特表 2025-504204 ヒト誘導性間葉系幹細胞を生成するための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-06

(54)【発明の名称】ヒト誘導性間葉系幹細胞を生成するための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20250130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250130BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20250130BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0775

C12N5/10

C12N5/0735

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024547071

(86)(22)【出願日】2023-02-06

(85)【翻訳文提出日】2024-08-06

(86)【国際出願番号】 IB2023000071

(87)【国際公開番号】W WO2023148556

(87)【国際公開日】2023-08-10

(31)【優先権主張番号】63/307,368

(32)【優先日】2022-02-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524295191

【氏名又は名称】スマートセラ ソリューションズ エービー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100227329

【弁理士】

【氏名又は名称】延原 愛

(72)【発明者】

【氏名】ヤング，ラン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ケネス，アール．

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BA01

4B065BB04

4B065CA44

(57)【要約】

ヒト誘導性間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）をヒト多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞）から生成するための方法を提供する。ｉＭＳＣの前駆細胞は、最初に２ステッププロトコルにおいて生成され、さらに第３ステップ培養によりｉＭＳＣへの分化が達成される。ｉＭＳＣは間葉系表面マーカーを発現し、脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞への三系列分化を示す。また、培養基、ｉＭＳＣから細胞外小胞を単離する方法、及びキットも提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む培養基中で少なくとも２日間培養して、誘導性細胞を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で少なくとも１０日間培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することとを含む、前記方法。

【請求項2】

ステップ（ａ）が、前記ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む前記培養基中で０日目から４日目まで培養して、誘導性細胞を生成することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）からの前記誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で４日目から１４日目まで培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＷＮＴ経路アゴニストがグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３）阻害剤である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＷＮＴ経路アゴニストがＣＨＩＲ９８０１４である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＡＺＤ１０８０、ＷＮＴ３Ａ、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．２５～０．７５μＭの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．５μＭの濃度で前記培養基中に存在する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９８０１４である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストがトリアゾロ－ジアゼピン化合物である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記トリアゾロ－ジアゼピン化合物が（＋）－ＪＱ１である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、（＋）－ＪＱ１、ＴＥＮ－０１０、ＯＴＸ０１５、Ｉ－ＢＥＴ７６２、Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＢＡＹ１２３８０９７、ＡＢＢＶ－７４４、ＡＢＢＶ－０７５、ｉＢＥＴ－ＢＤ１、ｉＢＥＴ－ＢＤ２、ＳＪ４３２、ＲＶＸ－２０８、ＭＳ４１７、ＡＺＤ５１５３、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、２５～７５ｎＭの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、５０ｎＭの濃度の（＋）－ＪＱ１である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ＰＤＧＦ経路アゴニストがＰＤＧＦ－ＢＢである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

ＰＤＧＦ－ＢＢが、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ＰＤＧＦ－ＢＢが、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記ＩＧＦ１経路アゴニストがＩＧＦ１である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

ＩＧＦ１が、１５～２５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ＩＧＦ１が、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストがＦＧＦ－ベータである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

ＦＧＦ－ベータが、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ＦＧＦ－ベータが、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）の前記培養基が、血清を含む基本培地を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

血清を含む前記基本培地が、１０～１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を少なくとも７日間、Ｌ－グルタミンサプリメントを含む基本培地を含む培養基中で培養することをさらに含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記Ｌ－グルタミンサプリメントがＬ－アラニン－Ｌ－グルタミンジペプチドである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

Ｌ－グルタミンサプリメントを含む前記基本培地が、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

ヒト誘導性間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）を生成する方法であって、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む培養基中で少なくとも２日間培養して、誘導性細胞を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で少なくとも１０日間培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を、基本培地と、Ｌ－グルタミンサプリメントとを含む培養基中で少なくとも７日間培養して、ｉＭＳＣを生成することとを含む、前記方法。

【請求項31】

ステップ（ａ）が、前記ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む前記培養基中で０日目から４日目まで培養して、誘導性細胞を生成することを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）からの前記誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で４日目から１４日目まで培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

ステップ（ｃ）が、前記ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を少なくとも１４日間、前記基本培地及びＬ－グルタミンサプリメント中で培養することを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項34】

前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記ｉＭＳＣが、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、及びこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の表面マーカーを発現する、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記ｉＭＳＣが、脂肪細胞、骨細胞、または軟骨細胞へのさらなる分化が可能である、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＷＮＴ経路アゴニストがグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３）阻害剤である、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記ＷＮＴ経路アゴニストがＣＨＩＲ９８０１４である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＡＺＤ１０８０、ＷＮＴ３Ａ、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．２５～０．７５μＭの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．５μＭの濃度で前記培養基中に存在する、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９８０１４である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストがトリアゾロ－ジアゼピン化合物である、請求項３０～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記トリアゾロ－ジアゼピン化合物が（＋）－ＪＱ１である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、（＋）－ＪＱ１、ＴＥＮ－０１０、ＯＴＸ０１５、Ｉ－ＢＥＴ７６２、Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＢＡＹ１２３８０９７、ＡＢＢＶ－７４４、ＡＢＢＶ－０７５、ｉＢＥＴ－ＢＤ１、ｉＢＥＴ－ＢＤ２、ＳＪ４３２、ＲＶＸ－２０８、ＭＳ４１７、ＡＺＤ５１５３、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項３０～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、２５～７５ｎＭの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、５０ｎＭの濃度の（＋）－ＪＱ１である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記ＰＤＧＦ経路アゴニストがＰＤＧＦ－ＢＢである、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

ＰＤＧＦ－ＢＢが、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

ＰＤＧＦ－ＢＢが、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

前記ＩＧＦ１経路アゴニストがＩＧＦ１である、請求項３０～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

ＩＧＦ１が、１５～２５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

ＩＧＦ１が、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

前記ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストがＦＧＦ－ベータである、請求項３０～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

ＦＧＦ－ベータが、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

ＦＧＦ－ベータが、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の前記培養基が、血清を含む基本培地を含む、請求項３０～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

血清を含む前記基本培地が、１０～１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記Ｌ－グルタミンサプリメントがＬ－アラニン－Ｌ－グルタミンジペプチドである、請求項３０～５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

ステップ（ｃ）のＬ－グルタミンサプリメントを含む前記基本培地が、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記ｉＭＳＣにより生成される細胞外小胞を培養物から単離することをさらに含む、請求項３０～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を得るための２段階培養基であって、（ｉ）ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む第１段階培地、及び（ｉｉ）ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む第２段階培地を含む、前記２段階培養基。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２２年２月７日に出願された米国仮出願第６３／３０７，３６８号に対する優先権を主張する。先行出願の内容は、参照により全体として本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、自己再生能力を有し多系統分化も示す非造血性の成体幹細胞である。ＭＳＣは、様々な組織（例えば、臍帯、骨髄、及び脂肪組織、ならびに羊水、月経血、及び子宮内膜）から単離することができる。ＭＳＣは、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、及び脂肪細胞を含む様々な細胞タイプに分化することができる多能性間質細胞である。また、ＭＳＣは免疫調節効果（免疫調節分子（例えば、サイトカイン）の産生能力を含む）を有することも示されている。ＭＳＣは、その多能性特性により、臨床応用において想定される開発を行う上で魅力的な選択肢となっている。

