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- 特許業務法人 広江アソシエイツ特許事務所 (岐阜県 岐阜市)
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
【公報種別】再公表特許(A1)
(11)【国際公開番号】WO/0
(43)【国際公開日】2019年10月3日
【発行日】2021年3月25日
(54)【発明の名称】細胞内動態を改善した新規カチオン性脂質
(51)【国際特許分類】
C07D 211/22 20060101AFI20210226BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20210226BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20210226BHJP
【ＦＩ】
C07D211/22CSP
A61K48/00
A61K47/22
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】54
【出願番号】特願2020-510009(P2020-510009)
(21)【国際出願番号】PCT/0/0
(22)【国際出願日】2019年3月25日
(31)【優先権主張番号】特願2018-60764(P2018-60764)
(32)【優先日】2018年3月27日
(33)【優先権主張国】JP
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000004341
【氏名又は名称】日油株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】304021831
【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】中井 悠太
(72)【発明者】
【氏名】丹下 耕太
(72)【発明者】
【氏名】吉岡 宏樹
(72)【発明者】
【氏名】玉川 晋也
(72)【発明者】
【氏名】秋田 英万
(72)【発明者】
【氏名】田中 浩揮
(72)【発明者】
【氏名】高田 奈依
(72)【発明者】
【氏名】小西 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼橋 達成
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076DD60
4C084AA13
(57)【要約】
細胞内動態を改善したカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、及びこれらの用途を提供すること。式（１）
（式（１）中、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１〜６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合を表し、
Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３〜１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し
Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基を表す。）で示されるカチオン性脂質。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（１）
（式（１）中、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１〜６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合を表し、
Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３〜１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し
Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基を表す。）で示されるカチオン性脂質。
【化1】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１〜６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合を表し、
Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３〜１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し
Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基を表す。）で示されるカチオン性脂質。
【請求項2】
Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立してＺ１：
（式中、
ｓは０〜３の整数を表し、
ｔは０〜３の整数を表し、
ｕは０〜４の整数を表し、
ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。）
である請求項１記載のカチオン性脂質。
【化2】
ｓは０〜３の整数を表し、
ｔは０〜３の整数を表し、
ｕは０〜４の整数を表し、
ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。）
である請求項１記載のカチオン性脂質。
【請求項3】
ｓが０である請求項２記載のカチオン性脂質。
【請求項4】
Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基である請求項１〜３のいずれか１項に記載のカチオン性脂質。
【請求項5】
Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基である請求項１〜４のいずれか１項に記載のカチオン性脂質。
【請求項6】
Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基である請求項５記載のカチオン性脂質。
【請求項7】
Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基である請求項５記載のカチオン性脂質。
【請求項8】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のカチオン性脂質を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
【請求項9】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のカチオン性脂質、又は請求項８記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
【請求項10】
生体外において、核酸を内封した請求項９記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
【請求項11】
核酸を内封した請求項９記載の核酸導入剤を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は細胞内動態を改善したカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、及びこれらの用途に関する。【背景技術】
【0002】
核酸治療を実用化するために、効果的で安全な核酸送達キャリアが求められている。ウイルスベクターは、発現効率のよい核酸送達キャリアであるが、安全性の観点から実用上問題がある。そのため、より安全に使用できる非ウイルス核酸送達キャリアの開発が進められており、そのなかでもカチオン性脂質を用いたキャリアは、現在最も一般的に使用されている非ウイルス核酸送達キャリアである。【0003】
カチオン性脂質は大別してアミン部位と脂質部位から構成されており、カチオン性を示すアミン部位とポリアニオンである核酸が静電的に相互作用し、正に帯電したリポソーム又は脂質膜構造体を形成することで、細胞への取り込みを促進し、核酸を細胞内へ送達するものである。【0004】
一般に広く用いられている公知のカチオン性脂質としてはＤＯＴＡＰやＤＯＤＡＰが挙げられる。これらの公知のカチオン性脂質はリン脂質と組み合わせることによって、正に帯電したリポソーム又は脂質膜構造体を形成し、核酸と静電的に相互作用することで、標的細胞に核酸を送達し得る（非特許文献１）。【0005】
一方で、カチオン性脂質を用いた脂質膜構造体が、核酸送達キャリアとして生体内で実用的な効果を発揮するためには、体内動態が良いこと、具体的には血中での安定性が高いこと、腫瘍等の標的への集積性が高いことなどの要件を満たす必要がある。この課題に対し、脂質膜構造体の表面のｐＫａを中性付近に調整し、ＰＥＧ脂質を導入した脂質膜構造体が、静脈内注射後に長い血中寿命を示すこと、腫瘍部位に集積することが知られている。【0006】
このように体内動態を改善したカチオン性脂質が開発されているが、一般的に外来物質を細胞内に導入するという核酸送達キャリアの性質上、少ない取り込み量で大きな効果を発揮することが望まれている。即ち、脂質膜構造体を発現ベクターの細胞内への送達キャリアとして用いた場合、細胞内に取り込まれた単位脂質膜構造体当たりの発現量を高め、細胞内での発現効率を高めることが求められている。細胞内での発現効率を高めるためには、体内動態の他に、細胞への取り込み、エンドソームからの脱出、核膜透過などの細胞内動態を改善する必要がある。さらに細胞内における転写を促進する上では、核酸をキャリアから解離させ、転写因子との結合性を高める必要があることがわかっている（非特許文献２）。【0007】
以上のように、核酸送達キャリアとしては、体内動態だけでなく、細胞内動態を改善する必要があり、特に、細胞への取り込み、エンドソーム脱出、核酸のキャリアからの解離、を促進させることが重要となる。これらの細胞内動態の改善例については以下の報告がある。【0008】
特許文献１には、細胞への取り込み量を増加させた例が述べられている。この文献では、細胞への取り込み量を増加させる目的でアミノ基を多く含有したカチオン性脂質が記載されている。このカチオン性脂質を含む脂質膜構造体は、細胞への取り込み量を増加させることはできるが、一方で、核酸と相互作用するアミノ基を多く有するため、細胞内においては、脂質膜構造体からの核酸の解離が抑制されることになり、核酸送達効率の改善は期待できない。【0009】
次に、エンドソーム脱出効率を改善した例がある（非特許文献３および非特許文献４）。これらの文献では、カチオン性脂質のアミノ基周辺構造を改変し、脂質膜構造体の表面のｐＫａをエンドソーム脱出に好ましい値に調整している。その結果、脂質膜構造体のエンドソームからの脱出が促進され、細胞質内へ効率良く核酸を送達できることが述べられている。しかし、適切なｐＫａを有する脂質膜構造体のすべてが、高い核酸送達効率を示すわけではなく、また、これら文献のカチオン性脂質については、脂質膜構造体のｐＫａを調整できる以外の効果についての記載はない。【0010】
また、エンドソーム脱出効率を改善する方法として、脂質膜構造体の膜融合能を向上させることも１つの手法である（非特許文献５）。この文献では、エンドソーム脱出能の指標の1つとして、膜融合能（ヘモライシス活性）を評価している。脂質膜構造体を構成するカチオン性脂質の構造を改変することで、膜融合能が変化し、エンドソーム内環境での膜融合能が、核酸送達効率に影響することが述べられている。しかし、具体的にどのような構造が膜融合能を改善させるかについての記載はない。【0011】
さらに、細胞内での核酸の脂質膜構造体からの解離を促進させた例がある（特許文献２及び３）。これら文献では、１つまたは２つのアミン部位と１つの脂質部位からなる化合物同士を、生分解性を示すジスルフィド結合で繋いだ構造を有するカチオン性脂質について述べられている。これらの文献では、当該カチオン性脂質が血中安定性や腫瘍標的性などの体内動態を改善することができ、また、アミン部位周辺の構造を変更することで、脂質膜構造体としてのｐＫａを細胞内でのエンドソーム脱出に有利な値に調整でき、さらに、細胞内でジスルフィド結合が切断されることを利用し、核酸を脂質膜構造体から解離させる効果を有することが示されている。実際、公知のカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰやＤＯＤＡＰと比較して、高い核酸送達効率を示すことから、当該カチオン性脂質は核酸の細胞質内への送達効率の向上などの細胞内動態を改善できることが明らかとなっている。【0012】
以上のように、細胞への取り込み、エンドソーム脱出、核酸のキャリアからの解離を促進させるなど、核酸送達キャリアの細胞内動態の改善に関する報告は複数ある。しかしながら、こうした当該分野での技術進捗にも関らず、これらカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体によって達成される細胞への核酸送達効率は、いまだ十分に満足されるものではなく、さらなる改善が求められている。【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【特許文献1】特開２０１１−１２１９６６号公報
【特許文献2】ＵＳ２０１４／０３３５１５７Ａ１
【特許文献3】国際公開第２０１６／１２１９４２号
【非特許文献】
【0014】
【非特許文献1】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２９（２４―２５）：３４７７―９６，２００８
【非特許文献2】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １３（４）：７８６―７９４，２００６
【非特許文献3】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（４）：７８８−７９５，２０１６
【非特許文献4】Ａｎｇｅｗａｎｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ５１：８５２９−８５３３，２０１２
【非特許文献5】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１０（３２）：１２８８１−１２８８６，２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
本発明の課題は、従来技術では達成し得なかった細胞内動態のさらなる改善を達成し、核酸送達キャリアとして用いることができるカチオン性脂質、当該カチオン性脂質を用いた脂質膜構造体、および当該カチオン性脂質を用いた核酸導入剤を提供することである。また、本発明の課題は、カチオン性脂質を含む核酸導入剤を用いて核酸導入を達成する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、エンドソーム脱出効率に影響する脂質膜構造体のｐＫａを調整でき、かつ高い膜融合能を有したカチオン性脂質を見出した。具体的には、脂質部位近傍に芳香環を導入し、これをアミン部位と結合させた化合物をジスルフィド結合で繋いだ構造を有するカチオン性脂質であり、ジスルフィド結合を有することから、細胞内でジスルフィド結合が切断され、核酸を脂質膜構造体から解離させる効果も併せ持つ。この新規カチオン性脂質を含んだ脂質膜構造体は、エンドソーム内環境において高い膜融合能を有し、エンドソーム脱出効率が高いことから、核酸を効率良く細胞質内へ送達できることを見出した。
【0017】
即ち、本発明は、以下の内容を包含する。［１］式（１）
【0018】
【化1】
【0019】
（式（１）中、Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１〜６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合を表し、
Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３〜１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基を表す。）で示されるカチオン性脂質（本明細書中、「カチオン性脂質（１）」と略記する場合がある）。
【0020】
［２］Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立してＺ１：【0021】
【化2】
【0022】
（式中、ｓは０〜３の整数を表し、
ｔは０〜３の整数を表し、
ｕは０〜４の整数を表し
ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。）
である［１］記載のカチオン性脂質。
【0023】
［３］ｓが０である［２］記載のカチオン性脂質。【0024】
［４］Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基である［１］〜［３］のいずれか１に記載のカチオン性脂質。【0025】
［５］Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基である［１］〜［４］のいずれか１に記載のカチオン性脂質。【0026】
［６］Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基である［５］記載のカチオン性脂質。【0027】
［７］Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基である［５］記載のカチオン性脂質。【0028】
［８］［１］〜［７］のいずれか１に記載のカチオン性脂質を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。【0029】
［９］［１］〜［７］のいずれか１に記載のカチオン性脂質、又は［８］記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。【0030】
［１０］生体外において、核酸を内封した［９］記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。【0031】
［１１］核酸を内封した［９］記載の核酸導入剤を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。【発明の効果】
【0032】
本発明は、３級アミノ基と芳香環を有するエステル、脂質部位、そして生分解性基であるジスルフィド結合を有するカチオン性脂質、またそれを含む脂質膜構造体に関するものである。本発明のカチオン性脂質は、脂質膜構造体を形成することができ、また当該カチオン性脂質を含む核酸導入剤とすることができる。本発明のカチオン性脂質はエンドソーム脱出効率に影響する脂質膜構造体のｐＫａを調整でき、それに加え、エンドソーム内環境において膜融合能が高いため、エンドソーム脱出が促進される。さらに、本発明のカチオン性脂質に含まれるジスルフィド結合が、細胞内の還元的環境において切断され、内包物（核酸）の放出が促進される。そのため、本発明のカチオン性脂質を用いた核酸導入剤は、細胞質内への高い核酸送達効率を達成することができる。【0033】
