【図1】ＣＲＩＳＰＲ系の模式的モデルを示す。化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼ（黄色）を、２０ｎｔガイド配列（青色）および足場（赤色）からなる合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によりゲノムＤＮＡにターゲティングする。必要な５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；マゼンタ）のすぐ上流のＤＮＡ標的（青色）とのガイド配列塩基対、およびＣａｓ９は、ＰＡＭの約３ｂｐ上流の二本鎖切断（ＤＳＢ）（赤色三角）を媒介する。

【図2A】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図2B】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図2C】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図2D】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図2E-F】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図3】例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。

【図4A-B】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図4C-E】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図4F】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図4G】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図5】プロトスペーサー配列の表を提供し、ヒトおよびマウスゲノム中の遺伝子座に対して例示的化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系に基づき設計されたプロトスペーサー標的と対応するＰＡＭについての改変効率結果をまとめる。細胞をＣａｓ９およびプレｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡまたはキメラＲＮＡのいずれかにより形質移入し、形質移入から７２時間後に分析した。インデルパーセントは、示された細胞系からのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果に基づき算出した（全てのプロトスペーサー標的についてＮ＝３、誤差は、標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）であり、Ｎ．Ｄ．は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して検出可能でないことを示し、Ｎ．Ｔ．は、本試験において試験しなかったことを示す）。

【図6A-B】Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。

【図6C】Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。

【図7】二本鎖切断により誘導された微小挿入および欠失の検出のためのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの模式図を示す。

【図8A-B】真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系エレメントの発現のための例示的バイシストロニック発現ベクターを示す。

【図9A-C】ヒトゲノム中の隣接する化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０遺伝子座１ＰＡＭ（ＮＧＧ）（図９Ａ）と、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ９遺伝子座２ＰＡＭ（ＮＮＡＧＡＡＷ）（図９Ｂ）との間の距離のヒストグラム；ならびに染色体（Ｃｈｒ）単位のそれぞれのＰＡＭについての距離（図９Ｃ）を示す。

【図10A-C】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図10D】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図11A-C】哺乳動物細胞中のゲノム遺伝子座のターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作を示す。

【図12A-B】哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングのノザンブロット分析の結果を示す。

【図13A-B】ヒトＰＶＡＬＢおよびマウスＴｈ遺伝子座中のプロトスペーサーの例示的選択を示す。

【図14】ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系の例示的プロトスペーサーおよび対応するＰＡＭ配列標的を示す。

【図15】Ｓｕｒｖｅｙｏｒ、ＲＦＬＰ、ゲノムシーケンシング、およびノザンブロットアッセイに使用されたプライマーおよびプローブについての配列の表を提供する。

【図16A】キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。

【図16B】キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。

【図16C】キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作および真核細胞中の系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。

【図17A-B】真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果のグラフ表示を示す。

【図18】ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用するヒトゲノム中のいくつかの化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位の例示的可視化を示す。

【図19A】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。

【図19B】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。

【図19C】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。

【図19D】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の円形表示を示す。

【図20A】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。

【図20B】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。

【図20C】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。

【図20D】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。

【図20E】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。

【図20F】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つの科を明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。

【図21A】相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。

【図21B】相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。

【図21C】相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。

【図21D】相同組換えを介するゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの模式図。（ｂ）センスまたはアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを修復テンプレートとして使用するヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す模式図。上方の赤色矢印は、ｓｇＲＮＡ開裂部位を示し；ゲノタイピングのためのＰＣＲプライマー（表ＪおよびＫ）を右側パネルに矢印として示す。（ｃ）ＨＲにより改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）およびニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測断片サイズの位置を示す。

【図22A】ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター設計を示す。

【図22B】ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター設計を示す。

【図23】Ｃａｓ９オルソログの長さ分布を表すグラフを示す。

【図24A】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24B】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24C】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24D】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24E】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24F】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24G】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24H】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24I】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24J】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24K】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24L】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図24M】図２４Ａ〜図２４Ｍは、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。