【0003】

しかし、ｅｘ ｖｉｖｏで単離された成体ＭＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで精力的に拡大するには、経時的な可塑性及び効力の低下、ならびにＤＮＡ異常及び複製老化の蓄積を含めて多数の制約が存在する（例えば、Ｒｏｍｂｏｕｔｓ ａｎｄ Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ（２００３）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １７：１６０－１７０；Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：１０９５－１１０３；Ｋｙｒｉａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９３：１４５７－１４６５；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３３２２５を参照）。さらに、ドナー及び組織供給源にわたって細胞の質にばらつきがあることにより、ＭＳＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の報告は一貫性がない（例えば、Ｗａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｈｏ（２００７）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．３：２３９－２４８；Ｇａｌｉｐｅａｕ（２０１３）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １５：２－８；Ｋｉｍｂｒｅｌ（２０１４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ．２３：１６１１－１６２４；Ｔｙｎｄａｌｌ（２０１４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１０：１１７－１２４を参照）。したがって、当技術分野では、信頼性及び一貫性がより高いＭＳＣの供給源が依然必要とされている。

【0004】

他の幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＳＣを生成する試みも行われている。例えば、ヒト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からＭＳＣを生成するためのアプローチについて説明されている（例えば、Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ．２３：１０８４－１０９６；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ１００２８５；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．６：１４４；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｕｒｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．１１：１２２－１３０；Ｓｐｉｔｚｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２７：１７０２－１７１４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３６：９０３－９１４；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＆ Ｄｉｓｅａｓｅ １０：７１８；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３７：７５４－７６５；Ｓｐｉｔｚｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．１０：１００を参照）。このような細胞は、当技術分野ではｉＰＳＣ－ＭＳＣと称される。

【0005】

いくらかの進歩が見られるものの、培養下でヒト多能性幹細胞からヒト誘導性間葉系幹細胞を生成するための効率的かつロバストな方法及び組成物は依然必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、わずか２１日間の培養でｉＭＳＣを生成する３ステッププロトコルを用いて、ヒト多能性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）からヒト誘導性間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）及びその前駆細胞を生成する方法を提供する。本開示では最初に、わずか１４日間の培養でｉＭＳＣ前駆細胞を得ることを可能にする２ステッププロトコルを提供する。第３ステップは、少なくとも７日以上さらに培養することにより、間葉系表面マーカーを発現し、適切な細胞特異的分化条件下のさらなる培養で脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞への三系列分化能を有する、成熟ｉＭＳＣを得ることを可能にする。また、ｉＭＳＣは免疫調節能力も示す。本開示の方法は、ｉＭＳＣ前駆細胞、ならびに成熟ｉＭＳＣ、及びｉＭＳＣから得られるさらなる分化細胞を得るために使用することができる。

【0007】

したがって、１つの態様において、本開示は、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む培養基中で少なくとも２日間（または少なくとも３日間もしくは４日間）、例えば、０日目から４日目まで培養して、誘導性細胞を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で少なくとも１０日間（または少なくとも１１、１２、１３、もしくは１４日間）、例えば、４日目から１４日目まで培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することとを含む、方法に関する。

【0008】

諸実施形態において、ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞である。

【0009】

諸実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３）阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９８０１４）である。諸実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストは、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＡＺＤ１０８０、ＷＮＴ３Ａ、及びこれらの組合せからなる群より選択される。諸実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストは、０．２５～０．７５μＭの範囲内の濃度で培養基中に存在する。諸実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストは、０．５μＭの濃度で培養基中に存在する。諸実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストは、０．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９８０１４である。

【0010】

諸実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストはトリアゾロ－ジアゼピン化合物（例えば、（＋）－ＪＱ１）である。諸実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストは、（＋）－ＪＱ１、ＴＥＮ－０１０、ＯＴＸ０１５、Ｉ－ＢＥＴ７６２、Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＢＡＹ１２３８０９７、ＡＢＢＶ－７４４、ＡＢＢＶ－０７５、ｉＢＥＴ－ＢＤ１、ｉＢＥＴ－ＢＤ２、ＳＪ４３２、ＲＶＸ－２０８、ＭＳ４１７、ＡＺＤ５１５３、及びこれらの組合せからなる群より選択される。諸実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストは、２５～７５ｎＭの範囲内の濃度で培養基中に存在する。１つの実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストは５０ｎＭの濃度の（＋）－ＪＱ１である。

【0011】

諸実施形態において、ＰＤＧＦ経路アゴニストはＰＤＧＦ－ＢＢである。諸実施形態において、ＰＤＧＦ－ＢＢは、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で培養基中に存在する。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ経路アゴニストはＰＤＧＦ－ＢＢであり、これは培養基中に１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0012】

諸実施形態において、ＩＧＦ１経路アゴニストはＩＧＦ１である。諸実施形態において、ＩＧＦ１は、１５～２５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で培養基中に存在する。１つの実施形態において、ＩＧＦ１経路アゴニストはＩＧＦ１であり、これは培養基中に２０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0013】

諸実施形態において、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストはＦＧＦ－ベータである。諸実施形態において、ＦＧＦ－ベータは、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で培養基中に存在する。１つの実施形態において、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストはＦＧＦ－ベータであり、これは培養基中に１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。

【0014】

諸実施形態において、この方法のステップ（ａ）及びステップ（ｂ）の培養基は、血清を含む基本培地を含む。１つの実施形態において、血清を含む基本培地は、１０～１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

【0015】

１つの実施形態において、この方法はさらに、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を少なくとも７日間（例えば、１４日間以上）、Ｌ－グルタミンサプリメントを含む基本培地を含む培養基中で培養することを含む。１つの実施形態において、Ｌ－グルタミンサプリメントはＬ－アラニン－Ｌ－グルタミンジペプチドである。１つの実施形態において、Ｌ－グルタミンサプリメントを含む基本培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

【0016】

別の態様において、本開示は、ヒト誘導性間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）を生成する方法であって、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む培養基中で少なくとも２日間（または少なくとも３日間、もしくは４日間）、例えば、０日目から４日目まで培養して、誘導性細胞を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で少なくとも１０日間（または少なくとも１１、１２、１３、もしくは１４日間）、例えば、４日目から１４日目まで培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）からのヒト間葉系幹細胞前駆細胞を、基本培地と、Ｌ－グルタミンサプリメントとを含む培養基中で少なくとも７日間培養して、ｉＭＳＣを生成することとを含む、方法に関する。

【0017】

諸実施形態において、ステップ（ｃ）は、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を７日間より長く、例えば、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、または少なくとも２８日間もしくはそれ以上の間、基本培地及びＬ－グルタミンサプリメント中で培養することを含む。

【0018】

諸実施形態において、ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞である。

【0019】

諸実施形態において、ステップ（ｃ）で生成されるｉＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、及びこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の表面マーカーを発現する。

【0020】

諸実施形態において、ステップ（ｃ）で生成されるｉＭＳＣは、脂肪細胞、骨細胞、または軟骨細胞へのさらなる分化が可能である。

【0021】

好適なＷＮＴ経路アゴニスト、ＢＥＴ経路アンタゴニスト、ＰＤＧＦ経路アゴニスト、ＩＧＦ１経路アゴニスト、及びＦＧＦ－ベータ経路アゴニスト、ならびにこれらの濃度については、上記及び本明細書でさらに説明する。

【0022】

諸実施形態において、ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の培養基は、血清を含む基本培地を含む。諸実施形態において、血清を含む基本培地は、１０～１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

【0023】

諸実施形態において、ステップ（ｃ）で使用されるＬ－グルタミンサプリメントはＬ－アラニン－Ｌ－グルタミンジペプチドである。１つの実施形態において、ステップ（ｃ）のＬ－グルタミンサプリメントを含む基本培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

