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特表2025-504968サイトメガロウイルス抗原を標的とするＴＣＲおよびそれを発現するＴ細胞ならびに使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-02-19
(54)【発明の名称】サイトメガロウイルス抗原を標的とするＴＣＲおよびそれを発現するＴ細胞ならびに使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/725 20060101AFI20250212BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20250212BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20250212BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20250212BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20250212BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20250212BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20250212BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20250212BHJP
A61K 35/17 20250101ALI20250212BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20250212BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20250212BHJP
【ＦＩ】
C07K14/725
C07K19/00 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N15/867 Z
C12N5/10
A61K38/16
A61K48/00
A61K35/17
A61K35/28
A61P31/20
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024545099
(86)(22)【出願日】2022-12-02
(85)【翻訳文提出日】2024-07-29
(86)【国際出願番号】 CN2022136297
(87)【国際公開番号】W WO2023142683
(87)【国際公開日】2023-08-03
(31)【優先権主張番号】202210099611.0
(32)【優先日】2022-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524282445
【氏名又は名称】上海市第一人民医院
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】王鵬然
(72)【発明者】
【氏名】沈良華
(72)【発明者】
【氏名】張岩
(72)【発明者】
【氏名】宋献民
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA02
4C084NA14
4C084ZB33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB33
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、サイトメガロウイルス抗原を標的とするＴＣＲおよびそれを発現するＴ細胞ならびに使用を提供し、具体的に、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１限定でサイトメガロウイルスｐｐ６５抗原エピトープを標的とする特異的Ｔ細胞およびその使用を公開し、当該Ｔ細胞が持つＴ細胞受容体は特異的にＣＭＶ－ｐｐ６５を標的とし、そして正確かつ迅速にＣＭＶウイルスを排除することができる。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、ＴＣＲα鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列がＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ （配列番号１３）で、ならびに／あるいは前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列がＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ （配列番号２１）であることを特徴とするＴＣＲ。
【請求項2】
前記ＴＣＲα可変ドメインのの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、α－ＣＤＲ１：ＳＳＮＦＹＡ（配列番号９）、
α－ＣＤＲ２：ＭＴＬＮＧＤＥ（配列番号１１）、
α－ＣＤＲ３：ＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ（配列番号１３）で；ならびに／あるいは
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの３つの相補性決定領域は、
β－ＣＤＲ １：ＭＮＨＥＹ（配列番号１７）、
β－ＣＤＲ ２：ＳＭＮＶＥＶ（配列番号１９）、
β－ＣＤＲ ３：ＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ（配列番号２１）である
ことを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項3】
ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列で、ならびに／あるいは、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項4】
前記ＴＣＲのアミノ酸配列は配列番号１で示されることを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項5】
多価ＴＣＲ複合体であって、少なくとも２つのＴＣＲ分子を含み、かつそのうちの少なくとも１つのＴＣＲ分子は上記請求項のいずれかに記載のＴＣＲであることを特徴とする複合体。
【請求項6】
請求項１に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項7】
前記の核酸分子はＴＣＲα鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の配列番号８を含み、ならびに／あるいは前記の核酸分子はＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の配列番号１６を含む
ことを特徴とする請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
請求項６記載の核酸分子を含み、好適に、ウイルスベクターで、より好適に、レンチウイルスベクターであることを特徴とするベクター。
【請求項9】
分離された宿主細胞であって、請求項８に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の請求項６記載の核酸分子が組み込まれていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項10】
請求項６に記載の核酸分子または請求項８に記載にベクターが形質導入されており、好適に、Ｔ細胞または幹細胞であることを特徴とする細胞。
【請求項11】
薬学的に許容されるビヒクルと、請求項１－４のいずれかに記載のＴＣＲ、請求項５に中記載のＴＣＲ複合体、請求項６に記載の核酸分子、あるいは請求項１０に中記載の細胞とを含有することを特徴とする薬物組成物。
【請求項12】
請求項１－４のいずれかに記載のＴ細胞受容体、または請求項５に記載のＴＣＲ複合体または請求項１０に記載の細胞の使用であって、サイトメガロウイルス感染症を治療する薬物の製造のためであることを特徴とする使用。
【請求項13】
疾患を治療する方法であって、治療を必要とする対象に請求項１－４のいずれかに記載のＴＣＲ、請求項５に記載のＴＣＲ複合体、請求項６に記載の核酸分子、または請求項１０に記載の細胞または請求項１１に記載の薬物組成物を施用することを含むことを特徴とする方法。
【請求項14】
前記の疾患はサイトメガロウイルス感染に関連する疾患（サイトメガロウイルス感染症）、たとえば、ＣＭＶ網膜炎、ＣＭＶ肺炎、ＣＭＶ胃腸炎やＣＭＶ脳炎などであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サイトメガロウイルス由来抗原ペプチドを認識できるＴＣＲ、上記ＴＣＲを発現するサイトメガロウイルス特異的Ｔ細胞、ならびにサイトメガロウイルス関連疾患の予防および治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）はヒトヘルペスウイルス科β亜科に属し、明らかな宿主種の特異性を有し、ヒトヘルペスウイルス科のうち、最も大きく、構造も最も複雑なウイルスである。ＣＭＶはヒト間における感染が非常に広く、成人の感染率が９５％以上に達し、通常、不顕性感染になっており、多くの感染者は臨床症状がないが、一定の条件において複数の臓器およびシステムを侵すと重度な疾患になることがある。近年、ＣＭＶ感染の診断・治療が大きく進歩することで、移植後のＣＭＶ感染の発症率が明らかに低下してきたが、ＣＭＶ感染は同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）の患者においては未だに高い発生率のままで、それによる間接的な結果、たとえば、継発性移植片機能不全、ＧＶＨＤ、全死因死亡率などが患者の予後にまだ大きな影響を与える。一方、既存の抗ＣＭＶ薬も、剤形が単調、標的が類似、顆粒球減少／腎臓損傷につながるなど、不足な点が多い。現在の抗ウイルス薬、たとえば、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）などは、重度な副作用、たとえば、骨髄抑制などを引き起こすことが多い。
【0003】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、約２０－２５種類のタンパク質を含有し、そのうち、ＨＣＭＶ感染およびウイルス複製の媒介において３種類のタンパク質、すなわち、ＯＲＦ ＵＬ８３によってコードされるｐｐ６５タンパク質、ＯＲＦ ＵＬ８２によってコードされるリン酸化タンパク質ｐｐ７１およびＯＲＦ ＵＬ６９によってコードされるｐＵＬ６９タンパク質の作用が最も重要である。上記３種類のタンパク質の共通の特徴は、ＨＣＭＶの宿主細胞に対する感染およびウイルスの複製を開始させることで、同時にＴ細胞が媒介する細胞毒性作用の逃避においても重要な作用がある。研究では、上記３種類のタンパク質のうち、ｐｐ６５タンパク質による移植片の血管病変および拒絶反応の作用が最も重度である。ａｌｌｏ－ＨＳＣＴによる免疫障害は、潜伏していたＨＣＭＶを再活性化させることで、重度の臨床合併症につながる。
【0004】
近年、免疫チェックポイント阻害剤、ＣＡＲ－Ｔ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ）およびＴＣＲ－Ｔ（Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ）をはじめとする細胞免疫治療は腫瘍治療の分野において大きな進展が得られた。ＴＣＲ－Ｔ治療は腫瘍抗原または特定のウイルス抗原に対する特異的ＴＣＲを獲得し、そして遺伝子工学技術によってＴ細胞を改変し、体内へ注入することで、腫瘍を治療するか、ウイルス感染を排除する目的を果たす。
【0005】
ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ患者は免疫機能が低下するため、有効にＣＭＶを排除することができず、原発性ＣＭＶ感染または潜伏していたＣＭＶの再活性化が発生しやすい。ＨＳＣＴ患者のＣＭＶ感染／再活性化が発生すると、ＣＭＶに関連する発熱、ひいては臓器に及ぶ一連の関連疾患につながり、疾患の再発および被験者の生存と密接に関連し、そして現在の通常の薬物治療の効果が劣る。そのため、ＣＭＶ－ＴＣＲ－Ｔ細胞療法をＨＳＣＴまたはほかの臓器移植後のＣＭＶ感染の治療および予防の分野に応用することができれば、臨床における価値および使用の将来性が非常にある。
【発明の概要】
【0006】
本発明の目的は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１限定でサイトメガロウイルス抗原エピトープｐｐ６５を標的とする特異的ＴＣＲ、当該ＴＣＲを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞およびその使用を提供することにある。
【0007】
本発明の第一の側面では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、ＴＣＲα鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列がＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ （配列番号１３）で、ならびに／あるいは
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列がＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ （配列番号２１）であるものを提供する。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲは特異的にＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１複合体に結合する。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は以下のものである：
α－ＣＤＲ１：ＳＳＮＦＹＡ（配列番号９）、
α－ＣＤＲ２：ＭＴＬＮＧＤＥ（配列番号１１）、
α－ＣＤＲ３：ＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ（配列番号１３）。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの３つの相補性決定領域は以下のものである：
β－ＣＤＲ １：ＭＮＨＥＹ（配列番号１７）、
β－ＣＤＲ ２：ＳＭＮＶＥＶ（配列番号１９）、
β－ＣＤＲ ３：ＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ（配列番号２１）。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列で、ならびに／あるいは前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはα鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号７を含む。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号１５を含む。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはαβヘテロ二量体で、ＴＣＲα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲβ鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含む。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列は配列番号３である。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列は配列番号５である。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはα鎖とβ鎖の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲのアミノ配列は配列番号１で示される。
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列がＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ （配列番号２１）であるものを提供する。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲは特異的にＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１複合体に結合する。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は以下のものである：
α－ＣＤＲ１：ＳＳＮＦＹＡ（配列番号９）、
α－ＣＤＲ２：ＭＴＬＮＧＤＥ（配列番号１１）、
α－ＣＤＲ３：ＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ（配列番号１３）。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの３つの相補性決定領域は以下のものである：
β－ＣＤＲ １：ＭＮＨＥＹ（配列番号１７）、
β－ＣＤＲ ２：ＳＭＮＶＥＶ（配列番号１９）、
β－ＣＤＲ ３：ＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ（配列番号２１）。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列で、ならびに／あるいは前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはα鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号７を含む。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号１５を含む。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはαβヘテロ二量体で、ＴＣＲα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲβ鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含む。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列は配列番号３である。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲのβ鎖のアミノ酸配列は配列番号５である。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲはα鎖とβ鎖の間に人工的鎖間ジスルフィド結合を含有する。
もう一つの好適な例において、前記ＴＣＲのアミノ配列は配列番号１で示される。
【0008】
本発明の第二の側面では、多価ＴＣＲ複合体であって、少なくとも２つのＴＣＲ分子を含み、かつそのうちの少なくとも１つのＴＣＲ分子は本発明の第一の側面に記載のＴＣＲである複合体を提供する。
【0009】
本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補配列を含む核酸分子を提供する。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子はＴＣＲα鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の配列番号８を含む。
もう一つの好適な例において、前記の核酸分子はＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の配列番号１６を含む。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子はＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列の配列番号４を含む。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子はＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列の配列番号６を含む。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子はヌクレオチド配列の配列番号２を含む。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子はＴＣＲα鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の配列番号８を含む。