【図25A】条件的Ｃａｓ９、Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクターマップを示す。

【図25B】構成的Ｃａｓ９、Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクターマップを示す。

【図26】構成的および条件的Ｃａｓ９構築物における重要なエレメントの略図を示す。

【図27】送達およびインビボマウス脳Ｃａｓ９発現データを示す。

【図28】細胞へのＣａｓ９およびキメラＲＮＡのＲＮＡ送達を示す（Ａ）ニューロ２Ａ細胞へのＤＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかとしてのＧＦＰレポーターの送達。（Ｂ）Ｃａｓ９およびキメラＲＮＡをＲＮＡとしてＩｃａｍ２遺伝子に対して送達すると、試験した２つのスペーサーのうちの一方に開裂が生じる。（Ｃ）Ｃａｓ９およびキメラＲＮＡをＲＮＡとしてＦ７遺伝子に対して送達すると、試験した２つのスペーサーのうちの一方に開裂が生じる。

【図29】ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復が遺伝子編集をいかに促進するかを示す。エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路において、ＤＳＢの末端は内因性ＤＮＡ修復機構によりプロセシングされ、一緒に再結合し、このことは接合部位におけるランダム挿入／欠失（インデル）突然変異をもたらし得る。遺伝子のコード領域内で生じるインデル突然変異は、フレームシフトおよび早期終止コドンをもたらし得、遺伝子ノックアウトをもたらす。あるいは、プラスミドまたは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形態の修復テンプレートを供給して高いフィデリティおよび正確な編集を可能とする相同性組換え修復（ＨＤＲ）経路を活用することができる。

【図30】図３０Ａ〜図３０Ｃは、ＨＥＫおよびＨＵＥＳ９細胞でのＨＤＲについて予想される結果を示す。（ａ）相同性アームを有するターゲティングプラスミドまたはｓｓＯＤＮ（センスまたはアンチセンス）のいずれかを使用して、Ｃａｓ９により開裂される標的ゲノム遺伝子座（赤色の三角形）で配列を編集することができる。ＨＤＲの効率をアッセイするため、本発明者らは標的遺伝子座にＨｉｎｄＩＩＩ部位（赤色のバー）を導入し、これを、相同性領域外にアニールするプライマーでＰＣＲ増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩでＰＣＲ産物を消化すると、ＨＤＲイベントの発生が明らかになる。（ｂ）目的の遺伝子座に対してセンス方向またはアンチセンス方向（ｓまたはａ）のいずれかに向くｓｓＯＤＮをＣａｓ９と組み合わせて使用することにより、標的遺伝子座における効率的なＨＤＲ媒介性編集を実現することができる。改変の両側に４０ｂｐ、および好ましくは９０ｂｐの最小相同性領域が推奨される（赤色のバー）。（ｃ）野生型Ｃａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）の両方を使用して、ＥＭＸ１遺伝子座におけるＨＤＲに対してｓｓＯＤＮが及ぼす効果の例が示される。各ｓｓＯＤＮは、２つの制限部位の１２ｂｐの挿入が隣接する９０ｂｐの相同性アームを含む。

【図31】図３１Ａ〜図３１Ｃは、嚢胞性線維症ΔＦ５０８突然変異の修復戦略を示す。

【図32】図３２Ａ〜図３２Ｂ（ａ）は、ＦＸＮイントロン１におけるＧＡＡリピート伸長の略図を示し、（ｂ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用したＧＡＡ伸長領域の切り出しに用いられる戦略の略図を示す。

【図33】Ｔｅｔ１〜３およびＤｎｍｔ１、３ａおよび３ｂ遺伝子座の効率的なＳｐＣａｓ９媒介性ターゲティングのスクリーニングを示す。形質移入したＮ２Ａ細胞のＤＮＡに関するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、種々のｇＲＮＡを使用することによる効率的なＤＮＡ開裂を実証する。

【図34】ＡＡＶ１／２送達系における２ベクター系を使用した多重ゲノムターゲティング戦略を示す。Ｔｅｔ１−３およびＤｎｍｔ１、３ａおよび３ｂ ｇＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下にある。ＧＦＰ−ＫＡＳＨはヒトシナプシンプロモーターの制御下にある。制限酵素部位が、サブクローニングによる単純なｇＲＮＡ置換戦略を示す。２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が隣接するＨＡタグ標識ＳｐＣａｓ９が示される。両方のベクターとも、１：１比でＡＡＶ１／２ウイルスによって脳に送達される。

【図35】Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いた多重ＤＮＭＴターゲティングベクター＃１の機能検証を示す。ＤＮＭＴ遺伝子ファミリー遺伝子座のＳｐＣａｓ９媒介性開裂を試験するため、Ｎ２Ａ細胞にＤＮＭＴターゲティングベクター＃１（＋）およびＳｐＣａｓ９コードベクターを同時形質移入した。ｇＲＮＡのみ（−）が陰性対照である。形質移入後４８時間でＤＮＡ精製および下流処理のため細胞を回収した。