本発明のカチオン性脂質、又はそれを含む脂質膜構造体を用いて、核酸導入を行うと、血清成分による核酸の分解が抑制されるので、血清存在下での核酸導入や、生体内での核酸導入に有利である。【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】本発明のカチオン性脂質（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２）から調製されるＬＮＰのｐＨ７．４および５．５でのヘモライシス活性（膜融合能）を示した図である。
【図2】本発明のカチオン性脂質（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２およびＯ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２）と比較例１から調製される各種ＬＮＰのｐＨ５．５における各種脂質濃度でのヘモライシス活性を示した図である。
【図3】本発明のカチオン性脂質（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ１、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２）および比較例１から調製される各種ＬＮＰのインビトロでの遺伝子発現活性を示した図である。
【図4】本発明のカチオン性脂質（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２およびＯ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２）と比較例１から調製される各種ＬＮＰのインビトロでの遺伝子発現活性を示した図である。
【図5】本発明のカチオン性脂質（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２およびＯ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２）と比較例１から調製される各種ＬＮＰ、および市販の遺伝子導入試薬ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）のインビボでの遺伝子発現活性を示した図である。
【図6】本発明のカチオン性脂質（Ｏ―Ｐｈ―Ｐ４Ｃ２、Ｏ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２）および比較例１から調製される各種ＬＮＰのインビボでのＦＶＩＩ遺伝子のノックダウン活性を示した図である。
【図7】本発明のカチオン性脂質（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、Ｅ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、ＨＤ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２）、および比較例１から調製される各種ＬＮＰのｐＨ７．４およびｐＨ５．５でのヘモライシス活性（膜融合能）を示した図である。
【図8】本発明のカチオン性脂質（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、Ｌ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、ＨＤ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２）と比較例１から調製される各種ＬＮＰのインビトロでの遺伝子発現活性を示した図である。
【図9】本発明のカチオン性脂質（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２）から調製されるＬＮＰおよび遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ）のインビトロでの遺伝子発現の総量を示した図である。
【図10】本発明のカチオン性脂質（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２）から調製されるＬＮＰおよび遺伝子導入試薬のインビトロでの細胞への遺伝子発現の均一性を示した図である。
【図11】本発明のカチオン性脂質（Ｅ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２）および比較例２から調製される各種ＬＮＰのインビボ（皮下）での遺伝子発現活性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0035】
以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【0036】
本発明は、式（１）で示されるカチオン性脂質を提供するものである。【0037】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、直鎖状であっても良く、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１〜２である。炭素数１〜６のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基等を挙げることができる。Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、好ましくはそれぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基又はテトラメチレン基であり、最も好ましくはそれぞれエチレン基である。【0038】
Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一の基である。【0039】
Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１〜６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基である。【0040】
炭素数が１〜６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基中の炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜３である。炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、２−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基又はイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。【0041】
炭素数が１〜６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基の好ましい具体的な構造は、Ｘ１で示される。【0042】
【化3】
【0043】
Ｘ１のＲ５は炭素数１〜６のアルキル基を表し、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜３である。炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、２−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができ、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基又はイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。【0044】
炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基中の炭素数は、好ましくは４〜５である。炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基としては、具体的にはアジリジレン基、アゼチジレン基、ピロリジレン基、ピペリジレン基、イミダゾリジレン基、ピペラジレン基であり、好ましくはピロリジレン基、ピペリジレン基、ピペラジレン基であり、最も好ましくはピペリジレン基である。【0045】
炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ２で示される。【0046】
【化4】
【0047】
Ｘ２のｐは１又は２である。ｐが１のときＸ２はピロリジレン基であり、ｐが２のときＸ２はピペリジレン基である。【0048】
炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が２の環状のアルキレン３級アミノ基の好ましい具体的な構造はＸ３で示される。【0049】
【化5】
【0050】
Ｘ３のｗは１又は２である。ｗが１のときＸ３はイミダゾリジレン基であり、ｗが２のときＸ３はピペラジレン基である。【0051】
ＸａはＸｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＸａはＸｂと同一の基である。【0052】
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基である。【0053】
炭素数８以下のアルキレン基は、直鎖状であっても、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。当該アルキレン基に含まれる炭素数は、好ましくは６以下であり、最も好ましくは４以下である。炭素数８以下のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基等を挙げることができ、好ましくはメチレン基、エチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基であり、最も好ましくはエチレン基である。【0054】
炭素数８以下のオキシジアルキレン基とは、エーテル結合を介したアルキレン基（アルキレン−Ｏ−アルキレン）を示し、２つ存在するアルキレン基の炭素数の合計が８以下のものである。ここで、２つ存在するアルキレンは同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。炭素数８以下のオキシジアルキレン基としては、具体的にはオキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジプロピレン基、オキシジブチレン基等を挙げることができる。好ましくは、オキシジメチレン基、オキシジエチレン基、オキシジプロピレン基であり、最も好ましくはオキシジエチレン基である。【0055】
Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であっても異なっていても良いが、好ましくは、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一の基である。【0056】
Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合であり、好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合又はカーバメート結合であり、より好ましくはそれぞれ独立して、エステル結合又はアミド結合であり、最も好ましくはそれぞれエステル結合である。Ｙａ及びＹｂの結合の向きは制限されないが、ＹａおよびＹｂがエステル結合の場合、好ましくは、−Ｚａ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２ａ−および−Ｚｂ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２ｂ−の構造を呈する。【0057】
ＹａはＹｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＹａはＹｂと同一の基である。【0058】
Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３〜１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表す。当該芳香族化合物に含まれる炭素数は好ましくは６〜１２であり、最も好ましくは６〜７である。また、当該芳香族化合物に含まれる芳香環は、好ましくは１つである。【0059】
炭素数３〜１６の芳香族化合物に含まれる芳香環の種類として、芳香族炭化水素環については、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、芳香族ヘテロ環についてはイミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、トリアジン環、ピロール環、フランチオフェン環、ピリミジン環、ピリダジン環、ピラジン環、ピリジン環、プリン環、プテリジン環、ベンズイミダゾール環、インドール環、ベンゾフラン環、キナゾリン環、フタラジン環、キノリン環、イソキノリン環、クマリン環、クロモン環、ベンゾジアゼピン環、フェノキサジン環、フェノチアジン環、アクリジン環等を挙げることができ、好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環であり、最も好ましくは、ベンゼン環である。芳香環は置換基を有してもよく、その置換基としては、炭素数２〜４のアシル基、炭素数２〜４のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜４のカルバモイル基、炭素数２〜４のアシルオキシ基、炭素数２〜４のアシルアミノ基、炭素数２〜４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜４のアルキルスルファニル基、炭素数１〜４のアルキルスルホニル基、炭素数６〜１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のウレイド基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素６〜１０のアリール基、炭素数６〜１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、t-ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、t-ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。
【0060】
Ｚａ及びＺｂの好ましい具体的な構造としては、Ｚ１が挙げられる。【0061】
【化6】
【0062】
式中、ｓは０〜３の整数を表し、ｔは０〜３の整数を表し、ｕは０〜４の整数を表し、ｕ個のＲ４はそれぞれ独立して置換基を表す。【0063】
Ｚ１のｓは、好ましくは０〜１の整数であり、より好ましくは０である。【0064】
Ｚ１のｔは、好ましくは０〜２の整数であり、より好ましくは１である。【0065】
Ｚ１のｕは、好ましくは０〜２の整数であり、より好ましくは０〜１の整数である。【0066】
Ｚ１のＲ４は、当該カチオン性脂質の合成過程における反応を阻害しない、炭素数３〜１６の芳香族化合物に含まれる芳香環（ベンゼン環）の置換基である。該置換基としては、炭素数２〜４のアシル基、炭素数２〜４のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜４のカルバモイル基、炭素数２〜４のアシルオキシ基、炭素数２〜４のアシルアミノ基、炭素数２〜４のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜４のアルキルスルファニル基、炭素数１〜４のアルキルスルホニル基、炭素数６〜１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のウレイド基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素６〜１０のアリール基、炭素数６〜１０のアリールオキシ基等を挙げることができ、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、シアノ基、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、t-ブチル基、ウレイド基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、t-ブトキシ基、フェニル基およびフェノキシ基等が挙げられる。Ｒ４が複数個存在する場合、各Ｒ４は同一であっても異なっていてもよい。【0067】
ＺａはＺｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＺａはＺｂと同一の基である。【0068】
Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基を表し、好ましくはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基であり、最も好ましくはそれぞれ独立して、炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基である。【0069】
水酸基を有する脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、トコトリエノール等を挙げることができる。水酸基を有する脂溶性ビタミンは、好ましくはトコフェロールである。【0070】
水酸基を有するステロール誘導体としては、例えばコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、及びエルゴステロール等が挙げられ、好ましくはコレステロール、又はコレスタノールである。【0071】
炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基は、直鎖状であっても、分岐を有していても良い。当該脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であっても良い。不飽和脂肪族炭化水素基の場合、当該脂肪族炭化水素基に含まれる不飽和結合の数は通常１〜６個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個である。不飽和結合には炭素−炭素二重結合及び炭素−炭素三重結合が含まれるが、好ましくは炭素−炭素二重結合である。当該脂肪族炭化水素基に含まれる炭素数は、好ましくは１３〜１９であり、最も好ましくは１３〜１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくはアルキル基又はアルケニル基が含まれる。炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基としては、具体的にはドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、１−ヘキシルヘプチル基、１−ヘキシルノニル基、１−オクチルノニル基、１−オクチルウンデシル基、１−デシルウンデシル基等を挙げることができる。炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基は、好ましくはトリデシル基、ペンタデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１−ヘキシルノニル基であり、特に好ましくはトリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基である。【0072】
本発明の一態様において、Ｒ３ａ及びＲ３ｂで表される炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基は脂肪酸由来である。この場合、脂肪酸由来のカルボニル炭素は式（１）中の−ＣＯ−Ｏ−に含まれる。脂肪族炭化水素基の具体例としては、脂肪酸としてリノール酸を用いた場合ではヘプタデカジエニル基となり、脂肪酸としてオレイン酸を用いた場合ではヘプタデセニル基となる。【0073】
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一の基である。【0074】
本発明の一態様において、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、ＸａはＸｂと同一であり、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、ＹａはＹｂと同一であり、ＺａはＺｂと同一であり、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。【0075】
本発明の式（１）で示されるカチオン性脂質の好適な例としては、以下のカチオン性脂質が挙げられる。［カチオン性脂質（１−１）］
Ｒ１ａ及びＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１〜６のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１〜６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、−Ｎ（ＣＨ３）−）、又は炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１〜２の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基）であり；
Ｙａ及びＹｂがそれぞれ独立してエステル結合又はアミド結合であり；
Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が３〜１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−）であり；
Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２〜２２の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１−ヘキシルノニル基）である；
カチオン性脂質（１）。
【0076】
［カチオン性脂質（１−２）］Ｒ１ａ及びＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１〜４のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、炭素数が１〜３であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基（例、−Ｎ（ＣＨ３）−）、又は炭素数が２〜５であり、かつ３級アミノ基の数が１の環状のアルキレン３級アミノ基（例、ピペリジレン基）であり；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数６以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基）であり；
Ｙａ及びＹｂがそれぞれ独立してエステル結合又はアミド結合であり；
Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立して、炭素数が６〜１２であり、１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基（例、−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−）であり；
Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１３〜１９の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１−ヘキシルノニル基）である；
カチオン性脂質（１）。
【0077】
［カチオン性脂質（１−３）］Ｒ１ａ及びＲ１ｂがそれぞれ独立して、炭素数１〜２のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基）であり；
Ｘａ及びＸｂがそれぞれ独立して、Ｘ１：
【0078】
【化7】
【0079】
（式中、Ｒ５は炭素数１〜３のアルキル基（例、メチル基）である。）、又はＸ２：【0080】
【化8】
【0081】
（式中、ｐは１又は２である。）であり；
Ｒ２ａ及びＲ２ｂがそれぞれ独立して、炭素数４以下のアルキレン基（例、メチレン基、エチレン基、プロピレン基）であり；
Ｙａ及びＹｂがそれぞれ独立してエステル結合又はアミド結合であり；
Ｚａ及びＺｂがそれぞれ独立して、Ｚ１：
【0082】
【化9】
【0083】
（式中、ｓは０〜１の整数であり、ｔは０〜２の整数であり、ｕは０〜２の整数（好ましくは０）であり、ｕ個のＲ４は、それぞれ独立して置換基を表す。）であり；
Ｒ３ａ及びＲ３ｂがそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミン（例、トコフェロール）とコハク酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１３〜１７の脂肪族炭化水素基（例、ヘプタデセニル基、ヘプタデカジエニル基、１−ヘキシルノニル基）である；
カチオン性脂質（１）。
【0084】
本発明のカチオン性脂質（１）の具体例として、以下のＯ−Ｐｈ−Ｐ３Ｃ１、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ１、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、Ｏ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２、Ｅ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、Ｌ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、ＨＤ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２、Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２、Ｏ−Ｐｈ−Ｃ３Ｍを挙げることができる。【0085】
【表1-1】
【0086】
【表1-2】
【0087】
次に本発明のカチオン性脂質（１）の製造方法について説明する。【0088】
本発明のカチオン性脂質（１）は、−Ｓ−Ｓ−（ジスルフィド）結合を有している。そのため、製造方法としては、Ｒ３ａ−ＣＯ−Ｏ−Ｚａ−Ｙａ−Ｒ２ａ−Ｘａ−Ｒ１ａ−を有するＳＨ（チオール）化合物、及びＲ３ｂ−ＣＯ−Ｏ−Ｚｂ−Ｙｂ−Ｒ２ｂ−Ｘｂ−Ｒ１ｂ−を有するＳＨ（チオール）化合物を製造後、これらを酸化（カップリング）することで−Ｓ−Ｓ−結合を含む本発明のカチオン性脂質（１）を得る方法、−Ｓ−Ｓ−結合を含む化合物に、必要な部分を順次合成していき、最終的に本発明のカチオン性脂質（１）を得る方法等が挙げられる。好ましくは、後者の方法である。【0089】
後者の方法の具体例を以下に挙げるが、製造方法はこれらに限定されない。【0090】
出発化合物としては、−Ｓ−Ｓ−結合を含む両末端カルボン酸、両末端アミン、両末端イソシアネート、両末端アルコール、メタンスルホニル基などの脱離基を有する両末端アルコール、ｐ−ニトロフェニルカーボネート基などの脱離基を有する両末端カーボネートなどが挙げられる。【0091】
例えば、Ｒ１ａおよびＲ１ｂが同一でＲ１であり、ＸａおよびＸｂが同一でＸであり、Ｒ２ａおよびＲ２ｂが同一でＲ２であり、ＹａおよびＹｂが同一でＹであり、Ｚａ及びＺｂが同一でＺであり、かつＲ３ａおよびＲ３ｂが同一でＲ３であるカチオン性脂質（１）を製造する場合、以下に示す合成経路にて目的とする式（１’）のカチオン性脂質物を得ることができる。【0092】
【化10】
【0093】
−Ｓ−Ｓ−結合を含む化合物（Ｉ）中の両末端官能基（ＦＧ１）を、二級アミンと末端に１つの官能基(ＦＧ２)を有する化合物（ＩＩ）中の二級アミンに反応させて化合物（ＩＩＩ）を合成する。Ｒ３を有する化合物（ＩＶ）と、水酸基と反応性官能基（ＦＧ３）を有するＺを含む化合物（Ｖ）中の水酸基とを反応させて化合物（ＶＩ）を合成し、最後に化合物（ＶＩ）の反応性官能基（ＦＧ３）と化合物（ＩＩＩ）の反応性官能基（ＦＧ２）とを反応させることにより、−Ｓ−Ｓ−結合、Ｒ１、Ｘ、Ｒ２、Ｙ、ＺおよびＲ３を含む式（１’）のカチオン性脂質を得ることができる。【0094】
上述の製造方法のうち、化合物（ＩＩＩ）は、特許文献２又は特許文献３に記載された方法により製造することが出来る。【0095】
化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）の反応には、触媒として炭酸カリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン（以下、「ＤＭＡＰ」と称する）などの塩基触媒を使用しても良く、ｐ−トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒存在下、または無触媒で行ってもよい。【0096】
また、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」と称する）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＣ」と称する）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」と称する）などの縮合剤を使用して、化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）を直接反応させてもよく、または、化合物（ＩＶ）を、縮合剤を使用して無水物などに変換した後、化合物（Ｖ）と反応させてもよい。【0097】
化合物（ＩＶ）の仕込み量は、化合物（Ｖ）に対して、通常1〜５０ｍｏｌ当量であり、好ましくは１〜１０ｍｏｌ当量である。【0098】
化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）との反応に使用される触媒は、反応させる化合物種によって、適宜選択してよい。【0099】
触媒量は、化合物（Ｖ）に対して、通常０．０５〜１００ｍｏｌ当量であり、好ましくは、０．１〜２０ｍｏｌ当量であり、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ当量である。【0100】
化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）の反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。例えば水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエンなどが挙げられる。これらの中ではクロロホルム、トルエンが好ましい。【0101】
反応温度は、通常０〜１５０℃であり、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは１０〜５０℃である。反応時間は、通常１〜４８時間であり、好ましくは１〜２４時間である。【0102】
上記反応によって得られた反応物（ＶＩ）は、抽出精製、再結晶、吸着精製、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。【0103】
化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＶＩ）とを反応させる場合には、化合物（ＩＶ）と化合物（Ｖ）の反応のように、触媒として炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、４−ジメチルアミノピリジンなどの塩基触媒を使用しても良く、ｐ−トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒存在下、または無触媒で行ってもよい。【0104】
また、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣなどの縮合剤を使用して、化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＶＩ）とを直接反応させてもよく、または、化合物（ＶＩ）を、縮合剤を使用して無水物などに変換した後、化合物（ＩＩＩ）と反応させてもよい。【0105】
化合物（ＶＩ）の仕込み量は、化合物（ＩＩＩ）に対して、通常1〜５０ｍｏｌ当量であり、好ましくは１〜１０ｍｏｌ当量である。【0106】
化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＶＩ）との反応に使用される触媒は、反応させる化合物種によって、適宜選択してよい。【0107】
触媒量は、化合物（ＩＩＩ）に対して、通常０．０５〜１００ｍｏｌ当量であり、好ましくは、０．１〜２０ｍｏｌ当量であり、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ当量である。【0108】
化合物（ＩＩＩ）と化合物（ＶＩ）の反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。例えば水、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエンなどが挙げられる。これらの中ではクロロホルム、トルエンが好ましい。【0109】
反応温度は、通常０〜１５０℃であり、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは１０〜５０℃である。反応時間は、通常１〜４８時間であり、好ましくは１〜２４時間である。【0110】
上記反応によって得られた本発明のカチオン性脂質（１）は、抽出精製、再結晶、吸着精製、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。【0111】
具体的な実施例は後述する（実施例１〜９）。当業者であれば、適宜原料を選択し、本明細書の実施例の方法に準じて反応を行うことにより、所望のカチオン性脂質（１）を製造することができる。【0112】
次に本発明の脂質膜構造体について説明する。【0113】
本発明の脂質膜構造体とは、本発明のカチオン性脂質、即ち、上記一般式（１）で表わされるカチオン性脂質を膜の構成物質として含有するものである。ここで、本発明における「脂質膜構造体」とは、両親媒性脂質の親水基が界面の水相側に向かって配列した膜構造を有する粒子を意味する。「両親媒性脂質」とは、親水性を示す親水性基、および疎水性を示す疎水性基の両方を有する脂質のことを意味する。両親媒性脂質としては、例えば、カチオン性脂質やリン脂質等を挙げることができる。【0114】
本発明の脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に本発明のカチオン性脂質が分散した形態として、リポソーム（例えば一枚膜リポソーム、多重層リポソームなど）、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、脂質ナノ粒子（Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏ Ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下「ＬＮＰ」と称する）または不特定の層状構造物などを挙げることができる。本発明の脂質膜構造体は、好ましくはリポソームである。本発明の別の実施態様において、本発明の脂質膜構造体は、好ましくはＬＮＰである。【0115】
本発明の脂質膜構造体は、本発明のカチオン性脂質に加え、それ以外のその他の構成成分をさらに含有してもよい。当該その他の構成成分としては、例えば、脂質（リン脂質（ホルファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホルファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン等）、糖脂質、ペプチド脂質、コレステロール、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質、ＰＥＧ脂質等）、界面活性剤（例えば、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート、コール酸ナトリウム塩、オクチルグリコシド、Ｎ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミド類等）、ポリエチレングリコール、タンパク質などが挙げられる。本発明の脂質膜構造体における当該その他の構成成分の含有量は、通常５〜９５ｍｏｌ％であり、好ましくは１０〜９０ｍｏｌ％であり、より好ましくは、３０〜８０ｍｏｌ％である。【0116】
本発明の脂質膜構造体に含まれる本発明のカチオン性脂質の含有量は特に限定されないが、通常は、脂質膜構造体を後述の核酸導入剤として用いた場合に、核酸を導入するために十分な量の本発明のカチオン性脂質が含まれる。例えば、総脂質の５〜１００ｍｏｌ％、好ましくは１０〜９０ｍｏｌ％、より好ましくは２０〜７０ｍｏｌ％である。【0117】
本発明の脂質膜構造体は、本発明のカチオン性脂質及びその他の構成成分（脂質等）を適当な溶媒または分散媒、例えば、水性溶媒やアルコール性溶媒中に分散させ、必要に応じて組織化を誘導する操作を行うことにより調製することができる。【0118】
