知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ パウル－エアリッヒ－インスティテュート，ブンデスインスティテュート フュア インプシュトッフェ ウント ビオメディツィーニシェ アルツナイミッテルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-19
(54)【発明の名称】ＣＤ３２ａに特異的な結合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20250212BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250212BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20250212BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20250212BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250212BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20250212BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/11 Z
A61K38/16
A61K48/00
A61P31/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024542249
(86)(22)【出願日】2023-01-13
(85)【翻訳文提出日】2024-08-05
(86)【国際出願番号】 EP2023050760
(87)【国際公開番号】W WO2023135264
(87)【国際公開日】2023-07-20
(31)【優先権主張番号】22151678.4
(32)【優先日】2022-01-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524265507
【氏名又は名称】パウル－エアリッヒ－インスティテュート，ブンデスインスティテュート フュア インプシュトッフェ ウント ビオメディツィーニシェ アルツナイミッテル
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】バネッサ・リーヒェルト
(72)【発明者】
【氏名】ジェシカ・ハートマン
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアン・ブーフホルツ
(72)【発明者】
【氏名】クラウス・シチュテック
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA19
4C084BA23
4C084BA44
4C084ZB33
4C084ZC55
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA18
4H045BA21
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、アンキリンリピートを含み、特にその結果ＣＤ３２ａと特異的に結合する、またはＣＤ３２ａ陽性細胞を特異的に標的化する結合タンパク質に関する。このような結合タンパク質をコードする核酸、核酸、前記核酸を含むベクター、前記結合タンパク質を含む粒子、前記核酸を含む宿主細胞、医薬組成物、ならびに医薬および／またはいくつかの遺伝子治療における使用のためにこれらのいずれかが開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインはＣＤ３２ａと特異的に結合し、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは：ｉ）配列番号２８、２９および３０、ならびに
ｉｉ）互いに独立して最大１０個のアミノ酸置換を含む、配列番号２８、２９および３０
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１個のアンキリンリピートユニットを含み、好ましくは、置換は、配列番号２８、２９および３０に従うアミノ酸配列の１位、３位、４位、６位、１４位、１５位、および／もしくは２７位において互いに独立している、ならびに／または配列番号２８、２９および３０に従うアミノ酸配列の最大３個の他の位置において互いに独立している、結合タンパク質。
【請求項2】
少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質であって、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインはＣＤ３２ａと特異的に結合し、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、配列番号１～２７に従うアミノ酸配列からなる群から選択される１個のアンキリンリピートドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、結合タンパク質。
【請求項3】
前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、配列番号３１Ｘ１ＤＸ２Ｘ３ＧＸ４ＴＰＬＨＬＡＡＸ５Ｘ６ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ７ＧＡＤＶＮＡ（配列番号３１）
に従うアミノ酸配列からなる少なくとも１個のアンキリンリピートユニットを含み、
ここで、
Ｘ１～Ｘ６は、グリシン、プロリンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であってよく、
Ｘ７は、ヒスチジン、アスパラギンまたはチロシンであってよく、
ここで、配列番号３１においてＸで示される位置以外の場合により最大５個のアミノ酸は、任意のアミノ酸で置換される、請求項１または２に記載の結合タンパク質。
【請求項4】
Ｘ１は、Ｔ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、またはＷであり、好ましくはＴであり、Ｘ２は、Ｅ、Ｎ、Ｔ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、またはＩであり、好ましくはＥであり、
Ｘ３は、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｈ、Ｍ、Ａ、またはＴであり、好ましくはＥであり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｑ、またはＡであり、好ましくはＬであり、
Ｘ５は、Ｌ、Ｑ、Ｖ、Ｅ、Ｍ、Ｖ、またはＹであり、好ましくはＬであり、
Ｘ６は、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｖ、Ｗ、またはＤであり、好ましくはＩであり、
Ｘ７はＹ、ＮまたはＨであり、好ましくはＹである、
請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項5】
Ｘ１は、Ａ、Ｈ、Ｍ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、またはＶであり、好ましくはＡであり、Ｘ２は、Ｍ、Ｙ、Ｎ、Ｅ、Ｗ、Ｄ、Ｈ、またはＴであり、好ましくはＭであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、またはＨであり、好ましくはＤであり、
Ｘ４は、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、Ｄ、Ｓ、Ｙ、またはＰであり、好ましくはＴであり、
Ｘ５は、Ｑ、Ｅ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、またはＹであり、好ましくはＱであり、
Ｘ６は、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、またはＡであり、好ましくはＥであり、
Ｘ７は、Ｙ、またはＮであり、好ましくはＹであり、
場合により、１５位から始まり１５位を含むアミノ酸が欠損している、
請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項6】
Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｈ、またはＹであり、好ましくはＤであり、Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｈ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、好ましくはＦであり、
Ｘ３は、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｖ、ＥまたはＧであり、好ましくはＷであり、
Ｘ４は、Ｈ、Ｙ、Ｌ、ＭまたはＦであり、好ましくはＨであり、
Ｘ５は、Ｗ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、またはＲであり、好ましくはＷであり、
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｑ、Ｄ、またはＬであり、好ましくはＦであり、
Ｘ７は、Ｈ、ＹまたはＮであり、好ましくはＨである、
請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項7】
Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングリピートドメインをさらに含み、好ましくは、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングリピートドメインが、前記アンキリンリピートユニットのいずれか１個とは異なるアミノ酸配列を有する、請求項３～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項8】
前記結合タンパク質が抗原結合タンパク質を含み、好ましくは、それはＤＡＲＰｉｎを含む、またはＤＡＲＰｉｎである、請求項１～７のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載の結合タンパク質をコードする核酸を含む核酸。
【請求項10】
請求項９に記載の核酸、または請求項１～８のいずれか１項に記載の結合タンパク質を含むベクター。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか１項に記載の少なくとも１種の結合タンパク質を提示するベクター。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか１項に記載の少なくとも１種の結合タンパク質、または請求項９に記載の核酸、または請求項１０もしくは１１に記載のベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項13】
医薬品として使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の結合タンパク質、請求項９に記載の核酸、請求項１０もしくは１１に記載のベクター、または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
対象における、好ましくはＨＩＶ関連状態である、ＣＤ３２ａの変化に関連する状態の治療、予防または診断に使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の結合タンパク質、請求項９に記載の核酸、請求項１０もしくは１１に記載のベクター、または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項15】
対象における、好ましくはＨＩＶ関連疾患である、ＣＤ３２ａの変化に関連する状態の治療、予防または診断に使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の結合タンパク質、請求項９に記載の核酸、請求項１０もしくは１１に記載のベクター、または請求項１２に記載の医薬組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＤ３２ａに対する結合特異性を有する結合タンパク質、ならびにこのような結合タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、医薬および／または遺伝子治療において使用するための前記結合タンパク質；ならびに前記結合タンパク質、核酸またはベクターを含む医薬組成物に関する。特に、本発明は、ＣＤ３２ｂではなくＣＤ３２ａと特異的に結合する前記結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ３２（ＦｃｙＲｌｌまたはＦＣＧＲ２としても知られる）は表面受容体糖タンパク質であり、様々な免疫細胞、例えば血小板、好中球、マクロファージ、および樹状細胞などに存在する。ヒトでは、３つの主要なＣＤ３２サブタイプがある：ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、およびＣＤ３２ｃである。
【0003】
ＣＤ３２ａは細菌によって活性化された血小板応答の媒介に関与し、傷害を受けた血管に対する血小板の活性化、接着、凝集に重要な役割を果たすことが知られている。さらに、血小板上のＣＤ３２ａは、ヘパリン治療の生命を脅かす副作用であるヘパリン誘発性血小板減少症に関与している。
【0004】
さらに、ＣＤ３２ａの活性化はＴ細胞抗腫瘍細胞性免疫の産生に必要かつ十分であることが知られている。ＣＤ３２ａは自己免疫やアレルギーにも関連している。例えば、ＣＤ３２ａがアナフィラキシーやアレルギー反応を誘発することが知られている。加えて、ＣＤ３２ａ受容体のＳＮＰ Ｈ１３１Ｒが様々な作用と関係していることも知られている。ＣＤ３２ａは、関節リウマチや感染症リスクの増加など、いくつかのヒト自己免疫疾患と関連している。
【0005】
したがって、ＣＤ３２ａの検出と標的化は非常に重要な意味を持つようになった。それにもかかわらず、主要なＣＤ３２サブタイプ間の相同性が極めて高いため、異なるタイプを区別することは非常に困難である。ＨＩＶ研究の分野では、最近ＣＤ３２ａがＨＩＶリザーバー・マーカーとなる可能性が確認されたが、ＣＤ３２ｂが存在する中でＣＤ３２ａ陽性細胞のわずかなサブセットを同定することは技術的に困難であるため、議論の余地がなかったわけではない。信頼性の高いＣＤ３２ａ特異的細胞検出試薬がないため、異なるＣＤ３２陽性免疫細胞サブセットを識別し、末梢血からＣＤ４＋ＣＤ３２＋Ｔリンパ球の少数集団を分離するためには、逐次的に、複数の周期で、磁気ビーズによる細胞選別法を使用しなければならなかった。
【0006】
遺伝子レベルでは、ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂを識別する市販のｑＰＣＲプライマーペアが利用可能である。しかし、細胞レベル、より具体的には細胞表面上のＣＤ３２ａを検出するには、ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの非常に相同性の高い細胞外ドメインを識別できる結合タンパク質が必要である。ＣＤ３２ａ抗体はいくつか市販されているが、ほとんどはＣＤ３２ｂとも結合する。識別可能なものは、タンパク質の細胞内部分に対して発現しているか、細胞表面のＣＤ３２ａを検出する特異性が検証されていないかのどちらかである。総合すると、細胞表面のＣＤ３２ａに選択的に結合することができる抗体や抗体アナログは知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、ＣＤ３２ａ発現細胞とＣＤ３２ｂ発現細胞の混合細胞において、ＣＤ３２ｂ陽性細胞集団を事前に除去することなく、ＣＤ３２ａ陽性細胞を選択的に認識できる結合タンパク質を設計した。発見された結合タンパク質は、ＣＤ３２ａ受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
第１の態様において、本発明は、少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質を提供し、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、ＣＤ３２ａと特異的に結合し、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、
ｉ）配列番号２８、２９および３０、ならびに
ｉｉ）互いに独立して最大１０個のアミノ酸置換を含む、配列番号２８、２９および３０
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含み、好ましくは、置換は、配列番号２８、２９および３０の１位、３位、４位、６位、１４位、１５位、および／または２７位において互いに独立している、および／または配列番号２８、２９および３０の最大３個の他の位置において互いに独立している。
ｉ）配列番号２８、２９および３０、ならびに
ｉｉ）互いに独立して最大１０個のアミノ酸置換を含む、配列番号２８、２９および３０
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールを含み、好ましくは、置換は、配列番号２８、２９および３０の１位、３位、４位、６位、１４位、１５位、および／または２７位において互いに独立している、および／または配列番号２８、２９および３０の最大３個の他の位置において互いに独立している。
【0009】
第２の態様において、本発明は、少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、ＣＤ３２ａと特異的に結合し、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、配列番号１～２７からなる群から選択される１個のアンキリンリピートドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0010】
第３の態様において、本発明は、結合タンパク質、本明細書中に記載されるＮ末端キャッピングリピートおよび／またはＣ末端キャッピングリピートをコードする核酸配列を含む核酸に関する。
【0011】
さらなる態様において、本発明は、第３の態様の核酸を含む宿主細胞に関し、それは、場合により本発明の結合タンパク質を発現する。
【0012】
さらなる態様において、本発明は、第３の態様の核酸分子を含むベクターに関する。
【0013】
さらなる態様において、本発明は、分子を含む粒子に関し、この分子は、場合により、本明細書に記載される結合タンパク質である。
【0014】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の結合タンパク質、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載の宿主細胞、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の粒子、またはそれらの複数を含む組成物に関する。
【0015】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の、結合タンパク質、核酸、宿主細胞、ベクター、および／または粒子のうちの少なくとも１種を含む医薬組成物に関する。
【0016】
さらなる態様において、本発明は、医薬品として使用するための、記載の結合タンパク質、核酸、宿主細胞、ベクター、粒子、組成物または医薬組成物に関する。
【0017】
さらに別の態様において、本発明は、記載の結合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、粒子、組成物または医薬組成物を含むキットに関する。
【0018】
本発明の一態様において、本明細書に開示される結合タンパク質、核酸、ベクター、粒子、宿主細胞、組成物、医薬組成物、またはキットは、状態の治療、予防、または診断に使用するためのものである。
【0019】
以下では、本明細書に含まれる図の内容が記述される。この文脈では、上記および／または下記の発明の詳細な説明も参照せよ。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】細胞表面に曝露したＣＤ３２ａに結合するＤＡＲＰｉｎクローンの同定。ＤＡＲＰｉｎ大腸菌粗抽出物は、Ｎ３Ｃ ＤＡＲＰｉｎについては安定発現ＣＤ３２ Ｓｕｐ Ｔ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＣＤ３２ａ）またはＣＤ３２ｂ Ｓｕｐ Ｔ１細胞（ＳｕｐＴ１－ＣＤ３２ｂ）への結合について、Ｎ２Ｃ ＤＡＲＰｉｎについては安定発現ＣＤ３２ ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＣＤ３２ａまたはＣＨＯ－ＣＤ３２ｂ）への結合について、フローサイトメトリーにより解析した。細胞表面でＣＤ３２ｂおよびＣＤ３２ａを認識する２種のＤＡＲＰｉｎは５３．Ｆ１と５３．２．Ｄ８である。Ａ：ＣＤ３２ａ発現細胞株、Ｂ：ＣＤ３２ｂ発現細胞株。
【図2】同定されたＮ３Ｃ ＤＡＲＰｉｎの配列解析。Ｎキャップ、リピートエレメント、Ｃキャップを網羅するＤＡＲＰｉｎライブラリーの配列ロゴ。作製したＮ３Ｃ ＤＡＲＰｉｎライブラリーのフレームワーク（灰色）と多様な位置（黒）を確認するため、出力レパートリーをプラスミドｐＱＥ－ＨｉｓＨＡにクローニングし、大腸菌ＸＬ－１ Ｂｌｕｅに形質転換した。ＶＶ－Ｎ３Ｃライブラリー由来の３３クローンのうち、２６配列がユニークなＤＡＲＰｉｎをコードしており、ＷｅｂＬｏｇｏ ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｔｈｒｅｅｐｌｕｓｏｎｅ．ｃｏｍ／ｃｒｅａｔｅ．ｃｇｉ）を使用して配列ロゴを作成した。ＶＶ－Ｎ２Ｃライブラリー由来のＤＡＲＰｉｎ５２．Ｈ６はこの解析には含まれていない。
