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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-06
(54)【発明の名称】バイオ系によるタウリン生成
(51)【国際特許分類】
C12P 13/00 20060101AFI20250130BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20250130BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250130BHJP
C12P 11/00 20060101ALN20250130BHJP
【ＦＩ】
C12P13/00
C12N1/19
C12N1/21
C12P11/00 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024567998
(86)(22)【出願日】2022-01-31
(85)【翻訳文提出日】2024-09-30
(86)【国際出願番号】 US2022014507
(87)【国際公開番号】W WO2023146544
(87)【国際公開日】2023-08-03
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524288252
【氏名又は名称】ナタウアー・エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100122644
【弁理士】
【氏名又は名称】寺地 拓己
(72)【発明者】
【氏名】トゥラノ，フランク
(72)【発明者】
【氏名】トゥラノ，キャスリーン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE02
4B064AE61
4B064CA02
4B064CA06
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA10
4B065AA01X
4B065AA15X
4B065AA19X
4B065AA22X
4B065AA24X
4B065AA25X
4B065AA26X
4B065AA28X
4B065AA30X
4B065AA46X
4B065AA49X
4B065AA80X
4B065BA02
4B065CA15
4B065CA16
4B065CA41
(57)【要約】
本発明では、単細胞生物からのタウリン含有生成物の発酵生成のための方法を記載する。より具体的には、本発明は、細菌、藻類、微細藻類、珪藻類、酵母または真菌を含む単細胞生物における、タウリンおよび／または基質の生合成経路の遺伝子修飾に関する。本発明は、種々のタウリン含有生成物の生成のための発酵方法および処理方法にも関する。本発明は、食品、飼料、飲料、栄養補助食品および健康補助食品、化粧品、日用品、医薬品または農業生産における使用のための生成物を生成する、タウリンを含む細胞、発酵ブロスまたは抽出物の使用にも関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
振盪フラスコにおいて単細胞生物を増殖させて、単細胞生物から１ｇ／リットルのタウリンを生成するステップを含む、タウリンの生成のための方法。
【請求項2】
発酵槽またはバイオリアクターにおいて単細胞生物を増殖させて、単細胞生物から少なくとも２０ｇ／リットルのタウリンを生成するステップを含む、タウリンの生成のための方法。
【請求項3】
単細胞生物が、１つまたは複数の外因性タウリン生合成経路を発現し、次の：タウリンまたはスルホネートの取込みおよび分解のための少なくとも１つのオペロンの欠失、
外因性タウリン排出輸送体、
硫酸もしくはチオ硫酸の輸送またはイオウの還元もしくはイオウの同化における遺伝子の発現の上昇、
セリン生合成経路における遺伝子の発現の上昇、
システイン生合成経路における遺伝子の発現の上昇、
２－アミノアクリレート生合成経路における遺伝子の発現の上昇、
タウリン、セリン、システエートまたは２－アミノアクリレートの分解における少なくとも１つの遺伝子の欠失、あるいは
タウリン、イオウまたはシステイン代謝の転写調節因子または活性化因子のための遺伝子の発現の修飾
の１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
単細胞生物が、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、イプシロンプロテオバクテリア（Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、メタン資化性菌（Ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネ型細菌（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅ）、コリネバクテリウム・クレナタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅｎａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・ペキネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｍ ｐｅｋｉｎｅｓｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エルウィニア・シトレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｉｔｒｅｕｓ）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｅｉｉ）、プロピオニバクテリウム・デニトリフィカンス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
タウリンを単離して、純度１０％超、純度２５％超、純度５０％超、純度７５％超または純度９８％超の純度レベルを有するタウリンを生成するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項6】
単細胞生物が、大腸菌であり、少なくとも５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、少なくとも６ｇ／Ｌの二塩基性リン酸カリウム、少なくとも３ｇ／Ｌの一塩基性リン酸ナトリウム、少なくとも０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも６ｇ／Ｌのグルコース、少なくとも０．１ｇ／Ｌのトリプトン、および少なくとも０．０５ｇ／Ｌの酵母抽出物を含む培地中で増殖させるステップを行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項7】
少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌのピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む培地中で増殖させるステップを行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項8】
単細胞生物の細胞を化学的、物理的または機械的に破壊し、乾燥させ、食品、飼料、飲料、栄養補助食品および健康補助食品、化粧品、日用品、医薬品または農業生産において使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項9】
振盪フラスコにおいて増殖させた場合、少なくとも１ｇ／リットルのタウリンまたは発酵槽もしくはバイオリアクターにおいて増殖させた場合、２０ｇ／リットルのタウリンを生成することが可能な、単細胞生物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列の提出
[0001]本出願は、配列表とともに電子書式により申請される。配列表は、Ｂｉｏ－ｂａｓｅｄ Ｔａｕｒｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２．ｔｘｔの表題を有し、２０２２年１月３０日に作成され、４４３ｋｂのサイズである。配列表の電子書式による情報は、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0001]本出願は、配列表とともに電子書式により申請される。配列表は、Ｂｉｏ－ｂａｓｅｄ Ｔａｕｒｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ２．ｔｘｔの表題を有し、２０２２年１月３０日に作成され、４４３ｋｂのサイズである。配列表の電子書式による情報は、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
[0002]本発明は、単細胞生物によるタウリン生成の分野に存在する。
【背景技術】
【0003】
[0003]ヒトおよび動物にとっての必須栄養素であるタウリン
[0004]スルホン酸であるタウリンは、ヒトおよび動物にとっての必須栄養素であり（１－６）、心血管系機能、骨格筋系機能、視覚系機能、および神経系機能に必要とされ（７）、ヒトの総合的健康および長寿と関連づけられている（１）。タウリンは、ＦＤＡによる一部の場合では、調製粉乳、ペットフード、動物飼料、エナジードリンク、栄養機能性食品、医薬品、日用品／化粧品、および植物成長増強剤を含む多数の製品に必要とされる成分として使用される。タウリンは、食肉および他の動物性製品に天然に存在するが（８）、我々が、より植物系の食品および飼料に移行するにつれて、タウリンを成分として加えるか、または補助食品として摂取しなければならない（５、９、１０）。
[0004]スルホン酸であるタウリンは、ヒトおよび動物にとっての必須栄養素であり（１－６）、心血管系機能、骨格筋系機能、視覚系機能、および神経系機能に必要とされ（７）、ヒトの総合的健康および長寿と関連づけられている（１）。タウリンは、ＦＤＡによる一部の場合では、調製粉乳、ペットフード、動物飼料、エナジードリンク、栄養機能性食品、医薬品、日用品／化粧品、および植物成長増強剤を含む多数の製品に必要とされる成分として使用される。タウリンは、食肉および他の動物性製品に天然に存在するが（８）、我々が、より植物系の食品および飼料に移行するにつれて、タウリンを成分として加えるか、または補助食品として摂取しなければならない（５、９、１０）。
【0004】
[0005]現在、補助食品としてのタウリンは、ほぼすべてが石油系のプロセスにより生成される（１１）。生物学的に合成され、安全、かつ持続可能であり、商業規模で経済的に生成可能な、タウリン供給源に対する現実的な必要性が存在する。
【0005】
[0006]本発明では、対費用効果の高い、単細胞生物によるタウリンの発酵生成のための方法を提供する。単細胞生物の遺伝子改良、増殖条件および発酵条件、対費用効果の高い栄養培地、ならびにタウリン精製のための下流処理による、タウリン生成の最適化のための方法を提供する。
【0006】
[0007]タウリン生合成経路
[0008]いくつかのタウリン生合成経路が同定されている。遺伝子および対応する遺伝子産物、ならびに細胞においてタウリンを生成する、遺伝子および対応するペプチドを使用するための方法が、文献に記載されている（１２－２０）。簡潔には、経路１：システインおよび酸素が、システインジオキシゲナーゼ（ＣＤＯ）またはＣＤＯ相同体により３－スルフィノアラニンに変換される（２１）。３－スルフィノアラニンが、スルフィノアラニンデカルボキシラーゼ（ＳＡＤ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）によって（２２、２３）、またはシステインシンセターゼ／ＰＬＰデカルボキシラーゼの部分（ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ）によって（１６）、ヒポタウリンに変換される。ヒポタウリンは、自然変換によって、または未だ同定されていないヒポタウリンデヒドロゲナーゼ（ＨＴＤｅＨａｓｅ）の活性によって、タウリンに変換される。経路２：システアミンおよび酸素が、システアミンジオキシゲナーゼ（ＡＤＯ）によりヒポタウリンに変換され、ヒポタウリンがタウリンに変換される。経路３：システインおよび亜硫酸が、システインリアーゼによりシステエートおよび硫化水素に変換される。システエートは、ＳＡＤ（２４）またはシステインスルホン酸デカルボキシラーゼ（ｃｙｓｔｅａｔｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＣＡＤ）によりタウリンに変換される。経路４：Ｏ－ホスホセリンおよび亜硫酸が、スレオニンシンターゼ（ＴＳ）によりシステエートに変換される（２５）。次いで、システエートが、ＳＡＤまたはＧＡＤのいずれかによりタウリンに変換される。経路５：セリンが、セリンデヒドラターゼ（ＳＤＨ）により２－アミノアクリレートに変換され得る（２６）。次いで、２－アミノアクリレートおよび３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）が、３’－ホスホアデニリル硫酸：２’－アミノアクリレートＣ－スルホトランスフェラーゼ（ＰＡＰＳ－ＡＳ）によりシステエートに変換される。システエートは、ＳＡＤまたはＧＡＤのいずれかによりタウリンに変換される（２６、２７）。経路６：システインシンセターゼ／ＰＬＰデカルボキシラーゼ（ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ）が、Ｏ－アセチルセリンおよび硫化水素または２－アミノアクリレートおよびＰＡＰＳをタウリンに変換する。
[0008]いくつかのタウリン生合成経路が同定されている。遺伝子および対応する遺伝子産物、ならびに細胞においてタウリンを生成する、遺伝子および対応するペプチドを使用するための方法が、文献に記載されている（１２－２０）。簡潔には、経路１：システインおよび酸素が、システインジオキシゲナーゼ（ＣＤＯ）またはＣＤＯ相同体により３－スルフィノアラニンに変換される（２１）。３－スルフィノアラニンが、スルフィノアラニンデカルボキシラーゼ（ＳＡＤ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）によって（２２、２３）、またはシステインシンセターゼ／ＰＬＰデカルボキシラーゼの部分（ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ）によって（１６）、ヒポタウリンに変換される。ヒポタウリンは、自然変換によって、または未だ同定されていないヒポタウリンデヒドロゲナーゼ（ＨＴＤｅＨａｓｅ）の活性によって、タウリンに変換される。経路２：システアミンおよび酸素が、システアミンジオキシゲナーゼ（ＡＤＯ）によりヒポタウリンに変換され、ヒポタウリンがタウリンに変換される。経路３：システインおよび亜硫酸が、システインリアーゼによりシステエートおよび硫化水素に変換される。システエートは、ＳＡＤ（２４）またはシステインスルホン酸デカルボキシラーゼ（ｃｙｓｔｅａｔｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＣＡＤ）によりタウリンに変換される。経路４：Ｏ－ホスホセリンおよび亜硫酸が、スレオニンシンターゼ（ＴＳ）によりシステエートに変換される（２５）。次いで、システエートが、ＳＡＤまたはＧＡＤのいずれかによりタウリンに変換される。経路５：セリンが、セリンデヒドラターゼ（ＳＤＨ）により２－アミノアクリレートに変換され得る（２６）。次いで、２－アミノアクリレートおよび３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）が、３’－ホスホアデニリル硫酸：２’－アミノアクリレートＣ－スルホトランスフェラーゼ（ＰＡＰＳ－ＡＳ）によりシステエートに変換される。システエートは、ＳＡＤまたはＧＡＤのいずれかによりタウリンに変換される（２６、２７）。経路６：システインシンセターゼ／ＰＬＰデカルボキシラーゼ（ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ）が、Ｏ－アセチルセリンおよび硫化水素または２－アミノアクリレートおよびＰＡＰＳをタウリンに変換する。
【0007】
[0009]藻類種および微細藻類種におけるタウリン合成に関与する遺伝子および対応するペプチド（２８）としては、システインジオキシゲナーゼ（ＣＤＯ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、スルフィノアラニンデカルボキシラーゼ（ＳＡＤ）、システエートシンターゼ（ＣＳ）、システインシンセターゼ／ＰＬＰデカルボキシラーゼ（ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ）またはシステインシンセターゼ／ＰＬＰデカルボキシラーゼの部分（ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ）が挙げられる。
【0008】
[00010]前駆体経路
[00011]タウリン生合成経路間の類似性は、タウリン生成における炭素、窒素、およびイオウの必要性から生じる。炭素および窒素は、セリン系経路の成分から供給される。イオウ（硫酸およびチオ硫酸）は、取込み、還元、および同化を含む一連の反応により細胞に供給される。グルコース由来の炭素は、ｐｇｋ遺伝子産物であるホスホグリセリン酸キナーゼによるグリセリン酸１，３－ビスリン酸からグリセリン酸３－リン酸への変換によってセリン生合成経路に入る（２９）。グリセリン酸３－リン酸は、ｓｅｒＡの産物である３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼにより３－ホスホヒドロキシピルビン酸に変換される。ｓｅｒＡ遺伝子産物は、セリンによるフィードバック阻害に対して感受性であるが、この阻害は、最後の１９７アミノ酸を欠失させること（ｓｅｒＡΔ１９７）により除去することができる（３０）。３－ホスホヒドロキシピルビン酸は、ｓｅｒＣの産物であるホスホセリンアミノトランスフェラーゼによりＯ－ホスホ－セリンに変換され、Ｏ－ホスホ－セリンは、ｓｅｒＢの産物であるホスホセリンホスファターゼによりセリンに変換される。セリンおよびアセチルＣｏＡは、ｃｙｓＥの産物であるセリンアセチルトランスフェラーゼによりＯ－アセチル－セリンに変換される。ｃｙｓＥ遺伝子産物は、システインによるフィードバック阻害に対して感受性であるが、変異したｃｙｓＥＭ２０１Ｒは、システイン阻害に対して非感受性である（３１）。Ｏ－アセチル－セリンは、ｃｙｓＫの産物であるシステインシンターゼによりシステインに変換される。システインは、ｔｎａの産物により分解され得る（３２）。他のセリン系タウリン前駆体は、上に指名するコンパウンドから得られる。前駆体である２－アミノアクリレートは、ｉｌｖＡの産物であるスレオニンデヒドラターゼ（２８）またはセリンデヒドラターゼ（２６）によりセリンから生成される。ｉｌｖＡ遺伝子産物は、イソロイシンによるフィードバック阻害に対して感受性であるが、変異したｉｌｖＡＬ４４７Ｆは、イソロイシン阻害に対して非感受性である（３３）。２－アミノアクリレートは、ＲｉｄＡもしくはｔｄｃＦの産物である２－イミノブタン酸／２－イミノプロパン酸デアミナーゼまたはｒｕｔＣの産物であるアミノアクリレート過酸レダクターゼにより２－ケト酪酸に変換される。
[00011]タウリン生合成経路間の類似性は、タウリン生成における炭素、窒素、およびイオウの必要性から生じる。炭素および窒素は、セリン系経路の成分から供給される。イオウ（硫酸およびチオ硫酸）は、取込み、還元、および同化を含む一連の反応により細胞に供給される。グルコース由来の炭素は、ｐｇｋ遺伝子産物であるホスホグリセリン酸キナーゼによるグリセリン酸１，３－ビスリン酸からグリセリン酸３－リン酸への変換によってセリン生合成経路に入る（２９）。グリセリン酸３－リン酸は、ｓｅｒＡの産物である３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼにより３－ホスホヒドロキシピルビン酸に変換される。ｓｅｒＡ遺伝子産物は、セリンによるフィードバック阻害に対して感受性であるが、この阻害は、最後の１９７アミノ酸を欠失させること（ｓｅｒＡΔ１９７）により除去することができる（３０）。３－ホスホヒドロキシピルビン酸は、ｓｅｒＣの産物であるホスホセリンアミノトランスフェラーゼによりＯ－ホスホ－セリンに変換され、Ｏ－ホスホ－セリンは、ｓｅｒＢの産物であるホスホセリンホスファターゼによりセリンに変換される。セリンおよびアセチルＣｏＡは、ｃｙｓＥの産物であるセリンアセチルトランスフェラーゼによりＯ－アセチル－セリンに変換される。ｃｙｓＥ遺伝子産物は、システインによるフィードバック阻害に対して感受性であるが、変異したｃｙｓＥＭ２０１Ｒは、システイン阻害に対して非感受性である（３１）。Ｏ－アセチル－セリンは、ｃｙｓＫの産物であるシステインシンターゼによりシステインに変換される。システインは、ｔｎａの産物により分解され得る（３２）。他のセリン系タウリン前駆体は、上に指名するコンパウンドから得られる。前駆体である２－アミノアクリレートは、ｉｌｖＡの産物であるスレオニンデヒドラターゼ（２８）またはセリンデヒドラターゼ（２６）によりセリンから生成される。ｉｌｖＡ遺伝子産物は、イソロイシンによるフィードバック阻害に対して感受性であるが、変異したｉｌｖＡＬ４４７Ｆは、イソロイシン阻害に対して非感受性である（３３）。２－アミノアクリレートは、ＲｉｄＡもしくはｔｄｃＦの産物である２－イミノブタン酸／２－イミノプロパン酸デアミナーゼまたはｒｕｔＣの産物であるアミノアクリレート過酸レダクターゼにより２－ケト酪酸に変換される。
【0009】
[00012]タウリン生合成のためのイオウ系前駆体は、イオウ（硫酸およびチオ硫酸）の取込み経路および還元経路から得られる。硫酸－チオ硫酸取込み経路は、ｓｂｐ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、およびｃｙｓＡの産物により制御される。硫酸およびチオ硫酸は、ｓｂｐおよびｃｙｓＰの産物がそれぞれ結合し、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＷ、およびｃｙｓＡの産物により細胞内に輸送される（３４）。硫酸は、ｃｙｓＤＮＣの産物であるＡＴＰスルフリラーゼおよびＡＰＳキナーゼにより３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）に変換される。ＰＡＰＳは、ｃｙｓＨの産物であるＰＡＰＳレダクターゼによりアデノシン－３’，５’－二リン酸（ＰＡＰ）および亜硫酸に変換される。ｃｙｓＱの産物であるＰＡＰヌクレオチダーゼは、ＰＡＰＳ再生に関与する。亜硫酸は、ｃｙｓＩＪの産物により硫化物に変換される。Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンおよび硫化物は、ＣｙｓＫおよびＣｙｓＭによりシステインに変換される。ＣｙｓＭは、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンおよびチオ硫酸からＳ－スルホシステインも合成する（３５）。Ｓ－スルホシステインは、グルタレドキシン（ＮｒｄＨ）またはＧｒｘによりシステインに変換される。
【0010】
[00013]タウリンおよびスルホン酸の分解
[00014]イオウの非存在下では、細菌は、スルホン酸の取込みおよび分解経路またはタウリンの取込みおよび分解経路を利用して、炭素、窒素またはイオウを動員する（３６－３９）。タウリンの取込みおよび分解に関与する遺伝子および対応するペプチドは、通常、同一のオペロンｔａｕＡＢＣＤ（４０）およびｓｓｕＥＡＤＣＢ（４１）上に存在し、窒素（４２、４３）もしくはイオウ（３６）の非存在下またはタウリン（３９、４４）の存在下で誘導される。他の細菌、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ． （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）では、スルホン酸、タウリンの取込みおよび分解に関与する遺伝子および対応するペプチドは、ｓｓｕＤ１ＣＢＡおよびｓｕｅＡＢＣＤ２のオペロンに存在する（４５）。
[00014]イオウの非存在下では、細菌は、スルホン酸の取込みおよび分解経路またはタウリンの取込みおよび分解経路を利用して、炭素、窒素またはイオウを動員する（３６－３９）。タウリンの取込みおよび分解に関与する遺伝子および対応するペプチドは、通常、同一のオペロンｔａｕＡＢＣＤ（４０）およびｓｓｕＥＡＤＣＢ（４１）上に存在し、窒素（４２、４３）もしくはイオウ（３６）の非存在下またはタウリン（３９、４４）の存在下で誘導される。他の細菌、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ． （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）では、スルホン酸、タウリンの取込みおよび分解に関与する遺伝子および対応するペプチドは、ｓｓｕＤ１ＣＢＡおよびｓｕｅＡＢＣＤ２のオペロンに存在する（４５）。
【0011】
[00015]分解酵素の遺伝子であるｔａｕＸおよびｔａｕＹは、タウリンデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）をコードする（４３）。ｔａｕＤは、タウリンジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）をコードし（３６）、ｔｐａは、タウリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＴＰＡＴ）をコードし（４６）、ｓｓｕＤおよびｓｓｕＥは、２成分アルカンスルホネートモノオキシゲナーゼ２ＣＡＳＭをコードする（３７）。
【0012】
[00016]転写調節因子
