【図1】パネルＡおよびＢ、ＮＨＥＪ事象を受けた一組のジンクフィンガーヌクレアーゼ対による目的とする位置での切断を測定するＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）の結果を示すゲルを示す。ＮＨＥＪは、ヌクレオチド塩基の挿入または欠失（「挿入欠失」）を引き起こし、これは、その後、ＤＮＡ鎖が野生型ＤＮＡ鎖とアニーリングされるときにミスマッチをもたらす。その後、Ｃｅｌ−Ｉ酵素は、このミスマッチ部位でＤＮＡを切断し、２つの小さい断片を作成する。図は、Ｋ５６２細胞（図１Ａ）またはマウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞（図１Ｂ）へのＨＰＲＴジンクフィンガーヌクレアーゼ対のトランスフェクション後の結果を示す。パーセントミスマッチ、または「％ＮＨＥＪ」は修飾された対立遺伝子の割合に相当し、各対のヌクレアーゼ活性の程度であり、各レーンの下に示される。ＧＦＰは、ＧＦＰコードプラスミドでトランスフェクトした対照細胞である。

【図2】ＨＰＲＴ特異的ＺＦＮでトランスフェクトし、その後、６−ＴＧで処理した細胞における挿入欠失のパーセントを測定するゲルを示す。Ｋ５６２細胞もＣＣＲ５またはグルココルチコイド受容体遺伝子座（ＧＲ）のいずれかに特異的なＺＦＮ対でトランスフェクトした。Ｃｅｌ−Ｉ実験（上述）を、６−ＴＧで増殖させた１０〜１４日後にＨＰＲＴ遺伝子座における細胞上で行った。ＨＰＲＴ耐性細胞は、ＨＰＲＴ遺伝子座を標的としたＺＦＮで処理した試料でのみ観察された。レーンの上部に１〜１３で番号付けし、以下を示す：レーン１〜３は、６−ＴＧの不在下（レーン２）または６−ＴＧの存在下（レーン３）でのＺＦＮ投与（レーン１）の３日後の８０ｎｇのＨＰＲＴ特異的ＺＦＮおよび４００ｎｇのＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（例えば、米国特許第７，９５１，９２５号を参照のこと）を用いたＣｅｌ−Ｉ結果を示す。レーン４〜６は、６−ＴＧの不在下（レーン５）または６−ＴＧの存在下（レーン６）でのＺＦＮ投与（レーン４）の３日後の２０ｎｇのＨＰＲＴ特異的ＺＦＮおよび８０ｎｇのＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（例えば、米国特許第７，９５１，９２５号）を用いたＣｅｌ−Ｉ結果を示す。レーン７〜９は、６−ＴＧの不在下（レーン８）または６−ＴＧの存在下（レーン９）でのＺＦＮ投与（レーン７）の３日後の８０ｎｇのＨＰＲＴ特異的ＺＦＮおよび４００ｎｇのＧＲ特異的ＺＦＮ（例えば、米国特許公開第２００８０１８８０００号）を用いたＣｅｌ−Ｉ結果を示す。レーン１０〜１３は、６−ＴＧの不在下（レーン１１）または６−ＴＧの存在下（レーン１２）またはＧＦＰの存在下（レーン１３）でのＺＦＮ投与（レーン１０）の３日後の２０ｎｇのＨＰＲＴ特異的ＺＦＮおよび８０ｎｇのＧＲ特異的ＺＦＮ（例えば、米国特許公開第２００８０１８８０００号）を用いたＣｅｌ−Ｉ結果を示す。

【図3】ＨＰＲＴ特異的ＺＦＮ、ならびにＣＣＲ５遺伝子座を標的とするＺＦＮの別の対でトランスフェクトしたＫ５６２細胞における挿入欠失のパーセントを測定するゲルを示す。その後、これらの細胞を６−ＴＧ上で選択した。選択後、ＤＮＡを細胞から単離し、Ｃｅｌ−ＩアッセイをＣＣＲ５遺伝子座で行った。見ることができるように、６−ＴＧ上でのトランスフェクト細胞の選択は、ＣＣＲ５で切断された細胞を富化する。レーンは以下の通りである：試料番号レーン（１、２等）は、トランスフェクションの３日後に回収したＤＮＡ上で行ったＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示す。ボックスで囲まれたゲルの上の数字または（−）は、トランスフェクション反応において使用したＤＮＡのｎｇを示す。「＊＊」が操作した偏性ヘテロ二量体性ＥＬＤ／ＫＫＲ ＦｏｋＩドメインを有するヌクレアーゼ対の使用を示す一方で、「＊」は、ヌクレアーゼ対がＤＤ／ＲＲ ＦｏｋＩ偏性ヘテロ二量体ドメインを含むことを示す。米国特許公開第２０１１０２０１０５５号を参照されたい。試料区分において、（−）または（＋）は、それぞれ、６−ＴＧの不在下または６−ＴＧの存在下で増殖した細胞から単離したＤＮＡを示す。観察された修飾パーセントは、各レーンの下に示される。

