置を予測することができる。特定の実施形態では、当業者は、タンパク質の表面にあると予測されるアミノ酸残基が他の分子との重要な相互作用に関与している可能性があるため、前記残基に根本的な変更を加えないことを選択できる。さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含む試験変異体を生成することができる。次に、当業者に知られている活性アッセイを使用して変異体をスクリーニングすることができる。前記変異体は、適切な変異体に関する情報を収集するために使用できる。例えば、特定のアミノ酸残基の変化によって、活性が破壊されたり、望ましくないほど低下したり、不適切な活性が生じたりすることがわかった場合、前記変化を伴う変異体を避けることができる。言い換えれば、このような日常的な実験から収集された情報に基づいて、当業者は、単独または他の変異と組み合わせてさらなる置換を避けるべきアミノ酸を容易に決定することができる。

【0168】

特定の実施形態では、その抗原結合断片変異体は、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較してグリコシル化部位の数および／またはタイプが変更されたグリコシル化変異体が含む。特定の実施形態では、タンパク質変異体は、天然タンパク質よりも多くのまたはより少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、Ａｓｎ－Ｘ－ＳｅｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒの配列によって特徴付けられ、ここで、Ｘとして指定されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作成するためにアミノ酸残基を置換すると、Ｎ結合型炭水化物鎖を追加するための潜在的な新しい場所が提供される。あるいは、この配列を除去する置換により、既存のＮ結合型炭水化物鎖が除去される。また、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（通常は天然に存在するもの）が除去され、１つ以上の新しいＮ結合型部位が生成されるＮ結合型炭水化物鎖の再配置も提供される。追加の好ましい抗体変異体には、親アミノ酸配列と比較して、１つ以上のシステイン残基が削除されているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されているシステイン変異体が含まれる。システイン変異体は、不溶性封入体の分離後など、抗体を生物学的に活性な構造に再折り畳む必要がある場合に役立つ。システイン変異体は、通常、天然タンパク質よりもシステイン残基の数が少なく、通常は不対システインによる相互作用を最小限に抑えるために偶数個になる。

【0169】

特定の実施形態によれば、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および／または（４）前記ポリペプチドに他の物理化学的または機能的特性を付与または変更するものである。特定の実施形態によれば、単一または複数のアミノ酸置換（特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換）を天然配列（特定の実施形態では、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分）に行うことができる。特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、通常、親配列の構造特性を実質的に変更しない可能性がある（例えば、置換アミノ酸は、親配列で発生するらせんを破壊したり、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊したりする傾向があってはならない）。当該技術分野で認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ＆Ｊ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１））およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：１０５（１９９１）に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

【0170】

いくつかの実施形態では、変異体は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片の核酸配列の変異体である。当業者であれば、上記の説明は、抗体およびタンパク質変異体の識別、評価、および／または作成、ならびにそれらのタンパク質変異体をコードできる核酸配列にも使用できることを理解するであろう。したがって、それらのタンパク質変異体をコードする核酸配列（ならびに表１の抗体またはその抗原結合断片をコードするが、本明細書に明示的に開示されているものとは異なる核酸配列）が考慮される。

【0171】

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、抗原（例えば、ＴｒｋＡ）による免疫化によって生成される。特定の実施形態では、全長ＴｒｋＡ、可溶性形態のＴｒｋＡ、細胞外ドメインのみ、ＴｒｋＡのスプライス変異体形態、またはその断片による免疫化によって抗体を産生することができる。特定の実施形態では、本開示の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、および／または組み換え抗体であり得る。特定の実施形態では、本開示の抗体は、例えば、ヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物の免疫化によって調製されたヒト抗体である（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９３／１２２２７を参照）。

【0172】

特定の実施形態では、特定の戦略を採用して、抗体の標的に対する親和性など、抗体の固有の特性を操作することができる。このような戦略には、抗体をコードするポリヌクレオチド分子の部位特異的またはランダムな突然変異誘発を利用して抗体変異体を生成することが含まれるが、これに限定されない。特定の実施形態では、このような生成の後に、所望の変化、例えば親和性の増加または減少を示す抗体変異体のスクリーニングが行われる。

【0173】

特定の実施形態では、変異誘発戦略で標的とされるアミノ酸残基は、ＣＤＲ内のアミノ酸残基である。特定の実施形態では、可変ドメインのフレームワーク領域内のアミノ酸が標的とされる。特定の実施形態では、このようなフレームワーク領域は、特定の抗体の標的結合特性に寄与することが示されている。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９：３９５～４０２（１９９９）およびその中の参考文献を参照。

【0174】

理解されるように、抗体はハイブリドーマ細胞株以外の細胞株でも発現され得る。特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために使用できる。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクター）にパッケージングし、ウイルス（またはベクター）で宿主細胞を形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法によって行うことができ、または米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号、および第４，９５９，４５５号（これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる）に例示されるような、当該技術分野で既知のトランスフェクション手順によって行うこともできる。使用される変換手順は、変換されるホストによって異なる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は、当該技術分野でよく知られており、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。

【0175】

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野で周知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含み、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、および他の多数の細胞株を含むが、これらに限定されない。特に好ましい細胞株は、どの細胞株の発現レベルが高く、恒常的なＴｒｋＡ結合特性を持つ抗体を産生するかを決定することによって選択される。

【0176】

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＭアイソタイプのうちの少なくとも１つの免疫グロブリン分子を含む。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトκ軽鎖および／またはヒト重鎖を含む。特定の実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＭアイソタイプである。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、哺乳動物細胞での発現のためにクローン化されている。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＭアイソタイプの定常領域のいずれか以外の定常領域を含む。

【0177】

抗ＴｒｋＡ抗体が結合するエピトープが提供される。いくつかの実施形態では、本発明で開示される抗体が結合するエピトープが特に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体が結合するエピトープのいずれかに結合する抗体、またはその抗原結合断片が有用である。いくつかの実施形態では、表１に列挙された抗体のいずれかによって結合されるエピトープが特に有用である。いくつかの実施形態では、エピトープはＴｒｋＡの細胞外ドメイン上にある。

【0178】

特定の実施形態では、ＴｒｋＡエピトープは、抗ＴｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片のＴｒｋＡへの結合を防止（例えば、低減）するために利用することができる。特定の実施形態では、ＴｒｋＡエピトープを利用して、抗ＴｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片のＴｒｋＡへの結合を減少させることができる。特定の実施形態では、ＴｒｋＡエピトープを利用して、抗ＴｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片のＴｒｋＡへの結合を実質的に阻害することができる。

【0179】

特定の実施形態では、ＴｒｋＡエピトープを利用して、ＴｒｋＡに結合する抗体または抗体、またはその抗原結合断片を単離することができる。特定の実施形態では、ＴｒｋＡエピトープを利用して、ＴｒｋＡに結合する抗体またはその抗原結合断片を生成することができる。特定の実施形態では、ＴｒｋＡエピトープまたはＴｒｋＡエピトープを含む配列を免疫原として利用して、ＴｒｋＡに結合する抗体を生成することができる。特定の実施形態では、ＴｒｋＡエピトープを動物に投与し、その後、ＴｒｋＡに結合する抗体を動物から得ることができる。特定の実施形態では、ＴｒｋＡエピトープまたはＴｒｋＡエピトープを含む配列を利用して、ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡ活性化などの通常のＴｒｋＡ媒介活性を妨害することができる。

【0180】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡ ＥＣＤに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体と接触している、または抗体によって埋め込まれている残基を含むドメイン／領域は、ＴｒｋＡ（例えば、野生型抗原）内の特定の残基を変異させ、その抗原結合断片が変異または変異型ＴｒｋＡタンパク質に結合できるかどうかを判定することによって識別することができる。多数の個別の変異を作製することにより、結合に直接的な役割を果たす残基、または抗体に十分近接しているために変異が抗原結合断片と抗原との間の結合に影響を与える可能性がある残基を特定することができる。これらのアミノ酸に関する知識から、抗原結合断片と接触する残基、または抗体によってカバーされる残基を含む抗原のドメインまたは領域を解明することができる。前記ドメインには、その抗原結合断片の結合エピトープが含まれ得る。この一般的なアプローチの具体的な例としては、アルギニン／グルタミン酸スキャンプロトコルを利用するものがある（例えば、Ｎａｎｅｖｉｃｚ，Ｔ．、ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：３７，２１６１９－２１６２５およびＺｕｐｎｉｃｋ，Ａ．、ｅｔ ａｌ、２００６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８＿Ｌ：２９，２０４６４－２０４７３を参照）。一般に、アルギニンおよびグルタミン酸は、野生型ポリペプチドのアミノ酸の代わりに（通常は個別に）使用されるが、これは、これらのアミノ酸が荷電しており、かさばっているため、変異が導入された抗原の領域において、その抗原結合断片と抗原との間の結合を破壊する可能性があるからである。野生型抗原に存在するアルギニンはグルタミン酸に置き換えられる。このような様々な個々の変異体が得られ、収集された結合結果が分析され、どの残基が結合に影響を与えるかが決定される。

【0181】

前述のように、結合に直接関与する残基またはその抗原結合断片によって覆われている残基は、スキャン結果またはＣｒｙｏ－ＥＭから識別できる。したがって、これらの残基は、本発明の抗体またはその抗原結合断片が結合する結合領域を含む配列番号１１９（または配列番号１２０）のドメインまたは領域の指標を提供することができる。実施例８にまとめられた結果から分かるように、いくつかの実施形態では、その抗原結合断片は、配列番号１１９のアミノ酸Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７のうちの少なくとも１つを含むドメインに結合する。