[00017]細菌では、イオウ代謝のいくつかの包括的調節因子が存在する。ｃｙｓＢ遺伝子産物は、イオウの取込みおよび還元ならびにシステイン代謝に関与する遺伝子のＬｙｓＲ型転写活性化因子である。ｃｙｓＢは、グラム陰性細菌において高度に保存される（４７）。コリネバクテリウム・グルタミクムでは、転写調節因子であるメチオニン／システイン生合成抑制因子（ＭｃｂＲ）（４８）は、イオウ同化およびシステイン生合成に関与する遺伝子の発現を抑制する。翻訳調節因子であるＣｂｌおよびＴａｕＲは、細菌におけるタウリン分解経路の発現および誘導を制御する（３６、４６）。Ｃｂｌは、いくつかの細菌におけるスルホン酸の取込みおよび分解経路またはタウリンの取込みおよび分解経路のＬｙｓＲ型転写調節因子である（４１、４９）。ｃｂｌ遺伝子は、アルファプロテオバクテリア（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびガンマプロテオバクテリア（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーを含むプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に見出される。Ｃｂｌ転写調節因子を欠く細菌は、活性化因子のＭｃｂＲサブファミリーを有し、これは、タウリンの取込みおよび分解系を制御するＴａｕＲを含む。ＴａｕＲは、アルファプロテオバクテリアのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）およびロドバクター目（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、ベータプロテオバクテリアのバークホルデリア科（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）およびコマモナス科（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ガンマプロテオバクテリアのエンテロバクター目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、オケアノスピリルム目（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、およびシクロモナス目（Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、ならびにアルファプロテオバクテリアのリゾビウム目およびロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）に見出される。
[00017]細菌では、イオウ代謝のいくつかの包括的調節因子が存在する。ｃｙｓＢ遺伝子産物は、イオウの取込みおよび還元ならびにシステイン代謝に関与する遺伝子のＬｙｓＲ型転写活性化因子である。ｃｙｓＢは、グラム陰性細菌において高度に保存される（４７）。コリネバクテリウム・グルタミクムでは、転写調節因子であるメチオニン／システイン生合成抑制因子（ＭｃｂＲ）（４８）は、イオウ同化およびシステイン生合成に関与する遺伝子の発現を抑制する。翻訳調節因子であるＣｂｌおよびＴａｕＲは、細菌におけるタウリン分解経路の発現および誘導を制御する（３６、４６）。Ｃｂｌは、いくつかの細菌におけるスルホン酸の取込みおよび分解経路またはタウリンの取込みおよび分解経路のＬｙｓＲ型転写調節因子である（４１、４９）。ｃｂｌ遺伝子は、アルファプロテオバクテリア（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびガンマプロテオバクテリア（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーを含むプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に見出される。Ｃｂｌ転写調節因子を欠く細菌は、活性化因子のＭｃｂＲサブファミリーを有し、これは、タウリンの取込みおよび分解系を制御するＴａｕＲを含む。ＴａｕＲは、アルファプロテオバクテリアのリゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）およびロドバクター目（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）、ベータプロテオバクテリアのバークホルデリア科（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）およびコマモナス科（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ガンマプロテオバクテリアのエンテロバクター目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、オケアノスピリルム目（Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ）、およびシクロモナス目（Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、ならびにアルファプロテオバクテリアのリゾビウム目およびロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）に見出される。
【0013】
[00018]タウリン排出輸送体
[00019]タウリンは、ｇａｄＣ、ｙｈｉＭまたはＡＡｐｅｒｍの産物により細胞外に排出され得る。
[00019]タウリンは、ｇａｄＣ、ｙｈｉＭまたはＡＡｐｅｒｍの産物により細胞外に排出され得る。
【0014】
[00020]発酵条件および栄養培地
[00021]記載の発明では、タウリンは、発酵により生成される。バッチ発酵、フェドバッチ発酵、連続発酵によって、またはタンクもしくは池によって、コンパウンドを生成する方法は、当業者に周知である（５０－６０）。
[00021]記載の発明では、タウリンは、発酵により生成される。バッチ発酵、フェドバッチ発酵、連続発酵によって、またはタンクもしくは池によって、コンパウンドを生成する方法は、当業者に周知である（５０－６０）。
【0015】
[00022]本発明において使用する培養培地は、生成に使用する微生物の要件に依存する。種々の微生物用に定義する培地の記載は、文献に見出される（６１－６３）。炭素源は、個別に、または組み合わせて使用してもよく、糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、脂肪酸、アルコール、ならびに有機酸を含み得る。窒素源は、個別に、または混合物として使用してもよく、有機窒素含有コンパウンド、例えば、ペプトン、トリプトン、カゼインアミノ酸、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸出液、大豆ミール、および尿素または無機コンパウンド、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムを含み得る。カリウム源およびリン酸源は、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、およびリン酸二ナトリウムを含み得る。硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄、微量栄養素、アミノ酸、およびビタミンも、増殖に必要である。
【0016】
[00023]培養物のｐＨを調整するために、コンパウンド、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化アンモニウム、または酸、例えば、リン酸もしくは硫酸を使用する。起泡性を調整するために、消泡剤を使用する。好気条件は、混合するか、または培養物に空気もしくは酸素を導入することにより維持される。溶存酸素は、増殖相および微生物に応じて１５％～４０％である。培養物の温度は、微生物に応じて２５℃～４０℃、好ましくは、３０℃～３７℃である。細胞培養物の増殖は、最大タウリン生成量に達するまで、典型的には、１０時間～１００時間、好ましくは、１５時間～３０時間以内で維持される。
【0017】
[00024]記載の発明では、発酵ブロスは、タウリン、微生物の細胞集団、発酵プロセスの有機副生成物、および残存する任意の培地成分を含む。
[00025]合成したタウリンの濃度は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、アミノ酸分析計、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、および液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して、発酵を通じた種々の時点で決定することができる。
[00025]合成したタウリンの濃度は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、アミノ酸分析計、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、および液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して、発酵を通じた種々の時点で決定することができる。
【0018】
[00026]下流処理：分離および精製
[00027]記載の発明では、タウリンを処理または精製して生成物とする。使用される特定の下流処理は、タウリンが細胞（もしくはバイオマス）または液体中に存在するかどうか、所望の最終タウリン生成物の形態、例えば、液体または粉末、ならびに所望の純度および／または含水レベルを含む、いくつかの因子に依存する。生成物の一部の適用では、処理は、適切な濃度および乾燥度に細胞および培地を乾燥させるステップを含み得る。生成物の一部の適用では、処理は、タウリンを精製または部分的に精製するステップを含み得る。費用を削減し効率を高めるために、濃縮するか、または蒸発により水分を除去することにより、例えば、流下膜式蒸発器、逆浸透またはナノ濾過を使用して、下流処理を通じた種々の時点で容量を減少させることができる。
[00027]記載の発明では、タウリンを処理または精製して生成物とする。使用される特定の下流処理は、タウリンが細胞（もしくはバイオマス）または液体中に存在するかどうか、所望の最終タウリン生成物の形態、例えば、液体または粉末、ならびに所望の純度および／または含水レベルを含む、いくつかの因子に依存する。生成物の一部の適用では、処理は、適切な濃度および乾燥度に細胞および培地を乾燥させるステップを含み得る。生成物の一部の適用では、処理は、タウリンを精製または部分的に精製するステップを含み得る。費用を削減し効率を高めるために、濃縮するか、または蒸発により水分を除去することにより、例えば、流下膜式蒸発器、逆浸透またはナノ濾過を使用して、下流処理を通じた種々の時点で容量を減少させることができる。
【0019】
[00028]タウリンが発酵ブロスの液体に存在する場合、遠心分離、濾過、デカンテーションまたはこれらの組合せにより、バイオマスから液体を分離し得る。タウリンを含む液体のさらなる処理は、本発明によるタウリン生成物の製造のための濃縮もしくは乾燥または精製ステップを含み得る。精製ステップは、イオン交換クロマトグラフィー（６４）、限外濾過、沈殿、ｐＨ調整およびナノ濾過（６５）、活性炭による処理（６６）または晶析を含む、クロマトグラフィー技術（５４）または膜に基づくプロセス（６４）からなる群から選択され得る。精製ステップまたはこれらの任意の組合せは、タウリンが、例えば、純度および含水量のための所望の規格に精製されるまで反復し得る。
【0020】
[00029]タウリンが発酵ブロスの細胞に存在する場合、遠心分離、濾過、デカンテーションまたはこれらの組合せにより、液体から細胞を分離し得る。タウリン含有細胞は、濃縮して生成物として使用し得るか、または化学物質、圧力、機械的力または超音波処理により細胞を破壊して、内容物を放出させ得る。内容物を有する破壊された細胞は、濃縮または乾燥させて生成物として使用し得るか、または内容物をさらに処理して単一細胞タンパク質を生じさせてもよく、これを濃縮または乾燥させて生成物として使用し得る。あるいは、遠心分離、濾過もしくはデカンテーションまたはこれらの組合せにより、細胞残屑から破壊細胞内のタウリンを分離した後、上記のように、さらに精製し得る。
【0021】
[00030]タウリンが発酵ブロスの液体および細胞の両方に存在する場合、液体および細胞を分離し、上記のように別々に処理するか、またはともに濃縮し得る。タウリン含有濃縮物は、本発明に従って生成物の製造に使用するか、または上記のように精製によってさらに処理し得る。
【0022】
[00031]タウリン含有生成物は、種々の形態、例えば、液体、粉末、ペースト、カプセルまたは錠剤であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0023】
[00032]本発明では、単細胞生物におけるタウリン含有生成物の発酵生成のための方法を提供する。より具体的には、本発明は、セリン生合成と、イオウ（硫酸もしくはチオ硫酸）の取込み、還元、および同化のためのポリヌクレオチドと組み合わせた、タウリン生合成酵素のポリヌクレオチドの使用、ならびに／またはタウリンを分解もしくは輸送して、細胞内のタウリンを増加させるか、もしくはタウリンを培地に排出する、ペプチドのポリヌクレオチドの使用を包含する。本発明は、タウリンを含む細胞、発酵ブロスまたは抽出物から生成される種々の生成物の生成のための発酵方法および処理方法にも関する。
【0024】
[00033]本発明の原理の理解を促進する目的で、ここで、本発明の特定の実施形態について言及し、特定の言語を使用して、これらを記載する。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、制限するものではない。
【0025】
[00034]一部の実施形態では、単細胞生物は、プロモーターに動作可能に結合する、１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、単細胞生物の内因性ポリヌクレオチドの発現は、外因性プロモーターにより修飾される。
【0026】
[00035]一実施形態では、本発明は、外因性ポリヌクレオチドであるＣＤＯおよびＳＡＤを含むタウリン生合成経路と、ｐｇｋ、ｓｅｒＡΔ１９７、ｓｅｒＣ、ｓｅｒＢ、ｃｙｓＥ、およびｃｙｓＫの発現を上昇させるように修飾した、セリン系経路と、ｃｙｓＰＵＷＡ、ｃｙｓＤＮＣ、ｃｙｓＱ、ｃｙｓＨ、およびｃｙｓＩＪの発現を上昇させ、ｔａｕＤ、ｓｓｕＤ、およびｓｓｕＥをノックアウトしてタウリンの分解を阻害するか、またはｔａｕＡＢＣＤ、ｓｓｕＥＡＤＣＢ、ｓｓｕＤ１ＣＢＡもしくはｓｕｅＡＢＣＤ２をノックアウトしてタウリンの分解および細胞内へのタウリンの再取込みを阻害するように修飾したイオウ系経路とを有する単細胞生物からなる。
【0027】
[00036]別の実施形態では、本発明は、外因性ポリヌクレオチドであるＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣを含むタウリン生合成経路と、ｐｇｋ、ｓｅｒＡΔ１９７、ｓｅｒＣ、およびｓｅｒＢの発現を上昇させるように修飾した、セリン系経路と、ｃｙｓＤＮＣおよびｃｙｓＱの発現を上昇させ、ｔａｕＤ、ｓｓｕＤ、およびｓｓｕＥをノックアウトしてタウリンの分解を阻害するか、またはｔａｕＡＢＣＤ、ｓｓｕＥＡＤＣＢ、ｓｓｕＤ１ＣＢＡもしくはｓｕｅＡＢＣＤ２をノックアウトしてタウリンの分解および細胞内へのタウリンの再取込みを阻害するように修飾したイオウ系経路とを有する単細胞生物からなる。
【0028】
[00037]別の実施形態では、本発明は、外因性ポリヌクレオチドであるＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣを含むタウリン生合成経路と、ｓｅｒＡΔ１９７の発現を上昇させ、ｔａｕＡＢＣＤ、ｓｓｕＥＡＤＣＢ、ｓｓｕＤ１ＣＢＡまたはｓｕｅＡＢＣＤ２をノックアウトしてタウリンの分解および細胞内へのタウリンの再取込みを阻害するように修飾したセリン系経路とを有する単細胞生物からなる。
【0029】
[00038]別の実施形態では、本発明は、外因性ポリヌクレオチドであるＴＳおよびＳＡＤを含むタウリン生合成経路と、ｐｇｋ、ｓｅｒＡΔ１９７、およびｓｅｒＣの発現を上昇させるように修飾した、セリン系経路と、ｓｂｐ、ｃｙｓＵＷＡ、ｃｙｓＤＮＣ、ｃｙｓＱ、およびｃｙｓＨの発現を上昇させ、ｔａｕＤ、ＳｓｕＤ、およびＳｓｕＥをノックアウトしてタウリンの分解を阻害し、ｃｕｙＡをノックアウトしてシステエートの分解を阻害するように修飾したイオウ系経路とを有する単細胞生物からなる。
【0030】
[00039]別の実施形態では、本発明は、外因性ポリヌクレオチドであるｉｌｖＡおよびＰＡＰＳ－ＡＳを含むタウリン生合成経路と、ｓｅｒＡΔ１９７、ｓｅｒＣ、ｓｅｒＢの発現を上昇させるように修飾した、セリン系経路と、ｓｂｐ、ｃｙｓＵＷＡ、ｃｙｓＤＮＣ、およびｃｙｓＱの発現を上昇させ、ｔａｕＤ、ｓｓｕＤ、およびｓｓｕＥをノックアウトしてタウリンの分解を阻害するように修飾したイオウ系経路とを有する単細胞生物からなる。
【0031】
[00040]別の実施形態では、本発明は、外因性ポリヌクレオチドであるｉｌｖＡＬ４４７ＦおよびＰＡＰＳ－ＡＳ、タウリン排出輸送体であるｇａｄＣ、ｙｈｉＭ、およびＡＡｐｅｒｍを含むタウリン生合成経路と、ｓｅｒＡΔ１９７、ｓｅｒＣ、ｓｅｒＢの発現を上昇させるように修飾した、セリン系経路と、ｃｙｓＰＵＷＡ、ｃｙｓＤＮＣ、およびｃｙｓＱの発現を上昇させ、ｔａｕＤ、ｓｓｕＤ、およびｓｓｕＥをノックアウトしてタウリンの分解を阻害し、ｒｉｄＡ、ｔｄｃＦ、およびｒｕｔＣをノックアウトして２－アミノアクリレートの分解を阻害するように修飾したイオウ系経路とを有する単細胞生物からなる。
【0032】
[00041]特定の実施形態では、本発明は、食品、飼料、飲料、栄養補助食品および健康補助食品、化粧品、日用品、医薬品または農業生産における使用のための、タウリンを生成する、細菌、酵母、真菌または単細胞藻類を含む、修飾もしくは変異した単細胞生物を含む。
【0033】
[00042]特定の実施形態では、本発明は、また、発酵により細胞を増殖させる方法についても記載し、タウリン、または液体、粉末、ペースト、カプセルもしくは錠剤であり得るタウリン生成物の生成のための、細胞を増殖させる培地組成についても記載する。
【0034】
[00043]特定の実施形態では、単細胞生物は、大腸菌（Ｅ． （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ） ｃｏｌｉ）であり、少なくとも５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、少なくとも６ｇ／Ｌの二塩基性リン酸カリウム、少なくとも３ｇ／Ｌの一塩基性リン酸ナトリウム、少なくとも０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、少なくとも６ｇ／Ｌのグルコース、少なくとも０．１ｇ／Ｌのトリプトン、少なくとも０．０５ｇ／Ｌの酵母抽出物、および少なくとも０．２５ｍｇ／Ｌのピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む培地中で増殖させる。
【0035】
[00044]特定の実施形態では、本発明は、細胞を増殖させて、純粋なタウリンまたはタウリン含有生成物を含む広範な生成物を生成する、細胞または培地を処理する方法に関する。方法は、タウリンを単離して、純度１０％超、純度２５％超、純度５０％超、純度７５％超または純度９８％超の純度レベルを有するタウリンを生成するステップを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【発明を実施するための形態】
【0037】
[00047]本発明は、単細胞生物におけるタウリン（２－アミノエタンスルホン酸）の生成のための方法を提供する。好ましい実施形態では、タウリン生合成経路、セリン生合成経路におけるタンパク質をコードする遺伝子を使用する、単細胞生物の遺伝子修飾のための方法、ならびにサイレンシングもしくはノックアウトされた、タウリンの分解のための遺伝子、またはノックアウトされた、タウリンの取込みおよび分解のための前駆体もしくはオペロンとともに、イオウの輸送、還元、および同化を上昇させるための方法を、本発明は提供する。本発明は、食品、飼料、飲料、栄養補助食品および健康補助食品、化粧品、日用品、医薬品または農業生産における使用のための、内因性タウリンまたはタウリン誘導体、例えば、ヒポタウリンのレベルが上昇した、細菌、微細藻類、真菌、酵母、および藻類を含む単細胞生物を使用する方法も提供する。
【0038】
[00048]本発明では、群１：ＣＤＯおよびＳＡＤ、ＧＡＤもしくはｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ；群２：ＡＤＯ；群３：システインリアーゼおよびＳＡＤもしくはＧＡＤ；群４：ＴＳおよびＳＡＤもしくはＧＡＤ；群５：ｉｌｖＡＬ４４７ＦおよびＰＡＰＳ－ＡＳならびにＳＡＤ；または群６：ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣの群からなる１つまたは複数のタウリン生合成経路由来のペプチドの１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含むことによる、単細胞生物の修飾のための方法を提示する。
【0039】
[00049]本発明では、ｐｇｋ、ｓｅｒＡΔ１９７、ｓｅｒＣ、ｓｅｒＢ、ｃｙｓＥＭ２０１Ｒ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｎｒｄＨ、ｓｂｐ、ｃｙｓＵＷＡ、ｃｙｓＰＵＷＡ、ｃｙｓＤＮＣ、ｃｙｓＱ、ｃｙｓＨ、およびｃｙｓＩＪから構成される、セリン系または硫酸系経路におけるペプチドの１つまたは複数のポリヌクレオチドの発現を上昇させる、単細胞生物の修飾のための方法を提示する。
【0040】
[00050]本発明では、次のオペロン：ｔａｕＡＢＣ、ｓｓｕＥＡＤＣＢ、ｓｓｕＤ１ＣＢＡまたはｓｕｅＡＢＣＤ２のうちの１つまたは複数をサイレンシング、変異またはノックアウトすることによりタウリンの取込みおよび分解を遮断する、単細胞生物の修飾のための方法を提示する。
【0041】
[00051]本発明では、次の遺伝子：ｔａｕＸ、ｔａｕＹ、ｔａｕＤ、ｔｐａ、ｓｓｕＤ、ｓｓｕＥまたはｓｓｕ１のうちの１つまたは複数をサイレンシング、変異またはノックアウトする方法によりタウリンを遮断する、単細胞生物の修飾のための方法を提示する。
【0042】
[00052]本発明では、次の：２－アミノアクリレート分解酵素の遺伝子：ｒｉｄＡ、ｔｄｃＦ、およびｒｕｔＣ、システエート分解酵素のための遺伝子：ｃｕｙＡ、ならびにセリン分解酵素の遺伝子：ｇｌｙＡ、ｓｄａＡ、およびｉｌｖＡのうちの１つまたは複数をサイレンシング、変異またはノックアウトする方法により前駆体の分解を遮断する、単細胞生物の修飾のための方法を提示する。
【0043】
[00053]本発明では、セリン系、硫酸系またはタウリン経路における１つまたは複数の翻訳調節遺伝子ｃｂｌ、ｃｙｓＢ、ｔａｕＲまたはｍｃｂＲの発現を制御する、単細胞生物の修飾のための方法を提示する。
【0044】
[00054]本発明では、タウリンを細胞外に輸送するペプチドの次の遺伝子：ｇａｄＣ、ｙｈｉＭ、およびＡＡｐｅｒｍからなる群由来の１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含むことにより、単細胞生物の修飾のための方法を提示する。
【0045】
[00055]以下は、特定の実施形態の各遺伝子に適切な、適するポリヌクレオチドのリストである。本発明による使用に適する他のポリヌクレオチドは、低ストリンジェンシー条件、中等ストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションによりポリヌクレオチドを指名されたポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズさせることによるポリヌクレオチドの同定によって得ることができる。本発明による使用に適するさらに他のポリヌクレオチドは、配列比較において参照として使用した場合、核酸対して実質的同一性を有するか、またはアミノ酸配列に対して実質的同一性を有するポリペプチドをコードする類似のポリヌクレオチドの同定により得ることができる。
【0046】
[00056]ＣＤＯに適するポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７に提供され、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0047】
[00057]ＳＡＤに適するポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３に提供され、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0048】
[00058]ＧＡＤに適するポリヌクレオチドは、配列番号１５に提供され、配列番号１６のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00059]ＣＳ／ＰＬ＿ＤＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号１７、配列番号７８に提供され、配列番号１８、配列番号７９のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
[00059]ＣＳ／ＰＬ＿ＤＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号１７、配列番号７８に提供され、配列番号１８、配列番号７９のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0049】
[00060]ＡＤＯに適するポリヌクレオチドは、配列番号１９に提供され、配列番号２０のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00061]ＣＬに適するポリヌクレオチドは、配列番号２１、配列番号２３に提供され、配列番号２２、配列番号２４のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
[00061]ＣＬに適するポリヌクレオチドは、配列番号２１、配列番号２３に提供され、配列番号２２、配列番号２４のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0050】
[00062]ＴＳに適するポリヌクレオチドは、配列番号２５、配列番号２７に提供され、配列番号２６、配列番号２８のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
[00063]ｉｌｖＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１３６、配列番号１４０に提供され、配列番号１３７、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
