特表 2025-504957 アポリポタンパク質ＥのＣ末端フラグメント及びγ－セクレターゼ活性の阻害におけるその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-02-19

(54)【発明の名称】アポリポタンパク質ＥのＣ末端フラグメント及びγ－セクレターゼ活性の阻害におけるその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20250212BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20250212BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20250212BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20250212BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20250212BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20250212BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20250212BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20250212BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20250212BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20250212BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20250212BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20250212BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20250212BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250212BHJP

   C12N 5/0793 20100101ALN20250212BHJP

【ＦＩ】

C07K14/47 ZNA

C12N15/12

C12N15/11 Z

C12N15/63 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N5/10

A61K38/16

A61K48/00

A61K31/7088

A61K35/76

A61K35/30

A61P25/28

A61P35/00

A61P29/00

A61P11/06

A61P11/00

A61P13/12

A61P43/00 111

C12N5/0793

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024544983

(86)(22)【出願日】2023-01-30

(85)【翻訳文提出日】2024-08-26

(86)【国際出願番号】 CN2023073849

(87)【国際公開番号】W WO2023143610

(87)【国際公開日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】202210113320.2

(32)【優先日】2022-01-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523427364

【氏名又は名称】斯莱普泰（上海）生物医藥科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＹＮＰＨＡＴＥＣ （ＳＨＡＮＧＨＡＩ） ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】陳 椰 林

(72)【発明者】

【氏名】侯 祥 龍

(72)【発明者】

【氏名】耿 泱

(72)【発明者】

【氏名】張 雪 馨

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084NA05

4C084ZA15

4C084ZA16

4C084ZA59

4C084ZA81

4C084ZB11

4C084ZB26

4C084ZC20

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA59

4C086ZA81

4C086ZB11

4C086ZB26

4C086ZC20

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA05

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZA59

4C087ZA81

4C087ZB11

4C087ZB26

4C087ZC20

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ＡｐｏＥ）のＣ末端フラグメント（例えばＡｐｏＥ ＣＴ）及び修飾されるＡｐｏＥ２及びγ－セクレターゼ活性の阻害におけるその応用に関する。本発明の一つの様態は、単離されたＡｐｏＥコンストラクト（ＡｐｏＥ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を提供し、それが、ＡｐｏＥポリペプチドを含み、前記ＡｐｏＥポリペプチドは：（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来のフラグメントを含み、当該フラグメントのＮ末端の最初のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２２１位のアミノ酸残基のいずれか一つであり、当該フラグメントのＣ末端の最末のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２７４－２９９位のアミノ酸残基のいずれか一つである；あるいは（２）そのアミノ酸配列は、（１）に記載のフラグメントと少なくとも約７０％の配列同一性を有し、かつ（１）に記載のフラグメントによるγセクレターゼ切断活性の阻害の少なくとも約５０％を保持する。本発明は、さらに、前記ＡｐｏＥコンストラクトのタンパク質部分のコード配列、核酸コンストラクト、宿主細胞、構築方法、医薬組成物及び用途を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡｐｏＥポリペプチドを含む単離されたＡｐｏＥコンストラクト。前記ＡｐｏＥポリペプチドは
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来のフラグメントを含み、当該フラグメントのＮ末端の最初のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２２１位のアミノ酸残基のいずれか一つであり、当該フラグメントのＣ末端の最末のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２７４－２９９位（好ましくは２７９－２９９位）のアミノ酸残基のいずれか一つである；あるいは
（２）そのアミノ酸配列は、（１）に記載のフラグメントと少なくとも約７０％の配列同一性を有し、かつ（１）に記載のフラグメントによるγセクレターゼ切断活性の阻害の少なくとも約５０％を保持する。

【請求項2】

前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、以下のいずれか一つの配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１６－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１７－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１８－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１６－２９４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１６－２８９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８８位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８７位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８６位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８５位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２７９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２７４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２７４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；
（ｘｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２７９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；または
（ｘｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基のアミノ酸配列。

【請求項3】

前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項4】

前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－３４、７８と８７中のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１－３のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項5】

前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列に対する一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異を含むことを特徴とする請求項１－４のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト：Ｒ２２６、Ｄ２２７、Ｒ２２８、Ｌ２２９、Ｄ２３０、Ｑ２３５、Ｅ２３８、Ｖ２３９、Ｒ２４０、Ｋ２４２、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｑ２４６、Ａ２４７、Ｑ２４８、Ｑ２４９、Ｉ２５０、Ｒ２５１、Ｌ２５２、Ｑ２５３、Ａ２５４、Ｅ２５５、Ｑ２７５、Ｖ２８０、Ｖ２８７、Ｔ２８９、Ｓ２９０、Ａ２９１、Ｐ２９３、Ｖ２９４、Ｐ２９５、Ｓ２９６、Ｄ２９７、Ｎ２９８、Ｈ２９９、Ｒ２５１＋Ｔ２８９、Ｒ２５１＋Ｔ２８９＋Ａ２９１、Ｓ２９０＋Ｐ２９３＋Ｖ２９４＋Ｐ２９５＋Ｓ２９６＋Ｄ２９７＋Ｎ２９８＋Ｈ２９９、Ｒ２２６＋Ｄ２２７＋Ｒ２２８＋Ｌ２２９＋Ｄ２３０、Ｅ２３８＋Ｖ２３９＋Ｒ２４０＋Ｋ２４２、またはＥ２４４＋Ｅ２４５＋Ｑ２４６＋Ａ２４７＋Ｑ２４８＋Ｑ２４９＋Ｉ２５０＋Ｒ２５１＋Ｌ２５２＋Ｑ２５３＋Ａ２５４。

【請求項6】

前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列に対する一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異を含むことを特徴とする請求項１－５のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト：Ｒ２２６Ａ、Ｄ２２７Ａ、Ｒ２２８Ａ、Ｌ２２９Ａ、Ｄ２３０Ａ、Ｑ２３５Ａ、Ｅ２３８Ａ、Ｖ２３９Ａ、Ｒ２４０Ａ、Ｋ２４２Ａ、Ｅ２４４ｄｅｌ、Ｅ２４５ｄｅｌ、Ｑ２４６ｄｅｌ、Ａ２４７ｄｅｌ、Ｑ２４８ｄｅｌ、Ｑ２４９ｄｅｌ、Ｉ２５０ｄｅｌ、Ｒ２５１Ｓ、Ｌ２５２ｄｅｌ、Ｑ２５３ｄｅｌ、Ａ２５４ｄｅｌ、Ｅ２５５Ａ、Ｑ２７５Ａ、Ｖ２８０Ａ、Ｖ２８７Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｓ２９０Ａ、Ａ２９１Ｔ、Ｐ２９３Ａ、Ｖ２９４Ａ、Ｐ２９５Ａ、Ｓ２９６Ａ、Ｄ２９７Ａ、Ｎ２９８Ａ、Ｈ２９９Ａ、Ｒ２５１Ａ＋Ｔ２８９Ａ、Ｒ２５１Ｓ＋Ｔ２８９Ａ＋Ａ２９１Ｔ、Ｓ２９０Ａ＋Ｐ２９３Ａ＋Ｖ２９４Ａ＋Ｐ２９５Ａ＋Ｓ２９６Ａ＋Ｄ２９７Ａ＋Ｎ２９８Ａ＋Ｈ２９９Ａ、Ｒ２２６Ａ＋Ｄ２２７Ａ＋Ｒ２２８Ａ＋Ｌ２２９Ａ＋Ｄ２３０Ａ、Ｅ２３８Ａ＋Ｖ２３９Ａ＋Ｒ２４０Ａ＋Ｋ２４２Ａ、またはＥ２４４ｄｅｌ＋Ｅ２４５ｄｅｌ＋Ｑ２４６ｄｅｌ＋Ａ２４７ｄｅｌ＋Ｑ２４８ｄｅｌ＋Ｑ２４９ｄｅｌ＋Ｉ２５０ｄｅｌ＋Ｒ２５１ｄｅｌ＋Ｌ２５２ｄｅｌ＋Ｑ２５３ｄｅｌ＋Ａ２５４ｄｅｌ。

【請求項7】

前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６－５２、５７－５９、６２と７６中のいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１－６のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項8】

前記ＡｐｏＥコンストラクトにおけるＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端は、さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸残基のアミノ酸配列を含み、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸と少なくとも約７０％の同一性の配列を有することを特徴とする請求項１－７のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項9】

前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項８に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項10】

前記ＡｐｏＥコンストラクトが、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、さらに、膜透過ペプチドを含むことを特徴とする請求項１－９のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項11】

前記膜透過ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５－４５、６３－６５と８４－８６中のいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項12】

前記膜透過ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項13】

前記膜透過ペプチドは、リンカー配列を介して、前記ＡｐｏＥポリペプチド、または前記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸残基を含むアミノ酸配列、または前記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸と少なくとも約７０％の同一性を有する配列に接続することを特徴とする請求項１０－１２のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項14】

前記ＡｐｏＥコンストラクトが、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端に、さらに、シグナルペプチドを含むことを特徴とする請求項１－１３のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項15】

前記シグナルペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６－６８から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１４に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト。

【請求項16】

請求項１－１５のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクトのタンパク質部分をコードすることを特徴とする単離された核酸。

【請求項17】

請求項１６に記載の単離された核酸を含むことを特徴とするベクター。

【請求項18】

前記ベクターは、前記単離された核酸の５’末端にニューロン特異的プロモーターを含有することを特徴とする請求項１７に記載のベクター。

【請求項19】

前記ニューロン特異的プロモーターが、シナプシンプロモーター、ｔｈｙ－１プロモーターとカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ－αプロモーターから選ばれることを特徴とする請求項１８に記載のベクター。

【請求項20】

前記ベクターは、組換えＡＡＶまたはｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ発現ベクターであることを特徴とする請求項１７－１９のいずれか一つに記載のベクター。

【請求項21】

請求項１－１５のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクトを発現し、請求項１６に記載の単離された核酸を含有し、または請求項１７－２０のいずれか一つに記載のベクターを含有することを特徴とする宿主細胞。

【請求項22】

前記宿主細胞は、ニューロンであることを特徴とする請求項２１に記載の宿主細胞。

【請求項23】

（ｉ）請求項１－１５のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト、請求項１６に記載の単離された核酸、請求項１７－２０のいずれか一つに記載のベクター、または請求項２１または２２に記載の宿主細胞；及び（ｉｉ）薬学のに許容される担体；を含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項24】

個体のγセクレターゼの切断活性に関連する疾患を治療または予防する医薬品の調製における請求項１－１５のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト、請求項１６に記載の単離された核酸、請求項１７－２０のいずれか一つに記載のベクター、請求項２１または２２に記載の宿主細胞、または請求項２３に記載の医薬組成物の用途。

【請求項25】

個体のγセクレターゼの切断活性に関連する疾患を治療または予防する方法、当該方法は、前記個体へ有効投与量の請求項１－１５のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト、請求項１６に記載の単離された核酸、請求項１７－２０のいずれか一つに記載のベクター、請求項２１または２２に記載の宿主細胞、または請求項２３に記載の医薬組成物を投与することを含む。

【請求項26】

前記医薬品または方法で、γセクレターゼの切断活性を阻害し、そして前記γセクレターゼの切断活性に関連する疾患を治療または予防することを特徴とする請求項２４に記載の用途または２５に記載の方法。

【請求項27】

前記疾患は、神経システム退行性疾患、癌症、炎性疾患と腎臓疾患から選ばれることを特徴とする請求項２４－２６のいずれか一つに記載の用途または方法。

【請求項28】

（ｉ）前記神経システム退行性疾患は、アルツハイマー病およびその関連疾患、アミロイド脳血管疾患、ダウン症候群、加齢に伴うその他の神経変性疾患（前頭側頭型認知症など）から選ばれる；
（ｉｉ）前記癌症は、頭頸部がん、乳がん、肝臓がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、神経膠腫、線維腫、リンパ腫、骨肉腫、胃がん、膀胱がんから選ばれる；
（ｉｉｉ）前記炎性疾患は、喘息、肺炎、気道炎症から選ばれる；及び／又は
（ｉｖ）前記腎臓疾患は、急性腎障害、明細胞腎細胞がん、腎線維症、閉塞性腎症から選ばれる；
ことを特徴とする請求項２４－２７のいずれか一つに記載の用途または方法。

【請求項29】

前記個体は、ヒトであることを特徴とする請求項２４－２８のいずれか一つに記載の用途または方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
この特許出願は、２０２２年１月３０日に出願された中国出願番号ＣＮ２０２２１０１１３３２０．２の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子配列表への参照
電子配列表（２１７３３４ １ＰＣＷＯ．ｘｍｌ；サイズ：９２，５５８ バイト；作成日：２０２３年１月３０日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

技術分野
本発明は、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ＡｐｏＥ）のＣ末端フラグメント及びγ－セクレターゼ活性の阻害におけるその応用に関する。

【背景技術】

【0004】

γ－セクレターゼは、１００種類を超えるＩ型膜貫通タンパク質の切断酵素であり、さまざまな生物学的プロセスに関与する。Ｔ細胞とＢ細胞の分化異常、血性下痢、皮膚や毛髪の欠損、アルツハイマー病（ＡＤ）などはすべて、γ－セクレターゼの異常に関連する。γ－セクレターゼは、ＮＣＴ、ＡＰＨ１、ＰＥＮ２、およびプレセニリン１（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ１、ＰＳ１）またはプレセニリン２（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ２、ＰＳ２）の４つのタンパク質の複合体である。γ－セクレターゼの酵素活性中心は、ＰＳ１またはＰＳ２である。現在、ＰＳ１とＰＳ２のさまざまな変異が、ＡＤを引き起こすことが発見され、ＰＳ１とＰＳ２は、両方ともＡＤの病原性遺伝子であるため、γ－セクレターゼは、特にＡＤの治療にとって、非常に重要な薬物標的となる。

【0005】

ＡＤは、ヒトで最も一般的な神経変性疾患である。ＡＤ患者は、主に、進行性の記憶障害、認知機能障害、性格変化、及び言語障害などの症状を示し、さらにセルフケア能力の喪失に発展し、最終的には死に至る。中国は、世界で最もＡＤ患者の数が多い国である。２０１９年の時点で、中国には、ＡＤ患者が１，０００万人以上おり、毎年増加傾向にある。８０歳超の人がＡＤになる確率は、４０％を超える。さらに、ＡＤの治療費も非常に高額であり、家族や社会に多大な負担を与える。

【0006】

過去数十年で、ＡＤの病因に関する研究は、大きく進歩し、Ａβカスケード仮説が提唱された。この仮説は、脳内でのＡβの過剰産生と異常な蓄積が、一連の重篤でゆっくりとした病気の最初の原因であり、脳内で一連の異常な生物学的プロセスを引き起こし、ニューロンでのシナプス変性とニューロン死を引き起こすと考えている。脳では、アミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＰＰ）は、主にニューロンによって発現され、Ａβは、βおよびγセクレターゼによるＡＰＰの連続的な切断によって生成され、生成されたＡβは、細胞外に放出され、このプロセスはＡＰＰのアミロイド代謝と呼ばれる。通常の生理学的条件下では、脳内で生成されるＡβは、ほとんどは可溶性である。しかし、病変が発生すると、脳内に大量のＡβが異常に蓄積し、神経細胞の周囲に沈着するアミロイド斑を形成し、ニューロンの損傷を引き起こし、さらに脳組織の不全を引き起こし、最終的にＡＤを引き起こす。さらに、脳血管内でのアミロイドタンパク質の異常な凝集と沈着は、アミロイド脳血管疾患を引き起こす可能性がある。ＡＰＰは、βおよびγセクレターゼによって切断され、有毒なＡβを生成するだけでなく、ＡＰＰの非アミロイド代謝経路であるαおよびγセクレターゼによっても順番に切断される。α－セクレターゼの切断部位は、Ａβの内部に位置するため、α切断産物は、Ａβを生成せず、その切断フラグメントはα－ＣＴＦと呼ばれ、神経毒性がなく、ＡＤを引き起こしない。α酵素とβ酵素の切断は、互いに競合し、α－セクレターゼの酵素切断が増加すると、Ａβの生成が減少する；同様に、γ－セクレターゼの酵素切断が減少すると、Ａβの生成が減少し、アミロイド斑の形成が遅くなり、そして最終的には、ＡＤとアミロイド脳血管疾患の発生を遅らせ、さらには予防することさえできる。γ－セクレターゼを標的とするさまざまな薬物が臨床試験で試験される。

【0007】

ＡｐｏＥは、人体内で広く分泌されるタンパク質であり、脳内のニューロンでＡＰＰと共発現することができる。ヒトＡｐｏＥには、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、およびＡｐｏＥ４の３つの異性体がある；それらは、構造と機能において非常に類似し、だいたい３つの機能ドメインに分けられ、受容体結合部位を含むＮ末端ドメイン、脂質結合部位を含むＣ末端ドメイン、及び両端のドメインを接続する中央の柔軟なヒンジ領域である。ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、とＡｐｏＥ４は、Ｎ末端ドメインの２つのアミノ酸残基が異なるだけであり、Ｃ末端ドメインでは完全に同一のアミノ酸配列を有する。中でも、ＡｐｏＥ２には、保護効果があり、ＡＤの発症リスクを軽減できる；ＡｐｏＥ４は、ＡＤの主な危険因子であり、ＡＤのリスクを大幅に高めるだけでなく、ＡＤの発症年齢を大幅に早め、ＡＤの状態を悪化させる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

これまでのところ、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ４が、どのようにＡＤのリスクに影響するかはまだ不明である。

【課題を解決するための手段】

【0009】

発明の内容
一つの様態では、本発明が、単離されたＡｐｏＥコンストラクトを提供し、それが、ＡｐｏＥポリペプチドを含み、前記ＡｐｏＥポリペプチドが：（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来のフラグメントを含み、当該フラグメント（または当該ＡｐｏＥポリペプチド）Ｎ末端の最初のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２２１位のアミノ酸残基のいずれか一つであり、当該フラグメント（または当該ＡｐｏＥポリペプチド）Ｃ末端の最末のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２７４－２９９位（例えば２７９－２９９位）のアミノ酸残基のいずれか一つである；または（２）そのアミノ酸配列が、（１）に記載のフラグメントと少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の配列同一性を有し、かつ（１）に記載のフラグメントによるγセクレターゼ切断活性の阻害の少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）を保持する。

【0010】

前記単離されたＡｐｏＥコンストラクトのいずれか一つによる一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、以下のいずれか一つの配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２９９位アミノ酸残基的アミノ酸配列；（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１６－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１７－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１８－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１６－２９４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１６－２８９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８８位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８７位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８６位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８５位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２７９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２７４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２７４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２７９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；または（ｘｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基のアミノ酸配列。

【0011】

前記単離されたＡｐｏＥコンストラクトのいずれか一つによる一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－３４、７８と８７中のいずれか一つに示されるアミノ酸配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。

【0012】

前記単離されたＡｐｏＥコンストラクトのいずれか一つによる一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列と、少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ヒト以外の霊長類の配列、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列と相同性が高く保存された配列を含有する。

【0013】

前記単離されたＡｐｏＥコンストラクトのいずれか一つによる一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列に対する一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異（例えば挿入、欠失または置換）を含む：Ｒ２２６、Ｄ２２７、Ｒ２２８、Ｌ２２９、Ｄ２３０、Ｑ２３５、Ｅ２３８、Ｖ２３９、Ｒ２４０、Ｋ２４２、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｑ２４６、Ａ２４７、Ｑ２４８、Ｑ２４９、Ｉ２５０、Ｒ２５１、Ｌ２５２、Ｑ２５３、Ａ２５４、Ｅ２５５、Ｑ２７５、Ｖ２８０、Ｖ２８７、Ｔ２８９、Ｓ２９０、Ａ２９１、Ｐ２９３、Ｖ２９４、Ｐ２９５、Ｓ２９６、Ｄ２９７、Ｎ２９８、Ｈ２９９、Ｒ２５１＋Ｔ２８９、Ｒ２５１＋Ｔ２８９＋Ａ２９１、Ｓ２９０＋Ｐ２９３＋Ｖ２９４＋Ｐ２９５＋Ｓ２９６＋Ｄ２９７＋Ｎ２９８＋Ｈ２９９、Ｒ２２６＋Ｄ２２７＋Ｒ２２８＋Ｌ２２９＋Ｄ２３０、Ｅ２３８＋Ｖ２３９＋Ｒ２４０＋Ｋ２４２、またはＥ２４４＋Ｅ２４５＋Ｑ２４６＋Ａ２４７＋Ｑ２４８＋Ｑ２４９＋Ｉ２５０＋Ｒ２５１＋Ｌ２５２＋Ｑ２５３＋Ａ２５４。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列に対する一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異を含む：Ｒ２２６Ａ、Ｄ２２７Ａ、Ｒ２２８Ａ、Ｌ２２９Ａ、Ｄ２３０Ａ、Ｑ２３５Ａ、Ｅ２３８Ａ、Ｖ２３９Ａ、Ｒ２４０Ａ、Ｋ２４２Ａ、Ｅ２４４ｄｅｌ、Ｅ２４５ｄｅｌ、Ｑ２４６ｄｅｌ、Ａ２４７ｄｅｌ、Ｑ２４８ｄｅｌ、Ｑ２４９ｄｅｌ、Ｉ２５０ｄｅｌ、Ｒ２５１Ｓ、Ｌ２５２ｄｅｌ、Ｑ２５３ｄｅｌ、Ａ２５４ｄｅｌ、Ｅ２５５Ａ、Ｑ２７５Ａ、Ｖ２８０Ａ、Ｖ２８７Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｓ２９０Ａ、Ａ２９１Ｔ、Ｐ２９３Ａ、Ｖ２９４Ａ、Ｐ２９５Ａ、Ｓ２９６Ａ、Ｄ２９７Ａ、Ｎ２９８Ａ、Ｈ２９９Ａ、Ｒ２５１Ａ＋Ｔ２８９Ａ、Ｒ２５１Ｓ＋Ｔ２８９Ａ＋Ａ２９１Ｔ、Ｓ２９０Ａ＋Ｐ２９３Ａ＋Ｖ２９４Ａ＋Ｐ２９５Ａ＋Ｓ２９６Ａ＋Ｄ２９７Ａ＋Ｎ２９８Ａ＋Ｈ２９９Ａ、Ｒ２２６Ａ＋Ｄ２２７Ａ＋Ｒ２２８Ａ＋Ｌ２２９Ａ＋Ｄ２３０Ａ、Ｅ２３８Ａ＋Ｖ２３９Ａ＋Ｒ２４０Ａ＋Ｋ２４２Ａ、またはＥ２４４ｄｅｌ＋Ｅ２４５ｄｅｌ＋Ｑ２４６ｄｅｌ＋Ａ２４７ｄｅｌ＋Ｑ２４８ｄｅｌ＋Ｑ２４９ｄｅｌ＋Ｉ２５０ｄｅｌ＋Ｒ２５１ｄｅｌ＋Ｌ２５２ｄｅｌ＋Ｑ２５３ｄｅｌ＋Ａ２５４ｄｅｌ。

【0014】

前記単離されたＡｐｏＥコンストラクトのいずれか一つによる一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６－５２、５７－５９、６２と７６中のいずれか一つのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。

【0015】

前記単離されたＡｐｏＥコンストラクトのいずれか一つによる一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトにおけるＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端は、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸残基のアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸と少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。

【0016】

前記単離されたＡｐｏＥコンストラクトのいずれか一つによる一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトにおける前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端またはＣ末端は、さらに膜透過ペプチドを含む。一部の実施形態において、前記膜透過ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５－４５、６３－６５と８４－８６中のいずれか一つのアミノ酸配列を含み（またはそれからなり、または基本的にそれからなり）、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。一部の実施形態において、前記膜透過ペプチド（例えばＣ末端）は、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＮ末端）に、または、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸残基を含むアミノ酸配列（例えばＮ末端）に、または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸と少なくとも約７０％の同一性を有する配列（例えばＮ末端）に、リンカー配列を介して接続される。

【0017】

前記単離されたＡｐｏＥコンストラクトのいずれか一つによる一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトにおける前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端は、さらにシグナルペプチドを含む。一部の実施形態において、前記シグナルペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６－６８に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。

【0018】

もう一つの態様では、本発明は、単離されたＡｐｏＥコンストラクトを提供し、当該単離されたＡｐｏＥコンストラクトは、エレメント（１）：膜透過ペプチド、及び、エレメント（２）：ＡｐｏＥ２の全長配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３の全長配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）または少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基を含むフラグメントを含む；ただし、前記エレメント（１）とエレメント（２）の間に、ペプチド結合を介して直接に接続し、またはリンカー配列を介して接続する。一部の実施形態において、前記膜透過ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５－４５、６３－６５と８４－８６中のいずれか一つのアミノ酸配列から選ばれ、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列である。一部の実施形態において、エレメント（２）に記載の少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基を含むフラグメントは、本発明に記載のいずれか一つのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基を含むＡｐｏＥポリペプチドから選ばれる。一部の実施の形態において、エレメント（２）に記載の少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基を含むフラグメントのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４と７８中のいずれか一つに示される。一部の実施の形態において、エレメント（２）に記載の少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基を含むフラグメントは、ＡｐｏＥ２のＮ末端ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位アミノ酸残基）、ヒンジ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１６８－２０５位アミノ酸残基）、及びＣ末端少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基を含むフラグメントを含む。一部の実施形態において、前記エレメント（２）は、以下のいずれか一つの配列含む：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－２７４位、１－２７９位、１－２８０位、１－２８１位、１－２８２位、１－２８３位、１－２８４位、１－２８５位、１－２８６位、１－２８７位、１－２８８位、１－２８９位、１－２９０位、１－２９１位、１－２９２位、１－２９３位、１－２９４位、１－２９５位、１－２９６位、１－２９７位、１－２９８位、または１－２９９位アミノ酸残基。

【0019】

本発明は、さらに、以上のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクトのタンパク質部分をコードする単離された核酸とベクター（例えばクローニングベクターまたは発現ベクター）、及び以上のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクトのタンパク質部分を発現する宿主細胞、または当該核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、前記ベクターが、前記単離された核酸の５’末端に、ニューロン特異的プロモーターを有する。一部の実施形態において、前記ニューロン特異的プロモーターが、シナプシンプロモーター、ｔｈｙ－１プロモーターとカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ－αプロモーターから選ばれる。一部の実施形態において、前記ベクターは、組換えＡＡＶまたはｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ発現ベクターである。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ニューロン（例えばヒトニューロン、ヒト以外の霊長類ニューロン、またはげっ歯類ニューロン）である。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＡｐｏＥ２（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）の全長アミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。

【0020】

本発明は、さらに、（ｉ）本明細書のいずれか一つの実施形態に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト、単離された核酸、ベクター、または宿主細胞、及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0021】

本発明は、さらに、個体（例えばヒト）のγセクレターゼの切断活性に関連する疾患を治療または予防する医薬品の調製における本明細書のいずれか一つの実施形態に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト、単離された核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物の応用を提供する。本発明は、さらに、個体（例えばヒト）のγセクレターゼの切断活性に関連する疾患を治療または予防する方法を提供し、当該方法は、前記個体へ有効投与量の本明細書のいずれか一つの実施形態に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト、単離された核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態において、前記医薬品または方法が、γセクレターゼの切断活性を阻害し、そして前記γセクレターゼの切断活性に関連する疾患を治療または予防する。一つまたは複数の実施形態では、前記疾患は、神経変性疾患、腫瘍またはがん、炎症性疾患、及び腎臓疾患から選ばれる。一つまたは複数の実施形態では、前記疾患は、アルツハイマー病およびその関連疾患、アミロイド脳血管疾患、ダウン症候群、加齢に伴うその他の神経変性疾患（前頭側頭型認知症など）、頭頸部がん（例えば頭頸部扁平上皮がんと口腔扁平上皮がん）、乳がん、肝臓がん、膵臓がん（転移性膵臓がんを含む）、卵巣がん、肺がん（例えば非小細胞肺がん、肺腺がんと小細胞肺がん）、神経膠腫（例えば悪性神経膠腫）、線維腫、リンパ腫（例えばＢ細胞リンパ腫）、骨肉腫、胃がん、膀胱がん、喘息（例えばアレルギー性喘息）、肺炎、気道炎症、急性腎障害、明細胞腎細胞がん、腎線維症、閉塞性腎症から選ばれる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１：ＡｐｏＥは、そのＣ末端フラグメント（ＡｐｏＥ ＣＴ）によって、ＡＰＰのアミロイド代謝を弱化し、その非アミロイド代謝物（α－ＣＴＦ）を増加する。パネルＡとＢ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ３の過剰発現は、非アミロイド代謝経路（α切断）によって共発現されたＡＰＰから産生されるα－ＣＴＦを大幅に増加することができるが、ＡｐｏＥ４が増加することができない。統計結果は、パネルＢに示し、Ｎ＝８、ｐａｉｒｅｄあるいはｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔである。パネルＣ：一過性トランスフェクションによる過剰発現ＡｐｏＥ２は、共発現されたＡＰＰから生成される総Ａβ４０を減少させ、Ｎ＝８、ｐａｉｒｅｄあるいはｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔである。パネルＤとＥ：免疫ブロット実験が、ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現は、共発現されたＡＰＰから生成されるα－ＣＴＦを増加するが、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ４のＮ末端フラグメント（ＡｐｏＥ２ ＮＴ、ＡｐｏＥ４ ＮＴ）の過剰発現は、α－ＣＴＦの産生を変化しないことを表し、統計結果は、パネルＥに示し、Ｎ＝８、ｐａｉｒｅｄあるいはｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔである。パネルＦとＧ：ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現が、ＡＰＰから生成されるＡβ４０とＡβ４２を低下するが、ＡｐｏＥ２ ＮＴ、ＡｐｏＥ３ ＮＴあるいはＡｐｏＥ４ ＮＴの過剰発現が、いずれもＡβを変化させなく、Ｎ＝５、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔである。パネルＡ－Ｇ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞。パネルＨ：マウスの大脳皮質と海馬の初代培養ニューロンにおいて、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）発現システムを使用して発現されたＡｐｏＥ ＣＴは、ニューロンにおけるＡβ４０の内因性産生を減少させることができる。プロモーターは、ｈＳｙｎである。Ｎ＝７、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＩ：レンチウイルスを使用して多能性幹細胞株から誘導されたヒトニューロンで発現されたＡｐｏＥ ＣＴも、ニューロンによって産生される内因性Ａβ４０を減少させることができる。プロモーターは、ｈＳｙｎであり、Ｎ＝５、ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによってタンパク質ＡＰＰ、α－ＣＴＦとＡｐｏＥを検出し、ＥＬＩＳＡによってＡβを検出する。

【図2】図２：培地中のＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴは、細胞におけるＡＰＰの非アミロイド代謝産物を増加させることができない。パネルＡ：免疫ブロット実験によって培地に含まれるＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴタンパク質を検出する。パネルＢとＣ：ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴタンパク質を含む細胞培養培地との共インキュベーションは、細胞におけるＡＰＰから生成されるα－ＣＴＦを変化させなく、統計結果は、パネルＣに示し、Ｎ＝９、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔである。パネルＤ：免疫蛍光実験により、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴタンパク質を含む細胞培地と共インキュベートした後、細胞内で大量のＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴタンパク質が検出されなく、個々の細胞の表面にはごく一部しか付着していないことが示された。リポソームを使用して、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトして発現されたＡｐｏＥ ＣＴは、細胞内に大量に存在する。パネルＥ：免疫蛍光実験により、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴタンパク質を含む培地と共インキュベートした後、マウスの初代培養ニューロンでは、大量のＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴ タンパク質が検出されなく、ＡｐｏＥのごく一部だけが、個々のニューロンの表面に付着することが示された。レンチウイルスによって発現させたＡｐｏＥ ＣＴは、ニューロン中に大量に存在する。ＭＡＰ２でニューロンをラベルし、ＤＡＰＩで核をラベルする。

【図3】図３：ＡｐｏＥ ＣＴが、Ａβのコア配列を減少させる。パネルＡ、ＢとＣ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるＡＰＰによるＡβ産生に対する、異なるＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体の過剰発現の影響。パネルＡ：ＣＴ ＮＡ１／２／３／４／／５：ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端に、ＡｐｏＥに元々存在する１、２、３、４または５個のアミノ酸残基を挿入する。ＣＴ ＮＤ３／４：ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端から３または４個のアミノ酸残基を削除する。ＣＴ ＣＤ５／１０：ＡｐｏＥ ＣＴのＣ末端から５または１０個のアミノ酸残基を削除する。ＥＬＩＳＡによって、Ａβ４０に対する異なるＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体の影響を測定した。パネルＢ：ＣＴ ＮＤ１／２／／５：ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端から１、２または５個のアミノ酸残基を削除する。ＥＬＩＳＡによって、Ａβ４０に対する異なるＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体の影響を測定した。パネルＣ：ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１０／１１／１２／１３／１４／１５／２０／２５：ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端から３個のアミノ酸残基を削除するとともに、Ｃ末端から１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０または２５個のアミノ酸を削除する。ＥＬＩＳＡによって、Ａβ４０に対する異なるＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体の影響を測定した。Ｎ＝５（パネルＡとＢ）または７（パネルＣ）、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。

【図4】図４：ＡｐｏＥ ＣＴがＡＰＰセクレターゼの発現量を変えない。パネルＡ：ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＰ代謝酵素ｍＲＮＡの発現に影響を与えない。パネルＢ：ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＰ代謝酵素ｍＲＮＡのタンパク質発現量に影響を与えない。ＡＤＡＭ１０：ＡＰＰのαセクレターゼ；ＢＡＣＥ１：ＡＰＰのβセクレターゼ；ＰＳ１とＰＳ２：γセクレターゼのコア活性サブユニットタンパク質。ｑＲＴ－ＰＣＲとＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔを使用して、それぞれにｍＲＮＡとタンパク質のレベルを検出した。ＧＦＰを発現する細胞は、陰性コントロールである。Ｎ＝９、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。

【図5】図５：ＡｐｏＥ ＣＴは、ＡＰＰ切断に対するγ－セクレターゼ阻害剤の効果をシミュレートし、β－ＣＴＦのγ切断を阻害する。パネルＡとＢ：γセクレターゼ活性中心タンパク質ＰＳ１の過剰発現が、α－ＣＴＦの産生を低下することができるが、ＡｐｏＥ ＣＴの発現あるいは１μＭ ＰＦ０３０８４０１４（γセクレターゼ阻害剤）での処理は、どちらもα－ＣＴＦの産生を増加する。統計結果は、パネルＢに示し、Ｎ＝１１、ｐａｉｒｅｄあるいはｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔである。パネルＣとＤ：ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現が、β－ＣＴＦが産生するＡβ４０（Ｎ＝４）とＡβ４２（Ｎ＝６）を阻害することができ、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＥ：ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現が、ＡＰＰ_{ΔＡＩＣＤ}のβ切断によって生成されるＡβ４０に影響を与えない。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔでタンパク質を検出し、ＥＬＩＳＡでＡβを検出する。

【図6】図６：ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＰの切断の必要とするγセクレターゼの存在に影響を与える。パネルＡとＤ：γセクレターゼ活性中心タンパク質ＰＳ１とＰＳ２がノックアウトされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞では（ＰＳ１／２ ｄＫＯ）、α－ＣＴＦが大量に増加し、この場合、ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現が、α－ＣＴＦをさらに増加させなく、統計結果は、パネルＤ（ＧＦＰ１を付いた二つの柱）に示される。パネルＢ、ＣとＤ：ＰＳ１あるいはＰＳ２の発現を補充したＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞では、ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現が、もう一度α－ＣＴＦを増加し、統計結果は、パネルＤに示され、Ｎ＝８、ｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＥ：ＰＳ２の発現を補充したＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞では、ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現は、ＡＰＰから産生するＡβ４０を低減し、Ｎ＝４、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔでタンパク質を検出し、ＥＬＩＳＡでＡβ４０を検出する。

【図7】図７：体外で精製されたＡｐｏＥ２が、濃度依存の方式でＡＰＰのγ切断を直接に阻害する。パネルＡ：免疫ブロットでは、単離精製されたβ－ＣＴＦ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ２ ＮＴ、ＰＳ１、ＮＣＴ、ＰＥＮ２とＧＦＰを示す。パネルＢ：精製システムでは、γセクレターゼがβ－ＣＴＦを切断して、Ａβ４０を産生する反応は、１０μＭ ＰＦ０３０８４０１４（γセクレターゼ阻害剤）に阻害され、Ｎ＝３、ｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔｓ。パネルＣ：精製されたＡｐｏＥ２が、投与量依存の方式で、γセクレターゼによるβ－ＣＴＦの切断を阻害し、Ａβ４０の産生を低減する。ＡｐｏＥ２の半数阻害濃度は、約１．２μＭであり、Ｎ＝３。パネルＤ：精製されたＡｐｏＥ２は、β－ＣＴＦのγ切断によって生成されるＡβ４０を阻害できるが、ＡｐｏＥ２ ＮＴは、γセクレターゼによるβ－ＣＴＦの切断を阻害できなく、Ｎ＝３、ｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔｓ。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔでタンパク質を検出し、ＥＬＩＳＡでＡβ４０を検出する。

【図8】図８：ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＬＰ１のγ切断を阻害しない。１μＭ ＰＦ０３０８４０１４（γセクレターゼ阻害剤）が、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において外因的に発現されたＡＰＬＰ１のγ切断を阻害し、ＡＰＬＰ１のα切断により産生されたα－ｌｉｋｅ ＣＴＦを増多する；しかし、ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＬＰ１により産生されたα－ｌｉｋｅ ＣＴＦを増多しない。

【図9】図９：ニューロンにおけるＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現が、５ｘＦＡＤマウスモデルの脳のアミロイド斑を低減する。パネルＡ：５ｘＦＡＤマウスモデルｓｕｂｉｃｕｌｕｍ領域アミロイド斑（ＴＨＳのマーク）とＡｐｏＥ ＣＴあるいはＧＦＰの共染色の代表的な画像。５ｘＦＡＤマウスでは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現システムを使用し、ニューロンにＡｐｏＥ ＣＴを発現し（１ヶ月齢で注射、７ヶ月齢で解析）、ＧＦＰをコントロールとし、プロモーターはｈＳｙｎ（ヒトシナプシン、ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ）である。ポリペプチドをコードする核酸配列の前には、シグナルペプチドをコードする配列が存在する。統計結果は、パネルＢ、Ｃ、ＤとＥに示される。パネルＢ：ＡｐｏＥ ＣＴを発現するマウスのｓｕｂｉｃｕｌｕｍ領域には、アミロイド斑（ｐｌａｑｕｅ）あたりの平均面積はより小さく（パネルＢ）、平均蛍光強度はより弱く（パネルＣ）、総面積に占める割合はより少なく（パネルＤ）、斑の密度もより低い（パネルＥ）。ＴＨＳで、アミロイド斑をマークする。Ｎ＝３３、ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ。

【図10】図１０：ニューロンに発現されたＡｐｏＥ２は、マウスニューロンに内因的に産生されたＡβ４０を阻害する。パネルＡ：マウスの初代培養ニューロンに、レンチウイルス発現システム（ｌｅｎｔｉ－ｖｉｒｕｓ）によって発現されたＡｐｏＥ２は、マウスニューロン（ｍｏｕｓｅ ｎｅｕｒｏｎｓ）に産生された内因的なＡβ４０を低下し、ＧＦＰをコントロールとする。Ｎ＝７、ｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＢ：野生型マウス（ＷＴ ｍｏｕｓｅ）の脳に、ＡＡＶによって発現されたＡｐｏＥ２が、マウス脳中の内因的なＡβ４０を低下し、ＧＦＰをコントロールとする。Ｎ＝５、ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ。ｈｓｙｎプロモーターを使用し、ニューロン特異的な発現を確保する。ＥＬＩＳＡでＡβを検出する。