「組織化を誘導する操作」としては、例えば、マイクロ流路又はボルテックスを用いたエタノール希釈法、単純水和法、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチ・プレス法、コール酸法、Ｃａ２＋融合法、凍結−融解法、逆相蒸発法等の自体公知の方法が挙げられるが、これらに限定されない。【0119】
本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体に核酸を内封させ、これを細胞へ接触させることにより、生体内及び／又は生体外において該核酸を該細胞内へ導入することができる。従って、本発明は、上記本発明のカチオン性脂質又は脂質膜構造体を含む、核酸導入剤を提供するものである。【0120】
本発明の核酸導入剤は、任意の核酸を細胞内へ導入することができる。核酸の種類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等を挙げることができるがこれらに限定されない。また、核酸は１〜３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。核酸は、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）、又は特殊な結合を有するその他のオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置を持つヌクレオチドを含有する）などであってもよい。さらに該核酸は、例えば、公知の修飾の付加された核酸、当該分野で知られた標識のある核酸、キャップの付いた核酸、メチル化された核酸、１個以上の天然ヌクレオチドを類縁物で置換した核酸、分子内ヌクレオチド修飾された核酸、非荷電結合（例えば、メチルスルホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カーバメート等）を持つ核酸、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を持つ核酸、例えば蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）や糖（例えば、モノサッカライド等）等の側鎖基を有している核酸、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレン等）を持つ核酸、キレート化合物（例えば、金属、放射活性を持つ金属、ホウ素、酸化性の金属等）を含有する核酸、アルキル化剤を含有する核酸、修飾された結合を持つ核酸（例えば、αアノマー型の核酸等）等であってもよい。【0121】
本発明において使用できるＤＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＣｐＧオリゴ等が挙げられ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡであり、より好ましくはプラスミドＤＮＡである。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。【0122】
本発明において使用できるＲＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡゲノム、二本鎖ＲＮＡゲノム、ＲＮＡレプリコン、トランスファーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ等が挙げられ、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡレプリコンである。【0123】
本発明において用いられる核酸は、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。【0124】
核酸を内封した本発明の核酸導入剤は、例えば疾患の予防および／又は治療を目的として、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）投与することができる。従って、本発明において用いられる核酸は、ある所定の疾患に対して予防および／又は治療活性を有するもの（予防・治療用核酸）が好ましい。そのような核酸としては、例えば、いわゆる遺伝子治療に用いられる核酸などが挙げられる。【0125】
本発明の核酸導入剤を用いて、核酸を細胞内へ導入するためには、本発明の脂質膜構造体を形成する際に、目的とする核酸を共存させることにより、該核酸を内封した本発明の脂質膜構造体を形成させる。例えば、エタノール希釈法によりリポソームを形成する場合、核酸の水溶液と、本発明の脂質膜構造体の構成成分（脂質等）のエタノール溶液とをボルテックスやマイクロ流路等で激しく混合した後で、混合物を適切な緩衝液で希釈する。単純水和法によりリポソームを形成する場合、本発明の脂質膜構造体の構成成分（脂質等）を適切な有機溶媒に溶解し、該溶液をガラス容器に入れ、減圧乾燥することにより溶媒を留去し、脂質薄膜を得る。ここへ、核酸の水溶液を加え、水和させた後に、ソニケーターで超音波処理する。本発明はこのような核酸を内封した上記脂質膜構造体をも提供するものである。【0126】
核酸を内封した脂質膜構造体の一形態として、核酸とカチオン性脂質との間の静電的複合体を形成することによって核酸封入したＬＮＰが挙げられる。このＬＮＰは、核酸等を特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができ、例えば、樹状細胞への抗原遺伝子導入によるＤＮＡワクチンや腫瘍の遺伝子治療薬や、ＲＮＡ干渉を利用した標的遺伝子の発現を抑制する核酸医薬品などに有用である。【0127】
核酸を内封した本発明の脂質膜構造体の粒子径は、特に制限は無いが、好ましくは１０ｎｍ〜５００ｎｍであり、より好ましくは３０ｎｍ〜３００ｎｍである。粒子径の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）などの粒度分布測定装置を用いて行うことができる。脂質膜構造体の粒子径は、脂質膜構造体の調製方法により、適宜調整することができる。【0128】
核酸を内封した本発明の脂質膜構造体の表面電位（ゼータ電位）は、特に制限は無いが、好ましくは−１５〜＋１５ｍＶ、さらに好ましくは−１０〜＋１０ｍＶである。従前の遺伝子導入においては、表面電位がプラスに荷電された粒子が主に用いられてきた。これは、負電荷を有する細胞表面のヘパリン硫酸との静電的相互作用を促進し、細胞への取り込みを促進するための方法としては有用であるが、正の表面電荷は、細胞内において送達核酸との相互作用によるキャリアからの核酸の放出の抑制や、ｍＲＮＡと送達核酸との相互作用によるタンパク質の合成が抑制される可能性がある。表面電荷を上記の範囲内に調整することにより、この問題を解決し得る。表面電荷の測定は、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏなどのゼータ電位測定装置を用いて行うことができる。脂質膜構造体の表面電荷は、本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体の構成成分の組成により、調整することができる。【0129】
本発明の脂質膜構造体の脂質膜表面ｐＫａ（以下、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａと称する）は、特に制限はないが、好ましくはｐＫａが５．５〜７．２であり、さらに好ましくはｐＫａが６．０〜６．８である。Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａは、エンドサイトーシスで取り込まれた脂質膜構造体がエンドソーム内の弱酸性環境下において、脂質膜構造体のプロトン化の受け易さを示す指標とされている。非特許文献３や４に記載されているようにエンドソームから脱出し、核酸を砂防室内へ送達するには、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａをエンドソーム脱出に好ましい値とすることが重要であり、上記の範囲内に調整することにより、効率良く細胞質内へ核酸の送達を行うことができる。Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａは、本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体の構成成分の組成により、調整することができる。【0130】
本発明の脂質膜構造体のヘモライシス活性（膜融合能）は、特に制限はないが、好ましくは生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）ではヘモライシス活性を有しておらず（５％未満）、エンドソーム内の弱酸性環境下（ｐＨ５．５）において活性を有している。非特許文献５に記載されているようにヘモライシスは、エンドサイトーシスで取り込まれた脂質膜構造体がエンドソームから脱出するための手段の１つである。ヘモライシス活性が高い方が効率よく核酸を細胞質内へ送達できるが、生理的ｐＨにおいてヘモライシス活性を有する場合、血中滞留中に意図しない細胞へ核酸を送達することになり、標的指向性の低下や毒性にも繋がる。そのため、上記のようにエンドソーム内環境においてのみヘモライシス活性を有することが好ましい。ヘモライシス活性は、本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体の構成成分の組成により、調整することができる。【0131】
核酸を内封した本発明の脂質膜構造体と細胞とを接触させることで、内封された核酸を細胞内へ導入することができる。当該「細胞」の種類は、特に限定されず、原核生物及び真核生物の細胞を用いることができるが、好ましくは真核生物である。真核生物の種類も、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物、微生物（例えば、酵母等）等が挙げられる。より好ましくは、本発明で対象とされる細胞は、動物もしくは植物細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞である。当該細胞は、癌細胞を含む培養細胞株であっても、個体や組織より単離された細胞、あるいは組織もしくは組織片の細胞であってもよい。また、細胞は接着細胞であっても、非接着細胞であってもよい。【0132】
生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において核酸を内封した本発明の脂質膜構造体と細胞とを接触させる工程を以下において具体的に説明する。【0133】
細胞は当該脂質膜構造体との接触の数日前に適当な培地に懸濁し、適切な条件で培養する。脂質膜構造体との接触時において、細胞は増殖期にあってもよいし、そうでなくてもよい。【0134】
当該接触時の培養液は、血清含有培地であっても血清不含培地であってもよいが、培地中の血清濃度は３０重量％以下が好ましく、２０重量％以下であることがより好ましい。培地中に過剰な血清等の蛋白質が含まれていると、当該脂質膜構造体と細胞との接触が阻害される可能性がある。【0135】
当該接触時の細胞密度は、特には限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常１×１０４〜１×１０７細胞／ｍＬの範囲である。【0136】
このように調製された細胞に、例えば、上述の核酸が内封された本発明の脂質膜構造体の懸濁液を添加する。該懸濁液の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能である。細胞へ接触させる際の脂質膜構造体の濃度は、目的とする核酸の細胞内への導入が達成可能な限り特には限定されないが、脂質濃度として、通常１〜１００ｎｍｏｌ／ｍＬ、好ましくは１０〜５０ｎｍｏｌ／ｍＬであり、核酸の濃度として、通常０．０１〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１０μｇ／ｍＬである。【0137】
上述の懸濁液を細胞に添加した後、該細胞を培養する。培養時の温度、湿度、ＣＯ２濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定する。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、通常、温度は約３７℃、湿度は約９５％、ＣＯ２濃度は約５％である。また、培養時間も用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定できるが、通常０．１〜７６時間の範囲であり、好ましくは０．２〜２４時間の範囲であり、より好ましくは０．５〜１２時間の範囲である。上記培養時間が短すぎると、核酸が十分細胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。【0138】
上述の培養により、核酸が細胞内へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、又は培地に新鮮な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、新鮮な培地は、血清又は栄養因子を含むことが好ましい。【0139】
また、上述の通り、本発明の脂質膜構造体を用いることで、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においても核酸を細胞内へ導入することが可能である。即ち、核酸を内封した本発明の脂質膜構造体を対象へ投与することにより、該脂質膜構造体が標的細胞へ到達・接触し、生体内で該脂質膜構造体に内封された核酸が細胞内へ導入される。該脂質膜構造体を投与可能な対象としては、特に限定されず、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（例えば、蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物等を挙げることができる。本発明の脂質膜構造体の投与対象としては、好ましくはヒト又は他の哺乳動物である。【0140】
標的細胞の種類は特に限定されず、本発明の脂質膜構造体を用いることで、種々の組織（例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脾臓、心臓、血液、筋肉、骨、脳、胃、小腸、大腸、皮膚、脂肪組組織、リンパ節、腫瘍等）中の細胞へ、核酸を導入することが可能である。【0141】
核酸および／または核酸以外の化合物が導入された脂質膜構造体の対象（例えば、脊椎動物、無脊椎動物など）への投与方法は、標的細胞へ該脂質膜構造体が到達・接触し、該脂質膜構造体に導入された化合物を細胞内へ導入可能な方法であれば特に限定されず、導入化合物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して、自体公知の投与方法（例えば、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。該脂質膜構造体の投与量は、化合物の細胞内への導入を達成可能な範囲であれば、特に限定されず、投与対象の種類、投与方法、導入化合物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して適宜選択することができる。【0142】
本発明のカチオン性脂質又は脂質膜構造体を核酸導入剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。【0143】
該核酸導入剤が研究用試薬として提供される場合、当該本発明の核酸導入剤は、本発明の脂質膜構造体をそのままで、あるいは例えば水もしくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、水溶性溶媒（例えば、リンゴ酸緩衝液、等）、有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、ｔｅｒｔ−ブタノールなど）もしくは水溶性溶媒と有機溶媒との混合液等）との無菌性溶液もしくは懸濁液を用いて提供され得る。本発明の核酸導入剤は適宜、自体公知の生理学的に許容し得る添加剤（例えば、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）を含むことが出来る。【0144】
また、該核酸導入剤が医薬として提供される場合、当該本発明の核酸導入剤は、本発明の脂質膜構造体をそのままで用いて、あるいは医薬上許容される公知の添加剤（例えば、担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）とともに用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって、経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤等）あるいは非経口剤（例えば注射剤、スプレー剤等）として、好ましくは非経口剤（より好ましくは、注射剤）として製造することができる。【0145】
本発明の核酸導入剤は、成人用に加えて、小児用の製剤とすることもできる。【0146】
本発明の核酸導入剤はキットの態様で提供することも可能である。当該キットには、本発明のカチオン性脂質又は脂質膜構造体に加えて、核酸導入の際に使用する試薬を含むことができる。一態様において、本発明の核酸導入剤（又はキット）は、ポリカチオン（例、プロタミン）を更に含む。当該態様の本発明の核酸導入剤（又はキット）を用いることにより、容易に核酸とポリカチオン（例、プロタミン）との間の静電的複合体を、本発明の脂質膜構造体に封入することができ、核酸を細胞内導入へ供することができる。【実施例】
【0147】
以下に本発明の実施例について更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されない。【0148】
実施例の説明において使用している略語の意味は、それぞれ以下の通りである。ｓｉＲＮＡ：スモールインターフェリングＲＮＡ
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
Ｃｈｏｌ：コレステロール
ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ：１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ ＭＷ ２０００）
ＤＳＧ−ＰＥＧ５ｋ：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ ＭＷ ５０００）
ＤＯＰＥ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＯＰＣ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＭＥＳ：２−モルホリノエタンスルホン酸
ＴＮＳ：６−（ｐ−トルイジノ）−２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム
【0149】
表１に、以下の実施例及び比較例において製造したカチオン性脂質の名称と構造を示した。比較例１および２は、特許文献２の製造方法に準じて製造した。【0150】
【表2-1】
【0151】
【表2-2】
【0152】
［実施例１］Ｏ−Ｐｈ−Ｐ３Ｃ１の合成Ｏ−Ｐｈ−Ｐ３Ｃ１は式（２）の方法で製造したが、製造はこの方法に限定されない。
【0153】
式（２）【0154】
【化11】
【0155】
＜オレイン酸の酸無水物化＞オレイン酸（日油（株）製）７０．０ｇ（２４８ｍｍｏｌ）をクロロホルム５６０ｇに室温で溶解させ、１０−１５℃まで冷却した。そこへ、ＤＣＣ（（株）大阪合成有機化学研究所製）２５．１ｇ（１２１ｍｍｏｌ）をクロロホルム１４０ｇで溶解させた懸濁液を滴下により加え、１０−２５℃で２時間反応させた。反応溶液をろ過後、ろ液をエバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮物をヘキサン２１０ｇに再溶解させ、不溶物をろ過により除去した。得られたろ液をエバポレーターにより濃縮し、オレイン酸無水物を６４．２ｇ得た。
【0156】
オレイン酸無水物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ）、δ１．２５−１．４０ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ）、δ１．６１−１．６８（ｍ、４Ｈ）、δ１．９４−２．０５（ｍ、８Ｈ）、δ２．３９−２．４６（ｔ、４Ｈ）、δ５．３０−５．３８（ｍ、４Ｈ）
【0157】
＜４−オレオイルオキシフェニル酢酸の合成＞オレイン酸無水物４３．１ｇ（７８．９ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシフェニル酢酸（東京化成工業（株）製）６．００ｇ（３９．４ｍｍｏｌ）をクロロホルム６４７ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ（広栄化学（株）製）１．９３ｇ（１５．８ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液２１６ｇで２回、イオン交換水２１６ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム（関東化学（株）製）１２．９ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン２８４ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル１６８ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、１８．１ｇの粗体を得た。得られた粗体１４．５ｇをカラム精製することで、４−オレオイルオキシフェニル酢酸を３．６６ｇ得た。
【0158】
４−オレオイルオキシフェニル酢酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．７７−０．８９（ｔ、３Ｈ）、δ１．２７−１．４２（ｍ、２０Ｈ）、δ１．７１−１．７７（ｍ、２Ｈ）、δ１．９９−２．０３（ｍ、４Ｈ）、δ２．５２−２．５６（ｍ、２Ｈ）、δ３．６４（ｓ、２Ｈ）、δ５．３２−５．３８（ｍ、２Ｈ）、δ７．０３−７．０６（ｍ、２Ｈ）、δ７．２８−７．３１（ｍ、２Ｈ）
【0159】
＜Ｏ−Ｐｈ−Ｐ３Ｃ１の合成＞特許文献２に記載の方法で合成したビス｛２−［３−（ヒドロキシメチル）ピペリジル］エチル｝ジスルフィド（ｄｉ−３ＰＭ体）０．３４０ｇ（０．９７５ｍｍｏｌ）と、４−オレオイルオキシフェニル酢酸０．８１３ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４７７ｇ（０．３９０ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．２ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ（東京化成工業（株）製）０．５６１ｇ（２．９３ｍｍｏｌ）を加え、３０−３５℃で３時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水６．８０ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３４０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．８７０ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ３Ｃ１を０．５８４ｇ得た。
【0160】
Ｏ−Ｐｈ−Ｐ３Ｃ１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ０．９２−１．０５（ｍ、２Ｈ）、δ１．２０−１．４２（ｍ、４０Ｈ）、δ１．５０−１．６０（ｍ、２Ｈ）、δ１．６２−１．８０（ｍ、１０Ｈ）、δ１．９０−２．０４（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５２−２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６１−２．６５（ｍ、４Ｈ）、δ２．７８−２．８２（ｍ、８Ｈ）、δ３．６１（ｓ、４Ｈ）、δ３．８９−４．０２（ｍ、４Ｈ）、δ５．３４−５．３７（ｍ、４Ｈ）、δ７．０２−７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６−７．３０（ｍ、４Ｈ）
【0161】
［実施例２］Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ１の合成Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ１は実施例１と同様の合成経路で合成した。
特許文献２に記載の方法で合成したビス｛２−［４−（ヒドロキシメチル）ピペリジル］エチル｝ジスルフィド（ｄｉ−４ＰＭ体）０．３４０ｇ（０．９７５ｍｍｏｌ）と、４−オレオイルオキシフェニル酢酸０．８５３ｇ（２．０５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４７７ｇ（０．３９０ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．２ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５６１ｇ（２．９３ｍｍｏｌ）を加え、３０−３５℃で３時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水６．８０ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３４０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．９００ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ１を０．６２９ｇ得た。
【0162】
Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２７−１．４２（ｍ、４４Ｈ）、δ１．６２−１．７６（ｍ、１０Ｈ）、δ１．９６−２．００（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５２−２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６４−２．６７（ｍ、４Ｈ）、δ２．８１−２．９３（ｍ、８Ｈ）、δ３．６０（ｓ、４Ｈ）、δ３．９３−３．９５（ｄ、４Ｈ）、δ５．３４−５．３７（ｍ、４Ｈ）、δ７．０２−７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６−７．３０（ｍ、４Ｈ）
【0163】
［実施例３］Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２の合成Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
特許文献２に記載の方法で合成したビス｛２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジル］エチル｝ジスルフィド（ｄｉ−４ＰＥ体）０．３５０ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４−オレオイルオキシフェニル酢酸０．８１３ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０−３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．１０ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２を０．７２２ｇ得た。
【0164】
Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２２−１．４２（ｍ、４６Ｈ）、δ１．５４−１．７６（ｍ、１２Ｈ）、δ１．９４−２．０３（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５２−２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６２−２．６６（ｍ、４Ｈ）、δ２．８０−２．８９（ｍ、８Ｈ）、δ３．５９（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１−４．１４（ｔ、４Ｈ）、δ５．３４−５．３７（ｍ、４Ｈ）、δ７．０２−７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６−７．３０（ｍ、４Ｈ）
【0165】
［実施例４］Ｏ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２Ｏ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
＜４−（オレオイルオキシメチル）フェニル酢酸の合成＞
オレイン酸無水物１３．２ｇ（２４．１ｍｍｏｌ）および４−（ヒドロキシメチル）フェニル酢酸（東京化成工業（株）製）２．０１ｇ（１２．１ｍｍｏｌ）をクロロホルム１９８ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ ０．５９０ｇ（４．８３ｍｍｏｌ）を加えて、室温で７時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液６６ｇで２回、イオン交換水６６ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム（関東化学（株）製）４．００ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン８７．０ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル５１．５ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、７．４７ｇの粗体を得た。得られた粗体５．９８ｇをカラム精製することで、４−（オレオイルオキシメチル）フェニル酢酸を１．０３ｇ得た。
【0166】
４−（オレオイルオキシメチル）フェニル酢酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．８９（ｔ、３Ｈ）、δ１．１５−１．３７（ｍ、２０Ｈ）、δ１．６０−１．６６（ｍ、２Ｈ）、δ１．９８−２．０４（ｍ、４Ｈ）、δ２．３２−２．３６（ｍ、２Ｈ）、δ３．６６（ｓ、２Ｈ）、δ５．０９（ｓ、２Ｈ）、δ５．３１−５．３８（ｍ、２Ｈ）、δ７．２５−７．２９（ｍ、２Ｈ）、δ７．３１−７．４４（ｍ、２Ｈ）
【0167】
＜Ｏ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２の合成＞ｄｉ−４ＰＥ体 ０．２５０ｇ（０．６６４ｍｍｏｌ）、４−（オレオイルオキシメチル）フェニル酢酸０．６００ｇ（１．３９ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０３２４ｇ（０．２６６ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム７．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．３８２ｇ（１．９９ｍｍｏｌ）を加え、３０−３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水５．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．２５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．８２３ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２を０．４６３ｇ得た。
【0168】
Ｏ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．８９（ｔ、６Ｈ）、δ１．２０−１．３０（ｍ、４６Ｈ）、δ１．５０−１．６５（ｍ、１２Ｈ）、δ１．９２−２．０３（ｍ、１２Ｈ）、δ２．３２−２．３６（ｔ、４Ｈ）、δ２．６２−２．６５（ｍ、４Ｈ）、δ２．８０−２．９０（ｍ、８Ｈ）、δ３．６１（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１−４．１４（ｔ、４Ｈ）、δ５．０９（ｓ、４Ｈ）、δ５．３１−５．３８（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６−７．２８（ｍ、４Ｈ）、δ７．３０−７．３２（ｍ、４Ｈ）
【0169】
［実施例５］Ｅ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２Ｅ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
＜コハク酸Ｄ−α−トコフェロールの酸無水物化＞
コハク酸Ｄ−α−トコフェロール（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）７０．０ｇ（１３２ｍｍｏｌ）をクロロホルム５６０ｇに室温で溶解させ、１０−１５℃まで冷却した。そこへ、ＤＣＣ（（株）大阪合成有機化学研究所製）１３．７ｇ（６６ｍｍｏｌ）をクロロホルム１４０ｇで溶解させた懸濁液を滴下により加え、１０−２５℃で２時間反応させた。反応溶液をろ過後、ろ液をエバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮物をヘキサン２１０ｇに再溶解させ、不溶物をろ過により除去した。得られたろ液をエバポレーターにより濃縮し、無水コハク酸Ｄ−α−トコフェロールを６４．２ｇ得た。
【0170】
無水コハク酸Ｄ−α−トコフェロールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８４−０．８７ｐｐｍ（ｍ、２４Ｈ）、δ１．０２−１．８５ｐｐｍ（ｍ、５２Ｈ）、δ１．９６（ｓ、６Ｈ）、δ２．０１（ｓ、６Ｈ）、δ２．０８（ｓ、６Ｈ）、δ２．５６−２．５９（ｔ、４Ｈ）、δ２．９０−２．９５（ｍ、８Ｈ）
【0171】
＜４−（Ｄ−α−トコフェロールヘミスクシニル）フェニル酢酸の合成＞無水コハク酸Ｄ−α−トコフェロール４３．１ｇ（４１．３ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシフェニル酢酸（東京化成工業（株）製）３．１３ｇ（２０．６ｍｍｏｌ）をクロロホルム６４７ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ（広栄化学（株）製）１．０１ｇ（８．２６ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液２１６ｇで２回、イオン交換水２１６ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム（関東化学（株）製）１２．９ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン２８４ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル１６８ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、１７．０ｇの粗体を得た。得られた粗体１３．６ｇをカラム精製することで、４−（Ｄ−α−トコフェロールヘミスクシニル）フェニル酢酸を３．４４ｇ得た。
【0172】
４−（Ｄ−α−トコフェロールヘミスクシニル）フェニル酢酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８３−０．８７ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、δ１．０２−１．８５ｐｐｍ（ｍ、２６Ｈ）、δ１．９６ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ）、δ２．０１ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ）、δ２．０８ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ）、δ２．５６−２．５９ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ）、δ２．７１−２．７６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、δ２．９２−２．９６ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、δ３．６６ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ）、δ７．０５−７．０８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、δ７．２７−７．３１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
【0173】
