特表 2025-535118 ＡＡＶカプシドの精製のためのクロマトグラフィー方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-10-22

(54)【発明の名称】ＡＡＶカプシドの精製のためのクロマトグラフィー方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/02 20060101AFI20251015BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20251015BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20251015BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20251015BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20251015BHJP

   G01N 30/00 20060101ALI20251015BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20251015BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20251015BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20251015BHJP

【ＦＩ】

C12N7/02

C12N7/01

A61K35/76

A61P43/00 105

A61K48/00

G01N30/00 B

G01N30/26 A

G01N30/88 E

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2025521129

(86)(22)【出願日】2023-10-11

(85)【翻訳文提出日】2025-06-10

(86)【国際出願番号】 IB2023060237

(87)【国際公開番号】W WO2024079655

(87)【国際公開日】2024-04-18

(31)【優先権主張番号】63/379,115

(32)【優先日】2022-10-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/489,684

(32)【優先日】2023-03-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517271175

【氏名又は名称】メイラグティーエックス ユーケー アイアイ リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100166165

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 英直

(74)【代理人】

【識別番号】100231902

【弁理士】

【氏名又は名称】吉田 李花

(72)【発明者】

【氏名】ジャヤン セナラトネ

(72)【発明者】

【氏名】シアン デイビス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084NA13

4C084ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA13

4C087ZB21

(57)【要約】

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを生成及び精製するための方法であって、弱分配モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して完全カプシドを空カプシドから分離することを含む、方法を提供する。本開示はまた、本方法によって濃縮されたｒＡＡＶ完全カプシドの集団、本方法によって単離及び濃縮されたｒＡＡＶ完全カプシドの集団、ならびに濃縮された完全カプシドの集団を含む医薬組成物も提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

完全カプシドと空カプシドとの混合物中の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の完全カプシドを濃縮する方法であって、前記方法が：
（ｉ）ｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液を提供するステップと；
（ｉｉ）陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムまたは膜を平衡化するステップと；
（ｉｉｉ）前記ｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液を、弱分配モードＡＥＸクロマトグラフィーに供して、前記空カプシドを前記完全カプシドから分離して、完全カプシドが濃縮されたＡＥＸ溶離液を得るステップと、を含む、前記方法。

【請求項2】

前記溶液はアフィニティークロマトグラフィー溶離液であり、ステップ（ｉｉｉ）が、前記アフィニティークロマトグラフィー溶離液を前記平衡化したＡＥＸカラムまたは膜に適用することと、前記ＡＥＸカラムまたは膜を少なくとも１回洗浄することと、ｒＡＡＶ完全カプシドを前記ＡＥＸカラムまたは膜から溶離することとを含み、前記弱分配モードは、完全カプシドが結合した空カプシドを前記ＡＥＸカラムまたは膜から置き換え、前記空カプシドが前記ＡＥＸカラムまたは膜を通って流れることで、ＡＥＸフロースルーを生成し、前記完全カプシドが溶離まで前記ＡＥＸカラムまたは膜に結合したままでいることをもたらす、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記アフィニティークロマトグラフィー溶離液が、前記平衡化されたＡＥＸカラムまたは膜に供される前に、目標塩濃度に希釈される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記目標塩濃度が、約８５ｍＭ～約９５ｍＭの範囲内である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記目標塩濃度が約９０ｍＭであり、前記塩がＮａＣｌである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＡＥＸカラムまたは膜が、前記ｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液でロードする前に、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．５％超（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む平衡化緩衝液で平衡化されており、ここで、前記平衡化緩衝液が、約９．０のｐＨである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記平衡化緩衝液が、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約９０ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．７５％のポリソルベート８０を含み、前記平衡化緩衝液が、約９．０のｐＨである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＡＥＸカラムまたは膜を少なくとも１回洗浄することが、（ｉ）約５０ｍＭのｔｒｉｓ；（ｉｉ）約８５ｍＭ～約９５ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．５％超（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む第１の洗浄緩衝液を含み、前記第１の洗浄緩衝液が約ｐＨ９．０である、請求項２に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の洗浄緩衝液が、（ｉ）約５０ｍＭのｔｒｉｓ；（ｉｉ）約９０ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．７５％のポリソルベート８０を含み、前記第１の洗浄緩衝液が約ｐＨ９．０である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＡＥＸカラムまたは膜を少なくとも１回洗浄することが、（ｉ）約５０ｍＭのｔｒｉｓ；（ｉｉ）約１００ｍＭ～約１２５ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．５％超（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む第２の洗浄緩衝液による第２の洗浄をさらに含み、前記第２の洗浄緩衝液が約ｐＨ９．０である、請求項２に記載の方法。

【請求項11】

前記第２の洗浄緩衝液が、（ｉ）約５０ｍＭのｔｒｉｓ；（ｉｉ）約１２５ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．７５％のポリソルベート８０を含み、前記第２の洗浄緩衝液が約ｐＨ９．０である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記完全カプシドが、（ｉ）約５０ｍＭのｔｒｉｓ；（ｉｉ）約１２５ｍＭ～２５０ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．５％超（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む溶離緩衝液によって前記ＡＥＸカラムまたは膜から溶離され、前記溶離緩衝液が約ｐＨ９．０である、請求項２に記載の方法。

【請求項13】

前記溶離緩衝液が、（ｉ）約５０ｍＭのｔｒｉｓ；（ｉｉ）約２５０ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．７５％のポリソルベート８０を含み、前記溶離緩衝液が約ｐＨ９．０である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＡＥＸクロマトグラフィーカラムまたは膜が、高流量吸着膜を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記高流量吸着膜が、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑクロマトグラフィー膜を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

完全カプシド濃縮を定量化するために、前記ＡＥＸ溶離液またはその試料を分析超遠心分離に供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記濃縮された完全カプシドが、ＡＡＶ血清型２カプシドタンパク質及び導入遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記導入遺伝子が、アクアポリン１（ＡＱＰ１）である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記濃縮された完全カプシドが、８０％を超える完全カプシドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記濃縮された完全カプシドが、約８１．５％の完全カプシドを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記濃縮された完全カプシドが、９０％を超える完全カプシドを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記濃縮された完全カプシドが、９５％を超える完全カプシドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

濃縮された完全カプシドを含む前記ＡＥＸ溶離液をタンジェント流濾過に供し、完全カプシドの精製された調製物を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

完全カプシド及び空カプシドの混合物中のｒＡＡＶ完全カプシドを単離及び濃縮するための方法であって、前記方法が：
（ｉ）ウイルス産生細胞から、ｒＡＡＶの完全カプシドと空カプシドとの混合物を、細胞を溶解し、得られた溶解物を清澄化することにより単離するステップと；
（ｉｉ）前記清澄化された溶解物をアフィニティークロマトグラフィーに供し、アフィニティークロマトグラフィー溶離液を得るステップと；
（ｉｉｉ）前記アフィニティークロマトグラフィー溶離液を弱分配モードＡＥＸクロマトグラフィーに供して、空カプシドを完全カプシドから分離して、濃縮された完全カプシドを含むＡＥＸ溶離液を得るステップと、を含む、前記方法。

【請求項25】

前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記細胞が懸濁液中で培養されている、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記細胞が、シェーカーフラスコ、スピナーフラスコ、細胞バッグ、またはバイオリアクタ中で培養される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法によって濃縮された完全カプシドの集団。

【請求項29】

請求項２８に記載の完全カプシドの集団を含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年１０月１１日に出願された米国仮出願連続番号第６３／３７９，１１５号、及び２０２３年３月１０日に出願された米国仮出願連続番号第６３／４８９，６８４号に対する優先権の権益を主張するものであり、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを生成及び精製するための方法であって、弱分配モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して完全カプシドを空カプシドから分離することを含む、方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損型パルボウイルスである。ＡＡＶ粒子は、３つのカプシドタンパク質－ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３－を有するカプシドを含み、カプシドは、約４．８ｋｂの長さの一本鎖ＤＮＡゲノムを封入し、一本鎖ＤＮＡゲノムは、プラス鎖であってもマイナス鎖であってもよい。いずれかの鎖を含む粒子は感染性であり、親の感染する一本鎖を二本鎖形態に変換し、その後に増幅することによって複製が行われ、そこから、子の一本鎖が置き換えられてカプシドにパッケージングされる。

【0004】

ＡＡＶは、複製を行うためには、他のウイルス、主にアデノウイルスとの、共感染に依存する。その一本鎖ゲノムは、３つの遺伝子、ｒｅｐ（複製）、ｃａｐ（カプシド）、及びａａｐ（アセンブリ）を含み、３つのプロモーター、代替翻訳開始部位、及び異なるスプライシングの使用を通して、少なくとも９つの遺伝子産物を生じる。これらのコード配列は、ゲノムの複製及びパッケージングに必要な、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と隣接している。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスゲノムの複製及びパッケージングに関与する、４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）をコードするのに対して、ｃａｐ発現は、ウイルスゲノムを保護する外側カプシドシェルを形成し、かつ細胞の結合と内在化に積極的に関与する、ウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）を生じる。ａａｐ遺伝子は、ｃａｐ遺伝子と重なる代替リーディングフレームで、アセンブリ－活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。このＡＡＰタンパク質は、カプシドアセンブリに対する足場の機能を提供すると考えられる。

【0005】

ＡＡＶ粒子は、遺伝子治療及び遺伝子ワクチンを含む、治療用途のベクターとして、魅力的となる特徴を有する。ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を含む広範囲の細胞型に感染し、インビボで、多くの異なる組織を標的にする可能性をもたらす。ＡＡＶは、緩慢に分裂する細胞と、分裂しない細胞に感染する。治療用途では、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が使用され、そこでは、ゲノムが異種導入遺伝子を含み、典型的には、ＩＴＲを保持しているが、ウイルスのｒｅｐ、ｃａｐ、及びａａｐ遺伝子を欠いている。Ｒｅｐタンパク質が存在しない場合、ＩＴＲに隣接した導入遺伝子は、転写活性のある核外染色体要素またはエピソームを形成することができ、この核外染色体要素またはエピソームは、本質的に、形質導入された細胞の寿命にわたり持続することができる。

