【図1】ｈｕ１Ａ７及びｈｕ４Ｄ５のＲＧＹ変異形バージョンが、天然ＩｇＧ１標準対照と比べて、六量体及び単量体種を密集させていることを実証する、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）クロマトグラムを示す。

【図2】優勢的に六量体（８６５ｋＤａ）の種の存在を確認する、ＲＧＹ ｈｕ４Ｄ５抗体のサイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱検出（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）データを示す。単量体（１５７ｋＤａ）抗体のより小さい集団もまた観察される。

【図3-1】溶液中の六量体形成を促進するのに３つ全てのＲＧＹ置換が必要であることを実証する、分析ＳＥＣクロマトグラムを示す。全ての抗体は、ｈｕ４Ｄ５ ＩｇＧ１の関連において構築、産生、及び試験された。ＷＴ＝天然ＩｇＧ１、ＲＧＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ、Ｒ＝Ｅ３４５Ｒ、Ｇ＝Ｅ４３０Ｇ、Ｙ＝Ｓ４４０Ｙ、ＲＧ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ、ＲＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｓ４４０Ｙ、及びＧＹ＝Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ。

【図3-2】溶液中の六量体形成を促進するのに３つ全てのＲＧＹ置換が必要であることを実証する、分析ＳＥＣクロマトグラムを示す。全ての抗体は、ｈｕ４Ｄ５ ＩｇＧ１の関連において構築、産生、及び試験された。ＷＴ＝天然ＩｇＧ１、ＲＧＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ、Ｒ＝Ｅ３４５Ｒ、Ｇ＝Ｅ４３０Ｇ、Ｙ＝Ｓ４４０Ｙ、ＲＧ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ、ＲＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｓ４４０Ｙ、及びＧＹ＝Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ。

【図4】六量体促進置換ＲＧＹと、エフェクター減弱置換Ｎ２９７ＧまたはＬＡＬＡＰＧエフェクター減弱との組み合わせを含有する、ｈｕ４Ｄ５抗体についての分析ＳＥＣクロマトグラムを示す。データは、エフェクター減弱のためのＮ２９７Ｇ使用が六量体化を可能にしない一方で、ＬＡＬＡＰＧはそれを可能にすることを実証する。

【図5】六量体促進置換ＲＧＹと、エフェクター減弱置換Ｎ２９７ＧまたはＬＡＬＡＰＧエフェクター減弱との組み合わせを含有する、ｈｕ１Ａ７抗体についての分析ＳＥＣクロマトグラムを示す。データは、エフェクター減弱のためのＮ２９７Ｇ使用が六量体化を可能にしない一方で、ＬＡＬＡＰＧはそれを可能にすることを実証する。

【図6】抗ＣＤ３抗体及びＣＤ８０＋ＦｃγＲＩＩａ＋Ｌ細胞の存在下での、抗ＯＸ４０または対照抗体によるＣＤ４＋メモリーＴ細胞増殖の共刺激を示す。Ｔ細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって監視した。抗体は、以下の通りである：１Ａ７＝ヒト化１Ａ７天然ＩｇＧ１、１Ａ７ ＲＧＹ＝ヒト化１Ａ７ ＲＧＹ ＩｇＧ１、４Ｄ５＝ヒト化４Ｄ５天然ＩｇＧ１、４Ｄ５ ＲＧＹ＝ヒト化４Ｄ５ ＲＧＹ ＩｇＧ１。

【図7】ＩＬ−１３及びＩＬ−５の放出によって測定した、抗ＯＸ４０または対照抗体によるＣＤ４＋メモリーＴ細胞活性化の共刺激を示す。抗体は、図６に記載される通りである。

【図8】抗ＣＤ３抗体ならびにＣＤ８０＋及びＦｃγＲＩＩａ＋Ｌ細胞の存在下での、抗ＯＸ４０または対照抗体によるＣＤ４＋メモリーＴ細胞の共刺激を示す。Ｔ細胞増殖及び活性化は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（上部グラフ）及びＩＬ−１３の放出（下部グラフ）によって監視した。

【図9】混合ＲＧＹ変異形抗体が互いに交流して、多重特異性六量体複合体を形成することを実証する、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）データを示す。示される抗ＯＸ４０（１Ａ７）及び抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）抗体は、混合され、ＯＸ４０抗原を担持するプレート上に捕捉された。洗浄後、抗体複合体は、ビオチン化Ｈｅｒ２及びＨＲＰ−ストレプトアビジンで検出された。