【図3】精製ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎによるＣＤ３２ａ陽性細胞集団の特異的標識。精製ＤＡＲＰｉｎは、安定発現ＣＤ３２ａ ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＣＤ３２ａ）、ＣＤ３２ｂ ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＣＤ３２ｂ）または野生型ＣＨＯへの結合をフローサイトメトリーにより解析した。
【図4】ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、およびＣＤ３２ｃアイソタイプの細胞外ドメインのタンパク質配列アラインメント。ヒトＣＤ３２ａの細胞外ドメイン（配列番号８７のアミノ酸３４から２１７）、１６７位のヒスチジンがアルギニンに変異しており、全長ＣＤ３２ａを参照すると「ＣＤ３２ａ Ｈ１６７Ｒ」とも呼ばれ、または成熟ＣＤ３２ａを参照すると「ｍＣＤ３２ａ Ｈ１３４Ｒ」とも呼ばれる）、ヒトＣＤ３２ｂの細胞外ドメイン（配列番号８８のアミノ酸４３から２１７）およびヒトＣＤ３２ｃの細胞外ドメイン（配列番号８９のアミノ酸４３から２２３）のアラインメントである。アミノ酸配列の違いは灰色で強調されている。下線を引いた１３４位のヒスチジン（全長配列ＣＤ３２ａのアミノ酸１６７に相当）は、リボソームディスプレイ手順ではＨ１６７Ｒ変異を保有する組み換えＣＤ３２ａタンパク質を使用し、細胞結合アッセイでは野生型Ｈ１６７ ＣＤ３２ａタンパク質を過剰発現する細胞を使用したので、特異的結合には関係ないと考えられる。
【図5】キメラＳｕｐＴ１－ＣＤ３２ｂ細胞株へのＤＡＲＰｉｎの結合。精製ＤＡＲＰｉｎは、キメラＣＤ３２ｂタンパク質、およびＣＨＯ細胞上で安定発現させた野生型ＣＤ３２ｂまたはＣＤ３２ａタンパク質との結合について、二次抗体コントロール染色と比較してフローサイトメトリーで解析された。ＣＤ３２ｂの細胞外ドメインにおける変異とその位置の概要は表２に見出すことができる。
【図6】ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎを提示したＬＶによるＣＤ３２ａ特異的遺伝子導入。２９３Ｔ細胞の細胞表面に一過性に発現したＮｉＶ－Ｇタンパク質に融合した選択されたＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎと組み換えＣＤ３２タンパク質の結合。
【図7】ニパウイルス偽型レンチウイルスベクターの概略構成（改変、出典：Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ，２０１８）。
【図8】ＣＤ３２ａ特異的ＤＡＲＰｉｎによる形質導入。濃縮しない小規模アプローチで生産されたＬＶベクター粒子による形質導入を介するＣＤ３２ａ特異的ＤＡＲＰｉｎの同定。
【図9】ニパ偽型ＣＤ３２ａによる形質導入。ＦＣＳとパネキシン（Ｐａｎｅｘｉｎ）を細胞培養補助剤として比較しながら大量生産で生産された５３．２．Ｆ１１－レンチウイルスベクター。
【図10】ヒトＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂに対する精製ＤＡＲＰｉｎ ５３．２．Ｆ１１［ＴＥＶ］の親和性決定。固定化した組み換えヒトＣＤ３２ａ標的タンパク質［Ａ］または組み換えヒトオフターゲットＣＤ３２ｂタンパク質［Ｂ］に濃度を変えて結合したＤＡＲＰｉｎのセンサーグラム。注入時のバッファーの不均等によって生じたピークは手動で除去した。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、多様であり、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0022】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ： （ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”， Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｈ．Ｇ．Ｗ， Ｎａｇｅｌ， Ｂ． ａｎｄ Ｋｌｂｌ， Ｈ． ｅｄｓ． （１９９５）， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されているように定義され、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ， Ｐａｔｅｎｔｓ， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” ｂｙ Ａｘｅｌ Ｋｌｅｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｊｕｒｇｅｎ Ｅｎｇｅｌ， Ｔｈｉｅｍｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， １９９９； “Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｄｒｕｇｓ， ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ”、ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｕｓａｎ Ｂｕｄａｖａｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９６，ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ－２５／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ－２０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍｄ．， ２００１に記載されているように定義される。
【0023】
本発明の実施では、特に断らない限り、化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組み換えＤＮＡ技術の従来法を使用するが、これらは当該分野の文献で説明されている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９）。
【0024】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の定めがない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を包含することを意味するが、他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を排除することを意味しないと理解される。以下の文章において、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。このように定義された各態様は、明確に反対の指示がない限り、他の態様と組み合わせることができる。特に、場合による、好ましい、または有利であると示された任意の特徴は、場合による、好ましい、または有利であると示された任意の他の特徴と組み合わせてもよい。
【0025】
これ以下において、本発明の要素について説明する。これらの要素は、特定の実施形態とともに列挙されている；しかし、追加の実施形態を作成するために、任意の方法および任意の数で組み合わせることができることを理解されたい。様々に記載された実施例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するように解釈されるべきではない。この明細書は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願における全ての記載された要素の任意の順列および組み合わせは、文脈がそうでないことを示さない限り、本出願の記載によって開示されたとみなされるべきである。
【0026】
定義
以下では、本明細書で頻繁に使用される用語の定義を提示する。これらの用語は、その使用の各例において、本明細書の残りの部分では、それぞれ定義された意味および好ましい意味を有する。
以下では、本明細書で頻繁に使用される用語の定義を提示する。これらの用語は、その使用の各例において、本明細書の残りの部分では、それぞれ定義された意味および好ましい意味を有する。
【0027】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明確に指示する場合を除き、複数の参照語を含む。本明細書における値の範囲の記載は、単に、範囲内に入る各個別の値を個別に参照するための省略法として機能することを意図している。本明細書において別段の指示がない限り、各個別の値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提示されるあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をより良く説明することを意図しており、特許請求の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる文言も、本開示の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【0028】
「約」という用語は、およそまたはほぼを意味し、一実施形態において本明細書に規定される数値または範囲の文脈では、記載または特許請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％、または±３％を意味する。
【0029】
明示的に別段の指定がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」によって導入されるリストのメンバーに加えて、場合により、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために使用される。しかしながら、本開示の具体的な実施形態として、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含する、すなわち、本実施形態の目的のために、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の意味を有すると理解されるべきであることが期待される。
【0030】
「タンパク質」という用語は、本発明の文脈において、ポリペプチドを指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、そのポリペプチド鎖内および／またはポリペプチド鎖間で二次構造、三次構造または四次構造を形成することによって、規定された三次元配置を有するか、または獲得することができる。タンパク質が２個またはそれ以上のポリペプチドから構成される場合、個々のポリペプチド鎖は非共有結合または共有結合、例えば２個のポリペプチド間のジスルフィド結合によって連結される。個々に二次構造または三次構造を形成することによって明確な三次元配置を有するか、または獲得することができる部分またはタンパク質は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。このようなタンパク質ドメインは、当業者によく知られている。
【0031】
アミノ酸は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を形成する構成単位である。以下に、アミノ酸に使用される略語と一文字コードを示す。
【0032】
【表1】
【0033】
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合を介して互いに連結された、約２個またはそれ以上、約３個またはそれ以上、約４個またはそれ以上、約６個またはそれ以上、約８個またはそれ以上、約１０個またはそれ以上、約１３個またはそれ以上、約１６個またはそれ以上、約２０個またはそれ以上、および最大約５０個、約１００個または約１５０個の連続したアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
【0034】
本発明の文脈において、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して連結された複数の、すなわち２個またはそれ以上のアミノ酸の１個またはそれ以上の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結された８個超のアミノ酸からなる。
【0035】
本発明の目的のために、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび／またはアミノ酸置換バリアントを含む。「バリアント」という用語は、全てのスプライスバリアント、翻訳後修飾バリアント、コンフォメーション、アイソフォームおよび種のホモログ、特に細胞によって天然に発現されるものを含む。「バリアント」という用語は、特にアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【0036】
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列における単一または２個またはそれ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１個またはそれ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、得られる産物を適切にスクリーニングするランダム挿入も可能である。アミノ酸付加バリアントは、１個またはそれ以上のアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個、３０個、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端の融合を含む。アミノ酸欠失バリアントは、配列から１個またはそれ以上のアミノ酸を除去することによって特徴付けられ、例えば、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個、３０個、５０個またはそれ以上のアミノ酸を除去することによって特徴付けられる。欠失はタンパク質のどの位置にあってもよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端での欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端および／またはＣ末端切断バリアントとも呼ばれる。アミノ酸置換バリアントは、配列中の少なくとも１個の残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されることを特徴とする。修飾は、相同タンパク質またはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にあること、および／またはアミノ酸を類似の特性を有する他のアミノ酸と置き換えることが優先される。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質のバリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖が関連するアミノ酸ファミリーの１個の置換を含む。
【0037】
天然に存在するアミノ酸は、一般的に酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として共同で分類されることもある。一実施形態において、保存的アミノ酸置換は、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【0038】
本発明の文脈で使用される「配列類似性」という用語は、同一であるか、または保存的アミノ酸交換を表すアミノ酸の割合を示す。２個のアミノ酸配列間の「配列同一性」という用語は、２個の所与の配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。「パーセント同一性」という用語は、最良のアラインメントの後に得られる、比較される２個の配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを示すことを意図しており、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、２個の配列間の差異はランダムに、その全長にわたって分布している。２個のアミノ酸配列間の配列比較は、従来、最適にアラインメントした後に、これらの配列を比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、セグメントごとまたは「比較の窓」ごとに実施される。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、技術的に既知のツールを使用して、好ましくは最良の配列アラインメントを使用して、例えばＣＬＣ ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ ｂｉｏ）またはＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用して行われる。同一性のパーセンテージは、最も類似性の高い配列または配列ストレッチだけでなく、比較に使用される全長配列を参照して決定される。したがって、比較に使用した１００アミノ酸長の配列のうち、連続する５０個のアミノ酸と１００％の配列同一性を持つアミノ酸は、（連続する５０個のアミノ酸の外側に同一性を持つアミノ酸が存在しないという仮定において）５０％の配列同一性しか有さない。
【0039】
相同アミノ酸配列は、本開示に従って、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示す。
【0040】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との間の類似性の程度、好ましくは同一性の程度は、本発明の結合タンパク質の文脈において、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であろう。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続アミノ酸について与えられる。好ましい実施形態において、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の完全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、技術的に公知のツールを使用して行うことができ、好ましくは、最良の配列アラインメントを使用して、例えば、Ａｌｉｇｎを使用して、標準設定、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５により行うことができる。
【0041】
本明細書に記載のアミノ酸配列バリアントは、例えば、組み換えＤＮＡ操作によって、当業者によって容易に調製できる。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載されるペプチドおよびアミノ酸バリアントは、例えば、固相合成および類似の方法などの公知のペプチド合成技術の助けを借りて容易に調製できる。
【0042】
一実施形態において、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）のフラグメントまたはバリアントは、好ましくは「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」である。本発明の文脈において使用されるアミノ酸配列の「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」という用語は、それが由来するアミノ酸配列と同一または類似の１個またはそれ以上の機能的特性を示す、すなわち機能的に同等である任意のフラグメントまたはバリアントに関する。「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、特に、親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１個またはそれ以上のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列を含み、親分子または配列の１個またはそれ以上の機能、例えば標的分子への結合を依然として果たすことができるバリアント分子または配列を指す。一実施形態において、親分子または配列のアミノ酸配列の改変は、分子または配列の結合特性に有意な影響を及ぼさないか、または変化させない。異なる実施形態において、機能性フラグメントまたは機能性バリアントの結合は減少しても有意に存在し、例えば、機能性バリアントの結合は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であってもよい。しかしながら、他の実施形態において、機能性フラグメントまたは機能性バリアントの結合は、親分子または配列と比較して増強されることがある。
【0043】
指定されたアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）とは、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはそのフラグメントと同一、本質的に同一または相同なアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはそのフラグメントのバリアントであってもよい。例えば、本明細書での使用に好適な抗原は、ネイティブ配列の望ましい活性を保持しつつ、それらが由来する天然に存在する配列またはネイティブ配列とは配列が異なるように改変することができることが、当業者には理解されよう。