もう一つの好適な例において、前記の核酸分子はＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の配列番号１６を含む。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子はＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列の配列番号４を含む。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子はＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列の配列番号６を含む。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子はヌクレオチド配列の配列番号２を含む。
【0010】
本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。好適に、前記のベクターはウイルスベクターである。より好適に、前記のベクターはレンチウイルスベクターである。
【0011】
本発明の第五の側面では、分離された宿主細胞であって、本発明の第四の側面に記載のベクターを含有するか、あるいはゲノムに外来の本発明の第三の側面に記載の核酸分子が組み込まれた宿主細胞を提供する。
【0012】
本発明の第六の側面では、本発明の第三の側面に記載の核酸分子または本発明の第四の側面に記載のベクターが形質移入された細胞を提供する。好適に、前記細胞はＴ細胞または幹細胞である。
【0013】
本発明の第七の側面では、薬学的に許容されるビヒクルと、本発明の第一の側面に記載のＴＣＲ、本発明の第二の側面に記載のＴＣＲ複合体、本発明の第三の側面に記載の核酸分子、本発明の第四の側面に記載のベクター、または本発明の第六の側面に記載の細胞とを含有する薬物組成物を提供する。
【0014】
本発明の第八の側面では、本発明の第一の側面に記載のＴ細胞受容体、または本発明の第二の側面に記載のＴＣＲ複合体、本発明の第三の側面に記載の核酸分子、本発明の第四の側面に記載のベクター、または本発明の第六の側面に記載の細胞の使用であって、サイトメガロウイルス関連疾患を治療する薬物の製造のための使用を提供する。
【0015】
本発明の第九の側面では、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に適量の本発明の第一の側面に記載のＴ細胞受容体、または本発明の第二の側面に記載のＴＣＲ複合体、本発明の第三の側面に記載の核酸分子、本発明の第四の側面に記載のベクター、または本発明の第六の側面に記載の細胞、または本発明の第七の側面に記載の薬物組成物を施用することを含む方法を提供する。
【0016】
好適に、前記の疾患はサイトメガロウイルス感染に関連する疾患（サイトメガロウイルス感染症）、たとえば、ＣＭＶ網膜炎、ＣＭＶ肺炎、ＣＭＶ胃腸炎やＣＭＶ脳炎などである。
【0017】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【0019】
具体的な実施形態
本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１限定でサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）ｐｐ６５抗原エピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶを標的とする特異的Ｔ細胞およびその使用を公開するが、当該Ｔ細胞が持つＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）は特異的にＣＭＶ－ｐｐ６５を標的とし、そして正確かつ迅速にＣＭＶウイルスを排除することができる。ＣＭＶ－ｐｐ６５に高親和力のＴＣＲ遺伝子がレンチウイルスを介してＴ細胞に感染すると、ＣＭＶ－ｐｐ６５特異的なＴＣＲ－Ｔ細胞を製造することができる。ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞は、直接正確な標的作用によって迅速にＣＭＶウイルスを排除すると同時に、間接的にＴＣＲ－Ｔ細胞が媒介する免疫再構築により、ウイルスを徹底的に排除し、そして再感染を防止し、長期間で保護作用を発揮することができる。そのため、本発明のｐｐ６５抗原エピトープ特異的なｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞は、特異的にＨＬＡ－Ａ＊０２０１限定でＣＭＶ ｐｐ６５抗原を発現する標的細胞に結合して殺傷することができ、ＣＭＶ関連疾患のＴＣＲ－Ｔ治療に新たな臨床プロトコールを提供し、ＨＳＣＴまたはほかの臓器移植後のＣＭＶ感染の治療および予防の分野に応用すると、臨床における価値および使用の将来性が非常にある。
本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１限定でサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）ｐｐ６５抗原エピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶを標的とする特異的Ｔ細胞およびその使用を公開するが、当該Ｔ細胞が持つＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）は特異的にＣＭＶ－ｐｐ６５を標的とし、そして正確かつ迅速にＣＭＶウイルスを排除することができる。ＣＭＶ－ｐｐ６５に高親和力のＴＣＲ遺伝子がレンチウイルスを介してＴ細胞に感染すると、ＣＭＶ－ｐｐ６５特異的なＴＣＲ－Ｔ細胞を製造することができる。ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞は、直接正確な標的作用によって迅速にＣＭＶウイルスを排除すると同時に、間接的にＴＣＲ－Ｔ細胞が媒介する免疫再構築により、ウイルスを徹底的に排除し、そして再感染を防止し、長期間で保護作用を発揮することができる。そのため、本発明のｐｐ６５抗原エピトープ特異的なｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞は、特異的にＨＬＡ－Ａ＊０２０１限定でＣＭＶ ｐｐ６５抗原を発現する標的細胞に結合して殺傷することができ、ＣＭＶ関連疾患のＴＣＲ－Ｔ治療に新たな臨床プロトコールを提供し、ＨＳＣＴまたはほかの臓器移植後のＣＭＶ感染の治療および予防の分野に応用すると、臨床における価値および使用の将来性が非常にある。
【0020】
用語
ＭＨＣ分子は免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質で、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子でもよい。そのため、抗原の提示に特異性があり、異なる個体が異なるＭＨＣを有し、タンパク質抗原のうちの異なる短鎖ペプチドをそれぞれのＡＰＣ細胞の表面に提示することができる。人類のＭＨＣは、通常、ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と呼ばれる。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に提示された特異的抗原ペプチドの唯一の受容体である。免疫系において、抗原特異的ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体の結合によってＴ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）が直接物理的に接触し、さらにＴ細胞およびＡＰＣの両者のほかの細胞膜の表面の分子が互いに作用し、これによって一連の後続の細胞シグナル伝達やほかの生理反応が生じることで、異なる抗原に特異的なＴ細胞はその標的細胞に対して免疫反応を果たす。
ＴＣＲは、α鎖／β鎖またはγ鎖／δ鎖のヘテロ二量体の形態で細胞膜の表面に存在する糖タンパク質である。９５％のＴ細胞において、ＴＣＲヘテロ二量体はα鎖とβ鎖からなるが、５％のＴ細胞はγ鎖とδ鎖からなるＴＣＲを有する。天然のαβヘテロ二量体ＴＣＲはα鎖およびβ鎖を有し、α鎖およびβ鎖はαβヘテロ二量体ＴＣＲのサブユニットを構成する。広義的に、αおよびβ鎖はそれぞれ可変領域、連結領域および定常領域を含み、β鎖は、通常、さらに可変領域と連結領域の間に短い多変領域を含むが、この多変領域は通常連結領域の一部と見なされる。各可変領域は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）に嵌っているＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含む。ＣＤＲ領域によってＴＣＲとｐＭＨＣ複合体の結合が決まり、中では、ＣＤＲ３は可変領域および連結領域から組み換えてなるため、超可変領域と呼ばれる。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、一般的に、それぞれ二つの「ドメイン」、すなわち、可変ドメインと定常ドメインを有するとされ、可変ドメインは連結する可変領域と連結領域で構成される。ＴＣＲ定常ドメインの配列は国際免疫遺伝情報システム（ＩＭＧＴ）の公開データベースで見つかり、たとえば、ＴＣＲ分子α鎖の定常ドメインの配列は「ＴＲＡＣ＊０１」で、ＴＣＲ分子β鎖の定常ドメインの配列は「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」である。また、ＴＣＲのαおよびβ鎖は、さらに、膜貫通領域および細胞内領域を含む。
本発明において、用語「本発明のポリペプチド」、「本発明のＴＣＲ」、「本発明のＴ細胞受容体」は、入れ替えて使用することができる。
ＭＨＣ分子は免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質で、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子でもよい。そのため、抗原の提示に特異性があり、異なる個体が異なるＭＨＣを有し、タンパク質抗原のうちの異なる短鎖ペプチドをそれぞれのＡＰＣ細胞の表面に提示することができる。人類のＭＨＣは、通常、ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と呼ばれる。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に提示された特異的抗原ペプチドの唯一の受容体である。免疫系において、抗原特異的ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体の結合によってＴ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）が直接物理的に接触し、さらにＴ細胞およびＡＰＣの両者のほかの細胞膜の表面の分子が互いに作用し、これによって一連の後続の細胞シグナル伝達やほかの生理反応が生じることで、異なる抗原に特異的なＴ細胞はその標的細胞に対して免疫反応を果たす。
ＴＣＲは、α鎖／β鎖またはγ鎖／δ鎖のヘテロ二量体の形態で細胞膜の表面に存在する糖タンパク質である。９５％のＴ細胞において、ＴＣＲヘテロ二量体はα鎖とβ鎖からなるが、５％のＴ細胞はγ鎖とδ鎖からなるＴＣＲを有する。天然のαβヘテロ二量体ＴＣＲはα鎖およびβ鎖を有し、α鎖およびβ鎖はαβヘテロ二量体ＴＣＲのサブユニットを構成する。広義的に、αおよびβ鎖はそれぞれ可変領域、連結領域および定常領域を含み、β鎖は、通常、さらに可変領域と連結領域の間に短い多変領域を含むが、この多変領域は通常連結領域の一部と見なされる。各可変領域は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）に嵌っているＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３という３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含む。ＣＤＲ領域によってＴＣＲとｐＭＨＣ複合体の結合が決まり、中では、ＣＤＲ３は可変領域および連結領域から組み換えてなるため、超可変領域と呼ばれる。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、一般的に、それぞれ二つの「ドメイン」、すなわち、可変ドメインと定常ドメインを有するとされ、可変ドメインは連結する可変領域と連結領域で構成される。ＴＣＲ定常ドメインの配列は国際免疫遺伝情報システム（ＩＭＧＴ）の公開データベースで見つかり、たとえば、ＴＣＲ分子α鎖の定常ドメインの配列は「ＴＲＡＣ＊０１」で、ＴＣＲ分子β鎖の定常ドメインの配列は「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」である。また、ＴＣＲのαおよびβ鎖は、さらに、膜貫通領域および細胞内領域を含む。
本発明において、用語「本発明のポリペプチド」、「本発明のＴＣＲ」、「本発明のＴ細胞受容体」は、入れ替えて使用することができる。
【0021】
天然の鎖間ジスルフィド結合と人工的鎖間ジスルフィド結合
天然ＴＣＲの膜近位領域のＣα鎖とＣβ鎖の間に１組のジスルフィド結合が存在し、本発明で「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、人工的に導入される、位置が天然の鎖間ジスルフィド結合の位置と異なる鎖間共役ジスルフィド結合を「人工的鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。
天然ＴＣＲの膜近位領域のＣα鎖とＣβ鎖の間に１組のジスルフィド結合が存在し、本発明で「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。本発明において、人工的に導入される、位置が天然の鎖間ジスルフィド結合の位置と異なる鎖間共役ジスルフィド結合を「人工的鎖間ジスルフィド結合」と呼ぶ。
【0022】
発明の詳述
ＴＣＲ分子
抗原加工の過程において、抗原は細胞内で分解され、さらにＭＨＣ分子を介して細胞の表面に運ばれる。Ｔ細胞受容体は抗原提示細胞の表面のペプチド－ＭＨＣ複合体を認識することができる。そのため、本発明の第一の側面では、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１複合体に結合できるＴＣＲ分子を提供する。好適に、前記ＴＣＲ分子は分離されたものまたは精製されたものである。当該ＴＣＲのαおよびβ鎖は、それぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ＴＣＲのα鎖は以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む：
α－ＣＤＲ１：ＳＳＮＦＹＡ（配列番号９）、
α－ＣＤＲ２：ＭＴＬＮＧＤＥ（配列番号１１）、
α－ＣＤＲ３：ＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ（配列番号１３）。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ＴＣＲのβ鎖は以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む：
β－ＣＤＲ １：ＭＮＨＥＹ（配列番号１７）、
β－ＣＤＲ ２：ＳＭＮＶＥＶ（配列番号１９）、
β－ＣＤＲ ３：ＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ（配列番号２１）。
上記本発明のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は任意の適切なフレームワーク領域に嵌めてキメラＴＣＲを製造することができる。フレームワーク領域が本発明のＴＣＲのＣＤＲ領域と適合であれば、当業者は本発明で公開されるＣＤＲ領域で相応する機能を有するＴＣＲ分子を設計または合成することができる。そのため、本発明のＴＣＲ分子とは、上記αおよび／またはβ鎖のＣＤＲ領域の配列ならびに任意の適切なフレームワーク領域を含むＴＣＲ分子である。
本発明のＴＣＲα鎖可変ドメインは配列番号７と少なくとも９０％、好適に９５％、より好適に９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列で、ならびに／あるいは本発明のＴＣＲβ鎖可変ドメインは配列番号１５と少なくとも９０％、好適に９５％、より好適に９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
本発明の一つの好適な例において、本発明のＴＣＲ分子はαとβ鎖から構成されるヘテロ二量体である。具体的に、一方では、前記ヘテロ二量体ＴＣＲ分子のα鎖は可変ドメインおよび定常ドメインを含み、前記α鎖可変ドメインのアミノ酸配列は上記α鎖のＣＤＲ１（配列番号９）、ＣＤＲ２（配列番号１１）およびＣＤＲ３（配列番号１３）を含む。好適に、前記ＴＣＲ分子はα鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号７を含む。より好適に、前記ＴＣＲ分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号７である。もう一方では、前記ヘテロ二量体ＴＣＲ分子のβ鎖は可変ドメインおよび定常ドメインを含み、前記β鎖可変ドメインのアミノ酸配列は上記β鎖のＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１９）およびＣＤＲ３（配列番号２１）を含む。好適に、前記ＴＣＲ分子はβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号１５を含む。より好適に、前記ＴＣＲ分子のβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号１５である。
本発明の一つの好適な例において、本発明のＴＣＲ分子はαの一部または全部ならびに／あるいはβ鎖の一部または全部で構成される一本鎖ＴＣＲ分子である。一本鎖ＴＣＲ分子の記述は文献Ｃｈｕｎｇら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， １２６５４－１２６５８を参照する。文献における記載によれば、当業者は容易に本発明のＣＤＲ領域を含む一本鎖ＴＣＲ分子を構築することができる。具体的に、前記一本鎖ＴＣＲ分子はＶα、ＶβおよびＣβを含み、好適に、Ｎ末端からＣ末端の順で連結している。
前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は上記α鎖のＣＤＲ１（配列番号９）、ＣＤＲ２（配列番号１１）およびＣＤＲ３（配列番号１３）を含む。好適に、前記一本鎖ＴＣＲ分子はα鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号７を含む。より好適に、前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号７である。前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は上記β鎖のＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１９）およびＣＤＲ３（配列番号２１）を含む。好適に、前記一本鎖ＴＣＲ分子はβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号１５を含む。より好適に、前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号１５である。
本発明の一つの好適な例において、本発明のＴＣＲ分子の定常ドメインはヒトまたはネズミの定常ドメインである。当業者はヒトの定常ドメインのアミノ酸配列を知っているか、関連書籍またはＩＭＧＴ（国際免疫遺伝情報システム）の公開データベースを閲覧・検索することによって得ることができる。たとえば、本発明のＴＣＲ分子α鎖の定常ドメインの配列は「ＴＲＡＣ＊０１」でもよく、ＴＣＲ分子β鎖の定常ドメインの配列は「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」でもよい。好適に、本発明のＴＣＲ分子α鎖のアミノ酸配列は配列番号３で、ならびに／あるいはβ鎖のアミノ酸配列は配列番号５である。
本発明のＴＣＲはそのαとβ鎖定常ドメインの残基の間に導入された人工的ジスルフィド結合を含んでもよい。なお、定常ドメインの間に上記の導入された人工的ジスルフィド結合が含まれていても含まれていなくても、本発明のＴＣＲはいずれもＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含有してもよい。ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列はＴＣＲに存在する天然のジスルフィド結合を介して連結していてもよい。
