特表 2025-504676 微生物学的用途のための単一ビーズ静電容量検出器

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-14

(54)【発明の名称】微生物学的用途のための単一ビーズ静電容量検出器

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6816 20180101AFI20250206BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20250206BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20250206BHJP

   G01N 1/00 20060101ALI20250206BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20250206BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6816 Z

C12M1/34 B

C12M1/00 A

G01N1/00 101F

G01N33/53 M

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024544981

(86)(22)【出願日】2023-01-27

(85)【翻訳文提出日】2024-09-27

(86)【国際出願番号】 IB2023000046

(87)【国際公開番号】W WO2023144630

(87)【国際公開日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】63/304,312

(32)【優先日】2022-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520086564

【氏名又は名称】アルトラテック・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ダルトン， タラ

(72)【発明者】

【氏名】カミンズ， ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】アハーン， マーガレット

(72)【発明者】

【氏名】マグワイア， デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】オドリスコル， ジョン

(72)【発明者】

【氏名】キング， コリン

(72)【発明者】

【氏名】フリー， ポール

(72)【発明者】

【氏名】オファーレル， ブライアン

【テーマコード（参考）】

2G052

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G052AB20

2G052GA23

4B029AA07

4B029BB01

4B029BB13

4B029BB15

4B029BB20

4B029FA11

4B029FA12

4B029GA08

4B029GB10

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ10

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ79

4B063QR32

4B063QR48

4B063QR55

4B063QR83

4B063QS33

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、試料中の標的分析物の検出および／または定量のための改良された静電容量ビーズセンサを提供し、検出限界は単一ビーズまでであり、複数のビーズ試験、またはビーズの連続フローに再使用可能であり、容易に製造可能かつ自動化可能である。それは、例えばウイルス核酸およびそのウイルスに対する宿主抗体の同時検出を可能にする、各種核酸標的全体にわたるだけでなく全標的クラスにわたってマルチプレックス標的検出をさらに可能にする様々な構造的利点および電子シグナル増幅技術の使用によって、ＰＣＲなどの酵素増幅を必要とせずに単一分子検出までの感度を可能にする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸検出のための方法であって、前記方法は、静電容量センサを使用し、酵素増幅なしで、試料中に存在する標的核酸を１００コピー／ｍＬまたはそれ未満で検出することを含む、方法。

【請求項2】

前記標的核酸の検出において少なくとも１０^９のシグナル増幅を達成するように操作可能である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

少なくとも３０回のＰＣＲサイクルと同等の前記標的核酸の検出においてシグナル増幅を達成するように操作可能である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

静電容量センサによる前記核酸検出が、少なくとも約８ｐＦのフルスケールレンジを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

静電容量－デジタルコンバータを使用して前記静電容量センサからのシグナルを変換することをさらに含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記静電容量－デジタルコンバータが、シグマ－デルタ２４ビット静電容量－デジタルコンバータである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

静電容量センサによる核酸検出が、少なくとも約０．５ａＦの分解能および少なくとも約４ａＦの精度を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

静電容量センサによる前記核酸検出が、基準入力に内部オフセットキャパシタを含めることにより、少なくとも約１５ｐＦのフルスケールレンジを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

前記標的核酸をレポーター（Ｒ）ビーズに結合させることと、
シグナル処理回路と通信する基板上の２つの静電容量電極を含むセンサ領域を介して前記Ｒビーズを通過させることであって、
前記２つの電極は、間隔を空けて配置されギャップを形成しており、
一度に単一のビーズのみが前記ギャップ間を移動する、前記Ｒビーズを介して通過させることと、
前記Ｒビーズを、前記シグナル処理回路を使用して、それが前記ギャップを介して通過するときに検出することと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記Ｒビーズを複数のセンサ領域を介して通過させることと、
前記Ｒビーズを、前記複数のセンサ領域から前記シグナル処理回路によって受信されたシグナルに、最大尤度推定（ＭＬＥ）機械学習アルゴリズム、部分応答最大尤度（ＰＲＭＬ）アルゴリズム、またはビタビアルゴリズムのうちの１つまたはそれを超えるものを適用することによって、それが前記複数のセンサ領域を通過するときに検出することと、
をさらに含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記標的核酸を検出することが、
前記標的核酸をレポーター（Ｒ）ビーズに結合させることと、
静電容量センサを使用して前記Ｒビーズを検出することと、
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記静電容量センサを使用して前記Ｒビーズを検出することが、流体中で前記センサを通過して流れる前記Ｒビーズを検出することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記流体がオイルを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記オイルがシリコーンオイルである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記流体がフッ素化炭素を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記流体が、ドデカフルオロ－２－メチルペンタン－３－オンおよびメトキシ－ノナフルオロブタンから選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記Ｒビーズをフッ素化することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記流体中を流れる前記Ｒビーズの周囲に水層を形成して、前記静電容量センサにおける検出シグナルを増幅することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項19】

ビーズ結合ペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用して前記標的核酸を前記Ｒビーズに結合させることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

前記ビーズ結合ＰＮＡがリガンドリンカーＰＮＡである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

１つまたはそれを超える静電容量センサを使用して、試料中に存在する少なくとも前記標的核酸を含む複数の異なる標的を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記複数の異なる標的が、複数の異なる標的核酸を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記複数の異なる標的核酸が、異なる病原体または病原体の異なるバリアントに由来する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記病原体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記複数の異なる標的がタンパク質を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項26】

前記タンパク質が抗体である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記タンパク質が抗原である、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記標的核酸がデングウイルスに由来し、前記抗体がデング特異的抗体である、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記複数の異なる標的を検出することが、
前記複数の標的の各々を異なるビーズに結合させることと、
前記静電容量センサを使用して前記異なるビーズの各々を検出することと、
を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項30】

前記静電容量センサからの異なる静電容量検出シグナルに基づいて前記異なるビーズを区別することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記複数の異なる標的を検出することが、前記複数の異なる標的の各々を基板上の異なるプローブに結合させることを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項32】

前記基板が、１つまたはそれを超える静電容量センサと操作可能に関連付けられる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

１つまたはそれを超えるレポーター（Ｒ）ビーズを前記異なる基板結合標的の各々に結合させることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記Ｒビーズが結合している前記異なる基板結合標的に基づいて前記基板結合標的から前記Ｒビーズを選択的に放出することと、
前記静電容量センサを通過する前記放出されたＲビーズを流体中で流すことと、
前記センサを通過して流れる前記放出されたＲビーズを検出することと、
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記異なるビーズの各々が異なるサイズを有する、請求項２９に記載の方法。

【請求項36】

前記異なるビーズの各々を、そのサイズに基づいて異なる静電容量センサにマイクロ流体的に誘導することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記誘導するステップが、慣性法、誘電泳動法または磁気泳動法のうちの１つまたはそれを超えるものを含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記標的核酸を検出することが、
前記標的核酸を基板上のプローブに結合させることと、
複数のレポーター（Ｒ）ビーズを前記基板結合標的核酸に結合させることと、
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項39】

前記複数のＲビーズが、前記基板結合標的核酸中の異なる配列に結合する、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記基板が、前記静電容量センサと操作可能に関連付けられる、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

前記基板結合標的核酸から前記複数のＲビーズを放出することと、
前記静電容量センサを通過する前記放出されたＲビーズを流体中で流すことと、
前記センサを通過して流れる前記放出されたＲビーズを検出することと、
をさらに含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項42】

前記２つの電極が、前記Ｒビーズが通過するトレンチを形成する、請求項９に記載の方法。

【請求項43】

前記標的核酸を検出することが、
輸送（Ｔ）ビーズを前記試料中の前記標的核酸に結合させてＴビーズ複合体を形成することと、
前記Ｔビーズ複合体をレポーター（Ｒ）ビーズに結合させてＲビーズ複合体を形成することと、
前記Ｒビーズ複合体から前記Ｒビーズおよび前記Ｔビーズを溶出することと、
静電容量センサを使用して前記Ｒビーズを検出することと、
前記Ｔビーズを前記試料に戻して別の標的核酸に結合させることと、
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項44】

核酸検出のためのシステムであって、前記システムは、
シグナル処理回路と、
前記シグナル処理回路と通信する基板上に２つの静電容量電極を含むセンサ領域と、
を含む静電容量センサを含み、前記２つの電極は間隔を空けて配置されギャップを形成しており、
単一のビーズのみが任意の時点で前記ギャップ間を移動し、前記電極は前記ビーズおよび／または前記ビーズに結合した任意の分子を検出する、システム。

【請求項45】

前記システムが、ビーズを検出するために使用された後に再使用可能である、請求項４４に記載のシステム。

【請求項46】

前記静電容量センサが、約２ｍｍ×２ｍｍである、請求項４４に記載のシステム。

【請求項47】

ビーズまたは粒子が、水、緩衝液、またはオイルもしくはフッ素化炭素、または有機溶媒に含まれ、前記センサ領域を通って流れる、請求項４４に記載のシステム。

【請求項48】

検出される前記ビーズまたは粒子が、上流アッセイからの微生物学的分析物の代用物である、請求項４７に記載のシステム。

【請求項49】

ビーズまたは粒子が磁性または非磁性であり得る、請求項４７に記載のシステム。

【請求項50】

前記ギャップが、ビーズ直径の２倍である、請求項４４に記載のシステム。

【請求項51】

前記基板が３Ｄ印刷されている、請求項４４に記載のシステム。

【請求項52】

前記電極が、スパッタリングまたはインク堆積およびパターニングによって形成される、請求項５１に記載のシステム。

【請求項53】

前記電極間の前記間隔が約０．８μｍ～２０μｍである、請求項５２に記載のシステム。

【請求項54】

前記基板がＣＭＯＳ半導体チップである、請求項４４に記載のシステム。

【請求項55】

前記電極が金属層内でエッチングされ、前記電極間の前記間隔は４０ｎｍ～５μｍである、請求項５４に記載のシステム。

【請求項56】

ビーズ凝集および／またはオイルシリンジングを防止するための超音波振盪、誘電泳動ビーズステアリング、またはビーズゼータ電位の調整のうちの１つまたはそれを超えるものをさらに含む、請求項４４に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２２年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／３０４，３１２号の利益および優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、一般に、磁気ビーズによる核酸および抗体／抗原分子捕捉、ならびにこれらの分子の検出／定量の方法、単一ビーズのレベルひいては単一分子検出に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
生物学的試料からの核酸（ＮＡ）の捕捉および検出は、早期疾患の検出およびモニタリングの重要な側面になっている。従来の臨床検査室評価では、分子および血清学（抗体／抗原）試験の両方が、確実な診断を提供する際に一緒に使用される。理想的には、そのような試験は、１つの試料から一緒に行われる。一例として、ＰＣＲまたはＬＡＭＰ試験は、ウイルスＲＮＡの存在に関する定性的またはおそらく半定量的な情報を提供することができ、一方、別個の抗体検出は、人の過去の感染状態を確立することができる。捕捉されたＮＡの定量が、例えば、感染性病原体のウイルス量を決定する際、または複数の捕捉されたＮＡの遺伝子発現分析のために重要である。