[00063]ｉｌｖＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１３６、配列番号１４０に提供され、配列番号１３７、配列番号１４１のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0051】
[00064]ｉｌｖＡＬ４４７Ｆに適するポリヌクレオチドは、配列番号２９に提供され、配列番号３０のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00065]ＰＡＰＳ－ＡＳに適するポリヌクレオチドは、配列番号３１、配列番号３３に提供され、配列番号３２、配列番号３４のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
[00065]ＰＡＰＳ－ＡＳに適するポリヌクレオチドは、配列番号３１、配列番号３３に提供され、配列番号３２、配列番号３４のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0052】
[00066]ｐｇｋに適するポリヌクレオチドは、配列番号３５に提供され、配列番号３６のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00067]ｓｅｒＡΔ１９７に適するポリヌクレオチドは、配列番号３７に提供され、配列番号３８のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00067]ｓｅｒＡΔ１９７に適するポリヌクレオチドは、配列番号３７に提供され、配列番号３８のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0053】
[00068]ｓｅｒＢに適するポリヌクレオチドは、配列番号３９に提供され、配列番号４０のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00069]ｓｅｒＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号４１に提供され、配列番号４２のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00069]ｓｅｒＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号４１に提供され、配列番号４２のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0054】
[00070]ｃｙｓＥＭ２０１Ｒに適するポリヌクレオチドは、配列番号４３に提供され、配列番号４４のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00071]ｃｙｓＫに適するポリヌクレオチドは、配列番号４５、配列番号１４７に提供され、配列番号４６、配列番号１４８のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
[00071]ｃｙｓＫに適するポリヌクレオチドは、配列番号４５、配列番号１４７に提供され、配列番号４６、配列番号１４８のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0055】
[00072]ｃｙｓＤＮＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号４７に提供され、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00073]ｃｙｓＱに適するポリヌクレオチドは、配列番号５１に提供され、配列番号５２のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00073]ｃｙｓＱに適するポリヌクレオチドは、配列番号５１に提供され、配列番号５２のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0056】
[00074]ｃｙｓＨに適するポリヌクレオチドは、配列番号５３に提供され、配列番号５４のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00075]ｃｙｓＩＪに適するポリヌクレオチドは、配列番号５５に提供され、配列番号５７、配列番号５６のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00075]ｃｙｓＩＪに適するポリヌクレオチドは、配列番号５５に提供され、配列番号５７、配列番号５６のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0057】
[00076]ｃｙｓＢに適するポリヌクレオチドは、配列番号５８に提供され、配列番号５９のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00077]ｔａｕＸに適するポリヌクレオチドは、配列番号６０に提供され、配列番号６１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00077]ｔａｕＸに適するポリヌクレオチドは、配列番号６０に提供され、配列番号６１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0058】
[00078]ｔａｕＹに適するポリヌクレオチドは、配列番号６２に提供され、配列番号６３のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00079]ｔａｕＤに適するポリヌクレオチドは、配列番号６４に提供され、配列番号６５のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00079]ｔａｕＤに適するポリヌクレオチドは、配列番号６４に提供され、配列番号６５のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0059】
[00080]ｔｐａに適するポリヌクレオチドは、配列番号６６に提供され、配列番号６７のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00081]ｔａｕＡＢＣＤに適するポリヌクレオチドは、配列番号６８に提供される。
[00081]ｔａｕＡＢＣＤに適するポリヌクレオチドは、配列番号６８に提供される。
【0060】
[00082]ｓｓｕＥＡＤＣＢに適するポリヌクレオチドは、配列番号６９に提供される。
[00083]ｓｓｕＤに適するポリヌクレオチドは、配列番号７０、配列番号７２に提供され、配列番号７１、配列番号７３のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
[00083]ｓｓｕＤに適するポリヌクレオチドは、配列番号７０、配列番号７２に提供され、配列番号７１、配列番号７３のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0061】
[00084]ｓｓｕＥに適するポリヌクレオチドは、配列番号７４、配列番号７６に提供され、配列番号７５、配列番号７７のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0062】
[00085]ｒｉｄＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号８０、配列番号１４９、配列番号１５１に提供され、配列番号８１、配列番号１５０、配列番号１５２のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0063】
[00086]ｔｄｃＦに適するポリヌクレオチドは、配列番号８２に提供され、配列番号８３のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00087]ｒｕｔＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号８４に提供され、配列番号８５のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00087]ｒｕｔＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号８４に提供され、配列番号８５のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0064】
[00088]ｃｕｙＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号８６に提供され、配列番号８７のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00089]ｃｂｌに適するポリヌクレオチドは、配列番号８８、配列番号９０に提供され、配列番号８９、配列番号９１のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
[00089]ｃｂｌに適するポリヌクレオチドは、配列番号８８、配列番号９０に提供され、配列番号８９、配列番号９１のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0065】
[00090]ｔａｕＲに適するポリヌクレオチドは、配列番号９２、配列番号９４に提供され、配列番号９３、配列番号９５のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0066】
[00091]ｍｃｂＲに適するポリヌクレオチドは、配列番号９６に提供され、配列番号９７のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00092]ｃｙｓＭに適するポリヌクレオチドは、配列番号９８に提供され、配列番号９９のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00092]ｃｙｓＭに適するポリヌクレオチドは、配列番号９８に提供され、配列番号９９のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0067】
[00093]ｓｄａＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１００、配列番号１０２に提供され、配列番号１０１、配列番号１０３のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0068】
[00094]ｇｌｙＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１０４、配列番号１０６に提供され、配列番号１０５、配列番号１０７のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0069】
[00095]ｔｎａＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１０８に提供され、配列番号１０９のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00096]ｃｙｓＰＵＷＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１１０に提供され、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00096]ｃｙｓＰＵＷＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１１０に提供され、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0070】
[00097]ｎｒｄｈに適するポリヌクレオチドは、配列番号１４３に提供され、配列番号１４４のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00098]ｓｂｐに適するポリヌクレオチドは、配列番号１６０に提供され、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[00098]ｓｂｐに適するポリヌクレオチドは、配列番号１６０に提供され、配列番号１６１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0071】
[00099]ｓｓｕＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号１６２に提供され、配列番号１６３のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[000100]ｓｓｕＢに適するポリヌクレオチドは、配列番号１６４に提供され、配列番号１６５のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[000100]ｓｓｕＢに適するポリヌクレオチドは、配列番号１６４に提供され、配列番号１６５のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0072】
[000101]ｓｓｕＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１６６に提供され、配列番号１６７のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[000102]ｓｓｕＤ１ＣＢＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１６８に提供される。
[000102]ｓｓｕＤ１ＣＢＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１６８に提供される。
【0073】
[000103]ｓｓｕ１に適するポリヌクレオチドは、配列番号１６９に提供され、配列番号１７０のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[000104]ｓｕｅＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１７２に提供され、配列番号１７３のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[000104]ｓｕｅＡに適するポリヌクレオチドは、配列番号１７２に提供され、配列番号１７３のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0074】
[000105]ｓｕｅＢに適するポリヌクレオチドは、配列番号１７４に提供され、配列番号１７５のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[000106]ｓｕｅＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号１７６に提供され、配列番号１７７のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[000106]ｓｕｅＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号１７６に提供され、配列番号１７７のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
【0075】
[000107]ｓｕｅＤ２に適するポリヌクレオチドは、配列番号１７８に提供され、配列番号１７９のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[000108]ｓｕｅＡＢＣＤ２に適するポリヌクレオチドは、配列番号１８０に提供される。
[000108]ｓｕｅＡＢＣＤ２に適するポリヌクレオチドは、配列番号１８０に提供される。
【0076】
[000109]ｇａｄＣに適するポリヌクレオチドは、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８に提供され、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0077】
[000110]ｙｈｉＭに適するポリヌクレオチドは、配列番号１９０に提供され、配列番号１９１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。
[000111]アミノ酸パーミアーゼＡＡｐｅｒｍに適するポリヌクレオチドは、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６に提供され、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
[000111]アミノ酸パーミアーゼＡＡｐｅｒｍに適するポリヌクレオチドは、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６に提供され、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれコードする。
【0078】
[000112]本発明は、このようなアミノ酸配列の使用に制限されない。列挙される多様な酵素および転写因子を含むアミノ酸配列は、本発明の範囲内に含まれ、参照アミノ酸配列に実質的にまたは十分に類似すると考えられる。本発明が、その有利な結果を達成するいかなる理論によっても制限されることは意図しないが、適切な機能性の維持に必要なアミノ酸配列間の同一性は、特定の相互作用的配列が適切に配置され、所望の活性を有するようにポリペプチドの三次構造の維持と関連すると考えられ、適切な空間的状況下でこのような相互作用的配列を含むポリペプチドが、活性を有することが検討される。
【0079】
[000113]２つのアミノ酸配列間に類似性が存在し得る別の方法は、１群の所与のアミノ酸間に保存的置換が存在する場合の方法である。特定のアミノ酸配列をコードするプロセスは、コードされるアミノ酸の変化を生じない１つまたは複数の塩基の変化（すなわち、挿入、欠失、置換）を有するＤＮＡ配列を含み得るか、または１つまたは複数のアミノ酸を変更する可能性があるが、ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの機能特性を除去しない塩基の変化を含み得る。
【0080】
[000114]当業者は、コード配列内の単一アミノ酸またはごく一部のアミノ酸を変更、付加または欠失させる、アミノ酸配列における変化、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、この変更によって化学的に類似するアミノ酸とのアミノ酸の置換が生じる場合、「十分に類似する」ことを認識するであろう。
【0081】
[000115]したがって、本発明では、本明細書に記載のタンパク質をコードする特定のポリヌクレオチドを単に包含するにとどまらないことが理解される。例えば、配列に対する修飾、例えば、生じるポリペプチドの機能特性に実質的に影響しない「サイレント」な変化をもたらす配列内の欠失、挿入または置換を、本発明では明示的に検討する。「ユニバーサル」コードが完全には普遍的ではないことは、当業者に公知である。一部のミトコンドリアゲノムおよび細菌ゲノムは、ユニバーサルコードから逸脱し、例えば、ユニバーサルコード内の一部の終結コドンにより、ミトコンドリアまたは細菌コード内のアミノ酸が特定される。したがって、本発明のポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載の各ポリペプチド配列に潜在し、本発明の明細書に組み込まれる。
【0082】
[000116]遺伝子コードの縮重を反映するか、または化学的に等価なアミノ酸の生成が所与の部位において生じる、ヌクレオチド配列内の変更を検討することが理解される。したがって、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、より疎水性でない別の残基、例えば、グリシンまたはより疎水性の残基、例えば、バリン、ロイシンまたはイソロイシンをコードするコドンにより置換し得る。同様に、ある負荷電残基と別の残基との置換、例えば、アスパラギン酸とグルタミン酸との置換、またはある正荷電残基と別の残基との置換、例えば、リジンとアルギニンとの置換が生じる変化によっても、生物学的に等価な生成物がもたらされると予想され得る。
【0083】
[000117]核酸を調製または合成的に変更する場合、当業者は、核酸が発現される、意図された宿主における公知のコドン選好性を考慮することができる。例えば、本発明の核酸配列は様々な種において発現され得るが、配列は、このような選好性が異なることが示されているため（６７－７２）、生物の特定のコドン選好性およびＧＣ含量選好性を考慮して修飾することができる。
【0084】
[000118]クローニング技術
[000119]他に言及しない限り、本明細書において利用または検討される技術は、当業者に周知の標準的方法である。以下に利用され、本節の終わりに定義される特定の用語は、単に説明的意味において使用され、制限する目的で使用されるものではない。本発明の実施では、他に指示しない限り、植物学、微生物学、菌類学、藻類学、組織培養、分子生物学、化学、生物化学、バイオテクノロジー、および組換えＤＮＡ技術の従来技術を利用し、これらは当技術分野の範囲内に存在する（７３－８０）。
[000119]他に言及しない限り、本明細書において利用または検討される技術は、当業者に周知の標準的方法である。以下に利用され、本節の終わりに定義される特定の用語は、単に説明的意味において使用され、制限する目的で使用されるものではない。本発明の実施では、他に指示しない限り、植物学、微生物学、菌類学、藻類学、組織培養、分子生物学、化学、生物化学、バイオテクノロジー、および組換えＤＮＡ技術の従来技術を利用し、これらは当技術分野の範囲内に存在する（７３－８０）。
【0085】
[000120]本発明による使用に適するポリヌクレオチドは、市販されているか、または当業者に公知の標準的方法を使用して構築することが可能な、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリー、ＤＮＡ、または細菌、藻類、微細藻類、珪藻類、酵母もしくは真菌由来のｃＤＮＡを使用するクローニング技術により得ることができる。適するヌクレオチド配列は、多種多様な種から得られるＤＮＡライブラリーから、核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順により、プローブまたはプライマーとして本発明に従って選択されたヌクレオチド配列を使用して単離し得る。
【0086】
[000121]その上、核酸配列は、化学合成を使用して構築または増幅され得る。増幅産物は、アンプリコンと呼ばれる。その上、特定の核酸配列が、全長の化学合成を非実用的にする長さである場合、配列は、当技術分野において公知の方法により、合成し得るより小型のセグメントに分割され、ともにライゲートされて所望の全配列を形成し得る。あるいは、個々の成分またはＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅してもよく、隣接する断片を、当技術分野において公知の方法により、供給業者（例えば、ＤＮＡ２．０社、ＧＥｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＧＥＮＥＡＲＴ社、Ｇｅｎ９社、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を使用し、融合ＰＣＲ（８１）、オーバーラップＰＣＲ（８２）、または化学（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成（８３－８７）を使用して、ともに増幅することができる。
【0087】
[000122]組換え発現カセットまたはＤＮＡ構築物は、単細胞生物において転写を方向づけ、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドに動作可能に結合する、プロモーターを含む。多様な種々の型のプロモーターが記載されており、使用されている。本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドは、プロモーターまたは他のヌクレオチド配列と機能的関係において配置されるとき、プロモーターまたは他のヌクレオチド配列に「動作可能に結合」される。プロモーターと所望のポリヌクレオチド挿入断片との間の機能的関係は、典型的に、ポリヌクレオチド配列の転写が容易となるように連続するポリヌクレオチドとプロモーター配列とを含む。２つの核酸配列は、２つの配列間の結合性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じないか、（２）所望のヌクレオチド配列の転写を方向づけるプロモーター領域配列の能力を妨害しないか、または（３）プロモーター配列領域により転写される所望のヌクレオチド配列の能力を妨害しない場合、さらに動作可能に結合されると言われる。典型的には、プロモーターエレメントは、核酸挿入断片コード配列の上流（すなわち、５’末端）に一般に存在する。
【0088】
[000123]プロモーター配列は、ベクターへの挿入前にコード配列にライゲートされ得るが、他の実施形態では、ベクターが挿入される宿主細胞内で動作可能なプロモーターを含むベクターが選択される。加えて、特定の好ましいベクターは、プロモーターと、本発明のＤＮＡ配列と動作可能に関連し、所望のポリペプチド、すなわち、本発明のＤＮＡ配列をインフレームで生成するように、ＤＮＡ配列が挿入される部位との間に位置するリボソーム結合部位をコードする領域を有する。
【0089】
[000124]遺伝子発現カセットは、１つまたは複数のポリヌクレオチド（遺伝子）を含んでもよく、それぞれが、プロモーターおよびターミネーターと動作可能に結合して一連のモノシストロン性ｍＲＮＡを形成するか、またはこれらの遺伝子が、１つのプロモーターおよびターミネーターとともに配列して単一のポリシストロン性ｍＲＮＡを形成することができる。多種多様な動作可能性カセットは、当業者に公知である。
【0090】
[000125]適するプロモーター
