【図1】 ＣＤ８Ｓ３６５－ＤＦＯコンジュゲートは、Ｔ細胞をデノボで活性化せず、そして、２４時間のＩＮＦγ ＥｌｉＳｐｏｔアッセイで、Ｔ細胞の抗原依存性活性化を調節しない。ＣＭＶ反応性Ｔ細胞を、ＣＭＶペプチドの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）で、３６５－ＤＦＯで処理した。第２のＭ１反応性ドナーもまた、Ｍ１ペプチドの非存在下（Ｃ）または存在下（Ｄ）で試験した。

【図2】 ＣＤ８Ｓ３６５－ＤＦＯコンジュゲートは、Ｔ細胞をデノボで活性化せず、そして、６日間のＩＦＮγ ＭＳＤアッセイで、Ｔ細胞の抗原依存性活性化を調節しない。ＣＭＶ反応性Ｔ細胞を、ＣＭＶペプチドの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）で、３６５－ＤＦＯで処理した。

【図3】 ［１２４Ｉ］－ＩＰＥＭの粗分取ＨＰＬＣトレース。Ｗａｔｅｒｓ １５２５ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ２４８９二重波長ＵＶ／可視検出器（λ＝２１４及び２５４ｎｍ）、Ｂｉｏｓｃａｎ Ｆｌｏｗ Ｃｏｕｎｔ放射線検出器（Ｂ－ＦＣ－２０００）、及び、Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３、１００オングストローム、５μｍ、１５０×４．６ｍｍのＨＰＬＣカラムを使用して、分取ＨＰＬＣを実施した。使用した溶出プロファイルは、以下の通りであった。溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ（０．１％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ（０．１％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ））、流速＝１．５ｍＬ／分、初期＝８０％Ａ、２０分＝０％Ａ（線形勾配）。２５４ｎｍ（上方のグラフ）、及び、２１４ｎｍ（中央のグラフ）のＵＶ－ｖｉｓトレースでの複数の小分子吸光度は、粗反応混合物での不純物、及び、副生成物の存在を示す。放射性トレース（下方のグラフ）は、放射標識不純物に起因する予想ベースラインピークも示している。

【図4】 ［１２４Ｉ］－ＩＰＥＭの分析ＨＰＬＣトレース。Ｗａｔｅｒｓ １５２５ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ２７０７オートサンプラー、Ｗａｔｅｒｓ ２４８９二重波長ＵＶ／可視検出器（λ＝２１４及び２８０ｎｍ）、Ｂｉｏｓｃａｎ Ｆｌｏｗ Ｃｏｕｎｔ放射線検出器（Ｂ－ＦＣ－２０００）、及び、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ５μｍ ＸＢ－Ｃ１８ １００オングストローム、１５０×４．６ｍｍＨＰＬＣカラムを使用して、分析ＨＰＬＣを実施した。使用した溶出プロファイルは、以下の通りであった。溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、流速＝１ｍＬ／分、初期＝９０％Ａ、１５分＝０％Ａ（線形勾配）。分析的に純粋な［Ｉ－１２４］ＩＰＥＭは、単一の放射性ピークを示しており（下方のグラフ）、滑らかなベースラインは、精製の成功を確認するものである。［Ｉ－１２４］ＩＰＥＭは、小さな有機分子であるので、２８０ｎｍ（上方のグラフ）、及び、２１４ｎｍ（中央のグラフ）では吸収が認められない。

【図5】 精製した［１２４Ｉ］－ＩＰＥＭ ＣＤ８Ｓ３６５のラジオＴＬＣ。ｉＴＬＣ－ＳＧプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号ＳＧＩ０００１）を、Ｂｉｏｓｃａｎ ＡＲ－２０００ラジオ－ＴＬＣ画像スキャナーで読み取った。この放射線ＴＬＣプレート（図３）を、１μｌのＮａＩ（０．１Ｍ）と共スポットし、そして、溶離液としてクエン酸（０．５ｍＭ、ｐＨ＝５）を用いて発色させた。原点＝２０ｍｍ、及び、溶媒先端＝１００ｍｍ。この放射線ＴＬＣ溶離液を、９６ｍｇのクエン酸（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ カタログ番号Ｃｌ１３１）を、２５ｍＬのＴｒａｃｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｈ２Ｏに溶解し、次いで、Ｎａ２ＣＯ３を加えて（２４５μＬ、２Ｍ）調製し、そのｐＨを、ストリップでチェックした（ｐＨ＝５）。

【図6】 精製した［１２４Ｉ］－ＩＰＥＭの分析ＨＰＬＣトレース。Ｗａｔｅｒｓ １５２５ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ２７０７オートサンプラー、Ｗａｔｅｒｓ ２４８９二重波長ＵＶ／可視検出器（λ＝２１４及び２８０ｎｍ）、Ｂｉｏｓｃａｎ Ｆｌｏｗ Ｃｏｕｎｔ放射線検出器（Ｂ－ＦＣ－２０００）、及び、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ５μｍ ＸＢ－Ｃ１８ １００オングストローム、１５０×４．６ｍｍＨＰＬＣカラムを使用して、分析ＨＰＬＣを実施した。使用した溶出プロファイルは、以下の通りであった。溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、流速＝１ｍＬ／分、初期＝９０％Ａ、１５分＝０％Ａ（線形勾配）。２８０ｎｍでの生体分子（ＣＤ８Ｓ）吸光度（上方のグラフ）、及び、２１４ｎｍでの小分子（Ｉ１２４－ＩＰＥＭ）吸光度（中央のグラフ）は、コンジュゲーション反応が成功したことを確認している。ＵＶ及び放射線トレース（下方のグラフ）は、分析的に純粋な試料を示している。