【0044】
組み換えタンパク質、組み換えタンパク質ドメイン、組み換え結合タンパク質などで使用される「組み換え」という用語は、前記ポリペプチドが、関連技術の当業者に周知の組み換えＤＮＡ技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子（例えば、遺伝子合成によって産生される）は、細菌発現プラスミド（例えば、ｐＱＥ３０、Ｑｉａｇｅｎ社製）、酵母発現プラスミドまたは哺乳動物発現プラスミドにクローニングできる。例えば、このような構築された組み換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌）に挿入すると、この細菌はこの組み換えＤＮＡによってコードされるポリペプチドを産生することができる。このようにして産生されたポリペプチドを組み換えポリペプチドと呼ぶ。したがって、本発明の文脈における「組み換え」という用語は、「遺伝子工学によって作られた」という意味である。好ましくは、本発明の文脈における組み換え細胞のような「組み換え体」は、天然には存在しない。
【0045】
本明細書で使用する「天然に存在する」という用語は、分子が自然界に存在する事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室でヒトにより意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在するものである。
【0046】
「結合タンパク質」という用語は、本発明の文脈において、１個またはそれ以上の結合ドメインを含むタンパク質を指す。さらに、このような結合タンパク質は、結合ドメインではない付加的なタンパク質ドメイン、多量体化部位、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカーおよび／または非タンパク質性ポリマー分子を含んでいてもよい。多量体化部位の例は、機能的免疫グロブリンＦｃドメインを提供するために対になる免疫グロブリン重鎖定常領域、およびロイシンジッパー、または２個のこのようなポリペプチド間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含むポリペプチドである。非タンパク質性ポリマー分子の例は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。単一のＣｙｓ残基は、例えば、当業者に周知のマレイミド化学を使用することによって、ポリペプチドに他の部位を結合させるために使用される。好ましくは、前記結合タンパク質は組み換え結合タンパク質である。
【0047】
「リピートタンパク質」という用語は、１個またはそれ以上のリピートドメインを含むタンパク質／（ポリ）ペプチドを指す。好ましくは、前記リピートタンパク質の各々は、最大４個のリピートドメインを含む。より好ましくは、前記リピートタンパク質の各々は、最大２個のリピートドメインを含む。最も好ましくは、リピートタンパク質の各々は、１個のリピートドメインのみを含む。さらに、前記リピートタンパク質は、追加の非リピートタンパク質ドメイン、（ポリ）ペプチドタグ、（ポリ）ペプチドリンカー、リピートタンパク質の検出を可能にし得る酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、または標的化のために使用できる部分（例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメント）および／またはエフェクター分子を含んでいてもよい。
【0048】
「（ポリ）ペプチドタグ」または「タンパク質タグ」という用語は、本発明の文脈において、（ポリ）ペプチド／タンパク質に結合したアミノ酸配列を互換的に指し、ここで、前記アミノ酸配列は、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の精製、検出、もしくは標的化に有用であるか、または前記アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善するか、または前記アミノ酸配列は、エフェクター機能を有する。結合タンパク質の個々の（ポリ）ペプチドタグ、部分および／またはドメインは、互いに直接またはポリペプチドリンカーを介して連結される。これらのポリペプチドタグは全て当技術分野で周知であり、当業者に十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小さなポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓ、ＨＡ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、またはＳｔｒｅｐ－タグ、ＧＦＰ、または前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の検出を可能にする、酵素のような部分（例えば、アルカリホスファターゼのような酵素）、または標的化におよび／もしくはエフェクター分子として使用できる部分（例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメント）である。酵素はまた、ＴＥＶプロテアーゼのようなプロテアーゼであってもよく、酵素は、例えば第Ｘ因子であってもよい。（ポリ）ペプチドまたはタンパク質は、当技術分野で主に知られている蛍光タグや放射性標識タグのようなタグを提示してもよい。
【0049】
「ポリペプチドリンカー」という用語は、本発明の文脈において、例えば、２個のタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインとポリエチレングリコールなどの非ポリペプチド部分、または２個の配列タグを連結することができるアミノ酸配列を指す。このような追加のドメイン、タグ、非ポリペプチド部分およびリンカーは、関連技術の当業者に公知である。そのようなリンカーの特定の例は、可変長のグリシンーセリンーリンカーおよびプロリンースレオニンーリンカーであり；好ましくは、前記リンカーは２～２４アミノ酸の長さを有し；より好ましくは、前記リンカーは２～１６アミノ酸の長さを有する。
【0050】
「リピートドメイン」という用語は、本発明の文脈において、構造ユニットとして２個またはそれ以上の連続するリピートユニット（モジュール）を含むタンパク質ドメインを指し、前記構造ユニットは、同じ折り畳みを有し、強固に積み重なって、例えば、共同疎水性コアを有する超らせん構造を形成する。好ましくは、リピートドメインは、Ｎ末端および／またはＣ末端のキャッピングユニット（またはモジュール）をさらに含む。さらに好ましくは、前記Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングユニット（またはモジュール）は、キャッピングリピートである。
【0051】
リピートタンパク質は、前記リピートモジュールのいずれか１個とは異なるアミノ酸配列を有するＮ末端および／またはＣ末端のキャッピングモジュールをさらに含んでもよい。「キャッピングモジュール」という用語は、リピートドメインのＮ末端またはＣ末端リピートモジュールに融合したポリペプチドを指し、前記キャッピングモジュールは、前記リピートモジュールと緊密な三次相互作用を形成し、それにより、連続するリピートモジュールと接触していない側で前記リピートモジュールの疎水性コアを溶媒から遮蔽するキャップを提供する。前記Ｎ末端および／またはＣ末端のキャッピングモジュールは、リピートユニットに隣接する天然に存在するリピートタンパク質に見出されるキャッピングユニットまたは他のドメインであってもよく、またはそれに由来してもよい。
【0052】
「キャッピングユニット」という用語は、本発明の文脈において、天然に存在するフォールディングされた（ポリ）ペプチドを指し、前記（ポリ）ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端がリピートユニットに融合した特定の構造ユニットを規定し、前記（ポリ）ペプチドは、前記リピートユニットと緊密な三次相互作用を形成し、それによって、前記リピートユニットの一方の疎水性コアを溶媒から遮蔽するキャップを提供する。好ましくは、キャッピングユニットはキャッピングリピートである。「キャッピングリピート」という用語は、前記隣接するリピートユニットと類似または同じフォールディングおよび／または前記隣接するリピートユニットとの配列類似性を有するキャッピングユニットを指す。
【0053】
「構造ユニット」という用語は、本発明の文脈において、ポリペプチド鎖に沿って互いに近接する二次構造の２個またはそれ以上のセグメント間の三次元的相互作用によって形成される、ポリペプチドの局所的に秩序化された部分を指す。このような構造ユニットは構造モチーフを示す。「構造モチーフ」という用語は、少なくとも１個の構造ユニットに存在する二次構造エレメントの三次元的配置を指す。構造モチーフは当業者によく知られている。構造ユニットは単独では定義された三次元配置を獲得することはできないが；例えばリピートドメインにおけるリピートモジュールとして連続的に配置されることにより、隣接するユニットが相互に安定化し、超らせん構造をもたらす。
【0054】
「設計されたリピートタンパク質」および「設計されたリピートドメイン」という用語は、本発明の文脈において、それぞれリピートタンパク質またはリピートドメインを互換的に指す。設計されたリピートタンパク質および設計されたリピートドメインは合成物であり、自然由来ではない。それらはそれぞれ、対応する設計された核酸の発現によって得られる人工タンパク質またはドメインである。好ましくは、発現は真核細胞または細菌細胞などの原核細胞で、または無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を使用して行われる。したがって、設計されたアンキリンリピートタンパク質（すなわちＤＡＲＰｉｎ）は、少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含む本発明の結合タンパク質に相当する。
【0055】
「リピートユニット」という用語は、本発明の文脈においては、設計されたリピートドメインのリピートアミノ酸配列を指し、これらは元来、天然に存在するリピートタンパク質のリピートユニット（モジュール）に由来する。各リピートドメインは、ファミリーまたはサブファミリーまたは天然に存在するリピートタンパク質、例えばファミリーまたはアルマジロリピートタンパク質またはアンキリンリピートタンパク質の１個またはそれ以上のリピートユニットに由来する。
【0056】
「リピートモジュール」という用語は、本発明の文脈において、１個またはそれ以上の天然に存在するリピートタンパク質のリピート配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、前記「リピートモジュール」（ユニット）は複数のコピーで見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全ての前記モチーフに共通する定義されたフォールディングトポロジーを示す。このようなリピートユニットは、フレームワーク残基と相互作用残基を含む。このようなリピートユニットの例は、アルマジロリピートユニット、ロイシンリッチリピートユニット、アンキリンリピートユニット、テトラトリコペプチドリピートユニット、ＨＥＡＴリピートユニット、ロイシンリッチバリアントリピートユニットである。このようなリピートユニットを２個またはそれ以上含む天然に存在するタンパク質は、「天然に存在するリピートタンパク質」と呼ばれる。リピートタンパク質の個々のリピートユニットのアミノ酸配列は、リピートユニットの一般的なパターン、すなわちモチーフを実質的に保持したまま、互いに比較した場合、かなりの数の変異、置換、付加、および／または欠失を有していてもよい。
【0057】
「リピートモジュールのセット」という用語は、本発明の文脈においては、リピートドメインに存在するリピートモジュールの総数を指す。リピートドメインに存在するそのような「リピートモジュールのセット」は、２個またはそれ以上の連続したリピートモジュールを含み、２個またはそれ以上のコピーに含まれる１個のタイプのリピートモジュールだけから構成され、または、それぞれが１個またはそれ以上のコピーに存在する２個またはそれ以上の異なるタイプのモジュールから構成される。このような、例えば３個のリピートモジュールを含むリピートモジュールのセットは、例えば図５に示すように、Ｎ末端からＣ末端まで連続して、リピートモジュール１、リピートモジュール２、リピートモジュール３を含んでよい。図５に示すようなリピートモジュール１は、好ましくはアミノ酸２９から６１を含む。図５に示すリピートモジュール２は、好ましくはアミノ酸６２から９４を含む。図５に示すようなリピートモジュール３は、好ましくはアミノ酸９５から１２７を含む。
【0058】
異なるリピートドメインは、リピートドメインあたりのリピートモジュールの数が同じであってもよいし、リピートドメインあたりのリピートモジュールの数が異なっていてもよい。
【0059】
好ましくは、セットで含まれるリピートモジュールは、相同リピートモジュールである。本発明の文脈において、「相同リピートモジュール」という用語は、前記リピートモジュールのフレームワーク残基の７０％超が相同であるリピートモジュールを指す。好ましくは、前記リピートモジュールのフレームワーク残基の８０％超が相同である。最も好ましくは、前記リピートモジュールのフレームワーク残基の９０％超が相同である。Ｆａｓｔａ、ＢｌａｓｔまたはＧａｐのようなポリペプチド間の相同性のパーセンテージを決定するコンピュータプログラムは、関連技術分野の当業者に知られている。
【0060】
リピートユニットは、対応するリピートユニットの全てのコピーに存在するアミノ酸残基を有する位置（「固定位置」）と、異なるアミノ酸残基または「ランダム化された」アミノ酸残基を有する位置（「ランダム化位置」）、すなわちフレームワーク残基および相互作用残基とを含んでよい。
【0061】
このようなリピートユニットの一例は、アンキリンリピートユニットである。このようなリピートユニットを２個またはそれ以上含む天然に存在するタンパク質は、「天然に存在するリピートタンパク質」と呼ばれる。リピートタンパク質の個々のリピートユニットのアミノ酸配列は、リピートユニットの一般的なパターン、またはモチーフを実質的に保持したまま、互いに比較した場合、かなりの数の変異、置換、付加、および／または欠失を有していてもよい。
【0062】
「アンキリンリピートユニット」という用語は、本発明の文脈において、アンキリンリピートであるリピートユニットを指す。アンキリンリピートは当業者によく知られている。
【0063】
「ＤＡＲＰｉｎ」という用語は、本発明の文脈においては、遺伝子工学的に設計された抗体模倣タンパク質である設計されたアンキリンリピートタンパク質を指し、高度に特異的で高親和性の標的タンパク質結合を示す。ＤＡＲＰｉｎは当技術分野でよく知られており、Ｂｉｎｚ ＨＫ， ｅｔ ａｌ．（２００３）ＪＭＢ．３３２ （２）：４８９－５０３ に最初に記載されており、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ （２０１５）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５５ （１）：４８９－５１１ で総説されている。ＤＡＲＰｉｎは、天然に存在するアンキリンリピートタンパク質に基づいているが、例えば、所与の標的分子に対する結合親和性、細胞表面発現などに影響を与えることができる１個またはそれ以上のアミノ酸変異を含んでいる。通常、ＤＡＲＰｉｎは４～５個のリピートを含み、そのうち最初のリピート（Ｎ－キャッピングリピート）と最後のリピート（Ｃ－キャッピングリピート）は疎水性タンパク質コアを水性環境から遮蔽する役割を果たす。ＤＡＲＰｉｎは天然のアンキリンリピートタンパク質ドメインの平均サイズに相当する。リピート数が３個未満のタンパク質（すなわち、キャッピングリピートと１個の内部リピート）は、十分安定した三次構造を形成しない。ＤＡＲＰｉｎの分子量は、以下のチャートに示すように、リピートの総数に依存する：本発明のＤＡＲＰｉｎは、好ましくは２～６個、より好ましくは３～５個のアンキリンリピートユニットを含み、Ｎ－およびＣ－キャップリピートで挟まれている。各アンキリンリピートユニットは約３３アミノ酸残基を含む。
【0064】
「リピート配列モチーフ」または「リピートコンセンサス配列」という用語は、本発明の文脈においては、１個またはそれ以上のリピートユニットから推定されるアミノ酸配列を指す。このようなリピート配列モチーフは、フレームワーク残基位置と標的相互作用残基位置とを含む。前記フレームワーク残基位置は、前記リピートユニットのフレームワーク残基の位置に対応する。前記標的相互作用残基位置は、前記リピートユニットの標的相互作用残基の位置に対応する。このようなリピート配列モチーフは、固定位置とランダム化位置とを含む。「固定位置」という用語は、リピート配列モチーフにおけるアミノ酸位置を指し、前記位置は特定のアミノ酸に設定される。しばしば、このような固定位置はフレームワーク残基の位置に対応する。
【0065】
「ランダム化された位置」という用語は、本発明の文脈において、リピート配列モチーフ中のアミノ酸位置を指し、２個またはそれ以上のアミノ酸が前記アミノ酸位置で許容される。しばしば、このようなランダム化位置は、標的相互作用残基の位置に対応する。しかしながら、フレームワーク残基のいくつかの位置もまたランダム化される。
【0066】
「フレームワーク残基」という用語は、本発明の文脈において、リピートユニットのアミノ酸残基、またはリピートモジュールの対応するアミノ酸残基を指し、フォールディングトポロジーに寄与する、すなわち、前記リピートユニット（またはモジュール）のフォールディングに寄与する、または隣接するユニット（またはモジュール）との相互作用に寄与する。このような寄与は、リピートユニット（またはモジュール）内の他の残基との相互作用、またはα－ヘリックスやβ－シートに見られるようなポリペプチドのバックボーンコンフォメーションへの影響、または直鎖ポリペプチドまたはループを形成するアミノ酸ストレッチである可能性がある。
【0067】
「標的相互作用残基」という用語は、本発明の文脈においては、標的物質との相互作用に寄与するリピートユニットのアミノ酸残基、またはリピートモジュールの対応するアミノ酸残基を指す。このような寄与は、標的物質との直接的な相互作用、または他の直接相互作用残基への影響であり、例えば、直接相互作用残基と前記標的との相互作用を許容または増強するために、リピートユニット（またはモジュール）のポリペプチドのコンフォメーションを安定化させることによるかもしれない。このようなフレームワークおよび標的相互作用残基は、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲおよび／またはＣＤ分光法などの物理化学的方法によって得られた構造データの解析によって、あるいは構造生物学および／またはバイオインフォマティクスの実務者によく知られている既知の関連構造情報との比較によって同定することができる。
【0068】
「フォールディングトポロジー」という用語は、本発明の文脈においては、前記リピートユニットまたはリピートモジュールの三次構造を指す。フォールディングトポロジーは、α－ヘリックスもしくはβ－シートの少なくとも一部を形成するアミノ酸のストレッチ、または直鎖ポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸のストレッチ、またはα－ヘリックス、β－シートおよび／もしくは直鎖ポリペプチド／ループの任意の組み合わせによって決定される。
【0069】
「連続した」という用語は、本発明の文脈においては、リピートユニットまたはリピートモジュールがタンデムに配置されている配置を指す。設計されたリピートタンパク質においては、少なくとも２個、通常は約２～６個、特に少なくとも約６個、頻繁には２０個またはそれ以上のリピートユニットが存在する。ほとんどの場合、リピートドメインのリピートユニットは高度の配列同一性（対応する位置に同じアミノ酸残基）または配列類似性（アミノ酸残基は異なるが、類似の物理化学的特性を有する）を示し、アミノ酸残基のいくつかは強く保存されている重要な残基であるかもしれない。しかし、リピートユニットの共通のフォールディングトポロジーが維持されている限り、リピートドメインの異なるリピートユニット間のアミノ酸の挿入および／または欠失、および／または置換による高度の配列可変性は、可能であろう。
【0070】
ほとんどの場合、前記リピートユニットは、高度の配列同一性（対応する位置に同じアミノ酸残基）または配列類似性（アミノ酸残基は異なるが、類似の物理化学的特性を有する）を示し、アミノ酸残基の一部は、天然に存在するタンパク質に見られる異なるリピートユニットに強く保存されている重要な残基であるかもしれない。
【0071】
しかし、共通のフォールディングトポロジーが維持される限り、天然に存在するタンパク質に見られる異なるリピートユニット間のアミノ酸の挿入および／または欠失、および／または置換による、高度な配列可変性は可能であろう。
【0072】
