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特表2025-503704ＶＥＧＦ及びＴＩＥ２を結合する融合タンパク質並びにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-04
(54)【発明の名称】ＶＥＧＦ及びＴＩＥ２を結合する融合タンパク質並びにその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20250128BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20250128BHJP
C07K 14/71 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20250128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20250128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250128BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20250128BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20250128BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20250128BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20250128BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20250128BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20250128BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20250128BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K16/28
C07K14/71
C12N15/62 Z
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 Z
A61K38/17
A61K39/395 N
A61K47/60
A61P9/00
A61P27/02
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024542028
(86)(22)【出願日】2023-01-12
(85)【翻訳文提出日】2024-09-06
(86)【国際出願番号】 US2023060582
(87)【国際公開番号】W WO2023137395
(87)【国際公開日】2023-07-20
(31)【優先権主張番号】63/299,177
(32)【優先日】2022-01-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/310,359
(32)【優先日】2022-02-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/335,805
(32)【優先日】2022-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524263743
【氏名又は名称】インゲニア・セラピューティクス・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(74)【代理人】
【識別番号】100228980
【弁理士】
【氏名又は名称】副島 由加里
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】チュ，ミンキュン
(72)【発明者】
【氏名】キム，クワンス
(72)【発明者】
【氏名】ハン，サンヨル
(72)【発明者】
【氏名】ドゥロスト，フィリップ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC50
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA37
4C084BA41
4C084BA42
4C084CA53
4C084DC50
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA332
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA57
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、Ｔｉｅ－２に対する抗体又はその抗原結合断片と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインとを有する融合タンパク質、該融合タンパク質を作製するための方法、並びに該融合タンパク質を含む、血管新生疾患を予防若しくは処置するための、又は血管新生、内皮シグナル伝達、炎症及び／若しくは血管漏出を調節するための薬学的組成物及び方法に言及する。
【選択図】図１３
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインとを含む融合タンパク質であって、ここで、前記融合タンパク質は、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメイン及びＶＥＧＦに結合する、融合タンパク質。
【請求項2】
前記ＶＥＧＦ結合ドメインがＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインであって、配列番号１３のＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）－Ａ結合領域及び配列番号１４のＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）－Ａ結合領域を含む、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインと、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体結合断片と、
を含む融合タンパク質であって、
ここで、前記融合タンパク質は、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメイン及びＶＥＧＦに結合する、
融合タンパク質。
【請求項4】
前記ＶＥＧＦ結合ドメインが、前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片の重鎖（ＨＣ）のＣ末端に連結されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記融合タンパク質が、Ｔｉｅ２の配列番号２０のアミノ酸配列及び／又はＴｉｅ２の配列番号２１のアミノ酸配列を結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記抗Ｔｉｅ２抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片が、配列番号５～７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域と、配列番号８～１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記ＶＥＧＦ結合ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記ＶＥＧＦ結合ドメインが配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記融合タンパク質が、前記ＶＥＧＦ結合ドメインと前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、ここで、前記リンカーは、５～５０個のアミノ酸残基、１０～４０個の残基、１５～３０個の残基又は２０個の残基を有する配列を含んでもよい、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記融合タンパク質が、前記ＶＥＧＦ結合ドメインと前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、そしてここで、前記リンカーは、配列番号１６の前記アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記融合タンパク質が、前記ＶＥＧＦ結合ドメインと前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、そしてここで、前記リンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記融合タンパク質が、前記ＶＥＧＦ結合ドメインと前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、そしてここで、前記リンカーは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含み、ここで、前記ＶＥＧＦ結合ドメインはＶＥＧＦ受容体であってもよい、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記融合タンパク質が、前記ＶＥＧＦ結合ドメインと前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、そしてここで、前記リンカーは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記融合タンパク質が、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むＣＨドメインを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
前記融合タンパク質が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＨドメインを含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
前記融合タンパク質が、Ｆｃ受容体との相互作用を低下させるか又は排除する１以上の変異を重鎖定常領域中に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
前記１以上の変異が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６及びＧ２３７（ＥＵナンバリング）を、ＬＡＧＡ変異、ＦＥＧＧ変異、ＡＡＧＧ変異、ＡＡＧＡ変異、ＬＡＬＡ変異又はそれらの組み合わせに変化させることを含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項19】
前記１以上の変異が、ＬＡＬＡ変異、並びに、Ｋ３２２Ａ及びＰ３３１Ｓ（ＥＵナンバリング）であってもよいＫ３２２及びＰ３３１（ＥＵナンバリング）における変異を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
前記融合タンパク質が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｈ３１０、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｈ４３３、Ｎ４３４及び／又はＨ４３５（ＥＵナンバリング）に１以上の変異を含み、ここで、前記変異は、ａ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＨ３１０Ａ；又はｂ）Ｍ２５２Ｙ；Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｍ若しくはＩ２５３Ｖ；Ｓ２５４Ｔ；Ｔ２５６Ｄ；Ｈ４３３Ｋ；Ｎ４３４Ｆ；及び／若しくはＨ４３５Ａ、Ｈ４３５Ｑ若しくはＨ４３５ＲであってもよいＭ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｈ４３３、Ｎ４３４及び／若しくはＨ４３５であってもよい、請求項１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
前記融合タンパク質が、前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片の１以上の重鎖定常ドメインのＣ末端側に及びＮ末端からＣ末端への順序で、前記ＶＥＧＦ結合ドメインと前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項22】
前記リンカーが、配列番号１６又は２５のアミノ酸配列を含み、そして、前記ＶＥＧＦ結合ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項23】
前記融合タンパク質が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＨドメインと、前記ＶＥＧＦ結合ドメインと前記抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間に配列番号１６又は２５のアミノ酸配列を含むリンカーと、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＥＧＦ結合ドメインとを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項24】
前記融合タンパク質が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項25】
前記融合タンパク質が、配列番号１１又は２６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を含む重鎖を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項26】
前記融合タンパク質が、配列番号１１又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項２５に記載の融合タンパク質。
【請求項27】
前記融合タンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を含む軽鎖を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項28】
前記融合タンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項29】
前記融合タンパク質が、配列番号１１又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項30】
前記融合タンパク質が、３Ｅ－９Ｍ未満の親和性ＫＤ（Ｍ）で、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメインに結合する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項31】
前記融合タンパク質がペグ化されている、請求項１～３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項32】
前記融合タンパク質が、部位特異的にペグ化されている、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項33】
前記融合タンパク質が、システイン残基上で部位特異的にペグ化されている、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項34】
前記融合タンパク質が、配列番号２２の配列をさらに含み、そして、配列番号２２の配列のシステイン残基上で部位特異的にペグ化されている、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項35】
配列番号２２の配列が重鎖のＣ末端に存在する、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項36】
前記重鎖が配列番号２３の配列を含む、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項37】
前記重鎖が配列番号２４の配列を含む、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項38】
前記ＰＥＧが約４０ｋＤａの分子量を有する、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項39】
前記融合タンパク質が、１以上の半減期延長モジュレータをさらに含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項40】
前記１以上の半減期延長モジュレータが、前記融合タンパク質の半減期を増加させる化学物質、バイオポリマー又はペプチドを含む、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項41】
前記１以上の半減期延長モジュレータが、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ヒアルロン酸（ＨＡ）又はホスホリルコリンを含有するバイオポリマー；アルブミン；アルブミン結合ペプチド及び／又はＨＡ結合タンパク質断片を含む、請求項３９又は請求項４０に記載の融合タンパク質。
【請求項42】
請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項43】
請求項４２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項44】
ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１（ＣＭＶ－ＩＥ１）プロモーター／エンハンサーをさらに含む、請求項４３に記載の発現ベクター。
【請求項45】
請求項４３又は請求項４４に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項46】
Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦを結合する融合タンパク質を製造する方法であって、請求項４５に記載の細胞を培養する工程と、
培養された細胞から融合タンパク質を回収する工程と
を含む、方法。
【請求項47】
血管新生疾患又は血管疾患を予防又は処置するための方法であって、血管新生疾患又は血管疾患を予防又は処置することを必要とする対象に有効量の請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項48】
血管新生疾患又は血管疾患を処置することを必要とする対象における血管新生疾患又は血管疾患を処置するための医薬の製造のための、請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項49】
血管新生疾患又は血管疾患を処置することを必要とする対象における血管新生疾患又は血管疾患の処置において使用するための、請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項50】
前記血管新生疾患又は血管疾患が、癌、転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、角膜移植片拒絶反応、黄斑変性、血管新生緑内障であってもよい緑内障、全身性紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節症、類縁硬化症、アテローム性プラークの毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽形成、血管接着、関節リウマチ、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、腸管癒着、ネコ引っ掻き病、潰瘍、肝硬変、腎炎、糖尿病性腎症、糖尿病、炎症性疾患又は神経変性疾患である、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の使用のための方法、使用又は融合タンパク質。
【請求項51】
前記癌が、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、白血病、ホジキンリンパ腫、リンパ腫又は多発性骨髄性血液癌である、請求項５０に記載の使用のための方法、使用又は融合タンパク質。
【請求項52】
血管新生、内皮シグナル伝達、炎症、無酸素症及び／又は血管漏出を調節するための方法であって、血管新生、内皮シグナル伝達、炎症、無酸素症及び／又は血管漏出を調節することを必要とする対象に有効量の請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項53】
前記炎症が敗血症、急性呼吸促迫症候群及び／又はウイルス感染性疾患に由来する、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記対象がヒトである、請求項４７～５３のいずれか一項に記載の使用のための方法、使用又は融合タンパク質。
【請求項55】
前記対象が愛玩動物であり、哺乳動物の愛玩動物であってもよい、請求項４７～５３のいずれか一項に記載の使用のための方法、使用又は融合タンパク質。
【請求項56】
前記愛玩動物が、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、ウマ、ラバ、ロバ又はハムスターである、請求項５５に記載の使用のための方法、使用又は融合タンパク質。
【請求項57】
請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む薬学的組成物。
【請求項58】
請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質の鎖状単量体を含むポリペプチド。
【請求項59】
前記ポリペプチドが、請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質の重鎖単量体を含む、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項60】
前記ポリペプチドが、配列番号１１又は２６の配列に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性又は１００％の同一性を有する配列を含む、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項61】
前記ポリペプチドが配列番号１１又は２６を含む、請求項６０に記載のポリペプチド。
【請求項62】
前記ポリペプチドが配列番号１１又は２６からなる、請求項６１に記載のポリペプチド。
【請求項63】
前記ポリペプチドが、請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質の軽鎖単量体を含む、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項64】
前記ポリペプチドが、配列番号１２に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性又は１００％の同一性を有する配列を含む、請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項65】
前記ポリペプチドが配列番号１２を含む、請求項６４に記載のポリペプチド。
【請求項66】
前記ポリペプチドが配列番号１２からなる、請求項６５に記載のポリペプチド。
【請求項67】
請求項５８～６６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項68】
前記核酸分子が、請求項５９～６２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、請求項６７に記載の核酸分子。
【請求項69】
前記核酸分子が、配列番号２７又は２９に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項６８に記載の核酸分子。
【請求項70】
前記核酸分子が配列番号２７又は２９を含む、請求項６９に記載の核酸分子。
【請求項71】
前記核酸分子が配列番号２７又は２９からなる、請求項７０に記載の核酸分子。
【請求項72】
前記核酸分子が、請求項６３～６６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、請求項６７に記載の核酸分子。
【請求項73】
前記核酸分子が、配列番号２８に対して少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７２に記載の核酸分子。
【請求項74】
前記核酸分子が配列番号２８を含む、請求項７３に記載の核酸分子。
【請求項75】
前記核酸分子が配列番号２８からなる、請求項７４に記載の核酸分子。
【請求項76】
請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質の両方の鎖（すなわち、軽鎖及び重鎖）がコードされるように、各ポリヌクレオチドが前記融合タンパク質の単量体鎖の少なくとも１つをコードする、１以上のポリヌクレオチドのセット。
【請求項77】
請求項６７～７５のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項78】
前記ベクターが、前記融合タンパク質の１つの重鎖配列及び１つの軽鎖配列をコードする核酸を含む、請求項７７に記載のベクター。
【請求項79】
前記融合タンパク質の両方の鎖（すなわち、軽鎖及び重鎖）がベクターの前記セットにおいてコードされるように、請求項７６に記載の１以上のポリヌクレオチドのセットを集団的に含む１以上のベクターのセット。
【請求項80】
前記ベクターが、動物ウイルス、例えば逆転写酵素ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、アネロウイルス及びパポバウイルスから選択されるウイルスである、請求項７７～７９のいずれか一項に記載のベクター又はベクターのセット。
【請求項81】
請求項７７～８０のいずれか一項に記載のベクターを発現する宿主細胞。
【請求項82】
請求項６７～７５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項７６に記載の１以上のポリヌクレオチドのセット、又は請求項７７～７９のいずれか一項に記載のベクター若しくはベクターのセットと、薬学的に許容され得る担体、希釈剤又は賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項83】
ベクター又はベクターのセットからの発現による、請求項１～４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質の生産のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年１月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２９９，１７７号、２０２２年２月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／３１０，３５９号及び２０２２年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／３３５，８０５号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。これらの先の出願の全開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２２年１月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／２９９，１７７号、２０２２年２月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／３１０，３５９号及び２０２２年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／３３５，８０５号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。これらの先の出願の全開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含む。２０２３年１月１１日に作成された前記ＸＭＬコピーは、「２０２３－０１－１２＿０１２６２－０００４－００ＰＣＴ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ」という名前であり、４８，４８９バイトのサイズである。配列表の電子形式中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含む。２０２３年１月１１日に作成された前記ＸＭＬコピーは、「２０２３－０１－１２＿０１２６２－０００４－００ＰＣＴ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ」という名前であり、４８，４８９バイトのサイズである。配列表の電子形式中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
