【図1a】実施例１に従う、引き上げ直後（左手パネル）及び非接着性静的培養系内での２４時間後（右手パネル）の、ヒト胚性幹（「ｈＥＳ」）細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す。引き上げ後の細胞（左手パネル）は、それぞれの断片が細胞の塊からなる、約２０〜３０マイクロメートルの平均断片直径を有する、単層の断片に類似した。非接着性静的培養系内で２４時間後、細胞はクラスタ様の構成を取った。

【図1b】実施例１に従う、２５ｍＬのｍＴｅＳＲ１培地を含有する１２５ｍＬスピナフラスコ内での４日間の培養後の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＣＸＣＲ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１についてのフローサイトメトリーの結果を示す。細胞は、分化のマーカーであるＣＸＣＲ４の発現はほとんど呈さなかったが、多能性（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）のマーカーについて高い発現を呈した。

【図1c】ステージ１の終了時の分化の７２及び９６時間後の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す。図１ｃにおいて可視であるのは、７２時間後で４×倍率（左手パネル）、９６時間後で４×倍率（中央パネル）、９６時間後で１０×倍率（右手パネル）の、疎性の細胞凝集体である。

【図1d】マーカーＣＤ９、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、及びＣＤ９９についての、ステージ１分化終了時の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞のフローサイトメトリー結果を示す（実施例１を参照されたい）。図１ｄに示すように、多能性のためのマーカーであるＣＤ９の発現はほぼ除去された一方で、胚体内胚葉分化のマーカー、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）及びＣＤ９９の発現はかなり高かった。

【図1e】未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞と比較した、ステージ１の終了時の、多能性と関連付けられている選択された遺伝子、及びヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子の発現の、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）結果を示す（実施例１を参照されたい）。ステージ１の終了時の細胞は、未分化のＷＡ０１ ｈＥＳ細胞と対比して、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現において劇的な減少を、及び胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（ＣＥＲ１）、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）において大きな増加を示した。

【図1f】細胞が胚体内胚葉から膵臓内胚葉に更に分化した際の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す（実施例１を参照されたい）。分化がステージ２、１日目（上部左手パネル）からステージ２、３日目（上部右手パネル）、ステージ３、４日目（下部左手パネル）、及びステージ４、１日目（下部右手パネル）へ進行するにつれて、細胞及び細胞クラスタに対する明白な形態的変化が可視である。

【図2a】実施例２に従う、ＥＤＴＡ処理後、攪拌された懸濁培養系内で２日間の培養後、及び分化培養系への遷移前の、多能性及び分化と関連付けられているマーカーについての、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞のフローサイトメトリーデータを示す。データは、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現はほとんど示さなかったが、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）について高い発現を示した。

【図2b】実施例２に従う、スピナフラスコ内で成長させたステージ１、３日目の細胞、並びにスピナフラスコ又は三角フラスコ内で成長させたステージ２、２日目、ステージ４、１日目、及びステージ４、３日目の細胞に分化した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の顕微鏡写真を示す。懸濁液分化培養系は、球状凝集体の、実質的に均一かつ同質の細胞の集団を形成した。

【図2c】多能性及び内胚葉分化の細胞表面マーカーについての、ステージ１の終了時の、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞のフローサイトメトリーデータを示す。図２ｃにおいて可視であるように、多能性のためのマーカーであるＣＤ９の発現はほぼ除去された一方で、胚体内胚葉分化のマーカーであるＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現はかなり高かった。

【図2d】未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞と比較した、ステージ１の終了時の、多能性と関連付けられている選択された遺伝子、及びヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子の発現の、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す（実施例２を参照されたい）。図２ｄは、多能性遺伝子（ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における減少、及び胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（「ＣＥＲ１」）、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）における大きな増加を示す。

【図2e】実施例２に従う、スピナフラスコ又は三角フラスコ内での懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉細胞へと分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の、分化を示すマーカー（ＮＫＸ６．１、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びクロマグラニン（Chromagranin））のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要とされる転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、並びに両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ示さず）及びクロモグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。

【図2f】実施例２に従う、スピナフラスコ又は三角フラスコ内での懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉細胞へと更に分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の、分化と関連付けられている選択された遺伝子の発現の、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。データを、ＷＡ０１ ｈＥＳ細胞における発現と比較する。ＲＴ−ＰＣＲ結果は、膵臓前駆体遺伝子の高いレベルの発現を示す。