【0006】

ｒＡＡＶベクター産生方法の重要な目標は、ＡＡＶカプシド化された残留ＤＮＡ不純物や空カプシドを含む、産生物関連不純物の生成を最小限に抑えながら、安定した、高いベクター生産性を達成することである。細胞１つ当たり生成されるベクターゲノム（ＶＧ）として測定すると、ｒＡＡＶベクターの生産性は、細胞１つ当たり１０^３未満～２×１０^５ＶＧの範囲で、非常に可変であり得る。高い費用対効果に加えて、高い生産性の重要な利点は、出発原料が全採取バイオマスに対するｒＡＡＶベクター生成物の比率がより高い場合に、精製がより効率的となり得ることにある。

【0007】

ｒＡＡＶベクターの産生中、産物関連の不純物の除去はｒＡＡＶ精製の重要な部分である。超遠心分離を使用した場合、完全カプシドから空カプシドを分離することは可能であるが、拡大可能であるクロマトグラフィー法はより困難であることが証明されている。代替として、結合及び溶離モードでの陰イオン交換クロマトグラフィーは、超遠心分離によって達成される高い完全カプシド比を再現する試みで一般に調査されている。しかしながら、完全カプシドと空カプシドの特性が類似しているため、生成物の収率と完全カプシド比との間に急激なトレードオフがもたらされ、最適な条件を選択することが困難になる。これはまた、ＡＡＶカプシドとクロマトグラフィーマトリックスとの間の複雑な相互作用によって妨げられ、これは、さらなる産物の損失をもたらすことが多い。したがって、空カプシドなどの産生物関連不純物を低減するｒＡＡＶ精製方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、弱分配モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する、完全カプシドを空カプシドから分離する（完全カプシドの濃縮）ことを含む、ｒＡＡＶ粒子を生成及び精製するための方法を提供する。本明細書には、完全カプシドと空カプシドとの混合物中のｒＡＡＶ完全カプシドを濃縮する方法が記載され、この方法は、
（ｉ）ｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液を提供することと；
（ｉｉ）陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムまたは膜を平衡化することと；
（ｉｉｉ）ｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液を、弱分配モードＡＥＸクロマトグラフィーに供して、空カプシドを完全カプシドから分離して、完全カプシドが濃縮されたＡＥＸ溶離液を得ることと、を含む。

【0009】

本方法の実施形態では、溶液はアフィニティークロマトグラフィー溶離液であり、ステップ（ｉｉｉ）は、アフィニティークロマトグラフィー溶離液を平衡化したＡＥＸカラムまたは膜に適用することと、ＡＥＸカラムまたは膜を少なくとも１回洗浄することと、ＡＥＸカラムまたは膜からｒＡＡＶ完全カプシドを溶離することと、を含む。これらの方法では、弱分配モードにより、結合した空カプシドがＡＥＸカラムまたは膜から完全カプシドに置き換えられ、空カプシドがＡＥＸカラムまたは膜を通って流れることで、ＡＥＸフロースルーが生じ、完全カプシドが溶離までＡＥＸまたは膜カラムに結合されたままになる。

【0010】

いくつかの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー溶離液は、平衡化されたＡＥＸカラムまたは膜に供される前に、目標塩濃度に希釈される。目標塩濃度は、典型的には、約８５ｍＭ～約９５ｍＭの範囲内である。目標塩濃度は、例えば、約９０ｍＭであり得、塩は、例えば、ＮａＣｌであり得る。

【0011】

本方法の実施形態では、ＡＥＸカラムまたは膜は、ｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液でロードする前に、約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ（例えば、約１０、４９、５０、５１、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ）のＴｒｉｓ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約８４、８４．９、８５、８６、８７、８８、８９、８９．５、９０、９０．５、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５）、及び約０．５％超（例えば、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０％）（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む平衡化緩衝液で平衡化されており、ここで、平衡化緩衝液は、約９．０（例えば、約８．８、８．９、９．０、９．１、９．２）のｐＨである。平衡化緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約９０ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．７５％のポリソルベート８０を含み得、約９．０のｐＨを有し得る。

【0012】

本方法の実施形態では、ＡＥＸカラムまたは膜を少なくとも１回洗浄することは、（ｉ）約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ（例えば、約１０、４９、５０、５１、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ）のＴｒｉｓ、（ｉｉ）約８５ｍＭ～約９５ｍＭ（例えば、約８４、８４．９、８５、８６、８７、８８、８９、８９．５、９０、９０．５、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５）のＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．５％超（例えば、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０％）（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、を含む第１の洗浄緩衝液を含み、ここで、第１の洗浄緩衝液は約ｐＨ９．０である（例えば、約８．８、８．９、９．０、９．１、９．２）。第１の洗浄緩衝液は、例えば、（ｉ）約５０ｍＭのＴｒｉｓ、（ｉｉ）約９０ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．７５％のポリソルベート８０を含み得、約ｐＨ９．０であり得る。

【0013】

実施形態では、ＡＥＸカラムまたは膜を少なくとも１回洗浄することは、（ｉ）約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ（例えば、約１０、４９、５０、５１、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ）のＴｒｉｓ、（ｉｉ）約１００ｍＭ～約１２５ｍＭ（例えば、約９９、１００、１０１、１０５、１１０、１２０、１２４、１２５、１２６ｍＭ）のＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．５％超（例えば、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０％）（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む第２の洗浄緩衝液による第２の洗浄を含み、ここで、第２の洗浄緩衝液は、約ｐＨ９．０（例えば、約８．８、８．９、９．０、９．１、９．２）である。第２の洗浄緩衝液は、例えば、（ｉ）約５０ｍＭのＴｒｉｓ、（ｉｉ）約１２５ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．７５％のポリソルベート８０を含み得、約ｐＨ９．０であり得る。

【0014】

実施形態では、完全カプシドは、ＡＥＸカラムまたは膜から、（ｉ）約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ（例えば、約１０、４９、５０、５１、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ）のＴｒｉｓ、（ｉｉ）約１２５ｍＭ～約２５０ｍＭ（例えば、約１２４、１２５、１２６、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２５１ｍＭ）のＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．５％超（例えば、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０％）（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む溶離緩衝液により溶離され、ここで、溶離緩衝液は、約ｐＨ９．０（例えば、約８．８、８．９、９．０、９．１、９．２）である。溶離緩衝液は、例えば、（ｉ）約５０ｍＭのＴｒｉｓ、（ｉｉ）約２５０ｍＭのＮａＣｌ、及び（ｉｉｉ）約０．７５％のポリソルベート８０を含み得、溶離緩衝液は約９．０のｐＨである。

【0015】

本方法の実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィーカラムまたは膜は、高流量吸着膜、例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑクロマトグラフィー膜を含む。実施形態では、本方法は、濃縮された完全カプシドを含むＡＥＸ溶離液をタンジェント流濾過（ＴＦＦ）に供し、完全カプシド（例えば原薬）の精製調製物を得るステップをさらに含むことができる。

【0016】

実施形態では、ポリソルベート２０及びポロキサマー１８８は、本明細書に記載の緩衝液のうちの１つ以上において使用され得る。

【0017】

本方法の実施形態では、本方法は、完全カプシド濃縮を定量化するために、ＡＥＸ溶離液を分析超遠心分離に供するステップをさらに含む。

【0018】

本方法の実施形態では、濃縮された完全カプシドは、ＡＡＶ血清型２カプシドタンパク質と、導入遺伝子、例えば、アクアポリン１（ＡＱＰ１）などの導入遺伝子を含むポリヌクレオチド配列とを含み得る。

【0019】

実施形態では、濃縮された完全カプシドは、８０％超の完全カプシド（例えば、約８０．５、８１．５、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６％の完全カプシド）、９０％超の完全カプシド、及び９５％超の完全カプシドを含む。

【0020】

また、本明細書には、完全カプシドと空カプシドとの混合物中のｒＡＡＶ完全カプシドを単離及び濃縮する方法も記載される。この方法は：ウイルス産生細胞からｒＡＡＶの完全カプシドと空カプシドとの混合物を、細胞を溶解し、得られた溶解物を清澄化することにより単離することと；清澄化した溶解物をアフィニティークロマトグラフィーに供し、アフィニティークロマトグラフィー溶離液を得ることと、空カプシドを完全カプシドから分離するために、アフィニティークロマトグラフィー溶離液を弱分配モードＡＥＸクロマトグラフィーに供し、濃縮された完全カプシドを含むＡＥＸ溶離液を得ることと、を含む。実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。細胞は典型的には、懸濁液中、例えば、シェーカーフラスコ、スピナーフラスコ、セルバッグ、またはバイオリアクタ内で培養される。

【0021】

本発明はまた、本方法によって濃縮されたｒＡＡＶ完全カプシドの集団、本方法によって単離及び濃縮されたｒＡＡＶ完全カプシドの集団、ならびに濃縮された完全カプシドの集団を含む医薬組成物も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ｐＩ（１）の上下の空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドの電荷を示す図である。

【図2】形成された環境により、空カプシドが完全カプシドに置き換えられる、弱分配プロセスを示す図である。

【図3】洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度（ｍＭ）と、空カプシドの除去（ＶＰ／ｍＬ）との関係を示すグラフである。

【図4】洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度（ｍＭ）と、溶離液中の完全カプシド比（％）との間の関係を示すグラフである。

【図5】洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度（ｍＭ）と、溶離液中のＶＧ回収率（％）との間の関係を示すグラフである。

【図6】洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度（ｍＭ）に基づく最適領域を示すプロットである。

【図7】ロード比と、完全カプシド（ＶＧ）及び空カプシド（ＶＰ）のブレークスルー（％）との関係を示すグラフである。

【図8】２リットル（Ｌ）スケールでの最適化されたＡＡＶ－ＡＱＰ１ ＡＥＸステップのクロマトグラムである。

【図9】ＡＥＸプロセスのスケーラビリティを示す結果の要約を示すグラフである。２Ｌスケールは、１０ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑを使用して操作されたプロセスを指し、８０は、７５ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑを使用して操作されたプロセスを指す。

【図10】ベクターゲノム及びベクター粒子のフロースルー中のブレークスルーの程度を示すブレークスルー実験の結果を示すグラフである。

【図11】１０ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑを使用するプロセスを確認するために行った実験（実施例２に記載）からのクロマトグラムの抜粋である。この抜粋は、カラム洗浄２及び溶離段階に焦点を当てている。

【図12】１０ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑで行った確認実行によって生成された溶離液で行った分析的超遠心分離の結果を示す。