本発明のＴＣＲ定常領域を改造することにより、内因性ＴＣＲ鎖とのミスマッチを阻止することができる。そのために、本発明のＴＣＲにおいて、そのαとβ鎖定常ドメインの残基の間に人工的ジスルフィド結合を導入した。
また、本発明のＴＣＲは１種類よりも多い種の配列から誘導されるキメラＴＣＲを含んでもよい。たとえば、ネズミ科ＴＣＲがヒトＴ細胞においてヒトＴＣＲよりも有効に発現することができることを示した研究がある。そのため、本発明のＴＣＲはヒトの可変ドメインおよびネズミの定常ドメインを含んでもよい。この方法の欠点は免疫応答を引き起こす可能性があることである。そのため、養子Ｔ細胞治療に使用する場合、ネズミ科のＴ細胞の移植が許容されるように、免疫抑制のための調節プランが必要である。
なお、本明細書において、アミノ酸の名称は、世界中に汎用の一文字のアルファベットまたは三文字のアルファベットの表示を使用し、アミノ酸の名称の一文字のアルファベットと三文字のアルファベットの相応関係は以下の通りである：Ａｌａ （Ａ）、Ａｒｇ （Ｒ）、Ａｓｎ （Ｎ）、Ａｓｐ （Ｄ）、Ｃｙｓ （Ｃ）、Ｇｌｎ （Ｑ）、Ｇｌｕ （Ｅ）、Ｇｌｙ （Ｇ）、Ｈｉｓ （Ｈ）、Ｉｌｅ （Ｉ）、Ｌｅｕ （Ｌ）、Ｌｙｓ （Ｋ）、Ｍｅｔ （Ｍ）、Ｐｈｅ （Ｆ）、Ｐｒｏ （Ｐ）、Ｓｅｒ （Ｓ）、Ｔｈｒ （Ｔ）、Ｔｒｐ （Ｗ）、Ｔｙｒ （Ｙ）、Ｖａｌ （Ｖ）。
ＴＣＲ分子
抗原加工の過程において、抗原は細胞内で分解され、さらにＭＨＣ分子を介して細胞の表面に運ばれる。Ｔ細胞受容体は抗原提示細胞の表面のペプチド－ＭＨＣ複合体を認識することができる。そのため、本発明の第一の側面では、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１複合体に結合できるＴＣＲ分子を提供する。好適に、前記ＴＣＲ分子は分離されたものまたは精製されたものである。当該ＴＣＲのαおよびβ鎖は、それぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ＴＣＲのα鎖は以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む：
α－ＣＤＲ１：ＳＳＮＦＹＡ（配列番号９）、
α－ＣＤＲ２：ＭＴＬＮＧＤＥ（配列番号１１）、
α－ＣＤＲ３：ＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ（配列番号１３）。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ＴＣＲのβ鎖は以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む：
β－ＣＤＲ １：ＭＮＨＥＹ（配列番号１７）、
β－ＣＤＲ ２：ＳＭＮＶＥＶ（配列番号１９）、
β－ＣＤＲ ３：ＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ（配列番号２１）。
上記本発明のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は任意の適切なフレームワーク領域に嵌めてキメラＴＣＲを製造することができる。フレームワーク領域が本発明のＴＣＲのＣＤＲ領域と適合であれば、当業者は本発明で公開されるＣＤＲ領域で相応する機能を有するＴＣＲ分子を設計または合成することができる。そのため、本発明のＴＣＲ分子とは、上記αおよび／またはβ鎖のＣＤＲ領域の配列ならびに任意の適切なフレームワーク領域を含むＴＣＲ分子である。
本発明のＴＣＲα鎖可変ドメインは配列番号７と少なくとも９０％、好適に９５％、より好適に９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列で、ならびに／あるいは本発明のＴＣＲβ鎖可変ドメインは配列番号１５と少なくとも９０％、好適に９５％、より好適に９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
本発明の一つの好適な例において、本発明のＴＣＲ分子はαとβ鎖から構成されるヘテロ二量体である。具体的に、一方では、前記ヘテロ二量体ＴＣＲ分子のα鎖は可変ドメインおよび定常ドメインを含み、前記α鎖可変ドメインのアミノ酸配列は上記α鎖のＣＤＲ１（配列番号９）、ＣＤＲ２（配列番号１１）およびＣＤＲ３（配列番号１３）を含む。好適に、前記ＴＣＲ分子はα鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号７を含む。より好適に、前記ＴＣＲ分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号７である。もう一方では、前記ヘテロ二量体ＴＣＲ分子のβ鎖は可変ドメインおよび定常ドメインを含み、前記β鎖可変ドメインのアミノ酸配列は上記β鎖のＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１９）およびＣＤＲ３（配列番号２１）を含む。好適に、前記ＴＣＲ分子はβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号１５を含む。より好適に、前記ＴＣＲ分子のβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号１５である。
本発明の一つの好適な例において、本発明のＴＣＲ分子はαの一部または全部ならびに／あるいはβ鎖の一部または全部で構成される一本鎖ＴＣＲ分子である。一本鎖ＴＣＲ分子の記述は文献Ｃｈｕｎｇら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， １２６５４－１２６５８を参照する。文献における記載によれば、当業者は容易に本発明のＣＤＲ領域を含む一本鎖ＴＣＲ分子を構築することができる。具体的に、前記一本鎖ＴＣＲ分子はＶα、ＶβおよびＣβを含み、好適に、Ｎ末端からＣ末端の順で連結している。
前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は上記α鎖のＣＤＲ１（配列番号９）、ＣＤＲ２（配列番号１１）およびＣＤＲ３（配列番号１３）を含む。好適に、前記一本鎖ＴＣＲ分子はα鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号７を含む。より好適に、前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号７である。前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は上記β鎖のＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１９）およびＣＤＲ３（配列番号２１）を含む。好適に、前記一本鎖ＴＣＲ分子はβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列の配列番号１５を含む。より好適に、前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号１５である。
本発明の一つの好適な例において、本発明のＴＣＲ分子の定常ドメインはヒトまたはネズミの定常ドメインである。当業者はヒトの定常ドメインのアミノ酸配列を知っているか、関連書籍またはＩＭＧＴ（国際免疫遺伝情報システム）の公開データベースを閲覧・検索することによって得ることができる。たとえば、本発明のＴＣＲ分子α鎖の定常ドメインの配列は「ＴＲＡＣ＊０１」でもよく、ＴＣＲ分子β鎖の定常ドメインの配列は「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」でもよい。好適に、本発明のＴＣＲ分子α鎖のアミノ酸配列は配列番号３で、ならびに／あるいはβ鎖のアミノ酸配列は配列番号５である。
本発明のＴＣＲはそのαとβ鎖定常ドメインの残基の間に導入された人工的ジスルフィド結合を含んでもよい。なお、定常ドメインの間に上記の導入された人工的ジスルフィド結合が含まれていても含まれていなくても、本発明のＴＣＲはいずれもＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含有してもよい。ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列はＴＣＲに存在する天然のジスルフィド結合を介して連結していてもよい。
本発明のＴＣＲ定常領域を改造することにより、内因性ＴＣＲ鎖とのミスマッチを阻止することができる。そのために、本発明のＴＣＲにおいて、そのαとβ鎖定常ドメインの残基の間に人工的ジスルフィド結合を導入した。
また、本発明のＴＣＲは１種類よりも多い種の配列から誘導されるキメラＴＣＲを含んでもよい。たとえば、ネズミ科ＴＣＲがヒトＴ細胞においてヒトＴＣＲよりも有効に発現することができることを示した研究がある。そのため、本発明のＴＣＲはヒトの可変ドメインおよびネズミの定常ドメインを含んでもよい。この方法の欠点は免疫応答を引き起こす可能性があることである。そのため、養子Ｔ細胞治療に使用する場合、ネズミ科のＴ細胞の移植が許容されるように、免疫抑制のための調節プランが必要である。
なお、本明細書において、アミノ酸の名称は、世界中に汎用の一文字のアルファベットまたは三文字のアルファベットの表示を使用し、アミノ酸の名称の一文字のアルファベットと三文字のアルファベットの相応関係は以下の通りである：Ａｌａ （Ａ）、Ａｒｇ （Ｒ）、Ａｓｎ （Ｎ）、Ａｓｐ （Ｄ）、Ｃｙｓ （Ｃ）、Ｇｌｎ （Ｑ）、Ｇｌｕ （Ｅ）、Ｇｌｙ （Ｇ）、Ｈｉｓ （Ｈ）、Ｉｌｅ （Ｉ）、Ｌｅｕ （Ｌ）、Ｌｙｓ （Ｋ）、Ｍｅｔ （Ｍ）、Ｐｈｅ （Ｆ）、Ｐｒｏ （Ｐ）、Ｓｅｒ （Ｓ）、Ｔｈｒ （Ｔ）、Ｔｒｐ （Ｗ）、Ｔｙｒ （Ｙ）、Ｖａｌ （Ｖ）。
【0023】
核酸分子
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面のＴＣＲ分子またはその一部をコードする核酸分子を提供するが、前記一部は一つまたは複数のＣＤＲ、αおよび／またはβ鎖の可変ドメイン、ならびにα鎖および／またはβ鎖でもよい。
本発明の第一の側面のＴＣＲ分子のα鎖のＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は以下の通りである。
α ＣＤＲ１－ ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣ（配列番号１０）
α ＣＤＲ２－ ＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡ（配列番号１２）
α ＣＤＲ３－ ＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣ（配列番号１４）
本発明の第一の側面のＴＣＲ分子のβ鎖のＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は以下の通りである。
β ＣＤＲ１－ ＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣ（配列番号１８）
β ＣＤＲ２－ ＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧ（配列番号２０）
β ＣＤＲ３－ ＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号２２）
そのため、本発明のＴＣＲのα鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４を含み、ならびに／あるいは本発明のＴＣＲのβ鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２を含む。
本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は一本鎖または二本鎖のものでもよく、当該核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡでもよく、そしてイントロンを含んでも含まなくてもよい。好適に、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列はイントロンを含まないが、本発明のポリペプチドをコードすることができ、たとえば、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号８を含み、ならびに／あるいは本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１６を含む。より好適に、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号４および／または配列番号６を含む。あるいは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号２である。
なお、遺伝子コドンの縮重により、異なるヌクレオチド配列は同様のポリペプチドをコードしてもよい。そのため、本発明のＴＣＲをコードする核酸配列は本発明の図面で示される核酸配列と同様のものでもよく、縮重変異体でもよい。本発明における一例で説明すると、「縮重変異体」とは配列番号１のタンパク質配列をコードするが、配列番号２の配列と異なる核酸配列である。
ヌクレオチド配列はコドン最適化されたものでもよい。異なる細胞は具体的なコドンの利用において異なるが、細胞の種類により、配列におけるコドンを変更することによって発現量を増加させることができる。哺乳動物細胞および数種類のほかの生物のコドン選択表は当業者に公知のものである。
本発明の核酸分子の全長配列あるいはその断片は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られるが、これらに限定されない。現在、本発明のＴＣＲ（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は完全に化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面のＴＣＲ分子またはその一部をコードする核酸分子を提供するが、前記一部は一つまたは複数のＣＤＲ、αおよび／またはβ鎖の可変ドメイン、ならびにα鎖および／またはβ鎖でもよい。
本発明の第一の側面のＴＣＲ分子のα鎖のＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は以下の通りである。
α ＣＤＲ１－ ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣ（配列番号１０）
α ＣＤＲ２－ ＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡ（配列番号１２）
α ＣＤＲ３－ ＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣ（配列番号１４）
本発明の第一の側面のＴＣＲ分子のβ鎖のＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は以下の通りである。
β ＣＤＲ１－ ＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣ（配列番号１８）
β ＣＤＲ２－ ＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧ（配列番号２０）
β ＣＤＲ３－ ＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号２２）
そのため、本発明のＴＣＲのα鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４を含み、ならびに／あるいは本発明のＴＣＲのβ鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２を含む。
本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は一本鎖または二本鎖のものでもよく、当該核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡでもよく、そしてイントロンを含んでも含まなくてもよい。好適に、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列はイントロンを含まないが、本発明のポリペプチドをコードすることができ、たとえば、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号８を含み、ならびに／あるいは本発明のＴＣＲのβ鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１６を含む。より好適に、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号４および／または配列番号６を含む。あるいは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号２である。
なお、遺伝子コドンの縮重により、異なるヌクレオチド配列は同様のポリペプチドをコードしてもよい。そのため、本発明のＴＣＲをコードする核酸配列は本発明の図面で示される核酸配列と同様のものでもよく、縮重変異体でもよい。本発明における一例で説明すると、「縮重変異体」とは配列番号１のタンパク質配列をコードするが、配列番号２の配列と異なる核酸配列である。
ヌクレオチド配列はコドン最適化されたものでもよい。異なる細胞は具体的なコドンの利用において異なるが、細胞の種類により、配列におけるコドンを変更することによって発現量を増加させることができる。哺乳動物細胞および数種類のほかの生物のコドン選択表は当業者に公知のものである。
本発明の核酸分子の全長配列あるいはその断片は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られるが、これらに限定されない。現在、本発明のＴＣＲ（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は完全に化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。ＤＮＡは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。
【0024】
ベクター
また、本発明は本発明の核酸分子を含むベクターに関し、発現ベクター、すなわち、体内または体外において発現できる構築体を含む。常用のベクターは細菌プラスミド、ファージおよび動植物ウイルスを含む。
ウイルス送達システムは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
好適に、ベクターは本発明のヌクレオチドを細胞、たとえば、Ｔ細胞に移動させることで、当該細胞に抗原特異的ＴＣＲを発現させることができる。理想的な場合、当該ベクターはＴ細胞において高レベルで発現を続けることができる。
また、本発明は本発明の核酸分子を含むベクターに関し、発現ベクター、すなわち、体内または体外において発現できる構築体を含む。常用のベクターは細菌プラスミド、ファージおよび動植物ウイルスを含む。
ウイルス送達システムは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
好適に、ベクターは本発明のヌクレオチドを細胞、たとえば、Ｔ細胞に移動させることで、当該細胞に抗原特異的ＴＣＲを発現させることができる。理想的な場合、当該ベクターはＴ細胞において高レベルで発現を続けることができる。
【0025】
細胞
また、本発明は本発明のベクターまはたコード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、本発明のベクターを含有するか、あるいは染色体に本発明のの核酸分子が組み込まれている。宿主細胞は、原核細胞および真核細胞、たとえば、大腸菌、酵母細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞などから選ばれる。
また、本発明は、本発明のＴＣＲを発現する分離された細胞、特にＴ細胞を含む。当該Ｔ細胞は被験者から分離されたＴ細胞から誘導されたものでもよく、あるいは被験者から分離された混合細胞群、たとえば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）群の一部でもよい。たとえば、当該細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から分離されたものでもよく、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞でもよい。当該細胞はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞／ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の混合群に存在してもよい。