【図3a】Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）での処理に続いて静的培養系から引き上げられた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。図３ａに示すように、細胞は表面から小さな凝集体として除去された。

【図3b】Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）での処理に続いて静的培養系から引き上げられ、その後懸濁培養系内で３日間増大させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図３ｂにおいて可視であるのは、球状凝集体の、実質的に均一かつ同質の細胞クラスタの集団の形成である。

【図3c】Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）での処理に続いて静的培養系から引き上げられ、その後懸濁培養系内で３日間増大させ、その後Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）解離を使用して連続的に継代培養した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞のクラスタの顕微鏡写真を示す。

【図4a】分化の異なるステージで指向された分化プロトコルを使用する、細胞株Ｈ１の懸濁培養したヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示す。図４ａにおいて可視であるのは、各分化ステージでの細胞の顕微鏡写真である。

【図4b】異なる分化ステージで指向された分化プロトコルを使用する、細胞株Ｈ１の懸濁培養したヒト胚性幹細胞の、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４、ＣＤ５６、及びＰＤＸ１）のフローサイトメトリーの結果を示す（分化開始後の時間）。ステージ４、４日目の分化プロセスの終了時、高い百分率の細胞は、ＰＤＸ１発現について陽性であった。

【図4c】ＴｈｅｒａＣｙｔｅデバイス内に封入された分化した細胞を移植した、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの非空腹時血糖レベルを示す。

【図5a】分化培養系への遷移前の、多能性及び分化と関連付けられているマーカーについての、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞のフローサイトメトリーデータを示す。図５ａに示すように、多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８０の高い発現が観察された。

【図5b】ステージ１中の３つの異なる供給設定の、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４及びＣＤ９９（分化のマーカー）、並びにＣＤ９（多能性マーカー）の、細胞の位相差画像及びフローサイトメトリーデータを示す。試験された条件は以下の通りであった：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。

【図5c】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、膵臓内胚葉形態を呈する分化した細胞の位相差画像を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。

【図5d】以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン）、及び分化した細胞の選択非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）の選択マーカーについての、フローサイトメトリーの結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。

【図5e1】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数の差として示される。

【図5e2】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数の差として示される。

【図5e3】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数の差として示される。

【図5e4】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す：（Ａ）分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし；（Ｂ）分化開始の２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコース巨塊剤添加；並びに（Ｃ）グルコース及びＧＤＦ８巨塊剤を分化開始の２４時間後に添加して、その後開始の４８時間後にグルコース巨塊剤を添加して、ステージ１を通して培地変更なし。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数の差として示される。

【図5f】条件Ａ（分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化した細胞を埋め込んだ、ＳＣＩＤ−ＢｇマウスにおけるＣ−ペプチドの発現を示す。各ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの腎臓被膜下に、５００万個の細胞を埋め込んだ。図５ｆに示すように、埋め込みの１２週目後までに、ヒトＣ−ペプチドは、１ｎｇ／ｍＬを超えるレベルで検出可能であり、１６週目でＣ−ペプチドレベルは平均２．５ｎｇ／ｍＬであった。

【図5g】条件Ａ（分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化した細胞の前及び後投与（例えば、埋め込み）された、選択されたＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに対する、グルコース処理の影響を示す。図５ｇに示すように、グルコース処理は、空腹状態で平均０．９３ｎｇ／ｍＬから供給状態で２．３９ｎｇ／ｍＬへの、循環するヒトＣ−ペプチドにおける有意な増加を誘導した。

【図5h】条件Ａ（分化開始の２４時間後に培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化した細胞を投与されたＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに対する、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与（すなわち、ＳＴＺ誘導糖尿病）の影響を示す。図５ｈから明白であるように、機能的ＧＳＩＳコンピテント組織（すなわち、細胞を投与されているもの）の移植片を有する動物は、真性糖尿病を発症した未処理の対照とは異なり、正常の血糖レベルを維持した。

【図6a】分化前にＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ上で成長させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。

【図6b】様々な分化ステージでＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ上で成長させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。

