【図1-1】変異型ＲＴ ＭＭ３．１４のヌクレオチド配列（配列番号３）とアミノ酸配列（配列番号２）の図である。野生型に対する６個の必須的変異（置換Ａ３２Ｖ、Ｌ７２Ｒ、Ｅ２８６Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｗ３８８ＲおよびＬ４３５Ｒ）を示す。

【図1-2】変異型ＲＴ ＭＭ３．１４のヌクレオチド配列（配列番号３）とアミノ酸配列（配列番号２）の図である。野生型に対する６個の必須的変異（置換Ａ３２Ｖ、Ｌ７２Ｒ、Ｅ２８６Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｗ３８８ＲおよびＬ４３５Ｒ）を示す。

【図2】ＭＭＬＶ−ＲＴ用の発現プラスミドの図である。星印は停止コドンを示す。

【図3-1】一重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ）比活性。ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃で実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ、Ｃ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４６℃（Ｂ）または４９℃（Ｃ）でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応を３７℃で実施した。相対活性は、インキュベーションなしでの初期反応速度に対する、４６℃または４９℃における１０分間のインキュベーションでのＲＴの初期反応速度の比として定義する。

【図3-2】一重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ）比活性。ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃で実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ、Ｃ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４６℃（Ｂ）または４９℃（Ｃ）でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応を３７℃で実施した。相対活性は、インキュベーションなしでの初期反応速度に対する、４６℃または４９℃における１０分間のインキュベーションでのＲＴの初期反応速度の比として定義する。

【図4-1】多重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ、Ｂ）比活性。（Ａ）ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ ＲＴで実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ ＲＴで実施した。初期反応速度（ΔＦＩ／分）を計算し、１．０として野生型の初期反応速度で標準化した。（Ｃ〜Ｆ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４９℃または５１℃でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応（Ｃ、Ｅ）またはＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応（Ｄ、Ｆ）を３７℃において１０ｎＭ ＲＴで実施した。相対活性は、熱処理なしのＲＴの初期反応速度に対する、１０分間の熱処理をしたＲＴの初期反応速度の比として定義する。

【図4-2】多重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ、Ｂ）比活性。（Ａ）ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ ＲＴで実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ ＲＴで実施した。初期反応速度（ΔＦＩ／分）を計算し、１．０として野生型の初期反応速度で標準化した。（Ｃ〜Ｆ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４９℃または５１℃でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応（Ｃ、Ｅ）またはＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応（Ｄ、Ｆ）を３７℃において１０ｎＭ ＲＴで実施した。相対活性は、熱処理なしのＲＴの初期反応速度に対する、１０分間の熱処理をしたＲＴの初期反応速度の比として定義する。

【図4-3】多重変異体の活性と安定性の図である。（Ａ、Ｂ）比活性。（Ａ）ｄＴＴＰの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ ＲＴで実施した。１ユニットは、１０分間でポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５中に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込む量として定義する。相対比活性は、野生型の比活性に対する変異体の比活性の比として定義する。（Ｂ）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応は３７℃において５ｎＭ ＲＴで実施した。初期反応速度（ΔＦＩ／分）を計算し、１．０として野生型の初期反応速度で標準化した。（Ｃ〜Ｆ）熱安定性。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４９℃または５１℃でインキュベートした。次いで、ｄＴＴＰの取り込み反応（Ｃ、Ｅ）またはＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込み反応（Ｄ、Ｆ）を３７℃において１０ｎＭ ＲＴで実施した。相対活性は、熱処理なしのＲＴの初期反応速度に対する、１０分間の熱処理をしたＲＴの初期反応速度の比として定義する。

【図5-1】野生型、ＭＭ３、またはＭＭ３．１４によるｃＤＮＡ合成に関する温度依存性の図である。ｃＤＮＡ合成反応は、５５℃で５分間の加熱インキュベーションを施したＲＴ（Ｂ）または加熱インキュベーションをしなかったＲＴ（Ａ、Ｃ〜Ｅ）を使用して、５０（Ａ）、５５（Ｂ、Ｃ）、６０（Ｄ）、または６５℃（Ｅ）で１０分間実施した。次いで、ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡ合成産物を使用したリアルタイムＰＣＲの蛍光を示した。クロッシングポイント（ＣＰ）は、野生型、ＭＭ３、およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２８．０１、２５．２２、および２５．６７分（Ａ）、ＭＭ３およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２４．９５および２６．７４分（Ｂ）、ＭＭ３．１４に関して３０．５２分（Ｃ）、ＭＭ３およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２８．４８および２９．１４分（Ｄ）、ならびにＭＭ３．１４に関して３２．５１分（Ｅ）であった。

【図5-2】野生型、ＭＭ３、またはＭＭ３．１４によるｃＤＮＡ合成に関する温度依存性の図である。ｃＤＮＡ合成反応は、５５℃で５分間の加熱インキュベーションを施したＲＴ（Ｂ）または加熱インキュベーションをしなかったＲＴ（Ａ、Ｃ〜Ｅ）を使用して、５０（Ａ）、５５（Ｂ、Ｃ）、６０（Ｄ）、または６５℃（Ｅ）で１０分間実施した。次いで、ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡ合成産物を使用したリアルタイムＰＣＲの蛍光を示した。クロッシングポイント（ＣＰ）は、野生型、ＭＭ３、およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２８．０１、２５．２２、および２５．６７分（Ａ）、ＭＭ３およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２４．９５および２６．７４分（Ｂ）、ＭＭ３．１４に関して３０．５２分（Ｃ）、ＭＭ３およびＭＭ３．１４に関してそれぞれ、２８．４８および２９．１４分（Ｄ）、ならびにＭＭ３．１４に関して３２．５１分（Ｅ）であった。

【図6】ｃＤＮＡ合成によって評価した野生型、ＭＭ３、またはＭＭ３．１４の安定性の図である。ポリ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_１５（２８μＭ）の存在下において１０分間、１００ｎＭのＲＴを４８、５４、５７、６０、または６３℃でインキュベートした。次いで、４５℃で３０分間、１６ｐｇ ｃｅｓＡＲＮＡ、０．５μＭ ＲＶ−Ｒ２６プライマーを用いてｃＤＮＡ合成を実施した。ＲＶとＦ５のプライマーの組合せを用いてＰＣＲを実施した。増幅産物は１％アガロースゲルに施し、次に臭化エチジウム（１μｇ／ｍｌ）で染色した。