【図11】図１１：両端にタグタンパク質を挿入したＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴが、依然としてＡＰＰ切断を制御する活性を有する。パネルＡとＢ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、タグタンパク質Ｖ５を含有するＡｐｏＥ２－Ｖ５（Ｃ末端にタグタンパク質を挿入する）の過剰発現とＶ５－ＡｐｏＥ２（Ｎ末端にタグタンパク質を挿入する）は、どちらも著しくＡＰＰから産生されたα－ＣＴＦを増加する。統計結果は、パネルＢに示される。Ｎ＝６、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＣとＤ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、タグタンパク質Ｖ５をＡｐｏＥ ＣＴのＣ末端あるいはＮ末端に挿入したＡｐｏＥ ＣＴ－Ｖ５とＶ５－ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現は、どちらもＡＰＰから産生されたα－ＣＴＦを著しく増加し、統計結果は、パネルＤに示される。Ｎ＝６、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌｏｔでＡＰＰ及びその切断フラグメントを検出する。

【図12】図１２：ＡｐｏＥ ＣＴの突然変異は、依然としＡＰＰの切断を制御することができる。パネルＡとＢ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるＡｐｏＥ ＣＴ、ＡｐｏＥ ＣＴの単一または二重部位の突然変異としてのＣＴ Ａ２０、ＣＴ Ａ４０、ＣＴ Ａ６０、ＣＴ Ａ６５、ＣＴ Ａ７２、ＣＴ Ａ８０とＣＴ Ａ３６／７４の過剰発現は、どちらもα－ＣＴＦを著しく増加する。統計結果は、パネルＢに示される。Ｎ＝６、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＣとＤ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における多重部位突然変異としてのＣＴ Ｒ１０、ＣＴ ＬＦ５とＣＴ ＬＭ５の過剰発現は、ＡｐｏＥ ＣＴと同様に、α－ＣＴＦを著しく増加する；しかしながら、ＣＴ Ｅ５、ＣＴ Ｅ１０、ＣＴ Ｅ２０とＣＴ Ｆ５は、α－ＣＴＦの活性を増加する機能を失う。統計結果は、パネルＤに示される。Ｎ＝４、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔでタンパク質を検出する。

【図13】図１３：ＡｐｏＥ２内にアミノ酸配列を挿入あるいは削除しても、ＡｐｏＥ２は、依然としてＡＰＰの代謝を制御することができる。パネルＡ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にＡＰＰと共発現するＡｐｏＥ２－Ｍ３Ｆは、α－ＣＴＦを増加する。パネルＢ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にＡＰＰと共発現するＡｐｏＥ２ ＭＤ１０は、α－ＣＴＦを増加する。

【図14】図１４：非ヒト由来のＡｐｏＥ ＣＴも、ＡＰＰの切断を制御する。パネルＡとＢ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、ヒト由来のＡｐｏＥ ＣＴ配列と非常に類似するヒト以外の霊長類由来のＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現は、α－ＣＴＦを著しく増加し、かつ、その活性は、ヒト由来のＡｐｏＥ ＣＴの活性と同じである。統計結果は、パネルＢに示される。Ｎ＝６、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔでタンパク質を検出する。ヒト由来とサル由来のＡｐｏＥ ＣＴ配列のアライメントは、パネルＣに示される。

【図15】図１５：膜透過ペプチドに接続するＡｐｏＥは、依然として、ＡＰＰ切断を制御する活性を有する。パネルＡとＢ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、ＡＰＰが、Ｒ９－ＡｐｏＥ２、ＦＧＦ４－ＡｐｏＥ２あるいはＲＤＰ－ＡｐｏＥ２と共発現し、ＧＦＰを陰性コントロールグループとする。Ｒ９－ＡｐｏＥ２とＲＤＰ－ＡｐｏＥ２の共発現は、α－ＣＴＦを著しく増加する。統計結果は、パネルＢに示される。Ｎ＝５、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔでタンパク質を検出する。

【図16】図１６：細胞に発現するＡｐｏＥ ＣＴは、ＡＰＰ切断を制御する活性を持つために、シグナルペプチドに接続する必要がある。パネルＡとＢ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、Ｎ末端にアポリポタンパク質Ａ１シグナルペプチドと接続するＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体（ＡＳＰ ＣＴ）とアポリポタンパク質Ｊシグナルペプチドを含有するＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体（ＪＳＰ ＣＴ）の過剰発現は、依然として、α－ＣＴＦを著しく増加する。細胞にシグナルペプチドに接続しないＮＳＰ ＣＴの発現は、ＡＰＰの切断を制御してα－ＣＴＦを増加することができない。統計結果は、パネルＢに示される。Ｎ＝６、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔでタンパク質を検出する。

【図17】図１７：ＡｐｏＥ２は、そのＣ末端領域によって、α－ＣＴＦを増加し、Ａβの産生を低減する。パネルＡ：ヒト（上）またはサル（下）皮質にＡｐｏＥとＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）の共免疫蛍光染色の代表的な画像。矢印は、ＡｐｏＥ陽性ニューロンを表す。パネルＢ：ヒトの脳皮質にＡｐｏＥとＡＰＰの共免疫蛍光染色の代表的な画像。パネルＣとＤ：ＡＰＰが、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４と一過性共発現するＮ２Ａ細胞中の全長ＡＰＰ（ＦＬ－ＡＰＰ）、α－ＣＴＦとＡｐｏＥシグナルのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、及び対応する統計解析。Ｎ＝８、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＥ：ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１が、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４と一過性共発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中のＡβ４０の正規化統計解析。Ｎ＝８、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＦとＧ：ＡＰＰが、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ ＣＴ、ＡｐｏＥ２ ＮＴまたはＡｐｏＥ４ ＮＴと一過性共発現するＮ２Ａ細胞中の全長ＡＰＰ（ＦＬ－ＡＰＰ）、α－ＣＴＦとＡｐｏＥシグナルのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、及び対応する統計解析。Ｎ＝８、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＨ：ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１が、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ ＣＴと一過性共発現するＮ２Ａ細胞中のＡβ４０の正規化統計解析。Ｎ＝４、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＩとＪ：ＡＰＰが、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴと一過性共発現するＮ２Ａ細胞中の全長ＡＰＰ（ＦＬ－ＡＰＰ）、α－ＣＴＦとＡｐｏＥシグナルのＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、及び対応する統計解析。Ｎ＝６、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＫ：レンチウイルスシステムを使用してＧＦＰあるいはＡｐｏＥ ＣＴを一過性発現するマウス皮質（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ）あるいは（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ）ニューロン中のＡβ４０正規化統計解析。プロモーターは、ｈＳｙｎである。Ｎ＝７、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＬ：レンチウイルスシステムを使用してＧＦＰあるいはＡｐｏＥ ＣＴを一過性発現するヒト由来多能干細胞に誘導されるニューロン（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ）中のＡβ４０正規化統計解析。プロモーターは、ｈＳｙｎである。Ｎ＝５、ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ。

【図18】図１８：ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＰ及びγセクレターゼと相互作用する。パネルＡ：ＡＰＰ－ＦＬＡＧが、ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２あるいはＡｐｏＥ ＣＴと一過性共発現するＮ２Ａ細胞にＡｐｏＥとＡＰＰの免疫蛍光染色の代表的な画像。パネルＢ：ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２－Ｖ５あるいはＡｐｏＥ ＣＴ－Ｖ５を一過性発現する初代培養ニューロンにＡｐｏＥと内因的に発現されたＡＰＰの免疫蛍光染色の代表的な画像。パネルＣ：ＡｐｏＥ ＣＴ－Ｖ５を一過性発現するヒト由来多能干細胞に誘導されるニューロンにＡｐｏＥ ＣＴと内因的に発現されたＡＰＰの免疫蛍光染色の代表的な画像。ＭＡＰ２染色で、ニューロンを表し、ＤＡＰＩ染色で細胞核を表す。パネルＤ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で共発現されたＡＰＰ－ＡＰＥＸ２ラベルされたＡｐｏＥ２を検出する。パネルＥ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で共発現されたＡＰＰ－ＡＰＥＸ２ラベルされたＡｐｏＥ ＣＴを検出する。パネルＦ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で共発現されたＡｐｏＥ２－ＡＰＥＸ２ラベルされたＡＰＰを検出する。パネルＧ：免疫ブロットで、マウスニューロン細胞で発現されたＡｐｏＥ－ＡＰＥＸ２ラベルされたニューロン中に内因的に発現されたＡＰＰと陰性コントロールＣＯＸ２。パネルＨ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で、それぞれにＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＰＳ１あるいはＰＳ２と一過性共発現したＡｐｏＥ２－ＡＰＥＸ２ラベルされたＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＰＳ１とＰＳ２を検出する。パネルＩ：免疫共沈降で、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で、それぞれに、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ２ ＮＴあるいはＡｐｏＥ ＣＴと一過性共発現したβ－ＣＴＦ－ＦＬＡＧ相互作用のＡｐｏＥを検出する。パネルＪ：免疫共沈降で、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で、それぞれに、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ２ ＮＴあるいはＡｐｏＥ ＣＴと一過性共発現したγセクレターゼ（ＨＡ－ＡＰＨ、Ｖ５－ＮＣＴ、ＦＬＡＧ－ＰＥＮ２）相互作用のＡｐｏＥを検出する。パネルＫ：免疫共沈降で、ヒトの脳組織中の内因的なγセクレターゼ（ＮＣＴ、ＰＳ１、ＰＳ２ とＰＥＮ２）と内因的なＡｐｏＥの相互作用を検出する。

【図19】図１９：ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＰのγ切断を阻害することで、α－ＣＴＦを増加し、Ａβを低減する。パネルＡとＢ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で、下記のものの発現あるいは医薬品による処理の条件下で、ＡＰＰからα－ＣＴＦを産生する状況を検出・統計解析した：ＡＰＰとＧＦＰの一過性発現（バンド１）；ＡＰＰとＰＳ１の共発現の場合、１マイクロモルのγセクレターゼ阻害剤ＰＦ０３０８４０１４での処理が有る／無い（バンド２、バンド３）；ＡＰＰ、ＰＳ１とＡｐｏＥ ＣＴの共発現（バンド４）。Ｎ＝１１。パネルＣとＤ、免疫ブロットで、１マイクロモルのγセクレターゼ阻害剤であるＰＦ０３０８４０１４で処理した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＰＰ共発現によるα－ＣＴＦ生成に対するＧＦＰまたはＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出・統計解析し、コントロールグループでは、阻害剤での処理を行わなかった。Ｎ＝７。パネルＥ：ＥＬＩＳＡで、それぞれにβ－ＣＴＦとＧＦＰまたはＡｐｏＥ ＣＴを一過性共発現したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に産生されたＡβ４０を検出した。Ｎ＝４。パネルＦ：ＥＬＩＳＡで、それぞれにβ－ＣＴＦとＧＦＰまたはＡｐｏＥ ＣＴを一過性共発現したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に産生されたＡβ４０を検出した。Ｎ＝６。パネルＧとパネルＨ：ＥＬＩＳＡでＡＰＰ_{ΔＡＩＣＤ}とＧＦＰあるいはＡｐｏＥ ＣＴが、それぞれに共発現されたＨＥＫ ２９３Ｔに産生されたＡβ４０を検出した結果を示す。パネルＧ、細胞培地。パネルＨ、細胞溶解液。パネルＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧとＨ、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。

【図20】図２０：ＡｐｏＥ ＣＴがＡＰＰ代謝を制御するにはγセクレターゼが必要である。パネルＡ：免疫ブロットで、野生型（ＷＴ）、ＰＳ１あるいはＰＳ２シングルノックアウト（ＰＳ１ ＫＯ、ＰＳ２ ＫＯ）、ＰＳ１とＰＳ２ダブルノックアウト（ＰＳ１／２ ｄＫＯ）のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系におけるＰＳ１とＰＳ２のタンパク質発現を検出した。パネルＢ：野生型ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系におけるＡＰＰの発現（バンド１）；ＰＳ１シングルノックアウトＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系におけるＡＰＰの発現（バンド２）；１マイクロモルのγセクレターゼ阻害剤ＰＦ０３０８４０１４で処理されたＰＳ１シングルノックアウトＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系におけるＡＰＰの発現（バンド３）；ＰＳ１シングルノックアウトＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系におけるＡＰＰとＰＳ１の共発現（バンド４）。免疫ブロットで、異なる条件での細胞のα－ＣＴＦの含量を検出した。パネルＣとＤ：それぞれに野生型（ＷＴ）とＰＳ１シングルノックアウト（ＰＳ１ ＫＯ）のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系中に、免疫ブロットで、共発現ＡＰＰの切断により産生されたα－ＣＴＦに対するＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出と統計解析し、ＧＦＰをコントロールとした。Ｎ＝９。パネルＥとＦ：それぞれに野生型とＰＳ２シングルノックアウト（ＰＳ２ ＫＯ）のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系中に、免疫ブロットで、共発現ＡＰＰの切断により産生されたα－ＣＴＦに対するＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出と統計解析し、ＧＦＰをコントロールとした。Ｎ＝９。パネルＧとＪ：それぞれに野生型（ＷＴ）とＰＳ１とＰＳ２ダブルノックアウト（ＰＳ１／２ ｄＫＯ）のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系中に、免疫ブロットで、ＡＰＰ共発現によるα－ＣＴＦ産生に対するＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出と統計解析し、ＧＦＰをコントロールとした。Ｎ＝８。パネルＨとＪ：免疫ブロットでＰＳ１とＰＳ２ダブルノックアウト（ＰＳ１／２ ｄＫＯ）ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中でそれぞれにＡＰＰ、ＰＳ１とＧＦＰあるいはＡｐｏＥ ＣＴを共発現させたことによって産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝８。パネルＩとＪ：免疫ブロットでＰＳ１とＰＳ２ダブルノックアウト（ＰＳ１／２ ｄＫＯ）ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中でそれぞれにＡＰＰ、ＰＳ２とＧＦＰあるいはＡｐｏＥ ＣＴを共発現させたことによって産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝８。パネルＫとＬ：免疫ブロットでＰＳ１とＰＳ２ダブルノックアウト（ＰＳ１／２ ｄＫＯ）ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中でそれぞれにＡＰＰとＧＦＰあるいはＡｐｏＥ２を共発現させたことによって産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝９。パネルＭ：ＥＬＩＳＡでＰＳ１とＰＳ２ダブルノックアウト（ＰＳ１／２ ｄＫＯ）ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中でそれぞれにβ－ＣＴＦ、ＰＳ２とＧＦＰあるいはＡｐｏＥ ＣＴを共発現させたことによって産生されたＡβ４０を検出した。Ｎ＝４。パネルＤ、Ｆ、Ｊ、ＬとＭ、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。

【図21】図２１：マウスのニューロンで内因性ＡｐｏＥのノックダウンが、ＡＰＰの代謝産物であるＣＴＦ_１４ｋＤのレベルの低下とＡβの上昇を引き起こした。パネルＡ：免疫ブロットで、レンチウイルス発現システムによってｓｈＳｃｒａｍｂｌｅ（陰性コントロール）、ｓｈＡｐｏＥ＿１（ＡｐｏＥのｓｈＲＮＡ＿１）またはｓｈＡｐｏＥ＿２（ＡｐｏＥのｓｈＲＮＡ＿２）を一過性発現した初代培養マウスのニューロン中の内因的に発現されたＡｐｏＥを検出した。パネルＢ：１マイクロモルのγセクレターゼ阻害剤ＰＦ０３０８４０１４で処理した場合、マウスのニューロン中のＡＰＰの代謝物であるＣＴＦ_１４ｋＤの相対含有量。パネルＣとＤ：免疫ブロットでレンチウイルス発現システムによってｓｈＳｃｒａｍｂｌｅ、ｓｈＡｐｏＥ＿１または ｓｈＡｐｏＥ＿２を一過性発現した初代培養マウスのニューロン中に内因的に発現されたＡＰＰの代謝物であるＣＴＦ_１４ｋＤの相対含有量を検出と統計解析した。Ｎ＝５、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。パネルＥ：１マイクロモルのγセクレターゼ阻害剤ＰＦ０３０８４０１４で処理した場合、免疫ブロットでレンチウイルス発現システムによってｓｈＳｃｒａｍｂｌｅ、ｓｈＡｐｏＥ＿１またはｓｈＡｐｏＥ＿２を一過性発現した初代培養マウスのニューロン中に内因的に発現されたＡＰＰの代謝物であるＣＴＦ_１４ｋＤの相対含有量を検出した。パネルＦ：ＥＬＩＳＡでレンチウイルス発現システムによってｓｈＳｃｒａｍｂｌｅ、ｓｈＡｐｏＥ＿１またはｓｈＡｐｏＥ＿２を一過性発現した初代培養マウスのニューロン中に内因的に発現されたＡＰＰに産生されたＡβ４０を解析した。Ｎ＝５、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。

【図22】図２２：ＡｐｏＥ２は、ＡＰＰのγ切断を直接阻害する。パネルＡ：免疫ブロットでは、発現され、精製されたβ－ＣＴＦ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ２ ＮＴ、ＰＳ１、ＮＣＴ、ＰＥＮ２とＧＦＰを解析した。パネルＢ：ＥＬＩＳＡで三つの異なる条件で産生されたＡβレベルを検出と統計解析した：精製されたβ－ＣＴＦ、精製されたβ－ＣＴＦとγセクレターゼ共インキュベーション、及び、１マイクロモルのγセクレターゼ阻害剤ＰＦ０３０８４０１４で処理した場合に精製されたβ－ＣＴＦとγセクレターゼ共インキュベーション。Ｎ＝３、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ。パネルＣ：ＥＬＩＳＡで精製されたβ－ＣＴＦと一連の濃度勾配のＡｐｏＥ２との共インキュベーションで産生されたＡβを検出と統計解析した。ＩＣ_５０は、約１．２±０．４８マイクロモルである。パネルＤ：ＥＬＩＳＡで、精製されたβ－ＣＴＦが、それぞれに２．５マイクロモルの精製されたＧＦＰ、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ２ ＮＴとの共インキュベーションで産生されたＡβを検出と統計解析した。Ｎ＝３、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ。

【図23】図２３：ニューロンで発現されたＡｐｏＥ ＣＴは、アミロイド斑に移動し、かつ５×ＦＡＤマウスの脳におけるアミロイド斑形成を遅延した。パネルＡ：実験モデル図。パネルＢ：５×ＦＡＤマウスで１０週間発現されたマウスの脳ニューロンにおけるアデノ随伴ウイルスＧＦＰまたはＡｐｏＥ ＣＴとアミロイド斑（ｐｌａｑｕｅ）の免疫蛍光染色の代表的な画像を示す。パネルＣ：アミロイド斑の平均大きさを統計解析した。パネルＤ：アミロイド斑の総面積がｓｕｂｉｃｕｌｕｍ領域に占めす割合を統計解析した。パネルＥ：アミロイド斑の密度を統計解析した。Ｎ＝２１。

【図24】図２４：５×ＦＡＤマウスのニューロンで発現されたＡｐｏＥは、ＣＴを介してアミロイド斑の周囲に凝集した。パネルＡ：５×ＦＡＤマウスの皮質ニューロンで３ヶ月間発現されたレンチウイルスＡｐｏＥ２－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ＡｐｏＥ２ ＮＴ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰとＡｐｏＥ ＣＴ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰおよびアミロイド斑（ＧＦＰ）の免疫蛍光染色の代表的な画像を示す。パネルＢ：５×ＦＡＤマウス皮質ニューロンで一か月発現されたレンチウイルスＡｐｏＥ ＣＴとヒト由来ＡＰＰ（ｈＡＰＰ）の免疫蛍光染色代表的な画像を示す。パネルＣ：野生型マウス皮質ニューロンで三か月発現されたレンチウイルスＡｐｏＥ ＣＴとｈＡＰＰの免疫蛍光染色代表的な画像を示す。Ｐｌａｑｕｅ、アミロイド斑。

【図25】図２５：ヒトのニューロンに内因的なＡｐｏＥが存在する；ＡＤ患者の脳中のアミロイド斑はＡｐｏＥと共局在する。パネルＡ：非ＡＤ患者（６２歳、最上部）あるいはＡＤ患者（８６歳、最下部）皮質にＡｐｏＥとＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）の共免疫蛍光染色の代表的な画像を示す。矢印は、ＡｐｏＥ陽性ニューロンを表す。パネルＢ：ヒト大脳皮質における全ニューロンに対するＡｐｏＥ陽性ニューロンの割合。パネルＣ：全ＡｐｏＥ陽性細胞に対するＡｐｏＥ陽性ニューロンの割合。若年（ＹＯＵＮＧ）：１６～２３歳、ｎ＝３；老年（ＯＬＤ）：６０歳以上、ｎ＝３；ＡＤ：６０歳以上、ｎ＝６。パネルＤ：ヒト大脳皮質におけるＡｐｏＥとＧＦＡＰ（アストロサイトマーカー）の共免疫蛍光染色の代表的画像。パネルＥ：非ＡＤ患者（６２歳、最上部）あるいはＡＤ患者（８６歳、最下部）皮質にＡｐｏＥとアミロイド斑（６Ｅ１０）の共免疫蛍光染色の代表的な画像を示す。

【図26】図２６：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、ＡｐｏＥ２は、ＡｐｏＥ ＣＴを介してα－ＣＴＦを増加させ、Ａβを減少させる。パネルＡ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにＡＰＰとＧＦＰあるいはＡＤＡＭ１０を共発現し、産生されたα－ＣＴＦを検出した。パネルＢ：免疫ブロットで、１マイクロモルのＡＤＡＭ１０の阻害剤ＧＩ２５４０２３Ｘで処理したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に産生されたα－ＣＴＦを検出し、コントロールには、ＧＩ２５４０２３Ｘで処理しなかった。パネルＣとＤ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにＡＰＰとＧＦＰ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４を共発現し、産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝１２。パネルＥとＦ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにＡＰＰとＧＦＰ、ＡｐｏＥ２ ＮＴ、ＡｐｏＥ３ ＮＴ又はＡｐｏＥ４ ＮＴを共発現し、産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝１２。パネルＧとＨ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにＡＰＰとＧＦＰ又はＡｐｏＥ ＣＴを共発現し、産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝１８。パネルＩ：ＥＬＩＳＡで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてそれぞれにＡＰＰ、ＢＡＣＥ１とＧＦＰ、ＡｐｏＥ ＣＴ、ＡｐｏＥ２ ＮＴ、ＡｐｏＥ３ ＮＴまたはＡｐｏＥ４ ＮＴの共発現で産生されて培地に分泌されたＡβ４０を検出と統計解析した。Ｎ＝４。パネルＪ：ＥＬＩＳＡで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてそれぞれにＡＰＰ、ＢＡＣＥ１とＧＦＰまたはＡｐｏＥ ＣＴの共発現で産生された細胞溶解液中のＡβ４０を検出した。Ｎ＝５。パネルＫ：ＥＬＩＳＡで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてそれぞれにＡＰＰ、ＢＡＣＥ１とＧＦＰまたはＡｐｏＥ ＣＴの共発現で産生されたＡβ４２和Ａβ４２／Ａβ４０を検出した。Ｎ＝６。パネルＬとＭ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにＡＰＰ、ＢＡＣＥ１と、ＧＦＰまたはＡｐｏＥ ＣＴとの共発現に産生されたβ－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝１３。パネルＮとＯ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにＡＰＰとＧＦＰ、ＡｐｏＥ ２又はＡｐｏＥ ＣＴを共発現し、産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝６。パネルＰとＱ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにマウスＡＰＰ（ｍＡＰＰ）とＧＦＰ又はＡｐｏＥ ＣＴを共発現し、産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝６。パネルＲとＳ：ＥＬＩＳＡで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてそれぞれにＡＰＰＳＷとＧＦＰあるいはＡｐｏＥ ＣＴの共発現で産生されたＡβ４０を検出と統計した；パネルＲ、培地中のＡβ４０；パネルＳ、細胞溶解液中のＡβ４０。Ｎ＝６。パネルＴとＵ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにＡＰＰとＧＦＰ又はＡｐｏＥＡ１を共発現し、産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝６。パネルＩ：ＥＬＩＳＡで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれに、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１とＧＦＰまたはＡｐｏＡ１の共発現で産生させたＡβ４０を検出と統計解析した。Ｎ＝３。面板Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、Ｏ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＵとＶ，ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔ。

【図27】図２７：培地中のＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＰの代謝を変えない。パネルＡ：免疫ブロットで、細胞培地中のＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴを検出した。パネルＢとＣ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において共発現させたＡＰＰからのα－ＣＴＦの産生に対する培地中のＧＦＰ、ＡｐｏＥ２あるいはＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出と統計解析した。Ｎ＝９。パネルＤ：免疫ブロットで、異なる条件で、培地中のＡｐｏＥ２を検出した。元々のＡｐｏＥ２含有培地（バンド１）、トランスフェクトしていない細胞と４８時間インキュベートした後のＡｐｏＥ２含有培地（バンド２）は、３７℃のインキュベーターに単独に４８時間保存されたＡｐｏＥ２含有培地（バンド３）。パネルＥ：免疫蛍光で、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に取り込ませる培地中のＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴ、及びＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に発現されたＡｐｏＥ ＣＴを検出した。ＤＡＰＩ、細胞核マーカー。パネルＦ：免疫蛍光で、ニューロンに取り込ませる培地中のＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴ、及びニューロンに発現されたＡｐｏＥ ＣＴを検出した。ＭＡＰ２、成熟ニューロンのマーカー；ＤＡＰＩ、細胞核マーカー。パネルＧ：免疫ブロットで、精製されたＡｐｏＥ２と細胞溶解物または細胞培地から由来のＡｐｏＥ２を解析した。

【図28】図２８：ＡＰＰのγ切断部位附近のＡＤに関連する突然変異が、ＡｐｏＥ ＣＴの活性に影響を与える。パネルＡとＢ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにＡＰＰが異なるＡＤ突然変異とＧＦＰ又はＡｐｏＥ ＣＴを共発現し、産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝７、ｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ａｎｄ ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ。

【図29】図２９：αまたはβセクレターゼが阻害される場合、ＡｐｏＥ ＣＴは、依然としてＡＰＰの代謝を制御することができる。パネルＡ：免疫ブロットで、１マイクロモルのＡＤＡＭ１０阻害剤であるＧＩ２５４０２３Ｘで処理した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＰＰ共発現によるα－ＣＴＦ生成に対するＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出・統計解析し、コントロールグループでは、阻害剤での処理を行わなかった。Ｎ＝９。パネルＣとＤ：ＥＬＩＳＡで、免疫ブロットで、１マイクロモルのＡＤＡＭ１０阻害剤であるＧＩ２５４０２３Ｘで処理した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＰＰとＢＡＣＥ１の共発現によるＡβ生成に対するＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出・統計解析し、コントロールグループでは、阻害剤での処理を行わなかった。パネルＣ、細胞培地中のＡβ４０；パネルＤ、細胞溶解液中のＡβ４０。Ｎ＝６。パネルＥとＦ：免疫ブロットで、５マイクロモルのＢＡＣＥ１阻害剤であるＡＺＤ３８３９で処理した場合、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＰＰ共発現によるα－ＣＴＦ生成に対するＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出・統計解析し、コントロールグループでは、阻害剤での処理を行わなかった。Ｎ＝１０。パネルＧとＨ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、それぞれにＡＰＰ_{Ｍ５９６Ｖ}とＧＦＰ又はＡｐｏＥ ＣＴを共発現し、産生されたα－ＣＴＦを検出と統計解析した。Ｎ＝７。パネルＩ：ｑＲＴ－ＰＣＲで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における内因性ＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＰＳ１およびＰＳ２ ｍＲＮＡ発現量に対するＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴの発現の影響を検出と統計解析した。パネルＪ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における内因性ＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＰＳ１およびＰＳ２タンパク質発現量に対するＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出した。パネルＫ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で共発現したＡＰＰの細胞表面発現に対するＡｐｏＥ ＣＴの影響を検出した。ＧＦＰ（－）およびＡｐｏＥ ＣＴ（＋）を発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の細胞表面タンパク質をスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ビオチンで標識し、ストレプトアビジン結合アガロースビーズで分離した。

【図30】図３０：ＡｐｏＥ ＣＴが、ＮＯＣＴＨとＡＰＬＰ１のγ切断を阻害することができない。パネルＡ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、Ｎ１００－Ｖ５しか発現しない（バンド１）；共発現されたＮ１００－Ｖ５とγセクレターゼ（バンド２）；１マイクロモルのγセクレターゼ阻害剤ＰＦ０３０８４０１４で処理して共発現されたＮ１００－Ｖ５とγセクレターゼ（バンド３）；共発現されたＮ１００－Ｖ５、γセクレターゼとＡｐｏＥ ＣＴ（バンド４）。免疫ブロットで、以上の条件で発現された場合のＮ１００－Ｖ５の切断を検出した。パネルＢ：免疫ブロットで、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてＡＰＰ、γセクレターゼとＡｐｏＥ ＣＴを共発現する場合のα－ＣＴＦの含有量を検出した。パネルＣ：ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、ＡＰＬＰ－Ｖ５しか発現しない（バンド１）；１マイクロモルのγセクレターゼ阻害剤ＰＦ０３０８４０１４で処理して発現されたＡＰＬＰ－Ｖ５（バンド２）；ＡＰＬＰ１－Ｖ５とＡｐｏＥ ＣＴの共発現（バンド３）。免疫ブロットで、以上の条件で発現された場合のＡＰＬＰ１－Ｖ５の代謝を検出した。

【図31】図３１：体外で精製されたβ－ＣＴＦ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ２ ＮＴとγセクレターゼ。コーカサスブルーの染色で、精製されたβ－ＣＴＦ－Ｍｙｃ－６×Ｈｉｓ（パネルＡ）、ＡｐｏＥ２－３×ＦＬＡＧ（パネルＢ）、ＡｐｏＥ２ＮＴ－３×ＦＬＡＧ（パネルＣ）、γセクレターゼ（パネルＤ）（ＮＣＴ－Ｖ５－ ６×Ｈｉｓ；ＰＬＡＧ－ＰＥＮ２；ＡＰＨ；全長ＰＳ１、ＦＬ－ＰＳ１；ＰＳ１のＮ末端フラグメント、ＰＳ１ ＮＴＦ；ＰＳ１のＣ末端フラグメント、ＰＳ１ ＣＴＦ）と３×ＦＬＡＧ－ＧＦＰ（パネルＥ）を示した。

【図32】図３２：本例で使用したヒトの脳に関する情報表。

【図33】図３３：ヒトＡｐｏＥタンパク質の構造。Ｎ末端構造ドメイン（残基１－１６７）とＣ末端構造ドメイン（残基２０６－２９９）は、柔軟なヒンジ領域（残基１６８－２０５）によって接続される。三つのサブタイプは、ＡｐｏＥ２（Ｃｙｓ１１２；Ｃｙｓ１５８）、ＡｐｏＥ３（Ｃｙｓ１１２；Ａｒｇ１５８）とＡｐｏＥ４（Ａｒｇ１１２；Ａｒｇ１５８）である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

具体的な実施形態
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下に具体的に記載される技術的特徴（実施例など）を互いに組み合わせて、好ましい技術を形成することができることを理解すべきである。

【0024】

ヒト由来アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、主に、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３とＡｐｏＥ４の三つのサブタイプを含む。ＡｐｏＥは、三つの領域を含む：一つのＮ末端ドメイン（ＡｐｏＥ ＮＴ）、一つのヒンジ領域と一つの保存的なＣ末端ドメイン（ＡｐｏＥ ＣＴ）。三つのＡｐｏＥサブタイプの間の唯一の配列の違いは、それらのＮ末端ドメイン（図３３）にある。例示的なＡｐｏＥ２（ヒト由来ＡｐｏＥ２）のアミノ酸配列は、以下に示される：

【0025】

【表1】

【0026】

例示的なＡｐｏＥ３（ヒト由来ＡｐｏＥ３）のアミノ酸配列は、以下に示される：

【0027】

【表2】

【0028】

本発明は、単離されたＡｐｏＥコンストラクトを提供し、それが、ＡｐｏＥポリペプチドを含む。当該ＡｐｏＥポリペプチドは、ＡｐｏＥタンパク質のＣ末端ドメインの一部の配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸）、または当該配列に基づいて改造された配列を含む。本発明は、発明者による前記のＡｐｏＥコンストラクト（例えば、本発明のＡｐｏＥポリペプチドまたはＡｐｏＥ２）の予期せぬ発見に基づく：（ｉ）それは、ニューロン中（生体内または生体外）でアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＰＰ）の切断を細胞自律的に制御できる；（ｉｉ）それが、γ－セクレターゼの酵素活性、例えば、γ－セクレターゼに仲介されるＡＰＰγ－切断を阻害（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を阻害）することができ、γ－セクレターゼ阻害剤（例えばＰＦ０３０８４０１４）によるＡＰＰ γ－切断阻害効果と類似する；（ｉｉｉ）それが、ＡＰＰのアミロイド代謝を低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低下）することができ、例えば、アミロイドタンパク質 β（Ａβ）（例えばＡβ４０及び／またはＡβ４２）の産生を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）し、またはＣ末端フラグメント β（β－ＣＴＦ）に対するγ－切断を低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低下）することができる；（ｉｖ）それが、ＡＰＰの非アミロイド代謝を向上（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を向上）することができ、例えばＣ末端フラグメント α（α－ＣＴＦ）の産生を増加（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を増加）することができる；（ｖ）それが、α－セクレターゼ、β－セクレターゼ、及び／またはγ－セクレターゼ（またはそのサブユニット）（例えばＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＰＳ１及び／またはＰＳ２）のｍＲＮＡ及び／またはタンパク質発現に影響を与えない（または約 ３０％、２０％、１０％、５％または以下しか影響を与えない）；（ｖｉ）そのが、β－セクレターゼに仲介されるＡＰＰ β－切断、及び／またはα－セクレターゼに仲介されるＡＰＰ α－切断に影響を与えない（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか影響を与えない）；（ｖｉｉ）それが、非ＡＰＰタンパク質（例えばＡＰＬＰ１（ＡＰＰ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）またはＮｏｔｃｈ）またはそのフラグメントに対するγ－切断を阻害しなく（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか阻害しなく）、非ＡＰＰタンパク質のγ－切断によって産生されるα－ＣＴＦを増加しなく（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか増加しなく）、これは、ＡｐｏＥコンストラクトが基質特異性でγ－切断を阻害するのに対し、γ－セクレターゼ阻害剤はこの基質特異性を持たないことを示す；（ｖｉｉｉ）前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＡＤモデルマウス脳中のアミロイド斑を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）することができ、例えばアミロイド斑の平均斑の大きさ、総面積、及び／または密度を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）し、ニューロン内のＡβ（例えばＡβ４０及び／またはＡβ４２）の産生を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）し、マウスのＡＤ病理学的プロセスを低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低下）し、ＡＤマウス生存率及び／または寿命を向上（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を向上）することができる；（ｉｘ）前記ＡｐｏＥコンストラクトのＮ末端及び／またはＣ末端に挿入されたタグタンパク質（例えば精製タグまたは検出タグ）、及びいくつかの前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えばＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３）の内部におけるアミノ酸残基（例えばＡｐｏＥ２－Ｍ３ＦまたはＡｐｏＥ２ ＭＤ１０）の挿入または削除は、当該ＡｐｏＥコンストラクトによるγ－セクレターゼ酵素活性の阻害、例えばγ－セクレターゼに仲介されるＡＰＰ γ－切断に対する阻害に影響を与えない（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか影響を与えない）；（ｘ）前記ＡｐｏＥコンストラクトのＮ末端またはＣ末端に膜透過ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）の挿入が、前記ＡｐｏＥコンストラクトによるγ－セクレターゼ酵素活性を阻害する効果（例えば前記一つまたは複数の効果）を向上（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を向上）することができる；（ｘｉ）細胞では、γセクレターゼによるＡＰＰの切断を制御するために、前記ＡｐｏＥコンストラクトのＮ末端にシグナルペプチドがある必要があるが、シグナルペプチドの由来について、厳密な要件はない；（ｘｉｉ）本発明に記載されるいくつかのＡｐｏＥコンストラクト（例えばＡｐｏＥ ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３））は、γ－セクレターゼに仲介されるＡＰＰγ－切断の阻害において、ＡｐｏＥ２（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）及び／またはＡｐｏＥ３（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）の全長タンパク質よりも高い（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上高い）活性さえ有する；（ｘｉｉｉ）前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＡＰＰバリアントを発現する複数の細胞（たとえば、病原性スウェーデンＡＰＰ突然変異体（ＡＰＰ_ＳＷ）、保護的アイスランドＡＰＰ突然変異（Ａ６７３Ｔ）、ＡＰＰＭ５９６Ｖ、またはβまたはα切断部位付近のＡＰＰ突然変異（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ、Ｅ６９３Ｋ、Ｅ６９３Δ））におけるＡＰＰ γ－切断を阻害する効果もあり、たとえば、Ａβの産生を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）する；（ｘｉｖ）前記ＡｐｏＥコンストラクトは、細胞内で内因的なＡＰＰと重複する核周囲の細胞内分布パターンを示し、細胞内で内因性的なＡＰＰ、α－セクレターゼとγ－セクレターゼまたはその成分と相互作用することができる；（ｘｖ）ＡＤモデルマウスでは、ニューロンで局所的に発現された（例えば皮質、歯状回（ＤＧ）、海馬ＣＡ３で発現された）前記ＡｐｏＥコンストラクトが、離れた部位から海馬台に移動し、アミロイド斑の周囲に蓄積し、それによって、これらのアミロイド産生ホットスポットにおけるγ－セクレターゼの酵素活性を局所的に阻害する；（ｘｖｉ）本発明に記載のＡｐｏＥコンストラクトと高い相同性（例えば少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の非ヒト由来ＡｐｏＥコンストラクト（例えばサルＡｐｏＥ Ｃ末端配列）は、前記の一つまたは複数の特性と類似する特性を有する。

【0029】

本願は、ポリポタンパク質Ｅが、そのＣ末端フラグメントを介して細胞自律的にγ－セクレターゼの切断を阻害し（すなわち、γ－セクレターゼと同じ細胞内で機能する）、ＡＰＰのアミロイド代謝を阻害し、Ａβの産生を減少する；また、ＡＰＰの非アミロイド代謝産物であるα－ＣＴＦを増加する；ＡＤモデルマウスの脳内のアミロイド斑の大きさと密度の増加を緩和することを初めて発見した。したがって、ＡｐｏＥのＣ末端フラグメントは、γセクレターゼを標的とする医薬品として使用され、ＡＤとアミロイド脳血管病の発生と進展の緩和（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％のＡＤ進展プロセスを緩和）、治療、あるいは予防に用いられる。なお、ＡｐｏＥのＣ末端フラグメントが、γセクレターゼの阻害剤として、複数の生物学的プロセスで役割を果たす可能性があり、ＡｐｏＥのＣ末端フラグメントの応用は、神経変性疾患分野に限られなく、がん、炎症性疾患、及び腎臓疾患などの複数の疾患、例えばγセクレターゼの切断活性に関連する任意の疾患（γセクレターゼの切断活性を阻害することで治療または予防できる疾患）に用いられてもよい。一般的なγセクレターゼ阻害剤が、治療中に重篤な副作用を引き起こし、これは、いずれもＮｏｔｃｈシグナル伝達の欠陥、例えば免疫抑制、胃腸出血と下痢、癌性皮膚病変に関連する。本発明に提供されるＡｐｏＥコンストラクトは、Ｎｏｔｃｈのγ－切断に影響を与えなく、したがって、本発明に提供されるＡｐｏＥコンストラクトと関連する方法は、効果的で安全な新しい治療方法を提供する可能性がある。