【図6c】アクチビンＡ（ＡＡ）及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内の平板（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡ平板）上で、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のマイクロキャリア（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア）で、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内の平板（ＭＣＸ／ＧＤＦ８平板）で、並びにＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のマイクロキャリア（ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア）で成長させ、分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞に対する、分化の日数の関数としての、細胞計数（細胞／ｃｍ²）を示す。

【図6d】アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内の平板（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡ平板）上で、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のマイクロキャリア（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア）で、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内の平板（ＭＣＸ／ＧＤＦ８平板）で、並びにＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のマイクロキャリア（ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア）で成長させ、分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞に対する、分化の日数の関数としての、細胞計数（細胞／ｍＬ）を示す。

【図6e】ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４（Ｙ軸）及びＣＤ９（Ｘ軸）の細胞発現のドットプロットとしての、（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ；又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８の存在下で、マイクロキャリア培養系又は平面培養系上で成長させた、細胞の分化の第１のステージのフローサイトメトリー結果を示す。

【図6f】それぞれのマーカー（ＣＸＣＲ４及びＣＤ９）の完全発現としての、（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ；又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８の存在下で、マイクロキャリア培養系又は平面培養系上で成長させた、細胞の分化の第１のステージのフローサイトメトリー結果を示す。

【図6g】（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ；又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８の存在下で、懸濁培養系内で、平面培養系上又はマイクロキャリアビーズ上での成長によって分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の分化と関連付けられている選択された遺伝子の発現の、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。

【図7】ステージ１、１日目からステージ４、３日目までの、実施例７のプロトコルに従って分化した細胞についての、バイオリアクターにおける様々な分化ステージでの細胞計数を示す。細胞計数を、画像に基づくサイトメター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））によって決定される、細胞１００万個／ｍｌとして示す。

【図8】実施例７の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地のｐＨレベルを示す。ｐＨレベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。

【図9】実施例７の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地の乳酸レベルを示す。乳酸レベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。

【図10】実施例７の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、平均バイオリアクター培地のグルコースレベルを示す。グルコースレベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。

【図11】多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、実施例７のプロトコルに従って分化したステージ０、１日目（すなわち、接種の２４時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す。

【図12】胚体内胚葉と関連付けられている選択遺伝子を含有する胚体内胚葉（「ＤＥ」）アレイの、ステージ０、１日目（すなわち、接種の２４時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照されたい）。

【図13】多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、ステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照されたい）。

【図14】ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照されたい）。

【図15】未分化のステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の、ＣＤ９、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の、蛍光活性細胞分別（ＦＡＣＳ）の結果を示す（実施例７を参照されたい）。結果をまた、表８に示す。

【図16】実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ０、１日目（すなわち、接種の２４時間後）及びステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す。特に、図１６は、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴの遺伝子発現における穏やかな増加、並びに指向された分化の前のステージ０プロセス中のＧＡＴＡ２発現における≧１００×の増加を示す。

【図17】実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ０、１日目（すなわち、接種の２４時間後）及びステージ０、３日目（すなわち、接種の７２時間後）の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、未分化の遺伝子発現を示す。特に、図１７は、指向された分化の前のステージ０プロセス中のＣＥＲ１、ＦＧＦ１７、及びＦＧＦ４発現における≧１００×の増加を示す。

【図18】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図１８は、ステージ１、１日目の細胞と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図１９は、ステージ１、１日目の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図１８及び１９は、ＦＯＸＡ２発現における約７００×の増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現における１０００×の増加などの、遺伝子発現パターンにおける有意な変化を図示する。

【図19】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図１８は、ステージ１、１日目の細胞と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図１９は、ステージ１、１日目の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図１８及び１９は、ＦＯＸＡ２発現における約７００×の増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現における１０００×の増加などの、遺伝子発現パターンにおける有意な変化を図示する。

【図20】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、３日目の細胞の遺伝子発現を示す。図２０は、ステージ１、３日目の細胞の、多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。

【図21】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、３日目の細胞の遺伝子発現を示す。図２１は、ステージ１、３日目の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。

【図22】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ１、３日目の細胞の、ＣＤ９、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４としても知られる）、及びＣＤ９９のＦＡＣＳの結果を示す。分化の開始時点でＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団（図１５）から、ステージ１の終了時点でＣＸＣＲ４発現細胞（細胞の９８．３％がＣＸＣＲ４陽性、±１．９標準偏差）の均質な集団（図２２）へのほぼ完全な遷移が観察された。