[000126]単独またはプロモーターと組み合わせて使用可能な他の調節エレメントのように、多種多様なプロモーターが当業者に公知である。単細胞生物内で転写を方向づける多種多様なプロモーターを、本発明と関連させて使用することができる（８８－９０）。機能性細菌プロモーターの同定および使用に必要な特徴（結合部位および調節エレメント）は、当業者に公知である（９１－９３）。本発明を説明する目的で、プロモーターは、２つの型、すなわち、構成的プロモーターおよび非構成的プロモーターに分けられる（８９、９４）。構成的プロモーターは、広範な構成的発現をもたらすものとして分類される。弱構成的プロモーターも存在すれば、強構成的プロモーターも存在する（９５）。他のプロモーターは、非構成的プロモーターであると考えられる（９６－１００）。
[000126]単独またはプロモーターと組み合わせて使用可能な他の調節エレメントのように、多種多様なプロモーターが当業者に公知である。単細胞生物内で転写を方向づける多種多様なプロモーターを、本発明と関連させて使用することができる（８８－９０）。機能性細菌プロモーターの同定および使用に必要な特徴（結合部位および調節エレメント）は、当業者に公知である（９１－９３）。本発明を説明する目的で、プロモーターは、２つの型、すなわち、構成的プロモーターおよび非構成的プロモーターに分けられる（８９、９４）。構成的プロモーターは、広範な構成的発現をもたらすものとして分類される。弱構成的プロモーターも存在すれば、強構成的プロモーターも存在する（９５）。他のプロモーターは、非構成的プロモーターであると考えられる（９６－１００）。
【0091】
[000127]ターミネーター
[000128]適するプロモーターの選択に加えて、ＤＮＡ構築物は、単細胞生物における適切な発現のために、本発明の所望の遺伝子の終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＧまたはＴＡＡ）の後に下流（３’）に結合する適切な転写ターミネーターを必要とする。このようないくつかのターミネーターが利用可能であり、当業者に公知である。ターミネーターは、ＲＮＡのプロセシングおよび安定性ならびに翻訳において重要な役割を果たし、遺伝子発現をも制御し得る（１０１－１１０）。単細胞生物における遺伝子の発現に必要とされるターミネーターの同定および使用は、当業者に公知である。
[000128]適するプロモーターの選択に加えて、ＤＮＡ構築物は、単細胞生物における適切な発現のために、本発明の所望の遺伝子の終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＧまたはＴＡＡ）の後に下流（３’）に結合する適切な転写ターミネーターを必要とする。このようないくつかのターミネーターが利用可能であり、当業者に公知である。ターミネーターは、ＲＮＡのプロセシングおよび安定性ならびに翻訳において重要な役割を果たし、遺伝子発現をも制御し得る（１０１－１１０）。単細胞生物における遺伝子の発現に必要とされるターミネーターの同定および使用は、当業者に公知である。
【0092】
[000129]選択可能性マーカー
[000130]選択可能性マーカーは、通常、抗生剤、除草剤もしくは化学物質に対する耐性を付与するか、または形質転換生物の同定に役立つ色の変化をもたらす。ベクターは、ＲＮＡ安定性シグナルも含んでもよく、これは、転写ＲＮＡの安定性を向上させる３’調節配列エレメントである（１１１、１１２）。
[000130]選択可能性マーカーは、通常、抗生剤、除草剤もしくは化学物質に対する耐性を付与するか、または形質転換生物の同定に役立つ色の変化をもたらす。ベクターは、ＲＮＡ安定性シグナルも含んでもよく、これは、転写ＲＮＡの安定性を向上させる３’調節配列エレメントである（１１１、１１２）。
【0093】
[000131]色素体輸送ペプチド
[000132]本発明は、葉緑体への形質転換を標的とし得る。藻類における葉緑体標的化形質転換系は、当業者に公知である（９７、９９、１１３－１１５）。
[000132]本発明は、葉緑体への形質転換を標的とし得る。藻類における葉緑体標的化形質転換系は、当業者に公知である（９７、９９、１１３－１１５）。
【0094】
[000133]本発明と関連させて使用することが可能になる、多種多様な色素体輸送ペプチドは、当業者に公知である。任意のＣＤＯ、ＳＡＤ、ＧＡＤ、ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ、ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ、ＴａｕＡまたはＴａｕＫポリペプチドを色素体に標的化するのに使用可能な、適する輸送ペプチドとしては、本明細書に記載のもの、米国特許第８，７７９，２３７号（１１６）、第８，６７４，１８０号（１１７）、第８，４２０，８８８号（１１８）、および第８，１３８，３９３号（１１９）に記載のもの、ならびにＬｅｅら（１２０）およびｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら（１２１）に記載のものが挙げられるが、これらに制限されない。藻類における葉緑体色素体標的化配列の同定および使用は、当業者に公知である（１２２－１２５）。ポリペプチドをコードする核酸配列の上流およびインフレームでの輸送ペプチドをコードする核酸配列のクローニングは、当業者に公知の標準的分子技術を含む。
【0095】
[000134]適するベクター
[000135]本発明に従って生成または選択された構築物で単細胞生物を形質転換するために、高または低コピー数プラスミド、ファージベクター、およびコスミドを含む、多種多様なベクターを利用し得る。ベクター系、発現カセット、培養方法、および形質転換方法は、当業者に公知である。ベクターは、動作可能に結合されるプロモーターおよび本発明の所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、単細胞生物のゲノムに組み込まれるように選択され得る。プロモーターおよび本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合することができる他のベクターは、宿主ゲノムには組み込まれないが、クローンポリヌクレオチドを有するベクターＤＮＡは、細胞内で自律的または半自律的に複製される。本発明の好ましい実施形態は、単細胞生物において発現されるが、他の実施形態は、制限されないが、酵母、真菌、藻類、微細藻類または微生物を含む、原核生物または単細胞真核生物における発現を含み得る。
[000135]本発明に従って生成または選択された構築物で単細胞生物を形質転換するために、高または低コピー数プラスミド、ファージベクター、およびコスミドを含む、多種多様なベクターを利用し得る。ベクター系、発現カセット、培養方法、および形質転換方法は、当業者に公知である。ベクターは、動作可能に結合されるプロモーターおよび本発明の所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、単細胞生物のゲノムに組み込まれるように選択され得る。プロモーターおよび本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合することができる他のベクターは、宿主ゲノムには組み込まれないが、クローンポリヌクレオチドを有するベクターＤＮＡは、細胞内で自律的または半自律的に複製される。本発明の好ましい実施形態は、単細胞生物において発現されるが、他の実施形態は、制限されないが、酵母、真菌、藻類、微細藻類または微生物を含む、原核生物または単細胞真核生物における発現を含み得る。
【0096】
[000136]本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な発現系が多数存在することは、当業者に公知である。単細胞生物を形質転換する多くの市販の組換えベクターが存在する。標準的な分子技術およびクローニング技術（７７、８０、１２６）が、本発明の所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する組換え発現カセットの生成に利用可能である。原核生物または真核生物におけるタンパク質の発現について公知の種々の方法を、詳細に記載する試みは行わない。簡潔には、本発明のタンパク質をコードする単離核酸の発現は、典型的には、例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡをプロモーターに動作可能に結合した後、発現ベクターに組み込むことにより達成される。ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかにおける複製および組込みに適し得る。典型的発現ベクターは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に有用な、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含む。クローン遺伝子の高レベルな発現を得るために、最低でも、転写を方向づける強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含む発現ベクターを構築することが望ましい。
【0097】
[000137]原核生物における発現
[000138]原核生物における使用のための、形質転換のためのプロトコル、および転写開始のためのプロモーターを含む制御配列をリボソーム結合部位配列とともに有する一般に使用されるベクター（一部はオペレーターを有する）は、当業者に公知である。当業者は、細菌系に使用される分子技術およびＤＮＡベクターを熟知している（１２７－１３１）。細菌では、１つのメッセンジャーＲＮＡは、１つのペプチド（モノシストロン性と呼ばれる）またはいくつかの独立的ペプチド（ポリシストロン性と呼ばれる）をコードすることができる。ポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡの部分はノックアウト可能であること（１３２）、または異種性もしくは外因性遺伝子はモノシストロン性もしくはポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡ上で発現可能であること（１３０、１３１）が当業者に公知である。遺伝子は、ノックイン、遺伝子挿入の使用を通して、またはアレル交換により、細菌ＤＮＡ（ゲノム）の修飾によって発現され得る（１３３－１３８）。ＰＣＲに基づく方法（１３９）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（１４０－１４２）を使用する特異的遺伝子標的化が、細菌において使用されている。
[000138]原核生物における使用のための、形質転換のためのプロトコル、および転写開始のためのプロモーターを含む制御配列をリボソーム結合部位配列とともに有する一般に使用されるベクター（一部はオペレーターを有する）は、当業者に公知である。当業者は、細菌系に使用される分子技術およびＤＮＡベクターを熟知している（１２７－１３１）。細菌では、１つのメッセンジャーＲＮＡは、１つのペプチド（モノシストロン性と呼ばれる）またはいくつかの独立的ペプチド（ポリシストロン性と呼ばれる）をコードすることができる。ポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡの部分はノックアウト可能であること（１３２）、または異種性もしくは外因性遺伝子はモノシストロン性もしくはポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡ上で発現可能であること（１３０、１３１）が当業者に公知である。遺伝子は、ノックイン、遺伝子挿入の使用を通して、またはアレル交換により、細菌ＤＮＡ（ゲノム）の修飾によって発現され得る（１３３－１３８）。ＰＣＲに基づく方法（１３９）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（１４０－１４２）を使用する特異的遺伝子標的化が、細菌において使用されている。
【0098】
[000139]藻類および微細藻類における発現
[000140]形質転換のためのプロトコル、ならびに藻類および微細藻類における使用のためのリボソーム結合部位配列とともに、転写開始のためのプロモーター、任意選択でオペレーターを含む制御配列を有する一般に使用されるベクターは、当業者に公知である（８９、１１３、１４３－１５３）。ＺＦＮ（１５４）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（１５５）を含む特異的遺伝子標的化系が、藻類において使用されている。
[000140]形質転換のためのプロトコル、ならびに藻類および微細藻類における使用のためのリボソーム結合部位配列とともに、転写開始のためのプロモーター、任意選択でオペレーターを含む制御配列を有する一般に使用されるベクターは、当業者に公知である（８９、１１３、１４３－１５３）。ＺＦＮ（１５４）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（１５５）を含む特異的遺伝子標的化系が、藻類において使用されている。
【0099】
[000141]非植物真核生物における発現
[000142]形質転換のためのプロトコルおよび一般に使用されるベクターは、当業者に公知である。単細胞真核生物における使用のための、転写開始のためのプロモーターおよびリボソーム結合部位配列を含む制御配列も当業者に公知である。本発明では、多様な真核生物発現系、例えば、酵母および原生生物において発現させることができる。ベクターは、通常、発現制御配列、例えば、プロモーター、複製起点、エンハンサー配列、終結配列、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列、および選択可能性マーカーを有する（１５６、１５７）。本発明とともに使用可能な、当業者に公知の多数のベクターが存在し、ｐＲＥＰ、ｐＲＩＰ、ｐＤ９１２、ｐＤ１２０１、ｐＤ１２１１、ｐＤ１２２１、ｐＤ１２３１、ｐＹＥＳ２／ＮＴ、ｐＹＳＧ－ＩＢＡまたはｐＥＳＣ－ＴＲＰを含むが、これらに制限されない。酵母における異種性タンパク質の合成および生成物の発酵は、当業者に公知である（１５８、１５９）。使用可能な原生生物としては、繊毛虫、アメーバ、および鞭毛虫が挙げられるが、これらに制限されない。本発明とともに使用可能な酵母および真菌ならびに形質転換のための分子プロトコル、このような系における遺伝子の発現に必要とされるベクターは、当業者に公知である（１６０－１６５）。広汎なベクターが利用可能である。プラスミドベクターも利用可能であり、これは、組込み可能な、自己複製高コピー数ベクターまたは自己複製低コピー数ベクターであり得る（１６６、１６７）。宿主において染色体変異を補完する、最も一般的なベクターとしては、機能性遺伝子、例えば、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２が挙げられる。単細胞真菌では、ＰＣＲに基づく方法（１６８－１７０）を使用して、特定の遺伝子の編集または標的化が使用されている。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（１７１）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（１７２）、およびクラスター化した規則的配置の短い回文リピート／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）（１７３、１７４）。
[000142]形質転換のためのプロトコルおよび一般に使用されるベクターは、当業者に公知である。単細胞真核生物における使用のための、転写開始のためのプロモーターおよびリボソーム結合部位配列を含む制御配列も当業者に公知である。本発明では、多様な真核生物発現系、例えば、酵母および原生生物において発現させることができる。ベクターは、通常、発現制御配列、例えば、プロモーター、複製起点、エンハンサー配列、終結配列、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列、および選択可能性マーカーを有する（１５６、１５７）。本発明とともに使用可能な、当業者に公知の多数のベクターが存在し、ｐＲＥＰ、ｐＲＩＰ、ｐＤ９１２、ｐＤ１２０１、ｐＤ１２１１、ｐＤ１２２１、ｐＤ１２３１、ｐＹＥＳ２／ＮＴ、ｐＹＳＧ－ＩＢＡまたはｐＥＳＣ－ＴＲＰを含むが、これらに制限されない。酵母における異種性タンパク質の合成および生成物の発酵は、当業者に公知である（１５８、１５９）。使用可能な原生生物としては、繊毛虫、アメーバ、および鞭毛虫が挙げられるが、これらに制限されない。本発明とともに使用可能な酵母および真菌ならびに形質転換のための分子プロトコル、このような系における遺伝子の発現に必要とされるベクターは、当業者に公知である（１６０－１６５）。広汎なベクターが利用可能である。プラスミドベクターも利用可能であり、これは、組込み可能な、自己複製高コピー数ベクターまたは自己複製低コピー数ベクターであり得る（１６６、１６７）。宿主において染色体変異を補完する、最も一般的なベクターとしては、機能性遺伝子、例えば、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２が挙げられる。単細胞真菌では、ＰＣＲに基づく方法（１６８－１７０）を使用して、特定の遺伝子の編集または標的化が使用されている。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（１７１）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（１７２）、およびクラスター化した規則的配置の短い回文リピート／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）（１７３、１７４）。
【0100】
[000143]当業者は、その生物学的活性を低下させることなく、本発明のタンパク質に修飾が行われ得ることを認識している。一部の修飾は、クローニング、発現、標的化を容易とするため、または宿主におけるポリペプチドの位置を方向づけるため、または精製のために行われ得る。このような修飾は、当業者に公知であり、例えば、開始部位を提供するためのアミノ末端におけるメチオニンの付加、制限部位または終結部位を挿入するための核酸の付加を含む。
【0101】
[000144]加えて、ポリヌクレオチドは、単細胞生物の形質転換に使用される適切なベクターに配置することができる。ポリペプチドを、発現させ、次いで、形質転換細胞から単離し得るか、または代謝物を合成し、形質転換細胞から単離し得る。このような遺伝子導入生物を、回収し、大規模なタンパク質または代謝物（タウリン）の抽出技術および精製技術に供することができる。
【0102】
[000145]ベクターは、シグナルポリペプチドまたはシグナル配列（「細胞内位置配列」）をコードし、宿主細胞内の所望のポリペプチドを方向づけて、ポリペプチドを特定の細胞コンパートメント、細胞内コンパートメントまたは膜に蓄積させる、別のポリヌクレオチドを含み得る。特定の細胞コンパートメントは、真菌または藻類の液胞、葉緑体（真菌にはない）、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、分泌経路、リソソーム、小胞体、核またはゴルジ体を含む。細菌において細胞膜周辺腔へのペプチドの輸送を方向づける、特定のシグナルポリペプチドまたはシグナル配列が存在する（１７５－１７７）。シグナルポリペプチドまたはシグナル配列は、通常、アミノ末端に存在し、通常、ポリペプチドが最終目的地に達する場合プロテアーゼがシグナルペプチドを除去するため、成熟タンパク質に存在しない。シグナル配列は、Ｎ末端（１２１、１７８－１８０）、Ｃ末端（１８１、１８２）または内部（１８３－１８５）または三次構造（１８５）に位置する一次配列であり得る。ポリペプチドを方向づけるシグナルポリペプチドまたはシグナル配列がベクター上に存在しない場合、当業者が、シグナルポリペプチドまたはシグナル配列をコードするのに必要な追加のヌクレオチドを、適切なヌクレオチドのライゲーションまたはＰＣＲにより組み込むことが可能であることが予想される。当業者は、シグナルポリペプチドまたはシグナル配列のヌクレオチド配列を、コンピューターツールを使用して同定することができる。標的とする配列またはシグナル配列の同定に利用可能な多数のコンピューターツールが存在する。これらとしては、ＴａｒｇｅｔＰ（１８６、１８７）、ｉＰＳＯＲＴ（１８８）、ＳｉｇｎａｌＰ（１８９）、ＰｒｅｄｉＳｉ（１９０）、ＥＬＳｐｒｅｄ（１９１）、ＨＳＬｐｒｅｄ（１９２）およびＰＳＬｐｒｅｄ（１９３）、ＭｕｌｔｉＬｏｃ（１９４）、ＳｈｅｒＬｏｃ（１９５）、ＣｈｌｏｒｏＰ（１９６）、ＭＩＴＯＰＲＯＴ（１９７）、Ｐｒｅｄｏｔａｒ（１９８）、３Ｄ－ＰＳＳＭ（１９９）、ならびにＰｒｅｄＡｌｇｏ（１２５）が挙げられるが、これらに制限されない。さらなる方法およびプロトコルは、文献において論じられている（１９４）。
【0103】
[000146]宿主細胞の形質転換
[000147]単細胞生物の形質転換は、当業者の範囲内の多種多様な方法により達成することができる（８８、９０、１５１、２００）。当業者は、種々の藻類、珪藻類、真菌、酵母、および細菌の遺伝子導入技術を使用することができ、これは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介（２０１）ガラスビーズおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（２０２、２０３）、エレクトロポレーション（２０４－２０７）、微粒子銃もしくは弾道粒子加速（２０８－２１２）、炭化ケイ素ウィスカー法（２１３、２１４）、ウイルス感染（２１５、２１６）またはトランスポゾン／トランスポザーゼ複合体（２１７）を含むが、これらに制限されない。形質転換では、オルガネラ（ｏｒｇａｎｅｌｌｕｌａｒ）ゲノムを標的とすることができる（１１５）。細菌、真菌、藻類ゲノム内に遺伝子を編集するか、組み込むか、または移動する他の方法としては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはクラスター化した規則的配置の短い回文リピート／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）が挙げられるが、これらに制限されない。
[000147]単細胞生物の形質転換は、当業者の範囲内の多種多様な方法により達成することができる（８８、９０、１５１、２００）。当業者は、種々の藻類、珪藻類、真菌、酵母、および細菌の遺伝子導入技術を使用することができ、これは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介（２０１）ガラスビーズおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（２０２、２０３）、エレクトロポレーション（２０４－２０７）、微粒子銃もしくは弾道粒子加速（２０８－２１２）、炭化ケイ素ウィスカー法（２１３、２１４）、ウイルス感染（２１５、２１６）またはトランスポゾン／トランスポザーゼ複合体（２１７）を含むが、これらに制限されない。形質転換では、オルガネラ（ｏｒｇａｎｅｌｌｕｌａｒ）ゲノムを標的とすることができる（１１５）。細菌、真菌、藻類ゲノム内に遺伝子を編集するか、組み込むか、または移動する他の方法としては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはクラスター化した規則的配置の短い回文リピート／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）が挙げられるが、これらに制限されない。
【0104】
[000148]変異誘発または組換え技術による遺伝子サイレンシング
[000149]単細胞生物の遺伝子または対応する遺伝子産物をサイレンシングまたは不活性化する遺伝子修飾は、放射線、化学物質またはＵＶに基づく変異誘発の後、生物化学的形質または経路についての特異的スクリーニングにより行うことができる（２００、２１８－２２２）。放射線に基づく変異では、ＤＮＡの切断および修復によって遺伝子または対応する遺伝子産物をサイレンシングまたは不活性化することができる。化学物質またはＵＶに基づく変異により、通常、単一のＤＮＡ塩基対の変化が生じる。変異により、次の：（１）フレームシフト変異の導入、（２）未成熟終止コドンの導入、（３）所望のヌクレオチド配列の転写を方向づけるプロモーター領域配列の能力の干渉、（４）プロモーター配列領域により転写される所望のヌクレオチド配列の能力の干渉、あるいは（５）活性（酵素活性もしくは結合）を低下もしくは阻害するまたは遺伝子産物の機能を妨害するための遺伝子産物におけるアミノ酸置換の導入のうちの１つによって、遺伝子または対応する遺伝子産物をサイレンシングまたは不活性化することができる。
[000149]単細胞生物の遺伝子または対応する遺伝子産物をサイレンシングまたは不活性化する遺伝子修飾は、放射線、化学物質またはＵＶに基づく変異誘発の後、生物化学的形質または経路についての特異的スクリーニングにより行うことができる（２００、２１８－２２２）。放射線に基づく変異では、ＤＮＡの切断および修復によって遺伝子または対応する遺伝子産物をサイレンシングまたは不活性化することができる。化学物質またはＵＶに基づく変異により、通常、単一のＤＮＡ塩基対の変化が生じる。変異により、次の：（１）フレームシフト変異の導入、（２）未成熟終止コドンの導入、（３）所望のヌクレオチド配列の転写を方向づけるプロモーター領域配列の能力の干渉、（４）プロモーター配列領域により転写される所望のヌクレオチド配列の能力の干渉、あるいは（５）活性（酵素活性もしくは結合）を低下もしくは阻害するまたは遺伝子産物の機能を妨害するための遺伝子産物におけるアミノ酸置換の導入のうちの１つによって、遺伝子または対応する遺伝子産物をサイレンシングまたは不活性化することができる。
【0105】
[000150]標的化遺伝子サイレンシングまたはノックアウトは、単細胞生物において、ファージもしくはウイルス（９４、２２３－２２７）、トランスポゾン（２１７、２２８－２３１）、ＰＣＲを使用する標的化（１６８－１７０、２３２）、リコンビナーゼを使用して、またはアレル交換（１３３－１３８）により行うことができる。標的化およびランダム細菌遺伝子破壊は、グループＩＩイントロン（Ｔａｒｇｅｔｒｏｎ）（２３３、２３４）、ＺＮＦ（１７１）、ＴＡＬＥＮ（１７２）、ＣＲＩＳＰＥＲ－Ｃａｓ９またはクラスター化した規則的配置の短い回文リピート干渉（ＣＲＩＳＰｉ）（１４０－１４２、１７３、１７４、２３５、２３６）を使用して行うことができる。加えて、ＲＮＡ媒介方法（２３７－２４２）または調節ＲＮＡ（２４３－２４５）が、単細胞生物における遺伝子発現のサイレンシングまたは抑制に使用されており、このような技術およびプロトコルは、当業者に周知である。
【0106】
[000151]適する単細胞生物