【0024】

また別の態様において、この方法は、ステップ（ｃ）の後、ｉＭＳＣにより生成される細胞外小胞を培養物から単離することを含む。追加または代替として、ｉＭＳＣ前駆細胞により生成される細胞外小胞をステップ（ｂ）の後に単離してもよい。

【0025】

また別の態様において、本開示は、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を得るための２段階培養基であって、（ｉ）ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む第１段階培地、及び（ｉｉ）ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む第２段階培地を含む、２段階培養基に関する。好適なＷＮＴ経路アゴニスト、ＢＥＴ経路アンタゴニスト、ＰＤＧＦ経路アゴニスト、ＩＧＦ１経路アゴニスト、及びＦＧＦ－ベータ経路アゴニスト、ならびにこれらの濃度については、上記及び本明細書でさらに説明する。

【0026】

本発明における他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】本開示の代表的な３段階ｉＭＳＣ分化プロトコルの模式図である。

【図2】ｉＭＳＣ分化プロトコル中の細胞の形態を示す写真である。Ａ（左右のパネル）は中胚葉期の細胞を示している。Ｂは、低密度（１０倍）（左パネル）または高密度（５倍）（右パネル）における間葉期の細胞を示している。

【図3】陽性ＭＳＣマーカー（Ａ）及び陰性ＭＳＣマーカー（Ｂ）のＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。試験したマーカーはグラフの上に示されている。陰性カクテルには抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ４５、抗ＨＬＡ－ＤＲの各抗体が含まれていた。

【図4】脂肪細胞（Ａ）、骨細胞（Ｂ）、または軟骨細胞（Ｃ）に分化した後のｉＭＳＣの形態を示す写真である。

【図5】免疫刺激物質（ｄｓ－ＲＮＡまたはＩＦＮｒ）で処理することによりｉＭＳＣの免疫調節遺伝子の発現が増加することを示す棒グラフである。

【図6】ｈＰＢＭＣのみ（左パネル）、ｈＰＢＭＣ＋不活性化ｉＭＳＣ（中パネル）、またはｈＰＢＭＣ＋活性化ＭＳＣ（右パネル）を用いた混合リンパ球反応の結果を示すグラフである。結果は、ｈＰＢＭＣの増殖を示している。

【図7】低用量または高用量のＩＦＮｒで処理したｉＭＳＣによるＩＬ－１０分泌についてのＥＬＩＳＡ試験結果を示す棒グラフである。

【図8】テトラスパニンタンパク質を標的としてｉＭＳＣによる細胞外小胞産生を定量化したＦＡＣＳベース分析の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本明細書では、まずｉＭＳＣ前駆細胞を生成し、次いで成熟ｉＭＳＣにさらに分化させることができるマルチステッププロトコルを用いて、規定された培養条件下でヒト誘導性間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）を生成することを可能にする、方法論及び組成物について説明する。実施例１で説明するように、ヒト多能性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）からｉＭＳＣを生成するための３ステッププロトコル（図１で模式的に示す）を開発した。実施例２で説明するように、ｉＭＳＣは間葉系表面マーカーを発現し、多能性マーカー及び造血マーカーの発現が欠如している。実施例３で説明するように、ｉＭＳＣは、適切な細胞特異的分化条件下で培養すると三系列分化が可能であり、脂肪細胞、骨細胞、または軟骨細胞に成熟する。実施例４で説明するように、ｉＭＳＣは、免疫調節能力（免疫刺激物質で処理したときの免疫調節遺伝子の上方調節、混合リンパ球反応の調節能力、及びインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮｒ）で刺激したときの抗炎症因子の分泌能力を含む）を示す。さらに、実施例５で説明するように、本明細書に記載のｉＭＳＣ及びその前駆細胞は、細胞培養物から採取することができる細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エクソソーム）の供給源である。

【0029】

本発明の様々な態様については、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。

【0030】

Ｉ．細胞
本開示の培養で使用される出発細胞はヒト多能性幹細胞である。本明細書で使用する場合、「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳＣと略記）という用語は、様々な異なる細胞タイプに分化する能力を有するヒト幹細胞を指す。本明細書で使用する場合、「多能性」という用語は、異なる条件下で、３胚葉全て（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）に特徴的な細胞タイプに分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えば、ヌードマウス及び奇形腫形成アッセイを用いて、３胚葉の全てに分化する能力によって主に特徴付けられる。多能性は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）マーカーの発現により証明することもできるものの、好ましい多能性の試験は、３胚葉の各細胞に分化する能力を実証することである。

【0031】

ヒト多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞株）及び誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。ヒト胚性幹細胞株の非限定的な例としては、ＥＳ０３細胞（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）及びＨ９細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５－１１４７）、ならびに低免疫性胚性幹細胞（ｈＥＳＣ ＳＫＯ－ＣＩＩＴＡ、ＳＫＯ－Ｂ２Ｍ、またはＤＫＯを含む）（Ｐｅｔｒｕｓ－Ｒｅｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １４：６４８－６６２）が挙げられる。誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の非限定的な例としては、１９－１１－１、１９－９－７、または６－９－９細胞（例えば、Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：７９７－８０１に記載）、Ｆｏｒｅｓｋｉｎ（クローン１からクローン４）、及びＩＭＲ９０（クローン１からクローン４）（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７－２０）が挙げられる。ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、ＰＳＣとして細胞を識別するために使用することができる細胞マーカーを発現する。多能性幹細胞マーカーの非限定的な例としては、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及び／またはＳＯＸ２が挙げられる。諸実施形態において、本開示の方法により生成される成熟ｉＭＳＣは、多能性幹細胞マーカーＴＲＡ－１－６０の発現が欠如している。

【0032】

多能性幹細胞は、本明細書に記載のように、細胞分化を誘導する培養条件に供される。本明細書で使用する場合、「分化」という用語は、より原始的な段階からより成熟した（すなわち、より原始的でない）細胞に細胞が発達することを指し、典型的には、特定の細胞系列へのコミットメントの表現型特徴を示す。本明細書に記載のｉＭＳＣ分化方法では、最初にｉＭＳＣの前駆細胞を生成し、次に成熟ｉＭＳＣにさらに分化させる。

【0033】

実施例２に記載しているように、分化の方法により生成される成熟ｉＭＳＣは、間葉系表面マーカー（例えば、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、及び／またはＣＤ４４）を発現する。諸実施形態において、ｉＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、及びこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の間葉系表面マーカーを発現する。諸実施形態において、ｉＭＳＣの集団において、生細胞の少なくとも９０％（または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％）が、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、及びこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の間葉系表面マーカーを発現する。

【0034】

また、実施例２に記載しているように、分化法により生成される成熟ｉＭＳＣは、少なくとも１つの多能性幹細胞マーカー（例えば、ＴＲＡ－１－６０）及び／または少なくとも１つの造血細胞マーカー（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及び／またはＨＬＡ－ＤＲ）の発現が欠如している。諸実施形態において、成熟ｉＭＳＣは、ＴＲＡ－１－６０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、及びこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上のマーカーの発現が欠如している。諸実施形態において、ｉＭＳＣの集団において、生細胞の５％未満（または３％未満、または２％未満、または１％未満）が、ＴＲＡ－１－６０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、及びこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の表面マーカーを発現する。

【0035】

ＩＩ．培養基の成分
ヒト誘導性間葉系幹細胞を生成するための本開示の方法は、ヒト多能性幹細胞（例えば、ヒトＥＳＣ）を、細胞受容体及び／またはシグナル伝達経路の特異的アゴニスト及び／またはアンタゴニストを含む培養基中で培養することを含む。