分野
本開示は、抗Ｔｉｅ－２抗体又はその抗原結合断片と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインとを含む融合タンパク質であって、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦに同時に結合する融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含有するベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記融合タンパク質を調製するための方法、血管新生、炎症及び血管漏出を調節する方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、血管新生疾患及び血管疾患を予防又は処置するための方法及び薬学的組成物に関する。
本開示は、抗Ｔｉｅ－２抗体又はその抗原結合断片と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインとを含む融合タンパク質であって、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦに同時に結合する融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含有するベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記融合タンパク質を調製するための方法、血管新生、炎症及び血管漏出を調節する方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、血管新生疾患及び血管疾患を予防又は処置するための方法及び薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【0004】
序論及び概要
血管新生は、生物の発生、成長、維持及び恒常性の間に様々な調節因子によって動的に起こる。この過程において新たに形成された血管は、周囲の細胞中の栄養素、酸素及びホルモンなどの様々な生体材料のための輸送チャネルとして機能する。機能的及び構造的に異常な血管は、様々な疾患の開始及び進行の直接的又は間接的な原因である。腫瘍血管は、それらの機能及び構造の欠陥の故に低酸素を悪化させ、腫瘍の進行及び他の組織への転移をもたらし、腫瘍塊の中心部への抗癌剤の送達を不良にする。欠陥を有する血管は、癌の他、他の様々な疾患及び症状においても見られる。その例には、様々な眼疾患（例えば、糖尿病性黄斑浮腫、滲出型加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症）、ウイルス感染症及び敗血症などの急性炎症反応などが含まれる。したがって、病的な血管を正常化することができる治療薬が利用可能であれば、血管異常を有する様々な患者／患畜の処置に適用することができる。
血管新生は、生物の発生、成長、維持及び恒常性の間に様々な調節因子によって動的に起こる。この過程において新たに形成された血管は、周囲の細胞中の栄養素、酸素及びホルモンなどの様々な生体材料のための輸送チャネルとして機能する。機能的及び構造的に異常な血管は、様々な疾患の開始及び進行の直接的又は間接的な原因である。腫瘍血管は、それらの機能及び構造の欠陥の故に低酸素を悪化させ、腫瘍の進行及び他の組織への転移をもたらし、腫瘍塊の中心部への抗癌剤の送達を不良にする。欠陥を有する血管は、癌の他、他の様々な疾患及び症状においても見られる。その例には、様々な眼疾患（例えば、糖尿病性黄斑浮腫、滲出型加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症）、ウイルス感染症及び敗血症などの急性炎症反応などが含まれる。したがって、病的な血管を正常化することができる治療薬が利用可能であれば、血管異常を有する様々な患者／患畜の処置に適用することができる。
【0005】
アンジオポエチンファミリーは、血管の形成及び維持において重要な役割を果たしており、４つのアンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、Ａｎｇ４）から構成される。アンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）は、血管内皮細胞の表面に存在するＴｉｅ２受容体に結合してＴｉｅ２受容体をリン酸化及び活性化し、血管の安定化及び血管漏出の抑制をもたらす。他方、アンジオポエチン－２（Ａｎｇ２）は、Ｔｉｅ２受容体に結合するが、アンタゴニストとして作用してＴｉｅ２受容体の不活性化を誘導し、Ａｎｇ１による結合を阻害し、血管の不安定化及び血管の漏出をもたらし、それによって新しい血管の成長を促進する傾向がある。Ａｎｇ２の発現レベルは、癌患者、眼疾患、ウイルス及び細菌感染症並びに炎症性疾患の血液中で高度に増加することが報告された（Ｓａｈａｒｉｎｅｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １６：６３５－６６１）。しかしながら、Ａｎｇ２は、リンパ管形成及び維持を含むいくつかの過程でＴｉｅ２受容体の活性化を誘導するアゴニストとして作用することも知られており、Ａｎｇ２は状況に応じて様々な機能を果たすと考えられている。
【0006】
これまで、様々な抗Ａｎｇ２抗体の開発及び臨床試験に、多くのバイオ医薬品企業の関心が寄せられてきた（例えば、米国特許第７，６５８，９２４号及び同第８，９８７，４２０号）。これらのＡｎｇ２抗体は、Ｔｉｅ２へのＡｎｇ２の結合を阻害することが報告されており、Ａｎｇ２中和効果は、新しい血管の形成を妨げることが報告された。これらの抗Ａｎｇ２抗体の抗血管新生活性及び抗癌活性は、多くの前臨床モデルで実証されており、多様な抗Ａｎｇ２抗体が様々な癌患者で臨床的に試験されている。しかしながら、それらの抗癌効果は不十分であることが実証されている。例えば、Ａｍｇｅｎによって実施された第３相臨床試験は、卵巣癌患者におけるＡｎｇ２抗体の抗癌効果がわずかであることを示した（Ｍａｒｔｈ Ｃ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：１１１－１２１）。癌モデルに加えて、Ａｎｇ２中和抗体であるネスバクマブは眼患者において試験されたが、臨床第２相試験においてアイリーア（ＥＹＬＥＡ）（Ｒ）（抗ＶＥＧＦ）の有効性を改善することができなかった。例えば、ｉｎｖｅｓｔｏｒ．ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ－ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｎｅｗｓ－ｒｅｌｅａｓｅ－ｄｅｔａｉｌｓ／ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ－ｐｒｏｖｉｄｅｓ－ｕｐｄａｔｅ－ｅｙｌｅａｒ－ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ－ａｎｄで入手可能な「Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ＥＹＬＥＡ（Ｒ）（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ（ａｎｇ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ）ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ」プレスリリースを参照されたい。
【0007】
上述のＡｎｇ２中和アプローチとは対照的に、直接的なＴｉｅ２活性化もまた、血管新生を阻害し、血管透過性を抑制するための代替アプローチと考えられてきた。Ｔｉｅ２受容体に直接結合し、Ｔｉｅ２のリン酸化及び活性化を誘導する組換えタンパク質も、多くの前臨床癌及び眼モデルにおいて開発及び試験されてきた。その例としては、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）－Ａｎｇｌ（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＰＮＡＳ １０１（１５）：５５４７－５５５２）及びバスキュロチド（Ｄａｖｉｄ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３００（６）：Ｌ８５１－Ｌ８６２）が挙げられる。これらの薬剤は抗血管新生活性及び抗透過性活性を示したが、これらは非常に短い半減期及び不安定な物理化学的特性を有する傾向がある。さらに、リン酸化されたＴｉｅ２からリン酸基を除去することによってＴｉｅ２を不活性化するホスファターゼであるＶＥ－ＰＴＰの阻害剤として、小分子化合物（ＡＫＢ－９７７８）が開発された（Ｇｏｅｌ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０５（１６）：１１８８－１２０１）。この化合物は、ＶＥ－ＰＴＰを阻害することによってＴｉｅ２活性を間接的に増加させるが、他の受容体も活性化するという欠点を有する。例えば、Ｆｒｙｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２１２（１３）：２２６７－２２８７；Ｈａｙａｓｈｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，４：１６７２；及びＭｅｌｌｂｅｒｇ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００９，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２３（５）：１４９０－１５０２）を参照されたい。さらに、アゴニスト作用を有するＴｉｅ２抗体が開発されてきた。例えば、米国特許第６３６５１５４号及び米国特許出願公開第２０１７０１７４７８９号を参照されたい。これらの抗体は、内皮細胞の生存を増加させ、血管漏出を阻害した。興味深いことに、ハーブ抽出物がＴｉｅ２活性を活性化することが示され、スキンケア化粧品として使用されることにつき権利が請求された。例えば、特開第２０１１１０２２７３号、特開第２０１８０４３９４９号、特開第２０１５１６８６５６号を参照されたい。
【0008】
Ｔｉｅ２は、血管の分化及び安定化を促進する受容体タンパク質であり、血管において高度に発現されている。活性化されると、Ｔｉｅ２受容体は血管を安定化させ、周囲の支持細胞を集めることが可能となる。例えば、癌血管中の活性化されたＴｉｅ２は、癌血管を正常化し、血管漏出を低下させ、腫瘍内の増加した低酸素を排除し、腫瘍内への血流を増加させることによって十分な酸素を供給し、他の抗癌剤の送達及び免疫細胞の浸透を増加させる。
【0009】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）及び滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）に対する標準治療の第一選択処置であるが、少なくない頻度の眼内投与及びかなりの不十分な応答の集団によって、これらの処置の有効性は制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】米国特許第７，６５８，９２４号
【特許文献2】米国特許第８，９８７，４２０号
【特許文献3】米国特許第６．３６５，１５４号
【特許文献4】米国特許出願公開第２０１７／０１７４７８９号
【特許文献5】特開第２０１１１０２２７３号
【特許文献6】特開第２０１８０４３９４９号
【特許文献7】特開第２０１５１６８６５６号
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｓａｈａｒｉｎｅｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １６：６３５－６６１
【非特許文献2】Ｍａｒｔｈ Ｃ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：１１１－１２１
【非特許文献3】Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＰＮＡＳ １０１（１５）：５５４７－５５５２
【非特許文献4】Ｄａｖｉｄ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３００（６）：Ｌ８５１－Ｌ８６２
【非特許文献5】Ｇｏｅｌ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０５（１６）：１１８８－１２０１
【非特許文献6】Ｆｒｙｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２１２（１３）：２２６７－２２８７
【非特許文献7】Ｈａｙａｓｈｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，４：１６７２
【非特許文献8】Ｍｅｌｌｂｅｒｇ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００９，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２３（５）：１４９０－１５０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
したがって、血管新生、内皮シグナル伝達、炎症及び／若しくは血管漏出を調節するための、並びに／又は血管新生疾患を処置するための改善された方法が必要とされている。例えば、改善された有効性、親和性、半減期、安定性、薬力学、持続性、並びに／又は患者の負担及び服薬遵守の問題を軽減するための処置の頻度の減少を伴う、癌などの血管新生疾患のための処置が必要とされている。本開示は、これらのニーズの１以上を満たすこと、他の利益を提供すること、又は少なくとも有用な選択肢を公衆に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本開示は、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインとを含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメイン及びＶＥＧＦに結合する。
【0014】
一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、ＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインを含む。
【0015】
一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、アンタゴニストＶＥＧＦ結合ドメインである。したがって、一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、細胞中のＶＥＧＦの活性を拮抗する（すなわち、阻害する）。ＶＥＧＦ結合ドメインは、ＶＥＧＦを結合し、その結果、ＶＥＧＦがその活性を発揮するのを妨げることによってそのアンタゴニスト効果を達成する。
【0016】
一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、２つのＶＥＧＦ受容体アイソフォームの細胞外ドメイン、例えばＶＥＧＦ受容体１及びＶＥＧＦ受容体２の両方の細胞外ドメイン（例えば、ＶＥＧＦ受容体１のＩｇ２ドメイン及びＶＥＧＦ受容体２のＩｇ３ドメイン）を含む。
【0017】
一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗体結合断片を含む。さらなる実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片は、ベバシズマブ、ラニビズマブ又はＨｕＭａｂ Ｇ６－３１（米国特許出願公開第２００７／０１４１０６５号）の可変結合ドメインを含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、本開示は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインであって、配列番号１３のＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）－Ａ結合領域及び配列番号１４のＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）－Ａ結合領域を含む、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインと、
抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体結合断片と、
を含む融合タンパク質であって、
ここで、前記融合タンパク質は、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメイン及びＶＥＧＦに結合する、融合タンパク質を提供する。
抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体結合断片と、
を含む融合タンパク質であって、
ここで、前記融合タンパク質は、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメイン及びＶＥＧＦに結合する、融合タンパク質を提供する。
【0019】
一実施形態では、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片は、アゴニスト抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片である。したがって、一実施形態では、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片はＴｉｅ２を結合し、細胞表面膜においてＴｉｅ２又はＴｉｅ２活性を提供し、保存し、又は増強する。
【0020】
一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片の重鎖（ＨＣ）のＣ末端に連結されている。
【0021】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列のＴｉｅ２のアミノ酸６３３～６４４（配列番号１９）及び／又はアミノ酸７１３～７２６（配列番号２０）を結合する。一実施形態では、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列のＴｉｅ２のアミノ酸６３３～６４４（配列番号１９）及び／又はアミノ酸７１３～７２６（配列番号２０）を結合する。
【0022】
一実施形態では、抗Ｔｉｅ２抗体はＩｇＧ１アイソタイプを有する。
【0023】
一実施形態では、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５～７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域と、配列番号８～１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む。
【0024】
一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む。
【0025】
一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0026】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ結合ドメイン（例えば、ＶＥＧＦ受容体）と抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含む。さらなる実施形態では、リンカーは、５～５０個のアミノ酸残基、例えば１０～４０個の残基、例えば１５～３０個の残基、例えば２０個の残基を含む。
【0027】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ結合ドメイン（例えば、ＶＥＧＦ受容体）と抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、リンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む。
【0028】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ結合ドメイン（例えば、ＶＥＧＦ受容体）と抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、リンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【0029】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ結合ドメイン（例えば、ＶＥＧＦ受容体）と抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、リンカーは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む。
【0030】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ結合ドメイン（例えば、ＶＥＧＦ受容体）と抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、リンカーは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
【0031】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むＣＨドメインを含む。
【0032】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＨドメインを含む。
【0033】
一実施形態では、融合タンパク質は、体内の他の免疫細胞上のＦｃ受容体との効率的な相互作用を低下させるか又は排除するために、重鎖の定常領域ドメイン中に１以上の変異を含む。一実施形態では、１以上の変異は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６及びＧ２３７（ＥＵナンバリング）をＬＡＧＡ変異、ＦＥＧＧ変異、ＡＡＧＧ変異、ＡＡＧＡ変異、ＬＡＬＡ変異又はそれらの組み合わせに変化させることを含む。一実施形態では、１以上の変異は、ＬＡＬＡ変異と、Ｋ３２２における変異（例えば、Ｋ３２２Ａ）及びＰ３３１における変異（例えば、Ｐ３３１Ｓ）とを含む（ＥＵナンバリング）。
【0034】
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｈ３１０、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｈ４３３、Ｎ４３４及び／又はＨ４３５（ＥＵナンバリング）に１以上の変異を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／又はＨ３１０Ａに１以上の変異を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｍ２５２（例えば、Ｍ２５２Ｙ）、Ｉ２５３（例えば、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｍ又はＩ２５３Ｖ）、Ｓ２５４（例えば、Ｓ２５４Ｔ）、Ｔ２５６（例えば、Ｔ２５６Ｄ）、Ｈ４３３（例えば、Ｈ４３３Ｋ）、Ｎ４３４（例えば、Ｎ４３４Ｆ）及び／又はＨ４３５（例えば、Ｈ４３５Ａ、Ｈ４３５Ｑ又はＨ４３５Ｒ）に１以上の変異を含む。
【0035】
一実施形態では、融合タンパク質は、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片の１以上の重鎖定常ドメインのＣ末端側に及びＮ末端からＣ末端への順序で、ＶＥＧＦ結合ドメインと抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、例えばリンカーは、５～５０残基、例えば１０～４０残基、例えば１５～３０残基、例えば２０残基を有する配列を含み、ＶＥＧＦ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0036】
一実施形態では、融合タンパク質は、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片の１以上の重鎖定常ドメインのＣ末端側に及びＮ末端からＣ末端への順序で、ＶＥＧＦ結合ドメインと抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、リンカーは、配列番号１６又は２５のアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0037】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＨドメインと、ＶＥＧＦ結合ドメインと抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間に配列番号１６又は２５のアミノ酸配列を含むリンカーを含み、ＶＥＧＦ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0038】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0039】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を含む重鎖を含む。
【0040】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を含む重鎖を含む。
【0041】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0042】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0043】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を含む軽鎖を含む。
【0044】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0045】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【0046】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【0047】
一実施形態では、融合タンパク質は、３Ｅ－９Ｍ未満の親和性ＫＤ（Ｍ）で、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメインに結合する。
【0048】
一実施形態では、融合タンパク質はペグ化されている。ＰＥＧ化（又はペグ化）は、複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、マクロゴールとも呼ばれる）単位（例えば、ＰＥＧポリマー）を含む鎖の共有結合的な付着又は融合を指す。一実施形態では、ＰＥＧは、約４０ｋＤａ又は約２０ｋＤａの分子量を有する。