【0182】

本出願において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１９のアミノ酸残基：Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、および／またはＰ１８７を含むＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープを認識することができる。例えば、エピトープは、配列番号１１９のＱ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のアミノ酸残基を含み得る。

【0183】

場合によっては、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１９のＱ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０および／またはＰ１８７に特異的に結合できる可能性がある。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１９のＱ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のアミノ酸残基に特異的に結合することができる。

【0184】

場合によっては、ＴｒｋＡのＥＣＤは、配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を含む。本出願において、ＴｒｋＡは配列番号１１９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0185】

場合によっては、抗原原子と、前記抗体または抗原結合断片の対応する相互作用部位との間の距離は、約４．００Å以下、例えば、３．７６Å、３．６２Å、３．４３Å、３．３６Å、３．１３Å、３．０６Å、および／または２．６８Åであってもよい。

【0186】

場合によっては、抗原原子Ｑ１７６に結合する抗体の相互作用部位は、配列番号８６の重鎖Ｗ３３または対応する残基であってもよい（例えば、対応は配列アライメントによって決定できる）。場合によっては、抗原原子Ｈ１７８に結合する抗体の相互作用部位は、配列番号９１の軽鎖Ｙ９０または対応する残基であってもよい。場合によっては、抗原原子Ｇ１７９に結合する抗体の相互作用部位は、配列番号８６の重鎖Ｈ３５または対応する残基であってもよい。場合によっては、抗原原子Ｇ１７９に結合する抗体の相互作用部位は、配列番号９１の軽鎖Ｙ９０または対応する残基であってもよい。場合によっては、抗原原子Ｑ１８０に結合する抗体の相互作用部位は、配列番号８６の重鎖Ｗ１０４または対応する残基であってもよい。場合によっては、抗原原子Ｑ１８０に結合する抗体の相互作用部位は、配列番号９１の軽鎖Ｙ９０または対応する残基であってもよい。場合によっては、抗原原子Ｐ１８７に結合する抗体の相互作用部位は、配列番号９１の軽鎖Ｙ３１または対応する残基であってもよい。

【0187】

別の態様では、本出願は、ＴｒｋＡとＮＧＦとの結合を実質的に阻害しないＴｒｋＡ抗体をスクリーニングまたは取得する方法を提供する。この方法は、配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、および／またはＰ１８７を含むＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープを使用することを含み得る。例えば、ＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープは、配列番号１１９のＱ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、およびＰ１８７の１つ以上の（例えば、２、３、４、または５つ）アミノ酸残基を含み得る。例えば、ＴｒｋＡ抗体は、以下の特性の１つ以上を備えていてもよい：ＯｃｔｅｔまたはＳＰＲで測定して約５＊１０^－８Ｍ未満のＫ_ＤでＴｒｋＡに結合することができること、ＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡの活性化を阻害することができること、ＴｒｋＡへの結合に関してＮＧＦと実質的に競合しないこと、および疼痛感作（例えば、ＮＧＦを介した疼痛感化を軽減できること（例えば、ＮＧＦの神経細胞の成長および生存に対する効果を実質的に損なうことなく、ＮＧＦを介した疼痛感化を軽減できること）。例えば、この方法は、インビトロまたはエクスビボの方法であってもよい。抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープを特異的に認識または結合してもよく、エピトープは、配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、および／またはＰ１８７を含んでもよい。

【0188】

いくつかの実施形態では、短縮または切断されたＴｒｋＡタンパク質（例えば、ヒトＴｒｋＡタンパク質）またはそのＥＣＤは、動物（例えば、マウス、ウサギ、または他の非ヒト動物）を免疫化するために使用され、または抗体生成細胞（例えば、Ｂ細胞、例えば、ヒトＢ細胞）に導入され、切断されたＴｒｋＡタンパク質に特異的に結合する抗体がさらに分析または選択されてもよい。切断型ＴｒｋＡタンパク質は、配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、および／またはＰ１８７を含む。

【0189】

場合によっては、配列番号１１９のＱ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、および／またはＰ１８７に対応する１つ以上の残基が異なる残基に変異しているか、または欠失している、変異または改変されたＴｒｋＡタンパク質が使用されてもよい。候補抗体またはその抗原結合断片が変異または改変されたＴｒｋＡタンパク質に結合しないか、または著しく低い親和性で結合する場合（例えば、Ｋ_Ｄ値が２０％高い、２５％高い、３０％高い、３５％高い、４０％高い、４５％高い、５０％高い、５５％高い、６０％高い、６５％高い、７０％以上高い）、抗体またはその抗原結合断片は、所望の特性（例えば、本開示の抗体または抗原結合断片に含まれる特性）を有する抗体（またはその抗原結合断片）とみなされる可能性があるため、さらに分析または選択されてもよい。

【0190】

別の態様では、本出願は、ＴｒｋＡとＮＧＦとの結合を実質的に阻害しないＴｒｋＡ抗体を取得またはスクリーニングするためのＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープの使用を提供し、前記エピトープは、配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、および／またはＰ１８７を含む。

【0191】

別の態様では、本開示は、ＴｒｋＡとＮＧＦとの結合を実質的に阻害しないＴｒｋＡ抗体を取得またはスクリーニングするための薬剤の製造におけるＴｒｋＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のエピトープの使用を提供し、ここで、エピトープは、配列番号１１９のアミノ酸残基Ｑ１７６、Ｈ１７８、Ｇ１７９、Ｑ１８０、および／またはＰ１８７を含む。

【0192】

場合によっては、抗体またはその抗原結合断片は、ＴｒｋＡへの結合に関して参照抗体と競合してもよく、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号９６、９７、および９８に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号９３、９４、および９５に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0193】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１１７、１１８、および４１に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１１４（ＳＸ_１ＷＸ_２Ｑ、ここでＸ_１はＨまたはＹ、Ｘ_２はＩまたはＭ）、１１５、および１１６に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0194】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号９、１１、および１３に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１、４、および７に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0195】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２８、３０、および３２に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２０、２３、および２６に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0196】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１－３はそれぞれ配列番号５６、５８、および６０に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号６２、６５、および６８に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0197】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号５６、５８、および６０に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２０、７３、および６８に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0198】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号５６、５８、および６０に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２０、７５、および６８に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0199】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号５６、７７、および６０に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号６２、６５、および６８に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0200】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号５６、７７、および６０に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２０、、７３および６８に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0201】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号５６、７７、および６０に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２０、７５、および６８に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0202】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号８０、８２、および３２に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号６２、７９、および２６に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0203】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号８８、３０、および３２に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２０、８７、および２６に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0204】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２８、３９、および４１に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号４５、４６、および３７に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0205】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号８８、１０３、および４１に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１０１、１０２、および３７に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0206】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号８８、１０３、および４１に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１０９、１１０、および１１１に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0207】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号８８、３９、および４１に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号４５、４６、および３７に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0208】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号３９、１０８および４１に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１０９、１１０および１１１に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0209】

場合によっては、参照抗体は軽鎖ＣＤＲ１～３および重鎖ＣＤＲ１～３を含み、軽鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号５０、３９、および４１に記載されるアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号４７、４８、および４９に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0210】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ１～３のうちの少なくとも１つを含み、軽鎖可変領域は、配列番号１３２、１３４、１５、および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0211】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ１～３のうちの少なくとも１つを含み、重鎖可変領域は、配列番号１３１、１３３、１４および５１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0212】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ１を含み、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号９６、１１７、９、および５０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0213】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ１を含み、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号９、２８、５０、５６、８０、および８８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0214】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ２を含み、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号９７、１１８、および１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0215】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ２を含み、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１１、３０、３９、５８、７７、８２、１０３、および１０８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0216】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号９８、１３、および４１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0217】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１３、３２、４１、６０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0218】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号１３２、１３４、１５、および５３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0219】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ１を含み、重鎖ＣＤＲ１は配列番号９３、１１４（ＳＸ_１ＷＸ_２Ｑ、ここでＸ_１はＨまたはＹであり、Ｘ_２はＩまたはＭである）、１、および４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0220】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ１を含み、重鎖ＣＤＲ１は配列番号１、２０、４５、４７、６２、１０１、および１０９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0221】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ２を含み、重鎖ＣＤＲ２は配列番号９４、１１５、４、および４８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0222】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ２を含み、重鎖ＣＤＲ２は配列番号４、２３、４６、４８、６５、７３、７５、８７、１０２、および１１０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0223】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ３を含み、重鎖ＣＤＲ３は配列番号９５、１１６、７、および４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖ＣＤＲ３を含み、重鎖ＣＤＲ３は配列番号７、２６、３７、４９、６８、および１１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0225】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号１３１、１３３、１４、および５１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0226】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１）それぞれ配列番号９６、９７、および９８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号９３、９４、および９５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、２）それぞれ配列番号１１７、１１８、および４１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、ならびにそれぞれ配列番号１１４（ＳＸ_１ＷＸ_２Ｑ、ここで、Ｘ_１ＨまたはＹであり、Ｘ_２はＩまたはＭである）、１１５、および１１６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、３）それぞれ配列番号９、１１、および１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１、４、および７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、４）それぞれ配列番号２８、３０、および３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号２０、２３、および２６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、５）それぞれ配列番号５６、５８、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号６２、６５、６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、６）それぞれ配列番号５６、５８、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号２０、７３、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、７）それぞれ配列番号５６、５８、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号２０、７５、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、８）それぞれ配列番号５６、７７、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号６２、６５、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、９）それぞれ配列番号５６、７７、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号２０、７３、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１０）それぞれ配列番号５６、７７、および６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号２０、７５、および６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１１）それぞれ配列番号８０、８２、および３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号６２、７９、および２６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１２）それぞれ配列番号８８、３０、および３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号２０、８７、および２６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１３）それぞれ配列番号２８、３９、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号４５、４６、および３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１４）それぞれ配列番号８８、１０３、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１０１、１０２、および３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１５）それぞれ配列番号８８、１０３、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１０９、１１０、および１１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１６）それぞれ配列番号８８、３９、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ～３、およびそれぞれ配列番号４５、４６、および３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、１７）それぞれ配列番号３９、１０８、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号１０９、１１０、および１１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、または１８）それぞれ配列番号５０、３９、および４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１～３、およびそれぞれ配列番号４７、４８、および４９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１～３、を含む。