【0036】

マルチステッププロトコル（図１で模式的に示す）における第１のステップ（本明細書ではステップ（ａ）と称される）では、ヒト多能性幹細胞を少なくとも２日間、または少なくとも３日間、または４日間（０日目～４日目）、ＷＮＴ経路アゴニストとＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む誘導培地中で培養する。第２ステップ（本明細書ではステップ（ｂ）と称される）では、ステップ（ａ）からの誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む強化培地中で少なくとも１０日間（または少なくとも１１、１２、１３、もしくは１４日間）、例えば、（４日間の誘導ステップの後に）４日目から１４日目までさらに培養して、ｉＭＳＣ前駆細胞を生成する。最後に、第３ステップ（本明細書ではステップ（ｃ）と称される）では、ステップ（ｂ）からのｉＭＳＣ前駆細胞を、Ｌ－グルタミンサプリメントを含む維持培地中でさらに少なくとも７日間以上培養して、成熟ｉＭＳＣを生成する。

【0037】

本明細書で使用する場合、細胞受容体またはシグナル伝達経路の「アゴニスト」とは、細胞受容体またはシグナル伝達経路を刺激（上方調節）する薬剤を指す。細胞シグナル伝達経路の刺激は、例えば、シグナル伝達経路に関与する細胞表面受容体を活性化するアゴニスト（例えば、アゴニストは受容体リガンドであり得る）を使用することにより、細胞外で開始することができる。追加または代替として、細胞内シグナル伝達の刺激は、例えば、シグナル伝達経路の成分（複数可）と細胞内で相互作用する低分子アゴニストを使用することにより、細胞内で開始することができる。

【0038】

本明細書で使用する場合、細胞シグナル伝達経路の「アンタゴニスト」は、細胞シグナル伝達経路を阻害（下方調節）する薬剤を指すことが意図されている。細胞内シグナル伝達経路の阻害は、例えば、シグナル伝達経路に関与する細胞表面受容体を遮断するアンタゴニストを使用することにより、細胞外で開始することができる。追加または代替として、細胞内シグナル伝達の阻害は、例えば、シグナル伝達経路の成分（複数可）と細胞内で相互作用する低分子アンタゴニストを使用することにより、細胞内で開始することができる。

【0039】

ＷＮＴ経路のアゴニストとしては、カノニカルＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を刺激（上方調節）可能な薬剤、分子、化合物、または物質が挙げられる。この経路は、Ｗｎｔタンパク質リガンドがＦｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体に結合することにより生物学的に活性化される。１つの実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３）阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９８０１４）である。１つの実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストは、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＡＺＤ１０８０、ＷＮＴ３Ａ、及びこれらの組合せからなる群より選択される。１つの実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストは、０．２５～０．７５μＭ、０．３～０．７μＭ、０．４～０．６μＭ、または０．４５～０．５５μＭの範囲内の濃度で培養基中に存在する。１つの実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストは、０．５μＭの濃度で培養基中に存在する。１つの実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストはＣＨＩＲ９８０１４である。１つの実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストはＣＨＩＲ９８０１４であり、これは、０．２５～０．７５μＭ、０．３～０．７μＭ、０．４～０．６μＭ、または０．４５～０．５５μＭの範囲内の濃度で培養基中に存在する。１つの実施形態において、ＷＮＴ経路アゴニストはＣＨＩＲ９８０１４であり、これは培養基中に０．５μＭの濃度で存在する。

【0040】

ＢＥＴ経路のアンタゴニストとしては、ブロモドメイン（複数可）を含むＢＥＴタンパク質（「ブロモドメイン及び末端外モチーフ」タンパク質）を阻害（下方調節）可能な薬剤、分子、化合物、または物質が挙げられる。ブロモドメインは、ｅ－Ｎ－アセチル化リジン残基（Ｋａｃ）を選択的に認識するタンパク質相互作用モジュールである。ヒトＢＥＴファミリー（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、及びＢＲＤＴ）は、いずれも標的ごとに２つの保存されたブロモドメインを含み、成長刺激遺伝子の転写を制御する重要な役割を担っている。

【0041】

１つの実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストはトリアゾロ－ジアゼピン化合物であり、その非限定的な例としては、（＋）－ＪＱ１（例えば、Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４６８：１０６７－１０７３に記載）、ＴＥＮ－０１０（例えば、Ｆｉｎｌｅｙ ａｎｄ Ｃｏｐｅｌａｎｄ（２０１４）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２１：１１９６－１２１０に記載）、ＯＴＸ０１５（例えば、Ｓｅａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２２：２９６８－２９７２に記載）、及び構造的に関連する化合物が挙げられる。１つの実施形態において、トリアゾロ－ジアゼピン化合物は（＋）－ＪＱ１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号ＳＭＬ１５２４）である。他にも様々なＢＥＴ経路アンタゴニストが記載されている（例えば、Ｃｏｃｈｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．１８：６０９－６２８；及びＺａｗａｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８７０－８７９で概説されている）。諸実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストは、（＋）－ＪＱ１、ＴＥＮ－０１０、ＯＴＸ０１５、Ｉ－ＢＥＴ７６２、Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＢＡＹ１２３８０９７、ＡＢＢＶ－７４４、ＡＢＢＶ－０７５、ｉＢＥＴ－ＢＤ１、ｉＢＥＴ－ＢＤ２、ＳＪ４３２、ＲＶＸ－２０８、ＭＳ４１７、ＡＺＤ５１５３、及びこれらの組合せからなる群より選択される。諸実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストは、２５～７５ｎＭ、３０～７０ｎＭ、４０～６０ｎＭ、または４５～５５ｎＭの範囲内の濃度で培養基中に存在する。１つの実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストは、培養基中に５０ｎＭの濃度で存在する。諸実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストは（＋）－ＪＱ１であり、これは２５～７５ｎＭ、３０～７０ｎＭ、４０～６０ｎＭ、または４５～５５ｎＭの範囲内の濃度で培養基中に存在する。１つの実施形態において、ＢＥＴ経路アンタゴニストは５０ｎＭの濃度の（＋）－ＪＱ１である。

【0042】

ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）経路のアゴニストとしては、ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、またはＰＤＧＦ－ＢＢ）とその受容体との結合により開始されるシグナル伝達経路を刺激（上方調節）可能な薬剤、分子、化合物、または物質が挙げられる。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ経路アゴニストはＰＤＧＦ－ＢＢ（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２２０－ＢＢ）である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦアゴニストは７４０Ｙ－Ｐ（Ｔｏｃｒｉｓ；カタログ番号１９８３）である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ経路アゴニストはＰＤＧＦ－ＢＢであり、これは培養基中に７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌ、８．０～１２．０ｎｇ／ｍｌ、９．０～１１．０ｎｇ／ｍｌ、９．５～１０．５ｎｇ／ｍｌ、または１０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で存在する。

【0043】

ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１）経路のアゴニストとしては、ＩＧＦ１とその受容体との結合により開始されるシグナル伝達経路を刺激（上方調節）可能な薬剤、分子、化合物、または物質が挙げられる。１つの実施形態において、ＩＧＦ１経路アゴニストはＩＧＦ１（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２９１－Ｇ１）である。ＩＧＦ１経路アゴニストの他の例としては、アゴニストペプチド（例えば、ＩＧＦ１ ３０－４１ペプチド及びＩＧＦ１ ２４－４１ペプチド）が挙げられる。１つの実施形態において、ＩＧＦ１経路アゴニストはＩＧＦ１であり、これは培養基中に１５～２５ｎｇ／ｍｌ、１６．５～２３．５ｎｇ／ｍｌ、１７．５～２２．０ｎｇ／ｍｌ、１９．０～２１．０ｎｇ／ｍｌ、または２０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で存在する。