【0030】

本願は、さらに、アポリポタンパク質ＥのＣ末端フラグメントにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸配列（ＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８；“ＡｐｏＥ ＣＴ ＮＤ５ＣＤ２５”）は、当該Ｃ末端フラグメントが生物学的機能（例えばγ－セクレターゼに仲介されるＡＰＰγ－切断を阻害すること）を発揮するために必要なアミノ酸配列であることを見出した。一部の実施形態において、アポリポタンパク質ＥのＣ末端フラグメントの最も短い機能的フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２７４位アミノ酸配列（ＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）である。一部の実施形態において、ＡｐｏＥのＣ末端フラグメントの最も短い機能的フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２７９位アミノ酸配列ＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）である。

【0031】

１．定義
特に指定しない限り、本発明の実施には、当業者の従来の方法の範囲内で、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、細胞生物学、幹細胞プロトコール、細胞培養およびトランスジェニック生物学における一般的な方法が採用され、多くは、説明のために以下に説明される。このような技術は文献に詳しく説明されている。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が参照により組み込まれる。

【0032】

他に説明されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本発明の目的のために、以下の用語は、当該技術分野で一般に理解されている意味と一致するように定義される。

【0033】

本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、その用語が適用される疾患または状態、あるいはそのような疾患または状態の一つまたは複数の症状の発症を遅延し、その進展を遅延または逆転し、その重症度を軽減し、それを軽減または予防することを意味する。

【0034】

「有効量」または「薬学的有効量」という用語は、所望の結果を生み出すために必要な１つまたは複数の薬剤の量および／または投与量および／または投与計画を指し、例えば、ＡＰＰγ切断を低下するのに十分の量、または、神経変性疾患（例えばＡＤ）に関連する一つまたは複数の症状を治療する量、または、哺乳類の脳におけるアミロイド堆積物を特徴とする疾患の重症度の軽減または前記疾患の進展の遅延に十分の量（例えば、治療有効量）、哺乳類の脳におけるアミロイド堆積物を特徴とする疾患のリスクの低下または前記疾患の発症の遅延及び／または最終の重症度のの軽減に十分の量（例えば、予防有効量）を指す。

【0035】

「軽減」という用語は、当該病状または疾患の一つまたは複数の症状を低減または除去し、及び／または、当該病状または疾患の一つまたは複数の症状の速率を低減し、または、当該病状または疾患の一つまたは複数の症状の発症や重症度を遅延し、及び／または、前記病状または疾患を予防することを指す。いくつかの実施形態では、病状または疾患の一つまたは複数の症状を低減または除去するとは、病状または疾患の特徴とする一つまたは複数のマーカー（例えば、総－Ｔａｕ（ｔＴａｕ）、リン酸化－Ｔａｕ（ｐＴａｕ）、ＡＰＰｎｅｏ、可溶性Ａβ４０、Ａβ４２、ｐＴａｕ／Ａβ４２比とｔＴａｕ／Ａβ４２比及び／またはＣＳＦのＡβ４２／Ａβ４０比、Ａβ４２／Ａβ３８比、ｓＡＰＰα、ｓＡＰＰα／ｓＡＰＰβ比、ｓＡＰＰα／Ａβ４０比、ｓＡＰＰα／Ａβ４２比などの組分から選ばれる一つまたは複数のレベルの増加）の低減または除去、及び／または非アミロイド代謝産物（例えばα－ＣＴＦ）の増加、及び／または一つまたは複数の診断基準（例えば、臨床認知症評価（ＣＤＲ））の低減、安定化または逆転を含むが、これらに限定されない。

【0036】

「個体」または「受験者」は、哺乳類、鳥類、カエル、魚類、ショウジョウバエ、線虫などを含むが、これらに限定されない。哺乳動物は、霊長類（例えばヒト、または非ヒト霊長類例えばサル）、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、リス、モルモット、ウサギ）、家畜（例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ロバ）、ペット（例えば猫、犬、ウサギ、ハムスターなど）を含むが、これらに限定されない。一部の実施の形態において、前記個体は、ヒトである。

【0037】

本明細書で使用される用語「製剤」または「医薬品制剤」または「剤形」または「医薬品製剤」は、少なくとも一種の受験者へ送達する治療剤または医薬品を含有する組成物を指す。

【0038】

二つのポリペプチドまたは核酸配列の間の「配列同一性」は、総残基数に対するパーセンテージとして前記配列の間で同一である残基の数を意味し、総残基数の計算は、変異の種類に基づいて行われる。突然変異のタイプは、配列のどちらかの端または両方の端の插入（伸び）、配列のどちらかの端または両方の端の欠失（短縮）、一つまたは複数のアミノ酸／ヌクレオチドの置換／取り替え、配列の内部の插入、配列の内部の欠失を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドを例として挙げると（ヌクレオチドも同じ）、突然変異のタイプは、一つまたは複数のアミノ酸／ヌクレオチドの置換／取り替え、配列の内部の插入と配列の内部の欠失から選ばれる一つまたは複数であると、残基の総数は、比較した分子の大きい方として計算される。突然変異のタイプは、さらに、配列のどちらかの端または両方の端での插入（伸び）または配列のどちらかの端または両方の端での欠失（短縮）を含むと、どちらかの端または両方の端に插入または欠失されるアミノ酸の数（例えば、両方の端の插入または欠失の数は、２０個より少ない）は、残基の総数に含まれない。同一性パーセントを計算する場合、比較しようとする配列を、配列の間で最大の一致が得られるようにアラインメントし、アラインメント内のギャップ（存在する場合）を特定のアルゴリズムで解決する。

【0039】

ここで使用される用語「フラグメント」は、ポリペプチドを指し、固有または特徴的な、特定のポリペプチドの任意の単離された部分として定義される。ここで使用される用語は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持する、所与のポリペプチドの任意の単離された部分も指す。好ましくは、保持される活性部分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。より好ましくは、保持される活性部分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。より好ましくは、保持される活性部分は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。最も好ましくは、保持される活性部分は、全長ポリペプチドの活性の１００％である。ここで使用される当該用語は、また、全長ポリペプチドの少なくとも１つの指定された配列エレメントを含む所定のポリペプチドの任意の部分を指す。好ましくは、配列エレメントは、全長ポリペプチドの少なくとも４～５個、より好ましくは少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個以上のアミノ酸にわたる。

【0040】

ここで使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合された連続したアミノ酸の鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すが、当業者は、この用語が長鎖を指すだけでなく、ペプチド結合によって接続された２つのアミノ酸を含む最も短い鎖を指すのにも使用できることを知っている。
ここで使用される「タンパク質」という用語は、別個の単位として機能する１つまたは複数のポリペプチドを指す。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、単一のポリペプチドが別個の機能単位であり、その独立した機能単位を形成するために他のポリペプチドとの持続的な物理的結合を必要としない場合、本明細書では互換的に使用される。別個の機能単位が、互いに物理的に結合した複数のポリペプチドからなる場合、本明細書で使用する「タンパク質」という用語は、物理的に結合し、別個の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。

【0041】

「組換え発現ポリペプチド」、「組換えポリペプチド」、および「修飾ポリペプチド」（またはタンパク質）は、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞から発現される当該ポリペプチドを指す。組換え発現ポリペプチドは、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）で通常に発現されるポリペプチドと同じまたは類似していてもよい。組換え発現されたポリペプチドはまた、宿主細胞にとって外来のもの、例えば、哺乳動物宿主細胞において通常発現されるポリペプチドに対して異種のポリペプチドであってもよい。あるいは、組換え発現ポリペプチドは、キメラポリペプチドであり、例えば、ポリペプチドの一部は、哺乳動物宿主細胞で通常に発現されるポリペプチドと同じまたは類似のアミノ酸配列を含み、他の部分は宿主細胞にとって外因性である。

【0042】

「アミノ酸」という用語は、２０の一般的な天然アミノ酸を意味する。天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）を含む。

【0043】

非重要なアミノ酸は、タンパク質の通常の機能に影響を与えることなく保存的に置換できる。保存的な置換とは、アミノ酸を化学的または機能的に類似したアミノ酸で置き換えることを意味する。類似のアミノ酸の保存的な置換表を提供することは当技術分野でよく知られている。例えば、いくつかの実施の形態では、以下に提供されるアミノ酸群は、互いの保存的な置換であるとみなされる。

【0044】

一部の実施形態において、互いの保存的な置換とみなされるアミノ酸群：

【表3】

【0045】

一部の実施形態において、互いの保存的な置換とみなされる別のアミノ酸群：

【0046】

【表4】

【0047】

一部の実施形態において、互いの保存的な置換とみなされる別のアミノ酸群：

【0048】

【表5】

【0049】

本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準量、レベル、値、量、頻度、パーセンテージ、スケール、サイズ、量、重量、または長さと比較して、最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％まで変化する量、レベル、値、量、頻度、パーセンテージ、スケール、サイズ、量、重量、または長さを指す。一つの実施の形態では、「約」または「およそ」という用語は、基準量、レベル、値、量、頻度、パーセンテージ、スケール、サイズ、量、重量、または長さの前後±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の量、レベル、値、量、頻度、パーセンテージ、スケール、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。

【0050】

本明細書で使用される場合、「基本的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ／ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、程度、基準量、レベル、値、量、頻度、パーセンテージ、スケール、サイズ、量、重量、または長さと比較して、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または以上の程度、量、レベル、値、量、頻度、パーセンテージ、スケール、サイズ、量、重量、または長さを指す。

【0051】

数値範囲は、範囲の終点と範囲の各特定の値を含み、たとえば、「１６～１００個のアミノ酸」は、１６と１００を含み、１６～１００の各特定の値を含む。

【0052】

本明細書全体を通じて、特に限定されない限り、「含む」、「含有」、「有する」、および「持つ」という用語は、記載されたステップまたは要素またはステップまたは要素のグループを含むことを非明示的に意味するが、他のステップまたは要素またはステップまたは要素のグループを除外しないと理解されるべきである。特定の実施形態では、「含む」、「含有」、「有する」、および「持つ」という用語は同義的に使用される。

【0053】

「からなる」とは、「からなる」という語句に続くものをすべて含むことを意味し、これらに限定される。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必須であり、他の要素が存在してはいけないことを示す。

【0054】

「基本的に……からなる」とは、「基本的に……からなる」という語句の後に列挙される要素のいずれかを含むことを意味し、また、挙げられた要素の開示で指定されている活動やアクションを妨げたり、それに寄与したりしない他の要素に限定される。したがって、「基本的に……からなる」という表現は、挙げられた要素が必須であるが、他の要素はオプションではなく、それらが挙げられた要素の活動またはアクションに影響を与えるかどうかに依存し、存在するか存在しない可能性があることを示す。

【0055】

冠詞「一つ／一個（ａ／ａｎ）」および「当該／この（ｔｈｅ）」は、本明細書では、冠詞の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）の単語の文法的対象を指すために使用される。例えば、「要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。

【0056】

代替案（例えば、「または」）の使用は、代替案のいずれか、両方、または任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。

【0057】

「および／または」という用語は、選択肢のいずれかまたは両方を意味すると理解されるべきである。

【0058】

本明細書全体を通して、「一つの実施形態」、「ある実施形態」、「いくつかの実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「別の実施形態」、または「さらなる実施形態」への言及またはそれらの組み合わせちは、実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体のさまざまな場所に出現する前述の語句は、必ずしもすべて同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。

【0059】

２．ＡｐｏＥコンストラクトとＡｐｏＥポリペプチド
一つの様態では、本願が、単離されたＡｐｏＥコンストラクトを提供し、それが、ＡｐｏＥポリペプチドを含み、前記ＡｐｏＥポリペプチドが：（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来のフラグメントを含み、当該フラグメント（または当該ＡｐｏＥポリペプチド）Ｎ末端の最初のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２２１位のアミノ酸残基のいずれか一つであり、当該フラグメント（または当該ＡｐｏＥポリペプチド）Ｃ末端の最末のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２７４－２９９位（例えば２７９－２９９位）のアミノ酸残基のいずれか一つである；または（２）そのアミノ酸配列が、（１）ぶｊに記載のフラグメントと少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の配列同一性を有し、かつ（１）に記載のフラグメントによるγセクレターゼ切断活性の阻害の少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）を保持する。本明細書に記載の「フラグメント」とは、対応するタンパク質からの連続したアミノ酸配列を指すことを理解されるべきである。

【0060】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来のフラグメントを含み、当該ＡｐｏＥポリペプチドＮ末端の最初のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２２１位のアミノ酸残基のいずれか一つであり、当該ＡｐｏＥポリペプチドＣ末端の最末のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２７４－２９９位（例えば２７９－２９９位）のアミノ酸残基のいずれか一つである。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＡｐｏＥポリペプチドを含み、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントからなり、当該ＡｐｏＥポリペプチドＮ末端の最初のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２２１位のアミノ酸残基のいずれか一つであり、当該ＡｐｏＥポリペプチドＣ末端の最末のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２７４－２９９位（例えば２７９－２９９位）のアミノ酸残基のいずれか一つである。

【0061】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来のフラグメントと、少なくとも約７０％の同一性を有し、かつ当該フラグメントによるγセクレターゼ切断活性の阻害の少なくとも約５０％を保留し、ただし、当該フラグメントのＮ末端の最初のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２２１位のアミノ酸残基のいずれか一つであり、当該フラグメントのＣ末端の最末のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２７４－２９９位（例えば２７９－２９９位）のアミノ酸残基のいずれか一つである。

【0062】

一部の実施形態において、前記単離されたＡｐｏＥコンストラクトは、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）からなる、または基本的に前記ＡｐｏＥポリペプチドからなる。したがって、一部の実施形態において、本願は、さらに、ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）を提供する。

【0063】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）は、（１）前記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントからなる、または基本的に前記（１）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントからなる。

【0064】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、天然に存在するものではない。例えば、一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたは前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＡｐｏＥ２ではなく、ＡｐｏＥ３ではなく、及び／またはＡｐｏＥ４全長タンパク質ではない。

【0065】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたは前記ＡｐｏＥポリペプチドは、たとえば、神経特性の発現にＡｐｏＥ コンストラクトを使用する場合、全長ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３タンパク質（例えばヒト全長ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３タンパク質）である。

【0066】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントのアミノ酸配列の開始点（またはＮ末端の最初のアミノ酸残基）は、ＡｐｏＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２配列の２１５－２２１位（例えば２１５位、２１６位、２１７位、２１８位、２１９位、２２０位または２２１位）のいずれか一つ部位のアミノ酸残基、例えば２１５位、２１６位、２１９位、２２０位または２２１位のいずれか一つのアミノ酸残基である。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントのアミノ酸配列の終わり（またはＣ末端の最末のアミノ酸残基）は、ＡｐｏＥ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２配列２７４～２９９位（例えば２７４位、２７５位、２７６位、２７７位、２７８位、２７９位、２８０位、２８１位、２８２位、２８３位、２８４位、２８５位、２８６位、２８７位、２８８位、２８９位、２９０位、２９１位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位または２９９位）のいずれか一つのの部位のアミノ酸残基、例えば２７９－２９９位（本数を含む）のいずれか位置のアミノ酸残基、例えば２７４位、２７９位または２９９位のいずれか一つのアミノ酸残基である。

【0067】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、以下のいずれか一つの配列を含む（またはそれからなる、または基本のにそれからなる）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される配列の２１５－２９９位、２１６－２９９位、２１７－２９９位、２１８－２９９位、２１９－２９９位、２２０－２９９位、２２１－２９９位、２１５－２７４位、２１６－２７４位、２１７－２７４位、２１８－２７４位、２１９－２７４位、２２０－２７４位、２２１－２７４位、２１５－２７９位、２１６－２７９位、２１７－２７９位、２１８－２７９位、２１９－２７９位、２２０－２７９位、２２１－２７９位、２１５－２９４位、２１６－２９４位、２１７－２９４位、２１８－２９４位、２１９－２９４位、２２０－２９４位、２２１－２９４位、２１５－２８９位、２１６－２８９位、２１７－２８９位、２１８－２８９位、２１９－２８９位、２２０－２８９位、２２１－２８９位、２１５－２８８位、２１６－２８８位、２１７－２８８位、２１８－２８８位、２１９－２８８位、２２０－２８８位、２２１－２８８位、２１５－２８７位、２１６－２８７位、２１７－２８７位、２１８－２８７位、２１９－２８７位、２２０－２８７位、２２１－２８７位、２１５－２８６位、２１６－２８６位、２１７－２８６位、２１８－２８６位、２１９－２８６位、２２０－２８６位、２２１－２８６位、２１５－２８５位、２１６－２８５位、２１７－２８５位、２１８－２８５位、２１９－２８５位、２２０－２８５位、２２１－２８５位、２１５－２８４位、２１６－２８４位、２１７－２８４位、２１８－２８４位、２１９－２８４位、２２０－２８４位、または２２１－２８４位のアミノ酸残基。

【0068】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、以下のいずれか一つの配列を含む（またはそれからなる、または基本のにそれからなる）：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５－２９９位アミノ酸残基的アミノ酸配列；（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１６－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１７－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１８－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２９９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１６－２９４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１６－２８９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８８位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８７位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８６位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８５位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２８４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２７９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２７４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２７４位アミノ酸残基のアミノ酸配列；（ｘｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２７９位アミノ酸残基のアミノ酸配列；または（ｘｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基のアミノ酸配列。

【0069】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１１－２１４位の一つまたは複数のアミノ酸配列を含まない。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドは、以下の一つまたは複数のアミノ酸フラグメントを含まない（またはいずれか一つも含まない）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１２－２１４位、２１３－２１４位、２１１－２１４位、２１１－２１５位、２１１－２１６位、２１１－２１７位、２１１－２１８位、２１１－２１９位、２１１－２２０位、２１１－２２１位、２１１－２２２位、２１２－２１４位、２１２－２１５位、２１２－２１６位、２１２－２１７位、２１２－２１８位、２１２－２１９位、２１２－２２０位、２１２－２２１位、２１２－２２２位、２１３－２１４位、２１３－２１５位、２１３－２１６位、２１３－２１７位、２１３－２１８位、２１３－２１９位、２１３－２２０位、２１３－２２１位、２１３－２２２位、２１４－２１５位、２１４－２１６位、２１４－２１７位、２１４－２１８位、２１４－２１９位、２１４－２２０位、２１４－２２１位、または２１４－２２２位。

【0070】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１１－２１４位のアミノ酸配列を含むが、当該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１１－２１４位のアミノ酸配列のＣ末端は、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端に直接に接続しなく、例えば、それらの間に少なくとも一つの非ＡｐｏＥ由来の配列（例えばＦＬＡＧ配列）を插入する。一部の実施形態において、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１１－２１４位のアミノ酸配列のＣ末端と前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端との間に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に示される３ＸＦＬＡＧ配列を插入する。

【0071】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたは前記ＡｐｏＥポリペプチドは、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントのＮ末端及び／またはＣ末端に、さらに、一つまたは複数の非ＡｐｏＥ由来のアミノ酸残基を含んでも良い。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたは前記ＡｐｏＥポリペプチドは、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントのＮ末端及び／またはＣ末端に、さらに一つまたは複数のアミノ酸残基を含んでも良く、かつ、当該アミノ酸残基を前記（１）フラグメントＮ末端またはＣ末端に挿入する場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の対応する部位のアミノ酸残基と異なる。例えば、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントのＮ末端の最初のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５位アミノ酸残基であり、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたは前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５位アミノ酸残基のＮ末端に、さらに、一つまたは複数のアミノ酸残基を含んでも良いが、当該一つまたは複数のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１４、２１３、２１２、２１１などの部位のアミノ酸残基と異なる。

【0072】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば（１）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント、またはＡｐｏＥ突然変異体）のＮ末端及び／またはＣ末端に、さらに、一つまたは複数の非ＡｐｏＥ由来のアミノ酸残基を含んでも良い。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に、さらに、一つまたは複数のアミノ酸残基を含んでも良く、且つ当該アミノ酸残基を、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に挿入する場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の対応する部位のアミノ酸残基と異なる。例えば、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５位アミノ酸残基であり、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１５位アミノ酸残基のＮ末端に、さらに、一つまたは複数のアミノ酸残基を含んでも良いが、当該一つまたは複数のアミノ酸残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１４、２１３、２１２、２１１などの部位のアミノ酸残基と異なる。

【0073】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、少なくとも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７８）を含む。例えば、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に示されるアミノ酸配列のＮ末端に、さらに、１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸残基を含んでも良く、及び／またはＣ末端に、さらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基を含んでも良い。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に示されるアミノ酸配列からなり、または基本的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に示されるアミノ酸配列からなる。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、少なくとも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２０－２７９位アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４）を含む。例えば、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列のＮ末端に、さらに、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基を含んでも良く、及び／またはＣ末端に、さらに、１、２、３、４、５、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸残基を含んでも良い。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列からなり、または基本的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列からなる。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、少なくとも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２７４位アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２）を含む。例えば、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるアミノ酸配列のＮ末端に、さらに、１、２、３、または４個のアミノ酸残基を含んでも良く、及び／またはＣ末端に、さらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基を含んでも良い。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるアミノ酸配列からなり、または基本的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるアミノ酸配列からなる。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、少なくとも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２１９－２７９位アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１）を含む。例えば、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるアミノ酸配列のＮ末端に、さらに、１、２、３、または４個のアミノ酸残基を含んでも良く、及び／またはＣ末端に、さらに、１、２、３、４、５、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸残基を含んでも良い。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるアミノ酸配列からなり、または基本的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示されるアミノ酸配列からなる。

【0074】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－３４、７８と８７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３または７８）中のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－３４、７８と８７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３または７８）中のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、または基本的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－３４、７８と８７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３または７８）中のいずれか一つのアミノ酸配列からなる。

【0075】

本願に記載のＡｐｏＥコンストラクトと前記ＡｐｏＥポリペプチドは、その突然変異体（本明細書には、「ＡｐｏＥ突然変異体」とも呼ばれる）を含む。例えば、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列）と比較すると、当該突然変異体は、一つまたは複数のアミノ酸突然変異（例えば挿入、欠失または置換）を有し、「酵素活性を阻害する保存的修飾」を含むが、これらに限定されない。例えば、当該突然変異体は、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列）と、少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の配列同一性を有する。一部の実施形態において、前記突然変異体は、少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）の前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列）によるγセクレターゼ切断活性の阻害を保持する。一部の実施形態において、前記突然変異体は、少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）のＡｐｏＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＡｐｏＥフラグメントによるγセクレターゼ切断活性の阻害を保持する。

【0076】

本明細書では、「酵素活性を阻害する保存的修飾」とは、タンパク質コンストラクトまたはポリペプチドによるγ－セクレターゼ切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）の阻害に有意な影響（例えば約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％または以下を超えない低下）を与えないか、または変化させないアミノ酸修飾を指す。こんな酵素活性を阻害する保存的修飾は、アミノ酸替換、挿入及び／または欠失を含む。修飾は、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で知られている標準的な技術によって、本発明のタンパク質コンストラクトまたはポリペプチドに導入され得る。一部の実施形態において、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列）と比較すると、前記ＡｐｏＥ突然変異体は、１個または複数個（例えば４０個以内、３０個以内、２０個以内、１０個以内、８個以内、５個以内、３個以内、２個または１個）のアミノ酸插入、置換及び／または欠失（Ｎ末端及び／またはＣ末端での插入及び／または削除）を有する同時に、少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）の前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントによるγセクレターゼの切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）を阻害する生物学活性を保持する。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）は、少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）のＡｐｏＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるＡｐｏＥフラグメントによるγセクレターゼ切断活性の阻害を保持する。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド）は、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）と比較して、より高い（例えば少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）γセクレターゼの切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）を阻害する生物学活性を有する。

【0077】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、実施例１の任意のＡｐｏＥポリペプチドまたはＡｐｏＥコンストラクト中の一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異（例えば挿入、欠失または置換）を含む。本発明は、実施例１と実施例２の中の任意のＡｐｏＥポリペプチドまたはＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたもの）を提供する。

【0078】

一部の実施形態において、、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列に対する一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異（例えば挿入、欠失または置換）を含む：Ｒ２２６、Ｄ２２７、Ｒ２２８、Ｌ２２９、Ｄ２３０、Ｑ２３５、Ｅ２３８、Ｖ２３９、Ｒ２４０、Ｋ２４２、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｑ２４６、Ａ２４７、Ｑ２４８、Ｑ２４９、Ｉ２５０、Ｒ２５１、Ｌ２５２、Ｑ２５３、Ａ２５４、Ｅ２５５、Ｑ２７５、Ｖ２８０、Ｖ２８７、Ｔ２８９、Ｓ２９０、Ａ２９１、Ｐ２９３、Ｖ２９４、Ｐ２９５、Ｓ２９６、Ｄ２９７、Ｎ２９８、Ｈ２９９、Ｒ２５１＋Ｔ２８９、Ｒ２５１＋Ｔ２８９＋Ａ２９１、Ｓ２９０＋Ｐ２９３＋Ｖ２９４＋Ｐ２９５＋Ｓ２９６＋Ｄ２９７＋Ｎ２９８＋Ｈ２９９、Ｒ２２６＋Ｄ２２７＋Ｒ２２８＋Ｌ２２９＋Ｄ２３０、Ｅ２３８＋Ｖ２３９＋Ｒ２４０＋Ｋ２４２、またはＥ２４４＋Ｅ２４５＋Ｑ２４６＋Ａ２４７＋Ｑ２４８＋Ｑ２４９＋Ｉ２５０＋Ｒ２５１＋Ｌ２５２＋Ｑ２５３＋Ａ２５４。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸部位に対する突然変異を含む：Ｑ２３５、Ｅ２５５、Ｑ２７５、Ｖ２８０、Ｖ２８７、Ｐ２９５、Ｒ２５１＋Ｔ２８９、Ｓ２９０＋Ｐ２９３＋Ｖ２９４＋Ｐ２９５＋Ｓ２９６＋Ｄ２９７＋Ｎ２９８＋Ｈ２９９、Ｒ２２６＋Ｄ２２７＋Ｒ２２８＋Ｌ２２９＋Ｄ２３０、Ｅ２３８＋Ｖ２３９＋Ｒ２４０＋Ｋ２４２、Ｅ２４４＋Ｅ２４５＋Ｑ２４６＋Ａ２４７＋Ｑ２４８＋Ｑ２４９＋Ｉ２５０＋Ｒ２５１＋Ｌ２５２＋Ｑ２５３＋Ａ２５４、またはＲ２５１＋Ｔ２８９＋Ａ２９１。一部の実施形態において、前記突然変異は、前記の一つまたは複数の部位のＡ、ＳまたはＴへの置換、例えばＡへの置換を含む。一部の実施形態において、前記突然変異は、前記の一つまたは複数の部位のアミノ酸残基の削除を含む。

【0079】

一部の実施形態において、前記酵素活性を阻害する保存的修飾は、保存的な置換である。保存的な置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を持つアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義される。これらのファミリーには、次の側鎖を持つアミノ酸が含まれる：塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファンなど）、非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンなど）、β分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシンなど）、芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）。

【0080】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列に対する一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異を含む：Ｒ２２６Ａ、Ｄ２２７Ａ、Ｒ２２８Ａ、Ｌ２２９Ａ、Ｄ２３０Ａ、Ｑ２３５Ａ、Ｅ２３８Ａ、Ｖ２３９Ａ、Ｒ２４０Ａ、Ｋ２４２Ａ、Ｅ２４４ｄｅｌ、Ｅ２４５ｄｅｌ、Ｑ２４６ｄｅｌ、Ａ２４７ｄｅｌ、Ｑ２４８ｄｅｌ、Ｑ２４９ｄｅｌ、Ｉ２５０ｄｅｌ、Ｒ２５１Ｓ、Ｌ２５２ｄｅｌ、Ｑ２５３ｄｅｌ、Ａ２５４ｄｅｌ、Ｅ２５５Ａ、Ｑ２７５Ａ、Ｖ２８０Ａ、Ｖ２８７Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｓ２９０Ａ、Ａ２９１Ｔ、Ｐ２９３Ａ、Ｖ２９４Ａ、Ｐ２９５Ａ、Ｓ２９６Ａ、Ｄ２９７Ａ、Ｎ２９８Ａ、Ｈ２９９Ａ、Ｒ２５１Ａ＋Ｔ２８９Ａ、Ｒ２５１Ｓ＋Ｔ２８９Ａ＋Ａ２９１Ｔ、Ｓ２９０Ａ＋Ｐ２９３Ａ＋Ｖ２９４Ａ＋Ｐ２９５Ａ＋Ｓ２９６Ａ＋Ｄ２９７Ａ＋Ｎ２９８Ａ＋Ｈ２９９Ａ、Ｒ２２６Ａ＋Ｄ２２７Ａ＋Ｒ２２８Ａ＋Ｌ２２９Ａ＋Ｄ２３０Ａ、Ｅ２３８Ａ＋Ｖ２３９Ａ＋Ｒ２４０Ａ＋Ｋ２４２Ａ、またはＥ２４４ｄｅｌ＋Ｅ２４５ｄｅｌ＋Ｑ２４６ｄｅｌ＋Ａ２４７ｄｅｌ＋Ｑ２４８ｄｅｌ＋Ｑ２４９ｄｅｌ＋Ｉ２５０ｄｅｌ＋Ｒ２５１ｄｅｌ＋Ｌ２５２ｄｅｌ＋Ｑ２５３ｄｅｌ＋Ａ２５４ｄｅｌ。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列に対する一つまたは複数のアミノ酸部位の突然変異を含む：Ｑ２３５Ａ、Ｅ２５５Ａ、Ｑ２７５Ａ、Ｖ２８０Ａ、Ｖ２８７Ａ、Ｐ２９５Ａ、Ｒ２５１Ａ＋Ｔ２８９Ａ、Ｓ２９０Ａ＋Ｐ２９３Ａ＋Ｖ２９４Ａ＋Ｐ２９５Ａ＋Ｓ２９６Ａ＋Ｄ２９７Ａ＋Ｎ２９８Ａ＋Ｈ２９９Ａ、Ｒ２２６Ａ＋Ｄ２２７Ａ＋Ｒ２２８Ａ＋Ｌ２２９Ａ＋Ｄ２３０Ａ、Ｅ２３８Ａ＋Ｖ２３９Ａ＋Ｒ２４０Ａ＋Ｋ２４２Ａ、Ｅ２４４ｄｅｌ＋Ｅ２４５ｄｅｌ＋Ｑ２４６ｄｅｌ＋Ａ２４７ｄｅｌ＋Ｑ２４８ｄｅｌ＋Ｑ２４９ｄｅｌ＋Ｉ２５０ｄｅｌ＋Ｒ２５１ｄｅｌ＋Ｌ２５２ｄｅｌ＋Ｑ２５３ｄｅｌ＋Ａ２５４ｄｅｌ、またはＲ２５１Ｓ＋Ｔ２８９Ａ＋Ａ２９１Ｔ。

【0081】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記ＡｐｏＥ突然変異体は、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）と少なくとも約７０％の配列同一性、例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上（しかし１００％ではない）の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥ突然変異体は、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）と比較して、同じレベルでγセクレターゼの切断を阻害し、または、少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）の前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントによるγセクレターゼ切断活性の阻害を保持する。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥ突然変異体は、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントと同様に、ヒトから由来する。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、非ヒト由来の配列を含むか、非ヒト由来の配列から由来する。当分野でよく知られる方法で、突然変異体と前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントとの間の配列同一性を測定し、例えば、ＢＬＡＳＴＰで測定しても良い。

【0082】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、非ヒト由来の配列を含むか、非ヒト由来の配列から由来し、且つそのアミノ酸配列は、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）と少なくとも約７０％の配列同一性を有し、かつ少なくとも約５０％の前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントによるγセクレターゼ切断活性の阻害を保持する。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、以下のいずれか一つの種のＡｐｏＥ配列を含むか、それらから由来する：哺乳動物、鳥類、カエル、魚類、ショウジョウバエ、線虫など。一部の実施形態において、哺乳動物は、霊長類（例えばヒト、または非ヒト霊長類例えばサル）、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、リス、アレチネズミ、リス、モルモット、ウサギ）、家畜（例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ロバ）、ペット（例えば猫、犬、ウサギ、ハムスターなど）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、非天然存在の修飾を含み、例えば、サルＡｐｏＥ配列にさらにアミノ酸修飾を含む。

【0083】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドまたは前記ＡｐｏＥ突然変異体は、ヒト以外の霊長類配列、例えば、前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）と相同性が高く保存された配列を含有する。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるサル由来のＡｐｏＥ Ｃ末端アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるアミノ酸配列からなり、または、基本的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるアミノ酸配列からなる。

【0084】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるアミノ酸配列に基づく一つまたは複数の突然変異（例えば挿入、欠失または置換）、例えば、前記の一つまたは複数の部位の突然変異を含み、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の配列同一性を有する。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるアミノ酸配列に基づく一つまたは複数の突然変異（例えば挿入、欠失または置換）、例えば、前記のいずれか一つまたは複数の部位の突然変異を含み、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の配列同一性を有し、且つ少なくとも約５０％（例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示されるアミノ酸配列によるγセクレターゼ切断活性の阻害を保持する。

【0085】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたは前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６－５２、５７－５９、６２と７６中のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたは前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６－５２、５７－５９、６２と７６中のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、または基本的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６－５２、５７－５９、６２と７６中のいずれか一つのアミノ酸配列からなる。

【0086】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列）によるγセクレターゼに仲介される切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）の阻害作用は、以下の一つまたは複数の特性を含む：（ｉ）γ－セクレターゼに仲介されるＡＰＰ γ－切断を阻害（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を阻害）すること；（ｉｉ）ＡＰＰのアミロイド代謝を低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低下）すること；（ｉｉｉ）Ａβ（例えばＡβ４０及び／またはＡβ４２）の産生を 低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）すること；（ｉｖ）β－ＣＴＦに対するγ－切断を低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低下）すること；（ｖ）ＡＰＰの非アミロイド代謝を向上（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を向上）すること；（ｖｉ）α－ＣＴＦの産生を増加（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を増加）すること；（ｖｉｉ）非ＡＰＰタンパク質（例えばＡＰＬＰ１またはＮｏｔｃｈ）またはそのフラグメントに対するγ－切断を阻害しない（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか阻害しない）こと；（ｖｉｉｉ）非ＡＰＰタンパク質（例えばＡＰＬＰ１、Ｎｏｔｃｈ、ＥｒｂＢ４、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ－Ｂ２またはＣＤ４４）のγ－切断で産生されるα－ＣＴＦを増加しない（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか増加しない）こと；（ｉｘ）ＡＤを罹患する個体の脳中のアミロイド斑を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）し、例えばアミロイド斑の平均斑大きさ、総面積、及び／または密度を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）すること；（ｘ）ＡＤを罹患する個体のニューロン内Ａβ（例えばＡβ４０及び／またはＡβ４２）の産生を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）すること；（ｘｉ）ＡＤを罹患する個体の病理学的プロセスを低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低下）すること；（ｘｉｉ）ＡＤを罹患する個体の生存率及び／または寿命を向上（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を向上）すること；及び／または（ｘｉｉｉ）α－セクレターゼ、β－セクレターゼ、及び／またはγ－セクレターゼ（またはそのサブユニット）（例えばＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＰＳ１及び／またはＰＳ２）のｍＲＮＡ及び／またはタンパク質発現に影響を与えない（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか影響を与えない）。

【0087】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントによるγ－セクレターゼ切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）を阻害する能力は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または３３または８９に示されるタンパク質によるγ－セクレターゼ切断を阻害する能力より高い（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上高い）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントによるγ－セクレターゼ切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）を阻害する能力は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または３３または８９に示されるタンパク質によるγ－セクレターゼ切断を阻害する能力と同じまたは類似する（例えばそれらの差は、約１０％を超えない）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントによるγ－セクレターゼ切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）を阻害する能力は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または３３または８９に示されるタンパク質によるγ－セクレターゼ切断を阻害する能力より、最大約５０％低い（例えば４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％または以下低い）。

【0088】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列）によるγセクレターゼに仲介される切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）の阻害活性は、γ－セクレターゼ阻害剤（例えばＰＦ０３０８４０１４）と同じまたは類似する（例えばそれらの差は、約１０％、５％または１％を超えない）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントによるγセクレターゼに仲介される切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）を阻害する活性は、γ－セクレターゼ阻害剤（例えばＰＦ０３０８４０１４）より高い（例えば少なくとも約１０％、２０％、５０％、１００％、１．５倍、２倍、５倍または以上高い）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントによるγセクレターゼに仲介される切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）を阻害する活性は、γ－セクレターゼ阻害剤（例えばＰＦ０３０８４０１４）より低い（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または以上低い）。

【0089】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、７８と８７のいずれか一つの配列）によるＡＰＰに対するγ－切断の阻害は、非ＡＰＰタンパク質（例えばＡＰＬＰ１、Ｎｏｔｃｈ）に対するγ－切断の阻害より高い（例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上高い）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントは、ＡＰＰに対するγ－切断しか阻害しなく、非ＡＰＰタンパク質（例えばＡＰＬＰ１、Ｎｏｔｃｈ）に対するγ－切断を阻害しないか、ほとんど阻害しない。

【0090】

一部の実施形態において、α－アミラーゼ阻害剤（例えばＧＩ２５４０２３Ｘ）及び／またはβ－アミラーゼ阻害剤（例えばＡＺＤ３８３９）は、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えば単離されたＡｐｏＥコンストラクト）、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えば単離されたＡｐｏＥポリペプチド、またはＡｐｏＥ突然変異体）、または前記（１）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列から由来するフラグメントによるγセクレターゼ切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）活性の阻害に影響を与えなく、または約５０％以下（例えば約４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％または以下）に影響を与える。例えば、α－アミラーゼ阻害剤またはβ－アミラーゼ阻害剤の存在下で、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドは、依然として、ＡＰＰから産生されるα－ＣＴＦレベルを向上し、Ａβの産生を低減することができる。

【0091】

γセクレターゼ切断（例えばＡＰＰに対するγ－切断）活性に対する影響は、当分野の任意の適当な方式、例えば、γセクレターゼの酵素活性自身を研究し、またはγセクレターゼの切断産物（例えばＡβ、如Ａβ４０またはＡβ４２）の特性または量を研究し、またはγセクレターゼ基質（例えばＡＰＰ、α－ＣＴＦ、β－ＣＴＦ、ＡＰＬＰ１、Ｎｏｔｃｈ、ＥｒｂＢ４、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ－Ｂ２あるいは ＣＤ４４）の特性または量（例えばγ切断により減少するかどうか）を研究することによって研究を行ってもよい。これらの研究方法は、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＢＣＡ、フローサイトメトリー、プロテオミクス、メタボロミクス、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、免疫共沈降、タンパク質蛍光標識、免疫染色などを含むが、これらに限定されなく、インビボでもインビトロでも可能（細胞実験または非細胞実験）である。任意のγセクレターゼ活性検出キット、例えばＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅの＃ＭＢＳ７０４５１３キット、またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの＃ＦＰ００３キットは、ここに用いられる。なお、実施例１と２に記載される研究方式も参照する。