【図4】ＨＰＲＴ遺伝子座に導入した制限部位での切断パーセントを測定するゲルを示す。Ｋ５６２細胞を、ＨＰＲＴ特異的ＺＦＮを含むベクターでトランスフェクトした。新規の制限部位、および挿入部位に隣接するＨＰＲＴ遺伝子座と相同のより短い（３５９ヌクレオチド長）またはより長い（７２５ヌクレオチド長）領域（「アーム」）のいずれかを含むドナー分子も含んだ。すべてのドナーをプラスミドに基づくアプローチを用いて導入したがある一連の実験において、ドナープラスミドは、エンハンサー要素（「短いアーム＋ｅｎ」）をさらに担持した。すべての条件は、制限部位を担持するドナーのＨＰＲＴ遺伝子座への導入に成功し、６−ＴＧ選択を用いたときに最大３倍および対立遺伝子の４０％を超えるレベルまで富化した。

【図5】パネルＡおよびＢ、Ｋ５６２細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子座へのＧＦＰ導入遺伝子の組み込みを示す。図５Ａは、導入遺伝子が、ＰＣＲに基づく半定量的アッセイにおいて測定したときに６−ＴＧ選択によって２〜３倍富化したドナーの相同組換えによって組み込まれたことを示す。図５Ｂは、アッセイにおける増幅のために用いた３個のＰＣＲプライマーの位置を示す図解を示し、組み込みがより大きいＰＣＲ産物のｐｇｋｒ１＋１５５１２ｆプライマー対からの産生を引き起こす（５Ａにおいて矢印で示される）一方で、ＨＰＲＴ ｒ１−１６０７８＋１５５１２ｆプライマー対が修飾されていない遺伝子座からより短いバンドを生成することを示す。一般的な順方向プライマー１５５１２ｆの使用ならびに野生型特異的バンドおよび組み込み特異的バンドの両方の生成は、ＰＣＲ反応が標的組み込みの効率の半定量的評価として用いられることを可能にした。

【図6】ＨｈａＩ制限部位を含むドナーのβ−グロビン遺伝子座への標的組み込み後の制限酵素消化の結果を示すゲルである。この実験において、ドナーを、ＨＰＲＴに特異的なＺＦＮ、ＺＦＮに特異的なβ−グロビン、およびβ−グロビン特異的ドナーの共トランスフェクション後にＫ５６２細胞におけるβ−グロビン遺伝子座に挿入した。トランスフェクションから回復した後、細胞を分け、１つの群を６−ＴＧ選択した。ＤＮＡを細胞から単離し、β−グロビン遺伝子座をＰＣＲ増幅し、その後、ＨｈａＩ制限消化に供した。βグロビン遺伝子座での遺伝子挿入（矢印で示される）の成功に関連したＨｈａ Ｉ特異的断片の頻度の劇的な増加が６−ＴＧ選択後に観察された。

【図7】動員ヒトＣＤ３４＋幹細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子座の修飾を示すゲルである。ＨＰＲＴ特異的ＺＦＮ発現プラスミドをＣＤ３４＋細胞にトランスフェクトし、ヌクレオフェクションからの回復後、これらを分け、６−ＴＧ選択した。ＨＰＲＴ遺伝子座の修飾を上述のＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて分析し、挿入欠失のパーセントが各レーンの下に示される。６−ＴＧ選択は、この細胞プールにおけるＨＰＲＴ修飾ゲノムの割合を増加させた。

【図8】パネルＡおよびＢ、ＨＰＲＴ特異的ＴＡＬＥＮを用いたＫ５６２細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子座の修飾を示す。図８Ａは、ヌクレアーゼ処理細胞由来のＨＰＲＴ遺伝子座をＰＣＲ増幅し、その後、Ｃｅｌ−Ｉアッセイに供したＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示す。これらの組の上の三角形は、トランスフェクションで用いたＴＡＬＥＮ発現プラスミドの増加量を示す。図８Ｂは、Ｃｅｌ−Ｉアッセイで決定したゲノム修飾の量（％挿入欠失）を示す。