【0044】

ＦＧＦ－ベータ（線維芽細胞成長因子－ベータ）経路のアゴニストとしては、ＦＧＦ－ベータとその受容体との結合により開始されるシグナル伝達経路を刺激（上方調節）可能な薬剤、分子、化合物、または物質が挙げられる。１つの実施形態において、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストはＦＧＦ－ベータ（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号３７１８－ＦＢ）である。１つの実施形態において、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストはＦＧＦ－ベータであり、これは培養基中に７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌ、８．０～１２．０ｎｇ／ｍｌ、９．０～１１．０ｎｇ／ｍｌ、９．５～１０．５ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で存在する。

【0045】

諸実施形態において、ｉＭＳＣ分化プロトコルのステップ（ａ）及びステップ（ｂ）の培養基は、基本培地を含む。１つの実施形態において、基本培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であるが、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に類似する成分から構成された他の培地も基本培地としての使用に適している。諸実施形態において、基本培地は血清を含む。諸実施形態において、血清は、ウシ胎児血清及びヒト血清から選択される。１つの実施形態において、基本培地（ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、またはステップ（ａ）及び（ｂ）の両方の基本培地）は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。

【0046】

分化プロトコルのステップ（ａ）及び（ｂ）により生成されるｉＭＳＣ前駆細胞を、さらに第３ステップ（本明細書ではステップ（ｃ）と称される）で培養して成熟ｉＭＳＣを生成する。このステップは、ステップ（ｂ）からのヒト間葉系幹細胞前駆細胞を、基本培地と、Ｌ－グルタミンサプリメントとを含む培養基中で少なくとも７日間培養して、ｉＭＳＣを生成することとを含む。諸実施形態において、前駆細胞を、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも１か月間、または少なくとも２か月間培養してｉＭＳＣを生成する。

【0047】

諸実施形態において、Ｌ－グルタミンサプリメントはＬ－アラニン－Ｌ－グルタミンジペプチドである。１つの実施形態において、Ｌ－アラニン－Ｌ－グルタミンジペプチドは、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号３５０５０－０６１）である。１つの実施形態において、Ｌ－グルタミンサプリメントはＬ－グルタミン（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号２５０３００８１）である。

【0048】

１つの実施形態において、基本培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であるが、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に類似する成分から構成された他の培地も基本培地としての使用に適している。諸実施形態において、基本培地は血清を含む。諸実施形態において、血清は、ウシ胎児血清及びヒト血清から選択される。１つの実施形態において、ステップ（ｃ）の基本培地は、１０～１５％ウシ胎児血清（例えば、１０％ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。１つの実施形態において、ステップ（ｃ）で使用される培養基は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充した１０～１５％ウシ胎児血清（例えば、１０％ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む。

【0049】

ＩＩＩ．培養条件
上記のサブセクションＩＩに記載している規定された培養基と組み合わせて、本開示のｉＭＳＣを生成する方法は、細胞培養における当技術分野で確立された標準的な培養条件を利用する。例えば、細胞は、３７℃ならびに２０％ Ｏ_２及び５％ ＣＯ_２の条件下で培養することができる。基本培地を出発培地として使用し、これに補充剤を加えることができる。例えば、１つの実施形態において、Ｌ－グルタミンを含む市販のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１１３２００３３）を基本培地として使用することができる。代替手段として、Ｌ－グルタミンを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号２１３３１０４６）を基本培地として使用し、Ｌ－グルタミンまたは安定化形態のグルタミンサプリメント（例えば、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））で補充してもよい。同様の基本培地の他の例としては、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１２３６４－０１０）、ＨＰＬＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号Ａ４８９９１０１）、及びａＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号２２５７１０２０）が挙げられる。

【0050】

ヒト多能性幹細胞の培養のための基本培地として使用するのに適した当技術分野で知られている他の培地としては、限定されるものではないが、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＰｅｐｒｏＧｒｏｗ（商標）ｈＥＳＣ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、及びＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が挙げられる。細胞は、標準的な培養容器またはプレート（例えば、培養皿、培養フラスコ、または９６ウェルプレート）で培養することができる。出発ヒト多能性細胞は、当技術分野で確立された細胞株（例えば、ヒトＥＳＣまたはｉＰＳＣ）として得ることができる。

【0051】

本開示の方法の様々な実施形態において、実施例１に記載の３ステッププロトコルから得られる細胞は、細胞集団内の細胞の少なくとも９０％（より好ましくは、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）が、少なくとも１つの、好ましくは複数の（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）の間葉系細胞表面マーカーを発現するように、十分な時間の間培養される。間葉系細胞表面マーカーの非限定的な例としては、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、及びこれらの組合せが挙げられる。諸実施形態において、実施例１に記載の３ステッププロトコルから得られる細胞は、細胞集団内の細胞の５％未満（より好ましくは、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満）が、ＴＲＡ－１－６０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲ、及びこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上のマーカーを発現するように、十分な時間の間培養される。

【0052】

諸実施形態において、実施例１に記載のプロトコルにより生成されるｉＭＳＣは、免疫調節効果のためにさらに処理され得る（実施例４を参照）。例えば、ｉＭＳＣの免疫調節遺伝子を上方調節するために、細胞は、免疫刺激物質（例えば、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓ－ＲＮＡ）またはインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ｒ））で処理され得る。ｉＭＳＣは、ＩＦＮ－ｒで処理することにより、抗炎症因子（例えば、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０））を分泌するように刺激することができる。

【0053】

諸実施形態において、実施例１に記載のプロトコルにより生成されるｉＭＳＣは、特定の細胞タイプ（限定されるものではないが、脂肪細胞、骨細胞、または軟骨細胞を含む）を生成する条件下で、さらなる分化に供することができる。このような細胞をｉＭＳＣから生成するための条件は、当技術分野で十分に確立されている（例えば、実施例３を参照）。

【0054】

ＩＶ．用途
ヒト誘導性間葉系幹細胞及びその前駆細胞を生成するための本開示の方法及び組成物は、これらの細胞集団を様々な用途で効率的かつロバストに利用することを可能にする。例えば、本方法及び組成物を用いて生成されるｉＭＳＣは、様々な他の細胞タイプへの分化を含めて、ヒト間葉系細胞の発生及び分化の研究に使用することができる。したがって、本開示の方法により生成されるｉＭＳＣは、研究目的及び臨床用のいずれにも用途を有する、さらに分化した様々な細胞タイプを生成するための幹細胞の供給源としての役割も果たす。

【0055】

本開示の方法により生成されるｉＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができ、他の薬剤を得るための供給源（例えば、ｉＭＳＣにより分泌され得る免疫調節剤（例えば、ＩＬ－１０）の供給源、またはｉＭＳＣにより生成される細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エクソソーム）の供給源）として使用することができる。このような薬剤は、当技術分野で知られている標準的な方法により、ｉＭＳＣから、または細胞が成長する培養基から精製することができる。

【0056】

さらに、本開示の方法により生成されるｉＭＳＣは、治療目的で、例えば、他の方法により誘導される間葉系幹細胞が使用されている臨床的状況、または使用のための検討もしくは試験が行われている臨床的状況で、使用することができる。治療目的に使用されるｉＭＳＣは、未修飾細胞である場合も、（例えば、治療薬剤（例えば、組換え分泌タンパク質またはｍＲＮＡ薬剤）を発現するように）修飾された細胞である場合もある。間葉系幹細胞が使用され、現在も試験が継続されている非限定的な臨床状況の例としては、心臓損傷（例えば、虚血性心筋症）及び自己免疫疾患（例えば、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症）が挙げられる。