【図10】ＲＧＹ変異形抗体（中空の記号及び点線）が、天然ヒトＩｇＧ１抗体（中実の記号及び実線）と比べて迅速に排除されることを実証する、同系ＥＭＴ６マウスがんモデルからの薬物動態（ＰＫ）データを示す。ＰＫ ＥＬＩＳＡは、血清から試験物質を捕捉するのにヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体を、及び検出するのにヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを使用した。７及び１４日目時点のいくつかの試験物質の不在は、データが検出限界未満であったことを示す。

【図11】ＲＧＹ変異形抗体が、それらの迅速な排除にもかかわらず、それらの親抗体と比べて抗腫瘍活性を強化し、その上、Ｆｃ受容体媒介性架橋結合の不在下でＯＸ４０受容体へのアゴニスト活性を促進することを実証する、同系ＥＭＴ６マウスがんモデルからの腫瘍体積データを示す。

【図12-1】溶液中の六量体形成を促進するのに３つ全てのＲＧＹ置換が必要であることを実証する、分析ＳＥＣクロマトグラムを示す。全ての抗体は、ｈｕ１Ａ７ ＩｇＧ１の関連において構築、産生、及び試験された。ＷＴ＝天然ＩｇＧ１、ＲＧＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ、Ｒ＝Ｅ３４５Ｒ、Ｇ＝Ｅ４３０Ｇ、Ｙ＝Ｓ４４０Ｙ、ＲＧ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ、ＲＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｓ４４０Ｙ、及びＧＹ＝Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ。

【図12-2】溶液中の六量体形成を促進するのに３つ全てのＲＧＹ置換が必要であることを実証する、分析ＳＥＣクロマトグラムを示す。全ての抗体は、ｈｕ１Ａ７ ＩｇＧ１の関連において構築、産生、及び試験された。ＷＴ＝天然ＩｇＧ１、ＲＧＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ、Ｒ＝Ｅ３４５Ｒ、Ｇ＝Ｅ４３０Ｇ、Ｙ＝Ｓ４４０Ｙ、ＲＧ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ、ＲＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｓ４４０Ｙ、及びＧＹ＝Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ。

【図12-3】溶液中の六量体形成を促進するのに３つ全てのＲＧＹ置換が必要であることを実証する、分析ＳＥＣクロマトグラムを示す。全ての抗体は、ｈｕ１Ａ７ ＩｇＧ１の関連において構築、産生、及び試験された。ＷＴ＝天然ＩｇＧ１、ＲＧＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ、Ｒ＝Ｅ３４５Ｒ、Ｇ＝Ｅ４３０Ｇ、Ｙ＝Ｓ４４０Ｙ、ＲＧ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ、ＲＹ＝Ｅ３４５Ｒ／Ｓ４４０Ｙ、及びＧＹ＝Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ。

【図13】抗ＣＤ３抗体及びＣＤ８０＋ＦｃγＲＩＩａ＋Ｌ細胞の存在下での、抗ＯＸ４０または対照抗体によるＣＤ４＋メモリーＴ細胞増殖の共刺激を示す。Ｔ細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって監視した。上グラフは、ｈｕ１Ａ７抗体についてのデータを示し、一方で、下グラフは、ｈｕ３Ｃ８抗体についてのデータを示す。両グラフにおけるｈＩｇＧ１（中実の菱形）は、ｈｕ１Ａ７＿ｈＩｇＧ１抗体である。両グラフにおける陰性対照抗体（Ｎｅｇ Ｃｎｔｒｌ Ａｂ）は、抗Ｈｅｒ２ ４Ｄ５ ｈＩｇＧ１（ＲＧＹ／ＬＡＬＡＰＧ）である。

【図14】ＲＧ及びＲＹ変異形抗体が、それらの親抗体と比べて抗腫瘍活性を強化し、かつＦｃ受容体媒介性架橋結合の不在下でＯＸ４０受容体へのアゴニスト活性を促進することを実証する、同系ＥＭＴ６マウスがんモデルからの腫瘍体積データを示す。

【図15】単独で及び１：１混合物として試験したｈ１Ａ７及びｈ３Ｃ８のＲＹ ＬＡＬＡＰＧ変異形のＴ細胞増殖（上グラフ）及びサイトカイン放出（下グラフ）データを示す。ｘ軸上の抗体濃度は、総計の抗体を表し、故に、混合物（ｈ１Ａ７ ＲＹ ＬＡＬＡＰＧ＋ｈ３Ｃ８ ＲＹ ＬＡＬＡＰＧ）に関して、成分抗体の各々は、それが単独で試験された点と比べて、その濃度の５０％である。細胞＋ａＣＤ３は、細胞のみプラス抗ＣＤ３、すなわち、ｈ１Ａ７またはｈ３Ｃ８抗体なし（陰性対照）を示す。