「標的に特異的に結合する」、「標的特異性」、「標的に対する結合特異性を有する」、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、交換可能であり、本発明の文脈において、結合タンパク質または結合ドメインがヒトＣＤ３２ａの細胞外ドメイン（配列番号８７（場合により天然ＣＤ３２ａ変異体Ｑ６３Ｒ、Ｍ１４０Ｖ、Ｈ１６７ＲおよびＩ２１８Ｖの細胞外ドメイン、位置は、配列番号８７に従う全長配列を参照して示されている）のアミノ酸３４から２１７）に対して、無関係なタンパク質よりも低い解離定数で結合し、好ましくは、本発明の結合タンパク質または結合ドメインは、ヒトＣＤ３２ａの細胞外ドメイン（配列番号８７（場合により、天然ＣＤ３２ａバリアントＱ６３Ｒ、Ｍ１４０Ｖ、Ｈ１６７ＲおよびＩ２１８Ｖの細胞外ドメイン）のアミノ酸３４から２１７）には、ヒトＣＤ３２ｂの細胞外ドメイン（配列番号８８のアミノ酸４３から２１７）またはヒトＣＤ３２ｃの細胞外ドメイン（配列番号８９のアミノ酸４３から２２３）よりも低い解離定数で結合する。より低い解離定数は、少なくとも１０倍低く、好ましくは１０２倍低く、より好ましくは１０３倍低く、より好ましくは１０４倍低く、さらに好ましくは１０５倍低くてもよい。最も好ましい実施形態において、ヒトＣＤ３２ａの細胞外ドメイン（配列番号８７（場合により、天然バリアントＱ６３Ｒ、Ｍ１４０Ｖ、Ｈ１６７ＲおよびＩ２１８Ｖ）のアミノ酸３４から２１７）に対する解離定数は、少なくとも１０６、より好ましくは１０７、さらに好ましくは１０８、または最も好ましくは１０９倍、ヒトＣＤ３２ｂの細胞外ドメイン（配列番号８８のアミノ酸４３から２１７）に対するような無関係なタンパク質に対する対応する解離定数よりも低く、ヒトＣＤ３２ｃの細胞外ドメイン（配列番号８９のアミノ酸４３から２２３）よりも低い解離定数を有する。
【0073】
「標的」という用語は、核酸分子、ポリペプチドまたはタンパク質、炭水化物、または他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部分、またはそのような分子の２個またはそれ以上の複合体を含む。標的は全細胞または組織サンプルであってもよいし、非天然の分子または部分であってもよい。好ましくは、標的は天然存在するもしくは非天然に存在するポリペプチド、または化学修飾、例えば天然もしくは非天然のリン酸化、アセチル化、もしくはメチル化によって修飾されたポリペプチドである。特に本発明では、標的はＣＤ３２ａである。
【0074】
「ＣＤ３２ａ」という用語は、ＦＣＧＲ２Ａとしても知られるタンパク質を指す。ＣＤ３２ａは免疫グロブリンガンマのＦｃ領域に結合する低親和性受容体ＩＩ－ａである。ヒトＣＤ３２ａの細胞外ドメインは、関連タンパク質ＣＤ３２ｂおよびＣＤ３２ｃの細胞外ドメインと非常に相同性が高い。ヒトＣＤ３２ａ（配列番号８７のアミノ酸３４から２１７）の細胞外ドメイン、１６７位のヒスチジンがアルギニンに変異しており、全長ＣＤ３２ａを参照して「ＣＤ３２ａ Ｈ１６７Ｒ」とも呼ばれ、成熟ＣＤ３２ａを参照して「ｍＣＤ３２ａ Ｈ１３４Ｒ」とも呼ばれる）、ヒトＣＤ３２ｂの細胞外ドメイン（配列番号８８のアミノ酸４３から２１７）、およびヒトＣＤ３２ｃの細胞外ドメイン（配列番号８９のアミノ酸４３から２２３）のアラインメントを図４に示す。
【0075】
本発明の文脈で使用される「コンセンサス配列」という用語は、２個またはそれ以上の配列間の配列アラインメントにおいて各位置に見られる、ヌクレオチドまたはアミノ酸のいずれかの最も頻度の高い残基の計算された順序を指す。これは、関連配列が互いに比較され、類似配列モチーフが計算される多重配列アラインメントの結果を表す。保存配列モチーフはコンセンサス配列として描かれ、同一アミノ酸、すなわち比較された配列間で同一のアミノ酸、保存アミノ酸、すなわち比較されたアミノ酸配列間で異なるが、全てのアミノ酸が特定の機能的または構造的アミノ酸群、例えば極性または中性に属するアミノ酸、および可変アミノ酸、すなわち比較された配列間で明らかな関連性を示さないアミノ酸を示す。表１は、Ｎ－およびＣ－キャッピングユニットを含むリピートユニットの配列のアラインメントを示す。アラインメントは手作業で作成されたか、あるいはデフォルトの設定を使用したＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａであるアルゴリズムを使用して言及したアラインメントを作成した。いくつかの実施形態において置換することができる７つのアミノ酸の位置は、強調表示されている。
【0076】
本発明の結合タンパク質または結合ドメインなどの薬物の「終末血漿半減期」という用語は、擬平衡に達した後、哺乳動物に適用した薬物の血漿中濃度が半分に達するのに必要な時間を指す。この半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排除するのに必要な時間とは定義されない。
【0077】
「生物活性化合物」という用語は、疾患を有する哺乳動物に適用された場合に、前記疾患を修飾する化合物を指す。生物活性化合物は、拮抗性または作動性の特性を有し、タンパク質性生物活性化合物または非タンパク質性生物活性化合物であってよい。
【0078】
「結合を競合する」という用語は、本発明の２個の異なる結合ドメインが同じ標的に同時に結合することができない一方で、両者は同じ標的に個別に結合することができることを意味する。したがって、このような２個の結合ドメインは、前記標的への結合のために競合する。好ましくは、前記２個の競合する結合ドメインは、前記標的上の重複するまたは同じ結合エピトープに結合する。２個の結合ドメインが標的への結合のために競合するかどうかを決定するための、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または競合ＳＰＲ測定（例えば、ＢｉｏＲａｄ社からのＰｒｏｔｅｏｎ装置を使用することによる）のような方法は、当業者に周知である。
【0079】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組み換え産生分子、化学合成分子などのＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。ＲＮＡには、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡが含まれる。本発明によれば、ポリヌクレオチドは好ましくは単離される。核酸はベクターに含まれていてもよい。
【0080】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本発明の文脈においては、互換的に使用され、本発明の核酸の集合体または本発明の核酸の集合体の一部である１個の核酸を細胞、好ましくは哺乳動物細胞に導入することができる、または導入するポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドとタンパク質の混合物を指す。ベクターの例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージのようなファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、アデノウイルスまたはバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、またはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。前記ベクターは、クローニングベクターだけでなく、発現ベクターも含む。特に、ベクターは、本発明のプロモーターおよび核酸の集合体または核酸の集合体の一部である１個の核酸を適当な宿主細胞に輸送するために使用される。発現ベクターは、宿主細胞内での発現ベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含むことができる。宿主細胞内に入ると、発現ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは無関係に、または宿主染色体ＤＮＡと同時に複製され、ベクターおよびその挿入ＤＮＡの複数のコピーを生成することができる。複製不能な発現ベクターが使用される場合（安全上の理由からしばしばそうなる）、ベクターは複製せず、単に核酸を直接発現させるだけかもしれない。発現ベクターのタイプによっては、発現ベクターは細胞から消失する、すなわち核酸によってコードされた新抗原を一過的に発現するだけであったり、細胞内で安定であったりすることができる。発現ベクターは通常、発現カセット、すなわち核酸のｍＲＮＡ分子への転写を可能にする必要なエレメントを含んでいる。
【0081】
「ウイルスベクター」という用語は、本発明の文脈において、感染性ウイルス粒子に組み立てできる一本鎖または二本鎖の核酸配列を指すために使用される。この核酸配列は、完全なウイルスゲノムであっても部分的なウイルスゲノムであってもよい。後者の場合、ウイルスゲノムは好ましくは１個またはそれ以上の異種遺伝子を含む。一部のウイルス粒子では、感染性ウイルス粒子の組み立てを可能にするために、ウイルスゲノムの非常に短い配列のみが必要である。例えば、感染性アデノ随伴ウイルス粒子の組み立てには、所与の長さの異種核酸の５’および３’に配置された短い（約２００ｂｐの長さの）リピート配列（通常、アデノ随伴ウイルスでは４．５．から５．３ｋＢ）だけが、感染性アデノ随伴ウイルス粒子の組み立てを可能にする。所与のウイルスを組み立てるための最小核酸配列はよく知られている。ウイルスゲノムが大きければ大きいほど、および感染性ウイルス粒子を組み立てるための最小ウイルス配列が小さければ小さいほど、ウイルスベクターに挿入できる異種遺伝子は大きくなる。
【0082】
本明細書で使用する「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスの中でもユニークである。宿主細胞のＤＩＭＡにかなりの量の遺伝情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶは全てレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏでかなりのレベルの遺伝子導入を達成する手段を提供する。
【0083】
本明細書で使用する「アデノウイルス随伴ウイルスベクター」とは、パルボウイルス科に属するデペンドパルボウイルス属を指す。このウイルスベクターは遺伝子治療に使用することができ、分裂している細胞および静止している細胞の両方に感染し、宿主細胞のゲノムに統合することなく染色体外の状態で持続することができる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は非エンベロープ型ウイルスで、標的細胞にＤＮＡを送達するように操作することができる。ウイルス遺伝子を欠き、様々な治療応用に関心のあるＤＮＡ配列を含むＡＡＶ組み換え粒子を作製することができ、遺伝子治療のための最も安全な戦略の一つとなっている。
【0084】
「コードする」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する固有の特性、およびそこから生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表で提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方を、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの産物をコードすると呼ぶことができる。
【0085】
本開示によれば、「ＲＮＡがコードする」という用語は、標的組織の細胞内などの適切な環境にＲＮＡが存在する場合、翻訳の過程で、それがコードするペプチドまたはタンパク質を産生するためにアミノ酸の組み立てを指示できることを意味する。一実施形態において、ＲＮＡは細胞の翻訳機構と相互作用することができ、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能にする。細胞は、コードされたペプチドまたはタンパク質を細胞内（例えば、細胞質内および／または核内）で産生することもできるし、コードされたペプチドまたはタンパク質を分泌することもできるし、表面で産生することもできる。
【0086】
本明細書で使用される「内因性」とは、生物、細胞、組織、または系由来の、あるいはその内部で産生される任意の物質を指す。
【0087】
本明細書において、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の外から導入された、または外部で産生された任意の物質を指す。
【0088】
本明細書で使用する「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。発現は一過性であっても安定であってもよい。本発明によれば、発現という用語には「異常な発現」または「異常発現」も含まれる。
【0089】
本発明によれば、遺伝子発現レベルが「変化した」とみなされるのは、遺伝子発現が対照レベルと比較して１０％、２５％、５０％以上増加または減少した場合である。あるいは、対照レベルと比較して、遺伝子発現が少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍以上増加または減少している場合、発現レベルは「増加」または「減少」とみなされる。
【0090】
本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照サンプルにおいて検出されたタンパク質発現レベルを指し、「正常対照レベル」と「疾患対照レベル」の両方を含む。対照レベルは、単一の参照集団に由来する単一の発現パターンであっても、複数の発現パターンに由来するものであってもよい。例えば、対照レベルは、過去に検査された細胞からの発現パターンのデータベースとすることができる。「正常対照レベル」とは、正常で健康な個体、またはＣＤ３２ａの発現変化に関連する状態（ＨＩＶ関連疾患など）に罹患していないことが知られている個体の集団において検出される遺伝子発現レベルを指す。正常な個体とは、ＣＤ３２ａ発現の変化に関連する状態の臨床症状がない個体である。一方、「疾患対照レベル」とは、ＣＤ３２ａ発現の変化に関連する状態に罹患している集団に見られるＣＤ３２ａ関連遺伝子の発現プロファイルを指す。
【0091】
本明細書において、「連結した」、「融合した」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、２個またはそれ以上の要素または成分またはドメインが結合することを指す。
【0092】
本開示の文脈において、「粒子」という用語は、分子または分子複合体によって形成される構造化実体に関する。一実施形態において、「粒子」という用語は、媒体中に分散したマイクロサイズまたはナノサイズのコンパクト構造体などの、マイクロサイズまたはナノサイズの構造体に関する。一実施形態において、粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物を含む粒子などの核酸含有粒子である。
【0093】
ポリマーおよび脂質のような正に帯電した分子と、負に帯電した核酸とのの静電的相互作用が、粒子形成に関与している。この結果、核酸粒子の複合化と自発的形成が起こる。一実施形態において、核酸粒子はナノ粒子である。
【0094】
本開示で使用されるように、「ナノ粒子」とは、非経口投与に適した平均直径を有する粒子を指す。
【0095】
「核酸粒子」は、目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に核酸を送達するために使用することができる。核酸粒子は、ＤＯＴＡＰなどの少なくとも１種のカチオン性またはカチオン性イオン化可能な脂質または脂質様物質、プロタミンなどの少なくとも１種のカチオン性ポリマー、またはそれらの混合物と核酸から形成することができる。核酸粒子には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に基づく製剤およびリポプレックス（ＬＰＸ）に基づく製剤が含まれる。
【0096】
いかなる理論にも拘束されるつもりはないが、カチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質とカチオン性ポリマーが核酸と組み合わさって凝集体を形成し、この凝集によりコロイド的に安定な粒子が得られると考えられる。
【0097】
本明細書に記載の粒子は、カチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の少なくとも１種の脂質または脂質様物質、カチオン性ポリマー以外の少なくとも１種のポリマー、またはそれらの混合物をさらに含んでもよい。
【0098】
核酸粒子は１種類超の核酸分子を含んでいてもよく、核酸分子の分子パラメーターは、モル質量、または分子構造、キャッピング、コード領域または他の特徴などの基本的な構造エレメントに関してのように、互いに類似していても異なっていてもよい。
【0099】
本明細書に記載される核酸粒子は、一実施形態において、約３０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約７０ｎｍ～約６００ｎｍ、約９０ｎｍ～約４００ｎｍ、または約１００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の平均直径を有してよい。
【0100】
本明細書に記載される核酸粒子、例えば本明細書に記載されるプロセスによって作製される核酸粒子は、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、または約０．２未満またはそれ以下の多分散性指数を示す。一例として、核酸粒子は、約０．１～約０．３または約０．２～約０．３の範囲の多分散性指数を示すことができる。
【0101】
本明細書に記載の核酸粒子は、少なくとも１種のカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質および／または少なくとも１種のカチオン性ポリマーからコロイドを得ること、およびコロイドを核酸と混合して核酸粒子を得ることを含み得る広範な方法を使用して調製することができる。
【0102】
本明細書で使用する「コロイド」という用語は、分散粒子が沈殿しないタイプの均質な混合物に関する。混合物中の不溶性粒子は微細であり、粒径は１～１０００ナノメートルである。混合物はコロイドまたはコロイド懸濁液と呼ばれることがある。「コロイド」という用語は、懸濁液全体ではなく、混合物中の粒子のみを指すこともある。
【0103】
「平均直径」という用語は、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用したデータ解析により動的レーザー光散乱（ＤＬＳ）によって測定される粒子の平均流体力学的直径を指し、このアルゴリズムは、結果として、長さの寸法を有するいわゆるＺ平均、および無次元である多分散性指数（ＰＩ）を提供する（Ｋｏｐｐｅｌ， Ｄ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． ５７， １９７２， ｐｐ ４８１４－４８２０， ＩＳ０ １３３２１）。ここでは、粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ平均の値と同義に使用される。
【0104】
「多分散性指数」は、「平均直径」の定義で述べたように、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて計算することが好ましい。特定の前提条件の下で、これはナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度としてとらえることができる。
【0105】
様々なタイプの核酸含有粒子が、粒子状の核酸の送達に適していることが以前に記載されている（例えば、Ｋａｃｚｍａｒｅｋ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９， ６０）。非ウイルス核酸送達ビヒクルの場合、核酸のナノ粒子カプセル化は、核酸を分解から物理的に保護し、特定の化学的性質によっては、細胞への取り込みおよびエンドソームからの脱出を助けることができる。
【0106】
本開示は、核酸、少なくとも１個のカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質、および／または少なくとも１種のカチオン性ポリマーを含み、核酸と会合して核酸粒子を形成する粒子、ならびにそのような粒子を含む組成物を記載する。核酸粒子は、粒子に非共有結合的相互作用によって異なる形態で複合体化された核酸を含んでいてもよい。本明細書に記載の粒子は、ウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、それらは、ウイルス的には細胞に感染できない。
【0107】
好適なカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質およびカチオン性ポリマーは、核酸粒子を形成するものであり、「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語に含まれる。「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語は、核酸と会合して核酸粒子を形成するあらゆる成分に関する。このような成分は、核酸粒子の一部となり得るあらゆる成分を含む。
【0108】
カチオン性ポリマーは化学的柔軟性が高いため、ナノ粒子に基づく送達によく使われる材料である。通常、カチオン性ポリマーは、負に帯電した核酸を静電的にナノ粒子に凝縮させるために使用される。これらの正に荷電した基は、しばしばアミンからなり、ｐＨ５．５から７．５の範囲でプロトン化状態が変化し、エンドソームの破裂をもたらすイオン不均衡を引き起こすと考えられている。ポリ－Ｌ－リジン、ポリアミドアミン、プロタミン、ポリエチレンイミンなどのポリマーや、キトサンなどの天然に存在するポリマーは全て核酸送達に応用されており、本明細書ではカチオン性ポリマーとして適している。加えて、核酸送達に特化したポリマーを合成した研究者もいる。特にポリ（β－アミノエステル）は、その合成の容易さと生分解性により、核酸デリバリーに広く使用されている。このような合成ポリマーも、本明細書のカチオン性ポリマーとして適している。
【0109】