【図7】 ＩＰＥＭ ＣＤ８Ｓ３６５のＭＡＬＤＩ－ＭＳ（理論値分子量＝１０７８６．１２）。ＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析を、Ｂｒｕｋｅｒ ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦを陽イオンモード（線形検出器）で使用して、Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで実施した。シナピン酸の飽和溶液を、ＴＡ３０溶媒（３０：７０（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ：０．１％ＴＦＡの水）で調製した。試料（ｃ＝０．３９７ｍｇ／ｍＬ）を、マトリックス溶液と１：１の比で混合し、そして、１μｌをプレート上にスポットした。タンパク質溶液を、外部標準として使用した。

【図8】 ［１２４Ｉ］－ＩＰＥＭ ＣＤ８Ｓ３６５と冷スタンダードとの共注入。Ｗａｔｅｒｓ １５２５ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ２７０７オートサンプラー、Ｗａｔｅｒｓ ２４８９二重波長ＵＶ／可視検出器（λ＝２１４及び２８０ｎｍ）、Ｂｉｏｓｃａｎ Ｆｌｏｗ Ｃｏｕｎｔ放射線検出器（Ｂ－ＦＣ－２０００）、及び、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ５μｍ ＸＢ－Ｃ１８ １００オングストローム、１５０×４．６ｍｍＨＰＬＣカラムを使用して、分析ＨＰＬＣを実施した。使用した溶出プロファイルは、以下の通りであった。溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、流速＝１ｍＬ／分、初期＝９０％Ａ、１５分＝０％Ａ（線形勾配）。冷試料と共注入すると、ＵＶピークの重なりは完全なものとなり（上方と中央のグラフ）、生成物の分子的同一性が確認できる（すなわち、ヨウ素がヨウ素－１２４に置き換わっている以外は、冷標識物と放射標識物とは同一である）。

【図9】 注射の２時間後に撮影した、I－１２４で放射標識したＣＤ８Ｓ３６５－ＩＰＥＭ５を示す代表的なＰＥＴ画像。この画像は、最大値投影像（前後方向）であり、脾臓は、十字線の中心にある。脾臓の下方にある臓器は腎臓であり、そして、この画像は、頭が上になるように調整してある。甲状腺への取り込みは、当該タンパク質が、幾ばくか脱ヨウ素化した証拠である。

【図10】 Ｚｒ－８９またはＩ－１２４のいずれかで標識した各抗ＣＤ８Ａ ＦＮ３ドメインについての非ヒト霊長類における血液放射能についての時間－活性曲線。

【図11】 Ｚｒ－８９またはＩ－１２４のいずれかで標識した各センチリンについてのＮＨＰでの臓器放射能についての時間－活性曲線。図１１Ａは、腎臓、肝臓、脾臓を示しており、一方で、図１１Ｂは、脾臓に注目をしている。［１２４Ｉ］－ＩＰＥＭ ＣＤ８Ｓ３６５の２４時間の時点は、技術的な問題のために欠落している。同位体の残留に起因する腎臓でのＺｒ－８９の大きな取り込みは、Ｉ－１２４のデータでは、ほとんど認められない。

【図12】 非ヒト霊長類から採取した血液での３日目までのＣＤ８ Ｔ細胞枯渇の確認（１２Ａ）。ＣＤ４（１２Ｂ）、及び、ＣＤ３ Ｔ細胞（１２Ｃ）での変化も示している。

【図13】 ＣＤ８枯渇動物での注射の２時間後に撮影した、Ｉ－１２４で放射標識した３６５抗ＣＤ８Ａ ＦＮ３ドメインを示す代表的なＰＥＴ画像。この画像は、最大値投影像（前後方向）である。このものは、脾臓が明確に腎臓の上に認められる図９での非枯渇動物と比較する。

【図14】 ［１２４Ｉ］－ＩＰＥＭ ＣＤ８Ｓ３６５を投与した後の枯渇動物、及び、非枯渇動物の双方についてのカニクイザルにおける血液放射能についての時間－活性曲線。

【図15A】 枯渇動物、及び、非枯渇動物の双方についてのカニクイザルにおける臓器放射能についての時間－活性曲線。１５Ａは、腎臓、肝臓、脾臓を示しており、一方で、図１５Ｂは、脾臓に注目をしている。

【図15B】 枯渇動物、及び、非枯渇動物の双方についてのカニクイザルにおける臓器放射能についての時間－活性曲線。１５Ａは、腎臓、肝臓、脾臓を示しており、一方で、図１５Ｂは、脾臓に注目をしている。

【図16】 注射の３時間後に撮影した、Ｉ－１２４で放射標識したＣＤ８Ｓ３６５－ＩＰＥＭを示す、同じように処置をした２匹のマウスの代表的なＰＥＴ画像。この画像は、ＣＴスキャンに重ね合わせた３Ｄ最大値投影像である。腫瘍（ｈｕＣＤ８＋を過剰発現するようにトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３－ｌｕｃから形成した）、及び、その他の器官を、矢印で示した。甲状腺への取り込みは、当該タンパク質が、幾ばくか脱ヨウ素化した証拠である。

【図17】 ＨＥＫ－２９３－ｌｕｃ ＣＤ８＋、または、ＨＥＫ－２９３親腫瘍のいずれかを保有するマウスにおける血中放射能についての時間－活性曲線。

【図18】 ＨＥＫ－２９３－ｌｕｃ ＣＤ８＋、または、ＨＥＫ－２９３親腫瘍のいずれかを保有するマウスにおける腫瘍放射能についての時間－活性曲線。

【図19】 移植細胞の数に応じた、ＨＥＫ２９３ ＣＤ８過剰発現細胞におけるＩ－１２４標識ＣＤ８Ｓ３６５の取り込み。