【0057】

Ｖ．組成物
他の態様において、本開示は、ヒト誘導性間葉系幹細胞の生成方法に関連する組成物であって、培養基とキットとを含む組成物を提供する。

【0058】

１つの態様において、本開示は、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を得るための２段階培養基であって、（ｉ）ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む第１段階培地、及び（ｉｉ）ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む第２段階培地を含む、２段階培養基を提供する。好適な薬剤及びその濃度の非限定的な例としては、上記のサブセクションＩＩに記載されているものが挙げられる。１つの実施形態において、第１段階培地は、ＣＨＩＲ９８０１４（例えば、０．５ｕＭ）と、（＋）－ＪＱ１（例えば、５０ｎＭ）とを含み、第２段階培地は、ＰＤＧＦ－ＢＢ（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）と、ＩＧＦ１（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）と、ＦＧＦ－ベータ（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）とを含む。第１段階培地及び第２段階培地は、上記のセクションＩＩ及びＩＩＩに記載されているような基本培地（例えば、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を含むことができる。

【0059】

別の態様において、本開示は、ヒト誘導性間葉系幹細胞を生成するためのキットであって、上述の２段階培養基と、ヒト多能性幹細胞（例えば、ｈＥＳＣ株またはｉＰＳＣ株）の試料とを、（例えば、本明細書に記載のプロトコルに従って）２段階培養基を用いてヒト多能性幹細胞を培養して、ｉＭＳＣを生成するための説明書とともに含む、キットを提供する。

【0060】

本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体で引用された図ならびに全ての参考文献、特許、及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。

【実施例】

【0061】

実施例１：誘導性間葉系幹細胞を生成するための培養プロトコル
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から誘導性間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）を生成するための３段階プロトコルを開発した。プロトコルを図１で模式的に示す。このプロトコルは、最初に誘導培地を用いた４日間の誘導段階、次に強化培地を用いた１０日間の強化段階を伴う。これら最初の２段階により、成熟したｉＭＳＣにさらに分化可能なヒトｉＭＳＣ前駆細胞の培養物がもたらされる。第３段階は、維持培地中でさらなる期間（例えば、少なくとも１～２週間）培養することにより、ｉＭＳＣ前駆細胞を成熟ｉＭＳＣにさらに分化させることを伴う。

【0062】

ｉＭＳＣプロトコルの開始前に培養下でｈＥＳＣを維持するため、ｈＥＳＣを、１％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３５４２７７）でコーティングした６ウェルプレートにおいて、ｍＴｅＳＲ１培養基（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号８５８５０）中で成長させた。培養基を毎日新たに交換した。細胞が８０～９０％のコンフルエントに達したら培養基を吸引し、１ｍＬ／ウェルのＶｅｒｓｅｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１５０４００６６）を加えた。培養プレートを３７℃で６～７分間インキュベートし、Ｖｅｒｓｅｎｅを静かに吸引し、ｍＴｅＳＲ１培地（５ｕＭのＹ－２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ；カタログ番号１２５４）を補充）に細胞を再懸濁した。細胞をカウントし、新たなプレートに１００ｋ／ウェル生細胞で播種した。細胞を、ｉＭＳＣプロトコルで使用するまでｍＴｅＳＲ１培地中で維持し、培養基は毎日交換した。

【0063】

第１段階の導入プロトコル
ｉＭＳＣプロトコルの第１段階において、１日目（分化プロトコル開始の前日）に、６０～１００ｋ／ウェルの生ｈＥＳＣを、１％ Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１４１３３０１）でコーティングした６ウェルプレート（２ｍＬ／ウェルのｍＴｅＳＲ１培養基（５μＭのＹ－２７６３２を補充）使用）に播種した（およそ８０００細胞／ｃｍ^２）。この継代を継代０（Ｐ０）と表示した。次いで０日目（分化の開始日）に、培地を２ｍＬ／ウェルの誘導培地に交換した。誘導培地のレシピは以下の通り：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１１３２００３３）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１００８２１４７）に５０ｎＭ（＋）－ＪＱ１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号ＳＭＬ１５２４）及び０．５μＭ Ｃｈｉｒ９８０１４（Ｔｏｃｒｉｓ；カタログ番号６６９５）を補充。（＋）－ＪＱ１は、ＢＥＴ（ブロモドメイン及び末端外モチーフ）ファミリーの阻害剤（アンタゴニスト）である。Ｃｈｉｒ９８０１４は、（ＧＳＫ阻害を通じた）ＷＮＴ経路の活性化物質（アゴニスト）である。細胞を誘導培地中で２日間（０日目から２日目）維持し、次に培養基を交換し、新鮮な誘導培地中でさらに２日間（２日目から４日目）培養し、合計４日間、第１段階における誘導培地中での培養を行った。

【0064】

第２段階の強化プロトコル
４日目に、培養物から誘導培地を吸引し、２ｍＬ／ウェルの強化培地を加えた。強化培地のレシピは以下の通り：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋１０％ ＦＢＳに１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２２０－ＢＢ）、２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２９１－Ｇ１）、及び１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－ベータ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号３７１８－ＦＢ）を補充。細胞を強化培地中で４日目から１４日目まで維持し、培地は２日ごとに交換した。

【0065】

細胞が強化培地中で９０％コンフルエントに達したら（典型的には６日目から８日目の間（最初の播種密度による））、細胞をＰ１に継代した。継代のために強化培地を吸引し、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。細胞を１ｍＬ／ウェルのアキュターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号Ａ１１１０５０１）で処理し、３７℃のインキュベーターで５～６分間インキュベートした。１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加えて細胞の分離を停止させた。細胞を浮遊させ、遠心管に移し、３００ｇで３分間スピンダウンした。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞ペレットを、５ｕＭのＹ－２７６３２を補充した強化培地に再浮遊させた。細胞を約１５０ｋ／ウェル生細胞で、１％ Ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングした新たな６ウェルプレートに播種した（およそ１５，０００細胞／ｃｍ^２）。細胞を強化培地中で１４日目まで維持し、２日ごとに新しい培地に交換した。細胞が１４日目より前に再び９０％コンフルエントに達したら、細胞を上記のように強化培地中で再び継代した。

【0066】

第３段階の維持プロトコル
１４日目に培養基を維持培地に交換し、次いで４日ごとに交換した。維持培地のレシピは以下の通り：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ ＦＢＳに２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号３５０５０－０６１）を補充。細胞が９０％コンフルエントに達したら、細胞を継代した。

【0067】

細胞が強化段階（すなわち、１４日目より前）にＰ２に継代しなかった場合、以下のように維持培地を用いて１４日目にＰ２継代を行った。細胞培養基を吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。アキュターゼ（１ｍＬ／ウェル）を加え、細胞を３７℃のインキュベーターで５～６分間インキュベートした。ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ ＦＢＳを加えて分離を停止させ、浮遊細胞を遠心管に移した。細胞を３００ｇで３分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを、５μＭのＹ－２７６３２を補充した維持培地に再浮遊させた。細胞を、ウェルから０．１％ゼラチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＥＳ－００６）でコーティングした１０ｃｍのディッシュに移した（およそ１０，０００細胞／ｃｍ^２）。さらなる培地を加えて、総体積が８～１０ｍＬ／ディッシュに達するようにした。