【図36】Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いた多重ＤＮＭＴターゲティングベクター＃２の機能検証を示す。ＤＮＭＴ遺伝子ファミリー遺伝子座のＳｐＣａｓ９媒介性開裂を試験するため、Ｎ２Ａ細胞にＤＮＭＴターゲティングベクター＃１（＋）およびＳｐＣａｓ９コードベクターを同時形質移入した。ｇＲＮＡのみ（−）が陰性対照である。形質移入後４８時間でＤＮＡ精製および下流処理のため細胞を回収した。

【図37】インビボでのＨＡ−ＳｐＣａｓ９発現に使用される短いプロモーターおよび短いポリＡバージョンの概略図を示す。Ｌ−ＩＴＲからＲ−ＩＴＲまでのコード領域のサイズを右側に示す。

【図38】インビボでのＨＡ−ＳａＣａｓ９発現に使用される短いプロモーターおよび短いポリＡバージョンの概略図を示す。Ｌ−ＩＴＲからＲ−ＩＴＲまでのコード領域のサイズを右側に示す。

【図39】Ｎ２Ａ細胞におけるＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９の発現を示す。種々の短いプロモーターの制御下にありかつ短いポリＡ（ｓｐＡ）配列を有するＨＡタグ標識ＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９バージョンの代表的なウエスタンブロット。チューブリンがローディング対照である。ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈ）が形質移入対照である。形質移入後４８時間でウエスタンブロッティングのため細胞を回収してさらに処理した。

【図40】Ｔｅｔ３遺伝子座の効率的なＳａＣａｓ９媒介性ターゲティングのスクリーニングを示す。形質移入したＮ２Ａ細胞のＤＮＡに関するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＮＮＧＧＧＴ ＰＵＭ配列を有する種々のｇＲＮＡを使用することによる効率的なＤＮＡ開裂が実証される。ＧＦＰ形質移入細胞およびＳａＣａｓ９のみを発現する細胞が対照である。

【図41】マウス脳におけるＨＡ−ＳａＣａｓ９の発現を示す。ヒトシナプシンプロモーターの制御下でＨＡ−ＳａＣａｓ９の発現をドライブするウイルスを動物の歯状回に注入した。手術後２週間で動物を犠牲にした。ウサギモノクローナル抗体Ｃ２９Ｆ４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用してＨＡタグを検出した。ＤＡＰＩ染色で細胞核は青色に染色された。

【図42】形質導入７日後の培養下の皮質初代ニューロンにおけるＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９の発現を示す。種々のプロモーターの制御下にありかつｂｇｈまたは短いポリＡ（ｓｐＡ）配列を有するＨＡタグ標識ＳｐＣａｓ９およびＳａＣａｓ９バージョンの代表的なウエスタンブロット。チューブリンがローディング対照である。

【図43】種々のプロモーターを含むＳｐＣａｓ９および多重ｇＲＮＡ構築物を有するＡＡＶ１粒子による形質導入後７日の初代皮質ニューロンのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を示す（ＤＮＭＴについては最後のパネルに例を示す）。ＡＡＶ形質導入後のニューロンを、対照の非形質導入ニューロンと比較した。赤色の核は、透過処理された死細胞を示す（パネルの２列目）。生細胞は緑色で示される（パネルの３列目）。

【図44】種々のプロモーターを含むＳａＣａｓ９を有するＡＡＶ１粒子による形質導入後７日の初代皮質ニューロンのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を示す。赤色の核は、透過処理された死細胞を示す（パネルの２列目）。生細胞は緑色で示される（パネルの３列目）。

【図45】ＴＥＴおよびＤＮＭＴ遺伝子座に関するＳｐＣａｓ９ならびにｇＲＮＡ多重体を有するＡＡＶ１ウイルスによる形質導入後のニューロンの形態比較を示す。形質導入されていないニューロンを対照として示す。

【図46】初代皮質ニューロンにおけるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いた多重ＤＮＭＴターゲティングベクター＃１の機能検証を示す。ＤＮＭＴ遺伝子ファミリー遺伝子座のＳｐＣａｓ９媒介性開裂を試験するため、細胞にＤＮＭＴターゲティングベクター＃１および種々のプロモーターを有するＳｐＣａｓ９ウイルスを共形質導入した。