【図23】実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ１、３日目、ステージ２、１日目、及びステージ２、３日目の細胞の、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図２３は、ステージ２、１及び３日目でのＨＮＦ４α及びＧＡＴＡ６発現レベルが増加した一方で、ステージ１の３日目に高いレベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）が、ステージ２の終了時点までに低減した発現を示したことを示す。

【図24】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ２、１日目の細胞及びステージ２、３日目の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、前腸遺伝子ＡＦＰ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１の遺伝子発現を示す。図２４に示すように、これらの遺伝子の発現は増加した。

【図25】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ３の培地内で成長させたステージ３、３日目の細胞（表７）の、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、クロモグラニン、ＮＫＸ２．２、及びＳＯＸ２のＦＡＣＳの結果を示す。図２５に示すように細胞は、ＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現によって測定される（９０．９％±１１．９標準偏差の陽性ＰＤＸ１、及び９９．２％±０．６標準偏差の陽性ＦＯＸＡ２）、内胚葉膵臓系統と一貫したマーカーを発現した。

【図26】実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ３、１日目及びステージ３、３日目の細胞の、ステージ４と関連付けられている選択遺伝子を含有するステージ４アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図２６は、これらの細胞が、一般的に膵臓内で発現する、増加したレベルの遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主を呈することを図示する。

【図27】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの結果を示す。図２７に示すように、ステージ４、３日目、細胞は高いレベルのＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現を保持し、膵内分泌細胞（２８．１％±１２．５標準偏差の陽性クロモグラニン）と膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１について５８．３％±９．７標準偏差で陽性）との混合と一貫した発現パターンを更に発展させた。

【図28】実施例７のプロトコルに従って分化した、ステージ３、３日目、ステージ４、１日目、及びステージ４、３日目の細胞の、ステージ４と関連付けられている選択遺伝子を含有するステージ４アレイの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図２８は、一般的に膵臓内で発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の増加した発現レベルを示す。

【図29】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す。特に、図２９は、３Ｌスケールで異なる種材料ロットから生成した、膵臓前駆体の平均ＦＡＣＳ発現パターンを示す。

【図30】実施例７のプロトコルに従って分化したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す。ステージ４、３日目の細胞における分化の前に、細胞を増大させて、ＩＳＭを形成し、その後、その両方を２％のＢＳＡで補助した、カスタムの自家培地「ＩＨ３」又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）のいずれか内で、ステージ０で成長させた。ＩＨ３培地内で成長させた細胞は「ＩＨ３−Ｐ成長細胞」であり、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）内で成長させた細胞は「ＥＺ８成長細胞」である。異なる培地内で成長させた細胞間での発現パターンにおける有意な差は、観察されなかった。

【図31】ステージ０で異なるｐＨレベルで予め成長させた、ステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す（実施例７を参照されたい）。ステージ４、３日目の細胞プロファイルにおける有意な変化は観察されなかった。

【図32】抗フォームＣで処理しなかったステージ４、３日目の細胞、及び抗フォームＣ乳剤（９４ｐｐｍ）で処理したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロモグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの結果を比較する（実施例７を参照されたい）。抗フォームＣ乳剤（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ａ８０１１）は、ステージ４、３日目の細胞のプロファイルに影響を与えることは観察されなかった。

【図33】実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す（実施例８を参照されたい）。図３３に示すように、バイオリアクターからの細胞は、多能性の遺伝子特徴（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＺＦＰ４２）の発現を保持し、分化の遺伝子特徴の最小限の誘導を示したか、又はそれを全く示さなかった（ＡＦＰ及びＦＯＸＡ２：＜５０倍の増加；ＦＯＸＤ３、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、ＭＩＸＬ１、及びＴ：＜１０倍の増加した発現）。

【図34】実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す（実施例８を参照されたい）。図３４は、分化開始の２４時間後の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。

【図35】実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す（実施例８を参照されたい）。図３５は、分化開始の７２時間後の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。

【図36(a)】実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ａ）は、ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、及びＣＤＸ２の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。

【図36(b)】実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｂ）は、ＧＡＳＴ、ＨＡＮＤ１、ＨＨＥＸ、及びＨＮＦ４ａの遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。