【0068】

次いで細胞を維持培地（４日ごとに交換）中で維持し、細胞密度が９０％コンフルエントに達するたびに、以下のようにして細胞を次の継代に分割した。細胞培養基を吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（５ｍＬ／ディッシュ）を加え、細胞を３７℃のインキュベーターで８～１０分間インキュベートした。ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ ＦＢＳを加えて分離を停止させ、浮遊細胞を遠心管に移した。細胞を３００ｇで３分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを、５μＭのＹ－２７６３２を補充した維持培地に再浮遊させた。細胞を３００ｋ／ディッシュの生細胞で、０．１％ゼラチンでコーティングした１０ｃｍのディッシュに播種した（およそ５，０００細胞／ｃｍ^２）。さらなる培地を加えて、総体積が８～１０ｍＬ／ディッシュに達するようにした。間葉系幹細胞様細胞が培養２１日目から出現を開始した。

【0069】

細胞形態を、分化プロトコルの異なる段階で顕微鏡的に調べた。結果を図２Ａ～Ｂに示す。４日目から１４日目までの細胞は中胚葉期であった。その代表例を図２Ａ（左右のパネル）に示す。この段階の細胞は、比較的大きな核を有する初期の中胚葉様形態を示し、一部の細胞はフィロポディアを有した。２１日目以降、細胞は、図２Ｂ（左パネル）（低密度１０倍）に示すように、間葉系／線維芽細胞様形態を獲得し始めた。高密度では、細胞は紡錘様の形状となり、図２Ｂ（右パネル）（高密度５倍）に示すように、波状パターンを観察することができた。

【0070】

誘導性ＭＳＣは少なくとも３か月間、培養下で一定の増殖率を維持した。細胞を拡大して、検証試験（下記でさらに説明する）に用いた。

【0071】

実施例２：誘導性間葉系幹細胞の表面マーカー発現
誘導性間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）の表面マーカー発現を標準的なＦＡＣＳ分析によって調べた。調べたＭＳＣの陽性マーカーはＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、及びＣＤ４４であった。図３Ａに示すように、実施例１に記載の分化プロトコルにより生成したｉＭＳＣは、これらの間葉系マーカーの各々の表面発現を示した。調べた陰性マーカーにはＴＲＡ－１－６０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ－ＤＲが含まれた。図３Ｂに示すように、ｉＭＳＣは、試験した陰性マーカーのいずれも発現しなかった（「陰性カクテル」は、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ４５、及び抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体を含む）。

【0072】

実施例３：誘導性間葉系幹細胞の三系列分化
実施例１に記載のプロトコルに従って生成したｉＭＳＣの分化能力を調べるため、脂肪細胞、骨細胞、または軟骨細胞の分化プロトコルを用いて、細胞をさらに処理した。

【0073】

脂肪形成については、Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号Ａ１００７００１）をメーカーの指示に従って用いてｉＭＳＣを培養した。脂肪細胞分化から２１日後、脂肪細胞内の脂質粒子を赤色に染色するＯｉｌ Ｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｏ１３９１）により細胞を染色した。結果を図４Ａに示す。この図は、ｉＭＳＣが脂肪細胞に分化する能力を示している。

【0074】

骨形成については、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号Ａ１００７２０１）をメーカーの指示に従って用いてｉＭＳＣを培養した。骨細胞分化から１４日後、骨細胞を赤色に染色するＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号ＴＭＳ－００８－Ｃ）により細胞を染色した。結果を図４Ｂに示す。この図は、ｉＭＳＣが骨細胞に分化する能力を示している。

【0075】

軟骨形成については、Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号Ａ１００７１０１）をメーカーの指示に従って用いてｉＭＳＣを培養した。軟骨細胞分化から１４日後、軟骨細胞を青色に染色するＡｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｂ８４３８）により細胞を染色した。結果を図４Ｃに示す。この図は、ｉＭＳＣが軟骨細胞に分化する能力を示している。

【0076】

全体として、図４Ａ～Ｃの結果は、ｉＭＳＣの三系列分化における能力を実証するものである。

【0077】

実施例４：誘導性間葉系幹細胞の免疫調節
この実施例では、様々な試験を行って、実施例１に記載の分化プロトコルに従って生成したｉＭＳＣの免疫調節能力を調べた。

【0078】

第１の試験セットでは、ｉＭＳＣを免疫刺激物質（二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または組換えヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮｒ）（Ｒ＆Ｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号３５－ＩＦ－１００））で処理した。ｉＭＳＣ（１００ｋ細胞／試料）をｄｓＲＮＡ（５００ｎｇ／試料）またはＩＦＮｒ（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに２４時間培養した。処理後、ｉＭＳＣの免疫調節能力を、試験した免疫刺激物質により上方調節される可能性があるマーカー遺伝子の定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。調べた免疫刺激マーカー遺伝子は以下の通り：ＲＩＧ１、ＴＬＲ３、ＣＯＸ２、ＩＤＯ１、ＨＧＦ、及びＴＧＦ－ベータ。対照遺伝子（ＭＳＣ表面マーカー用）は以下の通り：ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５。結果を図５に示す。この結果から、ｉＭＳＣを免疫刺激物質で処理すると、免疫刺激に関連する複数の遺伝子（特にＩＤＯ１、ＴＬＲ３、及びＨＧＦ）の発現が増加し、一方対照マーカー遺伝子は上方調節されなかった。

【0079】

第２の実験セットでは、ｉＭＳＣを混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で使用した。ヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）（Ｌｏｎｚａ；カタログ番号ｃｃ－２７０２）をＣｅｌｌＴｒａｃｋ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号Ｃ３４５５７）で標識して、細胞増殖を示した。ｉＭＳＣ（２４ウェルプレートの５０ｋ細胞／ウェル；およそ２５，０００細胞／ｃｍ^２を）１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮｒで３日間前処理した。これを「活性化ｉＭＳＣ」と称し、これに対しＩＦＮｒによる前処理なしのｉＭＳＣを「不活性化ｉＭＳＣ」と称する。ＭＬＲのために、ｉＭＳＣの上にｈＰＢＭＣを加え、組換えヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号２０２－ＩＬ）及び抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；カタログ番号１６－００３７－８１）を補充した共培養基中で３日間共培養して、Ｔ細胞の増殖を促進した。３日後、ｈＰＢＭＣを回収し、フローサイトメトリーにより分析した。図６に示すように、５つのピークが「ｈＰＢＭＣのみ」群で観察された。これは、細胞が４回増殖したことを示している。「＋不活性化ｉＭＳＣ」群ではピークが区別不可能であった。このことから、不活性化ｉＭＳＣとの共培養によりｈＰＢＭＣの増殖が妨害されたことが示唆される。「＋活性化ｉＭＳＣ」群における単一の優勢なピークは、細胞増殖が１回のみ起こり、次いで活性化ｉＭＳＣとの共培養中に増殖が停止したことを示している。

【0080】

第３の実験セットでは、ＩＦＮｒ処理後のｉＭＳＣによる抗炎症因子ＩＬ－１０の産生量を調べた。ｉＭＳＣ（２４ウェルプレートの５０ｋ細胞／ウェル；およそ２５，０００細胞／ｃｍ^２）を低濃度（２０ｎｇ／ｍＬ）または高濃度（５０ｎｇ／ｍＬ）のＩＦＮｒで３日間処理して、ＩＬ－１０の分泌を刺激した。対照群は同じ培養条件であったが、ＩＦＮｒ処理は行わなかった。３日後、培地上清を回収し、標準的なＥＬＩＳＡ分析（ヒトＩＬ－１０ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号Ｄ１０００Ｂ）によりＩＬ－１０分泌のレベルを定量化した。図７に示すように、ｉＭＳＣによるＩＬ－１０の分泌は、ＩＦＮｒ処理の濃度に対し用量依存的であった。