【0227】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１）配列番号１３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１３１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、２）配列番号１３４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１３３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、３）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、４）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、５）配列番号９０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、６）配列番号９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、７）配列番号９１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号９２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、８）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、９）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１０）配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１１）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１２）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１３）配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１４）配列番号８５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１５）配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１６）配列番号１００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号９９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１７）配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１８）配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、１９）配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、２０）配列番号１１３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または２１）配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、を含む。

【0228】

抗体または抗原結合断片には、実質的に同じ機能／特性を有するそれらの相同体または変異体も含まれてもよい。場合によっては、相同体または変異体は、本開示の抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列とは少なくとも１つのアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有してもよい。例えば、相同体または変異体は、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２個のアミノ酸などの１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換によって抗体またはその抗原結合断片とは異なるポリペプチドであってもよい。場合によっては、相同体または変異体は、抗体またはその抗原結合断片と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。例えば、相同体または変異体は、抗体またはその抗原結合断片に対して８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上）の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。

【0229】

本明細書で特定されるポリペプチド配列の文脈で使用される「パーセント（％）配列同一性」という用語は、一般に、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成し、いかなる保守的置換も配列同一性の一部として考慮しない後に、第２の参照ポリペプチド配列またはその一部のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一であるクエリ配列内のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージを指す。アミノ酸／ヌクレオチド配列の同一性のパーセントを決定するためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用するなど、当該技術分野の技術範囲内のさまざまな方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメータを決定することができる。同一性パーセントは、定義されたポリペプチド／ポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定されてもよく、より短い長さ、例えば、より大きな定義されたポリペプチド／ポリヌクレオチド配列から採取された断片の長さにわたって測定されてもよい。本明細書、表、図、または配列リストに示される配列によってサポートされる任意の断片長は、同一性のパーセンテージを測定できる長さを記述するために使用できることが理解される。

【0230】

場合によっては、その親配列と比較して、抗体またはその抗原結合断片の変異体または相同体において、以下の残基または対応する残基の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）は変更または変異していない：配列番号８６の重鎖Ｗ３３または対応する残基（例えば、対応は配列アライメントによって決定され得る）、配列番号９１の軽鎖Ｙ９０または対応する残基、配列番号８６の重鎖Ｈ３５または対応する残基、配列番号８６の重鎖Ｗ１０４または対応する残基、および／または配列番号９１の軽鎖Ｙ３１または対応する残基。

【0231】

本出願では、ＣＤＲ配列は、特定のＣＤＲ分類基準（例えば、Ｋａｂａｔ法）に従って分類されてもよい。なお、特定のＣＤＲ分類基準（例えば、Ｋａｂａｔ法）に従って決定されたＴｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列が、本出願で定義されたＣＤＲ配列と同じである場合、ＴｒｋＡ抗体またはその抗原結合断片も本出願の保護範囲内にあることに留意すべきである。異なるＣＤＲ分類基準に従って、ＣＤＲ位置の正確な識別は若干異なる場合があり、したがって、本出願には、配列リストに示されるＣＤＲだけでなく、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＩＭＧＴなどの他の分類方法を使用してＶＨおよびＶＬドメインに含まれるＣＤＲも含まれる。

【0232】

別の態様において、本出願は、本開示の抗体またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質を提供する。

【0233】

別の態様では、本出願は、本開示の抗体またはその抗原結合断片を含むタンパク質複合体（免疫複合体など）を提供する。

【0234】

核酸、ベクター、細胞および調製方法
別の態様では、本開示は、抗体またはその抗原結合断片、または融合タンパク質をコードする単離された核酸または分子を提供する。

【0235】

単離された核酸は、１つ以上の核酸分子を含み、各々が本開示の抗体またはその抗原結合断片の少なくとも一部をコードする。例えば、単離された核酸は、少なくとも２つの核酸分子を含み、そのうちの１つは抗体重鎖またはその断片をコードし、もう１つは抗体軽鎖またはその断片をコードする。場合によっては、単離された核酸が融合タンパク質をコードすることもある。

【0236】

単離された核酸または単離された核酸群は、当該技術分野で周知の組み換え技術を使用して合成することができる。例えば、単離された核酸または単離された核酸群は、自動ＤＮＡ合成装置を使用して合成することができる。標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８４）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅより出版（１９８７）、で説明されているものがある。簡単に言えば、本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡから調製することができ、これらは全て細胞から直接抽出することも、ＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲを含むが、これらに限定されない様々な増幅プロセスによって組み換え生成することもできる。

【0237】

核酸の直接化学合成では、通常、３’ブロックおよび５’ブロックヌクレオチドモノマーを、成長中のヌクレオチドポリマー鎖の末端５’ヒドロキシル基に順次付加する。各付加は、成長中の鎖の末端５’ヒドロキシル基による、付加されたモノマーの３’位への求核攻撃によって影響を受ける。付加されたモノマーは、通常、ホスホトリエステル、ホスホラミダイトなどのリン誘導体である。例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｉ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．５２１：７１９（１９８０）を参照、また、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第４，５００，７０７号、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，４３６，３２７号および第５，７００，６３７号を参照。

【0238】

別の態様では、本開示は、単離された核酸分子を含むベクターを提供する。

【0239】

ベクターは、任意の線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどであり得る。ウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどが挙げられる。場合によっては、ベクターは発現ベクター、例えば、ファージディスプレイベクターである。

【0240】

発現ベクターは、特定の種類の宿主細胞には適しているが、他の種類の宿主細胞には適していない場合がある。例えば、発現ベクターを宿主生物に導入し、ベクターに含まれる遺伝子／ポリヌクレオチドの生存率と発現をモニタリングすることができる。

【0241】

発現ベクターには、発現すると、発現ベクターを保持する宿主細胞を選択または識別するために有用な１つ以上の表現型特性を付与する１つ以上の選択マーカー遺伝子も含まれている場合がある。真核細胞に適した選択マーカーの非限定的な例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素およびネオマイシン耐性が挙げられる。

【0242】

対象ベクターは、様々な確立された技術によって安定的にまたは一時的に宿主細胞に導入することができる。例えば、一つの方法は、塩化カルシウム処理を含み、発現ベクターはカルシウム沈殿物を介して導入される。同様の手順に従って、リン酸カルシウムなどの他の塩も使用できる。さらに、電気穿孔法（つまり、電流を流して細胞の核酸の透過性を高める方法）も使用できる。形質転換方法の他の例としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストランを介した形質転換、酢酸リチウム存在下での熱ショックなどがある。脂質複合体、リポソーム、およびデンドリマーも宿主細胞へのトランスフェクションに使用できる。

【0243】

別の態様では、本開示は、本開示の単離された核酸分子または本開示のベクターを含む細胞（例えば、宿主細胞などの単離された細胞）を提供する。

【0244】

細胞は、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、または本発明の融合タンパク質を発現し得る。細胞は真核細胞であっても原核細胞であってもよい。適切な細胞は、本発明の核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、抗体、その抗原結合断片、または融合タンパク質の発現および／または分泌に利用され得る。例えば、細胞は、大腸菌細胞、他の細菌宿主細胞、酵母細胞、または様々な高等真核細胞である可能性がある。

【0245】

別の態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片、または融合タンパク質を産生する方法を提供し、前記方法は、本発明の細胞を、抗体、その抗原結合断片、または融合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養することを含む。

【0246】

この方法は、任意に、抗体またはその抗原結合断片、または本開示の融合タンパク質を採取することをさらに含んでもよい。

【0247】

組成物
別の態様では、本開示は、抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質、タンパク質複合体、単離された核酸分子、ベクター、および／または本開示の細胞、および任意に薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物を提供する。

【0248】

場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は緩衝剤を含んでもよい。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤はアミノ酸を含んでもよい。

【0249】

いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは１～１３であってもよく、例えば、ｐＨは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３であってもよい。

【0250】

場合によっては、組成物は、さらに、有効量の追加の治療活性成分、例えば、ＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害を治療するための追加の治療活性成分を含んでもよい。各活性成分は、医薬組成物中に医薬的に活性な量で存在してもよい。組成物において、本出願の抗体、その断片は、追加の活性成分と結合していても、結合していなくてもよい。