あるいは、本発明の細胞は、幹細胞、たとえば、造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導されたものでもよい。幹細胞の表面にＣＤ３分子が発現されないため、遺伝子をＨＳＣに移動させても細胞の表面にＴＣＲが発現されることがない。しかし、幹細胞の分化が胸腺のリンパ球前駆体（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）に移行した場合、ＣＤ３分子の発現は胸腺細胞の表面における当該導入されたＴＣＲ分子の発現を開始させる。
多くの方法は本発明のＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのＴ細胞への形質移入に適する（たとえば、Ｒｏｂｂｉｎｓら、（２００８）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６－６１３１）。本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は養子免疫治療に使用することができる。当業者は養子治療を行う多くの適切な方法を知っている（たとえば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ８（４）：２９９－３０８）。
また、本発明は本発明のベクターまはたコード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、本発明のベクターを含有するか、あるいは染色体に本発明のの核酸分子が組み込まれている。宿主細胞は、原核細胞および真核細胞、たとえば、大腸菌、酵母細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞などから選ばれる。
また、本発明は、本発明のＴＣＲを発現する分離された細胞、特にＴ細胞を含む。当該Ｔ細胞は被験者から分離されたＴ細胞から誘導されたものでもよく、あるいは被験者から分離された混合細胞群、たとえば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）群の一部でもよい。たとえば、当該細胞は末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から分離されたものでもよく、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞でもよい。当該細胞はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞／ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の混合群に存在してもよい。
あるいは、本発明の細胞は、幹細胞、たとえば、造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導されたものでもよい。幹細胞の表面にＣＤ３分子が発現されないため、遺伝子をＨＳＣに移動させても細胞の表面にＴＣＲが発現されることがない。しかし、幹細胞の分化が胸腺のリンパ球前駆体（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）に移行した場合、ＣＤ３分子の発現は胸腺細胞の表面における当該導入されたＴＣＲ分子の発現を開始させる。
多くの方法は本発明のＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのＴ細胞への形質移入に適する（たとえば、Ｒｏｂｂｉｎｓら、（２００８）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６－６１３１）。本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は養子免疫治療に使用することができる。当業者は養子治療を行う多くの適切な方法を知っている（たとえば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ８（４）：２９９－３０８）。
【0026】
サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）関連疾患
また、本発明は被験者においてＣＭＶ関連疾患を治療および／または予防する方法であって、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞を当該被験者へ養子移入する工程を含む方法に関する。当該ＣＭＶ特異的Ｔ細胞は主にＣＭＶマトリックスリン酸化タンパク質ｐｐ６５を認識することができる。当該ＣＭＶ特異的Ｔ細胞はエピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶを認識することができる。
ＣＭＶは幅広く存在するヒトヘルペスウイルスで、約５０％の正常な個体に感染している。多くの症例において、免疫反応はＣＭＶ由来の抗原を認識することによって急性感染を抑えることができる。その後、当該ウイルスは潜伏状態で宿主の一生を通してずっと存在する。外への増殖は、ウイルス膜タンパク質に対する中和抗体、ＨＬＡ限定のＣＭＶ特異的ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞ならびにＭＨＣ限定のエフェクター因子を含む、免疫系のエフェクター因子機序によって阻止される。
ＣＭＶ感染は一部のハイリスクな層には一大事である。感染リスクの主な範囲は、胎児または新生児、および免疫無防備状態の個体、たとえば、臓器移植のレシピエント、白血病患者またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染者を含む。
一般的に、三つの臨床様態のＣＭＶ感染が存在し、以下のものを含む：
（１）新生児ＣＭＶ封入体症で、無症状から、肝臓、脾臓および中枢神経系に影響し、障害が残る重症までの可能性があるもの；
（２）急性獲得性ＣＭＶ感染で、伝染性単核症に類似し、発熱、不調、骨格筋痛などの症状が現れるもの；
（３）免疫無防備状態の人（たとえば、臓器移植した人ｍたはＨＩＶに罹患した人）のＣＭＶ感染で、ＣＭＶ網膜炎、ＣＭＶ肺炎、ＣＭＶ胃腸炎およびＣＭＶ脳炎のリスクがあるもの。
本発明のＴＣＲは同種異系造血幹細胞後の潜伏ＣＭＶの再活性化の治療および／または予防に使用することができる。
Ａｌｌｏ－ＨＳＣＴレシピエントのＣＭＶ疾患は主に潜伏ウイルスにの再活性化によるものとされている。ウイルスの拡散はドナーの骨髄輸注または同種異系血液製品によることがある。免疫無防備状態の骨髄移植レシピエントにおいて、ウイルスの再活性化は、通常、進行性のＣＭＶ感染につながり、このような患者における感染性発症率および死亡率の要因になっている。進行性ＣＭＶ感染はこれらの患者の移植後の免疫抑制および遅い免疫回復の両者の結果である。
本発明の方法において、たとえば、本発明のＣＭＶ－特異的Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞でＡｌｌｏ－ＨＳＣＴレシピエントに対して養子免疫治療を行う。
また、本発明は被験者においてＣＭＶ関連疾患を治療および／または予防する方法であって、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞を当該被験者へ養子移入する工程を含む方法に関する。当該ＣＭＶ特異的Ｔ細胞は主にＣＭＶマトリックスリン酸化タンパク質ｐｐ６５を認識することができる。当該ＣＭＶ特異的Ｔ細胞はエピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶを認識することができる。
ＣＭＶは幅広く存在するヒトヘルペスウイルスで、約５０％の正常な個体に感染している。多くの症例において、免疫反応はＣＭＶ由来の抗原を認識することによって急性感染を抑えることができる。その後、当該ウイルスは潜伏状態で宿主の一生を通してずっと存在する。外への増殖は、ウイルス膜タンパク質に対する中和抗体、ＨＬＡ限定のＣＭＶ特異的ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞ならびにＭＨＣ限定のエフェクター因子を含む、免疫系のエフェクター因子機序によって阻止される。
ＣＭＶ感染は一部のハイリスクな層には一大事である。感染リスクの主な範囲は、胎児または新生児、および免疫無防備状態の個体、たとえば、臓器移植のレシピエント、白血病患者またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染者を含む。
一般的に、三つの臨床様態のＣＭＶ感染が存在し、以下のものを含む：
（１）新生児ＣＭＶ封入体症で、無症状から、肝臓、脾臓および中枢神経系に影響し、障害が残る重症までの可能性があるもの；
（２）急性獲得性ＣＭＶ感染で、伝染性単核症に類似し、発熱、不調、骨格筋痛などの症状が現れるもの；
（３）免疫無防備状態の人（たとえば、臓器移植した人ｍたはＨＩＶに罹患した人）のＣＭＶ感染で、ＣＭＶ網膜炎、ＣＭＶ肺炎、ＣＭＶ胃腸炎およびＣＭＶ脳炎のリスクがあるもの。
本発明のＴＣＲは同種異系造血幹細胞後の潜伏ＣＭＶの再活性化の治療および／または予防に使用することができる。
Ａｌｌｏ－ＨＳＣＴレシピエントのＣＭＶ疾患は主に潜伏ウイルスにの再活性化によるものとされている。ウイルスの拡散はドナーの骨髄輸注または同種異系血液製品によることがある。免疫無防備状態の骨髄移植レシピエントにおいて、ウイルスの再活性化は、通常、進行性のＣＭＶ感染につながり、このような患者における感染性発症率および死亡率の要因になっている。進行性ＣＭＶ感染はこれらの患者の移植後の免疫抑制および遅い免疫回復の両者の結果である。
本発明の方法において、たとえば、本発明のＣＭＶ－特異的Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞でＡｌｌｏ－ＨＳＣＴレシピエントに対して養子免疫治療を行う。
【0027】
予防および治療方法
用語「予防」とは疾患の進展を回避、遅延、抵抗または阻害することである。たとえば、ＣＭＶ感染および／またはＣＭＶ再活性化の可能性を予防または降下することができる。
本明細書において用いられる「治療」とは疾患の症状を緩和、治癒または減少するか、疾患の進展を減少または阻止することである。
関連疾患に罹患した患者または志願者のＴ細胞を分離し、そして本発明のＴＣＲを上記Ｔ細胞に導入し、さらにこれらの遺伝子工学によって修飾された細胞を患者の体内に回送することによって予防または治療するすることができる。
そのため、本発明は、ＣＭＶ関連疾患を治療する方法であって、分離された本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞、好適に患者自身由来のＴ細胞を、患者の体内に回送することを含む方法を提供する。一般的に、以下のことを含む：
（１）患者のＴ細胞を分離する；
（２）本発明の核酸分子または本発明のＴＣＲ分子をコードできる核酸分子を体外においてＴ細胞に形質導入する；
（３）遺伝子工学によって修飾されたＴ細胞を患者の体内に回送する。
分離、形質移入および回送する数は医師によって決定されてもよい。
用語「予防」とは疾患の進展を回避、遅延、抵抗または阻害することである。たとえば、ＣＭＶ感染および／またはＣＭＶ再活性化の可能性を予防または降下することができる。
本明細書において用いられる「治療」とは疾患の症状を緩和、治癒または減少するか、疾患の進展を減少または阻止することである。
関連疾患に罹患した患者または志願者のＴ細胞を分離し、そして本発明のＴＣＲを上記Ｔ細胞に導入し、さらにこれらの遺伝子工学によって修飾された細胞を患者の体内に回送することによって予防または治療するすることができる。
そのため、本発明は、ＣＭＶ関連疾患を治療する方法であって、分離された本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞、好適に患者自身由来のＴ細胞を、患者の体内に回送することを含む方法を提供する。一般的に、以下のことを含む：
（１）患者のＴ細胞を分離する；
（２）本発明の核酸分子または本発明のＴＣＲ分子をコードできる核酸分子を体外においてＴ細胞に形質導入する；
（３）遺伝子工学によって修飾されたＴ細胞を患者の体内に回送する。
分離、形質移入および回送する数は医師によって決定されてもよい。
【0028】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（１）本発明のＴＣＲは直接正確な標的作用によって迅速にＣＭＶウイルスを排除することができる。
（２）本発明のＴＣＲは体内におけるタンパク質の発現量が高く、かつ内因性ＴＣＲ鎖とミスマッチしない。
（３）本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は、殺傷能力が強く、特異性が高いなどで、有効に造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者またはほかの移植患者のＣＭＶ感染の治療に使用することができる。
以下の具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第三版）（２００１） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。以下、実施例で使用された実験材料および試薬は、特に説明しない限り、いずれも市販品として得られる。
（１）本発明のＴＣＲは直接正確な標的作用によって迅速にＣＭＶウイルスを排除することができる。
（２）本発明のＴＣＲは体内におけるタンパク質の発現量が高く、かつ内因性ＴＣＲ鎖とミスマッチしない。
（３）本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は、殺傷能力が強く、特異性が高いなどで、有効に造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者またはほかの移植患者のＣＭＶ感染の治療に使用することができる。
以下の具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第三版）（２００１） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。以下、実施例で使用された実験材料および試薬は、特に説明しない限り、いずれも市販品として得られる。
【0029】
実施例１ 体外における単核球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）から樹状細胞（ＤＣ細胞）への分化の誘導
（１）リンパ球分離液（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）で密度勾配遠心法によって健康なドナー／患者の血液におけるＰＢＭＣ（または再生された凍結保存ＰＢＭＣ）を獲得し、細胞傷害性Ｔ細胞培地（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）で再懸濁させた後、３５０ ｇで５ ｍｉｎ遠心して上清を除去し、適量のＤＣ細胞培地を入れて６ウェルプレートにおいてＰＢＭＣを再懸濁させ、インキュベーターにおいて２ ｈ培養した後、培地および固まった非付着細胞を吸い取って捨てた。
（２）各ウェルに側壁に沿って軽く３ ｍｌの最終濃度が１×のＤＣ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４）を含有するＤＣ細胞培地（ＤＣ ｍｅｄｉｕｍ）を入れ、６ウェルプレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて５ ｄ培養した。
（３）５日目に、培地を交換しないまま、各ウェルに３０ μｌの１００×ＤＣ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを培地（ＤＣ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの最終濃度が１×である）に入れた。６ウェルプレートを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターにおいて成熟まで２ ｄ誘導した。
（４）７日目に、成熟ＤＣ細胞（Ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）を収穫でき、ピペットで強く吹いて混ぜ、そしてウェルプレートの底部細胞を再懸濁されることによって成熟ＤＣ細胞を収集し、収集された成熟ＤＣ細胞を１５ ｍＬ遠心管に移し、３５０ ｇで５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去し、密度が２×１０６ 細胞／ｍｌになるようにＤＣ細胞培地（ＤＣ ｍｅｄｉｕｍ）でＤＣを再懸濁させて後続の実験に供した。
（１）リンパ球分離液（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）で密度勾配遠心法によって健康なドナー／患者の血液におけるＰＢＭＣ（または再生された凍結保存ＰＢＭＣ）を獲得し、細胞傷害性Ｔ細胞培地（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）で再懸濁させた後、３５０ ｇで５ ｍｉｎ遠心して上清を除去し、適量のＤＣ細胞培地を入れて６ウェルプレートにおいてＰＢＭＣを再懸濁させ、インキュベーターにおいて２ ｈ培養した後、培地および固まった非付着細胞を吸い取って捨てた。
（２）各ウェルに側壁に沿って軽く３ ｍｌの最終濃度が１×のＤＣ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４）を含有するＤＣ細胞培地（ＤＣ ｍｅｄｉｕｍ）を入れ、６ウェルプレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて５ ｄ培養した。
（３）５日目に、培地を交換しないまま、各ウェルに３０ μｌの１００×ＤＣ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを培地（ＤＣ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの最終濃度が１×である）に入れた。６ウェルプレートを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターにおいて成熟まで２ ｄ誘導した。
（４）７日目に、成熟ＤＣ細胞（Ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）を収穫でき、ピペットで強く吹いて混ぜ、そしてウェルプレートの底部細胞を再懸濁されることによって成熟ＤＣ細胞を収集し、収集された成熟ＤＣ細胞を１５ ｍＬ遠心管に移し、３５０ ｇで５ ｍｉｎ遠心した後、上清を除去し、密度が２×１０６ 細胞／ｍｌになるようにＤＣ細胞培地（ＤＣ ｍｅｄｉｕｍ）でＤＣを再懸濁させて後続の実験に供した。
【0030】
実施例２ ヒトＣＭＶ－ｐｐ６５抗原特異的Ｔ細胞の体外における刺激および増幅
（１）上記成熟ＤＣ細胞（Ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）に５ μｇ／ｍｌのＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチドを入れた。封止膜（Ｐａｒａｆｉｌｍ）で密封した後、ローテーター（ＭＡＣＳｍｉｘ）に入れ、インキュベーターにおいて４ ｈ回転結合させた。ｍＤＣとＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド（ＣＭＶ－ｐｅｐｔｉｄｅ）のインキュベートが終了した後、照射装置によって４０ Ｇｙの照射量でＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド搭載ＤＣ細胞（ＣＭＶ－ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｏａｄｅｄ ＤＣ）を照射した。照射終了後、遠心でＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド搭載ＤＣ細胞を１５ ｍｌ遠心管に収集した。
（２）リンパ球分離液（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）で密度勾配遠心法によって健康なドナーの血液におけるＰＢＭＣを獲得し、キット（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）でＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離し、ＤＣ／Ｔが１：２．５の比率で、ＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド搭載ＤＣ細胞（ＣＭＶ－ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｏａｄｅｄ ＤＣ）とＣＤ８＋ Ｔ細胞を１２ウェルプレートに入れて培養し、培養系に最終濃度が３０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１、および５ μｇ／ｍｌのＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド（ＣＭＶ－ＰＰ６５ ｐｅｐｔｉｄｅ）を入れた。
