本明細書において報告するのは、抗炎症性抗体で処置された患者からの血清サンプル中の抗薬物抗体を検出するための干渉抑制イムノアッセイ及びその使用である。 発明の背景
新規治療用抗体の臨床開発では、適当なアッセイによる、それらの潜在的な免疫原性の評価が要求される（Kaliyaperumal, A. and Jing, S., Curr. Pharm. Biotechnol. 10 (2009) 352-358）。抗薬物抗体（ＡＤＡ）テストは、通常、２段階のアプローチを含む：（１）ＡＤＡ検出のためのアッセイ及び（２）ＡＤＡ特徴付けのためのアッセイ。ＡＤＡ検出アッセイは、スクリーニング及び特異性の確認（確証的）アッセイを含む。マイクロタイタープレートベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、それらのハイスループット効率、相対的な単純さ、及び高い感度のため、依然として、ＡＤＡについてスクリーニングするために最も広く使用されているフォーマットである（Geng, D., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 364-375）。ＡＤＡ ＥＬＩＳＡは、最もしばしば、高い選択性、全てのアイソタイプの検出、及び汎種ＡＤＡ検出能力を提供する架橋フォーマットにおいて設計されている（Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16）。 架橋ＥＬＩＳＡが開発され、抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブについてのスクリーニング及び確認ＡＤＡアッセイとして使用されてきた（Stubenrauch, K., et al., Clin. Ther. 32 (2010) 1597-1609）。 Stubenrauch, K.らは、ヒト抗体に曝露されたマウスからの血清サンプル中での薬物耐性を用いたジェネリック抗薬物抗体アッセイを報告している（Anal. Biochem. 430 (2012) 193-199）。Bourdage, J. S.らは、抗原コーティング濃度依存性に対する二重抗原架橋イムノアッセイフォーマットの効果及びモノクローナル抗体のための免疫原性アッセイを設計するための意義を報告している（J. Pharm. Biochem. Anal. 39 (2005) 685-690）。Mikulskis, A.らは、薬物開発のサポートにおける頑強な、薬物耐性の免疫原性アッセイの開発のための選択肢のプラットフォームとして溶液ＥＬＩＳＡを報告している（J. Immunol. Meth. 365 (2010) 38-49）。Pan, J.らは、２つのバイオ治療薬の免疫原性テストにおいて、NIDSA（登録商標）迅速アッセイとＥＬＩＳＡ方法との比較を報告している（J. Pharm. Tox. Meth. 63 (2010) 150-159）。 WO 2009/077127において、識別アッセイが報告されている。 Qiu, Z. J.らは、自己免疫血清中のヒト抗治療用抗体の検出のための新規の均一ビオチン−ジゴキシゲニンベースのアッセイを報告している（J. Immunol. Meth. 362 (2010) 101-111）。 発明の概要
本明細書において報告するのは、治療用抗体を用いて処置された患者のサンプルを含む血清中での抗薬物抗体（ＡＤＡ）の検出のためのスクリーニング、確認、及び追跡調査アッセイとして使用することができる架橋酵素結合免疫吸着アッセイ（架橋ＥＬＩＳＡ）である。本明細書において報告するアッセイは、サンプルを含む血清が、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ（ＲＡ）など）を伴う患者からである場合に特に有用である。 本明細書において報告するアッセイは、分析されるサンプル中の治療用抗体の量に関して、改善された耐性（ＡＤＡ ＥＬＩＳＡでの増加した薬物耐性）を示し、及び、同時に、偽陽性のアッセイ結果の数が低下する。 本明細書において報告するアッセイを用いて、遊離薬物による、及びリウマチ因子（ＲＦ）による干渉を最小限にすることができることが見出されている。 このアッセイは、サンプルが、抗薬物抗体の検出のためのイムノアッセイにおいて干渉することができ、このように、偽陽性のイムノアッセイ結果を説明しうる、問題の抗薬物抗体以外の抗体を含む場合に特に有用である。 一実施形態において、本明細書において報告する方法は、抗炎症治療のために使用される薬物抗体の抗薬物抗体の決定のために使用される。 増加した薬物耐性は、以下の相乗的な相互作用により達成された：１）ビオチン化及びジゴキシゲニン化捕捉及びトレーサー試薬の濃度を増加させること；２）血清サンプルと捕捉試薬及びトレーサー試薬との同時（連続の代わりの）インキュベーション；３）長期インキュベーション時間；４）均一にモノ共役された捕捉試薬及びトレーサー試薬の使用；並びに５）増加した血清マトリックス含量の使用。 リウマチ因子からの干渉は、添加剤としてのオリゴマーヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の添加により抑制することができる。 本明細書において報告する干渉抑制ＡＤＡアッセイの薬物耐性は、当技術分野において公知のアッセイよりも少なくとも１０倍高い。 本明細書において報告する一態様は、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を含むサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイであり、ここで、
ａ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、０．５μg/mlを上回る濃度で用いられ、
ｂ）サンプルは、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と４〜２４時間にわたり同時にインキュベートされ、
