【図1】１Ａ〜１Ｃは、二特異性イムノグロブリンに対する「三重Ｆ」形式の解説である。図１Ａは、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式を示す。図１Ｃは、より標準的な二特異性の形式を示しているが、本発明のｐＩ変異（ならびに、任意選択的に、および独立して他の異種二量体化変異）を使用している。図１Ｂは、「三重Ｆ」（場合によって、「栓抜き型」構造とも呼称される）形式を示す；（ならびに、任意選択的に、および独立して他の異種二量体化変異）。

【図2】図２Ａ〜２Ｅは、本発明の様々な「高度な多特異性」の実施態様を示す。図２Ａは、Ｆａｂモノマーに付加された他のｓｃＦｖを有する「三重Ｆ」構造を示す（これは、図２Ｄと共に、さらにより大きな分子量差を有する）。図２Ｂは、ｓｃＦｖモノマーに付加された他のｓｃＦｖを有する「三重Ｆ」を示す。図２Ｃは、「３つのｓｃＦｖ」形式を示す。図２Ｄは、Ｆａｂモノマーに付加されたさらなるＦａｂを示す。図２Ｅは、ｓｃＦｖモノマーのうちの１つに接続されたＦａｂを示す。

【図3】３Ａ〜３Ｅは、「三重Ｆ」形式の「高度な多特異性」実施態様のさらなる型を示し、すべて、ｓｃＦｖを含有する１つのモノマーを伴い、それらすべて、異種二量体の精製に利用することができる分子量差を有している。図３Ａは、２つの異なる抗原に結合する「Ｆａｂ−Ｆｖ」形式を示し、図３Ｂは、１つの抗原に結合する「Ｆａｂ−Ｆｖ」形式を示す（たとえば、抗原１に対する二価性の結合）。図３Ｃおよび３Ｄは、同様の二価性または一価性のさらなる抗原結合を伴う「Ｆｖ−Ｆａｂ」形式を示す。図３Ｅは、第二のｓｃＦｖに付加されたＣＨ１−ＣＬを伴う１つのモノマーを示す。

【図4】４Ａおよび４Ｂは、新規立体構造変異を示す。当業者であれば理解されるように、各表の最初の列は、「対応する」モノマー対を表す。すなわち、モノマー１は、４０５Ａを有し、対応する立体構造変異は３９４Ｆである。非対称三重Ｆ形式と関連した箇所において、いずれかモノマーが、いずれか変異を有することができる。すなわち、ｓｃＦｖモノマーは、モノマー１またはモノマー２であっても良い。繰り返すと、これらのセットは、なんらかの「鎖状構造らしさ（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」が維持されている限り、任意選択的に、および独立して、他の立体構造変異ならびに他の異種二量体化変異（電荷対、アイソタイプ変異、等配電子変異、ｐＩ変異等を含む）と混合されても良い。さらに、「モノマー」とは、Ｆｃドメインを指す。すなわち、三重Ｆ形式において、実際にはＦａｂ構築物を構成する２つのアミノ酸配列（重鎖および軽鎖）が存在しているが、１つのモノマーはｓｃＦｖ構築物であり、他のモノマーは、Ｆａｂ構築物である。本発明における、多くの適切な立体構造または「ねじれ」変異の使用を示す。図４は、ｐＩ変異と組み合わせて用いることができる、または単独で用いることができる多くの立体構造変異を示す（図４の全ての変異に当てはまる）。しかしながら、当業者に認識されるように、もしｐＩ変異があっても、ｐＩ変異および立体構造変異の「鎖状構造らしさ」は維持されなければならない。すなわち、たとえば、ｐＩ変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ（モノマー１）およびＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ（モノマー２）が、図２９Ｃの変異と組み合わされる場合、立体構造変異のｐＩが考慮され、正しいモノマーに割り当てられなければならない。すなわち、電荷を変える立体構造変異（Ｔ４１１Ｅ）が、たとえば、「負の」モノマーに付加される。