【図13】初期の陰イオン交換クロマトグラフィーランスルーのクロマトグラムである。

【図14】９０ｍＭのＮａＣｌフィード及び平衡伝導度での４Ｅ１４ＶＧ／ｍＬのロード負荷までのＶＧブレークスルーと空カプシドブレークスルーの両方を示すブレークスルー曲線を示す。

【図15】ＶＧロード負荷が４Ｅ１４ｖｇ／ｍｌに増加したときのカラムのＶＧ濃度（上のグラフ）と、ＶＧロード負荷が４Ｅ１４ＶＧ／ｍＬに増加したときのカラムの空カプシド比（下のグラフ）とを示す対のグラフである。

【図16】ＶＧロード負荷が４Ｅ１４ＶＧ／ｍＬに増加するにつれての、カラム上の完全カプシド比の増加を示すグラフである。

【図17】達成可能な濃縮のレベルを強調するために、９ｍＳ／ｃｍと８ｍＳ／ｃｍの両方で４Ｅ１４ＶＧ／ｍＬまでロードした場合のカラム上の完全カプシドの濃度を示すグラフである。

【図18】２０Ｌスケール確認実行での最適化ＡＡＶ－ＡＱＰ１ ＡＥＸステップのクロマトグラムである。

【図19】「初期プロセス」及び「最終プロセス」における、ＵＳＰ、捕捉クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、及びタンジェント流濾過（ＴＦＦ）のそれぞれの後のＶＧ回収率及び完全カプシド％値を示す。

【図20】完全カプシド比及びＶＧ回収率の２０Ｌと８０Ｌのバッチの間での比較を示すグラフ、ならびに図８の溶離ピークが８２％の完全カプシドを含むことを確認する分析超遠心分離（ＡＵＣ）の結果を示すプロットである。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本開示は、弱分配モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する、完全カプシドを空カプシドから分離する（完全カプシドの濃縮）ことを含む、ｒＡＡＶを生成及び精製するための方法を提供する。完全カプシドと空カプシドとの混合物中でｒＡＡＶ完全カプシドを濃縮する方法は、以下のステップ：
（ｉ）ｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液を提供することと；
（ｉｉ）陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムまたは膜を平衡化することと；
（ｉｉｉ）ｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液を、弱分配モードＡＥＸクロマトグラフィーに供して、空カプシドを完全カプシドから分離して、完全カプシドが濃縮されたＡＥＸ溶離液を得ることと、を含む。

【0024】

完全カプシドと空カプシドとの混合物中でｒＡＡＶ完全カプシドを単離及び濃縮する方法は、以下のステップ：
（ｉ）ウイルス産生細胞から、ｒＡＡＶの完全カプシドと空カプシドとの混合物を、細胞を溶解し、得られた溶解物を清澄化することにより単離することと；
（ｉｉ）清澄化された溶解物をアフィニティークロマトグラフィーに供し、アフィニティークロマトグラフィー溶離液を得ることと；
（ｉｉｉ）アフィニティークロマトグラフィー溶離液を弱分配モードＡＥＸクロマトグラフィーに供して、空カプシドを完全カプシドから分離して、濃縮された完全カプシドを含むＡＥＸ溶離液を得ることと、を含む。

【0025】

本発明はまた、本方法によって濃縮されたｒＡＡＶ完全カプシドの集団、本方法によって単離及び濃縮されたｒＡＡＶ完全カプシドの集団、ならびに濃縮された完全カプシドの集団を含む医薬組成物（例えば、薬物、原薬）も提供する。実施形態では、本方法は、産生力価の増加、及び完全カプシド対空カプシドのより高い比（Ｆ：Ｅ）をもたらす。より具体的には、本開示は、例えば、完全カプシドと空カプシドとの混合物においてｒＡＡＶの完全カプシドを濃縮する方法を提供する。実施形態では、生成収率は５０％超であり、空カプシドの５０％超が除去され、８０％超のＦ：Ｅ比が達成される。

【0026】

ｒＡＡＶを精製するための弱分配モードでのＡＥＸ
本明細書に記載の精製方法及び濃縮方法は、ｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液から、ｒＡＡＶの完全カプシド（すなわち、組み換えゲノムを含むｒＡＡＶ粒子）を精製することを含む。溶液は、任意のｒＡＡＶ産生／精製方法の結果であってよい。典型的には、溶液は、ＡＥＸクロマトグラフィーに供される前に、目標塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度に希釈することによってコンディショニングされる。例えば、溶液は、約９０ｍＭ（例えば、約８９、９０、９１ｍＭ）のＮａＣｌ濃度まで、約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ（例えば、約１０、４９、５０、５１、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ）のＴｒｉｓ、約０．７５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、及び約９．０（例えば、約８．８、８．９、９．０、９．１、９．２）により希釈される。実施形態では、溶液はアフィニティークロマトグラフィー溶離液である。アフィニティークロマトグラフィーは、ｒＡＡＶ粒子（例えば、ｒＡＡＶ完全カプシド）を産生及び精製する典型的な方法におけるいくつかの精製ステップのうちの１つである。ｒＡＡＶの産生／精製の方法は当該技術分野で周知であり、このような方法の例を以下に記載する。

【0027】

本明細書に記載の方法において、弱分配モードＡＥＸクロマトグラフィーは、完全カプシドを空カプシドから分離するために使用される精製技術である（図１及び２）。この形式のクロマトグラフィーは、ウイルスゲノムを含むカプシドと空カプシドとの間の電荷差を利用する。カプシドｐＩを上回るｐＨ値の標的化は、ＶＧ含有完全カプシドが、空カプシドよりも大きな負電荷を保有することを意味する。本明細書に記載される精製方法及び濃縮方法では、弱分配は、完全カプシドの結合がより好ましい環境を作り出すことによって、完全カプシドを空カプシドから分離するプロセスを記載するものである。

【0028】

弱分配モードでの陰イオン交換クロマトグラフィーは、歴史的に使用されてきたフロースルーモードＡＥＸ方法及び結合－溶離モードＡＥＸ方法とは異なる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１０；２（５）：４８０－４９９、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｏｌ．１０１：５５３－５６６、２００８）。結合及び溶離モードＡＥＸでは、最初に（目的の）生成物プールを陰イオン交換カラムにロードし、次いで目的の生成物をより高い塩濃度でステップまたは直線勾配で溶離し、不純物の大部分をカラムに結合させたままにする。不純物は、洗浄または再生ステップ中にカラムから溶離される。フロースルーモードＡＥＸでは、操作ｐＨは通常８～８．２であり、生成品ロードならびに平衡化緩衝液及び洗浄緩衝液中の伝導度は最大１０ｍＳ／ｃｍである。条件は、生成物がカラムに結合しない一方で、核酸及び宿主細胞タンパク質などの酸性不純物がカラムに結合するように選択される。弱分配モードでの陰イオン交換クロマトグラフィーの使用は、目的の生成物について、アフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換を含む２つのクロマトグラフィー回収プロセスを可能にし得る。フロースルークロマトグラフィーと同様に、プロセスは均一濃度で実行されるが、フロースルーモードとは対照的に、生成物と不純物の両方の結合が増強され、０．１～２０、好ましくは１～３の生成物分配係数（Ｋｐ）を達成するように、伝導度及びｐＨが選択される。これは、除去すべき不純物が生成物よりも酸性度が高いという事実の利点を利用する。生成物と不純物の両方が陰イオン交換樹脂に結合するが、不純物の結合がフロースルーモードよりもはるかに密接に結合され、これが不純物の除去の増加をもたらし得る。したがって、フロースルーモードでは効率的に除去されない弱い結合の不純物は、その分配係数（Ｋｐ）が増加した条件下でより高い程度で除去され得る。フロースルーモードでの陰イオン交換クロマトグラフィーと比較して、ウイルス、宿主細胞タンパク質、及び生成物関連種のクリアランスが増加するため、弱分配クロマトグラフィーは、２カラムでの回収プロセスを可能にし得る。弱分配クロマトグラフィーの一態様は、ｐＨ及び対イオンの条件を生成物ごとに最適化する必要があることである。これは、ほとんどの生成物の陰イオン交換マトリックス（樹脂または膜）で標準化された条件を使用できるいくつかのプラットフォームクロマトグラフィープロセスとは対照的である。

【0029】

完全カプシドと空カプシドの混合物中でｒＡＡＶ完全カプシドを濃縮する方法では、ｒＡＡＶ完全カプシド及び空カプシドを含む溶液が提供される。上述のように、溶液は、任意のｒＡＡＶ産生／精製方法の結果であり得、実施形態では、溶液は、アフィニティークロマトグラフィー溶離液である。溶液を受容するＡＥＸカラムまたは膜は、典型的には、適切な事前平衡化緩衝液で事前に平衡化される。例えば、好適な事前平衡化緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約１ＭのＮａＣｌ、及び約０．７５％ポリソルベート８０を含み、約９．０（例えば、約８．８、８．９、９．０、９．１、９．２）のｐＨを有する。事前平衡化ステップの後、ＡＥＸカラムまたは膜は平衡化緩衝液で平衡化される。典型的には、平衡化緩衝液は、約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ（例えば、約１０、４９、５０、５１、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ）のＴｒｉｓ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭ（例えば、約８４、８４．９、８５、８６、８７、８８、８９、８９．５、９０、９０．５、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５）の塩（例えば、ＮａＣｌ）、及び約０．５％超（例えば、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０％）（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、平衡化緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約９０ｍＭのＮａＣｌ、ならびに０．５％（ｗ／ｖ）超のポリソルベート８０、及び約０．７５％超のポリソルベート８０を含み、約９．０のｐＨを有する。この方法では、任意の適切なＡＥＸカラム（複数可）または膜（複数可）が使用され得る。実施形態では、高流量吸着膜が使用される。そのような膜の例は、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑクロマトグラフィー膜である。そのような膜の別の例は、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ’ｓ Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ膜である。

【0030】

ＡＥＸカラムまたは膜の平衡化後、溶液（実施例１及び２では「フィード」、「供給材料」、及び「調整済みフィード」と呼ばれる）が、平衡化したＡＥＸカラムまたは膜に加えられる。溶液は、任意の適切なロード比で適用され得る。実施例１及び２に記載の実験では、５×１０^１３～１×１０^１５ＶＧ／ｍＬのロード比を使用し、８１．５％の完全カプシド比溶離％を得た。ロード溶液のフロースルーは、典型的には、空カプシドからなる（完全カプシドは、カラムまたは膜とのより強い相互作用を有し、空カプシドを置換する）。実施形態では、フロースルーまたはその試料を分析して、そのウイルスゲノム及びウイルス粒子濃度を、任意の適切な方法によって決定することができる。