【0004】

最近のＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックに見られるように、マルチプレックス試験、バリアントの同定、およびジェノタイピングも非常に重要になっており、この場合、「懸念されるバリアント」（例えば、デルタ、オミクロン）が大きな健康問題および多くの死者を引き起こした。超高感度での直接単一分子検出は、がんを引き起こす可能性がある稀少変異の分析、病原性ＤＮＡまたはＲＮＡによるバイオ医薬品の微量汚染の検出、ウイルス量が極めて低い患者におけるウイルス感染の非常に早いまたは遅い検出（参照により本明細書に組み込まれる「ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ＰＣＲ」米国特許第５８１１２３５号を参照されたい）、ならびにクローニングおよびＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定におけるテンプレート生成を可能にし得る。超高感度法の欠点は、アンプリコンによる交差汚染、犯罪現場に容疑者が偶発的に接触すること、および患者が感染から回復してもはや感染性でなくなった後も病原性ＲＮＡまたはＤＮＡの存在に関して長期間検査陽性であり続けることであり得る。これらは酵素増幅法の特定の特徴である。

【0005】

これらの非常に重要な健康診断は、現在、高度に専門化された検査室でのみ利用可能であり、高度に訓練されたスタッフならびにかなりの設備およびインフラストラクチャを必要とし、すべてが多大な費用の一因となる。

【0006】

核酸捕捉のための磁気ビーズの使用は公知である。このための最適な磁気ビーズ直径は、４００ｎｍ～２８００ｎｍの範囲である。核酸捕捉のために、典型的には４０ｎｍに至るまでのさらに小さい直径を有する非磁性粒子（例えば、ガラス、シリカ、ポリスチレン、チタニア、銀、または金）もまた、用いられる。診断におけるナノ粒子の注目すべき使用は、それらが抗原の比色検出のために抗体とコンジュゲートされる、またはその逆に、同じ技術を使用した抗体試験のために抗原とコンジュゲートされるラテラルフロー試験である。

【0007】

捕捉されたＤＮＡを溶出し、仮に標的ＤＮＡが存在し、適合するオリゴマープローブおよびプライマーとハイブリダイズする場合、それは典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または光検出のためのループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）アッセイで指数関数的に増幅される。捕捉された標的がＲＮＡである場合、逆転写ステップ（ＲＮＡからｃＤＮＡ）が最初に用いられる。

【0008】

存在する場合、標的ＮＡの検出には従来の酵素増幅が用いられる。しかしながら、これらのＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法では、指数関数的増幅の確率論的性質のために、試料中の標的ＮＡの正確な定量が困難であり、低濃度の試料を測定および定量することは依然として困難である。ＰＣＲおよびＬＡＭＰを使用した単一分子検出もまた、特定の試料による酵素阻害、典型的にはそれぞれ＞１８（一般的には２０＋）および＞５０ヌクレオチドであるプライマープローブの長さのために困難である。これにより、一塩基変異（例えば、デルタまたはオミクロンバリアントにおいて）の多くが互いに１５～２０ヌクレオチド以内に起こり得る、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイク遺伝子の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）における変異などの非常に重要な変異への結合を防ぐことができる。液滴／デジタルＰＣＲおよび配列決定は、単一分子の検出および識別に対処することができるが、それらの方法は、典型的には、大型で極めて高価な検査装置および訓練された専門家のオペレーターを必要とする。

【0009】

相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）チップ、例えば、Ｆｌｏｒｅｓｃｕら（２０１０）「Ｏｎ－ｃｈｉｐ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｊ Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．１０７（５）：０５４７０２に記載されているようなホールセンサ、およびＭｕｒｍａｎｎら（２０１３）「Ａ ２５６ ｐｉｘｅｌ ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｉｎ ０．１８μｍ ＣＭＯＳ」，ＩＥＥＥ Ｊ Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ４８（５）：１２９０－１３０１に記載されているようなＧＭＲ－ＳＶセンサ（これらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）上で標的分子を運ぶ磁性ビーズの検出が提案されている。

【0010】

しかしながら、これらのＣＭＯＳチップの各々は、高価でありかつ標準的な大容量ＣＭＯＳファウンドリープロセスでは一般に利用できない余分な磁性層および金属特殊層を必要とする。

【0011】

ＣｈａｎｇおよびＬｕ（２０１３），「ＣＭＯＳ ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔ Ｃｏｎｆ ＩＥＥＥ Ｅｎｇ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｓｏｃ．２０１３：４１０２－５（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、ＣＭＯＳチップ上での磁気ビーズの静電容量検出を提案している。

【0012】

ガラス、シリカ、チタニア、銀、金ナノ粒子などの非磁性粒子の検出は、典型的には、高価な光検出器、レーザ、Ｘ線もしくはＳＥＭ、または質量分析装置を必要とする。いくつかのラテラルフロー試験では、ヒトの眼による視覚的な検出が可能であり、この試験では、多数の典型的には４０ｎｍのナノ粒子が検出（または対照ライン）で捕捉されることで視覚的な検出が可能になる。しかしながら、これらの方法の感度は数千の粒子に限定される。

【0013】

米国特許第１０，７４６，６８３号（Ｃｕｍｍｉｎｓら）（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、上に列挙した磁性および非磁性の両方の粒子を検出するための櫛型電極（ＩＤＥ）静電容量センサを記載している。これは、２００ビーズの検出下限を有する使い捨てセンサであり、水またはバッファー担体が蒸発し、ビーズがセンサ表面に永久的に付着したままになる。
米国特許第１０，１６０，９６６号（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌら）（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、試料に提供され得るビーズ、および標的核酸分子にハイブリダイズし捕捉するこれらのビーズに結合したペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを開示している。これは使い捨ての構成である。
米国特許第１１，４５９，６０１号（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌら）（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、核酸検出のための様々なアッセイステップを開示している。第１のＰＮＡプローブおよび捕捉された核酸が付着した常磁性輸送（Ｔ）ビーズを試料から磁気的に除去し、様々な洗浄およびテザーステップにより移動させる。次いで、第２のＰＮＡプローブが付着したレポーター（Ｒ）ビーズが、存在する場合、捕捉された標的核酸にテザリングして、標的特異的サンドイッチアッセイを作製する。次いで、これを洗浄チャンバおよびＣＭＯＳセンサチップ上に移動させ、そこでＲビーズを溶出および検出する。これも使い捨ての構成である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】米国特許第５８１１２３５号

【特許文献2】米国特許第１０，７４６，６８３号

【特許文献3】米国特許第１０，１６０，９６６号

【特許文献4】米国特許第１１，４５９，６０１号

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Ｆｌｏｒｅｓｃｕら（２０１０）「Ｏｎ－ｃｈｉｐ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｊ Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．１０７（５）：０５４７０２

【非特許文献2】Ｍｕｒｍａｎｎら（２０１３）「Ａ ２５６ ｐｉｘｅｌ ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｉｎ ０．１８μｍ ＣＭＯＳ」，ＩＥＥＥ Ｊ Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ４８（５）：１２９０－１３０１

【非特許文献3】ＣｈａｎｇおよびＬｕ（２０１３），「ＣＭＯＳ ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔ Ｃｏｎｆ ＩＥＥＥ Ｅｎｇ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｓｏｃ．２０１３：４１０２－５

【発明の概要】

【0016】

本開示のシステムおよび方法は、一般に、試料中の標的分析物の検出および／または定量に関する。本明細書で論じられる様々な構造および技術により、単独でまたは組み合わせて、ＰＣＲなどの酵素増幅を必要とせずに、単一分子検出に至るまでの感度を得ることができる。本発明のシステムおよび方法は、例えばウイルス核酸およびそのウイルスに対する宿主抗体の同時検出を可能にする、各種核酸標的全体にわたるだけでなく全標的クラスにわたってマルチプレックス標的検出をさらに可能にする様々な構造的利点および電子シグナル増幅技術を使用することができる。

【0017】

本発明の態様は、静電容量センサを使用し、酵素増幅なしで、試料中に存在する標的核酸を１００コピー／ｍＬまたはそれ未満で検出することを含む、核酸検出方法を含み得る。様々な実施形態において、全体を通して論じられる技術は、単独でまたは組み合わせて使用して、アッセイの所望の感度、精度、および複雑性に応じて、１５０コピー／ｍＬまたはそれ未満、２５０コピー／ｍＬまたはそれ未満、５００コピー／ｍＬまたはそれ未満、１０００コピー／ｍＬまたはそれ未満、５０００コピー／ｍＬまたはそれ未満、１０，０００コピー／ｍＬまたはそれ未満、５０，０００コピー／ｍＬまたはそれ未満、１００，０００コピー／ｍＬまたはそれ未満、１，０００，０００コピー／ｍＬまたはそれ未満などの検出を達成し得る。特定の実施形態において、方法は、標的核酸の検出において少なくとも１０^９個のシグナル増幅を達成するように操作可能であり得る。様々な実施形態において、方法は、この場合もアッセイパラメータに応じて、少なくとも１０^８、少なくとも１０^７、少なくとも１０^６、少なくとも１０^５、少なくとも１０^４、少なくとも１０^３、または少なくとも１０^２のシグナル増幅を達成し得る。同様に、方法は、少なくとも３０回のＰＣＲサイクル、少なくとも２５回のＰＣＲサイクル、少なくとも２０回のＰＣＲサイクル、少なくとも１５回のＰＣＲサイクル、少なくとも１０回のＰＣＲサイクル、または少なくとも５回のＰＣＲサイクルと同等の標的核酸の検出においてシグナル増幅を達成するように操作可能であり得る。