【0049】
一実施形態では、融合タンパク質は、部位特異的にペグ化されている。一実施形態では、融合タンパク質は、システイン残基上で部位特異的にペグ化されている。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２２の配列をさらに含み、配列番号２２の配列のシステイン残基上で部位特異的にペグ化されている。
【0050】
一実施形態では、配列番号２２の配列は、重鎖のＣ末端に存在する。一実施形態では、重鎖は、配列番号２３の配列を含む。一実施形態では、重鎖は、配列番号２４の配列を含む。
【0051】
一実施形態では、融合タンパク質は、１以上の半減期延長モジュレータをさらに含む。一実施形態では、１以上の半減期延長モジュレータは、融合タンパク質の半減期を増加させる化学物質、バイオポリマー又はペプチドを含む。
【0052】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質の鎖状単量体を含むポリペプチドが提供される。
【0053】
一実施形態では、ポリペプチドは、本発明の融合タンパク質の重鎖単量体を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１又は２６の配列に対して少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９１％の同一性、例えば少なくとも９２％の同一性、例えば少なくとも９３％の同一性、例えば少なくとも９４％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、例えば少なくとも９７％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば少なくとも９９％の同一性、例えば１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１の配列からなる。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６の配列からなる。
【0054】
一実施形態では、ポリペプチドは、本発明の融合タンパク質の軽鎖単量体を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２に対して少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９１％の同一性、例えば少なくとも９２％の同一性、例えば少なくとも９３％の同一性、例えば少なくとも９４％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、例えば少なくとも９７％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば少なくとも９９％の同一性、例えば１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２の配列からなる。
【0055】
本明細書で使用される場合、「バイオポリマー」は、生物学的材料から化学的に合成されるか、又は生物若しくは微生物によって完全に生合成されるかのいずれかの、天然源から生産されるポリマーを指す。いくつかの実施形態では、バイオポリマーは、ポリペプチド又はタンパク質（すなわち、アミノ酸のポリマー、例えば、コラーゲン、アクチン及びフィブリン）、ポリヌクレオチド（すなわち、核酸のポリマー、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）、多糖（すなわち、炭水化物及びグリコシル化分子、例えば、セルロース、デンプン又はアルギネート）、天然ゴム（イソプレンのポリマー）、スバリン、リグニン（複合ポリフェノールポリマー）、クチン及びクタン（長鎖脂肪酸の複合ポリマー）、メラニン、代謝産物及びその他の構造分子を含むが、これらに限定されない。
【0056】
一実施形態では、１以上の半減期延長モジュレータは、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ヒアルロン酸（ＨＡ）又はホスホリルコリンを含有するバイオポリマー；アルブミン；アルブミン結合ペプチド及び／又はＨＡ結合タンパク質断片を含む。
【0057】
別の実施形態では、本開示は、融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【0058】
別の実施形態では、本開示は、本発明の融合タンパク質の鎖状単量体を含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。一実施形態では、本開示は、融合タンパク質の重鎖をコードする核酸を提供する。別の実施形態では、本開示は、融合タンパク質の軽鎖をコードする核酸を提供する。
【0059】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号２７又は２９に対して少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９１％の同一性、例えば少なくとも９２％の同一性、例えば少なくとも９３％の同一性、例えば少なくとも９４％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、例えば少なくとも９７％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば少なくとも９９％の同一性、例えば１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２７又は２９からなる。
【0060】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号２８に対して少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９１％の同一性、例えば少なくとも９２％の同一性、例えば少なくとも９３％の同一性、例えば少なくとも９４％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、例えば少なくとも９７％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば少なくとも９９％の同一性、例えば１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２８からなる。
【0061】
一実施形態では、本開示は、各ポリヌクレオチドが本発明の融合タンパク質の単量体鎖の少なくとも１つをコードする、１以上のポリヌクレオチドのセットを提供し、前記融合タンパク質のこのような両方の鎖（すなわち、軽鎖及び重鎖）がコードされる。
【0062】
別の実施形態では、本開示は、核酸を含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、融合タンパク質の１つの重鎖配列及び１つの軽鎖配列をコードする核酸を含むベクターが提供される。
【0063】
一実施形態では、融合タンパク質の両方の鎖（すなわち、軽鎖及び重鎖）がベクターの前記セットにおいてコードされるように、本発明の１以上のポリヌクレオチドのセットを集団的に含む１以上のベクターのセットが提供される。
【0064】
一実施形態では、ベクターは、動物ウイルス、例えば逆転写酵素ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、アネロウイルス及びパポバウイルスから選択されるウイルスである。
【0065】
一実施形態では、発現ベクターは、ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１（ＣＭＶ－ＩＥ１）プロモーター／エンハンサーをさらに含む。
【0066】
別の実施形態では、本開示は、発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【0067】
別の実施形態では、本開示は、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦを結合する融合タンパク質を製造する方法であって、発現ベクターで形質転換された細胞を培養する工程と、培養された細胞から融合タンパク質を回収する工程とを含む、方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、ベクター又はベクターのセットからの発現による本発明の融合タンパク質の生産のための方法を提供する。
【0068】
別の実施形態では、本開示は、血管新生疾患を予防又は処置するための方法であって、血管新生疾患を予防又は処置することを必要とする対象に、有効量の融合タンパク質を投与することを含む、方法を提供する。
【0069】
別の実施形態では、本開示は、血管新生疾患を処置することを必要とする対象における血管新生疾患を処置するための医薬の製造のための、融合タンパク質の使用を提供する。
【0070】
別の実施形態では、本開示は、血管新生疾患又は血管疾患を処置することを必要とする対象における血管新生疾患又は血管疾患の処置において使用するための融合タンパク質を提供する。
【0071】
いくつかの実施形態では、血管新生疾患又は血管疾患は、癌、転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、角膜移植片拒絶反応、黄斑変性、血管新生緑内障などの緑内障、全身性紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節症、類縁硬化症、アテローム性プラークの毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽形成、血管接着、関節リウマチ、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、腸管癒着、ネコ引っ掻き病、潰瘍、肝硬変、腎炎、糖尿病性腎症、糖尿病、炎症性疾患又は神経変性疾患である。
【0072】
いくつかの実施形態では、癌は、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、白血病、ホジキンリンパ腫、リンパ腫又は多発性骨髄性血液癌である。
【0073】
いくつかの実施形態では、本開示は、血管新生、内皮シグナル伝達、炎症及び／又は血管漏出を調節するための方法であって、血管新生、内皮シグナル伝達、炎症及び／又は血管漏出を調節することを必要とする対象に有効量の融合タンパク質を投与することを含む、方法を提供する。
【0074】
いくつかの実施形態では、炎症は、敗血症、急性呼吸促迫症候群及び／又はウイルス感染性疾患に由来する。
【0075】
いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物の愛玩動物などの愛玩動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物の愛玩動物は、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、ウマ、ラバ、ロバ若しくはハムスター又はその他の家畜化されたペットである。
【0076】
いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含む。
【0077】
追加の目的及び利点は、以下の説明において部分的に記載されており、説明から部分的に理解されるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘されている要素及び組み合わせによって実現及び達成される。
【0078】
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。セクションの見出しは、単に読者の便宜のために提供されており、本開示を限定するものではない。
【0079】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、特定の実施形態を図示し、説明と共に、本明細書に記載されている原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【0080】
【図2A】図２Ａ～２Ｃは、ＩＧＴ－４２７によるＶＥＧＦＲ２リン酸化及びＡＫＴ活性化の阻害を示す。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を４時間血清飢餓状態にし、表記された濃度のＩＧＴ－４２７（図２Ａ）又はアフリベルセプト（図２Ｂ）とともに３０分間インキュベートし、次いで、組換えヒトＶＥＧＦで２分間処理した。細胞可溶化物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティングに供し、抗ホスホ－ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ホスホ－Ａｋｔ（Ｓ４７３）又は総Ａｋｔ抗体でブロットをプローブした。ＶＥＧＦレポーターアッセイは、ＩＧＴ－４２７、ファリシマブ及びアフリベルセプトの同等の阻害効果を示す（図２Ｃ）。
【図2B】図２Ａ～２Ｃは、ＩＧＴ－４２７によるＶＥＧＦＲ２リン酸化及びＡＫＴ活性化の阻害を示す。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を４時間血清飢餓状態にし、表記された濃度のＩＧＴ－４２７（図２Ａ）又はアフリベルセプト（図２Ｂ）とともに３０分間インキュベートし、次いで、組換えヒトＶＥＧＦで２分間処理した。細胞可溶化物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティングに供し、抗ホスホ－ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ホスホ－Ａｋｔ（Ｓ４７３）又は総Ａｋｔ抗体でブロットをプローブした。ＶＥＧＦレポーターアッセイは、ＩＧＴ－４２７、ファリシマブ及びアフリベルセプトの同等の阻害効果を示す（図２Ｃ）。
【図2C】図２Ａ～２Ｃは、ＩＧＴ－４２７によるＶＥＧＦＲ２リン酸化及びＡＫＴ活性化の阻害を示す。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を４時間血清飢餓状態にし、表記された濃度のＩＧＴ－４２７（図２Ａ）又はアフリベルセプト（図２Ｂ）とともに３０分間インキュベートし、次いで、組換えヒトＶＥＧＦで２分間処理した。細胞可溶化物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティングに供し、抗ホスホ－ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）、抗ＶＥＧＦＲ２、抗ホスホ－Ａｋｔ（Ｓ４７３）又は総Ａｋｔ抗体でブロットをプローブした。ＶＥＧＦレポーターアッセイは、ＩＧＴ－４２７、ファリシマブ及びアフリベルセプトの同等の阻害効果を示す（図２Ｃ）。
【図3】図３は、アンジオポエチン－１と比較した場合の、ＩＧＴ－４２７によるホスホ－Ｔｉｅ２シグナル伝達のより強力かつより持続的なレベルを示す。ヒトＴｉｅ２を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を４時間血清飢餓状態にし、次いで、１０ｎＭのＩＧＴ－４２７又はアンジオポエチン－１で表記の期間処理した。可溶化物をホスホ－Ｔｉｅ２及び総Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡアッセイに供した。
【図5】図５は、ＩＧＴ－４２７が、ＨＵＶＥＣにおいて、Ｔｉｅ２シグナル伝達に対するアンジオポエチン－２の効果を乗り越え、回避し、前処理されたＡｎｇ２の存在下でＡｋｔシグナル伝達のさらなる活性化をもたらすことを示す。
【図6】図６は、ＩＧＴ－４２７がＡｎｇ２と複合体を形成したＴｉｅ２及びＶＥＧＦに同時に結合することを示す。Ａｎｇ２をＣＭ５チップに捕捉し、続いて、ヒトＴｉｅ２、ＩＧＴ－４２７及びヒトＶＥＧＦを表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｂｉｏｃｏｒｅ（商標））分析において注入した。
【図7】図７は、ＩＧＴ－４２７によるＴＮＦ－α誘導性アポトーシスの阻害を示す。ＩＧＴ－４２７又はアイリーア（Ｒ）でＨＵＶＥＣを１時間前処理し、次いで、ＴＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。ＡＰＯ－ＢｒｄＵ（商標）ＴＵＮＥＬ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ２３２１０）によってアポトーシス細胞を染色し、Ａｔｔｕｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって判定した。値は平均±標準誤差である。一元配置ＡＮＯＶＡにより＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図9】図９は、ＩＧＴ－４２７がＭＭＰ１４によるＴｉｅ２切断を阻止することを示す。組換えヒトＭＭＰ１４、ヒトＴｉｅ２－ＥＣＤ－ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質又はＩＧＴ－４２７を混合し、示されているようにインキュベートした。
【図10】図１０は、ＩＧＴ－４２７が、基礎のＨＵＶＥＣ又はＴＮＦ－α処理されたＨＵＶＥＣにおけるｓＴｉｅ２生成を阻害することを示す。ｓＴｉｅ２のレベルは、Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定された。
【図12】図１２は、レーザー誘発ＣＮＶモデルにおける硝子体内注射されたＩＧＴ－４２７又はアイリーア（Ｒ）によるＣＮＶ（脈絡膜新生血管形成）の抑制を示す。抗体（５０μｌの注入体積／眼、アイリーア（Ｒ）（８００μｇ）、ＩＧＴ－４２７（８８５μｇ）、対照ＩｇＧ（７１６μｇ））の硝子体内投与をレーザー光凝固後０日目に行った。アイリーア（Ｒ）、ＩＧＴ－４２７及び対照ＩｇＧのモル比は、１：０．６５：０．６８である。レーザー光凝固後１４日目に撮影したＦＡ画像において、ＣＮＶ周辺の漏出領域における蛍光強度を測定した。各群について、４～７匹のウサギを試験し、６つのレーザー誘発ＣＮＶ病変を各ウサギについて試験した。ＣＮＶ病変（ｎ＝２４～４２）を各群について画像化した。値は平均±ＳＥＭである。一方向ＡＮＯＶＡにより＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。
【図14】図１４は、５つのＩＧＴ－４２７バリアントに対する最適化されたＰＥＧ化条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥデータを示す。ＰＲＯ５９３、ＰＲＯ５９４及びＰＲＯ５９５は、反応混合物中に非修飾抗体を有さずに完全な変換を受ける。ＰＲＯ５９２及びＰＲＯ５９６の反応混合物は、反応の終了時にいくらかの非修飾抗体を有する。
【図15】図１５は、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦ表面へのＩＧＴ－４２７及びＰＥＧ化バリアントのＳＰＲ結合を示す。いずれかの抗原への結合シグナルにわずかな差が存在するが、非修飾ＩＧＴ－４２７と比較して、ＰＥＧ化バリアントは両抗原を同じように結合する。
【図17】図１７は、眼のＰＫ研究被験物質の非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥデータを示す。レーン１：アイリーア（Ｒ）；レーン２：ファリシマブ；レーン３：ＩＧＴ－４２７；レーン４：（２×２０ｋＤａの直鎖状ＰＥＧ）－ＩＧＴ－４２７；レーン５：（２×４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧ）－ＩＧＴ－４２７。
【図18A】図１８Ａ～１８Ｃは、ウサギＶＥＧＦ（図１８Ａ）、Ｔｉｅ２（図１８Ｂ）及びＡｎｇ２（図１８Ｃ）への眼のＰＫ被験物質のＳＰＲ結合データを示す。測定された結合定数の要約が表として記載されている。
【図18B】図１８Ａ～１８Ｃは、ウサギＶＥＧＦ（図１８Ａ）、Ｔｉｅ２（図１８Ｂ）及びＡｎｇ２（図１８Ｃ）への眼のＰＫ被験物質のＳＰＲ結合データを示す。測定された結合定数の要約が表として記載されている。
【図18C】図１８Ａ～１８Ｃは、ウサギＶＥＧＦ（図１８Ａ）、Ｔｉｅ２（図１８Ｂ）及びＡｎｇ２（図１８Ｃ）への眼のＰＫ被験物質のＳＰＲ結合データを示す。測定された結合定数の要約が表として記載されている。
【図19-1】図１９は、ニュージーランド白ウサギ硝子体からの総薬物測定の要約を示す。ＥＬＩＳＡ定量からの測定された薬物レベルを経時的にプロットした。各データ点は、単一のウサギの眼からの２つ組の測定を表す。各データセットへの指数関数フィットが、フィットされたパラメータとともに赤色で示されており、抽出された眼の半減期が各曲線の下に示されている。ＰＥＧ化ＩＧＴ－４２７バリアントについては、１４日間の測定値がプロットに含まれているが、フィッティング及び抽出された半減期分析からは除外されている。各被験物質について観察された半減期の要約が右下に示されている。
【発明を実施するための形態】
【0081】
配列の説明
表１は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。
表１は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。
【表1】
【0082】
【0083】
【0084】
【0085】
【0086】
【0087】
実施形態の説明
定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び語句は、以下の意味を有することが意図される。
定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び語句は、以下の意味を有することが意図される。
【0088】
本明細書で使用される場合、「抗Ｔｉｅ２抗体」という用語は、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体を意味し、Ｔｉｅ２に特異的に結合する完全な抗体に加えて、抗体分子の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、完全な抗体は、２つの完全長軽鎖及び２つの完全長重鎖の構造を有し、各軽鎖はジスルフィド結合によって重鎖に接続されている。重鎖の定常領域は、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）のサブクラスを有する、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）型を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）型及びラムダ（λ）型を有する。
【0089】
「抗原結合断片」又は「抗体の抗体断片」は、抗原に結合することができる断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域並びに重鎖の第１のＣＨ１の構造を有する１つの抗原結合部位を有する。
【0090】
Ｆａｂ’は、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１以上のシステイン残基を含むヒンジ領域を有するという点でＦａｂとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域内のシステイン残基間でのジスルフィド結合形成によって産生される。Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域のみを有する最小の抗体断片である。二重鎖Ｆｖ（二本鎖Ｆｖ）は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間での非共有結合によって形成され、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般に、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域との間で共有結合したペプチドリンカーを介して形成されるか、又は二重鎖Ｆｖのような二量体様構造を形成することによってＣ末端において直接接続される。この断片は、タンパク質加水分解酵素によって得ることができ（例えば、パパインを使用した全抗体の制限消化によってＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断することによってＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる。）、遺伝子操作技術によっても作製される。
【0091】
抗体は、例えば、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）又は完全な抗体形態であり得る。さらに、重鎖の定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はイプシロン（ε）の任意のアイソタイプから選択され得る。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ型又はラムダ型のものであり得る。
【0092】
抗体には、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、又は上記抗体のエピトープ結合断片などが含まれるが、これらに限定されない。
【0093】
「ＨＣ」の「重鎖」という用語は、抗原特異性を提供するために十分な可変領域を有するアミノ酸配列を有する、可変領域ドメインＶＨ及び３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む完全長重鎖又はその断片を意味する。さらに、本明細書で使用される場合、「軽鎖」又は「ＬＣ」は、抗原特異性を提供するために十分な可変領域を有するアミノ酸配列を有する、可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む完全長軽鎖又はその断片を意味する。（例えば、ヒトＩｇＧ１の）重鎖定常領域ドメインは、体内の免疫細胞上のＦｃ受容体との効率的な相互作用を低下させるか又は排除するために、１以上の修飾を含有することができる。（１又は複数の）このような変異は、Ｆｃ受容体へのその結合を抑制し、抗体誘導性細胞傷害を低下又は消失させることができる。このような修飾は、Ｌ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６Ｇ２３７残基（ＥＵナンバリング）をＬＡＧＡ変異、ＦＥＧＧ変異、ＡＡＧＧ変異、ＡＡＧＡ変異、ＬＡＬＡ変異又はそれらの組み合わせに変更することを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、免疫細胞によって媒介される細胞傷害を低下又は消失させるために、（例えば、前述の変異のいずれかと組み合わせて）Ｋ３２２及びＰ３３１（ＥＵナンバリング）に変異を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、免疫細胞によって媒介される細胞傷害を低下又は消失させるために、ＬＡＬＡ変異並びにＫ３２２及びＰ３３１における変異（例えば、Ｋ３２２Ａ及びＰ３３１Ｓ）（ＥＵナンバリング）を含む。
【0094】
「モノクローナル抗体」は、細胞又は細胞株の単一クローンによって産生され、同一の抗体分子からなる抗体である。モノクローナル抗体は、一価の親和性を有することができ、同じエピトープにのみ結合する。対照的に、ポリクローナル抗体は複数のエピトープに結合し、通常、いくつかの異なる抗体分泌形質細胞系統によって作製される。１つのモノクローナル抗体の標的を２つのエピトープに増加させることによって、二重特異性モノクローナル抗体を設計することもできる。
【0095】
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合することができるタンパク質決定基（例えば、抗体によって認識される抗原の一部）を意味する。エピトープは、化学的に活性な表面分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の群であり得、一般に、特定の電荷特性及び特定の三次元構造特性を有する。