【図47】脳におけるＳｐＣａｓ９開裂のインビボ効率を示す。ＤＮＭＴファミリー遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ多重体を有するＡＡＶ１／２ウイルスを、２つの異なるプロモーター：マウスＭｅｃｐ２およびラットＭａｐ１ｂの制御下にあるＳｐＣａｓ９ウイルスと共にマウスに注入した。注入後２週間で脳組織を摘出し、ｇＲＮＡ多重体構築物からシナプシンプロモーターによりドライブされるＧＦＰ発現に基づき、ＦＡＣＳを使用して核を調製および選別した。ｇＤＮＡ抽出後、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実行した。＋はＧＦＰ陽性核を示し、−は同じ動物からの対照のＧＦＰ陰性核を示す。ゲル上の数字は、評価したＳｐＣａｓ９効率を示す。

【図48】海馬ニューロンからのＧＦＰ−ＫＡＳＨ標識細胞核の精製を示す。細胞核膜の核外膜（ＯＮＭ）をＧＦＰとＫＡＳＨタンパク質膜貫通ドメインとの融合物でタグ標識する。定位手術およびＡＡＶ１／２注入の１週間後の脳における強力なＧＦＰ発現。密度勾配遠心ステップによるインタクトな脳からの細胞核の精製。精製された核を示す。Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）Ｒｕｂｙ染色によるクロマチン染色は赤色で示され、ＧＦＰ標識核は緑色で示される。ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−細胞核の代表的なＦＡＣＳプロファイル（マゼンタ色：Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）Ｒｕｂｙ染色、緑色：ＧＦＰ）。

【図49】マウス脳におけるＳｐＣａｓ９開裂効率を示す。ＴＥＴファミリー遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ多重体を有するＡＡＶ１／２ウイルスを、２つの異なるプロモーター：マウスＭｅｃｐ２およびラットＭａｐ１ｂの制御下にあるＳｐＣａｓ９ウイルスと共にマウスに注入した。注入後３週間で脳組織を摘出し、ｇＲＮＡ多重体構築物からシナプシンプロモーターによりドライブされるＧＦＰ発現に基づき、ＦＡＣＳを使用して核を調製および選別した。ｇＤＮＡ抽出後、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実行した。＋はＧＦＰ陽性核を示し、−は同じ動物からの対照のＧＦＰ陰性核を示す。ゲル上の数字は、評価したＳｐＣａｓ９効率を示す。

【図50】培養下の皮質ニューロンにおけるＧＦＰ−ＫＡＳＨ発現を示す。ＴＥＴ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ多重体構築物を有するＡＡＶ１ウイルスをニューロンに形質導入した。ＫＡＳＨドメインの局在化により、最も強力なシグナルは細胞核の周りに局在する。

【図51】（上）ガイドＲＮＡのペア間の間隔（２つのＰＡＭ配列の配置パターンにより示されるとおり）のリストを示す。ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼと共に使用したとき、パターン１、２、３、４を満たすガイドＲＮＡペアのみがインデルを呈した。（下）ＳｐＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）と、パターン１、２、３、４を満たすガイドＲＮＡのペアとの組み合わせが、標的部位におけるインデルの形成をもたらしたことを示すゲル画像。

【図52】Ｕ６ガイドＲＮＡ発現カセット（ｃａｓｓｓｅｔｔｅ）の作成に使用されるＵ６リバースプライマー配列のリストを示す。Ｕ６および所望のガイドＲＮＡを含有するアンプリコンを作成するためには、各プライマーがＵ６フォワードプライマー「ｇｃａｃｔｇａｇｇｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃ」とペアを形成する必要がある。

【図53】図３３に掲載する２４パターンの位置を示すヒトＥＭＸ１遺伝子座からのゲノム配列マップを示す。

【図54】（右側）種々のガイドＲＮＡペアにより標的化されたＣａｓ９ニッカーゼによる開裂の後に可変の５’オーバーハングが存在するときの標的部位におけるインデルの形成を示すゲル画像を示す。（左側）右側にゲルのレーン番号を示し、使用したガイドＲＮＡペアおよびＣａｓ９ニッカーゼによる開裂後に存在する５’オーバーハングの長さを特定することを含めた種々のパラメータを示す表を示す。

【図55】図５４のゲルパターン（右）をもたらしおよび実施例３５にさらに記載する種々のガイドＲＮＡペアの位置を示すヒトＥＭＸ１遺伝子座からのゲノム配列マップを示す。