【0031】

溶液の適用に続いて、ＡＥＸカラムまたは膜は、少なくとも１回（例えば、１回、２回、３回）洗浄される。少なくとも第１の洗浄では、ＡＥＸカラムまたは膜は、約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ（例えば、約１０、４９、５０、５１、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ）のＴｒｉｓ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭ（例えば、約８４．５、８４．９、８５、８５．５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５．５、９６ｍＭ）のＮａＣｌ、及び約０．５％超（例えば、約０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０％）（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む第１の洗浄緩衝液により洗浄される。第１の洗浄緩衝液は、典型的には、約ｐＨ９．０（例えば、約８．８、８．９、９．０、９．１、９．２）である。例えば、第１の洗浄緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約９０ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．７５％のポリソルベート８０を含み得、約９．０のｐＨを有し得る。実施形態では、約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ（例えば、約１０、４９、５０、５１、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ）のＴｒｉｓ、約１００ｍＭ～約１２５ｍＭのＮａＣｌ（例えば、約９９、１００、１０１、１０５、１１０、１２０、１２４、１２５、１２６ｍＭ）のＮａＣｌ、及び約０．５％超（例えば、０．５％、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０％）（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む第２の洗浄緩衝液による２回の洗浄がある。第２の洗浄緩衝液は、典型的には、約９．０（例えば、約８．８、８．９、９．０、９．１、９．２）のｐＨである。例えば、第２の洗浄緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約１２５ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．７５％のポリソルベート８０を含み得、第２の洗浄緩衝液は、約９．０のｐＨを有する。カラムまたは膜の洗浄液は、典型的には、ほとんどが空カプシドからなるが、完全カプシドを含み得る。洗浄液、または洗浄液の画分（試料）を、任意の適切な方法によって、それらのウイルスゲノム及びウイルス粒子濃度について分析することができる。

【0032】

少なくとも１回の洗浄（例えば、２回の洗浄）に続いて、完全カプシドがカラムまたは膜から溶離され、完全カプシドについて濃縮されたＡＥＸ溶離液が得られる。完全カプシドは、概して、約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ（例えば、約１０、４９、５０、５１、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ）のＴｒｉｓ、約１２５ｍＭ～約２５０ｍＭ（例えば、約１２４、１２５、１２６、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２５１ｍＭ）のＮａＣｌ、及び約０．５％超（例えば、約０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０％）（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む溶離液により、ＡＥＸカラムまたは膜から溶離する。溶離液は、典型的には、約ｐＨ９．０（例えば、約８．８、８．９、９．０、９．１、９．２）である。溶離緩衝液の例は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５０ｍＭのＮａＣｌ、及び約０．７５％のポリソルベート８０を含み、ｐＨ約９．０を有する緩衝液である。完全カプシドについて濃縮されたＡＥＸ溶離液の試料を、そのウイルスゲノム及びウイルス粒子濃度、ならびにその完全カプシド比及びウイルスゲノム回収率について分析することができる。したがって、実施形態では、本方法はさらに、完全カプシドについて濃縮されたＡＥＸ溶離液またはその試料を、ｐＰＣＲ及び分析用超遠心分離（ＡＵＣ）に供し、完全カプシド濃縮の定量化をすること（例えば、ベクター精製の品質及び有効性をモニターすること、組換えウイルス粒子の調製物における空カプシドの相対量を測定すること）を含む。ＡＵＣは、サイズ、形状、化学量論、及び結合特性などの高分子の特性を、すべて真の溶液状態環境で調査するための、広く適用可能であり、情報量の多い方法である。ＡＵＣは、中程度に高い濃度での定量的及び定性的な情報を評価することができる。ＡＵＣを使用して、組換えウイルス粒子の調製物を特性評価する方法は、既知である（例えば、本明細書に参照により組み込まれる米国特許公開第２０２００２２５１３９号を参照されたい）。

【0033】

事前平衡化、平衡化、洗浄、及び溶離ステップのすべてについて、任意の適切な膜体積（ＭＶ）及び流速（ＭＶ／分）を使用することができる。表６及び８に適切なＭＶ及びＭＶ／分の例を示す。完全カプシドと空カプシドの混合物中でｒＡＡＶ完全カプシドを濃縮する方法の具体例は、実施例１及び２に記載される。

【0034】

実施形態では、完全カプシドについて濃縮されたＡＥＸ溶離液は、遺伝子治療薬として投与され得る製剤（例えば、薬物、原薬）の追加の精製及び調製のためにＴＦＦ（例えば、ＴＦＦ透析）に供される。

【0035】

実施形態では、本方法は、少なくとも約３０％、例えば、約３０％～４０％、少なくとも６５％、約６５％～９５％、少なくとも８０％、約８０％～８５％（例えば、７９％、７９．５％、８０％、８０．５％、８１％、８１．５％、８２％、８３％、８５％、８５％）、約９０％～９５％（例えば、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％）などの空ＡＡＶ粒子（空カプシド）に対するｒＡＡＶ完全粒子（完全カプシド）の比を提供する。ヌクレアーゼ抵抗性ＡＡＶカプセル化ＤＮＡ不純物のレベルは、ヘルパープラスミド中の関連する配列用に設計された、プライマー及びプローブを使用するｑＰＣＲによって、または高コピー数ゲノム配列に対して、評価されてもよい。ｑＰＣＲ前に行われるヌクレアーゼ処理への感受性により、ヌクレアーゼ感受性の「ネイキッド」残留ＤＮＡ不純物と、ヌクレアーゼ不感受性のカプセル化された残留ＤＮＡ不純物とを、区別することができる。完全ＡＡＶカプシドは、カプシド特異的ＥＬＩＳＡアッセイ、及びカプシド粒子力価とＶＧ力価との比較により決定された空カプシドの量を使用して、測定してもよい。分光光度法は、非ＡＡＶカプシド不純物が実質的に除去された試料に、使用してもよい。

【0036】

本方法は、製造規模、例えば、約５～約１０リットル、約１０～約２０リットル、約２０～約５０リットル、約５０～約１００リットル（例えば、７９、８０、８１）、約１００～約２００リットル、またはそれ以上の培養に拡大可能であり、多様なＡＡＶ血清型／カプシドバリアントを含むｒＡＡＶに適用可能である。実施例１及び２に記載される実験は、ｒＡＡＶ完全カプシドが大（製造）スケールで濃縮され得ることを実証する。

【0037】

本明細書に開示される方法によって産生されたｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ完全カプシド）は、標的細胞において導入遺伝子を発現するのに有用である。これらのｒＡＡＶベクターは、標的細胞で維持及び発現され得る導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを、標的細胞内に導入することができるため、遺伝子治療に使用することが可能である。ｒＡＡＶベクターは、ヒト患者の標的細胞に異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質またはレポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、及びタンパク質発現のための調節因子）を送達することが可能である。導入遺伝子の例の非排他的なリストには、ＲＰＧＲ、ＲＰＥ６５、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、ＣＮＧＢ３、及びＡＱＰ１が含まれる。いくつかの実施形態では、２つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。本方法では、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．５、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ９－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ、及びそれらのハイブリッドなどの、ＡＡＶ血清型またはＡＡＶバリアント由来のものであってもよい。

【0038】

「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを標的細胞内に導入するためのビヒクルを指す。ベクターは、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター、ＨＳＶベクター）もしくはプラスミドなどの非ウイルスベクター、またはリポソーム、ゼラチン、もしくはポリアミンなどの化合物と結合したＤＮＡであってもよい。発現ベクターは、宿主細胞または標的細胞における発現のための調節因子を有する、遺伝子産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むベクターである。

【0039】

「ｒＡＡＶ」、「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶ粒子」、または「ｒＡＡＶビリオン」は、エクスビボ、インビトロ、またはインビボの、標的細胞のその後の感染のために、カプシドタンパク質にパッケージングされる（すなわち、カプシドタンパク質によってカプシド化される）、組換えＡＡＶベクターゲノムを指す。これらの語句は、空のＡＡＶカプシド及び標的細胞で発現すべき導入遺伝子を含む、完全な組換えＡＡＶゲノムを欠くＡＡＶカプシドを除外している。したがって、カプシドに加えて、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶゲノムを含む。「ｒＡＡＶゲノム」または「ｒＡＡＶベクターゲノム」は、ｒＡＡＶ粒子を形成するように、最終的にパッケージングまたはカプシド化される、目的の導入遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を指す。典型的には、ｒＡＡＶについては、ＡＡＶゲノム（例えば、ｒｅｐ、ｃａｐ、及びａａｐ遺伝子を含む）の大部分が削除されており、一方または両方のＩＴＲ配列は、導入遺伝子とともにｒＡＡＶゲノムの一部として残存している。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」は、遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質またはレポータータンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列、及び標的細胞での遺伝子産物の発現のための調節因子を指す。

【0040】

「空カプシド」及び「空粒子」は、ＡＡＶカプシドシェルを有するが、導入遺伝子配列と１つまたは２つのＩＴＲとを含む組換えＡＡＶゲノム全体または一部が欠失している、ＡＡＶ粒子を指す。そのような空カプシドは、導入遺伝子を１つ以上の標的細胞内に導入する機能を有しない。実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、空ＡＡＶ粒子から分離される。

【0041】

ｒＡＡＶゲノム（例えば、ＩＴＲを含む）は、同一の株もしくは血清型（または、サブグループもしくはバリアント）に基づいていてよく、またはそれらが互いに異なっていてもよい。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムに基づく、ｒＡＡＶプラスミド、またはベクターゲノムもしくは粒子（カプシド）は、ベクターゲノムをパッケージングする１つ以上のカプシドタンパク質と同一であってもよい。さらに、ｒＡＡＶゲノムは、ｒＡＡＶベクターゲノムをパッケージングする１つ以上のカプシドタンパク質とは異なる、ＡＡＶゲノムから誘導してもよい（例えば、ＡＡＶ２ゲノムから誘導される、１つ以上のＩＴＲを含む）。