[000152]本発明では、原核宿主細胞および単細胞真核宿主細胞を含む、多種多様な単細胞宿主細胞を使用し得る。これらの細胞または生物は、酵母、真菌、藻類、微細藻類、微生物または単細胞光合成生物を含み得る。本発明に好ましい宿主細胞は、古細菌および真正細菌を含む細菌である。プロテオバクテリア、例えば、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびイプシロンプロテオバクテリア（Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーは、本発明の宿主となり得る。メタン資化性菌（Ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｓ）およびメチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（２４６）を含む他の細菌は、本発明とともに使用され得る。本発明の宿主となり得る他の細菌属としては、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ）が挙げられるが、これらに制限されない。本発明に使用可能な一部の特定の細菌種としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅ）、コリネバクテリウム・クレナタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅｎａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・ペキネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｓｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム、エルウィニア・シトレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｉｔｒｅｕｓ）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、大腸菌、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｅｉｉ）、プロピオニバクテリウム・デニトリフィカンス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（５０）が挙げられるが、これらに制限されない。
[000152]本発明では、原核宿主細胞および単細胞真核宿主細胞を含む、多種多様な単細胞宿主細胞を使用し得る。これらの細胞または生物は、酵母、真菌、藻類、微細藻類、微生物または単細胞光合成生物を含み得る。本発明に好ましい宿主細胞は、古細菌および真正細菌を含む細菌である。プロテオバクテリア、例えば、アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびイプシロンプロテオバクテリア（Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーは、本発明の宿主となり得る。メタン資化性菌（Ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｓ）およびメチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（２４６）を含む他の細菌は、本発明とともに使用され得る。本発明の宿主となり得る他の細菌属としては、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ）が挙げられるが、これらに制限されない。本発明に使用可能な一部の特定の細菌種としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅ）、コリネバクテリウム・クレナタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅｎａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・ペキネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｓｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム、エルウィニア・シトレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｉｔｒｅｕｓ）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、大腸菌、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｅｉｉ）、プロピオニバクテリウム・デニトリフィカンス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（５０）が挙げられるが、これらに制限されない。
【0107】
[000153]単細胞藻類、単細胞光合成生物、および顕微鏡的藻類（微小植物または微細藻類）の細胞を本発明において使用し得る。これらとしては、珪藻類、緑藻類（緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ））、ならびにユーグレナ植物門（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、渦鞭毛虫門（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、黄金色植物門（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物門（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）、紅藻類（紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ））、不等毛藻（Ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、およびラン藻（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）のメンバーが挙げられるが、これらに制限されない。本発明は、タウリンを合成することが示されている藻類（２８）またはタウリンを合成する能力を有し得る（２８）藻類において、タウリンをタウリン結合タンパク質と結合させること、またはタウリン分解のための遺伝子をノックアウトすることによりタウリンを増加させるためにも使用され得る。これらとしては、コッコミクサ（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ）種、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）種、トレボキシア・インプレッサ（Ｔｒｅｂｏｕｘｉａ ｉｍｐｒｅｓｓａ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）種、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ミクロモナス・プシラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）、オステレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）、ナビキュラ・ラディオーサ（Ｎａｖｉｃｕｌａ ｒａｄｉｏｓａ）、フェオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、シュードニッチア・マルチセリエス（Ｐｓｅｕｄｏ－ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｍｕｌｔｉｓｅｒｉｅｓ）、フラジラリオプシス・シリンドラス（Ｆｒａｇｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｃｙｌｉｎｄｒｕｓ）、タラシオシラ・ウェイスフロギー（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｅａｎｉｃａ）、オレオコッカス・アノファジェフェレンス（Ａｕｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｏｐｈａｇｅｆｆｅｒｅｎｓ）、マコンブ（Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、ホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）種、およびビゲロウィエラ・ナタンス（Ｂｉｇｅｌｏｗｉｅｌｌａ ｎａｔａｎｓ）が挙げられるが、これらに制限されない。
【0108】
[000154]本発明において使用され得る原生生物としては、繊毛虫、アメーバ、および鞭毛虫が挙げられるが、これらに制限されない。使用可能な酵母および単細胞真菌としては、アシュビヤ・ゴシピー（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒｉ）、エレモテシウム・アシュビー（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ）、モルティエレラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ、および分裂酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が挙げられるが、これらに制限されない。
【0109】
[000155]形質転換すると、増殖前または増殖中のいずれかに単細胞生物を他の「活性物質」で処理して、タウリンの生成をさらに増加させ得る。「活性物質」は、本明細書において使用する場合、単細胞生物によるタウリン生成に対して有利な作用を有する物質を指す。イオウ含有コンパウンド、例えば、亜硫酸、硫化物、硫化水素、硫酸、タウリン、ヒポタウリン、システエート、２－スルフアセトアルデヒド、ホモタウリン、ホモシステイン、シスタチオニン、Ｎ－アセチルチアゾリジン４カルボン酸（ＡＴＣＡ）、グルタチオンもしくは胆汁、または他の非タンパク質アミノ酸、例えば、ＧＡＢＡ、シトルリンおよびオルニチン、あるいは他の窒素含有コンパウンド、例えば、ポリアミンをも使用してタウリン生成を促進し得る。遺伝子構築物または組換え発現カセットの種類に応じて、他の代謝物および栄養素を使用し得る。これらとしては、糖、炭水化物、脂質、オリゴペプチド、単糖（グルコース、アラビノース、フルクトース、キシロース、およびリボース）、二糖（スクロースおよびトレハロース）、および多糖、カルボン酸（コハク酸、リンゴ酸、およびフマル酸）、ビタミン、ならびに栄養素、例えば、リン酸、モリブデン酸または鉄が挙げられるが、これらに制限されない。
【0110】
[000156]一部の実施形態では、遺伝子導入単細胞生物の特性は、細胞内のイオウ濃度を上昇させる物質、例えば、イオウ、亜硫酸、硫化物、硫化水素、硫酸、タウリン、ヒポタウリン、ホモタウリン、システエート、２－スルフアセトアルデヒド、Ｎ－アセチルチアゾリジン４カルボン酸（ＡＴＣＡ）、グルタチオン、および胆汁を使用して変更される。他の実施形態では、物質は、窒素濃度を上昇させる。タンパク質に天然に存在するアミノ酸（例えば、システイン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、アラニンもしくはグリシン）またはタンパク質に天然には存在しないアミノ酸（例えば、ＧＡＢＡ、シトルリンもしくはオルニチン）のいずれか、および／あるいはポリアミンを、この目的のために使用し得る。
【0111】
[000157]医薬組成物
[000158]本発明は、上記の１つまたは複数の修飾単細胞生物の抽出物を含む医薬組成物を提供する。ヒポタウリンまたはタウリンを含む抽出物を使用して、タウリン誘導体（２４７、２４８）、タウリンコンジュゲート（２４９）またはタウリンポリマー（２５０）を合成または製造することができ、これらは広範な商業適用および薬用適用を有し得る（２５１）。一部のタウリン誘導体は、有機ゲル化剤（２５２）または色素（２５３）として機能することができ、ナノセンサーの合成（２５４）において使用され得る。一部のタウリン誘導体は、抗痙攣（２４７）または抗がん（２５５）特性を有する。他のタウリン誘導体は、アルコール依存（２５６、２５７）の治療において使用される。タウリンコンジュゲート・カルボキシエチルエステル・ポリロタキサンは、抗凝固活性を上昇させる（２５８）。タウリン含有ポリマーは、創傷治癒（２５９、２６０）を向上させ得る。タウリン結合ポリマー、例えば、ポリガンマ・グルタミン酸・スルホネートは、生物分解性であり、薬物送達系、環境物質、組織工学、および医用素材（２６１）の開発における適用を有し得る。タウリン含有細胞の抽出物は、医薬または薬用組成物において使用され、タウリン、ヒポタウリン、タウリンコンジュゲートまたはタウリンポリマーを送達して、うっ血性心不全、高血圧、肝炎、高コレステロール、線維症、癲癇、自閉症、注意欠陥多動障害、網膜変性症、糖尿病、およびアルコール依存の治療において使用され得る。これは、精神機能を向上させるため、抗酸化剤としても使用される。
[000158]本発明は、上記の１つまたは複数の修飾単細胞生物の抽出物を含む医薬組成物を提供する。ヒポタウリンまたはタウリンを含む抽出物を使用して、タウリン誘導体（２４７、２４８）、タウリンコンジュゲート（２４９）またはタウリンポリマー（２５０）を合成または製造することができ、これらは広範な商業適用および薬用適用を有し得る（２５１）。一部のタウリン誘導体は、有機ゲル化剤（２５２）または色素（２５３）として機能することができ、ナノセンサーの合成（２５４）において使用され得る。一部のタウリン誘導体は、抗痙攣（２４７）または抗がん（２５５）特性を有する。他のタウリン誘導体は、アルコール依存（２５６、２５７）の治療において使用される。タウリンコンジュゲート・カルボキシエチルエステル・ポリロタキサンは、抗凝固活性を上昇させる（２５８）。タウリン含有ポリマーは、創傷治癒（２５９、２６０）を向上させ得る。タウリン結合ポリマー、例えば、ポリガンマ・グルタミン酸・スルホネートは、生物分解性であり、薬物送達系、環境物質、組織工学、および医用素材（２６１）の開発における適用を有し得る。タウリン含有細胞の抽出物は、医薬または薬用組成物において使用され、タウリン、ヒポタウリン、タウリンコンジュゲートまたはタウリンポリマーを送達して、うっ血性心不全、高血圧、肝炎、高コレステロール、線維症、癲癇、自閉症、注意欠陥多動障害、網膜変性症、糖尿病、およびアルコール依存の治療において使用され得る。これは、精神機能を向上させるため、抗酸化剤としても使用される。
【0112】
[000159]タウリン、タウリン誘導体、タウリンコンジュゲートまたはタウリンポリマーの薬学的に許容される溶媒は、錠剤、カプセル、ゲル、軟膏、フィルム、パッチ、粉末であるか、または液体の形態中に溶解される。
【0113】
[000160]栄養補助食品および飼料
[000161]ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞は消費され、または栄養補助食品のための抽出物を生成するために使用され得る。ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞は、ヒトの食用に使用され得る。ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞の抽出物は、栄養補助食品として、抗酸化剤として、または身体的機能もしくは精神的機能を向上させるために使用され得る。抽出物は、液体、粉末、カプセルまたは錠剤の形態で使用され得る。
[000161]ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞は消費され、または栄養補助食品のための抽出物を生成するために使用され得る。ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞は、ヒトの食用に使用され得る。ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞の抽出物は、栄養補助食品として、抗酸化剤として、または身体的機能もしくは精神的機能を向上させるために使用され得る。抽出物は、液体、粉末、カプセルまたは錠剤の形態で使用され得る。
【0114】
[000162]ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞は、魚もしくは動物の飼料として使用され得るか、または動物飼料の補助食品用の抽出物を生成するために使用され得る。ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞は、動物または魚の飼料として使用され得る。タウリンを含む遺伝子導入細胞の抽出物は、飼料の補助剤として、液体、粉末、カプセルまたは錠剤の形態で使用され得る。
【0115】
[000163]植物の成長または収率の増強剤
[000164]ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞は、植物の成長または収率の増強剤として使用され得る。ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞の抽出物は、植物増強剤として、液体、粉末、カプセルまたは錠剤の形態で使用され得る。
[000164]ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞は、植物の成長または収率の増強剤として使用され得る。ヒポタウリンまたはタウリンを含む遺伝子導入細胞の抽出物は、植物増強剤として、液体、粉末、カプセルまたは錠剤の形態で使用され得る。
【0116】
定義
[000165]「ポリヌクレオチド」の用語は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、およびこれらの誘導体を含むヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドの天然または合成で直鎖状および連続アレイを指す。これは、染色体ＤＮＡ、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および一次構造的役割を果たすＤＮＡまたはＲＮＡを含む。他に指示しない限り、核酸またはポリヌクレオチドは、５’から３’方向に左から右へ記載される。ヌクレオチドは、一般に認められた１文字コードによって参照される。数値範囲は、範囲を画定する数を含む。
[000165]「ポリヌクレオチド」の用語は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、およびこれらの誘導体を含むヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドの天然または合成で直鎖状および連続アレイを指す。これは、染色体ＤＮＡ、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および一次構造的役割を果たすＤＮＡまたはＲＮＡを含む。他に指示しない限り、核酸またはポリヌクレオチドは、５’から３’方向に左から右へ記載される。ヌクレオチドは、一般に認められた１文字コードによって参照される。数値範囲は、範囲を画定する数を含む。
【0117】
[000166]「増幅した（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）」および「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」の用語は、核酸配列のうちの少なくとも１つを鋳型として使用する、核酸配列の複数のコピーまたは核酸配列に相補的な複数のコピーの構築を指す。増幅は、次の方法、例えば、固相ホスホロアミド酸技術またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のいずれかを使用して、化学合成により達成され得る。他に増幅系としては、リガーゼ連鎖反応系、核酸配列に基づく増幅、Ｑベータレプリカーゼ系、転写に基づく増幅系、および鎖置換増幅が挙げられる。増幅産物は、アンプリコンと呼ばれる。
【0118】
[000167]本明細書において使用する場合、「プロモーター」は、転写開始点から上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩもしくはＩＩＩのいずれか、および転写を開始するための他のタンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡ領域への言及を含む。プロモーターは、転写開始部位付近に必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合では、ＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターは、任意選択で、遠位エンハンサーまたは抑制エレメントも含み、これは、転写開始部位から数千の塩基対の範囲にまで配置され得る。細菌では、プロモーターは、ＡＧＧＡＧＧの配列（－３５ボックス）を含み得るシャイン・ダルガーノまたはリボソーム結合部位、およびＴＡＴＡＡＴの配列（－１０ボックス）を含み得るプリブノーボックスまたはＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む。
【0119】
[000168]「藻類プロモーター」の用語は、藻類細胞において転写を開始することが可能なプロモーターを指す。
[000169]「外来プロモーター」の用語は、生得的または天然のプロモーター以外のプロモーターを指し、これは、微生物、植物、植物ウイルス、無脊椎動物または脊椎動物由来のＤＮＡを含む、ウイルス、細菌または真核生物起源の、ある長さのＤＮＡの転写を促進する。
[000169]「外来プロモーター」の用語は、生得的または天然のプロモーター以外のプロモーターを指し、これは、微生物、植物、植物ウイルス、無脊椎動物または脊椎動物由来のＤＮＡを含む、ウイルス、細菌または真核生物起源の、ある長さのＤＮＡの転写を促進する。
【0120】
[000170]「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」の用語は、任意の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）（真核微生物と原核微生物との両方を含む）、例えば、細菌、真菌、酵母、細菌、藻類、および原生生物、ならびに他の単細胞生物を指す。
【0121】
[000171]「構成的」の用語は、最も環境的および発生的な条件下で活性なプロモーター、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等を指すが、これに制限されない。
[000172]「誘導性プロモーター」の用語は、化学的（生体分子、例えば、糖、有機酸もしくはアミノ酸を含む）または環境的制御下のプロモーターを指す。
[000172]「誘導性プロモーター」の用語は、化学的（生体分子、例えば、糖、有機酸もしくはアミノ酸を含む）または環境的制御下のプロモーターを指す。
【0122】
[000173]「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」および「コードする（ｃｏｄｉｎｇ）」の用語は、ポリヌクレオチドが、転写および翻訳の機構によって細胞に情報をもたらし、これにより、一連のアミノ酸が特定のアミノ酸配列に会合して、機能性ポリペプチド、例えば、活性酵素またはリガンド結合タンパク質等を生成することが可能となるプロセスを指す。
【0123】
[000174]「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、および「遺伝子産物」の用語は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用する。アミノ酸は、一般に公知の３文字または１文字の記号によって表され得る。アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右へそれぞれ記載される。数値範囲は、範囲を画定する数を含む。
【0124】
[000175]「残基」、「アミノ酸残基」、および「アミノ酸」の用語は、本明細書において互換的に使用され、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに組み込まれるアミノ酸を指す。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、天然に存在するアミノ酸と同様に機能し得る天然アミノ酸の公知の類似体を包含してもよい。
【0125】
[000176]「タウリン分解経路」、「タウリン分解酵素」、「タウリン分解系」、および「タウリン分解タンパク質」に関する「分解」の用語は、タウリンの分解、異化（ｃａｔａｂｏｌｉｓｍまたはｄｉｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ）のプロセスを指す。
【0126】
[000177]「システインジオキシゲナーゼ」および「ＣＤＯ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
システイン＋酸素＝３－スルフィノアラニン
注意：３－スルフィノアラニンは、システインスルフィン酸、システインスルフィネート、３－スルフィノ－Ｌ－アラニン（３－ｓｕｌｐｈｉｎｏ－Ｌ－ａｌａｎｉｎｅ）、３－スルフィノ－アラニン、３－スルフィノ－Ｌ－アラニン（３－ｓｕｌｆｉｎｏ－Ｌ－ａｌａｎｉｎｅ）、Ｌ－システインスルフィン酸、Ｌ－システインスルフィン酸、システイン亜硫酸水素エステルまたはアラニン３－スルフィン酸の別名である。
システイン＋酸素＝３－スルフィノアラニン
注意：３－スルフィノアラニンは、システインスルフィン酸、システインスルフィネート、３－スルフィノ－Ｌ－アラニン（３－ｓｕｌｐｈｉｎｏ－Ｌ－ａｌａｎｉｎｅ）、３－スルフィノ－アラニン、３－スルフィノ－Ｌ－アラニン（３－ｓｕｌｆｉｎｏ－Ｌ－ａｌａｎｉｎｅ）、Ｌ－システインスルフィン酸、Ｌ－システインスルフィン酸、システイン亜硫酸水素エステルまたはアラニン３－スルフィン酸の別名である。
【0127】
[000178]「スルフィノアラニンデカルボキシラーゼ（ｓｕｌｆｉｎｏａｌａｎｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」および「ＳＡＤ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