【図36(c)】実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｃ）は、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＯＳＲ１、及びＰＤＸ１の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。

【図36(d)】実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｄ）は、ＰＲＯＸ１、ＰＦＴ１ａ、ＳＯＸ１７、及びＳＯＸ２の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。

【図36(e)】実施例８のプロトコルに従ってステージ２からステージ３及び４へと分化した細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；ステージ２、３日目；ステージ３、３日目；及び遺伝子によっては、ステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｅ）は、ＳＯＸ９の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差として示される。

【図37】実施例８のプロトコルに従う分化のステージ４、３日目の細胞の選択遺伝子の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。図３７に示すように、ステージ３、３日目での分化の終了時点で、細胞は、ＰＤＸ１（＞１×１０⁶倍の誘導）及び他の膵臓遺伝子（ＡＲＸ、ＧＣＧ、ＧＡＳＴ、ＩＮＳ、ＩＳＬ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＴＦ１ａ、及びＳＳＴの＞１０００倍の誘導）の高い発現レベル、並びに未分化のＨ１ヒト胚性幹細胞と比較して、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現のほぼ全損失を特徴とする膵臓前駆細胞に分化している。

【図38】実施例８に従う、分化プロトコル中の毎日の細胞計数を示す。特に、図３８は、プロセス日数の関数としての細胞密度を示す。図３８は、ｐＨ ６．８及び７．２で実行した２度のリアクター施行（ＰＲＤ１２０５及びＰＲＤ１２０７）の、分化プロトコルの細胞計数を示す。比較のために、細胞ドリフトの細胞計数もまた示す。

【図39(a)】実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞を、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込むかのいずれかにした。マウスを、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視した。図３９（ａ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、５Ｍ又は１０Ｍのステージ４、３日目の細胞の埋め込み後の、Ｃ−ペプチドレベルを時間の関数として示す。

【図39(b)】実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞を、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込むかのいずれかにした。マウスを、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視した。図３９（ｂ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、５Ｍ又は１０Ｍのステージ４、３日目の細胞の埋め込み後の動物における非空腹時グルコースレベルを示す。

【図39(c)】実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞を、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込むかのいずれかにした。マウスを、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視した。図３９（ｃ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、予め冷凍保存したステージ４、３日目の細胞の埋め込み後に産生されたＣ−ペプチドレベルを時間の関数（埋め込み後の週）として示す。

【図39(d)】実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞を、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込むかのいずれかにした。マウスを、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視した。。図３９（ｄ）は、解凍直後（０日目）又は解凍の１日後（１日目）に埋め込まれる、一度も凍結保存しなかった／新鮮な腎臓移植片ステージ４、３日目の細胞、又は凍結保存されたステージ４、３日目の細胞によって処理したマウスのＣ−ペプチドレベルを比較する。

【図40】Ａ〜Ｄは、ステージ１、１日目に、ＭＣＸ化合物及びＧＤＦ−８（図４０Ａ）；ＭＣＸのみ（図４０Ｂ）；ＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡ（図４０Ｃ）；並びにＷＮＴ３Ａのみ（図４０Ｄ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。これらの図は、懸濁培養系内で、分化の１日目のＴＧＦ−β族員の不在での、３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞を処理する際に得られる、それに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。

【図41】Ａ〜Ｄは、ステージ１、１日目に様々な量のＭＣＸで処理した、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、ステージ１、１日目に、４μＭのＭＣＸ（図４１Ａ）；３μＭのＭＣＸ（図４１Ｂ）；２μＭのＭＣＸ（図４１Ｃ）；及び１．５μＭのＭＣＸ（図４１Ｄ）で細胞を処理した。

【図42】Ａ〜Ｂは、実施例１１のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、これらの図は、懸濁培養系内の培地交換頻度の役割を示す。図４２Ａは、ステージ１で完全な培地交換して、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図４２Ｂは、３日目の培地交換なしで、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。データは、懸濁培養系内で、分化の３日目に培地交換を受ける培養系（図４２Ａ）が、３日目に培地交換を受けなかった培養系（図４２Ｂ）に相当する効率を有する胚体内胚葉をもたらしたことを示唆する。