【0096】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体（ドナー又はソース抗体）由来の１以上のアミノ酸配列（例えば、６つのＣＤＲ配列などの１以上のＣＤＲ配列）と、非ヒト免疫グロブリンに由来する他の最小配列とを含むキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、その超可変領域が、レシピエントの超可変領域由来の残基の所望の特異性、親和性及び能力を有する、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類（受容体抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。ヒト化のために、フレームワークドメイン（ＦＲ）中の１以上の残基が、非ヒトドナー抗体の対応する残基によって置き換えられ得る。これは、（１又は複数の）移植されたＣＤＲの適切な三次元立体配置を維持し、それによって親和性及び抗体安定性を改善するのに役立ち得る。ヒト化抗体は、例えば、代替的に又は追加的に、抗体のさらなる性能をさらに改良するために、元のレシピエント抗体又はドナー抗体には現れない新しい残基を含むことができる。
【0097】
重鎖及び／若しくは軽鎖の一部が特定の種に由来するか、又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同であるのに対して、（１又は複数の）残りの鎖は別の種に由来するか、又は他の抗体クラスに属するか、又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である、所望の生物学的活性を示す任意の「キメラ」抗体（免疫グロブリン）及び上記抗体の断片が含まれる。
【0098】
本明細書で使用される「抗体可変ドメイン」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含むドメインを指す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指す。「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲの外側の可変ドメインセグメントである。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として特定される４つのＦＲを有する。
【0099】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要である、抗体の可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲ領域を含む。
【0100】
本明細書で使用される「半減期延長モジュレータ」は、抗体又は抗体断片の半減期を増加させるために抗体又は抗体断片に付加することができる化学物質、バイオポリマー、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質断片を指す。半減期延長モジュレータは、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ヒアルロン酸（ＨＡ）又はホスホリルコリンを含有するバイオポリマー；アルブミン；アルブミン結合ペプチド；又はＨＡ結合タンパク質断片を含み得る。
【0101】
半減期はまた、例えば、抗体又は抗体断片と新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）媒介性再利用との相互作用を消失させることによって減少させ得る。例えば、複数の部位におけるコンビナトリアル変異は、抗体の半減期に影響を及ぼすことが知られている。いくつかの実施形態では、変異は、Ｍ２５２（例えば、Ｍ２５２Ｙ）、Ｉ２５３（例えば、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｍ又はＩ２５３Ｖ）、Ｓ２５４（例えば、Ｓ２５４Ｔ）、Ｔ２５６（例えば、Ｔ２５６Ｄ）、Ｈ３１０（例えば、Ｈ３１０Ａ）、Ｈ４３３（例えば、Ｈ４３３Ｋ）、Ｎ４３４（例えば、Ｎ４３４Ｆ）及び／又はＨ４３５（例えば、Ｈ４３５Ａ、Ｈ４３５Ｑ又はＨ４３５Ｒ）（ＥＵナンバリング）を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ及びＨ３１０Ａ（ＥＵナンバリング）を含む。全身半減期の減少は、ＶＥＧＦ阻害の確立されたオンターゲット毒性問題（出血、高血圧など）のために最小の全身曝露及び減少した全身半減期が望まれる、眼疾患処置などの非全身性疾患処置に有利であり得る。
【0102】
本明細書で使用される場合、「又は」は、文脈が明らかに包括的な意味でないことを示さない限り、包括的な意味（すなわち、及び／又はに等しい）を有する。
【0103】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、複数の源からの配列を含む任意のポリペプチドを包含する。融合タンパク質は、例えば、遺伝子融合物（例えば、融合タンパク質の配列をコードするポリヌクレオチド）から、又は別々に生産若しくは合成されたポリペプチドを化学的に連結することによって生産され得る。
【0104】
「血管新生関連疾患」とも呼ばれる「血管新生疾患」は、血管新生の発生、又は血管新生の進行に関連する疾患を意味する。
【0105】
本明細書で使用される場合、「対象」はヒト又は動物であり得る。例えば、対象はヒトであり得る。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、愛玩動物（「ペット」とも呼ばれる）を含み得る。「愛玩動物」という用語は、ペットとして、又はその他愛玩目的のために飼育され得る家畜化された動物を指し、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、ウマ、ロバ、ラバ及びハムスターが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、愛玩動物は、哺乳動物の愛玩動物である。
【0106】
本明細書で使用される「予防」という用語は、融合タンパク質又は組成物を投与することによって、目的の疾患を阻害する、その発症を遅延させる、又はその発生の可能性を低下させる任意の行為を表す。「処置」又は「治療」という用語は、目的の疾患の症候を軽減する、遅延させる、若しくは緩和するか、又は目的の疾患を治癒する、目的の疾患の重症度を低下させる、若しくは目的の疾患の進行を遅延させる任意の行為を示す。
【0107】
本開示は、それぞれ所与の核酸配列又はアミノ酸配列（参照配列）に対してある程度の同一性を有する核酸配列及びアミノ酸配列を記載する。
【0108】
２つの核酸配列間の「配列同一性」は、それらの配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、それらの配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【0109】
「％同一の」、「％同一性」という用語又は類似の用語は、特に、比較されるべき配列間での最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージを指すことが意図される。前記パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間での差は、比較されるべき配列の全長にわたってランダムに分布し得るが、必ずしも比較されるべき配列の長さ全体にわたってランダムに分布するとは限らない。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を特定するために、最適なアラインメント後に、セグメント又は「比較のウィンドウ」に関して前記配列を比較することによって行われる。比較のための最適なアラインメントは、手作業で、又はＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所的相動性アルゴリズムの助けを借りて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所的相動性アルゴリズムの助けを借りて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４による類似性検索アルゴリズムの助けを借りて、又は前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ サイエンスドライブ、マジソン、ウィスコンシン州のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）の助けを借りて実施され得る。
【0110】
パーセンテージ同一性は、比較されるべき配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較される位置の数（例えば、参照配列中の位置の数）で割り、この結果に１００を掛けることによって得られる。
【0111】
いくつかの実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である領域に対して与えられる。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、いくつかの実施形態では連続ヌクレオチド中の少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０又は約２００ヌクレオチドに対して与えられる。いくつかの実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長に対して与えられる。
【0112】
それぞれ所与の核酸配列又はアミノ酸配列に対して特定の程度の同一性を有する核酸配列又はアミノ酸配列は、前記所与の配列の少なくとも１つの機能的特性を有し得、例えば、いくつかの例では、前記所与の配列と機能的に等価である。１つの重要な特性には、特に対象に投与された場合にサイトカインとして作用する能力が含まれる。いくつかの実施形態では、所与の核酸配列又はアミノ酸配列に対して特定の程度の同一性を有する核酸配列又はアミノ酸配列は、前記所与の配列と機能的に等価である。
【0113】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記載された主題の特性に実質的に影響を及ぼさない、例えば１０％、５％、２％又は１％以内の変動の程度を示す。したがって、反対のことが示されていない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、得ることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、及び特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。
【0114】
概要
Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦの両方に特異的に結合する融合タンパク質が本明細書において提供される。融合タンパク質は、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦの現在の治療の制限並びに血管新生疾患又は血管疾患のための他の現在利用可能な治療の制限の両方に対処するように設計された。その結果、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインとを含む融合タンパク質が提供される。これらの融合タンパク質は、ＶＥＧＦ阻害及びＴｉｅ２活性化という二重の機能の故に、血管新生疾患又は血管疾患のための治療剤として有益な役割を果たすことができる。
Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦの両方に特異的に結合する融合タンパク質が本明細書において提供される。融合タンパク質は、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦの現在の治療の制限並びに血管新生疾患又は血管疾患のための他の現在利用可能な治療の制限の両方に対処するように設計された。その結果、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインとを含む融合タンパク質が提供される。これらの融合タンパク質は、ＶＥＧＦ阻害及びＴｉｅ２活性化という二重の機能の故に、血管新生疾患又は血管疾患のための治療剤として有益な役割を果たすことができる。
【0115】
融合タンパク質
本開示は、Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片とＶＥＧＦ結合ドメインとを含む融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、Ｔｉｅ－２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２の配列を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメインに結合する。
本開示は、Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片とＶＥＧＦ結合ドメインとを含む融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、Ｔｉｅ－２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２の配列を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメインに結合する。
【0116】
いくつかの実施形態では、Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５～７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８～１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメイン及びＶＥＧＦに結合する。
【0118】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインであって、前記ＶＥＧＦ結合ドメインは、配列番号１３のＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）－Ａ結合領域及び配列番号１４のＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）－Ａ結合領域を含む、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合ドメインと、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体結合断片とを含み、前記融合タンパク質は、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメイン及びＶＥＧＦに結合する。
【0119】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗体結合断片を含む。さらなる実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片は、ベバシズマブ、ラニビズマブ又はＨｕＭａｂ Ｇ６－３１（米国特許出願公開第２００７／０１４１０６５号）の可変結合ドメインを含む。
【0120】
一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片の重鎖（ＨＣ）のＣ末端に連結されている。
【0121】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＴｉｅ２のアミノ酸６３３～６４４（配列番号２０）及び／又はアミノ酸７１３～７２６（配列番号２１）を結合する。一実施形態では、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列のＴｉｅ２のアミノ酸６３３～６４４（配列番号１９）及び／又はアミノ酸７１３～７２６（配列番号２０）を結合する。
【0122】
一実施形態では、抗Ｔｉｅ２抗体はＩｇＧ１アイソタイプを有する。
【0123】
一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0124】
一実施形態では、融合タンパク質は４つのポリペプチド鎖を含み、２つの鎖は一対の重鎖であり、２つの鎖は一対の軽鎖である。適切には、重鎖は、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメインに結合するＴｉｅ２結合ドメインをＮ末端に含み、ＶＥＧＦ結合ドメインをＣ末端に含む。適切には、Ｔｉｅ２結合ドメインは抗Ｔｉｅ２抗体であり、融合タンパク質の重鎖の対は抗体の重鎖を含み、融合タンパク質の軽鎖の対は抗体の軽鎖を含む。
【0125】
一実施形態では、融合タンパク質は、
ａ．第１及び第２の重鎖単量体の二量体であって、各重鎖単量体は、Ｎ末端からＣ末端へ、
ｉ．ｉｉ．の定常重鎖ドメイン（ＣＨ）に連結された、軽鎖可変ドメインと一緒にＴｉｅ２を結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ドメインと、
ｉｉ．ｉｉｉ．のＶＥＧＦ結合ドメインに連結された、ＣＨ１ドメイン及びＦｃ領域又はその断片を含む定常重鎖ドメイン（ＣＨ）と、
ｉｉｉ．ＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインを含むＶＥＧＦ結合ドメイン（ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）及びＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）のＶＥＧＦ－Ａ結合領域など）と
を含む一本鎖ポリペプチドを含む、第１及び第２の重鎖単量体の二量体と；
ｂ．第１及び第２の軽鎖単量体であって、各軽鎖単量体は、Ｎ末端からＣ末端へ、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ１）に連結された、ＶＨと一緒にＴｉｅ２を結合する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、第１及び第２の軽鎖単量体と；
を含み、
前記第１及び第２の単量体は、それらのＦｃ領域又はその断片を介して二量体化し；
前記Ｔｉｅ２結合ドメインは、各重鎖単量体の前記ＶＨ及びＣＨ１が前記軽鎖単量体の前記ＶＬ及びＣＬ１ドメインと対を形成するように、各重鎖単量体と前記軽鎖単量体の１つとの対形成によって形成される。
ａ．第１及び第２の重鎖単量体の二量体であって、各重鎖単量体は、Ｎ末端からＣ末端へ、
ｉ．ｉｉ．の定常重鎖ドメイン（ＣＨ）に連結された、軽鎖可変ドメインと一緒にＴｉｅ２を結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ドメインと、
ｉｉ．ｉｉｉ．のＶＥＧＦ結合ドメインに連結された、ＣＨ１ドメイン及びＦｃ領域又はその断片を含む定常重鎖ドメイン（ＣＨ）と、
ｉｉｉ．ＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインを含むＶＥＧＦ結合ドメイン（ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）及びＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）のＶＥＧＦ－Ａ結合領域など）と
を含む一本鎖ポリペプチドを含む、第１及び第２の重鎖単量体の二量体と；
ｂ．第１及び第２の軽鎖単量体であって、各軽鎖単量体は、Ｎ末端からＣ末端へ、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ１）に連結された、ＶＨと一緒にＴｉｅ２を結合する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、第１及び第２の軽鎖単量体と；
を含み、
前記第１及び第２の単量体は、それらのＦｃ領域又はその断片を介して二量体化し；
前記Ｔｉｅ２結合ドメインは、各重鎖単量体の前記ＶＨ及びＣＨ１が前記軽鎖単量体の前記ＶＬ及びＣＬ１ドメインと対を形成するように、各重鎖単量体と前記軽鎖単量体の１つとの対形成によって形成される。
【0126】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ受容体と抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含む。さらなる実施形態では、リンカーは、５～５０残基、例えば１０～４０残基、例えば１５～３０残基、例えば２０残基を含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ結合ドメインと抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、リンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１６の配列を含む。
【0128】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ受容体と抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、リンカーは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号２５の配列を含む。
【0129】
一実施形態では、融合タンパク質は、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片の１以上の重鎖定常ドメインのＣ末端側に及びＮ末端からＣ末端への順序で、ＶＥＧＦ結合ドメインと抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、例えばリンカーは、５～５０アミノ酸残基、例えば１０～４０残基、例えば１５～３０残基、例えば２０残基を有する配列を含む。
【0130】
一実施形態では、融合タンパク質は、抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗原結合断片の１以上の重鎖定常ドメインのＣ末端側に及びＮ末端からＣ末端への順序で、ＶＥＧＦ結合ドメインと抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間にリンカーを含み、リンカーは、配列番号１６又は２５のアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0131】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＨドメインと、ＶＥＧＦ結合ドメインと抗Ｔｉｅ２抗体又はその抗体断片との間に配列番号１６又は２５のアミノ酸配列を含むリンカーを含み、ＶＥＧＦ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0132】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0133】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を含む重鎖を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0134】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を含む重鎖を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0135】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を含む軽鎖を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【0136】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むＣＨドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、体定常領域ドメインにおいて他の免疫細胞上のＦｃ受容体との効率的な相互作用を低下させるか又は排除するために、重鎖中の定常領域ドメインに１以上の修飾又は変異を含む。いくつかの実施形態では、１以上の修飾又は変異は、Ｌ２３４Ｌ２３５Ｇ２３６Ｇ２３７（ＥＵナンバリング）をＬＡＧＡ変異、ＦＥＧＧ変異、ＡＡＧＧ変異、ＡＡＧＡ変異、ＬＡＬＡ変異又はそれらの組み合わせに変化させることを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、免疫細胞によって媒介される細胞傷害を低下及び消失させるために、前述の変異のいずれか（例えば、ＬＡＬＡ変異）並びにＫ３２２及びＰ３３１（ＥＵナンバリング）における変異を含む。
【0137】
Ｔｉｅ２抗体は、一価又は二価であり、一本鎖又は二本鎖を含有する。機能的には、結合親和性又は解離定数（ＫＤ）は、系平衡状態においてタンパク質上のリガンド結合部位の半分が占有される、リガンドのモル（Ｍ）濃度である。解離定数（ＫＤ）は、解離速度（Ｋｏｆｆ）値を会合速度（Ｋｏｎ）値で割ることにより算出される。解離定数の文脈では、より低い値はより強い結合と一致する。Ｔｉｅ２抗体のＫＤは、１０－５Ｍ～１０－１２Ｍの範囲内である。例えば、Ｔｉｅ２抗体の結合親和性（ＫＤ）は、１０－６Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１２Ｍ、１０－５Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－６Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－１０Ｍ～１０－１１Ｍ、１０－５Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－６Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－７Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－９Ｍ～１０－１０Ｍ、１０－５Ｍ～１０－９Ｍ、１０－６Ｍ～１０－９Ｍ、１０－７Ｍ～１０－９Ｍ、１０－８Ｍ～１０－９Ｍ、１０－５Ｍ～１０－８Ｍ、１０－６Ｍ～１０－８Ｍ、１０－７Ｍ～１０－８Ｍ、１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、１０－６Ｍ～１０－７Ｍ又は１０－５Ｍ～１０－６Ｍである。
【0138】
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質であるＩＧＴ－４２７は、同時に、ＶＥＧＦシグナル伝達を抑制し、Ｔｉｅ２シグナル伝達経路を活性化する。ＩＧＴ－４２７は、細胞表面相互作用と同様に、二価の相互作用において１ｎＭ未満のＫＤでヒトＴｉｅ－２を結合し、１０ｐＭ未満のＫＤでヒトＶＥＧＦを結合する。表面上のＶＥＧＦとは、ＩＧＴ－４２７は、５００ｐＭ未満の見かけの親和性で結合する。表面上のＩＧＴ－４２７とは、ＫＤは１０ｐＭ未満である。ＩＧＴ－４２７は、ウサギオルソログに対して同等の高い親和性を示す。
【0139】
一実施形態では、融合タンパク質は、３Ｅ－９Ｍ（ここで、Ｅ－Ｘは負の指数及びゼロの数を表し、例えば３Ｅ－９は、．０００００００００３と同じである。）未満、３．５Ｅ－９Ｍ未満、４Ｅ－１０Ｍ未満、又はそれ未満の親和性ＫＤ（Ｍ）で、配列番号２、３又は４を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメインに結合する。所与の量より未満のＫＤ値は、そのＫＤが所与の量より数値的に小さいことを意味し、これはより強い結合を示す。
【0140】
ＩＧＴ－４２７は、ＶＥＧＦのみを阻害する薬剤と比較して優れた有効性を提供する、及び／又はＡｎｇ２阻害剤と比較してより強力なＴｉｅ－２アゴニスト活性を有する可能性を有する。
【0141】