【0092】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列）のＮ末端に、さらに、ＡｐｏＥ２タンパク質のＮ末端ドメイン配列または一部の配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位アミノ酸配列または一部の配列；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、及び／またはヒンジ領域配列または一部の配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１６８－２０５位アミノ酸配列または一部の配列；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、またはＡｐｏＥ２タンパク質のＮ末端ドメイン配列（または一部の配列）及び／またはヒンジ領域配列（または一部の配列）と少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の同一性を有する配列（例えば非ヒトの霊長類（例えばサル）のＡｐｏＥ同種配列）を含む。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列）のＮ末端に、さらに、ＡｐｏＥ３タンパク質のＮ末端ドメイン配列または一部の配列（例えば１－１６７位アミノ酸配列または一部の配列；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）、及び／またはヒンジ領域配列または一部の配列（例えば１６８－２０５位アミノ酸配列または一部の配列；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、またはＡｐｏＥ３タンパク質のＮ末端ドメイン配列（または一部の配列）及び／またはヒンジ領域配列（または一部の配列）と少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の同一性を有する配列（例えば非ヒトの霊長類（例えばサル）のＡｐｏＥ同種配列）を含む。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端に、さらに、ＡｐｏＥ Ｃ末端ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２０６－２９９位）から由来する一部の配列（例えばそのＮ末端一部の配列）、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２０６－２１４位アミノ酸の配列または一部の配列、またはＡｐｏＥ Ｃ末端ドメインの当該一部の配列と少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または以上）の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３タンパク質（または非ヒト同種タンパク質）のＮ末端ドメイン配列または一部の配列のＣ末端、または（Ｎ末端ドメイン＋ヒンジ領域）配列または一部の配列のＣ末端、または（Ｎ末端ドメイン＋ヒンジ領域＋Ｃ末端ドメインの一部のＮ末端配列）配列のＣ末端は、ペプチド結合またはリンカー配列（例えばタンパク質リンカー配列）によって、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端に接続する。一部の実施形態において、ヒトＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３タンパク質のＮ末端ドメイン（または一部の配列）及び／またはヒンジ領域（または一部の配列）及び／またはＣ末端ドメイン（またはそのＮ末端の一部の配列）に対して同種のＡｐｏＥタンパク質配列は、以下の任意の種から由来する配列である：哺乳動物（例えば非ヒトの霊長類例えばサル、げっ歯類、家畜、ペット）、鳥類、カエル、魚類、ショウジョウバエ、線虫など。

【0093】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列）のＮ末端に、さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）または１－２０５位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）または１－２１４位アミノ酸残基のアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列からなり、または基本的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列からなる。

【0094】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列）のＮ末端に、さらに、ＡｐｏＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）の１－１６７位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸残基のアミノ酸配列、またはＡｐｏＥ３の１－１６７位または１－２０５位または１－２１４位アミノ酸と少なくとも約７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0095】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＡｐｏＥ２（例えばヒトＡｐｏＥ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）の全長配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＡｐｏＥ３（例えばヒトＡｐｏＥ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）の全長配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。

【0096】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、またはＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３全長配列）のＮ末端またはＣ末端に、さらに一つの膜透過ペプチドを含む。一部の実施形態において、前記膜透過ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５－４５、６３－６５と８４－８６中のいずれか一つのアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。一部の実施形態において、前記膜透過ペプチド（例えばＣ末端）は、ペプチド結合またはリンカー配列（例えばタンパク質リンカー配列）によって、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＮ末端）、または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または８９の１－１６７位（またはそのフラグメント）または１－２０５位（またはそのフラグメント）または１－２１４位（またはそのフラグメント）アミノ酸残基を含むアミノ酸配列（例えばＮ末端）、または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または８９の１－１６７位（またはそのフラグメント）または１－２０５位（またはそのフラグメント）または１－２１４位（またはそのフラグメント）アミノ酸と少なくとも約７０％の同一性を有する配列（例えばＮ末端）に接続する。一部の実施形態において、前記膜透過ペプチドのＮ末端は、さらに、ペプチド結合またはリンカー配列によって、シグナルペプチドのＣ末端に接続する。一部の実施形態において、前記膜透過ペプチドは、前記ＡｐｏＥコンストラクトの最もＮ末端に位置する。一部の実施形態において、前記膜透過ペプチドは、前記ＡｐｏＥコンストラクトの最もＣ末端に位置する。

【0097】

一部の実施形態において、本発明は、ＡｐｏＥコンストラクト（または融合タンパク質）を提供し、当該融合タンパク質は、以下のエレメント（１）とエレメント（２）を含む：（１）膜透過ペプチド、と（２）ＡｐｏＥ２の全長配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、またはＡｐｏＥ３の全長配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）、またはＡｐｏＥ２の少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基を含むフラグメント。前記エレメント（１）とエレメント（２）の間は、ペプチド結合によって直接に接続しても良く、リンカー配列を介して接続しても良い。

【0098】

膜透過ペプチドまたは細胞膜透過ペプチド、巨大分子を細胞内に運ぶことができる一種の短いペプチドを指す。当分野によく知られる膜透過ペプチドで、本発明の融合タンパク質を構築しても良い。例示的なの膜透過ペプチドは、Ｓｉｅｇｍｕｎｄ Ｒｅｉｓｓｍａｎｎ、Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ： ｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ． ２０１４；２０：７６０-７８４を参照する。本明細書では、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。本発明に適する膜透過ペプチドは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）；ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）；ＫＱＡＩＰＶＡＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）；ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）；オリゴアルギニン（即ち、長さ９－１２個のアルギニン残基のフラグメント；Ｒ_９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）、Ｒ_１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）、Ｒ_１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）、Ｒ_１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６））；ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）；ＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）；ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）；ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）；ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）；ＹＴＡＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）；及びＫＳＶＲＴＷＮＥＩＩＰＳＫＧＣＬＲＶＧＧＲＣＨＰＨＶＮＧＧＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）を含むが、これらに限定されない。

【0099】

一部の実施形態において、融合タンパク質におけるエレメント（２）に記載のＡｐｏＥ２の少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の２２１－２７４位アミノ酸残基を含むフラグメントは、本明細書のいずれか一つの実施形態に記載の単離されたＡｐｏＥポリペプチド、及びＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３のＮ末端とヒンジ領域（またはそのフラグメント）及びＣ末端の少なくとも２２１－２７４位アミノ酸残基を含有するフラグメントであっても良い。一部の実施形態において、前記のＡｐｏＥ２ポリペプチドは、以下のいずれか一つの配列を含んでも良い：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１－２７４位、１－２７９位、及び１－２８０位、１－２８１位、１－２８２位、１－２８３位、１－２８４位、１－２８５位、１－２８６位、１－２８７位、１－２８８位、１－２８９位、１－２９０位、１－２９１位、１－２９２位、１－２９３位、１－２９４位、１－２９５位、１－２９６位、１－２９７位、１－２９８位、または１－２９９位アミノ酸残基。

【0100】

一部の実施形態において、前記融合タンパク質におけるエレメント（２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、１３、１８－３４、６０、７８、８７と８９中のいずれか一つのアミノ酸配列から選ばれる。

【0101】

一部の実施形態において、前記リンカーは、非タンパク質リンカーである。一部の実施形態において、前記リンカーは、タンパク質リンカーである。一部の実施形態において、前記リンカーは、３～２５個の残基を含むペプチド、例えば３～１５、５～１５、１０～２０、２０－２５、または３－１０個の残基を含むペプチドである。ペプチドリンカーの適当な実例は、当分野で公知されるものである。通常、リンカーは、一つまたは複数の前後に反復するモチーフを含有し、当該モチーフは、通常にＧｌｙ及び／またはＳｅｒを含有する。例えば、当該モチーフは、ＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）、ＧＳＳＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）、ＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１）、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）、ＳＳＳＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）、ＧＳＧＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）ＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）またはＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）であっても良い。一部の実施形態において、前記モチーフは、リンカー配列中で隣接し、繰り返し部分の間にアミノ酸残基は挿入されていない。リンカー配列は、１、２、３、４又は５個の繰り返しモチーフの組成を含んでも良い。ある実施の形態において、リンカー配列は、ポリグリシンリンカー配列である。リンカー配列におけるグリシンの数は、特に制限されなく、通常に、２～２０個、例えば２～１５、２～１０、２～８個である。グリシンとセリン以外に、リンカーには、他の既知なアミノ酸残基、例えばアラニン、ロイシン、スレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、アルギニン、グルタミンなどを含んでも良い。一部の実施形態において、前記リンカー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８に示される。

【0102】

本発明のＡｐｏＥコンストラクトまたは融合タンパク質には、遺伝子クローニング操作、融合タンパク質の構築、組換えタンパク質の発現の促進、宿主細胞から自動的に分泌される組換えタンパク質の取得、または組換えタンパク質の検出および／または精製の容易化などを目的として、融合タンパク質へアミノ酸残基または配列を導入することも可能である。一部の実施形態において、本発明のＡｐｏＥコンストラクトまたは融合タンパク質には、さらに、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端伸長、タグタンパク質などを含む。

【0103】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、特に細胞で発現するしようとする場合、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端に、さらに、シグナルペプチドを含む。一部の実施形態において、前記シグナルペプチドのＣ末端は、ペプチド結合またはリンカー配列（例えばタンパク質リンカー配列）によって、前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、またはＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３全長配列）のＮ末端、または前記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または８９の１－１６７位（またはそのフラグメント）または１－２０５位（またはそのフラグメント）または１－２１４位（またはそのフラグメント）アミノ酸残基を含むアミノ酸配列のＮ末端、または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または８９の１－１６７位（またはそのフラグメント）または１－２０５位（またはそのフラグメント）または１－２１４位（またはそのフラグメント）アミノ酸と少なくとも約７０％の同一性を有する配列のＮ末端、または膜透過ペプチドのＮ末端に接続する。一部の実施形態において、前記シグナルペプチドは、前記ＡｐｏＥコンストラクトの最もＮ末端に位置する。一部の実施形態において、前記シグナルペプチドは、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列のＮ末端に挿入される。一部の実施形態において、前記シグナルペプチドは、さらに、ＡｐｏＥ２（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）の全長配列のＮ末端に挿入される。一部の実施形態において、前記シグナルペプチドのＣ末端は、さらに、ペプチド結合またはリンカー配列（例えばタンパク質リンカー配列）によって、膜透過ペプチドのＮ末端に接続する。任意のよく知られたシグナルペプチドは、ここで用いられる。一部の実施形態において、前記シグナルペプチドは、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたは前記ＡｐｏＥポリペプチドに対して同種であり、例えばＡｐｏＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）タンパク質自己から由来するシグナルペプチドである。一部の実施形態において、前記シグナルペプチドは、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたは前記ＡｐｏＥポリペプチドに対して異種であり、例えば、ＡｐｏＡ１またはＡｐｏＪから由来するシグナルペプチドである。一部の実施形態において、前記シグナルペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６－６８に示されるいずれか一つのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。

【0104】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端まで、以下の配列を含む（またはそれらからなる、または基本的にそれらからなる）：
シグナルペプチド－任意のリンカー１－膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列）－任意のリンカー２ － ＡｐｏＥ２タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）；
シグナルペプチド－任意のリンカー－ＡｐｏＥ２タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）；
ＡｐｏＥ２タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）；
膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列）－任意のリンカー－ＡｐｏＥ２タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）またはＡｐｏＥ３タンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）；
シグナルペプチド－任意のリンカー１ － 膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列）－任意のリンカー２ － いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）；
膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列）－任意のリンカー－いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）；
シグナルペプチド－任意のリンカー－いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）；
いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）；
シグナルペプチド－任意のリンカー１－膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列）－任意のリンカー２－ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３ Ｎ末端ドメイン及び／またはヒンジ領域及び／または（Ｃ末端ドメインのＮ末端）配列またはフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９－８１と９０中のいずれか一つに示されるアミノ酸配列またはそのフラグメント）－任意のリンカー３－いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）；
膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列）－任意のリンカー１－ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３ Ｎ末端ドメイン及び／またはヒンジ領域及び／または（Ｃ末端ドメインのＮ末端）配列またはフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９－８１と９０中のいずれか一つに示されるアミノ酸配列またはそのフラグメント）－任意のリンカー２－いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）；
シグナルペプチド－任意のリンカー１－ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３ Ｎ末端ドメイン及び／またはヒンジ領域及び／または（Ｃ末端ドメインのＮ末端）配列またはフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９－８１と９０中のいずれか一つに示されるアミノ酸配列またはそのフラグメント）－任意のリンカー２－いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）；
ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３ Ｎ末端ドメイン及び／またはヒンジ領域及び／または（Ｃ末端ドメインのＮ末端）配列またはフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９－８１と９０中のいずれか一つに示されるアミノ酸配列またはそのフラグメント）－任意のリンカー－いずれか一つの前記ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７のいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）；
シグナルペプチド－任意のリンカー１－膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列）－任意のリンカー２－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列）；
膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５に示されるアミノ酸配列）－任意のリンカー－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列）；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列；または
シグナルペプチド－任意のリンカー－（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１に示されるアミノ酸配列）。

【0105】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に、さらに、タグタンパク質を含む。一部の実施形態において、前記タグタンパク質は、前記ＡｐｏＥコンストラクトの最もＮ末端に位置する。一部の実施形態において、前記タグタンパク質は、前記ＡｐｏＥコンストラクトの最もＣ末端に位置する。一部の実施形態において、前記タグタンパク質（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に示される３ＸＦＬＡＧ配列）は、前記ＡｐｏＥコンストラクトの内部に位置するが、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端に位置し、例えば、前記ＡｐｏＥポリペプチドのＮ末端に直接に連結する。前記タグタンパク質は、発現精製タグ（例えばＨｉｓ－ｔａｇ、ＦＬＡＧ－ｔａｇ、ＧＳＴ－ｔａｇ、ｃ－Ｍｙｃ－ｔａｇ、Ｖ５－ｔａｇ、ＨＡ－ｔａｇ）であっても良く、または、検出タグ（例えばＧＦＰ、ＲＦＰ、Ｖ５、ＨＡ）であっても良い。一部の実施形態において、精製タグは、検出に使用されてもよく、例えば免疫ブロットまたは抗体による検出に用いられる。一部の実施形態において、前記タグタンパク質は、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えばＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３配列を含むＡｐｏＥポリペプチド）の最もＮ末端に位置する。一部の実施形態において、前記タグタンパク質は、前記ＡｐｏＥコンストラクトの最もＣ末端に位置する。一部の実施形態において、前記タグタンパク質は、Ｖ５タグＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）またはＩＰＮＰＬＬＧＬＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）である。一部の実施形態において、前記タグタンパク質は、ＦＬＡＧタグ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）である。

【0106】

アミロイド前駆体タンパク質（Ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＰＰ）と加水分解
ＡＰＰは、細胞膜に埋め込まれたタンパク質であり、主にニューロンのシナプスに集中すす。それが、α、β、γセクレターゼの切断部位を含有する。ＡＰＰは、多くの異なる種で発現され、高い相同性を持つ。本明細書に記載のＡＰＰは、いずれかの種から由来されてもよく、例えば哺乳動物、鳥類、カエル、魚類、ショウジョウバエ、線虫などから由来されてもよい。哺乳動物は、霊長類（例えばヒト、または非ヒト霊長類例えばサル）、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、リス、モルモット、ウサギ）、家畜（例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ロバ）、ペット（例えば猫、犬、ウサギ、ハムスターなど）を含むが、これらに限定されない。一部の実施の形態において、前記ＡＰＰは、ヒトＡＰＰである。

【0107】

ＡＰＰのアミロイド代謝が、短いβアミロイドポリペプチド（Ａβ）を産生する。Ａβポリペプチドは、ＡβのＮ末端位置近くのβ－セクレターゼ活性による、およびＡβのＣ末端位置近くのガンマセクレターゼ活性によるＡＰＰの切断によって調製される。ＡＰＰはα－セクレターゼ活性によっても切断され、可溶性 ＡＰＰα の分泌された非アミロイド フラグメントが生成される。β部位ＡＰＰ切断酵素（「ＢＡＣＥ－１」）は、βセクレターゼ活性によるＡβの産生に関与する主要なアスパルチル プロテアーゼであると考えられる。ＢＡＣＥ－１阻害はＡβの産生を阻害する。ＢＡＣＥ１は、ＡＰＰを切断し、細胞外ドメイン（ｓＡＰＰβ）を細胞外空間に放出する内腔活性部位を持つＩ型膜貫通タンパク質である。残りのＣ末端フラグメント（ＣＴＦ）は、γ－セクレターゼによってさらに切断され、その結果、ＡβおよびＡＰＰ細胞内Ｃ末端ドメイン（ＡＩＣＤ）が放出される。プレセニリンはγ－セクレターゼの主要な酵素成分であり、γ－セクレターゼによるＡＰＰの不正確な切断により、Ｃ末端で長さが数アミノ酸ずつ異なる連続したＡβポリペプチドが産生される。ほとんどのＡβは、通常に、アミノ酸４０（Ａβ４０）で終わるが、４２アミノ酸バリアント（Ａβ４２）は、凝集しやすいことが示され、老人斑形成の核となるとの仮説が立てられる。γ－セクレターゼの調節も、３８アミノ酸バリアント（Ａβ３８）の増加につながる可能性がある。競合するα－セクレターゼ経路は、α－セクレターゼとγ－セクレターゼによる連続的な切断の結果である。ＡＤＡＭ－１０は、ＡＰＰ切断のためのα－セクレターゼであり、当該切断は、神経保護機能を示す細胞外ドメイン（ｓＡＰＰα）を放出する（Ｌａｍｍｉｃｈら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３９２２－３９２７）。続いて８３アミノ酸ＣＴＦ（Ｃ８３）が切断され、ｐ３（非アミロイド性）とＡＩＣＤが放出される（Ｆｕｒｕｋａｗａら，（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６７：１８８２－１８９６）。

【0108】

Ａβは、βアミロイド線維および斑の主要成分であり、前記βアミロイド線維及び斑は、増加する病状に関与していると考えられる。このような病状の例は、アルツハイマー病、ダウン症候群、パーキンソン病、記憶喪失（アルツハイマー病およびパーキンソン病に伴う記憶喪失を含む）、注意欠陥障害（アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するものを含む）、認知症（初老期認知症、老人性認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、ダウン症候群に関連する認知症を含む）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性、神経変性、嗅覚障害（アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症候群に関連するものを含む）、ベータアミロイド脳血管疾患（脳アミロイド脳血管疾患を含む）、遺伝性脳出血、軽度認知障害（「ＭＣＩ」）、緑内障、アミロイドーシス、ＩＩ型糖尿病、血液透析（β２ミクログロブリンとその合併症）、スクレイピー、牛海綿状脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、外傷性脳損傷などの神経変性疾患を含むが、これらに限定されない。

【0109】

一部の実施の形態において、前記ＡＰＰは、野生型ＡＰＰである。一部の実施の形態において、前記ＡＰＰは、天然に存在するＡＰＰサブタイプである。一部の実施形態において、前記ＡＰＰは、任意の既知または未知のＡＰＰ突然変異体を含むがこれらに限定されない突然変異体である。ＡＰＰ突然変異は、１２１ファミリーで確認される。最も一般的なミスセンス変異は、Ｖａｌ^７１７残基をＩｌｅ（ロンドン変異）、Ｐｈｅ、またはＧｌｙ残基に置き換え、Ｇｌｕ^６９３をＧｌｎ残基（Ｄｕｔｃｈ変異）またはＧｌｙ残基（Ａｒｃｔｉｃ変異）に置き換え、または、Ｌｙｓ^６７０とＭｅｔ^６７１をＡｓｎとＬｅｕ残基に置き換える（二重変異はスウェーデン変異ＡＰＰ_ＳＷと呼ばれ、ＡＰＰ_７７０アイソフォームで番号が付けられる）。一部の実施形態において、前記ＡＰＰは、ヒトＡＰＰであり、以下の一つまたは複数の突然変異を含む：Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ、スウェーデン（Ｋ６７０Ｎ＋Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ（Ｉ７１６Ｖ）、ロンドン（Ｖ７１７Ｉ）、ＡＰＰ_{Ｍ５９６Ｖ}（β切断は実行できない）、γ切断部位に近いｆＡＤ変異（例えば、Ｔ７１４Ｉ、Ｖ７１７Ｆ、Ｌ７２３Ｐ）、βまたはα切断部位に近いｆＡＤ突然変異（例えば、ＫＭ６７０／６７１ＮＬ、Ｅ６９３Ｋ、Ｅ６９３Δ）、または保護的アイスランド突然変異（Ａ６７３Ｔ）。一部の実施形態において、前記ＡＰＰは、γ－切断に影響を与える突然変異、例えばγ部位に近い突然変異を含まない。

【0110】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドは、いずれか一つのＡＰＰのγ－切割を阻害（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を阻害）することができる。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドによるいずれか一つの前記ＡＰＰ突然変異体のγ－切割を阻害する能力は、それによる野生型ＡＰＰのγ－切割を阻害する能力の少なくとも約３０％（例えば少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）である。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドは、γ－切断に影響を与える突然変異を含むＡＰＰ（例えばＴ７１４Ｉ、Ｖ７１７Ｆ、Ｌ７２３Ｐ）のγ－切割を阻害する能力が、野生型ＡＰＰのγ－切割を阻害する能力より低い（例えば少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％低い）。

【0111】

γセクレターゼ
γセクレターゼ複合体は、四つの単独のタンパク質からなる：ＰＳＥＮ１（プレセニリン１、ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ－１，ＰＳ１）、ｎｉｃａｓｔｒｉｎ、ＡＰＨ－１（前咽頭欠陥１、ａｎｔｅｒｉｏｒ ｐｈａｒｙｎｘ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ １）とＰＥＮ－２（プレセニリンエンハンサー２、ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ２）。最近の証拠は、複合体の５番目のタンパク質であるＣＤ１４７が、非必須の制御因子であり、ＣＤ１４７が存在しないと、γ－セクレターゼ活性が増加することを示唆する。
本明細書に記載のγセクレターゼは、いずれかの種から由来されてもよく、例えば哺乳動物、鳥類、カエル、魚類、ショウジョウバエ、線虫などから由来されてもよい。一部の実施形態において、前記γセクレターゼは、ヒト、または非ヒトの霊長類、例えばサルから由来する。

【0112】

一部の実施形態において、本明細書に記載のγセクレターゼは、野生型γセクレターゼ、または自然に存在するサブタイプである。一部の実施形態において、前記γセクレターゼは、一つまたは複数の突然変異、例えばその切断活性を増強または低下する突然変異を含む。一部の実施形態において、前記γセクレターゼは、ＰＳ１に一つまたは二つの突然変異を有する：Ｍ１４６Ｌ、Ｌ２８６Ｖ。一部の実施形態において、前記γセクレターゼのＰＳ１及び／またはＰＳ２活性は、低下または欠失する。

【0113】

一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドは、いずれか一つのγセクレターゼの酵素活性を阻害（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を阻害）することができる。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドによるいずれか一つの前記γセクレターゼ突然変異体酵素活性を阻害する能力は、それによる野生型γセクレターゼ酵素活性を阻害する能力の少なくとも約３０％（例えば少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１．５倍、２倍、５倍、１０倍または以上）である。

【0114】

３．ＡｐｏＥコンストラクトの製造方法
本発明は、さらに、以上のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、６０、６１と８９のいずれか一つのアミノ酸配列）、融合タンパク質、またはＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）のタンパク質部分をコードする単離された核酸とベクター（例えばクローニングベクターまたは発現ベクター）、及び以上のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクトを発現する宿主細胞、または当該核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、前記ベクターは、組換えＡＡＶまたはｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ発現ベクターである。一部の実施形態において、前記ベクターが、前記単離された核酸の５’末端に、ニューロン特異的プロモーターを有する。一部の実施形態において、前記ニューロン特異的プロモーターが、シナプシンプロモーター（例えばｈＳＹＮ）、ｔｈｙ－１プロモーターとカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ－αプロモーターから選ばれる。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、神経細胞、例えばニューロン（例えばヒトニューロン、ヒト以外の霊長類ニューロン、またはげっ歯類ニューロン）である。実施例１と２のベクター、細胞と製造方法を参照する。

【0115】

一部の実施形態において、本発明は、神経細胞におけるいずれか一つの前記ＡｐｏＥコンストラクト、融合タンパク質、またはＡｐｏＥポリペプチドの特異的発現を媒介する核酸またはベクターを提供する。一部の実施形態において、本発明は、ベクターまたは単離された核酸を提供し、それが、以下の５’～３’配列を含む：ニューロン特異的プロモーター（例えばｈＳＹＮ）－シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列-膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５）をコードするヌクレオチド配列-いずれか一つの前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または８９）／融合タンパク質／ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）をコードするヌクレオチド配列。一部の実施形態において、本発明は、ベクターまたは単離された核酸を提供し、それが、以下の５’～３’配列を含む：ニューロン特異的プロモーター（例えばｈＳＹＮ）-膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３または６５）をコードするヌクレオチド配列-いずれか一つの前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または８９）／融合タンパク質／ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）をコードするヌクレオチド配列。一部の実施形態において、本発明は、ベクターまたは単離された核酸を提供し、それが、以下の５’～３’配列を含む：ニューロン特異的プロモーター（例えばｈＳＹＮ）－シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列-いずれか一つの前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または８９）／融合タンパク質／ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）をコードするヌクレオチド配列。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３の全長配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥコンストラクトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０または６１のアミノ酸配列を含む（またはそれからなる、または基本的にそれからなる）。一部の実施形態において、前記ＡｐｏＥポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を含む（またはそれからなる、または基本のにそれからなる）。

【0116】

本願は、以上のいずれか一つに記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト、融合タンパク質、またはＡｐｏＥポリペプチドをコードする核酸分子及びその相補配列も含む。本発明は、本発明の核酸分子の全ての形式（ＲＮＡとＤＮＡを含む）を含む。本明細書に記載の相補配列は、長さが当該核酸分子と基本的に一致（例えば長さは、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同）する相補配列を指し、例えば少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補である。

【0117】

前記核酸分子またはその相補配列を含有する核酸コンストラクトも本発明の範囲に含まれる。核酸コンストラクトは、プロモーター、前記核酸分子及び転写終結配列を含有する発現カセットであっても良い。発現カセットは、発現に必要なエンハンサーを任意に含んでもよい。プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、選択可能なマーカーおよびシグナル配列は、当技術分野で周知であり、当業者は、前記ポリペプチドの発現のために選択された宿主細胞に従って適切に選択することができる。発現カセット中のこれらのエレメントは、意図された機能を実行できるように、相互に動作可能に連結される。例えば、プロモーター配列を目的のヌクレオチド配列に作動可能に接続するとは、プロモーター配列は、標的細胞における目的のヌクレオチド配列の転写および／または目的のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの合成を指示することができるように、プロモーター配列と目的のヌクレオチド配列を接続することを指す。選択可能なマーカーは、ベクターが挿入された宿主細胞を、ベクターが挿入されていない宿主細胞から選択するのに役立ち、例えば、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性を与える遺伝子であっても良い。発現されたポリペプチドを宿主細胞の外部へ輸送できるように、シグナル配列を選択する。

【0118】

遺伝制御エレメントは、ポリペプチドまたはタンパク質の遺伝子発現の制御に用いられてもよい。このような遺伝子制御エレメントは、関連する宿主細胞内で活性となるように選択される。制御エレメントは、構成的に活性を有し、または特定の条件下で誘導可能である。誘導可能な制御エレメント、毒性のあるまたは細胞の成長及び／または生存力に他の悪影響を与えるタンパク質を発現する場合に特に役立つ。当該場合、誘導可能な制御エレメントによってポリペプチドまたはタンパク質の発現を制御し、細胞生存率、細胞密度、および／または発現されたポリペプチドまたはタンパク質の総収量を改善することができる。本発明を実施するために使用できる多数の制御エレメントが、当技術分野で知られており、入手可能である。

【0119】

本発明において有用な代表的な構成的哺乳類プロモーターとしては、ヒポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）プロモーター、アデノシン デアミナーゼ プロモーター、ピルビン酸キナーゼ プロモーター、β＋アクチン プロモーター及び当業者に知られている他の構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、真核細胞においてコード配列の構成的発現を駆動することができるウイルスプロモーターは、サルウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、パピローマウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス、その他のレトロウイルスロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、及び当業者に知られている他のウイルスプロモーターを含む。

【0120】

誘導性プロモーターは、誘導剤が存在する場合、有効的に接続されるコード配列の発現を駆動することができ、または、本発明に従って使用することができる。たとえば、哺乳動物細胞では、メタロチオネイン プロモーターは、特定の金属イオンの存在下で、下流のコード配列の転写を誘導できる。他の誘導性プロモーターは、当業者に認識および／または知られている。

【0121】

一部の実施形態において、本発明に適する遺伝子発現制御エレメントは、プロモーターおよびエンハンサーを含むニューロン特異的制御エレメントである。本明細書で使用する場合、「ニューロン特異的」制御エレメントという用語は、ニューロンにおける目的の核酸分子の特異的発現のためのプロモーターおよびエンハンサーなどの制御エレメントを指す。一部の実施形態において、ニューロン特異的プロモーターは、特定のサブタイプのニューロン（例えば、ドーパミン作動性ニューロン、興奮性ニューロン、外側前頭前皮質ニューロンなど）における導入遺伝子の発現のためのプロモーターである。

【0122】

ニューロン特異的プロモーターと他の制御エレメント（エンハンサーなど）は、当技術分野で知られる。適切なニューロン特異的プロモーターは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター、シナプシンプロモーター、ｔｈｙ－１プロモーター、セロトニン受容体プロモーター、チロシン水酸化酵素プロモーター、ＧｎＲＨプロモーター、Ｌ７プロモーター、ＤＮＭＴプロモーター、エンケファリンプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ－αプロモーター、ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子－βプロモーターを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記ニューロン特異的プロモーターが、シナプシンプロモーター（例えばｈＳＹＮ）、ｔｈｙ－１プロモーターとカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ－αプロモーターから選ばれる。

【0123】

一般に、遺伝子発現配列は、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などのそれぞれに転写と翻訳の開始に関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列を含む。エンハンサーエレメントを任意に使用し、発現されるポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルを増強することができる。哺乳動物細胞で機能するエンハンサーエレメントの実例は、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら，ＥＭＢ０Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載）とヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載）長末端反復配列からのエンハンサー／プロモーターを含む。

【0124】

制御エレメントをコード配列に接続するためのシステムは、当技術分野でよく知られている（一般的な分子生物学および組換えＤＮＡ技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９年、参照により本明細書に組み込まれる）。様々な増殖条件および誘導条件下で、様々な哺乳動物細胞内で発現させるための好ましいコード配列を挿入するのに適する市販のベクターも、当技術分野で公知である。

【0125】

一部の実施形態において、核酸コンストラクトは、発現ベクターおよびクローニングベクターを含むベクターである。発現ベクターは、本発明に記載のポリペプチド（例えばＡｐｏＥ２もしくはＡｐｏＥ３の全長配列、あるいは本明細書に記載のいずれかのＡｐｏＥコンストラクト、ＡｐｏＥポリペプチドもしくは融合タンパク質）をコードする核酸分子などの外来遺伝子を宿主細胞内で発現するのに適するベクターであり、原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターを含む。真核生物の発現システムは、酵母菌の発現システム、哺乳類細胞の発現システム、昆虫細胞の発現システムなどを含む。クローニングベクターは、宿主細胞内で標的遺伝子（例えば本発明のポリペプチドをコードする核酸分子）を増幅するために使用される。クローニングベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、および相互にまたは他のゲノムＤＮＡと結合したベクターを含む。分子クローニングには、最も一般的に使用される宿主細胞は大腸菌である。

【0126】

一部の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターであり、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含むが、これらに限定されない。このようなベクターは、当技術分野の標準的な方法を使用して調製することができる。一部の実施形態において、前記ベクターは、ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓまたはｌｅｎｔｉｖｉｒａｌベクターである。

【0127】

一部の実施形態において、前記ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、当技術分野の標準的な方法を使用して調製することができる。あらゆる血清型のアデノ随伴ウイルスベクターを使用しても良く、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５とＡＡＶ１６を含むが、これらに限定されない。

【0128】

一部の実施形態において、本発明は、ベクター（例えばＡＡＶまたはレンチウイルスベクター）を提供し、それが、発現カセットを含み、当該発現カセットは、目的の核酸分子に作動可能に連結されたニューロン特異的プロモーター（例えばｈＳｙｎ）を含み、当該目的の核酸分子は、本発明のいずれか一つの前記ＡｐｏＥ Ｃ末端フラグメントをコードする核酸分子、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３全長タンパク質をコードする核酸分子、本発明のいずれか一つの前記ＡｐｏＥ２コンストラクトまたは融合タンパク質をコードする核酸分子、または本発明のいずれか一つの前記ＡｐｏＥ２ポリペプチドをコードする核酸分子から選ばれる。好ましくは、当該ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。好ましくは、本明細書に適するニューロン特異的プロモーターは、シナプシンプロモーター、ｔｈｙ－１プロモーターとカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ－αプロモーターを含む。一部の実施形態において、前記目的の核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１２、１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６０－６２、７６、７８、８７と８９中のいずれか一つに示されるアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、前記目的の核酸分子は、さらに、Ｎ末端のシグナルペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６－６８中のいずれか一つのアミノ酸配列）をコードする。一部の実施形態において、前記目的の核酸分子は、さらにＮ末端及び／またはＣ末端の膜透過ペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５－４５、６３－６５と８４－８６中のいずれか一つのアミノ酸配列）をコードする。一部の実施形態において、前記目的の核酸分子は、さらに、Ｎ末端及び／またはＣ末端のタグタンパク質（例えばＶ５、ＥＧＦＰ）をコードする。

【0129】

本発明は、さらに、本明細書に開示される核酸分子、核酸コンストラクトまたはベクターを含む発現システムを提供する。発現システムは、例えば、本発明のポリペプチドを発現するように改変された大腸菌などのグラム陽性またはグラム陰性の原核宿主細胞システムであってもよい。一部の実施形態において、発現システムは、ピキア・パストリスまたはサッカロミセス・セレビシエなどの酵母などの真核宿主細胞システムである。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、例えばＨＥＫ ２９３Ｔ、Ｎ２Ａ、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、神経細胞であり、グリア細胞とニューロンを含むが、これらに限定されない。高等真核細胞、特に多細胞生物に由来する細胞は、グリコシル化ポリペプチドの発現に使用することができる。適切な高等真核細胞は、脊椎動物細胞だけでなく、無脊椎動物細胞および昆虫細胞を含むが、これらに限定されない。

【0130】

目的のポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な十分な量の核酸を宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）に導入するのに適する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０－６２５（１９８１）；マンテイら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０－４６（１９７９）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、ＥＰ １１７，０６０、およびＥＰ １１７，０５８を参照し、それらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。ベクターは、当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して宿主細胞に導入されてもよく、前記方法は、ＤＥＡＥデキストラン媒介送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン性脂質媒介送達、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、微粒子衝撃、受容体媒介遺伝子送達、ポリリジン、ヒストン、キトサンおよびペプチド媒介送達を含むが、これらに限定されない。哺乳動物細胞にとって、好ましい形質転換方法は、Ｇｒａｈａｍとｖａｎ ｄｅｒ ＥｒｂがＶｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６－４５７（１９７８）で開示したリン酸カルシウム沈殿法、または、Ｈａｗｌｅｙ－Ｎｅｌｓｏｎ、Ｆｏｃｕｓ １５：７３（１１９３）のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）法を含む。哺乳動物細胞宿主システムの形質転換の一般的な態様は、Ａｘｅｌによって１９８３年８月１６日に出願された米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術は、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７－５３７（１９９０）、及びＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８－３５２（１９８８）に見出すことができる。哺乳動物細胞において、ポリペプチドまたはタンパク質を発現させるための適切なベクターの非限定的な代表例としては、Ｐ（３）ＮＡｌ；ｐ（３）（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６－１１４２）、ｐＭＣｌｎｅｏＰｏｌｙ－Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３－５１２）、バキュロウイルスベクター（例えばＰＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）が挙げられる。

【0131】

一部の実施形態において、本発明に記載のポリペプチドまたはタンパク質は、宿主細胞に安定にトランスフェクトされる。しかし、当業者であれば、本発明が宿主細胞を一過性にまたは安定にトランスフェクトするために使用できることを認識すべきである。

【0132】

標的タンパク質またはポリペプチドを標的細胞に導入するには、リポソームを使用して標的タンパク質をコードするＤＮＡ（プラスミドなど）またはＲＮＡを送達する方法や、標的タンパク質をコードするレンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを使用して細胞に感染する方法など、多くの方法がある。

【0133】

細胞培養およびポリペプチド発現を受けやすい任意の哺乳動物細胞または細胞タイプを本発明で使用することができる。本発明において有用な哺乳類細胞の非限定的な実例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞腫細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌＩ、オランダ、ライデン））、ＳＶ４０形質転換サル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎児腎臓細胞株（懸濁培地中での増殖のためにサブクローン化された２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨ０，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ１．ＵＳＡ，７７：４２ １６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３－２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲ０－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃ１．、３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４ 細胞およびヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス神経細胞Ｎ２Ａを含む。

【0134】

単離された宿主細胞は、ベクターに挿入された単離された核酸の発現を可能にする条件下で培養される。ポリヌクレオチドの発現に適する条件としては、適切な培地、培地中の宿主細胞の適切な密度、必要な栄養素の存在、補助因子の存在、適切な温度と湿度、および微生物汚染物質が存在しないことを含むが、これらに限定されない。当業者は、発現目的に適切な条件を選択し、本発明のステップおよび組成物を適切に変更し、細胞の成長および／または任意の所与の発現されたポリペプチドまたはタンパク質の産生を最適化することができる。

【0135】

宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）を調製する様々な方法が当技術分野で知られている。例えば、発現に十分な核酸（一般に、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子および任意の作動可能に連結された遺伝子制御エレメントを含むベクター）は、任意の数の周知の技術によって、宿主細胞株に導入されてもよい。一般に、どの宿主細胞が実際にベクターを獲得し、目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現したかを決定するために、細胞をスクリーニングする。宿主細胞によって発現される特定の目的のポリペプチドまたはタンパク質を検出するための日常的な方法は、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術、生物活性アッセイおよびアフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。当業者は、発現されたポリペプチドまたはタンパク質を検出する他の適切な技術を知っている。複数の宿主細胞が、目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する場合、前記技術の一部またはすべてを使用し、どの細胞が最も高いレベルのポリペプチドまたはタンパク質を発現するかを確定することができる。

【0136】

１つ又は複数の発現されたポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体は、任意の適切な方法を使用して収集されてもよい。１つ又は複数のポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体は、細胞内、細胞質周囲腔内で発現することができるか、または細胞外の培地中に分泌することができる。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を、細胞内で発現する場合、ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を含む宿主細胞は溶解し、かつ、ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を、遠心分離または限外濾過によって溶解物から単離し、望ましくない残骸を除去しても良い。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を、大腸菌のペリプラズム空間に分泌する場合、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ ３．５）、ＥＤＴＡとフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）などの薬剤の存在下で、約３０分間解凍し、細胞破片を遠心分離によって除去することができる（Ｃａｒｔｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。ポリペプチドおよび／またはポリペプチド複合体を、培地中に分泌する場合、細胞培養物の上清を収集し、かつＡｍｉｎｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置などの市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して濃縮することができる。タンパク質の分解および／または汚染微生物の増殖を阻害するために、プロテアーゼ阻害剤および／または抗生物質が収集および濃縮のステップに含まれてもよい。