３－スルフィノアラニン＝ヒポタウリン＋ＣＯ２
注意：ＳＡＤは、システイン－スルフィネートデカルボキシラーゼ、Ｌ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ、システイン－スルフィネートデカルボキシラーゼ、ＣＡＤＣａｓｅ／ＣＳＡＤＣａｓｅ、ＣＳＡＤ、システイン酸デカルボキシラーゼ（ｃｙｓｔｅｉｃ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ、システインスルフィネートデカルボキシラーゼ、スルホアラニンデカルボキシラーゼ、スルフィノアラニンデカルボキシラーゼ（ｓｕｌｐｈｉｎｏａｌａｎｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、システエートデカルボキシラーゼ（ｃｙｓｔｅａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＣＡＤ）、システイン酸デカルボキシラーゼ（ｃｙｓｔｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、および３－スルフィノ－Ｌ－アラニンカルボキシ－リアーゼの別名である。
注意：ＳＡＤ反応は、一部のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）によっても触媒される。ＧＡＤと呼ばれるが、この酵素は、ＳＡＤ反応を触媒することが示されている（２２、２３）。
３－スルフィノアラニン＝ヒポタウリン＋ＣＯ２
注意：ＳＡＤは、システイン－スルフィネートデカルボキシラーゼ、Ｌ－システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ、システイン－スルフィネートデカルボキシラーゼ、ＣＡＤＣａｓｅ／ＣＳＡＤＣａｓｅ、ＣＳＡＤ、システイン酸デカルボキシラーゼ（ｃｙｓｔｅｉｃ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ、システインスルフィネートデカルボキシラーゼ、スルホアラニンデカルボキシラーゼ、スルフィノアラニンデカルボキシラーゼ（ｓｕｌｐｈｉｎｏａｌａｎｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、システエートデカルボキシラーゼ（ｃｙｓｔｅａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＣＡＤ）、システイン酸デカルボキシラーゼ（ｃｙｓｔｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、および３－スルフィノ－Ｌ－アラニンカルボキシ－リアーゼの別名である。
注意：ＳＡＤ反応は、一部のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）によっても触媒される。ＧＡＤと呼ばれるが、この酵素は、ＳＡＤ反応を触媒することが示されている（２２、２３）。
【0128】
[000179]ヒポタウリンの他の名称は、２－アミノエタンスルフィネート、２－アミノエチルスルフィン酸、および２－アミノエタンスルフィン酸である。
[000180]タウリンの他の名称は、２－アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルホネート、Ｌ－タウリン、タウリンエチルエステル、およびタウリンケトイソカプロン酸２－アミノエタンスルフィネートである。
[000180]タウリンの他の名称は、２－アミノエタンスルホン酸、アミノエタンスルホネート、Ｌ－タウリン、タウリンエチルエステル、およびタウリンケトイソカプロン酸２－アミノエタンスルフィネートである。
【0129】
[000181]「スレオニンシンターゼ」および「ＴＳ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
Ｏ－ホスホセリンおよび亜硫酸＝システエート
注意：ＴＳは、システエートシンターゼの別名である。
Ｏ－ホスホセリンおよび亜硫酸＝システエート
注意：ＴＳは、システエートシンターゼの別名である。
【0130】
[000182]「ｉｌｖＡ」または「ｉｌｖＡ遺伝子産物」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
セリン＝２－アミノアクリレート
注意：ｉｌｖＡは、セリン／スレオニンデヒドラターゼ、スレオニンデヒドラターゼ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒデヒドラターゼ、スレオニンデアミナーゼ、セリンアンモニアリアーゼ、セリンデヒドラターゼまたはＳＤＨの別名である。
セリン＝２－アミノアクリレート
注意：ｉｌｖＡは、セリン／スレオニンデヒドラターゼ、スレオニンデヒドラターゼ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒデヒドラターゼ、スレオニンデアミナーゼ、セリンアンモニアリアーゼ、セリンデヒドラターゼまたはＳＤＨの別名である。
【0131】
[000183]２－アミノアクリレートの他の名称は、２－アミノアクリル酸、デヒドロアラニン、および２－アミノプロパ－２－エン酸である。
[000184]「３’－ホスホアデニリル硫酸：２’アミノアクリレートＣ－スルホトランスフェラーゼ」または「ＰＡＰＳ－ＡＳ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
２－アミノアクリレート＋３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸＝システエート
[000185]「システアミンジオキシゲナーゼ」および「ＡＤＯ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
２－アミノエタンチオール＋Ｏ２＝ヒポタウリン
ＡＤＯは、２－アミノエタンチオール：酸素オキシドレダクターゼ、ペルスルフラーゼ、システアミンオキシゲナーゼ、およびシステアミン：酸素オキシドレダクターゼの別名である。
[000184]「３’－ホスホアデニリル硫酸：２’アミノアクリレートＣ－スルホトランスフェラーゼ」または「ＰＡＰＳ－ＡＳ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
２－アミノアクリレート＋３’－ホスホアデノシン－５’－ホスホ硫酸＝システエート
[000185]「システアミンジオキシゲナーゼ」および「ＡＤＯ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
２－アミノエタンチオール＋Ｏ２＝ヒポタウリン
ＡＤＯは、２－アミノエタンチオール：酸素オキシドレダクターゼ、ペルスルフラーゼ、システアミンオキシゲナーゼ、およびシステアミン：酸素オキシドレダクターゼの別名である。
【0132】
[000186]２－アミノエタンチオールの他の名称は、システアミンまたは２－アミノエタン－１－チオール、ｂ－メルカプトエチルアミン、２－メルカプトエチルアミン、デカルボキシシステイン、およびチオエタノールアミンである。
【0133】
[000187]「システインリアーゼ」および「ＣＬ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
システイン＋亜硫酸＝システエート＋硫化水素
システインリアーゼの他の名称は、システイン亜硫酸リアーゼおよびシステイン水素－硫化物－リアーゼである。
システイン＋亜硫酸＝システエート＋硫化水素
システインリアーゼの他の名称は、システイン亜硫酸リアーゼおよびシステイン水素－硫化物－リアーゼである。
【0134】
[000188]「タウリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ」および「ＴＰＡＴ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
タウリン＋ピルビン酸＝Ｌ－アラニン＋２－スルホアセトアルデヒド
ＴＰＡＴは、タウリントランスアミナーゼまたはタウリントランスアミナーゼアミノトランスフェラーゼの別名である。「Ｔｐａ」の用語は、ＴＰＡＴをコードする遺伝子を指す。
タウリン＋ピルビン酸＝Ｌ－アラニン＋２－スルホアセトアルデヒド
ＴＰＡＴは、タウリントランスアミナーゼまたはタウリントランスアミナーゼアミノトランスフェラーゼの別名である。「Ｔｐａ」の用語は、ＴＰＡＴをコードする遺伝子を指す。
【0135】
[000189]「タウリンデヒドロゲナーゼ」および「ＴＤＨ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
タウリン＋水＝アンモニア＋２－スルホアセトアルデヒド
ＴＤＨは、タウリン：オキシドレダクターゼ、タウリン：フェリシトクロム－ｃオキシドレダクターゼの別名である。
タウリン＋水＝アンモニア＋２－スルホアセトアルデヒド
ＴＤＨは、タウリン：オキシドレダクターゼ、タウリン：フェリシトクロム－ｃオキシドレダクターゼの別名である。
【0136】
[000190]「ｔａｕＸ」または「ｔａｕＹ」の用語は、それぞれ小型および大型のＴＤＨサブユニットをコードする遺伝子を指す。
[000191]「タウリンジオキシゲナーゼ」および「ＴＤＯ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
タウリン＋２－オキソグルタル酸＋Ｏ２＝亜硫酸＋アミノアセトアルデヒド＋コハク酸＋ＣＯ２
ＴＤＯは、２－アミノエタンスルホネートジオキシゲナーゼ、アルファ－ケトグルタル酸依存性タウリンジオキシゲナーゼ、タウリンまたは２－オキソグルタル酸：Ｏ２オキシドレダクターゼの別名である。
[000191]「タウリンジオキシゲナーゼ」および「ＴＤＯ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
タウリン＋２－オキソグルタル酸＋Ｏ２＝亜硫酸＋アミノアセトアルデヒド＋コハク酸＋ＣＯ２
ＴＤＯは、２－アミノエタンスルホネートジオキシゲナーゼ、アルファ－ケトグルタル酸依存性タウリンジオキシゲナーゼ、タウリンまたは２－オキソグルタル酸：Ｏ２オキシドレダクターゼの別名である。
【0137】
[000192]「ｔａｕＤ」の用語は、ＴＤＯをコードする遺伝子を指す。
[000193]「２成分アルカンスルホネートモノオキシゲナーゼ」または「２ＣＡＳＭ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
タウリン＋Ｏ２＋ＦＭＮＨ２＝アミノアセトアルデヒド＋ＳＯ３ ２＋Ｈ２Ｏ＋ＦＭＮ
または
タウリン＋Ｏ２＋チオレドキシンｒｅｄ＝アミノアセトアルデヒド＋ＳＯ３ ２＋Ｈ２Ｏ＋チオレドキシンｏｘ
[000194]「ｓｓｕＤＥ」、「ｓｓｕＤ」または「ｓｓｕＥ」の用語は、２成分アルカンスルホネートモノオキシゲナーゼ（２ＣＡＳＭ）をコードする遺伝子を指す。
[000193]「２成分アルカンスルホネートモノオキシゲナーゼ」または「２ＣＡＳＭ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
タウリン＋Ｏ２＋ＦＭＮＨ２＝アミノアセトアルデヒド＋ＳＯ３ ２＋Ｈ２Ｏ＋ＦＭＮ
または
タウリン＋Ｏ２＋チオレドキシンｒｅｄ＝アミノアセトアルデヒド＋ＳＯ３ ２＋Ｈ２Ｏ＋チオレドキシンｏｘ
[000194]「ｓｓｕＤＥ」、「ｓｓｕＤ」または「ｓｓｕＥ」の用語は、２成分アルカンスルホネートモノオキシゲナーゼ（２ＣＡＳＭ）をコードする遺伝子を指す。
【0138】
[000195]「システインシンセターゼ／ＰＬＰデカルボキシラーゼ」および「ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ」の用語は、次の反応を触媒するタンパク質を指す。
２－アミノアクリレート＋ＰＡＰＳ＝タウリン
Ｏ－ホスホセリン＋ＰＡＰＳ＝タウリン
Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン＋硫化水素＝タウリン
[000196]「システインシンセターゼ／ＰＬＰデカルボキシラーゼの一部分」および「ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ」の用語は、デカルボキシラーゼ反応を触媒するタンパク質を指し、この反応では、炭素間結合を切断し、次の基質および最終産物を含むが、これらに制限されない。
システイン酸＝２－アミノエタンスルホネート＋ＣＯ２
３－スルフィノアラニン＝ヒポタウリン＋ＣＯ２
グルタミン酸＝４－アミノブタン酸＋ＣＯ２
[000197]４－アミノブタン酸の別名は、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である。
２－アミノアクリレート＋ＰＡＰＳ＝タウリン
Ｏ－ホスホセリン＋ＰＡＰＳ＝タウリン
Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン＋硫化水素＝タウリン
[000196]「システインシンセターゼ／ＰＬＰデカルボキシラーゼの一部分」および「ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ」の用語は、デカルボキシラーゼ反応を触媒するタンパク質を指し、この反応では、炭素間結合を切断し、次の基質および最終産物を含むが、これらに制限されない。
システイン酸＝２－アミノエタンスルホネート＋ＣＯ２
３－スルフィノアラニン＝ヒポタウリン＋ＣＯ２
グルタミン酸＝４－アミノブタン酸＋ＣＯ２
[000197]４－アミノブタン酸の別名は、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である。
【0139】
[000198]ピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）の他の名称は、ビタミンＢ６およびＰ－５－Ｐである。
[000199]「組換え」の用語は、異種核酸の導入により修飾された細胞またはベクターへの言及を含む。組換え細胞は、通常その細胞において見出されない遺伝子を発現するか、またはヒトによる計画的介入の結果として、さもなければ異常に発現するか、低発現するか、もしくはまったく発現しない生得的遺伝子を発現するか、あるいはヒトによる計画的介入の結果として、生得的遺伝子の発現を低下させるか、または除去し得る。
[000199]「組換え」の用語は、異種核酸の導入により修飾された細胞またはベクターへの言及を含む。組換え細胞は、通常その細胞において見出されない遺伝子を発現するか、またはヒトによる計画的介入の結果として、さもなければ異常に発現するか、低発現するか、もしくはまったく発現しない生得的遺伝子を発現するか、あるいはヒトによる計画的介入の結果として、生得的遺伝子の発現を低下させるか、または除去し得る。
【0140】
[000200]「組換え発現カセット」の用語は、組換えまたは合成により生成した、一連の特定の核酸エレメントを有する核酸構築物を指し、これは、標的細胞において特定の核酸の転写を可能とする。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片に組み込まれ得る。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写される核酸およびプロモーターを含む。
【0141】
[000201]「遺伝子導入」の用語は、ゲノム内に異種ポリヌクレオチドを含む単細胞生物への言及を含む。一般には、異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを継続的世代に伝えるようにゲノム内に組み込まれる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノム内に単独で、または組換え発現カセットの部分として組み込まれ得る。「遺伝子導入」は、異種核酸の存在により表現型が変更された、あらゆる細胞も含むように使用され、これは、出芽またはコンジュゲーションによる増殖によって最初の遺伝子導入細胞から変更または生成された細胞を含む。
【0142】
[000202]「ベクター」の用語は、宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換において使用され、ポリヌクレオチドを挿入可能な、核酸への言及を含む。
[000203]「選択的にハイブリダイズする」の用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも検出可能に高度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）の、特定する核酸標的配列への核酸配列のハイブリダイゼーション、および非標的核酸の実質的除外への言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的には、相互に少なくとも約４０％の配列同一性、好ましくは、６０～９０％の配列同一性、最も好ましくは、１００％の配列同一性（すなわち、相補性）を有する。
[000203]「選択的にハイブリダイズする」の用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも検出可能に高度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）の、特定する核酸標的配列への核酸配列のハイブリダイゼーション、および非標的核酸の実質的除外への言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的には、相互に少なくとも約４０％の配列同一性、好ましくは、６０～９０％の配列同一性、最も好ましくは、１００％の配列同一性（すなわち、相補性）を有する。
【0143】
[000204]「ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の用語は、他の配列よりも検出可能に高度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）にプローブが標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、種々の状況で異なる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗浄条件を制御することにより、プローブに対して最大１００％相補性であり得る標的配列を同定することができる（相同性プローブ）。あるいは、ストリンジェンシー条件を調整して一部の不適合を許容することにより、より低度の類似性を検出することができる（異種性プローブ）。最適には、プローブは、およそ５００ヌクレオチドの長さであるが、長さが５００ヌクレオチド未満から標的配列の全長と同等まで大きく変動し得る。
【0144】
[000205]典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には、ｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブでは（例えば、１０～５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃、長いプローブでは（例えば、５０ヌクレオチド超）少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は、不安定化物質、例えば、ホルムアミドまたはデンハート液を加えることによっても達成され得る。低ストリンジェンシー条件は、３０～３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を３７℃で用いたハイブリダイゼーションおよび１×～２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）を５０～５５℃で用いた洗浄を含む。中等度のストリンジェンシー条件は、４０～４５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳを３７℃で用いたハイブリダイゼーションおよび０．５×～１×ＳＳＣを５５～６０℃で用いた洗浄を含む。高ストリンジェンシー条件は、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳを３７℃で用いたハイブリダイゼーションおよび０．１×ＳＳＣを６０～６５℃で用いた洗浄を含む。特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄、決定的因数であるイオン強度、および最終洗浄溶液の温度の関数である。ＤＮＡ間のハイブリッドでは、Ｔｍは近似してもよく（２６２）、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ｆｏｒｍ）－５００／Ｌであり、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡにおけるグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは、塩基対におけるハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補性標的配列の５０％が完全に適合するプローブにハイブリダイズする温度である（定義のイオン強度およびｐＨ下）。Ｔｍは、各１％の不適合毎に約１℃低下するため、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列にハイブリダイズすることができる。例えば、９０％以上の同一性を有する配列を探索する場合、Ｔｍを１０℃低下させ得る。一般には、ストリンジェントな条件は、定義のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその補体の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。しかし、著しくストリンジェントな条件では、熱融点（Ｔｍ）よりも１、２、３または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、中等度のストリンジェントな条件では、熱融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件では、熱融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。方程式、ハイブリダイゼーション組成物および洗浄組成物、ならびに所望のＴｍの使用により、当業者は、ハイブリダイゼーション溶液および／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変形形態が本質的に記載されることを理解するであろう。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、科学文献に見出される（１２６、２６３）。特に明記しない限り、本出願では、高ストリンジェンシーは、４×ＳＳＣ、５×デンハート液（水５００ｍｌ中フィコール５ｇ、ポリビニルピロリドン５ｇ、ウシ血清アルブミン５ｇ）、０．１ｍｇ／ｍｌの煮沸サケ精子ＤＮＡ、および２５ｍＭのリン酸Ｎａを６５℃で用いたハイブリダイゼーション、ならびに０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを６５℃で用いた洗浄として定義される。
【0145】
[000206]次の用語：「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的同一性」を使用して、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を記載する。
【0146】
[000207]「参照配列」の用語は、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、例えば、完全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメントまたは完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列として特定する配列のサブセットまたは全体であり得る。
【0147】
[000208]「比較ウインドウ」の用語は、ポリヌクレオチド配列の連続する特定のセグメントへの言及を含み、ここで、ポリヌクレオチド配列を参照配列と比較してもよく、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部分は、最適アラインメントについて参照配列と比較した場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウは、通常、連続する少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、任意選択で、３０、４０、５０、１００ヌクレオチドまたはこれ以上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列アラインメントにおけるギャップの組入れにより、ギャップペナルティが導入され、適合数から減算されることを理解している。
【0148】
[000209]ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の比較のためのアラインメント方法は、当業者に周知である。局所相同性アルゴリズムであるＢＥＳＴＦＩＴ（２６４）では、ＧＡＰ（２６５）と呼ばれる相同性アラインメントアルゴリズムを使用する配列の比較のための最適なアラインメントを実行することができ、ＴｆａｓｔａおよびＦａｓｔａ（２６６）を使用して、オンラインまたは様々な供給業者（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社）から広く利用可能なこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実装によって類似性を検索することができる。ＣＬＵＳＴＡＬでは、複数の配列のアラインメントが可能となり（２６７－２６９）、ＰｉｌｅＵｐプログラムは、複数の配列の最適な包括的アラインメントに使用することができる（２７０）。ＢＬＡＳＴファミリープログラムは、ヌクレオチドまたはタンパク質データベースの類似性検索に使用することができる。ＢＬＡＳＴＮでは、ヌクレオチドクエリを使用してヌクレオチドデータベースを検索する。ＢＬＡＳＴＰでは、タンパク質クエリを使用してタンパク質データベースを検索する。ＢＬＡＳＴＸでは、ヌクレオチドクエリ配列（両鎖）の６フレーム翻訳に由来する、翻訳ヌクレオチドクエリを使用して、タンパク質データベースを検索する。ＴＢＬＡＳＴＮでは、逆翻訳により得られるタンパク質クエリを使用して、翻訳ヌクレオチドデータベースを検索する。ＴＢＬＡＳＴＸでは、翻訳ヌクレオチドクエリを使用して、翻訳ヌクレオチドデータベースを検索する。