【0018】

静電容量センサによる核酸検出は、少なくとも約８ｐＦ、少なくとも約７ｐＦ、少なくとも約６ｐＦ、少なくとも約５ｐＦ、少なくとも約４ｐＦ、少なくとも約３ｐＦ、少なくとも約２ｐＦ、または少なくとも約１ｐＦのフルスケールレンジを含み得る。方法は、静電容量－デジタルコンバータを使用して静電容量センサからのシグナルを変換することを含み得る。静電容量－デジタルコンバータは、シグマ－デルタ方式の２４ビット静電容量－デジタルコンバータであり得る。静電容量センサによる核酸検出は、少なくとも約０．５ａＦの分解能および少なくとも約４ａＦの精度を含み得る。様々な実施形態において、静電容量センサによる核酸検出は、参照入力に内部オフセットキャパシタを含めることにより、少なくとも約１５ｐＦのフルスケールレンジを含み得る。

【0019】

本発明の方法は、標的核酸をレポーター（Ｒ）ビーズに結合させることと、シグナル処理回路と通信する基板上の２つの静電容量式電極を含むセンサ領域を介してＲビーズを通過させることと、シグナル処理回路を使用して、ギャップを介してＲ－ビーズが通過するときのＲビーズを検出することと、をさらに含み得る。２つの電極は、単一のビーズのみが一度にギャップ間を移動するように間隔を空けて配置されギャップを形成してもよい。２つの電極は、Ｒビーズが通過するトレンチを形成してもよい。方法は、Ｒビーズを複数のセンサ領域を介して通過させることと、Ｒビーズを、複数のセンサ領域からシグナル処理回路によって受信されたシグナルに最大尤度推定（ＭＬＥ）機械学習アルゴリズム、部分応答最大尤度（ＰＲＭＬ）アルゴリズム、またはビタビアルゴリズムのうちの１つまたはそれを超えるものを適用することによって、それが複数のセンサ領域介して通過するときに検出することと、をさらに含み得る。

【0020】

いくつかの実施形態において、標的核酸を検出することは、標的核酸をレポーター（Ｒ）ビーズに結合することと、静電容量センサを使用してＲビーズを検出することと、を含み得る。静電容量センサを使用してＲビーズを検出することは、流体中でセンサを通過して流れるＲビーズを検出することを含み得る。流体はオイルであり得る。オイルはシリコーンオイルであり得る。流体はフッ素化炭素を含み得る。流体は、ドデカフルオロ－２－メチルペンタン－３－オンおよびメトキシ－ノナフルオロブタンから選択され得る。方法は、Ｒビーズをフッ素化することを含み得る。方法は、流体中を流れるＲビーズの周りに水層を形成して、静電容量センサで検出シグナルを増幅することを含み得る。

【0021】

特定の実施形態において、方法は、ビーズ結合ペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用して標的核酸をＲビーズに結合させることを含み得る。ビーズ結合ＰＮＡは、標的ＲＮＡと相互作用しないリガンドまたはリンカーＰＮＡを含み得る。方法は、１つまたはそれを超える静電容量センサを使用して、試料中に存在する少なくとも標的核酸を含む複数の異なる標的を検出することを含み得る。複数の異なる標的は、複数の異なる標的核酸を含み得る。複数の異なる標的核酸は、異なる病原体または病原体の異なるバリアントに由来し得る。病原体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり得る。複数の異なる標的は、タンパク質を含み得る。タンパク質は抗体であり得る。タンパク質は抗原であり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸はデングウイルスに由来し得、抗体はデング特異的抗体であり得る。特定の実施形態において、標的は、Ｏｎｐａｔｔｒｏ、Ｐａｔｉｓｉｒａｎ、ｇｉｖｏｓｉｒａｎ、ｌｕｍａｓｉｒａｎ、およびｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ（ｓｉＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない薬物、またはＲＥＧＥＮ－ＣＯＶ（ｃａｓｉｌｉｖｉｍａｂおよびｉｍｄｅｖｉｍａｂ）などの抗体カクテルであり得る。

【0022】

標的は、トジナメランなどのｍＲＮＡワクチンであり得る。治療薬およびウイルス量の共モニタリングが有利であり、本方法およびシステムのマルチプレックス性により、そのような共モニタリングが可能になり得る。いくつかのＲＮＡ由来薬物の安定性が使用前および使用後の両方で懸念されており、例えば注射前および使用後の血液または唾液試料からの両方のこれらの濃度またはレベルのモニタリング技術が有益である。製薬会社におけるこれらの技術のＱＣに同じ技術を使用することができる。標的は、合成であり得、Ｎｌ－メチルプソイドウリジンなどの非標準塩基を含み得る標的核酸誘導体を含み得る。標的はまた、リン脂質または糖脂質であり得る。標的は、細胞、ウイルス粒子または脂質ナノ粒子の表面にあってもよく、ここで、細胞、ウイルス粒子または脂質ナノ粒子はテザリングを可能にする。

【0023】

複数の異なる標的を検出することは、複数の標的の各々を異なるビーズに結合させることと、静電容量センサを使用して異なるビーズの各々を検出することと、を含み得る。方法は、静電容量センサからの異なる静電容量検出シグナルに基づいて異なるビーズを区別することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、Ｒビーズが結合している異なるセンサ結合標的に基づいて、Ｒビーズを基板結合標的から選択的に放出することと、Ｒビーズを放出するキャパシタンスへの影響を検出することと、を含み得る。

【0024】

複数の異なる標的を検出することは、複数の異なる標的の各々を基板上の異なるプローブに結合することを含み得る。基板は、１つまたはそれを超える静電容量センサと操作可能に関連付けられてもよい。方法は、１つまたはそれを超えるレポーター（Ｒ）ビーズを異なる基板結合標的の各々に結合させることをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、Ｒビーズが結合している異なる基板結合標的に基づいて基板結合標的からＲビーズを選択的に放出することと、静電容量センサを通過する、放出されたＲビーズを流体中で流すことと、センサを通過して流れる放出されたＲビーズを検出することと、を含み得る。異なるビーズの各々は、異なるサイズを有してもよく、方法は、そのサイズに基づいて異なるビーズの各々を異なる静電容量センサにマイクロ流体的に誘導することを含み得る。この誘導するステップは、慣性法、誘電泳動法または磁気泳動法のうちの１つまたはそれを超えるものを含み得る。

【0025】

標的核酸を検出することは、標的核酸を基板上のプローブに結合させることと、複数のレポーター（Ｒ）ビーズを基板結合標的核酸に結合させることと、をさらに含み得る。複数のＲビーズは、基板結合標的核酸中の異なる配列に結合し得る。基板は、静電容量センサと操作可能に関連付けられてもよい。方法は、基板結合標的核酸から複数のＲビーズを放出することと、静電容量センサを通過する、放出されたＲビーズを流体中で流すことと、センサを通過して流れる放出されたＲビーズを検出することと、をさらに含み得る。

【0026】

特定の実施形態において、標的核酸を検出することは、輸送（Ｔ）ビーズを試料中の標的核酸に結合させてＴビーズ複合体を形成することと、Ｔビーズ複合体をレポーター（Ｒ）ビーズに結合させてＲビーズ複合体を形成することと、Ｒビーズ複合体からＲビーズおよびＴビーズを溶出することと、静電容量センサを使用してＲビーズを検出することと、Ｔビーズを試料に戻して別の標的核酸に結合させることと、を含み得る。

【0027】

本発明の態様はまた、上記の方法のいずれかを実行するように操作可能な本明細書に記載されるようなシステムおよびアーキテクチャを含み得る。

【0028】

本発明の態様は、核酸検出のためのシステムを含み得、システムは、シグナル処理回路と、シグナル処理回路と通信する基板上に２つの静電容量電極を含むセンサ領域とをさらに含む静電容量センサを含み、２つの電極は間隔を空けて配置されギャップを形成しており、単一のビーズのみが任意の時点でギャップ間を移動し、電極はビーズおよび／またはビーズに結合した任意の分子を検出する。システムは、ビーズを検出するために使用された後に再利用可能であり得る。静電容量センサは、約２ｍｍ×２ｍｍであり得る。ビーズまたは粒子は、水、緩衝液、またはオイルもしくはフッ素化炭素、または有機溶媒に含まれていてもよい。検出されるビーズまたは粒子は、上流アッセイからの微生物学的分析物の代用物であり得る。ビーズまたは粒子は、磁性または非磁性であり得る。

【0029】

ギャップは、ビーズ直径の２倍であり得る。いくつかの実施形態において、基板は３Ｄ印刷されてもよい。電極は、スパッタリングまたはインク堆積およびパターニングによって形成され得る。電極間の間隔は、約０．８μｍ～２０μｍであり得る。基板は、ＣＭＯＳ半導体チップであり得る。電極は、金属層内でエッチングされてもよく、電極間の間隔は、約４０ｎｍ～約５ｐｍであり得る。特定の実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、ビーズ凝集を防止し、かつ／またはシステムを通る粒子およびビーズの移動を誘導するために、超音波振盪、誘電泳動ビーズステアリング、オイルシリンジングおよび／またはビーズゼータ電位の調整の１つまたはそれを超えるものをさらに含み得る。

【0030】

本発明の目的は、検査室以外で、簡易な携帯用フォーマットで、臨床現場および家庭で使用するために、操作のための訓練をほとんどまたは全く必要としない非常に重要な健康診断を利用可能にすることである。しかしながら、同じ技術は、中央検査室のサイズ、規模、電力消費量および物流コストを削減することができる。本発明の更なる目的は、患者試料からの核酸および抗体の同時かつ迅速な検出を可能にすることである。この同時検出は、デングウイルス（ＤＥＮＶ）ＲＮＡバリアント１、２、３、４（現在の活動性感染を示す）を検出および区別するだけでなく、ＤＥＮＶ抗体も検出および同定することが不可欠なデングアウトブレイクなどの症例に有利であり得る。トリアージでは、デングワクチンの適用に関する何らかの臨床判断を行う前に、患者が過去のデング熱感染症の病歴を有していたかどうかを確立することにそれが役立ち得る。