【0137】

ポリペプチドまたはタンパク質を、標準的な方法で単離および精製でき、クロマトグラフィー、ゲル濾過、遠心分離または溶解度差、エタノール沈殿、またはその他のタンパク質精製に利用可能な技術を含むがこれらに限定されない（Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８７を参照；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．およびＨａｍｅｓのＢ．Ｄ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、オックスフォード大学出版局、１９９９年；およびＤｅｕｔｓｃｈｅｒ， Ｍ．Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．１．、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｖｏｌ １８２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７、すべて参照により本明細書に組み込まれる）。具体的に、免疫アフィニティークロマトグラフィーの場合、タンパク質に対して生成され、固体支持体上に固定化された抗体を含むアフィニティーカラムにタンパク質を結合させることで、タンパク質を分離できる。あるいは、標準的な組換え技術を使用し、インフルエンザコート配列、ポリヒスチジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に結合させることができ、適切なアフィニティーカラムによる簡単な精製が可能になる。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプシン阻害剤、アプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤を、任意の段階またはすべての段階で添加して、精製中のペプチドまたはタンパク質の分解を軽減または解消できる。発現されたポリペプチドまたはタンパク質を単離および精製するために、細胞を溶解する必要がある場合、プロテアーゼ阻害剤は、特に必要となる。当業者は、特定の精製技術が、精製されるポリペプチドまたはタンパク質の特性、、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞の特性、および細胞成長のための培地の組成に応じて変化することを認識すべきである。

【0138】

４． 医薬組成物とキット
本発明は、さらに、医薬組成物を提供し、それが、（ｉ）本明細書のいずれか一つの前記の単離されたＡｐｏＥコンストラクト（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、６０、６１と８９中のいずれか一つのアミノ酸配列）、融合タンパク質、単離されたＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、単離された核酸、ベクター（例えばＡｐｏＥコンストラクト（例えば全長ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３）またはＡｐｏＥポリペプチドを神経特異的に発現するベクター）、または宿主細胞、及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体；を含有する。

【0139】

以下の効果を達成するのに有効な活性成分の量を得るために、医薬組成物における活性成分（即ち、本発明のＡｐｏＥコンストラクト、ＡｐｏＥポリペプチド（例えばＡｐｏＥ Ｃ末端ポリペプチド）、融合タンパク質または発現ベクター）の実際の投与量のレベルを、変化してもよい：患者に毒性を与えることなく、特定の患者、組成物、投与方法に対して望ましい治療反応を達成する。選択される投与量のレベルは、本発明で使用されるポリペプチドまたは発現ベクターの活性、投与経路、投与時間、治療続き期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の医薬品、化合物および／または物質、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態および以前の病歴、および医療分野でよく知られている同様の因子を含む、様々な薬物動態学的要因に依存する。

【0140】

本明細書で使用される場合、薬学的に許容される担体は、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを含み、水、動物油、植物油、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリル、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含むが、これらに限定されない。必要があれば、当該組成物は、少量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。典型的には、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で、暴露された細胞に対して毒性がなく、以下を含む：リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸とメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピルなどのｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドロカルビル；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清タンパク質、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、デキストリンなどの他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロースや塩化ナトリウムなどの張性調整剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ^{（登録商標）}、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^{（登録商標）}またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。

【0141】

一部の実施形態において、医薬組成物は、例えば、約５．０～約８．０、約６．５～約７．５、または約６．５～約７．０のｐＨ範囲のいずれかを含む、約４．５～約９．０の範囲のｐＨを有するように製剤される。一部の実施形態において、グリセロールなどの適切な張性調整剤を添加することによって、医薬組成物を血液と等張にすることもできる。

【0142】

インビボで投与しようとする医薬組成物は、通常、無菌の実質的に等張性の医薬組成物として製剤され、米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠している。滅菌は、滅菌フィルター膜でろ過することで簡単に行える。一部の実施形態において、組成物は、病原体を含まない。注射の場合、医薬組成物は、例えばハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）またはリンガー液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの生理学的に適合するバッファー中の溶液の形態であってもよい。さらに、医薬組成物は固体の形態であり、使用直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥された組成物も含まれる。

【0143】

本明細書では、医薬組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態であってもよい。本発明のポリペプチドは、具体的な投与形態および投与経路に応じて適切な剤形に調製することができる。

【0144】

医薬組成物は、例えば全身投与または局所投与を含む、本明細書に記載の様々な投与様式に適合させることができる。一部の実施形態において、医薬組成物は、静脈内投与または皮下注射のために製剤される。一部の実施形態において、医薬組成物は、腫瘍部位への局所投与（例えば、腫瘍内注射）、または脳（例えば、皮質または海馬）への局所投与（例えば、注射）などの局所投与用に製剤される。

【0145】

一部の実施形態において、医薬組成物は、従来の手順に従って、静脈内、腹腔内、または脳内注射に適する医薬組成物に製剤される。典型的には、注射可能な組成物は、滅菌等張性水性バッファー中の溶液である。必要に応じて、組成物には、注射部位の痛みを軽減するために、可溶化剤および局所麻酔薬（リグノカイン（ｌｉｇｎｏｃａｉｎｅ）など）も含んでも良い。通常、成分は、別々に供給されるか、単位剤形で一緒に混合されて、例えば、活性剤の量を示すアンプルや小袋などの気密容器に入った乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。注入によって投与される場合、組成物は、滅菌した医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルにｓ分配され得る。組成物が、注射によって投与される場合、成分が投与前に混合できるように、注射用の滅菌水または生理食塩水を含むアンプルが提供され得る。

【0146】

一部の実施形態において、医薬組成物はヒトへの投与に適する。一部の実施形態において、医薬組成物は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ）または非ヒト霊長類（例えば、サル）への投与に適する。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、単回使用密封バイアルなどの単回使用バイアルに含まれる。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、多回使用バイアルに収容される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は容器内に分散の状態で収容される。一部の実施形態において、前記医薬組成物は、低温保存されたものである。

【0147】

本発明は、さらに、本明細書のいずれか一つの前記の単離されたＡｐｏＥコンストラクト、融合タンパク質、単離されたＡｐｏＥポリペプチド、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、またはその組成物（例えば医薬組成物）を含む単位剤形を提供する。「単位剤形」という用語は、個体への投与のための単位剤形として適した物理的に別個の単位を意味し、各単位には、適切な医薬担体、希釈剤、または賦形剤とともに、所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性物質を含む。これらの単位剤形は、単回または複数回の単位投与量で、適切な包装に保管することができ、さらに滅菌および密封することができる。

【0148】

本願はまた、適切な包装に入った本明細書に記載の組成物（医薬組成物など）を含む製品も提供する。本明細書に記載の組成物（医薬組成物など）に適する包装は当技術分野で知られ、例えば、バイアル（密封バイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、柔軟な包装（密封されたマイラーまたはビニール袋など）などを含む。これらの製品は、さらに滅菌および／または密封することができる。

【0149】

本発明は、さらに、本明細書のいずれか一つの前記の単離されたＡｐｏＥコンストラクト、融合タンパク質、単離されたＡｐｏＥポリペプチド、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態において、前記キットは、本明細書に記載される使用など、タンパク質、発現ベクター、または組成物の使用方法に関する１つまたは複数の説明書をさらに含む。本明細書に記載のキットは、また、商業的およびユーザーの観点から、望ましい可能性がある他の材料を含んでもよく、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および本明細書に記載される方法のいずれかを実施するのに有用な他の材料を含む。

【0150】

５．疾患の治療方法
本発明は、さらに、個体（例えばヒト）のγセクレターゼの切断活性（例えばＡＰＰに対するγ切断活性）に関連する疾患を治療または予防する医薬品の調製における、いずれか一つの実施形態に記載の単離されたＡｐｏＥコンストラクト（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、６０、６１と８９中のいずれか一つのアミノ酸配列）、融合タンパク質、単離されたＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、単離された核酸、ベクター（例えばＡｐｏＥコンストラクト（例えば全長ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３）またはＡｐｏＥポリペプチドを神経特異的に発現するベクター）、宿主細胞または医薬組成物の用途を提供する。一部の実施形態において、前記医薬品が、γセクレターゼの切断活性（例えばＡＰＰに対するγ切断活性）を阻害し、そして前記γセクレターゼの切断活性に関連する疾患を治療または予防する。一部の実施形態において、本発明は、個体（例えばヒト）のγセクレターゼの切断活性（例えばＡＰＰに対するγ切断活性）に関連する疾患を治療または予防する方法を提供し、当該方法は、前記個体へ有効投与量の本発明に記載のいずれか一つの単離されたＡｐｏＥコンストラクト（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、６０、６１と８９中のいずれか一つのアミノ酸配列）、融合タンパク質、単離されたＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、単離された核酸、ベクター（例えばＡｐｏＥコンストラクト（例えば全長ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３）またはＡｐｏＥポリペプチドを神経特異的に発現するベクター）、宿主細胞または医薬組成物を投与することを含む。一部の実施形態において、前記方法が、γセクレターゼの切断活性（例えばＡＰＰに対するγ切断活性）を阻害し、そして前記γセクレターゼの切断活性に関連する疾患を治療または予防する。一部の実施形態において、前記γセクレターゼの切断活性に関連する疾患は、神経システム退行性疾患、腫瘍またはがん、炎症性疾患と腎臓疾患から選ばれる。一部の実施形態において、前記疾患は、アルツハイマー病およびその関連疾患、アミロイド脳血管疾患、ダウン症候群、加齢に伴うその他の神経変性疾患（前頭側頭型認知症など）、頭頸部がん（例えば頭頸部扁平上皮がんと口腔扁平上皮がん）、乳がん、肝臓がん、膵臓がん（転移性膵臓がんを含む）、卵巣がん、肺がん（例えば非小細胞肺がん、肺腺がんと小細胞肺がん）、神経膠腫（例えば悪性神経膠腫）、線維腫、リンパ腫（例えばＢ細胞リンパ腫）、骨肉腫、胃がん、膀胱がん、喘息（例えばアレルギー性喘息）、肺炎、気道炎症、急性腎障害、明細胞腎細胞がん、腎線維症、閉塞性腎症から選ばれる。一部の実施形態において、前記疾患は、ＡＤ及びその関連疾患、例えば散発性アルツハイマー病（ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ｓＡＤ）である。

【0151】

本発明に提供される前記医薬品、治療または予防する方法は、いずれかの個体に適し、哺乳動物、鳥類、カエル、魚類、ショウジョウバエ、線虫などを含むがこれらに限定されない。哺乳動物は、霊長類（例えばヒト、または非ヒト霊長類例えばサル）、げっ歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、リス、モルモット、ウサギ）、家畜（例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ロバ）、ペット（例えば猫、犬、ウサギ、ハムスターなど）を含むが、これらに限定されない。一部の実施の形態において、前記個体は、マウスまたはサルである。一部の実施の形態において、前記個体は、ヒトである。

【0152】

本明細書で使用される場合、適切な投与様式および投与経路は、当技術分野で周知であり、適切な投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または注射または灌流などの他の非経口投与経路が含まれる。「非経口投与」とは、経腸投与および局所投与以外の投与方法を意味し、通常は注射によるものであり、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢胞内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、鼻腔、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下腔、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および灌流を含むが、これらに限定されない。「全身投与（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「全身投与（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」という用語は、本明細書に記載の薬剤または組成物を個体（例えば、哺乳動物）に投与し、そして前記薬剤または組成物が循環系を介して、薬物作用の標的部位を含む体内の部位に送達される方法を指す。全身投与は、経口、鼻腔内、直腸、および非経口（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮、および皮下などの消化管以外の）投与を含むが、これらに限定されない。

【0153】

一部の実施形態において、本発明のいずれか一つの前記単離されたＡｐｏＥコンストラクト（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、６０、６１と８９中のいずれか一つのアミノ酸配列）、融合タンパク質、単離されたＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、単離された核酸、ベクター、または医薬組成物を、脳室内注射および髄腔内注射を含む任意の適切な経路を介して中枢神経系に導入する。脳室内注射は、例えば、リザーバ（例えば、オンマヤリザーバ）に接続された脳室内カテーテルによって補助することができる。

【0154】

一部の実施形態において、ＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列を含む本発明のポリペプチドのコード配列など、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、当技術分野で周知の技術を使用して送達することができる。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドのコード配列は、発現ベクターの形態で（例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して）必要とする対象（例えば、ヒト）に送達される。一部の実施形態において、リポソームは、本発明のポリペプチドをコードすることができる本明細書に記載のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を送達するために使用される。したがって、これらの実施形態において、本発明の医薬組成物は、リポソーム、本明細書に記載の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、およびその発現ベクターを含む。本発明での使用に適するリポソームは、当技術分野で周知であり、ヒトへの投与に適したリポソームであっても良い。

【0155】

本発明に提供されるＡｐｏＥコンストラクト（例えば全長ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３）、融合タンパク質、またはＡｐｏＥポリペプチドは、γ－セクレターゼの阻害剤（例えば、ＡＰＰのγ－切断を特異的に阻害する）であり、したがって、本発明のポリペプチドまたはその医薬組成物は、γ－セクレターゼの阻害によって利益を受ける疾患、γ－セクレターゼの阻害を標的とすることが治療または予防に効果がある疾患（本明細書では、γ－セクレターゼに仲介される疾患またはγ－セクレターゼの酵素切断活性に関連する疾患とも呼ばれる）を治療または予防することに使用されてもよい。複数の疾患は、γセクレターゼに仲介されることが知られ、アルツハイマー病および関連疾患とアミロイド脳血管疾患などの神経変性疾患（Ｅｒｉｋ Ｄ． ＲｏｂｅｒｓｏｎとＬｅｎｎａｒｔ Ｍｕｃｋｅ， １００ ｙｅａｒｓ ａｎｄ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ｄｅｆｅａｔｉｎｇ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， ３１４：７８１－７８４（２００６）； Ｂａｒｔ Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ａｎｄ γ－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， ２：ａ００６３０４（２０１２）； Ｗｅｉｍｉｎｇ Ｘｉａ、γ－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ：Ｔｗｅｎｔｙ ｙｅａｒｓ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ７０１：１６２-１６９（２０１９））；頭頸部扁平上皮がんおよび口腔扁平上皮がん（Ｌｉａｎｇ Ｍａｏら、γ－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ：１４２， ９９９-１００９（２０１８））、乳がんおよび肝細胞がん（Ｈｕｉ Ｊｉａら、γ－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｆｒｏｍ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２６８（２０２１）１１９００７）、膵臓がん（転移性膵臓がんを含む）（Ａｎａ Ｄｅ Ｊｅｓｕｓ－Ａｃｏｓｔａら、Ａ Ｐｈａｓｅ ＩＩ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇａｍｍａ Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＲＯ４９２９０９７ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ． ２０１４ Ａｕｇｕｓｔ； ３２（４）：７３９-７４５）、卵巣がん（Ｚｈａｏｙｉ Ｆｅｎｇ、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｍｍａ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎ Ｎｏｔｃｈ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ， ２０１７， Ｖｏｌ． ８，（Ｎｏ． ５）， ｐｐ：８２１５－８２２５）、肺がん（非小細胞肺がん、肺腺がん、小細胞肺がんなど）（Ａｎｔｏｎｉｏ Ｍａｒａｖｅｒ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ＫｒａｓＧ１２Ｖ－ｄｒｉｖｅｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＵＳＰ１ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ２０１２ Ａｕｇｕｓｔ １４； ２２（２）；Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｍ． Ｍｏｒｇａｎら、Ｇａｍｍａ ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ＢＭＳ－９０６０２４ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２０１７ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ； １６（１２）：２７５９-２７６９）、悪性神経膠腫などの神経膠腫（Ｅｄｗａｒｄ Ｐａｎら、Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＲＯ４９２９０９７ ｗｉｔｈ Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａ、Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ． ２０１６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ； １３０（３）：５７１-５７９）、線維腫（Ｓｈｉｖａａｎｉ Ｋｕｍｍａｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇ－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＰＦ－０３０８４０１４ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ Ｗｉｔｈ Ｄｅｓｍｏｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＯＮＣＯＬＯＧＹ、ＶＯＬＵＭＥ ３５、ＮＵＭＢＥＲ １４、ＭＡＹ １０， ２０１７）、Ｂ細胞リンパ腫などのリンパ腫（Ｓｈｕｊｉ Ｔｏｈｄａ、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｇａｍｍａ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（２００６）１３８５-１３９０）、胃がん（Ｈｙｕｎ－Ｗｏｏ Ｌｅｅら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｃ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ５－ＦＵ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（２０１５）３２：５９３-６０３）、膀胱がん（ＹＩＢＩＮＧ ＷＡＮＧら、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＲＥＰＯＲＴＳ １２：２８２１－２８２７， ２０１５）、骨肉腫（Ｍ Ｔａｎａｋａら、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（２００９）１００， １９５７ - １９６５）を含む腫瘍またはがん；アレルギー性喘息などの喘息（Ｗｅｉｘｉ Ｚｈａｎｇら、γ－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ Ａｃｕｔｅ Ａｉｒｗａｙ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｉｃ Ａｓｔｈｍａ ｉｎ Ｍｉｃｅ ｂｙ Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｔｈ１７ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｖｏｌｕｍｅ ２０１５， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２５８１６８， ７ ｐａｇｅｓ）、アレルギー性気道炎症などの気道炎症（Ｗｅｉｘｉ Ｚｈａｎｇら、γ－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ Ａｃｕｔｅ Ａｉｒｗａｙ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｉｃ Ａｓｔｈｍａ ｉｎ Ｍｉｃｅ ｂｙ Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｔｈ１７ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｖｏｌｕｍｅ ２０１５， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２５８１６８）、肺炎（Ｊｉｎ Ｈｙｕｎ Ｋａｎｇら、ｇ－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ａｌｌｅｒｇｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ、ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＲＥＳＰＩＲＡＴＯＲＹ ＡＮＤ ＣＲＩＴＩＣＡＬ ＣＡＲＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＶＯＬ １７９、２００９）などを含む炎症性疾患；急性腎損傷などの腎臓疾患（Ｊｅａｎ－Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ Ｗｙｓｓら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３１４：Ｆ７３６-Ｆ７４６， ２０１８）を含むが、これらに限定されない。

【0156】

一部の実施形態において、前記γセクレターゼの切断活性（例えばＡＰＰに対するγ切断活性）に関連する疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、ＣＡＡ関連脳出血などの神経変性疾患、血管性認知障害、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、または脆弱Ｘ症候群関連振戦／運動失調症候群である。ＣＡＡは、脳血管壁へのタンパク質（主にアミロイドベータ）の沈着を特徴とする症状である。ＣＡＡはＡＤ患者によく見られるが、ＡＤの証拠がなくても発生する可能性がある。

【0157】

一部の実施形態において、前記γセクレターゼの切断活性（例えばＡＰＰに対するγ切断活性）に関連する疾患は、「アミロイドタンパク質β関連疾患」であり、当該用語は、異常に高レベルのアミロイドタンパク質βペプチドの産生、蓄積、および／または凝集を特徴とするあらゆる状態を指し、例えば、アミロイド斑の形式で、特に脳内で発生する。アミロイドタンパク質β関連疾患は、ＡＤ、ダウン症候群、脆弱Ｘ症候群、ＣＡＡ、ＣＡＡ関連脳出血、散発性封入体筋炎を含む。

【0158】

ＡＤは先進国で最も一般的な神経変性疾患である。組織病理学的に、ＡＤは、Ａβペプチドを含むアミロイドタンパク質斑の蓄積とｔａｕタンパク質から由来するＮＦＴを特徴とする。臨床的に、ＡＤは、記憶、機能、言語能力、判断力、および実行機能の喪失を特徴とする進行性の認知障害と関連する。ＡＤは、その後期段階で重度の行動症状を引き起こすことがよくある。

【0159】

若年性アルツハイマー病（６５歳未満で診断された）の約半数は、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）であり、常染色体優性遺伝する。ＦＡＤは、ＡＰＰ突然変異、ＰＳＥＮＩ突然変異、ＰＳＥＮ２突然変異の３つの遺伝子の少なくとも１つの突然変異によって引き起こされる。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）突然変異は、１２１ファミリーで確認される。最も一般的なミスセンス変異は、Ｖａｌ^７１７残基をＩｌｅ（ロンドン変異）、Ｐｈｅ、またはＧｌｙ残基に置き換え、Ｇｌｕ^６９３をＧｌｎ残基（Ｄｕｔｃｈ変異）またはＧｌｙ残基（Ａｒｃｔｉｃ変異）に置き換え、または、Ｌｙｓ^６７０とＭｅｔ^６７１をＡｓｎとＬｅｕ残基に置き換える（二重変異はスウェーデン変異と呼ばれ、ＡＰＰ_７７０アイソフォームで番号が付けられる）。２１９個のプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）が、４８０ファミリーで同定され、γ－セクレターゼ切断の減弱、一部の突然変異における酸化ストレスの増加、およびＤＮＡ損傷誘発死に対する神経細胞の感受性の増加が見られる。３４ファミリーで１３個のプレセニリン２（ＰＳＥＮ２）が同定され、これらでは、γ－セクレターゼ切断の減弱、一部の突然変異における酸化ストレスの増加が見られる。

【0160】

一部の実施形態において、本発明に提供されるいずれか一つの単離されたＡｐｏＥコンストラクト（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、６０、６１と８９中のいずれか一つのアミノ酸配列）、融合タンパク質、単離されたＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、単離された核酸、ベクター（例えばＡｐｏＥコンストラクト（例えば全長ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３）またはＡｐｏＥポリペプチドを神経特異的に発現するベクター）、宿主細胞または医薬組成物は、γセクレターゼ酵素活性を阻害することで、いずれかのＡＰＰ γ－切断に関連する疾患（例えばＡＤ）、例えばいずれかのＡＰＰ突然変異を有する疾患（例えばＡＤ）の治療に使用される。一部の実施形態において、前記ＡＰＰは、ヒトＡＰＰであり、以下の一つまたは複数の突然変異を含む：Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ、スウェーデン（Ｋ６７０Ｎ＋Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ（Ｉ７１６Ｖ）、ロンドン（Ｖ７１７Ｉ）、ＡＰＰ_{Ｍ５９６Ｖ}（β切断は実行できない）、γ切断部位に近いｆＡＤ変異（例えば、Ｔ７１４Ｉ、Ｖ７１７Ｆ、Ｌ７２３Ｐ）、βまたはα切断部位に近いｆＡＤ突然変異（例えば、ＫＭ６７０／６７１ＮＬ、Ｅ６９３Ｋ、Ｅ６９３Δ）、または保護的アイスランド突然変異（Ａ６７３Ｔ）。

【0161】

アルツハイマー病の表現型を評価し、治療薬を特徴づけ、治療を評価するためのいくつかの行動学的検査および組織病理学的検査が、当技術分野で知られる。組織学的分析は、通常、死後に行われる。Ａβレベルの組織学的分析は、チオフラビンＳの使用して実行する。コンゴレッドまたは抗Ａβ染色（例えば４Ｇ８、１０Ｄ５、または６Ｅ１０抗体）により、切片化された脳組織上の Ａβ 沈着を視覚化する（たとえば、Ｈｏｌｃｏｍｂら、１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：９７－１００；Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、１９９７，Ｎｅｕｒｏｎ１９：９３９－９４５；Ｄｉｃｋｓｏｎら、１９８８，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１３２：８６－１０１を参照する）。遺伝子組み換えマウスにおけるＡβ沈着を視覚化するインビボ方法も記載される。ＢＳＢ（（トランス，トランス）－１－ブロモ－２，５－ビス－（３－ヒドロキシカルボニル－４－ヒドロキシ）スチリルベンゼン）とＰＥＴトレーサーである１１Ｃで標識したピッツバーグ化合物Ｂ（ＰＩＢ）は、Ａβ斑に結合する（例えば、Ｓｋｏｖｒｏｎｓｋｙら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７６０９－７６１４；Ｋｌｕｎｋら，２００４，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５５：３０６－３１９を参照する）。^１９Ｆ含有アミロイド親和性コンゴレッド型化合物ＦＳＢ（（Ｅ，Ｅ）－１－フルオロ－２，５－ビス－（３－ヒドロキシカルボニル－４－ヒドロキシ）スチリルベンゼン）が、ＭＲＩによるＡβプラークの視覚化を可能になる（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉら，２００５，ａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８：５２７－５３３を参照する）。放射性マークされたプトレッシンも修飾されたアミロイドβペプチドは、アルツハイマー病のマウスモデルにおける生体内でのアミロイド沈着をマークする（例えば、Ｗｅｎｇｅｎａｃｋら， ２０００， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８：８６８－８７２を参照する）。

【0162】

アルツハイマー病の当該技術分野で知られる標準的な診断方法を使用して、アルツハイマー病に罹患している受験者を同定することができる。通常、アルツハイマー病の診断は、患者の症状（例えば、記憶機能の進行性の低下、通常の活動の進行性の放棄とフラストレーション、無関心、落ち着きのなさまたは過敏症、攻撃性、不安、睡眠障害、動揺、異常な運動行動、脱抑制、社会的引きこもり、食欲の低下、幻覚、認知症）、病歴、神経心理学的検査、神経学的および／または身体検査に基づいて行われる。脳脊髄液では、ｔａｕ、アミロイドβペプチドとＡＤ７Ｃ－ＮＴＰを含むアルツハイマー病に関連する複数のタンパク質を検出することもできる。遺伝子検査も、若年性家族性アルツハイマー病（ｅＦＡＤ）、常染色体優性遺伝性疾患も使用されてもよい。臨床遺伝子検査は、ＡＤ症状のある個体、または早期発症型疾患のリスクのある家族に利用できる。米国では、臨床検査改善修正条項に基づいて、ＰＳ２変異とＡＰＰを臨床検査機関または連邦政府が承認した臨床検査機関で、検査することができる。ＰＳ１突然変異の市販検査も利用できる（Ｅｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。

【0163】

本発明の治療効果は、上記のいずれかの方法または指標によって評価することができる。一部の実施形態において、本発明のＡｐｏＥコンストラクト、ＡｐｏＥポリペプチド、ベクター、組成物、または治療／予防方法は、以下の一つまたは複数の効果を達成することができる：（ｉ）ニューロン中（生体内または生体外）で細胞自律的にＡＰＰの切断を制御する；（ｉｉ）γ－セクレターゼの酵素活性を阻害（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％阻害）し、例えばγ－セクレターゼ阻害剤（例えばＰＦ０３０８４０１４）によるＡＰＰ γ－切断阻害効果と類似するように、γ－セクレターゼに仲介されるＡＰＰγ－切断を阻害する；（ｉｉｉ）ＡＰＰのアミロイド代謝を低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％低下）し、例えばアミロイドタンパク質 β（Ａβ）（例えばＡβ４０及び／またはＡβ４２）の産生を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％低減）し、またはＣ末端フラグメント β（β－ＣＴＦ）に対するγ－切断を低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％低下）する；（ｉｖ）ＡＰＰの非アミロイド代謝を向上（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を向上）し、例えばＣ末端フラグメント α（α－ＣＴＦ）の産生を増加（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を増加）する；（ｖ）α－セクレターゼ、β－セクレターゼ、及び／またはγ－セクレターゼ（またはそのサブユニット）（例えばＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＰＳ１及び／またはＰＳ２）のｍＲＮＡ及び／またはタンパク質発現に影響を与えない（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか影響を与えない）；（ｖｉ）β－セクレターゼに仲介されるＡＰＰ β－切断、及び／またはα－セクレターゼに仲介されるＡＰＰ α－切断に影響を与えない（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか影響を与えない）；（ｖｉｉ）非ＡＰＰタンパク質（例えばＡＰＬＰ１（ＡＰＰ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）またはＮｏｔｃｈ）またはそのフラグメントに対するγ－切断を阻害しなく（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか阻害しなく）、非ＡＰＰタンパク質のγ－切断によって産生されるα－ＣＴＦを増加しない（または約３０％、２０％、１０％、５％または以下しか増加しない）；（ｖｉｉｉ）脳中のアミロイド斑を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）または予防し、例えばアミロイド斑の平均斑大きさ、総面積、及び／または密度を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）し、ニューロン内のＡβ（例えばＡβ４０及び／またはＡβ４２）の産生を低減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低減）または予防し、ＡＤ病理学的プロセスを遅延（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍または以上を遅延）し、個体生存率及び／または寿命を向上（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍または以上を向上）する；（ｉｘ）ニューロンで局所的に発現された（例えば皮質、歯状回（ＤＧ）、海馬ＣＡ３で発現された）本発明に記載の前記ＡｐｏＥコンストラクトが、離れた部位から海馬台に移動し、アミロイド斑の周囲に蓄積し、それによって、これらのアミロイド産生ホットスポットにおけるγ－セクレターゼの酵素活性を局所的に阻害する；または（ｘ）一つまたは複数のＡＤ症状（例えば、記憶機能の進行性の低下、通常の活動の進行性の放棄とフラストレーション、無関心、落ち着きのなさまたは過敏症、攻撃性、不安、睡眠障害、動揺、異常な運動行動、脱抑制、社会的引きこもり、食欲の低下、幻覚、認知症）を軽減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を低下）、除去、または予防（発生時間の遅延を含む）する。

【0164】

一部の実施形態において、前記γセクレターゼの切断活性に関連するがんは、以下の一つまたは複数を含む：頭頸部がん（例えば頭頸部扁平上皮がんと口腔扁平上皮がん）、乳がん、肝臓がん、膵臓がん（転移性膵臓がんを含む）、卵巣がん、肺がん（例えば非小細胞肺がん、肺腺がんと小細胞肺がん）、神経膠腫（例えば悪性神経膠腫）、線維腫、リンパ腫（例えばＢ細胞リンパ腫）、骨肉腫、胃がん、膀胱がん。

【0165】

一部の実施形態において、本明細書に記載のγセクレターゼの切断活性に関連するがんを治療する医薬品または方法は、以下の生物活性の一つまたは複数を有する：（１）癌細胞を殺すこと、例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの腫瘍細胞死率；（２）がん細胞の増殖を阻害すること、例えば、増殖を少なくとも約１０％（例えば少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％中のいずれか一つを含む）阻害すること；（３）腫瘍サイズの縮小、例えば、腫瘍サイズの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の縮小；（４）がん患者の一つまたは複数の症状を軽減すること；（５）腫瘍転移（例えばリンパ節への転移）を阻害すること、例えば、腫瘍転移を少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかを含む）阻害すること；（６）生存期間を例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、または２４ヶ月以上延長すること；（７）がんを予防し、あるいはがんの進行までの時間を延長し、例えば、癌が進行するまでの時間を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２か月または以上延長すること；及び（８）がんの再発を予防、抑制、または軽減すること。

【0166】

一部の実施形態において、γ－セクレターゼの酵素切断活性に関連する疾患は、炎症性疾患であり、喘息（アレルギー性喘息など）、肺炎、および気道炎症を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本明細書に記載の医薬品または治療／予防方法は、炎症を引き起こすサイトカインの分泌及び／または活性を低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％中のいずれかを低下）し、及び／または一つまたは複数の疾患症状を軽減（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％中のいずれかを軽減）、除去または予防（発生時間の遅延を含む）する。

【0167】

一部の実施形態において、前記γセクレターゼの切断活性に関連する疾患は、腎臓疾患であり、腎臓または腎系に影響を与える任意の疾患、障害または症状を指す。腎臓関連の疾患または症状の例としては、急性腎疾患（または腎不全）、明細胞腎細胞癌、腎線維症、または閉塞性腎症を含むが、これらに限定されない。腎臓疾患を評価および診断するための従来のマーカーは、ＧＦＲ、クレアチニンおよびアルブミンを含み、任意のマーカーまたは関連する方法を本発明の治療効果を評価するために使用することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載の医薬品または治療／予防方法は、（ｉ）一つまたは複数の腎臓疾患指標を低下（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％中のいずれかを低下）、除去または予防（発生時間の遅延を含む）する；及び／または（ｉｉ）腎臓機能を保護または改善することができる。

【0168】

本発明は、対象（例えばヒト）のγセクレターゼに仲介される疾患を治療または予防する方法を提供し、当該方法は、当該対象へ、治療有効量または予防有効量の本発明のいずれか一つの前記ＡｐｏＥコンストラクト、融合タンパク質、ＡｐｏＥポリペプチド、核酸分子、ベクターまたはその医薬組成物を投与することを含む。有効量は、対象の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態、および以前の病歴などの要因に基づいて当業者によって決定される。前記疾患は、好ましくは、前記の神経システム退行性疾患、腫瘍または癌症、炎性疾患及び腎臓疾患を含む。

【0169】

本発明の一部の実施形態は、γセクレターゼの切断を阻害することによって、ＡＰＰのアミロイド代謝を阻害し、Ａβの産生を低減する方法を提供し、当該方法は、γセクレターゼを発現する細胞（例えばニューロン）で、ＡｐｏＥ２（例えばＮ末端に膜透過ペプチドを持つＡｐｏＥ２）または本明細書のいずれか一つの実施形態に記載のＡｐｏＥコンストラクト（例えばＡｐｏＥ２のＣ末端フラグメント、または全長ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３）、融合タンパク質またはＡｐｏＥポリペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１８－３４、４６－５２、５７－５９、６２、７６、７８と８７中のいずれか一つのアミノ酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）を産生することを含む。一部の実施形態において、前記細胞は、ニューロンである。一部の実施形態において、前記方法は、ＡＤとアミロイド脳血管病の発生と進展を遅延（例えば少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％中のいずれかを遅延）、予防または治療することに用いられる。本明細書に記載の産生は、ポリペプチドの発現および細胞外から細胞内へのポリペプチドの送達を含む。一部の実施形態において、リポソームによって、前記ＡｐｏＥコンストラクト（例えばＡｐｏＥ２及び／またはＡｐｏＥ３及び／またはそのＣ末端フラグメント）またはＡｐｏＥポリペプチドをコードするＤＮＡあるいはＲＮＡを前記細胞に送達し、細胞内で前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドを発現し、産生する；あるいは、レンチウイルスとアデノ随伴ウイルスを使用して細胞に感染する方式で、前記細胞内で前記ＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドを産生する；または細胞透過ペプチドまたは細胞エンドサイトーシス増強によってＡｐｏＥコンストラクトまたはＡｐｏＥポリペプチドを細胞へ侵入させる。

【0170】

一部の実施形態において、本明細書のいずれか一つに記載の実施形態に記載のＡｐｏＥコンストラクトまたは融合タンパク質、用途と方法に言及されるポリペプチドは、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２、１３、１８－３３と８９中いずれか一つに示されるポリペプチドを含む。

【実施例】

【0171】

以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。理解すべきのは、本発明の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。

【0172】

実施例では、データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析され、すべてのデータは平均±ＳＥＭとして表示される。次のデータ分析では、ｕｎｐａｉｒｅｄ、ｐａｉｒｅｄ又はｏｎｅ ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔを使用する。有意な差は、アスタリスク（＊）で示され、１つのアスタリスク（＊）は、０．０５未満のＰ値を表し、２つのアスタリスク（＊＊）は、０．０１未満のＰ値を表し、３つのアスタリスク（＊＊＊）は、０．００１未満のＰ値を表し、４つのアスタリスク（＊＊＊＊）は、０．０００１未満のＰ値を表す。

【0173】

実施例１
１．主な薬剤と材料
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ会社）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培養液（ＨｙＣｌｏｎｅ会社）中で培養し、５％ＣＯ_２を含む３７℃の滅菌細胞培養インキュベーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）内で培養した。

【0174】

初代培養ニューロンは、１６日目のマウスの胎児の皮質または海馬から由来した。マウス皮質または海馬をステレオスコープで採取した；２０ Ｕ／ｍｌ パパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ会社）で３７℃で１０分間消化した；消化後に、単一細胞の形で存在するニューロンを、ウェルあたり（２４ウェルプレート）１００，０００ 個のニューロンでプレーティングした；ニューロンは、２％Ｂ２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む神経培養液（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）で培養された；週に１回、新鮮な培地を交換した。

【0175】

０～７ヶ月齢のＣ５７野生型マウスおよびＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤマウス［Ｔｇ６７９９］、病原性変異を含むＡＰＰおよびＰＳ１を発現するマウス；発現されたＡＰＰには３つの変異Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ、Ｉ７１６Ｖ、およびＶ７１７Ｉが含まれるが、ＰＳ１には２つの変異Ｍ１４６Ｌ、Ｌ２８６Ｖが含まれる）。マウスには、十分な餌と水を与え、室温で１２時間／１２時間の明暗サイクルで飼育し、飼育環境はＳＰＦ（特定病原体を含まない）レベルの基準に達した。

【0176】

酵素結合免疫吸着測定キット（ＥＬＩＳＡ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社から購入した；ヒト由来Ａβ４０（ＫＨＢ３４８１）、ヒト由来Ａβ４２（ＫＨＢ３４４１）、マウス由来Ａβ４０（ＫＭＢ３４８１）。

【0177】

トランスフェクション試薬は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００およびＳｉｇｎａＧｅｎ会社のＰｏｌｙｊｅｔである。

【0178】

ｑＲＴ－ＰＣＲ用のＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲキットは、Ｑｉａｇｅｎ会社から購入した。

【0179】

【表6】

【0180】

２．実験方法
２．１ タンパク質サンプルの調製とイムノブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）
ａ） 哺乳動物細胞内で目的のタンパク質を発現するプラスミドを構築し、タンパク質発現プロモーターはＣＡＧである。

【0181】

ｂ） ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株で目的のタンパク質を発現した。トランスフェクションの１日前に、細胞の継代を行い、細胞の接着度が７０％～８０％に達した時点でトランスフェクションを行った。トランスフェクション試薬はｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）である。

【0182】

ｃ） トランスフェクションの４～６時間後、新鮮な細胞培養液と交換した。

【0183】

ｄ） トランスフェクションの３６～４８時間後、細胞を溶解（１０％１Ｍ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝６．８）、４％ＳＤＳ、２０％ グリセロール、０．０１％ブロモフェノール ブルー）し、タンパク質サンプルを収集し、イムノブロッティング実験に使用するか、－８０℃の冷蔵庫で凍結した。

【0184】

ｅ） ポリアクリルアミドゲル電気泳動。タンパク質をロードする前に、９８℃で１０分間煮沸し、その後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。電気泳動：上部濃縮ゲル８０Ｖ；下部分離ゲル１２０Ｖ。

【0185】

ｆ） メンブレンへの転写。使用前に濾紙を電気転写液に浸し、ＰＶＤＦメンブレンをメタノール中で１０秒間親水化し、泳動後のゲルを泳動槽から取り出し、濾紙→ＰＶＤＦメンブレン→ゲル→濾紙を、下から上までの順に置き、メンブレン転写装置に入れ、定流量で０．１Ａ、７０分間メンブレン転写した。

【0186】

ｇ） ブロッキングと抗体のインキュベーション：転写されたＰＶＤＦメンブレンを、５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴブロッキング溶液に置き、シェーカー上で室温で１時間ブロックした。一次抗体を、４℃、シェーカー上で一晩（１２～１６時間）インキュベートした；１×ＴＢＳＴ、１０分ごとに３回洗浄した；二次抗体を、室温℃、シェーカー上で１～２時間インキュベートした；１×ＴＢＳＴ、１０分ごとに３回洗浄した。

【0187】

ｈ） 現像とイメージング：ＥＣＬ化学発光超高感度発色試薬で現像した。

【0188】

２．２ 脳スライスの製造と免疫組織化学
ａ） 灌流と脳の採取。マウスを心臓から灌流し、最初に２０ｍｌのＰＢＳで血液を洗い流し、次に２０ｍｌの４％ＰＦＡで灌流した。