融合タンパク質中のＴｉｅ２抗体又は抗体断片は、Ｔｉｅ２を特異的に認識することができる範囲内でその生物学的等価物を含むことができる。例えば、融合タンパク質中のＴｉｅ２抗体又は抗体断片は、抗体の結合親和性及び／又はその他の生物学的特性をさらに改善するために、アミノ酸配列への変化を含むことができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換が含まれ得る。これらのアミノ酸変動は、保存的置換を提供するために、アミノ酸側鎖の疎水性、親水性、電荷、サイズなどのアミノ酸置換基の相対的類似性に基づいて行われ得る。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状及び種類の分析により、アルギニン、リジン及びヒスチジンはすべて正に帯電した残基であり、アラニン、グリシン及びセリンは同様のサイズを有し、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の形状を有することが知られている。したがって、これらの考察に基づいて、アルギニン、リジン及びヒスチジンアラニン、グリシン及びセリン；並びにフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは保存的置換であると言うことができる。
【0142】
生物学的に等価な活性を有する上記の変動を考慮して、いくつかの実施形態では、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５～１０中の６つのＣＤＲの配列、並びに／又は配列番号１１及び１２の重鎖及び軽鎖、又は実質的な同一性を示す任意の配列を含む。実質的な同一性は、少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を意味する。
【0143】
これに基づいて、融合タンパク質又はその構成要素は、本明細書に記載されている指定された又はすべての配列と比較した場合、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性を有し得る。
【0144】
一実施形態では、融合タンパク質はペグ化されている。一実施形態では、融合タンパク質は、半減期延長モジュレータ、例えばＰＥＧ、ヒアルロン酸又はホスホリルコリンで修飾されている。一実施形態では、融合タンパク質は、部位特異的にペグ化されている。一実施形態では、融合タンパク質は、システイン残基上で部位特異的にペグ化されている。一実施形態では、融合タンパク質は、ＰＥＧ、ヒアルロン酸又はホスホリルコリンを含み得る半減期延長モジュレータで部位特異的に（例えば、システイン残基上で）修飾されている。あるいは、半減期延長モジュレータはアルブミン、アルブミン結合ペプチド及び／又はＨＡ結合タンパク質断片を含み得る。
【0145】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２２の配列をさらに含み、配列番号２２の配列のシステイン残基上で、本明細書に記載されている半減期延長モジュレータのいずれかで部位特異的に修飾（例えば、ペグ化）されている。一実施形態では、配列番号２２の配列は、重鎖のＣ末端に存在する。一実施形態では、重鎖は、配列番号２３の配列を含む。一実施形態では、重鎖は、配列番号２４の配列を含む。
【0146】
一実施形態では、ＰＥＧは約４０ｋＤａの分子量を有する。
【0147】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質の鎖状単量体を含むポリペプチドが提供される。
【0148】
一実施形態では、ポリペプチドは、本発明の融合タンパク質の重鎖単量体を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１又は２６の配列に対して少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９１％の同一性、例えば少なくとも９２％の同一性、例えば少なくとも９３％の同一性、例えば少なくとも９４％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、例えば少なくとも９７％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば少なくとも９９％の同一性、例えば１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１の配列からなる。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２６の配列からなる。
【0149】
一実施形態では、ポリペプチドは、本発明の融合タンパク質の軽鎖単量体を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２に対して少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９１％の同一性、例えば少なくとも９２％の同一性、例えば少なくとも９３％の同一性、例えば少なくとも９４％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、例えば少なくとも９７％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば少なくとも９９％の同一性、例えば１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２の配列からなる。
【0150】
ポリヌクレオチド；製造方法；ベクター及び宿主細胞
別の態様では、本開示は、融合タンパク質をコードする核酸に関する。
別の態様では、本開示は、融合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0151】
別の実施形態では、本開示は、本発明の融合タンパク質の鎖状単量体を含むポリペプチドをコードする核酸を提供する。一実施形態では、本開示は、融合タンパク質の重鎖をコードする核酸を提供する。別の実施形態では、本開示は、融合タンパク質の軽鎖をコードする核酸を提供する。
【0152】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号２７又は２９に対して少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９１％の同一性、例えば少なくとも９２％の同一性、例えば少なくとも９３％の同一性、例えば少なくとも９４％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、例えば少なくとも９７％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば少なくとも９９％の同一性、例えば１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２７又は２９からなる。
【0153】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号２８に対して少なくとも７０％の同一性、例えば少なくとも７５％の同一性、例えば少なくとも８０％の同一性、例えば少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９１％の同一性、例えば少なくとも９２％の同一性、例えば少なくとも９３％の同一性、例えば少なくとも９４％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性、例えば少なくとも９６％の同一性、例えば少なくとも９７％の同一性、例えば少なくとも９８％の同一性、例えば少なくとも９９％の同一性、例えば１００％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２８からなる。
【0154】
一実施形態では、本開示は、各ポリヌクレオチドが本発明の融合タンパク質の単量体鎖の少なくとも１つをコードする、１以上のポリヌクレオチドのセットを提供し、前記融合タンパク質のこのような両方の鎖（すなわち、軽鎖及び重鎖）がコードされる。
【0155】
融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする核酸を構築又は単離することによって組換え的に生産され得る。核酸を単離し、それを複製可能なベクターに挿入することによるさらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）を行ってもよく、又はさらなる発現を行ってもよい。これに基づいて、本開示は、別の態様において、核酸を含有するベクターに関する。
【0156】
いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質を含む核酸に関する。「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に包含するものとし、核酸の基本構造単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチド及び修飾された糖又は塩基部分を有する類似体を含む。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は、修飾され得る。修飾には、ヌクレオチドの付加、欠失、又は非保存的若しくは保存的置換が含まれる。
【0157】
融合タンパク質をコードするＤＮＡは、従来のプロセスを用いて（例えば、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成される。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素は、一般に、以下のもの：シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列のうちの１以上を含むが、これらに限定されない。
【0158】
いくつかの実施形態では、本開示は、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、融合タンパク質の１つの重鎖配列及び１つの軽鎖配列をコードする核酸を含むベクターが提供される。
【0159】
一実施形態では、融合タンパク質の両方の鎖（すなわち、軽鎖及び重鎖）がベクターの前記セットにおいてコードされるように、本発明の１以上のポリヌクレオチドのセットを集団的に含む１以上のベクターのセットが提供される。
【0160】
一実施形態では、ベクターは、動物ウイルス、例えば逆転写酵素ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス及びパポバウイルスから選択されるウイルスである。
【0161】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１（ＣＭＶ－ＩＥ１）プロモーター／エンハンサーなどのプロモーター／エンハンサーをさらに含む。
【0162】
本明細書で使用される場合、宿主細胞において目的の遺伝子を発現させるための手段としての、「ベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む。ベクター中の抗体をコードする核酸は、プロモーターに動作可能に連結されている。
【0163】
本明細書で使用される場合、「動作可能に連結された」又は「連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列又は転写調節因子結合部位のアレイ）と異なる核酸配列との間での機能的な連結を意味し、それにより、制御配列は他の核酸配列の転写及び／又は翻訳を制御する。
【0164】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞が本明細書で提供される。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。宿主細胞は、単離されてもよく、例えば、培養されてもよく、又は多細胞生物の一部でなくてもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞株のメンバーである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、不死化された哺乳動物細胞である。
【0165】
宿主としての原核細胞の場合、転写を処理することができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、翻訳の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／翻訳終結配列が一般に含まれる。さらに、例えば宿主としての真核細胞の場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター）を用いることができ、一般的には、転写終結配列としてポリアデニル化配列を含めることができる。
【0166】
いくつかの事例では、ベクターは、発現された抗体の精製を容易にするために他の配列と融合され得る。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、米国）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、米国）及び６×Ｈｉｓ（ヘキサヒスチジン；Ｑｉａｇｅｎ、米国）である。
【0167】
ベクターは、選択マーカーとして当技術分野で一般的に使用される抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含有する。
【0168】
別の態様では、本開示は、上記発現ベクターで形質転換された細胞に関する。抗体を生産するために使用される細胞は、原核生物、酵母及び高等真核生物の細胞であり得るが、これらに限定されない。
【0169】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））などの原核宿主細胞を使用することができる。
【0170】
例示的な有用な動物宿主細胞株は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ又はＨＴ１０８０であるが、これらに限定されない。
【0171】
一実施形態では、本開示は、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦを結合する融合タンパク質を製造する方法であって、融合タンパク質をコードする、発現ベクターなどの核酸を含む（例えば、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された）細胞を培養する工程と、前記培養された細胞から融合タンパク質を回収する工程とを含む、方法を提供する。
【0172】
細胞は、様々な培地中で培養され得る。任意の市販の培養培地を制限なく使用することができる。当業者に公知のすべての他の必須サプリメントは、適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件、及び選択される宿主細胞は、当業者に公知である。
【0173】
抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば遠心分離又は限外濾過を用いて、及び例えばアフィニティークロマトグラフィーなどを用いて不純物を除去することによって行うことができる。アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどのさらなる追加の精製技術を使用することができる。
【0174】
融合タンパク質の使用；治療
別の態様では、本開示は、有効量の融合タンパク質を投与することによって血管新生疾患又は血管疾患を予防又は処置するための方法及び組成物に関する。他の態様では、本実施形態は、血管新生、内皮シグナル伝達、炎症及び／又は血管漏出を調節することを必要とする対象に融合タンパク質を投与することによって、血管新生、内皮シグナル伝達、炎症及び／又は血管漏出を調節するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、治療において使用するためのものである。
別の態様では、本開示は、有効量の融合タンパク質を投与することによって血管新生疾患又は血管疾患を予防又は処置するための方法及び組成物に関する。他の態様では、本実施形態は、血管新生、内皮シグナル伝達、炎症及び／又は血管漏出を調節することを必要とする対象に融合タンパク質を投与することによって、血管新生、内皮シグナル伝達、炎症及び／又は血管漏出を調節するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質は、治療において使用するためのものである。
【0175】
血管新生は、既存の血管からの新しい血管の形成又は成長を意味する。血管新生疾患又は血管新生関連疾患の例には、癌、転移、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶反応、黄斑変性、血管新生緑内障などの緑内障、全身性紅皮症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節症、アテローム性プラークにおける毛細血管形成、ケロイド、創傷肉芽形成、血管接着、関節リウマチ、変形性骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、腸管癒着、ネコ引っ掻き病、潰瘍、肝硬変、腎炎、糖尿病性腎症、糖尿病、炎症性疾患及び神経変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。さらに、例示的な癌には、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、白血病、ホジキンリンパ腫、リンパ腫及び多発性骨髄性血液癌が含まれるが、これらに限定されない。
【0176】
融合タンパク質は、血管新生、内皮シグナル伝達、炎症及び／又は血管漏出を調節するために投与され得る。例えば、融合タンパク質は、血管内皮細胞膜の完全性を増加させ、及び／又は血管漏出を低下させるために投与され得る。血管漏出は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を含むがこれらに限定されないいくつかの一般的な眼障害における視覚障害の一因であることが知られている。いくつかの実施形態では、炎症は、敗血症、呼吸促迫症候群及び／又はウイルス感染性疾患に由来する。
【0177】
融合タンパク質及びその組成物は、ラット、マウス、家畜、愛玩動物、ヒトなどを含む哺乳動物に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物の愛玩動物などの愛玩動物である。いくつかの実施形態では、愛玩動物は、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、ウマ、ラバ、ロバ又はハムスターである。融合タンパク質又はその組成物は、毎日投与され得る。融合タンパク質又はその組成物は、１、２、３、４、６又は１２ヶ月ごとに１回投与され得る。一実施形態では、融合タンパク質は、６ヶ月に１回（すなわち、１年に２回）投与される。投与は、典型的に受け入れられた経路、例えば、経口、直腸、硝子体内、静脈内、皮下、子宮内、又は脳血管内投与によるものである。いくつかの実施形態では、投与は硝子体内注射によるものである。一実施形態では、１ｍｇ～１０ｍｇの融合タンパク質が、毎日、毎月又は６ヶ月ごとに硝子体内注射によって投与される。一実施形態では、１０ｍｇ未満の融合タンパク質が、６ヶ月ごとに約１回（例えば、１年に２回）の硝子体内注射によって投与される。
【0178】
薬学的組成物；投与
いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む組成物は薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、当分野で典型的に使用される適切なビヒクル、賦形剤又は希釈剤を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む組成物は薬学的組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、当分野で典型的に使用される適切なビヒクル、賦形剤又は希釈剤を含む。
【0179】
適切なビヒクル、賦形剤、希釈剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９５に記載されている。適切な薬学的に許容され得るビヒクル、賦形剤又は希釈剤としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、ヒスチジン、グリセロール、スクロース、ポリソルベート、エタノールなどの１以上、及びそれらの組み合わせが挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５～約８、より好ましくは約６～約７である。例えば、投与経路及び濃度に応じて、ある種の担体がより好ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。
【0180】
薬学的に許容され得るビヒクルを有する薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、経口溶液、エマルジョン、シロップ、無菌水溶液、非水溶液、懸濁剤、凍結乾燥物及び坐剤などの様々な経口又は非経口剤形であり得る。薬学的組成物は、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの、組み合わせで調合され得る希釈剤又は賦形剤を含むことができる。経口投与用の固体調製物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などの形態であり得る。結束との関連で、化合物は、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース又はゼラチンなどの１以上の賦形剤を組み合わせることによって製剤化され得る。単純な賦形剤及びステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤がさらに使用され得る。
【0181】
経口投与用液体調製物は、懸濁液、経口溶液、エマルジョン、シロップなどであり得る。賦形剤、例えば水又は湿潤パラフィンのような単純な希釈剤、様々な湿潤剤、甘味料、芳香剤、防腐剤などを液体製剤中に含めることができる。さらに、薬学的組成物は、無菌水溶液、非水性溶媒、懸濁液、エマルジョン、凍結乾燥物、坐剤などの非経口剤形であり得る。注射可能なプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油及びオレイン酸エチルなどのエステルは、不溶性溶媒及び懸濁液に適し得る。坐剤の基本物質としては、ウイテプゾール、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ ６１、カカオバター、ラウリンバター、グリセロゼラチンが挙げられる。
【0182】
組成物は、薬学的有効量で投与される。「薬学的有効量」などの本明細書で使用される用語は、すべての医学的処置に適用可能であり得る適切な利益／リスク比を有する、疾患処置のための薬学的組成物の十分な量を指す。有効量は、疾患の重症度、患者／患畜の年齢及び性別、疾患の種類、薬物活性、薬物感受性、投与時間、投与経路、分泌速度、処置の期間及び他の要因などのパラメータを含む様々な要因に応じて異なり得る。また、上記組成物は、単一用量で投与され得るか、又は複数用量に分割され得る。これらの要因を十分に考慮すると、副作用なしで最大の効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要である。薬学的組成物の投与量は、特に限定されないが、患者／患畜の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与経路及び投与時間を含む種々の要因に応じて変動する。
【0183】
組成物は、典型的に受け入れられた経路、例えば、経口、直腸、静脈内、皮下、子宮内、硝子体内又は脳血管内を介して、１日に１回又は複数回、ラット、マウス、家畜、愛玩動物、ヒトなどを含む哺乳動物に投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、硝子体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物の愛玩動物などの愛玩動物である。いくつかの実施形態では、愛玩動物は、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、ウマ、ラバ、ロバ、ハムスター又はその他の家畜化されたペットである。
【0184】
他の観点での本開示は、抗体又は上記組成物を必要とする個体中に投与するための工程を含む、血管新生疾患又は血管疾患のための予防又は処置方法、及び抗血管新生方法に言及する。
【0185】
融合タンパク質は、薬学的組成物で提供され得る。
【0186】
本開示の方法は、血管新生の阻害を必要とする個体に対して薬学的有効用量の薬学的組成物を投与するための手順を含む。個体は、イヌ、ネコ、フェレット、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット又はヒトなどの哺乳動物であり得るが、これらに限定されない。例えば、一実施形態では、個体は、ニワトリ、シチメンチョウ又はその他の非哺乳動物であり得る。薬学的組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内又は鼻腔内、及び必要に応じて局所処置のための病変内を含む適切な方法で投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物の投与量は、個体の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬物の種類、投与経路及び投与時間を含むがこれらに限定されない様々な要因に応じて変化し、当業者によって容易に決定され得る。
【0187】
他の態様では、本開示は、抗体及び抗体を含む癌の予防又は処置のための組成物又は薬学的組成物を必要とする個体への組成物又は抗体の投与手順を含む、癌の予防又は処置の方法に言及する。
【0188】
癌は、本開示の抗体で処置可能である限り、限定されない。具体的には、抗体は、血管新生を阻害することにより、癌の発生又は進行を予防することができる。癌の例には、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、白血病、ホジキンリンパ腫、リンパ腫及び多発性骨髄性癌血液癌が含まれるが、これらに限定されない。
【0189】
別段の定義がなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。
【0190】
［実施例］
以下の実施例は、単に本発明を例示することを意図しており、本発明を限定するように構成されていない。
以下の実施例は、単に本発明を例示することを意図しており、本発明を限定するように構成されていない。
【0191】
［実施例１］
融合タンパク質の調製
Ａ．構築物の設計
ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）及びＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）のＶＥＧＦ－Ａ結合領域が抗Ｔｉｅ２抗体の重鎖（ＨＣ）のＣ末端に融合された融合タンパク質、ＩＧＴ－４２７を設計した。構築物を、ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１（ＣＭＶ－ＩＥ１）プロモーター／エンハンサーを含有するタンパク質発現ベクターにした。重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列が、上記の表１に示されている。
融合タンパク質の調製
Ａ．構築物の設計
ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）及びＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）のＶＥＧＦ－Ａ結合領域が抗Ｔｉｅ２抗体の重鎖（ＨＣ）のＣ末端に融合された融合タンパク質、ＩＧＴ－４２７を設計した。構築物を、ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１（ＣＭＶ－ＩＥ１）プロモーター／エンハンサーを含有するタンパク質発現ベクターにした。重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列が、上記の表１に示されている。