【0031】

本明細書に記載されるシステムおよび方法は、上で論じた技術における特定の欠点を認識し、これに対処する。例えば、Ｆｌｏｒｅｓｃｕのビーズは極めて大きく、通常は２．８μｍまたはそれよりも大きく、直径４．５μｍの円形ホールセンサ上へのビーズの正確な操作を必要とする。単一粒子のこの精密操作は、自動化された市販のＮＡアッセイでは実用的ではない。Ｍｕｒｍａｎｎの磁性粒子はより小さい（５０ｎｍ）が、検出の下限は２０００粒子であり、ほとんどの核酸試験および遺伝子発現分析に実用的ではない。ＣｈａｎｇおよびＬｕに記載されているビーズは、１０μｍの直径であり、ほとんどの分子分析アッセイには大きすぎ、コイルの正確な中心へのビーズの電磁的操作を必要とする。これはまた、商業的または自動化されたアッセイに実用的ではない。さらに、ＣｈａｎｇおよびＬｕに記載されているセンシング機構は、ビーズの存在下でＣｈａｎｇおよびＬｕのキャパシタンスが実際に減少するため、静電容量性ではない。したがって、ビーズの連続フローを検出し、単一のビーズを検出することができる再使用可能なセンサのニーズは満たされていない。さらに、単一分子分析を可能にするためのビーズの連続フローに対する満たされていないニーズがある。単一分子分析、ジェノタイピング、およびバリアント同定を可能にするためのＴビーズおよびＲビーズの連続フローに対する満たされていないニーズ、ならびに流行病大発生状況における迅速な臨床介入、処置、およびリアルタイム監視を可能にするために、ポイントオブケアおよびコミュニティクリニックなどの非検査室環境において、核酸検出、バリアント同定、ウイルス量定量、および単一分子検出分析を実行するための簡易な携帯用手段および方法に対する満たされていないニーズもある。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】ＰＥＴフィルム上のスパッタリングされたＩＴＯ電極上のビーズ付き分析物液滴を示す。

【0033】

【図2】静電容量－デジタルコンバータおよびＰＥＴフィルムへの接続ソケットを示す。

【0034】

【図3】２４ビットシグマデルタ静電容量－デジタルコンバータアーキテクチャおよび回路を示す。

【0035】

【図4】３Ｄ印刷された基板上のインク印刷されたレーザーアブレーション電極キャパシタを示す。

【0036】

【図5】図４のインク印刷されたレーザーアブレーション電極の側面写真である。

【0037】

【図6】ＣＭＯＳシリコンチップ上のエッチングされたアルミニウム電極ＩＤＥキャパシタを示す。

【0038】

【図7】アルミニウムおよび銅電極ＣＭＯＳ半導体の形成を示す。

【0039】

【図8】テザリングされたビーズ付きの従来技術の分析物センサ、およびその等価回路を示す。

【0040】

【図9】図６の円形ＣＭＯＳセンサ上に具体的に捕捉されたビーズの写真である。

【0041】

【図10】キャパシタンス対ＲＮＡのグラフにおけるエンドツーエンドアッセイ性能を示す。

【0042】

【図11】１つのセンサへの多数のビーズの特異的テザリングによるシグナル増幅を示す。

【0043】

【図12】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの保存領域を標的とするＰＮＡプローブを示す。

【0044】

【図13】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの領域を標的とする更なるＰＮＡプローブを示す。

【0045】

【図14】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの領域を標的とする更なるＰＮＡプローブを示す。

【0046】

【図15】デングエンベロープおよびＮＳ１タンパク質の抗原性ペプチド配列を示す。

【0047】

【図16】デングウイルスバリアント１、２、３、４を標的とするＰＮＡプローブを示す。

【0048】

【図17】デングウイルスバリアント１、２、３、４を標的とするＰＮＡプローブを示す。

【0049】

【図18】いくつかのセンサにスポットされたＰＮＡプローブを有する３０個のＣＭＯＳセンサを示す。

【0050】

【図19】デングＲＮＡおよび抗体検出のためのセンサのスポッティングパターンを示す。

【0051】

【図20】ＣＭＯＳセンサチップ上に並んだデングＲＮＡおよび抗体アッセイを示す。

【0052】

【図21】図６のＩＤＥキャパシタのいくつかをＣＭＯＳシリコンチップ上の行で示す。

【0053】

【図22】いくつかのセンサ上に透明なシリコーンオイルを有する図２１のチップの写真である。

【0054】

【図23】図２１の円形センサの一方の上にあるオイルのシリンダの概略図である。

【0055】

【図24】Ｃ_{シリコーンオイル}およびＣ_窒化物を有する図２３の等価回路を示す。

【0056】

【図25】図２１の円形センサ上のビーズ含有ＰＤ５オイル膜の写真である。

【0057】

【図26】円形センサ上の図２５のビーズ付きオイルのシリンダの概略図である。

【0058】

【図27】Ｃ_{シリコーンオイル}、Ｃ_窒化物、Ｃ_ビーズを有する図２６の等価回路を示す。

【0059】

【図28】ビーズの有無によるＰＤ５オイルキャパシタンスのセンサ測定値を提供する。

【0060】

【図29】金属電極間の０．８μｍトレンチ内の０．４μｍビーズを示す。

【0061】

【図30】電極間を通過するオイル中のこのビーズの電場シミュレーションである。

【0062】

【図31】ビーズが電極間を通過するときのビーズの計算されたキャパシタンスを示す。

【0063】

【図32】図３０および図３１のシミュレーションで使用される境界要素モデルを示す。

【0064】

【図33】図２９の電極の真下の接地面を示す。

【0065】

【図34】接地面を下にした、図３３のビーズキャパシタンス計算を示す。

【0066】

【図35】電極間を流れる一連のビーズのリアルタイムキャパシタンスを示す。

【0067】

【図36】複数の電極間を流れ、次いで基板の孔を流れ落ちるビーズを示す。

【0068】

【図37】インク電極および３Ｄ印刷された基板のレーザ形成貫通孔を示す。

【0069】

【図38】レーザアブレーションによって形成された狭いギャップを有するインク印刷電極を示す。

【0070】

【図39】Ｔビーズの再利用を伴う特定の実施形態によるアッセイを示す。

【0071】

【図40】例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の単一分子分析を可能にする実施形態を示す。

【0072】

【図41】ＣＯＶＩＤ／インフルエンザ／枯草熱についての家庭用呼吸器唾液自己検査の実施形態を示す。

【0073】

【図42】流体相転移を通って流れるフッ素化レポータービーズを示す。

【0074】

【図43】相転移を横切ってビーズを流すためのマイクロ流体の実施形態を示す。

【0075】

【図44】追加の増幅を提供するＤビーズにテザリングされたＲビーズを示す。

【0076】

【図45】センサ間を流れるＲビーズ－Ｄビーズテザリング複合体を示す。

【0077】

【図46-1】（ａ）ＣＭＯＳセンサ、（ｂ）ビーズ基板にテザリングされたＲ－Ｄビーズ複合体を示す。

【図46-2】同上。

【0078】

【図47】Ｄビーズを表面にテザリングする縮小サイズＲナノ粒子（１～１００ｎｍ）を示す。

【0079】

【図48】リンカー型の分子形状を有するＲナノ粒子を示す。

【0080】

【図49】標的ＲＮＡと相互作用しないリガンドであるリンカーを示す。

【0081】

【図50】Ｄビーズを磁性粒子の表面にテザリングするＲナノ粒子を示す。

【発明を実施するための形態】

【0082】

詳細な説明
本発明は、複数のビーズ試験、またはビーズの連続フローに再使用可能であり、容易に製造可能かつ自動化可能な改良された静電容量ビーズセンサを提供する。本明細書に記載されるシステムおよび方法は、単一ビーズ、したがって単一標的分子に至るまでの検出を可能にする。以下で論じられる電子的および他のシグナル増幅技術により、酵素増幅なしでその感度を達成することができ、それによって上記のような酵素法の欠点のいくつかが回避される。さらに、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、試料中の様々な濃度の標的分子のマルチプレックス分析において特に有用な広いダイナミックレンジを維持しながら、所望の感度を達成することができる。

【0083】

以下により詳細に論じられるように、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、とりわけ、ａ）生物学的試料からの核酸分子、抗体分子、および抗原分子の同時の捕捉および検出；ｂ）（例えば、臨床的ウイルス量決定のための）これらの分子の一桁のコピーレベルまでの定量；ｃ）複数の静電容量ビーズセンサ上の複数のＰＮＡ捕捉遺伝子の同時定量による遺伝子発現分析；ｄ）試料およびアッセイステップを通してリサイクルされた複数のビーズ上の複数のＰＮＡプローブによる単一分子検出分析；ｅ）同じ試料からのＲＮＡおよび抗体の両方の同時検出による現在の感染と過去の感染との識別のうちの１つまたはそれを超えるものを可能にし得る。
ビーズ検出およびシグナル増幅

【0084】

図１は、１５０μｍ厚さのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム上の６つのスパッタリングされたインジウム－スズ酸化物（ＩＴＯ）静電容量電極センサを示す。各キャパシタは約２ｍｍ×２ｍｍである。コネクタソケット（右側）は、キャパシタンス－デジタルコンバータ、アナログおよびデジタルフィルタ、不揮発性メモリ、シグナルプロセッサ、および無線通信（Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、ＷｉＦｉ、ＧＳＭ（登録商標）、ＧＰＲＳなど）を含み得るシグナルプロセッサにキャパシタを接続する。示されているキャパシタンス（４．４５ｐＦ、４．５８７ｐＦ、４．５９ｐＦ）は、液体またはビーズを含まないベースライン値である。わずかな値の増加（Ｓ１－Ｓ３－Ｓ５）は、各キャパシタに到達するためのより長い配線を反映している。これらのベースライン値は、（図２８に示すように）関連するセンサ読み取り値の各々からのオフセット減算によってゼロベースラインへのすべてのセンサのヌル化を可能にするために、シグナル処理回路の不揮発性メモリにオフセットとして格納することができる。センサは、いくつかの用途におけるアッセイの自動化のために、液滴分注チップとの統合を容易にするために直線状に配置される。