ｃ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、単一のリジン残基を介して誘導体化され、
ｄ）サンプルは、７．５%血清又はそれ以上を含み、並びに
ｅ）オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前にサンプルに加える。 本明細書において報告する一態様は、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を含む、関節リウマチ患者のサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイであって、ここで、
ａ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイにおいて０．５μg/ml又はそれ以上の濃度を有し、
ｂ）サンプルを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と０．５〜２４時間にわたり同時にインキュベートし、
ｃ）捕捉薬物抗体は、捕捉薬物抗体及び特異的結合対の第１成分の１：１コンジュゲートであり、トレーサー薬物抗体は、トレーサー薬物抗体及び検出可能な標識の１：１コンジュゲートであり、
ｄ）サンプルは１%血清又はそれ以上を含み、並びに
ｅ）オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前にサンプルに加える。 一実施形態において、サンプルは、５%血清又はそれ以上を含む。一実施形態において、サンプルは、７．５%血清又はそれ以上を含む。 一実施形態において、サンプルは、抗薬物抗体及びリウマチ因子を含む。 一実施形態において、薬物抗体は、炎症性疾患の処置のための抗体である。一実施形態において、炎症性疾患の処置のための抗体は、自己免疫疾患の処置のための抗体である。一実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ又は若年性関節炎又は変形性関節症又はキャッスルマン病である。 一実施形態において、薬物抗体は、癌の処置のための抗体である。一実施形態において、抗体は、骨髄腫又は形質細胞腫の処置のためである。 一実施形態において、薬物抗体は、ＩＬ−６受容体に対する（抗ＩＬ６Ｒ抗体）、又はＩＧＦ−１受容体（抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、又はＩＬ−１３受容体１α（抗ＩＬ１３Ｒ１α抗体）に対する、又はＯＸ４０Ｌ（抗ＯＸ４０Ｌ抗体）に対する、又は腫瘍壊死因子α（抗ＴＮＦα抗体）に対する抗体である。一実施形態において、薬物抗体は、抗ＩＬ６Ｒ抗体である。一実施形態において、抗ＩＬ６Ｒ抗体は、トシリズマブである。 一実施形態において、捕捉薬物抗体は、固相にコンジュゲートされている。一実施形態において、固相への捕捉薬物抗体のコンジュゲーションは、特異的結合対を介して実施される。一実施形態において、特異的結合対（第１成分／第２成分）は、ストレプトアビジン若しくはアビジン／ビオチン、又は抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと）、又はレクチン／多糖類、又はステロイド／ステロイド結合タンパク質、又はホルモン／ホルモン受容体、又は酵素／基質、又はＩｇＧ／プロテインＡ及び／若しくはＧより選択される。 一実施形態において、捕捉薬物抗体は、（特異的結合対の第１成分として）ビオチンにコンジュゲートされる。この場合において、固相へのコンジュゲーションは、固定化されたアビジン又はストレプトアビジンを介して実施される。 一実施形態において、トレーサー薬物抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされる。一実施形態において、トレーサー薬物抗体は、特異的結合対を介して検出可能な標識にコンジュゲートされる。一実施形態において、特異的結合対（第１成分／第２成分）は、ストレプトアビジン若しくはアビジン／ビオチン、又は抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと）、又はレクチン／多糖類、又はステロイド／ステロイド結合タンパク質、又はホルモン／ホルモン受容体、又は酵素／基質、又はＩｇＧ／プロテインＡ及び／若しくはＧより選択される。 一実施形態において、トレーサー薬物抗体は、（検出可能な標識として）ジゴキシゲニンにコンジュゲートされる。この場合において、検出可能な標識への連結は、ジゴキシゲニンに対する抗体を介して実施される。 一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において約０．５μg/mlから約１０μg/mlの濃度を有する。一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、０．５μg/ml超から１０μg/ml未満の濃度を有する。一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、約１μg/mlから約５μg/mlの濃度を有する。一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、約１．４μg/mlから約１．８μg/mlの濃度を有する。一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、約１．４５μg/mlから約１．６μg/mlの濃度を有する。好ましい一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、約１．５μg/mlの濃度を有する。 一実施形態において、インキュベーション時間は、少なくとも６時間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、少なくとも１２時間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、少なくとも１６時間である。 