（３）１２ウェルプレートを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターにおいて一晩インキュベートした。１日目に、各ウェルに１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５を入れ、さらにインキュベーターにおいて３７℃、５％ ＣＯ２で１０日培養した。培養過程において、２～３日おきに半分の量で液を交換した。そして、５日目および１０日目に、各培養系に最終濃度が５ μｇ／ｍｌのＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド（ＣＭＶ－ＰＰ６５ ｐｅｐｔｉｄｅ）を入れた。
（４）１１日目に、上記工程を参照し、照射されたＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド搭載ＤＣ細胞（Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ＣＭＶ－ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｏａｄｅｄ ＤＣ）を調製して各培養系における細胞と二回目の体外刺激を行い、７日刺激を続けた。
（５）１８日目に、ウェルプレートの各ウェルから５００ μｌの細胞を吸い取り、緩衝液（ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）で二回洗浄した後、ＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ：Ａ：０２０１ Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ－ＦＩＴＣとＣＤ８ａ－ＰＥを入れ、均一に混合した後、４℃で光を避けて２０ ｍｉｎインキュベートし、インキュベート終了後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後、４００ μｌの１×ＤＡＰＩ使用液を含有する緩衝液（ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）で細胞を再懸濁させた後、ＣＤ８＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋（％）の比率を検出した。
（１）上記成熟ＤＣ細胞（Ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）に５ μｇ／ｍｌのＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチドを入れた。封止膜（Ｐａｒａｆｉｌｍ）で密封した後、ローテーター（ＭＡＣＳｍｉｘ）に入れ、インキュベーターにおいて４ ｈ回転結合させた。ｍＤＣとＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド（ＣＭＶ－ｐｅｐｔｉｄｅ）のインキュベートが終了した後、照射装置によって４０ Ｇｙの照射量でＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド搭載ＤＣ細胞（ＣＭＶ－ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｏａｄｅｄ ＤＣ）を照射した。照射終了後、遠心でＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド搭載ＤＣ細胞を１５ ｍｌ遠心管に収集した。
（２）リンパ球分離液（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）で密度勾配遠心法によって健康なドナーの血液におけるＰＢＭＣを獲得し、キット（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）でＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離し、ＤＣ／Ｔが１：２．５の比率で、ＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド搭載ＤＣ細胞（ＣＭＶ－ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｏａｄｅｄ ＤＣ）とＣＤ８＋ Ｔ細胞を１２ウェルプレートに入れて培養し、培養系に最終濃度が３０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１、および５ μｇ／ｍｌのＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド（ＣＭＶ－ＰＰ６５ ｐｅｐｔｉｄｅ）を入れた。
（３）１２ウェルプレートを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターにおいて一晩インキュベートした。１日目に、各ウェルに１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５を入れ、さらにインキュベーターにおいて３７℃、５％ ＣＯ２で１０日培養した。培養過程において、２～３日おきに半分の量で液を交換した。そして、５日目および１０日目に、各培養系に最終濃度が５ μｇ／ｍｌのＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド（ＣＭＶ－ＰＰ６５ ｐｅｐｔｉｄｅ）を入れた。
（４）１１日目に、上記工程を参照し、照射されたＣＭＶ－ＰＰ６５目的ペプチド搭載ＤＣ細胞（Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ＣＭＶ－ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｏａｄｅｄ ＤＣ）を調製して各培養系における細胞と二回目の体外刺激を行い、７日刺激を続けた。
（５）１８日目に、ウェルプレートの各ウェルから５００ μｌの細胞を吸い取り、緩衝液（ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）で二回洗浄した後、ＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ：Ａ：０２０１ Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ－ＦＩＴＣとＣＤ８ａ－ＰＥを入れ、均一に混合した後、４℃で光を避けて２０ ｍｉｎインキュベートし、インキュベート終了後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後、４００ μｌの１×ＤＡＰＩ使用液を含有する緩衝液（ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）で細胞を再懸濁させた後、ＣＤ８＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋（％）の比率を検出した。
【0031】
実施例３ 単細胞シークエンシングによるＨＬＡ：Ａ：０２０１限定型ＣＭＶ－ｐｐ６５抗原特異的ＴＣＲの獲得
（１）フローサイトメトリーによってＣＤ８＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔ細胞を分別し、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ単細胞シークエンシング技術によってＣＤ８＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔ細胞のＴＣＲαとＴＣＲβ鎖の配列を獲得した。
（２）単細胞シークエンシングによってＴＣＲの配列を得た後、出現頻度が最も高いＴＣＲα／β鎖の配列に対して配列最適化を行い、外因性ＴＣＲがＴ細胞の内因性ＴＣＲとミスマッチしないように、その定常領域を改変した。発現配列に対してコドン最適化を行い、タンパク質の発現量を向上させた。ＴＣＲαとＴＣＲβが一つの発現ベクターにおいて同時に発現するが、余分なプロリンテールが生じないように、Ｐ２Ａおよびフーリンプロテアーゼによって酵素切断を行った（フーリン切断、Ｆｕｒｉｎ－ｃｌｅａｖａｇｅ）。
（３）レンチウイルス発現ベクターを構築し、上記ＴＣＲαとＴＣＲβの配列を同一のレンチウイルス発現ベクターに挿入し、２９３Ｔ細胞でウイルスのパッケージングを行い、ＣＭＶ－ｐｐ６５抗原特異的ＴＣＲの特異的ウイルス粒子を生産した。
（１）フローサイトメトリーによってＣＤ８＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔ細胞を分別し、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ単細胞シークエンシング技術によってＣＤ８＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔ細胞のＴＣＲαとＴＣＲβ鎖の配列を獲得した。
（２）単細胞シークエンシングによってＴＣＲの配列を得た後、出現頻度が最も高いＴＣＲα／β鎖の配列に対して配列最適化を行い、外因性ＴＣＲがＴ細胞の内因性ＴＣＲとミスマッチしないように、その定常領域を改変した。発現配列に対してコドン最適化を行い、タンパク質の発現量を向上させた。ＴＣＲαとＴＣＲβが一つの発現ベクターにおいて同時に発現するが、余分なプロリンテールが生じないように、Ｐ２Ａおよびフーリンプロテアーゼによって酵素切断を行った（フーリン切断、Ｆｕｒｉｎ－ｃｌｅａｖａｇｅ）。
（３）レンチウイルス発現ベクターを構築し、上記ＴＣＲαとＴＣＲβの配列を同一のレンチウイルス発現ベクターに挿入し、２９３Ｔ細胞でウイルスのパッケージングを行い、ＣＭＶ－ｐｐ６５抗原特異的ＴＣＲの特異的ウイルス粒子を生産した。
【0032】
実施例４ ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲレンチウイルスの感染からＴ細胞の活性化によるＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの生成
（１）キット（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）によってＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離し、１：３のＣＤ８＋ Ｔ細胞：ＣＤ３／２８ 免疫ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）の比率で、体外においてＣＤ３／２８免疫ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）でＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化させ、３７℃でＣＤ８＋ Ｔ細胞を２ ｄ刺激して活性化させた。
（２）ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲレンチウイルス粒子で活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を感染させ、８ μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を入れ、５００×ｇ、９０ ｍｉｎ、３０℃で遠心感染を行った。遠心終了後、インキュベーターにおいて、３７℃、５％ ＣＯ２で３日培養し、さらにＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲレンチウイルスの二回目の感染を行った。
（３）ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲレンチウイルスの二回目の感染から３日後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を吸い取り、緩衝液（ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）で二回洗浄した後、ＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ－ＦＩＴＣとＣＤ８ａ－ＰＥ抗体を入れて染色し、ＦＡＣＳによってＣＤ８＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋（％）の比率を検出し、さらにフローサイトメトリーによってＣＤ８ａ＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔ細胞を分別して後続の体外殺傷実験に供した。
（１）キット（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）によってＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋ Ｔ細胞を分離し、１：３のＣＤ８＋ Ｔ細胞：ＣＤ３／２８ 免疫ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）の比率で、体外においてＣＤ３／２８免疫ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）でＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化させ、３７℃でＣＤ８＋ Ｔ細胞を２ ｄ刺激して活性化させた。
（２）ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲレンチウイルス粒子で活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を感染させ、８ μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を入れ、５００×ｇ、９０ ｍｉｎ、３０℃で遠心感染を行った。遠心終了後、インキュベーターにおいて、３７℃、５％ ＣＯ２で３日培養し、さらにＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲレンチウイルスの二回目の感染を行った。
（３）ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲレンチウイルスの二回目の感染から３日後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を吸い取り、緩衝液（ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ）で二回洗浄した後、ＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ－ＦＩＴＣとＣＤ８ａ－ＰＥ抗体を入れて染色し、ＦＡＣＳによってＣＤ８＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋（％）の比率を検出し、さらにフローサイトメトリーによってＣＤ８ａ＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔ細胞を分別して後続の体外殺傷実験に供した。
【0033】
実施例５ ＨＬＡ：Ａ＊０２０１限定型ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ体外活性化実験
Ａ．ＦＡＣＳによるＴＣＲ－Ｔ細胞のＣＤ１３７、ＩＦＮγおよびＴＮＦ－αの発現レベルの検出
（１）レンチウイルスでＫ５６２細胞を感染させてそれぞれＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ、Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｖｅｃｔｏｒおよびＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を調製した。
（２）実施例４で調製されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ／Ｒｅｐｏｒｔｅｄ－ＴＣＲ－Ｔ細胞を取り、それぞれエフェクター標的比率１：１で、それぞれＴＣＲ－Ｔ細胞とＫ５６２細胞を丸底９６ウェルプレートに接種して培養した。
（３）２４ ｈ共培養した後、細胞外染色を行い、固定して膜を破壊し、細胞内染色後、ＦＡＣＳによって共培養系におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ１３７、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの発現レベルを検出することで、Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞が体外において特異的にＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を活性化させるか評価した。
Ａ．ＦＡＣＳによるＴＣＲ－Ｔ細胞のＣＤ１３７、ＩＦＮγおよびＴＮＦ－αの発現レベルの検出
（１）レンチウイルスでＫ５６２細胞を感染させてそれぞれＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ、Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｖｅｃｔｏｒおよびＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を調製した。
（２）実施例４で調製されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ／Ｒｅｐｏｒｔｅｄ－ＴＣＲ－Ｔ細胞を取り、それぞれエフェクター標的比率１：１で、それぞれＴＣＲ－Ｔ細胞とＫ５６２細胞を丸底９６ウェルプレートに接種して培養した。
（３）２４ ｈ共培養した後、細胞外染色を行い、固定して膜を破壊し、細胞内染色後、ＦＡＣＳによって共培養系におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ１３７、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの発現レベルを検出することで、Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞が体外において特異的にＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を活性化させるか評価した。
【0034】
Ｂ．ＥｌｉｓｐｏｔによるＴＣＲ－Ｔ細胞のＩＦＮγの放出レベルの検出
（１）無菌のｐＨ ７．４のカルシュウム・マグネシウムイオンフリーの１×ＤＰＢＳでコーティング抗体（ＭａｂｔｅｃｈＩＦＮγ、１－Ｄ１Ｋ：１ ｍｇ／ｍｌ）を １５ μｇ／ｍｌ（１．５ μｇ／１００ μｌ）に希釈した。各ウェルに１００ μｌの希釈された１－Ｄ１Ｋ抗体溶液を入れ、４～８ ℃で一晩インキュベートした。
（２）プレートにおける抗体を除去し、無菌ＤＰＢＳで洗浄した後、エフェクター標的比１：１の比率で細胞をプレートに敷き、各ウェルに１００ μｌの１６４０完全培地、３×１０４ ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞またはＫ５６２細胞を入れ、細胞が均一になるように軽くプレートの縁部を叩き、インキュベーターに置き、３７ ℃、５％ ＣＯ２で２０ ｈ培養した。
（３）２０ ｈ後、細胞を除去し、細胞が完全に除去されるようにＤＰＢＳで４～６回洗浄し、さらに各ウェルに１００ μｌのビオチンで標識された検出抗体７－Ｂ６－１－ｂｉｏｔｉｎを入れて３７ ℃で２ ｈインキュベートした。インキュベート終了後、ＤＰＢＳでプレートを５回洗浄し、最後の一回は液体を捨てた後、軽く無菌紙に叩いて乾燥させた。その後、各ウェルに２００ μｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを入れ、３７ ℃で１ ｈインキュベートした。
（４）インキュベート終了後、ＤＰＢＳでプレートを５回洗浄し、各ウェルに１００ μｌの基質ＴＭＢを入れ、はっきりとしたスポットが現れるまで反応させた。最後に、脱イオン水を入れて呈色反応を停止させた。Ｅｌｉｓｐｏｔｓ－ｒｅａｄｅｒ装置によってプレートをスキャンして統計分析を行った。
（１）無菌のｐＨ ７．４のカルシュウム・マグネシウムイオンフリーの１×ＤＰＢＳでコーティング抗体（ＭａｂｔｅｃｈＩＦＮγ、１－Ｄ１Ｋ：１ ｍｇ／ｍｌ）を １５ μｇ／ｍｌ（１．５ μｇ／１００ μｌ）に希釈した。各ウェルに１００ μｌの希釈された１－Ｄ１Ｋ抗体溶液を入れ、４～８ ℃で一晩インキュベートした。
（２）プレートにおける抗体を除去し、無菌ＤＰＢＳで洗浄した後、エフェクター標的比１：１の比率で細胞をプレートに敷き、各ウェルに１００ μｌの１６４０完全培地、３×１０４ ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞またはＫ５６２細胞を入れ、細胞が均一になるように軽くプレートの縁部を叩き、インキュベーターに置き、３７ ℃、５％ ＣＯ２で２０ ｈ培養した。