【0192】
Ｂ．ＩＧＴ－４２７の発現及び精製
製造者の説明書（Ｇｉｂｃｏ）に基づいて、ＩＧＴ－４２７をコードするプラスミドＤＮＡをＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に一過性に同時トランスフェクトした。等量の重鎖及び軽鎖ＤＮＡを使用した。次いで、Ｍａｘ力価プロトコルのために、振盪しながら空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気で、３２℃で、トランスフェクトされた細胞をインキュベートした。１２日間のインキュベーション後、分泌された融合タンパク質を含有する培養培地を回収し、遠心分離して細胞を除去し、培養上清を回収し、濾過した。結合／洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）及び溶出緩衝液（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．３）中で、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｃｙｔｉｖａ）のアフィニティーカラムを有するＡＫＴＡＰｕｒｅ精製システム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して融合タンパク質を精製し、したがって１ミリリットルの画分当たり１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８を添加することによって直ちに中和した。次いで、遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して、プールされた画分をＰＢＳ、ｐＨ７．４に緩衝液交換した。その結果得られた最終試料をさらに使用するまで保存した。同時に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）ＷｅｄｇｅＷｅｌｌ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０及び３００Å細孔径のカラム）及び内毒素測定（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ＜０．０５ＥＵ／ｍｌ感度）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅ）などの品質管理研究に融合タンパク質を供した。
製造者の説明書（Ｇｉｂｃｏ）に基づいて、ＩＧＴ－４２７をコードするプラスミドＤＮＡをＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に一過性に同時トランスフェクトした。等量の重鎖及び軽鎖ＤＮＡを使用した。次いで、Ｍａｘ力価プロトコルのために、振盪しながら空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気で、３２℃で、トランスフェクトされた細胞をインキュベートした。１２日間のインキュベーション後、分泌された融合タンパク質を含有する培養培地を回収し、遠心分離して細胞を除去し、培養上清を回収し、濾過した。結合／洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）及び溶出緩衝液（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．３）中で、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｃｙｔｉｖａ）のアフィニティーカラムを有するＡＫＴＡＰｕｒｅ精製システム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して融合タンパク質を精製し、したがって１ミリリットルの画分当たり１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８を添加することによって直ちに中和した。次いで、遠心フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して、プールされた画分をＰＢＳ、ｐＨ７．４に緩衝液交換した。その結果得られた最終試料をさらに使用するまで保存した。同時に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）ＷｅｄｇｅＷｅｌｌ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０及び３００Å細孔径のカラム）及び内毒素測定（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ＜０．０５ＥＵ／ｍｌ感度）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅ）などの品質管理研究に融合タンパク質を供した。
【0193】
［実施例２］
オルソロガスなＴｉｅ２タンパク質の調製
Ａ．構築物の設計
Ｔｉｅ２の３つのオルソロガスなタンパク質（ヒト、ウサギ及びマウス）のＩｇ３ドメイン及びＦＮＩＩＩ（１－３）ドメインを、ＩＧＴ－４２７への結合タンパク質として選択した。Ｔｉｅ２とＩｇＧ１ Ｆｃ配列との間の連続するＣ末端ヘキサ－ヒスチジン及びトロンビンプロテアーゼ切断部位（ＬＶＰＲＧＳ）と共に、伸長因子１－アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター及びＩＬ２シグナルペプチドから構成されるｐＦｕｓｅ－マウスＩｇＧ１ Ｆｃ２ベクターに各Ｔｉｅ２オルソログのドメインをクローニングした。ヒト（配列番号２）、ウサギ（配列番号３）及びマウス（配列番号４）Ｔｉｅ２オルソログの配列が上記の表１に示されている。
オルソロガスなＴｉｅ２タンパク質の調製
Ａ．構築物の設計
Ｔｉｅ２の３つのオルソロガスなタンパク質（ヒト、ウサギ及びマウス）のＩｇ３ドメイン及びＦＮＩＩＩ（１－３）ドメインを、ＩＧＴ－４２７への結合タンパク質として選択した。Ｔｉｅ２とＩｇＧ１ Ｆｃ配列との間の連続するＣ末端ヘキサ－ヒスチジン及びトロンビンプロテアーゼ切断部位（ＬＶＰＲＧＳ）と共に、伸長因子１－アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター及びＩＬ２シグナルペプチドから構成されるｐＦｕｓｅ－マウスＩｇＧ１ Ｆｃ２ベクターに各Ｔｉｅ２オルソログのドメインをクローニングした。ヒト（配列番号２）、ウサギ（配列番号３）及びマウス（配列番号４）Ｔｉｅ２オルソログの配列が上記の表１に示されている。
【0194】
Ｂ．Ｔｉｅ２オルソログの発現及び精製
Ｔｉｅ２オルソログを生産するために、組換えタンパク質を高効率で生産することができるＥｘｐｉ２９３Ｆ（Ｇｉｂｃｏ）細胞を使用した。製造者の取扱説明書（Ｇｉｂｃｏ）を参照することによって、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞株において、オルソロガスなＴｉｅ２タンパク質を一過性に発現させた。４日のトランスフェクション及び振盪しながら空気中８％ＣＯ２の加湿雰囲気での、３７℃でのインキュベーション後、得られた培養培地を回収し、遠心分離して細胞を除去した。分泌された抗体を含有する培養上清を単離し、４℃で保存するか、又は結合及び洗浄（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）並びに溶出緩衝液（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．３）という２つの異なる緩衝液系中で、アフィニティーカラム（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｃｙｔｉｖａ）を備えたＡＫＴＡＰｕｒｅ精製装置（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して直ちに精製した。１ミリリットルの画分当たり１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８を添加することによって、Ｔｉｅ２タンパク質を直ちに中和した。画分をプールし、次いで、タンパク質遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を通してＰＢＳ、ｐＨ７．４に緩衝液交換し、－８０℃で保存した。次のプロセスとして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）ＷｅｄｇｅＷｅｌｌ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０及び３００Å孔径のカラム）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの品質管理研究のためにタンパク質を分析した。
Ｔｉｅ２オルソログを生産するために、組換えタンパク質を高効率で生産することができるＥｘｐｉ２９３Ｆ（Ｇｉｂｃｏ）細胞を使用した。製造者の取扱説明書（Ｇｉｂｃｏ）を参照することによって、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞株において、オルソロガスなＴｉｅ２タンパク質を一過性に発現させた。４日のトランスフェクション及び振盪しながら空気中８％ＣＯ２の加湿雰囲気での、３７℃でのインキュベーション後、得られた培養培地を回収し、遠心分離して細胞を除去した。分泌された抗体を含有する培養上清を単離し、４℃で保存するか、又は結合及び洗浄（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）並びに溶出緩衝液（２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．３）という２つの異なる緩衝液系中で、アフィニティーカラム（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｃｙｔｉｖａ）を備えたＡＫＴＡＰｕｒｅ精製装置（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して直ちに精製した。１ミリリットルの画分当たり１００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８を添加することによって、Ｔｉｅ２タンパク質を直ちに中和した。画分をプールし、次いで、タンパク質遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を通してＰＢＳ、ｐＨ７．４に緩衝液交換し、－８０℃で保存した。次のプロセスとして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）ＷｅｄｇｅＷｅｌｌ）、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０及び３００Å孔径のカラム）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの品質管理研究のためにタンパク質を分析した。
【0195】
［実施例３］
Ｔｉｅ２オルソログに対する融合タンパク質（ＩＧＴ－４２７）の親和性測定
ＳＰＲシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００）によって、オルソロガスなＴｉｅ２タンパク質に対する融合タンパク質の親和性を測定した。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用して、ヒト、ウサギ又はマウスＴｉｅ２の単量体又は二量体形態のいずれかで、ＣＭ５ ＳＰＲチップ（Ｃｙｔｉｖａ）を修飾した（ここでは、二量体形態はＦｃ融合物であった）。センサーチップをＥＤＣ（０．２Ｍ）及びＮＨＳ（０．０５Ｍ）で７分間活性化した後、約２００ＲＵの抗原表面密度に達するように、ｐＨ５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２．５μｇ ｍＬ－１のＴｉｅ２構築物を注入した。次いで、１Ｍエタノールアミン・ＨＣｌ ｐＨ８．５の７分間の注入で表面を非活性化した。活性化及び非活性化試薬は、Ｃｙｔｉｖａから購入した。Ｔｉｅ２構築物の固定化後、３００ｍＭリン酸の２回の５秒間パルスで表面の状態を整えた。これらの固定化されたＴｉｅ２表面上に、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ及び１．２ｎＭで、３０μＬ／分で５分間、ランニング緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ及び０．０５％ポリソルベート－２０）中の融合タンパク質を注入し、解離を２０分間監視した。３００ｍＭリン酸の１０秒間の注入で表面再生を行った。Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ）を使用して、センサーグラムを１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。ＫＤ値及びＳＰＲセンサーグラムが、それぞれ以下の表２及び図１Ａ～１Ｃに示した。
Ｔｉｅ２オルソログに対する融合タンパク質（ＩＧＴ－４２７）の親和性測定
ＳＰＲシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００）によって、オルソロガスなＴｉｅ２タンパク質に対する融合タンパク質の親和性を測定した。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用して、ヒト、ウサギ又はマウスＴｉｅ２の単量体又は二量体形態のいずれかで、ＣＭ５ ＳＰＲチップ（Ｃｙｔｉｖａ）を修飾した（ここでは、二量体形態はＦｃ融合物であった）。センサーチップをＥＤＣ（０．２Ｍ）及びＮＨＳ（０．０５Ｍ）で７分間活性化した後、約２００ＲＵの抗原表面密度に達するように、ｐＨ５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中２．５μｇ ｍＬ－１のＴｉｅ２構築物を注入した。次いで、１Ｍエタノールアミン・ＨＣｌ ｐＨ８．５の７分間の注入で表面を非活性化した。活性化及び非活性化試薬は、Ｃｙｔｉｖａから購入した。Ｔｉｅ２構築物の固定化後、３００ｍＭリン酸の２回の５秒間パルスで表面の状態を整えた。これらの固定化されたＴｉｅ２表面上に、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７ｎＭ及び１．２ｎＭで、３０μＬ／分で５分間、ランニング緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ及び０．０５％ポリソルベート－２０）中の融合タンパク質を注入し、解離を２０分間監視した。３００ｍＭリン酸の１０秒間の注入で表面再生を行った。Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ）を使用して、センサーグラムを１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた。ＫＤ値及びＳＰＲセンサーグラムが、それぞれ以下の表２及び図１Ａ～１Ｃに示した。
【表2】
【0196】
［実施例４］
ＩＧＴ－４２７によるＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を培養した。飢餓状態にするために、サプリメントを含まないＥＢＭ－２培地とともに４時間、９０％コンフルエントの細胞をインキュベートした。表記された濃度のＩＧＴ－４２７又はアイリーア（Ｒ）で、飢餓状態にしたＨＵＶＥＣを３０分間前処理し、次いで組換えヒトＶＥＧＦで２分間処理した。冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）で処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細胞可溶化物を調製した。上清中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量した。４×ＳＤＳ試料緩衝液を添加することによって細胞可溶化物を調製し、細胞可溶化物をＳＤＳ ＰＡＧＥに供し、タンパク質をニトロセルロース膜（ＧＥ）に転写した。
ＩＧＴ－４２７によるＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を培養した。飢餓状態にするために、サプリメントを含まないＥＢＭ－２培地とともに４時間、９０％コンフルエントの細胞をインキュベートした。表記された濃度のＩＧＴ－４２７又はアイリーア（Ｒ）で、飢餓状態にしたＨＵＶＥＣを３０分間前処理し、次いで組換えヒトＶＥＧＦで２分間処理した。冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）で処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細胞可溶化物を調製した。上清中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量した。４×ＳＤＳ試料緩衝液を添加することによって細胞可溶化物を調製し、細胞可溶化物をＳＤＳ ＰＡＧＥに供し、タンパク質をニトロセルロース膜（ＧＥ）に転写した。
【0197】
ＶＥＧＦＲ２及びＡｋｔのリン酸化を調べるために、５％スキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔにより室温（ＲＴ）で１時間ブロットをブロッキングし、抗ホスホ－ＶＥＧＦＲ２抗体（Ｔｙｒ１１７５）又は抗ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）抗体とともに、４℃で約１６時間インキュベートした。増感化学発光（ＥＣＬ）によって、ホスホ－ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１１７５）又はｐＡｋｔ（Ｓ４７３）のシグナルを、可視化した。次いで、ストリッピング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１５分間、膜をインキュベートし、その後、抗ＶＥＧＦＲ２抗体又は抗Ａｋｔ抗体により再度プローブして、総ＶＥＧＦＲ２及び総Ａｋｔの量を決定した。Ｔｙｒ１１７５におけるＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲ２リン酸化は、ＩＧＴ－４２７によって濃度依存的に阻害され、その阻害は、アイリーア（Ｒ）による阻害に匹敵する（図２Ａ及び２Ｂ）。さらに、ＩＧＴ－４２７は、Ａｋｔのリン酸化を用量依存的様式で誘導した。
【0198】
ＶＥＧＦレポーターバイオアッセイキット（ＰＲＯＭＥＧＡ（商標））を使用して、ＶＥＧＦレポーターアッセイを行った。簡潔には、１０％ＦＢＳ（アッセイ緩衝液）を含有する４．６ｍｌのＤＭＥＭ培地に、０．４ｍｌのＫＤＲ／ＮＦＡＴ－ＲＥ ＨＥＫ２９３細胞を加え、２５μｌの細胞懸濁液を白色平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に蒔いた。５０ｎＭの３倍高濃度の濃度及び２５μｌのアッセイ緩衝液中での３倍連続希釈で、ＩＧＴ－４２７、ファリシマブ又はアフリベルセプトを添加し、２５μｌのアッセイ緩衝液中の４０ｎｇ／ｍｌの３倍高濃度の組換えヒトＶＥＧＦをプレートに添加した。３７℃で６時間インキュベートした後、７５μｌのキットに付属のＢＩＯ－ＧＬＯ（商標）試薬を加え、ＧｌｏＭａｘ（Ｒ）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ（商標））を用いて発光を測定した。ＩＧＴ－４２７、ファリシマブ又はアフリベルセプトのＩＣ５０値は、それぞれ約０．４８ｎＭ、０．３２ｎＭ又は０．７５ｎＭであり（図２Ｃ）、ＩＧＴ－４２７によるＶＥＧＦ阻害がファリシマブ又はアフリベルセプトのいずれかによる阻害と同等であることを示唆した。
【0199】
［実施例５］
ＩＧＴ－４２７によるＴｉｅ２のより強くかつより持続的な活性化
完全長のヒトＴｉｅ２を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＴｉｅ２、１×１０５細胞／ｍｌ）を、６０ｍｍ培養皿中において、３７℃でＤＭＤＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で培養した。飢餓状態にするために、サプリメントを含まないＤＭＥＭ培地とともに４時間、９０％コンフルエントの細胞をインキュベートした。飢餓状態にされたＣＨＯ細胞を、様々な期間（３０分、１時間、２時間、６時間及び２４時間）、１０ｎＭの濃度のＩＧＴ－４２７又は組換えヒトアンジオポエチン－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））で処理した。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）で処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細胞可溶化物を調製した。次いで、可溶化物を使用して、ｐＴｉｅ２及び総Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））を使用して、ホスホ－Ｔｉｅ２及び総Ｔｉｅ２シグナルのレベルを検出した。総Ｔｉｅ２シグナルによってホスホ－Ｔｉｅ２シグナルを正規化した。ＩＧＴ－４２７は、アンジオポエチン－１と比較して、より強くかつより持続的なｐＴｉｅ２シグナルを示した（図３）。
ＩＧＴ－４２７によるＴｉｅ２のより強くかつより持続的な活性化
完全長のヒトＴｉｅ２を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＴｉｅ２、１×１０５細胞／ｍｌ）を、６０ｍｍ培養皿中において、３７℃でＤＭＤＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で培養した。飢餓状態にするために、サプリメントを含まないＤＭＥＭ培地とともに４時間、９０％コンフルエントの細胞をインキュベートした。飢餓状態にされたＣＨＯ細胞を、様々な期間（３０分、１時間、２時間、６時間及び２４時間）、１０ｎＭの濃度のＩＧＴ－４２７又は組換えヒトアンジオポエチン－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））で処理した。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）で処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細胞可溶化物を調製した。次いで、可溶化物を使用して、ｐＴｉｅ２及び総Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））を使用して、ホスホ－Ｔｉｅ２及び総Ｔｉｅ２シグナルのレベルを検出した。総Ｔｉｅ２シグナルによってホスホ－Ｔｉｅ２シグナルを正規化した。ＩＧＴ－４２７は、アンジオポエチン－１と比較して、より強くかつより持続的なｐＴｉｅ２シグナルを示した（図３）。
【0200】
［実施例６］
ＩＧＴ－４２７によるＡｋｔシグナル伝達の用量依存的活性化
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を培養した。飢餓状態にするために、サプリメントを含まないＥＢＭ－２培地とともに４時間、９０％コンフルエントの細胞をインキュベートした。飢餓状態にされたＨＵＶＥＣを様々な濃度のＩＧＴ－４２７（０．３、１、３、１０、３０、１００ｎＭ）で３０分間処理した。冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）で処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細胞可溶化物を調製した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量した。４×ＳＤＳ試料緩衝液を添加することによって細胞可溶化物を調製し、細胞可溶化物をＳＤＳ ＰＡＧＥに供し、タンパク質をニトロセルロース膜（ＧＥ）に転写した。Ａｋｔのリン酸化を調べるために、５％スキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔにより室温（ＲＴ）で１時間ブロットをブロッキングし、抗ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）抗体とともに、４℃で約１６時間インキュベートした。増感化学発光（ＥＣＬ）によって、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）のシグナルを可視化した。次いで、ストリッピング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１５分間、膜をインキュベートし、その後、抗Ａｋｔ抗体により再度プローブして、総Ａｋｔの量を決定した。図４に示されているように、ＩＧＴ－４２７によるホスホ－Ａｋｔシグナル伝達の用量依存的な漸増が存在した。
ＩＧＴ－４２７によるＡｋｔシグナル伝達の用量依存的活性化
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を培養した。飢餓状態にするために、サプリメントを含まないＥＢＭ－２培地とともに４時間、９０％コンフルエントの細胞をインキュベートした。飢餓状態にされたＨＵＶＥＣを様々な濃度のＩＧＴ－４２７（０．３、１、３、１０、３０、１００ｎＭ）で３０分間処理した。冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）で処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細胞可溶化物を調製した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量した。４×ＳＤＳ試料緩衝液を添加することによって細胞可溶化物を調製し、細胞可溶化物をＳＤＳ ＰＡＧＥに供し、タンパク質をニトロセルロース膜（ＧＥ）に転写した。Ａｋｔのリン酸化を調べるために、５％スキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔにより室温（ＲＴ）で１時間ブロットをブロッキングし、抗ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）抗体とともに、４℃で約１６時間インキュベートした。増感化学発光（ＥＣＬ）によって、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）のシグナルを可視化した。次いで、ストリッピング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１５分間、膜をインキュベートし、その後、抗Ａｋｔ抗体により再度プローブして、総Ａｋｔの量を決定した。図４に示されているように、ＩＧＴ－４２７によるホスホ－Ａｋｔシグナル伝達の用量依存的な漸増が存在した。
【0201】
［実施例７］
ＩＧＴ－４２７によってＡｎｇ２シグナル伝達を回避する