【図56】Ａはガイド（標的）１がＡｐｏＢで最も高い割合のインデルを誘導したことを示す。Ｂは注入後４週間のインデル形成効率に関するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼゲルアッセイの結果を示す。

【図57】ＡＡＶ−Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ送達後のインビボでの肝臓脂質蓄積表現型を検出するオイルレッド染色を示す。各囲み内のスケールバーが２０マイクロメートルを表す。

【図58】種々の標的間および２つの異なる遺伝子（ＡＡＶＳ１およびＥＭＸ１）の範囲内では、灰色のバーで表される２１ｎｔｄ／塩基対（ｂｐ）が、少なくとも２０または２２塩基対（それぞれ黒色および白色のバーで表される）と比較して最適なスペーサー長さであることを示す。

【図59】ガイド配列をＣａｓ９イントロン配列に挿入することができたかどうかを示す。

【図60】試験した各標的についてＵ６がインデル形成割合の増加を示すとおり、完全長Ｈ１プロモーター（灰色のバー）がなおもＵ６プロモーター（黒色のバー）より弱いことを示す。

【図61】短鎖Ｈ１プロモーターが完全長Ｈ１より弱いことを示す。

【図62】Ｄ１０Ａ ＳａＣＡｓ９二重ニッカーゼの開裂効率に関して測定した構築物中の２つのガイド配列の５’末端間の距離を示す。

【図63】（実施例３８）マウス脳におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系送達およびＭｅｃｐ２遺伝子座のターゲティングを示す。（ａ）ＡＡＶ−ＳｐＣａｓ９およびＡＡＶ−ＳｐＧｕｉｄｅ（Ｍｅｃｐ２）発現ベクター。ｓｇＲＮＡベクターは、形質導入ニューロンを同定するためのＧＦＰ−ＫＡＳＨ融合タンパク質のコード配列を含む。（ｂ）マウス海馬の背側歯状回（ＤＧ）におけるＨＡ−Ｃａｓ９およびＧＦＰ−ＫＡＳＨの発現。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）デュアルベクターＣａｓ９−ＣＲＩＳＰＲ系によって効率的にターゲティングされる細胞の定量化。（ｄ）Ｃａｓ９標的位置を示すマウスＭｅｃｐ２遺伝子座の図解表示；ｓｇＲＮＡを青色で示す。ＰＡＭ配列を紫色で示す。Ｍｅｃｐ２遺伝子座のシーケンシングによって検出される代表的な突然変異パターンを下に示した：緑色−野生型配列；赤色ダッシュ記号−欠失した塩基；赤色の塩基：挿入または突然変異；赤色の三角矢印はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９切断部位を示す。（ｅ）ＤＧ領域へのＡＡＶ送達後２週間のＭｅｃｐ２遺伝子座の改変を示すＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイゲル。（ｆ）ターゲティングした脳領域におけるＭｅＣＰ２タンパク質発現のウエスタンブロット分析および背側ＤＧにおけるＭｅＣＰ２タンパク質レベルの定量化（ｔ検定、^＊＊ｐ＜０．００１、３匹の動物からのｎ＝４、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。（ｇ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＭｅｃｐ２遺伝子座のターゲティング後２週間の背側ＤＧ領域の画像。スケールバー、１５０μｍ。（ｈ）ターゲティングした脳領域において検出された全ての細胞中にあるＭｅＣＰ２陽性細胞集団（ＤＡＰＩ染色）の、対照副次部位と比較した定量化（ｔ検定、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、２匹の動物からのそれぞれｎ＝２９０および２４９細胞；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。（ＩＴＲ−逆方向末端反復；ＨＡ−ヘマグルチニンタグ；ＮＬＳ−核局在化シグナル；ｓｐＡ−合成ポリアデニル化シグナル；Ｕ６−ＰｏｌＩＩＩプロモーター；ｓｇＲＮＡ−単一ガイドＲＮＡ；ｈＳｙｎ−ヒトシナプシン１プロモーター；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；ＫＡＳＨ−Ｋｌａｒｓｉｃｈｔ、ＡＮＣ１、Ｓｙｎｅ相同性核膜貫通ドメイン；ｂＧＨ ｐＡ−ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏ ｓｉｇｎａｌ）；ＷＰＲＥ−ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）。