「遺伝子改変」という用語は、核酸による細胞のトランスフェクションを含む。「トランスフェクション」という用語は、核酸、特にＲＮＡを細胞に導入することに関する。本発明の目的上、「トランスフェクション」という用語は、細胞への核酸の導入、またはそのような細胞による核酸の取り込みも含み、ここで細胞は対象、例えば患者中に存在してもよい。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで存在することができ、例えば、細胞は患者の器官、組織および／または有機体の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定性であり得る。トランスフェクションの用途によっては、トランスフェクトされた遺伝物質が一過的に発現されるだけで十分である。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。トランスフェクションプロセスで導入された核酸は通常核ゲノムに組み込まれないので、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるか分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に減少させる。トランスフェクトされた核酸が細胞およびその娘細胞のゲノムに実際に残ることが望まれる場合、安定したトランスフェクションが起こらなければならない。このような安定したトランスフェクションは、トランスフェクションプロセスで導入された核酸が核ゲノムに組み込まれた場合に起こり得、例えば、トランスフェクションにウイルスに基づくシステムまたはトランスポゾンに基づくシステムを使用することによって達成できる。一般に、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞は、抗原受容体をコードする核酸で安定的にトランスフェクトされるが、一般に、抗原をコードする核酸は細胞に一過性にトランスフェクトされる。
【0110】
「医薬組成物」という用語は、治療上有効な薬剤を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤とともに含む製剤に関する。前記医薬組成物は、対象への前記医薬組成物の投与による疾患または障害の治療、予防、または重症度の軽減に有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても知られている。
【0111】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、好ましくは、医薬組成物の活性剤の作用と相互作用しない材料の非毒性を意味する。特に、「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されるか、または動物、より詳細にはヒトにおける使用のために、米国薬局方、欧州薬局方または他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。
【0112】
「担体」という用語は、天然または合成性の有機または無機成分を指し、その中に活性成分が、適用を容易にし、強化し、または可能にするために配合される。本発明によれば、「担体」という用語は、対象への投与に適した１種またはそれ以上の適合性のある固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質も含む。可能な担体物質（例えば、希釈剤）は、例えば、滅菌水、リンゲル液、乳酸化リンゲル液、生理的食塩水、静菌生理食塩水（例えば、０．９％のベンジルアルコールを含む生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンク溶液、固定油、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、および生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。一実施形態において、担体はＰＢＳである。得られた溶液または懸濁液は、好ましくはレシピエントの血液に対して等張である。適切な担体およびその処方については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８５， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記載されている。
【0113】
「細胞」という用語は、本発明の文脈において、真核細胞または原核細胞、例えば細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物の細胞、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、またはネコの細胞を指すために使用される。
【0114】
本発明の態様と好ましい実施形態
以下では、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。このように定義された各態様は、反対のことが明確に示されていない限り、任意の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された任意の他の特徴または複数の特徴と組み合わせることができる。
以下では、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。このように定義された各態様は、反対のことが明確に示されていない限り、任意の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された任意の他の特徴または複数の特徴と組み合わせることができる。
【0115】
本発明につながる研究において、驚くべきことに、特異的結合タンパク質が相同性の高いＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂを識別できることが示された。
【0116】
第１の態様において、本発明は、少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質を提供し、ここで、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、ＣＤ３２ａと特異的に結合し、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、
ｉ）配列番号２８、２９および３０、ならびに
ｉｉ）互いに独立して最大１０個のアミノ酸置換を含む、配列番号２８、２９および３０
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１個のアンキリンリピートモジュールを含む。
ｉ）配列番号２８、２９および３０、ならびに
ｉｉ）互いに独立して最大１０個のアミノ酸置換を含む、配列番号２８、２９および３０
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１個のアンキリンリピートモジュールを含む。
【0117】
好ましくは、最大９個のアミノ酸、より好ましくは最大８個のアミノ酸、より好ましくは最大７個のアミノ酸、より好ましくは最大６個のアミノ酸、より好ましくは最大５個のアミノ酸、より好ましくは最大４個のアミノ酸、より好ましくは最大３個のアミノ酸、より好ましくは最大２個のアミノ酸、より好ましくは最大１個のアミノ酸が置換され、最も好ましくは、配列番号２８、２９および３０のアミノ酸は置換されていない。
【0118】
ここで、１０個のアミノ酸が置換されている場合、最大１０個の置換アミノ酸は、好ましくは、配列番号２８、２９および３０の１位、３位、４位、６位、１４位、１５位、２７位および／または３個のさらなる位置にあり、９個のアミノ酸が置換されている場合、最大９個の置換アミノ酸は、好ましくは、配列番号２８、２９および３０の１位、３位、４位、６位、１４位、１５位、２７位および／または２個のさらなる位置にあり、８個のアミノ酸が置換されている場合、最大８個のアミノ酸は、好ましくは、配列番号２８、２９および３０の１位、３位、４位、６位、１４位、１５位、２７位および／または１個のさらなる位置にあり、７個のアミノ酸が置換されている場合、最大７個のアミノ酸は、好ましくは配列番号２８、２９および３０の１位、３位、４位、６位、１４位、１５位、２７位にある。
【0119】
好ましくは、配列番号２８、２９および／または３０において１位、３位、４位、６位、１４位および／または１５位のアミノ酸が置換されている場合、これらのアミノ酸は任意のアミノ酸であり、好ましくはグリシン、プロリンまたはシステインを除く任意のアミノ酸である。好ましくは、２７位のアミノ酸が配列番号２８、２９および／または３０において置換されている場合、このアミノ酸は任意のアミノ酸であり、好ましくはヒスチジン、アスパラギンまたはチロシンである。
【0120】
第１の態様の一実施形態において、結合タンパク質は少なくとも２個のリピートモジュールを含んでおり、それらは同一であっても異なっていてもよい。第１の態様の一実施態様において、結合タンパク質は２～２０個のリピートモジュールを含んでおり、それらは同一であっても異なっていてもよい。第１の態様の一実施態様において、結合タンパク質は３個のリピートモジュールを含んでおり、それらは同一であっても異なっていてもよい。
【0121】
好ましい実施形態において、結合タンパク質は、３個のリピートモジュールを含み、ここで、リピートモジュール１は、配列番号２８に従うアミノ酸配列を有し、リピートモジュール２は、配列番号２９に従うアミノ酸配列を有し、リピートモジュール３は、配列番号に従う３０アミノ酸配列を有し、好ましくは、各モジュール中の１０アミノ酸またはそれ以下が任意のアミノ酸で置換され、好ましくは、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸が置換され、最も好ましくは、アミノ酸は置換されない。
【0122】
好ましい実施形態において、結合タンパク質は、３個のリピートモジュールを含み、リピートモジュール１は配列番号２８に従うアミノ酸配列を有し、リピートモジュール２は配列番号２９に従うアミノ酸配列を有し、リピートモジュール３は配列番号３０に従うアミノ酸配列を有し、好ましくは、各モジュール中の５アミノ酸またはそれ以下が任意のアミノ酸で置換され、好ましくは４、３、２、または１が置換され、最も好ましくは、アミノ酸は置換されない。
【0123】
好ましい結合タンパク質は、少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含み、前記アンキリンリピートモジュールは、２×１０－５Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）でＣＤ３２ａと結合する。好ましくは、前記アンキリンリピートモジュールは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合、２×１０－６Ｍ以下、より好ましくは２×１０－７Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、または最も好ましくは２×１０－９Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する。２×１０－５Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合するアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質を実施例に示す。
【0124】
本発明のタンパク質の結合タンパク質中にＣＤ３２ａと結合する２個またはそれ以上のリピートドメインを含むと、本発明の結合タンパク質が２個またはそれ以上のＣＤ３２ａ抗原に、例えば細胞の表面で同時に結合することから生じる親和性効果により、本発明の結合タンパク質の親和性を高めることができることが当業者には理解される。したがって、ＣＤ３２ａと結合する前記リピートドメインの１個を含む本発明の好ましい結合タンパク質は、２×１０－５Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａに結合する。好ましくは、本発明の前記結合タンパク質は、ＳＰＲで測定した場合、２×１０－６Ｍ以下、より好ましくは２×１０－７Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、または最も好ましくは２×１０－９Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する。２×１０－５Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する本発明の結合タンパク質を実施例に示す。
【0125】
ＣＤ３２ａと結合する前記アンキリンリピートドメインを２個、３個、４個またはそれ以上含む本発明の別の好ましい結合タンパク質は、２×１０－５Ｍまたはそれ以下のＫｄでＣＤ３２ａに結合する。好ましくは、本発明の前記結合タンパク質は、ＳＰＲで測定した場合、２×１０－６Ｍ以下、より好ましくは２×１０－７Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、または最も好ましくは２×１０－９Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する。２×１０－５Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する本発明の結合タンパク質を実施例に示す。
【0126】
本発明の結合タンパク質のアンキリンリピートはＣＤ３２ａと特異的に結合する。好ましくは、少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質は、ヒトＣＤ３２ａと特異的に結合する。
【0127】
好ましくは、本発明の結合ドメインは、アンキリンリピートドメインまたは設計されたアンキリンリピートドメインである。設計されたアンキリンリピートドメインの例を実施例に示す。
【0128】
第２の態様において、本発明は、少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質に関し、ここで、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、ＣＤ３２ａと特異的に結合し、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、配列番号１～２７からなる群から選択される１個のアンキリンリピートドメインと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0129】
上記で定義したように、前記アンキリンリピートドメインは、２×１０－５Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する。好ましくは、前記リピートドメインは、ＳＰＲで測定した場合、２×１０－６Ｍ以下、より好ましくは２×１０－７Ｍ以下、より好ましくは２×１０－８Ｍ以下、または最も好ましくは２×１０－９Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する。２×１０－５Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合するアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質を実施例に示す。
【0130】
本発明の好ましい結合タンパク質は、２×１０－５Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する。好ましくは、前記結合タンパク質は、ＳＰＲで測定した場合、２×１０－６Ｍ以下、より好ましくは２×１０－７Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、または最も好ましくは２×１０－９Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する。２×１０－５Ｍ以下のＫｄでＣＤ３２ａと結合する本発明の結合タンパク質を実施例に示す。
【0131】
好ましくは、本発明の結合タンパク質におけるアンキリンリピートドメインは、配列番号１～２７からなる群から選択されるアンキリンリピートドメインにおけるランダム化されたリピートユニットまたはランダム化された位置と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明の結合タンパク質中のアンキリンリピートドメインは、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。最も好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質中のアンキリンリピートドメインは、配列番号１～２７のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【0132】
一実施形態において、本発明の結合タンパク質は、少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含み、以下の配列モチーフ
Ｘ１ＤＸ２Ｘ３ＧＸ４ＴＰＬＨＬＡＡＸ５Ｘ６ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ７ＧＡＤＶＮＡ（配列番号３１）
に従うアミノ酸配列からなる少なくとも１個のアンキリンリピートモジュールを含み、
Ｘ１からＸ６は、グリシン、プロリンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であってよく、
Ｘ７はヒスチジン、アスパラギンまたはチロシンであってよく、
ここで、配列番号３１においてＸで示される位置以外の場合により最大５個、好ましくは４個、３個、２個または１個のアミノ酸が、任意のアミノ酸で置換される。好ましい実施形態において、配列番号３１においてＸで示される位置以外の最大２個のアミノ酸が、任意のアミノ酸で置換される。リピートモジュール１における本発明の一実施形態において、
Ｘ１は、Ｔ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、またはＷであり、好ましくはＴであり、
Ｘ２は、Ｅ、Ｎ、Ｔ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、またはＩであり、好ましくはＥであり、
Ｘ３は、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｈ、Ｍ、Ａ、またはＴであり、好ましくはＥであり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｑ、またはＡであり、好ましくはＬであり、
Ｘ５は、Ｌ、Ｑ、Ｖ、Ｅ、Ｍ、Ｖ、またはＹであり、好ましくはＬであり、
Ｘ６は、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｖ、Ｗ、またはＤであり、好ましくはＩであり、
Ｘ７は、Ｙ、Ｎ、またはＨであり、好ましくはＹである。
Ｘ１ＤＸ２Ｘ３ＧＸ４ＴＰＬＨＬＡＡＸ５Ｘ６ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ７ＧＡＤＶＮＡ（配列番号３１）
に従うアミノ酸配列からなる少なくとも１個のアンキリンリピートモジュールを含み、
Ｘ１からＸ６は、グリシン、プロリンまたはシステインを除く任意のアミノ酸であってよく、
Ｘ７はヒスチジン、アスパラギンまたはチロシンであってよく、
ここで、配列番号３１においてＸで示される位置以外の場合により最大５個、好ましくは４個、３個、２個または１個のアミノ酸が、任意のアミノ酸で置換される。好ましい実施形態において、配列番号３１においてＸで示される位置以外の最大２個のアミノ酸が、任意のアミノ酸で置換される。リピートモジュール１における本発明の一実施形態において、
Ｘ１は、Ｔ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、またはＷであり、好ましくはＴであり、
Ｘ２は、Ｅ、Ｎ、Ｔ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、またはＩであり、好ましくはＥであり、
Ｘ３は、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｈ、Ｍ、Ａ、またはＴであり、好ましくはＥであり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｑ、またはＡであり、好ましくはＬであり、
Ｘ５は、Ｌ、Ｑ、Ｖ、Ｅ、Ｍ、Ｖ、またはＹであり、好ましくはＬであり、
Ｘ６は、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｖ、Ｗ、またはＤであり、好ましくはＩであり、
Ｘ７は、Ｙ、Ｎ、またはＨであり、好ましくはＹである。
【0133】
したがって、リピートモジュール１の好ましい実施形態において、Ｘ１はＴであり、Ｘ２はＥであり、Ｘ３はＥであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＬであり、Ｘ６はＩであり、Ｘ７はＹである。
【0134】
リピートモジュール２における本発明の一実施形態において、
Ｘ１は、Ａ、Ｈ、Ｍ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、またはＶであり、好ましくはＡであり、
Ｘ２は、Ｍ、Ｙ、Ｎ、Ｅ、Ｗ、Ｄ、Ｈ、またはＴであり、好ましくはＭであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、またはＨであり、好ましくはＤであり、
Ｘ４は、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、Ｄ、Ｓ、Ｙ、またはＰであり、好ましくはＴであり、