【図5】好ましい異種二量体化変異を示している。

【図6】一部の特に有用なｐＩアイソタイプ変異および対を示している。本明細書に記述されるように、図は、両方のモノマーの操作（１つはより正に、１つはより負に）を示しているが、１つのモノマーだけを操作することもまた可能である。

【図7】ＸＥＮＰ１１８７４、抗ＣＤ１９ Ｆａｂ ｘ 抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ「三重Ｆ」形式の実施態様のアミノ酸配列を図示し、ＨＣ−Ｆａｂ配列、ＨＣ−ｓｃＦｖ配列、および軽鎖を示している。所望されない二重ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｍＡｂ同種二量体を超えて、所望の「三重Ｆ」異種二量体が効率的に精製されるよう作製されたアミノ酸置換は、下線を引かれている。

【図8】ヒト化抗ＣＤ３可変領域（ＣＤＲは下線）のアミノ酸配列を図示する。

【図9】Ａ〜Ｃは、ＸＥＮＰ１１８７４、抗ＣＤ１９ Ｆａｂおよび抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する「三重Ｆ」二特異性抗体の産生を図示する。図９Ａは、二重ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｍＡｂ同種二量体からの、「三重Ｆ」異種二量体のイオン交換精製を示す。図９Ｂは、「三重Ｆ」分画を含有する精製ＩＥＸ分画を示す（ＩＥＧゲルで確認された）。図９ＣはＳＥＣにより形成された、「三重Ｆ」産物の同種サイズを示す。

【図10】３５０ｋ ｈＰＢＭＣ（２４ｈ）、およびＸＥＰ１１８７４の様々な精製ＩＥＸ分画を用いたアネキシン染色ＲＴＣＣアッセイのグラフである。

【図11】Ａ〜Ｃは、ＸＥＮＰ１１９２４、抗ＣＤ１９ Ｆａｂおよび抗ＣＤ３ｓｃＦｖを有する「三重Ｆ」二特異性抗体の産生を図示する。図１１Ａは、二重ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｍＡｂ同種二量体からの、「三重Ｆ」異種二量体のイオン交換精製を示す。図１１Ｂは、「三重Ｆ」分画を含有する精製ＩＥＸ分画を示す（ＩＥＧゲルで確認された）。図１１ＣはＳＥＣにより形成された、「三重Ｆ」産物の同種サイズを示す。

【図12】１０ｋ Ｒａｊｉ細胞（Ｐ８）、４００ｋ Ｔ細胞（２４ｈ）およびＸＥＰ１１９２４の様々な精製ＩＥＸ分画を用いた蛍光ＬＤＨＲＴＣＣアッセイのグラフである。

【図13】ＸＥＮＰ１１９２５、抗ＣＤ３８ Ｆａｂ ｘ 抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ「三重Ｆ」形式の実施態様のアミノ酸配列を図示し、ＨＣ−Ｆａｂ配列、ＨＣ−ｓｃＦｖ配列、および軽鎖を示している。所望されない二重ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｍＡｂ同種二量体を超えて、所望の「三重Ｆ」異種二量体が効率的に精製されるよう作製されたアミノ酸置換は、下線を引かれている。

【図14】Ａ、ＢおよびＣは、ＸＥＮＰ１１９２５、抗ＣＤ３８ Ｆａｂおよび抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを有する「三重Ｆ」二特異性抗体の産生を図示する。図１４Ａは、二重ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｍＡｂ同種二量体からの、「三重Ｆ」異種二量体のイオン交換精製を示す。図１４Ｂは、ＸＥＮＰ１１９２５の精製ＩＥＸ分画を示す（図１４Ｂに示されるように、ＩＥＧゲルで確認された）。図１４ＣはＳＥＣにより確認された、「三重Ｆ」産物の同種サイズを示す。

【図15】１０ｋ ＲＰＭＩ８２２６細胞（Ｐ１２）、３００ｋ Ｔ細胞（２４ｈ）およびＸＥＮＰ１１９２５の様々な精製ＩＥＸ分画を用いた蛍光ＬＤＨＲＴＣＣアッセイのグラフである。