＜Ｅ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２の合成＞ｄｉ−４ＰＥ体 ０．３５０ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４−（Ｄ−α−トコフェロールヘミスクシニル）フェニル酢酸１．０４ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０−３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．３１ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｅ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２を０．８６０ｇ得た。
【0174】
Ｅ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８３−０．８７ｐｐｍ（ｍ、２４Ｈ）、δ１．０２−１．８５ｐｐｍ（ｍ、６６Ｈ）、δ１．９４−１．９８ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ）、δ２．００ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、δ２．０８ｐｐｍ（ｓ、６Ｈ）、δ２．５３−２．６６ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、δ２．７１−２．８５ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、δ２．８５−２．９５ｐｐｍ（ｍ、８Ｈ）、δ３．６５ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１−４．１４ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ）、δ７．０５−７．０８ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、δ７．２７−７．３１ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）
【0175】
［実施例６］Ｌ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２Ｌ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
＜リノール酸の酸無水物化＞
リノール酸（日油（株）製）６９．６ｇ（２４８ｍｍｏｌ）をクロロホルム５６０ｇに室温で溶解させ、１０−１５℃まで冷却した。そこへ、ＤＣＣ２５．１ｇ（１２１ｍｍｏｌ）をクロロホルム１４０ｇで溶解させた懸濁液を滴下により加え、１０−２５℃で２時間反応させた。反応溶液をろ過後、ろ液をエバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮物をヘキサン２１０ｇに再溶解させ、不溶物をろ過により除去した。得られたろ液をエバポレーターにより濃縮し、リノール酸無水物を６３．８ｇ得た。
【0176】
リノール酸無水物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．９０ｐｐｍ（ｔ、６Ｈ）、δ１．２５−１．４０ｐｐｍ（ｍ、３２Ｈ）、δ１．６１−１．６８（ｍ、４Ｈ）、δ１．９４−２．０５（ｍ、８Ｈ）、δ２．３９−２．４６（ｔ、４Ｈ）、δ５．３０−５．３８（ｍ、８Ｈ）
【0177】
＜４−リノレオイルオキシフェニル酢酸の合成＞リノール酸無水物４２．８ｇ（７８．９ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシフェニル酢酸６．００ｇ（３９．４ｍｍｏｌ）をクロロホルム６４７ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ１．９３ｇ（１５．８ｍｍｏｌ）を加えて、１５−２０℃で９時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液２１６ｇで２回、イオン交換水２１６ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム１２．９ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン２８４ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル１６８ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、１８．１ｇの粗体を得た。得られた粗体１４．５ｇをカラム精製することで、４−リノレオイルオキシフェニル酢酸を３．６６ｇ得た。
【0178】
４−リノレオイルオキシフェニル酢酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．７７−０．８９（ｔ、３Ｈ）、δ１．２７−１．４２（ｍ、４Ｈ）、δ１．７１−１．７７（ｍ、２Ｈ）、δ１．９９−２．０３（ｍ、４Ｈ）、δ２．５２−２．５６（ｍ、２Ｈ）、δ３．６４（ｓ、２Ｈ）、δ５．３４−５．３９（ｍ、４Ｈ）、δ７．０３−７．０６（ｍ、２Ｈ）、δ７．２８−７．３１（ｍ、２Ｈ）
【0179】
＜Ｌ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２の合成＞ｄｉ−４ＰＥ体 ０．３５０ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４−リノレオイルオキシフェニル酢酸０．８０８ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０−３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．０２ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｌ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２を０．６６８ｇ得た。
【0180】
Ｌ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８７−０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２４−１．４１（ｍ、３８Ｈ）、δ１．５５−１．７６（ｍ、１２Ｈ）、δ１．９３−２．０７（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５３−２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６３−２．６５（ｍ、４Ｈ）、δ２．７７−２．８９（ｍ、８Ｈ）、δ３．５９（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１−４．１３（ｔ、４Ｈ）、δ５．３４−５．３９（ｍ、８Ｈ）、δ７．０２−７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６−７．３０（ｍ、４Ｈ）
【0181】
［実施例７］ＨＤ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２ＨＤ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２は実施例１と同様の合成経路で合成した。
＜２−ヘキシルデカン酸の酸無水物化＞
２−ヘキシルデカン酸（東京化成工業（株）製）６．３６ｇ（２４．８ｍｍｏｌ）をクロロホルム５６ｇに室温で溶解させ、１０−１５℃まで冷却した。そこへ、ＤＣＣ２．５１ｇ（１２．１ｍｍｏｌ）をクロロホルム１４ｇで溶解させた懸濁液を滴下により加え、１０−２５℃で２時間反応させた。反応溶液をろ過後、ろ液をエバポレーターにより濃縮した。得られた濃縮物をヘキサン２１ｇに再溶解させ、不溶物をろ過により除去した。得られたろ液をエバポレーターにより濃縮し、２−ヘキシルデカン酸無水物を５．８３ｇ得た。
【0182】
２−ヘキシルデカン酸無水物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．９０ｐｐｍ（ｍ、１２Ｈ）、δ１．２５−１．４０ｐｐｍ（ｍ、４０Ｈ）、δ１．６１−１．６８（ｍ、８Ｈ）、δ２．３９−２．４６（ｍ、２Ｈ）
【0183】
＜２−ヘキシルデカノイルオキシフェニル酢酸の合成＞２−ヘキシルデカン酸無水物３．９０ｇ（７．８９ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシフェニル酢酸０．６００ｇ（３．９４ｍｍｏｌ）をクロロホルム６５ｇに溶解させた。そこへＤＭＡＰ０．１９３ｇ（１．５８ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９時間反応を行った。反応溶液を１０％酢酸水溶液２２ｇで２回、イオン交換水２２ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム１．５ｇを有機層へ加え、３０分間攪拌した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮した。濃縮物をヘキサン２８ｇで再溶解し、不溶物をろ過後、アセトニトリル１７ｇを用いた抽出を６回行った。アセトニトリル層を回収し、エバポレーターにて濃縮することで、１．６４ｇの粗体を得た。得られた粗体１．３２ｇをカラム精製することで、２−ヘキシルデカノイルオキシフェニル酢酸を０．３３３ｇ得た。
【0184】
２−ヘキシルデカノイルオキシフェニル酢酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．７７−０．８９（ｔ、６Ｈ）、δ１．２７−１．４２（ｍ、２０Ｈ）、δ１．７１−１．７７（ｍ、４Ｈ）、δ２．５２−２．５６（ｍ、２Ｈ）、δ３．６４（ｓ、２Ｈ）、δ７．０３−７．０６（ｍ、２Ｈ）、δ７．２８−７．３１（ｍ、２Ｈ）
【0185】
＜ＨＤ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２の合成＞ｄｉ−４ＰＥ体 ０．１１７ｇ（０．３１０ｍｍｏｌ）と、２−ヘキシルデカノイルオキシフェニル酢酸０．２５４ｇ（０．６５０ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０１５１ｇ（０．１２４ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム３．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．１７８ｇ（０．９３０ｍｍｏｌ）を加え、３０−３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水３ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．３２０ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、ＨＤ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２を０．２１０ｇ得た。
【0186】
ＨＤ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８７−０．９０（ｔ、１２Ｈ）、δ１．２３−１．４１（ｍ、４０Ｈ）、δ１．５４−１．７６（ｍ、２０Ｈ）、δ１．９３−１．９７（ｍ、４Ｈ）、δ２．５４−２．５７（ｍ、２Ｈ）、δ２．６３−２．６５（ｍ、４Ｈ）、δ２．８１−２．８９（ｍ、８Ｈ）、δ３．５９（ｓ、４Ｈ）、δ４．１１−４．１３（ｔ、４Ｈ）、δ７．００−７．０２（ｍ、４Ｈ）、δ７．２６−７．２９（ｍ、４Ｈ）
【0187】
［実施例８］Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２＜ｄｉ−４ＰＥ体水酸基のアミノ化＞
ｄｉ−４ＰＥ体 ０．８１５ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）と、フタルイミド（関東化学（株）製）０．８９２ｇ（６．０６ｍｍｏｌ）、およびトリフェニルホスフィン（関東化学（株）製） １．５９ｇ（６．０６ｍｍｏｌ）を室温でジクロロメタン５ｇに溶解させた。そこへアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＡＣＲＯＳ ＯＲＧＡＮＩＣＳ製）１．０５ｇ（５．２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間反応させた。反応溶液にメタノール１０gを加え、エバポレーターにて濃縮した後、濃縮物をメタノール４gで再溶解し、エチレンジアミン・一水和物（関東化学（株）製）５．０８g（６５．０ｍｍｏｌ）を加え、３５−４５℃で３時間反応させた。反応溶液をエバポレーターにて濃縮した後、濃縮物を５％リン酸二水素ナトリウム水溶液１０gで再溶解し、酢酸エチル１０gで３回洗浄を行った。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて水層をｐＨ１２に調整し、ジクロロメタン１０gで抽出を２回行い、硫酸ナトリウム（関東化学（株）製）１gを用いて脱水した。硫酸ナトリウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮することで、ｄｉ−４ＰＥ−ａｍｉｎｅ体を０．５７２g得た。
【0188】
ｄｉ−４ＰＥ−ａｍｉｎｅ体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１．２０−１．５５ｐｐｍ（ｍ、１０Ｈ）、δ１．５１−１．５４ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、δ１．９５−２．０５ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、δ２．５８−２．６６ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、δ２．７２ｐｐｍ（ｔ、４Ｈ）、δ２．７８−２．８３ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）、δ２．８９−２．９２ｐｐｍ（ｍ、４Ｈ）
【0189】
＜Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２の合成＞ｄｉ−４ＰＥ−ａｍｉｎｅ体 ０．３４８ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４−オレオイルオキシフェニル酢酸０．８１３ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０−３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、１．１０ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２を０．６２９ｇ得た。
【0190】
Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２２−１．４２（ｍ、４６Ｈ）、δ１．６１−１．７７（ｍ、１２Ｈ）、δ１．９２−２．０３（ｍ、１２Ｈ）、δ２．５２−２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６２−２．６６（ｍ、４Ｈ）、δ２．８０−２．８９（ｍ、８Ｈ）、δ３．２２−３．２５（ｍ、４Ｈ）、δ３．５４（ｓ、４Ｈ）、δ５．３２−５．３７（ｍ、６Ｈ）、δ７．０５−７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２５−７．２６（ｍ、４Ｈ）
【0191】
［実施例９］Ｏ−Ｐｈ−Ｃ３Ｍ＜Ｏ−Ｐｈ−Ｃ３Ｍの合成＞
特許文献２に記載の方法で合成したビス[｛Ｎ−メチル−Ｎ−（３-ヒドロキシプロピル）アミノ｝エチル]ジスルフィド（ｄｉ−ＭＡＰ体） ０．２７５ｇ（０．９２９ｍｍｏｌ）と、４−オレオイルオキシフェニル酢酸０．８１３ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ ０．０４５４ｇ（０．３７２ｍｍｏｌ）を室温でクロロホルム１０．５ｇに溶解させた。そこへＥＤＣ ０．５３４ｇ（２．７９ｍｍｏｌ）を加え、３０−３５℃で４時間反応させた。反応溶液を２０％食塩水７．００ｇで２回洗浄した後、硫酸マグネシウム０．３５０ｇを用いて脱水した。硫酸マグネシウムをろ過後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、０．８７１ｇの粗体を得た。得られた粗体をカラム精製することで、Ｏ−Ｐｈ−Ｃ３Ｍを０．４９８ｇ得た。
【0192】
Ｏ−Ｐｈ−Ｃ３Ｍの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２２−１．４２（ｍ、４４Ｈ）、δ１．７７−１．８２（ｍ、８Ｈ）、δ１．９９−２．０３（ｍ、８Ｈ）、δ２．２６（ｓ、６Ｈ）、δ２．２８−２．３０（ｔ、４Ｈ）、δ２．５２−２．５６（ｍ、４Ｈ）、δ２．６７−２．６９（ｍ、４Ｈ）、δ２．７９−２．８１（ｍ、４Ｈ）、δ３．５４（ｓ、４Ｈ）、δ４．１０−４．１３（ｔ、４Ｈ）、δ５．３２−５．３７（ｍ、４Ｈ）、δ７．０５−７．０５（ｍ、４Ｈ）、δ７．２５−７．２６（ｍ、４Ｈ）
【0193】
［比較例１］Ｏ−Ｐ４Ｃ２の合成特許文献２に記載の合成経路にて合成した。
【0194】
Ｏ−Ｐ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８６−０．９０（ｔ、６Ｈ）、δ１．２０−１．３５（ｍ、４０Ｈ）、δ１．５８−１．７０（ｍ、４Ｈ）、δ１．７５−１．８３（ｍ、４Ｈ）、δ１．９５−２．０５（ｍ、８Ｈ）、δ２．２４−２．３２（ｍ、１０Ｈ）、δ２．６６−２．７０（ｍ、４Ｈ）、δ２．７８−２．８２（ｍ、４Ｈ）、δ４．１０−４．１３（ｔ、４Ｈ）、δ５．１３−５．３８（ｍ、４Ｈ）
【0195】
［比較例２］Ｅ−Ｐ４Ｃ２の合成特許文献２に記載の合成経路にて合成した。
【0196】
Ｅ−Ｐ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．８３−０．８８（ｍ、２４Ｈ）、δ１．００−１．８１（ｍ、６６Ｈ）、δ１．９５−２．１０（ｍ、２２Ｈ）、δ２．５５−２．６０（ｔ、４Ｈ）、δ２．６２−２．６６（ｍ、４Ｈ）、δ２．７３−２．７７（ｔ、４Ｈ）、δ２．８０−２．８４（ｍ、４Ｈ）、δ２．８６−２．９５（ｍ、８Ｈ）、δ４．１２−４．１７（ｔ、４Ｈ）
【0197】
［試験例１］ｍＲＮＡ封入粒子の調製と物性評価１．エタノール希釈法によるｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
（１）脂質のエタノール溶液の調製
脂質のエタノール溶液は、５ｍＬチューブに５ｍＭのカチオン性脂質、５ｍＭリン脂質、５ｍＭコレステロールを総脂質量１３１．５ｎｍｏｌとなるように目的の割合で混合し、ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ（１ｍＭエタノール溶液）をさらに総脂質量の３％相当量添加し、全量が３０μＬとなるようにエタノールを加えることで調製した。