【0189】

ｂ） 固定と脱水。まず、４％ＰＦＡで４℃で２４時間固定し、次に３０％スクロースを使用し、４℃で脱水した。

【0190】

ｃ） マウスの脳のスライシング。２４時間脱水した後、マウスの脳を厚さ４０μｍの脳スライスに切断し、凍結バッファーに保存するか、その後の免疫組織化学に使用した。

【0191】

ｄ） ＴＨＳ染色。ｄｄＨ_２Ｏ、各回５分間、３回洗浄した；１％ ＴＨＳ水溶液で１０分間浸した；８０％エタノール、毎回３分間、２回洗浄した；９５％エタノール、１回、３分間洗浄した。その後の免疫組織化学を実行した。ＴＨＳ染色を行わない場合は、直接次の免疫組織化学に進んだ。

【0192】

ｅ） 免疫組織化学。１×ＰＢＳ、各回１０分間、３回洗浄した；０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で細胞膜を破壊した；５％ロバまたはヤギ血清でブロッキングした；次に、一次抗体をシェーカー上で４℃で一晩（１２～１６時間）インキュベートした；１×ＰＢＳ、各回１０分間、３回洗浄した；二次抗体をシェーカー上で室温で１～２時間インキュベートした；１×ＰＢＳ、各回１０分間で３回洗浄した。

【0193】

ｆ） パッチングとシーリング。

【0194】

ｇ） シーリングの２４時間後に現像した。

【0195】

ｈ） ＩｍａｇｅＪを使用して画像を処理し、信号密度を分析した。

【0196】

２．３ 酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）
実験は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社のＥＬＩＳＡ分析キットの標準手順に従って実施した。

【0197】

ａ） ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株で目的のタンパク質を発現した。トランスフェクションの１日前に、細胞の継代を行い、細胞の接着度が７０％～８０％に達した時点でトランスフェクションを行った。トランスフェクション試薬はｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）である。

【0198】

ｂ） トランスフェクションの４～６時間後、新鮮な培養液と交換した。

【0199】

ｃ） トランスフェクションの３６～４８時間後、細胞培養液を収集し、ＥＬＩＳＡプロセスに入るか、－８０℃の冷蔵庫で凍結した。

【0200】

ｄ） ５０μｌの標準サンプルと実験サンプルを９６ウェルプレートの各ウェルに加えった。

【0201】

ｅ） ５０μｌのヒトＡβ４０またはＡβ４２またはマウスＡβ４０検出抗体を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。

【0202】

ｆ） 軽く振り、室温で３時間放置した。

【0203】

ｇ） ウェルから液体を除去し、１×洗浄バッファーで４回洗浄した。

【0204】

ｈ） １×抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰを含むバッファー１００μｌを加えた。

【0205】

ｉ） 軽く振り、室温で３０分間放置した。

【0206】

ｊ） ウェルから液体を除去し、１×洗浄バッファーで４回洗浄した。

【0207】

ｋ） １００μｌの安定化色素原を各ウェルに加え、室温の暗所に３０分間置いた。

【0208】

ｌ） １００μｌの停止液を各ウェルに加えた。

【0209】

ｍ） マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0210】

２．４ ｑＲＴ－ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ^（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）の取扱説明書に従って、処理した細胞からＲＮＡを抽出した。

【0211】

ａ） ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株で目的のタンパク質を発現した。トランスフェクションの１日前に、細胞の継代を行い、細胞の接着度が７０％～８０％に達した時点でトランスフェクションを行った。トランスフェクション試薬はｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）である。

【0212】

ｂ） トランスフェクションの６時間後、新鮮な培養液と交換した。

【0213】

ｃ） トランスフェクションの４８時間後、ＲＮＡを抽出した。

【0214】

ｄ） ５００μｌのＴｒｉｚｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）を２４ウェル プレートの各ウェルに加え、振盪し、室温で２０分間インキュベートした。

【0215】

ｅ） 細胞懸濁液を遠心管に集めた。

【0216】

ｆ） クロロホルム２５０μｌを加え、転倒混和し、室温で３分間放置した。

【0217】

ｇ） ４℃、１２０００ｇで１５分間遠心分離した。遠心分離後の溶液は、フェノールを含むクロロホルム（ピンク色）が底部、ＤＮＡとタンパク質が中央、ＲＮＡを含む水相（透明）が上部にあり、溶液は明確に層状になっているように見えた。上清を新しい遠沈管に移した。

【0218】

ｈ） 等体積（上清）のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和し、室温で２０分間放置した。

【0219】

ｉ） ４℃、１２０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を除去し、底に少量の白い沈殿物（ＲＮＡ）が見えた。

【0220】

ｊ） ７５％エタノール４００μｌを加えた。４℃、１２０００ｇで５分間遠心分離した。

【0221】

ｋ） できるだけ多くのエタノールを除去し、ドラフト内で完全に乾燥させたが、過度の乾燥は避けた。適量のＤＥＰＣ水を加えた。

【0222】

ｌ） ＤＮＡを除去した後は、次の実験のために－８０℃で保存した。

【0223】

ｍＲＮＡの相対含有量を、Ｑｉａｇｅｎ会社のＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲキットで定量的に分析した。ｑＲＴ－ＰＣＲプライマーを表２に示します。

【0224】

【表7】

【0225】

２．５ ＰＳ１ ＫＯ、ＰＳ２ ＫＯ および ＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞株の構築
本発明は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を選択し、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術を使用し、Ｚｈａｎｇ Ｆｅｎｇら， ２０１３によって公開された標準手順（Ｒａｎら， ２０１３）に従って、ＰＳ１ ＫＯ、ＰＳ２ ＫＯおよびＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞株を構築した。表３に示すように、ＰＳ１とＰＳ２を特異的にノックアウトしたｓｇＲＮＡは、ｈｔｔｐｓ：／／ｚｌａｂ．ｂｉｏ／ｇｕｉｄｅ－ｄｅｓｉｇｎ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｗｅｂ サイトを使用して設計された。

【0226】

ａ） ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞には、ＰＳ２ ｓｇＲＮＡとコントロールの空のプラスミドを発現した。トランスフェクションの１日前に、細胞の継代を行い、細胞の接着度が７０％～８０％に達した時点でトランスフェクションを行った。トランスフェクション試薬はｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）である。

【0227】

ｂ） トランスフェクションの６時間後、新鮮な培養液と交換した。

【0228】

ｃ） トランスフェクションの１８時間後、３μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｅｌｅｃｔ会社）を含有する新鮮な培養液に交換した。

【0229】

ｄ） 空のプラスミドをトランスフェクトしたすべてのＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株が３μｇ／ｍｌピューロマイシンの作用下で死滅した後、ＰＳ２ ｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を収集した。

【0230】

ｅ） ＰＳ２ ｓｇＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１：４００の比率で、１０ｃｍ細胞培養皿に継代し、細胞がモノクローンの形態で増殖することを確認した。

【0231】

ｆ） モノクローナルで増殖した細胞が細胞塊に成長した後、単一細胞塊を収集し、１２ウェル プレートに継代した。

【0232】

ｇ） 細胞塊が１２ウェルプレート全体を覆った後、細胞を回収した。細胞の半分を使用してＤＮＡとタンパク質を抽出し、ＰＳ２のＤＮＡ配列とタンパク質発現を検出した。細胞の別の部分は継代に使用された。

【0233】

ｈ） ＰＳ２のＤＮＡ配列が編集され、ＰＳ２タンパク質を発現しなくなった細胞は、ＰＳ２ノックアウト細胞株--ＰＳ２ ＫＯ細胞株である。

【0234】

ｉ） 本発明は、ＰＳ２ ＫＯ細胞株に基づいてＰＳ１／ＰＳ２ ｄＫＯ細胞株を構築した。さらに、ＰＳ２ ＫＯ細胞株でＰＳ１ ｓｇＲＮＡまたはコントロールの空のプラスミドを発現させた；ステップａ～ｇを行い、ＰＳ１のＤＮＡ 配列とタンパク質発現を検出した。

【0235】

ｊ） ＰＳ１のＤＮＡ配列が編集され、ＰＳ１タンパク質を発現しなくなったＰＳ２ ＫＯ細胞株は、ＰＳ１およびＰＳ２ダブルノックアウト細胞株--ＰＳ１／２ ＫＯ細胞株である。

【0236】

【表8】

【0237】

２．６ ウイルスの調製と注射。
２．６．１ レンチウイルスの調製
ａ） ニューロンで特異的に発現できるレンチウイルス発現プラスミド、レンチウイルスＧＦＰおよびレンチウイルスＡｐｏＥ ＣＴを構築した。

【0238】

ｂ） レンチウイルス発現ベクターをカプシッドタンパク質ベクター（ＰＳＰＡＸ２とＰＭＤ２Ｇ）とともに、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株に共トランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に、細胞の継代を行い、細胞の接着度が７０％～８０％に達した時点でトランスフェクションを行った。トランスフェクション試薬はＰｏｌｙｊｅｔ（ＳｉｇｎａＧｅｎ会社）である。

【0239】

ｃ） トランスフェクションの３６～４８時間後、細胞培養液を収集し、０．２２μｍフィルターで濾過した。

【0240】

ｄ） 濾過した細胞培養液を超遠心分離した。２０，０００ｒｐｍ、４℃で２時間５分間遠心分離した。

【0241】

ｅ） 遠心分離後、上清を除去し、三つの１０ｃｍ細胞培養培地あたり、５０μｌのＰＢＳに沈殿を再懸濁した。

【0242】

ｆ） 再懸濁したウイルスを個別包装し、その後の実験のために－８０℃の冷蔵庫に保存した。

【0243】

２．６．２アデノ随伴ウイルスの調製
ニューロンで発現されたアデノ随伴ウイルスＡＡＶ－ＣＴ（ＡＡＶ２／９－ｈＳｙｎ－ＡｐｏＥ ＣＴ）およびＡＡＶ－ＧＦＰ（ＡＡＶ２／９－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ）は、Ｔｅｌｔｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 会社から購入した。

【0244】

２．６．３ウイルス注射
定位注射器を使用し、上記で調製したアデノ随伴ウイルス１μｌを、１ヶ月齢のマウスの大脳皮質（ｘ、ｙ、ｚ、＋／－１．６、０、－１）および海馬（ｘ、ｙ、ｚ、＋／－１．５、－２、－１．５）に注射した。

【0245】

２．７ タンパク質の精製
２．７．１ γ－セクレターゼの精製
ヒトγ－セクレターゼの発現ベクターは、Ｌｕら，２０１４を参照する。

【0246】

ａ） ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株でヒトγセクレターゼを発現した（同じ発現プラスミドでヒトγ－セクレターゼ、ＮＣＴ、ＰＳ１、ＰＬＡＧ－ＰＥＮ２、ＡＰＨの４つのタンパク質を同時に発現した）。トランスフェクションの１日前に、細胞の継代を行い、細胞の接着度が７０％～８０％に達した時点でトランスフェクションを行った。トランスフェクション試薬はｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）である。

【0247】

ｂ） トランスフェクションの４～６時間後、新鮮な細胞培養液と交換した。

【0248】

ｃ） トランスフェクションの４８時間後、１×氷冷したＰＢＳで１回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を削り取り、８００ｇで５分間遠心分離して細胞を回収した。

【0249】

ｄ） 再懸濁した細胞を溶解バッファー［２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、１×ｃｏｃｋｔａｉｌ］で溶解した。

【0250】

ｅ） 溶解細胞を２０サイクル（３秒間オン、３秒間オフ）、出力４５％ で超音波処理した。

【0251】

ｆ） ４℃、３０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を新しい遠沈管に回収した。

【0252】

ｇ） １５０００ｇ、４℃で１時間遠心分離し、上清を捨てた。

【0253】

ｈ） 沈殿を１ｍｌの溶解バッファーに再懸濁し、再懸濁後に１％ＣＨＡＰＳＯを加え、４℃で２時間インキュベートした。１５，０００ｇで３０分間遠心分離し、上清を新しい遠沈管に回収した。

【0254】

ｉ） １００μｌ ＦＬＡＧビーズ（ＳＩＧＭＡ 会社）を上清に加え、４℃で２時間インキュベートした。

【0255】

ｊ） 以下のバッファーで３回洗浄した。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ。

【0256】

ｋ） ヒトγ－セクレターゼは以下のバッファーで溶出した。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ｄｉｇｉｔｏｎｉｎと５００ μｇ／ｍｌ ３ｘＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ会社）。

【0257】

ｌ） 精製されたヒトγ－セクレターゼを、ウェスタンブロット検出し、－８０℃で保存した。

【0258】

２．７．２ ＡｐｏＥの精製
ａ） ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株でＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ２ ＮＴを発現した。ＡｐｏＥ２タンパク質とＡｐｏＥ２ＮＴタンパク質には、融合発現されたＦＬＡＧが含まれる。トランスフェクションの１日前に、細胞の継代を行い、細胞の接着度が７０％～８０％に達した時点でトランスフェクションを行った。トランスフェクション試薬はｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ会社）である。

【0259】

ｂ） トランスフェクションの４～６時間後、新鮮な細胞培養液と交換した。

【0260】

ｃ） トランスフェクションの４８時間後、１×氷冷したＰＢＳで１回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を削り取り、８００ｇで５分間遠心分離して細胞を回収した。

【0261】

ｄ） 再懸濁した細胞を溶解バッファー［２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１×ｃｏｃｋｔａｉｌ］で溶解した。

【0262】

ｅ） 溶解細胞を２０サイクル（３秒間オン、３ 秒間オフ）、出力４５％ で超音波処理した。

【0263】

ｆ） タンパク質を含む上清を得るために、１２０００ｇ、１５分間、４℃で遠心分離し、上清を新しい遠沈管に集めた。

【0264】

ｇ） タンパク質を含む上清を抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティー樹脂（ＳＩＧＭＡ会社）とともに４℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ２ ＮＴは抗ＦＬＡＧ Ｍ２ アフィニティー樹脂に移された。

【0265】

ｈ） ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ２ ＮＴを含む抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティー樹脂を以下のバッファーで３回洗浄した。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１ｍＭ ＤＴＴ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０。

【0266】

ｉ） ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ２ ＮＴを、以下のバッファーで溶出した。２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ ７．４；１５０ ｍＭ ＮａＣｌと５００ μｇ／ｍｌ ３ｘＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ会社）。

【0267】

ｊ） 精製されたＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ２ ＮＴを、ウェスタンブロット検出し、－８０℃で保存した。

【0268】

２．７．３ β－ＣＴＦの精製
ａ） Ｅ．ｃｏｌｉ大腸菌でβ－ＣＴＦを発現し、発現プラスミドは、ｐＥＴ２２ β－ＣＴＦ－Ｍｙｃ－６ｘＨｉｓである。

【0269】

ｂ） ０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、３７℃で４時間発現させた後、Ｅ． ｃｏｌｉ大腸菌を以下の溶解バッファーで溶解した。３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ７．５；１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ。

【0270】

ｃ） 室温、２５０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去した。

【0271】

ｄ） 沈殿を以下のバッファーに再懸濁し、室温でゆっくりと混合した。３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ ８．０；３００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，６Ｍ ｕｒｅａ，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，１ｍＭ ＣａＣｌ_２，１×ｃｏｃｋｔａｉｌ。

【0272】

ｅ） ４００００ｇ、３０分間遠心分離し、沈殿を捨て、上清を０．４５ ｍＭフィルター膜で濾過した。

【0273】

ｆ） 濾過した上清をＮｉ－ＮＴＡビーズとともに室温で２時間インキュベートし、次に、インキュベートしたＮｉ－ＮＴＡ ビーズと上清を同時に空のクロマトグラフィーカラムにロードし、重力の作用で流出させた。通過した液体を収集し、もう一度ビーズと混ぜ合わせた。

【0274】

ｇ） 次のように、Ｎｉ－ＮＴＡ ビーズ カラム体積の１０倍で、Ｎｉ－ＮＴＡビーズを洗浄した：３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０；３００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，６Ｍ ｕｒｅａ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，１ ｍＭ ＣａＣｌ_２，１× ｃｏｃｋｔａｉｌ。

【0275】

ｈ） 次のように、Ｎｉ－ＮＴＡ ビーズ カラム体積の２０倍で、Ｎｉ－ＮＴＡ ビーズを洗浄した：３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０；３００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｒｉｏｎ Ｘ－１００。

【0276】

ｉ） 次のように、Ｎｉ－ＮＴＡ ビーズ カラム体積の２０倍で、Ｎｉ－ＮＴＡ ビーズを洗浄した：５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０；３００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＣＨＡＰＳＯ。

【0277】

ｊ） β－ＣＴＦは次のバッファーで溶出した：５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＣＨＡＰＳＯ、３００ｍＭ イミダゾール。

【0278】

ｋ） 精製されたβ－ＣＴＦを、ウェスタンブロット検出し、－８０℃で保存した。

【0279】

２．７．４ ＧＦＰの精製
ＧＦＰの精製方法は２．７．２のＡｐｏＥの精製方法と同様である。

【0280】

３． 実験結果
３．１ ３つのＡｐｏＥ異性体とさまざまなＡｐｏＥタンパク質フラグメントがＡＰＰ代謝に及ぼす影響
本発明は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてヒトＡＰＰをそれぞれＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、およびＡｐｏＥ４と共発現させ、ＧＦＰをコントロールグループとして使用し、ウェスタンブロットを使用してα－ＣＴＦの産生を測定した。免疫ブロット実験の結果（図１、パネルＡ～Ｂ）は、ＡＰＰと共発現したＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ３が、ＡＰＰの非アミロイド代謝産物α－ＣＴＦを大幅に増加できるが、ＡＰＰと共発現したＡｐｏＥ４は、α－ＣＴＦを有意に変化させることができない（ＧＦＰコントロールグループのα－ＣＴＦと比較して）ことを示した。本発明は、さらに、ＡＰＰアミロイド代謝経路に対するＡｐｏＥの影響を検討した。Ａβは、アミロイド代謝の産物であり、生成されるＡβの量が少ないほど、ＡＰＰのアミロイド代謝は弱くなる。本発明では、ヒト野生型ＡＰＰとβ－セクレターゼを、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてそれぞれＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４と共発現させ、ＧＦＰをコントロールグループとして使用して、Ａβ産生に対するＡｐｏＥの効果を検出した。ＥＬＩＳＡの結果（図１、パネルＣ）は、ＡｐｏＥ２の発現により、Ａβ４０の産生が有意に減少するが、ＡｐｏＥ３とＡｐｏＥ４には、この効果がないことを示した。ＡｐｏＥ２の発現も、ＡｐｏＥ４と比較してＡβ４０を有意に減少させた。これらの結果は、ＡＰＰと同じ細胞で発現されたＡｐｏＥ２が、ＡＰＰのアミロイド代謝を弱め、Ａβ４０を減少させたが、ＡＰＰの非アミロイド代謝物であるα－ＣＴＦを増加させることを示した。ＡｐｏＥ４は、この機能を持たない。

【0281】

本発明は、さらに、ＡｐｏＥのどのフラグメントが、ＡＰＰアミロイド代謝を減弱させる機能を発揮するかを検出した。ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、とＡｐｏＥ４は、Ｎ末端ドメインの２つのアミノ酸残基が異なるだけであり、Ｃ末端ドメインでは完全に同一のアミノ酸配列を有する。したがって、本発明は、ヒトＡｐｏＥのＮ末端フラグメントとＣ末端フラグメントの発現プラスミドを構築し、その後の実験のためにそれぞれプラスミドをＡｐｏＥ２ ＮＴ、ＡｐｏＥ３ ＮＴ、ＡｐｏＥ４ ＮＴまたはＡｐｏＥ ＣＴタンパク質と命名した。細胞内で発現させた場合、構築されたすべてのタンパク質のＮ末端はさらに、ヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（配列番号６６）に接続された。ＡＰＰを、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、ＡｐｏＥ２ ＮＴ、ＡｐｏＥ４ ＮＴおよびＡｐｏＥ ＣＴと共発現させ、ＧＦＰをコントロールグループとして使用した。免疫ブロット実験の結果（図１、パネルＤ～Ｅ）は、ＡｐｏＥ ＣＴ を共発現させた場合のみ、α－ＣＴＦが元のレベルの ５ 倍を超えて有意に増加したことを示した。ＡｐｏＥ２ ＮＴまたはＡｐｏＥ４ ＮＴのいずれかを共発現させても、α－ＣＴＦ は変化しなかった。同時に、ＥＬＩＳＡ実験結果は、ＡｐｏＥ ＣＴが、Ａβ４０をＧＦＰコントロールの約２５％まで有意に減少させ、３つのＡｐｏＥ ＮＴは、いずれもＡβ４０を減少させないことを示した（図１、パネルＦ）；同様に、ＡｐｏＥ ＣＴは、Ａβ４２をＧＦＰ コントロールの約２６％ まで大幅に減少させた（図１、パネルＧ）。

【0282】

ＡＤは神経疾患であり、脳では、Ａβは、主にニューロンで発現されるＡＰＰ の切断によって産生される。本発明は、ニューロン内にＡｐｏＥ ＣＴを発現するレンチウイルスを構築した。ＥＬＩＳＡの結果（図１、パネルＨ）は、ニューロンにおけるＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現により、初代培養マウスの海馬または皮質ニューロンで内因的に生成されるＡβ４０が、それぞれコントロールグループの約７１％および約７３％に減少する可能性があることを示した。同様に（図１、パネルＩ）、ヒト多能性幹細胞によって誘導されるニューロンにおける ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現も、ヒトニューロンで内因的に生成されるＡβ４０をコントロールグループの約５４％まで減少させた。

【0283】

これらの結果は、さまざまな細胞において、ＡｐｏＥ２が細胞自律的な方式で、Ｃ末端フラグメントを介してＡＰＰの非アミロイド代謝物 α－ＣＴＦ を増加させることができ、同時に、アミロイド代謝経路を弱め、Ａβ を減少させることできる。

【0284】

本発明の各実験で使用したＡｐｏＥ ＣＴアミノ酸配列は以下のとおりである。

【0285】

ＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）。

【0286】

３．２ 培養液中に分泌されるＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴは、ＡＰＰ切断に影響を与えない
ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴを発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を培養し、培養液を得た結果、培養液には、分泌されたＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴが含まれていることが示された（図２、パネルＡ）。ＡＰＰを発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴを含むこの培養液とともに共インキュベートした。ＡＰＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ネガティブコントロールとしてＧＦＰを含む培養液とともに共インキュベートした。結果は、共インキュベートした培養液中のＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴは、ＧＦＰコントロールと比較して、α－ＣＴＦレベルを有意に変化させないことを示した（図２、パネルＢ～Ｃ）。免疫蛍光の結果（図２、パネルＤ～Ｅ）は、長期間の共インキュベーション後でも、培養液中のＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴは、主に細胞表面に接着し、細胞内にほとんど侵入しないことを示した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（図 、パネルＤ）またはマウス初代培養ニューロン（図２、パネルＥ）で発現された ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴは、細胞内に大量に存在する。

【0287】

この結果は、細胞培養液中のＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴが、α－ＣＴＦおよびＡβの産生を変化させることができないことを示した。ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴは、細胞自律的でなければなく、つまり、ＡＰＰの切断を調節するには、ＡＰＰと同じ細胞内に存在する必要があり、それによって、α－ＣＴＦが増加し、Ａβの産生が減少する。その中には、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴを標的細胞に侵入させる方法が数多くあり、具体的に、以下を含む：リポソームは、そのようなタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを送達し、特別な指示がない限り、本発明では、リポソームを使用して、対応するタンパク質をコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトし、ＡｐｏＥおよびＡｐｏＥ ＣＴを発現させる；細胞をレンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに感染させることによって、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ ＣＴは、ＡＰＰ発現細胞において発現させることができ、本発明は、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルス発現システムを使用して、ニューロンにおいてＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴを発現させる；細胞透過性ペプチド、細胞エンドサイトーシスの増強および他の方法により、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴタンパク質をＡＰＰを発現する標的細胞に進入させることができる；本発明は、細胞透過性ペプチドの役割を後で詳細に検討する。

【0288】

３．３ ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＰアミロイド代謝のコア配列を減弱する
ＡｐｏＥ ＣＴ上に、どのアミノ酸がＡＰＰ代謝を変化させるコア配列であるかを調べるために、本発明は、ＡｐｏＥの元の１、２、３、４または５個のアミノ酸残基をＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端に付加して、ＣＴ ＮＡ１、ＣＴ ＮＡ２、ＣＴ ＮＡ３、ＣＴ ＮＡ４およびＣＴ ＮＡ５を発現するプラスミドを構築した；ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端の１、２、３、４、または５個のアミノ酸を削除し、ＣＴ ＮＤ１、ＣＴ ＮＤ２、ＣＴ ＮＤ３、ＣＴ ＮＤ４、およびＣＴ ＮＤ５を発現するプラスミドを構築した；ＡｐｏＥの元の５および１０個のアミノ酸をＡｐｏＥ ＣＴのＣ末端から削除し、ＣＴ ＣＤ５およびＣＴ ＣＤ１０を発現するプラスミドを構築した。前記ＣＴ ＮＡ１、ＣＴ ＮＡ２、ＣＴ ＮＡ３、ＣＴ ＮＡ４、ＣＴ ＮＡ５、ＣＴ ＮＤ１、ＣＴ ＮＤ２、ＣＴ ＮＤ３、ＣＴ ＮＤ４、ＣＴ ＮＤ５、ＣＴ ＣＤ５およびＣＴ ＣＤ１０のアミノ酸配列は、それぞれにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３－２４に示される。細胞内で発現させた場合、構築されたすべてのタンパク質のＮ末端はさらに、ＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に接続された。

【0289】

【表9】

【0290】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８（ＣＴ ＮＤ１）：
ＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（ＣＴ ＮＤ２）：
ＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（ＣＴ ＮＤ３）：
ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（ＣＴ ＮＤ４）：
ＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２（ＣＴ ＮＤ５）：
ＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶＰＳＤＮＨ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３（ＣＴ ＣＤ５）：
ＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴＳＡＡＰＶ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４（ＣＴ ＣＤ１０）：
ＡＲＭＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴ。

【0291】

ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、ヒトＡＰＰとβ－セクレターゼを、前記プラスミドのそれぞれと共発現させ、ＧＦＰをコントロールグループとし、ＥＬＩＳＡを使用して、Ａβ４０産生に対する前記タンパク質の効果を測定した。ＥＬＩＳＡの結果（図３、パネルＡ～Ｂ）としては、元のアミノ酸残基の１つを、ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端に付加した後でも、ＣＴ ＮＡ１が、Ａβ４０の産生を依然として減少させるが、２つ以上のアミノ酸残基を付加すると、ＣＴ ＮＡ２、ＣＴ ＮＡ３、ＣＴ ＮＡ４、およびＣＴ ＮＡ５は、Ａβを減少させる能力を完全に失うことを示す。ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端の１～５個のアミノ酸残基を削除した後でも、ＡｐｏＥ ＮＤ１、ＡｐｏＥ ＮＤ２、ＡｐｏＥ ＮＤ３、ＡｐｏＥ ＮＤ４、およびＡｐｏＥ ＮＤ５は、Ａβ４０を依然として低減できる。ＡｐｏＥ ＣＴのＣ末端から５または１０個のアミノ酸残基を削除しても、ＣＴ ＣＤ５、ＣＴ ＣＤ１０は、依然としてＡβの産生を減少した。これらの結果は、ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端が非常に重要であり、わずか１つまたは２つのアミノ酸の変化でさえ、Ａβ４０産生の阻害におけるＡｐｏＥ ＣＴの活性に影響を与える可能性があることを示す。ただし、Ｃ末端残基の活性に対する影響は比較的弱い。

【0292】

前記結果によれば、本発明は、ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端における３つのアミノ酸残基（ＣＴ ＮＤ３）の削除に基づいて、ＡｐｏＥ ＣＴのＣ末端における１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０または２５のアミノ酸残基を削除し、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１０、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１１、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１２、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１３、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１４、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１５、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ２０およびＣＴ ＮＤ３ＣＤ２５を発現するプラスミドを構築し、それらのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～３２に示す。細胞内で発現させた場合、構築されたすべてのタンパク質のＮ末端はさらに、ＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に接続された。

【0293】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５（ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１０）：
ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧＴ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６（ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１１）：
ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶＧ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７（ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１２）：
ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡＶ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８（ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１３）：
ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡＡ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９（ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１４）：
ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱＡ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０（ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１５）：
ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬＶＥＫＶＱ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１（ＣＴ ＮＤ３ＣＤ２０）：
ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲＱＷＡＧＬ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２（ＣＴ ＮＤ３ＣＤ２５）：
ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬＤＥＶＫＥＱＶＡＥＶＲＡＫＬＥＥＱＡＱＱＩＲＬＱＡＥＡＦＱＡＲＬＫＳＷＦＥＰＬＶＥＤＭＱＲ。

【0294】

ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、ヒトＡＰＰ、β－セクレターゼを、前記プラスミドのそれぞれと共発現させ、ＧＦＰをコントロールグループとし、ＥＬＩＳＡを使用して、細胞におけるＡβ４０産生に対する前記タンパク質の効果を測定した。ＥＬＩＳＡの結果（図３、パネルＣ）としては、ＡｐｏＥ ＣＴのＮ末端から３個のアミノ酸残基を削除し、かつＣ末端から１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０または２５個のアミノ酸を削除した後でも、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１０、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１１、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１２、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１３、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１４、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ１５、ＣＴ ＮＤ３ＣＤ２０またはＣＴ ＮＤ３ＣＤ２５が、Ａβ４０を依然として有意に減少させることができることを示す。これらの結果は、Ａβ産生を阻害するＡｐｏＥ ＣＴのコア配列の末端位置が、ＡｐｏＥタンパク質の残基２７４から最後のアミノ酸残基までであることを示す。

【0295】

３．４ ＡｐｏＥ ＣＴは、γ切断を介してＡＰＰ切断に影響を与える
ＡｐｏＥ ＣＴがＡＰＰ切断に影響を与える機構を研究するために、本発明は、ＡｐｏＥ ＣＴがＡＰＰの重要な分泌酵素の発現レベルを変化させるかどうかを検出した。本発明は、ｑＲＴ－ＰＣＲとＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ技術を使用し、ＡＤＡＭ１０（主要なα－セクレターゼ）、ＢＡＣＥ１（β－セクレターゼ）、ＰＳ１とＰＳ２（γ－セクレターゼ活性サブユニット）のｍＲＮＡとタンパク質の発現レベルをそれぞれ検出した。ｑＲＴ－ＰＣＲ（図４、パネルＡ）とＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ（図４、パネルＢ）の結果は、ＧＦＰコントロールと比較して、細胞内でのＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現は、ＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＰＳ１とＰＳ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現に変化を与えず、ＡｐｏＥ ＣＴがＡＰＰ代謝酵素の発現量の変化によるＡＰＰ切断に影響を及ぼさないことを示す。

【0296】

α－ＣＴＦはγ－セクレターゼの基質であり、Ａβはγ－セクレターゼの切断産物である。したがって、γ－セクレターゼの活性が変化すると、α－ＣＴＦとＡβの産生が大きく変化し、ＡｐｏＥ ＣＴはα－ＣＴＦとＡβの産生を変化させる。したがって、ＡｐｏＥ ＣＴはγ－セクレターゼの活性を変化させる可能性がある。この推測を検証するために、本発明は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞においてＡＰＰおよびγ－セクレターゼの活性中心であるＰＳ１を共発現させた。免疫ブロットの結果（図５、パネルＡ～Ｂ）としては、ＰＳ１（γ－セクレターゼ活性を増強できる）の過剰発現によりα－ＣＴＦが減少することを示した。ＡｐｏＥ ＣＴの発現、または１μＭのγ－セクレターゼ阻害剤ＰＦ０３０８４０１４による処理は、どちらもα－ＣＴＦを有意に増加した（図５、パネルＡ～Ｂ）。この結果は、細胞内で発現されたＡｐｏＥ ＣＴのＡＰＰ切断に対する効果が、γ－セクレターゼの阻害の効果と同様であることを示唆した。β－ＣＴＦは、β－セクレターゼによって消化されたＡＰＰの産物であり、γ－セクレターゼの基質でもあり、Ａβを生成するには、γ－セクレターゼ切断を１段階行うだけで完成できる。ＥＬＩＳＡの結果（図５、パネルＣ～Ｄ）は、ＡｐｏＥ ＣＴの発現が、β－ＣＴＦによって生成されるＡβ４０が元のレベルの約８０％に減少させるだけでなく、Ａβ４２も元のレベルの約８％に減少させることを示し、これは、Ａβを減少させるＡｐｏＥ ＣＴの能力が、γ切断を制御することによって達成される可能性があることを示した。本発明は、さらに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＡＰＰ細胞内Ｃ末端ドメイン（ＡＰＰ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ）が除去されたＡＰＰ（ＡＰＰ_{ΔＡＩＣＤ}）を、ＢＡＣＥ１（β－セクレターゼ）とＡｐｏＥ ＣＴと共発現させた。ＡＰＰ_{ΔＡＩＣＤ}は、γ切断を受ける必要がなく、β切断を １ 段階行うだけで、Ａβを生成することができる。ＥＬＩＳＡの結果（図５、パネルＥ）としては、ＡｐｏＥ ＣＴの発現が、ＡＰＰ_{ΔＡＩＣＤ}から生成されるＡβをもはや減少させないことを示し、ＡｐｏＥ ＣＴが、β切断に影響を及ぼさないことを示した。

【0297】

これらの結果は、細胞内で発現されたＡｐｏＥ ＣＴは、Ａβを減少させるために、γ切断を必要とし、過剰発現されたＡｐｏＥ ＣＴは、γ－セクレターゼ阻害剤の効果をシミュレートすることを示し、ＡｐｏＥ ＣＴは、ＡＰＰのγ切断を阻害し、それによって、α－ＣＴＦを増加させ、Ａβを減少させる可能性がある。

【0298】

３．５ ＡｐｏＥ ＣＴによるＡＰＰ切断の制御には、γ－セクレターゼの関与が必要である
γ－セクレターゼの活性中心は、ＰＳ１またはＰＳ２であり、ＰＳ１とＰＳ２をノックアウトすると（ＰＳ１／２ ｄＫＯ）、α－ＣＴＦは、γ－セクレターゼによって代謝されなくなり、大量に蓄積する。免疫ブロットの結果（図６、パネルＡとＤ）としては、野生型ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株において、発現されたＡｐｏＥ ＣＴが、α－ＣＴＦを有意に増加させることを示し、ＧＦＰを発現したＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞では、野生型ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株と比較して、α－ＣＴＦ含有量が大幅に増加した。ＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞におけるＡｐｏＥ ＣＴの発現は、α－ＣＴＦをさらに増加させなく、これは、γ－セクレターゼが存在しない場合、ＡｐｏＥ ＣＴがもはやα－ＣＴＦを増加させることができないことを示した。ＰＳ１あるいはＰＳ２の発現を補充したＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞で発現させたＡｐｏＥ ＣＴは、α－ＣＴＦを有意に増加させ（図６、パネルＢ～Ｄ）、これは、ＡｐｏＥ ＣＴによるα－ＣＴＦの増加が、ＰＳ１またはＰＳ２に依存することを示す。同様に、ＰＳ２の発現を補充したＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞株において、ＡｐｏＥ ＣＴの過剰発現は、Ａβ４０を減少させた（図６、パネルＥ）。これらの結果は、ＡｐｏＥ ＣＴが、γ－セクレターゼの存在下でのみ、ＡＰＰの代謝を制御できることを示した。

【0299】

３．６ ＡｐｏＥは、精製系におけるγ－セクレターゼによるβ－ＣＴＦ の切断を直接阻害する
ＡｐｏＥがγ－セクレターゼを直接阻害するかどうかをさらに検証するために、本発明は、β－ＣＴＦ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ２ ＮＴおよびγ－セクレターゼを精製し、免疫ブロットにより、これらの精製タンパク質を検証した（図７、パネルＡ）。このうちＰＳ１、ＮＣＴ、ＰＥＮ２はγ－セクレターゼの構成タンパク質である。ＥＬＩＳＡの結果（図７、パネルＢ）としては、γ－セクレターゼとβ－ＣＴＦの共インキュベーションが、Ａβを産生させることができ、当該場合、１０μＭのγ－セクレターゼ阻害剤（ＰＦ０３０８４０１４）の添加が、Ａβの産生を阻害することができることを示した。この反応系に、精製されたＡｐｏＥ２を添加し、濃度依存の方式で、Ａβ４０の産生を阻害し、その半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、約１．２μＭである（図７、パネルＣ）。さらに、同じ濃度条件（２．５μＭ）では、ＡｐｏＥ２は、Ａβの産生を有意に阻害できるが、ＡｐｏＥ２ ＮＴは、Ａβ４０の産生を阻害できない（図７、パネルＤ）。これらの結果は、ＡｐｏＥ２は、γ－セクレターゼによるβ－ＣＴＦの切断を直接阻害することができ、ＡｐｏＥ ＣＴは、ＡｐｏＥの当該活性に必要であることから、ＡｐｏＥ ＣＴは、γ－セクレターゼによるＡＰＰの切断を阻害するＡｐｏＥ２の重要なフラグメントであることを示唆した。

【0300】

３．７ ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＬＰ１のγ切断を阻害しない
ＡＰＬＰ１（ＡＰＰ ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）は、ＡＰＰと類似した構造を持つタンパク質であり、αとγセクレターゼの基質の１つである。免疫ブロットの結果（図８）としては、γ－セクレターゼ阻害剤であるＰＦ０３０８４０１４が、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるＡＰＬＰ１のγ切断を阻害し、α－ｌｉｋｅ ＣＴＦを大幅に増加させることができるが、共発現されたＡｐｏＥ ＣＴは、ＡＰＬＰ１のα－ｌｉｋｅ ＣＴＦを増加させず、ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＬＰ１のγ切断を阻害しないことを示した。この結果は、ＡｐｏＥ ＣＴがある程度の基質選択性でγ－セクレターゼの切断活性を阻害することを示した。

【0301】

３．８ ニューロンで発現されたＡｐｏＥ ＣＴは、ＡＤモデルマウスの脳のアミロイド斑を減少させる
ニューロン内でＡｐｏＥ ＣＴを発現できるアデノ随伴ウイルスを、４週齢のＡＤモデルマウス（５×ＦＡＤ）の皮質および海馬に注射した。ニューロン内でＡｐｏＥ ＣＴを（またはＧＦＰをネガティブコントロールとして）発現させてから６か月後に、アミロイド斑に対するその効果を検出し、ＡｐｏＥ ＣＴ、ＧＦＰ、とアミロイド斑を染色した。その結果としては、ニューロン内でＡｐｏＥ ＣＴ（Ｎ末端はヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）と接続する）を発現する５×ＦＡＤマウスの脳内のアミロイド斑面積は、より小さく、蛍光強度はより弱く、アミロイド斑の総面積が脳に占める割合はより小さくなり、アミロイド斑の密度もより減少した（図９、パネルＡ～Ｅ）。これらの結果は、ニューロンで発現されたＡｐｏＥ ＣＴが、５×ＦＡＤマウスの脳におけるアミロイド斑の沈着を阻害し、マウスにおけるＡＤの病理学的進行を軽減することを示した。

【0302】

３．９ ニューロンに発現されたＡｐｏＥ２は、マウスに内因的に産生されたＡβ４０を阻害できる
上記の実験は、ＡｐｏＥ ＣＴが、γ－セクレターゼ活性の阻害におけるＡｐｏＥ２の重要な機能ドメインであり、かつＡｐｏＥ ＣＴが、マウスのニューロンにおけるＡβ４０の産生を阻害できることを示した。次に、ＡｐｏＥ２がニューロンにおける内因性Ａβ４０の産生も阻害するかどうかを検討した（図１０）。ＧＦＰまたはＡｐｏＥ２は、それぞれ、レンチウイルス発現システム（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）およびニューロン特異的プロモーターを使用し、マウスの初代培養ニューロンで発現された。ＡｐｏＥ２のＮ末端は、さらに、ヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に接続された。ＥＬＩＳＡの結果（図１０、パネルＡ）としては、ニューロンにおいて過剰発現されたＡｐｏＥ２が、ＧＦＰコントロールと比較して、内因的に産生されるＡβ４０を減少させることができることを実証した。さらに、ＡＡＶ発現システムの使用が、ＡｐｏＥ２を、野生型マウス（ＷＴマウス）の脳のニューロンで発現させた。ＥＬＩＳＡの結果（図１０、パネルＢ）は、マウスの脳のニューロンで発現されたＡｐｏＥ２も、ＧＦＰコントロールと比較して内因性Ａβ４０の産生を減少させることを示した。これらの結果は、ＡｐｏＥ２が、ＡｐｏＥ ＣＴと同様に、ニューロンにおける内因性Ａβ４０の産生を阻害できることを示した。