【図16】抗ＣＤ１９Ｆａｂｘ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ「三重Ｆ」二特異性抗体、ＸＥＮＰ１１９２４の実施態様に関するさらなるアミノ酸配列を図示しており、各二特異性抗体に対するＨＣ−Ｆａｂ配列、ＨＣ−ｓｃＦｖ配列、および軽鎖を示している。所望されない二重ｓｃＦｖ−ＦｖおよびｍＡｂ同種二量体を超えて、所望の「三重Ｆ」異種二量体へと形成が「ねじれる」よう作製されたアミノ酸置換に下線を引いてある。

【図17】本明細書に開示される、ＸＥＮ１１９２４、ＸＥＮＰ１２１５２、およびＸＥＮ１２１５５を含む、様々な「三重Ｆ」二特異性抗体の分析を示すゲルを図示する。

【図18】ＸＥＮＰ１１９２４およびＸＮＰ１２１５５「三重Ｆ」二特異性抗体のクロマトグラフィ分析を示す。

【図19】２０アミノ酸の文献上のｐＩを示す。列記されたｐＩは、遊離アミノ酸として算出されたものであり、タンパク質の場合において実際の任意の側鎖のｐＩは異なっていること、および、それゆえに、このリストはｐＩの傾向を示すために用いられたものであり、本発明の目的に対し、絶対的な数値ではないことに注記されたい。

【図20】本明細書の三重Ｆ形式における用途が見出された、以下に示される例示的なｐＩ操作変異のデータをまとめた表である。図２０は、ＵＳＳＮ１３／６４８，９５１において提出された配列表と関連した配列番号を有しており、参照により、本明細書に明示的に援用されることに注記されたい。

【図21】本発明における用途をさらに見出すことができる多くのｐＩ変異のリストであり、ＩｇＧ１〜４のアイソタイプ置換から生成されるすべての可能性のあるｐＩ低下変異のリストである。変異重鎖がＩｇＧ１−ＷＴ重鎖とトランスフェクトされた場合に存在する異種二量体種と２つの同種二量体種の間の、３つの予測種に対するｐＩ値、ならびに、平均デルタｐＩを示している。

【図22】ＩｇＧ１〜４のアイソタイプ置換から生成されるすべての可能性のあるｐＩ増加変異のリストである。変異重鎖がＩｇＧ１−ＷＴ重鎖とトランスフェクトされた場合に存在する異種二量体種と２つの同種二量体種の間の、３つの予測種に対するｐＩ値、ならびに、平均デルタｐＩを示している。