【図16】ＲＧＹ及びＲＧＹ／ＬＡＬＡＰＧ変異形抗ＤＲ５抗体を非六量体のｈＩｇＧ１対照に対して比較する細胞生存能データを示す。

【図17】ＨＥＫ２９３細胞に対してアポトーシスを促進する変異形抗ＤＲ５抗体の能力を示す。活性データは、抗体重鎖及び軽鎖ＤＮＡのトランスフェクション後２４時間でのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイにおける発光を表す。

【図18】非トランスフェクト細胞と比べた変異形抗ＤＲ５抗体の細胞生存倍率（図１７から算出）と、同じ単一、二重、及び三重ＲＧＹ変異形についてのｈ１Ａ７抗ＯＸ４０抗体のＴ細胞活性化倍率との間の相関を示す。

【図19】抗Ｔｉｅ２抗体についての分析ＳＥＣクロマトグラム。

【図20】ＲＧＹ抗Ｔｉｅ２のアゴニスト活性が天然リガンドＡｎｇ１を超えることを示す。

【図21】ＲＧＹ抗Ｔｉｅ２が二価抗Ｔｉｅ２抗体と比べて強力なアゴニスト活性を示すことを実証する。商用の均一性時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いたラット大動脈内皮細胞（ＲＡＥＣ）におけるＡＫＴのリン酸化（ｐＡＫＴ）活性測定。

【図22A】図２２Ａ及び図２２Ｂは、Ｆｃ操作された抗ＤＲ５抗体の２９３細胞に対する抗増殖活性を示す。Ｆｃ操作された抗ＤＲ５抗体の２９３細胞に対する抗増殖活性を示す。データは、トランスフェクション後４８時間時点（図２２Ａ）または２２時間時点（図２２Ｂ）の細胞生存能を表す。黒色バーは、非トランスフェクト天然ＩｇＧ１、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ、ＲＧＹ、及びＲＧＹ ＬＡＬＡＰＧ変異形についてのデータを強調する。２２Ｂにおける非トランスフェクト細胞についてのバーは、０時間時点の細胞生存能を表す。

【図22B】図２２Ａ及び図２２Ｂは、Ｆｃ操作された抗ＤＲ５抗体の２９３細胞に対する抗増殖活性を示す。Ｆｃ操作された抗ＤＲ５抗体の２９３細胞に対する抗増殖活性を示す。データは、トランスフェクション後４８時間時点（図２２Ａ）または２２時間時点（図２２Ｂ）の細胞生存能を表す。黒色バーは、非トランスフェクト天然ＩｇＧ１、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡＰＧ、ＲＧＹ、及びＲＧＹ ＬＡＬＡＰＧ変異形についてのデータを強調する。２２Ｂにおける非トランスフェクト細胞についてのバーは、０時間時点の細胞生存能を表す。

【図23】ＬＡＬＡＰＧ及びＬＡＬＡＰＧ／Ｋ３２２Ａ変異形がＲＧＹ六量体抗体のヒトＣ１ｑへの結合を切断することを実証するＥＬＩＳＡデータを示す。

【図24A】Ｆｃ受容体遮断抗体の存在下でのＦｃ変異形抗ＯＸ４０抗体によるＴ細胞活性化を示す。

【図24B】Ｆｃ受容体遮断抗体の不在下でのＦｃ変異形抗ＯＸ４０抗体によるＴ細胞活性化を示す。

【図25A】ＦｃγＲＩＩａ及びＢ７−１の両方を発現するＬ細胞の存在下での変異形ｈｕ１Ａ７抗ＯＸ４０抗体によるＴ細胞共活性化を示す。

【図25B】ＦｃγＲＩＩａのみを発現するＬ細胞の存在下での変異形ｈｕ１Ａ７抗ＯＸ４０抗体によるＴ細胞共活性化を示す。

【図26A】ＦｃγＲＩＩａ及びＢ７−１の両方を発現するＬ細胞の存在下での変異形ｈｕ３Ｃ８抗ＯＸ４０抗体によるＴ細胞共活性化を示す。

【図26B】ＦｃγＲＩＩａのみを発現するＬ細胞の存在下での変異形ｈｕ３Ｃ８抗ＯＸ４０抗体によるＴ細胞共活性化を示す。

【図27】ＦｃγＲＩＩａのみを発現するＬ細胞の存在下での変異形ｈｕ１Ａ７抗ＯＸ４０抗体によるＴ細胞共活性化を示す。抗体と共に実験された全ての群は、抗ＣＤ３抗体を使用したＣＤ３刺激を含んだ。