【0303】

３．１０ 両端にタグタンパク質を挿入したＡｐｏＥが、依然としてＡＰＰ切断を制御する活性を有する
ＡｐｏＥに付加されたタグタンパク質が、ＡｐｏＥの活性を破壊するかどうかを検討するために、本発明には、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴのＣ末端およびＮ末端に、それぞれタグタンパク質Ｖ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）を付加し、それぞれ、ＡｐｏＥ２－Ｖ５（Ｖ５はＣ末端にある）、Ｖ５－ＡｐｏＥ２（Ｖ５はＮ末端にある）、ＡｐｏＥ ＣＴ－Ｖ５、およびＶ５－ＡｐｏＥ ＣＴと名付けられた。構築されたすべてタンパク質のＮ末端は、さらに、ヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に接続された。そして、これらの発現プラスミドとＡＰＰをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で共発現させた。免疫ブロットの結果としては、ＡｐｏＥ２－Ｖ５およびＶ５－ＡｐｏＥ２（図１１、パネルＡ～Ｂ）とＡｐｏＥ ＣＴ－Ｖ５およびＶ５－ＡｐｏＥ ＣＴ（図１１、パネルＣ～Ｄ）は、どちらもα－ＣＴＦを有意に増加させることを示し（図１１）、その活性は、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴに似ている。これは、両端にタグタンパク質を挿入したＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴが、依然としてＡＰＰ切断を制御する活性を有することを示した。

【0304】

３．１１ ＡｐｏＥ ＣＴの突然変異は、依然としＡＰＰの切断を制御することができる
ＡｐｏＥ ＣＴにおける突然変異が、ＡＰＰ切断の制御におけるＡｐｏＥ ＣＴの活性を変化させるかどうかを検討するために、本発明は、一連のＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体を構築し分析した。単一部位突然変異：ＣＴ Ａ２０、ＣＴ Ａ４０、ＣＴ Ａ６０、ＣＴ Ａ６５、ＣＴ Ａ７２、ＣＴ Ａ８０；二重部位突然変異：ＣＴ Ａ３６／７４；複数の部位突然変異：ＣＴ Ｅ５、ＣＴ Ｅ１０、ＣＴ Ｅ２０、ＣＴ Ｆ５、ＣＴ Ｒ１０、ＣＴ ＬＦ５、ＣＴ ＬＭ５；を含む。突然変異部位の位置は、ＡｐｏＥ ＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）に対する位置である。それらのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６～５９に示す。構築されたすべてタンパク質のＮ末端は、さらに、ヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に接続された。

【0305】

【表10】

【0306】

【表11】

【0307】

【表12】

【0308】

ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、ヒトＡＰＰを、前記プラスミドのそれぞれと共発現させ、ＧＦＰをネガティブコントロールとし、ＡｐｏＥ ＣＴをポジティブコントロールとして用いた。免疫ブロットの結果としては、構築されたＡｐｏＥ ＣＴ（図１２、パネルＡ～Ｂ）の単一部位突然変異および二重部位突然変異のうち、ＣＴ Ａ２０、ＣＴ Ａ４０、ＣＴ Ａ６０、ＣＴ Ａ６５、ＣＴ Ａ７２、ＣＴ Ａ８０およびＣＴ Ａ３６／７４のすべては、α－ＣＴＦを大幅に増加し、そしてＡｐｏＥ ＣＴと比較して、これらの突然変異によるα－ＣＴＦ増加の程度は減少しない（ＣＴ Ａ７２、ＣＴ Ａ８０、およびＣＴ Ａ３６／７４は、α－ＣＴＦをさらに大幅に増加させた）ことを示した。複数の部位突然変異ＣＴ Ｅ５、ＣＴ Ｅ１０、ＣＴ Ｅ２０およびＣＴ Ｆ５ は、α－ＣＴＦ を増加させることができなくなるが、ＣＴ Ｒ１０、ＣＴ ＬＦ５、およびＣＴ ＬＭ５は依然としてα－ＣＴＦを有意に増加させ、かつこれらの突然変異は、α－ＣＴＦをＡｐｏＥ ＣＴと同様のレベルまで増加させた（図１２、パネルＣ～Ｄ）。これらのデータは、ＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体（例えばＣＴ Ａ２０、ＣＴ Ａ４０、ＣＴ Ａ６０、ＣＴ Ａ６５、ＣＴ Ａ７２、ＣＴ Ａ８０、ＣＴ Ａ３６／７４、ＣＴ Ｒ１０、ＣＴ ＬＦ５とＣＴ ＬＭ５）も、ＡＰＰ 切断の制御において元の ＡｐｏＥ ＣＴ と同様の活性を有することを示した。

【0309】

３．１２ ＡｐｏＥ２ 内のアミノ酸残基の挿入または削除が、依然としてＡＰＰの代謝を制御できる
本実験が、ＡｐｏＥ２内のアミノ酸残基の挿入または削除が、ＡｐｏＥの活性に影響を与えるかどうかを検討した。本発明は、まず、ＡｐｏＥ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）の２１５位と２１６位のアミノ酸残基の間に、タグタンパク質３ＸＦＬＡＧを挿入し、ＡｐｏＥ２－Ｍ３Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０；太字は３ＸＦＬＡＧ配列；下線はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３の配列を示す）と命名し、当該修飾は、ＡｐｏＥ ＣＴ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）には影響を及ぼさない。本発明はまた、ＡｐｏＥ２ ＭＤ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）を構築し、ＡｐｏＥ２ ＭＤ１０は、ＡｐｏＥ２のアミノ酸残基２４４位～２５４位を削除させることにより得られ、これらの欠失アミノ酸は、ＡｐｏＥ２がＡＰＰ代謝を制御するＣ末端領域、すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３の配列に位置する。細胞内で発現させた場合、構築されたすべてのタンパク質のＮ末端はさらに、ヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に接続された。

【0310】

【表13】

【0311】

【表14】

【0312】

ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、ヒトＡＰＰを、ＡｐｏＥ２－Ｍ３ＦとＡｐｏＥ２ ＭＤ１０と共発現させ、ＧＦＰをネガティブコントロールグループとして使用した。免疫ブロットの結果（図１３）としては、ＡｐｏＥ２の中間位置にアミノ酸残基を挿入するＡｐｏＥ２－Ｍ３Ｆ（ＡｐｏＥ ＣＴ配列に影響を与えない）であっても、Ｃ末端機能領域の中央にあるアミノ酸残基を削除するＡｐｏＥ２ ＭＤ１０であっても、α－ＣＴＦを有意に増加した。この結果は、ＡｐｏＥ２内にあるアミノ酸配列を挿入あるいは削除しても、ＡｐｏＥ２は、依然としてＡＰＰの代謝を制御することができることを示した。

【0313】

３．１３：非ヒト由来のＡｐｏＥ ＣＴも、ＡＰＰの切断を制御する
非ヒトＡｐｏＥが同じ活性を持つかどうかをさらに研究するために、本実験では非ヒト霊長類由来のＡｐｏＥ ＣＴ（ｍｏｎｋｅｙ ＣＴ）を分析した。当該配列は、アミノ酸配列がヒトＡｐｏＥ ＣＴと非常に類似し、アミノ酸置換がＲ３６Ｓ＋Ｔ７４Ａ＋Ａ７６Ｔの３つだけである（図１４、パネルＣ）。サル ＡｐｏＥ ＣＴ アミノ酸配列を以下に示す。

【0314】

【表15】

【0315】

ＨＥＫ ２９３Ｔ 細胞において、ヒトＡＰＰと非ヒト霊長類ＡｐｏＥ ＣＴ（細胞内で発現させる場合、Ｎ末端はさらにヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に接続する）を共発現させ、ＧＦＰをネガティブコントロールグループとして、ヒトＡｐｏＥ ＣＴ（Ｎ末端はさらにヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に接続する）をポジティブコントロールとして使用した。免疫ノブロットの結果（図１４、パネルＡおよびＢ）としては、非ヒト霊長類ＡｐｏＥ ＣＴ（ｍｏｎｋｅｙ ＣＴ）もヒトＡｐｏＥ ＣＴもα－ＣＴＦを増加させることを示した。この結果は、非ヒト霊長類のＡｐｏＥ ＣＴにもＡＰＰ切断を制御する活性があることを示した。

【0316】

３．１４：膜透過ペプチドを挿入するＡｐｏＥは、ＡＰＰ切断を制御する活性を有する
膜透過性ペプチドが、ＡｐｏＥの活性を変化させるかどうかを検討するために、本発明は膜透過性ペプチドをＡｐｏＥに添加した。選択された膜透過ペプチド配列は次のとおりであった：

【0317】

【表16】

【0318】

ヒトＡｐｏＥ２のＮ末端にＲ９、ＦＧＦ４、ＲＤＰを添加して構築したＡｐｏＥ２突然変異体を、それぞれＲ９－ＡｐｏＥ２、ＦＧＦ４－ＡｐｏＥ２、ＲＤＰ－ＡｐｏＥ２と名付けた。すべてのタンパク質構築体のＮ末端は、さらに、ヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）に接続された。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、Ｒ９－ＡｐｏＥ２、ＦＧＦ４－ＡｐｏＥ２、およびＲＤＰ－ＡｐｏＥ２をそれぞれヒトＡＰＰと共発現させ、ＧＦＰをネガティブコントロールグループとして使用した。免疫ブロットの結果（図１５）としては、ＦＧＦ４－ＡｐｏＥ２はα－ＣＴＦを増加させなかったが、Ｒ９－ＡｐｏＥ２およびＲＤＰ－ＡｐｏＥ２の両方がα－ＣＴＦを有意に増加させたことを示した。この結果は、膜透過ペプチドと結合した ＡｐｏＥ２が、依然としてＡＰＰの切断を制御できることを示した。

【0319】

３．１５ シグナルペプチドは、ＡＰＰ切断を制御するＡｐｏＥＣＴの活性に必要である
細胞内で発現したＡｐｏＥの機能を研究するための前記実験では、使用した対応するペプチドを発現するすべてのアミノ酸配列は、ヒトＡｐｏＥ自体のシグナルペプチド（ＡｐｏＥ ＳＰ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）を含み、このシグナルペプチドは、ＡｐｏＥまたはＡｐｏＥ ＣＴおよび前記に記載のＡｐｏＥまたはＡｐｏＥ ＣＴの各突然変異体のＮ末端に位置する。シグナルペプチドがＡｐｏＥ ＣＴの活性に影響を及ぼすかどうかを研究するために、本発明では、ＡｐｏＥ ＣＴのシグナルペプチドを、それぞれＡｐｏＡ１およびＡｐｏＪのシグナルペプチドに置き換えた（ＡｐｏＡ１ ＳＰおよびＡｐｏＪ ＳＰ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）。シグナルペプチドに接続しないＡｐｏＥ ＣＴ活性も分析した。

【0320】

【表17】

【0321】

ＡｐｏＥ Ａ１シグナルペプチドで置換されたＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体はＡＳＰ ＣＴ、ＡｐｏＥ Ｊシグナルペプチドで置換されたＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体はＪＳＰ ＣＴ、シグナルペプチドを含まないＡｐｏＥ ＣＴ突然変異体はＮＳＰ ＣＴと命名した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、ヒトＡＰＰを、前記のＡｐｏＥ ＣＴの突然変異体のそれぞれと共発現させ、ＧＦＰをネガティブコントロールとし、ＡｐｏＥ ＣＴをポジティブコントロールとして用いた。免疫ブロットの結果（図１６）としては、ＡＳＰ ＣＴとＪＳＰ ＣＴは、依然としてα－ＣＴＦを増加させたが、ＡｐｏＥ自身のシグナルペプチドを用いたＡｐｏＥ ＣＴほどではなかった；シグナルペプチドを削除した後、ＮＳＰ ＣＴはもはやα－ＣＴＦを増加させなかった。この結果は、細胞内に発現したＡｐｏＥのＣＴが、γセクレターゼによるＡＰＰの切断を制御するためにはシグナルペプチドと結合している必要があるが、このシグナルペプチドは異なるシグナルペプチドであってもよく、ＡｐｏＥ本来のシグナルペプチドに限定されないことを示唆した。

【0322】

４． 実験結果
本発明は、ＡｐｏＥ２がニューロンにおいて細胞自律的な方式で、ＡＰＰの切断を制御できることを初めて明らかにしたもので、この過程はＡｐｏＥ２のＣ末端フラグメントに依存する。ＡｐｏＥのＣ末端フラグメントは、ＡＰＰの非アミロイド代謝産物であるα－ＣＴＦを増加させるだけでなく、ＡＰＰのアミロイド代謝を減衰させ、Ａβを減少させる。また、ＡｐｏＥ２とそのＣ末端フラグメントがＡＰＰの代謝を制御するのは、細胞外に分泌されたＡｐｏＥタンパク質を介して、細胞内のＡＰＰの切断に間接的に影響を与えるためではなく、ＡｐｏＥ２またはそのＣ末端フラグメントが、ＡＰＰと同じ細胞内に共存するＡＰＰのγ－切断を直接阻害することによって達成されるのであり、これは細胞自律的な作用方式であることを判明した。ＡｐｏＥ２はまた、精製タンパク質を用いた実験で、β－ＣＴＦのγセクレターゼ切断を直接阻害し、Ｃ末端を欠失するＡｐｏＥ ＮＴは、β－ＣＴＦのγセクレターゼ切断を阻害しなかったことがわかった。さらに、ＡｐｏＥのＣ末端フラグメントは、ＡＰＬＰ１のγ切断を阻害しなかったことから、ＡｐｏＥのＣ末端フラグメントによるγ切断の阻害は、ある程度基質選択的であることが示唆された。本発明はまた、ニューロンに特異的に発現するＡｐｏＥのＣ末端フラグメントが、ＡＤモデルマウスの脳におけるアミロイド斑の大きさと密度を有意に減少させることを見出した。マウスのニューロンで特異的に発現したＡｐｏＥは、内因性のＡβ４０産生を抑制する。また、ＮまたはＣ末端にタグタンパク質の挿入が、ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ Ｃ末端フラグメントのＡＰＰγ切断阻害活性には影響しなかった。本発明はまた、ＡｐｏＥ Ｃ末端フラグメントおよびＡｐｏＥ２の内部配列の一連の突然変異体を構築し、元のＡｐｏＥ ＣＴまたはＡｐｏＥ２と同様のＡＰＰγ切断阻害活性を有することを判明した。また、ＡｐｏＥのＮ末端にある膜透過性ペプチドを挿入しても、ＡＰＰγ切断を阻害する活性には影響しないが、Ｎ末端にシグナルペプチドがない場合には、ＡｐｏＥのＡＰＰγ切断阻害活性が欠損することを本発明は見出した。本発明の知見は、ヒト由来のＡｐｏＥ Ｃ末端フラグメントに限定されるものではなく、非ヒト霊長類のＡｐｏＥ Ｃ末端フラグメントもＡＰＰγ切断に対して同様の阻害活性を有する。

【0323】

これらの結果は、ＡｐｏＥ２とそのＣ末端フラグメント（あるいはＡｐｏＥ２またはＣ末端フラグメントに基づく突然変異体）が、ＡＤを予防または治療する医薬品として使用される可能性があることを示唆する。そして、そのような可能性のある医薬品は、ニューロンにおいて細胞自律的な方式で作用する必要がある。ＤＮＡまたはＲＮＡのリポソーム送達、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス感染などは、標的細胞におけるＡｐｏＥ２および／またはそのＣ末端フラグメントを発現させることができる；細胞透過性ペプチド、細胞貪食能の増強などの方式でも、標的細胞内にＡｐｏＥ２および／またはそのＣ末端フラグメントタンパク質が豊富に存在するようになる；そして、ＡｐｏＥ２および／またはそのＣ末端フラグメントは、細胞自律的な方式でγセクレターゼの切断活性を阻害し、Ａβを減少させ、ＡＰＰのアミロイド代謝を抑制する。

【0324】

前記実験は、ＡｐｏＥ２および／またはそのＣ末端フラグメントが、細胞自律的な方式でγセクレターゼの切断活性を阻害することを説明するための、ＡＤ疾患を一例として挙げるものに過ぎない。さらに、アミロイド脳血管障害などの疾患は、γセクレターゼの機能異常と関連する。また、ダウン症もＡＤに進展しやすい。したがって、ＡｐｏＥ２および／またはそのＣ末端フラグメントは、これらのＡＰＰまたはγセクレターゼ関連疾患の治療や予防に応用できる可能性もある。

【0325】

実施例２：ＡｐｏＥによるγセクレターゼの正確な阻害がアルツハイマー病の予防につながる
１． 概要
γセクレターゼ活性の異常な低下は、家族性アルツハイマー病（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＤ、ｆＡＤ）の原因となるほとんどのプロジェロイド変異と関連している。しかし、より一般的な散発性ＡＤ（ｓＡＤ）におけるγセクレターゼの役割は、未解決のままである。ヒトのアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、ｓＡＤの最も重要な遺伝的危険因子であり、本発明は、ＡｐｏＥがγセクレターゼと相互作用し、その保存されたＣ末端領域（ＣＴ）を介して、基質特異的に細胞自律的な方式でγセクレターゼ活性を阻害することを報告している。このＡｐｏＥ ＣＴに仲介される阻害活性は、異なるＡｐｏＥサブタイプによって、異なって損なわれ、その結果、ＡｐｏＥ２＞ＡｐｏＥ３＞ＡｐｏＥ４の順で、ＡＤリスクと反比例する効力を示す。興味深いことに、ＡＤマウスモデルでは、ニューロンに発現したＡｐｏＥ ＣＴが、他の領域からアミロイド斑に移動し、アミロイド斑の形成を遅らせることができる。つまり、本実験のデータは、ＡｐｏＥが基質特異的なγセクレターゼ阻害活性を持つことを明らかにし、ＡｐｏＥによるγセクレターゼの正確な阻害がｓＡＤのリスクを防ぐことを強く示唆した。

【0326】

２． 紹介
アルツハイマー病（ＡＤ）は最も一般的な神経変性疾患であり、世界中で５０００万人近くが罹患している（Ｐｒｉｎｃｅ、２０１５）。β－アミロイド（Ａβ）仮説では、ＡＤは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がβ－セクレターゼ酵素とγ－セクレターゼ酵素によって順次切断されることによって産生されるペプチドであるＡβの過剰凝集が原因であるとされる（Ｄｅ ＳｔｒｏｏｐｅｒとＫａｒｒａｎ，２０１６；Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら，１９９８；ＨａａｓｓとＳｅｌｋｏｅ，１９９３；Ｈａｒｄｙ とＳｅｌｋｏｅ，２００２；Ｗｏｌｆｅら，１９９９）。γセクレターゼの触媒活性中心であるプレセニリン１（ＰＳ１）とプレセニリン２（ＰＳ２）の突然変異は、まれな家族性ＡＤ（ｆＡＤ）を引き起こす。これらの証拠から、γセクレターゼはＡＤの創薬ターゲットと考えられる。残念ながら、従来のγセクレターゼ阻害剤による治療は、重篤な副作用を引き起こす可能性がある（Ｐａｎｚａら、２０１９；Ｘｉａ、２０１９）。最近の研究では、ｆＡＤに関連するプロジェリン突然変異は、通常、γセクレターゼ活性の全体的な低下と関連する（ＳｈｅｎとＫｅｌｌｅｈｅｒ ２００７；Ｓｕｎら．２０１７；Ｗａｌｋｅｒら．２００５；Ｘｉａら．２０１５）ことが分かって、これは、Ａβ仮説に基づいて予測されるγセクレターゼの役割とは矛盾している。Ａβに基づく薬剤開発の努力が満足のいくものではなかったことを考えると（ＫａｒｒａｎとＤｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ，２０１６）、より一般化した散発性ＡＤ（ｓＡＤ）においてγセクレターゼが果たす役割を明らかにすることが急務である。

【0327】

ｓＡＤの原因遺伝子はないが、発症リスクは多くの遺伝的要因に影響される。その中でも、アポリポ蛋白質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）は最も影響力のあるものの一つである（Ｃｏｒｄｅｒら、１９９３；Ｒｈｉｎｎら、２０１３）。ＡｐｏＥ遺伝子は、そのＮ末端領域（ＮＴ）にのみ１つのアミノ酸の違いがある３つのアイソフォーム、すなわちＡｐｏＥ２、３、４をコードする（Ｋａｎｅｋｉｙｏら，２０１４）。ＡｐｏＥ４は、ＡＤのリスクを高めるだけでなく、発症年齢を早め、ＡＤの重症度を悪化させる（Ｂｅｌｌｏｙら、２０１９；Ｌｉら、２０２０）。逆に、ＡｐｏＥ２はＡＤリスクを減少させた。げっ歯類の脳では、正常な生理的条件下では、ＡｐｏＥは通常グリア細胞でのみ検出されるが（Ｋａｎｅｋｉｙｏら、２０１４）、Ａβはニューロンで産生される。しかし、ＡｐｏＥはヒトのニューロン（Ａｏｋｉら、２００３年；Ｈａｎら、１９９４年；Ｍｅｔｚｇｅｒら、１９９６年；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら、１９９３年；Ｘｕら、１９９９年）や傷害を受けたげっ歯類のニューロンにも発現する（Ｘｕら、２００６年）。ヒトの脳におけるＡｐｏＥの代謝は、グリア細胞よりもニューロンに発現するＡｐｏＥの代謝に類似する（Ｂｒｅｃｈｔら、２００４）。異なるＡｐｏＥサブタイプを持つヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から作製したニューロンを用いた最近の研究では、ＡｐｏＥ４ポジティブニューロンでＡβ産生が増加したことから、ニューロン中のＡｐｏＥが細胞自律的な方式でＡＰＰ代謝を制御することが示唆された（Ｗａｎｇら、２０１８年）。この証拠は、ニューロンにおけるＡｐｏＥが非常に重要な生理的役割を担っていることを示唆するが、これについてはこれまで十分に研究されてこなかった。

【0328】

本実験は、ＡｐｏＥがγセクレターゼと直接相互作用し、そのＣ末端領域を介してＡＰＰのγ切断を特異的に阻害することを報告する。エキサイティングなことに、こんな抑制活性は、ＡｐｏＥサブタイプによって異なって損なわれ、ＡｐｏＥサブタイプに対応するＡＤリスクと負の相関を示した。さらに、ニューロンで発現したＡｐｏＥ ＣＴは、アミロイド斑の周囲に集積し、このアミロイド形成ホットスポット領域で局所的なγ阻害を達成できる可能性がある（Ｊｏｒｄa－Ｓｉｑｕｉｅｒら、２０２２年）。つまり、本実験のデータは、ＡｐｏＥによるγセクレターゼの正確な阻害が、ｓＡＤのリスクを防ぐことを示唆し、ＡｐｏＥ ＣＴが、これまでにない特異性を持つ新規のγセクレターゼ阻害剤であることを明らかにした。

【0329】

３． 実験結果
３．１． 内因性ＡｐｏＥとＡＰＰは、ヒト大脳皮質ニューロンで共発現し、かつ重複した細胞内分布パターンを示す
ＡｐｏＥは、げっ歯類の脳では主にグリア細胞に発現し、Ａβはニューロンに発現するＡＰＰによって代謝される。そのため、ほとんどの研究は、グリア細胞から分泌されるＡｐｏＥが、細胞外のアミロイド斑の形成にどのように影響するかに焦点を当てる（Ｈｕａｎｇら、２０１７年；Ｈｕｙｎｈら、２０１７年；Ｌｉｕら，２０１７年）。しかし最近の研究で、ＡｐｏＥは細胞自律的な方式で、Ａβの産生を制御できることが示された（Ｗａｎｇら、２０１８年）。本研究では、この可能性のあるメカニズムを探る前に、ＡｐｏＥが実際にニューロンに発現することを確認するため、まずヒトの脳サンプルを免疫蛍光法で染色した。この実験結果は、ヒトの脳のニューロンとグリア細胞の両方でＡｐｏＥが検出されたという、以前に報告されたヒトの脳のデータ（Ａｏｋｉら、２００３；Ｂｅｌｏｎｗｕら、２０２２；Ｈａｎら、１９９４；Ｚａｌｏｃｕｓｋｙら、２０２１）と一致する。具体的には、若年コントロールグループ（図１７、パネルＡ；図２５、パネルＢ；および図３２のヒト脳ドナーの情報）、年齢をマッチさせた非ＡＤ患者のコントロールグループ（高齢、６０歳以上）、ＡＤ患者（ＡＤ、６０歳以上）の脳サンプルでは、皮質ニューロンの３０～５０％がＡｐｏＥ陽性であった（図２５、パネルＡおよびＢ）；一方、ヒト大脳皮質サンプルでは、ＡｐｏＥ陽性細胞の４０－６２％がニューロンであった（図１７、パネルＡ；図２５、パネルＡおよびＣ）。さらに、ヒトの皮質アストロサイトもＡｐｏＥを発現した（図２５、パネルＤ）。サルの大脳皮質では、検出可能なＡｐｏＥシグナルのほとんどはニューロンに位置する（図１７、パネルＡ）。ヒトＡＤ患者の脳では、アミロイド斑に強いＡｐｏＥ染色シグナルが検出されたが、ＡＤを罹患しないコントロール脳サンプルの同じ部位では、ＡｐｏＥシグナルは検出されなかった（図２５、パネルＥ）。重要なことは、免疫染色によって、内因性のＡｐｏＥとＡＰＰが、ヒト大脳皮質神経細胞で共存し、細胞内シグナル伝達パターンが重複していることが示されたことである（図１７、パネルＢ）。

【0330】

３．２． ＡｐｏＥ２は、細胞自律的な方式でα－ＣＴＦを増加させ、Ａβを減少させる
ＡｐｏＥが細胞自律的な方式でＡＰＰ代謝を制御できるかどうかを研究するため、本実験では、マウスのニューロン株（Ｎ２Ａ；図１７、パネルＣ）とＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（図２６、パネルＣ）で、ＡＰＰをＡｐｏＥと共発現させた。α－ＣＴＦは、ＡＰＰの非アミロイド代謝経路の切断産物であり、その産生は、α－セクレターゼ（Ｅｓｃｈら、１９９０年；Ｈａａｓｓら、１９９２年；ＭｕｃｋｅとＳｅｌｋｏｅ，２０１２年）であるＡＤＡＭ１０（図２６、パネルＡおよびＢ）に大きく依存することが知られる。Ｎ２Ａ細胞とＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３は、共発現ＡＰＰから産生されるα－ＣＴＦのレベルを有意に増加させた（図１７、パネルＣおよびＤ、Ｎ２Ａ細胞；図２６、パネルＣおよびＤ、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞）。さらに、ＡｐｏＥ２は、共発現ＡＰＰから産生されるＡβ４０のレベルも有意に減少させた（図１７、パネルＥ）。興味深いことに、ＡｐｏＥ４とＡＰＰの共発現は、α－ＣＴＦ（図１７、パネルＣとＤ）およびＡβ４０レベル（図１７、パネルＥ）を変化させることができなかった。これらの結果は、ＡｐｏＥ２が細胞自律的な方式でα－ＣＴＦを増加させることを示唆する。

【0331】

３．３． ＡｐｏＥ２のＣ末端領域は、全長ＡｐｏＥ２よりもα－ＣＴＦ濃度を上昇させる活性が高い
ＡｐｏＥは、三つの領域を含む：一つのＮ末端領域（ＡｐｏＥ ＮＴ）、一つのヒンジ領域と一つの保存のＣ末端領域（ＡｐｏＥ ＣＴ）（図３３）（Ｃｈｅｎら、２０１１）。３つのＡｐｏＥサブタイプの間の配列の違いは、それらのＮＴ内にあるのみである。ＡｐｏＥサブタイプの短縮突然変異体を持つＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を用いた実験では、ＡｐｏＥ２、３、４由来のＮＴは、共発現ＡＰＰから産生されるα－ＣＴＦを有意に変化させないことが示された（図２６、パネルＥおよびＦ）。逆に、保存されたＡｐｏＥ ＣＴの共発現は、α－ＣＴＦレベルを６倍以上増加させた（図２６、パネルＧとＨ）。

【0332】

驚くべきことに、実験の結果としては、ＡｐｏＥ ＣＴをＡＰＰと共発現させると、細胞培養液に分泌されるＡβ_４０が、約７５％減少し（図２６、パネルＩ）、細胞溶解液中のＡβ_４０が、約４２％減少し（図２６、パネルＪ）、さらにＡβ_４２が、約７４％有意に減少したが（図２６、パネルＫ）、それでもＡβ_４２／Ａβ_４０の比率は、変化しなかった（図２６、パネルＫ）。しかし、ＡｐｏＥ ＣＴをＡＰＰとＢＡＣＥ１と共発現させても、β－ＣＴＦレベルは変化しなかった（図２６、パネルＬおよびＭ）。すべてのＡｐｏＥ ＮＴは、Ａβ_４０を有意に減少させることができなかった（図２６、パネルＩ）。同様に、Ｎ２Ａ細胞を用いた実験では、ＡｐｏＥ ＣＴとＡＰＰの共発現のみがα－ＣＴＦを有意に増加させたが、ＡｐｏＥ ＮＴの共発現ではα－ＣＴＦは増加しなかった（図１７、パネルＦおよびＧ）；さらに、ＡｐｏＥ ＣＴは総Ａβ_４０も有意に減少させた（図１７、パネルＨ）。

【0333】

実験により、ＡｐｏＥ２と比較して、ＡｐｏＥ ＣＴは、α－ＣＴＦレベル（図１７、パネルＩとＪ、Ｎ２Ａ細胞；図２６、パネルＮとＯ、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞）を有意に増加させ、これは、ＡｐｏＥ ＣＴがＡＰＰの代謝を制御する上で、全長ＡｐｏＥ２よりも活性が高いことを示している。これらの結果は、ＡｐｏＥの保存領域であるＡｐｏＥ ＣＴが、α－ＣＴＦレベルを増加させることを示唆し、かつＡｐｏＥのＮＴがＡｐｏＥ ＣＴのこの活性を何らかの形で妨げている可能性を表す。

【0334】

分泌のＡｐｏＥが、ＡＰＰの切断にも影響するかどうかを研究するため、本研究は、分泌型ＡｐｏＥまたはＡｐｏＥ ＣＴを含む培養液で、ＡＰＰのみを発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を培養した（図２７）。実験では、培養液中の遊離のＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴは、細胞内でＡＰＰが産生するα－ＣＴＦを変化させないことを示した（図２７、パネルＡ、Ｂ、Ｃ）。注目すべきことに、ＡｐｏＥ２は、３７℃の条件付き培地中で４８時間も安定して存在した（図２７、パネルＤ）。ならし培地で処理したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞と初代培養のラットのニューロンでは、ＡｐｏＥ２ またはＡｐｏＥ ＣＴが、主に細胞膜の外側に検出された（図２７、パネルＥおよびＦ）。これに対して、細胞内またはニューロンで発現されるＡｐｏＥ ＣＴは、細胞内またはニューロン内に分布した（図２７、パネルＥおよびＦ）。細胞溶解液中のＡｐｏＥ２と培養液中に分泌されたＡｐｏＥ２の相対量を比較すると、どちらも同程度の量のＡｐｏＥ２を含んでいた（図２７、パネルＧ）。さらに、ならし培地に含まれる少量のＡｐｏＥは、共インキュベーション後、細胞やニューロンによってエンドサイトーシスされる（図２７、パネルＥおよびＦ）。従って、ＡｐｏＥによるＡＰＰ代謝制御は、分泌のＡｐｏＥよりも細胞内ＡｐｏＥによって細胞自律的な方式で行われる可能性が高い。

【0335】

３．４． ニューロンに発現したＡｐｏＥ ＣＴは、内因性Ａβを減少させる
ヒトＡＰＰに加え、ＡｐｏＥ ＣＴは、マウスＡＰＰ（ｍＡＰＰ）を一過性に発現させたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞でもα－ＣＴＦレベルを増加させた（図２６、パネルＰおよびＱ）。初代培養のニューロンを用いた実験の結果としては、マウスの皮質および海馬ニューロンでＡｐｏＥ ＣＴを過剰発現（レンチウイルス感染）させると、内因性Ａβ_４０がＧＦＰコントロールに比べて３０％減少した（図１７、パネルＫ）。ｈｉＰＳＣで誘導したニューロンでは、ＡｐｏＥ ＣＴ（レンチウイルス感染）により、ヒトのニューロンによる産生されたＡβ_４０が、約４６％減少した（図１７、パネルＬ）。つまり、これらの結果により、ＡｐｏＥ ＣＴが、げっ歯類およびヒトのニューロンにおける内因性Ａβを遅らせることが示唆される。さらに、ＡｐｏＥ ＣＴの発現は、病原性スウェーデンＡＰＰ突然変異体（ＡＰＰＳＷ）を発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（Ｃｉｔｒｏｎら、１９９２）におけるＡβ_４０産生を遅らせた：培地におけるＡβ_４０は、約７６％減少し（図２６、パネルＲ）、細胞溶解液におけるＡβ_４０は、約４３％減少し（図２６、パネルＳ）、これは、ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＰＰＳＷから産生されたＡβを減少させることを示した。

【0336】

ＡＰＰと共発現したもう一つのアポリポタンパク質であるアポリポタンパク質Ａ１（ＡｐｏＡ１）は、α－ＣＴＦとＡβのレベルを変化させることができなかった（図２６、パネルＴ、Ｕ、Ｖ）ことから、ＡＰＰの切断を制御するＡｐｏＥの活性は、どのアポリポタンパク質の非特異的な活性でもないことが示唆される。

【0337】

３．５． ＡｐｏＥ２は、ＣＴを仲介してＡＰＰとγセクレターゼと相互作用する
Ｎ２Ａ細胞では、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ ＣＴは、共発現したＡＰＰ－ＦＬＡＧと非常によく似た核周囲の細胞内分布パターンを示した（図１８、パネルＡ）。培養されたラットの海馬ニューロン（図１８、パネルＢ）とｈｉＰＳＣ誘導ニューロン（図１８、パネルＣ）では、ＡｐｏＥ２－Ｖ５またはＡｐｏＥ ＣＴ－Ｖ５の発現は、ニューロン内で内因性に発現したＡＰＰと同様の細胞内分布パターンを示した（Ｖ５はタグタンパク質）。これらの結果は、ＡｐｏＥとＡｐｏＥ ＣＴがＡＰＰと同様の細胞内分布パターンを持つことを示唆した。

【0338】

ＡｐｏＥとＡＰＰまたはＡＰＰセクレターゼとの潜在的相互作用を検出するため、本実験では、タンパク質近接依存性標識技術が用いられた（Ｈｕｎｇら、２０１６）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させると、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴは、ＡＰＰ－ＡＰＥＸ２（ＡＰＰのＣ末端に接続したアスコルビン酸ペルオキシダーゼ２；図１８、パネルＤとＥ）によってビオチン化された。また、ＦＬ－ＡＰＰ（全長ＡＰＰ）とα－ＣＴＦは、同じシステムでＡｐｏＥ２－ＡＰＥＸ２によってビオチン化された（図１８、パネルＦ）。初代培養のラットのニューロンでは、ＡｐｏＥ２－ＡＰＥＸ２は内因性に発現したＡＰＰをビオチン化した（図１８、パネルＧ）。さらに、ＡｐｏＥ２－ＡＰＥＸ２は、共発現したＡＤＡＭ１０（αセクレターゼ）、ＰＳ１およびＰＳ２（γセクレターゼの切断触媒活性）をビオチン化したが、βセクレターゼＢＡＣＥ１はビオチン化しなかった（図１８、パネルＨ）。さらに、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で共発現させると、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴ（ＡｐｏＥ２ ＮＴではなく）は、β－ＣＴＦ－ＦＬＡＧと免疫沈降できた（図１８、パネルＩ）。同様に、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で共発現させると、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴ（ＡｐｏＥ２ＮＴではなく）は、γセクレターゼの成分（ＡＰＨ、ＮＣＴ、ＰＥＮ２）と免疫沈降した（図１８、パネルＪ；抗ＦＬＡＧ－ＰＥＮ２で用い、免疫沈降を行う）。興味深いことに、ヒトの脳サンプルでは、内因性のγセクレターゼ（ＮＣＴ、ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＥＮ２）が、内因性のＡｐｏＥと免疫沈降した（図１８、パネルＫ）。以上の結果は、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴのみが（ＡｐｏＥ ＮＴではなく）、ＡＰＰ、γセクレターゼ、αセクレターゼと相互作用できるが、ＢＡＣＥ１とは相互作用しないこと、かつＡｐｏＥとγセクレターゼの内因性相互作用がヒトの脳に存在することを示している。

【0339】

３．６． ＡｐｏＥ ＣＴはＡＰＰのγ切断を減少させる
潜在的なメカニズムをさらに研究するため、本研究では、ＡＤに関連するＡＰＰ突然変異体とＡｐｏＥ ＣＴとの相互作用をさらに探索した。ＡｐｏＥ ＣＴは、試験したすべてのＡＰＰ突然変異体から産生されたα－ＣＴＦを増加させた（図２８）。興味深いことに、野生型ＡＰＰ（ＷＴ ＡＰＰ）に比べて、ＡｐｏＥ ＣＴがα－ＣＴＦレベルを増加させる能力は、γ切断部位近傍にｆＡＤ変異を持つＡＰＰ突然変異体を発現する細胞（Ｔ７１４Ｉ、Ｖ７１７Ｆ、Ｌ７２３Ｐ）（Ｋｕｍａｒ－Ｓｉｎｇｈら、２０００；Ｋｗｏｋら、２０００；Ｍｕｒｒｅｌｌら、１９９１）で有意に低下した（図２８）。ＷＴ ＡＰＰと、β－またはα－切断部位近傍にｆＡＤ突然変異を生じたＡＰＰサブタイプ（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ、Ｅ６９３Ｋ、Ｅ６９３Δ）（Ｂｕｇｉａｎｉら、２０１０；Ｃｉｔｒｏｎら、１９９２；Ｔｏｍｉｙａｍａら、２００８；Ｘｉａら、２０２１）を研究するところ、α－ＣＴＦレベルに対するＡｐｏＥ ＣＴの統計的に有意な影響は検出されなかった（図２８）；ＡＤ発症の確率を低下させ、保護的であるＩｃｅｌａｎｄｉｃ突然変異（Ａ６７３Ｔ）（Ｘｉａら、２０２１年）を共発現するＡＰＰサブタイプも、α－ＣＴＦレベルに対するＡｐｏＥ ＣＴの有意な影響は検出されなかった（図２８）。これらを総合すると、ＡＰＰのγ部位近傍で変異が起こると、ＡｐｏＥ ＣＴ活性は、破壊され、この現象は、ＡＰＰの代謝を制御するＡｐｏＥ ＣＴの活性にγ切断が関係していることを示唆する。α－ＣＴＦはγ切断によって分解されることから（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら ２０１２；Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら １９９８；Ｈａａｓｓら １９９２）、これらの結果は、ＡｐｏＥ ＣＴがα－ＣＴＦ分解に影響を及ぼす可能性を示唆する。