【0251】

以下に、限定されない例示的な医薬組成物およびその製造方法を説明する。医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、徐放性製剤、溶液、懸濁液として経口投与に適した形態、滅菌溶液、懸濁液または乳剤として非経口注射に適した形態、軟膏またはクリームとして局所投与に適した形態、または坐剤として直腸投与に適した形態であってもよい。医薬組成物は、正確な投与量を単回投与するのに適した単位投与形態であってもよい。場合によっては、医薬組成物は、液体医薬組成物であってもよい。

【0252】

本開示の医薬組成物は、個別の剤形として提供することができ、各剤形には、水性または非水性液体中の粉末または顆粒、溶液、または懸濁液として所定量の有効成分が含まれる。このような剤形は、当業者に知られている方法のいずれかによって調製することができ、例えば、活性成分を、１つ以上の他の成分を構成する担体と組み合わせるステップを含むことができる。一般に、組成物は、有効成分を液体担体または細かく分割された固体担体、あるいはその両方と均一かつ緊密に混合し、その後、必要に応じて、製品を所望の形状に成形することによって調製される。

【0253】

本発明の抗体、その抗原結合断片、または融合タンパク質は、従来の医薬配合技術に従って医薬担体と緊密に混合して組み合わせることができる。担体は、投与に望ましい製剤の形態に応じて、様々な形態をとることができる。

【0254】

組成物はさらに、１種以上の薬学的に許容される添加剤および賦形剤を含むことができる。このような添加剤および賦形剤には、粘着防止剤、消泡剤、緩衝剤、ポリマー、抗酸化剤、防腐剤、キレート剤、粘性調節剤、等張化剤、香味剤、着色剤、着臭剤、乳白剤、懸濁剤、結合剤、充填剤、可塑剤、潤滑剤、および／またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。

【0255】

本開示の医薬組成物は、治療有効量の活性剤（例えば、抗体、その抗原結合断片、または本開示の融合タンパク質）を含んでもよい。治療有効量とは、当該状態または障害を患っているか、または発症するリスクがある対象において、状態または障害（例えば、慢性疼痛）および／またはその合併症を（少なくとも部分的に）予防および／または治癒することができる対象医薬組成物の量である。含まれる活性剤の具体的な量／濃度は、投与方法および患者の必要性に応じて異なり、例えば、患者の体積、粘度、および／または体重などに基づいて決定することができる。例えば、適切な投与量は、約０．１ｍｇまたは１ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日であり得るが、場合によっては、投与量はさらに高くなることもある。これらの特定の投与量は、特定の患者の状態、製剤、および／または疾患に基づいて、当業者（例えば、医師または薬剤師）によって都合よく調整され得ることが理解されるべきである。

【0256】

医療用途と治療方法
別の態様では、本発明は、ＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害を予防および／または治療するための医薬品の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質、タンパク質複合体、単離された核酸分子、ベクター、および／または細胞の使用を提供する。

【0257】

さらなる態様において、本出願は、対象に、本開示の抗体または抗原結合断片、融合タンパク質、タンパク質複合体、単離された核酸分子、ベクター、細胞、および／または組成物の有効量を投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または障害を予防および／または治療する方法を提供し、ここで、疾患または障害は、ＴｒｋＡの不適切な発現または機能に関連する疾患または障害である。

【0258】

例えば、疾患または障害は、疼痛を含んでもよい。

【0259】

例えば、疼痛は、慢性的な疼痛を含んでもよい。

【0260】

例えば、疾患または障害は、侵害受容性、非侵害受容性、外傷性、炎症性、神経障害性、増殖性、または混合の病因による慢性疼痛を含んでもよい。例えば、疾患または障害は、筋骨格系または神経障害に起因する慢性疼痛を含んでもよい。

【0261】

例えば、疾患または障害は、術後疼痛、関節リウマチ疼痛、神経障害性疼痛、および／または変形性関節症疼痛を含んでもよい。

【0262】

他の実施形態では、疼痛は筋骨格系または神経障害に起因する急性または慢性の疼痛である。本出願によって予防および／または治療され得る疼痛の具体的な非限定的な例としては、例えば、術後疼痛、関節リウマチ疼痛、神経障害性疼痛（根性疼痛ＣＬＢＰ、ＤＮＰ、およびＬＳＲを含む）、および変形性関節症疼痛（非根性疼痛を含む）が挙げられる。場合によっては、疼痛は筋骨格系と神経障害の両方に起因する慢性の疼痛である。他の実施形態では、疼痛は内臓痛（例えば、慢性前立腺炎、間質性膀胱炎、または慢性骨盤痛など）である。

【0263】

例えば、前記疾患または障害は、膵炎、腎臓結石、子宮内膜症、ＩＢＤ、クローン病、術後癒着、胆嚢結石、頭痛、月経困難症、筋骨格痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢胞、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後痛、片頭痛、三叉神経痛、火傷および／または創傷による疼痛、外傷による疼痛、神経障害性疼痛、筋骨格疾患による疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、関節周囲病変、腫瘍性疼痛、骨転移による疼痛、および／またはＨＩＶ感染による疼痛など、いずれかに関連する疼痛である可能性があるが、これらに限定されない。

【0264】

別の態様では、本開示は、サンプル中のＴｒｋＡの存在および／または量を決定するための薬剤の製造における抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質、またはタンパク質複合体の使用を提供する。

【0265】

別の態様では、本開示は、サンプル中のＴｒｋＡの存在および／または量を決定する方法を提供し、前記方法は、ａ）サンプルを本開示の抗体または抗原結合断片、融合タンパク質、またはタンパク質複合体と接触させること、およびｂ）サンプルに結合した抗体または抗原結合断片、融合タンパク質、またはタンパク質複合体の存在および／または量を決定することを含む。

【実施例】

【0266】

以下の実施例は、当業者に、本出願をどのように作成し、用いるかについての完全な開示および記載を提供するために記載され、発明者らがその発明としてみなす範囲を限定することを意図するわけではなく、また、以下の実験が全てである、もしくはその実験のみが実施されたということを意図するものでもない。使用した数（例えば量、温度など）の正確性を確保するための努力はなされているが、いくつかの実験の誤差およびずれは存在する。

【0267】

実施例１．抗ＴｒｋＡモノクローナル抗体の生成
免疫、結合、機能アッセイ用のＴｒｋＡ組み換えタンパク質
ヒトＴｒｋＡタンパク質（配列番号１２０）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を遺伝子合成し、Ｃ末端にＨｉｓタグを融合し、Ｎ末端にシグナルペプチドおよびフラグタグ（ＰＨＡ）を融合したｐｃＤＮＡ３．４ベースの発現ベクターにサブクローニングした。得られたプラスミドを２９３－Ｆ細胞に一時的にトランスフェクトし、回転振とう機を備えたＣＯ_２インキュベーターで５～７日間培養した。組み換えタンパク質を含む上清を収集し、遠心分離により清澄化し、その後、タンパク質をワンステップ固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製されたタンパク質はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に緩衝剤交換され、小分けにして－８０℃の冷凍庫に保存された。

【0268】

免疫化、ハイブリドーマ融合およびクローニング
ＢＡＬＢ／ｃマウスの１つのグループ（５匹のマウス／グループ）を、表３のスケジュールに従って、上記の精製タンパク質で免疫した。ＴｒｋＡ ＥＣＤタンパク質を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と１：１で混合し、安定した水中油型エマルジョンを得た。ＣＦＡは最初の予防接種でのみ使用された。その後の免疫化はＩＦＡを含むＰＢＳで実施された。注射用量はマウス１匹あたり２５～５０μｇ／２００Ｌであった。免疫後、血清サンプルを採取し、間接ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって免疫抗原に対する抗体反応（力価）を測定した（下記参照）。ブーストから４日後、脾臓細胞を分離し、電気細胞融合法によってＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させて細胞融合を誘導し、ハイブリドーマを形成した。融合細胞は９６ウェルプレートに播種され、各融合に５０枚のプレートが使用された。

【0269】

【表3】

ＴｒｋＡ抗体の結合活性を決定する
ハイブリドーマ上清は、最初に間接ＥＬＩＳＡによってヒトＴｒｋＡでスクリーニングされた。簡単に説明すると、精製されたＰＨＡをＰＢＳ緩衝剤で最終濃度１μｇ／ｍＬに希釈した。希釈された抗原１００μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、次にＰＢＳＴで希釈した２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を２００μＬ／ウェル加え、室温で２時間インキュベートしてブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、プレートを３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。一次抗体と二次抗体の希釈溶液、および基質溶液を調製した。希釈された一次抗体１００μＬを各ウェルにピペットで分注し、室温で１時間インキュベートした。ウェルの内容物を取り除き、３００μＬのＰＢＳＴ緩衝剤で３回洗浄した。ＰＢＳをプレートから除去した。希釈されたペルオキシダーゼ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ １００μＬを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルの内容物を除去し、ウェルを３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ基質溶液をウェルに加えた。十分に発色した後、反応停止液１００μＬをウェルに加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度（ＯＤ：４５０）を読み取り、データを分析した。