【0085】

図２は、印刷回路基板（ＰＣＢ）上のキャパシタンス－デジタルコンバータ、およびこれらを図１の６つのキャパシタに接続する小型ソケットを示す。

【0086】

図３は、当該技術分野、例えば、「Ｏｖｅｒｓａｍｐｌｉｎｇ Ｄｅｌｔａ－Ｓｉｇｍａ Ｄａｔａ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒｓ」（Ｃａｎｄｙら、Ｗｉｌｅｙ－ＩＥＥＥ Ｐｒｅｓｓ，１９９２）で知られているようなシグマ－デルタ静電容量－デジタルコンバータの回路アーキテクチャを示す。ＫＨｚ～ＭＨｚのモジュレータクロック周波数で操作する標準的なスイッチトキャパシタ技術を使用して、Ｃ_センサをＣ_基準と比較する；差分が増幅および積分され、次いでコンパレータに適用される。コンパレータ出力は、Ｖ_基準スイッチ、事実上１ビットデジタル－アナログコンバータ（ＤＡＣ）を制御するためにフィードバックされる。コンパレータビットストリーム出力はデシメーションフィルタに適用されて最大２４ビット分解能のデジタル結果を生成する。典型的な変換時間は１ｍＳ～１００ｍＳである。多段積分増幅器によって提供される１００万倍の電子増幅は、全体的なアッセイ増幅に寄与し得る。

【0087】

図４は、インク印刷およびレーザアブレーションパターニングを使用して形成された櫛型電極を有する３Ｄ印刷されたポリ乳酸（ＰＬＡ）基板を示す。測定されたベースラインキャパシタンス（フィンガおよび配線間寄生を含む）は、４．５ｐＦ～６．１ｐＦの領域にある。キャパシタンスのフリンジ電界センシングまたは変換部分は、電極間隔に応じて０．４ｐＦ～１．６ｐＦの領域内にあってよく、これはアブレーションレーザのスポットサイズに応じて、典型的には０．８μｍ～２０μｍであり得る。

【0088】

図５は、図４のＳ４のインク電極の側面写真である。電極構造を作製するためのインクのレーザアブレーションは、３Ｄ印刷中に数ミクロンから数百ミクロンまでプログラム可能なインク厚さの高さを有する、電極間のトレンチをもたらす。エレクトロハイドロダイナミックインクジェット印刷は、レーザアブレーションを必要とせずに細線（例えば１ｐｍ）電極特徴を作り出す別の方法である。

【0089】

図６は、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）チップの金属トップ層のサブトラクティブエッチングによって形成された櫛型電極（ＩＤＥ）キャパシタを示す。この実施形態において、シグマ－デルタ静電容量－デジタルコンバータは、センサの下または隣接して、同じＣＭＯＳチップ内に形成されてもよい。これにより、寄生キャパシタンスおよびノイズ（熱および電磁気）が有意に低減され、それによって測定のダイナミックレンジがより広くなる。

【0090】

ＣＭＯＳセンサを形成する金属層の断面図を図７（Ｂｕｒｇｈａｒｔｚら、ＩＥＥＥ ２００４，ＤＯＩ １０．１１０９／ＴＥＤ．２００４．８２３３２５からの例示的な例）に示す。この参考文献はまた、典型的なＣＭＯＳプロセス形成ステップを記載しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０ｎｍもの低い電極間隔は、半導体製造の最新のドライプラズマエッチングおよび高度方向性異方性深部反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）方法で達成することができる。図７の破線（ａ）は、特定の実施形態において、不動態化せずにビーズをその間に流すためのトレンチとして使用することができるトップ金属の狭い空間を示す。これは、製造ステップ（不動態化）を排除してより狭い間隔を達成しながら、アッセイ増幅を増加させるのに有利であり得る。ビーズが流れ得るシリコーンオイルで覆われている場合、金属の酸化または腐食が起こらない。図７の破線（ｂ）は、図５の３Ｄ印刷されたレンチと同様に、はるかに厚い金属構造用の銅めっきを用いた変形例である。Ｂｕｒｇｈａｒｔｚのこの銅めっきの例は、ＲＦインダクタコイル形成のためのものである。特定の実施形態において、本発明のシステムは、トレンチ内のビーズの測定、およびオイル中のビーズの流れの測定のために、この標準的な大容量ＲＦ－ＣＭＯＳ厚金属技術を電極トレンチ構造として使用することができる。これにより、特別なＣＭＯＳ層または非標準半導体処理の要求を回避することができる。

【0091】

図８は、静電容量ビーズ検出方法（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，７４６，６８３号を参照されたい）を示す。ビーズは、単にセンサ表面（８ｂ）に到達するか、または例えばプローブ－０によってセンサ表面（８ｃ）に特にテザリングされ、ビーズに結合した更なるプローブ－１によってテザリングされ得る。静電容量フリンジ場（８ｂ点線の電場）が、ビーズ材料の誘電率に起因するＣ_ビーズを検出するトランスデューサを形成する。図８（ａ）は等価回路を示す。力線が絶縁窒化物保護層を通過するため、Ｃ_窒化物がＣ_ビーズと一続きに現れる。

【0092】

図９は、図８（ｃ）テザリングの写真図であり、この場合、ＨＩＶ ｇａｇ遺伝子を標的とするように設計されたＰＮＡプローブによって図６の円形センサの中心に特異的に捕捉されたレポータービーズ（Ｒビーズ）を示す。これらは、患者試料からの上流アッセイにおけるＨＩＶ－ＲＮＡのプロキシビーズであるため、ビーズ数を定量したものであるセンサキャパシタンスもまた、患者試料中のＨＩＶウイルス量の直接デジタル読み出しである。これは、図１０の「キャパシタンス対ＲＮＡ」のエンドツーエンドのアッセイ性能グラフに示されている。上の写真は、センサ表面に特異的に捕捉されたビーズを示す。下の写真は、オフターゲットＰＮＡプローブを使用した場合にビーズが捕捉されていないことを示す。

【0093】

図１１は、（プローブ－０によって）センサ表面にテザリングされた標的ＲＮＡ鎖を示し、プローブ１、２、３、４などによって、いくつかのビーズがＲＮＡにテザリングされている。これらのプローブは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの異なる保存領域を標的とするように設計され得、したがって、標的捕捉の非常に高い特異性を与える。それはまた、センサ上にテザリングされた捕捉ビーズの数が増加するために、有意なシグナル増幅をもたらす。これは、樹状増幅を模倣し、酵素増幅なしで非常に低いコピー数レベルであってもＤＮＡまたはＲＮＡを定量するために、全体的なアッセイ増幅を補助することができる。
核酸および抗体アッセイペプチドならびにプローブ設計

【0094】

図９のＨＩＶ Ｇａｇ遺伝子ＰＮＡプローブの配列は、ＺｈａｏらによってＮａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（ｎＣｏｍｍｓ ５０７９）に発表されており、その内容全体が本明細書に組み込まれる。完全合成ＰＮＡプローブは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用してＦＭＯＣ化学によって化学的に合成することができる。

【0095】

図１２は、武漢参照配列ならびにアルファ、ベータ、ガンマ、デルタおよびオミクロンＢＡ．１およびＢＡ．２バリアントにわたって保存された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの固有の領域を標的とする１４塩基ＰＮＡプローブを示す。このプローブは、例えば図１１のプローブ－０のように、センサ表面にテザリングされてもよい。

【0096】

図１３および図１４は、オミクロンＢＡ．１およびＢＡ．２バリアントをアルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタバリアントと識別するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の領域を標的化するように設計された更なるＰＮＡプローブ（プローブ６、プローブ７）を示す。プローブ８は、そのＳ遺伝子ドロップアウト欠失を標的とすることによってＢＡ．２バリアントをさらに限定し、同定する。当該技術分野で公知のように、更なるプローブを同様に適用して他のバリアントを同定し、ここで、（例えば、図４１に示すような論理テーブルを適用することによって）少数の慎重に設計されたプローブ配列を用いてバリアント同定およびウイルスジェノタイピングを達成することができる。例えば、２００４「Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ」（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２００４．０６．０１６）において、Ｌｏｎｇらは、（２００３／２００４年の）「ＳＡＲＳ－ＣｏＶの検出だけでなく、ＳＡＲＳの流行の異なる段階に関連する６つの変異した塩基の遺伝子型の同定」を与える２０個のプローブ配列を発表した。

【0097】

図１５は、デングウイルス（ＤＥＮＶ）（Ｎａｇａｒら、ＤＯＩ１０．１１５５／２０２０／１８２０３２５）のエンベロープ（Ｅ）および非構造（ＮＳ－１）タンパク質の合成ペプチド配列を示す。これらはまた、ＦＭＯＣ ＳＰＰＳによって化学的に合成され得る。それらは、患者の抗血清中のデング特異的ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体を試験および診断するために使用されるＤＥＮＶエンベロープおよび非構造タンパク質の線状エピトープに基づく。示されている９つの配列は、（Ｎａｇａｒらによる）高特異性抗体検出を提供するための「最も抗原性／反応性」の中からのものである。

【0098】

図１６および図１７は、示されている保存領域を標的とするちょうど２つのＰＮＡプローブ（１４ｂｐおよび１５ｂｐ）を用いて、４つのデング参照ゲノムＮＣ＿００１４７７、ＮＣ＿００１４７４、ＮＣ＿００１４７５、ＮＣ＿００２６４０（ＤＥＮＶ１、２、３、４）の１００％検出を達成する例を示す。これは、典型的には＞２５ｎｔであり、したがって示されている変異のいくつかに及ぶであろうより長いＰＣＲプローブおよびプライマーでは不可能であり、１００％未満の特異性、およびより低い捕捉効率をもたらす。ＰＮＡの高い捕捉効率はまた、全体的なアッセイシグナル増幅、したがって感度に寄与し得る。