【0149】
[000210]ＧＡＰ（２６５）では、２つの完全配列のアラインメントにおいて、適合数を最大化し、ギャップ数を最小化する。ＧＡＰでは、可能なすべてのアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、最多数の適合塩基および最少のギャップを有するアラインメントを生成する。適合塩基のユニットにおける、ギャップペナルティおよびギャップ伸長ペナルティも算出する。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅのバージョン１０におけるデフォルトのギャップ生成ペナルティ値およびギャップ伸長ペナルティ値は、それぞれ８および２である。ギャップ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティは、０～１００からなる整数の群から選択される整数として表され得る。ＧＡＰでは、アラインメントについて４つの性能指数：品質、比率、同一性、および類似性を呈示する。品質は、配列をアラインメントさせるために最大化される測定基準である。比率は、より短いセグメントにおいて品質を塩基数で割ったものである。パーセント同一性は、実際に適合する記号の割合である。パーセント類似性は、類似する記号の割合である。ギャップと向かい合う記号は無視される。類似性は、一対の記号のスコアリングマトリックス値が類似性閾値の０．５０以上である場合に点数化される。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅのバージョン１０において使用されるスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２である（２７１）。
【0150】
[000211]特に明記しない限り、配列同一性または類似性の値は、ＢＬＡＳＴ２．０のプログラム一式を使用しデフォルトパラメータを使用して得られる値を指す（２７２）。当業者は、ＢＬＡＳＴ検索により、タンパク質はランダム配列としてモデル化されることが可能であり、タンパク質は非ランダム配列、短いリピートまたは１つもしくは複数のアミノ酸残基が豊富である、低複雑性領域と呼ばれる領域を含むと想定されることを理解している。このような低複雑性領域は、他のタンパク質領域がまったく異なっていても、無関係のタンパク質間にアラインメントし得る。当業者は、低複雑性フィルタープログラムを使用して、検索においてアラインメントされる低複雑性領域の数を減少させ得る。このようなフィルタープログラムとしては、ＳＥＧ（２７３、２７４）およびＸＮＵ（２７５）が挙げられるが、これらに制限されない。
【0151】
[000212]「配列同一性」および「同一性」の用語は、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において使用され、特定する比較ウインドウにわたる最大対応関係についてアラインメントした場合、同一である、２つの配列内の残基への言及を含む。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージを使用する場合、非同一残基位置では、アミノ酸の保存的置換が異なることが多いことが認識されており、この場合、アミノ酸残基を類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換することにより、分子の機能特性を変えない。配列の保存的置換が異なる場合、パーセント配列同一性を上方調整して、置換の保存的性質を修正し得る。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。保存的置換のスコアリングでは、完全ではなく部分的な不適合を許容し（２７６）、これによりパーセンテージ配列類似性が上昇する。
【0152】
[000213]「配列同一性のパーセンテージ」の用語は、最適にアラインメントした２つの配列の比較ウインドウにわたる比較により決定される値を意味し、ここで、比較ウインドウのポリヌクレオチド配列の一部分は、最適アラインメントについて参照配列と比較した場合、ギャップ（付加または欠失）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を両配列において決定して適合位置の数を得、適合位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。
【0153】
[000214]ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」の用語は、ポリヌクレオチドが、記載のアラインメントプログラムのうちの１つを使用し標準的パラメータを使用して、参照配列と比較して５０～１００％の配列同一性、好ましくは、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、このような値を適切に調整して、２つのヌクレオチド配列がコードするタンパク質の対応する同一性を、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決め等を考慮することにより決定することが可能であることを認識するであろう。このような目的では、アミノ酸配列の実質的同一性は、通常５０～１００％の配列同一性を意味する。ヌクレオチド配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子が低ストリンジェンシー条件、中等度ストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件で相互にハイブリダイズするかどうかである。２つの核酸配列が実質的に同一であるまた別の指標は、ウエスタンブロット、免疫ブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイにおいて、２つのポリペプチドが同一抗体と免疫学的に交差反応するかどうかである。
【0154】
[000215]「実質的同一性」の用語は、ペプチドの文脈において、ペプチドが、参照配列に対する５５～１００％の配列同一性、好ましくは、少なくとも５５％の配列同一性、好ましくは、６０％、好ましくは、７０％、より好ましくは、８０％、最も好ましくは、参照配列に対する少なくとも９０％または９５％の配列同一性を、特定する比較ウインドウにわたって有する配列を含むことを示す。好ましくは、最適アラインメントは、相同性アラインメントアルゴリズムを使用して行われる（２６５）。したがって、ペプチドは、第２のペプチドと実質的に同一であり、例えば、この２つのペプチドは、保存的置換によってのみ異なる。アミノ酸配列が実質的に同一である別の指標は、ウエスタンブロット、免疫ブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイにおいて、２つのポリペプチドが同一抗体と免疫学的に交差反応するかどうかである。加えて、ペプチドは、抗体が認識するエピトープが実質的に同一である場合に非保存的変化によって異なるとき、第２のペプチドと実質的に同一であり得る。
【0155】
[000216]本発明は、機能性タウリン分解酵素を発現しないＤＮＡを含む単離細胞を提供し、本発明の一部の単離細胞は、（ｉ）遺伝子の発現を破壊するか、もしくは分解酵素の対応するペプチドを非機能性とする、外因性ＤＮＡ、（ｉｉ）遺伝子の発現を破壊するか、もしくは分解酵素の対応するペプチドを非機能性とする、塩基対変異、または（ｉｉｉ）遺伝子の発現を破壊するか、もしくは分解酵素の対応するペプチドを非機能性とする、全ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの部分の欠失を含む。非機能性ＤＮＡは、遺伝子産物を非機能性とする、プロモーター、コード領域の一部分もしくはターミネーターにおける、ｔａｕＸ、ｔａｕＹ、ｔａｕＤ、ｔｐａ、ｓｓｕＤもしくはｓｓｕＥを含むタウリン分解酵素をコードするポリヌクレオチドに対する変化、またはｃｂｌもしくはｔａｕＲを含む遺伝子の翻訳活性化因子をコードする遺伝子における変化に起因し得る。本発明は、アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡ干渉に起因する、対応するＲＮＡの抑制または蓄積低下による、タウリン分解酵素の非機能性遺伝子または遺伝子産物を含む単離細胞も提供する。
【0156】
[000217]本開示において引用される、すべての特許、特許出願、および参考文献は、参照により、明示的に本明細書に組み込まれる。上記の開示は、概して、本発明を説明する。より完全な理解は、次の具体例への参照により得ることができ、これらは、単なる例示目的において提供され、本発明の範囲を制限することは意図しない。
【0157】
[000218]本発明の背景を明らかとするため、または実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書において使用される公表文献および他の資料は、参照により組み込まれ、便宜上、それぞれ参考文献においてグループ化される。
【0158】
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276. Myers EW, Miller W. Optimal alignments in linear-space. Computer Applications in the Biological Sciences. 1988;4:11-7.
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278. Buchholz J, Schwentner A, Brunnenkan B, Gabris C, Grimm S, Gerstmeir R, et al. Platform engineering of Corynebacterium glutamicum with reduced pyruvate dehydrogenase complex activity for improved production of L-lysine, L-valine, and 2-ketoisovalerate. Appl Environ Microbiol. 2013;79(18):5566-75.
【実施例】
【0159】
実施例１
高タウリン生成微生物の作製
[000219]ステップ１：化学合成を使用してΔｔａｕＡＢＣＤポリヌクレオチド（配列番号１１６）を生成する。ポリヌクレオチドをｐＴＯＦ２５ベクターにクローニングして、大腸菌Ｋ１２株に形質転換し、Ｍｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してｔａｕＡＢＣＤ（配列番号６８）をノックアウトする。
高タウリン生成微生物の作製
[000219]ステップ１：化学合成を使用してΔｔａｕＡＢＣＤポリヌクレオチド（配列番号１１６）を生成する。ポリヌクレオチドをｐＴＯＦ２５ベクターにクローニングして、大腸菌Ｋ１２株に形質転換し、Ｍｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してｔａｕＡＢＣＤ（配列番号６８）をノックアウトする。
【0160】
[000220]ステップ２：化学合成を使用してΔｓｓｕＥＡＤＣＢポリヌクレオチド（配列番号１１５）を生成する。ポリヌクレオチドをｐＴＯＦ２５ベクターにクローニングして、ΔｔａｕＡＢＣＤ株（実施例１ステップ１の）に形質転換し、Ｍｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してｓｓｕＥＡＤＣＢ（配列番号６９）をノックアウトする。
【0161】
[000221]ステップ３：化学合成を使用してｔｒｃＰＵＷＡポリヌクレオチド（配列番号１１８）を生成する。ポリヌクレオチドをｐＴＯＦ２５ベクターにクローニングして、ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ株（実施例１ステップ２の）に形質転換し、構成的プロモーターをノックインし、Ｍｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用して生得的プロモーターをｃｙｓＰＵＷＡ（配列番号１１０）と置換する。
【0162】
[000222]ステップ４：化学合成を使用してｔｒｃＤＮＣポリヌクレオチド（配列番号１１７）を生成する。ポリヌクレオチドをｐＴＯＦ２５ベクターにクローニングして、ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ｔｒｃＰＵＷＡ株（実施例１ステップ３の）に形質転換し、構成的プロモーターをノックインし、Ｍｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用して生得的プロモーターをｃｙｓＤＮＣ（配列番号４７）と置換する。
【0163】
[000223]ステップ５：化学合成を使用して、次のような、宿主細胞株における発現のために最適化した、動作可能なポリシストロン性ＣＤＯ／ＳＡＤ／ｃｙｓＱ／ｃｙｓＨ／ｃｙｓＩＪポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ＣＤＯ遺伝子は、ヌクレオチド４～１５９（生得的輸送ペプチドに対応）を除去することにより配列番号３から得られ、コナミドリムシ由来のＣＤＯペプチド（配列番号４からアミノ酸２～５３をマイナス）をコードする。
ｂ．ＳＡＤ遺伝子は、配列番号９から得られ、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）由来のＳＡＤペプチド（配列番号１０）をコードする。
ｃ．ｃｙｓＱ遺伝子は、配列番号５１から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＱペプチド（配列番号５２）をコードする。
ｄ．ｃｙｓＨ遺伝子は、配列番号５３から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＨペプチド（配列番号５４）をコードする。
ｅ．ｃｙｓＩＪ遺伝子は、配列番号５５から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＩペプチド（配列番号５７）および大腸菌由来のｃｙｓＪペプチド（配列番号５６）をコードする。
ａ．ＣＤＯ遺伝子は、ヌクレオチド４～１５９（生得的輸送ペプチドに対応）を除去することにより配列番号３から得られ、コナミドリムシ由来のＣＤＯペプチド（配列番号４からアミノ酸２～５３をマイナス）をコードする。
ｂ．ＳＡＤ遺伝子は、配列番号９から得られ、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）由来のＳＡＤペプチド（配列番号１０）をコードする。
ｃ．ｃｙｓＱ遺伝子は、配列番号５１から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＱペプチド（配列番号５２）をコードする。
ｄ．ｃｙｓＨ遺伝子は、配列番号５３から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＨペプチド（配列番号５４）をコードする。
ｅ．ｃｙｓＩＪ遺伝子は、配列番号５５から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＩペプチド（配列番号５７）および大腸菌由来のｃｙｓＪペプチド（配列番号５６）をコードする。
【0164】
[000224]ステップ６：ポリヌクレオチドを細菌発現ベクターにクローニングして機能性とする。
[000225]ステップ７：化学合成を使用して動作可能なポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢ／ｃｙｓＥＭ２０１Ｒ／ｃｙｓＫ／ｃｙｓＭポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ｐｇｋ遺伝子は、配列番号３５から得られ、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｐｇｋペプチド（配列番号３６）をコードする。
ｂ．ｓｅｒＡΔ１９７遺伝子は、配列番号３７から得られ、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｓｅｒＡΔ１９７ペプチド（配列番号３８）をコードする。
ｃ．ｓｅｒＣ遺伝子は、配列番号４１から得られ、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｓｅｒＣペプチド（配列番号４２）コードする。
ｄ．ｓｅｒＢ遺伝子は、配列番号３９から得られ、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｓｅｒＢペプチド（配列番号４０）をコードする。
ｅ．ｃｙｓＥＭ２０１Ｒ遺伝子は、配列番号４３から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＥＭ２０１Ｒペプチド（配列番号４４）をコードする。
ｆ．ｃｙｓＫ遺伝子は、配列番号４５から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＫペプチド（配列番号４６）をコードする。
ｇ．ｃｙｓＭ遺伝子は、配列番号９８から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＭペプチド（配列番号９９）をコードする。
[000225]ステップ７：化学合成を使用して動作可能なポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢ／ｃｙｓＥＭ２０１Ｒ／ｃｙｓＫ／ｃｙｓＭポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ｐｇｋ遺伝子は、配列番号３５から得られ、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｐｇｋペプチド（配列番号３６）をコードする。
ｂ．ｓｅｒＡΔ１９７遺伝子は、配列番号３７から得られ、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｓｅｒＡΔ１９７ペプチド（配列番号３８）をコードする。
ｃ．ｓｅｒＣ遺伝子は、配列番号４１から得られ、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｓｅｒＣペプチド（配列番号４２）コードする。
ｄ．ｓｅｒＢ遺伝子は、配列番号３９から得られ、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のｓｅｒＢペプチド（配列番号４０）をコードする。
ｅ．ｃｙｓＥＭ２０１Ｒ遺伝子は、配列番号４３から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＥＭ２０１Ｒペプチド（配列番号４４）をコードする。
ｆ．ｃｙｓＫ遺伝子は、配列番号４５から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＫペプチド（配列番号４６）をコードする。
ｇ．ｃｙｓＭ遺伝子は、配列番号９８から得られ、大腸菌由来のｃｙｓＭペプチド（配列番号９９）をコードする。
【0165】
[000226]ステップ８：ポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢ／ｃｙｓＥＭ２０１Ｒ／ｃｙｓＫ／ｃｙｓＭポリヌクレオチドを、実施例１ステップ６のベクターとは異なる選択可能性マーカーを有する細菌発現ベクターにクローニングして、機能性とする。
【0166】
[000227]ステップ９：ＣＤＯ－ＳＡＤ／ｃｙｓＱ／ｃｙｓＨ／ｃｙｓＩＪ構築物（実施例１ステップ６の）およびｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢ／ｃｙｓＥＭ２０１Ｒ／ｃｙｓＫ構築物（実施例１ステップ８の）を有するベクターをΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ｔｒｃＰＵＷＡ／ｔｒｃＤＮＣ株（実施例１ステップ４の）に同時形質転換し、両ＤＮＡ構築物の存在を確認する。
【0167】
実施例２
別の高タウリン生成微生物の作製
[000228]ステップ１：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ株（実施例１ステップ２の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１４６）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してΔｓｄａＡを生成する。
別の高タウリン生成微生物の作製
[000228]ステップ１：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ株（実施例１ステップ２の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１４６）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してΔｓｄａＡを生成する。
【0168】
[000229]ステップ２：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ株（実施例２ステップ１の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１５９）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してΔｇｌｙＡを生成する。
【0169】
[000230]ステップ３：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ株（実施例２ステップ２の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１１７）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してｔｒｃＤＮＣを生成する。
【0170】
[000231]ステップ４：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ／ｔｒｃＤＮＣ株（実施例２ステップ３の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１３４）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してｔｒｃＵＷＡを生成する。
【0171】
[000232]ステップ５：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ／ｔｒｃＤＮＣ／ｔｒｃＵＷＡ株（実施例２ステップ４の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１３５）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してΔｉｌｖＡを生成する。
【0172】
[000233]ステップ６：化学合成を使用して、実施例１ステップ７ａ～７ｆに記載のように、動作可能なポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢ／ｃｙｓＥＭ２０１Ｒ／ｃｙｓＫポリヌクレオチドを生成する。
【0173】
[000234]ステップ７：ポリヌクレオチドを細菌発現ベクターにクローニングして機能性とする。
[000235]ステップ８：化学合成を使用して、次のような、宿主細胞株における発現のために最適化した、動作可能なポリシストロン性ＣＤＯ／ＳＡＤ／ｃｙｓＱ／ｃｙｓＨ／ｃｙｓＩＪ／ｓｂｐポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ＣＤＯ、ＳＡＤ、ｃｙｓＱ、ｃｙｓＨ、およびｃｙｓＩＪは、実施例１ステップ５ａ～５ｅに記載のように得られる。
ｂ．ｓｂｐは、配列番号１６０から得られ、大腸菌由来のｓｂｐペプチド（配列番号１６１）をコードする。
[000235]ステップ８：化学合成を使用して、次のような、宿主細胞株における発現のために最適化した、動作可能なポリシストロン性ＣＤＯ／ＳＡＤ／ｃｙｓＱ／ｃｙｓＨ／ｃｙｓＩＪ／ｓｂｐポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ＣＤＯ、ＳＡＤ、ｃｙｓＱ、ｃｙｓＨ、およびｃｙｓＩＪは、実施例１ステップ５ａ～５ｅに記載のように得られる。
ｂ．ｓｂｐは、配列番号１６０から得られ、大腸菌由来のｓｂｐペプチド（配列番号１６１）をコードする。
【0174】
[000236]ステップ９：ポリシストロン性ＣＤＯ／ＳＡＤ／ｃｙｓＱ／ｃｙｓＨ／ｃｙｓＩＪ／ｓｂｐポリヌクレオチドを、実施例２ステップ７のベクターとは異なる選択可能性マーカーを有する細菌発現ベクターにクローニングして、機能性とする。
【0175】
[000237]ステップ１０：ＣＤＯ／ＳＡＤ／ｃｙｓＱ／ｃｙｓＨ／ｃｙｓＩＪ／ｓｂｐ構築物（実施例２ステップ９の）およびｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢ／ｃｙｓＥＭ２０１Ｒ／ｃｙｓＫ（実施例２ステップ７の）を有するベクターを、ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ／ｔｒｃＤＮＣ／ｔｒｃＵＷＡ株（実施例２ステップ５の）に同時形質転換し、両ＤＮＡ構築物の存在を確認する。
【0176】
実施例３
別の高タウリン生成微生物の作製
[000238]ステップ１：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ／ｔｒｃＤＮＣ株（実施例２ステップ３の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１１９）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してΔｒｉｄＡを生成する。
別の高タウリン生成微生物の作製