【0081】

実施例５：誘導性間葉系幹細胞による細胞外小胞の産生
この実施例では、ｉＭＳＣによる細胞外小胞の産生を定量化した。細胞を最初にＰＢＳで洗浄し、次いでエクソソーム枯渇ＦＢＳを含む維持培地（実施例１に記載）中で培養した。培養から４日後に培地を回収し、全体積を測定した。ｉＭＳＣを培養小胞から分離し、細胞数をカウントした。小胞膜上のテトラスパニンタンパク質を標的とするＦＡＣＳベース分析を用いて、細胞外小胞を定量化した。代表的な３つの試料の結果を図８に示す（ＰＢＳ及び培地のみの対照あり）。これは、ｉＭＳＣによる細胞外小胞の産生を実証するものである。

【0082】

等価物
当業者は、本明細書に記載の特定の態様における多くの等価物を認識し、または単なる通例的実験を用いてこれらを確認することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【手続補正書】

【提出日】2023-11-29

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成する方法であって、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む培養基中で少なくとも２日間培養して、誘導性細胞を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で少なくとも１０日間培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することとを含む、前記方法。

【請求項2】

ステップ（ａ）が、前記ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む前記培養基中で０日目から４日目まで培養して、誘導性細胞を生成することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）からの前記誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で４日目から１４日目まで培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＷＮＴ経路アゴニストがグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３）阻害剤である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＷＮＴ経路アゴニストがＣＨＩＲ９８０１４である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＡＺＤ１０８０、ＷＮＴ３Ａ、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．２５～０．７５μＭの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．５μＭの濃度で前記培養基中に存在する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９８０１４である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストがトリアゾロ－ジアゼピン化合物である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記トリアゾロ－ジアゼピン化合物が（＋）－ＪＱ１である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、（＋）－ＪＱ１、ＴＥＮ－０１０、ＯＴＸ０１５、Ｉ－ＢＥＴ７６２、Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＢＡＹ１２３８０９７、ＡＢＢＶ－７４４、ＡＢＢＶ－０７５、ｉＢＥＴ－ＢＤ１、ｉＢＥＴ－ＢＤ２、ＳＪ４３２、ＲＶＸ－２０８、ＭＳ４１７、ＡＺＤ５１５３、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

ＢＥＴ経路アンタゴニストが、２５～７５ｎＭの範囲内の濃度で培養基中に存在する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、５０ｎＭの濃度の（＋）－ＪＱ１である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ＰＤＧＦ経路アゴニストがＰＤＧＦ－ＢＢである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

ＰＤＧＦ－ＢＢが、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ＰＤＧＦ－ＢＢが、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記ＩＧＦ１経路アゴニストがＩＧＦ１である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

ＩＧＦ１が、前記培養基中に１５～２５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で存在する、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ＩＧＦ１が、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストがＦＧＦ－ベータである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

ＦＧＦ－ベータが、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ＦＧＦ－ベータが、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）の前記培養基が、血清を含む基本培地を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

血清を含む前記基本培地が、１０～１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を少なくとも７日間、Ｌ－グルタミンサプリメントを含む基本培地を含む培養基中で培養することをさらに含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記Ｌ－グルタミンサプリメントがＬ－アラニン－Ｌ－グルタミンジペプチドである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

Ｌ－グルタミンサプリメントを含む前記基本培地が、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

ヒト誘導性間葉系幹細胞（ｉＭＳＣ）を生成する方法であって、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む培養基中で少なくとも２日間培養して、誘導性細胞を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で少なくとも１０日間培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を、基本培地と、Ｌ－グルタミンサプリメントとを含む培養基中で少なくとも７日間培養して、ｉＭＳＣを生成することとを含む、前記方法。

【請求項31】

ステップ（ａ）が、前記ヒト多能性幹細胞を、ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む前記培養基中で０日目から４日目まで培養して、誘導性細胞を生成することを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）からの前記誘導性細胞を、ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む培養基中で４日目から１４日目まで培養して、ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を生成することを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

ステップ（ｃ）が、前記ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を少なくとも１４日間、前記基本培地及びＬ－グルタミンサプリメント中で培養することを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項34】

前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記ｉＭＳＣが、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、及びこれらの組合せからなる群より選択される１つ以上の表面マーカーを発現する、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記ｉＭＳＣが、脂肪細胞、骨細胞、または軟骨細胞へのさらなる分化が可能である、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＷＮＴ経路アゴニストがグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（Ｇｓｋ３）阻害剤である、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記ＷＮＴ経路アゴニストがＣＨＩＲ９８０１４である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ ２１６７６３、ＳＢ ４１５２８６、ＬＹ２０９０３１４、３Ｆ８、Ａ １０７０７２２、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、ＢＩＯ、ＡＺＤ１０８０、ＷＮＴ３Ａ、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．２５～０．７５μＭの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．５μＭの濃度で前記培養基中に存在する、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記ＷＮＴ経路アゴニストが、０．５μＭの濃度のＣＨＩＲ９８０１４である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストがトリアゾロ－ジアゼピン化合物である、請求項３０～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記トリアゾロ－ジアゼピン化合物が（＋）－ＪＱ１である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、（＋）－ＪＱ１、ＴＥＮ－０１０、ＯＴＸ０１５、Ｉ－ＢＥＴ７６２、Ｉ－ＢＥＴ１５１、ＢＡＹ１２３８０９７、ＡＢＢＶ－７４４、ＡＢＢＶ－０７５、ｉＢＥＴ－ＢＤ１、ｉＢＥＴ－ＢＤ２、ＳＪ４３２、ＲＶＸ－２０８、ＭＳ４１７、ＡＺＤ５１５３、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項３０～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、２５～７５ｎＭの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記ＢＥＴ経路アンタゴニストが、５０ｎＭの濃度の（＋）－ＪＱ１である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記ＰＤＧＦ経路アゴニストがＰＤＧＦ－ＢＢである、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

ＰＤＧＦ－ＢＢが、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

ＰＤＧＦ－ＢＢが、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

前記ＩＧＦ１経路アゴニストがＩＧＦ１である、請求項３０～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

ＩＧＦ１が、１５～２５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

ＩＧＦ１が、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

前記ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストがＦＧＦ－ベータである、請求項３０～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

ＦＧＦ－ベータが、７．５～１２．５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度で前記培養基中に存在する、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

ＦＧＦ－ベータが、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培養基中に存在する、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の前記培養基が、血清を含む基本培地を含む、請求項３０～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

血清を含む前記基本培地が、１０～１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記Ｌ－グルタミンサプリメントがＬ－アラニン－Ｌ－グルタミンジペプチドである、請求項３０～５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

ステップ（ｃ）のＬ－グルタミンサプリメントを含む前記基本培地が、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を補充した１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記ｉＭＳＣにより生成される細胞外小胞を培養物から単離することをさらに含む、請求項３０～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

ヒト間葉系幹細胞前駆細胞を得るための２段階培養基であって、前記２段階培養基が、（ｉ）ＷＮＴ経路アゴニストと、ＢＥＴ経路アンタゴニストとを含む第１段階培養基、及び（ｉｉ）ＰＤＧＦ経路アゴニストと、ＩＧＦ１経路アゴニストと、ＦＧＦ－ベータ経路アゴニストとを含む第２段階培養基を含む、前記２段階培養基。

【国際調査報告】