【図43】Ａ〜Ｂは、実施例１２のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、これらの図は、懸濁培養系内のＧｌｕｔａｍａｘ（商標）の役割を示す。細胞を、ステージ１に、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）で補助した培地（図４３Ａ）、あるいはＧｌｕｔａｍａｘ（商標）又はいかなるグルタミン（０ＭのＧｌｕｔａｍａｘ（商標））も含まない培地（図４３Ｂ）内で培養した。データは、懸濁培養系内で、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）の添加が、胚体内胚葉が生成される効率に影響を及ぼさないようであることを示唆する。

【図44】Ａ〜Ｄは、実施例１３のプロトコルに従って分化した細胞に対する、様々な量の重炭酸ナトリウムの影響を示す。図４４Ａ及び図４４Ｂは、ステージ１で３．６４ｇ／ｌ（図４４Ａ）又は２．４９ｇ／ｌ（図４４Ｂ）のいずれかを添加して、実施例１３のプロトコルに従って３日間分化した細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図４４Ｃ及び図４４Ｄは、ステージ１で３．６４ｇ／ｌ（図４４Ｃ）又は２．４９ｇ／ｌ（図４４Ｄ）のいずれかを添加して、実施例１３のプロトコルに従って３日間分化した細胞の位相差顕微鏡写真を示す。

【図45】実施例１４のプロトコルに従って分化した細胞の分化の関数としての、細胞密度の毎日の細胞計数を示す。細胞計数を、画像に基づくサイトメター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））を使用して得た。

【図46】実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地のｐＨレベルを示す。ｐＨレベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。

【図47】実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地のグルコースレベルを示す。グルコースレベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。

【図48】実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化の日数）の関数としての、１日の平均バイオリアクター培地の乳酸レベルを示す。乳酸レベルを、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））によって決定した。

【図49】実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ０、１〜３日目及びステージ１、１日目〜３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの遺伝子発現を示す。

【図50】実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ０、１〜３日目；ステージ１、１日目〜３日目；及びステージ２、１日目〜３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの遺伝子発現を示す。

【図51】ステージ０の、実施例１４のプロトコルに従って分化する前の細胞の、多能性と関連付けられているマーカー（ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）のＦＡＣＳの結果を示す。特に、図５１は、多能性と関連付けられているマーカーの高い発現を示す。

【図52】実施例１４のプロトコルに従ってステージ１の終了まで分化した細胞の胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。

【図53】実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ２、１日目；ステージ２、２日目；及びステージ２、３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４α、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１の遺伝子発現を示す。図５３は、前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現における増加を示す。

【図54】実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ２、１日目〜３日目及びステージ３、１日目〜３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＨＮＦ４Ａ、ＮＫＸ２−２、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、及びＰＦＴ１Ａの遺伝子発現を示す。図５４に示すように、ＰＤＸ１の発現は、ステージ２、３日目の終了時点で対照に対して１２，０００×から、ステージ３、３日目の終了時点で対照に対して７３９，０００×へと６０倍増加した。

【図55】実施例１４のプロトコルに従って分化した、ステージ３、１〜３日目及びステージ４、１日目〜３日目の細胞の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、特定の遺伝子の遺伝子発現を示す。特に、図５５の上部パネルは、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＡＲＸ、ＣＤＸ２、ＣＨＧＡ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＡＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、及びＭＡＦＢの遺伝子発現を示す。図５５の下部パネルは、ＭＡＦＢ、ＭＵＣＳ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＫＸ２−２、ＮＫＸ６−１、ＰＡＸ４、ＰＤＸ１、ＰＯＵＳＦ１、ＰＴＦ１Ａ、ＳＳＴ、及びＺｌＣ１の遺伝子発現を示す。

【図56】実施例１４のプロトコルに従って分化した細胞の、ステージ終了時の顕微鏡写真を示す。図５６において可視であるのは、ステージ０での、及びステージ１〜４の分化の終了時点での、細胞クラスタの代表的な顕微鏡写真（４×）である。