【0099】

マルチプレックス試験
図１８は、様々なセンサ上にスポットされたＰＮＡテザリングプローブと共にグループ化された、図６に個別に示すような３０個の円形ＣＭＯＳセンサを示す写真である。これらのプローブは、図９のビーズサークルに見られ、図１１に示されるように、レポーターＲビーズを特異的に捕捉することができる。３０個のセンサは、ＬＡＭＰまたはＰＣＲアッセイで可能であるよりもはるかに高次のマルチプレックス化およびジェノタイピングを可能にする。これは、図１９の例示的な実施形態に示されており、１２個のセンサには、６つのＲビーズＤＥＮＶ ＰＮＡプローブ（ＰＮＡ１～６）の二重複製物がスポットされている。これらは、１００％デング検出のための図１６／１７の２つのＰＮＡプローブと、ＤＥＮＶ１／２／３／４変異同定のための各々１つのＰＮＡプローブとを含む。高特異性ＤＥＮＶ抗体検出のために、９つのセンサに図１５のＥおよびＮＳ１ペプチド配列がスポットされる：
ＥＰｌ、ＥＰ２、ＥＰ４、ＥＰ７、ＥＰ１０、ＥＰ１２、ＮＳｌ－ｌ、ＮＳｌ－３、ＮＳｌ－４。各センサのビーズ定量能力を使用して、ＥおよびＮＳ１量を確立することができる。ＣＭＯＳチップエレクトロニクスおよびプロセッサの機械学習能力と組み合わせると、これは、アッセイ感度および選択性の向上、ならびに「重度のデング」ならびに重度および潜在的に致死性のデング出血熱（ＤＨＦ）およびデングショック症候群（ＤＳＳ）の潜在的な発症の予測を助けることができる。２つのＰＮＡ陽性対照センサ（両方とも、血液試料の場合は１８ｓ ｒＲＮＡ相補的プローブ、または唾液試料の場合はＲＮＡｓｅ Ｐ相補的プローブをスポットした）が含まれる。例えば単一塩基ミスマッチ確認試験対照用の２つの「ＰＮＡーｎｅｇ」陰性対照センサが含まれる。ＩｇＭおよびＩｇＧ陽性対照、ならびにａＧ陰性抗原対照についてスポットしたセンサも含まれる。温度およびＣＭＯＳプロセス変動補正およびオフセット除去のための２つのブランクセンサが使用される。

【0100】

このアッセイのこの高マルチプレックスおよび核酸／抗体固有の同時検出能力は、同じＦＭＯＣ化学によって各々合成された、図２０に示すように、３０個の同一場所に配置されたセンサ、および並列完全合成ペプチド配列およびペプチド－核酸（ＰＮＡ）プローブによって実行される。

【0101】

特定の実施形態において、上記マルチプレックス化検出は、フロースルー検出を使用して実行されてもよい。例えば、上記の各スポットは、センサでなくてもよい。代わりに、基板へのＲビーズのテザリングは、試料中のＲＮＡと相互作用しない慎重に設計されたＰＮＡリンカーまたはリガンド配列によって媒介され得る。これらは、ＲＮＡを標的とするＰＮＡプローブまたは抗原性ペプチド配列にコンジュゲートされる。リンカーＰＮＡの慎重な設計により、システムが加熱され、リンカーＰＮＡの融解温度に達すると、基板からのＲビーズの連続的かつ選択的な溶出が可能になる。このようにして、ＲＮＡ標的によって媒介されるスポットに付着したＲビーズを選択的かつ連続的に放出し、続いて下流のセンサで測定することができる。さらに、関連するリンカーＰＮＡのＴｍに達すると、抗体によって媒介されるスポットに付着したＲビーズを選択的に放出し、下流のセンサで測定することができる。センサは、それらを通過するＲビーズを検出するインラインセンサであり得る。特定の実施形態において、センサは、特定のＲビーズに結合するＰＮＡ機能性センサであり得る。代替的に、基板は、磁気ビーズの表面であり得る。
シリコーンオイル中を流れるビーズの検出：

【0102】

図２１は、ＣＭＯＳシリコンチップ上の図６のセンシングキャパシタの別の実施形態を示す。この実施形態において、シグマ－デルタキャパシタンス－デジタルコンバータは、センシングキャパシタの左側のＣＭＯＳチップ内に形成される。チップ全体に統合された複数のダイオード温度センサは、チップ全体の温度変動によるセンサ読み取り値の差を測定および補償できることを保証する。センサは、いくつかのアッセイ自動化用途のための液滴ディスペンサ、または例えば上流核酸および抗体アッセイが異なるチャネルにあり得るマルチチャネルアッセイ方法との統合を容易にするために、行および列がオフセット形成にある。

【0103】

図２２は、チップの右半分の様々な直径のいくつかのセンサ上に透明なＰＤ５シリコーンオイルの膜を有する図２１のチップの写真である。オイルの膜は、ＩＤＥ電極静電容量センサのフリンジ場変換部分に位置し、したがって、空気（Ｋ＝１）よりも高い約２．５～３のオイル誘電率Ｋに起因してセンサキャパシタンスを増加させる。

【0104】

図２３は、円形センサのうちの一方の上でセンシングされているオイル膜の円筒部分の概略図である。図２４は、絶縁窒化物不動態化層のキャパシタンスであるＣ_窒化物と一続きに現れるオイルキャパシタンスＣ_{シリコーンオイル}を示す、図２３の等価回路を示す。

【0105】

図２５は、一方の円形センサ上の二酸化チタン（ＴｉＯ_２）ビーズを含むＰＤ５オイル膜の写真である。オイル膜中のこれらの二酸化チタン分析物ビーズは、それらの誘電率が約３０～約１００と、それがオイル誘電率（２．５～３）よりもはるかに高いために、更なるキャパシタンスを追加する。実際、ＴｉＯ_２のＫは、より低い周波数（１００Ｈｚ、Ｗｙｐｙｃｈら、ＤＯＩ １０．１１５５／２０１４／１２４８１４による）で１０倍高くなり得る（最大Ｋ＝１０００）。したがって、最大１秒のより遅い変換時間を犠牲にしてシグマ－デルタコンバータモジュレータ周波数を遅くすることによって、更なる１０倍のアッセイ増幅が可能である。

【0106】

図２６は、円形センサ上のビーズ付きオイルの円筒部分を示す、図２５の概略図である。

【0107】

図２７は、図２５および図２６のこの分析物センサの等価回路であり、Ｃ_窒化物と組をなして、関連するＣ_{シリコーンオイル}およびＣ_ビーズキャパシタンスを示す。

【0108】

図２８は、ビーズの有無によるオイルキャパシタンスのセンサ測定値を示す。時間ゼロにおいて、すべてのセンサは、空気誘電体でゼロにベースライン化される。２分後、ＰＤ５オイル膜（ビーズなし）を（陰性対照として）センサＳ０およびＳ３０に適用し、１分後に１μｍのＴｉＯ２ビーズを含有するＰＤ５オイルをＳ６およびＳ２５に適用する。グラフの上部に見ることができるように、ビーズはキャパシタンスの７．６ｆＦの増加を引き起こす。（図２５の写真のように）顕微鏡でのビーズの目視計数は、約６０００個のビーズの推定値を与え、すなわち、ビーズあたり約１．２６ａＦを示す。これは、シグマ－デルタコンバータのモジュレータによって電極間に印加される１．６Ｖのスイッチトキャパシタ電圧に対して、約１２個の電子に相当する。

【0109】

Ｓ０およびＳ３０陰性対照センサ（直径０．９６ｍｍ）を参照すると、シリコーンオイルの２分での添加が、キャパシタンスを１３２ｆＦ増加させる。直径０．５４ｍｍおよび０．３ｍｍのセンサＳ５およびＳ７の場合、キャパシタンスはそれぞれ４５ｆＦおよび１２．５ｆＦ増加する。これらの測定値を以下の表１にまとめており、これは、センサ直径に関係なく、シリコーン－オイル膜が空気誘電体と比較して約１８３ｆＦ／平方ｍｍ増加していることを示す。
表１

【表1】

【0110】

オイル中のビーズのこれらの測定は、本発明のシステムおよび方法の様々な実施形態を示す。それらは、液体蒸発の必要性を排除するために使用することができ、複数回の測定のためのセンサの再使用を可能にするのに有利である。それは、液体流量制御およびシリンジするによるビーズの移動を可能にし得、非磁性ビーズおよび粒子を検出するために、または磁性粒子のために有用である。図２８に示すグラフはまた、オイル膜厚さが変化するときのキャパシタンスの変化と、動的リアルタイムのビーズフロー検出能力を示すセンサからビーズが流出するときのキャパシタンスの変化とを示す。
オイル中の単一ビーズおよびビーズフローの電気的特性評価：

【0111】

図２９は、電極間の０．８μｍトレンチ内の０．４μｍビーズを示す。

【0112】

図３０は、１ボルトが印加されたこれらの電極、および電極間を通過するオイル中（Ｋ＝２．５）のこのビーズ（Ｋ＝１００）のＣＯＭＳＯＬ静電シミュレーションを示す。電場勾配線を０．１Ｖステップで示す。

【0113】

図３１は、２．５、１０、３０、１００、および１０００のビーズ誘電率について、電極間を通過する際のビーズのＣＯＭＳＯＬキャパシタンス計算を示す。オイル中の０．４μｍビーズ（Ｋ＝１００）が０．８μｍの電極ギャップを通過するときにキャパシタンスは４アトファラド（ａＦ）でピークになる。これは、（図２８のグラフから）より大きな１μｍのＴｉＯ２ビーズについて、１．２ａＦよりも０．４μｍのビーズについての方が、電極間隔がより小さくかつビーズ全体の電場がより強いために、キャパシタンスがより高い。これは、この非酵素的検出／定量アッセイの全体的なシグナル増幅にさらに寄与し得る。ビーズ全体の電場の増加が、ビーズ内の分子の双極子分極を増加させ、それによってそのキャパシタンスが増加する。３９９ａＦのベースラインキャパシタンスは、このシミュレーションで使用された図３２の境界要素モデル（ＢＥＭ）に示すように、近傍に他の配線または接地面がないモデルの短い電極に部分的に起因して、このシミュレーションでは極めて低い。