（３）２０ ｈ後、細胞を除去し、細胞が完全に除去されるようにＤＰＢＳで４～６回洗浄し、さらに各ウェルに１００ μｌのビオチンで標識された検出抗体７－Ｂ６－１－ｂｉｏｔｉｎを入れて３７ ℃で２ ｈインキュベートした。インキュベート終了後、ＤＰＢＳでプレートを５回洗浄し、最後の一回は液体を捨てた後、軽く無菌紙に叩いて乾燥させた。その後、各ウェルに２００ μｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを入れ、３７ ℃で１ ｈインキュベートした。
（４）インキュベート終了後、ＤＰＢＳでプレートを５回洗浄し、各ウェルに１００ μｌの基質ＴＭＢを入れ、はっきりとしたスポットが現れるまで反応させた。最後に、脱イオン水を入れて呈色反応を停止させた。Ｅｌｉｓｐｏｔｓ－ｒｅａｄｅｒ装置によってプレートをスキャンして統計分析を行った。
【0035】
実施例６ ＨＬＡ：Ａ＊０２０１限定型ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔのｐｐ６５－ＨＬＡ＊Ａ０２０１－Ｋ５６２細胞に対する体外における特異的殺傷
（１）レンチウイルスでＫ５６２細胞を感染させてそれぞれＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ対照細胞およびＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞を調製した。
（２）実施例４で調製されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ／Ｒｅｐｏｒｔｅｄ－ＴＣＲ－Ｔ細胞を取り、それぞれ１：１および５：１のエフェクター標的比で、Ｔ細胞とＫ５６２細胞を丸底９６ウェルプレートに接種して培養した。
（３）２４ ｈ共培養した後、ＦＡＣＳによって共培養系におけるＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰまたはＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙの比率を検出することで、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴおよびＲｅｐｏｒｔｅｄ－ＴＣＲ－Ｔが特異的にＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を殺傷するか評価し、そして二つのＴＣＲ－Ｔの殺傷効率を比較した。
（１）レンチウイルスでＫ５６２細胞を感染させてそれぞれＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ対照細胞およびＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞を調製した。
（２）実施例４で調製されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ／Ｒｅｐｏｒｔｅｄ－ＴＣＲ－Ｔ細胞を取り、それぞれ１：１および５：１のエフェクター標的比で、Ｔ細胞とＫ５６２細胞を丸底９６ウェルプレートに接種して培養した。
（３）２４ ｈ共培養した後、ＦＡＣＳによって共培養系におけるＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰまたはＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙの比率を検出することで、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴおよびＲｅｐｏｒｔｅｄ－ＴＣＲ－Ｔが特異的にＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を殺傷するか評価し、そして二つのＴＣＲ－Ｔの殺傷効率を比較した。
【0036】
実施例７ ＨＬＡ：Ａ＊０２０１限定型ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔのｐｐ６５－ＨＬＡ＊Ａ０２０１－Ｋ５６２細胞に対する体内における特異的殺傷
（１）レンチウイルスでＫ５６２細胞を感染させてＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞を、レンチウイルスでＣＤ８＋Ｔ細胞を感染させてＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞を調製した。
（２）マウス皮下腫瘍移植モデル：ｄａｙ０ではＮＯＧマウスの右側の脇下に１×１０６の標的細胞を皮下注射し、ｄａｙ３ではそれぞれ尻尾から５×１０６の初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ ｄａｙ３群）とＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞（ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ ｄａｙ３群）を静脈注射し、さらにｄａｙ７では尻尾から５×１０６のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞（ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ ｄａｙ７群）を静脈注射した。腫瘍細胞の注射後のｄ０（＋４ｈ）、ｄ７、ｄ１４、ｄ２１、ｄ２８、ｄ３５でマウスに対して生物発光イメージングを行って腫瘍細胞におけるルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の発現を検出し、そしてそのルシフェラーゼの光子数強度を定量することで、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴがＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞の生長を抑制するか評価した。
（３）マウス尾静脈転移モデル：ｄａｙ０ではＮＯＧマウスの尻尾から１×１０６の標的細胞を静脈注射し、ｄａｙ３ではそれぞれ尻尾から１×１０７の初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を静脈注射した。腫瘍細胞の注射後のｄ０（＋４ｈ）、ｄ２８、ｄ３５、ｄ４２、ｄ４９、ｄ５６でマウスに対して生物発光イメージングを行って腫瘍細胞におけるルシフェラーゼの発現を検出し、そしてそのルシフェラーゼの光子数強度を定量することで、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの標的細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅに対する抑制作用を評価した。
（１）レンチウイルスでＫ５６２細胞を感染させてＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞を、レンチウイルスでＣＤ８＋Ｔ細胞を感染させてＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞を調製した。
（２）マウス皮下腫瘍移植モデル：ｄａｙ０ではＮＯＧマウスの右側の脇下に１×１０６の標的細胞を皮下注射し、ｄａｙ３ではそれぞれ尻尾から５×１０６の初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ ｄａｙ３群）とＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞（ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ ｄａｙ３群）を静脈注射し、さらにｄａｙ７では尻尾から５×１０６のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞（ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ ｄａｙ７群）を静脈注射した。腫瘍細胞の注射後のｄ０（＋４ｈ）、ｄ７、ｄ１４、ｄ２１、ｄ２８、ｄ３５でマウスに対して生物発光イメージングを行って腫瘍細胞におけるルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の発現を検出し、そしてそのルシフェラーゼの光子数強度を定量することで、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴがＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞の生長を抑制するか評価した。
（３）マウス尾静脈転移モデル：ｄａｙ０ではＮＯＧマウスの尻尾から１×１０６の標的細胞を静脈注射し、ｄａｙ３ではそれぞれ尻尾から１×１０７の初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を静脈注射した。腫瘍細胞の注射後のｄ０（＋４ｈ）、ｄ２８、ｄ３５、ｄ４２、ｄ４９、ｄ５６でマウスに対して生物発光イメージングを行って腫瘍細胞におけるルシフェラーゼの発現を検出し、そしてそのルシフェラーゼの光子数強度を定量することで、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの標的細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅに対する抑制作用を評価した。
【0037】
実験結果：
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔのスクリーニングの流れ：
図１は本発明のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの特異性刺激およびスクリーニングの流れで、試験全体は健康なＨＬＡ－Ａ：０２０１ドナーのＣＤ８＋ Ｔ細胞を自家のｍＤＣにｐｐ６５ポリペプチドと搭載して二回刺激した後、ＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ ＤｅｘｔｒａｍｅｒでＣＭＶ－ｐｐ６５抗原特異的ＴＣＲ－Ｔ細胞に対して特異性の分析を行った。
フローサイトメトリーの結果（図２）から、二回のｍＤＣ－ｐｐ６５ポリペプチドによる刺激後、健康なドナーＤ６のＣＤ８ａ＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔの比率が０．１６％から８１．３％に向上したことが示され、ＣＭＶ－ｐｐ６５特異的ＴＣＲ－Ｔ細胞が体外において特異的に増幅したことがわかる。
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔのスクリーニングの流れ：
図１は本発明のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの特異性刺激およびスクリーニングの流れで、試験全体は健康なＨＬＡ－Ａ：０２０１ドナーのＣＤ８＋ Ｔ細胞を自家のｍＤＣにｐｐ６５ポリペプチドと搭載して二回刺激した後、ＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ ＤｅｘｔｒａｍｅｒでＣＭＶ－ｐｐ６５抗原特異的ＴＣＲ－Ｔ細胞に対して特異性の分析を行った。
フローサイトメトリーの結果（図２）から、二回のｍＤＣ－ｐｐ６５ポリペプチドによる刺激後、健康なドナーＤ６のＣＤ８ａ＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔの比率が０．１６％から８１．３％に向上したことが示され、ＣＭＶ－ｐｐ６５特異的ＴＣＲ－Ｔ細胞が体外において特異的に増幅したことがわかる。
【0038】
単細胞シークエンシングによるＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ配列の獲得：
自家ｍＤＣにｐｐ６５ポリペプチドを搭載して二回刺激した後、ＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ ＤｅｘｔｒａｍｅｒおよびＣＤ８ａ抗体でＣＭＶ－ｐｐ６５抗原特異的ＴＣＲ－Ｔ細胞に対してフローサイトメトリーによる分別を行い、得られたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ法によって単細胞シークエンシングし、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞のαとβ鎖の配列を得た。
単細胞シークエンシング後、得られた頻度のトップ１０位をランキングした。単細胞シークエンシングの結果から、分別されたＣＤ８ａ＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔ細胞における９９．６４％のＴ細胞クローンが一つのＴＣＲ－Ｔで構成されることが示され、本実験（抗体特異的Ｔ細胞分別、Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｉｍｉｎｇ）の特異性が良いことが証明された。当該Ｔ細胞クローンは２本のα鎖を含むが、そのうちの１本は余分なα鎖で、その後でＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ体外結合実験によって排除された。
最終的に得られたＴＣＲ配列は以下の通りである。
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ：
ＭＧＰＱＬＬＧＹＶＶＬＣＬＬＧＡＧＰＬＥＡＱＶＴＱＮＰＲＹＬＩＴＶＴＧＫＫＬＴＶＴＣＳＱＮＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＬＧＬＲＱＩＹＹＳＭＮＶＥＶＴＤＫＧＤＶＰＥＧＹＫＶＳＲＫＥＫＲＮＦＰＬＩＬＥＳＰＳＰＮＱＴＳＬＹＦＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦＧＱＧＴＲＬＴＶＶＥＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＫＲＫＮＳＲＡＫＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＥＫＮＰＬＡＡＰＬＬＩＬＷＦＨＬＤＣＶＳＳＩＬＮＶＥＱＳＰＱＳＬＨＶＱＥＧＤＳＴＮＦＴＣＳＦＳＳＳＮＦＹＡＬＨＷＹＲＷＥＴＡＫＳＰＥＡＬＦＶＭＴＬＮＧＤＥＫＫＫＧＲＩＳＡＴＬＮＴＫＥＧＹＳＹＬＹＩＫＧＳＱＰＥＤＳＡＴＹＬＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦＧＡＧＴＲＬＴＶＥＰＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＣＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号１）、配列におけるＣは人工的突然変異によって導入されたシステイン残基である
コドン最適化されたＴＣＲコード配列は以下の通りである。
ＡＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＡＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＴＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＧＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴ（配列番号２）
自家ｍＤＣにｐｐ６５ポリペプチドを搭載して二回刺激した後、ＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ ＤｅｘｔｒａｍｅｒおよびＣＤ８ａ抗体でＣＭＶ－ｐｐ６５抗原特異的ＴＣＲ－Ｔ細胞に対してフローサイトメトリーによる分別を行い、得られたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ法によって単細胞シークエンシングし、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞のαとβ鎖の配列を得た。
単細胞シークエンシング後、得られた頻度のトップ１０位をランキングした。単細胞シークエンシングの結果から、分別されたＣＤ８ａ＋／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ Ｔ細胞における９９．６４％のＴ細胞クローンが一つのＴＣＲ－Ｔで構成されることが示され、本実験（抗体特異的Ｔ細胞分別、Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｉｍｉｎｇ）の特異性が良いことが証明された。当該Ｔ細胞クローンは２本のα鎖を含むが、そのうちの１本は余分なα鎖で、その後でＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ体外結合実験によって排除された。
最終的に得られたＴＣＲ配列は以下の通りである。
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ：
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コドン最適化されたＴＣＲコード配列は以下の通りである。
ＡＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＡＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＴＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＧＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴ（配列番号２）
【0039】
中では、
α鎖およびそのコード配列は以下の通りである。
ＭＥＫＮＰＬＡＡＰＬＬＩＬＷＦＨＬＤＣＶＳＳＩＬＮＶＥＱＳＰＱＳＬＨＶＱＥＧＤＳＴＮＦＴＣＳＦＳＳＳＮＦＹＡＬＨＷＹＲＷＥＴＡＫＳＰＥＡＬＦＶＭＴＬＮＧＤＥＫＫＫＧＲＩＳＡＴＬＮＴＫＥＧＹＳＹＬＹＩＫＧＳＱＰＥＤＳＡＴＹＬＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦＧＡＧＴＲＬＴＶＥＰＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＣＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号３）
ＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＧＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴ（配列番号４）
β鎖およびそのコード配列は以下の通りである。
ＭＧＰＱＬＬＧＹＶＶＬＣＬＬＧＡＧＰＬＥＡＱＶＴＱＮＰＲＹＬＩＴＶＴＧＫＫＬＴＶＴＣＳＱＮＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＬＧＬＲＱＩＹＹＳＭＮＶＥＶＴＤＫＧＤＶＰＥＧＹＫＶＳＲＫＥＫＲＮＦＰＬＩＬＥＳＰＳＰＮＱＴＳＬＹＦＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦＧＱＧＴＲＬＴＶＶＥＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＫＲＫＮＳ（配列番号５）
ＡＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＡＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＴＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡ（配列番号６）
α鎖およびそのコード配列は以下の通りである。
ＭＥＫＮＰＬＡＡＰＬＬＩＬＷＦＨＬＤＣＶＳＳＩＬＮＶＥＱＳＰＱＳＬＨＶＱＥＧＤＳＴＮＦＴＣＳＦＳＳＳＮＦＹＡＬＨＷＹＲＷＥＴＡＫＳＰＥＡＬＦＶＭＴＬＮＧＤＥＫＫＫＧＲＩＳＡＴＬＮＴＫＥＧＹＳＹＬＹＩＫＧＳＱＰＥＤＳＡＴＹＬＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦＧＡＧＴＲＬＴＶＥＰＤＩＱＮＰＥＰＡＶＹＱＬＫＤＰＲＳＱＤＳＴＬＣＬＦＴＤＦＤＳＱＩＮＶＰＫＴＭＥＳＧＴＦＩＴＤＫＣＶＬＤＭＫＡＭＤＳＫＳＮＧＡＩＡＷＳＮＱＴＳＦＴＣＱＤＩＦＫＥＴＮＡＴＹＰＳＳＤＶＰＣＤＡＴＬＴＥＫＳＦＥＴＤＭＮＬＮＦＱＮＬＳＶＭＧＬＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号３）
ＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＧＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴ（配列番号４）
β鎖およびそのコード配列は以下の通りである。
