特許6037393IP Force 特許公報全文掲載

技術分野

幹細胞から分化誘導された細胞集団に残存する未分化細胞の選択的除去方法、そのための薬剤、並びに当該方法により得られる分化細胞または当該薬剤を用いた細胞移植治療用組成物など

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明の目的は、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団内に残存し、移植後の腫瘍化の原因となる未分化細胞を標的化して殺傷することにより選択除去する手段を提供することであり、それによって腫瘍化リスクのない安全な移植細胞・薬効、毒性評価系としての信頼性の高い分化細胞を提供し、幹細胞を用いた細胞移植治療の実用化、創薬開発の進展への途を開くことである。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

前述のとおり、従来の、ヒトiPS細胞をはじめとする多能性幹細胞を用いた細胞移植治療の実用化へ向けた安全面での取り組みは、いずれも腫瘍発生の抑制を主眼とするものしかなかった。しかしながら、導入遺伝子の組合せや導入、あるいは由来となる体細胞の選択といった予防的措置では、せいぜいES細胞と同等レベルまで腫瘍化リスクを低減させることができるのみであり、未分化細胞の混在という根本的な問題を解決すること・・・ 続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る
【発明の効果】
本発明によれば、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団の中に残存する未分化細胞および/または腫瘍化の原因となる細胞を選択的に殺傷除去することができ、腫瘍化リスクの低減された安全な移植細胞・目的細胞以外の細胞の混在の低減された均一な分化細胞の提供が可能となり、多能性幹細胞を用いた細胞移植治療・ハイスループットなin vitro薬効・毒性試験の実現に大いに寄与する。

この発明についての権利主張の範囲[特許請求の範囲]

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】多因子癌細胞特異的増殖制御型アデノウイルス(m-CRA)作製に用いるプラスミドの構造を示す模式図である。

【図2】実施例で用いた(a)非増殖型アデノウイルスおよび(b)多因子増殖制御型アデノウイルスの構造を示す模式図である。

【図3】ヒトES細胞(KhES1)およびヒトiPS細胞(253G1および201B7)におけるサバイビン(Survivin)およびTERT遺伝子の発現を示す図である。内部標準としてグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)を用いた。

【図4】ヒトES細胞(KhES1)およびヒトiPS細胞(253G1および201B7)におけるサバイビン(Surv)およびTERT遺伝子のプロモーター活性を示す図である。各カラム左からサバイビンプロモーター、TERTプロモーター、RSVプロモーターおよびCMVプロモーターの制御下にあるlacZ遺伝子の発現を示す。No Virusはウイルス非感染を示す。

【図5-1】ヒトiPS細胞(253G1)に二種類のm-CRA(TERT.m-CRA、Survivin.m-CRA)または非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CA-EGFP)をMOI(Multiplicity of infection; 感染多重度;細胞一個当たりの感染性ウイルス数) 3(左)、またはMOI 10(右)で感染させた場合の、ウイルス感染1日後(Day1)、2日後(Day2)、3日後(Day3)、4日後(Day4)、7日後(Day7)における非感染細胞(No Virus)に対するウイルス感染細胞の生細胞の割合(Viability (% of non-treated control))を示す図である。

【図5-2】ヒトiPS細胞(201B7)に二種類のm-CRA(TERT.m-CRA、Survivin.m-CRA)または非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CA-EGFP)をMOI 3(左)、またはMOI 10(右)で感染させた場合の、ウイルス感染1日後(Day1)、2日後(Day2)、3日後(Day3)、4日後(Day4)、7日後(Day7)における非感染細胞(No Virus)に対するウイルス感染細胞の生細胞の割合(Viability (% of non-treated control))を示す図である。

【図5-3】ヒトES細胞(KhES1)に二種類のm-CRA(TERT.m-CRA、Survivin.m-CRA)または非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CA-EGFP)をMOI 3(左)、またはMOI 10(右)で感染させた場合の、ウイルス感染1日後(Day1)、2日後(Day2)、3日後(Day3)、4日後(Day4)、7日後(Day7)における非感染細胞(No Virus)に対するウイルス感染細胞の生細胞の割合(Viability (% of non-treated control))を示す図である。

【図6】ヒトES細胞(KhES1; 図6a)、ヒトiPS細胞(201B7; 図6bおよび253G1; 図6c)に自発的な分化を誘導して1週間後に、m-CRA(TERT.m-CRA、Survivin.m-CRA)または非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.dE1.3)をMOI 10で感染させ、残存未分化細胞が増殖できる環境下で2週間培養した後に出現するアルカリフォスファターゼ陽性細胞(未分化細胞)のコロニー数を示す図である。No virusはウイルス非感染を示す。

【図7】自発的な分化誘導後のヒトES細胞(KhES1)およびヒトiPS細胞(253G1および201B7)における、NanogおよびOct3/4(未分化マーカー)、Nestin(外胚葉マーカー)、GATA4(内胚葉マーカー)、Brachyury(中胚葉マーカー)、サバイビンおよびTERT遺伝子の発現を示す図である。内部標準としてGAPDHを用いた。

【図8】25日間分化誘導を行った後m-CRA(TERT.m-CRA、Survivin.m-CRA)または非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CA-EGFP)を感染させたヒトES細胞(KhES1)における、感染2日後(day2)(図8a)および3日後(day3)(図8b)の細胞の様子とEGFP発現の観察結果を示す図である。

【図9-1】ヒトiPS細胞(201B7)から胚様体(EB)形成を誘導後15日目(Day15)にm-CRA(TERT.m-CRA、Survivin.m-CRA)または非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CA-EGFP)をMOI 10で感染させ、感染翌日(day16)から6日目(day21)までの細胞の様子とEGFP発現の観察結果を示す図である。

【図9-2】ヒトiPS細胞(253G1)から胚様体(EB)形成を誘導後15日目(Day15)にm-CRA(TERT.m-CRA、Survivin.m-CRA)または非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CA-EGFP)をMOI 10で感染させ、感染翌日(day16)から6日目(day21)までの細胞の様子とEGFP発現の観察結果を示す図である。

【図9-3】ヒトES細胞(KhES1)から胚様体(EB)形成を誘導後15日目(Day15)にm-CRA(TERT.m-CRA、Survivin.m-CRA)または非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CA-EGFP)をMOI 10で感染させ、感染翌日(day16)から6日目(day21)までの細胞の様子とEGFP発現の観察結果を示す図である。

【図10】胚様体形成法による分化誘導後0(day0)、7(day7)、15(day15)および22日目(day22:15日目にm-CRA(TERT.m-CRA、Survivin.m-CRA)または非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CA-EGFP)をMOI 10で感染)のヒトES細胞(KhES1)における、NanogおよびOct4(未分化マーカー)、TP63(外胚葉系のマーカー)、GATA4(内胚葉系のマーカー)、サバイビンおよびTERT遺伝子の発現を示す図である。内部標準としてGAPDHを用いた。

選択図 図1出願人が指定した本件の代表的な図

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