Ｘ５は、Ｑ、Ｅ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、またはＹであり、好ましくはＱであり、
Ｘ６は、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、またはＡ、好ましくはＥであり、
Ｘ７は、Ｙ、またはＮ、好ましくはＹである、
場合により、この配列は初期停止コドンを有し、場合により、１３位から始まり１３位を含むアミノ酸、好ましくは１４位、最も好ましくは１５位を含むアミノ酸を欠損している。
Ｘ１は、Ａ、Ｈ、Ｍ、Ｔ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、またはＶであり、好ましくはＡであり、
Ｘ２は、Ｍ、Ｙ、Ｎ、Ｅ、Ｗ、Ｄ、Ｈ、またはＴであり、好ましくはＭであり、
Ｘ３は、Ｄ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、またはＨであり、好ましくはＤであり、
Ｘ４は、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、Ｄ、Ｓ、Ｙ、またはＰであり、好ましくはＴであり、
Ｘ５は、Ｑ、Ｅ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、またはＹであり、好ましくはＱであり、
Ｘ６は、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、またはＡ、好ましくはＥであり、
Ｘ７は、Ｙ、またはＮ、好ましくはＹである、
場合により、この配列は初期停止コドンを有し、場合により、１３位から始まり１３位を含むアミノ酸、好ましくは１４位、最も好ましくは１５位を含むアミノ酸を欠損している。
【0135】
したがって、リピートモジュール２の好ましい実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＭであり、Ｘ３はＤであり、Ｘ４はＴであり、Ｘ５はＱであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＹである。
【0136】
リピートモジュール３における本発明の一実施形態において、
Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｈ、またはＹであり、好ましくはＤであり、
Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｈ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、Ｖ、Ｃであり、好ましくはＦであり、
Ｘ３は、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｖ、ＥまたはＧであり、好ましくはＷであり、
Ｘ４は、Ｈ、Ｙ、Ｌ、ＭまたはＦであり、好ましくはＨであり、
Ｘ５は、Ｗ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、またはＲであり、好ましくはＷであり、
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｑ、Ｄ、またはＬであり、好ましくはＦであり、
Ｘ７は、Ｈ、Ｙ、またはＮであり、好ましくはＨである。
Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｈ、またはＹであり、好ましくはＤであり、
Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｈ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、Ｖ、Ｃであり、好ましくはＦであり、
Ｘ３は、Ｗ、Ａ、Ｆ、Ｖ、ＥまたはＧであり、好ましくはＷであり、
Ｘ４は、Ｈ、Ｙ、Ｌ、ＭまたはＦであり、好ましくはＨであり、
Ｘ５は、Ｗ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、またはＲであり、好ましくはＷであり、
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｑ、Ｄ、またはＬであり、好ましくはＦであり、
Ｘ７は、Ｈ、Ｙ、またはＮであり、好ましくはＨである。
【0137】
したがって、リピートモジュール３の好ましい実施形態において、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５はＷであり、Ｘ６はＦであり、Ｘ７はＨである。
【0138】
したがって、好ましい実施形態のリピートモジュール１において、Ｘ１はＴであり、Ｘ２はＥであり、Ｘ３はＥであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＬであり、Ｘ６はＩであり、Ｘ７はＹであり、リピートモジュール２において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＭであり、Ｘ３はＤであり、Ｘ４はＴであり、Ｘ５はＱであり、Ｘ６はＥであり、Ｘ７はＹであり、リピートモジュール３において、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＦであり、Ｘ３はＷであり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５はＷであり、Ｘ６はＦであり、Ｘ７はＨである。
【0139】
一実施形態において、本発明の結合タンパク質は、リピートコンセンサス配列を含む少なくとも２個、または少なくとも３個のリピートモジュールを含む、これらは同一であっても異なっていてもよい。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、３個のリピートモジュールを含み、これらは同一でも異なっていてもよい。好ましくは、本発明の結合タンパク質のリピートドメインは、リピートモジュール１、リピートモジュール２およびリピートモジュール３のリピートコンセンサス配列を含む少なくとも３個のリピートモジュールを含む。
【0140】
本明細書に記載される全ての態様の１個の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングリピートドメインをさらに含み、好ましくは、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングリピートドメインは、アンキリンリピートモジュールのいずれか１個とは異なるアミノ酸配列を有する。
【0141】
好ましくは、前記Ｎ末端キャッピングリピートドメインのアミノ酸配列は、配列番号３２と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記Ｃ末端キャッピングリピートドメインのアミノ酸配列は、配列番号３３と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0142】
好ましくは、前記Ｎ末端キャッピングリピートドメインのアミノ酸配列は、配列番号３２に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0143】
好ましくは、前記Ｃ末端キャッピングリピートドメインのアミノ酸配列は、配列番号３３に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0144】
その代わりに、Ｎ末端キャッピングリピートドメインは、配列番号３２に従うアミノ酸配列からなり、ここで場合により最大５個、好ましくは最大４個、３個、２個または１個のアミノ酸が任意のアミノ酸で置換されている。Ｃ末端キャッピングリピートドメインは、配列番号３３に従うアミノ酸配列からなり、ここで場合により最大８個、好ましくは最大７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個のアミノ酸が任意のアミノ酸によって置換されている。
【0145】
さらに好ましいのは、当該分野で公知の任意のＮ末端またはＣ末端キャッピングを含む結合タンパク質である。Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングリピートドメインを含む本発明の結合タンパク質の例は、それぞれ配列番号３４～６０および６１～８６に対応するアミノ酸配列である。
【0146】
一実施形態において、結合タンパク質は、場合によりリピートタンパク質と融合した別のペプチドまたはタンパク質成分をさらに含む。一実施形態において、結合タンパク質は、脂質もしくは脂質様成分、または別の非ペプチド成分をさらに含む。
【0147】
好ましい実施形態において、少なくとも１個のアンキリンリピートドメインを含む本発明の結合タンパク質は、ＣＤ３２ａ受容体の細胞外ドメイン、好ましくはＣＤ３２ａ細胞外ドメインのＩｇ様Ｃ２型２ドメインと特異的に結合し、より好ましくは、特異的結合は、ＣＤ３２ａのＩｇ様Ｃ２型２ドメインの１６８位のロイシンと結合することを含む。一実施形態において、前記少なくとも１個のアンキリンリピートドメインは、ＣＤ３２ａへの結合についてＩｇＧ、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分と競合してもよい。
【0148】
好ましい実施形態において、ＣＤ３２ａは霊長類ＣＤ３２ａであり、より好ましくはヒトＣＤ３２ａである。
【0149】
好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質はＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ３２ｃを識別し、好ましくはＣＤ３２ｂまたはＣＤ３２ｃに結合せず、最も好ましくはＣＤ３２ｂに結合しない。
【0150】
また好ましくは、前記結合タンパク質は、ＣＤ３２ｂと結合せず、ＣＤ３２ｂの結合に対するＫｄは２×１０－５Ｍ超、より好ましくは２×１０－４Ｍ超、または最も好ましくは２×１０－３Ｍ超で示される。
【0151】
好ましくは、本発明の結合タンパク質は、抗原結合タンパク質、好ましくは組み換え抗原結合タンパク質を含む。好ましくは、前記結合タンパク質は、抗体またはそのフラグメント、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントではない。最も好ましくは、本発明の結合タンパク質はＤＡＲＰｉｎを含む、またはＤＡＲＰｉｎである。
【0152】
さらなる態様において、本発明は、本明細書中に記載される結合タンパク質、Ｎ末端キャッピングリピートおよび／またはＣ末端キャッピングリピートをコードする核酸を含む核酸に関する。
【0153】
一実施態様において、核酸配列は、少なくとも１個の転写制御ユニットに作動可能に連結される。本発明による核酸の一実施形態において、核酸は少なくともオープンリーディングフレームを追加で含む。別の実施形態において、核酸は、遺伝子の少なくとも調節領域を追加で含む。好ましくは、調節領域は転写調節領域であり、より具体的には、調節領域はプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、遺伝子座制御領域、およびボーダーエレメントからなる群から選択される。本発明による核酸は、通常、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを含むリボ核酸を含み、組み換えウイルスベクターも含む。本発明による核酸の一実施態様において、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり、別の好ましい実施態様において、核酸はプラスミドまたは組み換えウイルスベクターの一部である。本発明の核酸は、好ましくは、本発明の結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列から選択される。そのため、アミノ酸が置換された上記本発明の結合タンパク質をコードする全ての核酸バリアントは、遺伝暗号の変性によってヌクレオチド配列が変化する核酸バリアントを含む。特に、選択された宿主生物においてコードされた融合タンパク質の改良された発現を導く核酸バリアントのヌクレオチド配列が好ましい。核酸配列を宿主細胞の特異的な転写／翻訳機構に適切に調整するための表は、当業者に公知である。一般に、ヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含量を特定の宿主細胞の条件に適合させることが好ましい。ヒト細胞における発現のためには、最大Ｇ／Ｃ含量（それぞれ本発明の結合タンパク質をコードする）の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、５０％、７０％、さらに好ましくは９０％のＧ／Ｃ含量の増加が好ましい。このような核酸および／または誘導体の調製および精製は、通常、標準的な手順で行われる。
【0154】
これらの配列バリアントは、好ましくは、ＣＤ３２ａに対する結合特異性を有する本発明の結合タンパク質を導く。したがって、本発明の核酸配列は、本発明の全ての結合タンパク質バリアントをコードする。さらに、プロモーターまたは他の発現制御領域が、本発明の結合タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結され、定量的または組織特異的様式で結合タンパク質の発現を調節する。
【0155】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸を含み、場合により結合タンパク質を発現する宿主細胞に関する。一実施形態において、細胞は動物、好ましくは脊椎動物由来であり、これは好ましくは魚類、鳥類、または哺乳動物、好ましくは哺乳動物からなる群から選択される。
【0156】
さらに、本明細書に記載の核酸または結合タンパク質、を含む、から本質的になる、またはからなる、ベクターが提供される。
【0157】
既に叙述したように、本発明の結合タンパク質をコードする核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。同様に、本発明の結合タンパク質をコードする本発明の核酸は、線状または環状化されたフラグメント、単離されたフラグメントであってもよく、または、好ましくはプラスミド、もしくは組み換えウイルスＤＮＡとしてベクターに挿入されてよい。
【0158】
全ての態様の一実施形態において、結合タンパク質は分子であり、場合により、粒子中に含まれる。
【0159】
一実施形態において、粒子はさらに核酸を含み、好ましくは、核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏだけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏでも細胞に核酸を送達してよい。好ましくは、粒子は免疫細胞、より好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、単球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、および肥満細胞に核酸を送達する。一実施形態において、粒子は非ウイルス粒子である。一実施形態において、粒子は、脂質に基づくおよび／またはポリマーに基づく粒子である。一実施形態において、粒子はナノ粒子である。
【0160】
一実施形態において、粒子は、その表面上の本発明の結合タンパク質またはＤＡＲＰｉｎで機能化される。一実施形態において、粒子は、リピートタンパク質を少なくとも１個の粒子形成成分に連結することにより、本発明の結合タンパク質で機能化される。ＣＤ３２ａ陽性細胞の遺伝子改変のための積み荷を運ぶ粒子を本明細書に記載の結合剤で機能化することにより、ＣＤ３２ａ陽性細胞への積み荷の特異的送達および改変がもたらされる。
【0161】
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態において、遺伝子改変は一過性または安定である。本明細書に記載される全ての態様の一実施形態において、遺伝子改変は、ウイルスに基づく方法、トランスポゾンに基づく方法、または遺伝子編集に基づく方法によって行われる。一実施形態において、遺伝子編集に基づく方法は、ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子編集を含む。
【0162】
ＣＤ３２陽性細胞を特異的に標的化するために、本明細書に記載の結合タンパク質またはＤＡＲＰｉｎで機能化された本明細書に記載の粒子による細胞の遺伝子改変は、抗原受容体をコードする核酸をＣＤ３２陽性細胞のような細胞に送達して、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を産生するために、ｅｘ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用することができる。このような遺伝子改変には、非ウイルスに基づくＤＮＡトランスフェクション、非ウイルスに基づくＲＮＡトランスフェクション、例えばｍＲＮＡトランスフェクション、トランスポゾンに基づくシステム、およびウイルスに基づくシステムが含まれる。非ウイルスに基づくＤＮＡトランスフェクションは、挿入突然変異誘発のリスクが低い。トランスポゾンに基づくシステムは、統合エレメントを含まないプラスミドよりも効率的に導入遺伝子を統合することができる。ウイルスに基づくシステムには、ＡＡＶやアデノウイルスベクターだけでなく、ガンマレトロウイルスやレンチウイルスベクターの使用も含まれる。レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、細胞を永続的に形質導入するエンベロープ粒子であるが、ＡＡＶとアデノウイルスベクターは、少なくとも有糸分裂活性細胞への一過性の遺伝子送達を媒介する無防備の粒子である。エンベロープ型および無防備ウイルスベクター粒子表面上のＤＡＲＰｉｎの提示は確立されており、以前にも記述されている。
【0163】
本発明は、本発明の少なくとも１種の結合タンパク質を提示するベクターにも関する。
【0164】
例えば、脂質および／またはポリマーに基づくナノ粒子のような非ウイルスベクターは、ＣＤ３２ａ陽性細胞に結合するためにＣＤ３２ａ特異的ＤＡＲＰｉｎに結合させることができる。ＣＤ３２ａ陽性細胞に結合すると、これらの粒子はエンドサイトーシスされる。その内容物、例えば治療遺伝子をコードする核酸は、例えば微小管関連配列（ＭＴＡＳ）や核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むペプチドが含まれることにより、ＣＤ３２ａ陽性細胞の核に誘導される可能性がある。
【0165】
ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターにパッケージされた治療遺伝子は、例えば、ＣＤ３２ａ＋ＨＩＶリザーバー細胞を排除するための細胞傷害性遺伝子、またはＣＤ３２ａ＋細胞に新規治療活性を付与する免疫治療遺伝子であってよい。これらは、ＣＤ３２ａ標的粒子と全て組み合わせることができる多種多様な選択肢の一例に過ぎない。
【0166】
核酸に隣接するトランスポゾンと、高活性トランスポザーゼをコードする別の核酸、例えばプラスミドを含めることで、治療用核酸を効率的に染色体に組み込むことができる。
【0167】
もう一つの可能性は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用して、治療遺伝子を特定の遺伝子座に意図的に配置することである。例えば、治療遺伝子がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であった場合、既存のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）はノックアウトされ、一方でＣＡＲはノックインされ、そうでなければＴＣＲの発現を抑制する内因性プロモーターの動的制御下に置かれることになる。
【0168】
したがって、抗原受容体をコードする核酸の他に、本明細書に記載の粒子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（または関連）のような遺伝子編集ツール、またはスリーピングビューティー（ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）もしくはピギーバック（ｐｉｇｇｙ ｂａｇ）のようなトランスポゾンシステムを積み荷として送達することもできる。ゲノム統合／編集のためのこのようなツール（例えば、トランスポザーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような遺伝子編集ツール）は、タンパク質またはコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）として送達される。それにもかかわらず、治療用遺伝子の一過性の発現を誘導するために、ｍＲＮＡを送達することも選択肢の一つである。
【0169】
ＣＤ３２ａ＋に関する特定の例である、慢性感染ＨＩＶ陽性細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓツールの送達であり、組み込まれたプロウイルスＨＩＶゲノムを切除および／または不活性化する。ＣＤ３２ａ特異的ＤＡＲＰｉｎを表面に提示しているＨＩＶリザーバー細胞であれば、上記のいずれかのベクターシステムにより、慢性感染したＨＩＶリザーバー細胞にこれらの編集機構を正確に送達することができる。
【0170】
本発明の全ての態様の一実施形態において、治療遺伝子を発現するように遺伝子改変された細胞は、治療遺伝子をコードする核酸で安定的または一過性にトランスフェクトされる。したがって、治療遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに組み込まれるか、組み込まれない。
【0171】