[000238]ステップ１：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ／ｔｒｃＤＮＣ株（実施例２ステップ３の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１１９）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してΔｒｉｄＡを生成する。
【0177】
[000239]ステップ２：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ／ｔｒｃＤＮＣ／ΔｒｉｄＡ株（実施例３ステップ１の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１２０）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してΔｔｄｃＦを生成する。
【0178】
[000240]ステップ３：ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ／ｔｒｃＤＮＣ／ΔｒｉｄＡ／ΔｔｄｃＦ株（実施例３ステップ２の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１２１）およびＭｅｒｌｉｎら（２７７）の組換え方法を使用してΔｒｕｔＣを生成する。
【0179】
[000241]ステップ４：化学合成を使用して、実施例１ステップ７ａ～７ｄに記載のように、動作可能なポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢポリヌクレオチドを生成する。
【0180】
[000242]ステップ５：ポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢポリヌクレオチドを細菌発現ベクターにクローニングして機能性とする。
[000243]ステップ６：化学合成を使用して、次のような、宿主細胞株における発現のために最適化した、動作可能なポリシストロン性ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ／ＩｌｖＡＬ４４７Ｆポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ遺伝子は、配列番号１７から得られ、ミクロモナス・プシラ由来のｐｇｋペプチド（配列番号１８）をコードする。
ｂ．ＩｌｖＡＬ４４７Ｆ遺伝子は、配列番号２９から得られ、大腸菌由来のＩｌｖＡＬ４４７Ｆペプチド（配列番号３０）をコードする。
[000243]ステップ６：化学合成を使用して、次のような、宿主細胞株における発現のために最適化した、動作可能なポリシストロン性ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ／ＩｌｖＡＬ４４７Ｆポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ遺伝子は、配列番号１７から得られ、ミクロモナス・プシラ由来のｐｇｋペプチド（配列番号１８）をコードする。
ｂ．ＩｌｖＡＬ４４７Ｆ遺伝子は、配列番号２９から得られ、大腸菌由来のＩｌｖＡＬ４４７Ｆペプチド（配列番号３０）をコードする。
【0181】
[000244]ステップ７：ポリシストロン性ＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ／ＩｌｖＡＬ４４７Ｆポリヌクレオチドを、実施例３ステップ５のベクターとは異なる選択可能性マーカーを有する細菌発現ベクターにクローニングして、機能性とする。
【0182】
[000245]ステップ８：機能性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢ（実施例３ステップ５の）およびＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ／ＩｌｖＡＬ４４７Ｆ構築物（実施例３ステップ７の）を有するベクターを、ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ／ｔｒｃＤＮＣ／ΔｒｉｄＡ／ΔｔｄｃＦ／ΔｒｕｔＣ株（実施例３ステップ３の）に同時形質転換し、両ＤＮＡ構築物の存在を確認する。
【0183】
実施例４
別の高タウリン生成微生物の作製
[000246]ステップ１：化学合成を使用して、次のような、宿主細胞株における発現のために最適化した、動作可能なポリシストロン性ＴＳ／ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ＴＳ遺伝子は、配列番号２７から得られ、ユリアーキオータ・アーキオン（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ ａｒｃｈａｅｏｎ）由来のＴＳペプチド（配列番号２８）をコードする。
ｂ．ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ遺伝子は、ヌクレオチド４～１４１３を除去することにより（生得的輸送ペプチド配列およびシステインシンセターゼペプチド配列を除去するが、開始コドンは保持する）配列番号１７から得られ、ミクロモナス・プシラ由来のｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣペプチド（配列番号１８からアミノ酸２～４７１をマイナス）をコードする。
別の高タウリン生成微生物の作製
[000246]ステップ１：化学合成を使用して、次のような、宿主細胞株における発現のために最適化した、動作可能なポリシストロン性ＴＳ／ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ＴＳ遺伝子は、配列番号２７から得られ、ユリアーキオータ・アーキオン（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ ａｒｃｈａｅｏｎ）由来のＴＳペプチド（配列番号２８）をコードする。
ｂ．ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ遺伝子は、ヌクレオチド４～１４１３を除去することにより（生得的輸送ペプチド配列およびシステインシンセターゼペプチド配列を除去するが、開始コドンは保持する）配列番号１７から得られ、ミクロモナス・プシラ由来のｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣペプチド（配列番号１８からアミノ酸２～４７１をマイナス）をコードする。
【0184】
[000247]ステップ２：ポリシストロン性ＴＳ／ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣポリヌクレオチドを細菌発現ベクターにクローニングして機能性とする。
[000248]ステップ３：化学合成を使用して、実施例１ステップ７ａ～７ｃに記載のように、動作可能なポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣポリヌクレオチドを生成する。
[000248]ステップ３：化学合成を使用して、実施例１ステップ７ａ～７ｃに記載のように、動作可能なポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣポリヌクレオチドを生成する。
【0185】
[000249]ステップ４：ポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣポリヌクレオチドを、実施例４ステップ２のベクターとは異なる選択可能性マーカーを有する細菌発現ベクターにクローニングして、機能性とする。
【0186】
[000250]ステップ５：機能性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ（実施例４ステップ４の）およびＴＳ／ｐａｒｔＣＳ／ＰＬＰ－ＤＣ構築物（実施例４ステップ２の）を有するベクターを、ΔｔａｕＡＢＣＤ／ΔｓｓｕＥＡＤＣＢ／ΔｓｄａＡ／ΔｇｌｙＡ／ｔｒｃＤＮＣ株（実施例２ステップ３の）に同時形質転換し、両ＤＮＡ構築物の存在を確認する。
【0187】
実施例５
別の高タウリン生成微生物の作製
[000251]ステップ１：コリネバクテリウム・グルタミクム由来のゲノムＤＮＡならびに配列番号１２２および配列番号１２３のプライマー対を使用してＤＮＡ断片を生成する。コリネバクテリウム・グルタミクム由来のゲノムＤＮＡならびに配列番号１２４および配列番号１２５のプライマー対を使用して第２のＤＮＡ断片を生成する。各ＤＮＡ断片を精製し、これらをオーバーラップＰＣＲに配列番号１２２および配列番号１２５のプライマーとともに使用して、ｓｓｕＥ（配列番号７６）のノックアウト断片を生成する。生じた断片をｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターにクローニングし、コリネバクテリウム・グルタミクムに形質転換して、ｓｓｕＥをｓｓｕＥノックアウト断片と、Ｂｕｃｈｈｏｌｚら（２７８）により記載の相同組換えにより置換する。
別の高タウリン生成微生物の作製
[000251]ステップ１：コリネバクテリウム・グルタミクム由来のゲノムＤＮＡならびに配列番号１２２および配列番号１２３のプライマー対を使用してＤＮＡ断片を生成する。コリネバクテリウム・グルタミクム由来のゲノムＤＮＡならびに配列番号１２４および配列番号１２５のプライマー対を使用して第２のＤＮＡ断片を生成する。各ＤＮＡ断片を精製し、これらをオーバーラップＰＣＲに配列番号１２２および配列番号１２５のプライマーとともに使用して、ｓｓｕＥ（配列番号７６）のノックアウト断片を生成する。生じた断片をｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢベクターにクローニングし、コリネバクテリウム・グルタミクムに形質転換して、ｓｓｕＥをｓｓｕＥノックアウト断片と、Ｂｕｃｈｈｏｌｚら（２７８）により記載の相同組換えにより置換する。
【0188】
[000252]ステップ２：ΔｓｓｕＥ株（実施例５ステップ１の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１４２）およびＢｕｃｈｈｏｌｚら（２７８）により記載の組換え方法を使用してΔｍｃｂＲを生成する。
【0189】
[000253]ステップ３：ΔｓｓｕＥ／ΔｍｃｂＲ株（実施例５ステップ２の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１３９）およびＢｕｃｈｈｏｌｚら（２７８）により記載の組換え方法を使用してΔｉｌｖＡを生成する。
【0190】
[000254]ステップ４：ΔｓｓｕＥ／ΔｍｃｂＲ／ΔｉｌｖＡ株（実施例５ステップ３の）において合成ポリヌクレオチド（配列番号１３８）およびＢｕｃｈｈｏｌｚら（２７８）により記載の組換え方法を使用してΔｇｌｙＡを生成する。
【0191】
[000255]ステップ５：実施例３ステップ５のポリシストロン性ｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢポリヌクレオチドを細菌発現ベクターにクローニングして機能性とする。
【0192】
[000256]ステップ６：化学合成を使用して、次のような、宿主細胞株における発現のために最適化した、動作可能なポリシストロン性ＣＤＯ／ＳＡＤ／ｇａｄＣポリヌクレオチドを生成する。
ａ．ＣＤＯ遺伝子は、配列番号１から得られ、ゼブラフィッシュ由来のＣＤＯペプチド（配列番号２）をコードする。
ｂ．ＳＡＤ遺伝子は、配列番号９から得られ、ゼブラフィッシュ由来のＳＡＤペプチド（配列番号１０）をコードする。
ｃ．ｇａｄＣ遺伝子は、配列番号１８４から得られ、大腸菌由来のＧａｄＣペプチド（配列番号１８５）をコードする。
ａ．ＣＤＯ遺伝子は、配列番号１から得られ、ゼブラフィッシュ由来のＣＤＯペプチド（配列番号２）をコードする。
ｂ．ＳＡＤ遺伝子は、配列番号９から得られ、ゼブラフィッシュ由来のＳＡＤペプチド（配列番号１０）をコードする。
ｃ．ｇａｄＣ遺伝子は、配列番号１８４から得られ、大腸菌由来のＧａｄＣペプチド（配列番号１８５）をコードする。
【0193】
[000257]ステップ７：ＣＤＯ／ＳＡＤ／ｇａｄＣポリヌクレオチドを、実施例５ステップ５のベクターとは異なる選択可能性マーカーを有する細菌発現ベクターにクローニングして、機能性とする。
【0194】
[000258]ステップ８：機能性ＣＤＯ／ＳＡＤ／ｇａｄＣ（実施例５ステップ７の）およびｐｇｋ／ｓｅｒＡΔ１９７／ｓｅｒＣ／ｓｅｒＢ（実施例５ステップ５の）を有するベクターを、ΔｓｓｕＥ／ΔｍｃｂＲ／ΔｉｌｖＡ／ｇｌｙＡ株（実施例５ステップ４の）に同時形質転換し、ＤＮＡ構築物の存在を確認する。
【0195】
実施例６
振盪フラスコにおいて少なくとも１．０ｇ／Ｌのタウリンを生成する微生物発酵プロセス
[000259]ステップ１：タウリン生成細菌の種培養物（実施例１、２、３または４の）を、適切な抗生剤を加えたＬＢブロス中、回転式振盪機上で３７℃および２５０ｒｐｍで１２～２０時間増殖させる。
振盪フラスコにおいて少なくとも１．０ｇ／Ｌのタウリンを生成する微生物発酵プロセス
[000259]ステップ１：タウリン生成細菌の種培養物（実施例１、２、３または４の）を、適切な抗生剤を加えたＬＢブロス中、回転式振盪機上で３７℃および２５０ｒｐｍで１２～２０時間増殖させる。
【0196】
[000260]ステップ２：生成培地に種培養物１／５０容量を播種する。生成培地は、硫酸アンモニウム（５ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸カリウム（６ｇ／Ｌ）、一塩基性リン酸ナトリウム（３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（０．５ｇ／Ｌ）、グルコース（６ｇ／Ｌ）、トリプトン（０．１ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（０．０５ｇ／Ｌ）、およびＰＬＰ（２．４ｍｇ／Ｌ）を、抗生剤の有無に関わらず、ｐＨ７．０で含む。タウリン生成細菌を、斜角フラスコ内の生成培地中、回転式振盪機で２５０ｒｐｍおよび３０℃で２０～３０時間増殖させる。
【0197】
[000261]ステップ３：遠心分離によりブロスから細胞を分離する。
[000262]ステップ４：ＨＰＬＣにより、細胞内のタウリン濃度を決定し、ブロスを清澄化する。
[000262]ステップ４：ＨＰＬＣにより、細胞内のタウリン濃度を決定し、ブロスを清澄化する。
【0198】
実施例７
発酵槽において少なくとも２５ｇ／Ｌのタウリンを生成する微生物発酵プロセス
[000263]ステップ１：タウリン生成細菌の種培養物（実施例１、２、３または４の）を、適切な抗生剤を加えたＬＢブロス中、回転式振盪機上で２５０ｒｐｍおよび３７℃で１２～２０時間増殖させる。
発酵槽において少なくとも２５ｇ／Ｌのタウリンを生成する微生物発酵プロセス
[000263]ステップ１：タウリン生成細菌の種培養物（実施例１、２、３または４の）を、適切な抗生剤を加えたＬＢブロス中、回転式振盪機上で２５０ｒｐｍおよび３７℃で１２～２０時間増殖させる。
【0199】
[000264]ステップ２：１．５Ｌのバイオリアクターにおいて、消泡剤を加えた、実施例６ステップ２の生成培地を使用して、バッチ発酵を行う。水酸化アンモニウムによりｐＨを７．０、温度を３０℃、撹拌速度および気流を調整することにより溶存酸素を２０％超に維持する。
【0200】
[000265]ステップ３：遠心分離によりブロスから細胞を分離する。
[000266]ステップ４：ＨＰＬＣにより、細胞内のタウリン濃度を決定し、ブロスを清澄化する。
[000266]ステップ４：ＨＰＬＣにより、細胞内のタウリン濃度を決定し、ブロスを清澄化する。
【0201】
実施例８
振盪フラスコにおいて少なくとも１．０ｇ／Ｌのタウリンを生成する別の微生物発酵プロセス
[000267]ステップ１：タウリン生成細菌の種培養物（実施例５の）を、０．５％のグルコースを適切な抗生剤とともに加えたＬＢブロス中で２４時間、回転式振盪機上で２００ｒｐｍおよび３０℃で４８時間増殖させる。
振盪フラスコにおいて少なくとも１．０ｇ／Ｌのタウリンを生成する別の微生物発酵プロセス
[000267]ステップ１：タウリン生成細菌の種培養物（実施例５の）を、０．５％のグルコースを適切な抗生剤とともに加えたＬＢブロス中で２４時間、回転式振盪機上で２００ｒｐｍおよび３０℃で４８時間増殖させる。
【0202】
[000268]ステップ２：生成培地に種培養物１／１０容量を播種する。生成培地は、酵母抽出物（２ｇ／Ｌ）、グルコース（４０ｇ／Ｌ）、炭酸カルシウム（１０ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（１５ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸カリウム（１ｇ／Ｌ）、一塩基性リン酸カリウム（１ｇ／Ｌ）、塩化ナトリウム（２ｇ／Ｌ）、塩化カルシウム（８０ｍｇ／Ｌ）、塩化第二鉄（３ｍｇ／Ｌ）、硫酸亜鉛七水和物（０．９ｍｇ／Ｌ）、硫酸銅（０．２ｍｇ／Ｌ）、硫酸マンガン（０．４ｍｇ／Ｌ）、モリブデン酸ナトリウム（０．１ｍｇ／Ｌ）、ホウ酸ナトリウム（０．３ｍｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム（１ｇ／Ｌ）、塩酸チアミン（０．２ｍｇ／Ｌ）、ビオチン（０．２ｍｇ／Ｌ）、およびＰＬＰ（２．４ｍｇ／Ｌ）を、抗生剤の有無に関わらず、ｐＨ７．０で含む。タウリン生成細菌を、斜角フラスコ内の生成培地中、回転式振盪機で２５０ｒｐｍおよび３０℃で２４時間増殖させる。
【0203】
[000269]ステップ３：遠心分離によりブロスから細胞を分離する。
[000270]ステップ４：ＨＰＬＣにより、細胞内のタウリン濃度を決定し、ブロスを清澄化する。
[000270]ステップ４：ＨＰＬＣにより、細胞内のタウリン濃度を決定し、ブロスを清澄化する。
【0204】
実施例９
発酵槽において少なくとも２５ｇ／Ｌのタウリンを生成する別の微生物発酵プロセス
[000271]ステップ１：タウリン生成細菌の種培養物（実施例５の）を、適切な抗生剤を加えたＬＢブロス中、回転式振盪機上で２００ｒｐｍおよび３０℃で２４時間増殖させる。
発酵槽において少なくとも２５ｇ／Ｌのタウリンを生成する別の微生物発酵プロセス
[000271]ステップ１：タウリン生成細菌の種培養物（実施例５の）を、適切な抗生剤を加えたＬＢブロス中、回転式振盪機上で２００ｒｐｍおよび３０℃で２４時間増殖させる。
【0205】
[000272]ステップ２：１．５Ｌのバイオリアクターにおいて、消泡剤を加えた、実施例８ステップ２の生成培地を使用して、バッチ発酵を行う。水酸化カリウムおよびリン酸によりｐＨを７．０、温度を３０℃、撹拌速度および気流を調整することにより溶存酸素を２０％超に維持する。
【0206】
[000273]ステップ３：遠心分離によりブロスから細胞を分離する。
[000274]ステップ４：ＨＰＬＣにより、細胞内のタウリン濃度を決定し、ブロスを清澄化する。
[000274]ステップ４：ＨＰＬＣにより、細胞内のタウリン濃度を決定し、ブロスを清澄化する。
【0207】
実施例１０
清澄化ブロスからの少なくとも９０％のタウリンの精製
[000275]ステップ１：次のように、カチオン交換により清澄化ブロス（実施例６～９ステップ３）からタウリンを精製する。
ａ．溶液を限外濾過膜により濃縮する。
ｂ．清澄化ブロス溶液のｐＨをＨＣｌによりｐＨ４．０に調整する。
ｃ．活性化カチオン交換カラムに溶液を加える。
ｄ．カラムを０．１ＮのＨＣｌで洗浄する。
ｅ．タウリンを脱イオン水で溶出する。
清澄化ブロスからの少なくとも９０％のタウリンの精製
[000275]ステップ１：次のように、カチオン交換により清澄化ブロス（実施例６～９ステップ３）からタウリンを精製する。
ａ．溶液を限外濾過膜により濃縮する。
ｂ．清澄化ブロス溶液のｐＨをＨＣｌによりｐＨ４．０に調整する。
ｃ．活性化カチオン交換カラムに溶液を加える。
ｄ．カラムを０．１ＮのＨＣｌで洗浄する。
ｅ．タウリンを脱イオン水で溶出する。
【0208】
[000276]ステップ２：溶液を結晶または粉末形態に乾燥させる。
[000277]ステップ３：タウリン濃度をＨＰＬＣにより決定する。
実施例１１
発酵細胞からの少なくとも９０％のタウリンの精製
[000278]ステップ１：細胞（実施例６、７、８または９ステップ３の）を０．１ＮのＨＣｌに懸濁させる。
[000277]ステップ３：タウリン濃度をＨＰＬＣにより決定する。
実施例１１
発酵細胞からの少なくとも９０％のタウリンの精製
[000278]ステップ１：細胞（実施例６、７、８または９ステップ３の）を０．１ＮのＨＣｌに懸濁させる。
【0209】
[000279]ステップ２：細胞を化学物質、圧力、機械力または超音波処理により破壊して、内容物を放出させる。
[000280]ステップ３：遠心分離により上清から細胞残屑を分離する。
[000280]ステップ３：遠心分離により上清から細胞残屑を分離する。
【0210】
[000281]ステップ４：実施例１０ステップ１ａ～１ｅに記載のようにカチオン交換により上清（実施例６～９ステップ３）からタウリンを精製する。
[000282]ステップ５：溶液を結晶または粉末形態に乾燥させる。
[000282]ステップ５：溶液を結晶または粉末形態に乾燥させる。
【0211】
[000283]ステップ６：タウリン濃度をＨＰＬＣにより決定する。
[000284]「ａ」、および「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の用語、ならびに類似の参照対象の、本発明の記載の文脈における（特には、次の特許請求の範囲の文脈における）使用は、本明細書における他の指示も文脈による明白な矛盾もない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈すべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の用語は、他に述べない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「を含むが、これらに制限されない」を意味するもの）として解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他に指示しない限り、範囲内の別々の各値に個別に参照する簡単な方法として作用することを単に意図し、別々の各値は、本明細書において個別に列挙するものとして本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書における他の指示も文脈による明白な矛盾もない限り、適する任意の順序で実施することができる。本明細書において提供する、ありとあらゆる実施例および例示的な言語（例えば、「例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、他に主張しない限り、本発明をより良好に明らかにすることを単に意図し、本発明の範囲に対する制限は提起しない。本明細書における言語は、任意の非請求要素を本発明の実施に必須であると示すものとして解釈されるべきではない。
[000284]「ａ」、および「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の用語、ならびに類似の参照対象の、本発明の記載の文脈における（特には、次の特許請求の範囲の文脈における）使用は、本明細書における他の指示も文脈による明白な矛盾もない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈すべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の用語は、他に述べない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「を含むが、これらに制限されない」を意味するもの）として解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他に指示しない限り、範囲内の別々の各値に個別に参照する簡単な方法として作用することを単に意図し、別々の各値は、本明細書において個別に列挙するものとして本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書における他の指示も文脈による明白な矛盾もない限り、適する任意の順序で実施することができる。本明細書において提供する、ありとあらゆる実施例および例示的な言語（例えば、「例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、他に主張しない限り、本発明をより良好に明らかにすることを単に意図し、本発明の範囲に対する制限は提起しない。本明細書における言語は、任意の非請求要素を本発明の実施に必須であると示すものとして解釈されるべきではない。
【0212】
[000285]本発明を実行するための、本発明者らに既知の最良の方法を含む、本発明の実施形態を本明細書において記載する。このような実施形態の変形形態は、前述の明細書を読解すれば、当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形形態を適宜利用することを予想し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載のもの以外に本発明が実践されることを意図する。したがって、本発明は、適用法により認められるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙する主題の変更形態および均等物のすべてを含む。その上、可能なすべての変形形態における上記の要素のあらゆる組合せは、本明細書における他の指示も文脈による明白な矛盾もない限り、本発明により包含される。本発明を実行するための、本発明者らに既知の最良の方法を含む、本発明の実施形態を本明細書において記載する。このような実施形態の変形形態は、前述の明細書を読解すれば、当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形形態を適宜利用することを予想し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載のもの以外に本発明が実践されることを意図する。したがって、本発明は、適用法により認められるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙する主題の変更形態および均等物のすべてを含む。その上、可能なすべての変形形態における上記の要素のあらゆる組合せは、本明細書における他の指示も文脈による明白な矛盾もない限り、本発明により包含される。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】