【図57】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＡＦＰ（図５７）。

【図58】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤ９９（図５８）。

【図59】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤ９（図５９）。

【図60】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤＨ１（図６０）。

【図61】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤＨ２（図６１））。

【図62】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＤＸ２（図６２）。

【図63】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＥＲ１（図６３）。

【図64】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＣＸＣＲ４（図６４）。

【図65】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示すＦＧＦ１７（図６５）。

【図66】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＦＧＦ４（図６６）。

【図67】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＦＯＸＡ（図６７）。

【図68】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＧＡＤＰＨ（図６８）。

【図69】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＧＡＴＡ４（図６９）。

【図70】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＧＡＴＡ６（図７０）。

【図71】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＧＳＣ（図７１）

【図72】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＫＩＴ（図７２）。

【図73】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＭＩＸＬ１（図７３）。

【図74】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＭＮＸ１（図７４）。

【図75】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＮＡＮＯＧ（図７５）。

【図76】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＯＴＸ２（図７６）。

【図77】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＰＯＵＦ５Ｆ１（図７７）；。

【図78】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＳＯＸ１７（図７８）。

【図79】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：ＳＯＸ７（図７９）。

【図80】以下の遺伝子の分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す：Ｔ（図８０）。

【図81】実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＧ０／Ｇ１における細胞の百分率を示す。特に、図８１は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図82】実施例１５のプロトコルに従って分化した細胞クラスタに対する、ＥＤＵ処理の影響を示す。左手パネルは、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＧ２／Ｍにおける細胞の百分率を示す。特に、左手パネルは、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。一組のデータにおいて、これらのクラスタをまた、ＥＤＵで処理した。図８２の右手パネルは、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の０時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、及び７２時間、ＥＤＵ陽性の細胞％を示す。

【図83】実施例１５のプロトコルにおいて使用される、一般的な操作パラメーターを示す。

【図84】実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、細胞のＥＤＵ取り込みの量を示す。特に、図８４は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理した、ＥＤＵインキュベートした細胞クラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図85】実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＧ０／Ｇ１における細胞の百分率を示す。特に、図８５は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図86】実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＳ相における細胞の百分率を示す。特に、図８６は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図87】実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従う分化の時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の細胞周期のＳ相における細胞の百分率を示す。特に、図８７は、分化の第１日目に６つの条件のうちの１つで処理したクラスタの結果を示す：（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ １３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭＮ））、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図88A】未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ａは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＣＤ９９、ＣＤ９、ＣＤＨ１、及びＣＤＨ２の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。

【図88B】未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す図８８Ａは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＣＸＤ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、及びＦＧＦ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。

【図88C】未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ｃは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ６の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。

【図88D】未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ｄは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＧＳＣ、ＫＩＴ、ＭＩＸＬ１、及びＭＮＸ１の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。

【図88E】未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ｅは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵＦ５Ｆ１、及びＳＯＸ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。

【図88F】未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの様々な実施形態に従って分化した細胞の遺伝子発現を示す。図８８Ｆは、未分化の細胞と対比して、発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＳＯＸ７及びＴの遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの根本的なデータを、図５８〜６７及び６９〜８０に示す。

【図89】ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の遺伝子発現パターンを示す。図８９に示すように、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図８９の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図８９の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。

【図90】ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の遺伝子発現パターンを示す。図９０に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９０の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９０の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。

【図91】ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の遺伝子発現パターンを示す。図９１に示すように、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図９１の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９１の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。

【図92】ＦＡＣＳによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で３日間培養した、ＦＡＣＳのＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のタンパク質発現パターンを示す。特に、図９２の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４の発現パターンを示す。図９２の右パネル、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のタンパク質発現パターンを示す。

【図93】ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、実施形態１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の遺伝子発現パターンを示す。図９３に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９３の左パネルは、臍組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９３の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。

【図94】実施形態１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で分化した細胞の顕微鏡写真を示す。図９４に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９４の左手パネルは、分化の３日目、５日目、及び１０日目での、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの細胞の顕微鏡写真を示す。図９４の右手パネルは、分化の１０日間後に臍組織細胞（ＵＴＣ ＩＰＳＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の顕微鏡写真を示す。

【図95】実施形態１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で分化した細胞の顕微鏡写真を示す。図９５に示すように、細胞は神経細胞系に向かって分化した。特に、図９５の左手パネルは、分化の３日目、５日目、及び１０日目での、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの細胞の顕微鏡写真を示す。図９５の右手パネルは、分化の１０日間後に臍組織細胞（ＵＴＣ ｉＰＳＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の顕微鏡写真を示す。