本発明の全ての態様の一実施形態において、本明細書に記載される細胞は、治療される対象に対して自己由来、同種異系由来、または同系由来であってよい。一実施形態において、本開示は、患者からの細胞の除去およびその後の患者への細胞の再送を想定している。一実施形態において、本開示は患者からの細胞の除去を想定していない。後者の場合、細胞の遺伝子改変の全工程がｉｎ ｖｉｖｏで行われる。
【0172】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の結合タンパク質、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載の宿主細胞、本明細書に記載の粒子、またはそれらの複数を含む組成物に関する。
【0173】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の結合タンパク質、核酸、宿主細胞、ベクター、および／または粒子の少なくとも１種を含む医薬組成物に関する。
【0174】
医薬組成物は、１種またはそれ以上の担体および／または賦形剤をさらに含んでもよく、これらの全ては好ましくは薬学的に許容される。本発明によれば、医薬組成物は、所望の反応または所望の効果を生成するために、有効量の活性剤、例えば、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、または細胞を含む。本発明による医薬組成物は、好ましくは無菌状態である。医薬組成物は、均一な剤形で提供することができ、それ自体公知の方法で調製することができる。本発明に従う医薬組成物は、例えば、溶液または懸濁液の形態であってよい。
【0175】
本発明の組成物において使用できる薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物などの緩衝物質、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩または電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂肪が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、経口投与、非経口投与、吸入スプレーによる投与、局所投与、直腸投与、鼻腔投与、口腔投与、経膣投与により、または移植リザーバーを介して投与することができる。本明細書で使用される非経口的という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または点滴技術を含む。好ましくは、医薬組成物は経口、腹腔内または静脈内に投与される。本発明の医薬組成物の無菌注射可能な形態は、水性懸濁液または油性懸濁液であってよい。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当該分野で公知の技術に従って処方することができる。無菌注射製剤は、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液のように、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。採用できる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の固定油が溶媒または懸濁媒体として慣例的に採用されている。
【0176】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、状態の治療、予防、または診断における使用に適している。好ましくは、状態は、対象におけるＣＤ３２ａ発現レベルの変化に関連する。ＣＤ３２ａ発現レベルの変化とは、対照レベルと比較してＣＤ３２ａの発現が増加または減少することを指す。
【0177】
本発明の一態様において、本明細書に開示される結合タンパク質、核酸、ベクター、粒子、宿主細胞、組成物または医薬組成物は、医薬品として使用される。好ましくは、医薬品は、好ましくは、アレルギー、自己免疫疾患、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされるような免疫不全障害の文脈で、免疫調節剤である。
【0178】
本明細書に開示される結合タンパク質、核酸、ベクター、粒子、宿主細胞、組成物または医薬組成物は、状態の治療、予防または診断に使用することができる。好ましくは、状態はＣＤ３２ａの発現レベルに関連し、好ましくはＣＤ３２ａの発現レベルの変化に関連し、および／またはＣＤ３２ａの標的化が望まれる。
【0179】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に開示された結合タンパク質、核酸、宿主細胞、ベクター、粒子、組成物または医薬組成物を含むキットに関する。好ましくは、キットは、状態の治療、予防または診断における使用のためのものである。好ましくは、キットは、状態を治療、予防または診断する方法において、キットを使用するための説明書をさらに含む。好ましくは、前記状態は、ＣＤ３２ａ発現レベルに関連する状態、好ましくはＣＤ３２ａ発現レベルの変化に関連する状態、および／またはＣＤ３２ａの標的化が望まれる状態である。
【0180】
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態において、ＣＤ３２ａ発現レベルの変化に関連する状態は、アレルギー、自己免疫疾患／免疫不全、またはヘパリン誘発性血小板減少症である。免疫不全には、ＨＩＶ、関節リウマチ、ハンチントン病、α－抗トリプシン欠損症、ならびに結腸がん、黒色腫、腎臓がん、リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、胃腸腫瘍、肺がん、神経膠腫、甲状腺がん、乳房がん、前立腺腫瘍、肝臓がん、パピローマウイルス誘発がん（例えば、子宮頸がん）など多様なウイルス誘発腫瘍、腺がん、ヘルペスウイルス誘発腫瘍（例えば、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ誘発Ｂ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎誘発腫瘍（肝細胞がん）、ＨＴＬＶ－１およびＨＴＬＶ－２誘発リンパ腫、聴神線維腫症、肺がん、咽頭がん、肛門がん、膠芽細胞腫、リンパ腫、直腸がん、星状細胞腫、脳腫瘍、胃がん、網膜芽細胞腫、基底細胞腫、脳転移、髄芽細胞腫、膣がん、膵臓がん、精巣がん、黒色腫、膀胱がん、ホジキン症候群、髄膜腫、シュネーベルガー病、気管支がん、下垂体がん、菌状息肉症、食道がん、乳がん、神経鞘腫、棘細胞腫、バーキットリンパ腫、喉頭がん、胸腺腫、体がん、骨がん、非ホジキンリンパ腫、尿道がん、ＣＵＰ症候群、乏突起膠腫、外陰がん、腸がん、食道がん、小腸腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣がん（ｏｖａｒｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓がん、白血病から選択されるがん、または、皮膚がん、もしくは眼がんから選択されるがんなどが含まれる。好ましくは、状態は、ＨＩＶまたは関節リウマチであり、より好ましくはＨＩＶである。
【0181】
当業者には、意図した発明を成功裏に実施することを同様に可能にする、利用可能な様々な代替技術や手順が存在する。
実施例
実施例
【実施例1】
【0182】
ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎの同定
リボソームディスプレイ
リボソームディスプレイによる選択は、Ｈａｒｔｍａｎｎら（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８）の記載に従って行った。合計で最大５回の選択ラウンドを行った。ベイトタンパク質（ｂａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）として、Ｃ末端Ｈｉｓタグでタグ付けされたＣＤ３２ａの細胞外ドメイン（ＣＤ３２ａ－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を、ビオチン化ありまたはなしで使用した。ＣＤ３２ｂについては、組み換えＣＤ３２ｂタンパク質（ＣＤ３２ｂ－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を使用して対抗選択を行った。最初の３回の選択ラウンドは、固定化したビオチン化ＣＤ３２ａ－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、１０３７４－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ）を使用して行い、粘着性ＤＡＲＰｉｎの選択を除外するためのニュートラビジンまたはストレプトアビジンに対する事前選択ステップを含む。４回目と５回目の選択ラウンドは溶液中で行った。４回目の選択ラウンドでは、ＣＤ３２ａに対する高い親和性と特異性を持つ結合剤を選択するために、ビオチン化されていないＣＤ３２ａ－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、１０３７４－Ｈ２７Ｈ）によるオフレート（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）選択を行い、５回目の選択ラウンドでは、ビオチン化されていないＣＤ３２ｂ－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、１０２５９－Ｈ２７Ｈ）タンパク質による対抗選択を含んだ。
リボソームディスプレイ
リボソームディスプレイによる選択は、Ｈａｒｔｍａｎｎら（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８）の記載に従って行った。合計で最大５回の選択ラウンドを行った。ベイトタンパク質（ｂａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）として、Ｃ末端Ｈｉｓタグでタグ付けされたＣＤ３２ａの細胞外ドメイン（ＣＤ３２ａ－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を、ビオチン化ありまたはなしで使用した。ＣＤ３２ｂについては、組み換えＣＤ３２ｂタンパク質（ＣＤ３２ｂ－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を使用して対抗選択を行った。最初の３回の選択ラウンドは、固定化したビオチン化ＣＤ３２ａ－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、１０３７４－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ）を使用して行い、粘着性ＤＡＲＰｉｎの選択を除外するためのニュートラビジンまたはストレプトアビジンに対する事前選択ステップを含む。４回目と５回目の選択ラウンドは溶液中で行った。４回目の選択ラウンドでは、ＣＤ３２ａに対する高い親和性と特異性を持つ結合剤を選択するために、ビオチン化されていないＣＤ３２ａ－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、１０３７４－Ｈ２７Ｈ）によるオフレート（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）選択を行い、５回目の選択ラウンドでは、ビオチン化されていないＣＤ３２ｂ－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、１０２５９－Ｈ２７Ｈ）タンパク質による対抗選択を含んだ。
【0183】
簡単に説明すると、最初の３回の選択ラウンドでは、翻訳されたＶＶ－Ｎ２ＣおよびＶＶ－Ｎ３Ｃ ＤＡＲＰｉｎライブラリーは、固定化されたニュートラビジンまたはストレプトアビジン（どちらも６６ｎＭ）を使用したプレパンニングステップに供された。オンターゲット選択のために、ライブラリーを固定化したビオチン化ＣＤ３２ａ－Ｈｉｓ（４２５．５ｎＭ）とインキュベートした。得られたＤＡＲＰｉｎライブラリーは増幅され、次の選択ラウンドの鋳型として使用された。固定化標的タンパク質を使用した３回目ラウンドの後、４回目のラウンドと５回目のラウンドの選択を溶液中の標的で行った。４回目のラウンドでは、ライブラリーはまずビオチン化ＣＤ３２ａ－Ｈｉｓターゲット（１７ｐｍｏｌ）に曝露され、その後１０倍過剰のビオチン化ＣＤ３２ａ（１７０ｐｍｏｌ）にオフレート選択として曝露された。最後に、５回目のラウンドは２つのアプローチに分けられた：（ｉ）一方のアプローチでは、ライブラリーをビオチン化ＣＤ３２ａ－Ｈｉｓタンパク質（１７ｐｍｏｌ）に曝露する前に、ビオチン化されていないＣＤ３２ｂ－Ｈｉｓタンパク質（１７ｐｍｏｌ）で予備選択した、（ｉｉ）もう一方のアプローチでは、ライブラリーをまずビオチン化ＣＤ３２ａ－Ｈｉｓタンパク質に曝露し、その後ビオチン化されていないＣＤ３２ｂ－Ｈｉｓタンパク質（１７０ｐｍｏｌ）で対抗選択した。５回目の選択ラウンドの後、ＤＡＲＰｉｎをコードするＤＮＡフラグメントを大腸菌にクローニングし、シングルクローン解析（ｓｉｎｇｌｅ ｃｌｏｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）によってＣＤ３２ａとの結合を解析した。
【0184】
ＤＡＲＰｉｎの発現と粗溶解物の調製
５回目の選択ラウンド後に選択したＤＡＲＰｉｎのＣＤ３２ａへの特異的結合を試験するために、ＤＮＡフラグメントを細菌発現ベクターｐＱＥ－ＨｉｓＨＡにクローニングし、前に記載したように大腸菌ＸＬ １－ｂｌｕｅに形質転換した（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８）単一クローンを摘出し、６００μｌの２ＹＴ培地（２ＹＴ、１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）中、３７℃で一晩培養した後、培養液を１ｍｌの２ＹＴ培地で希釈してＯＤ６００を０．１にし、２ＹＴ培地中の５．５ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１００μＬの添加により１時間培養後にＤＡＲＰｉｎｓの発現を誘導した。３７℃で５時間培養後、遠心分離で菌体を回収し、ペレットを－８０℃で一晩保存した。翌日、ペレットを氷上で解凍し、Ｂ－ＰＥＲＩＩ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加えて溶解し、その後室温で２時間インキュベートした。溶解したペレットをボルテックスし、ＴＢＳで１：１０に希釈した後、遠心分離で細胞残屑を除去した。粗ＤＡＲＰｉｎを含む上清を分注し、細胞結合アッセイで使用するまで－８０℃で保存した。粗溶解物の調製は常に氷上で行い、タンパク質の品質低下を避けるため、最大３回の凍結融解サイクルを行った。５回目の選択ラウンドから合計２８５個のＤＡＲＰｉｎクローンを大腸菌で発現させ、細胞表面に発現したＣＤ３２ａへの結合を試験した。試験されたＤＡＲＰｉｎクローンの中から有望な候補を同定し、標準的な配列決定技術を使用して塩基配列を決定し、ＤＮＡおよびタンパク質の配列を得た。
５回目の選択ラウンド後に選択したＤＡＲＰｉｎのＣＤ３２ａへの特異的結合を試験するために、ＤＮＡフラグメントを細菌発現ベクターｐＱＥ－ＨｉｓＨＡにクローニングし、前に記載したように大腸菌ＸＬ １－ｂｌｕｅに形質転換した（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ２０１８）単一クローンを摘出し、６００μｌの２ＹＴ培地（２ＹＴ、１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）中、３７℃で一晩培養した後、培養液を１ｍｌの２ＹＴ培地で希釈してＯＤ６００を０．１にし、２ＹＴ培地中の５．５ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）１００μＬの添加により１時間培養後にＤＡＲＰｉｎｓの発現を誘導した。３７℃で５時間培養後、遠心分離で菌体を回収し、ペレットを－８０℃で一晩保存した。翌日、ペレットを氷上で解凍し、Ｂ－ＰＥＲＩＩ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加えて溶解し、その後室温で２時間インキュベートした。溶解したペレットをボルテックスし、ＴＢＳで１：１０に希釈した後、遠心分離で細胞残屑を除去した。粗ＤＡＲＰｉｎを含む上清を分注し、細胞結合アッセイで使用するまで－８０℃で保存した。粗溶解物の調製は常に氷上で行い、タンパク質の品質低下を避けるため、最大３回の凍結融解サイクルを行った。５回目の選択ラウンドから合計２８５個のＤＡＲＰｉｎクローンを大腸菌で発現させ、細胞表面に発現したＣＤ３２ａへの結合を試験した。試験されたＤＡＲＰｉｎクローンの中から有望な候補を同定し、標準的な配列決定技術を使用して塩基配列を決定し、ＤＮＡおよびタンパク質の配列を得た。
【0185】
細胞ベースの結合アッセイ
選択されたＤＡＲＰｉｎクローンのＣＤ３２ａ結合能を解析するために、細胞ベースの結合アッセイを、レンチウイルス導入によって作製され、ＣＤ３２抗体染色によって適切な細胞表面発現が確認された安定なＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｂ受容体発現細胞株を使用して実施した（データは示さず）。簡単に説明すると、８×１０３～１×１０５細胞を５～２５μｌの粗ＤＡＲＰｉｎ抽出物と４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞を２回洗浄して、ＤＡＲＰｉｎを検出する蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。試験した２８５クローンのうち、４５個の個々のＤＡＲＰｉｎクローンがヒトＣＤ３２ａ陽性細胞に特異的に結合したが、２個のＤＡＲＰｉｎ（５３．Ｆ１１、５３．２．Ｄ８）だけがＣＤ３２ｂ陽性細胞にオフターゲット結合を示した（図１）。注目すべきは、１個のＤＡＲＰｉｎ（５２．Ｈ６）以外の同定されたＣＤ３２ａ結合ＤＡＲＰｉｎは全てＶＶ－Ｎ３Ｃライブラリー由来であったことである。
選択されたＤＡＲＰｉｎクローンのＣＤ３２ａ結合能を解析するために、細胞ベースの結合アッセイを、レンチウイルス導入によって作製され、ＣＤ３２抗体染色によって適切な細胞表面発現が確認された安定なＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｂ受容体発現細胞株を使用して実施した（データは示さず）。簡単に説明すると、８×１０３～１×１０５細胞を５～２５μｌの粗ＤＡＲＰｉｎ抽出物と４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞を２回洗浄して、ＤＡＲＰｉｎを検出する蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。試験した２８５クローンのうち、４５個の個々のＤＡＲＰｉｎクローンがヒトＣＤ３２ａ陽性細胞に特異的に結合したが、２個のＤＡＲＰｉｎ（５３．Ｆ１１、５３．２．Ｄ８）だけがＣＤ３２ｂ陽性細胞にオフターゲット結合を示した（図１）。注目すべきは、１個のＤＡＲＰｉｎ（５２．Ｈ６）以外の同定されたＣＤ３２ａ結合ＤＡＲＰｉｎは全てＶＶ－Ｎ３Ｃライブラリー由来であったことである。
【0186】
【表2-1】
【表2-2】
【0187】
ＤＡＲＰｉｎ配列解析
配列決定の結果、同定された４５個のＣＤ３２ａ特異的候補のうち３４個が一般的なＤＡＲＰｉｎ構造に似ており、そのうち２７個はユニークなアミノ酸配列を持っていた（表１）。残りのＤＡＲＰｉｎ候補については、典型的なＤＡＲＰｉｎ構造は完全ではなかった（初期の配列切断など）ので、これらの候補はそれ以上考慮されなかった。個々のＤＡＲＰｉｎクローンは、Ｎ末端とＣ末端のキャッピングリピートドメインによってフランジ状に配置された少なくとも１個の多様なリピートドメインを含む。各リピートユニットは同じ構造モチーフを含み、３３個のＮ３Ｃ ＤＡＲＰｉｎのフレームワーク残基の６９．８％超が互いに相同である。各多様なリピートドメイン中の１位、３位、４位、６位、１４位および１５位の多様なアミノ酸は、グリシン、プロリンまたはシステインを除く任意のアミノ酸を含むことができる。各多様なリピートドメイン中の２７位の多様なアミノ酸は、ヒスチジン、アスパラギンまたはチロシンを含むことができる。個々のＤＡＲＰｉｎクローンおよびリピートモチーフの多様な位置を評価した結果、選択されたＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎは、第１の多様なリピートでは、１位にスレオニン（Ｔ）、３位と４位にグルタミン酸（Ｅ）、６位と１４位にロイシン（Ｌ）、１５位にイソロイシン（Ｉ）、２７位にチロシン（Ｙ）、第２の多様なリピートでは、１位にアラニン（Ａ）、３位にメチオニン（Ｍ）、４位にアスパラギン酸（Ｄ）、６位にスレオニン（Ｔ）、１４位にグルタミン（Ｑ）、１５位にグルタミン酸（Ｅ）、２７位にチロシン（Ｙ）であり、第３の多様なリピートでは、１位にアスパラギン酸（Ｄ）、３位と１５位にフェニルアラニン（Ｆ）、４位と１４位にトリプトファン（Ｗ）、６位と２７位にヒスチジン（Ｈ）を選択的に保有することを示した（図２および表１）。