【0270】

ＥＬＩＳＡ陽性抗体産生クローンについては、従来の方法を用いて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってさらに検証された。簡単に説明すると、ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（登録商標） ＴｒｋＡ－ＮＦＡＴ－ｂｌａ ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ヒトＴｒｋＡを過剰発現する細胞）をＵ底９６ウェルプレートで抗ＴｒｋＡ抗体で染色した。細胞を氷冷ＰＢＳで２×１０^６細胞／ｍＬに再懸濁した。一次抗体と二次抗体の希釈溶液を調製し、希釈された一次抗体１００μＬを各ウェルに加え、暗所で４℃で１時間インキュベートした。細胞を２５００ｒｐｍで３分間遠心分離して２回洗浄し、氷冷ＰＢＳに再懸濁した。ＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧを冷ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、その後、細胞をこの溶液１００μＬに再懸濁した。細胞を２５００ｒｐｍで３分間遠心分離して２回洗浄し、１００μＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液は直ちに暗所で４℃で保存した。細胞はできるだけ早くフローサイトメーターで分析された。

【0271】

サブクローニング
ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳアッセイの両方で陽性結合を示したハイブリドーマは、その後、機能アッセイでテストされ、目的の機能活性を持つ抗体が特定された。機能活性が陽性の抗体は限界希釈法によってさらにサブクローニングされ、ＦＡＣＳおよび機能アッセイによって特性評価された。機能アッセイを通じて選択されたサブクローンはモノクローナル抗体として定義された。選択されたサブクローンはハイブリドーマ－ＳＦＭ培地で培養された。

【0272】

モノクローナル抗体の発現と精製
陽性ハイブリドーマはまずハイブリドーマ－ＳＦＭ培地で培養され、その後細胞はハイブリドーマ－ＳＦＭ培地で５％のＣＯ_２および３７℃のインキュベーター内で４日間培養された。培養後、細胞生存率とタンパク質産生を評価した。

【0273】

発現させる抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列をそれぞれｐＣＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ４またはｐＣＤＮＡ３．４－ｈＫａｐｐａベクターに挿入した。得られたベクタープラスミドを抽出し、配列決定によって検証した。検証されたプラスミドは、ＰＥＩを含むヒト２９３Ｆ細胞にトランスフェクトされ、継続的に培養された。２９３Ｆ細胞は、細胞トランスフェクションのために無血清培地（上海ＯＰＭバイオサイエンス、ＯＰＭ－２９３ＣＤ０３）で対数増殖期まで培養された。抗体軽鎖プラスミド３μｇと抗体重鎖プラスミド２μｇをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標） Ｉ還元血清培地（ＧＩＢＣＯ、３１９８５－０７０）１ｍＬに溶解し、よく混合し、ＰＥＩ ２０μｇを加えてよく混合し、室温で１５分間インキュベートし、５ｍＬの細胞に加えた。細胞培養条件は以下のとおり：５％のＣＯ_２、３７℃、１２５ｒｐｍ／分。フィーダー培地は１日目に補充された。細胞はさらに４日間培養された。

【0274】

全ての細胞を収集し、４０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離した。抗体を含む上清を収集した。抗体の精製は、製造元の指示に従ってＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭａｇＢｅａｄｓを使用して実行された。簡単に言うと、１）結合。目的の抗体を含む清澄化された上清を、ＭａｇＢｅａｄｓとともに室温で２時間インキュベートした。２）洗浄。磁気分離ラックを使用してビーズを収集し、上清を廃棄した。１ｍＬのＰＢＳ緩衝剤をチューブに加えてよく混ぜ、磁気分離ラックを使用してビーズを収集し、上清を捨てた。洗浄ステップを３回以上繰り返した。３）溶出。１００μＬの溶出緩衝剤（０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０）をチューブに加え、よく混合した。時々混ぜながら室温で５分間インキュベートした。磁気分離ラックを使用してビーズを収集し、溶出されたＩｇＧを含む上清をきれいなチューブに移した。ｐＨを中和するために、各１００μＬの溶出液に１０μＬの中和緩衝剤（１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５）を加えた。タンパク質濃度は２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定され、精製された抗体は小分けされて－８０℃の冷凍庫に保存された。３つのコントロール抗体、抗ＴＮＰ（それぞれ配列番号１２５および１２６に示すＶＨおよびＶＬを持つ）、タネズマブ（それぞれ配列番号１２７および１２８に示すＶＨおよびＶＬを持つ）、およびファシヌマブ（それぞれ配列番号１２９および１３０に示すＶＨおよびＶＬを持つ）も、上記の方法によって調製された。

【0275】

ＮＦＡＴレポーターアッセイを用いたＴｒｋＡ活性化に対する拮抗効果
ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（登録商標） ＴｒｋＡ－ＮＦＡＴ－ｂｌａ ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｋ１５１６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）には、ＮＦＡＴ応答エレメントの制御下にあるベータラクタマーゼレポーター遺伝子が含まれており、この遺伝子は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞に安定的に組み込まれており、ヒトＴｒｋＡ遺伝子も安定的に発現している。したがって、細胞が神経成長因子２．５ｓ（ＮＧＦ２．５ｓ）で刺激されると、ＴｒｋＡシグナル伝達が活性化され、ベータラクタマーゼの特殊な蛍光基質で検出できるようになる。この細胞株を使用すると、サンプルのＮＧＦ－ＴｒｋＡシグナル伝達経路に対する拮抗作用をテストできる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｅｌｌｓｅｎｓｏｒ＿ＴｒｋＡ ＮＦＡＴ ｂｌａ＿ＣＨＯＫ１＿ｍａｎｕａｌに従って、Ｃｅｌｌｓｅｎｓｏｒ ＴｒｋＡ－ＮＦＡＴ－ｂｌａ ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｋ１５１６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を実験の前日に３２μＬの培地とともに３８４ウェルプレートに播種した。細胞は、３７℃／５％のＣＯ_２の加湿インキュベーター内で３０分間、３倍段階希釈した抗体とともにプレインキュベートされた。次に、ＮＧＦの１１Ｘ ＥＣ８０ストック溶液４μＬを加えました。拮抗薬アッセイプレートを加湿された３７℃／５％のＣＯ_２インキュベーター内で５時間インキュベートした。６Ｘ ＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ^ＴＭ－ＦＲＥＴ Ｂ／Ｇ 基質（ＣＣＦ４－ＡＭ）混合物は、製造元の指示に従って調製された。各ウェルに８μＬの６Ｘ基質混合物を加えた。プレートは光と蒸発から保護するために覆われ、室温で２時間培養された。背景として無細胞ウェルを使用した。ＦＲＥＴシグナル（４０５ｎｍ励起、および４６０ｎｍと５３０ｎｍ発光）はマイクロプレートリーダー（Ｃ５、Ｂｉｏｔｅｋ）から取得され、バックグラウンドシグナルが差し引かれた。４６０ｎｍと５３０ｎｍの蛍光信号の比率は、ＴｒｋＡ活性化のレベルを反映している。

【0276】

実施例２．ＴｒｋＡ拮抗モノクローナル抗体の開発
スクリーニング後、目的のクローンをサブクローニングして同定した。これらのクローンは、高い特異性と強度でヒトＴｒｋＡに結合し、ＴｒｋＡ依存性ＮＦＡＴ拮抗薬レポーターアッセイでも強力な阻害を示した。ＥＬＩＳＡアッセイ結果（図１）およびＦＡＣＳ分析結果（図２）に示されているように、選択されたクローンｍｕＰＨＤ５０、ｍｕＰＨＤ４８、およびｍｕＰＨＤ４９は、ヒトＴｒｋＡに対して望ましい結合を示した。さらに、アンタゴニストＮＦＡＴアッセイ（図３Ａおよび３Ｂ）に示されているように、選択された抗体ｍｕＰＨＤ３１、ｍｕＰＨＤ５０、ｍｕＰＨＤ４８、およびｍｕＰＨＤ４９は、ヒトＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡシグナル伝達の活性化を阻害することができる。

【0277】

実施例３．抗体可変領域遺伝子のクローニング
ハイブリドーマ細胞は１０ｃｍディッシュで培養され、対数増殖期に採取された。全細胞ＲＮＡは、製造元の指示に従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６－０１８）を使用して抽出された。ＲＮＡをヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。ＲＮＡ濃度は、ｂｉｏＴＥＫ装置で２６０ｎｍの吸光度を使用して測定した。ｃＤＮＡテンプレートを得るために、各ＲＮＡ４μｇをＨｉＦｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（ＣＷＢＩＯ、ＣＷ２５６９）を使用して逆転写した。次に、抗体の可変遺伝子をクローン化するためにＰＣＲ反応を２回実行した。ＰＣＲ産物は直接配列決定された。キメラ抗体の発現プラスミドを構築するために、ＶＨ遺伝子をｐＣＮＤＡ３．４－ｈＩｇＧ４ベクターにサブクローニングし、ＶＬ遺伝子をｐＣＤＮＡ３．４－ｈＫａｐｐａベクターにサブクローニングし、さらにＤＮＡ配列決定によって配列を確認した。抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ（強化Ｃｈｏｔｈｉａ）、およびＩＭＧＴシステム（Ｄｕｎｂａｒ Ｊ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１６、３２（２）：２９８～３００）に従って同定された。