【0042】

本明細書に開示されている方法によって産生、単離、精製、及び濃縮されてもよいｒＡＡＶベクターとしては、任意のＡＡＶ株または血清型に由来するカプシド及びゲノムを含む、任意のｒＡＡＶベクターが挙げられる。非限定的な例として、ｒＡＡＶベクターカプシド及び／またはゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＰＨＰ－５、ＡＡＶ－ＰＨＰ－Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ－ｅＢ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ９－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）などに基づいてもよい。実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、同一のＡＡＶ株または血清型に由来するゲノム及びカプシドタンパク質を含む。例えば、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ２ベクター（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）であってもよい。

【0043】

実施形態では、ＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲ、及び異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を含む、偽型ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、偽型ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ２／５（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）、ｒＡＡＶ２／８（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）、ｒＡＡＶ２／９（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ｒＡＡＶ２／１０（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１０カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）である。実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２バリアントｒＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ（ＷＯ２０１７／２１８８４２からの配列番号４４、参照により本明細書に組み込まれる）などのバリアントＡＡＶカプシドである、カプシドタンパク質を含む。

【0044】

ｒＡＡＶの生成方法
上記で説明したように、ｒＡＡＶ精製及び濃縮方法は、任意の適切な生成方法によって得られるまたは生成されるｒＡＡＶの完全カプシド及び空カプシドを含む溶液（例えば、溶解物、溶離液）に適用され得る。ｒＡＡＶを生成する方法は、当該技術分野でよく知られている。一般に、方法は、プロデューサー細胞を拡大させることと、プロデューサー細胞にｒＡＡＶベクター、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ、ならびにヘルパー遺伝子の核酸配列を導入することと、形質導入されたプロデューサー細胞を、ｒＡＡＶ粒子が産生されるような条件下で培養することと、ｒＡＡＶ粒子を単離することと、を含む。ｒＡＡＶを生成させる方法の特定の実施形態を、以下に詳細に記載する。

【0045】

細胞株
ｒＡＡＶベクター産生方法は、一般的に、例えば、（ｉ）ｒＡＡＶ産生のための許容宿主細胞（プロデューサー細胞）、（ｉｉ）例えば、アデノウイルスヘルパー機能を提供する遺伝子を含む適切なコンストラクトによって供給され得る、ヘルパーウイルス機能、（ｉｉｉ）トランスパッケージングｒｅｐ／ｃａｐコンストラクト、及び（ｉｖ）適切な産生培地を含む、特定の要素を必要とする。

【0046】

プロデューサー細胞は、ｒＡＡＶゲノム産生コンストラクト、ヘルパー機能コンストラクト、及びＡＡＶ機能（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐの発現）を提供するコンストラクトが存在する場合に、ｒＡＡＶを産生するための許容宿主細胞である、任意の細胞である。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫も含まれてもよい。したがって、プロデューサー細胞はまた、外来性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた宿主細胞、またはそのＤＮＡ配列が宿主細胞ゲノムに組み込まれた宿主細胞の子孫である。単一の親細胞の子孫は、自然的、偶発的、または意図的な変異のために、形態、またはゲノムＤＮＡ相補体もしくは総ＤＮＡ相補体において、元の親と必ずしも完全に同一である必要はないことが、理解される。

【0047】

実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を産生するために使用される細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、及びＨｅＬａ細胞を含む、哺乳動物細胞である。例示的なプロデューサー／宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３などの、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、懸濁培養に適合したＨＥＫ２９３細胞を含む、懸濁液中での増殖のために適合される。さらに好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、無血清培地中での増殖のために適合される。実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、シェーカーフラスコ、スピナーフラスコ、細胞バッグ、またはバイオリアクタの、１つ以上であってもよい、少なくとも１つの培養容器内で増加する。

【0048】

本明細書に開示されるｒＡＡＶの産生、単離、精製、及び濃縮の方法で使用されてもよい、プロデューサー細胞株としては、哺乳動物または昆虫細胞株が挙げられる。「細胞株」という用語は、適切な培養条件下で、インビトロで、連続的または長期の増殖及び分裂が可能な細胞集団を指す。細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。細胞株では、このようなクローン集団の保存または移動の間、ならびに組織培養における長期の継代の間、核型において、自発的または誘発される変化が生じてもよい。したがって、細胞株に由来する子孫細胞は、先祖細胞または培養物と、正確に同一ではなくてもよい。

【0049】

ｒＡＡＶ産生を行うためには、プロデューサー細胞株は、ｒＡＡＶゲノム産生コンストラクト、ヘルパー機能コンストラクト、及び／またはＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐコンストラクトの１つ以上が、プロデューサー細胞内に存在することが必要となる場合がある。これらは、３つのコンストラクト（例えば、３つのプラスミド）として導入されてもよく、またはプロデューサー細胞は、これらの機能の一部または全てを安定的にプロデューサー細胞ゲノムに組み込む、１つ以上のコンストラクトを既に有していてもよい。実施形態では、１つ以上のヘルパー遺伝子には、１つ以上のアデノウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルス１型遺伝子、またはバキュロウイルス遺伝子の、全部または一部が含まれてもよい。本明細書で使用される場合、細胞に関する「安定した」または「安定的に組み込まれた」という用語は、選択可能なマーカー、及び／または異種核酸配列などの核酸配列、またはプラスミドもしくはベクター（もしくは、その一部）が、（例えば、相同組換え、非相同末端結合、トランスフェクションなどによって）染色体に挿入されているか、または染色体外でレシピエント細胞もしくは宿主生物に保持されており、染色体内に残存していたか、もしくは染色体外に一定時間保持されていることを、意味する。

【0050】

プロデューサー細胞株の拡大
本明細書に記載の方法の実施形態では、（ｒＡＡＶゲノムを含む）ｒＡＡＶゲノム産生コンストラクト、及び／またはヘルパーウイルス機能及びＡＡＶ機能を提供する他のコンストラクトを導入するステップの前に、拡大段階または拡大ステップを使用して、プロデューサー細胞の数を増加させる。拡大段階または拡大ステップを、１つ以上の細胞培養容器において実施してもよい。例えば、拡大段階または拡大ステップを、体積が増加する一連の細胞培養容器において実施してもよい。プロデューサー細胞株の拡大に使用される細胞培養培地は、プロデューサー細胞の増殖（すなわち、数の増加）に適切な、任意の培地であってもよい。好ましい実施形態では、拡大段階培養培地は動物成分を含まず、例えば、動物由来の血清または他の成分を含まない。既知組成の、動物成分を含まない培地は、市販されている。

【0051】

実施形態では、本明細書では時に抗凝集剤（ＡＣＡ）と呼ばれる、抗凝集補助剤が、細胞凝集を低減するために拡大培地に添加される。ＡＣＡは、例えば、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から市販されている。抗凝集補助剤は、１つ以上の時点で、拡大段階培養培地に添加されてもよい。実施形態では、抗凝集補助剤としては、デキストラン硫酸、ヘパリン、及び／またはプロデューサー細胞の凝集を抑制する他の硫酸化グリコサミノグリカンが挙げられる。実施形態では、抗凝集補助剤は、約２５μｇ／ｍｌ～約２５０μｇ／ｍｌ、例えば、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、及び／または約２００μｇ／ｍｌの濃度に培地に添加されてもよい、ヘパリンナトリウムを含む。

【0052】

実施形態では、拡大段階培養培地は、約２ｍＭ～約６ｍＭ（例えば、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、または約６ｍＭ）の濃度の、グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上を含み、及び／またはこれらを含むように補充される。グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上は、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン、グルタミン酸塩、グリシル－Ｌ－グルタミン、グルタミンタンパク質加水分解物、Ｌ－グルタミン酸、及びグルタミンジペプチドの、１つ以上であってもよい。ジペプチドＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンとして提供されるグルタミン補充剤の、市販されている例は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）である。

【0053】

実施形態では、拡大段階培養培地は、非イオン性ポリオール界面活性剤、例えば、ポロキサマー１８８（ポリエチレンとポリプロピレンエーテルグリコールのコポリマー）を含み、及び／またはこれを含むように補充される。実施形態では、非イオン性ポリオール界面活性剤は、拡大段階培養培地中に、約０．０５％～約０．２％（ｗ：ｖ）（例えば、約０．０５％、約０．１％、約０．１％、または約０．２％）で存在する。実施形態では、拡大段階培養培地は、約４ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、及び０．１％（ｗ：ｖ）のポロキサマー１８８を含む。

【0054】

実施形態では、拡大段階培養培地のｐＨは、約７．１～約７．５（例えば、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、または約７．５）のｐＨで維持される。実施形態では、ｐＨは、ＣＯ_２スパージングによって、約７．２～約７．４で維持される。実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトを細胞内に導入する前に、培養培地のｐＨを約６．９に変化させ、ＣＯ_２スパージングを停止させる。

【0055】

１つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトの導入
ｒＡＡＶベクターの産生は、典型的には、基本的な生合成機構を提供するプロデューサー細胞株、ならびに（ｉ）ｒＡＡＶゲノム（目的の導入遺伝子及びＡＡＶ ＩＴＲに隣接する関連する調節因子）を提供するコンストラクト、及び（ｉｉ）ｒＡＡＶベクター産生を指示するのに必要な遺伝子産物を提供する追加の遺伝子を含む１つ以上のコンストラクト、を必要とする。これらの追加の遺伝子としては、ベクターゲノムの複製及びパッケージングを支援するのに必要な、ＡＡＶ由来の遺伝子（例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ）、ならびにヘルパーウイルス由来の遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ）が挙げられる。

【0056】

「ヘルパーウイルス遺伝子」または「ヘルパーウイルス由来の遺伝子」とは、ＡＡＶが複製のために非ＡＡＶ由来のウイルス遺伝子の遺伝子産物に依存している、非ＡＡＶ由来のウイルス遺伝子を指す。この用語としては、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶのｍＲＮＡスプライシング、及びＡＡＶのＤＮＡ複製に関与するものを含む、ＡＡＶ複製において必要なタンパク質及び／またはＲＮＡが挙げられる。ヘルパーウイルス遺伝子は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスなどの、既知のＡＡＶヘルパーウイルスのいずれかに由来してもよい。したがって、「ヘルパーウイルス機能」は、ＡＡＶ産生に必要なヘルパーウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ）によって提供されるこれらの機能を指す。これらのヘルパーウイルス機能は、プロデューサー細胞内に導入された１つ以上のベクター上で提供されてもよく、安定的にプロデューサー細胞によって発現してもよく、あるいは両者の組合せとしてもよい。