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を培養した。飢餓状態にするために、サプリメントを含まないＥＢＭ－２培地とともに４時間、９０％コンフルエントの細胞をインキュベートした。０．０１、０．１、１ｎＭの濃度の組換えヒトアンジオポエチン－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））で３０分間、飢餓状態にされたＨＵＶＥＣを前処理し、次いで、３０ｎＭの濃度の２×２０ｋＤａのペグ化ＩＧＴ－４２７で６０分間処理した。冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）で処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細胞可溶化物を調製した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量した。４×ＳＤＳ試料緩衝液を添加することによって細胞可溶化物を調製し、細胞可溶化物をＳＤＳ ＰＡＧＥに供し、タンパク質をニトロセルロース膜（ＧＥ）に転写した。Ａｋｔのリン酸化を調べるために、５％スキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔにより室温（ＲＴ）で１時間ブロットをブロッキングし、抗ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）抗体とともに、４℃で約１６時間インキュベートした。増感化学発光（ＥＣＬ）によって、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）のシグナルを可視化した。次いで、ストリッピング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１５分間、膜をインキュベートし、その後、抗Ａｋｔ抗体により再度プローブして、総Ａｋｔの量を決定した。組換えアンジオポエチン－２（Ａｎｇ２）は、Ａｋｔの弱いリン酸化を濃度依存的様式で誘導した。しかしながら、ＩＧＴ－４２７は、組換えアンジオポエチン－２の存在下でＡｋｔリン酸化をさらに増加させ、ＩＧＴ－４２７がＡｎｇ２シグナル伝達を乗り越えることを実証した（図５）。
ＩＧＴ－４２７によってＡｎｇ２シグナル伝達を回避する
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を培養した。飢餓状態にするために、サプリメントを含まないＥＢＭ－２培地とともに４時間、９０％コンフルエントの細胞をインキュベートした。０．０１、０．１、１ｎＭの濃度の組換えヒトアンジオポエチン－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））で３０分間、飢餓状態にされたＨＵＶＥＣを前処理し、次いで、３０ｎＭの濃度の２×２０ｋＤａのペグ化ＩＧＴ－４２７で６０分間処理した。冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤）で処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって細胞可溶化物を調製した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量した。４×ＳＤＳ試料緩衝液を添加することによって細胞可溶化物を調製し、細胞可溶化物をＳＤＳ ＰＡＧＥに供し、タンパク質をニトロセルロース膜（ＧＥ）に転写した。Ａｋｔのリン酸化を調べるために、５％スキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔにより室温（ＲＴ）で１時間ブロットをブロッキングし、抗ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）抗体とともに、４℃で約１６時間インキュベートした。増感化学発光（ＥＣＬ）によって、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）のシグナルを可視化した。次いで、ストリッピング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１５分間、膜をインキュベートし、その後、抗Ａｋｔ抗体により再度プローブして、総Ａｋｔの量を決定した。組換えアンジオポエチン－２（Ａｎｇ２）は、Ａｋｔの弱いリン酸化を濃度依存的様式で誘導した。しかしながら、ＩＧＴ－４２７は、組換えアンジオポエチン－２の存在下でＡｋｔリン酸化をさらに増加させ、ＩＧＴ－４２７がＡｎｇ２シグナル伝達を乗り越えることを実証した（図５）。
【0202】
［実施例８］
ＩＧＴ－４２７の二重結合能力
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００）によって、ＩＧＴ－４２７の、その抗原であるＴｉｅ２及びＶＥＧＦへの二重結合特性を調べた。組換えヒト完全長Ａｎｇ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））をＣＭ５ ＳＰＲチップ（Ｃｙｔｉｖａ）上に捕捉し、まずヒト二量体型のＴｉｅ２（１００ｎＭ）を注射した後、ＩＧＴ－４２７（１５０ｎＭ）及びヒトＶＥＧＦ（２０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））を順次注射した。センサーグラムは、シグナルの逐次の増加を示し、ＩＧＴ－４２７がＡｎｇ２－Ｔｉｅ２複合体及びＶＥＧＦに同時に結合することができることを実証した（図６）。
ＩＧＴ－４２７の二重結合能力
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００）によって、ＩＧＴ－４２７の、その抗原であるＴｉｅ２及びＶＥＧＦへの二重結合特性を調べた。組換えヒト完全長Ａｎｇ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））をＣＭ５ ＳＰＲチップ（Ｃｙｔｉｖａ）上に捕捉し、まずヒト二量体型のＴｉｅ２（１００ｎＭ）を注射した後、ＩＧＴ－４２７（１５０ｎＭ）及びヒトＶＥＧＦ（２０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））を順次注射した。センサーグラムは、シグナルの逐次の増加を示し、ＩＧＴ－４２７がＡｎｇ２－Ｔｉｅ２複合体及びＶＥＧＦに同時に結合することができることを実証した（図６）。
【0203】
［実施例９］
ＩＧＴ－４２７によるＴＮＦ－α誘導性アポトーシスの阻害
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０ ５細胞／ｍｌ）を培養した。ＩＧＴ－４２７又はアイリーア（Ｒ）で６０分間、９０％コンフルエントの細胞を前処理し、次いで、組換えヒトＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。ＡＰＯ－ＢｒｄＵ（商標）ＴＵＮＥＬ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ２３２１０）によってアポトーシス細胞を染色し、Ａｔｔｕｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって判定した。簡潔には、０．５ｍＬのＰＢＳに細胞を懸濁し、ＰＢＳ中の５ｍＬの１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを細胞懸濁液に添加し、次いで、細胞懸濁液を氷上に１５分間置いた。細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。０．５ｍＬのＰＢＳに細胞を再懸濁し、５ｍＬの氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールを細胞懸濁液に添加し、細胞懸濁液を最低３０分間、－２０℃の冷凍庫内に置いた。７０％（ｖ／ｖ）エタノールを除去するために、細胞懸濁液を３００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、キットに付属の１ｍＬの洗浄緩衝液で細胞ペレットを再懸濁した。５０μＬのＤＮＡ標識溶液（１０μＬの反応緩衝液、０．７５μＬのＴｄＴ酵素、８．０μＬのＢｒｄＵＴＰ及び３１．２５μＬのｄＨ２Ｏ）中で、３７℃で６０分間、細胞ペレットをインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、１．０ｍＬのリンス緩衝液を細胞に添加し、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離した。リンス緩衝液でさらに洗浄した後、１００μＬの抗体染色溶液（５．０μＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８色素標識抗ＢｒｄＵ抗体）と９５μＬのリンス緩衝液）中で、室温で３０分間、細胞をインキュベートした。Ａｔｔｕｎｅフローサイトメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によってアポトーシス細胞を分析した。ＴＮＦ－αはＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスを誘導し、ＩＧＴ－４２７は、ＴＮＦ－αによって誘導されたアポトーシスを有意に阻害したが、アイリーア（Ｒ）は阻害しなかった（図７）。
ＩＧＴ－４２７によるＴＮＦ－α誘導性アポトーシスの阻害
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０ ５細胞／ｍｌ）を培養した。ＩＧＴ－４２７又はアイリーア（Ｒ）で６０分間、９０％コンフルエントの細胞を前処理し、次いで、組換えヒトＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。ＡＰＯ－ＢｒｄＵ（商標）ＴＵＮＥＬ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ２３２１０）によってアポトーシス細胞を染色し、Ａｔｔｕｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって判定した。簡潔には、０．５ｍＬのＰＢＳに細胞を懸濁し、ＰＢＳ中の５ｍＬの１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを細胞懸濁液に添加し、次いで、細胞懸濁液を氷上に１５分間置いた。細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。０．５ｍＬのＰＢＳに細胞を再懸濁し、５ｍＬの氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールを細胞懸濁液に添加し、細胞懸濁液を最低３０分間、－２０℃の冷凍庫内に置いた。７０％（ｖ／ｖ）エタノールを除去するために、細胞懸濁液を３００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、キットに付属の１ｍＬの洗浄緩衝液で細胞ペレットを再懸濁した。５０μＬのＤＮＡ標識溶液（１０μＬの反応緩衝液、０．７５μＬのＴｄＴ酵素、８．０μＬのＢｒｄＵＴＰ及び３１．２５μＬのｄＨ２Ｏ）中で、３７℃で６０分間、細胞ペレットをインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、１．０ｍＬのリンス緩衝液を細胞に添加し、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離した。リンス緩衝液でさらに洗浄した後、１００μＬの抗体染色溶液（５．０μＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８色素標識抗ＢｒｄＵ抗体）と９５μＬのリンス緩衝液）中で、室温で３０分間、細胞をインキュベートした。Ａｔｔｕｎｅフローサイトメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によってアポトーシス細胞を分析した。ＴＮＦ－αはＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスを誘導し、ＩＧＴ－４２７は、ＴＮＦ－αによって誘導されたアポトーシスを有意に阻害したが、アイリーア（Ｒ）は阻害しなかった（図７）。
【0204】
［実施例１０］
表面Ｔｉｅ２レベルの測定
アッセイの準備として、１０ｃｍ組織培養皿上で、コンフルエントになるまでＣＨＯ－ｈＴｉｅ２細胞を増殖させた。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）でＣＨＯ－ｈＴｉｅ２細胞を洗浄し、トリプシンで処理して細胞を剥離し、計数し、２００ｇで５分間遠心分離し、０．０５×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。アッセイプレートに播種するために、２４ウェル組織培養プレートの各ウェルに１ｍＬの細胞懸濁液を分注し、プレートを３７０℃で一晩インキュベートした。翌日、組織培養プレートから培地を取り出し、非刺激群についてはＤＭＥＭのみ、又は１０ｎＭアンジオポエチン１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ）＃９２３－ＡＮ）、１０ｎＭ ＩＧＴ－３０１（ＩＴＰ－００６）若しくは１０ｎＭ ＩＧＴ－４２７（ＩＴＰ－０１６）を含有するＤＭＥＭのいずれかの０．５ｍＬと交換した。アッセイプレートを３７０℃の組織培養インキュベータに所定の時間（０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間又は２４時間）戻した。
表面Ｔｉｅ２レベルの測定
アッセイの準備として、１０ｃｍ組織培養皿上で、コンフルエントになるまでＣＨＯ－ｈＴｉｅ２細胞を増殖させた。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）でＣＨＯ－ｈＴｉｅ２細胞を洗浄し、トリプシンで処理して細胞を剥離し、計数し、２００ｇで５分間遠心分離し、０．０５×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。アッセイプレートに播種するために、２４ウェル組織培養プレートの各ウェルに１ｍＬの細胞懸濁液を分注し、プレートを３７０℃で一晩インキュベートした。翌日、組織培養プレートから培地を取り出し、非刺激群についてはＤＭＥＭのみ、又は１０ｎＭアンジオポエチン１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ）＃９２３－ＡＮ）、１０ｎＭ ＩＧＴ－３０１（ＩＴＰ－００６）若しくは１０ｎＭ ＩＧＴ－４２７（ＩＴＰ－０１６）を含有するＤＭＥＭのいずれかの０．５ｍＬと交換した。アッセイプレートを３７０℃の組織培養インキュベータに所定の時間（０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間又は２４時間）戻した。
【0205】
インキュベーション後、組織培養プレートを氷上に置き、冷ＤＰＢＳで洗浄し、０．５ｍＬの非酵素的細胞解離緩衝液（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒ）＃ＣＰＤ－１２５）を添加することによって剥離させた。細胞を氷上で５分間インキュベートし、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ）を添加し、培養表面になお付着している細胞を剥離させるために穏やかにピペット操作を行うことによって回収した。得られた細胞懸濁液を５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ ＦＡＣＳチューブに回収し、３００ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引した。１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を１回洗浄し、上清を吸引すると、チューブ内に約１００ｕＬの残留ＦＡＣＳ緩衝液が残存した。次いで、９９．５ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液及び０．５ｕＬのＰＥ－Ｔｉｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｒ）＃３３４２０５）からなる１００ｕＬの染色カクテルを添加することによって細胞を染色した。パラフィルムで試料を覆い、暗所において４０℃で３０分間インキュベートした。
【0206】
インキュベーション後、上記のように１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、次いで４００ｕＬの最終体積のＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、直ちに分析するか又は翌日の分析のために固定した。固定のために、上記のように細胞を２回洗浄し、暗所において４０℃で３０分間、２００ｕＬの４％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、４００ｕＬの最終体積のＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、４０℃で一晩被覆して保存した。Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴ Ａｃｏｕｓｔｉｃフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて試料を取得し、ＦｌｏｗＪｏ（商標）（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いてファイルを分析した。ＩＧＴ－４２７処理は、内因性Ｔｉｅ２アゴニストであるアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）と比較して、表面Ｔｉｅ２のより遅い消失及びより多い存在をもたらした（図８）。
【0207】
［実施例１１］
Ｔｉｅ２切断を遮断する
Ｔｉｅ２は、様々な炎症症状でヒト、マウス及び内皮細胞において切断及び下方制御され、可溶性Ｔｉｅ２（ｓＴｉｅ２）のレベルの増加をもたらすことが知られている（Ｔｈａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８．４６：ｅ９２８－ｅ９３６）。広範囲のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を遮断することは、Ｔｉｅ２切断及び血管漏出を防ぐのに十分であることが知られている（Ｔｈａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８．４６：ｅ９２８－ｅ９３６；Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ９６：Ｅ１１４８－Ｅ１１５２；Ｆｉｎｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７：２６１９－２６２６）。ＭＭＰ－１４は、主要なＴｉｅ２切断であるとされており、Ｔｉｅ２は、マトリックスメタロプロテアーゼ－１４によってフィブロネクチン３型ドメイン内の複数の部位において切断される（Ｉｄｏｗｕ，ＴＯ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，Ａｕｇｕｓｔ ２４，２０２０，９：ｅ５９５２０）。
Ｔｉｅ２切断を遮断する
Ｔｉｅ２は、様々な炎症症状でヒト、マウス及び内皮細胞において切断及び下方制御され、可溶性Ｔｉｅ２（ｓＴｉｅ２）のレベルの増加をもたらすことが知られている（Ｔｈａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８．４６：ｅ９２８－ｅ９３６）。広範囲のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を遮断することは、Ｔｉｅ２切断及び血管漏出を防ぐのに十分であることが知られている（Ｔｈａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８．４６：ｅ９２８－ｅ９３６；Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ９６：Ｅ１１４８－Ｅ１１５２；Ｆｉｎｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７：２６１９－２６２６）。ＭＭＰ－１４は、主要なＴｉｅ２切断であるとされており、Ｔｉｅ２は、マトリックスメタロプロテアーゼ－１４によってフィブロネクチン３型ドメイン内の複数の部位において切断される（Ｉｄｏｗｕ，ＴＯ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，Ａｕｇｕｓｔ ２４，２０２０，９：ｅ５９５２０）。
【0208】
ＩＧＴ－４２７（ｈＴｉｅ２－ＥＣＤの同じモル濃度）の非存在下又は存在下で、組換えヒトＭＭＰ－１４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ）、カタログ＃、９１８－ＭＰ－０１０，０．５ｕｇ）を二量体ヒトＴｉｅ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）－ヒトＩｇＧ融合タンパク質（ｈＴｉｅ２－ＥＣＤ、５ｕｇ）と混合した。混合物を３０℃で１６時間インキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元条件）に供した。以前の報告と一致して、ＭＭＰ－１４及びヒトＴｉｅ２の共インキュベーションは、無傷のｈＴｉｅ２－ＥＣＤの有意な低下をもたらし、より短い切断された断片が出現した。しかしながら、ＩＧＴ－４２７は、ＭＭＰ－１４による無傷のヒトＴｉｅ２－ＥＣＤタンパク質の切断及び低下を有意に遮断した（図９）。
【0209】
理論に拘束されることを望むものではないが、この証拠に基づくと、配列番号２、３若しくは４、又はより具体的には配列番号２０のアミノ酸配列及び／若しくは配列番号２１のアミノ酸配列を含むＴｉｅ２ Ｉｇ３－ＦＮＩＩＩ（１－３）ドメインに結合する抗Ｔｉｅ２抗体又は抗原結合断片と、ＶＥＧＦ結合ドメインとを含む二重特異性は、ヒトＴｉｅ２へのＭＭＰ－１４の結合を遮断するという効果と、ＶＥＧＦによって引き起こされるヒトＴｉｅ２－ＥＣＤタンパク質の切断を阻害するという効果とを組み合わせることによって、Ｔｉｅ２のシェディンングを低下させると考えられる。これは、Ｔｉｅ２を細胞表面膜に保つという特に有益な結果を提供する。
【0210】
［実施例１２］
可溶性Ｔｉｅ２（ｓＴｉｅ２）測定
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を培養した。１０ｎＭの濃度のＩＧＴ－４２７、ファリシマブ又は組換えヒトアンジオポエチン－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））で、９０％コンフルエントの細胞を６０分間前処理し、次いで、組換えヒトＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。細胞上清を回収し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。総Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））によって細胞上清中の可溶性Ｔｉｅ２を測定した。ＩＧＴ－４２７は、基礎条件及びＴＮＦ－αによって誘導された条件の両方で可溶性Ｔｉｅ２レベルを抑制したが、他の薬剤は抑制しなかった（図１０）。
可溶性Ｔｉｅ２（ｓＴｉｅ２）測定
６０ｍｍ培養皿において、ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中、３７℃で、ＨＵＶＥＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を培養した。１０ｎＭの濃度のＩＧＴ－４２７、ファリシマブ又は組換えヒトアンジオポエチン－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））で、９０％コンフルエントの細胞を６０分間前処理し、次いで、組換えヒトＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。細胞上清を回収し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。総Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ））によって細胞上清中の可溶性Ｔｉｅ２を測定した。ＩＧＴ－４２７は、基礎条件及びＴＮＦ－αによって誘導された条件の両方で可溶性Ｔｉｅ２レベルを抑制したが、他の薬剤は抑制しなかった（図１０）。
【0211】
［実施例１３］
ＴＥＥＲ（経内皮電気抵抗）アッセイ
ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中の２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の細胞培養インサート中で、ＨＵＶＥＣ（２×１０５細胞）を３７℃で培養した。２日間のインキュベーション後、培地を、０．５％ＦＢＳを含有するＥＧＭ－２培地に変えた。その後の２日間のインキュベーション後に、細胞培養インサートをＣｅｌｌＺｓｃｏｐｅ（Ｒ）（ＮａｎｏＡｎａｌｙｔｉｃｓ）の中に入れ、ＴＥＥＲ（経内皮電気抵抗）を３７℃のＣＯ２インキュベータ中で連続的に測定した。細胞バリア形成を確認した後、１０ｎｇ／ｍｌの濃度の組換えヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を下方の区画に添加した。種々の薬剤、例えば１０ｎＭの濃度のＩＧＴ－４２７、ファリシマブ、アフリベルセプト又は組換えヒトアンジオポエチン－１（Ｒ＆Ｄ）を下方の区画に添加し、ＶＥＧＦ処理後４８時間にわたってＴＥＥＲをモニターした。ＶＥＧＦは内皮バリアの完全性を破壊し、ＩＧＴ－４２７は、ＶＥＧＦによって誘発された損傷から内皮バリアの完全性を回復させる上で、ファリシマブ及びアフリベルセプト、並びにＡｎｇ１よりも優れていた（図１１）。
ＴＥＥＲ（経内皮電気抵抗）アッセイ
ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）中の２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の細胞培養インサート中で、ＨＵＶＥＣ（２×１０５細胞）を３７℃で培養した。２日間のインキュベーション後、培地を、０．５％ＦＢＳを含有するＥＧＭ－２培地に変えた。その後の２日間のインキュベーション後に、細胞培養インサートをＣｅｌｌＺｓｃｏｐｅ（Ｒ）（ＮａｎｏＡｎａｌｙｔｉｃｓ）の中に入れ、ＴＥＥＲ（経内皮電気抵抗）を３７℃のＣＯ２インキュベータ中で連続的に測定した。細胞バリア形成を確認した後、１０ｎｇ／ｍｌの濃度の組換えヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を下方の区画に添加した。種々の薬剤、例えば１０ｎＭの濃度のＩＧＴ－４２７、ファリシマブ、アフリベルセプト又は組換えヒトアンジオポエチン－１（Ｒ＆Ｄ）を下方の区画に添加し、ＶＥＧＦ処理後４８時間にわたってＴＥＥＲをモニターした。ＶＥＧＦは内皮バリアの完全性を破壊し、ＩＧＴ－４２７は、ＶＥＧＦによって誘発された損傷から内皮バリアの完全性を回復させる上で、ファリシマブ及びアフリベルセプト、並びにＡｎｇ１よりも優れていた（図１１）。
【0212】
［実施例１４］
硝子体内注射されたＩＧＴ－４２７によるＣＮＶ（脈絡膜新生血管形成）の抑制
点眼剤（Ｍｙｄｒｉａｃｙｌ点眼液、１％）を右眼球に適用することによってチンチラウサギ（雄、２．０～２．５ｋｇ）に麻酔をかけ、５３２ｎｍ、出力１５０ｍＷ、持続時間０．１秒で右眼球にレーザー（Ｅｌｉｔｅ、Ｌｕｍｅｎｉｓ（Ｒ）、米国）を照射して、視神経の周囲に６つのスポットを生成した。麻酔をかけた動物の右眼に、３ゲージ針を備えたシリンジを使用して、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）誘発の日に、ＩＧＴ－４２７、アイリーア（Ｒ）又は対照ＩｇＧ（５０μｌ注入体積／眼、アイリーア（Ｒ）（８００μｇ）、ＩＧＴ－４２７（８８５μｇ）、対照ＩｇＧ（７１６μｇ））を硝子体内投与した。アイリーア（Ｒ）、ＩＧＴ－４２７及び対照ＩｇＧのモル比は、１：０．６５：０．６８である。濃度及び体積に対するいくつかの制限のために、異なるモルを使用した。０日目、７日目及び１４日目に、右眼球に点眼剤（Ｍｙｄｒｉａｃｙｌ点眼液、１％）を適用することによって動物に麻酔をかけ、１ｍＬのフルオレセインナトリウム塩溶液（２％）を静脈内注射して２分以内に眼底カメラ（ＴＲＣ－５０ＩＸ、ＴＯＰＣＯＮ、日本）を用いて眼底画像を撮影した。網膜フルオレセイン眼底写真を用いて網膜ＣＮＶ面積及び有効性の評価を行い、ＣＮＶ病変部位の蛍光強度を検証するために、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド州）を用いて画像解析を行った。ＩＧＴ－４２７は、対照ＩｇＧと比較して網膜漏出を３０％抑制した。一方、アイリーア（Ｒ）は網膜漏出を２０％阻害することができた（図１２）。