【0278】

ｍｕＰＨＤ４８の重鎖および軽鎖可変領域配列は、それぞれ配列番号１６および１８に示されている。

【0279】

ｍｕＰＨＤ４８のＣＤＲは次のとおりである：

【0280】

【表4】

ＰＨＤ４９の重鎖および軽鎖可変領域配列は、それぞれ配列番号４２および４４に示されている。

【0281】

ｍｕＰＨＤ４９のＣＤＲは次のとおりである：

【0282】

【表5】

ｍｕＰＨＤ５０の重鎖および軽鎖可変領域配列は、それぞれ配列番号５１および５３に示されている。

【0283】

ｍｕＰＨＤ５０のＣＤＲは次のとおりである：

【0284】

【表6】

ｍｕＰＨＤ３１の重鎖および軽鎖可変領域配列は、それぞれ配列番号１４および１５に示されている。

【0285】

ｍｕＰＨＤ３１のＣＤＲは次のとおりである：

【0286】

【表7】

【0287】

実施例４．ヒト化
マウス抗体のヒト化は、以前に報告されたように、ＣＤＲ移植を使用して実行された。簡単に言えば、親（マウス抗体）可変領域（ＶＨおよびＶＬ）フレームワークを、選択されたヒト生殖細胞系列ＶおよびＪ遺伝子のＶＨおよびＶＬのフレームワークに置き換えた。生殖細胞遺伝子は、親抗体と生殖細胞ＶおよびＪ遺伝子間の相同性に基づいて選択された。ヒトＨＣ生殖細胞系遺伝子ＩＧＨＶ１－４６＊０１およびＩＧＨＪ３＊０１は、ｍｕＰＨＤ４８ ＶＨのヒト化のためのＦＲドナーとして選択され、ヒトＬＣ生殖細胞系遺伝子ＩＧＫＶ１－３９＊０１およびＩＧＫＪ４＊０１は、ｍｕＰＨＤ４８ ＶＬのヒト化のためのＦＲドナーとして選択された。ヒトＨＣ生殖細胞系遺伝子ＩＧＨＶ１－６９＊０１およびＩＧＨＪ５＊０１は、ｍｕＰＨＤ４９ ＶＨのヒト化のためのＦＲドナーとして選択され、ヒトＬＣ生殖細胞系遺伝子ＩＧＫＶ１－３９＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１は、ｍｕＰＨＤ４９ ＶＬのヒト化のためのＦＲドナーとして選択された。

【0288】

ヒト化ｍｕＰＨＤ４８（すなわち、ＰＨＤ４８－０１）のＶＨおよびＶＬ配列は次のとおりである：
ＰＨＤ４８－０１のＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＴＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＴＩＹＰＧＮＳＤＳＳＮＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＦＹＹＥＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号：８９）
ＰＨＤ４８－０１のＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＷＩＹＲＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＨＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：９０）

【0289】

ヒト化ｍｕＰＨＤ４９（すなわち、ＰＨＤ４９－０１）のＶＨおよびＶＬ配列は次のとおりである：
ＰＨＤ４９－０１のＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＹＷＭＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＤＤＤＴＩＹＴＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＮＹＤＹＱＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：９９）
ＰＨＤ４９－０１のＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＷＩＹＬＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：１００）

【0290】

対応するコード化核酸配列を合成し、それぞれｐＣＤＮＡ３．４－ｈＩｇＧ４またはｐＣＤＮＡ３．４－ｈＫａｐｐａベクターにサブクローニングし、その後配列決定した（ＧｅｎｅＷｉｚ）。ＰＨＤ４８－０１およびＰＨＤ４９－０１の発現プラスミドは、ヒトＩｇＧ４定常領域に融合したヒト化ＶＨと、ヒトＩｇカッパ定常領域に融合したヒト化ＶＬで構成されている。全ての組み換え抗体は、実施例１に記載のとおり発現され、精製された。

【0291】

図４Ａおよび４Ｂに示すように、ＦＡＣＳ分析におけるＰＨＤ４８－０１のＥＣ５０値は約１４２ｎｇ／ｍＬで、ｃｈｉ－ＰＨＤ４８（ｍｕＰＨＤ４８由来のキメラ抗体）の１１２ｎｇ／ｍｌに匹敵し、ＮＦＡＴ拮抗アッセイにおけるＰＨＤ４８－０１のＩＣ５０値は約３４５ｐＭで、ｍｕＰＨＤ４８（４１１ｐＭ）に匹敵した。これらの結果は、ＰＨＤ４８－０１がｍｕＰＨＤ４８およびｃｈｉ－ＰＨＤ４８の結合および生物学的活性を完全に保持していることを示唆している。

【0292】

図５Ａおよび５Ｂに示すように、ＰＨＤ４９－０１もｃｈｉ－ＰＨＤ４９と同様の機能を保持していた。ＦＡＣＳ分析におけるＰＨＤ４９－０１のＥＣ５０値は約１９８ｎｇ／ｍＬで、ｃｈｉ－ＰＨＤ４９の１５７ｎｇ／ｍＬに匹敵した。ＮＦＡＴアッセイにおけるＰＨＤ４９－０１のＩＣ５０値は約６０４ｐＭで、ｍｕＰＨＤ４９の値（４０４ｐＭ）と同等であった。

【0293】

Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４を用いたバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して抗体の親和性を決定した。簡単に説明すると、抗ヒトＦｃコーティングされたバイオセンサーＡＨＱチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を、事前湿潤プレート内で０．１％のｗ／ｖウシ血清アルブミンおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳに最低１０分間浸した。精製された抗体（０．１％のウシ血清アルブミンおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（アッセイ緩衝剤）を含むＰＢＳ中の１００ｎＭ）は、約１ｎｍのレベルでＡＨＱバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で捕捉された。ロードされたバイオセンサーはアッセイ緩衝剤で洗浄し、結合していないタンパク質を除去した。次に、１００ｎＭの抗原（０．１％のウシ血清アルブミンおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ中）を使用して、結合率、解離率、および応答を測定した。結果は以下の表に示されている。

【0294】

【表8】

ＰＨＤ４８－０１抗体はキメラ抗体と同様の親和性を示した。一方、ＰＨＤ４９－０１抗体はキメラ抗体の親和性よりは低かったものの、Ｋ_Ｄ値で示されるようにキメラ抗体の親和性に匹敵していた。

【0295】

さらに２回のヒト化が行われた。最初のラウンドでは、キメラ抗体に匹敵する高い親和性を維持しながら、変異したマウスアミノ酸残基は少なくなっていた。第２ラウンドでは、他の多くの変異体（ＣＤＲ配列のいくつかの変異を含む）がさらに構築された。クイックチェンジベースの部位特異的変異誘発またはオーバーラップＰＣＲを実行して、第２ラウンドのヒト化抗体の新しいバージョンの発現プラスミドを作成した。全ての組み換え抗体は、実施例１で説明したように発現および精製され、その後、前述のＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４機器を使用してＢＬＩ技術を使用して抗原結合親和性を測定された。ヒト化抗体とキメラ抗体の機能活性を比較するために、ＮＦＡＴアッセイも実施した。結果は下の表にまとめられている。

【0296】

【表9】

【0297】

実施例５．親和性の成熟
抗体親和性成熟は、以前に報告されたようにファージディスプレイによって行われたＴｈｉｅ Ｈ ｅｔ．ａｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９、５２５：３０９－ｘｖ、Ｂｏｓｔｒｏｍ Ｊ ｅｔ．ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９、５２５：３５３－ｘｉｉｉ）。ランダム変異は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、製造元の指示に従ってエラーを起こしやすいＰＣＲによって挿入された。変異したＰＣＲ産物とファージディスプレイベクターをＮｃｏＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）とＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で３７℃で一晩消化した。完全に消化されたＤＮＡはＡｘｙｇｅｎ（登録商標） ＡｘｙＰｒｅｐ ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製され、ベクターおよびＰＣＲ産物のそれぞれのＤＮＡ濃度は２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定された。次に、ベクター：インサートのモル比が１：３となるように５００μＬの容量でライゲーションを行い、１６℃で一晩インキュベートした。その後、ライゲーション産物はＡｘＹＧｅｎ（登録商標） ＡｘＹＰｒｅｐ ＰＣＲクリーンアップキットを使用して脱塩され、ＸＬ１－ｂｌｕｅ電気変換効率の高い細胞に導入された。形質転換細胞は、１５ｍＬの予め温めた２Ｘ ＹＴ培地で３７℃、２５０ｒｐｍで２時間培養された。形質転換効率は、各希釈液の一部を３０℃で一晩インキュベートした後に播種して計算した。残りの細胞懸濁液は１５×１５ｃｍ ２ｘＹＴ寒天培地プレートに播種した。翌日、プレートから細胞をスパチュラで慎重に掻き取った。高親和性クローンを選択し、配列を決定した。

【0298】

抗体の親和性は以下の表にまとめられている。

【0299】

【表10】

【0300】

実施例６．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性の測定
ヒト化抗体の結合速度と親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴ２００^ＴＭ ＳＰＲシステムを使用して決定された。約３０ＲＵのヒト化抗体をタンパク質Ｇセンサーチップ上に固定化し、１ｘＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝剤中のＰＨＡ（０．６２５～２０ｎＭ）の連続２倍希釈液を、抗体結合表面に３０μＬ／分の流速で注入した。結果は以下のようにまとめられる。