【0057】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ機能」または「ＡＡＶアクセサリ機能」は、産生的ＡＡＶ複製及びパッケージングのために、トランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために、プロデューサー細胞で発現され得るＡＡＶ由来のコード配列を指す。したがって、ＡＡＶ機能としては、ｒｅｐ及びｃａｐを含むＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、特定のＡＡＶ血清型のａａｐなどの他のものとが含まれる。このようなＡＡＶ機能は、１つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトによって提供されており、これは、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、またはＡＡＶヘルパー機能を提供する、プロデューサー細胞の染色体に組み込まれたポリヌクレオチドコンストラクトであってもよい。本明細書に開示された方法で使用されてもよいＡＡＶ機能を提供するプラスミドは、市販されている。

【0058】

本方法の実施形態では、１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子は、プロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）によって構成的に発現され、一方、他のヘルパーウイルス遺伝子は、例えば、ＡＡＶ産生に必要な残りのヘルパーウイルス遺伝子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトのトランスフェクションによって、プロデューサー細胞内に導入される。ＡＡＶ由来の遺伝子（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）は、１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む同一のポリヌクレオチドコンストラクト中に含まれてもよく、別々のポリヌクレオチドコンストラクト上に含まれてもよい。ｒＡＡＶゲノムを提供するかコードするポリヌクレオチドコンストラクト（例えば、ｒＡＡＶゲノム産生ベクター）がプロデューサー細胞株に導入された後に、ｒＡＡＶ粒子が生成される。実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、（ｉ）ｒＡＡＶゲノム産生ベクターと、（ｉｉ）ヘルパーウイルス遺伝子（例えば、Ｅ４、Ｅ２ａ、及びＶＡ）ならびにＡＡＶ遺伝子（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）を提供する１つ以上のベクターとを、プロデューサー細胞に一過的にトランスフェクトした後に産生される。実施形態では、これらのベクターは、プラスミドである。

【0059】

本明細書に開示された方法の実施形態では、拡大段階に続いて、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を含む第１のポリヌクレオチドコンストラクトと、ヘルパーウイルス遺伝子及びＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む第２のポリヌクレオチドコンストラクトとが、拡大されたプロデューサー細胞内に導入される。第１のポリヌクレオチドコンストラクト及び第２のポリヌクレオチドコンストラクトがプラスミドである場合、この系は、２プラスミド系と呼ばれてもよい。

【0060】

本明細書に開示された方法の実施形態では、拡大段階に続いて、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を含む第１のポリヌクレオチドコンストラクトと、ヘルパーウイルス遺伝子を含む第２のポリヌクレオチドコンストラクトと、なＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子とを含む第３のポリヌクレオチドコンストラクトとが、拡大されたプロデューサー細胞内に導入される。第１のポリヌクレオチドコンストラクト、第２のポリヌクレオチドコンストラクト、及び第３のポリヌクレオチドコンストラクトがプラスミドである場合、この系は、３プラスミド系と呼ばれてもよい。

【0061】

１つ以上の組換えプラスミドを使用してｒＡＡＶベクターを産生する場合、「ｒＡＡＶゲノム産生プラスミド」は、導入遺伝子（調節配列に作動可能に連結されている）、及びｒＡＡＶへのパッケージングを意図した１つ以上のＩＴＲ、ならびにプラスミドのクローニング及び増幅に重要であるが、ｒＡＡＶベクターにパッケージングまたはカプシド化されない非ｒＡＡＶゲノム成分（プラスミド骨格）を含むプラスミドを指す。本明細書で使用される場合、「コンストラクト」という用語は、プラスミドであり得る組み換えポリヌクレオチドコンストラクト（すなわち、異なる供給源に由来するエレメントを有するポリヌクレオチド）を指す。

【0062】

「導入」及び「トランスフェクト」という用語は、宿主細胞または標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を指す。実施形態では、宿主細胞は、プロデューサー細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である。実施形態では、ｒＡＡＶゲノム産生プラスミドは、ヘルパーウイルス機能及びＡＡＶ機能を提供する１つ以上のプラスミドと一緒に、一過性トランスフェクション法によってプロデューサー細胞内に導入される。導入遺伝子及びＩＴＲ（複数可）を含む第１のポリヌクレオチドコンストラクト（例えば、ｒＡＡＶゲノム産生ベクター）と、任意選択の、ＡＡＶ機能（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）及びヘルパーウイルス機能を提供する、第２のポリヌクレオチドコンストラクト、及び／または第３のポリヌクレオチドコンストラクトを導入する、プロデューサー細胞の一過性トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム共沈、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション、及びカチオン性ポリマーベースのトランスフェクションを含む、標準的なトランスフェクション法によって達成されてもよい。カチオン性脂質ベースのトランスフェクションとしては、例えば、リポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ（２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンジニウムトリフルオロアセート）とＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）の、３：１混合物）が挙げられる。カチオン性ポリマーベースのトランスフェクションとしては、例えば、直鎖状、及び／または分枝鎖状の、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－アルギニン、及びポリアミドアミンデンドリマーなどが挙げられる。実施形態では、プロデューサー細胞の一過性トランスフェクションは、ＰＥＩベースのトランスフェクション試薬を使用して行われる。ＰＥＩは、直鎖状または分枝鎖状のポリマーであってもよい。実施形態では、ＰＥＩは、２０～２５ｋＤの直鎖状ＰＥＩである。例えば、実施形態では、ＰＥＩは、ｊｅｔＰＥＩまたはＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓから入手可能）である。加えて、プロデューサー細胞の一過性トランスフェクションを、カチオン性脂質とカチオン性ポリマーとの両方を含むトランスフェクション試薬を使用して行ってもよい。

【0063】

ｒＡＡＶは、代替的には、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞（例えば、ｓｆ９細胞）内で、またはＨＳＶ感染ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＢＨＫ２１）内で、産生されてもよい。いずれの方法でも、ｒＡＡＶ産生は、ｒＡＡＶゲノム、１つ以上のＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ、ならびにｒＡＡＶ複製及びパッケージングに必要なヘルパーウイルス機能を保有する２つ以上の組換えウイルスの同時感染によって、宿主細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞内のぞれぞれで誘発される。

【0064】

ｒＡＡＶ粒子の産生
一般的に、産生段階（産生ステップとも呼ばれる）は、ｒＡＡＶゲノムベクター、及び／またはヘルパーウイルス機能及び／またはＡＡＶ機能を提供するベクターを、プロデューサー細胞内に導入するステップの後に続く。実施形態では、ｒＡＡＶゲノムベクターの導入後、少なくとも約４８時間（例えば、４７．５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９６．５、または９７時間）にわたり細胞を培養することによって、ｒＡＡＶ粒子を産生する。実施形態では、トランスフェクトされたプロデューサー細胞を、約７２～約１００時間、約９０時間～約１００時間、約９２時間～約９８時間、または約９４～約９８時間培養する（すなわち、産生段階を維持する）。実施形態では、産生段階は、約９６時間維持される。

【0065】

産生段階培地は、プロデューサー細胞におけるｒＡＡＶの産生に適切な、任意の細胞培養培地であってもよい。実施形態では、産生培地は、血清などの動物性産物を含まない。この文脈において「含まない」とは、培地が、血清などの動物性産物の検出不可能なレベルを有することを意味する。実施形態では、産生培地のｐＨは、拡大段階培地のｐＨと比較して低下している。実施形態では、産生培地は、約６．８～約７．４（例えば、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、または約７．１４）のｐＨで維持される。実施形態では、ｐＨは、約６．９～約７．３で維持される。

【0066】

本方法の実施形態では、産生段階は、産生段階細胞培養培地へのカルシウムイオンの添加を含む。本明細書ではカルシウム補充とも呼ばれる、産生培地にカルシウムイオンを添加することは、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）をカルシウム塩、例えば、ＣａＣｌ_２の形態で添加することを含む。カルシウムイオンは、産生段階中、ｒＡＡＶゲノムベクターの導入後（例えば、トランスフェクション後）に１回以上添加されてもよい。例えば、カルシウムイオンは、産生段階開始から（すなわち、トランスフェクション後）、約０時間～約４８時間、例えば、約１時間、約６時間、約１０時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、及び／または約４８時間で１回以上添加されてもよい。

【0067】

培養培地中のカルシウムイオンの総濃度が、０．３ｍＭ超～１０ｍＭ未満となるように、カルシウムイオン（例えば、ＣａＣｌ_２）を産生培地に添加してもよい。実施形態では、カルシウムイオンは、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約１ｍＭ～約８ｍＭ、約１ｍＭ～約７ｍＭ、約２ｍＭ～約９ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約２ｍＭ～約７ｍＭ、約２ｍＭ～約６ｍＭ、約２ｍ～約５ｍＭ、または約２ｍＭ～約４ｍＭの総濃度まで添加される。

【0068】

実施形態では、産生段階は、グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上を、産生段階培地に添加することを含む。グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上は、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン、グルタミン酸塩、グリシル－Ｌ－グルタミン、グルタミンタンパク質加水分解物、Ｌ－グルタミン酸、及びグルタミンジペプチドの、１つ以上であってもよい。グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの少なくとも１つを含む溶液は、例えば、トランスフェクション後、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、または約７２時間の１つ以上で、産生段階培地に添加されてもよい。

【0069】

実施形態では、産生段階は、ソルビトールを産生段階培地に添加することを含む。ソルビトールは、産生段階の間の１つ以上の時点で、例えば、トランスフェクション後、約６時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、及び／または約４８時間で、産生段階培地に添加されてもよい。実施形態では、ソルビトールは、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約８０ｍＭ～約１２０ｍＭの濃度、あで、産生培地に添加される。実施形態では、ソルビトールは、約１００ｍＭの濃度まで、産生培地に添加される。

【0070】

実施形態では、産生段階は、抗凝集補助剤を産生段階培地に添加することを含む。抗凝集補助剤は、１つ以上の時点で（例えば、トランスフェクション後、約６時間、約１０時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、約４８時間、または約７２時間の１つ以上で）、産生段階培養培地に添加されてもよい。実施形態では、抗凝集補助剤としては、デキストラン硫酸、ヘパリン、及び／またはプロデューサー細胞の凝集を抑制する他の硫酸化グリコサミノグリカンが挙げられる。実施形態では、抗凝集補助剤は、約２５μｇ／ｍｌ～約２５０μｇ／ｍｌ、例えば、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、及び／または約２００μｇ／ｍｌの濃度に培地に添加されてもよい、ヘパリンナトリウムを含む。