【図64】（実施例３８）Ｃａｓ９媒介性ＭｅＣＰ２ノックダウンニューロンにおける遺伝子発現の解析を示す。（ａ）マウス脳からのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９標的細胞の細胞核精製戦略。（ｂ）ＲＮＡｓｅｑによって検出された差次的発現遺伝子の階層クラスタリング（ｔ検定、ｐ＜０．０１、８匹の動物からの選別した核のｎ＝１９集団）。行毎に遺伝子の相対ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）発現レベルを正規化し、赤色−青色カラースケールで表示する。各列が、指示するとおり、対照動物またはＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡ形質導入動物のいずれかに由来する単離歯状回細胞集団からＦＡＣＳ選別した１００個の標的神経核の集団を表す。

【図65】（実施例３８）ＣＲＩＳＰＲ媒介性ＭｅＣＰ２ノックダウン後のニューロンの細胞応答特性における細胞自律性欠陥を示す。（ａ）マウス視覚野からの生体内実験構成および視覚刺激パラメータを示す略画。ＧＦＰ^＋ニューロンを示す。スケールバー、２０μｍ。（ｂ）対側眼および同側眼の両方に特異的な入力を受け取る第２／３層興奮性ニューロンにおける記録構成を示す略画。ゲノム改変ＧＦＰ^＋細胞は緑色であり、一方、非改変細胞は灰色である。正規化したスパイク形状は、規則的にスパイク発火する興奮性ニューロンを示す。（ｃ、ｄ）それぞれＭｅｃｐ２および対照ｓｇＲＮＡを発現するＧＦＰ^＋細胞から平均ＯＳＩ（ｃ）および誘発ＦＲ（ｄ）を測定した（ｔ検定、^＊ｐ＜０．０５；グラフ中の数字は記録された細胞の数を示す；ｎ＝２〜３匹の動物；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。

【図66】（実施例３８）マウス脳における同時多重化遺伝子編集を示す。（ａ）多重化ゲノムターゲティング用に設計されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の概略図。（ｂ）標的ＤＮＭＴマウス遺伝子座の図解表示。ガイドＲＮＡを青色で示す。ＰＡＭ配列を紫色で示す。（ｃ）ＤＧ領域へのＡＡＶ送達後４週間の、ＦＡＣＳ選別したＧＦＰ−ＫＡＳＨ陽性細胞におけるＤＮＭＴ遺伝子座の改変を示すＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイゲル。（ｄ）単一細胞におけるＤＮＭＴ遺伝子座改変のディープシーケンシングベースの解析であって、複数の遺伝子座に改変が同時に起こることを示す。（ｅ）ＤＮＭＴファミリー遺伝子をターゲティングするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系をインビボ送達した後のＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ１タンパク質のウエスタンブロット分析（上）。インビボＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ターゲティング後のＤＧにおけるＤｎｍｔ３ａおよびＤｎｍｔ１タンパク質レベルのウエスタンブロット定量化（下；ｔ検定、^＊＊ｐ＜０．００１、^＊ｐ＜０．０５、Ｄｎｍｔ３ａ：ｎ＝７；Ｄｎｍｔ１：５匹の動物からのｎ＝５；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。（ｆ）訓練文脈および文脈変化で試験した、海馬のＤＧ領域でＳｐＣａｓ９を使用してＤＮＭＴ遺伝子をターゲティングした８週間後の文脈学習障害（ｔ検定、^＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝１８匹の動物、２つの独立した実験；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。