【図23】本発明における使用のための異種二量体化変異のさらなるリストである。

【図24】異種二量体形式、異種二量体化変異（ｐＩ変異および立体構造変異（電荷対変異を含む）へと別れる）、Ｆｖ変異、ＦｃＲｎ変異、およびそれらの組み合わせの可能性のある組み合わせのマトリクスである。凡例のＡは、適したＦｃＲｎ変異である：４３４Ａ、４３４Ｓ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、２５２Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、および、２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌ。すなわち、図１Ｂの三重Ｆの形式は、モノマー配列のいずれか、または両方に、これらＦｃＲｎ変異のいずれかを有しても良い。明確に言えば、各重鎖は異なっているため、ＦｃＲｎ変異（ならびにＦｃ変異）は、１つまたは両方のモノマーに存在することができる。凡例のＢは、適したＦｃ変異である：２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２３６Ｒ、３２８Ｒ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２３６Ｎ／２６７Ｅ、２４３Ｌ、２９８Ａ、および、２９９Ｔ。（追加の適したＦｃ変異は、ＵＳ ２００６／００２４２９８の図４１にあり、その図および説明文は、その全体で参照により本明細書に援用されることに注記されたい）。本明細書の一部の場合において、「ノックアウト」または「欠落」変異は、たとえば図３５に示されるように用いられ、および、それらは、Ｆｃ変異の定義に含まれる。ＦｃＲｎ変異に関しては、Ｆｃ変異は、いずれかの鎖に存在することができる。凡例のＣは、適したｐＩ変異であり、これらは、簡潔さのために図２３から引用されているが、ｐＩ変異に対する「鎖状構造らしさ」が存在することを再度理解されたい。凡例のＤは、適した立体構造変異であり（荷電対変異を含む）；これらは、簡潔さのために図９、３２、および３３から再度引用されているが、立体構造変異に対する「鎖状構造らしさ」が存在することを再度理解されたい。凡例のＥは、以下の可能性のある組み合わせを反映しているものであり、各変異は、独立して、および任意選択的に、再度、適切な凡例の元から組み合わせられている：１）ｐＩ変異＋ＦｃＲｎ変異；２）ｐＩ変異＋Ｆｃ変異；３）ｐＩ変異＋ＦｃＲｎ変異＋Ｆｃ変異；４）立体構造変異＋ＦｃＲｎ変異；５）立体構造変異＋Ｆｃ変異；６）立体構造変異＋ＦｃＲｎ変異＋Ｆｃ変異；７）ｐＩ変異＋立体構造変異＋ＦｃＲｎ変異；８）ｐＩ変異＋立体構造変異＋ Ｆｃ変異；９）ｐＩ変異＋立体構造変異＋ＦｃＲｎ変異＋Ｆｃ変異；および、１０）ｐＩ変異＋立体構造変異。これらの組み合わせのすべて、および任意のものは、任意選択的に、いずれか、または両方のモノマーのノックアウト／欠落変異を含有または除外することができることに注記されたい。

【図25】Ａ、ＢおよびＣは、安定性−最適化された、ヒト化抗ＣＤ３変異ｓｃＦｖを図示する。置換は、Ｈ１＿Ｌ１．４ ｓｃＦｖ配列に対して行われている。アミノ酸のナンバリングは、Ｋａｂａｔのナンバリングである。

【図26】Ａ〜ＹＹは、安定的に最適化された、ヒト化抗ＣＤ３変異ｓｃＦｖ、可変重鎖配列および可変軽鎖配列のアミノ酸配列を図示する。（なお、第一の配列は、精製を容易にするためのヒスチジンタグ化されものであることに注意されたい）。ＣＤＲは、下線を引いてある。最適化可変および最適化軽鎖（ならびに、ｓｃＦｖ鎖）の安定性の増加は、フレームワーク領域ならびに ＣＤＲに起因するものであっても良いことを理解されたい。ゆえに、それらは別々にナンバリングされているが、可変領域全体の開示には、フレームワーク領域の開示が含まれることを理解されたい。さらに、ｓｃＦｖリンカーは、グレーで示されている。各ｓｃＦｖリンカーは、図７に示される荷電ｓｃＦｖリンカーと置換されても良い。すなわち、図７に示されるものを含む、荷電ｓｃＦｖリンカー（正電荷か負電荷かに関わらず）はいずれも、図２６Ａ〜２６ＹＹ中の強調された領域と置換されることができる。

【図27】ＡおよびＢは、安定的に最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異ｓｃＦｖのＮｉ−ＮＴＡ精製後の産生量、および、ＤＳＦ（示差走査蛍光光度法）により測定された融点（Ｔｍ）を示す。同等のｓｃＦｖ形式における、Ｉ２Ｃ抗ＣＤ３可変領域に対する同様のＤＳＦ安定性の測定値は、５９℃のＴｍが得られた。

【図28】ＡおよびＢは、安定性−最適化された、ヒト化抗ＣＤ３変異ｓｃＦｖの細胞表面結合アフィニティ（ＩＣ５０）における倍数改善（Ｈ１＿Ｌ１．４と比較）を示す（ＰＢＭＣからの精製ヒトＴ細胞を用いた競合結合実験において測定）。

【図29】ヒトＣＤ３イプシロン鎖の配列を示す。

【図30】Ａ〜Ｉは、本発明に有用なすべてのＣＤ３ ｖｈＣＤＲ１〜３およびｖｌＣＤＲ１〜３の照合を示す。