一実施形態において、インキュベーション時間は、最大２４時間である。 一実施形態において、インキュベーション時間は、４時間と２４時間の間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、６時間と２４時間の間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、１２時間と２４時間の間である。好ましい一実施形態において、インキュベーション時間は、１２時間と２０時間の間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、１４時間と１８時間の間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、約１６時間である。 一実施形態において、サンプルは、１%〜２０%血清を含む。一実施形態において、サンプルは、約１０%血清を含む。 一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、１０μg/mlから１０００μg/mlの最終濃度まで加える。一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、１５μg/mlから５００μg/mlの最終濃度まで加える。一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、２０μg/mlから２５０μg/mlの最終濃度まで加える。一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、２５μg/mlから１００μg/mlの最終濃度まで加える。好ましい一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、約５０μg/mlの最終濃度まで加える。 本明細書において報告する一態様は、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を含む、関節リウマチ患者のサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイであって、ここで、
ａ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイにおいて約１．５μg/mlの濃度を有し、
ｂ）サンプルを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と１４〜１６時間にわたり同時にインキュベートし、
ｃ）捕捉薬物抗体は、捕捉薬物抗体のリジン残基を介した捕捉薬物抗体及びビオチンの１：１コンジュゲートであり、トレーサー薬物抗体は、トレーサー薬物抗体のリジン残基を介したトレーサー薬物抗体及びジゴキシゲニンの１：１コンジュゲートであり、
ｄ）サンプルは１%〜２０%血清を含み、並びに
ｅ）オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前に、２５μg/ml〜１００μg/mlの最終濃度までサンプルに加える。 本明細書において報告する一態様は、抗薬物抗体ＥＬＩＳＡにおけるリウマチ因子の捕捉のためのオリゴマーヒトＩｇＧの使用である。 本明細書において報告する一態様は、治療的抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗薬物抗体の存在を決定することを含む、疾患を有する個体を処置する方法である。 本明細書において報告する一態様は、抗ＩＬ６Ｒ抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、炎症性疾患を有する個体を処置する方法である。 一実施形態において、炎症性疾患は、自己免疫疾患である。一実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節炎、変形性関節症、又はキャッスルマン病より選択される。 一実施形態において、炎症性疾患は、メサンギウム増殖性糸球体腎炎である。 本明細書において報告する一態様は、抗ＩＬ６Ｒ抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、形質細胞腫を有する個体を処置する方法である。 本明細書において報告する一態様は、抗ＩＬ６Ｒ抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、骨髄腫を有する個体を処置する方法である。 本明細書において報告する一態様は、ＩＬ６Ｒ活性を阻害するための抗ＩＬ６Ｒ抗体の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、個体においてＩＬ６Ｒ活性を阻害する方法である。

要約特許出願時に添付された[要約書]

【課題】捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を含むサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出方法を提供する。
【解決手段】酵素結合免疫吸着アッセイであって、ここでは、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、０．５μg/ml又はそれ以上の濃度で用いられ、サンプルを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と１〜２４時間にわたり同時にインキュベートし、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を、単一のリジン残基を介して誘導体化し、サンプルは１０%血清を含み、オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前にサンプルに加える工程を含む。
【選択図】なし

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