【図67】（実施例３８）ＡＡＶパッケージングのためのＨＡタグ標識ＳｐＣａｓ９（ＨＡ−ＳｐＣａｓ９）のクローニングおよび発現を示す。（ａ）短鎖ラットＭａｐ１ｂプロモーター（ｐＭａｐ１ｂ）、トランケート型のマウスＭｅｃｐ２プロモーター（ｐＭｅｃｐ２）および短鎖ポリＡモチーフ（ｓｐＡ）を使用してＳｐＣａｓ９発現カセットサイズを最小限に抑える種々のクローニング戦略の概略図。（ｂ）種々のＳｐＣａｓ９発現カセットを使用してＨＡ−ＳｐＣａｓ９を発現する初代皮質ニューロン培養物のウエスタンブロット分析。（ｃ）Ｍｅｃｐ２プロモーターはＨＡ−ＳｐＣａｓ９（赤色）発現をニューロンでは駆動するが（Ｍａｐ１ｂ、ＮｅｕＮ；矢印）、しかしアストログリアでは駆動しない（ＧＦＡＰ、三角矢印）。ＨＡ−ＳｐＣａｓ９とＧＦＰ−ＫＡＳＨとの同時発現が示される（下）。核はＤＡＰＩ（青色）で標識した。スケールバー、２０μｍ。（ｄ）ＧＦＰ標識の概略図。核膜貫通ＫＡＳＨドメインに融合した高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および核外膜へのＧＦＰ−ＫＡＳＨのインテグレーションが示される。（ｅ）ＨＡ−ＳｐＣａｓ９とＧＦＰ−ＫＡＳＨとの両方を発現する細胞の集団を示す重感染効率計算（３つの培養物からのｎ＝９７３ニューロン；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。（ｆ）ウイルス送達７日後に細胞をＬＩＦＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）キットで染色した。ＤＡＰＩ^＋および死滅（ＤＥＡＤ^＋）細胞の定量化（対照 ｎ＝５１８個のＤＡＰＩ^＋核；ＳｐＣａｓ９／ＧＦＰ−ＫＡＳＨ ２つの培養物からのｎ＝１００３個のＤＡＰＩ^＋核；エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。（ＩＴＲ−逆方向末端反復；ＨＡ−ヘマグルチニンタグ；ＮＬＳ−核局在化シグナル；ｓｐＡ−合成ポリアデニル化シグナル；Ｕ６−ＰｏｌＩＩＩプロモーター；ｓｇＲＮＡ−単一ガイドＲＮＡ；ｈＳｙｎ−ヒトシナプシン１プロモーター；ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質；ＫＡＳＨ−Ｋｌａｒｓｉｃｈｔ、ＡＮＣ１、Ｓｙｎｅ相同性 核膜貫通ドメイン；ｂＧＨ ｐＡ−ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；ＷＰＲＥ−ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント）。

【図68】（実施例３８）Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞におけるＭｅｃｐ２のターゲティングを示す。（ａ）Ｍｅｃｐ２ターゲティング配列および対応するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）。（ｂ）Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞にＳｐＣａｓ９と同時形質移入した６つのＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡの評価。形質移入後４８時間にＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイを用いて遺伝子座改変効率を分析した。

【図69】（実施例３８）初代皮質ニューロンにおけるＭｅｃｐ２のＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９ターゲティングを示す。（ａ）ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ形質導入７日後の培養ニューロンにおけるＭｅＣＰ２（赤色）の免疫蛍光染色（緑色、ＧＦＰ−ＫＡＳＨ）。核はＤＡＰＩ（青色）で標識した。スケールバー、２０μｍ。（ｂ）ＳｐＣａｓ９またはｄＳｐＣａｓ９をＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡまたは対照（細菌ｌａｃＺ遺伝子をターゲティングする）ｓｇＲＮＡと共に使用したＭｅｃｐ２遺伝子座ターゲティングに関するＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）アッセイゲルを用いた評価。（ｃ）標的ニューロン集団（ＧＦＰ^＋）中のＭｅＣＰ２陽性核の定量化。（ｄ）ＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９によるＭｅｃｐ２遺伝子座のターゲティング後におけるＭｅＣＰ２タンパク質レベルのウエスタンブロットおよびＭｅＣＰ２タンパク質レベルの定量化（ｔ検定、^＊＊ｐ＜０．００１、３個の培養物からのｎ＝５、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。

【図70】（実施例３８）インビトロでのＳｐＣａｓ９媒介性ＭｅＣＰ２ノックダウン後のニューロンの樹状突起樹における形態学的変化を示す。（ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９によるＭｅｃｐ２遺伝子座のターゲティング後のニューロンにおける樹状突起樹の複雑さの低下。スケールバー、２０μｍ。（ｂ）ＳｐＣａｓ９およびＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡでターゲティングしたニューロンにおける樹状突起棘形態の変化。スケールバー、１０μｍ。細胞の形態はｍＣｈｅｒｒｙ構築物との同時形質移入で可視化した。形態分析用の細胞はＭｅｃｐ２染色の結果に基づき選択した。（ｃ）樹状末端の数で評価した樹状突起樹形態、および（ｄ）Ｓｈｏｌｌ解析（ｔ検定、^＊＊＊ｐ＜０．０００１、２つの培養物からのｎ＝４０）。（ｅ）棘密度定量化（ｔ検定、^＊＊＊ｐ＜０．０００１、２つの培養物からのｎ＝４０、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ）。