【0198】
（２）核酸の酸性バッファー溶液の調製核酸の酸性バッファー溶液は、エッペンドルフチューブにｍＲＮＡ溶液（濃度はインビトロ翻訳の効率により変化するが概ね０．６−０．８μｇ／μＬ）を３μｇとなるようにはかり取り、全量が４５μＬとなるように酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０，３０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を加えることで調製した。
【0199】
（３）エタノール希釈法によるＬＮＰ調製核酸の酸性バッファー溶液４５μＬを脂質のエタノール溶液３０μＬにボルテックスしながら加えた。続いて混合液へＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を９２５μＬ加えた。事前にＭＥＳ緩衝液１ｍＬを加えておいたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）へＬＮＰ溶液を全量移した。ＬＮＰ溶液の入っていた５ｍＬチューブへ１ｍＬのＭＥＳ緩衝液を加え、洗い込みを行った。本洗い込みは二度行った。遠心条件（２５℃，１０００ｇ，３ｍｉｎ）で約１００μＬまで限外濾過し濃縮した後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心条件（２５℃，１０００ｇ，１０ｍｉｎ）で濃縮した。最後に、ＰＢＳを用いて目的の脂質濃度になるようメスアップした。
【0200】
２．各種ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径、及び表面電位の測定粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）により測定した。上記１．の方法で調製した各種ＬＮＰの粒子径、表面電位の１例を表３〜９に示す。
【0201】
【表3】
【0202】
【表4】
【0203】
【表5】
【0204】
【表6】
【0205】
【表7】
【0206】
【表8】
【0207】
【表9】
【0208】
３．結果いずれのＬＮＰも好ましい形態である粒子径３０〜３００ｎｍであり、生理的ｐＨでの電荷（ゼータ電位）も、好ましい形態である−１５〜＋１５ｍＶであった。
【0209】
［試験例２］ｓｉＲＮＡ封入粒子の調製と物性評価１．マイクロ流路法によるｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
（１）脂質のエタノール溶液の調製
脂質のエタノール溶液は、エッペンドルフチューブに５ｍＭのカチオン性脂質、５ｍＭコレステロールを総脂質量９００ｎｍｏｌとなるように目的の割合で混合し、ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ（２ｍＭエタノール溶液）をさらに総脂質量の１．５％相当量添加し、全量が１００μＬとなるようにエタノールを加えることで調製した。
【0210】
（２）核酸の酸性バッファー溶液の調製核酸の酸性バッファー溶液は、５ｍＬチューブに４ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液を４．５μｇとなるようにはかり取り、全量が９００μＬとなるように酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０）を加えることで調製した。
【0211】
（３）マイクロ流路を用いたＬＮＰ調製核酸の酸性バッファー溶液および脂質のエタノール溶液をそれぞれシリンジにはかり取った。超高速ナノ医薬作成装置ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、核酸溶液を１８ｍＬ／ｍｉｎ、脂質溶液を２ｍＬ／ｍｉｎ、シリンジホルダー温度を３０℃の条件にて、ＬＮＰを調製し、１５ｍＬチューブへ回収した。１５ｍＬチューブへＰＢＳを３０００μＬ加えた後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ４へ移し、遠心条件（３０℃，１０００ｇ，６ｍｉｎ）で約１００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心条件（３０℃，１０００ｇ，６ｍｉｎ）で濃縮した。最後に、ＰＢＳを用いて目的の脂質濃度になるようメスアップした。
【0212】
２．各種ｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径、及び表面電位の測定粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法により測定した。［試験例５］の１に記載の方法で調製した各種ＬＮＰの粒子径、表面電位の１例を表１０〜１２に示す。
【0213】
【表10】
【0214】
【表11】
【0215】
【表12】
【0216】
３．結果いずれのＬＮＰも好ましい形態である粒子径３０〜３００ｎｍであり、生理的ｐＨでの電荷（ゼータ電位）も、好ましい形態である−１０〜＋１０ｍＶであった。
【0217】
［試験例３］Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａの測定１．各種ＬＮＰの調製
Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａの評価には核酸を封入していない空のＬＮＰを使用した。空のＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＰ−ＰＥＧ２ｋ＝６０：１０：３０：３）は［試験例１］に記載の方法において核酸を使用せずに粒子調製を行うことで作製した。
【0218】
２．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａの測定ｐＨ３．０〜１０．０の範囲で種々のｐＨに合わせた、終濃度１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液およびトリスＨＣｌ緩衝液を用意した。［試験例３］１．で調製したＬＮＰを脂質濃度として０．５ｍＭとなるようにＰＢＳで希釈した。ＴＮＳ（Ｓｉｇｍａ製）は０．６ｍＭとなるように超純水で希釈した。黒色９６ｗｅｌｌプレートにＴＮＳ溶液を２μＬ、各種ＬＮＰ溶液を１２μＬ、および種々のｐＨに調整した緩衝液を１８６μＬ加えた。プレートを遮光し、４００ｒｐｍで１０分間振盪した。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製）を用いて、蛍光強度（励起：３２１ｎｍ／発光：４４７ｎｍ）を測定した。各ＬＮＰにおける蛍光強度の最大値を１００％、最小値を０％として、相対蛍光強度を百分率で算出した。また、相対蛍光強度が５０％であるｐＨをＬｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａとした。各種ＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａの評価結果を表１３に示す。
【0219】
【表13】
【0220】
３．結果いずれのＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａも、エンドソーム脱出に好ましいｐＫａ（５．５〜７．２）の範囲内であった。また、カチオン性脂質のアミノ基周辺構造を改変することで、ＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａを調整することができた。
【0221】
［試験例４］ｐＨ７．４および５．５でのヘモライシス活性（膜融合能）の評価１．各種ＬＮＰの調整
ヘモライシス活性の評価には核酸を封入していない空のＬＮＰを使用した。空のＬＮＰは［試験例２］の１に記載の方法において核酸を使用せずに粒子調製を行うことで作製した。
【0222】
２．マウス赤血球の取得６−７週齢の雄のＩＣＲマウスを安楽死させ、下大静脈から血液約１０００μＬを採取した。取得した血液は直ちに０．５μＬのヘパリン溶液（５０００Ｕ／５ｍＬ）と混合した。血液にＰＢＳ約９ｍＬを加え全量を１０ｍＬとし、転倒混和した後、遠心分離を行った（４℃，４００ｇ，１０ｍｉｎ）。血漿成分を含む上清をパスツールピペットにより取り除いた。血球成分へＰＢＳ約９ｍＬを加え全量を１０ｍＬとし、再度遠心分離を行った。同様の洗浄作業を４度繰り返し、マウス赤血球を得た。
【0223】
３．ヘモライシス活性の評価マウス赤血球を２、４、６、８、１０μＬはかり取り、１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳで希釈した。全量を透明９６ｗｅｌｌプレートへ移し、プレートリーダーを用いて５４５ｎｍにおける吸光度を測定した。本希釈系列を用いて検量線を作成し、吸光度が１になる点をヘモライシスアッセイに使用する血球量として決定した。空のＬＮＰ溶液をエッペンドルフチューブにはかり取り、リンゴ酸−ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．５，ｐＨ６．５，ｐＨ７．４）で希釈し、さらにマウス赤血球を加えた。脂質の終濃度を１００μＭ、溶液の最終体積を２５０μＬとした。各チューブを１９００ｒｐｍで３０分間振盪した。各サンプルを遠心条件（４℃，４００ｇ，５ｍｉｎ）で遠心分離し、上清２００μＬを透明９６ｗｅｌｌプレートに移し５４５ｎｍにおける吸光度を測定した。ネガティブコントロールとして、未処理赤血球を用いた。ポジティブコントロールとして１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを用いた。各サンプルの吸光度はネガティブコントロールとポジティブコントロールで規格化した。
【0224】
４．結果結果を図１に示す。値が高い程、膜融合能（ヘモライシス活性）が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は生理的ｐＨ（７．４）ではヘモライシス活性を有さなかった。一方で、エンドソーム内環境ｐＨ（５．５）では８０％以上の高いヘモライシス活性を示した。
【0225】
［試験例５］各種ＬＮＰのｐＨ５．５でのヘモライシス活性の評価１．各種ＬＮＰの調整
空のＬＮＰは［試験例２］の１に記載の方法において核酸を使用せずに粒子調製を行うことで作製した。
【0226】
２．マウス赤血球の取得マウス赤血球の取得は「試験例４」に記載の方法で行った。
【0227】
３．ヘモライシス活性の評価マウス赤血球を２、４、６、８、１０μＬ測り取り、１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳで希釈した。全量を透明９６ｗｅｌｌプレートへ移し、プレートリーダーを用いて５４５ｎｍにおける吸光度を測定した。本希釈系列を用いて検量線を作成し、吸光度が１になる点をヘモライシスアッセイに使用する血球量として決定した。空のＬＮＰ溶液をエッペンドルフチューブにはかり取り、リンゴ酸−ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈し、さらにマウス赤血球を加えた。脂質の終濃度を１．５６、６．２５、２５、１００、４００μＭ、溶液の最終体積を２５０μＬとした。各チューブを１９００ｒｐｍで３０分間振盪した。各サンプルを遠心条件（４℃，４００ｇ，５ｍｉｎ）で遠心分離し、上清２００μＬを透明９６ｗｅｌｌプレートに移し５４５ｎｍにおける吸光度を測定した。ネガティブコントロールとして未処理赤血球、ポジティブコントロールとして１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を添加したものを用いた。各サンプルの吸光度はネガティブコントロールとポジティブコントロールで規格化した。
【0228】
４．結果結果を図２に示す。値が高い程、膜融合能（ヘモライシス活性）が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）はいずれも、比較例１のＬＮＰよりも、各種脂質濃度においてヘモライシス活性が高かった。Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰとＯ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰはヘモライシス活性に差はなかった。ｐＨ５．５においてヘモライシス活性が高いことは、エンドソーム内環境においてエンドソーム膜との相互作用が高いこと、つまり、エンドソームからの脱出効率が高いことを意味している。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、ヘモライシス活性が高いので、エンドソーム脱出に優位であることが分かる。
【0229】
［試験例６］インビトロにおける遺伝子発現の評価１１．各種ＬＮＰの調製
ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝６０：１０：３０）を［試験例１］の１に記載の方法で調製した。
【0230】
２．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価トランスフェクション２４時間前にヒト腎がん細胞ＯＳＲＣ２を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、培地を０．１ｍＭのＤ−ルシフェリンを含む培養培地（ＲＰＭＩ１６４０）へ交換した。調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で６μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液３３μＬ（ｍＲＮＡ０．２μｇ）を３．５ｃｍディッシュに加え、インキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏ（ＡＴＴＯ製）にセットした。ルシフェラーゼの発光強度を１時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、２４時間の累積発光強度を算出した。
【0231】
３．結果結果を図３に示す。値が高い程、即ち総ルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ１_ＬＮＰおよびＯ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、比較例１のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）と比較して、高い遺伝子発現を示した。
【0232】
［試験例７］インビトロにおける遺伝子発現の評価２１．各種ＬＮＰの調製
ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５２．５：７．５：４０）を［試験例１］の１に記載の方法で調製した。
【0233】
２．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価トランスフェクション２４時間前にマウス大腸がん細胞ＣＴ２６を８．０×１０４／２ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、培地を０．１ｍＭのＤ−ルシフェリンを含む培養培地へ交換した。調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で６μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液６７μＬ（ｍＲＮＡ０．４μｇ）を３．５ｃｍディッシュに加え、インキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏにセットした。ルシフェラーゼの発光強度を1時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、２４時間の累積発光強度を算出した。
【0234】
３．結果結果を図４に示す。値が高い程、即ち総ルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、比較例１のＬＮＰと比較して、高い遺伝子発現活性を示した。特に、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰは、比較例１のＬＮＰよりも１０倍程度高い遺伝子発現活性を示しており、インビトロでの優れたｍＲＮＡの送達能を有していることがわかる。
【0235】
［試験例８］インビボにおける遺伝子発現の経時評価１．各種ＬＮＰの調製
エリスロポエチンを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５２．５：７．５：４０）を［試験例１］に記載の方法で調製した。
【0236】
２．インビボにおける遺伝子発現の経時評価調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように尾静脈内投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０５ｍｇ/ｋｇ）。投与後０．５、１、２、３、６、９、２４時間後にマウス尾静脈から血液１５μＬを採取した。採取した血液は直ちに０．３μＬのヘパリン溶液（５０００Ｕ／５ｍＬ）と混合した。各血液サンプルを遠心条件（２５℃，２０００ｇ，２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上清を回収した。上清中のエリスロポエチン濃度をＭｏｕｓｅ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、Ｋｉｔのプロトコルに記載の方法で測定した。
【0237】
３．市販の遺伝子導入試薬ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）を用いたｍＲＮＡ−ＴｒａｎｓＩＴ複合体の調製本複合体の調製は文献（Ｔｈｅｓｓ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ． ２０１７）を参考に行った。ｍＲＮＡ溶液をｍＲＮＡが５μｇとなるようにエッペンドルフチューブにはかり取った。ｍＲＮＡ溶液をダルベッコ改変イーグル培地（Ｈｉｇｈ−Ｇｌｕｃｏｓｅ）で希釈し４９１μＬとした。そこへＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ試薬５．５μＬとｍＲＮＡ Ｂｏｏｓｔ試薬を３．５μＬ加え、２分インキュベーションすることでｍＲＮＡ−ＴｒａｎｓＩＴ複合体を調製した。
【0238】