ＭＧＰＱＬＬＧＹＶＶＬＣＬＬＧＡＧＰＬＥＡＱＶＴＱＮＰＲＹＬＩＴＶＴＧＫＫＬＴＶＴＣＳＱＮＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＬＧＬＲＱＩＹＹＳＭＮＶＥＶＴＤＫＧＤＶＰＥＧＹＫＶＳＲＫＥＫＲＮＦＰＬＩＬＥＳＰＳＰＮＱＴＳＬＹＦＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦＧＱＧＴＲＬＴＶＶＥＤＬＲＮＶＴＰＰＫＶＳＬＦＥＰＳＫＡＥＩＡＮＫＱＫＡＴＬＶＣＬＡＲＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＡＹＫＥＳＮＹＳＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＨＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＨＧＬＳＥＥＤＫＷＰＥＧＳＰＫＰＶＴＱＮＩＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＩＴＳＡＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＴＬＶＶＭＡＭＶＫＲＫＮＳ（配列番号５）
ＡＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＡＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＴＴＡＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡ（配列番号６）
【0040】
α鎖可変領域およびそのコード配列は以下の通りである。
ＭＥＫＮＰＬＡＡＰＬＬＩＬＷＦＨＬＤＣＶＳＳＩＬＮＶＥＱＳＰＱＳＬＨＶＱＥＧＤＳＴＮＦＴＣＳＦＳＳＳＮＦＹＡＬＨＷＹＲＷＥＴＡＫＳＰＥＡＬＦＶＭＴＬＮＧＤＥＫＫＫＧＲＩＳＡＴＬＮＴＫＥＧＹＳＹＬＹＩＫＧＳＱＰＥＤＳＡＴＹＬＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦＧＡＧＴＲＬＴＶＥＰ（配列番号７）
ＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＧＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＧＣＣＴ（配列番号８）
それに含まれる３つのＣＤＲ配列は以下の通りである。
α－ＣＤＲ１：ＳＳＮＦＹＡ（配列番号９）、コード配列：ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣ（配列番号１０）；
α－ＣＤＲ２：ＭＴＬＮＧＤＥ（配列番号１１）、コード配列：ＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡ（配列番号１２）；
α－ＣＤＲ３：ＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ（配列番号１３）、コード配列：ＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣ（配列番号１４）
ＭＥＫＮＰＬＡＡＰＬＬＩＬＷＦＨＬＤＣＶＳＳＩＬＮＶＥＱＳＰＱＳＬＨＶＱＥＧＤＳＴＮＦＴＣＳＦＳＳＳＮＦＹＡＬＨＷＹＲＷＥＴＡＫＳＰＥＡＬＦＶＭＴＬＮＧＤＥＫＫＫＧＲＩＳＡＴＬＮＴＫＥＧＹＳＹＬＹＩＫＧＳＱＰＥＤＳＡＴＹＬＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦＧＡＧＴＲＬＴＶＥＰ（配列番号７）
ＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＧＡＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＧＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＧＡＣＣＧＴＴＧＡＧＣＣＴ（配列番号８）
それに含まれる３つのＣＤＲ配列は以下の通りである。
α－ＣＤＲ１：ＳＳＮＦＹＡ（配列番号９）、コード配列：ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＧＣＣ（配列番号１０）；
α－ＣＤＲ２：ＭＴＬＮＧＤＥ（配列番号１１）、コード配列：ＡＴＧＡＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＡ（配列番号１２）；
α－ＣＤＲ３：ＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ（配列番号１３）、コード配列：ＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＧＧＴＴＣ（配列番号１４）
【0041】
β鎖可変領域およびそのコード配列は以下の通りである。
ＭＧＰＱＬＬＧＹＶＶＬＣＬＬＧＡＧＰＬＥＡＱＶＴＱＮＰＲＹＬＩＴＶＴＧＫＫＬＴＶＴＣＳＱＮＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＬＧＬＲＱＩＹＹＳＭＮＶＥＶＴＤＫＧＤＶＰＥＧＹＫＶＳＲＫＥＫＲＮＦＰＬＩＬＥＳＰＳＰＮＱＴＳＬＹＦＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦＧＱＧＴＲＬＴＶＶ（配列番号１５）
ＡＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＡＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧ（配列番号１６）
ＭＧＰＱＬＬＧＹＶＶＬＣＬＬＧＡＧＰＬＥＡＱＶＴＱＮＰＲＹＬＩＴＶＴＧＫＫＬＴＶＴＣＳＱＮＭＮＨＥＹＭＳＷＹＲＱＤＰＧＬＧＬＲＱＩＹＹＳＭＮＶＥＶＴＤＫＧＤＶＰＥＧＹＫＶＳＲＫＥＫＲＮＦＰＬＩＬＥＳＰＳＰＮＱＴＳＬＹＦＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦＧＱＧＴＲＬＴＶＶ（配列番号１５）
ＡＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＡＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧ（配列番号１６）
【0042】
それに含まれる３つのＣＤＲ配列は以下の通りである。
β－ＣＤＲ １：ＭＮＨＥＹ（配列番号１７）、コード配列：ＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣ（配列番号１８）；
β－ＣＤＲ ２：ＳＭＮＶＥＶ（配列番号１９）、コード配列：ＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧ（配列番号２０）；
β－ＣＤＲ ３：ＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ（配列番号２１）、コード配列：ＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号２２）。
β－ＣＤＲ １：ＭＮＨＥＹ（配列番号１７）、コード配列：ＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＣ（配列番号１８）；
β－ＣＤＲ ２：ＳＭＮＶＥＶ（配列番号１９）、コード配列：ＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧ（配列番号２０）；
β－ＣＤＲ ３：ＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ（配列番号２１）、コード配列：ＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴ（配列番号２２）。
【0043】
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔベクターの構築および配列最適化：
シークエンシングによってｐｐ６５－ＴＣＲ（配列番号１）の配列を得た後、配列の最適化を行い、具体的に以下のことを含む：
（１）その定常領域を改造し、内因性ＴＣＲ鎖とのミスマッチを阻止した；
（２）発現配列に対してヒト由来コドン最適化を行い、ＴＣＲタンパク質の発現量を向上させた；
（３）Ｐ２Ａおよびフーリン切断によってα鎖およびβ鎖が一つのプラスミドにおいて同時に発現され、Ｐ２Ａの単独使用による末端のプロリン残留が生じないようにした。
その後、最適化されたｐｐ６５－ＴＣＲ配列（図３）をレンチウイルス発現ベクターにクローニングした。
シークエンシングによってｐｐ６５－ＴＣＲ（配列番号１）の配列を得た後、配列の最適化を行い、具体的に以下のことを含む：
（１）その定常領域を改造し、内因性ＴＣＲ鎖とのミスマッチを阻止した；
（２）発現配列に対してヒト由来コドン最適化を行い、ＴＣＲタンパク質の発現量を向上させた；
（３）Ｐ２Ａおよびフーリン切断によってα鎖およびβ鎖が一つのプラスミドにおいて同時に発現され、Ｐ２Ａの単独使用による末端のプロリン残留が生じないようにした。
その後、最適化されたｐｐ６５－ＴＣＲ配列（図３）をレンチウイルス発現ベクターにクローニングした。
【0044】
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ体外結合実験：
２９３Ｔ細胞でＴＣＲレンチウイルスのパッケージングを行い、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲレンチウイルスで健康なＨＬＡ－Ａ：０２０１ドナーのＰＢＭＣまたはｊｕｒｋａｔ Ｔを二回感染させた後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ Ｄｅｘｔｒａｍｅｒの染色を行い、フローサイトメトリーの結果から、Ｔｅｔｒａｍｅｒ＋／ｍＴＣＲβＣ＋ｊｕｒｋａｔＴ（図４のＡ）およびＤｅｘｔｒａｍｅｒ＋／初代ＣＤ８＋ Ｔ（図４のＢ）細胞の群分けが明らかであったことがわかり、当該結果から、本プロジェクトのスクリーニングおよび同定されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔは健康なドナーのｊｕｒｋａｔＴおよび初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞において正常に発現され、そしてＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ Ｔｅｔｒａｍｅｒ／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒと結合することができることが示された。
２９３Ｔ細胞でＴＣＲレンチウイルスのパッケージングを行い、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲレンチウイルスで健康なＨＬＡ－Ａ：０２０１ドナーのＰＢＭＣまたはｊｕｒｋａｔ Ｔを二回感染させた後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ Ｄｅｘｔｒａｍｅｒの染色を行い、フローサイトメトリーの結果から、Ｔｅｔｒａｍｅｒ＋／ｍＴＣＲβＣ＋ｊｕｒｋａｔＴ（図４のＡ）およびＤｅｘｔｒａｍｅｒ＋／初代ＣＤ８＋ Ｔ（図４のＢ）細胞の群分けが明らかであったことがわかり、当該結果から、本プロジェクトのスクリーニングおよび同定されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔは健康なドナーのｊｕｒｋａｔＴおよび初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞において正常に発現され、そしてＣＭＶ－ＰＰ６５－ＨＬＡ＊Ａ：０２０１ Ｔｅｔｒａｍｅｒ／Ｄｅｘｔｒａｍｅｒと結合することができることが示された。
【0045】
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ体外活性化実験：
体外において対照細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ、ベクター対照群の細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｖｅｃｔｏｒ、および標的細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙを調製し、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞と標的細胞または対照（ベクター対照およびブランク対照）を体外において共培養し、細胞内外の染色後、フローサイトメトリーによってＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞のＣＤ１３７およびＩＦＮγの発現レベルを検出した。
フローサイトメトリー実験の結果（図５）から、Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞は体外において特異的にＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を活性化させ、活性化後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴのＣＤ１３７およびＩＦＮγの発現レベルが顕著に向上したが、ベクター対照群のＫ５６２細胞と対照Ｋ５６２細胞はＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞に明らかな活性化作用が無かったことが示された。
また、ＩＦＮγ－Ｅｌｉｓｐｏｔ実験の結果から、同様に、Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞は体外において特異的にＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を活性化させ、活性化後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴのＩＦＮγ発現レベルが顕著に向上したが、対照細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰはＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔに活性化作用が無かったことが示された。
体外において対照細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ、ベクター対照群の細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｖｅｃｔｏｒ、および標的細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙを調製し、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞と標的細胞または対照（ベクター対照およびブランク対照）を体外において共培養し、細胞内外の染色後、フローサイトメトリーによってＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞のＣＤ１３７およびＩＦＮγの発現レベルを検出した。
フローサイトメトリー実験の結果（図５）から、Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞は体外において特異的にＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を活性化させ、活性化後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴのＣＤ１３７およびＩＦＮγの発現レベルが顕著に向上したが、ベクター対照群のＫ５６２細胞と対照Ｋ５６２細胞はＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞に明らかな活性化作用が無かったことが示された。
また、ＩＦＮγ－Ｅｌｉｓｐｏｔ実験の結果から、同様に、Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ標的細胞は体外において特異的にＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を活性化させ、活性化後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴのＩＦＮγ発現レベルが顕著に向上したが、対照細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰはＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔに活性化作用が無かったことが示された。
【0046】
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ体外殺傷実験：
体外において標的細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＮ１０２６５６１８８Ａで公開されたＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔおよび本プロジェクトのＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔを調製した。
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴまたはＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞と標的細胞をエフェクター標的比１：１および５：１で、体外において２４ ｈ共培養した後、フローサイトメトリーによってＧＦＰ＋標的細胞の比率を検出し、フローサイトメトリー実験の結果（図６のＡ、Ｂ）から、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴとＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔ細胞はいずれも体外においてｐｐ６５を発現するＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を殺傷したが、本プロジェクトで公開されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔは殺傷効果の面においてＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔよりも良かったことが示された。
その後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴおよびＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞と標的細胞をエフェクター標的比１：１で体外において共培養し、２４ｈ後、細胞内染色を行い、さらにフローサイトメトリーによってサイトカインＴＮＦ－αの発現を検出することで、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴおよびＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔのサイトカイン放出の状況を評価した。フローサイトメトリー実験の結果から、本プロジェクトでスクリーニングおよび同定されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞はＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔよりも体外においてより高いレベルのＴＮＦ－αを放出し、特異的にｐｐ６５を発現するＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を殺傷したが（図６のＣ）、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴとＫ５６２－Ａ０２０１対照群細胞を共培養した後、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのサイトカイン放出がなかったことがわかり、その特異性が良いことが示された。
体外において標的細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＮ１０２６５６１８８Ａで公開されたＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔおよび本プロジェクトのＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔを調製した。
