特開2016-106631IP Force 特許公報全文掲載

技術分野

非ヒト哺乳動物に関する。更に詳しくは、体細胞核移植法により得られるアレルギーモデル動物として使用可能なクローン非ヒト哺乳動物、及び該非ヒト哺乳動物を調製する方法

要約特許出願時に添付された[要約書]

【課題】抗原特異的CD4陽性T細胞クローン動物の作製技術を確立し、ダニやスギ花粉など、免疫アレルギー疾患との関連性が示唆されているさまざまな抗原に反応する非ヒト哺乳動物を提供すること。
【解決手段】室内塵、昆虫抗原、花粉抗原、食餌性抗原等に特異的なCD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用い、体細胞核移植法によって得られる、非ヒト哺乳動物及びその子孫、ならびに、CD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用いて体細胞核移植する、非ヒト哺乳動物の調製方法。
【選択図】なし

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

しかしながら、抗原特異的CD4陽性T細胞のクローンマウスは未だ樹立されていない。 本発明の課題は、抗原特異的CD4陽性T細胞クローン動物の作製技術を確立し、ダニやスギ花粉など、免疫アレルギー疾患との関連性が示唆されているさまざまな抗原に反応する非ヒト哺乳動物を提供することである。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明は、以下の〔1〕〜〔22〕に関する。 〔1〕 CD4陽性T細胞の核を核ドナーとして用い、体細胞核移植法によって得られる、非ヒト哺乳動物及びその子孫。 〔2〕 CD4陽性T細胞が、G0期及び/又はG1期のCD4陽性T細胞である、〔1〕記載の非ヒト哺乳動物及びその子孫。 〔3〕 T細胞受容体の遺伝子領域が、ダニ抗原特異的なT細胞受容体として再構成されている、前記〔1〕又は〔2〕記載の・・・ 続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る
【発明の効果】
本発明の非ヒト哺乳動物は、ダニ抗原やスギ花粉、卵白アルブミンなどに特異的なアレルギー反応を確実かつ効率的に呈するという優れた効果を奏するものである。また、本発明の非ヒト哺乳動物をアレルギーモデル動物として用いることによって、ダニ抗原やスギ花粉、卵白アルブミンなどに対する特異的生体反応に起因するアレルギー疾患における発症機構を解明し、その予防・治療法の開発に寄与することが可能となる。

この発明についての権利主張の範囲[特許請求の範囲]

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】図1は、抗原特異的CD4陽性T細胞の調製結果の一例を示す図である。感作マウスのCD4陽性T細胞について、IL-2の添加を制御した場合の結果と(左図)、IL-2を添加し続けた場合の結果(右図)を示す。なお、上図は調製後におけるCD4陽性T細胞の純度を、下図は細胞周期パターンを示す。

【図2】図2は、抗原としてMite Extract−Df (LG5339)を、アジュバントとしてCFAを用いて得られた2匹のクローンマウス(Df#1、Df#2)を用いて、末梢血CD4陽性T細胞における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。図中、CD4はCD4陽性T細胞の単独培養した場合を、APCは正常マウスの脾臓細胞にX線を照射することによって得た抗原提示細胞の単独培養した場合を、CD4+APCは CD4、APCを混合して培養した場合を、CD4+APC+DfはCD4、APCとダニ抗原を混合して培養した場合を表す。

【図3】図3は、クローンマウス(Df#1)の末梢血CD4陽性T細胞におけるTCRα鎖(TRAV)/TCRβ鎖(TRBV)のクローニング結果を示す図である。図中の数値は独自に付与したプライマーセット番号を、Mはマーカーを表す。

【図4】図4は、クローンマウス及びそのF1マウスのTCR genotypingの結果を示す図である。図中、親マウス(#1)、F1マウス(#1−1〜7)、野生型マウス(WT)を示す。

【図5】図5は、クローンマウスのF1マウスにおける抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。図中、「−」カラムは非特異抗原を反応させた場合、「Df」カラムは特異抗原を反応させた場合を示す。

【図6】図6は、抗原としてOVA 326-339部分ペプチドを用いて得られたクローンマウス(OVA#6)を用いて、末梢白血球における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。図中、−はCD4陽性T細胞の単独培養した場合を、OVA proteinはOVA proteinとAPCを混合培養した場合を、OVA 326-339はOVA 326-339部分ペプチドとAPCを混合培養した場合、OVA 323-339はOVA 323-339部分ペプチドとAPCを混合して培養した場合を表す。

【図7】図7は、抗原としてDerp1(RP−DP1D−1)を、アジュバントとしてCFAを用いて得られたクローンマウス(Dp#7〜11)を用いて、末梢白血球における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。図中、−はCD4陽性T細胞の単独培養した場合を、Der p1はDer p1とAPCを混合培養した場合を表す。

【図8】図8は、クローンマウスのT細胞における再構成TCRの発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。上段がCD4細胞における結果、下段がCD8細胞における結果である。

【図9】図9は、クローンマウス(Df#1、Df#2)における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。

【図10】図10は、クローンマウス(Dp#7)における抗原特異的増殖反応を解析した結果を示す図である。左図がタンパク全体とその部分ペプチドについて調べた結果、右図が左図において反応性を示したペプチド領域についてエピトープを調べた結果である。なお、図の下部に用いた部分ペプチドの詳細を示す。

【図11】図11は、クローンマウス(Dp#1、Dp#2)のCD4陽性T細胞の分化能をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。上半分がDp#1マウスについて、下半分がDp#2マウスについての結果である。なお、図中の「***」はDunnett’s法によるP<0.001を示す。

【図12】図12は、クローンマウス(Dp#1)の気管支喘息様気道炎症の発症を検討した結果を示す図である。上段が再構成TCRを有するクローンマウスにおける炎症細胞数についての結果、下段が通常マウスにおける気管支喘息様気道炎症の誘導結果を示す図である。

【図13】図13は、クローンマウス(OVA#6)の抗原誘発鼻粘膜反応の発症を検討した結果を示す図である。上段が鼻炎反応(くしゃみ反応)についての結果、下段が鼻腔内反応(炎症細胞数)についての結果を示す図である。

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