【0071】

実施形態では、抗凝集補助剤は、産生段階培地に添加されないか、または産生段階の終了直前に、例えば、産生段階の終了の、約２４時間以内、約１２時間以内、約６時間以内、約３時間以内、約２時間以内、または約１時間以内にのみ、産生段階培地に添加される。

【0072】

ｒＡＡＶの単離及び精製
本明細書に記載される方法の実施形態は、産生段階の終了時にｒＡＡＶ粒子（ｒＡＡＶ完全カプシド）を単離及び精製することを含む。実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクター、及び／またはヘルパー機能、及び／またはＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列の導入後（換言すると産生段階の開始後）、４８時間以上（例えば、４７．５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９６．５、９７時間）で、単離されてもよい。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクター、及び／またはヘルパー機能、及び／またはＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列の導入後、約９０～約１００時間、約９２時間～約９８時間、または約９４～約９８時間で、単離されてもよい。実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶベクター、及び／またはヘルパー機能及び／またはＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列の導入後、約９６時間で単離される（例えば、細胞が溶解される）。ｒＡＡＶを単離することは、例えば、プロデューサー細胞を溶解して細胞溶解物を得るステップ、溶解物を清澄化して清澄化された溶解物を得るステップ、及び後続する精製ステップを含む、複数のステップを含んでもよい。

【0073】

ｒＡＡＶ粒子は、生成後にプロデューサー細胞内に保持されてもよく、細胞内ｒＡＡＶベクターを放出する方法は、物理的破壊及び化学的破壊、例えば、洗浄剤の使用、マイクロ流動化、及び／またはホモジナイズを含む。実施形態では、細胞からの細胞膜破壊（溶解）及びｒＡＡＶまたはＡＡＶの粒子の放出（回収）は、両性洗浄剤Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラデシルアミンＮ－オキシド（ＴＤＡＯ）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡからＤｅｖｉｒｏｎ（登録商標）Ｃ１６として市販されている）を使用して達成される。例えば、ｒＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ｒＡＡＶ２、またはＡＡＶ２粒子を回収する場合、約０．１％～約０．５％（例えば、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．５１％）のＤｅｖｉｒｏｎ（登録商標）Ｃ１６を使用することができる。他の実施形態では、高浸透圧ショック（外部容積モル濃度の増加）を使用して、細胞を溶解させ、ｒＡＡＶまたはＡＡＶの粒子を放出する。例えば、ｒＡＡＶ８またはＡＡＶ８の粒子を回収する場合、プロデューサー細胞は、約９０～約１２０分（例えば、約８９、９０、９５、１００、１０５、１１５、１２０、１２１分）のインキュベーション持続時間で約４００ｍＭ（例えば、約３９９、４００、４０１ｍＭ）のＮａＣｌ濃度の高浸透圧ショックに供され得る。細胞溶解の間同時に、及び／または細胞溶解の後、混入しているＤＮＡを分解するために、ベンゾナーゼのようなヌクレアーゼが添加されてもよい。典型的には、得られた溶解物を清澄化することで、細胞残屑が除去され、清澄化された細胞溶解物が提供される。実施形態では、清澄化された溶解物は、本明細書に記載されるような完全カプシドを空カプシドから分離するために、弱分配モードでＡＥＸに供される。

【実施例】

【0074】

実施例１．高い空ＡＡＶカプシドの除去及び生成物収量を提供するための弱分配モードでの陰イオン交換クロマトグラフィーの使用
ＡＡＶ－ＡＱＰ１（ＡＡＶ２）の完全カプシド濃縮を最大化するために陰イオン交換ステップを開発した。完全カプシドと空カプシドの特性が類似しているため、生成物の収率と完全カプシド比との間にトレードオフがもたらされ、最適な条件を選択することが困難となった。異なる界面活性剤のタイプ及び濃度でスクリーニングを行い、ＡＡＶ２ベクターの産物収量を最大化した。設計空間を探索することで、結合及び溶離モードの代替として弱分配モードが同定され（図１、２）、フロースルーのみにおける空カプシドの５０％超の除去を達成する条件が特定された。高ＮａＣｌ洗浄と組み合わせて、８０％超の完全カプシドを有する溶離液が達成された。これらの結果は、分析超遠心分離（ＡＵＣ）で確認した場合に８０％超の完全カプシド比、及び５０％超の生成物収率が、本明細書に記載の新規条件を使用して堅牢に達成され得ることを示す。設計空間を理解し、プロセスの失敗点を特定することは、プロセスが製造規模で再現可能であることを意味した。

【0075】

最初の実験設計では、さらなる最適化のためのパラメータ及び範囲を、初期のＡＥＸプラットフォーム適合実験から特定した。これらを表１に列挙する。

【0076】

【表1】

【0077】

洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度（ｍＭ）と、（ｉ）空カプシドの除去、（ｉｉ）溶離液中の完全カプシドの比率、及び（ｉｉｉ）溶離液中のＶＧ回収率との関係を分析した。結果を図３～５に示す。所望の結果に沿って、設計空間内の最適な領域を強調するために組み合わされた実験計画法（ＤＯＥ）の結果（図６）。洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度に基づく最適領域からのパラメータ及び値を表２に示す：

【0078】

【表2】

【0079】

ロード比が弱分配にどのように影響するかを理解するために、ロード比と完全カプシド（ＶＧ）及び空カプシド（ＶＰ）のブレークスルーとの関係を分析した。結果（図７）は、弱分配の効果が、ロード比を増加させることによって最大化されることを示した。パラメータ及び値を表３に示す：

【0080】

【表3】

【0081】

図７を参照すると、機会の窓の利用により、空カプシドの最大８０％が通過するが、完全カプシドの１０％のみがフロースルーで失われる。

【0082】

知見を照合すると、図３に示す結果から、空カプシドを最大に除去するには、洗浄２と溶離の両方で高ＮａＣｌ濃度が必要であることが示された。洗浄２のＮａＣｌを増加させると、最大３０％のＶＧ損失が生じた。５０％のＶＧ回収率が溶離段階において依然として回収された。パラメータ及び最適化された範囲を表４に示す：

【0083】

【表4】

【0084】

２Ｌスケールでの最適化されたＡＡＶ－ＡＱＰ１ ＡＥＸステップのクロマトグラムを図８に示し、反転（カプシド化ＤＮＡの存在によって典型的に高い完全カプシドを示す２６０ｎｍ及び２８０ｎｍのＵＶ吸光度トレースの反転）により強調表示された８０％の完全カプシド比に留意されたい。パラメータ及び値を表５に示す：

【0085】

【表5】

【0086】

図９に示すように、このプロセスは、ＶＧ回収率と完全カプシド比との両方について、２Ｌから８０Ｌまで拡大可能である。

【0087】

実施例２：完全カプシドの濃縮及び収量増加のためのＡＥＸ弱分配プロトコール
以下に記載する実験は、本明細書に記載のｒＡＡＶ精製方法が、完全カプシド比及びＶＧ回収率に関して一貫していることを実証し、このプロセスが拡大可能であることを示している。

【0088】

材料
ＡＡＶ供給材料
本試験に記載する実験用の供給材料は、アクアポリン１遺伝子をコードする導入遺伝子がパッケージされた血清型２のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドからなるものであった。

【0089】

これらのカプシドは、三重プラスミド複合体で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用した細胞培養によって産生された。細胞培養の生産段階の完了後、細胞をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用して溶解してＡＡＶを放出させ、得られた溶解物をベンゾナーゼで処理した。次いで、０．２μｍのＰＥＳフィルターを使用して溶解物を清澄化した。

【0090】

ＡＡＶＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）アフィニティークロマトグラフィー樹脂及びＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ（Ｃｙｔｉｖａ）クロマトグラフィーシステムを使用して、ＡＡＶカプシドの初期精製を行った。この精製は、清澄化した溶解物をＡＡＶＸ樹脂１ｍＬ当たり清澄化溶解物２００ｍＬのロード比及び滞留時間１分でベッド高５ｃｍのＡＡＶＸカラムにロードすることによって行った。捕捉されたＡＡＶカプシドを、５０ｍＭのグリシン、１８０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０からなる溶離緩衝液（ｐＨ２．７）を使用して溶離した。

【0091】

化学物質
これらの実験で使用したすべての化学物質は、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡから購入したＧＭＰ（医薬品製造管理及び品質管理基準）グレードの試薬であった。

【0092】

方法
陰イオン交換クロマトグラフィー
すべての小規模陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）実験を、１ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ （Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）ＡＥＸ膜及びＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ（Ｃｙｔｉｖａ）クロマトグラフィーシステムを使用して行った。

【0093】

これらの実験用の緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．７５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ９、及び実験の段階で必要とされる様々な濃度のＮａＣｌからなっていた。これらの実験用の供給は、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．７５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ９．０で目標ＮａＣｌ濃度に希釈することによってコンディショニングしたＡＡＶＸ溶離液であった。表６に、本試験でＡＥＸ実験に使用した方法を記載する。

【0094】

【表6】

【0095】

実験の設計
ＤｏＥ試験を実施して、完全カプシド比及びベクターゲノム（ＶＧ）回収率に対するロード、洗浄段階、及び溶離段階のＮａＣｌ濃度、ならびにロード比の影響を評価した。本試験は１６回の実験で構成され、それぞれの実験で試験したパラメータ値を表７に記載する。フロースルー、洗浄２、及び溶離液の試料をそれぞれの実行から収集し、それらのベクターゲノム及びベクター粒子の濃度を分析した。

【0096】

【表7】

【0097】

ブレークスルー実験
ＡＥＸプロセスに対するロード比の影響をさらに評価するために、ブレークスルー実験を行った。ＮａＣｌ濃度９０ｍＭにコンディショニングした供給で、ＡＥＸ膜を１×１０^１５ＶＧ／ｍＬのロード比にロードした。フロースルーを１ｍＬ画分に分画し、得られた画分を分析して、それらのＶＧ及びＶＰの濃度を決定した。

【0098】

確認及びスケールアップ実験
１０ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑモジュールで精製を実施することにより、最適化されたプロセスを確認した。この実行に使用した方法を表８に詳述する。フロースルー、カラム洗浄２、及び溶離液の試料を、それらのＶＧ及びＶＰの濃度について分析した。さらに、溶離液の試料を分析的超遠心分離及びｑＰＣＲによって分析して、完全カプシド比及びＶＧ回収率を確認した。