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴまたはＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞と標的細胞をエフェクター標的比１：１および５：１で、体外において２４ ｈ共培養した後、フローサイトメトリーによってＧＦＰ＋標的細胞の比率を検出し、フローサイトメトリー実験の結果（図６のＡ、Ｂ）から、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴとＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔ細胞はいずれも体外においてｐｐ６５を発現するＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を殺傷したが、本プロジェクトで公開されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔは殺傷効果の面においてＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔよりも良かったことが示された。
その後、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴおよびＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞と標的細胞をエフェクター標的比１：１で体外において共培養し、２４ｈ後、細胞内染色を行い、さらにフローサイトメトリーによってサイトカインＴＮＦ－αの発現を検出することで、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴおよびＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔのサイトカイン放出の状況を評価した。フローサイトメトリー実験の結果から、本プロジェクトでスクリーニングおよび同定されたＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞はＲｅｐｏｒｔｅｄ ＴＣＲ－Ｔよりも体外においてより高いレベルのＴＮＦ－αを放出し、特異的にｐｐ６５を発現するＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を殺傷したが（図６のＣ）、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴとＫ５６２－Ａ０２０１対照群細胞を共培養した後、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γのサイトカイン放出がなかったことがわかり、その特異性が良いことが示された。
【0047】
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの皮下腫瘍移植モデルにおける体内殺傷実験
体外においてＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞およびＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞を調製し、ｄａｙ０ではＮＯＧマウスの右側の脇下に１×１０６の標的細胞を皮下注射し、ｄａｙ３ではそれぞれ尻尾から５×１０６の初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ ｄａｙ３群）とＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞（ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ ｄａｙ３群）を静脈注射し、さらにｄａｙ７では尻尾から５×１０６のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞（ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ ｄａｙ７群）を静脈注射した（図７のＡ）。腫瘍細胞の注射後の０－５週目にマウスに対して生物発光イメージング検出を行い（図７のＢ）、そしてマウスのルシフェラーゼの光子数強度を定量した。体内実験の結果から、本プロジェクトのＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞は体内において特異的にＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞を殺傷することができ（図７のＢ、Ｃ）、ｄａｙ３またはｄａｙ７のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの注射はいずれも顕著に腫瘍細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの生長を抑制し、顕著にマウスの生存時間を延長させることができ（図７のＤ）、その標的細胞に対する殺傷効果が顕著にｐｐ６５－ＴＣＲ形質導入が行われなかったＣＤ８＋Ｔ対照群細胞よりも良いことが示された。
体外においてＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞およびＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞を調製し、ｄａｙ０ではＮＯＧマウスの右側の脇下に１×１０６の標的細胞を皮下注射し、ｄａｙ３ではそれぞれ尻尾から５×１０６の初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ ｄａｙ３群）とＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞（ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ ｄａｙ３群）を静脈注射し、さらにｄａｙ７では尻尾から５×１０６のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞（ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ ｄａｙ７群）を静脈注射した（図７のＡ）。腫瘍細胞の注射後の０－５週目にマウスに対して生物発光イメージング検出を行い（図７のＢ）、そしてマウスのルシフェラーゼの光子数強度を定量した。体内実験の結果から、本プロジェクトのＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞は体内において特異的にＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞を殺傷することができ（図７のＢ、Ｃ）、ｄａｙ３またはｄａｙ７のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの注射はいずれも顕著に腫瘍細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの生長を抑制し、顕著にマウスの生存時間を延長させることができ（図７のＤ）、その標的細胞に対する殺傷効果が顕著にｐｐ６５－ＴＣＲ形質導入が行われなかったＣＤ８＋Ｔ対照群細胞よりも良いことが示された。
【0048】
ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの転移モデルにおける体内殺傷実験：
体外においてＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞およびＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞を調製し、ｄａｙ０ではＮＯＧマウスの尻尾から１×１０６の標的細胞を静脈注射し、ｄａｙ３ではそれぞれ尻尾から５×１０７の初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を静脈注射した（図８のＡ）。腫瘍細胞の注射後の４－８週目にマウスに対して生物発光イメージング検出を行い（図８のＢ）、そしてマウスのルシフェラーゼの光子数強度を定量した。
体内実験の結果から、本プロジェクトのＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞は体内において特異的にＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞を殺傷することができ（図８のＢとＣ）、ｄａｙ３のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの注射は顕著に腫瘍細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの生長を抑制し、その抑制効果が顕著にｐｐ６５－ＴＣＲ形質導入が行われなかったＣＤ８＋Ｔ対照群細胞よりも良いことが示された。
体外においてＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞およびＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔエフェクター細胞を調製し、ｄａｙ０ではＮＯＧマウスの尻尾から１×１０６の標的細胞を静脈注射し、ｄａｙ３ではそれぞれ尻尾から５×１０７の初代ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞を静脈注射した（図８のＡ）。腫瘍細胞の注射後の４－８週目にマウスに対して生物発光イメージング検出を行い（図８のＢ）、そしてマウスのルシフェラーゼの光子数強度を定量した。
体内実験の結果から、本プロジェクトのＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔ細胞は体内において特異的にＫ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞を殺傷することができ（図８のＢとＣ）、ｄａｙ３のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔの注射は顕著に腫瘍細胞Ｋ５６２－Ａ：０２０１－ＧＦＰ－ｐｐ６５－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの生長を抑制し、その抑制効果が顕著にｐｐ６５－ＴＣＲ形質導入が行われなかったＣＤ８＋Ｔ対照群細胞よりも良いことが示された。
【0049】
技術効果
ＣＭＶはヒト間における感染が非常に広く、中国の成人の感染率が９５％以上に達し、通常、不顕性感染になっており、多くの感染者は臨床症状がないが、一定の条件において複数の臓器およびシステムを侵すと重度な疾患になることがある。ＣＭＶ活性化は造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者においてよく見られ、一部の患者は薬物治療効果が劣るか、薬剤耐性が低く、薬物治療クールを完成することができい。患者は免疫機能が低下し、有効にＣＭＶを排除することができず、ＣＭＶに関連する発熱から臓器に及ぶ一連の関連性疾患を引き起こす可能性があり、高い病死率を有する。既存の抗ＣＭＶ薬も、剤形が単調、標的が類似、顆粒球減少／腎臓損傷につながるなど、不足な点が多い。そのため、ＨＳＣＴ患者のＣＭＶ感染の治療のための新たな臨床治療プロトコールが切望されている。本プロジェクトのＣＭＶ－ＴＣＲ－Ｔ細胞は、正確にターゲティングしてＣＭＶウイルスに感染した標的細胞を排除すると同時に、間接的にＴＣＲ－Ｔ細胞が媒介する免疫再構築により、ウイルスを徹底的に排除し、そして再感染を防止し、長期間で保護作用を発揮することができる。
本プロジェクトの発明のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔは以下の特徴を有する。
体内外実験から、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔは正確にターゲティングして迅速にＣＭＶ抗原を発現する標的細胞を排除することができ、体内におけるタンパク質の発現量が高く、かつ内因性ＴＣＲ鎖とミスマッチがなく、殺傷能力が強く、特異性が高いなどが示された。そして、体外実験から、本プロジェクトのＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴはＣＮ１０２６５６１８８Ａで公開されたＲｅｐｏｒｔｅｄ－ＴＣＲ－Ｔよりも標的細胞に対する殺傷作用が顕著で、有効にＨＳＣＴ患者またはほかの移植患者のＣＭＶ感染の治療に使用することができることが示された。
また、既存の関連する公開発明と比べ、本プロジェクトはＴＣＲ－Ｔ分野で公認されたゴールド基準のＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合イムノスポット）体外実験の証拠を提供し、本プロジェクトのスクリーニングによって得られたＴＣＲは特異的にＣＭＶ抗原を認識することができることが示された。同時萎、本プロジェクトの発明は尾静脈モデルによってＣＭＶ特異的ＴＣＲ搭載Ｔ細胞が特異的にＣＭＶ抗原を発現する標的細胞を排除することが実証された以外、より臨床ＣＭＶ感染の状況に近い皮下腫瘍移植モデルで、同様に本プロジェクトのスクリーニングによって得られたＣＭＶ特異的ＴＣＲ搭載Ｔ細胞が特異的にＣＭＶ抗原を発現する標的細胞を排除することが実証された。
つまり、本プロジェクトの発明は完全で、分野の基準に合い、かつより臨床ＣＭＶ感染状況に近い体内外データを提供し、スクリーニングによって得られたＣＭＶ抗原特異的ＴＣＲの特異性、有効性が十分に実証された。
ＣＭＶはヒト間における感染が非常に広く、中国の成人の感染率が９５％以上に達し、通常、不顕性感染になっており、多くの感染者は臨床症状がないが、一定の条件において複数の臓器およびシステムを侵すと重度な疾患になることがある。ＣＭＶ活性化は造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）患者においてよく見られ、一部の患者は薬物治療効果が劣るか、薬剤耐性が低く、薬物治療クールを完成することができい。患者は免疫機能が低下し、有効にＣＭＶを排除することができず、ＣＭＶに関連する発熱から臓器に及ぶ一連の関連性疾患を引き起こす可能性があり、高い病死率を有する。既存の抗ＣＭＶ薬も、剤形が単調、標的が類似、顆粒球減少／腎臓損傷につながるなど、不足な点が多い。そのため、ＨＳＣＴ患者のＣＭＶ感染の治療のための新たな臨床治療プロトコールが切望されている。本プロジェクトのＣＭＶ－ＴＣＲ－Ｔ細胞は、正確にターゲティングしてＣＭＶウイルスに感染した標的細胞を排除すると同時に、間接的にＴＣＲ－Ｔ細胞が媒介する免疫再構築により、ウイルスを徹底的に排除し、そして再感染を防止し、長期間で保護作用を発揮することができる。
本プロジェクトの発明のＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔは以下の特徴を有する。
体内外実験から、ＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－Ｔは正確にターゲティングして迅速にＣＭＶ抗原を発現する標的細胞を排除することができ、体内におけるタンパク質の発現量が高く、かつ内因性ＴＣＲ鎖とミスマッチがなく、殺傷能力が強く、特異性が高いなどが示された。そして、体外実験から、本プロジェクトのＣＭＶ－ｐｐ６５－ＴＣＲ－ＴはＣＮ１０２６５６１８８Ａで公開されたＲｅｐｏｒｔｅｄ－ＴＣＲ－Ｔよりも標的細胞に対する殺傷作用が顕著で、有効にＨＳＣＴ患者またはほかの移植患者のＣＭＶ感染の治療に使用することができることが示された。
また、既存の関連する公開発明と比べ、本プロジェクトはＴＣＲ－Ｔ分野で公認されたゴールド基準のＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合イムノスポット）体外実験の証拠を提供し、本プロジェクトのスクリーニングによって得られたＴＣＲは特異的にＣＭＶ抗原を認識することができることが示された。同時萎、本プロジェクトの発明は尾静脈モデルによってＣＭＶ特異的ＴＣＲ搭載Ｔ細胞が特異的にＣＭＶ抗原を発現する標的細胞を排除することが実証された以外、より臨床ＣＭＶ感染の状況に近い皮下腫瘍移植モデルで、同様に本プロジェクトのスクリーニングによって得られたＣＭＶ特異的ＴＣＲ搭載Ｔ細胞が特異的にＣＭＶ抗原を発現する標的細胞を排除することが実証された。
つまり、本プロジェクトの発明は完全で、分野の基準に合い、かつより臨床ＣＭＶ感染状況に近い体内外データを提供し、スクリーニングによって得られたＣＭＶ抗原特異的ＴＣＲの特異性、有効性が十分に実証された。
【0050】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-08-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、
ＴＣＲα鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列がＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ（配列番号１３）であり、かつ／または
ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列がＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ（配列番号２１）である、ＴＣＲ。
【請求項2】
ＴＣＲα鎖可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、α－ＣＤＲ１：ＳＳＮＦＹＡ（配列番号９）、
α－ＣＤＲ２：ＭＴＬＮＧＤＥ（配列番号１１）、
α－ＣＤＲ３：ＣＡＦＰＹＮＮＮＤＭＲＦ（配列番号１３）であり；かつ／または
ＴＣＲβ鎖可変ドメインの３つの相補性決定領域は、
β－ＣＤＲ１：ＭＮＨＥＹ（配列番号１７）、
β－ＣＤＲ２：ＳＭＮＶＥＶ（配列番号１９）、
β－ＣＤＲ３：ＣＡＳＳＬＥＧＹＴＥＡＦＦ（配列番号２１）である、
請求項１に記載のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項3】
ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、ＴＣＲα鎖可変ドメインは配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、かつ／またはＴＣＲβ鎖可変ドメインは配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項4】
ＴＣＲのアミノ酸配列は配列番号１で示される、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項5】
多価ＴＣＲ複合体であって、少なくとも２つのＴＣＲ分子を含み、かつそのうちの少なくとも１つのＴＣＲ分子は請求項１に記載のＴＣＲである、ＴＣＲ複合体。
【請求項6】
請求項１に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補配列を含む、核酸分子。
【請求項7】
核酸分子は、ＴＣＲα鎖可変ドメインをコードする、配列番号８のヌクレオチド配列を含み、かつ／または
核酸分子は、ＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードする、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、
請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
請求項６に記載の核酸分子を含み、好適には、ウイルスベクターであり、より好適には、レンチウイルスベクターである、ベクター。
【請求項9】
分離された宿主細胞であって、請求項８に記載のベクターを含むか、または外来の請求項６に記載の核酸分子が染色体に組み込まれている、宿主細胞。
【請求項10】
請求項６に記載の核酸分子で形質導入されており、好適には、Ｔ細胞または幹細胞である、細胞。
【請求項11】
請求項８に記載のベクターで形質導入されており、好適には、Ｔ細胞または幹細胞である、細胞。
【請求項12】
薬学的に許容されるビヒクルと、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項５に記載のＴＣＲ複合体、請求項６に記載の核酸分子、または請求項１０若しくは１１に記載の細胞とを含有する、薬物組成物。
【請求項13】
請求項１～４のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体、または請求項５に記載のＴＣＲ複合体、または請求項１０若しくは１１に記載の細胞の使用であって、サイトメガロウイルス感染症を治療するための薬物の製造における、使用。
【請求項14】
治療を必要とする対象において疾患を治療するための医薬であって、請求項１２に記載の薬物組成物の適量を含む、医薬。
【請求項15】
疾患はサイトメガロウイルス感染に関連する疾患である、請求項１４に記載の医薬。
【請求項16】
サイトメガロウイルス感染に関連する疾患が、ＣＭＶ網膜炎、ＣＭＶ肺炎、ＣＭＶ胃腸炎、ＣＭＶ脳炎からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬。
【国際調査報告】