【図71】（実施例３８）対照動物およびＳｐＣａｓ９媒介性Ｍｅｃｐ２ノックダウンの神経核のＲＮＡｓｅｑを示す。発現レベルの分位点毎の全ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリ（各々１００個の、対照ｓｇＲＮＡから取った核またはＭｅｃｐ２ ｓｇＲＮＡを形質導入した核の１９個のライブラリ、；ｎ＝４匹の動物／群）で検出された遺伝子の数を示す箱ひげ図。全ての遺伝子をその平均ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）発現レベルで１０分位に分け、次に各分位点について、試料毎に検出された（ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１）＞２）遺伝子の数をカウントした。図示する３つの標的配列は、それぞれＤｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１およびＤｎｍｔ３ｂについて、配列番号＿＿＿、配列番号＿＿＿および配列番号＿＿＿である。

【図72】（実施例３８）インビトロでのＤＮＭＴファミリーメンバーの多重化ゲノムターゲティングを示す。（ａ）Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１およびＤｎｍｔ３ｂターゲティング配列および対応するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）。（ｂ）Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子座をターゲティングするＳｐＣａｓ９およびＤＮＭＴ ３ｘｓｇＲＮＡベクターの形質移入後４８時間におけるＮｅｕｒｏ−２ａ細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼアッセイ分析。ターゲティングされた３つ全ての遺伝子の効率的なゲノム編集が示される。

【図73】（実施例３８）標的Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子座の次世代シーケンシングを示す。ＳｐＣａｓ９およびＤＮＭＴ ３ｘｓｇＲＮＡをマウス歯状回にインビボ送達した後の突然変異Ｄｎｍｔ３ａ（ａ）、Ｄｎｍｔ１（ｂ）およびＤｎｍｔ３ｂ（ｃ）遺伝子座のシーケンシング結果の例。緑色：野生型配列、赤色ダッシュ記号：欠失した塩基、赤色の塩基：挿入または突然変異。赤色の三角矢印はＣＲＩＳＰＲ−ＳｐＣａｓ９切断部位を示す。この図に用いた完全配列は、それぞれＤｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ１およびＤｎｍｔ３ｂ遺伝子座について、配列番号 、配列番号 、および配列番号 として提供される。これらは以下である： 配列番号 （Ｄｎｍｔ３ａ）： ＣＣＴ ＣＣＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＴＧ ＣＣＡ Ａ 配列番号 （Ｄｎｍｔ１）： ＣＣＡ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＧＣ ＣＣＧ 配列番号 （Ｄｎｍｔ３ｂ） ＡＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＣＡＧ ＣＧＧ ＧＴＡ ＴＡＴ ＧＡＧ Ｇ

【図74】発現を増進させるため、ＳａＣａｓ９タンパク質配列がコドン最適化されており（「ｒｅｏｐｔ」）、そのユビキチン化シグナルが取り除かれている（「ｒｅｏｐｔ（Ｕｂ）」）ことを示す。ＦＬＡＧタグおよびＨＡタグ標識ＳａＣａｓ９に対するタンパク質ブロットは、最適化ＳａＣａｓ９（ｒｅｏｐｔ、＃２〜４）が元の構築物（＃０、５、および６）と比べて約２倍の発現増加を示し、ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９ ３３０、左側パネル最上部のバー；ＳｐＣａｓ９ ４１４、右側パネル最上部のバー）と同程度であることを示す。３ｘＨＡタグ標識（右側パネル＃６）を加えると、１ｘＨＡタグ（右側パネル＃５）と比べて検出シグナルが約２倍向上する。

【図75】そのままの（灰色、各ｎｔｄ数について左側のバー）またはＳａＣａｓ９のｓｇＲＮＡの最も５’側の位置に「Ｇ」を付加した（青色、各ｎｔｄ数について太い輪郭を有する右側のバー）Ｕ６プロモーターによって転写されるｓｇＲＮＡを使用したインデル効率を示す。総ｓｇＲＮＡスペーサー長さ（Ｇを含む）をｘ軸上に示す。グラフは、５個のｓｇＲＮＡから集約したデータを示す。

【図76】ｓｇＲＮＡスペーサー長さ（ｘ軸）の最適化を示す。グラフは、ＨＥＫ（左）およびＨｅｐａ（右）細胞における種々の長さのｓｇＲＮＡスペーサーによるインデル形成を示す。