【0340】

次に、本研究は、ＡＰＰ代謝におけるγ－セクレターゼの役割に基づく詳細な検討した。γセクレターゼによるα－ＣＴＦ切断に関する以前の報告（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら、２０１２；Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら、１９９８；Ｈａａｓｓら、１９９２）と一致し、ＰＳ１の過剰発現は、α－ＣＴＦのレベルを５０％まで有意に減少させた（図１９、パネルＡおよびＢ）；γセクレターゼ阻害剤ＰＦ０３０８４０１４（１μＭ）で処理すると、過剰発現したＰＳ１はもはやα－ＣＴＦを減少させず、ＰＦ０３０８４０１４はα－ＣＴＦも増加させた；γセクレターゼ阻害剤で処理したとき、α－ＣＴＦのレベルは、ＡｐｏＥ ＣＴを共発現させたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるα－ＣＴＦのレベルと同様であった（図１９、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）。興味深いことに、ＰＦ０３０８４０１４の存在下で、ＡｐｏＥ ＣＴは、α－ＣＴＦをさらに増加させることができず（図１９、パネルＣおよびＤ）、ＡｐｏＥ ＣＴ活性はγセクレターゼを阻害することでブロックできることが示唆された。さらに、ＡＤＡＭ１０阻害剤ＧＩ２５４０２３Ｘ（１μＭ）を使用すると、α－ＣＴＦは約４５％まで減少した（図２９、パネルＡおよびＢ）。ＧＩ２５４０２３Ｘの存在下でも、ＡｐｏＥ ＣＴは、α－ＣＴＦを増加させ（約４倍；図２９、パネルＡおよびＢ）、Ａβ_４０を減少させた（図２９、パネルＣおよびＤ）。さらに、β－セクレターゼを、その阻害剤ＡＺＤ３８３９（５μＭ）で阻害しても、ＡｐｏＥ ＣＴはα－ＣＴＦを増加させた（図２９、パネルＥおよびＦ）。ＡｐｏＥ ＣＴはまた、ＡＰＰ_{Ｍ５９６Ｖ}から産生されたα－ＣＴＦを増強することができ（図２９、パネルＧおよびＨ）、ＡＰＰ_{Ｍ５９６Ｖ}は、β－切断を受けられないＡＰＰ突然変異である（Ｃｉｔｒｏｎら、１９９５）。さらに、ＡｐｏＥ ＣＴは、β－ＣＴＦから産生されるＡβ_４０（図１９、パネルＥ）およびＡβ_４２（図１９、パネルＦ）も有意に減少させたことから、ＡｐｏＥ ＣＴはγ－切断を阻害することによってＡβ産生を減少させることが示唆された。ＡＰＰのγ－切断産物であるＡＰＰ_{ΔＡＩＣＤ}は、Ａβ_４０を産生するためにβ切断されるだけでよい。興味深いことに、ＡｐｏＥ ＣＴは、ＡＰＰ_{ΔＡＩＣＤ}から産生されたＡβ_４０を減少させることができなかった（図１９、パネルＧおよびＨ）。これらの結果の全ては、ＡｐｏＥ ＣＴはＡＰＰのγ切断を阻害するが、α切断やβ切断は直接に制御しないという仮説が支持される。

【0341】

また、ＡｐｏＥ２もＡｐｏＥ ＣＴも、どちらも、ＡＤＡＭ１０、ＢＡＣＥ１、ＰＳ１、ＰＳ２のｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルを変化させなかったことから（図２９、パネルＩおよびＪ）、ＡＰＰセクレターゼの発現レベルには変化がないことが示唆された。また、ＡｐｏＥ ＣＴは、細胞表面上のＡＰＰ発現を変化させなかった（図２９、パネルＫ）。

【0342】

３．７． ＡｐｏＥ ＣＴによるＡＰＰ代謝の制御には、γ－セクレターゼの関与が必要である
ＡｐｏＥ ＣＴによるＡＰＰ代謝の制御が、γセクレターゼを必要とするかどうかを研究するため、本研究では、ＰＳ１および／またはＰＳ２ノックアウト（ＫＯ）ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株を構築した（Ｌｕら、２０１４）（図２０、パネルＡ）。ＰＳ１ ＫＯ細胞でのα－ＣＴＦレベルは上昇し、これは、ＰＳ１の代償的発現によって逆転することができた（図２０、パネルＢ）。ＰＦ０３０８４０１４処理は、ＰＳ１ ＫＯ細胞でのα－ＣＴＦレベルをさらに増加させた（図２０、パネルＢ）。共発現させたＡｐｏＥ ＣＴは、ＰＳ１ ＫＯ細胞（図２０、パネルＣとＤ）およびＰＳ２ ＫＯ細胞（図２０、パネルＥとＦ）でもα－ＣＴＦを増加させることができた。したがって、ＰＳ１またはＰＳ２をノックダウンするだけでは、ＡｐｏＥのＣＴ活性を完全に消失させるには不十分である。

【0343】

ＷＴ細胞に比べて、ＰＳ１／２ダブルノックアウト細胞（ＰＳ１／２ ｄＫＯ）では、α－ＣＴＦレベルも有意に上昇した（図２０、パネルＧ）；ＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞にＡｐｏＥ ＣＴ（図２０、パネルＧおよびＪ）またはＡｐｏＥ２（図２０、パネルＫおよびＬ）を共発現させても、α－ＣＴＦレベルはそれ以上上昇しなかった。ＰＳ１またはＰＳ２の発現を補充することが、ＡｐｏＥ ＣＴの活性を回復し、ＡｐｏＥ ＣＴが、再びα－ＣＴＦを有意に増加した（図２０、パネルＨ、Ｉ、Ｊ）。また、ＰＳ２の発現を補充したＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞において、ＡｐｏＥ ＣＴは、β－ＣＴＦから産生されるＡβ_４０を有意に減少させた（図２０、パネルＭ）。これらの結果から、ＡｐｏＥ ＣＴまたはＡｐｏＥ２がα－ＣＴＦを増加させるにはγセクレターゼが必要であることが示唆される。

【0344】

３．８． マウスのニューロンに内因性に発現したＡｐｏＥは、内因性ＡＰＰのγ－切断を制御する。
ニューロンにおける内因性ＡｐｏＥの生理的活性を研究するため、マウスＡｐｏＥに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＡｐｏＥ＿１、ｓｈＡｐｏＥ＿２、およびｓｈＳｃｒａｍｂｌｅをコントロールとして）を構築した。マウスニューロンでレンチウイルスシステムを利用して発現されたｓｈＡｐｏＥ＿１とｓｈＡｐｏＥ＿２が、初代培養のマウスニューロンにおける内因的なＡｐｏＥのタンパク質の発現量を低下することに成功した（図２１、パネルＡ）。γセクレターゼ阻害剤であるＰＦ０３０８４０１４で処理した後に、ニューロンにおけるＡＰＰ代謝によって産生された～１４ｋＤのＣＴＦ（Ｃ末端断片、ＣＴＦ_１４ｋＤ）のレベルは有意に増加し、これは、当該ＣＴＦ_１４ｋＤもγセクレターゼによって切断されることを示する（図２１、パネルＢ）。ｓｈＡｐｏＥ＿１またはｓｈＡｐｏＥ＿２は、マウスのニューロンにおけるＣＴＦ_１４ｋＤバンドの基礎レベルを有意に減少させ（図２１、パネルＣおよびＤ）、これは、内因性ＡｐｏＥが、ＣＴＦ_１４ｋＤを増加させることが示唆された。γセクレターゼである阻害剤ＰＦ０３０８４０１４が存在する場合、ＡｐｏＥのこれら２つのｓｈＲＮＡは、もはやＣＴＦ_１４ｋＤを減少させることができなく（図２１、パネルＥ）、これは、ＡｐｏＥのこの活性には、活性型γセクレターゼの存在が必要であることを示唆する。また、ＡｐｏＥのノックダウンが、ニューロンで産生されるＡβレベルも増加した（図２１、パネルＦ）。これらの結果から、ニューロン内の内因性ＡｐｏＥが、内因性ＡＰＰのγ切断を制御することが示唆される。

【0345】

３．９． ＡｐｏＥ ＣＴは基質特異的にγ切断を阻害する。
本発明は、さらに、ＡｐｏＥ ＣＴがＮＯＴＣＨのγ－切断も阻害するかどうかを検出した。ＮＯＴＣＨは、γセクレターゼの基質である（Ｘｉａ， ２０１９；Ｙａｎｇら、２０１９）。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞では、共発現したγセクレターゼは、Ｎ１００（ＮＯＴＣＨフラグメント）を減少し、ＰＦ０３０８４０１４での処理が、この減少を逆転した（図３０、パネルＡ）。興味深いことに、共発現したＡｐｏＥ ＣＴは、このγセクレターゼ依存性のＮ１００の減少を抑制できなかった（図３０、パネルＡ）。しかし、ＡｐｏＥ ＣＴをγセクレターゼと共発現させる場合、ＡｐｏＥ ＣＴが、依然としてγセクレターゼによるＡＰＰのγ切断を阻害した（図３０、パネルＢ）。ＡＰＰ様タンパク質１（ＡＰＰ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １、ＡＰＬＰ１）は、αセクレターゼとγセクレターゼのもう一つの基質である（Ｅｇｇｅｒｔら、２００４）。ＰＦ０３０８４０１４での処理が、ＡＰＬＰ１のレベルを減少したが、その切断産物（α－ｌｉｋｅ ＣＴＦ）は増加した；しかし、α－ｌｉｋｅ ＣＴＦは、ＡｐｏＥ ＣＴとＡＰＬＰ１の共発現によって変化しない（図３０、パネルＣ）。これらの結果は、ＡｐｏＥ ＣＴがＮＯＴＣＨとＡＰＬＰ１のγ－切断を阻害しないことを示する。

【0346】

３．１０． ＡｐｏＥ２は、ＡＰＰのγ切断を直接阻害する
ＡｐｏＥがβ－ＣＴＦのγ切断を直接阻害するかどうかを確定するために、本発明は、さらなる試験のために、β－ＣＴＦ、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ２ ＮＴ、およびγセクレターゼ（Ｌｕら、２０１４）を精製した（図２２、パネルＡ；図３１）。精製されたγセクレターゼをβ－ＣＴＦとインキュベートすると、Ａβ_４０が産生された；γセクレターゼが存在しない場合、β－ＣＴＦはＡβ_４０を産生しない；そして、β－ＣＴＦとインキュベートしたγ－セクレターゼによるＡβ_４０の産生は、ＰＦ０３０８４０１４によって完全にブロックされた（図２２、パネルＢ）。精製されたＡｐｏＥ２は、用量依存的な方式でＡβ４０産生を阻害し、ＩＣ５０は１．２μＭであった（図２２、パネルＣ）。逆に、ＡｐｏＥ２ ＮＴは、Ａβ４０の産生を抑制できなかった（図２２、パネルＤ）。これらの結果は、ＡｐｏＥ２が、そのＣＴを介してβ－ＣＴＦのγ－切断を直接阻害することを示唆する。

【0347】

３．１１． ニューロンに発現されたＡｐｏＥ ＣＴが、アミロイド斑に移行し、かつ５×ＦＡＤマウスの斑の負荷を減弱させた
ＡｐｏＥ ＣＴが、ＡＤマウスモデルにおけるアミロイド斑の発生を遅らせることができるかどうかを研究するため、本実験では、４週齢の５×ＦＡＤマウスの大脳皮質と海馬の神経細胞に、ＡＡＶベクターを介してＡｐｏＥ ＣＴを発現させた（図２３、パネルＡ）。１０週後、ＧＦＰコントロールと比較して、ＡｐｏＥ ＣＴを発現した５×ＦＡＤマウスの海馬台（ｓｕｂｉｃｕｌｕｍ）の脳領域では、平均斑の大きさ、総アミロイド斑の面積の百分比、斑密度が有意に減少した（図２３、パネルＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。

【0348】

興味深いことに、これらの５×ＦＡＤマウスでは、ＡｐｏＥ ＣＴの発現は、大脳皮質、海馬の歯状回（ＤＧ）とＣＡ３領域のニューロンに限定されたが、ｓｕｂｉｃｕｌｕｍに移動してアミロイド斑の周辺に蓄積した（図２３、パネルＢ）；これに対して、ニューロンで発現されたＧＦＰは、そうならなかった。本発明（図２５、パネルＥ）および他者（Ｍｅｔｚｇｅｒら、１９９６）によって報告されたデータによって、ニューロンで発現されたＡｐｏＥ ＣＴはアミロイド斑に移動し、アミロイド形成のホットスポット（Ｊｏｒｄａ－Ｓｉｑｕｉｅｒら、２０２２）でγセクレターゼを局所的に制御することができる。５×ＦＡＤマウスで、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ ＣＴをレンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ）を用いて発現させると、アミロイド斑の周囲に同様の分布パターンが検出された（図２４、パネルＡ、矢印、アミロイド斑中のＡｐｏＥ；無柄矢印、神経細胞中のＡｐｏＥ）；一方、ＧＦＰとＡｐｏＥ２ ＮＴは、斑の周囲に集積しなかった（図２４、パネルＡ）。アミロイド斑を産生しなかった１ヵ月齢の５×ＦＡＤマウス（図２４、パネルＢ）とＷＴマウス（図２４、パネルＣ）では、ＡｐｏＥ ＣＴは、ニューロンのみに存在し、かつ発現されたヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）の細胞内分布部分と共局在していた。これらの結果は、アミロイド斑周辺へのＡｐｏＥの蓄積にはＣＴが必要であることを示唆する。

【0349】

４． 検討
ＡＤ治療のためにＡβを標的とする取り組みが失敗し続けていることから、ＡＤにおけるＡβの役割が疑問視されている（Ｌｉｕら２０１９；Ｐａｎｚａら２０１９；Ｒｏｂｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｕｃｋｅ ２００６）。必然的に、この失敗は、ＡＤそのものの基本的な理解の多くにも挑戦することになる。例えば、γセクレターゼの機能不全が、ｆＡＤの原因であることに疑いの余地はないが、ヒトの遺伝学的証拠によると、Ａβの調節異常とｆＡＤが強く結びついている（Ｓｅｌｋｏｅ，２００１）。しかし、ｓＡＤにおけるＡβの役割を支持する証拠ははるかに弱い。ｓＡＤが、たまたまｆＡＤと同じ病理学的特徴を共有する別の疾患である可能性を完全に否定することはできない（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，２０１３；Ｄｅ ＳｔｒｏｏｐｅｒとＫａｒｒａｎ，２０１６）。実際、ｆＡＤとｓＡＤは、発症年齢、詳細な病理学的異常、症状など、基礎となる遺伝的要因以外にも異なる点がある（Ｄｏｒｓｚｅｗｓｋａら、２０１６年；Ｒｏｈｅｒら、２０１６年）。

【0350】

ＡｐｏＥはｓＡＤの最も重要な遺伝的因子であり、本実験から得られたデータは、ＡｐｏＥが、ＡＰＰのγ切断（アミロイド形成における重要なステップ）を選択的に阻害することによって、ｓＡＤのリスクを減少させるようであることを初めて示している。本発明のこれらの結果は、ＡｐｏＥ２保有者に比べて、ＡｐｏＥ４保有者のアミロイド負荷がより多く、非アミロイド生成経路からの代謝産物が少ない理由を説明するものである（Ｃｏｒｄｅｒら、１９９３；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２０１２；Ｏｌｓｓｏｎら、２００３；Ｓｃｈｍｅｃｈｅｌら、１９９３）。つまり、本実験から得られたデータは、γセクレターゼの正確な阻害がｓＡＤのリスクを防ぐことを支持し、したがって、γセクレターゼを阻害することによってｓＡＤを治療することは合理的である。注目すべきは、最近の研究で、ｆＡＤのプロジェリン変異のほとんどが、γセクレターゼ活性の低下をもたらすことがわかったことである（Ｓｕｎら、２０１７；Ｘｉａら、２０１５）。このことは、γセクレターゼの機能不全が、ｓＡＤとｆＡＤの発病機構において、中心的な役割を果たしているにもかかわらず、γセクレターゼ活性の変化が、これら２つの異なるＡＤ型では逆であることを示唆している。この観点から、γセクレターゼの阻害は、プロジェリン機能喪失の突然変異を持つｆＡＤには適用されないかもしれない。このことは、なぜγセクレターゼ活性が高くても低くてもＡＤになるのか、及びｆＡＤは、γセクレターゼ活性に対するプロジェリン突然変異の影響に基づいて異なるグループに分類されるべきかどうか、という興味深い疑問が生じる。

【0351】

同時に、まだ試験されていない広範なγ基質（ＧｕｎｅｒとＬｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ，２０２０）を考慮すると、ＡｐｏＥによって切断が阻害される基質は、ＡＰＰだけではない可能性があり、したがって、ＡｐｏＥがＡＰＰのγ酵素切断に及ぼす影響は、ｓＡＤの危険性の唯一の原因ではない可能性があるが、それでもなおもっともらしい。したがって、γセクレターゼを阻害しても、Ａβクリアランスと同じ効果は得られないかもしれない。これは、Ａβクリアランス戦略だけでは、満足のいく臨床結果が得られない理由を説明する一助となる可能性があり、特に興味深い問題である。γセクレターゼのどの基質が、ＡｐｏＥの影響を受けるかを分析することにより、本発明の研究は、ＡＤの病因におけるＡβ以外のγセクレターゼの基質の役割を探求する機会となる。

【0352】

マウスモデルでは、ＡｐｏＥは、主にグリア細胞に発現する（Ｘｕら、２００６年）。Ａβはニューロンで産生されるため、ほとんどの研究は、グリア細胞から分泌されるＡｐｏＥが、細胞外のアミロイドプロセスにどのように影響するかに焦点を当ててきた（Ｈｏｌｔｚｍａｎら、１９９９；Ｈｕａｎｇら、２０１７；Ｈｕｙｎｈら、２０１７；Ｌｉｕら、２０１７；Ｙｕら、２０１４）。実際、ＡｐｏＥのｍＲＮＡとタンパク質の両方が、ヒトの神経細胞で検出されることは、異なる研究室からの多くの論文で独立して示される（Ａｏｋｉら、２００３；Ｈａｎら、１９９４；Ｍｅｔｚｇｅｒら、１９９６；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら、１９９３；Ｘｕら、１９９９）。最近の単一核ＲＮＡ－ｓｅｑデータからも、ニューロンでＡｐｏＥが検出されることが示唆され、ＡＤ患者のニューロンの最大２８％が高レベルでＡｐｏＥを発現し（Ｂｅｌｏｎｗｕら、２０２２年；Ｚａｌｏｃｕｓｋｙら，２０２１年）、これは、ヒト大脳皮質の神経細胞の約３０～４０％がＡｐｏＥを発現しているというわれわれの観察と一致している。なお、ヒトの脳におけるＡｐｏＥの代謝は、グリア細胞よりもニューロンに発現するＡｐｏＥの代謝に類似する（Ｂｒｅｃｈｔら、２００４）。また、ＡｐｏＥ４サブタイプを持つヒトのニューロンが産生したＡβは、他のＡｐｏＥサブタイプを持つヒトのニューロンよりも多いことが報告され（Ｗａｎｇら、２０１８年）、このことは、ヒトのニューロンにおいて内因性に発現したＡｐｏＥが内因性のＡＰＰ代謝を制御しているという考えを強く支持している。しかし、ニューロンにおけるＡｐｏＥの役割は、まだほとんど理解されていない。本発明は、保護サブタイプＡｐｏＥ２が、そのＣＴを介して細胞自律的な方式でＡＰＰのγ切断を直接阻害するが、、ＡｐｏＥ４にはこの活性がないことを見出した。重要なことは、本発明は、マウスのニューロンにおける内因性ＡｐｏＥが、内因性に発現したＡＰＰのγ切断を有意に阻害することも見出した；また、ヒトの脳において内因性ＡｐｏＥと内因性に発現したγセクレターゼとの間に、相互作用があることも見出した。さらに、ＡＤのマウスモデルには、ＡＤの主要な病理学的特徴の多くを内包しているが、ＡｐｏＥによるアミロイド沈着は内包していない（Ｏａｋｌｅｙら、２００６年）。驚くべきことに、５×ＦＡＤマウスのニューロンで発現したＡｐｏＥが、アミロイド斑の周囲に移動し、集積していることを本発明は見出し、このことは、ＡＤ患者の脳のアミロイド斑にＡｐｏＥが存在するという既報の報告と一致し（Ｈａｎら、１９９４；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒら、１９９３）、斑中のＡｐｏＥがニューロン由来であることを示唆する。これらの見出は、ニューロンにおけるＡｐｏＥが、ＡＤにおいて非常に重要な役割を果たしていることを強調し、ＡｐｏＥ２とＡｐｏＥ４が、ＡＤの発病機構に与える寄与の違いについて、新たなメカニズム的説明を与えるものである。

【0353】

γセクレターゼは、ＡＤの創薬ターゲットとなる可能性がある。しかしながら、過去の医薬品開発において、γセクレターゼ活性の阻害は、おそらく異なる基質にわたるγセクレターゼ阻害剤の選択性が低いために、重篤な副作用につながることが判明した（Ｐａｎｚａら、２０１９；ＲｏｂｅｒｓｏｎとＭｕｃｋｅ ２００６；Ｘｉａ ２０１９）。広範で非特異的な阻害剤は、γセクレターゼを阻害し、Ａβの産生をブロックする際に、γセクレターゼの他の基質の正常なプロセシングも阻害し（Ｐａｎｚａら、２０１９年；Ｘｉａ，２０１９年）、副作用を引き起こす。ＡＰＰのγ切断を選択的に阻害するγセクレターゼ修飾剤の開発は、有望な新戦略である（Ｘｉａ，２０１９）。本発明は、ＡｐｏＥ ＣＴがＡＰＰのγ切断を阻害するが、ＮＯＴＣＨとＡＰＬＰ１のγ切断には影響しないことを見出し、これは、ＡｐｏＥ ＣＴのγ切断阻害作用が基質特異的であることを示した。以前に報告されたように、低分子薬剤は、基質（例えばＡＰＰ又はＮｏｔｃｈ（Ｙａｎｇら、２０２１））と相互作用するＰＳ１上のβ鎖と同じ位置を占めることによって、γセクレターゼ活性を阻害する。ＡｐｏＥ ＣＴは、従来の低分子阻害剤とは構造的に異なる分子であるため、多くの変化した部位に作用し、γセクレターゼへの特定の基質のみの結合に影響を与えるが、他の基質には影響を与えなく、そして、基質選択性を実現する可能性がある。しかし、正確なメカニズムはまだ解明されていない。それにもかかわらず、ＡｐｏＥ ＣＴは、従来のγセクレターゼ阻害剤よりも副作用が少ない可能性のある、新たな戦略的治療法として役立つ可能性がある。つまり、本発明は、ｓＡＤの発病機構におけるニューロンＡｐｏＥサブタイプの役割を理解するための潜在的なメカニズムを提供するだけではなく、さらに、本発明は、ＡＤに関連するγセクレターゼ基質のγ切断を選択的に阻害することにより、ＡｐｏＥ ＣＴをＡＤの潜在的治療アプローチとして同定する。

【0354】

これらの結果は、通常γセクレターゼ活性の低下と関連するｆＡＤとは逆に、γセクレターゼの正確な阻害が、ｓＡＤのリスクを防ぐという考えを支持するものである。本発明はまた、ＡｐｏＥ ＣＴをγセクレターゼの効果的な阻害剤として同定し、ＡｐｏＥ ＣＴは、稀な基質特異性を持ち、遠くから移動して斑周辺のアミロイド形成ホットスポットで局所的に作用することができる。

【0355】

５． 実験材料と方法
動物
５×ＦＡＤマウスのニューロンは、５つのｆＡＤ突然変異を持つヒト由来のＡＰＰとＰＳ１を発現する：ＡＰＰのＫ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ＋Ｉ７１６Ｖ＋Ｖ７１７Ｉ突然変異とＰＳ１のＭ１４６Ｌ＋Ｌ２８６Ｖ突然変異である（Ｏａｋｌｅｙら， ２００６）。すべてのマウスは、１２時間の明暗サイクル（午前８時から午後８時まで点灯）で飼育され、餌と水は自由に摂取できた。すべてのマウスの処置は、中国科学院および米国国立衛生研究所の実験動物の飼育と使用に関するガイドラインに従って行われた。

【0356】

ヒトとサルの脳組織
すべてのヒト脳組織は、中国湖北省のＣｈｉｎｅｓｅ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＢＢＣ）、浙江大学医学部およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。図３２には、ドナー情報をまとめた。ヒト脳組織は、実験前に－８０℃で保存し、４％ＰＦＡで一晩固定し、切片化する前に３０％のスクロースで一晩凍結した。以下のステップは、マウスの脳切片を用いたＩＨＣと同じである。

【0357】

アカゲザルの成体の固定した脳スライスは、中国、上海の中国科学院神経科学研究所から入手した（Ｗｕら、２０２１年）。

【0358】

初代ニューロンの培養
初代の単離されたニューロンの培養物は、以前に記載されたように調製した（Ｃｈｅｎら、２０１４年）。１６日目の野生型胚から、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）またはラット（ＳＤ）の海馬全体または皮質を取り出し、３７℃で１０分間パパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）で処理し、解離した。単離した細胞を、Ｂ２７ニューロン増殖培地に、１５０，０００個／ウェル（２４ウェルプレート）で接種した。ニューロンは３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養され、新鮮な培地が週に一度加えられた。

【0359】

ＰＳ１ ＫＯ、ＰＳ２ ＫＯおよびＰＳ１／２ ｄＫＯ細胞株の構築
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ血清アルブミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。ＰＳ１、ＰＳ２シングルノックアウトまたはＰＳ１／２ダブルノックアウトのＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株を調製するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集法を用いた（Ｒａｎら、２０１３年）。ＰＳ１エクソン４を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）５’－ＡＴＴＡＴＣＴＡＡＴＧＧＡＣＧＡＣＣＣＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）およびＰＳ２エクソン４を標的とするｇＲＮＡ、すなわち５’－ＣＡＡＡＴＡＣＧＧＡＧＣＧＡＡＧＣＡＣＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）を、それぞれｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ｐｕｒｏ骨格にサブクローニングした（ＰＳ１ｇＲＮＡ、ＰＳ２ｇＲＮＡ）。ｇＲＮＡを含むプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＰＳ１ ｇＲＮＡまたはＰＳ２ ｇＲＮＡのトランスフェクションから１８時間後、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、３μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｅｌｌｅｃｋ）で処理した。空のプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞が完全に死滅した時点で、ＰＳ１ ｇＲＮＡまたはＰＳ２ ｇＲＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍディッシュで、１：４００の希釈率で培養し、各細胞が単一クローンであることを確認した。個々の細胞が、細胞クラスターに成長した後、ゲノム編集された細胞クラスターが選択され、ＤＮＡシーケンシングとＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによって検証された。ＰＳ１／２ｄＫＯを構築する用の細胞株は、ＰＳ１ ｇＲＮＡをＰＳ２ノックアウト細胞にトランスフェクトし、２回目のスクリーニングを行った。

【0360】

タンパク質ブロッティング（ＷＢ）
プラスミドを、ＨＥＫ ２９３ＴまたはＮ２Ａ細胞に、３６－４８時間トランスフェクトし、細胞溶解バッファー［１０％ １Ｍｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー］で溶解した。溶解液を室温で１０分間シェイクした後、１０分間煮沸し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。タンパク質は、８％または１２％のＴｒｉｓ－グリシン ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけられ、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に移された。サンプルは、５％ＢＳＡバッファ－（１×ＴＢＳＴ中）で希釈した一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。１×ＴＢＳＴで３回洗浄した後、５％ＢＳＡブッファ－（１×ＴＢＳＴ中）で希釈した二次抗体と室温で２時間インキュベートした。最後に、１×ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬタンパク質ブロッティング基質（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、ＰＥ００１０）でシグナルを検出した。

【0361】

脳組織のサンプルは、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ、８５３００）を用い、ＲＩＰＡバッファー（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｒ００１０）中で溶解した。溶解液を１０分間煮沸し、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの操作手順は、細胞サンプルの場合と同じであった。

【0362】

タンパク質ブロッティング用のＡＰＥＸタグ付きタンパク質の調製
ＡＰＥＸ２によって生細胞内のタンパク質相互作用を標的的に検出する方法は、以前に記載されたように適用された（Ｈｕｎｇら、２０１６年）。トランスフェクションから約３０時間後、ＡＰＥＸ２プラスミドと一緒に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を通して、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、２５０ｕＭビオチンフェノール（ＢＰ）を含むか含まない１ｍｌの完全培地中で、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を１ｍＭのＨ_２Ｏ_２で１分間処理し、クエンチャー溶液（１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＴｒｏｌｏｘ、１０ｍＭのアジ化ナトリウムの１×ＤＰＢＳ溶液）で３回洗浄した。細胞を、ＲＩＰＡ溶解バッファー（１×タンパク質阻害剤混合物、１ｍＭ ＰＭＳＦと１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、５ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘと１０ｍＭアジ化ナトリウム）で溶解した。溶解物を、氷上で超音波処理し、遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、上清をストレプトアビジン磁気ビーズと、４℃で一晩インキュベートした。ビーズをマグネットラックで回収し、一連のバッファー（ＲＩＰＡバッファーで２回、１Ｍ ＫＣｌで１回、０．１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３で１回、２Ｍ尿素の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２回、ＲＩＰＡ溶解バッファーで２回）で洗浄した。２ｍＭビオチンと２０ｍＭ ＤＴＴを含むローディングバッファー中で、各サンプルを１０分間煮沸することにより、ビーズからビオチン化されたタンパク質を溶出し、溶出液を回収した。サンプルは、さらにタンパク質ブロッティングを行った。

【0363】

免疫共沈降（ｃｏ－ＩＰ）
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトしようとするプラスミドと共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で４８時間処理し、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を１％ＣＨＡＰＳＯ（ＳＩＧＭＡ社）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（Ｇｉｂｃｏ社）、１５０ｍＭＮａＣｌ（１×プロテアーゼ阻害剤混合物を含む）で溶解し、１４，０００×ｇで２０分間遠心し、上清を回収した。上清を抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社）または抗ＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）と、４℃で３時間インキュベートし、そして、ＰｒｏｔｅｉｎＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｇｅｎ Ｓｃｒｉｐｔ社）でプルダウンし、その後、０．１％ジギタリスサポニン－ＨＥＰＥＳバッファーで、１５分間ずつ３回洗浄し、細胞溶解バッファー［１０％１Ｍｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー］で回収した。サンプルは、さらにタンパク質ブロッティングを行った。

【0364】

免疫蛍光染色および免疫組織化学（ＩＨＣ）
２４ウェルプレートのカバースリップ上で培養したニューロンとＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１×ＰＢＳ（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）で洗浄し、４％ ＰＦＡ＋４％ スクロースで、室温で、１×ＰＢＳに１０分間固定した。次に、１×ＰＢＳ中の０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで１５分間透過処理し、かつ室温で、１×ＰＢＳ中の５％ ＢＳＡで３０分間ブロッキングし、サンプルを、５％ ＢＳＡ（１×ＰＢＳ中）バッファーで希釈した一次抗体とともに、４℃で一晩インキュベートした。その後、サンプルを、１×ＰＢＳ中の０．５Ｍ ＮａＣｌで１回、１×ＰＢＳで３回洗浄した。その後、５％ ＢＳＡ（１×ＰＢＳ中）バッファーで希釈した二次抗体とインキュベートし、室温で１時間放置した。１×ＰＢＳで３回の最終洗浄した後、サンプルを、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で封入した。すべての画像は盲検下で撮影、分析された。

【0365】

マウスを、イソフルランで麻酔し、４％ ＰＦＡで灌流した。解剖したマウスの脳を、４％ ＰＦＡで一晩固定し、３０％ スクロースで一晩凍結保護した。凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて、固定・凍結保護したマウスの脳から凍結脳切片（４０μＭ）を得た。切片を浮遊させ、１×ＰＢＳで３回洗浄し、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを加えた１×ＰＢＳで３０分間透過処理した。１×ＰＢＳ中の５％ ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした後、切片を、一次抗体を含む５％ ＢＳＡ（１×ＰＢＳ中）ブッファ－中で、４℃で一晩インキュベートした。切片を、１×ＰＢＳで３回洗浄し、５％ ＢＳＡ（１×ＰＢＳ）バッファーで希釈した二次抗体と室温で１時間インキュベートした。その後、サンプルを、１×ＰＢＳで３回洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で封入した。

【0366】

ＴＨＳ染色
マウスを、イソフルランで麻酔し、４％ ＰＦＡで灌流した。解剖したマウスの脳を、４％ ＰＦＡで一晩固定し、３０％ スクロースで一晩凍結保護した。凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて、固定・凍結保護したマウスの脳から凍結脳切片（４０μＭ）を得た。切片を浮遊させ、ｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄し、その後、１％ ＴＨＳ（ＳＩＧＭＡ）水溶液で室温で５分間インキュベートした。次に、切片を、８０％ エタノールで２回、９５％ エタノールで１回、それぞれ３分間洗浄した。ＩＨＣのために、サンプルを、ｄｄＨ_２Ｏで洗浄し、１×ＰＢＳで３回洗浄した。

【0367】

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から総ＲＮＡを抽出した。逆転写は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて行った。ＧＡＰＤＨは、内部コントロールとして用いた。ＡＤＡＭ１０ ｍＲＮＡのフォワードプライマー５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧＡＣＡＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）とリバースプライマー５’－ＴＣＣＡＣＡＡＡＴＡＧＧＴＴＧＧＣＣＡＧＡＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡのフォワードプライマー５’－ＡＡＣＧＡＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）とリバースプライマー５’－ＡＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＧＴＴＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）、ＰＳ１ ｍＲＮＡのためのフォワードプライマー５’－ＴＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）とリバースプライマー５’－ＴＣＡＧＡＡＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）、ＰＳ２ ｍＲＮＡのためのフォワードプライマー５’－ＴＴＴＧＡＧＣＣＴＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）とリバースプライマー５’－ＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＣＴＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）は、ｑＲＴ－ＰＣＲに用いられた。定量は、ＳＹＢＲグリーン蛍光シグナル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のアプライドバイオシステムズ）の比較閾値サイクリング測定を用いて、テストした。

【0368】

酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＮ２Ａ細胞を４８時間トランスフェクトし、またはレンチウイルスでニューロンを４．５日後感染した後に、培地と溶解物を回収した。プロトコルの指示に従い、ＡβＥＬＩＳＡキットによって、培地と細胞溶解物におけるＡβ_４０とＡβ_４２を検出した。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；ヒトＡβ４０はＫＨＢ３４８１で、ヒトＡβ_４２はＫＨＢ３４４１で、マウスＡβ_４０はＫＭＢ３４８１で検出する）。

【0369】

タンパク質の精製
ヒトのγセクレターゼ複合体を、前述（Ｌｕら、２０１４）のように精製し、ヒトのγセクレターゼ複合体をコードするｃＤＮＡと発現ベクターも、Ｌｕら、２０１４年を参照する。

【0370】

ヒトＡｐｏＥタンパク質の精製。ヒトのＡｐｏＥプラスミド（ＡｐｏＥ２－３×ＦＬＡＧまたはＡｐｏＥ２ＮＴ－３×ＦＬＡＧ）で細胞をトランスフェクションしてから４８時間後、トランスフェクションした細胞を、冷たい１×ＰＢＳで１回洗浄し、回収して８００ｇで遠心分離した。細胞の沈殿を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ－２０と１×プロテアーゼ阻害剤の混合物を含む溶解バッファー５ｍｌに再懸濁した。細胞溶解は、超音波処理で行い、細胞破片を、遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃、１５分間）で分離した。上清を、抗ＦＬＡＧＭ２アフィニティーゲル（ＳＩＧＭＡ社）と一緒に、４℃で９０分間インキュベートした。その後、樹脂を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴと０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ－２０を含むバッファーで３回洗浄した。２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００μｇ／ｍｌの３×ＦＬＡＧペプチド（ＳＩＧＭＡ社）を含むバッファーで、ＡｐｏＥタンパク質を溶出した。精製されたタンパク質を示すために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとタンパク質ブロッティングが用いられた。

【0371】

β－ＣＴＦの精製。ヒトβ－ＣＴＦ－Ｍｙｃ－６×Ｈｉｓプラスミドで、大腸菌細胞を形質転換し、ＯＤ２６０が０．６～０．８に達した時点で、０．５μＭ ＩＰＴＧ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）で３７℃、４時間に、大腸菌細胞を誘導した。大腸菌細胞を、該当バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解し、氷上で超音波処理した。溶解物を、２５，０００×ｇで１０分間遠心し、尿素バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ 尿素、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１×プロテアーゼ阻害剤混合物）に溶解して３時間ゆっくり回転させた。再懸濁した溶解物を、４０，０００×ｇ、３０分間で２回遠心し、上清をＮｉ－ＮＴＡビーズ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）と室温で２時間インキュベートした。１０カラム容量（ＣＶ）の尿素バッファー１（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０；３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ尿素、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１×ｃｏｃｋｔａｉｌ）、２０ＣＶの洗浄バッファー２（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＴｒｉｏｎＸ－１００）、２０ＣＶの洗浄バッファー３（５０ ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｓｈａｒｐｓｏｌ）を使用した。結合した物質は、０－３００ｍＭのイミダゾール勾配を持つ洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＣＨＡＰＳＯ）で溶出された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥとタンパク質ブロッティングは、精製されたタンパク質の可視化に用いられた。

【0372】

ウイルスの立体的な定位注射
イソフルランによる深麻酔後、マウス（５週齢）を立体的な定位装置（ＲＷＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）に入れた。ゼロ点（ｘ，ｙ，ｚ，０，０，０）はブレグマ（Ｂｒｅｇｍａ）である。レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ＧＦＰ、ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ＡｐｏＥとｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ＡｐｏＥ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）とＡＡＶ（ＡＡＶ２／９－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡおよびＡＡＶ２／９－ｈＳｙｎ－ＡｐｏＥＣＴ；Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔａｉｔｏｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社購入）を大脳皮質（ｘ，ｙ，ｚ，＋／－１．６，０，－１）または海馬（ｘ，ｙ，ｚ，＋／－１．５，－２，－１．５）に注射し、各注射部位に１ｕｌずつ注入した。その後、手術後のマウスは、リハビリのためにケージに戻された。

【0373】

量子化と統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（ｖ６）は、ｕｎｐａｉｒｅｄ、ｐａｉｒｅｄ又はｏｎｅ ｓａｍｐｌｅのｔ－ｔｅｓｔを用いてデータを分析した。Ａβ_４０とＡβ_４２レベルは、対応するＧＦＰコントロールに対して正規化した。α－ＣＴＦレベルは、ＦＬ－ＡＰＰと、対応するＧＦＰコントロールに対して正規化した。全てのデータは平均値±ＳＥＭで表される。統計の有意性は、ｐ＜０．０５と定義した。図における１つ星、２つ星、３つ星、４つ星（＊）は、それぞれｐ値＜０．０５、＜０．０１、＜０．００１、＜０．０００１を示す。

【0374】

６． 参考文献

【0375】

【表18】

【0376】

【表19】

【0377】

【表20】

【0378】

【表21】

【0379】

【表22】

【0380】

【表23】

【0381】

【表24】

【0382】

【表25】

【0383】

【表26】

【0384】

【表27】

【0385】

【表28】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【配列表】

2025504957000001.xml

【国際調査報告】