【0114】

実際には、電極は、それらを静電容量－デジタルコンバータに接続する長さ数ミリメートルの配線を有し得、かつ／または物理基板、例えば３Ｄ印刷されたベース、またはＣＭＯＳシリコン基板上に形成され得る。電気的にこれらの基板は大きな接地面として現れ得る。これは図３３に示されており、ＣＭＯＳシリコン基板で一般的であり得るように、０．４μｍのビーズが０．８μｍの電極ギャップを通過し、その下には２μｍの接地面がある。オイル（Ｋ＝２．５）中Ｋ＝１００ビーズの場合、ＣＯＭＳＯＬビーズキャパシタンスは、図３４に示すように、ここでも４ａＦである。しかしながら、図３４のベースラインキャパシタンスは、近くの接地面への寄生キャパシタンスの増加に起因して４．２７４フェムトファラド（ｆＦ）（すなわち、図３１よりも１０倍超高い）である。より長い配線（例えば、１０ｍｍ～１５ｍｍ）は、このベースラインをさらに、例えば、図１および４に示す実施形態において４．５ｐＦ～６．１ｐＦ増加させることができる。４ａＦの単一ビーズキャパシタンスは、アトファラド（ａＦ）～ピコファラド（ｐＦ）までのこれらの巨大なベースライン変動でも検出可能であることは注目に値する。これは、シグマ－デルタ２４ビット静電容量－デジタルコンバータの広いダイナミックレンジに起因する。この実施形態は、８ｐＦのフルスケールレンジ、０．５ａＦの分解能、および４ａＦの精度を有する。追加の内部オフセットキャパシタをＣ_基準（図３）に追加して、ベースライン範囲を、例えば最大１７ｐＦまたは２０ｐＦまで拡張することができる。これにより、大きな寄生があっても、シリコン基板またはＣＭＯＳチップ上に、接地面の有無にかかわらず、３Ｄ印刷によって、多くの異なる方法で静電容量センサを製造することが可能になる。

【0115】

図３５は、非常に低いアトファラドレベルの測定値のコンバータ出力の時間領域グラフを示す。大量の熱および１／Ｆノイズが明らかである。電極間を通過するビーズは、３ａＦ～６ａＦの静電容量シグナルにほぼ対応する短い「ブリップ」として現れ得る（波形において丸で囲まれた先端）。これらのブリップを識別することは簡単ではない。単純なピーク検出は、あいまいなブリップを見逃す可能性がある（図３５において「？」が付されたピークによって例示される）。特定の実施形態において、移動平均フィルタリングを使用して識別を補助することができるが、短いブリップを見逃す可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、図３６に示すように同じビーズを複数回読み取るのを助けるために、ビーズチャネルに複数の電極を使用することができる。次いで、最大尤度推定（ＭＬＥ）機械学習アルゴリズムを読み取り値に適用してビーズカウント精度を改善することができる。部分応答最大尤度（ＰＲＭＬ）およびビタビアルゴリズムは、ビーズ識別をさらに改善し、エラー率を低減する。ＣＭＯＳセンサチップ内にそれ自体埋め込まれ得るシグナル対雑音比のこれらのデジタルフィルタリングの改善は、酵素増幅なしで全体的なアッセイ増幅にさらに寄与し得る。

【0116】

多くの増幅方法および増幅ステップが本開示に記載されている：ＰＮＡ高捕捉効率、ビーズ質量、ＣＭＯＳ １０^６電子増幅、マルチビーズテザリングシグナル増幅、トレンチ内のビーズ電場増加、ＭＬＥおよびＰＲＭＬ／ビタビデジタルシグナル処理。これらの複合効果は、このアッセイにおいて１０^９～１０^１２の増幅に達することである。これは、それぞれ３０～４０回のＰＣＲサイクルにほぼ等しい。したがって、本明細書に記載される全合成アッセイを使用して、＜１００コピー／ｍＬの分析感度レベルを達成することができるが、臨床ＲＮＡウイルス量モニタリングに理想的な数桁の広いダイナミックレンジを有する。本発明のアッセイは、酵素増幅の要求をさらに排除することができ、したがって、ＰＣＲおよびＬＡＭＰアッセイの阻害問題および複雑性の多くも排除する。全合成であるため、このアッセイはまた、ドライアイスの輸送および冷蔵庫または冷凍庫での貯蔵の要件を排除する。電子デバイスのような潜在的に数年までの長い貯蔵寿命は、試薬がより迅速に、特別な取り扱いなしに劣化する可能性がある酵素アッセイと比較して、別の可能な利点である。
貫通孔ビーズフローアッセイ方法

【0117】

図３６は、複数の電極対の間で基板上のチャネルまたはトレンチに沿って流れ、次いで基板の孔を流れ落ちて後部から出るビーズを示す。いくつかの実施形態において、これは、国際公開第２００４／１０９７７０号に記載されているように、ＤＲＩＥエッチングされたシリコン貫通孔であり得る。

【0118】

図３７は、インク電極および３Ｄ印刷されたＰＬＡ基板における例示的なレーザ形成貫通孔を示す。これは、ビーズがチューブまたはチャネル内を流れ得るインラインビーズ測定に有利であり得る。

【0119】

図３８は、０．８μｍのレーザスポットサイズを有するレーザアブレーションによって形成された、ＡおよびＢインク印刷電極間の狭い０．８μｍの電極間隔を示す。次いで、ビーズはチャネル内を流れ、（３Ｄ印刷されたベースのレーザアブレーションによって作製された）電極間の孔を通って「落下」する。滑らかなビーズフローは、ビーズを運ぶオイルまたは他の液体流のプッシュ／プル制御をシリンジ処理することによって、かつ／または誘電泳動ステアリングによって強化することができ、この場合、帯電ビーズ（例えば、－３０ｍＶのゼータ電位）は、外部からまたは流路に沿って、例えば図３８に示す＋／－チップによって印加される正または負の電圧に応答する。ビーズの凝集は、ビーズを互いに反発させることができるカルボン酸コーティングによってビーズのゼータ電位を例えば－３０ｍＶに調整することによって、かつ／またはセンサを通る単分散フローを補助するための装置の超音波振盪によって最小限に抑えることができる。

【0120】

フロースルー検出器システムにマルチプレックス化能力を提供するために、複数のフロースルーセンサを同じデバイスに配置することができる。試験される各バリアントに対応して、異なるサイズのＲビーズのいくつかの個別の群を使用することができる。これらのＲビーズは、各サイズの群が異なる貫通孔センサに送達されることを可能にするために空間的に分離されてもよい。分離の方法は、慣性分離、または誘電泳動分離または磁気泳動分離によるものであり得る。それによって、ビーズを区別することができ、マルチプレックスアッセイにおける各ビーズのそれぞれの標的の分別検出が可能になる。
ビーズのリサイクル

【0121】

特定の実施形態において、ワークフローに応じてシステムを通してビーズをリサイクルすることが有利であり得る。例示的なビーズリサイクルスキームを図３９に示す。システム３９０１は、試料捕捉３９０３、アッセイ構築３９０５、溶出３９０７およびセンサ検出３９０９の４つの主要領域を有する。選択されたセンシング方法に応じて、標的化ＲＮＡが枯渇するまでＴビーズが連続的に供給されるので、Ｔビーズのリサイクルが有利であり得る（図３９）。３９０３において、Ｔビーズは、Ｔプローブを介して標的ＲＮＡを捕捉する。ＲプローブおよびＲビーズは、３９０５でアッセイ構築の次の段階に添加され、その時点で完全なアッセイは、センサ上の溶出点３９０７に磁気的に輸送される。次いで、溶出したＲビーズは、特異的ＰＮＡ－ＰＮＡ結合を介してセンサ３９０９に付着する。経時的に、ソース標的ＲＮＡがもはや利用できなくなるまで、特定のセンサ上にＲビーズの数が蓄積する。次いで、最終的な（合計）シグナルが捕捉される。図３９に示すように、溶出ステップ３９０７の後にＴビーズを再利用３９１１し、初期捕捉ステップ３９０３に戻すことができる。Ｔビーズを初期捕捉ステップ３９０３に戻す前に洗浄し、ビーズに偽プローブ、ＲビーズまたはＲＮＡが確実に付着しないようにすることができる。

【0122】

ＣＭＯＳ検出器が上記のような単一ビーズ連続フローセンサである場合、センサ表面結合なしで、アッセイ構築および溶出は、溶出後にリサイクルされたＴビーズを用いて同様に行われる。そのような実施形態において、ＲビーズおよびＴビーズは、溶出後に迂回され、Ｒビーズは単一ビーズＣＭＯＳ検出器を通過し、Ｔビーズは、標的ＲＮＡが枯渇するまで初期捕捉ステップで試料に戻る。次いで、シグナルは、各イベントで読み取られて、ＣＭＯＳ検出器を通過したビーズの数を効果的にカウントする。
単一分子分析：

【0123】

全体を通して論じたように、各種シグナル増幅技術を単独でまたは組み合わせて使用して、例えば単一分子検出に対する感度を高めることができる。単一分子検出は、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアウトブレイクにおける感染症の早期検出およびウイルス量の正確な定量を含む多くの用途を有する。図４０は、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の単一分子分析のための実施形態を示す。

【0124】

２０２２年初期に、Ｌａｉら（ＤＯＩ：１０．１１０１／２０２２．０１．０８．２２２６８８６５）は、その時点で既知のバリアント：アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、ラムダ、ミュー、イプシロン、イオタ、エータ、カッパ、および初期オミクロンバリアントに対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム内の４８個のマーカーまたはヌクレオチド変異のリストを公開した。ゲノム内のこれらの変異領域の各々を標的とする４８個のプローブの「総当たり（ｂｒｕｔｅ－ｆｏｒｃｅ）」セットを想定すると、プローブ－１は、例えば図１２に示すように、すべてのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２バリアントを一意的に標的とするように設計された捕捉プローブである。プローブ－１は、試料からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを捕捉し抽出するために連続的に流れるアッセイの常磁性輸送（Ｔ）ビーズに結合され得る。Ｒビーズはまた、最初にプローブ２、次にプローブ３、次にプローブ４など、プローブ４８までの異なるプローブが付着した群で、テザリングチャンバに順次流入することができる。次いで、図１３および図１４に部分的に示すように、患者試料中のバリアントを検索および絞り込み分析によって同定することができる。いくつかの実施形態において、必要とされるプローブの数は、オミクロンバリアントを同定するためのＬ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、およびＨ６５５Ｙ変異のマッピングを有する図４１に示されるように、バリアントを同定するために「真理値表」の論理的低減分析を適用することによって減少され得る。