【図9】ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮヌクレアーゼによって切断された標的領域に対応するイヌおよびヒトＨＰＲＴ遺伝子座におけるＤＮＡ配列のアライメントである。イヌ（ｃａｎｉｎｅ）（「イヌ（ｄｏｇ）」）ＤＮＡ配列は各配列対の上に示され（この図において示される、配列番号６１、６３、６５、および６７）、ヒトＤＮＡ配列は各配列対の下に示される（この図において示される、配列番号６２、６４、６６および、６８）。灰色で強調表示された配列内の文字列は、これら２つのＤＮＡ配列間で相同ではないヌクレオチドを示す。一列に並べたＤＮＡ配列下の黒色の囲みはＴＡＬＥＮ結合部位を示し、灰色の縁取り囲みはＺＦＮ結合部位を示す。矢印は、ヌクレアーゼがどのＤＮＡ鎖に結合するかを示し、左から右への矢印は、５’から３’またはワトソン鎖上の結合部位を示し、右から左への矢印は、３’から５’またはクリック鎖上の結合部位を示す。

【図10】様々なヒトＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼ対でトランスフェクトしたイヌ細胞株Ｄ１７から単離したＤＮＡ上でのＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示すゲルを示す（各レーンは以下の表６で特定される）。検出された修飾のパーセント（「％ＮＨＥＪ」）は、各レーンの下に示される。

【図11】様々なヒトＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼ対でトランスフェクトしたアカゲザル細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２から単離したＤＮＡ上でのＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示すゲルを示す。検出された修飾のパーセント（「％ＮＨＥＪ」）は、各レーンの下に示される。

【図12】は、６個のヒトＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼ対と個別にトランスフェクトしたヒトＣＤ３４＋細胞から単離したＤＮＡ上でのＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示す一連のゲルを示し、これらはそれぞれイントロンで切断される。「部位」とは、各ＺＦＮ対が切断する標的部位を指す。加えて、さらなるＺＦＮ対（「Ａ’」）をＫ５６２細胞において試験した。検出された修飾のパーセント（「％ＮＨＥＪ」）は、各レーンの下に示される。

【図13】パネルＡ〜Ｆ、図１２における切断された６個の遺伝子座それぞれへのオリゴドナーのＣＤ３４＋細胞における標的組み込みを示すゲルを示す。検出された標的修飾のパーセントは、各レーンの下に示される。

【図14】パネルＡ〜Ｃ、ヒトＫ５６２細胞におけるＨＰＲＴ遺伝子座へのＳＡ−２Ａ−ＧＦＰ−ｐＡ導入遺伝子の組み込みを示す。図１４Ａは、組み込まれた導入遺伝子の概略図を示し、スプライシング時に配列がどこで欠失されるかを図解する。図１４Ｂは、６−ＴＧ選択を用いて（右側の棒線）、６−ＴＧ選択を用いずに（左側の棒線）試験した条件のそれぞれにおけるＧＦＰ導入遺伝子を含む細胞のパーセントを示す。図１４Ｃは、これらの条件のそれぞれにおける細胞の生存を示すグラフである（左側の棒線は、６−ＴＧ選択を用いなかったものを示し、右側の棒線は、６−ＴＧ選択を用いたものを示す）。

【図15】パネルＡおよびＢ、６−ＴＧ選択を用いなかったヒトＫ５６２細胞におけるＨＰＲＴへのＳＡ−２Ａ−ＧＦＰ−ｐＡカセットの標的組み込みのＰＣＲ検出を示す。図１５Ａは、組み込まれた導入遺伝子の概略図であり、増幅に用いたＰＣＲプライマーの位置を含む。図１５Ｂは、ＰＣＲ産物を示すゲルを示し、選択の不在下における標的挿入（ＧＦＰ ＴＩ）によるＧＦＰ導入遺伝子の標的組み込みを示す。

【図16】ヒトＣＤ３４＋細胞におけるＨＰＲＴイントロン遺伝子座へのＳＡ−２Ａ−ＧＦＰ−ｐＡ導入遺伝子の組み込みを示すグラフである。一番左の棒線は、ＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。