硝子体内注射されたＩＧＴ－４２７によるＣＮＶ（脈絡膜新生血管形成）の抑制
点眼剤（Ｍｙｄｒｉａｃｙｌ点眼液、１％）を右眼球に適用することによってチンチラウサギ（雄、２．０～２．５ｋｇ）に麻酔をかけ、５３２ｎｍ、出力１５０ｍＷ、持続時間０．１秒で右眼球にレーザー（Ｅｌｉｔｅ、Ｌｕｍｅｎｉｓ（Ｒ）、米国）を照射して、視神経の周囲に６つのスポットを生成した。麻酔をかけた動物の右眼に、３ゲージ針を備えたシリンジを使用して、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）誘発の日に、ＩＧＴ－４２７、アイリーア（Ｒ）又は対照ＩｇＧ（５０μｌ注入体積／眼、アイリーア（Ｒ）（８００μｇ）、ＩＧＴ－４２７（８８５μｇ）、対照ＩｇＧ（７１６μｇ））を硝子体内投与した。アイリーア（Ｒ）、ＩＧＴ－４２７及び対照ＩｇＧのモル比は、１：０．６５：０．６８である。濃度及び体積に対するいくつかの制限のために、異なるモルを使用した。０日目、７日目及び１４日目に、右眼球に点眼剤（Ｍｙｄｒｉａｃｙｌ点眼液、１％）を適用することによって動物に麻酔をかけ、１ｍＬのフルオレセインナトリウム塩溶液（２％）を静脈内注射して２分以内に眼底カメラ（ＴＲＣ－５０ＩＸ、ＴＯＰＣＯＮ、日本）を用いて眼底画像を撮影した。網膜フルオレセイン眼底写真を用いて網膜ＣＮＶ面積及び有効性の評価を行い、ＣＮＶ病変部位の蛍光強度を検証するために、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド州）を用いて画像解析を行った。ＩＧＴ－４２７は、対照ＩｇＧと比較して網膜漏出を３０％抑制した。一方、アイリーア（Ｒ）は網膜漏出を２０％阻害することができた（図１２）。
【0213】
［実施例１５］
ＰＥＧ化のためのＩＧＴ－４２７バリアント
ＩＧＴ－４２７の眼半減期を延長するために、ＩＧＴ－４２７の重鎖及び軽鎖プラスミドを改変して、ＰＥＧ化のための５つの異なる抗体構築物を作製した（図１３に概説されている）。５つバリアントはすべて、各重鎖上のＣ２１８Ｓ変異（ＥＵナンバリング）と組み合わせて、重鎖と軽鎖間の鎖間ジスルフィド結合を除去する変異Ｃ２１４Ｓ（ＥＵナンバリング）を有する軽鎖を有する。さらに、ＩＧＴ－４２７のヒンジ領域内の一方又は両方の重鎖システインをセリンで置換し、重鎖間の鎖間ジスルフィド結合の１つを残すか、又は全く残さなかった。ＰＲＯ５９２及びＰＲＯ５９６の場合には、単一のジスルフィド結合が還元及びＰＥＧ化された状態を保つ。ＰＲＯ５９３、ＰＲＯ５９４及びＰＲＯ５９５の場合には、すべての鎖間ジスルフィド結合が除去され、ＰＥＧ化のために新しいシステイン残基が導入される。ＰＲＯ５９３は、重鎖のＣ末端にシステインが導入されているのに対して、ＰＲＯ５９４及びＰＲＯ５９５はそれぞれ、ＦｃドメインとＶＥＧＦトラップドメインの間のリンカードメインにシステインが導入されている。合わせて、これらのバリアントは、ＰＥＧ化効率、抗原結合及び生物活性について試験された多様なＰＥＧ化部位を有する一組の構築物となる。Ｅｘｐｉ２９３一過性発現系を使用して、各ＩＧＴ－４２７バリアントを発現させた。清澄化した細胞培養上清をＨｉＴｒａｐ ｍＡｂｓｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡカラム（Ｃｙｔｉｖａ）で精製した。溶出した抗体を１×ＰＢＳ中に透析し、ＰＥＧ化研究のために１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
ＰＥＧ化のためのＩＧＴ－４２７バリアント
ＩＧＴ－４２７の眼半減期を延長するために、ＩＧＴ－４２７の重鎖及び軽鎖プラスミドを改変して、ＰＥＧ化のための５つの異なる抗体構築物を作製した（図１３に概説されている）。５つバリアントはすべて、各重鎖上のＣ２１８Ｓ変異（ＥＵナンバリング）と組み合わせて、重鎖と軽鎖間の鎖間ジスルフィド結合を除去する変異Ｃ２１４Ｓ（ＥＵナンバリング）を有する軽鎖を有する。さらに、ＩＧＴ－４２７のヒンジ領域内の一方又は両方の重鎖システインをセリンで置換し、重鎖間の鎖間ジスルフィド結合の１つを残すか、又は全く残さなかった。ＰＲＯ５９２及びＰＲＯ５９６の場合には、単一のジスルフィド結合が還元及びＰＥＧ化された状態を保つ。ＰＲＯ５９３、ＰＲＯ５９４及びＰＲＯ５９５の場合には、すべての鎖間ジスルフィド結合が除去され、ＰＥＧ化のために新しいシステイン残基が導入される。ＰＲＯ５９３は、重鎖のＣ末端にシステインが導入されているのに対して、ＰＲＯ５９４及びＰＲＯ５９５はそれぞれ、ＦｃドメインとＶＥＧＦトラップドメインの間のリンカードメインにシステインが導入されている。合わせて、これらのバリアントは、ＰＥＧ化効率、抗原結合及び生物活性について試験された多様なＰＥＧ化部位を有する一組の構築物となる。Ｅｘｐｉ２９３一過性発現系を使用して、各ＩＧＴ－４２７バリアントを発現させた。清澄化した細胞培養上清をＨｉＴｒａｐ ｍＡｂｓｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡカラム（Ｃｙｔｉｖａ）で精製した。溶出した抗体を１×ＰＢＳ中に透析し、ＰＥＧ化研究のために１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【0214】
［実施例１６］
ＰＥＧ化反応スクリーニング
１０ｍｇ／ｍＬのＩＧＴ－４２７バリアントのそれぞれを１０又は２０ｍＭシステアミンで、室温で１時間還元し、次いでＰＥＧ化緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に緩衝液交換した。緩衝液交換した抗体に１０モル当量の２０ｋＤａ直鎖状ＰＥＧ－マレイミドを加え、室温で１．５時間ＰＥＧ化反応を進行させた。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって反応混合物を分析すると、これらのバリアントは、二重にＰＥＧ化された種への、最大で約５０％の転化を示すことが明らかになった。
ＰＥＧ化反応スクリーニング
１０ｍｇ／ｍＬのＩＧＴ－４２７バリアントのそれぞれを１０又は２０ｍＭシステアミンで、室温で１時間還元し、次いでＰＥＧ化緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に緩衝液交換した。緩衝液交換した抗体に１０モル当量の２０ｋＤａ直鎖状ＰＥＧ－マレイミドを加え、室温で１．５時間ＰＥＧ化反応を進行させた。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって反応混合物を分析すると、これらのバリアントは、二重にＰＥＧ化された種への、最大で約５０％の転化を示すことが明らかになった。
【0215】
ＰＥＧ化効率をさらに最適化するために、穏やかな還元条件下で最も優れた転化を示したバリアントであるＰＲＯ５９３を使用して還元条件をスクリーニングした。１０若しくは１００ｍＭのシステアミンで１時間、１若しくは１０ｍＭのＤＴＴで１５分間、又は２若しくは２０倍モル過剰のＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）で１５分間、１０ｍｇ／ｍＬのＰＲＯ５９３を還元した。それぞれの還元後、ＰＲＯ５９３をＰＥＧ化緩衝液に緩衝液交換し、１０倍モル過剰の２０ｋＤａ直鎖状ＰＥＧ－マレイミドで１．５時間ＰＥＧ化した。この一連の還元条件から、２０倍モル過剰のＴＣＥＰが、２つのＰＥＧ付加を有する種へのＰＲＯ５９３のほぼ完全な転化をもたらしたことが観察された。次いで、室温で１５分間、２０倍モル過剰のＴＣＥＰで５つのＩＧＴ－４２７バリアントすべてを還元し、続いてＰＥＧ化緩衝液に緩衝液交換し、１０倍モル過剰の２０ｋＤａ直鎖状ＰＥＧ－マレイミドでＰＥＧ化した。最適化された反応条件の結果を図１４に示す。ＨｉＴｒａｐ ＳＰ－ＨＰ陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｃｙｔｉｖａ）及びグラジエント塩溶出を使用して、２つのＰＥＧ付加を有する抗体を反応混合物から精製した。ＰＥＧ化抗体を１×ＰＢＳ中に透析し、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．０１％ポリソルベート－２０とともに製剤化し、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【0216】
［実施例１７］
ＰＥＧ化ＩＧＴ－４２７バリアントの特徴付け
Ｔｉｅ２又はＶＥＧＦの結合をＳＰＲによって特徴付けた（図１５）。固定化されたＴｉｅ２又はＶＥＧＦを含有する表面上に、３０μＬ／分で３００秒間、各抗体の１００ｎＭ溶液を注入した。３００秒後の相対結合シグナルを使用して、結合の差を決定した。
ＰＥＧ化ＩＧＴ－４２７バリアントの特徴付け
Ｔｉｅ２又はＶＥＧＦの結合をＳＰＲによって特徴付けた（図１５）。固定化されたＴｉｅ２又はＶＥＧＦを含有する表面上に、３０μＬ／分で３００秒間、各抗体の１００ｎＭ溶液を注入した。３００秒後の相対結合シグナルを使用して、結合の差を決定した。
【0217】
［実施例１８］
眼のＰＫ研究
ＩＧＴ－４２７の眼の薬物動態に対するＰＥＧ化及びＰＥＧ分子量の効果を評価するために、アイリーア（Ｒ）、ファリシマブ、ＩＧＴ－４２７、（２×２０ｋＤａ ＰＥＧ）－ＩＧＴ－４２７及び（２×４０ｋＤａ ＰＥＧ）－ＩＧＴ－４２７の５００μｇ硝子体内注射を雄のニュージーランドホワイトウサギに投与した。各被験物質群について、３匹又は４匹の動物が０日目に投薬された。投薬後１日目、３日目、７日目及び１４日目に、３匹又は４匹のいずれかの動物から血液を採取し、次いで、静脈内バルビツレート過量投与によって安楽死させた後、両眼を採取し、液体窒素中で急速凍結し、房水、硝子体液、網膜及び脈絡膜の採取のために解剖した。ホモイナイズせずに硝子体液試料を１×ＰＢＳＴで１：５希釈し、さらなる分析まで－７０℃で保存した。
眼のＰＫ研究
ＩＧＴ－４２７の眼の薬物動態に対するＰＥＧ化及びＰＥＧ分子量の効果を評価するために、アイリーア（Ｒ）、ファリシマブ、ＩＧＴ－４２７、（２×２０ｋＤａ ＰＥＧ）－ＩＧＴ－４２７及び（２×４０ｋＤａ ＰＥＧ）－ＩＧＴ－４２７の５００μｇ硝子体内注射を雄のニュージーランドホワイトウサギに投与した。各被験物質群について、３匹又は４匹の動物が０日目に投薬された。投薬後１日目、３日目、７日目及び１４日目に、３匹又は４匹のいずれかの動物から血液を採取し、次いで、静脈内バルビツレート過量投与によって安楽死させた後、両眼を採取し、液体窒素中で急速凍結し、房水、硝子体液、網膜及び脈絡膜の採取のために解剖した。ホモイナイズせずに硝子体液試料を１×ＰＢＳＴで１：５希釈し、さらなる分析まで－７０℃で保存した。
【0218】
ザルトラップ（Ｒ）を商業的供給源から購入し、アイリーア（Ｒ）製剤緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３％ポリソルベート－２０、５％スクロース）に対して透析し、同じ緩衝液で１０ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【0219】
Ｅｘｐｉ２９３一過性発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ファリシマブを発現させた。内毒素を除去するために２％エタノール洗浄を含むＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡカラム（Ｃｙｔｉｖａ）で、清澄化した細胞培養上清を精製し、続いて不完全に組み立てられた抗体を除去するためにｐＨ勾配溶出を行った。溶出した抗体を１×ＰＢＳ中に透析し、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．０１％ポリソルベート－２０とともに製剤化し、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【0220】
Ｅｘｐｉ２９３一過性発現系を使用して、ＩＧＴ－４２７を発現させた。内毒素を除去するために２％エタノール洗浄を含むＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡカラム（Ｃｙｔｉｖａ）で、清澄化した細胞培養上清を精製した。溶出した抗体を１×ＰＢＳ中に透析し、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．０１％ポリソルベート－２０とともに製剤化し、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【0221】
ペグ化ＩＧＴ－４２７。Ｅｘｐｉ２９３一過性発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＰＲＯ５９３を発現させた。内毒素を除去するために２％エタノール洗浄を含むＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡカラム（Ｃｙｔｉｖａ）で、清澄化した細胞培養上清を精製した。溶出した抗体を１×ＰＢＳ中に透析し、ＰＥＧ化のために１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮された抗体を２０倍モル過剰のＴＣＥＰで還元し、次いでＰＥＧ化緩衝液に脱塩し、１０倍モル過剰の２０ｋＤａ直鎖状又は４０ｋＤａ分枝状ＰＥＧマレイミドのいずれかとともに、室温で１．５時間インキュベートした。ＮａＣｌ勾配を用いてｐＨ４．６でＨｉＴｒａｐ ＳＰ－ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、ＰＥＧ化反応混合物を精製した。溶出中のＰＥＧ化抗体をＰＢＳ中に透析し、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．０１％ポリソルベート－２０とともに製剤化し、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【0222】
［実施例１９］
ＰＫ研究用の試料の特徴付け
５μｇのタンパク質を４×ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）と混合し、４～１２％のビス－トリスゲル上で、１５０Ｖで６０分間、加熱せずに試料を泳動し、続いてＳａｆｅＳｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色することによって、各被験物質の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。１００ｍＭアルギニン、１×ＰＢＳ、ｐＨ６．７中、０．５ｍＬ／分でＺｅｎｉｘ（Ｒ）サイズ排除カラム（ＳＥＣ）－３００に５μｇの各被験物質をロードすることによって、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を行った。ウサギＴｉｅ２及びＶＥＧＦへの結合をＳＰＲによって特徴付けた。
ＰＫ研究用の試料の特徴付け
５μｇのタンパク質を４×ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）と混合し、４～１２％のビス－トリスゲル上で、１５０Ｖで６０分間、加熱せずに試料を泳動し、続いてＳａｆｅＳｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色することによって、各被験物質の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。１００ｍＭアルギニン、１×ＰＢＳ、ｐＨ６．７中、０．５ｍＬ／分でＺｅｎｉｘ（Ｒ）サイズ排除カラム（ＳＥＣ）－３００に５μｇの各被験物質をロードすることによって、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を行った。ウサギＴｉｅ２及びＶＥＧＦへの結合をＳＰＲによって特徴付けた。
【0223】
ＳＰＲを使用して、Ｔｉｅ２又はＶＥＧＦのいずれかへのＰＥＧ化ＩＧＴ－４２７バリアントの結合を評価した。図３は、ヒトＴｉｅ２又はＶＥＧＦ表面上へのバリアントの１００ｎＭ注射から得られたセンサーグラムを示す。非修飾ＩＧＴ－４２７と比較して、ＰＥＧの存在に起因する結合シグナルの劇的な低下が存在する。しかしながら、残りのバリアントに対する各バリアントの相対的結合シグナルは、抗原に対する相対的親和性の尺度として使用することができる。各バリアントの結合シグナルにはわずかな差が存在するが、総じて、Ｔｉｅ２又はＶＥＧＦのいずれかへの結合はＰＥＧ化部位とは概ね無関係である。
【0224】
すべての被験物質は１０ｍｇ／ｍＬで製剤化され、１５％の高分子量種を含有した２０ｋＤａのＰＥＧ化ＩＧＴ－４２７を除いて、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（図１６）及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図１７）によって９０％超の純度であった。内毒素レベルはすべて０．１ＥＵ／ｍｇ未満であり、すべての被験物質は予想された親和性でそれらのそれぞれの抗原を結合した（図１８Ａ～１８Ｃ）。
【0225】
［実施例２０］
硝子体液測定のための総薬物ＥＬＩＳＡ
投与された薬物に応じて、３つの異なるＥＬＩＳＡによって、硝子体液中の総薬物レベルを定量した。ＩＧＴ－４２７及びＩＧＴ－４２７のＰＥＧ化バージョンをマウス抗ヒトＩｇＧ被覆プレート上に捕捉し、Ｔｉｅ２－ＨＲＰコンジュゲートで検出した。アイリーア（Ｒ）をマウス抗ヒトＩｇＧ被覆プレート上に捕捉し、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートで検出した。最後に、ファリシマブをＶＥＧＦ被覆プレート上に捕捉し、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートで検出した。すべてのＥＬＩＳＡ分析について、試料を１：１２５０～１：６２５００希釈で、２つ組でアッセイし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｒ）Ｍ５プレートリーダーを使用してアッセイプレートの発光を読み取った。すべてのＥＬＩＳＡ分析について、試料発光値は標準曲線の線形範囲内であった。４パラメータ式を使用して標準曲線全体をフィッティングし、４パラメータフィットによって試料発光値を濃度に変換した。
硝子体液測定のための総薬物ＥＬＩＳＡ
投与された薬物に応じて、３つの異なるＥＬＩＳＡによって、硝子体液中の総薬物レベルを定量した。ＩＧＴ－４２７及びＩＧＴ－４２７のＰＥＧ化バージョンをマウス抗ヒトＩｇＧ被覆プレート上に捕捉し、Ｔｉｅ２－ＨＲＰコンジュゲートで検出した。アイリーア（Ｒ）をマウス抗ヒトＩｇＧ被覆プレート上に捕捉し、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートで検出した。最後に、ファリシマブをＶＥＧＦ被覆プレート上に捕捉し、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートで検出した。すべてのＥＬＩＳＡ分析について、試料を１：１２５０～１：６２５００希釈で、２つ組でアッセイし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｒ）Ｍ５プレートリーダーを使用してアッセイプレートの発光を読み取った。すべてのＥＬＩＳＡ分析について、試料発光値は標準曲線の線形範囲内であった。４パラメータ式を使用して標準曲線全体をフィッティングし、４パラメータフィットによって試料発光値を濃度に変換した。
【0226】
抗ヒトＩｇＧ捕捉／Ｔｉｅ２検出ＥＬＩＳＡ。炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中の１μｇ／ｍＬ抗ヒトＩｇＧを使用して、４℃で一晩、高結合プレートをコーティングした。コーティングしたプレートを洗浄緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１×ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ＴＷＥＥＮ（Ｒ）２０））で洗浄し、ＰＢＳＴ中５％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロッキングした（４２０ＲＰＭで振盪）。ブロッキングしたプレートを洗浄し、試料、標準曲線及びブランクを室温で１．５時間プレート上でインキュベートした（４２０ＲＰＭで振盪）。試料のインキュベーション後、プレートを洗浄し、室温で１時間、１μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＴｉｅ２とともにインキュベートした（蓋をして、４２０ＲＰＭで振盪）。プレートを再度洗浄し、遮光してストレプトアビジン－ＨＲＰと１時間インキュベートした。プレートに最後の洗浄を行い、次いで、化学発光ＨＲＰ基質で発色させた。３０秒後にすべての発光波長をプレートリーダーで読み取った。
【0227】
抗ヒトＩｇＧ捕捉／抗ｈｕＦｃ検出ＥＬＩＳＡ。炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中の１μｇ／ｍＬ抗ヒトＩｇＧを使用して、４℃で一晩、高結合プレートをコーティングした。コーティングしたプレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡを用いて４℃で４時間ブロッキングした。ブロッキングしたプレートを洗浄し、最終洗浄後にプレートを４℃で乾燥させた。試料、標準曲線及びブランクをプレート上で、４℃で一晩インキュベートした。試料のインキュベーション後、プレートを洗浄し、室温で１時間、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした（蓋をして、４２０ＲＰＭで振盪）。プレートに最後の洗浄を行い、次いで、化学発光ＨＲＰ基質で発色させた。３０秒後にすべての発光波長をプレートリーダーで読み取った。
【0228】
ＶＥＧＦ捕捉／抗ｈｕＦｃ検出ＥＬＩＳＡ。炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中の１μｇ／ｍＬのＶＥＧＦを使用して、４℃で一晩、高結合プレートをコーティングした。コーティングしたプレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡを用いて４℃で４時間ブロッキングした。ブロッキングしたプレートを洗浄し、最終洗浄後にプレートを４℃で乾燥させた。試料、標準曲線及びブランクをプレート上で、４℃で一晩インキュベートした。試料のインキュベーション後、プレートを洗浄し、室温で１時間、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした（蓋をして、４２０ＲＰＭで振盪）。プレートに最後の洗浄を行い、次いで、化学発光ＨＲＰ基質で発色させた。３０秒後にすべての発光波長をプレートリーダーで読み取った。
【0229】
［実施例２１］
眼のＰＫの測定
投薬後１、３、７及び１４日目に、硝子体液中で各被験物質の総薬物レベルを測定した。各時点で、３匹又は４匹の動物から眼を採取し、１時点当たり被験物質当たり６つ又は８つのいずれかの硝子体液試料を得た。抗ヒトＩｇＧ捕捉及びＴｉｅ２検出ＥＬＩＳＡによって、ＩＧＴ－４２７又はＰＥＧ化ＩＧＴ－４２７を投薬された動物からの総薬物レベルを定量した。抗ヒトＩｇＧ捕捉及び抗ヒトＦｃ検出ＥＬＩＳＡによって、アイリーア（Ｒ）を投薬された動物からの総薬物レベルを定量した。最後に、ＶＥＧＦ捕捉及び抗ヒトＦｃ検出ＥＬＩＳＡによって、ファリシマブを投薬された動物からの総薬物レベルを定量した。これらのＥＬＩＳＡのそれぞれの結果を図１９に示す。硝子体内でアイリーア（Ｒ）を測定し、４３３．８μｇ／ｍＬのＣｍａｘ値及び４．２日の半減期であった。硝子体内でファリシマブを測定し、１５４．２μｇ／ｍＬのＣｍａｘ及び４．４日の半減期での崩壊であった。硝子体内でＩＧＴ－４２７を測定し、２１７．３μｇ／ｍＬのＣｍａｘ値及び３．８日の半減期であった。硝子体内で２つの２０ｋＤａの直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＩＧＴ－４２７を測定し、４０６．６μｇ／ｍＬのＣｍａｘ及び８．３日の半減期での崩壊であった。硝子体内で２つの４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧ分子で修飾されたＩＧＴ－４２７を測定し、２６８．８μｇ／ｍＬのＣｍａｘ値及び８．０日の半減期であった。
眼のＰＫの測定
投薬後１、３、７及び１４日目に、硝子体液中で各被験物質の総薬物レベルを測定した。各時点で、３匹又は４匹の動物から眼を採取し、１時点当たり被験物質当たり６つ又は８つのいずれかの硝子体液試料を得た。抗ヒトＩｇＧ捕捉及びＴｉｅ２検出ＥＬＩＳＡによって、ＩＧＴ－４２７又はＰＥＧ化ＩＧＴ－４２７を投薬された動物からの総薬物レベルを定量した。抗ヒトＩｇＧ捕捉及び抗ヒトＦｃ検出ＥＬＩＳＡによって、アイリーア（Ｒ）を投薬された動物からの総薬物レベルを定量した。最後に、ＶＥＧＦ捕捉及び抗ヒトＦｃ検出ＥＬＩＳＡによって、ファリシマブを投薬された動物からの総薬物レベルを定量した。これらのＥＬＩＳＡのそれぞれの結果を図１９に示す。硝子体内でアイリーア（Ｒ）を測定し、４３３．８μｇ／ｍＬのＣｍａｘ値及び４．２日の半減期であった。硝子体内でファリシマブを測定し、１５４．２μｇ／ｍＬのＣｍａｘ及び４．４日の半減期での崩壊であった。硝子体内でＩＧＴ－４２７を測定し、２１７．３μｇ／ｍＬのＣｍａｘ値及び３．８日の半減期であった。硝子体内で２つの２０ｋＤａの直鎖状ＰＥＧ分子で修飾されたＩＧＴ－４２７を測定し、４０６．６μｇ／ｍＬのＣｍａｘ及び８．３日の半減期での崩壊であった。硝子体内で２つの４０ｋＤａの分枝状ＰＥＧ分子で修飾されたＩＧＴ－４２７を測定し、２６８．８μｇ／ｍＬのＣｍａｘ値及び８．０日の半減期であった。
【産業上の利用可能性】
【0230】
Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦに結合する融合タンパク質は、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦに高い親和性で結合し、ヒト、マウス及びウサギに対する交差反応性を維持し、所望の抗原反応性を示すことができる。さらに、Ｔｉｅ２リン酸化、Ｔｉｅ２受容体の活性化及びＶＥＧＦの阻害を誘導することによって、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦに結合する融合タンパク質は、目的の血管新生疾患又は血管疾患を予防又は処置するために使用され得る。
【0231】
均等物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、本発明者らが企図する最良の態様を記載する。しかしながら、前述の内容がいかに詳細に文章で記載されていても、実施形態は多くの様式で実施され得、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
前述の明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、本発明者らが企図する最良の態様を記載する。しかしながら、前述の内容がいかに詳細に文章で記載されていても、実施形態は多くの様式で実施され得、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【0232】
少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前に存在する場合、それらの用語は、リストに提供された値又は範囲のすべてを修飾する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含み得る。任意の記載された範囲は、反対のことを明示する文言が存在しなければ、端点を含み、例えば、「５～５０」は、値５及び５０を包含する。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19-1】
【図19-2】
【図19-3】
【配列表】
【国際調査報告】