【0099】

【表8】

【0100】

拡大可能性を実証するために、プロセスを７５ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ膜にスケールアップした。この実行は、表８に詳述した同じ方法を使用して実施し、溶離液の試料を分析的超遠心分離及びｑＰＣＲによって分析して、その完全カプシド比及びＶＧ回収率を決定した。

【0101】

分析方法
本試験で作製した試料中のベクターゲノム濃度を、ＡＱＰ１導入遺伝子の領域に特異的なプライマー及びプローブを使用したｑＰＣＲによって決定した。ベクター粒子濃度は、Ｇｙｒｏｌａｂ（登録商標）ＡＡＶＸ Ｔｉｔｅｒキット（Ｇｙｒｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して決定した。

【0102】

ＤｏＥ及びブレークスルー実験の間、空カプシド比は、ベクターゲノム濃度をベクター粒子濃度で割ることによって推定した。確認及びスケールアップ実験では、完全カプシド比を、Ｏｐｔｉｍａ ＡＵＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用した分析超遠心分離によって測定した。

【0103】

結果
ＤｏＥ
ＡＥＸプロセスの設計空間を、完全カプシド比及びＶＧ回収率を最大化する条件を特定することを目的とした実験計画法を行うことにより調査した。本研究において調査した変数は、供給のＮａＣｌ濃度、洗浄２のＮａＣｌ濃度、溶離のＮａＣｌ濃度、及びロード比であった。これらの変数について試験した範囲を表９に詳述する。これらの実験の結果を表１０に詳述する一方、このデータセットで観察された傾向を図３、図４、及び図５に示す。

【0104】

【表9】

【0105】

【表10-1】

【0106】

【表10-2】

【0107】

これらの実験用の供給は、推定完全カプシド率が１０％未満であった。表１０は、試験した条件のいくつかで、推定全カプシド比が有意に増加した（最大８７％）ことを示す。図３は、高い当量／供給及び洗浄２のＮａＣｌ濃度が、溶離液プール中の空カプシドの減少をもたらすことを示している。これは、供給中のＮａＣｌ濃度が高いほど、空カプシドがＡＥＸ膜に結合することが妨げられるためである。同様に、カラム洗浄２中のＮａＣｌ濃度が高いと、この段階で空カプシドが溶離され、後の溶離液プールからそれらが除去される。

【0108】

図４は、これらの効果が、溶離液プールにおいてより高い完全カプシド比にどのように転換されるかを示す。空カプシドが結合することが防止されるか、またはカラムから洗浄されると、得られる溶離液プールは、高い完全カプシド比を有する。供給及びカラム洗浄２のＮａＣｌ濃度を増加させることの影響を図５に示す。完全カプシドのＡＥＸ膜との相互作用がより強いにもかかわらず、これらの完全カプシドの一部は、供給及び洗浄２のＮａＣｌ濃度が増加して、これらの相互作用を妨害するため、フロースルー及び洗浄水に失われる。図６は、これらの実験で見られる傾向を組み合わせて、高い完全カプシド比及び高いＶＧ回収率が達成され得る領域を強調する。

【0109】

ブレークスルー実験
上記のＤｏＥ研究では、空カプシドが供給の高いＮａＣｌ濃度でＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ ＡＥＸ膜に結合せずに膜を通過することが観察された。この影響を、ブレークスルー実験を行うことによってさらに調査した。この実験は、この効果を最大化するように９５ｍＭの供給のＮａＣｌ濃度で実施し、カプシドがフロースルーに確実にブレークスルーするように膜に１×１０^１５ＶＧ／ｍＬをロードした。

【0110】

フロースルーの試料を分析して、それらのＶＧ及びＶＰ濃度を決定した。その結果を図１０に示す。これらの結果は、これらの供給条件下で、ベクター粒子が実験開始のほぼ直後にブレークスルーし始めることを示している。しかしながら、ベクターゲノムは、約２．５×１０^１４ＶＧ／ｍＬのロード比までブレークスルーしないので、ブレークスルーするベクター粒子は、空カプシドであると結論付けることができる。

【0111】

これらの結果はまた、ベクターゲノムが段階的なブレークスルーを経ることを示している。典型的には、鋭いブレークスループロファイルが予想され、これは、クロマトグラフィーマトリックスが飽和に達したことを示す。しかしながら、この段階的なブレークスルーは、弱分配が行われている可能性があることを示している。弱分配の下では、完全カプシドは、完全カプシドが膜と有するより強い荷電相互作用に起因して、クロマトグラフィー膜に結合した空カプシドを置換し始める。これは、最終的に膜から溶離される生成物の完全カプシド比をさらに増加させるという利点を有する。

【0112】

確認実行及びスケールアップ
特定したプロセス条件は、１０ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑを使用してより大規模で実行を行うことによって確認し、プロセス条件を表８に詳述する。カラム洗浄２及び溶離の段階に焦点を当てた、この実行のクロマトグラムの抜粋を図１１に示す。この図は、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍのＵＶ吸光度トレースの反転を示し、これは典型的には、カプシド化ＤＮＡの存在に起因する高い完全カプシド比を示す。この実行からの溶離液を分析超遠心分離によって分析して、完全カプシドの比率を確認した。完全カプシド比は、供給中の３１％から溶離液中の８１．５％に増加することが分かった。溶離液の対応するＡＵＣトレースを図１２に示す。

【0113】

プロセスの拡大可能性を確認するために、７５ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑでさらなる実行を行った。１０ｍＬと７５ｍＬの実行の結果を図９で比較する。この図は、このプロセスが完全カプシド比及びＶＧ回収率に関して一貫していることを示し、このプロセスが拡大可能であることを示している。

【0114】

実施例３． 初期ＡＥＸプラットフォーム及び追加の実験からのパラメータ及び範囲の特定
プラットフォーム適合実験を行った。図１３には、初期のＡＥＸクロマトグラフィーランスルーのクロマトグラムを示す。ＡＥＸステップで使用した条件を以下に示す：

【0115】

【表11】

【0116】

以下の表１１に示すパラメータ及び範囲は、初期のＡＥＸプラットフォーム適合実験から特定した（図１３）。これらの初期実験は、図１９において「初期プロセス」と称され、これは、初期プロセスにおけるＵＳＰ、捕捉クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、及びタンジェント流濾過（ＴＦＦ）のそれぞれ後のＶＧ回収率及び完全カプシド％値を示す。これらの値を、本明細書に記載の本発明の最適化プロセス（図１９の「最終プロセス」を参照されたい）から得られた値と比較する。

【0117】

【表12】

【0118】

パラメータと溶離液中の空カプシド、完全カプシド、及びＶＧ回収％との間の以下の関係について図３～５を参照されたい：
・ 図３：洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度（ｍＭ）と、溶離液中に存在する空カプシド（ＶＰ／ｍＬ）との関係
・ 図４：洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度（ｍＭ）と、溶離液中の完全カプシド比（％）との関係
・ 図５：洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度（ｍＭ）と、溶離液中のＶＧ回収率（％）との関係

【0119】

図６：図１～３の洗浄２及び当量／供給のＮａＣｌ濃度（ｍＭ）に基づく最適領域を示す。図及び２は、形成された環境により、空カプシドが完全カプシドに置き換えられる、弱分配プロセスを示す。ｐＩの上下の空ＡＡＶカプシド及び完全なＡＡＶカプシドの電荷を示す。（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ２０２２． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＡＡＶ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）．

【0120】

追加のブレークスルー実験を行って、ロード負荷を増加させるときに、異なる供給及び平衡伝導率で弱分配が異なる速度で利用されるかどうかを同定した。

【0121】

方法及び材料
実行１：伝導度９０ｍＭのＮａＣｌでの供給材料及び平衡化緩衝液。
実行２：伝導度８０ｍＭのＮａＣｌでの供給材料及び平衡化緩衝液。

【0122】

０．０８ｍＬのＳａｒｔｏｂｉｎｄ ＱにＡＡＶ－ＡＱＰ１中和ＡＡＶＸ溶離液を４Ｅ１４ＶＧ／ｍＬにロードし、フロースルー試料を分画し、ＶＧ力価についてはｑＰＣＲを、ＶＰ力価についてはＧｙｒｏｌａｂを使用して分析した。

【0123】

【表13】

【0124】

【表14】

【0125】

【表15】

【0126】

図１４から、空カプシドと完全カプシドの両方のブレークスルー曲線を計算するとき、９ｍＳ／ｃｍの目標伝導度は、空カプシドよりも完全カプシドの結合に有利に働くように見えることがわかる。カラムで何が起こっているかを検査するために、ＶＧロード負荷が４Ｅ１４ｖｇ／ｍｌに増加したときのカラム上のＶＧ濃度を調べた（図１５、上のグラフ）。ＶＧロード負荷を４Ｅ１４ＶＧ／ｍＬに増加したときのカラム上の空カプシド比を調べた（図１５、下グラフ）。カラム上の完全カプシド比への影響を決定するために、ＶＧロード負荷が増加した際のカラム上の完全カプシド比を分析した。図１６に示すように、任意の形態の洗浄または溶離ステップの前に３８％から＞５５％への増加が観察された。図１４に示したものと同様に、図１７を見ると、目標９ｍＳ／ｃｍでのロードの方が、目標８ｍＳ／ｃｍよりも高いレベルの濃縮が可能であることは明らかであり、弱分配を利用して濃縮率を最大化しようとするとき、供給及び平衡供給の伝導率が重要であることを示唆している。

【0127】

２０Ｌスケール確認実行での最適化ＡＡＶ－ＡＱＰ１ ＡＥＸステップのクロマトグラムについては図１８を参照されたい。この図に示すように、８０％の完全カプシド比が得られた。この確認実行から得たパラメータ及び値を下記表１５に示す。再び図１９を参照すると、「初期プロセス」の値と「最終プロセス」の値との差が示されている。

【0128】

【表16】

【0129】

２０Ｌ及び８０Ｌのバッチへのスケールアップに関して、２０Ｌ及び８０Ｌのバッチの完全カプシド比とＶＧ回収率との比較を図２０に示す。この図はまた、図１８の溶離ピークが８０％の完全カプシドを含んでいることを確認するＡＵＣの結果も含む。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【国際調査報告】