配列決定の結果、同定された４５個のＣＤ３２ａ特異的候補のうち３４個が一般的なＤＡＲＰｉｎ構造に似ており、そのうち２７個はユニークなアミノ酸配列を持っていた（表１）。残りのＤＡＲＰｉｎ候補については、典型的なＤＡＲＰｉｎ構造は完全ではなかった（初期の配列切断など）ので、これらの候補はそれ以上考慮されなかった。個々のＤＡＲＰｉｎクローンは、Ｎ末端とＣ末端のキャッピングリピートドメインによってフランジ状に配置された少なくとも１個の多様なリピートドメインを含む。各リピートユニットは同じ構造モチーフを含み、３３個のＮ３Ｃ ＤＡＲＰｉｎのフレームワーク残基の６９．８％超が互いに相同である。各多様なリピートドメイン中の１位、３位、４位、６位、１４位および１５位の多様なアミノ酸は、グリシン、プロリンまたはシステインを除く任意のアミノ酸を含むことができる。各多様なリピートドメイン中の２７位の多様なアミノ酸は、ヒスチジン、アスパラギンまたはチロシンを含むことができる。個々のＤＡＲＰｉｎクローンおよびリピートモチーフの多様な位置を評価した結果、選択されたＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎは、第１の多様なリピートでは、１位にスレオニン（Ｔ）、３位と４位にグルタミン酸（Ｅ）、６位と１４位にロイシン（Ｌ）、１５位にイソロイシン（Ｉ）、２７位にチロシン（Ｙ）、第２の多様なリピートでは、１位にアラニン（Ａ）、３位にメチオニン（Ｍ）、４位にアスパラギン酸（Ｄ）、６位にスレオニン（Ｔ）、１４位にグルタミン（Ｑ）、１５位にグルタミン酸（Ｅ）、２７位にチロシン（Ｙ）であり、第３の多様なリピートでは、１位にアスパラギン酸（Ｄ）、３位と１５位にフェニルアラニン（Ｆ）、４位と１４位にトリプトファン（Ｗ）、６位と２７位にヒスチジン（Ｈ）を選択的に保有することを示した（図２および表１）。
【実施例2】
【0188】
精製ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎによるＣＤ３２ａ陽性細胞集団の特異的標識
ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂを発現する細胞集団を識別できるＣＤ３２ａ特異的ＤＡＲＰｉｎを同定するために、３４個のＤＡＲＰｉｎ候補のうち６個を、Ｈａｒｔｍａｎｎら（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１８）が記載したように、精製したＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎを使用して、若干の修正を加えてさらに詳細に調べた。簡単に言えば、各ＤＡＲＰｉｎについて、単一のコロニーを３０℃で一晩、溶原性培養液（ＬＢ）完全培地に接種した。翌日、新鮮なＬＢ完全培地１００ｍｌに一晩培養したものを５ｍｌ接種した。光学密度ＯＤが０．７になった時点で、３００μＭのＩＰＴＧを添加してタンパク質の発現を誘導した。３７℃で４時間培養した後、遠心分離によってバクテリアを回収し、ペレットを－８０℃で保存した。ペレットは氷上で解凍し、溶解バッファーに再懸濁し、機械的抽出のために超音波で破砕するか、化学的抽出のためにＢ－ＰＥＲＩＩと混合した。細胞残屑を遠心分離で除去し、上清を再貯蔵し、グリセロールバッファー（２．５×）を加えた。Ｎｉ－ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）アガロースカラムでのＤＡＲＰｉｎの精製は、製造元の指示に従って行った。この手順の間、ＳＤＳ ＰＡＧＥ用のサンプルを異なる時間に採取した。溶出画分を、透析チューブを使用して４℃で一晩かけてＰＢＳに対して透析した（ＭＷＣＯは使用した抽出方法によって異なる）。透析したＤＡＲＰｉｎタンパク質をブラッドフォードタンパク質分析で測定し、必要に応じて、保存のため、グリセロールとプロテアーゼ阻害剤を補充した。
ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂを発現する細胞集団を識別できるＣＤ３２ａ特異的ＤＡＲＰｉｎを同定するために、３４個のＤＡＲＰｉｎ候補のうち６個を、Ｈａｒｔｍａｎｎら（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１８）が記載したように、精製したＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎを使用して、若干の修正を加えてさらに詳細に調べた。簡単に言えば、各ＤＡＲＰｉｎについて、単一のコロニーを３０℃で一晩、溶原性培養液（ＬＢ）完全培地に接種した。翌日、新鮮なＬＢ完全培地１００ｍｌに一晩培養したものを５ｍｌ接種した。光学密度ＯＤが０．７になった時点で、３００μＭのＩＰＴＧを添加してタンパク質の発現を誘導した。３７℃で４時間培養した後、遠心分離によってバクテリアを回収し、ペレットを－８０℃で保存した。ペレットは氷上で解凍し、溶解バッファーに再懸濁し、機械的抽出のために超音波で破砕するか、化学的抽出のためにＢ－ＰＥＲＩＩと混合した。細胞残屑を遠心分離で除去し、上清を再貯蔵し、グリセロールバッファー（２．５×）を加えた。Ｎｉ－ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）アガロースカラムでのＤＡＲＰｉｎの精製は、製造元の指示に従って行った。この手順の間、ＳＤＳ ＰＡＧＥ用のサンプルを異なる時間に採取した。溶出画分を、透析チューブを使用して４℃で一晩かけてＰＢＳに対して透析した（ＭＷＣＯは使用した抽出方法によって異なる）。透析したＤＡＲＰｉｎタンパク質をブラッドフォードタンパク質分析で測定し、必要に応じて、保存のため、グリセロールとプロテアーゼ阻害剤を補充した。
【0189】
選択した精製ＤＡＲＰｉｎタンパク質のＣＤ３２ａ結合能を解析するため、一過性または安定なＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｂ発現細胞株を使用して細胞ベースの結合アッセイを行った。簡単に説明すると、８×１０４～１×１０５の細胞を異なる量の精製ＤＡＲＰｉｎとインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄して、ＤＡＲＰｉｎのＨｉｓタグを検出する蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。選択された精製ＤＡＲＰｉｎは、ＤＡＲＰｉｎ候補によって細胞の染色強度が異なるが、ＣＤ３２＋細胞とオフターゲット細胞を区別することができた（図３）。利用可能なＣＤ３２ａ細胞表面受容体の結合は、１μｇ以下のＤＡＲＰｉｎ濃度で達成されるようである。
【実施例3】
【0190】
ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎの結合部位のマッピング
ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの細胞外ドメインの配列は１２アミノ酸しか違わないが、最初の両アミノ酸はシグナルペプチドに近いため、この研究では考慮しない（図４）。これらのアミノ酸のうち、どのアミノ酸がＣＤ３２ａ ＤＡＲＰｉｎ結合に寄与するかを同定するために、細胞外ドメインに１～５個のＣＤ３２ａ特異的アミノ酸を保有するキメラＣＤ３２ｂタンパク質（表２）を合成し、ＳｕｐＴ１細胞上で発現させ、上記のように、細胞ベースの結合アッセイにおける標的集団として使用した。全てのキメラＣＤ３２ｂタンパク質は細胞表面によく発現し、様々な程度までｌｇＧ－Ｆｃと結合した（データは示さず）。興味深いことに、細胞外ドメインの始まりから数えて１３５位にあるセリンの代わりにロイシンを保有するキメラＣＤ３２ｂバリアントだけが、ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎ結合を媒介することができた（図５）。ＣＤ３２ｂのＥＣＤにおけるこの単一のアミノ酸交換が、ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎ結合を可能にするのに十分であり、選択されたＤＡＲＰｉｎによるＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの識別につながることは、一点変異Ｓ１３５Ｌのみを持つキメラＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ１０受容体の結合解析によってさらに確認された。対照的に、キメラＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ１１の一点変異Ｎ１３８Ｔは、キメラＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ４、ＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ６、ＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ８、およびＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ９バージョンにも存在するが、ＤＡＲＰｉｎの結合には至らなかった。注目すべきことに、このロイシンはＣＤ３２ａのＩｇ様Ｃ２型２ドメインに配置され、これはＣＤ３２ａ受容体のネイティブリガンドであるｌｇＧ（Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ， １９９９； Ｒａｍｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ，２０１１）のＦｃ部分のための結合領域である。
ＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの細胞外ドメインの配列は１２アミノ酸しか違わないが、最初の両アミノ酸はシグナルペプチドに近いため、この研究では考慮しない（図４）。これらのアミノ酸のうち、どのアミノ酸がＣＤ３２ａ ＤＡＲＰｉｎ結合に寄与するかを同定するために、細胞外ドメインに１～５個のＣＤ３２ａ特異的アミノ酸を保有するキメラＣＤ３２ｂタンパク質（表２）を合成し、ＳｕｐＴ１細胞上で発現させ、上記のように、細胞ベースの結合アッセイにおける標的集団として使用した。全てのキメラＣＤ３２ｂタンパク質は細胞表面によく発現し、様々な程度までｌｇＧ－Ｆｃと結合した（データは示さず）。興味深いことに、細胞外ドメインの始まりから数えて１３５位にあるセリンの代わりにロイシンを保有するキメラＣＤ３２ｂバリアントだけが、ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎ結合を媒介することができた（図５）。ＣＤ３２ｂのＥＣＤにおけるこの単一のアミノ酸交換が、ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎ結合を可能にするのに十分であり、選択されたＤＡＲＰｉｎによるＣＤ３２ａとＣＤ３２ｂの識別につながることは、一点変異Ｓ１３５Ｌのみを持つキメラＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ１０受容体の結合解析によってさらに確認された。対照的に、キメラＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ１１の一点変異Ｎ１３８Ｔは、キメラＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ４、ＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ６、ＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ８、およびＣＤ３２ｂ．ｍｕｔ９バージョンにも存在するが、ＤＡＲＰｉｎの結合には至らなかった。注目すべきことに、このロイシンはＣＤ３２ａのＩｇ様Ｃ２型２ドメインに配置され、これはＣＤ３２ａ受容体のネイティブリガンドであるｌｇＧ（Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ， １９９９； Ｒａｍｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ，２０１１）のＦｃ部分のための結合領域である。
【0191】
ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎがｌｇＧ抗体とＣＤ３２ａ結合で競合するかどうかを解析するために、競合アッセイを行った。事前にｌｇＧ抗体を細胞に添加したところ、ＣＤ３２ａ＋細胞へのＤＡＲＰｉｎの結合は、存在しなくなるまで減少することが示された（データは示さず）。したがって、ＣＤ３２ａ受容体表面のｌｇＧ結合領域とＤＡＲＰｉｎ結合領域には正の相関があると推測される。
【0192】
【表3】
【実施例4】
【0193】
ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎを提示したＬＶによるＣＤ３２ａ特異的遺伝子導入
ＤＡＲＰｉｎは以前、レンチウイルスベクターを選択した受容体に再度標的化するのに適したツールであることが示された（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， ２０１８； Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ， ２０１８）。この目的のためには、ＤＡＲＰｉｎをニパウイルスの糖タンパク質（ＮｉＶ－Ｇ）に遺伝子的に融合させる必要がある。同定された７つのＤＡＲＰｉｎ候補（５３．２．Ｇ２、５３．２Ａ８、５３Ｃ８、５２Ｈ６、５３．２．Ｆ１１、５３Ｄ８、５３Ｈ３）は、Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ， ２０２０の記載に従って、Ｎ末端が切断され天然受容体が盲検化されたＮｉＶ－ＧのＣ末端にクローニングされた。選択されたＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎの結合能と特異性が、ＮｉＶ－Ｇタンパク質への融合と２９３Ｔ細胞上での提示によって消失しないかどうかを解析するために、様々なＤＡＲＰｉｎ－ＮｉＶ－Ｇタンパク質を一過性に発現する２９３Ｔ細胞を使用して細胞ベースの結合アッセイを行った。
ＤＡＲＰｉｎは以前、レンチウイルスベクターを選択した受容体に再度標的化するのに適したツールであることが示された（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， ２０１８； Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ， ２０１８）。この目的のためには、ＤＡＲＰｉｎをニパウイルスの糖タンパク質（ＮｉＶ－Ｇ）に遺伝子的に融合させる必要がある。同定された７つのＤＡＲＰｉｎ候補（５３．２．Ｇ２、５３．２Ａ８、５３Ｃ８、５２Ｈ６、５３．２．Ｆ１１、５３Ｄ８、５３Ｈ３）は、Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ， ２０２０の記載に従って、Ｎ末端が切断され天然受容体が盲検化されたＮｉＶ－ＧのＣ末端にクローニングされた。選択されたＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎの結合能と特異性が、ＮｉＶ－Ｇタンパク質への融合と２９３Ｔ細胞上での提示によって消失しないかどうかを解析するために、様々なＤＡＲＰｉｎ－ＮｉＶ－Ｇタンパク質を一過性に発現する２９３Ｔ細胞を使用して細胞ベースの結合アッセイを行った。
【0194】
簡単に説明すると、ＤＡＲＰｉｎ提示細胞はＰＥＩを使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって作製した。トランスフェクションミックスは、４００ｎｇの全ＤＮＡを無添加の３０μｌのＤＭＥＭと混合し、２４ウェルプレートあたり２μｌのＰＥＩ溶液を補充した３０μｌのＤＭＥＭに加えた。室温で１５分間インキュベートした後、トランスフェクションミックスを細胞に加え、６時間後に培地を新鮮な細胞培養液に交換した。トランスフェクション後２日目に、１×１０５の細胞を、２５０ｎｇのビオチン化組み換えＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｂタンパク質とインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、蛍光標識したストレプトアビジンで染色し、フローサイトメトリーで解析した。図７は、ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎのＮｉＶ－Ｇへの融合と哺乳動物細胞での発現が、ＣＤ３２ａ受容体結合能および受容体特異性を保持していることを示している。これらの発見は、選択されたＤＡＲＰｉｎがＣＤ３２ａに対して高い特異性を有することを示す以前の結果（図１、図３および図６）と一致している。
【0195】
次のステップでは、それらＤＡＲＰｉｎ候補をエンベロープに提示し、レポーターとしてＧＦＰを保有する受容体標的レンチウイルスベクター（ＣＤ３２ａ－ＬＶ）を、前に記載したように、ＣＤ３２ａ特異的導入遺伝子送達を媒介する能力についてスクリーニングした（Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ．、２０２０）。ＣＤ３２ａ－ＬＶの概略構成を図７に示す。
【0196】
簡単に説明すると、ＬＶベクター粒子は、小規模フォーマット（１２ウェル、ＤＮＡ合計０．８μｇ）または大規模フォーマット（Ｔ１７５フラスコ、ＤＮＡ合計３５μｇ）のいずれかで、ＰＥＩを使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより作製した。小規模生産のトランスフェクションミックスでは、８００ｎｇの全ＤＮＡを５３μｌのＤＭＥＭ（添加物なし）と混合し、１２ウェルプレートあたり３μｌのＰＥＩ溶液を補充した５０μｌのＤＭＥＭに加えた。室温で１５分間インキュベートした後、トランスフェクションミックスを細胞に添加した。６時間後、培地を新鮮な細胞培養液に交換した。トランスフェクション後２日目に、ベクター粒子を含む細胞上清を回収し、小規模生産用に遠心分離して細胞残屑を除去するか、濾過した。上清は形質導入実験に使用した。大規模でのＬＶ生産については、Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ．、２０２０に記載されている。
【0197】
作製したＣＤ３２ａ－ＬＶ粒子を、ＣＤ３２ａ陽性（ＨＴ１０８０－ＣＤ３２ａ）および陰性（ＨＴ１０８０－ｗｔ、ＨＴ１０８０－ＣＤ３２ｂ）細胞株への形質導入の能力についてスクリーニングした。試験した７つの候補は全て、ＬＶ粒子上に提示させるとＣＤ３２ａ特異的遺伝子導入を媒介した（図８）。これらからＤＡＲＰｉｎ ５３．２．Ｆ１１と５３．Ｈ３を大規模生産（２０ｘ Ｔ１７５培養フラスコ）で生産し、さらにＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｂ受容体発現の有無にかかわらず、ＳｕｐＴ１細胞への導入効率を評価した（図９；データはＣＤ３２ａ．５３Ｈ３－レンチウイルスベクターについては示していない）。興味深いことに、無血清培地（Ｐａｎｅｘｉｎ）を使用すると、標的細胞への導入率が高くなる。この発見は、ＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎの競合物質として働くかもしれないウシ胎児血清（ＦＣＳ）中のｌｇＧの存在によって説明されるかもしれない。
【実施例5】
【0198】
選択したＣＤ３２ａ－ＤＡＲＰｉｎの速度論的測定
選択したＤＡＲＰｉｎのヒトＣＤ３２ａに対する結合親和性を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（Ｃｙｔｉｖａ社製）にて表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）測定を行った。ヒトＣＤ３２ｂに対するＤＡＲＰｉｎの特異性をさらに証明するために、ヒトＣＤ３２ｂに対するＤＡＲＰｉｎの潜在的結合も分析した。
選択したＤＡＲＰｉｎのヒトＣＤ３２ａに対する結合親和性を決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（Ｃｙｔｉｖａ社製）にて表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）測定を行った。ヒトＣＤ３２ｂに対するＤＡＲＰｉｎの特異性をさらに証明するために、ヒトＣＤ３２ｂに対するＤＡＲＰｉｎの潜在的結合も分析した。
【0199】
簡単に説明すると、ニュートラビジンＮＡチップ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を製造業者のプロトコルに従って調製し、１１０ＲＵのヒトビオチン化ＣＤ３２ａ（または９８５ＲＵ）および１１４ＲＵのヒトビオチン化ＣＤ３２ｂタンパク質をそれぞれ固定化した。ランニングバッファーとして、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を使用した。ＤＡＲＰｉｎサンプルは濃度を変えながら３分間注入され、続いて１５分間の解離段階を経て、その後１０ｍＭ ＮａＯＨで再生した。タンパク質－タンパク質相互作用の結合動態を解析し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用してフィッティングした。各測定値から、コーティングされていない参照フローセルのシグナルを差し引いた。
【0200】
ＳＰＲ実験において、選択したＤＡＲＰｉｎは組み換えＣＤ３２ａタンパク質に特異的で、ＣＤ３２ｂタンパク質やニュートラビジンとは交差反応しなかった。本発明者らは、５３．２．Ｆ１１と同じＤＡＲＰｉｎであるが、Ｈｉｓ－タグとＨＡ－タグの間にＴＥＶ切断部位を保有する、ＤＡＲＰｉｎ ５３．２Ｆ１１［ＴＥＶ］の固定化ヒトＣＤ３２ａタンパク質に対する結合動態を測定したところ、親和性（ＫＤ）は低ナノモル領域（＜２×１０－９Ｍ）であったが、ヒトＣＤ３２ｂに対する親和性は評価できなかった（ベースライン以下）（図１０）。試験した他の全てのＤＡＲＰｉｎ候補（５３．Ｈ３、５３．Ｄ８、５３．２．Ｆ１１、５２．Ｈ６、５３．Ａ８、５３．Ｃ８）では、ＣＤ３２ａに対する同様の親和性（＜２×１０－９Ｍ）が観察されたが、ＣＤ３２ｂに対する結合は常にベースライン以下であった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】