４．インビボにおけるｍＲＮＡ−ＴｒａｎｓＩＴ複合体の遺伝子発現の経時評価本遺伝子発現活性評価は文献（Ｔｈｅｓｓ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ． ２０１７）を参考に行った。調製したｍＲＮＡ−ＴｒａｎｓＩＴ複合体を６週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内へ体重１ｇあたり５μＬ投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０５ｍｇ/ｋｇ）。各種タイムポイントでのマウス尾静脈からの血液採取、並びにエリスロポエチン濃度の定量を［試験例７］の２に記載の方法で行った。
【0239】
５．結果結果を図５に示す。値が高い程、即ちエリスロポエチン活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）はいずれも、市販の遺伝子導入試薬（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標））と比較して、高い遺伝子発現活性を示した。特に、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰは、市販の遺伝子導入試薬よりも１０倍程度高い遺伝子発現活性を示しており、インビボでの優れたｍＲＮＡの送達能を有していることがわかる。
【0240】
［試験例９］インビボにおける遺伝子ノックダウン活性の評価（肝臓へのｓｉＲＮＡの送達）１．各種ＬＮＰの調製
肝臓特異的タンパク質である凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）に対するｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰを［試験例２］の１に記載の方法で調製した。
【0241】
２．インビボ肝臓における遺伝子ノックダウン活性の評価調製したｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰをｓｉＲＮＡの濃度で２μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｓｉＲＮＡ封入ＬＮＰを、４週齢の雄のＩＣＲマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように尾静脈内投与した（ｓｉＲＮＡの投与量として０．０２ｍｇ/ｋｇ）。２４時間後にマウスを安楽死させ、下大静脈から血液約５００μＬを取得した。取得した血液は直ちに０．５μＬのヘパリン溶液（５０００Ｕ／５ｍＬ）と混合し、アッセイまで氷上で保存した。血中のＦＶＩＩ濃度はＢｉｏｐｈｅｎ ＶＩＩ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ａｎｉａｒａ社）を用い、Ｋｉｔのプロトコルに記載の方法にて測定した。各サンプル投与後２４時間におけるＦＶＩＩの血中濃度は未処理マウスの血中ＦＶＩＩ濃度により規格化した。
【0242】
３．結果結果を図６に示す。値が低い程、即ちＦＶＩＩタンパク質の発現活性が低い程、遺伝子ノックダウン活性が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ−Ｂｎ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）はいずれも、比較例１のＬＮＰよりも遺伝子ノックダウン活性が高く、特に、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰは、インビボでの優れたｓｉＲＮＡの送達能を有していることがわかる。
【0243】
［試験例１０］ｍＲＮＡ封入粒子の調製と物性評価１．マイクロ流路法によるｍＲＮＡ封入ＬＮＰの調製
（１）脂質のエタノール溶液の調製
脂質のエタノール溶液は、５ｍＬチューブに５ｍＭのカチオン性脂質、５ｍＭリン脂質、５ｍＭコレステロールを総脂質量２５５０ｎｍｏｌとなるように目的の割合で混合し、ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ（１ｍＭエタノール溶液）をさらに総脂質量の１．５％相当量添加し、全量が５１０μＬとなるようにエタノールを加えることで調製した。
【0244】
（２）核酸の酸性バッファー溶液の調製核酸の酸性バッファー溶液は、５ｍＬチューブにｍＲＮＡ溶液（濃度はインビトロ翻訳の効率により変化するが概ね０．６−０．８μｇ／μＬ）を１０．８μｇとなるようにはかり取り、全量が１３００μＬとなるように酸性リンゴ酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ３．０，３０ｍＭ ＮａＣｌを含む）を加えることで調製した。
【0245】
（３）マイクロ流路を用いたＬＮＰ調製核酸の酸性バッファー溶液および脂質のエタノール溶液をそれぞれシリンジにはかり取った。超高速ナノ医薬作成装置ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒを用いて、核酸溶液を３ｍＬ／ｍｉｎ、脂質溶液を１ｍＬ／ｍｉｎにてＬＮＰ調製を行い、１．２ｍＬを１５ｍＬチューブへ回収した。１５ｍＬチューブへｐＨ６．５の２０ｍＭのＭＥＳ（ＮａＯＨで調製）を３０００μＬ加えた後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ４へ移し、遠心（２５℃，１０００ｇ，３ｍｉｎ）を繰り返し、約３００μＬまで限外濾過し濃縮した。その後、ＰＢＳを用いて４ｍＬまでメスアップし、再度、遠心（２５℃，１０００ｇ，3ｍｉｎ）を繰り返し、濃縮した。最後に、ＰＢＳを用いて目的の脂質濃度になるようメスアップした。
【0246】
２．各種ｍＲＮＡ封入ＬＮＰの粒子径、及び表面電位の測定粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法により測定した。上記１．の方法で調製した各種ＬＮＰの粒子径、表面電位の１例を表１４〜２１に示す。
【0247】
【表14】
【0248】
【表15】
【0249】
【表16】
【0250】
【表17】
【0251】
【表18】
【0252】
【表19】
【0253】
【表20】
【0254】
【表21】
【0255】
３．結果いずれのＬＮＰも好ましい形態である粒子径３０〜３００ｎｍであり、生理的ｐＨでの電荷（ゼータ電位）も、好ましい形態である−１５〜＋１５ｍＶであった。
【0256】
［試験例１１］Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａの測定１．各種ＬＮＰの調製
Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａの評価には核酸を封入していない空のＬＮＰを使用した。空のＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ＝５２．５：７．５：４０：１．５）は［試験例１０］に記載の方法において核酸を使用せずに粒子調製を行うことで作製した。
【0257】
２．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａの測定Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａは［試験例３］に記載の方法で算出した。各種ＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａの値を表２２に示す。
【0258】
【表22】
【0259】
３．結果いずれのＬＮＰのＬｉｐｏｓｏｍａｌ ｐＫａも、エンドソーム脱出に好ましいｐＫａ（５．５〜７．２）の範囲内であった。Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２を加えることでｐＫａが向上した。
【0260】
［試験例１２］ｐＨ７．４および５．５でのヘモライシス活性（膜融合能）の評価１．各種ＬＮＰの調整
ヘモライシス活性の評価には核酸を封入していない空のＬＮＰを使用した。空のＬＮＰは［試験例１１］の１に記載の方法で作製した。
【0261】
２．マウス赤血球の取得［試験例４］の２に記載の方法でマウス赤血球を得た。
【0262】
３．ヘモライシス活性の評価［試験例４］の３に記載の方法でヘモライシス活性を評価した。
【0263】
４．結果結果を図７に示す。本発明のカチオン性脂質または比較例１のカチオン性脂質を用いたＬＮＰはいずれも生理的ｐＨ（７．４）ではヘモライシス活性を有さなかった。一方で、エンドソーム内環境ｐＨ（５．５）では本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰはいずれも比較例１のカチオン性脂質を用いたＬＮＰよりも優れたヘモライシス活性を有することがかわる。
【0264】
［試験例１３］インビトロにおける遺伝子発現の評価３１．各種ＬＮＰの調製
ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝５２．５：７．５：４０）を［試験例１０］の１に記載の方法で調製した。
【0265】
２．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価トランスフェクション２４時間前にヒト子宮頚がん細胞であるＨｅＬａ細胞を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、培地を０．１ｍＭのＤ−ルシフェリンを含む培養培地（Ｄ−ＭＥＭ）へ交換した。調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰをｍＲＮＡの濃度で約８μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈した。希釈したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液約５０μＬ（ｍＲＮＡ ０．４μｇ）を３．５ｃｍディッシュに加え、インキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏにセットした。ルシフェラーゼの発光強度を１時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、２４時間の累積発光強度を算出した。
【0266】
３．結果結果を図８に示す。値が高い程、即ち総ルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ、Ｌ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ、ＨＤ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２＋Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ、およびＬ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、比較例１のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）と比較して、高い遺伝子発現を示した。さらに、Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰおよびＯ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２＋Ｏ−Ｐｈ−ａｍｉｄｅ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰは、市販のｍＲＮＡ導入試薬よりも高い遺伝子発現活性を示した。
【0267】
［試験例１４］インビトロにおける遺伝子発現の評価４１．ＬＮＰの調製
ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ＝５２．５：７．５：４０：０．７５）を［試験例１０］の１の記載に類する方法で調製した。
【0268】
２．遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ）を用いたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｍＲＮＡの複合体の調製本複合体の調製は、メーカー記載のプロトコルに従って行った。エッペンドルフチューブにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１２５μＬおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ試薬を７．５μＬ加え、１０分間インキュベーションした。別のエッペンドルフチューブにｍＲＮＡ２．５μｇ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１２５μＬの溶液を調製した。そこへインュベートしたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ溶液を１２５μＬ加えて、５分間インキュベートすることでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｍＲＮＡの複合体を調製した。
【0269】
３．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価トランスフェクション２４時間前にヒト白血病Ｔ細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／１．８ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＤ−ルシフェリン入りの培地（ＲＰＭＩ１６４０）を各ディッシュに２００μＬ加えた。そこへ、各種濃度に調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液を８０μＬ（ｍＲＮＡとして０．４、０．８、１．６、３．２μｇ）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｍＲＮＡ複合体を４０、８０、１６０、３２０μＬ（ｍＲＮＡとして０．４、０．８、１．６、３．２μｇ）加え、インキュベーター型ルミノメーターＫｒｏｎｏｓＤｉｏにセットした。ルシフェラーゼの発光強度を３時間ごとに２分間計測した。得られた発現の時間変化から、４８時間の累積発光強度を算出した。
【0270】
４．結果結果を図９に示す。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、いずれのｍＲＮＡ量においても遺伝子導入試薬と比較して優れた遺伝子発現活性を示した。
【0271】
［試験例１５］インビトロにおける遺伝子発現の評価５１．ＬＮＰの調製
ＥＧＦＰを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（Ｏ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ＝５２．５：７．５：４０：０．７５）を［試験例１０］の１の記載に類する方法で調製した。
【0272】
２．遺伝子導入試薬を用いたＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｍＲＮＡの複合体の調製Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｍＲＮＡの複合体は［試験例１４］の２に記載の方法にて調製した。
【0273】
３．インビトロにおける遺伝子発現の経時評価トランスフェクション２４時間前にヒト白血病Ｔ細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／Ｄｉｓｈとなるように３．５ｃｍディッシュに播種した。２４時間後、各種濃度に調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰ溶液を８０μＬ（ｍＲＮＡとして ０．４、０．８、１．６、３．２μｇ）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｍＲＮＡ複合体を４０、８０、１６０、３２０μＬ（ｍＲＮＡとして ０．４、０．８、１．６、３．２μｇ）３．５ｃｍディッシュに加え、インキュベーターで２４時間培養した。培養液をＦＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳ）に交換し、フローサイトメーター（ＮｏｖｏＣｙｔｅ；ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にて測定を行い、遺伝子導入された細胞の分析を行った。
【0274】
４．結果結果を図１０に示す。値が高いほど多くの細胞に遺伝子導入されていることを表す。遺伝子導入試薬では、いずれのｍＲＮＡ量でも一部の細胞でのみ遺伝子発現しており、発現の均一性が低かった。対して、本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰでは、ｍＲＮＡ量に関係なく殆ど全ての細胞に遺伝子導入されており、発現の均一性が非常に高いことが分かる。
【0275】
［試験例１６］インビボにおける遺伝子発現の評価（皮下投与）１．各種ＬＮＰの調製
ルシフェラーゼを発現するｍＲＮＡを封入したＬＮＰ（カチオン性脂質：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝６０：３０：１０）を、[試験例１０]に記載のマイクロ流路を用いた方法にて調製した。
【0276】
２．インビボにおける遺伝子ノックダウン活性の評価調製したｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、６週齢の雌のＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスに体重１ｇあたり１０μＬとなるように頸背部に皮下投与した（ｍＲＮＡの投与量として０．０５ｍｇ／ｋｇ）。投与５時間半後、体重１ｇあたり１０μＬとなるようにマウスにルシフェリンを腹腔内投与した（ルシフェリンの投与量として１．５ｇ／ｋｇ）。３０分後、ＩＶＩＳイメージングシステムを用いてイメージングを行った。取得した画像からマウスの頸背部における輝度の平均値をＰｈｏｔｏｍｓ／ｓｅｃとして算出し、これを頸背部における遺伝子発現活性の指標とした。
【0277】
３．結果結果を図１１に示す。値が高い程、即ち総ルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いたＬＮＰ（Ｅ−Ｐｈ−Ｐ４Ｃ２_ＬＮＰ）は、マウスの皮下において比較例２よりも高い遺伝子発現活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【0278】
本発明によると、高効率で核酸を細胞内へ導入することが可能であるので、核酸医薬や遺伝子治療、生化学実験に有用である。【0279】
本出願は、日本で出願された特願２０１８−０６０７６４を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。【国際調査報告】