【0301】

【表11】

【0302】

実施例７．ＴｒｋＡ抗体のインビトロ機能解析
本発明のヒト化ＴｒｋＡ抗体の活性を評価するために、ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（登録商標） ＴｒｋＡ－ＮＦＡＴ－ｂｌａ ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いて、ＮＧＦ誘導性ＴｒｋＡ活性化の阻害を評価した。Ｃｅｌｌｓｅｎｓｏｒ ＴｒｋＡ－ＮＦＡＴ－ｂｌａ ＣＨＯ－Ｋ１細胞（Ｋ１５１６、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏＧｉｅｓ）を、実験の前日に１００μＬの培地とともに９６ウェルプレートに播種した。細胞は、３７℃／５％のＣＯ_２の加湿インキュベーター内で３０分間、３倍段階希釈した抗体とともにプレインキュベートされた。次に細胞上清を除去し、５０μＬ／ウェルの２×ＮＧＦを添加した。プレートを３７℃／５％のＣＯ_２インキュベーター内で３０分間インキュベートした。細胞上清は、上清を吸引するか、プレートを軽くたたくことによって慎重に除去された。補充溶解緩衝剤（１Ｘ）５０μＬを直ちに添加し、振とうしながら室温で３０分間インキュベートした。ピペッティングによる均質化後、１６μＬの細胞溶解物を９６ウェルプレートから３８４ウェルプレートに移した。補充溶解緩衝剤（１Ｘ）１６μＬを細胞フリーコントロールウェルに分注した。１６μＬの均質化細胞溶解液を試験サンプルウェル、非刺激コントロールウェル、および刺激コントロールウェルに分注し、室温で少なくとも４時間インキュベートした。Ｅｕ^３＋ ＣｒＹｐｔａｔｅのリーダーをセットアップし、２つの異なる波長６６５ｎｍと６２０ｎｍ）での蛍光発光を互換性のあるＨＴＲＦ（登録商標）リーダーで読み取った。ＮＧＦ用量反応曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して４パラメータフィットで分析された。結果は下の表にまとめられている。

【0303】

【表12】

【0304】

実施例８．抗ＴｒｋＡ抗体の結合エピトープの決定
全長ＰＨＤ４８抗体は、モル比１：２００（ペプシン：抗体タンパク質）のペプシンで３７℃で２４０分間消化された。最終濃度５０ｍＭの２－メルカプトエチルアミンＨＣｌ（２－ＭＥＡ）を試料に加え、試料を３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＰＨＤ４８ Ｆａｂはサイズ排除カラムによって精製された。ＴｒｋＡ（ＥＣＤ）－ＰＨＤ４８ Ｆａｂ－抗ヒトＦａｂ ＶＨＨ（モル比 １：２：６）は、３つの成分を氷上で２時間インキュベートして調製した。

【0305】

Ｃｒｙｏ－ＥＭデータは、カウントモードで動作するＫ３直接電子検出器（Ｇａｔａｎ、米国）を備えた３００ｋＶ Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して収集された。全ての動画は、ＥＰＵを使用して、倍率１０５Ｋ、物理ピクセルサイズ０．８１９Åで自動的に記録された。総線量５５．８ｅ－／Å２が４０フレームに分割された。全ての画像処理は、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ ｖ３．３．１を使用して実行され、パッチＣＴＦ推定、２Ｄ分類、異種改良、同種改良は全てｃｒｙｏＳＰＡＲＣで実行された。合計６１，７７７，７０７個の粒子がテンプレートピッカーを使用して自動的に選択され、２×２ビニング（１８０ピクセルのボックスサイズ、ピクセルあたり１．６３８Å）で抽出された。良好な粒子のデータセットを選択するために、２Ｄ分類を２回実行した。次に、選択された粒子を不均一な精製にかけた。改良された座標は、ビン化されていない粒子（ピクセルあたり０．８１９Å、３６０ピクセルのボックスサイズ）の再中心化と再抽出に使用された。これらの粒子はさらに均一に精製され、最終的な密度マップは３．１１Åになった。

【0306】

ＴｒｋＡ（ＥＣＤ）－ＰＨＤ４８ Ｆａｂ－抗ヒトＦａｂ ＶＨＨ複合体のモデルを構築するために、ＴｒｋＡ（ＥＣＤ）（ＡｌｐｈａＦｏｌｄ ＰＤＢより）とＰＨＤ４８ Ｆａｂ（ＰＤＢ ６ＷＷ２からＦｒｉｚｚｌｅｄ－５タンパク質を削除）の構造を、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ（ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ Ｈｏｍｅ ＰａＧｅ）を使用してｃｒｙｏ－ＥＭマップに当てはめた。このモデルは、ｃｒｙｏ－ＥＭマップのガイダンスと、ＣＣＰＥＭを使用した実空間改良を組み合わせて、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ．ａｌ．、２０１０）で手動で構築された。

【0307】

ＴｒｋＡ（ＥＣＤ）とＰＨＤ４８の相互作用はＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａによって解析された。図６に示すように。抗原抗体相互作用は主に水素結合によって媒介され、相互作用領域は、ＴｒｋＡ（ＥＣＤ）の残基１７６（Ｑ）、１７８～１８０（ＨＧＱ）、および１８７（Ｐ）、ＰＨＤ４８重鎖（そのＶＨは配列番号８６に記載のアミノ酸配列を有する）の残基３３（Ｗ）、３５（Ｈ）、および１０４（Ｗ）、ＰＨＤ４８軽鎖（そのＶＬは配列番号９１に記載のアミノ酸配列を有する、Ｙ３１は図６のＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってＹ３２に対応し、Ｙ９０は図６のＫａｂａｔ番号付けシステムに従ってＹ９１に対応する）の残基３１（Ｙ）および９０（Ｙ）である。相互作用残基部位は次の表に示されている。

【0308】

【表13】

【0309】

実施例９．ＴｒｋＡ抗体変異体の親和性と機能の決定
追加のＴｒｋＡ抗体変異体の親和性は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）ベースの方法（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）によって決定された。全ての抗体変異体は、上記の実施例１および実施例４に記載のとおり調製した。

【0310】

ＴｒｋＡ抗体変異体のアミノ酸配列を以下に示す。

【0311】

【表14】

ＰＨＤ２２のＶＨ内のＣＤＲは以下のとおりである。

【0312】

【表15】

ＰＨＤ２４のＶＨ内のＣＤＲは以下のとおりである。

【0313】

【表16】

ＰＨＤ２５のＶＨ内のＣＤＲは以下のとおりである。

【0314】

【表17】

ＰＨＤ３０のＶＨ内のＣＤＲは以下のとおりである。

【0315】

【表18】

ＰＨＤ２５のＶＬ内のＣＤＲは以下のとおりである。

【0316】

【表19】

ＰＨＤ２６のＶＨ内のＣＤＲは以下のとおりである。

【0317】

【表20】

ＰＨＤ３０のＶＬ内のＣＤＲは以下のとおりである。

【0318】

【表21】

親和性データは次の表に示されている。

【0319】

【表22】

さらに、アンタゴニストＮＦＡＴアッセイ（図９）に示されているように、ＴｒｋＡ抗体ＰＨＤ２２、ＰＨＤ２４、ＰＨＤ２５、ＰＨＤ２６、ＰＨＤ２８、ＰＨＤ２９、ＰＨＤ３０、およびＰＨＤ４８は、ヒトＮＧＦによって誘導されるＴｒｋＡシグナル伝達の活性化を阻害することができ、その阻害活性は対照抗体ｐＡｂ０１よりも大幅に優れている。

【0320】

実施例１０．ＴｒｋＡ抗体競合アッセイ
ＴｒｋＡ抗体が標的への結合に関して互いに競合するかどうかを決定する。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４に対して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づく競合アッセイを実施した。簡単に説明すると、抗ペンタＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を、０．１％のｗ／ｖウシ血清アルブミンおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（アッセイ緩衝剤）を含むＰＢＳに、事前湿潤プレート内で最低１０分間浸した。アッセイ緩衝剤中の１００ｎＭのＴｒｋＡ ＥＣＤタンパク質をセンサー上に捕捉し、０．３～１ｎｍの捕捉レベルを得た。次に、ロードされたバイオセンサーをアッセイ緩衝剤で最低３０秒間平衡化し、続いて最初の抗体を９０秒間結合した。２回目の平衡化後、２番目の抗体を９０秒間ロードした。抗体ＰＨＤ２２、ＰＨＤ２４、ＰＨＤ２５、ＰＨＤ２６、ＰＨＤ２８、ＰＨＤ２９、ＰＨＤ３０、およびＰＨＤ４８は、ＴｒｋＡへの結合をめぐって互いに競合する。対照抗体ｐＡｂ０１（配列番号１２３に示すＶＨと配列番号１２４に示すＶＬを持つ）は、ＰＨＤ２２、ＰＨＤ２４、ＰＨＤ２５、ＰＨＤ２６、ＰＨＤ２８、ＰＨＤ２９、ＰＨＤ３０、またはＰＨＤ４８と競合しない（図７Ａ～７Ｄ）。