【0125】

図４１は、自己検査唾液試料からの家庭用呼吸器検査のためのアッセイ実施形態を示す。上記のＣＯＶＩＤ－１９検出およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアント同定に加えて、別個にプローブを追加して、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＲＳＶおよび他のウイルス性病原体を識別および同定し、また免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体を検出するためのエピトープ抗原のペプチド配列プローブを識別して、くしゃみおよび鼻づまり発作の原因となり得るアレルギー性鼻炎（「枯草熱」）を同定する。上で論じた実施形態の単一分子までのアッセイ感度、酵素増幅（家庭での使用が複雑になる可能性がある）の欠如、および標的のクラスにわたるマルチプレックス性をすべて組み合わせて、そのような試験を可能にすることができる。

【0126】

他の低誘電率液体中を流れるビーズの検出：
低誘電率液体の他の例は、ドデカフルオロ－２－メチルペンタン－３－オン（Ｎｏｖｅｃ ６４９）、およびフッ素化炭素、例えばメトキシ－ノナフルオロブタン（Ｎｏｖｅｃ ７１００）である。これらは、望ましい環境特性および電気特性を有する高度な熱伝達流体として使用される透明で無色で低臭気の液体である。Ｎｏｖｅｃ ６４９は、電子機器の冷却に一般的に使用される。それは１．８の非常に低い誘電率（＠ｌｋＨｚ）を有し、ビーズのキャパシタンスセンシングに有利なキャリア媒体となる。さらに、それはより高密度で水に難溶性であり、フッ素化物質として、水性液体および油性液体の両方から分別される。特定の実施形態において、センサを通過してフローに放出されたビーズは、その液体内に単分散されて、アッセイ感度および単一分子検出を補助することができる。いくつかの実施形態において、相転移は、一般的に試料の種類が水性であるため使用され得る。

【0127】

図４２は、特定の実施形態による、水性溶媒とフッ素化溶媒との間の界面にフッ素化Ｒビーズを作製するための概略図である。ビーズは、界面全体の移行を可能にするリガンドで修飾され得る。図４２に示される界面に、例えばヘプタフルオロブチルアミン（Ｄｙｎａｂｅａｄｓで実証済み）を用いてフッ素化Ｒビーズに修飾されたビーズと、フルオロＰＮＡで修飾されたビーズ（例えば、Ｆｌｕｏｒ－ＰＮＡ２は、ミセルを形成し、かつ／または水性／フッ素化流体界面で整列する）とが続く。このスキームは、二相性の可溶性ＰＮＡ（ＰＮＡおよびフッ素化末端）を使用して、水性溶解Ｒビーズをタグ化し、その後のＲビーズのフッ素化溶媒への移行を可能にする方法を示す。オイルへの移行のための親油性ビーズを製造するために、同様の化学物質が利用可能である。いくつかの実施形態において、Ｒビーズは両親媒性を有し得、水性溶媒および有機溶媒またはフッ素化溶媒の両方に単分散し得る。さらに、一方または両方の溶媒に溶解した両親媒性界面活性剤の使用は、溶媒相間のビーズの移行を容易にし得る。このアプローチは、水相から非混和性イオン液体への金ナノ粒子の移行について、Ｗｅｉら（ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊａ０３９８７４ｍ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって実証されている。

【0128】

特定の実施形態において、例えば、最終フッ素化溶媒へのビーズの移行は、複数の溶媒（例えば、水性からアプロティック／有機、フルオロエーテル／エステル／ケトン、フッ素化または低誘電率溶媒）間の移行によるものであり得る。そのような移行は、図４３に示すようなマイクロ流体アプローチを使用して実行することができる。流体を使用して、ビーズが溶媒相全体を移動するときに混合またはミセル形成が重複する異なる溶媒を導入することができる。このアプローチはまた、別個の溶媒の各々における相間移行分子または両親媒性界面活性剤の使用を容易にし得る。このアプローチは、ビーズおよび溶媒のハンセン溶解度パラメータによって導かれ、ビーズ相移行を容易にするために各々の十分な溶解度を得る。同様の方法を、ビーズを有機溶液から水溶液に移す微小流体的なビーズ製造に使用することができる。

【0129】

Ｒビーズをある溶媒から別の溶媒に移動させる別の方法は、それらの高い誘電率または高いゼータ電位を利用して、Ｒビーズを「試料」または水溶液のフローからＮｏｖｅｃ ６４９または他の流体の平行なフローに偏向させることであり得、ここで、ビーズは、Ｎｏｖｅｃ ６４９に入ってセンサを有する出口に偏向されるまで、フローライン全体にわたって側方に移動する。

【0130】

いくつかの実施形態において、磁気感受性Ｒビーズをデバイス内に展開することができる。文献（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｍｍｅ＆Ｍａｎｚ、２００４，ＤＯＩ １０．１０２１／ａｃ０４９１８３ｏ）に示されているように、磁気泳動分離を使用して流体中でビーズを移動させることができる。磁気泳動分離を使用して、Ｒビーズを水相からＮｏｖｅｃ ６４９または油性もしくは他の相に偏向させることができる。

【0131】

水相から油性相へのビーズの移行は、ビーズが油性相にあるときにビーズの周りに薄いシェル層または水溶液の液滴の形成を可能にする。いくつかの実施形態において、この水性コーティングビーズをキャパシタンスセンサに流すことにより、ビーズ上の水性シェル層の高い誘電率に起因して、標準ビーズのシグナルを超える増幅されたシグナルを提供することができ、それによってシステム感度をさらに高めることができる。
テザリングとビーズフローアッセイとの組み合わせ：

【0132】

図４４の実施形態において、上流アッセイから溶出したＲビーズは、その後、更なるビーズに結合してシグナルを増幅し得る（「Ｄビーズ」、樹状増幅をここでも模倣する）。これは、ビーズ間のＰＮＡ－ＰＮＡ結合を使用して行うことができる。これにより、Ｒビーズをより小さくすることが可能になり、これらのより多くを単一分子（例えば、ＲＮＡ）に付着させることが可能になる。図４５は、流路を通るＲビーズ－Ｄビーズ複合体を示し、ここで、２つのＣＭＯＳセンサが互いの上に配置されて流路を部分的または全体的に形成し、ビーズが各センサを通過するときにキャパシタンスシグナルが両方のチップによって独立して測定される。一方のセンサによる測定値が、他方のセンサからの測定値とデジタル的に比較される。単一ビーズを測定するために同じ配置を使用することができる。

【0133】

Ｒビーズは、基板上のＲビーズおよびＤビーズ複合体の捕捉を媒介するために使用することができる。複合体は、複合体化していないビーズとの区別を媒介する特性を有し得る。これらは、基板がセンサの表面であるアッセイを完了し得る基板（例えば、ＲビーズＰＮＡによって媒介される）上での複合体の捕捉を含み得る。複合体の特性は、ＰＮＡ－ＰＮＡ結合、誘電泳動、または電気泳動を含み得る。この特性は、複合体をセンサに引き寄せ得る。この特性は、複合体がセンサを通過し、複合体化していない粒子が出口を通って流れる流路内で複合体を逸脱させる可能性がある。この特性は、複合体化していない粒子が出口を介して洗浄および／または除去される間、複合体または複合体の要素を基板上に一時的に保持することができる。例えば、基板に結合するＰＮＡ－ＰＮＡが使用される場合、複合体化していない粒子が出口を介して除去された後、システムの温度を上昇させて、複合体の１つまたは他のメンバーを基板から溶出させることができ、その後、それはセンサを通過し、本明細書の他の箇所に記載されるように測定することができる。複数のビーズの捕捉およびその後の放出は、フロースルー実施形態において前述のテザリングシグナル増幅を達成することができる。

【0134】

特定の実施形態において、Ｒビーズは、単一のＰＮＡに減少され得、このＰＮＡの別の基板への結合は、Ｄビーズの捕捉を媒介するために使用され得る。基板は、図４６ａに示すようにセンサチップ（すなわち、ＰＮＡ－ＰＮＡ捕捉のためにＰＮＡで機能化される）であってもよく、または基板は、図４６ｂに示すように追加の磁気ビーズであり得る。これは、テザリングされた複合体の各メンバー内の非常に強いＰＮＡ－ＰＮＡ結合の利点を用いて、磁気的にビーズのテザリングおよび操作を提供することができる。したがって、フロースルーセンサを使用する場合、テザリングによるシグナル増幅の利点を依然として得ることができる。

【0135】

図４７は、Ｄビーズを表面にテザリングするはるかに小さなＲビーズ（１～１００ｎｍ）の例である。

【0136】

図４８は、Ｒナノ粒子が他の形状を有し得るか、または１つもしくはそれを超えるプローブの付着を可能にするリンカー型分子であり得るか、または２つの領域を有する長いＰＮＡプローブであり得ることを示す。プローブ２は、Ｒナノ粒子上でも機能化されているが、天然のＲＮＡ標的と相互作用しないプローブまたはリガンドであり得る。これは、天然のＲＮＡ標的に見出される配列を回避し、ＰＮＡプローブとの相互作用を回避するための慎重なプローブ設計によって達成され得る。リガンドは、図４９に示すように、ビオチン－ストレプトアビジンを含むがこれに限定されない標的ＲＮＡ上の正常な塩基対形成と相互作用しないようなものであり得る。

【0137】

図５０は、センシングの前の更なる操作のためにＤビーズを磁性粒子の表面にテザリングする小型Ｒナノ粒子（１～１００ｎｍ）を示す。
参照による組み込み

【0138】

特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照および引用は、本開示全体を通して行われている。そのようなすべての文書は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0139】

均等物
本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の各種修正およびその多くの更なる実施形態は、本明細書に引用された科学文献および特許文献への参照を含むこの文書の全内容から当業者に明らかになる。本明細書の主題は、その各種実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な情報、例示、およびガイダンスを含む。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46-1】

【図46-2】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【国際調査報告】