【0321】

実施例１１．ＮＧＦ阻害アッセイ
ＴｒｋＡ抗体がＴｒｋＡとＮＧＦとの間の結合を阻害できるかどうかを決定する。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４に対して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づく競合アッセイを実施した。簡単に説明すると、抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を、０．１％のｗ／ｖウシ血清アルブミンおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０（アッセイ緩衝剤）を含むＰＢＳに、事前湿潤プレート内で最低１０分間浸した。アッセイ緩衝剤中の１００ｎＭの抗体をセンサー上に捕捉し、０．５～１．５ｎｍの捕捉レベルを得た。次に、ロードされたバイオセンサーをアッセイ緩衝剤内で最低１５秒間平衡化し、続いてＴｒｋＡ ＥＣＤを最低６０秒間結合させた。２回目の平衡化後、ＮＧＦを最低６０秒間ロードした。抗体ＰＨＤ２２、ＰＨＤ２４、ＰＨＤ２５、ＰＨＤ２６、ＰＨＤ２８、ＰＨＤ２９、ＰＨＤ３０、ＰＨＤ４８、およびＰＨＤ４９は、ＴｒｋＡとＮＧＦとの間の結合を遮断しない。対照的に、対照抗体ｐＡｂ０１はＴｒｋＡとＮＧＦとの間の結合を阻害する（図８Ａ～８Ｃ）。

【0322】

実施例１２．ＴｒｋＡ抗体のＤＲＧニューロンの生存と軸索伸展への影響
ＤＲＧ分離一次ニューロンはヒト化胎児マウスから調製された。ＤＲＧを採取し、０．０５％のトリプシン－ＥＤＴＡで３７℃で５～８分間インキュベートし、単一細胞にピペットで移し、ポリ－Ｄ－リジンとラミニンで前処理したペトリ皿に、異なるＤＲＧ馴化培地（ＮＧＦ ０ｎＭ、ＮＧＦ ０．３ｎＭ、ＮＧＦ ０．３ｎＭ／ＰＨＤ４８ ３ｎＭ、ＮＧＦ０．３ｎＭ／タネズマブ ３ｎＭ、ＮＧＦ ０．３ｎＭ／ファシヌマブ ３ｎＭ）を含む２４ウェルプレート上に５０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。４８時間後にＤＲＧ馴化培地の半分を交換し、グリア細胞の過剰な増殖を抑制するために５－フルオロ－２’－デオキシウリジンを最終濃度５μｇ／ｍＬで添加した。ＤＲＧ播種の７２時間後、１０倍および２０倍の明視野撮影を実施した。図１０に示すように、明視野写真では、ＮＧＦ ０．３ｎＭ群およびＮＧＦ ０．３ｎＭ／ＰＨＤ４８ ３ｎＭ群のＤＲＧニューロンの正常な生存および軸索伸展が示された。ＮＧＦ ０ｎＭグループ、タネズマブ ３ｎＭグループ、ＮＧＦ ０．３ｎＭ／ファシヌマブグループでは、生存したＤＲＧニューロンはごく少数であり、生存したニューロンの軸索は極めて短かった。

【0323】

ＤＲＧ播種後７２時間経過後、実験群の各ウェルの中間視野を撮影し（２０倍）、ＤＲＧニューロンの軸索経路をトレースしてＩｍａｇｅＪで長さを計算し、各視野の平均長さを上記の統計に使用した。グラフはＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して生成され、データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として報告された。データの分析には一元配置分散分析が使用された。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。図１１に示すように、ＮＧＦ ０．３ｎＭ群とＮＧＦ ０．３ｎＭ／ＰＨＤ４８ ３ｎＭ群は４００μｍを超えており、２つのグループ間で軸索の長さに有意差はなかった。ＮＧＦ ０ｎＭ群、ＮＧＦ ０．３ｎＭ／３ｎＭタネズマブ群、ＮＧＦ ０．３ｎＭ／３ｎＭファシヌマブ群の平均軸索長は全て１００μｍ未満であり、ＮＧＦ ０．３ｎＭ／３ｎＭファシヌマブ群のＤＲＧニューロンの軸索長は有意に短かった。これらの結果は、ＰＨＤ４８がＮＧＦ中和抗体（タネズマブおよびファシヌマブ）とは異なり、ＤＲＧニューロンのＮＧＦ媒介生存および軸索伸展に対して有意な阻害効果を及ぼさなかったことを示している。

【0324】

実施例１３．ＴｒｋＡ抗体はマウスのＮＧＦ誘発性疼痛を軽減する
炎症とニューロンの損傷は、インビボでのＮＧＦレベルの早期かつ持続的な上昇をもたらす。成人では、ＮＧＦは有害刺激に対する感受性を高め、痛覚過敏を引き起こす可能性がある。外因性ＮＧＦを注射すると、げっ歯類およびヒトに機械的および熱的過敏性の変化が生じる。ＮＧＦの足底内注射により、機械的過敏性が比較的短時間の増加をもたらす。

【0325】

本発明のＴｒｋＡ抗体（例えばＰＨＤ４８）の抗侵害受容作用を理解するために、ＮＧＦ誘発過敏症モデル（ＮＧＦの足底内注射による）をモデルとして使用した（図１２）。結果は、ファシヌマブの皮下注射により、熱過敏症（ＮＧＦ注射後２４時間、図１３Ａ）および機械的過敏症（ＮＧＦ注射後７２時間～１２０時間、図１３Ｂ）が著しく軽減されたことを実証しており、これは過敏症がＮＧＦシグナル経路によって媒介されていることを示している。このモデルでは、ＰＨＤ４８はＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達を阻害することで、熱過敏症（ＮＧＦ誘導後２４時間、図１３Ａ）と機械的過敏症（ＮＧＦ注入後４８時間～１２０時間、図１３Ｂ）も大幅に軽減した。

【0326】

実施例１４．ＴｒｋＡ抗体はマウスのホルマリン誘発性疼痛を軽減する
神経成長因子（ＮＧＦ）は、主にその受容体ＴｒｋＡを介して末梢神経系に強力な鎮痛作用を発揮する。

【0327】

マウスのホルマリン試験は、痛覚の信頼できるモデルであり、様々な種類の鎮痛薬に対して感度がある。有害刺激は、右後足の背側皮膚の下に希釈ホルマリンを注射することである。痛覚行動は、ホルマリン注射後０～４５分までの動作回数（足をなめる動作）として記録された。そして、炎症性疼痛を表す後期相（ホルマリン注射後２０～３０分）の総動作回数を計算し、異なるグループ間で分析した。

【0328】

本発明のＴｒｋＡ抗体（例えば、ＰＨＤ４８）の抗侵害受容作用を理解するために、ホルマリン誘発性炎症性疼痛マウスモデルが確立され（図１４）、ファシヌマブの皮下注射によりホルマリン媒介性運動カウントの増加が著しく緩和されることがわかった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。これは、ホルマリン誘発性疼痛がＮＧＦシグナル経路によって媒介されることを示している。一方、ＰＨＤ４８はホルマリン媒介運動カウントの増加も大幅に軽減した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。これは、本開示のＴｒｋＡ抗体がこの疼痛モデルに有効であることを示している。

【0329】

実施例１５．ＴｒｋＡ抗体はマウスのＭＩＡ誘発ＯＡ疼痛を改善した
膝関節へのモノヨード酢酸（ＭＩＡ）注射は、軟骨の進行性の破壊を引き起こし、それが疼痛のような行動の発症につながる。ＭＩＡによって誘発される病理学的変化は、軟骨の喪失や軟骨下骨の変化など、ヒトのＯＡで観察されるものと多くの共通点を持っている。

【0330】

本発明のＴｒｋＡ抗体（例えばＰＨＤ４８）のＯＡ疼痛に対する効果を研究するために、ＭＩＡをマウスの膝関節に注射してＯＡ疼痛モデルを誘発した（図１６）。対照群を除き、他の群の動物には膝関節にＭＩＡが注射され、ＭＩＡ注射の９日後にベースラインスクリーニングが実施された。各グループでモデル基準を満たしたマウス（足引っ込め閾値＜０．６ｇ）を選択し、試験薬を投与した。セレコキシブ（ＴＣＩ、ロット番号：ＣＪＤＢＦ－ＲＧ）陽性対照として１００ｍｇ／ｋｇ、経口投与したところ、ＭＩＡ投与マウスの機械的過敏症が有意に軽減した（図１７Ａ～１７Ｇ）。ファシヌマブの皮下注射は、ＭＩＡ治療を受けたマウスの機械的過敏症も有意に抑制した（図１７Ａ～１７Ｇ）。これは、ＭＩＡ誘発性疼痛がＮＧＦシグナル経路によって媒介されることを示している。一方、本開示のＴｒｋＡ抗体（例えば、ＰＨＤ４８）による治療は、ＭＩＡ治療マウスにおける機械的過敏症を著しく緩和した（図１７Ａ～１７Ｇ）。これは、本開示のＴｒｋＡ抗体がＯＡ疼痛治療に有望な抗侵害受容作用を示したことを意味する。

【0331】

本願の好ましい実施形態が本明細書で図示および説明されるものの、当業者には、このような実施形態は、単に例示として示されるものであることが明らかであろう。本発明が、本明細書内で提供される特定の実施例により制限されることは、意図されてはいない。上述の記載を参照して本発明が記載されているものの、本明細書の実施形態の記載および図面は、限定の意味で解釈されることを意味していない。本発明から逸脱することなく、当業者には、様々な変更、変化、および置換が生じる。さらに、本発明の態様は全て、種々の条件および変数に依存する、本明細書で説明した特定の描写、構成または相対的な比率に限定されないものと理解されなければならない。本発明の実践において、本明細書に記載する本発明の実施形態に様々な代替物を用いることができることが理解されなければならない。それ故、本発明は、前記任意の代替物、変更、変化、および均等物もまた含まなければならないことが想到される。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造、ならびにこれらの均等物が特許請求の範囲に含まれることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図17F】

【図17G】

【配列表】

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【国際調査報告】